NO333603B1 - Kjemiske forbindelser samt anvendelse og fremstilling derav og farmasoytisk sammensetning for behandling av cancer - Google Patents

Abstract

Fosforamidatderivater av nukleotider og anvendelse derav for behandling av cancer er beskrevet. Gruppene til f.eks. hver av deoksyuridin, cytarabin, gemcitabin og citidin kan være substituert i 5-posisjonen. Fosforamidatgruppen har bundet til P-atomet en aryl-O-gruppe og en a-aminosyregruppe. a-aminosyregruppen kan tilsvare eller være avledet fra enten en naturlig forekommende eller være avledet fra enten en naturlig forekommende eller en ikke-naturlig forekommende aminosyre.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører kjemiske forbindelser samt anvendelse og fremstilling derav og farmasøytisk sammensetning for behandling av cancer

Nukleosidanaloger så som fluordeoksyuridin (1), cytarabin (2) og gemcitabin (3) er velkjente som anticancermidler. De virker som inhibitorer av DNA-syntese etter aktivering til deres 5'-fosfatform.

De frie biaktive fosfatformene representerer ikke generelt nyttige medikamenter grunnet deres dårlige membranpermeasjon. I et forsøk på å omgå dette er et antall fosfat pro-drogetilnærminger blitt beskrevet [Rosowsky et al., J. Med. Chem., 1982, 25, 171-8; Hong et al., J. Med. Chem., 1985, 28,171-8; Kodama et al., Jpn. J. Cancer Res., 1989, 80, 679-85; Hong et al., 1979, 22, 1428-32; Ji et al., J. Med. Chem., 1990, 33, 2264-70; Jones et al., Nucleic Acids Res., 1989, 17, 7195-7201; Hunston et al., J. Med. Chem., 1984, 27, 440-4; Lorey et al., Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 1307-10; Farquhar et al., J. Med. Chem., 1983, 26, 1153-8; Shuto et al., Nucleosides Nucleotides, 1992, 11, 437-46; Le Bec et al., Tet. Letts., 1991, 32, 6553-6; Phelps et al., J. Med. Chem., 1980, 23, 1229-32].

Generelt har fosfatprodrogene biologiske egenskaper og terapeutiske egenskaper som ligner eller er noe lavere enn den til opphavsnukleosidanalogen.

Vi har utført omfattende arbeid innenfor dette området ut i fra et antiviralt perspektiv, stort sett på dideoksynukleosider, og har rapportert en fosforamidattilnærming som er blitt omfattende tilpasset for levering av bioaktive fosfater av antivirale nukleosider.

Et eksempel er fosforamidat (4) avledet fra anti-HIV d4T (5).

Vi observerte effekten av variasjoner i esteren [McGuigan et al., AVCC, 1998, 9, 473-9], amino acid [McGuigan et al., Antiviral Res., 1997, 35, 195-204; AVCC, 2000, 11, 111-6], og aryl [Siddiqui et al., J. Med. Chem., 1999, 42, 393-9] regioner av fosforamidat, samt effekten av aminosyrestereokjemi [McGuigan et al., AVCC, 1996, 7,184-8], fosfatstereokjemi [Allender et al., Analytica Chim. Acta, 2001, 435, 107-13] og nukleosid [Balzarini et al., BBRC, 1996, 225, 363-9; McGuigan et al., BioOrg. Med, Chem. Lett., 1996, 6, 2369-62; McGuigan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 2000, 10, 645-7].

Dette arbeidet har ført til den optimale beskrivelsen av

fenylmetoksyalaninylfosforamidat som prototype pro-gruppen for intracellulær levering av bioaktive nukleotider [Balzarini et al., PNAS, 1996, 93, 7295-9; McGuigan et al., J. Med. Chem., 1996, 39, 1748-53].

Lackey et al., [Biochen Pharmacol., 2001, 61, 179-89] har beskrevet anvendelse av vår fosforamidat pro-drogemetode for antivirale nukleosider til det anti-herpetiske midlet bromvinyl-2'-deoksyuridin (BVDU) (6). Spesielt har de funnet at fenylmetoksyalaninylfosforamidat (7) har betydelig anti-canceraktivitet. Dette står i sterk kontrast til opphavs (antiviralt) nukleosid (6).

Begrenset SAR har blitt presentert av denne gruppen til tross for at opphavssøknadene [WO 02/39952, EP 1 200 455, CA 2 317 505, US 6 339 151, EP 116797, AU 2 451 601] kreves en serie av generelle variasjoner i basen, og fosfatregionene. Men på grunnlag av tidligere kjent teknikk vil fenylmetoksyalaninylfosforamidat (7) være antatt å være blant den mest optimale av strukturene.

Det er nå overraskende blitt funnet at andre derivater av oksyaminosyre-fosforamidatnukleosidanaloger er betydelig mer potente for behandling av cancer enn fenylmetoksyalaninylfosforamidat (7).

Ifølge et første aspekt av foreliggende oppfinnelse er det tilveiebragt en kjemisk forbindelse, kjennetegnet ved at den har formel I:

hvor:

R er valgt fra gruppen omfattende Ci-Ci6acyklisk alkyl som kan være mettet eller umettet og eventuelt substituert med en til tre substituenter valgt fra aryl, hvor aryl er en aromatisk gruppe inneholdende 5 til 14 ringatomer, idet en, to, tre eller fire av ringatomene kan være heteroatomer uavhengig valgt fra gruppen bestående av O, N og S;

R' og R" er uavhengig valgt fra gruppen omfattende H og C1-C16acyklisk alkyl som kan være mettet eller umettet;

Q er valgt fra gruppen omfattende -O- og -CH2-;

X og Y er uavhengig valgt fra gruppen omfattende H, F, Cl, Br, I, OH og metyl (-CH3);

Ar er fenyl hvor en, to, tre eller fire substituenter valgt fra halogen kan eventuelt være tilstede på Ar;

Z er H; og

n er 0, Z' er -NH2og en dobbelt binding eksisterer mellom posisjon 3 og posisjon 4.

Referanse i foreliggende beskrivelse til en arylgruppe betyr en aromatisk gruppe inneholdende 5-14 ringatomer, f.eks. fenyl eller naftyl. Den aromatiske gruppen kan være en heteroaromatisk gruppe inneholdende én, to, tre eller fire, fortrinnsvis én, heteroatom valgt, uavhengig, fra gruppen bestående av O, N og S.

Eksempler på slike heteroaromatiske grupper inkluderer pyridyl, pyrrolyl, furanyl og tiofenyl. Det er foretrukket at arylgruppen omfatter fenyl eller substituert fenyl.Alkyl- og arylgruppene kan være substituerte eller usubstituerte. Når substituert vil det generelt være 1-3 substituenter tilstede, fortrinnsvis i én substituent. Substituenter kan innbefatte halogenatomer, med det menes F-, Cl-, Br- og l-atomer, og halogenmetylgrupper så som CF3og CCI3; oksygeninneholdende grupper så som okso, hydroksy, karboksy, karboksyCi-i6alkyl, alkoksy, akoyl, alkoyloksy, aryloksy, aryloyl og aryloyloksy; nitrogeninneholdende grupper så som amino, Ci-6alkylamino, diCi-6alkylamino, cyano, azid og nitro; svovelinneholdende grupper så som tiol, Ci^alkyltiol, sulfonyl og sulfoksid; heterosykliske grupper som i seg selv kan være substituerte; alkylgrupper som definert ovenfor, som i seg selv kan være substituert; og arylgrupper som definert ovenfor, som i seg selv kan være substituert, så som fenyl og substituert fenyl. Substituenter på nevnte heterosykliske, alkyl- og arylgrupper er som definert rett ovenfor.

Referanse ifølge den foreliggende beskrivelse til alkoksy- og aryloksygrupper betyr, henholdsvis, alkyl-O- (f.eks. hvor alkyl er C1-C16, fortrinnsvis C1-C6) og aryl-O- (f.eks. hvor aryl er en 5-14-leddet aromatisk mono-eller bikondensert ringgruppe, eventuelt inneholdende 1, 2, 3 eller 4 heteroatomer valgt, uavhengig, fra O, S og N, aryl er fortrinnsvis fenyl).

Referanse i foreliggende beskrivelse til alkoyl- og aryloyl-grupper, betyr henholdsvis alky-CO- (f.eks. hvor alkyl er Ci-Ci6, fortrinnsvis CrC6) og aryl-CO-(f.eks. hvor aryl er en 5-14-leddet aromatisk mono- eller bikondensert ringgruppe, eventuelt inneholdende 1,2,3 eller 4 heteroatomer som valgt, uavhengig fra O, S og N, aryl er fortrinnsvis fenyl).

Referanse i foreliggende beskrivelse til alkoyloksy og aryloyloksy betyr, henholdsvis, alkyl-CO-0 (f.eks. hvor alkyl er C1-C16, fortrinnsvis C1-C6) og aryl-CO-O (f.eks. hvor aryl er et 5-14-leddet mono- eller bikondensert aromatisk ringsystem, eventuelt inneholdende 1, 2, 3 eller 4 heteroatomer valgt, uavhengig, fra O, S og N, aryl er fortinnsvis fenyl).

Referanse i foreliggende beskrivelse til heterosykliske grupper betyr grupper inneholdende én eller flere pyrrolyl, imidazolyl, pyraziolyl, tiazolyl, isotiazolyl, oksazolyl, pyrrolidinyl, pyrrolinyl, imidazolidinyl, imidazolinyl, pyrazolidinyl, tetrahydrofuranyl, pyranyl, pyronyl, pyridyl, pyrazinyl, pyridazinyl, piperidyl, piperazinyl, morfolinyl, tionaftyl, benzfuranyl, isobenzofuryl, indolyl, oksyindolyl, isoindolyl, indazolyl, indolinyl, 7-azaindolyl, isoindazolyl, benzopyranyl, kumarinyl, isokumarinyl, kinolyl, isokinolyl, naftridinyl, cinnolinyl, kinazolinyl, pyridopyridyl, benzoksazinyl, kinokadinyl, kromenyl, kromanyl, isokromanyl og karbolinyl. Gruppen Ar omfatter en substituert eller usubstituert arylgruppe, hvor betegnelsen "arylgruppe" og mulig substitusjon av nevnte gruppe er som definert heri. Det er foretrukket at Ar er en substituert eller usubstituert fenylgruppe. Spesielt foretrukne substituenter er elektrontiltrekkende grupper så som halogen (fortrinnsvis klor eller fluor), trihalogenmetyl (fortrinnsvis trifluormetyl), cyano- og nitrogrupper. F.eks. kan Ar være fenyl, 3,5-diklor-fenyl, p_-trifluormetyl-fenyl, p_-cyano-fenyl, eller p_-nitrofenyl. Når Ar er en heteroaromatisk gruppe, er den fortrinnsvis eventuelt substituert pyridyl.

Det er foretrukket at R er en C1-16primær eller sekundær alkylgruppe. Foretrukket er R valgt fra gruppen omfattende metyl (-CH3), etyl (-C2H5) og benzyl (-CH2C6H5). at R er valgt fra gruppen omfattende metyl (-CH3), etyl (-C2H5) og benzyl (-CH2C6H5). Videre er det foretrukket at R er benzyl.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er forbindelsen kjennetegnet ved at Ar er valgt fra gruppen omfattende -C6H5, pFC6H4-, pCIC6H4- og0CIC6H4-.

I et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse er forbindelsen kjennetegnet ved at R' og R" er, uavhengig, valgt fra gruppen omfattende H, C1-6primær, sekundær og tertiær alkyl.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er forbindelsen kjennetegnet ved at R' og R" er, uavhengig, valgt fra gruppen omfattende H og metyl. Videre er R' og R" hver metyl. Videre er det foretrukket at én av R' og R" er H og én av R' og R" er metyl. Ifølge foreliggende oppfinnelse er forbindelsen videre kjennetegnet ved at R' og R" tilsvarer sidekjedene til en naturlig forekommende aminosyre. Når R' og R" er forskjellige, er C-atomet hvortil de er bundet chiral. Foreliggende forbindelser kan være L eller D eller en blanding av stereoisomerer. De er fortrinnsvis L.

