NO300916B1 - Gassholdige hulpartikler - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår den gjenstand som

er kjennetegnet i patentkravene, dvs. nye, gassholdige hulpartikler som kan anvendes i ultralyddiagnostikken.

Det er kjent at det kan oppnås cardiale ekkokontraster med perifer injeksjon av løsninger, som inneholder fine gassbobler (Roelandt j. , Ultrasound Med. Biol. 8: 471-492, 1982).

Disse gassbobler oppnås i fysiologisk tålbare løsninger for eksempel ved rysting, annen omrøring eller ved tilsetning av carbondioxyd. De er imidlertid ikke enhetlige når det gjelder antall og størrelse og kan bare produseres utilstrekkelig.

De er som regel heller ikke stabilisert slik at deres varighet

er liten. Deres midlere diameter ligger for det meste over størrelsen av erythrocytter, slik at ingen lungekapillarpassasje med etterfølgende kontrastering av organer som venstre hjerte, lever, nyre eller milt er mulig. Dessuten egner de seg ikke for kvantifiseringer, da det ultralydekko som oppnås av disse er sammensatt av flere prosesser som ikke kan skilles fra hverandre som blærefremkomst, koalescens og oppløsning. Således er det for eksempel ikke mulig ved hjelp av disse ultralydkontrastmid-ler via målingen av kontrastforløpet i myokardium å oppnå utsagn om transitt-tider.

I EP 0 131 540 er stabiliseringen av gassbobler med sukker beskrevet. Dermed er riktignok reproduserbarheten og homogeniteten i kontrasteffekten forbedret, imidlertid klarer disse boblene ikke en lungepassasje.

I EP 0 122 624 og 0 123 235 beskrives det at den gass-boblestabiliserende effekt av sukkere, sukkeralkoholer og salter forbedres ved tilsetning av tensider. Ved hjelp av disse ultra-lydkontrastmidlene oppnås en lungekapillartilgjengelighet og muligheten for fremstilling av den arterielle kar-forgrening og forskjellige organer som lever eller milt. Kontrasteffekten er dermed imidlertid bare begrenset til karlumen, da boblene ikke opptas av vevscellene.

Ingen av de hittil kjente ultralyd-kontrastmidlene forblir uforandret i lengre tid i kroppen. En organfremstilling med tilstrekkelig signalintensitet ved selektiv anrikning etter intravenøs tilsetning eller kvantifiseringer er derfor ikke mulig.

En innkapsling av gasser, som f.eks. luft som ultra lyd-kontrastmidler, beskrives i DE-OS 38 03 972. Det herved anvendte veggmateriale består av bionedbrytbare, syntetiske materialer som fremfor alt cyanakrylat og polylactid.

Disse mikropartiklene er imidlertid, særlig i større målestokk såvel som med henblikk på deres opparbeidelse, vanske-lig fremstillbare. Således er fremfor alt partiklenes store størrelsesfordeling en ulempe.

Oppfinnelsen angår således gassholdige hulpartikler av et bionedbrytbart polyaldehyd som eventuelt inneholder en væske med et kokepunkt på mindre enn 60 °C og med en partikkeldiameter på fra 0,1 til 40 um, hvilke partikler er kjennetegnet ved at de kan erholdes ved tilsetning av en polymeriserbar aldehydmonomer, under omrøring ved en temperatur på fra -5 °C til +80 °C og en pH-verdi på fra 7 til 14, i løpet av fra 1 minutt til 24 timer til en vandig løsning som inneholder den ønskede gass og eventuelt væsken med et kokepunkt på mindre enn 60 °C, hvori konsentrasjonen av aldehydet, basert på reaksjonsblandingen, er fra 0,1 til 50% w/v,

og etter av polymerisasjon er blitt utført, separeres de gassholdige partikler fra ikke-gassholdige partikler og, om ønsket, deretter

(a) renses og/eller

(b) omsettes med en opp til ekvimolar mengde - basert på mengden av aldehyd - av vandig løsning inneholdende koblingsmiddel, under omrøring i opp til 3 dager ved en temperatur på fra 0 ° til 60 °C og en pH-verdi på fra 3 til 9, og bindes deretter til bio- eller makromolekylet, eller

(c) bindes til bio- eller makromolekylet.

De polymeriserte aldehyder som hovedsakelig deltar

ved oppbyggingen av hulpartiklene, heretter kalt mikropartiklene, velges blant følgende, polymeriserbare aldehyder: I. a,(i-umettede aldehyder, som for eksempel acrolein

crotonaldehyd

propynaldehyd

II. a-substituerte acroleinderivater, som for eksempel oc-methylacrolein

a-kloracrolein

a-fenylacrolein

oc-ethylacrolein

oc-isopropylacrolein

a-n-butylacrolein

a-n-propylacrolein

III. Dialdehyder, som for eksempel glutaraldehyd, succinaldehyd eller deres derivater eller deres blandinger med tilsetninger som er istand til kopolymerisasjon, som for eksempel:

oc-substituerte acroleiner

|3-substituerte acroleiner

ethylcyanacrylater

methylcyanacrylater

butylcyanacrylater

hexylcyanacrylater

methyImetacrylater

vinylalkoholer

akrylsyrer

methakrylsyrer

akrylsyreklorider

methakrylsyreklorider

akrylnitril

methakrylnitriler

akrylamider

substituerte akrylamider

hydroxymethylmethakrylater

mesityloxyd

dimethylaminoethylmethakrylater-2-vinylpyridiner

N-vinyl-2-pyrrolidinon

Foretrukket er derved acrolein og glutaraldehyd.

De tensider som eventuelt deltar i oppbyggingen av mikropartiklene, velges blant ionogene eller ikke-ionogene, overflateaktive substanser (tensider), som for eksempel polyethylenoxyd polyoxyethylenpolyoxypropylener som Pluronic<®>F 68, Pluronic<®>F 108, Pluronic<®>F 127, polyethylenglykol, Poloxamin 908, Polaxamer 407

carboxylsyresalter, som for eksempel: natriumoleat polyoxyethylenfettsyreestere, som for eksempel: polyoxyethylenstearat

natriumdioktylsulfosuccinat

polyglutaraldehydnatriumhydrogensulfitt-addukt polyacrolein-natriumhydrogensulfitt-addukt

polyvinylsulfonsyre

De kan anvendes alene eller i form av deres blandinger.

Foretrukket av disse er: polyglutaraldehydnatrium-sulfitt-addukt, polyacrolein-natriumhydrogensulfitt-addukt, Pluronic<®>F 68, Pluronic<®>F 108 og Pluronic<®>F 127.

Dersom de polymeriserbare aldehyder som anvendes for oppbygging av mikropartiklene har overflateaktive egenskaper,

er anvendelsen av tensidene ikke nødvendig. Som eksempel på slike aldehyder skal glutaraldehyd nevnes.

Som gass henholdsvis lettflyktige væsker, foretrukket er herved væsker med et kokepunkt under 60° C, som skal inneholdes i mikropartiklene i fri eller bundet form, er blant annet egnet:

ammoniakk

luft

edelgasser (helium, neon,

argon, xenon, krypton)

svovelhalogenider, som for eksempel: svovelhexafluorid, hydrogen

carbonoxyder

oxygen

hydrogen,

hydrocarboner eller deres blandinger, som for eksempel:

methan

ethan

propan

butan

pentan

neopentan

isopentan

cyklopentan

ethylen

propylen

acetylen

3,3-dimethyl-l-butyn

2,3-pentadien

2-methy1-2-buten 2-methyl-l,3-butadien 2-butyn

2- methyl-l-buten 3- methyl-l-buten,

halogenerte hydrocarboner eller blandinger, som for eksempel: methylenklorid 1,1-diklorethylen isopropylklorid dibromdifluormethan

brommethan,

ethere, som for eksempel: dimethylether, diethylether eller fluorerte ethere,

eller forbindelser som for eskempel: dimethylaminoaceton propylenoxyd N-ethylmethylamin N-ethyldimethylamin

furan.

Foretrukket av disse er: luft, argon, xenon, svovelhexafluorid, propan, butan og furan.

Som koblingsmidler som deltar i oppbyggingen av mikropartiklene, er fremfor alt egnet: I.Aminogruppeholdige forbindelser, som for eksempel: hydroxylamin

butylamin

allylamin

ethanolamin tr i shydroxymethylaminomethan 3-amino-l-propansulfonsyre 5-aminovaleriansyre 8-aminooktansyre D-glucosaminhydroklorid aminogalactose aminosorbitt aminomannitt diethylaminoethylamin

anilin

sulfonylsyreamid cholin

N-methylglucamin piperazin

1,6-hexandiamin urea

hydrazin

glycin

alanin

lysin

serin

valin

leucin

peptider

proteiner<:>

albumin

humanserumalbumin polylysin

gelatiner

polyglykolaminer aminopolyalkoholer dextransulfater med aminogrupper N-aminopolyethylenglykol (HO-PEG-NH2) N,N'-diaminopolyethylenglykol (NH2-PEG-NH2) antistoffer

immunoglobuliner

II. Syregruppeholdige forbindelser, som for eksempel: carboxylsyrer eddiksyre

propionsyre smørsyre

valeriansyre capronsyre caprylsyre caprinsyre laurinsyre myristinsyre

palmitinsyre stearinsyre oljesyre linolsyre linolensyre cyklohexancarboxylsyre fenyleddiksyre benzoyleddiksyre klorbenzoesyre benzoesyre nitrobenzoesyre ortho-fthalsyre meta-fthalsyre para-fthalsyre salicylsyre hydroxyben z oe syre aminobenzoesyre methoxybenzoesyre

(PEG-linker-asparaginsyre)

PEG-linker-glutaminsyre PEG-linker-DTPA

PEG-linker-EDTA III: HydroxygruppehoIdige forbindelser, som for eksempel: alkoholer methanol ethanol propanol butanol pentanol hexanol heptanol octanol decanol dodecanol tetradecanol hexadecanol

octadecanol

isopropylalkohol

isobutylalkohol

isopentylalkohol

cyklopentanol

cyklohexanol

crotylalkohol

benzylalkohol

fenylalkohol

difenylmethanol

trifenylmethanol

kanelalkohol

ethylenglykol

1,3-propandiol

glycerol

pentaerytritol

IV. Polymeriserbare substanser, som oe, |B-umettede aldehyder, som for eksempel:

acrolein

crotonaldehyd

propynaldehyd

oc-substituerte acroleinderivater, som for eksempel:

ot-me thy lacro lein

a-kloracrolein

a-fenylacrolein

oc-ethylacrolein

a-isopropylacrolein a-n-butylacrolein cx-n-propy lacro lein

Dialdehyder, som for eksempel: glutaraldehyd, succinaldehyd eller deres derivater eller deres blandinger med tilsetninger som er istand til kopolymerisasjon, som for eksempel: oc-substituerte acroleiner

(3-substituerte acroleiner ethylcyanakrylater

methylcyanakrylater

butylakrylater

hexylcyanakrylater

methylmetakrylater

vinylalkoholer

akrylsyrer

methakrylsyrer

akrylsyreklorider

akrylnitril

methakrylnitriler

akrylamider

substituerte akrylamider

hydroxymethyImethakrylater

mesityloxyd

dimethylaminoethylmethakrylater-2-vinylpyridiner N-vinyl-2-pyrrolidinon

Foretrukket av disse er: hydroxylamin, trishydroxy-methylaminomethan, 3-amino-l-propansulfonsyre, D-glucosaminhydroklorid, aminomannitol, urea, humanalbumin, hydrazin, proteiner, polyglykolamin, aminopolyalkoholer som for eksempel HO-PEG-NH2 eller NH2-PEG-NH2eller syregruppeholdige forbindelser som for eksempel PEG-linker-asparaginsyre, PEG-linker-glutaminsyre, PEG-linker-DTPA og PEG-linker-EDTA, hvorved molekylvekten av polyethylenglykolen (PEG) ligger opp til 100 000 d, fortrinnsvis under 40 000 d.

De koblingsmidler som er nevnt under I., er over sin aminogruppe kondensert til de formylgrupper som befinner seg på overflaten av de mikropartikler som er oppbygget av polymeriserte aldehyder og eventuelt tensider.

Bundet via formylgruppene er likeledes de monomerer som er oppført under IV., som er polymerisert med ytterligere monomerer.

De syrer og alkoholer som er nevnt under II. og III., er derimot tilkoblet til mikropartiklene først etter forhånds-omdannelse av aldehydfunksjonen.

Ved valg av egnede bio- eller makromolekyler, som for eksempel enzymer, dextraner, immunoglobuliner, monoklonale antistoffer (se nedenfor) som er bundet via disse koblingsmidler, oppnås mikropartiklene ifølge oppfinnelsen, som oppviser en overraskende høy vevs- og organspesifisitet.

Mikropartiklene ifølge oppfinnelsen inneholder eventuelt diagnostisk eller terapeutisk virksomme bestanddeler for diagnose og terapi av tumorer, som for eksempel

doxorubicin

actinomycin

magnetitt

mitomycin C

triamcinolon.

Mikropartiklene ifølge oppfinnelsen oppviser de inn-ledningsvis nevnte, ønskede egenskaper. De kan fremstilles enkelt og med høyt utbytte. En forstørrelse av målestokken ved fremstillingen (up-scaling) er likesom rensingen av mikropartiklene, problemløs.

Partiklene oppviser en smal størrelsesfordeling (monodispers). Det er derved mulig å variere størrelsen av partiklene over et stort område avhengig av anvendt konsentrasjon av utgangsstoffene (se nedenfor). Ved styring av frem-stillingsbetingelsene (for eksempel pH-verdi) er det mulig også å variere molekylvekten innenfor store områder.

En ytterligere fordel består i at reaksjonen for syntese av mikropartiklene kan utløses ved hjelp av mange muligheter, eksempelvis: anionisk polymerisasjon ved pH-forandring, kationisk polymerisasjon med for eksempel jernsalter, radikal polymerisasjon med UV-lys og ved ioniserende stråling.

Det vide temperaturområde (-5 til +80° C) som er mulig for fremstillingen av mikropartiklene, gir en enkel styring av forsøket med optimale utbytter med meget forskjellige gasser hhv. lettkokende væske.

Partiklene inneholder frie aldehydgrupper, som ved kjemiske reaksjoner kan knyttes kovalent til andre molekyler. Denne muligheten tillater å forandre partikkeloverflatens egenskaper målrettet, uten å påvirke de ekkogene egenskaper. Ved valg av egnede molekyler kan den kolloidale stabilitet påvirkes. Spesielt hindres derved agglomerering som er et hyppig opptre-dende fenomen for kolloidale systemer. Dette er igjen av stor fordel for utviklingen av en stabil formulering.

Ved siden av påvirkningen på stabiliteten foreligger det muligheter for å forandre partikkeloverflaten slik at en "drug-targeting" er mulig. Dette skjer ved tilkobling av egnede bio- eller makromolekyler (for eksempel monoklonale antistoffer), som bevirker en høy vevs- og organspesifisitet (G. Gregoriadis,

G. Poste "Targeting of Drugs", Plenum Press 1988, New York) eller ved påvirkning av partiklenes overflateegenskaper ved adsorpsjon av molekyler (f.eks. tensider).

I avhengighet av valget av disse molekyler og av størrelsen til mikropartiklene kan det oppnås en partikkelanrik-ning i/på tumorer hhv. for eksempel i lungen, leveren, milten og i knokkeImargen. Anrikningen i knokkelmargen oppnås spesielt derved at små partikler (< 100 nm) belegges med for eksempel Poloxamer 407. Dersom partiklene er belagt med Poloxamin 90 8, overvinnes RES-systemet av disse partikler, og de forblir i blodkretsløpet (blood pool agent).

Ved hjelp av deler som er koblet med antistoffer, kan det oppnås en anrikning av partiklene i/på tumorer.

En aktiv "targeting" kan også gjennomføres med mikropartikler som inneholder magnetitt. Ved hjélp av et mag-netfelt som pålegges utenfra, anrikes partiklene på de ønskede steder i det intravasale system. Det oppnås herved en mulighet for å undersøke strømningsforholdene for eksempel i blodkar.