Det er foretrukket at stereokjemien ved det asymmetriske senteret -CR'R" tilsvarer en L-aminosyre. Stereokjemien ved det asymmetriske senteret -CR'R" kan derimot tilsvare en D-aminosyre. Alternativt kan blandinger av forbindelser bli anvendt som har asymmetriske sentre tilsvarende L- og D-aminosyrer.

I foreliggende beskrivelse mener vi med "naturlig forekommende aminosyre" alanin, arginin, asparagin, asparaginsyre, cystein, cystein, glysin, glutaminsyre, glutamin, histidin, hydroksylysin, hydroksyprolin, isoleucin, leucin, lysin, metionin, fenylalanin, prolin, serin, treonin, tryptofan, tyrosin og valin.

Med hensyn til forbindelser med formel I når n er 0, korresponderer gruppen ROCOCR'R"NH- verken med eller avledet fra alanin, mer foretrukket verken korresponderer med eller er avledet fra hvilke som helst av alanin eller tryptofan, enda mer foretrukket verken korresponderer med eller er avledet fra en hvilken som helst naturlig forekommende aminosyre.

Det er foretrukket at Q er O.

Det er foretrukket at X og Y er hver F.

Når Z er F, Q er O, n er 1 og X og Y er hver H, tilsvarer basegruppen til forbindelsen i formel I med den til fluordeoksyuridin, dvs. forbindelse (1) ovenfor.

Når Z er H, Q er O, n er 0 og X er H og Y er OH, korresponderer basegruppen av forbindelsen med formel I med den til cytidin.

Forbindelser med formel I hvor n er 0 og X og Y er F er foretrukket. Spesielt foretrukket er forbindelser med foremel I hvor n er 0, X og Y er F, Q er O og Z er H, som tilsvarer fosforamidert gemcitabin.

Også foretrukket er forbindelser med formel I hvor n er 0 og X er OH og Y er H. Spesielt foretrukket er forbindelser med formel I hvor n er 0, X er OH, Y er H, Q er O og Z er H, som tilsvarer fosforamidert cytarabin.

Også foretrukket er forbindelser med formel I hvor n er 0 og X er H og Y er OH. Spesielt foretrukket er forbindelser med formel I hvor n er 0, X er H, Y er OH, Q er O og Z er H, som tilsvarer fosforamidert cytidin.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er forbindelsen kjennetegnet ved at den er valgt fra gruppen omfattende: Gemcitabin-[fenyl-(benzoksy-L-alaninyl)]-fosfat; Gemcitabin-[para-klorfenyl-(benzoksy-L-alaninyl)]-fosfat (CPF 40); og Gemcitabin-[ para-klorfenyl-(benzoksy-a,a-dimetylglysinyl)]-fosfat.

Substituentene på Ar kan være ved en hvilken som helst posisjon på ringgruppen. Når ringgruppen er C6dvs. fenyl, med en enkel substituent i 2 (orfo) eller 4 ( para) posisjon er foretrukket. Når Ar er fenyl, er en enkel substituent i 4-posisjonen mer foretrukket.

Det er overraskende at modifisering av estergruppen i forbindelse (7) er blitt funnet å vise en betydelig økning i potens med hensyn på cancercellelinjer. Det har overraskende blitt oppdaget at benzylesteren (8) er meget signifikant mer potent overfor flere cancercellelinjer enn metylesteren (7):

Forbindelse (8) inhiberer veksten av koloncancercellelinje HT115 med 50 % ved 1,4^m, mens (7) krever en konsentrasjon på 244^m; (8) er dermed 174 ganger mer potent. Forbindelse (8) er også åtte ganger mer potent enn (7) hvor prostatacancercellelinje PC-3 (19^m vs. 155^m).

Graden av potensøkning for (8) vs. (7) er overraskende basert på tidligere kjent teknikk. Ytterligere, ved sammenligning av ekvivalente fosforamidater av d4T viser en ca. 4-ganger potensøkning av (10) over (9) [McGuigan et al., AVCC, 1998, 9, 473-9].

Dette innbefatter at benzylfosforamidatmotivet i (10) er ca. 4-ganger mer effektivt for intracellulær levering av de bioaktive frie fosfatformene av d4T enn metylesteren (9). En fagperson innenfor dette området vil antisipere at en lignende grad av forøkning for benzylfosforamidat av BVDU (8) over metylester (7) mens vi observerte en nesten 200-ganger forøkning for koloncancer som angitt ovenfor.

Overraskende effektivitet for modifikasjon i aminosyre- og arylgruppene til BVDU-fosforamidat er også blitt funnet i forbindelsene heri.

Følgelig har forbindelsen (11) samtidig modifikasjon i disse to regionene, som er p-trifluormetylfenylbenzyl [a,a-dimetylglysinyl]fosforamidat.

Forbindelse 11 viser høy potens mot en rekke cancercelletyper og er signifikant og overraskende mer potent enn (7). Følgelig for brystcancer er (11) 60 ganger mer aktiv (1,3 vs. 79^M), og for prostatacancer er (11) 254 ganger mer potent (0,61 vs. 155^M). Mot koloncancer er (11) 35 ganger mer potent (7^M vs. 244^M). Igjen er graden av forøkning av analogen (11) vs. (7) overraskende basert på tidligere kjent teknikk. Følgelig viser sammenligning av (12) [dimetylglysinmodifikasjon] og (13) [p-CF3fenylmodifikasjon] til (9) ingen signifikant forskjell i potens.

Følgelig er 50 % effektive doser vs. HIV-1 for (9), (12) og (13): henholdsvis 0,075, 0,29 og 0,01^M; innenfor eksperimentelle feil er (12) og (13) identiske i potens med (9). Fagfolk innenfor dette området ville følgelig ha at (11) ville vise liten forøkning over (7) i forhold til 35-254 ganger forøkninger angitt ovenfor.

Forbindelsene omfattet av foreliggende oppfinnelse og som har variasjoner i én eller flere av esteren ®, aminosyren R', R") og aryl (Ar) regionen av fosforamidatstrukturen sammenlignet med fenylmetoksyalaninylfosforamidat kan følgelig gi overraskende og vesentlig potensøkninger av pro-tides avledet fra BVDU og for en rekke cancercelletyper.

Ifølge et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse er det videre tilveiebragt en forbindelse med formel I ifølge foreliggende oppfinnelse for anvendelse i en fremgangsmåte for behandling, fortrinnsvis for profylakse eller behandling av cancer.

Ifølge et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse er det følgelig tilveiebragt anvendelse av en forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-13, for fremstilling av et medikament for profylakse eller behandling av cancer.

Ifølge et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse er det nærmere tilveiebragt en farmasøytisk sammensetning som omfatter en forbindelse med formel I ifølge foreliggende oppfinnelse i en kombinasjon med en farmasøytisk akseptabel eksipient, en bærer eller et fortynningsmiddel.

Ifølge et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse er det tilveiebragt en fremgangsmåte for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning, kjennetegnet ved at den omfatter trinnet av å kombinere en forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-13 med en farmasøytisk akseptabel eksipient, en bærer eller et fortynningsmiddel.

Ifølge et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse er det tilveiebragt en fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse med formel I ifølge krav 1, kjennetegnet ved at fremgangsmåten omfatter omsetning av en forbindelse ifølge formel (III): med en forbindelse ifølge formel (IV)

hvor Ar, n, Q, R, R', R", X, Y, Z' og Z har betydningene beskrevet i krav 1 og en dobbeltbinding eksisterer mellom posisjon 3 og posisjon 4.

Foreliggende farmasøytiske sammensetning er spesielt anvendbar for behandling av en pasient som har brystcancer, koloncancer eller prostatacancer. Eksempler på slike cancerformer innbefatter bryst MDA MB231, kolon HT115 og prostata PC-3.

Forbindelsen i formel I eller farmasøytisk sammensetning ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli administrert til en pasient, som kan være human eller et dyr, ved en hvilken som helst egnet metode.

Medikamenter anvendt i foreliggende oppfinnelse kan bli administrert ved orale eller parenterale veier, inkludert intravenøs, intramuskulært, intraperetonealt, subkutant, transdermalt, luftvei (aerosol), rektal, vaginal og topisk (inkludert bukkal og sublingual) administrering.

For oral administrering vil forbindelsene ifølge oppfinnelsen generelt blitt i form av tabletter eller kapsler, som et pulver eller granuler, eller som en vandig løsning eller suspensjon.

Tabletter for oral anvendelse kan inkludere det aktive ingredienset blandet med farmasøytisk akseptable eksipienter så som inerte fortynningsmidler, oppløsningsmidler, bindemidler, smøremidler, søtningsmidler, smaksmidler, fargemidler og konserveringsmidler. Egnede inerte fortynningsmidler innbefatter natrium- og kalsiumkarbonat, natrium- og kalsiumfosfat, og laktose, mens maisstivelse og alginsyre er egnede oppløsningsmidler. Bindemidlene kan inkludere stivelse og gelatin, mens smøremidlet hvis det er tilstede vil generelt være magnesiumstearat, stearinsyre eller talk. Om ønskelig kan tablettene bli belagt med et materiale så som glyserylmonostearat eller glyseryldistearat, for å forsinke absorpsjon i mave-tarm-kanalen.

Kapsler for oral anvendelse innbefatter harde gelatinkapsler hvor det aktive ingredienset er blandet med et fast fortynningsmiddel, og bløte gelatinkapsler hvor det aktive ingredienset er blandet med vann eller en olje så som peanøttolje, flytende parafin eller olivenolje.

Formuleringer for rektal administrering kan være tilstede som en suppositorie med en egnet base som omfatter f.eks. kakaosmør eller et salisylat.

Formuleringer egnede for vaginal administrering kan bli presentert som pessarer, tamponger, kremer, geler, pastaer, skum eller sprayformuleringer inneholdende i tillegg til det aktive ingredienset slike bærere som er kjent innenfor fagområdet å være hensiktsmessige.

For intramuskulært, intraperitonealt, subkutane og intravenøs anvendelse vil forbindelsene ifølge oppfinnelsen generelt bli gitt i sterile vandige løsninger eller suspensjoner, buffere til en hensiktsmessig pH og isotonisitet. Egnede vandige bærere inkluderer Ringers løsning og isotonisk natriumklorid. Vandige suspensjoner ifølge oppfinnelsen kan inkludere suspenderingsmidler så som cellulosederivater, natriumalginater, polyvinyl-pyrrolidon og gummitragakant, og et fuktemiddel så som lecitin. Egnede konserveringsmidler for vandige suspensjoner inkluderer etyl og n-propyl p-hydroksybenzoat.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan også bli presentert som liposomformuleringer.

Generelt vil en egnet dose være i området på 0,1-300 mg/kg kroppsvekt av mottageren pr. dag. En foretrukket lavere dose er 0,5 mg/kg kroppsvekt av mottageren pr. dag, en mer foretrukket lavere dose er 6 mg/kg kroppsvekt av mottageren pr. dag, en enda mer foretrukket lavere dose er 10 mg/kg kroppsvekt pr. mottager pr. dag. En egnet dose er fortrinnsvis innenfor området på 6-150 mg/kg kroppsvekt av mottageren pr. dag, og mest foretrukket i omrpdet på 15-100 mg/kg kroppsvekt pr. dag. Den ønskede dosen er fortrinnsvis tilstede som to, tre, fire, fem eller seks eller flere sub-doser administrert ved hensiktsmessige intervaller i løpet av dagen. Disse sub-dosene kan bli administrert i enhetsdoseringsformer, f.eks. inneholdende 10-1500 mg, fortrinnsvis 20-1000 mg, og mest foretrukket 50-700 mg av det aktive ingredienset pr. enhetsdoseringsform.

Utførelsesformer ifølge foreliggende oppfinnelse vil nå bli beskrevet, kun i eksemplene, med referanse til følgende eksempler, eksperimentelle prosedyrer og eksperimentelle data.

Data er presentert for en rekke strukturer mot tumorcelletyper som representerer en rekke vanlige cancerformer i mennesket med ikke oppfylte kliniske behov: bryst MDA MB231, kolon HT115, prostata PC-3. Data fra disse analysene er presentert som tabell I.

Eksperimentell prosedyre

Generelle metoder

De følgende vannfrie løsningsmidlene og reagensene blir kjøpt fra Aldrich med "sure stopper": diklormetan (DCM), dietyleter (Et20), tetrahydrofuran THF), N-metylimidazol (NMI), metanol (MeOH), dimetylformamid (DMF), 1,4-dioksan, trietylamin ble tørket på molekylsikter med 4 Ångstrøm.

Tynnsjiktskromatografi

Tynnsjiktskromatografi (TLC) ble utført på kommersielt tilgjengelige Merck Kieselgel 60 F254plater og separerte komponenter ble visualisert ved anvendelse av ultrafiolett lys (254 nm o 366 nm).

Kolonnekromatografi

Kolonner ble utført ved anvendelse av (Kieselgel 60, 35-70^m, Fluka) som stasjonær fase. Prøver ble applisert som en konsentrert løsning i det samme elueringsmidlet, eller på forhånd absorbert på silikagel.

NMR- spektroskopi

<1>H,13C og<31>P-NMR ble registrert på et bruker Avance DPX300 spektrometer med driftsfrekvenser på henholdsvis 300 MHz, 75 MHz og 121 MHz.<31>P-NMR-spektre ble rapportert i enheter av 5 i forhold til 85 % fosforsyre som ytre standard, positive skift er nedfelt. Følgende forkortelser blir anvendt ved tildeling av NMR-signaler: s (singlet), d (dublett), t (triplett), q (kvartett), m (multippel), bs (bredsignal), dd (dublett av dublett), dt (dublett av triplett). "Starred" signal er splittet grunnet stereoisomere blandinger.

Standardprosedyrer

For praktiske formål er standardprosedyrer gitt hvor dette er anvendbart.

Standardprosedyre 1: Syntese av aminoesterhydrokloridsalter.

Til en omrørende løsning av vannfri alkohol (10 mol ekv.) ble det tilsatt tionylklorid (2 mol ekv.) ved 0°C, og den resulterende løsningen ble omrørt i 1 t. Etter varming til romtemperatur ble hensiktsmessig aminosyre (1 mol ekv.) tilsatt og reaksjonen ble oppvarmet ved tilbakeløp i 6-161. Fjerning av løsningsmidlet og omkrystallisering fra metanol/eter ga aminoesterhydrokloridsalter.

Standardprosedyre 2: Syntese av aminobenzylesterhydrokloridsalter.

Hensiktsmessig aminosyre (1,0 mol ekv.) p-toluensyre (1,0 mol ekv.) og vannfri benzylalkohol (4,1 mol ekv.) ble oppvarmet ved tilbakeløp i toluen (10 mol ekv.) med Dean-Stark-felle i 241. Ved avkjøling til romtemperatur ble Et20 tilsatt og blandingen ble latt stå i isbad i 1 t og deretter filtrert og vasket med Et20. Faststoffer ble løst opp i DCM og vasket med 10 % K2CO3og vann. Det organiske laget ble deretter tørket over MgSCv, filtrert og løsningsmidlet fjernet under redusert trykk for å gi en olje. Dette ble oppløst i aceton og nøytralisert med 1 M HCI. Et20 ble tilsatt og faststoffet ble filtrert og vasket med Et20 for å gi et hvitt fast stoff.

Standardprosedyre 3: Syntese av fosfordikloridatarter.

Fosforoksyklorid (1,0 mol ekv.) og hensiktsmessig substituert fenol (1,0 mol) ble omrørt med vannfri dietyleter (31 mol ekv.). Til dette ble det tilsatt vannfri trietylamin (1,0 mol ekv.) ved -80°C og latt øke til romtemperatur over 161. Trietylaminhydrokloridsaltet ble deretter filtrert ut og filtratet redusert til tørrhet for å gi råproduktet som en klar væske.

Standardprosedyre 4: Syntese av fosfokloridatarter.

Fosfodikloridat (1,0 mol ekv.) og hensiktsmessige aminoesterhydrokloridsalt (1,0 mol ekv.) ble suspendert i vannfri DCM. Vannfri trietylamin ble tilsatt dråpevis ved -80°C og etter 1 t ble reaksjonen latt bli øket til romtemperatur. Dannelse av fosfokloridat ble registrert med<31>P-NMR. Etter 2-51 ble løsningsmidlet fjernet under redusert trykk og faststoffet oppnådd vasket med vannfri eter (2x20 ml), filtrert, og filtratet redusert til tørrhet for å gi produktene som råolje. Disse oljene ble anvendt uten ytterligere rensing.

Standardprosedyre 5: Syntese av fosforamidatderivater.

Til den omrørte løsning av (E)-5-(2-bromvinyl)-2'-deoksyuridin (1,0 mol ekv.) og hensiktsmessig fosfokloridat (2,0-3,0 mol ekv.) i vannfri THF ved -80°C ble det tilsatt dråpevis over 1 min. NMI (5,0 mol ekv.). Etter 15 min. ble reaksjonen latt bli øket til romtemperatur og omrørt ved romtemperatur i 2-19 t. Løsningsmidlet ble deretter fjernet under redusert trykk og den gule oljen som ble oppnådd ble løst opp i DMC, vasket med 0,5 M HCI og vann. Det organiske laget ble tørket ver MgSO\4, filtrert, redusert til tørrhet og renset ved flashkromatografi (kloroform/metanol 97/3, diklormetan/metanol 97/3).

Syntese av metyl-2-amino-2-metylpropanoathydrokloridsalt

C5H12CIN03, MV 153,61.

Dette ble syntetisert ifølge standardprosedyre 1, ved anvendelse av 2-amino-isosmørsyre (5,102 g, 48,49 mmol) med tionylklorid (11,538 g, 96,98 mmol, 7,04 ml) og vannfri metanol (19,6 ml). Produktet ble isolert som et hvitt fast stoff (6,636 g, utbytte 89,2 %).

<1>H-NMR (CDCI3; 300 MHz): 5 8,81 (3H, bs, NH3CI), 3,83 (3H, s, OCH3), 1,74 (6H, s, [CH3J2C).

<13>C-NMR (CDCI3; 75 MHz): 5 24,1, 24,3 ([CH3]3C), 57,9 (C[CH3]2), 172,4 (COOCH3).

Syntese av etyl-2-amino-2-metylpropanoathydrokloridsalt. C6H14CIN02, MV 167,63.

Dette ble syntetisert ifølge standardprosedyre 1, ved anvendelse av 2-amino-isosmørsyre (5,102 g, 48,49 mmol) med tionylklorid (11,772 g, 98,95 mmol, 7,2 ml) og vannfri etanol (29 ml). Produktet ble isolert som et hvitt fast stoff (7,159 g, utbytte 86,3 %).

<1>H-NMR (CDCI3; 300 MHz): 5 8,93 (3H, bs, NH3CI), 4,3 (2H, q,<3>J=7,1Hz, OCH2CH3), 1,75 (6H, s, [CA^bC), 1,33 (3H, t,<3>J=7,1 Hz, OCH2CH3).

<13>C-NMR (CDCI3; 75 MHz): 5 14,4 (CH3CH20), 24,3 ([CH3]2C), 57,9 (C[CH3]2), 63,1 (OCH2CH3), 171,6 (COOCH2CH3).

Syntese av benzyl-2-amino-2-metylpropanoathydrokloridsalt.

CiiH16CIN02, MV 229,70.

Dette ble syntetisert ifølge standardprosedyre 2, ved anvendelse 2-amino-isosmørsyre (1,960 g, 19,00 mmol) med p-toluensulfonsyremonohydrat (3,750 g, 19,7 mmol) og benzylalkohol (8,360 g, 77,30 mmol, 8 ml), i toluen (20 ml). Produktet ble isolert som et hvitt fast stoff (2,556 g, utbytte 87,4 %).

p-toluensulfonatsalt:<1>H-NMR (CDCI3; 300 MHz): 5 8,40 (3H, bs, NH3CI), 7,79 (2H, d,<3>J=8,0 Hz, " m" p-TSA), 7,34 (5H, m, CH^, 7,14 (2H, d,<3>J=8,0 Hz, ("o" p-TSA), 5,16 (2H, s, CHgPh), 2,38 (3H, s, CH^ p-TSA), 1,57 (6H, s, [CH3J2C)

<13>C-NMR (CDCI3; 75 MHz): 5 21,8 (CH3, p-TSA), 23,9 ([CH3]2C), 57,8 (C[CH3]2), 68,3 (CH2Ph), 126,55, 128,5, 128,8, 129,0, 129,3 (CH?Pft+p-TSA), 135,4 (" ipso", CH2Ph), 140,8 ("p", p-TSA), 141,9 (" ipso", p-TSA), 171,9 (COOCH2Ph).

Hydrokloridsalt:<1>H-NMR (CDCI3; 300 MHz): 5 9,10 (3H, bs, NH3CI), 7,41-7,31 (5H, m, CH2P/?), 5,27 (2H, s, CH^), 1,77 ([CH^C).

<13>C-NMR (CDCI3; 75 MHz): 5 24,2 ([C^J2C), 58,0 (C[CH3]2), 68,5 (CH2Ph), 128,62, 129,0, 129,1 ("o", "m", "p", CHzPh), 135,2 ("opso", CHzP/t), 171,8 (COOCH2Ph).

Syntese av gemicitabin-[fenyl-(benzoksy-L-alaninyl)]-fosfat. C25H27F2N4O8P, MV = 580,47 (CPF 1).

Dette ble syntetisert ifølge standardprosedyre 5, ved anvendelse av gemicitabin (131 mg, 0,5 mmol), fenyl-(benzoksy-L-alaninyl)-fosforkloridat (529 mg, 1,5 mmol), NMI (4,42 mmol, 300^l) i THF/pyridin (4/2 ml) i 2 t. Råproduktet ble deretter renset ved kolonnekromatografi ved eluering med CH2CI2/metanol 95:5 for å gi det rene produktet som et hvitt skumaktig fast stoff (46 mg, utbytte 16<%>)<.>

<31>P-NMR (MeOD, 121 MHz): 5 5,05, 4,94.

<1>H-NMR (MeOD, 300 MHz): 5 7,6-7,5 (1H, 2d,<3>J=7Hz, H-6), 7,4-7,2 (10H, m, OPh+ CH2Ph), 6,25 (1H, m, H-T), 5,95 (1H, 2d,<3>J=7 Hz, H-5), 5,19 (1H, 2s, CHgPh), 4,55-4,1 (3H, m, H-3', H-4', CHala), 4,05 (2H, m, H-5'), 1,20 (3H, 2t,<3>J=6Hz, CH3ala).

<13>C-NMR (MeOD, 75 MHz): 5 20,8, 20,7 (CH3ala), 52,2, 52,0 (CHala), 6,61 (C-5'), 68,4 (CH2Ph), 71,9, 71,3 (C-3'), 80,6 (C-4'), 85,9 (C-T), 97,1 (C-5), 121,8, 121,6 ("o", OPh), 123 (C-2'), 126,2 ("p". OPh), 131,8, 130,0, 129,7 ("m" OPh, Bn),

137,9 (" ipso", CU2Ph), 142,7, 142,6 (C-6), 152,5, 152,4 (" ipso", OPh), 158,2 (C-2), 168,0 (C-4), 175,3, 174,9 (COOBn).

Syntese av gemcitabin-[para-klorfenyl-(benzoksy-L-alaninyl)]-fosfat. C25H26CIF2N4080, MV=614,92 (CPF 2).

Dette ble syntetisert ifølge standardprosedyre 5, ved anvendelse av gemicitabin (131 mg, 0,5 mmol), para-klorfenyl-(benzoksy-L-alaninyl)-fosforkloridat (582 mg, 1,5 mmol), NMI (4,42 mmol, 300^l) i THF/pyridin (4/2 ml) i 2 t. Råproduktet ble deretter renset ved kolonnekromatografi ved eluering med CH2Cl2/metanol 95:5 for å gi det rene produktet som et hvitt skumaktig fast stoff (76 mg, utbytte 25 %).

<31>P-NMR(MeOD, 121 MHz): 5 5,08.

<1>H-NMR (MeOD, 300 MHz): 5 7,65 (1H, 2d,<3>J=7Hz, H-6), 7,5-7,2 (9H, m, OP£+CH2Ph), 6,2 (1H, m, H-1'), 5,9 (1H, 2d,<3>J=7Hz, H-5), 5,12 (1H, 2s, Ctf^Ph), 4,6-4,1 (3H, m, H-3', H-4', CHala), 4,05 (2H, m, H-5'), 1,45-1,35 (3H, 2t,<3>J=6Hz, CH3ala).