Ved hjelp av partikler som er ladet med magnetitt,

er det også mulig lokalt å oppnå høye temperaturer ved hjelp av et magnetisk vekselfelt som innstråles utenfra. Dette lar seg utnytte terapeutisk, for eksempel ved ødeleggelse av tumorer (hypertermi-terapi). Foruten anvendelse av et magnetisk vekselfelt kan det anvendes et ultralydfelt. Også herved oppnås det lokalt sterke temperaturøkninger.

Fremstillingen av mikropartiklene ifølge oppfinnelsen foregår ved at en vandig løsning som inneholder 0 til 40 %, fortrinnsvis 0,01 til 10 % vekt/volum tensid(er) og 0 til 10 % vekt/volum diagnostisk eller terapeutisk virksomme bestanddeler og gasser eller lettflyktige væsker under omrøring ved en temperatur fra -5 til +80° C, fortrinnsvis 0 til 40° C, en pH-verdi på 7 - 14, fortrinnsvis 9 - 13, i løpet av 1 minutt til 24 timer, fortrinnsvis 1 time til 10 timer, og eventuelt under innledning av gass omsettes med kopolymeriserbare aldehyder til en konsentrasjon beregnet på reaksjonsblandingen på 0,1 til 50 %, fortrinnsvis 3 - 20 % vekt/volum, såvel som med kopolymeriserbare tilsetninger i en konsentrasjon beregnet på reak-sjonsløsningen på 0 - 20 %, fortrinnsvis 1 til 5 % vekt/volum, med tverrbindere med en konsentrasjon beregnet på reaksjonsblandingen på 0 - 5 %, fortrinnsvis 0,1 - 1 % vekt/volum,

hvoretter de således oppnådde mikropartikler, eventuelt etter rensing, omsettes med en vandig løsning som, beregnet på aldehyd-mengden, inneholder opp til ekvimolare mengder av koblingsmiddel såvel som 0 til 20 %, fortrinnsvis 0,01 til 10 % vekt/volum, tensid(er) beregent på totalvolumet, under omrøring i opp til 3 dager, fortrinnsvis opp til 2 dager, ved temperaturer fra 0 til 60° C, fortrinnsvis 5 til 30° C, ved en pH-verdi fra 3 til 9, fortrinnsvis 5 til 8, og, om ønsket etter rensing, bindes disse eventuelt til bio- eller makromolekyler.

De polymeraldehyd-partikler som oppnås etter det før-ste reaksjonstrinn, har aldehydgrupper på overflaten. Ved hjelp av disse aldehydgrupper kan de reaksjoner gjennomføres som er typiske for aldehyder (R.C. Schulz, Kolloidzeitschrift und Zeitschrift fur Polymere, 182 (1-2), 99 (1961); Lehrbuch der organischen Chemie "Organikum", VEB Verlag der Wissenschaften, Berlin, 1984). Derved er det mulig å tilkoble molekyler på partikkeloverflaten som forandrer overflateegenskapene.

Eksempler på mulige reaksjoner for aldehydgruppenei .

- reduksjon til alkohol

- oxydasjon til syrer

- oximering

- imindannelse, eventuelt fulgt av hydrering og eventuelt etter-følgende N-alkylering

- hydrazondannelse, eventuelt fulgt av hydrering

- mercaptalisering

- acetalisering

- disproporsjonering med NaOH (Cannizzaro-reaksjon)

- aldolkondensasjon

Koblingen av aminogruppehoIdige molekyler til de partikler som er dannet i det første reaksjonstrinn, foregår ved omsetning med aldehydgruppen. Herved velges eksempelvis følgende eksperimentelle betingelser: 1000 mg polyacrolein-partikler suspenderes i 50 ml destillert vann. Til denne partikkelsuspensjon tilsettes 5000 mg av den substans som skal omsettes, og omrøres ved romtemperatur. Røringen må gjennomføres tilsvarende omsetningens reaks jonshastighet, ved langsomme reaks jonshastigheter opp til 48 timer. Partikkelsuspensjonen dialyseres deretter (Cut off 10000 d).

Dersom de substituenter (eventuelt midlertidig beskyttede) som f.eks. er innført ved hjelp av de ovenfor angitte reaksjoner, inneholder funksjonelle grupper, så kan disse omdannes til egnede reaktive grupper for kobling til bio- eller makromolekyler ved hjelp av fremgangsmåter som er kjent for fagmannen. Foretrukne slike grupper er eksempelvis maleimidobenzoyl-, 3-sulfomaleimido-benzoyl-, 4-(maleimidomethyl)-cyklo-hexylcarbonyl-, 4-[3-sulfo-(maleimido-methyl)-cyklohexyl-carbonyl-, 4-(p-maleimidofenyl)-butyryl-, 3-(2-pyridyl-dithio)-propionyl-, methacryloyl-(pentamethylen)-amido-, bromacetyl-, jodacetyl-, 3-jodpropyl-, 2-bromethyl-, 3-mercaptopropyl-, 2-mercaptoethyl-, fenylenisothiocyanat, 3-aminopropyl-, benzyl-ester-<-, ethylester-, t-butylester, amino-, C^-Cg-alkylamino-, amino-carbonyl-, hydrazino-, hydrazinocarbonyl-, maleimido-, methacrylamido-, methacryloylhydrazinocarbonyl-, maleimidamido-carbonyl-, halogen-, mercapto-, hydrazinotrimethylenhydrazino-carbonyl-, aminodimethylenamido-carbonyl-, bromcarbonyl-, fenylendiazonium-, isothiocyanat-, semicarbazid-, thiosemi-carbaz id-, isocyanat-gruppen.

En aminogruppe kan eksempelvis omdannes til en iso-thiocyanatgruppe ved hjelp av metoder som er kjent fra litteraturen (f.eks. med thiofosgen i et tofasesystem, S. Scharma, Synthesis 1978, 803, D.K. Johnson, J. Med. Chem. 1989, Vol, 32, 236) .

Ved omsetning av en aminofunksjon med et halogen-eddiksyrehalogenid kan det genereres en a-halogenacetamidgruppe (JACS 1969, Vol. 90, 4508; Chem. Pharm, Bull. 29 (1), 128, 1981), som på samme måte som f.eks. isothiocyanatgruppen er egnet for kobling til bio- og makromolekyler.

Som substituenter som kan overføres til en funksjonell gruppe som er egnet for en binding til et makro- eller biomolekyl, er blant annet hydroxy- og nitrobenzyl-, hydroxy- og carboxyalkyl- såvel som thioalkylrester med opp til 20 carbonatomer egnet. De omdannes ved hjelp av litteraturfremgangsmåter som er kjent for fagmannen [Chem. Pharm. Bull. 33, 674 (1985), Compendium of Org. Synthesis Vol. 1-5, Wiley and Sons, Inc., Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, bind VIII, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, J. Biochem. 92, 1413 (1982)] til de ønskede substituenter (for eksempel med amino-, hydrazino-, hydrazinocarbonyl-, epoxyd-, anhydrid-, methakryloylhydrazino-carbonyl-, måleimidamidocarbonyl-, halogen-, halogencarbonyl-, mercapto-, isothiocyanatgruppen som funksjonell gruppe), hvorved det i tilfelle av nitrobenzylresten først må foretas en katalyt-tisk hydrering (f. eks. etter P.N. Ry lander, Catalyt ic.~Hydrogena-tion over Platinum Metals, Academic Press 1967) til aminobenzyl-derivatet.

Eksempler på omdannelsen av hydroxy-, eller aminogrupper som er bundet til aromatiske eller alifatiske rester, er de omsetninger som er gjennomført i egnede løsningsmidler som tetrahydrofuran, dimethoxyethan eller dimethylsulfoxyd, vandige tofasesystemer, som f.eks. vann/diklormethan, i nærvær av en syreoppfanger som for eksempel natriumhydroxyd, natriumhydrid eller alkali eller jordalkalicarbonater som f.eks. natrium-, magnesium-, kalium-, calsiumcarbonat eller poly-(4-vinylpyridin) Reillex<®>ved temperaturer mellom 0° C og kokepunktet for det aktuelle løsningsmiddel, fortrinnsvis imidlertid mellom 20 og 60° C, med et substrat med den generelle formel I

hvori Nf står for en nucleofug som f.eks. Cl, Br, J, CH^C^H.SO-,

J b 4 J • eller CF^SO^, L for en alifatisk, aromatisk, arylalifatisk, forgrenet, lineær eller cyklisk hydrocarbonrest med opp til 20 carbonatomer og Fu for den ønskede funksjonelle gruppe, eventuelt i beskyttet form (DE-OS 34 17 413) .

Som eksempler på forbindelser med den generelle formel I skal nevnes

Br(CH2)2NH2, Br(CH2)3OH, BrCH2COOCH3, BrCI^CO^Bu, ClCH2CONHNH2,

Br(CH2)4C02C2H5,BrCH2COBr, BrCH2<C>ONH2, ClCH2COOC2<H>5,

BrCH2CONHNH2,

CF3S03(CH2)3Br, BrC<H>2C<=>CH, BrCH2CH=CH2>

BrCH2C6H4NCS.

Omdannelse av carboxy-grupper kan for eksempel gjennomføres ved hjelp av carbodiimid-metoden (Fieser,Reagents for Organic Syntheses 10, 142), over et blandet anhydrid [Org. Prep. Proe. Int. 7, 215 (1975)] eller over en aktivert ester (Adv. Org. Chem. del B, 472).

De således oppnådde mikropartikler som bærer koblingsmidler, kan også være knyttet til bio- eller makromolekylene, av hvilke er kjent at de særlig anrikes i det organ eller den organdel som skal undersøkes. Slike molekyler er eksempelvis enzymer, hormoner, polysaccharider som dextraner eller stivelser, porfyriner, bleomyciner, insulin, prostaglandin, steroidhormoner, aminosukker, aminosyrer, peptider som polylysin, proteiner (som f.eks. immunoglobuliner, monoklonale antistoffer, lektiner), lipider (også i form av liposomer) og nukleotider av DNA- eller RNA-typen. Særlig skal fremheves konjugater med albuminer, som humanserumalbumin, antistoffer, som f.eks. monoklonale antistoffer som er spesifikke for tumorassosierte antigener eller antimyosin. Istedenfor biologiske makromolekyler kan også egnede, syntetiske polymerer som polyethyleniminer, polyamider, polyurea, polyethere som polyethylenglykoler og polythiourea tilknyttes. De herav dannede, farmasøytiske midler egner seg eksempelvis for anvendelse i tumor- og infarkt-diagnostikken såvel som tumor-terapien. Monoklonale antistoffer (som f.eks. Nature 256, 495, 1975) har de fortrinn overfor polyklonale antistoffer, at de er spesifikke for en antigen determinant,

har en definert bindingsaffinitet, er homogene (dermed blir deres renfremstilling vesentlig enklere) og kan fremstilles i store mengder i cellekulturer. Som slike er f.eks. monoklonale antistoffer henholdsvis deres fragmenter Fab og Ffab'^ egnet for tumorpåvirkning, som f.eks. er spesifikk for humane tumorer i gastrointestinaltrakten, brystet, leveren, blæren, kjønns-kjertlene og av melanomer [Cancer Treatment Repts. 68, 317,

(1984), Bio Sei 34, 150, (1984)] eller er rettet mot carcinom-embryonalt antigen (CEA) , humant choriogonadotropin ((3-HCG) eller andre tumorstående antigener, som glycoproteiner [New Engl. J. Med. 298, 1384, (1973), US-P 4 331 647]. Egnet er blant annet også anti-myosin-, . anti-insulin- og anti-fibrin-antistoffer (US-P 4 036 945).

Coloncarcinomer kan påvises diagnostisk ved hjelp av mikropartikkel-konjugater med antistoffet 17-1A (Centocor, USA).

Når det gjelder antistoff-konjugater må bindingen av antistoffet til mikropartikkelen ikke føre til tap eller minskning av bindingsaffiniteten og bindingsspesifiteten av antistoffet til antigenet. Dette kan enten foregå ved binding til carbohydrat-andelen i Fc-delen av glycoproteinet hhv. i Fab-eller F(ab<1>)2-fragmentene eller ved binding til svovelatomene i antistoffet hhv. antistoff-fragmentene.

I det første tilfelle må det først gjennomføres en oxidativ spaltning av sukkerenhetene for generering av koblings-dyktige formylgrupper. Denne oxydasjon kan foretas på kjemisk måte med oxydasjonsmidler som f.eks. perjodsyre, natriummeta-perjodat eller kaliummetaperjodat ved hjelp av metoder som er kjent fra litteraturen (f.eks. J. Histochem and Cytochem. 22, 1084, 1974) i vandig løsning i konsentrasjoner fra 1 til 100, fortrinnsvis 1 til 20 mg/ml, og en konsentrasjon av oxydasjons-midlet mellom 0,001 og 10 mmol, fortrinnsvis 1 til 10 mmol, i et pH-område fra ca. 4 til 8 ved en temperatur fra 0 og 37° C

og en reaksjonsvarighet mellom 15 minutter og 24 timer. Oxyda-sjonen kan også foregå enzymatisk, eksempelvis ved hjelp av

galaktoseoxidase, i en enzymkonsentrasjon fra 10 til 100 enheter/ ml, en substratkonsentrasjon fra 1 til 20 mg/ml, ved en pH-verdi fra 5 til 8, en reaksjonsvarighet fra 1 til 8 timer og en temperatur mellom 20 og 40° C (f.eks. J. Biol. Chem. 234, 445, 1959).

Til de aldehyder som er generert ved oxydasjon bindes mikropartikler med egnede funksjonelle grupper, som f.eks. hydrazin, hydrazid, hydroxylamin, fenylhydrazin, semicarbazid og thiosemicarbazid, ved reaksjon mellom 0 og 37° C, ved en reaksjonsvarighet fra 1 til 65 timer, en pH-verdi mellom ca.

5,5 og 8, en antistoffkonsentrasjon fra 0,5 til 20 mg/ml og et molart forhold mellom kompleksdanner og antistoffaldehyder på

1:1 til 1000:1. Den etterfølgende stabilisering av konjugatet foregår ved reduksjon av dobbeltbindingen, f.eks. med natrium-borhydrid eller natriumcyanoborhydrid. Reduksjonsmidlet anvendes derved i et overskudd på 10 til 100 ganger (f.eks. J. Biol. Chem. 254, 4359, 1979).

Den andre muligheten for dannelse av antistoff-konjugatet utgår fra en skånende reduksjon av disulfid-broene i immunoglobulin-molekylet. Herved spaltes de mere følsomme disulfid-broer mellom H-kjedene i antistoff-molekylet, mens S-S-bindingene i det antigendannende område blir intakte, slik at det praktisk talt ikke inntrer noen minskning av bindingsaffiniteten og -spesifiteten av antistoffet (Biochem. 18, 2226, 1979, Handbook of Experimental Immunology, Vol. 1, 2. utgave, Blackwell Scientific Publications, London 1973, Kapittel 10). Disse frie sulfhydrylgrupper i interH-regionene omsettes så med egnede funksjonelle grupper i mikropartiklene ved 0 - 3 7° C, en pH-verdi på ca. 4 - 7 og en reaksjonsvarighet fra 3 til 72 timer under dannelse av en kovalent binding, som ikke påvirker antistoffets antigen-bindingsområde. Som egnede, reaktive grupper skal eksempelvis nevnes: halogenalkyl-, halogenacetyl-, p-mercuribenzoat-, isothiocyanat-, thiol-, epoxydgrupper såvel som grupper, som skal underkastes en Michael-addisjonsreaksjon, som f.eks. maleinimid, methakrylogrupper (f.eks. J. Amer. Chem. Soc. 101, 3097, 1979).