<13>C-NMR (MeOD, 75 MHz): 5 20,9, 20,7 (CH3ala), 52,2, 52,0 (CHala), 66,4, 66,2 (C-5'), 68,5 (CH2Ph), 71,5 (C-3'), 80,7 (C-4'), 86,4 (C-1'), 97,2 (C-5), 123,5 ("o", OPh), 126,9 (C-2'), 131,2, 130,6, 130,3 ("m" OPh, Bn), 131,9 ("p'\ OPh) 137,5 (" ipso", CHzP/t), 142,8, 142,7 (C-6), 151,4, 151,0 (" ipso", OPh), 158,2 (C-2), 166,9 (C-4), 175,1, 174,9 (COOBn).

Syntese av gemcitabin-[para-klorfenyl-(benzoksy-a,a-dimetylglysinyl)]-fosfat (CPF 3).

C26H28CIF2N4O8P, MV = 628,95.

Dette ble syntetisert ifølge standardprosedyre 5, ved anvendelse av gemicitabin (131 mg, 0,5 mmol), para-klorfenyl-(benzoksy-a,a-dimetylglysinyl)-fosforkloridat (603 mg, 1,5 mmol), NMI (4,42 mmol, 300^l) i THF/pyridin (4/3 ml) i 21. Råproduktet ble deretter renset ved kolonnekromatografi ved eluering med CH2Cl2/metanol 95:5 for å gi det rene produktet som et hvitt skumaktig fast stoff (163 mg, utbytte 52%).

<31>P-NMR(MeOD, 121 MHz): 5 3,56, 3,52.

<1>H-NMR (MeOD, 300 MHz): 5 7,55 (1H, 2d,<3>J=7Hz, H-6), 7,4-7,15 (9H, m, OPh+ CH9Ph), 6,25 (1H, m, H-1'), 5,85 (1H, 2d,<3>J=7 Hz, H-5), 5,15 (1H, 2s, Ctf^Ph), 4,55-4,1 (3H, m, H-3', H-4'), 4,05 (2H, m, H-5'), 1,50 (6H, m,<3>J=6Hz, 2CH3dimetylgly).

<13>C-NMR (MeOD, 75 MHz): 5 28,2, 28,0 (CH3dimetygly), 58,6 (Cq dimetygly), 66,2, 66,1 (C-5'), 66,7 (CH2Ph), 71,5 (C-3'), 80,6 (C-4'), 86,4 (C-1'), 97,0 (C-5), 123,9 , 123,6 ("o", OPh), 127,3 (C-2'), 130,0, 129,7 ("m", OPh, Bn)m 131,8 ("p", OPh), 137,6 (" ipso", CHzPh), 142,8, 142,7 (C-6), 151,2, 151,1 (" ipso", OPh), 158,1 (C-2), 167,9 (C-4), 176,8, 176,7 (COOBn).

Syntese av fenyl-(metoksy-L-alaninyl)-fosforkloridat.

Ci0H13CINO4P, MV = 277,64.

Dette ble syntetisert ifølge standardprosedyre 4, ved anvendelse av L-alaninmetylesterhydroklorid (2 g, 14,3 mmol), fenyldiklorfosfat (3,02 g, 2,14 ml, 14,3 mmol), og TEA (2,9 g, 4,0 ml, 28,7 mmol) i DCM (60 ml), for å gi 3,91 g av råproduktet anvendt uten ytterligere rensing.

31P-NMR(CDCI3, 121 MHz): 5 9,28, 8,97.

<1>H-NMR (CDCI3; 300 MHz): 5 7,39-7,34 (2H, m, "o", OPh), 7,29-7,20 (2H, m, "m+p" OPh), 4,98 (1H, bs, NH), 4,27-4,09 (1H, m, CHala), 3,78 (3H, s, OCH3), 1,52-1,49 (3H, 2xd,<3>J=7Hz, CA^ala).

<13>C-NMR (CDCI3; 75 MHz): 5 20,9 (CH3ala), 51,0 (CHala), 53,6 (OCH3), 120,9 ("o" OPh), 126,4 ("p", OPh), 130,2 ("m", OPh), 150,1 (" ipso", OPh), 173,6 (COOCH3).

Syntese av fenyl-(etoksy-L-alaninyl)-fosforkloridat.

C11H15CIN04P, MV = 291,67.

Dette ble syntetisert ifølge standardprosedyre 4, ved anvendelse av L-alaninetylesterhydroklorid (770 mg, 5,01 mmol), fenyldiklorfosfat (1,12 g, 5,01 mmol, 749^l), og TEA (1,4 ml, 10,02 mmol) i DCM (40 ml). Råproduktet ble renset ved flashkromatografi (etylacetat/petroleumeter 7:3) ved å gi 1,02 (69 %) olje.

31P-NMR(CDCI3, 121 MHz): 5 9,49, 9,07.

<1>H-NMR (CDCI3; 300 MHz): 5 7,39-7,34 (2H, m, "o", OPh), 7,29-7,20 (2H, m, "m+p" OPh), 4,95 (1H, bs, Ntf), 4,3-4,1 (3H, m, OCH2CH3, CHala), 1,50 (3H, 2xd,<3>J=7 Hz, CHaala), 1,30 (3H, t,<3>J=7,1Hz, OCH2CH3).

<13>C-NMR (CDCI3, 75 MHz): 5 14,5 (CH3CH2), 20,9 (CH3ala), 51,0 (CHala), 62,6 CH3CH2), 120,9 ("o" OPh), 126,5 ("p", OPh), 130,1 ("m", OPh), 1501, (" ipso", OPh), 175,1 (COOCH2CH3).

Syntese av fenyl-(benzoksy-L-alaninyl)-fosforkloridat.

C16H17CINO4O, MV = 353,74.

Dette ble syntetisert ifølge standardprosedyre 4, ved anvendelse av L-alaninbenzylesterhydroklorid (1,0 g, 4,64 mmol), fenyl-diklorfosfat (980 mg, 0,69 ml, 4,64 mmol), og TEA (0,94 g, 1290^l, 9,27 mmol) i DCM (40 ml). Råproduktet ble renset ved flashkromatografi (etylacetat/petroleumeter 6:4) som gir 1,61 (98 %) olje.

31P-NMR(CDCI3, 121 MHz): 5 9,41, 9,23.

<1>H-NMR (CDCI3; 300 MHz): 5 7,41-721 (10H, m, OPh+ CH2Ph), 5,24 (2H, s, CH?Ph), 4,95-4,88 (1H, bs, NH), 4,36-4,15 (1H, m, CHala), 1,52-1,49 (3H, 2xd,<3>J=7Hzm CHaala).

<13>C-NMR (CDCI3; 75 MHz): 5 20,8 (CH3ala), 51,1 (CHala), 68,0 (CH2Ph), 121,0 ("o" OPh), 126,4 (" p" OPh), 130,3, 129,0, 128,7 ("m"OPh, CH2Ph), 135,5 (" ipso", CH4Ph), 150,2 (" ipso", OPh), 172,9 (COOCH2Ph).

Syntese av p-nitrofenyl-(metoksy-L-alaninyl)-fosforkloridat.

C10H12CIN2O6P, MV = 322,64.

Dette ble syntetisert ifølge standardprosedyre 4, ved anvendelse av L-alaninmetylesterhydroklorid (0,70 g, 5,01 mmol), p-nitrofenyldiklorfosfat (1,362 g, 5,01 mmol), og TEA (1,4 ml, 10 mmol) i DCM (40 ml), for å gi 1,60 g (99 %) av råproduktet anvendt uten ytterligere rensing.

31P-NMR(CDCI3, 121 MHz): 5 9,13, 9,03.

<1>H-NMR (CDCI3; 300 MHz): 5 8,1 (2H, 2d,<3>J=8 Hz, OPh), 7,3 (2H, 2d,<3>J=8 Hz, OPh), 5,0 (1H, bs, Ntf), 4,1 (1H, m, CHala), 3,75 (3H, s, OCH3), 1,5-1,45 (3H, m, C^ala).

<13>C-NMR (CDCI3; 75 MHz): 5 20,8, 20,7 (CH3ala), 51,1, 50,9 (CHala), 53,2, 53,2 (OCH3), 121,8, 121,6 (" o" OPh), 126,5 (" m" OPh), 145,7 (" ipso", OPh), 154,7, 154,6 ("p", OPh), 173,4, 173,2 (COOCH3).

Syntese av p-nitrofenyl-(etoksy-L-alaninyl)-fosforkloridat.

CiiH14CIN206P, MV = 336,67.

Dette ble syntetisert ifølge standardprosedyre 4, ved anvendelse av L-alaninetylesterhydroklorid (770 mg, 5,01 mmol), p-nitrofenyldiklorfosfat (1,362 g, 5,01 mmol), og TEA (1,4 ml, 10,02 mmol) i DCM (40 ml), for å gi 1,64 g (98 %) av råproduktet anvendt uten ytterligere rensing.

31P-NMR(CDCI3, 121 MHz): 5 9,06, 8,81.

<1>H-NMR (CDCI3; 300 MHz): 5 8,1 (2H, m, OPh), 7,4 (2H, m, OPh), 4,9-4,7 (1H, bs, Ntf), 4,3-4,1 (3H, m, OCH2CH3, CHala), 1,55-1,45 (3H, 2xd,<3>J=7Hz, CHaala), 1,40 (3H, t,<3>J=7 Hz, OCH2CH3).

<13>C-NMR (CDCI3; 75 MHz): 5 14,5 (CH3CH2), 21,1, 20,9 (CH3ala), 51,2, 51,0 (CHala), 62,6_CH3CH2), 121,7, 121,3 ("o" OPh), 126,2, 126,0 (" rn", OPh), 145,7 (" ipso", OPh), 154,5 ("p" OPh), 173,4, 173,3 (COOCH2CH3).

Syntese av p-nitrofenyl-(benzoksy-L-alaninyl)-fosforkloridat. Ci6H16CIN206P, MV = 398,04.

Dette ble syntetisert ifølge standardprosedyre 4, ved anvendelse av L-alaninbenzylesterhydroklorid (1,08 g, 5,01 mmol), para-nitrofenyl-diklorfosfat (1,362 g, 5,01 mmol), og TEA (1,4 ml, 1,4 mmol) i DCM (40 ml) for å gi 1,85 g (93

%) av råproduktet anvendt uten ytterligere rensing.

31P-NMR(CDCI3, 121 MHz): 5 9,15, 9,06.

<1>H-NMR (CDCI3; 300 MHz): 5 8,15 (2H, m, OPh), 7,45 (2H, m, OPh), 7,35-7,25 (5H, m, CH2Ph), 5,2 (2H, 2s, CH?Ph). 5,00 (1H, bs, Ntf), 4,2 (1H, m, CHala), 1,64 (3H, 2xd,<3>J= 7Hz, CHaala).

<13>C-NMR (CDCI3; 75 MHz): 5 20,8 (CH3ala)m 51,1 (CHala), 68,0 (CH2Ph), 121,4 ("o"OPh), 126,1 ("m"0Ph), 130,3, 129,0 ( CH2Ph), 145,7 (" ipso"), CH2Ph), 150,2 (" ipso", OPh), 154,6 ("p", OPh), 172,9 (COOCH2Ph).

Syntese av p-fluorfenyl-(metoksy-L-alaninyl)-fosforkloridat. CioH12CIFN04P, MV = 295,63.

Dette ble syntetisert ifølge standardprosedyre 4, ved anvendelse av L-alaninmetylesterhydroklorid (0,70 g, 5,01 mmol), p-fluorfenyldiklorfosfat (1,210 g, 5,01 mmol), og TEA (1,4 ml, 10 mmol) i DCM (40 ml). Det rå ble renset ved flashkromatografi (etylacetat/petroleumeter 7:3) for å gi 1,11 g (75 %) av olje.

31P-NMR(CDCI3, 121 MHz): 5 9,98, 9,96.

<1>H-NMR (CDCI3; 300 MHz): 5 7,1 (2H, m, OPh), 6,95 (2H, m, OPh), 5,0 (1H, bs, Ntf), 4,25-4,1 (1H, m, CHala), 3,78 (3H, 2s, OCH3), 1,55 (3H, m, CWgala).