FOr sammenknytning av antistoffragmentene med mikropartiklene finnes det i tillegg en rekke egnede, ofte også kommersielt tilgjengelige, bifunksjonelle "linkere" (se f.eks. Pierce, Handbook and GeneralCatalogue 1986), som er reaktive såvel overfor SH-gruppene i fragmentene som også for amino- hhv. hydrazinogruppene i mikropartiklene.

Som eksempler skal nevnes: m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester (MBS), m-maleimidobenzoyl-N-sulfosuccinimidester (Sulfo-MBS), N-succinimidyl-[4-(jodacetyl)-aminoIbenzoesyreester (SIAB), succinimidyl-4 (N-maleiitiidomethyl) -cyklohexan-l-carboxylsyre ester (SMCC),

succinimidyl-4(p-maleimidofenyl)-smørsyreester (SMPB), N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionsyreester (SDPD),

4-[3-(2,5-dioxo-3-pyrrolinyl)-propionyloxy]-3-oxo-2,5-difenyl-2,3-dihydro-thiofen-l,1-dioxyd,

acetylalanylleucylalanylamino-benzyl,

acetamido-p-thioureidobenzy1.

Det kan også anvendes bindinger av ikke-kovalent art for kobling til bio- eller makromolekylet, hvorved såvel ioniske som også van der Waals- og hydrogenbro-bindinger kan bidra i vekslende andeler og styrke (nøkkel-lås-prinsipp) (f.eks. avidin-biotin, antistoff-antigen). Også inneslutningsforbindelser (vert-gjest) av mindre komplekser i større kaviteter hos makromolekylet er mulig.

Koblingsprinsippet består i først å fremstille et bifunksjonelt makromolekyl, idet enten et antistoff-hybridom som er rettet mot et tumorantigen fusjoneres ved et andre anti-stof f-hybridom som er rettet mot mikropartiklene ifølge oppfinnelsen eller begge antistoffene sammenknyttes med hverandre kjemisk via en linker (eksempelvis på den måte som er angitt i J. Amer. Chem. Soc. 101, 3097 (1979) eller det antistoff som er rettet mot tumorantigenet bindes til avidin (hhv. biotin) over en linker [D.J. Hnatowich et al., J. Nucl. Med. 28, 1294 (1987)]. Istedenfor antistoffene kan også deres tilsvarende F(ab)- hhv. F(ab')2~fragmenter anvendes. For den farmasøytiske anvendelse injiseres først det bifunksjonelle makromolekyl, som anrikes på målstedet, og så i tidsavstand mikropartiklene ifølge oppfinnelsen [eventuelt bundet til biotin (hhv. avidin)], som tilkobles til målstedet in-vivo og der kan utfolde sin diagnostiske eller terapeutiske virkning. Utover dette kan også andre koblings-metoder komme til anvendelse, som eksempelvis den "Reversible Radiolabeling" som er beskrevet i Protein Tailoring Food Med. Uses [Am. Chem. Soc. Symp.] (1985), 349.

Med den såkalte fastfase-kobling står en særlig enkel metode for fremstilling av antistoff-konjugater hhv. antistoff-fragment-konjugater til disposisjon: Antistoffet kobles til en stasjonær fase (f.eks. en ioneveksler), som f.eks. befinner seg i glassøyle. Ved suksessiv spyling av søylen med en løsning som er egnet for generering av aldehyd-grupper, vasking, spyling med en løsning av de funksjonaliserte mikropartikler, vasking og endelig eluering av konjugatet oppnås meget høye konjugat-utbytter.

Denne fremgangsmåte muliggjør den automatiske og kontinuerlige produksjon av vilkårlige mengder konjugater.

Også andre koblingstrinn kan gjennomføres på denne måte.

Således kan det for eksempel fremstilles fragment-konjugater ved hjeip av sekvensen papain-reduksjon/bifunksjonell linker/funksjonaliserte mikropartikler.

De således dannede forbindelser renses deretter, fortrinnsvis kromatografisk.

Det kan fremstilles partikler med en størrelse fra 0,1 - 40 um. Partikkelstørrelsen kan påvirkes vesentlig ved variasjon av utgangskonsentrasjonen av monomer, tensid og pH-verdi.

Eksempler på fremstilling av partikler av bestemt størrelse:

Dersom disse betingelser velges, oppnås partikler med en midlere diameter på 750 nm.

Ved disse betingelser oppnås partikler med en midlere diameter på 40 um. 3.) Ved samme betingelser som oppført under 2.), men imidlertid ved en acroleinkonsentrasjon på 10 % (vekt/volum) oppnås partikler med en midlere diameter på 8 um. 5.) Ved samme betingelser som under 4.), bare ved en pH-verdi på 9 oppnås en midlere partikkelstørrelse på 3,2 pm.

Som tensid anvendes polyglutaraldehydnatriumhydrogensulfitt-addukt (PGL).

Istedenfor polyglutaraldehydnatriumhydrogensulfitt-adduktet (PGL) kan også polyacroleinnatriumhydrogensulfitt-adduktet (PAC-SO^) anvendes, uten at det kan oppdages noen påvirkning på partikkelstørrelsen.

Syntese av PGL:

En 25 %-ig vandig løsning av glutaraldehyd renses ved hjelp av aktivt kull. Deretter befries løsningen fra C>2ved innledning av N2 i den vandige løsning. Videre innstilles en bufferløsning (fosfatbuffer, 1 molar) på pH = 11. Bufferløsnin-gen befries også fra C>2 ved innledning av N2. Bufferløsningen og glutaraldehydløsningen bringes sammen og polymeriseres i 72 timer under N2-atmosfære. Deretter filtreres polymerisatet og vaskes med aceton og vann. Det vaskede polymerisat tørkes i et vakuumtørkeskap ved 45° C. 5 g polyglutaraldehyd oppløses i 30 ml H20, som inneholder 12,5 g NaHSO^. Løsningen dialyseres med destillert H2<D. Deretter lyofiliseres løsningen.

Partiklene ifølge oppfinnelsen kan suspenderes i vandige løsninger uten at smådelene aggregeres. For fremstilling av en galenisk blanding som kan appliseres parenteralt, kan det anvendes vandige løsninger som inneholder isotoniserende tilsetninger som natriumklorid, sukkeralkoholer (mannitol, sorbitol, xylitol etc.) eller sukker (glukose, fruktose). For innstilling av pH-verdien kan det velges buffere som trometamol/ HC1, sitronsyre/NaOH etc.

Syntese av PAC-S03:

A. I en trehalset kolbe utstyrt med dråpetrakt og omrører innføres 100 ml destillert vann og vannet befries fra oxygen ved innledning av nitrogen. Deretter tilsettes 1,829 g K2S20g til dette vann og oppløses. Etter at K2S2°8 er fuHstendi9 oppløst, tilsettes 20 ml nydestillert acrolein til denne løsning. Deretter tilsettes 1,14 g AgNO^oppløst i 5 ml vann og polymeriseres under omrøring

i 2 timer. Det utfelte polymerisat frafiltreres, vaskes flere ganger med vann og resuspenderes deretter for fjerning av sølvioner i 1 time i 1 liter vann, i hvilket det er oppløst 1,63 g natriumthiosulfat. Polymerisatet fra-

filtreres og tørkes i et vakuumtørkeskap ved 45° C. Det tørkede polymerisat oppdeles grovt i en morter. 10 g oppdelt polymerisat oppløses i 100 ml natriumhydrogensulfitt (37 %). Deretter dialyseres løsningen mot destillert vann (avkutt 5000 d). Dialysatet anvendes som tensid for

fremstilling av polyacrolein-mikropartiklene.

B. I en rundkolbe anbringes 10 0 ml destillert vann. Under omrøring tilsettes 20 ml nydestillert acrolein. Deretter innstilles pH i reaksjonsbladingen på 10,5 ved tilsetning av NaOH-løsning (2 N) og blandingen polymeriseres under omrøring i 2 timer. Det utfelte polymerisat frafiltreres, vaskes flere ganger med vann og tørkes i et vakuumtørke-skap ved 45° C. 10 g polymerisat oppløses i 100 ml NaHS03-løsning (37 %). Løsningen dialyseres mot dobbelt-destillert vann (avkutt 5000 d). Resten anvendes som tensid ved fremstilling av polyacrolein-mikropartikler.