<13>C-NMR (CDCI3; 75 MHz): 5 20,8 (CH3ala), 51,1, 50,9 (CHala), 53,3 (OCH3), 117,1, 117,0 (" o" OPh), 122,6, 122,5 (" rn", OPh), 146,0 (" ipso", OPh), 159,1, 159,0 (" p", OPh), 173,4, 173,2 (COOCH3).

Syntese av p-fluorfenyl-(etoksy-L-alaninyl)-fosforkloridat.

CnH14CIFN04P, MV = 309,66.

Dette ble syntetisert ifølge standardprosedyre 4, ved anvendelse av L-alaninetylesterhydroklorid (770 mg, 5,01 mmol), p-fluorfenyldiklorfosfat (1,210 g, 5,01 mmol), og TEA (1,4 ml, 10,02 mmol) i DCM (40 ml). Det rå ble renset ved flashkromatografi (etylacetat/petroleumeter 7:3) for å gi 1,07 (69 %) av olje.

<31>P-NMR (CDCI3, 121 MHz): 5 10,04, 9,95.

<1>H-NMR (CDCI3; 300 MHz): 5 7,1 (2H, m, OPh), 6,95 (2H, m, OPh), 5,0 (1H, bs, NH), 4,25-4,1 (3H, m, OCH2CH3, CHala), 1,55 (3H, m, CHgala), 1,40 (3H, t,<3>J=7 Hz, OCH2CH3).

<13>C-NMR (CDCI3; 75 MHz): 5 14,5 (CH3CH2), 21,1, 21,0 (CH3ala), 51,2, 51,1 (CHala), 62,6_CH3CH2), 117,3 ("o" OPh), 122,2, 212,0 ("m", OPh), 145,9, 145,8 (" ipso", OPh), 159,0 ("p", OPh), 173,6, 173,5 (COOCH2CH3).

Syntese av p-fluorfenyl-(benzoksy-L-alaninyl)-fosforkloridat. Ci6H16CIFN04P, MV = 371,73.

Dette ble syntetisert ifølge standardprosedyre 4, ved anvendelse av L-alaninbenzylesterhydroklorid (1,08 g, 5,01 mmol), para-fluorfenyl-diklorfosfat (1,210 mg, 5,01 mmol), og TEA (1,4 ml, 1,4 mmol) i DCM (40 ml). Det rå ble renset ved flashkromatografi (etylacetat/petroleumeter 7:3) for å gi 1,599 (86 %) olje.

31P-NMR(CDCI3, 121 MHz): 5 9,15-9,06.

<1>H-NMR (CDCI3; 300 MHz): 5 7,35-7,25 (5H, m, CH2Ph), 7,1 (2H, m, OPh),

6,95 (2H, m, OPh), 5,2 (2H, 2s, CH?Ph). 5,00 (1H, bs, NH), 4,25-4,1 (1H, m, CHala), 1,55 (3H, m, Ctfaala).

<13>C-NMR (CDCI3; 75 MHz): 5 20,8 (CH3ala), 51,1, 51,0 (CHala), 68,1 (CH2Ph), 117,0, 116,9 ("o" OPh), 122,6 (" m" OPh), 130,3, 129,0 ( CH2Ph), 135,7 (" ipso", CH2Ph), 146,1, 146,0 (" ipso", OPh), 158,9 ("p", OPh), 173,1 (COOCH2Ph).

Syntese av 4-(trifluormetyl)-fenyl-(metoksy-L-alaninyl)-fosforkloridat. CiiH12CIF3N04P> MV = 345,64.

Dette ble syntetisert ifølge standardprosedyre 4, ved anvendelse av L-alaninmetylesterhydroklorid (1,0 g, 7,16 mmol), 4-(trifluormetyl)-fenyl-fosfodikloridat (1,998 g, 7,16 mmol), og TEA (1,449 g, 14,32 mmol, 1916^l) i DCM (30 ml), for å gi 2,202 g (89,0 %) av råproduktet anvendt uten ytterligere rensing.

31P-NMR(CDCI3, 121 MHz): 5 9,36, 9,22.

<1>H-NMR (CDCI3; 300 MHz): 5 7,66 (2H, d,<3>J=8,1Hz, OPh), 7,44-7,33 (2H, m, OPh), 5,10 (1H, bs, NH), 3,81-3,78 (3H, 2s, CH3O), 3,77-3,68 (1H, m, CH3CH), 1,56-1,52 (3H, m, CHCH3).

<13>C-NMR (CDCI3; 75 MHz): 5 20,6, 20,7 (CH3CH), 50,9, 51,1 (CHCH3), 53,2 (CH30), 121,4 ("o", OPh), 124,1 (CP3, J = 270 Hz), 128,0 ("m", OPh), 128,6 ("p", J = 34 Hz), 152,4, 152,6 (" ipso", OPh), 173,4, 173,5 (COOCH3).

Syntese av 4-(trifluormetyl)-fenyl-(etoksy-L-alaninyl)-fosforkloridat. C12H14CIF3N04>MV = 359,67.

Dette ble syntetisert ifølge standardprosedyre 4, ved anvendelse av L-alaninetylesterhydroklorid (1,0 g, 6,50 mmol), 4-(trifluormetyl)-fenyl-fosfodikloridat

(1,813 g, 6,50 mmol), og TEA (1,316 g, 13,00 mmol, 1740^l) i DCM (30 ml), for å gi 2,150 g (92,2 %) av råproduktet anvendt uten ytterligere rensing.

31P-NMR(CDCI3, 121 MHz): 5 9,33, 9,28.

<1>H-NMR (CDCI3; 300 MHz): 5 7,70 (2H, d,<3>J=8,2 Hz, OPh), 7,46-7,39 (2H, m, OPh), 4,78 (1H, bs, Ntf), 4,33-4,17 (3H, m, CH3Ctf20+CtfCH3), 1,59-1,55 (1H, m, CHCH3), 1,56-1,52 (3H, m, C^CH^).

<13>C-NMR (CDCI3; 75 MHz): 5 14,5 (CH3CH20), 20,8, 20,9 (CH3CH), 50,3, 50,9 (CHCH3), 62,3, 62,5 (CH3CH20), 121,4 ("o", OPh), 124,1 (CF3, J = 270 Hz), 127,7 (" m", OPh), 128,7 ("p", J= 33 Hz), 152,4 (" ipso", OPh), 172,9 (COOCH2CH3).

Syntese av p-trifluorfenyl-(benzoksy-L-alanin)-fosforkloridat. Ci7H16CIF3N04P, MV = 421,73.

Dette ble syntetisert ifølge standardprosedyre 4, ved anvendelse av L-alaninbenzylesterhydroklorid (1,08 g, 5,01 mmol), para-trifluorfeny-diklorfosfat (1,490 mg, 5,01 mmol), og TEA (1,4 ml, 1,4 mmol) i DCM (40 ml). Det rå ble renset ved flashkromatografi (etylacetat/petroleumeter 6:4) for å gi 1,80 (85 %) olje.

31P-NMR(CDCI3, 121 MHz): 5 9,11, 8,84.

<1>H-NMR (CDCI3; 300 MHz): 5 7,65 (2H, m, OPh), 7,4-7,2 (7H, m, CH2Ph+ 2H OPh), 5,25 (2H, 2s, CH?Ph), 4,75-4,55 (1H, bs, NH), 4,25-4,1 (CHala), 1,60-1,55 (3H, 2d,<3>J=7 Hz, CHaala).

<13>C-NMR (CDCI;75 MHz): 5 20,9 (CH3ala), 51,3, 51,0 (CHala), 68,2, 68,1 (CH2Ph), 121,4, 120,9 ("o", OPh), 125,2 (d, J=270 Hz, CF3), 126,6 (" m", OPh), 129,1, 128,8, 127,8 (Bn), 130,0 ("p", q, J=32 Hz, OPh), 135,4 (" ipso", CH2Ph), 153,0 (" ipso", OPh), 172,8 (COOCH2Ph).

Syntese av 4-klorfenyl-(metoksy-L-alaninyl)-fosforkloridat. C10H12CI2NO4P>MV = 312,09.

Dette ble syntetisert ifølge standardprosedyre 4, ved anvendelse av L-alaninmetylesterhydroklorid (1,0 g, 7,16 mmol), 4-klorfenylfosfordikloridat (1,757 g, 7,16 mmol), og TEA (1,449 g, 14,32 mmol, 1995^l) i DCM (30 ml), for å gi 1,621 g (72,5 %) av råproduktet anvendt uten ytterligere rensing.

31P-NMR(CDCI3, 121 MHz): 5 9,36, 9,07.

<1>H-NMR (CDCI3; 300 MHz): 5 7,35-7,15 (4H, m, OPh), 4,48-4,36 (1H, bs, Ntf), 4,22-4,04 (1H, m, CHCH3), 3,76-3,74 (3H, 2s, CH3O), 1,49-1,46 (3H, m, CHCH3).

<13>C-NMR (CDCI3; 75 MHz); 5 21,0 (CH3CH), 50,8, 51,1 (CHCH3), 53,4 (CH30), 121,9, 122,1, 122,3, 122,4 ("o", OPh), 130,6, 130,4, 130,2 ("m", OPh), 132,0 ("p", OPh), 148,6 (" ipso", OPh), 173,5 (COOCH3).

Syntese av 4-klorfenyl-(etoksy-L-alaninyl)-fosforkloridat.

C11H14CI2NO4P, MV = 326,11.

Dette ble syntetisert ifølge standardprosedyre 4, ved anvendelse av L-alaninetylesterhydroklorid (1,000 g, 6,50 mmol), 4-klorfenylfosfordiklorid (1,595 g, 6,50 mmol), og TEA (1,315 g, 13,00 mmol, 1810^l) i DCM (20 ml) for å gi 1,794 mg (utbytte 84,7 %) av produktet.

<31>P-NMR (CDCI3, 121 MHz): 5 9,54, 9,25.

<1>H-NMR (CDCI3; 300 MHz): 5 7,44-7,21 (4H, m, OPh), 4,59 (1H, bs, Ntf), 4,33-4,13 (3H, m, OCtf2CH3+CtfCH3), 1,57-1,56 (3H, m, CH3CH), 1,43-1,21 (3H, m, OCH2CH3).

<13>C-NMR (CDCI3; 75 MHz): 5 14,5, 14,6 (OCH2CH3), 21,0, 21,5 (CH3CH), 50,9, 51,2 (CHCH3), 62,4, 62,5 (OCH2CH3), 122,04, 122,3, 122,4 ("o", OPh), 130,4 ("m", OPh), 131,9 ("P/t), 148,5, 148,6 (" ipso", OPh), 173,0, 173,1 (COOCH2CH3).

Syntese av 4-nitrofenyl-(benzyl-2-amino-2-metylpropanoat)-fosforkloridat. Ci6H16Cl2N04P, MV =388,18.

Dette ble syntetisert ifølge standardprosedyre 4, ved anvendelse av L-alaninbenzylesterhydroklorid (1,000 g, 4,63 mmol), 4-klorfenylfosfodiklorid (1,136 g, 4,63 mmol), og TEA (937,0 mg, 9,26 mmol, 1290^l) i DCM (40 ml), for å gi 1534 mg (utbytte 86,5 %) av råproduktet anvendt uten ytterligere rensing.

31P-NMR(CDCI3, 121 MHz): 5 9,43, 9,16.

<1>H-NMR (CDCI3: 300 MHz): 5 7,42-7,08 (9H, m, OPh+ CH2Ph), 5,19 (2H, s, CH^Ph), 4,61-4,54 (1H, bs, NH), 4,26-4,10 (1H, m, CHCH3), 1,42-1,38 (3H, m, CH3CH).

<13>C-NMR (CDCI3; 75 MHz): 5 20,9, 21,0 (CH3CH), 51,0, 51,2 (CHCH3), 68,1, 68,2 (OCH2Ph), 122,3, 122,4 (" o", OPh), 128,8, 129,1, 130,4 ("o", "m", "p", CHiPh+ OPh), 131,9 (" ipso", CH2Ph), 135,3 ("p", OPh), 14,8,5 (" ipso", OPh), 172,7, 172,8 (COOCH2Ph).

Syntese avfenyl-(metyl-2-amino-2-metylpropanoat)-fosforkloridat. CiiH15CIN040, MV = 291,67.

Dette ble syntetisert ifølge standardprosedyre 4, ved anvendelse av 2-aminoisobutyratmetylesterhydroklorid (583,5 mg, 3,75 mmol), fenyldiklorfosfat (791,1 mg, 3,75 mmol, 560^l), og TEA (758,9 mg, 7,5 mmol, 1045^l) i DCM (20 ml), for å gi 1.041 g (95,2 %) av råproduktet anvendt uten ytterligere rensing.

<31>P-NMR (CDCI3, 121 MHz): 5 6,99 (s).

<1>H-NMR (CDCI3; 300 MHz): 5 7,41-7,17 (5H, m, OPh), 4,98 (1H, bs, Ntf), 3,80 (3H, s, OCH3), 1,71-1,69 (6H, 2s, [C^C.

<13>C-NMR (CDCI3; 75 MHz): 5 27,3, 27,2, 27,0 ([CH3]2C), 53,6 (OCH3), 58,8 (C[CH3]2), 120,0, 121,1, ("o" OPh), 126,2 ("p", OPh), 130,3 ("m", OPh) 145,7 ("p", OPh), 150,2, 150,3 (" ipso", OPh), 175,6, 175,7 (COOCH3).

Syntese forfenyl-(etyl-2-amino-2-metylpropanoat)-fosforkloridat. Ci2H17CIN04P, MV = 305,69.

Dette ble syntetisert ifølge standardprosedyre 4, ved anvendelse av 2-aminoisobutyratetylesterhydroklorid (628,6 mg, 3,75 mmol), fenyldiklorfosfat (791,1 mg, 3,75, 560^l), og TEA (758,9 mg, 7,5 mmol, 1045^l) i DCM (20 ml), for å gi 1,018 g, (88,8 %) av råproduktet anvendt uten ytterligere rensing.

<31>P-NMR (CDCI3, 121 MHz): 5 7,02 (s)

<1>H-NMR (CDCI3; 300 MHz): 5 7,23-7,37 (5H, m, OPh), 4,98 (1H, bs, NH)m 4,24 (2H, q,<3>J=7,1Hz, OCH2CH3), 1,70, 1,68 (6H, 2s, [CH^C), 1,30 (3H, t,<3>J=7,1Hz, OCH2CH3).

<13>C-NMR (CDCI3; 75 MHz): 5 14,5 (CH3CH20), 27,3, 26,9 ([CH3]2C), 58,7 (C[CH3]2), 62,7 (OCH2CH3), 121,1, 121,0 ("o", OPh), 127,6 ("p", OPh), 1307, ("m", OPh), 150,4 (" ipso", OPh), 175,2, 175,1 (COOCH2CH3).

Syntese avfenyl-(benzyl-2-amino-2-metylpropanoat)-fosforkloridat. Ci7H19CIN04P, MV = 367,76.

Dette ble syntetisert ifølge standardprosedyre 4, ved anvendelse av 2-aminoisobutyratbenzylesterhydroklorid (861,4 mg, 3,75 mmol), fenyldiklorfosfat (791,1 mg, 3,75, 560^l), og TEA (758,9 mg, 7,5 mmol, 1045^l) i DCM (30 ml). Det rå ble renset ved flashkromatografi (etylacetat/petroleumeter 6:4) for å gi 580 mg (42,2 %) olje.

<31>P-NMR (CDCI3, 121 MHz): 5 6,79 (s)

<1>H-NMR (CDCI3; 300 MHz): 5 7,45-7,27 (10H, m, OPh+ CHzPh), 5,28 (2H, s, CH<p>Ph), 4,81, 4,78 (1H, 2bs, NH), 1,78, 1,75 (6H, 2s, [CH^jC).

<13>C-NMR (CDCI3; 75 MHz): 5 27,3, 26,9 ([CH3]C), 53,9 (C[CH3]2), 60,9 (CH2Ph), 121,0, 126,3, 128,6, 129,0, 129,1, 130,3, 135,5 ( OPh, CH2Ph), 135,5 (" ipso", CH2Ph), 150,3, 150,2 (" ipso", OPh), 175,0, 175,2 (COOCH2Ph).

Syntese av 4-nitrofenyl-(metyl-2-amino-2-metylpropanoat)-fosforkloridat. CiiH14CIN206P, MV = 336,67.

Dette ble syntetisert ifølge standardprosedyre 4, ved anvendelse av 2-aminoisobutyratmetylesterhydroklorid (290,0 mg, 1,89 mmol), 4-nitrofenylfosfodiklorid (483,3 mg, 1,89 mmol), og TEA (382m5 mg, 3,78 mmol, 526,9 ul) i DCM (15 ml), for å gi 486 mg (utbytte 76,4 %) av råproduktet anvendt uten ytterligere rensing.

31P-NMR(CDCI3, 121 MHz): 5 6,61 (s)

<1>H-NMR (CDCI3; 300 MHz): 5 8,25 (2H, d,<3>J = 9,0 Hz, OPh), 7,43 (2H, d,<3>J = 9,0 Hz, OPh), 4,91-4,87 (1H, 2bs, NH), 3,79 (3H, s, OChk), 1,69-1,66 (6H, 2s,[Ctf^Q.

<13>C-NMR (CDCI3; 75 MHz): 5 27,0, 27,1, 27,3 ([CH3]2C), 53,8 (OCH3), 59,2 (C[CH3]2), 121,7, 121,8 ("o" OPh), 126,2 (" m", OPh), 145,7 (" p", OPh), 154,8, 154,7 (" ipso", OPh), 175,4, 175,6 (COOCH3).

Syntese av 4-nitrofenyl-(etyl-2-amino-2-metylpropanoat)-fosforkloridat. C12H16CIN206P, MV = 350,69.

Dette ble syntetisert ifølge standardprosedyre 4, ved anvendelse av 2-aminoisobutyratetylesterhydroklorid (270,0 mg, 1,61 mmol), 4-nitrofenylfodiklorid (412,3 mg, 1,61 mmol), TEA (325,8 mg, 3,22 mmol, 448,8^l) i DCM (15 ml), for å gi 500 mg (utbytte 88,5 %) av råproduktet anvendt uten ytterligere rensing.

<31>P-NMR (CDCI3, 121 MHz): 5 6,64 (s)

<1>H-NMR (CDCI3; 300 MHz): 5 8,35 (2H, d,<3>J=9,0Hz, OPh), 7,53 (2H, d,<3>J=9,0Hz, OPh), 4,99-4,96 (1H, 2bs, NH), 4,34 (2H, q,<3>J=7,1 Hz, OCH2CH3), 1,79-1,76 (6H, 2s, [ CH^ zC), 1,40 (3H, t,<3>J=7,1 Hz, OCHzCtfg).

<13>C-NMR (CDCI3; 75 MHz): 5 14,5 (OCH2CH3), 27,0, 27,3 ([CH3]2C), 59,1, 59,2 (C[CH3]2), 62,9, 63,0 (OCH2CH3), 121,7, 121,8 ("o" OPh), 126,2 ("m", OPh), 145,7 (" p", OPh), 154,7, 154,8 ("/pso", OPh), 175,4, 175,6 (COOCH2CH3).

Syntese av 4-nitrofenyl-(benzyl-2-amino-2-metylpropanoat)-fosforkloridat. C17H18CIN206P, MV = 412,76.

Dette ble syntetisert ifølge standardprosedyre 4, ved anvendelse av 2-aminoisobutyratbenzylester hydroklorid (578 mg, 2,52 mmol), 4-nitrofenylfosfodiklorid (645 mg, 2,52 mmol), og TEA (510 mg, 5,04 mmol, 702,5^l) i DCM (20 ml), for å gi 936 mg (utbytte 90,0 %) av råproduktet anvendt uten ytterligere rensing.

<31>P-NMR (CDCI3, 121 MHz): 5 6,56 (s)

<1>H-NM (CDCI3; 300 MHz): 5 8,29 (2H, d,<3>J=9,0Hz, OPh), 7,47 (2H, 3,<3>J=9,0Hz, OPh), 7,40-7,37 (5H, m, CH^), 5,27 (2H, s, CH^Ph), 5,04-5,01 (1H,

2bs, NH), 1,77-1,74 (6H, 2s, [C^J2C).

<13>C-NMR (CDCI3; 75 MHz): 5 27,0, 27,3 ([CH3]2C), 59,2 (C[CH3]2), 68,5 (OCH2Ph), 121,6, 121,7, 126,2, 128,6, 129,1 ("o", " m", " p", CH2Ph+ OPh), 135,7 (" ipso", CH2Ph), 145,7 ("p", OPh), 154,7, 154,8 (" ipso", OPh), 175,9 (COOCH2Ph).

Syntese av 4-klorfenyl-(metyl-2-amino-2-metylpropanoat)-fosforkloridat. CiiH14CI2N04P, MV = 326,11.

Dette ble syntetisert ifølge standardprosedyre 4, ved anvendelse av 2-aminoisobutyratmetylesterhydroklorid (280,0 mg, 1,82 mmol), 4-klorfenylfosfodiklorid (447,4 mg, 1,82 mmol), og TEA (368,3 mg, 3,64 mmol, 507,3 ul) i DCM (20 ml), for å gi 554 mg (utbytte 91,1 %) av råproduktet anvendt uten ytterligere rensing.

<31>P-NMR (CDCI3, 121 MHz): 5 7,05 (s)

<1>H-NMR (CDCI3; 300 MHz): 5 7,38 (2H, d,<3>J= 9,0 Hz, OPh), 7,28-7,24 (2H, 2d,<3>J=9,0Hz, OPh), 4,87-4,83 (1H, 2bs, Ntf), 3,84 (3H, s, OCH3), 1,73-1,71 (6H, 2s, [CHa]2C).

<13>C-NMR (CDCI3; 75 MHz): 5 27,0, 27,3 ([CH3]2C), 53,7 (OCH3), 58,9 (C[CH3]2), 122,5 ("o", OPh), 129,7 (" m", OPh), 131,8 ("p", OPh), 148,7, 148,9 (" ipso", OPh), 175,5, 175,7 (COOCH3).

Syntese av 4-klorfenyl-(etyl-2-amino-2-metylpropanoat)-fosforkloridat. Ci2H16Cl2N04P, MV = 340,14.

Dette ble syntetisert ifølge standardprosedyre 4, ved anvendelse av 2-aminoisobutyratetylesterhydroklorid (293,4 mg, 1,75 mmol), 4-klorfenylfosfodiklorid

(430,0 mg, 175 mmol), og TEA (354,2 mg, 3,50 mmol, 488,0^l) i DCM (15 ml) for å gi 571,7 mg (utbytte 96,1 %) av råproduktet anvendt uten ytterligere rensing.

<31>P-NMR (CDCI3, 121 MHz): 5 7,09 (s)

<1>H-NMR (CDCI3; 300 MHz): 5 7,38 (2H, d,<3>J=9,1Hz, OPh), 7,26 (2H, d,<3>J=9,1 Hz, OPh) m 4,88-4,84 (1H, 2bs, NH), 4,29 (2H, q,<3>J=7,1 Hz, OCH2CH2), 1,74-1,70 (6H, 2s, [CCH3JC), 1,35 (3H, t,<3>J=7,1 Hz, OCH2CH3).

<13>C-NMR (CDCI3; 75 MHz): 5 14,5 (OCH2CH3), 27,0, 27,3 ([CH3]2C), 58,9 (C[CH3]2), 62,8 (OCH2CH3), 122,5 ("o", OPh), 130,4 (" rn", OPh), 131,8 ("p", OPh), 148,7, 148,8 (" ipso", OPh), 175,1, 175,3 (COOCH2CH3).

Syntese av 4-klorfenyl-(benzyl-2-amino-2-metylpropanoat)-fosforkloridat. C17H18CI2NO4P, MV = 402,21.

Dette ble syntetisert ifølge standardprosedyre 4, ved anvendelse av 2-aminoisobutyratbenzylesterhydroklorid (402,0 mg, 1,75 mmol), 4-klorfenylfosfodiklorid (430 mg, 1,75 mmol), og TEA (354,2 mg, 3,50 mmol, 488,0 ul) i DCM (15 ml) for å gi 57,9 mg (utbytte 93,5 %) av råproduktet anvendt uten ytterligere rensing.