Eksempler

1.) I 100 ml av en blanding inneholdes:

2.) I 100 ml av en blanding inneholdes:

En oppløsning av partiklene kan hindres ved at partiklenes midlere tetthet tilpasses til det omgivende medium.

Dette kan oppnås ved tilsetning av substanser med høyere tetthet (røntgenkontrastmidler, magnetitt). Denne mulighet foreligger særlig hos partikler med lavt polyaldehydinnhold.

De farmasøytiske midler inneholder 0,1 ug - 100 mg mikropartikler/ml, fortrinnsvis 10 ug - 1 mg mikropartikler/ml galenisk blanding og doseres som regel i doser på 0,01 ml - 10 ml/kg, fortrinnsvis 0,1-1 ml/kg kroppsvekt. De er bestemt til enteral og parenteral applikasjon.

For anvendelse i hypertermi-terapien anvendes de farmasøytiske midler som regel i mengder på 0,001 - 10 mg, fortrinnsvis 0,01 - 1 mg pr. g tumor.

De etterfølgende eksempler skal forklare oppfinnelsen uten å begrense den til disse.

Fremgangsmåter for fremstilling av kontrastmidler

1. Reaksjonstrinn:

A) En tensidholdig (0,01 - 5 % vekt/volum), vandig løsning avkjøles under omrøring ved 0° C. Samtidig innføres en gass i løsningen. Løsningens pH-verdi innstilles på den ønskede pH-verdi (fortrinnsvis 9-13) med NaOH. Til denne løsning tilsettes monomeren henholdsvis monomerblandingen. Etter 30 minutters forløp reduseres omrøringshastigheten. Etter 1 time fortynnes reaksjonsblandingen med den ovenfor angitte, tensidholdige, vandige løsning. Omrøringshastig-heten senkes ytterligere. Etter 4 timer dekanteres de utfelte, ikke gassholdige mikropartikler fra den øvrige suspensjon og kastes. Den dekanterte suspensjon dialyseres for å fjerne restmonomerer fra kontrastmidlet.

Utbytte: 80 - 90 %

B) En vandig løsning som inneholder det ønskede tensid- og monomermengde, avkjøles til 0° C. Samtidig innledes den ønskede gass gjennom løsningen under omrøring. Deretter innstilles pH-verdien i løsningen fortrinnsvis på 9 - 13 med NaOH. Etter 1 time fortynnes reaksjonsblandingen. Etter 3-4 timer skilles suspensjonen som inneholder mikropartiklene fra det utfelte polymerisat, som kastes. Suspensjonen renses ved dialyse.

Utbytte: 80 - 90 %

Eksempel 1

91 ml 0,5 %-ig, vandig tensidløsning innføres i en kolbe. Løsningens pH-verdi innstilles på 11 méd 0,2 N NaOH-løsning. N2innledes gjennom løsningen. Til den 0,5 %-ige tensidløsning som er avkjølt til 0 C, tildryppes 9,5 ml nydestillert acrolein. Etter 1 time tilsettes ytterligere 100 ml 0,5 %-ig tensidløsning til reaksjonsblandingen. Etter 3 timer dekanteres suspensjonen som inneholder mikropartiklene, fra den utfelte polymer og renses ved dialyse.

Eksempel 2

82 ml 0,08 %-ig, vandig tensidløsning tilsettes til en kolbe. Løsningen avkjøles til 0° C. Til den avkjølte løs-ning tildryppes 18 ml nydestillert acrolein. Argon innledes i løsningen under omrøring. Etter 1 time innstilles pH-verdien i løsningen på 12 med en 0,2 N NaOH-løsning. Etter 2 timer tilsettes 100 ml 0,08 %-ig tensidløsning. Etter 3 timer dekanteres suspensjonen og dialyseres.

Eksempel 3

70 ml 0,0 8 %-ig, vandig tensidløsning som inneholder 10 % dimethylformamid, tilsettes til en kolbe. Løsningens pH-verdi innstilles på 11,5 med 0,2 N NaOH-løsning. Løsningen avkjøles til 0° C. Samtidig innføres N2i løsningen. Til denne løsning tildryppes 30 ml nydestillert acrolein. Etter 1 time tilsettes 100 ml 0,08 %-ig tensidløsning til løsningen. Etter 4 timer skilles suspensjonen fra de utfelte polymerer og renses.

Eksempel 4

91 ml 0,5 %-ig, vandig tensidløsning som inneholder

5 % magnetitt, avkjøles i en kolbe til 0° C. Løsningens pH-verdi innstilles på 12 med 0,2 N NaOH. N2innledes i løsningen. Til løsningen som er avkjølt til 0° C, tildryppes 9 ml nydestillert acrolein. Etter 1 time tilsettes 100 ml av den 0,5 %-ige tensidløsning til reaksjonsblandingen. Suspensjonen som inneholder mikropartiklene, skilles ved dekantering fra utfelte polymerer og dialyseres.

Eksempel 5

91 ml 0,5 % ig, vandig tensidløsning tilsettes til kolben. Løsningens pH-verdi innstilles på 12 ved tilsetning av 0,2 N NaOH-løsning. Løsningen avkjøles til 0° C. Argon innledes gjennom løsningen. Til denne løsning tildryppes 9 ml nydestillert acrolein som inneholder 5 % butylcyanoakrylat.

Etter 1 time tilsettes ytterligere 100 ml av den 0,5 %-ige tensidløsning. Suspensjonen skilles fra bunnfallet og renses.

Eksempel 6

91 ml 0,08 %-ig, vandig tensidløsning tilsettes til en kolbe. Løsningens pH-verdi innstilles på 10,5 ved tilsetning av 0,2 N NaOH-løsning. Løsningen avkjøles til 0° C. N2innledes gjennom løsningen. Til denne løsning tildryppes 9 ml nydestillert acrolein som inneholder 20 % ot-methylacrolein. Etter 1 time tilsettes ytterligere 100 ml av den 0,08 %-ige tensidløsning. Etter 2 timer skilles mikrokule-suspensjonen fra bunnfallet og renses.

Eksempel 7

91 ml 0,08 %-ig vandig tensidløsning som inneholder 25 % isopentan, tilsettes til en kolbe. Løsningen avkjøles til 0° C. Til denne løsning tilsettes 9 ml nydestillert acrolein under omrøring. Etter 2 timer filtreres reaksjonsblandingen. Mikropartiklene renses ved vasking med vann. Mikrokulene resuspenderes i vann.

Tensidløsning: polyglutaraldehydnatriumhydrogensulfitt-addukt.

2. Reaksjonstrinn

En suspensjon av polyacrolein-mikropartikler i destillert vann innstilles på en pH-verdi på 6,5 ved tilsetning av 0,01 N HCl-løsning. Til denne suspensjon tilsettes under omrøring ved romtemperatur et overskudd av den aminholdige ligand. pH-verdien i denne løsning innstilles på forhånd på

8 ved tilsetning av 0,01 N NaOH-løsning.

Deretter omrøres i avhengighet av reaksjonshastig-heten opp til 48 timer ved romtemperatur. For fjerning av overskudd av den aminholdige ligand dialyseres mot vann.

Eventuelt reduseres de dannede schiffske baser

til aminene ved tilsetning av reduksjonsmidler.

Eksempel 8

10 00 mg polyacrolein-mikropartikler fra eksempel 1 resuspenderes i 50 ml vann. Til denne suspensjon tilsettes 1000 mg 3-aminopropan-l-sulfonsyre og omrøres i 48 timer ved romtemperatur. Deretter dialyseres suspensjonen mot vann.

Så tilsettes 150 mg NaBH^CN og omrøres i 24 timer ved pH 7,5. Denne suspensjon dialyseres deretter mot vann.

Eventuelt kan aminet alkyleres eller acetyleres med kloreddiksyre, acetanhydrid eller diglykolsyreanhydrid.

Eksempel 9

1000 mg polyacrolein-mikropartikler fra eksempel 2 resuspenderes i 50 ml vann. Til denne suspensjon tilsettes 1000 mg 3-aminopropanfosfat og omrøres i 48 timer ved romtemperatur. Deretter dialyseres suspensjonen mot vann.

Så tilsettes 150 mg NaBH^CN og omrøres i 24 timer ved pH 7,5. Denne suspensjon dialyseres deretter mot vann.

Eventuelt kan aminet alkyleres eller det kan acetyleres med kloreddiksyre, acetanhydrid eller diglykolsyreanhydrid.

Eksempel 10

1000 mg polyacrolein-mikropartikler fra eksempel 3 resuspenderes i 50 ml vann. Til denne suspensjon tilsettes 1000 mg 8-aminooktansyre og omrøres ved romtemperatur i 24 timer. Deretter dialyseres suspensjonen mot vann.

Så tilsettes 150 mg NaBH^CN og omrøres i 24 timer ved pH 7,5. Denne suspensjon dialyseres deretter mot vann.

Eventuelt kan aminet alkyleres eller kan acetyleres med kloreddiksyre, acetanhydrid eller diglykolsyreanhydrid.

Eksempel 11

1000 mg polyacrolein-mikropartikler fra eksempel 4 resuspenderes i 50 ml vann. Til denne suspensjon tilsettes 1000 mg 5-aminovaleriansyre og omrøres ved romtemperatur i 36 timer. Deretter dialyseres suspensjonen mot vann.

Så tilsettes 150 mg NaBH^CN og omrøres i 24 timer ved pH 7,5. Denne suspensjon dialyseres mot vann.

Eventuelt kan aminet alkyleres eller det kan acetyleres med kloreddiksyre, acetanhydrid eller diglykolsyreanhydrid.

Eksempel 12

1000 mg polyacrolein-mikropartikler fra eksempel 5 resuspenderes i 50 ml vann. Til denne suspensjon tilsettes 10 00 mg D-glucoseaminhydroklorid og omrøres ved romtemperatur i 30 timer. Deretter dialyseres suspensjonen mot vann.

Så tilsettes 150 mg NaBH^CH og omrøres i 24 timer ved pH 7,5. Denne suspensjon dialyseres deretter mot vann.

Eventuelt kan aminet alkyleres eller det kan acetyleres med kloreddiksyre, acetanhydrid eller diglykolsyreanhydrid.

Eksempel 13

1000 mg polyacrolein-mikropartikler fra eksempel 6 resuspenderes i 50 ml vann. Til denne suspensjon tilsettes 1000 mg hexamethylendiamin og omrøres ved romtemperatur i 24 timer. Deretter dialyseres suspensjonen mot vann.

Så tilsettes 150 mg NaBH^CN og omrøres i 24 timer ved pH 7,5. Denne suspensjon dialyseres deretter mot vann.

Eventuelt kan aminet alkyleres eller det kan acetyleres med kloreddiksyre, acetanhydrid eller diglykolsyreanhydrid.

Eksempel 14

1000 mg polyacrolein-mikropartikler fra eksempel 7 resuspenderes i 50 ml vann. Til denne suspensjon tilsettes 1000 mg polylysin (MG = 32.600 dalton) og omrøres ved romtemperatur i 30 timer. Deretter vaskes suspensjonen med vann.

Eksempel 15

1000 mg polyacrolein-mikropartikler fra eksempel 5 resuspenderes i 2,5 ml vann. Til denne suspensjon tilsettes 250 mg humanserumalbumin oppløst i 2,5 ml vann,og omrøres i 8 timer ved romtemperatur. Deretter dialyseres suspensjonen mot destillert vann (avkutt 100 000) .

Eksempel 16

1000 mg polyacrolein-mikropartikler fra eksempel 4 resuspenderes i 50 ml vann. Til denne suspensjon tilsettes 1000 mg (2-diethylamino)-ethylamin og omrøres i 20 timer ved romtemperatur. Deretter dialyseres suspensjonen mot vann.

Eksempel 17

300 mg polyacrolein-mikropartikler fra eksempel 7 suspenderes i 7,5 ml destillert vann. Til denne suspensjon tilsettes 750 mg 3-aminopropan-l-sulfonsyre som er oppløst i 7,5 ml vann og omrøres i 24 timer ved romtemperatur. Deretter dialyseres suspensjonen mot destillert vann (avkutt 1000 d).

Eksempel 18

200 ml polyacrolein-mikropartikler fra eksempel 7 resuspenderes i 5 ml destillert vann. Til denne suspensjon tilsettes 500 mg lysin oppløst i 5 ml vann og omrøres i 24 timer ved romtemperatur. Deretter dialyseres suspensjonen mot destillert vann (avkutt 5000 d).

In vitro- forsøk

I in vitro-forsøk bekreftes ved hjelp av tilbake-spredningsmålinger av ekko.amplituden av suspensjoner av eksempelvis utvalgte mikropartikler ifølge oppfinnelsen, disse mikropartiklers meget gode akustiske egenskaper.

Nedenfor følger en forklaring av in vitro-forsøkene og de avbildninger som er oppnådd av disse: Måleapparaturen består av en ultralydsender kombi-nert med en ultralydmottager og en målekuvette med prøven.

For måling av prøvens akustiske egenskaper utsendes en ultra-lydimpuls. Impulsen spres ved kuvettens glassvegg og gjennom prøven og spres på baksiden av kuvetten dersom prøven ikke er ekkogen. Tilbakespredningen av ultralydimpulsen måles av mottageren og anvises ved en forandring av amplituden (se avbildningene) .

I avbildning 1 vises tilbakespredningsforholdene i vann (som eksempel på en ikke ekkogen prøve). Tilbakespred-ningsamplituden fra forveggen (ved 3 usek) og bakveggen (ved ca. 16 usek) av kuvetten kan tydelig erkjennes.

Dersom en ekkogen prøve måles, oppnås et tilbake-spredningsforhold som er gjengitt i avbildningene 2-4. Tilbakespredningssignalet fra kuvetteveggen oppnås ikke, da ultralydimpulsen ved vekselvirkning med den ekkogene prøve dissiperes 'henholdsvis forandres slik at det ikke lenger kan foregå noen tilbakespredning til mottageren.

Tilbakespredningsamplituder av vandige partikkelsus-pens joner fra eksemplene 8 (avbildning 2) , 11 (avbildning 3)

og 15 (avbildning 4), hver i en konsentrasjon på 0,5 mg/ml,

ble bestemt.

In vivo-forsøk

For gjennomføring av en ekkocardiografisk under-søkelse hos en ca. 10 kg tung hund (beagle) anvendes kontrastmidlene ifølge oppfinnelsen på følgende måte: Fra medisin-glasset med den bruksferdige suspensjon uttas 1 ml av løsningen, som inneholder 40 ug/ml partikler (eksempel 15) koblet med albumin i 5 % glukoseløsning. Injeksjonen av dette kontrastmiddel foregår i Vena saphena ramus caudalis via en treveiskran som er åpen til alle sider, med en injeksjonshastighet på minst 1 ml/s, men mere fordelaktig med en hastighet på 3 ml/s, fulgt av en etterinjeksjon av 5 ml av en fysiologisk koksaltløsning (0,9 %'ig). Etterinjeksjonen foregår for å oppnå en kontrast-middelbolus som kan bestå så lenge som mulig. Før injeksjonen (avbildning 5) innstilles et "apikalt firekammerblikk" hos forsøksdyret med et handelsvanlig lydhode for ekkocardiografien ved thoraxveggen (transthorakal avledning) og fikseres med en klemme. Før, under og etter injeksjonen anvises lydavledningen på ultralydundersøkelsesapparatets bildeskjerm og dokumenteres eventuelt på videobånd eller med en videoprinter. Denne for-søksanordning tilsvarer teknikkens stand og er kjent for fagmannen .