<31>P-NMR (CDCI3, 121 MHz): 5 7,00 (s)

<1>H-NMR (CDCI3; 300 MHz): 5 7,39.7,12 (9H, m, CH2P/7+ OPh), 2H, s, CHgPh), 4,75-4,72 (1H, 2bs, NH), 1,68-1,65 (6H, 2s, [CH^C).

<13>C-NMR (CDCI3; 75 MHz): 5 27,0, 27,3 ([CH3]2C), 59,0 (C[CH3]2), 68,4 (OCH2Ph), 122,5, 128,6, 129,1 130,7 ("o", " rn", "p", CH2Ph+ OPh), 131,8 ("p", CH2Ph), 135,4 (" p", OPh), 148,6, 148,7 (" ipso", OPh), 174,9, 175,1 (COOCH2Ph).

Syntese av 4-(trifluormetyl)-fenyl-(benzyl-2-amino-2-metylpropaoat)-fosforkloridat.

C18H18CIF3N04P, MV = 435,76.

Dette ble syntetisert ifølge standardprosedyre 4, ved anvendelse av 2-aminoisobutyratbenzylesterhydroklorid (341,0 mg, 1,49 mmol), 4-(trifluormetyl)-fenyl-fosfodikloridat (414,3 mg, 1,49 mmol), og TEA (300,5 mg, 2,97 mmol, 413,9Hl) i DCM (15 ml), for å gi 623,9 mg (96,4 %) av råproduktet anvendt uten ytterligere rensing.

<31>P-NMR (CDCI3, 121 MHz): 5 6,74 (s)

<1>H-NMR (CDCI3; 300 MHz): 5 7,66 (2H, d,<3>J=8,8 Hz, OPh), 7,42-7,30 (7H, m, OPh+ CH2Ph), 5,25 (2H, s, CH^Ph), 4,95-4,91 (1H, 2bs, NH), 1,75-1,72 (6H, 2s,

[ CH& C).

<13>C-NMR (CDCI3; 75 MHz): 5 26,9, 27,0, 27,3 ([CH3]2C), 59,1 (C[CH3]2), 68,4 (CH2Ph), 121,1, 121,4, 127,7, 128,4, 128,5, 128,6, 128,9 ("o", "m", "p", OPh+ CH2Ph), 124,2 (CF3, J = 265 Hz), 135,4 (" ipso", CHzPh), 152,6, 152,7 (" ipso", OPh), 174,9, 175,0 (COOCH2Ph).

Syntese av fenyl-(metoksy-a,a-sykloleucinyl)-fosforkloridat.

C13H17CIN04P>MV = 317,70.

Dette ble syntetisert ifølge standardprosedyre 4, ved anvendelse av metyl-1-amino-1-syklopentanoathydrokloridsalt (0,885 g, 5,01 mmol), fenyldiklorfosfat (1,12 g, 0,749 ml, 5,01 mmol), og TEA (1,4 ml, 10 mmol) i DCM (40 ml), for å gi 1,266 g, (81 %) av råproduktet anvendt uten ytterligere rensing.

31P-NMR(CDCI3, 121 MHz): 5 7,90.

<1>H-NMR (CDCI3; 300 MHz): 5 7,4-7,2 (5H, m, OPh), 4,3 (1H, bs, Ntf), 3,75 (3H, 2s, OCH3), 2,15 (4H, m, 4H syklopentan), 1,9-1,7 (4H, m, 4H syklopentan).

<13>C-NMR (CDCI3; 75 MHz): 5 24,4 (2CH2syklopent), 38,8, 38,7, 38,6 (2CH2syklopent), 53,3, 53,2 (CH30), 66,6 (Ca syklopentan), 121,1, 121,0 ("o" OPh), 126,3 ("p", OPh), 130,3, 130,2 ("m", OPh), 150,2 (" ipso", OPh), 174,8 (COOCH3).

Syntese av fenyl-(metoksy-L-fenylalaninyl)-fosforkloridat.

Ci6H17CIN04P, MV = 353,74.

Dette er syntetisert ifølge standardprosedyre 4, ved anvendelse av L-fenylalaninmetylesterhydroklorid (1,08 g, 5 mmol), fenyldiklorfosfat (1,12 g, 0,75 ml, 5 mmol), og TEA (1,4 ml, 10 mmol) i DCM (40 ml), for å gi 1,626 g (92 %) av råproduktet anvendt uten ytterligre rensing.

31P-NMR(CDCI3, 121 MHz): 5 9,1, 8,95.

<1>H-NMR (CDCI3; 300 MHz): 5 7,3-7,1 (10H, m, CH2Ph+ OPh), 5,00 (1H, bs, NH), 4,35 (1H, m, CHfenylala), 3,79 (3H, 2s, CH30), 3,00 (2H, m, CH2Ph)

<13>C-NMR (CDCI3; 75 MHz): 5 36,3 (CH2fenylalanin), 53,0 (CH3O), 56,6, 56,5 (CHfenylala), 121,0 ("o" OPh), 126,4 ("p", OPh), 130,2 (" m", OPh), 150,2 (" ipso", OPh), 174,1 (COOCH3).

Syntese av fenyl-(metoksy-L-leucinyl)-fosforkloridat.

C13H19CIN04P, MV = 319,72.

Dette er syntetisert ifølge standardprosedyre 4, ved anvendelse av L-leucinmetylesterhydroklorid (0,91 g, 5 mmol), fenyldiklorfosfat (1,12 g, 0,75 ml, 5 mmol), og TEA (1,4 ml, 10 mmol) i DCM (40 ml), for å gi 1,58 g (99 %) av

råproduktet anvendt uten ytterligere rensing.

31P-NMR(CDCI3, 121 MHz): 5 9,45, 9,35.

<1>H-NMR (CDCI3; 300 MHz): 5 7,4-7,2 (5H, m, OPh), 4,90 (1H, bs, Ntf), 3,95 (1H, m, CHCH2CH(CH3)2), 3,78 (3H, s, OCH3), 1,8 (1H, m, CHCH2CH(CH3)2), 1,8-1,5 (2H, m, CHCtf2CH(CH3)2), 1,0-0,9 (6H, m, CHCH2CH(Ctf3;2).

<13>C-NMR (CDCI3; 75 MHz): 5 23,2, 23,1, 22,4, 22,3 (2C, CHCH2CH(CH3;2), 24,9, 24,8 (CHCH2CH(CH3;2), 43,6 (CHCH2CH(CH3)2), 53,2 (CH30), 53,7, 53,6 (CHCH2CH(CH3)2), 120,9 ("o" OPh), 126,4 ("p", OPh), 130,2 (" rn", OPh), 150,1 (" ipso", OPh), 173,6 (COOCH3).

Syntese av fenyl-(benzoksy-L-leucinyl)-fosforkloridat.

C19H23CINO4P, MV = 395,83.

Dette er syntetisert ifølge standardprosedyre 4, ved anvendelse av L-leucinbenzylesterhydroklorid (1,29 g, 5,0 mmol), fenyl-diklorfosfat (1,12 g, 0,75 ml, 5,0 mmol), og TEA (1,4 ml, 10,0 mmol) i DCM (40 ml), for å gi 1,88 g (95 %) av råproduktet anvendt uten ytterligere rensing.

31P-NMR(CDCI3, 121 MHz): 5 9,93, 9,57.

<1>H-NMR (CDCI3; 300 MHz): 5 7,5-7,2 (10H, m, OPh+ CH2Ph), 5,2 (2H, 2s, CH<p>Ph), 4,95 (1H, bs, NH), 4,2-4,1 (1H, m, CHCH2CH(CH3)2), 1,95-1,80 (1H, m, CHCH2CH(CH3)2), 1,7 (2H, m, CHCtf2CH(CH3)2), 1,0-0,9 (6H, m, CHCH2CH(CH3;2).

<13>C-NMR (CDCI3; 75 MHz): 5 23,2, 23,1, 22,4, 22,3 (2C, CHCH2CH(Ctf3;2), 24,9 (CHCH2CH(CH3;2), 43,5 (CHCH2CH(CH3)2), 53,8, 53,3 (CHCH2CH(CH3)2), 67,8, 67,7 (CH2Ph), 120,7 ("o" OPh), 126,4 ("p", OPh), 130,2, 129,1, 128,8, 128,7 ("m"OPh, CH2P/7), 135,8 (" ipso", CH2Ph), 150,2 (" ipso", OPh), 174,1 (COOCH2Ph).

Syntese av p-nitrofenyl-(benzoksy-L-leucinyl)-fosforkloridat. Ci9H22CIN2060, MV = 440,81.

Dette er syntetisert ifølge standardprosedyre 4, ved anvendelse av L-leucinbenzylesterhydroklorid (1,08 g, 5,01 mmol), para-nitrofenyl-diklorfosfat (1,362 g, 5,01 mmol), og TEA (1,4 ml, 1,4 mmol) i DCM (40 ml), for å gi 2,08 g (95 %) av råproduktet anvendt uten ytterligere rensing.

31P-NMR(CDCI3, 121 MHz): 5 9,87, 9,38.

<1>H-NMR (CDCI3; 300 MHz): 5 8,25-8,10 (2H, m, OPh), 7,35-7,25 (7H, m, OPh + CH2Ph), 5,15 (2H, 2s, CH?Ph), 4,95 (1H, bs, NH), 4,15 (1H, m, CHCH2CH(CH3)2), 1,95 (1H, m, CHCH2CH(CH3)2), 1,7 (2H, m, CHCH2CH(CH3)2), 1,0-0,9 (6H, m, CHCH2CH(CH3;2).

<13>C-NMR (CDCI3; 75, MHz): 5 23,2, 23,1, 22,1, 22,0 (2C, CHCH2CH(CH3;2), 24,8 (CHCH2CH(CH3;2), 43,4, 43,3 (CHCH2CH(CH3)2), 54,2, 53,9 (CHCH2CH(CH3)2), 68,0, 67,9 (CH2Ph), 121,6 ("o" OPh), 126,2, 126,1 ("m"OPh), 129,2, 129,0 (CH2P/?), 135,4, 135,3 (" ipso", CH2Ph), 145,8, 145,7 (" ipso, OPh), 154,7, 154,5 ("p", OPh), 173,0, 172,8 (COOCH2Ph).

Syntese av p-klorfenyl-(benzoksy-L-leucinyl)-fosforkloridat.

C19H22CI2NO4P, MV = 430,26.

Dette er syntetisert ifølge standardprosedyre 4, ved anvendelse av L-leucinbenzylesterhydroklorid (0,664 g, 2,5 mmol), para-klorfenyl-diklorfosfat (0,613 g, 2,5 mmol), og TEA (0,7 ml, 5 mmol) i DCM (20 ml), for å gi 0,968 g (90 %) av råproduktet anvendt uten ytterligere rensing.

31P-NMR(CDCI3, 121 MHz): 5 9,71, 9,55.

<1>H-NMR (CDCI3; 300 MHz): 5 7,4-7,0 (9H, m, OPh + CH?Pft), 5,15 (2H, s,

CHpPh). 4,5 (1H, D,<3>J=7Hz, NH), 4,0 (1H, m, CHCH2CH(CH3)2), 1,9-1,8 (1H, m, CHCH2CH(CH3)2), 1,7 (2H, m, CHCH2CH(CH3)2), 0,85 (6H, m, CHCH2CH(CH3;2).

<13>C-NMR (CDCI3; 75 MHz): 5 23,4, 23,3, 22,5, 22,4 (2C, CHCH2CH(CH3;2), 25,0 (CHCH2Ctf(Ctf3;2), 43,8, 43,7 (CHCH2CH(CH3)2), 54,0, 53,8 (CHCH2CH(CH3)2), 68,2 (CH2Ph), 122,5 ("o" OPh), 130,5, 130,4, 129,3, 129,2 ("m"OPh, CH2Ph), 133,2 ("p", OPh), 135,7 (" ipso", CH2Ph), 149,9, 149,8 (" ipso", OPh), 173,4, 173,2 (COOCH2Ph).

Syntese av 4-klorfenyl-(metyl-2-amino-2-metylpropanoat)-fosforkloridat. C11H14CI2NO4P, MV=326,11.