Når ultralyd-kontrastmidlet går inn i det høyre hjerte, kan kontrasteffekten følges i farvedopler, i 2D-ekkobilde eller i ekkobilde av M-typen. Kontrastmidlet mar-kerer først blodet i det høyre forkammer, og så kontrasteres den høyre ventrikkel og endelig pulmonalarterien. Herved opp-trer en homogen fylling, som holder seg i en tilstrekkelig tid til en diagnostisk undersøkelse. Mens hulrommene i det høyre hjerte igjen fylles med ikke kontrastert (minskning og for-svinning av ekkogeniteten i hjertehulrommene) viser kontrastmidlet seg etter lungepassasjen (transkapillær) i pulmonal-vevene, fyller så det venstre forkammer, den venstre ventrikkel og det etterfølgende høytrykkssystem homogent. Kontrasteffek-tene i hulrommene i det venstre hjertet holder seg lenger enn i den høyre hjertesiden. Ved siden av kontraster-ingen av hulrommene i det venstre hjerte foregår også en kontrastering av andre organer, som gjenspeiler gjennomblød-ningen.

Avbildning 6 viser fyllingen av den venstre ventrikkel med kontrastmiddel.

Anvendelsen av ultralyd-kontrastmidlet ifølge oppfinnelsen innkrenker seg ikke til synliggjøring av blodstrømmene i karsystemet, en kontrastering av kroppshulrom er likeså mulig. Betinget av gjennomblødningspåvisningen kan også under-søkelse av andre organer gjennomføres med disse kontrastmidler med godt resultat.

Claims (20)

1. Gassholdige hulpartikler av et bionedbrytbart polyaldehyd som eventuelt inneholder en væske med et kokepunkt på mindre enn 60 'C og med en partikkeldiameter på fra 0,1 til 40 um, karakterisert vedat de kan erholdes ved tilsetning av en polymeriserbar aldehydmonomer, under omrøring ved en temperatur på fra -5 °C til +80 °C og en pH-verdi på fra 7 til 14, i løpet av fra 1 minutt til 24 timer til en vandig løsning som inneholder den ønskede gass og eventuelt væsken med et kokepunkt på mindre enn 60 °C, hvori konsentrasjonen av aldehydet, basert på reaksjonsblandingen, er fra 0,1 til 50% w/v, og etter av polymerisasjon er blitt utført, separeres de gassholdige partikler fra ikke-gassholdige partikler og, om ønsket, deretter (a) renses og/eller (b) omsettes med en opp til ekvimolar mengde - basert på mengden av aldehyd - av vandig løsning inneholdende koblingsmiddel, under omrøring i opp til 3 dager ved en temperatur på fra 0 ° til 60 "C og en pH-verdi på fra 3 til 9, og bindes deretter til bio- eller makromolekylet, eller (c) bindes til bio- eller makromolekylet.

2. Partikler ifølge krav 1, karakterisert vedat den bionedbrytbare polymer er en kopolymer som er syntetisert fra et polymeriser-bart aldehyd og et additiv som er i stand til kopolymerisering.

3. Partikler ifølge krav 1 eller 2,karakterisert vedat den bionedbrytbare polymer er tverrbundet ved hjelp av tverrbindere.

4. Partikler ifølge kravene 1 til 3,karakterisert vedat et bio- eller makromolekyl er bundet til den bionedbrytbare polymer.

5. Partikler ifølge krav 4, karakterisert vedat bio- eller makromolekylet bundet til den bionedbrytbare polymer, er bundet ved hjelp av et koblingsmiddel.

6. Partikler ifølge kravene 1 til 5,karakterisert vedat den bionedbrytbare polymer inneholder et overflateaktivt middel eller blanding av overflateaktive midler.

7. Partikler ifølge kravene 1 til 6,karakterisert vedat det polymeriserbare aldehyd er valgt fra a,p-umettede aldehyder, a-substituerte acroleinderivater og dialdehyder.

8. Partikler ifølge krav 7, karakterisert vedat det a,p-umettede aldehyd er acrolein, crotonaldehyd eller propynaldehyd.

9. Partikler ifølge krav 7, karakterisert vedat det a-substituerte acroleinderivat er a-methylacrolein, a-kloracrolein, a-fenylacrolein, a-ethylacrolein, a-isopropylacrolein, a-n-butylacrolein eller a-n-propylacrolein.

10. Partikler ifølge krav 7, karakterisert vedat dialdehydet er glutaraldehyd eller ravsyrealdehyd eller et derivat derav.

11. Partikler ifølge krav 2, karakterisert vedat det som additiv som er i stand til kopolymerisering er anvendt a-substituert acrolein, p-substituert acrolein, ethylcyanakrylat, methyl-cyanakrylat, butylcyanakrylat, hexylcyanakrylat, methyl-methakrylat, vinylalkohol, akrylsyre, methakrylsyre, akryl-syreklorid, methakrylsyreklorid, akrylnitril, methakrylnitril, akrylamider, substituert akrylamid, hydroxymethylmethakrylat, mesityloxid, dimethylaminoethylmethakrylat-2-vinylpyridin eller N-vinyl-2-pyrrolidinon.

12. Partikler ifølge kravene 1 til 11,karakterisert vedat de som gass og/eller væske med et kokepunkt på mindre enn 60 °C inneholder ammoniakk, luft, helium, neon, argon, xenon, krypton, svovelhalogenider, svovelhexafluorid, nitrogen, karbonoxider, oxygen, hydrogen, methan, ethan, propan, butan, pentan, neopentan, isopentan, cyklopentan, ethylen, propylen, acetylen, 3,3-dimethyl-l-butyn, 2,3-pentadien, 2-methyl-2-buten, 2-methyl-1,3-butadien, 2-butyn, 2-methyl-l-buten, 3-methyl-l-buten, methylenklorid, 1,1-diklorethylen, isopropylklorid, dibromdifluormethan, brommethan, dimethylether, diethylether, fluorerte etere, dimethylaminoaceton, propylenoxid, N-ethylmethylamin, N-ethyldimethylamin eller furan.

13. Partikler ifølge krav 5, karakterisert vedat det som koblingsmiddel er anvendt hydroxylamin, butylamin, allylamin, ethanolamin, tris(hydroxymethyl)aminomethan, 3-amino-l-propansulfonsyre, 5-aminovalerinsyre, 8-aminooktansyre, D-glukosaminhydroklorid, aminogalaktose, aminosorbitol, aminomannitol, diethylaminoethylamin, aniliner, sulfanylsyreamid, cholin, N-methyl-glukamin, piperazin, 1,6-hexandiamin, urea, hydrazin, glysin, alanin, lysin, serin, valin, leucin, peptider, proteiner, albumin, humant serumalbumin, polylysin, gelatin, polyglykolaminer, aminopolyalkoholer, dextransulfater med aminogrupper, N-aminopolyethylenglykol, N,N'-diaminopolyethylenglykol, antistoffer, immunglobuliner,

(PEG-linker-asparaginsyre), PEG-linker-glutamsyre, PEG-linker-DTPA, PEG-linker-EDTA, ethylenglykol, 1,3-propandiol, glyserol eller pentaerythritol.

14. Partikler ifølge krav 4, karakterisert vedat de inneholder mono klonale antistoffer som bio- eller makromolekyler.

15.Partikler ifølge krav 6, karakterisert vedat de som overflateaktivt middel inneholder polyetylenoxid, Pluronic<®>F 68, Pluronic<®>F 108, Pluronic<®>F 127, polyethylenglykol, poloxamin 908, poloxamer 407, natriumoleat, polyoxyethylenstearat, natriumdioktylsulfosuccinat, polyglutaraldehyd-natriumhydrogen-sulfittaddukt, polyacrolein-natriumhydrogensulfidaddukt eller polyvinylsulfonsyre.

16. Anvendelse av mikropartikler ifølge krav 1 for fremstilling av ultralyddiagnostiske midler.

17. Partikler ifølge krav 1, karakterisert vedat det polymeriserbare aldehyd inneholder et kopolymeriserbart additiv i en konsentrasjon opp til 20 % w/v.

18. Partikler ifølge krav 1, karakterisert vedat det polymeriserbare aldehyd inneholder en tverrbinder i en konsentrasjon opp til 5 % w/v.

19. Partikler ifølge krav 1, karakterisert vedat reaksjonsløsningen inneholder et overflateaktivt middel i en konsentrasjon på fra 0,01 til 10 % w/v.

20. Partikler ifølge krav 1, karakterisert vedat den ønskede gass inn-føres under polymeriseringsforløpet.