Dette er syntetisert ifølge standardprosedyre 4, ved anvendelse av 2-aminoisobutyratmetylesterhydroklorid (280,0 mg, 1,82 mmol), 4-klorfenylfosfodiklorid (447,4 mg, 1,82 mmol), og TEA (368,3 mg, 3,64 mmol, 507,3^l) i DCM (20 ml), for å gi 554 mg (utbytte 91,1 %) av råproduktet anvendt uten ytterligere rensing.

<31>P-NMR (CDCI3, 121 MHz): 5 7,05 (s)

<1>H-NMR (CDCI3; 300 MHz): 5 7,38 (2H, d,<3>J=9,0Hz, OPh), 7,29-7,24 (2H, 2d,<3>J=9,0Hz, OPh), 4,87-4,83 (1H, 2bs, NH), 3,84 (3H, s, OCH^), 1,73-1,71 (6H, 2s, [CH3j2C).

<13>C-NMR (CDCI3; 75 MHz): 5 27,0, 27,3, ([CH3]2C), 53,7 (OCH3), 58,9 (C[CH3]2), 122,5 ("o", OPh), 129,7 (" m" OPh), 131,8 ("p", OPh) 148,7, 148,9 (" ipso", OPh), 175,5, 175,7 (COOCH3).

Syntese av 4-klorfenyl-fosfodikloridat.

C6H4CI302P, MV = 245,43.

Dette er syntetisert ifølge standardprosedyre 3, ved anvendelse av fosforoksyklorid (1,533 mg, 10,00 mmol, 932^l), 4-klorfenol (1,285 g, 10,00 mmol) og TEA (1,011 g, 10,00 mmol, 1394^l) i etyleter (100 ml) for å gi en olje (1,897 g, 77,3 % utbytte).

31P-NMR(CDCI3, 121 MHz): 5 5,18.

<1>H-NMR (CDCI3; 300 MHz): 5 7,45 (2H, d,<3>J=9,0 Hz, OPh), 7,30 (2H, d,<3>J=9,0 Hz, OPh).

<13>C-NMR (CDCI3; 75 MHz): 5 122,5 ("o", OPh), 130,6 (" m", OPh), 133,2 ("p", OPh), 148,5 (" ipso", OPh).

Syntese av 4-(trifluormetyl)-fenyl-fosfodikloridat.

C7H4CIF3O3P, MV = 278,98.

Dette er syntetisert ifølge standardprosedyre 3, ved anvendelse av fosforoksyklorid (1,570 mg, 10,24 mmol, 954,5^l) i etyleter (100 ml) for å gi en olje (2,521 g, 88,2 % utbytte).

31P-NMR(CDCI3, 121 MHz): 5 4,75.

<1>H-NMR (CDCI3; 300 MHz): 5 7,77 (2H, d,<3>J=8,4 Hz, OPh), 7,49 (2H, d,<3>J=8,4 Hz, OPh).

<13>C-NMR (CDCI3; 75 MHz): 5 121,6 ("o", OPh), 123,6 (CF3, J = 271 Hz, OPh), 128,2 (" m", OPh), 129,7 ("p", J = 33 Hz), 152,7 (" ipso", OPh).

Syntese av 4-fluorfenyl-fosfodikloridat.

C6H4Cl2F02P, MV = 228,97.

Dette er syntetisert ifølge standardprosedyre 3, ved anvendelse av fosforoksyklorid (1,395 ml, 15,00 mmol), 4-klorfenol (1,68 g, 15,00 mmol) og TEA (2,1 ml, 15,00 mmol) i etyleter (140 ml) for å gi en olje (3,96 g, 96 % utbytte).

31P-NMR(CDCI3, 121 MHz): 5 5,52.

<1>H-NMR (CDCI3; 300 MHz): 5 7,15 (2H, d,<3>J=8,0 Hz, OPh), 7,05 (2H, d,<3>J=8,0 Hz, OPh).

<13>C-NMR (CDCI3; 75 MHz): 5 116,8 ("o", OPh), 122,1 (" m", OPh), 146,7 ("p", OPh), 158,7 (" ipso", OPh).

Eksperimentelle data er gitt i tabell I som illustrerer aktiviteten til forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse og av noen sammenlignende forbindelser med hensyn på human brystcancercellelinje MDA MB231, human tarmcancercellelinj HT115 og human prostatacancercellelinje PC-3. Forbindelsene inkluderer de hvor fremstillingene derav er beskrevet ovenfor og forbindelser fremstilt ved preparative metoder som tilsvarer metodene beskrevet ovenfor.

De eksperimentelle prosedyrene anvendte human tarmcancercellelinje (HT115), human prostatacancercellelinje (PC-3), human brystcancercellelinje (MDA MB 231) og normal human navlestrengseneendotelial celle (HUVEC). Forbindelsene ble fortynnet over en rekke konsentrasjoner og tilsatt til celler i løpet av 1-3 dager. Cytotoksisiteten ble bestemt ved anvendelse av en MTT-analyse i slutten av hvert eksperiment.

I tabellen:

ArO refererer til Ar som definert ovenfor med hensyn på formel I;

J refererer til gruppen av foreliggende forbindelser representert henholdsvis av ROCOCR'R"NH-, som definert ovenfor med hensyn på formel I, og

B refererer til basegruppen ifølge foreliggende forbindelser som definert ovenfor med hensyn til formel I.

GemCyt står for gemcitabin.

Eksempel G er et sammenlignende eksempel.

Eksempel G er gemcitabin.

Gemcitabin (eksempel G i tabellen) og forbindelse CPF1 (eksempel 1 i

tabellen: gemcitabin-[fenyl-(benzoksy-L-alaninyl)]-fosfat) ble sammenlignet i musemodell med xenografter av human cancer (tarm HT115 og prostrat PC3).

Mus ble dosert daglig i et område av konsentrasjoner (0,01-10^m) og tumorvolum vurdert mot kontroll.

Kaplan-Meier-statistikk ble dataregistrert med hensyn på forekomst-fri overlevelse ("incident-free survival").

I vedlagte tegninger:

Fig. 1 viser for mus-xenograft tumorvolumet for prostatadata på dag 13 ved anvendelse av Gemzar™ (gemcitabin tilgjengelig eks. Lilly); Fig. 2 viser for mus-xenograft tumorvolum for prostatadata på dag 13 ved anvendelse av CPF1; Fig. 3 viser forekomst-fri overlevelsesfunksjoner v. dag for hver av CPF1 og gemcitabin; og Fig. 4 viser for muse-xenograft tumorvolum for tarmdata på dag 24 ved anvendelse av henholdsvis Gemzar og forbindelse CPF1.

Det refereres til tegningene, og CPF1 kan ses å være betydelig mindre toksisk enn gemcitabin.

CPF1 var signifikant effektiv til å redusere prostata og tarmtumorvolumet i forhold til kontrollen ved daglig dosering av 5 og 10 jam (3 og 6 jag/ml). Gemcitabin var ikke effektiv ved høyeste ikke-toksiske konsentrasjon.

Gemzar ses i fig. 1 å være toksisk over 1^m. I kontrast til dette fremgår det av fig. 2 at CPF1 har vesentlig lavere toksisitet.

Fig. 3 viser at CPF1 hadde betydelig lavere bivirkninger på et sammenlignbart grunnlag: 3 dyr viser alvorlig toksisitet (10 % kroppsmassetap) i

GMZ og i CPF1 på dag 10, kollektivt 4 i GMZ og 1 i CPF1 på dag 11 og 5 i GMZ og 1 i CPF på dag 13. Ved anvendelse av Chi square analyse ved kombinering av 5 og 10 grupper, er signifikans p=0,193, 0,078 og 0,0289 på dag 10, 11 og 13. Det er klart at innen dag 13 utviser CPF1 betydelig mindre bieffekter og anti-cancereffekter fortsetter å overskride det til Gemzar.

Fig. 3 viser Kaplan-Meier-overlevelseskurve, forekomst-fri overlevelse: basert på tapet ifølge vekttapet. En Cox-proporsjonsanalyse viser at CPF1 er mye mindre toksisk enn GMZ basert på vekttap beregnet tap (p=0,043).

CPF1 ble funnet å være aktiv ved 5^m in vitro, mens Gemzar ble funnet å være aktiv ved 600^m, med hensyn på den samme tarmcellelinjen. Fig. 4 viser resultater av testing av begge in vivo ved 5^m. Høyere aktivitet av CPF1 for redusering av tumorvolum er vist i fig. 4.

Claims (18)

1. Kjemisk forbindelse,karakterisert vedat den har formel I:

hvor: R er valgt fra gruppen omfattende Ci-Ci6acyklisk alkyl som kan være mettet eller umettet og eventuelt substituert med en til tre substituenter valgt fra aryl, hvor aryl er en aromatisk gruppe inneholdende 5 til 14 ringatomer, idet en, to, tre eller fire av ringatomene kan være heteroatomer uavhengig valgt fra gruppen bestående av O, N og S; R' og R" er uavhengig valgt fra gruppen omfattende H og C1-C16acyklisk alkyl som kan være mettet eller umettet; Q er valgt fra gruppen omfattende -O- og -CH2-; X og Y er uavhengig valgt fra gruppen omfattende H, F, Cl, Br, I, OH og metyl (-CH3); Ar er fenyl hvor en, to, tre eller fire substituenter valgt fra halogen kan eventuelt være tilstede på Ar; Z er H; og n er 0, Z' er -NH2og en dobbelt binding eksisterer mellom posisjon 3 og posisjon 4.

2. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert vedat R er valgt fra gruppen omfattende en C1-16primær eller sekundær alkylgruppe.

3. Forbindelse ifølge krav 2, karakterisert vedat R er valgt fra gruppen omfattende metyl (-CH3), etyl (-C2H5) og benzyl (-CH2C6H5).

4. Forbindelse ifølge krav 3, karakterisert vedat R er benzyl.

5. Forbindelse ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene,karakterisert vedat Ar er valgt fra gruppen omfattende -C6H5, pFC6H4-, pCIC6H4- og oCIC6H4-.

6. Forbindelse ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene,karakterisert vedat R' og R" er, uavhengig, valgt fra gruppen omfattende H, C1-6primær, sekundær og tertiær alkyl.

7. Forbindelse ifølge krav 6, karakterisert vedat R' og R" er, uavhengig, valgt fra gruppen omfattende H og metyl.

8. Forbindelse ifølge krav 7, karakterisert vedat R' og R" er hver metyl.

9. Forbindelse ifølge krav 7, karakterisert vedat én av R' og R" er H og én av R' og R" er metyl.

10. Forbindelse ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene,karakterisert vedat R' og R" tilsvarer sidekjedene til en naturlig forekommende aminosyre.

11. Forbindelse ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene,karakterisert vedatQerO.

12. Forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-11,karakterisert vedat hver av X og Y er F.

13. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert vedat den er valgt fra gruppen omfattende: Gemcitabin-[fenyl-(benzoksy-L-alaninyl)]-fosfat; Gemcitabin-[para-klorfenyl-(benzoksy-L-alaninyl)]-fosfat (CPF 40); og Gemcitabin-[ para-klorfenyl-(benzoksy-a,a-dimetylglysinyl)]-fosfat.

14. Forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-13,karakterisert vedat den er for anvendelse i en fremgangsmåte for behandling, fortrinnsvis for profylakse eller behandling av cancer.

15. Anvendelse av en forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-13, for fremstilling av et medikament for profylakse eller behandling av cancer.

16. Farmasøytisk sammensetning, karakterisert vedat den omfatter en forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-13 i kombinasjon med en farmasøytisk akseptabel bærer, et fortynningsmiddel eller en eksipient.

17. Fremgangsmåte for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning,karakterisert vedat den omfatter trinnet av å kombinere en forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-13 med en farmasøytisk akseptabel eksipient, en bærer eller et fortynningsmiddel.

18. Fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse med formel I ifølge krav 1,karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter omsetning av en forbindelse ifølge formel (III):

med en forbindelse ifølge formel (IV)

hvor Ar, n, Q, R, R', R", X, Y, Z' og Z har betydningene beskrevet i krav 1 og en dobbeltbinding eksisterer mellom posisjon 3 og posisjon 4.