CN112266425B - 一种靶向cd44的金属有机络合物及其制备方法 - Google Patents

一种靶向cd44的金属有机络合物及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112266425B
CN112266425B CN202011073342.8A CN202011073342A CN112266425B CN 112266425 B CN112266425 B CN 112266425B CN 202011073342 A CN202011073342 A CN 202011073342A CN 112266425 B CN112266425 B CN 112266425B
Authority
CN
China
Prior art keywords
iii
cells
hyaluronic acid
metal
organic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011073342.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112266425A (zh
Inventor
牡丹
张冰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Drum Tower Hospital
Original Assignee
Nanjing Drum Tower Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Drum Tower Hospital filed Critical Nanjing Drum Tower Hospital
Priority to CN202011073342.8A priority Critical patent/CN112266425B/zh
Publication of CN112266425A publication Critical patent/CN112266425A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112266425B publication Critical patent/CN112266425B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0072—Hyaluronic acid, i.e. HA or hyaluronan; Derivatives thereof, e.g. crosslinked hyaluronic acid (hylan) or hyaluronates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
    • A61K49/10—Organic compounds
    • A61K49/12—Macromolecular compounds
    • A61K49/122—Macromolecular compounds dimers of complexes or complex-forming compounds

Abstract

本发明提供一种金属‑有机纳米络合物，所述化合物可以高效靶向高表达CD44的组织或细胞；进一步地，所述金属‑有机纳米络合物MRI的弛豫率随着环境pH的降低而增大，呈现出pH响应的MRI，从而可以利用病变组织的低pH微环境实现pH增强的MRI成像；更进一步地，所述金属‑有机纳米络合物可以将病变组织或细胞内过表达的高浓度过氧化氢转变成杀伤作用更强的羟基自由基，从而引起细胞死亡，实现化学动力治疗。

Description

一种靶向CD44的金属有机络合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种靶向CD44诊疗的纳米制剂及其制备方法。
背景技术
当前，多种诊断治疗一体化的纳米制剂被开发出来作为疾病尤其是肿瘤的诊断和治疗方案。然而，这些诊疗一体化的纳米制剂尽管在诊断和治疗效果上取得了显著的进步，但是都面临着一些不足，尤其是复杂的反应条件和构建步骤导致其不可能实现大规模生产。除此之外，最亟待解决的缺陷是这些纳米制剂普遍缺乏靶向病灶部位的能力，成像信噪比差，并且副作用明显等。以核磁共振成像(MRI)为例，临床上用于MRI的造影剂为钆造影剂，但是钆造影剂缺乏靶向性，会引起严重的肾毒性，且信噪比较差。虽然可以通过化学合成的方式为钆造影剂赋予靶向特定组织或细胞的功能，但是这就涉及到复杂的靶向修饰和配体合成。除钆外，基于锰和铁的MRI造影剂也表现出良好的性质，受到广泛关注。但是基于锰和铁的造影剂构建也涉及到复杂的配体或者纳米颗粒的合成。除此之外，还有一点非常关键，绝大多数基于钆、锰和铁的MRI纳米制剂都不具备治疗作用。
CD44蛋白是一组分布广泛、分子量为(85-160)×10kD的多分子形式的膜整合蛋白，含糖量很高。CD44介导细胞与细胞间及细胞与细胞外基质间的相互作用，也是由胞外、跨膜及胞质三个部分构成的糖蛋白，糖链为硫酸软骨素和硫酸乙酰肝素。
CD44肽链的N端可结合透明质酸(HA)，故CD44也被视为透明质酸的受体。CD44在血细胞、上皮细胞、内皮细胞及软骨中表达，变异型CD44在肿瘤组织中表达。CD44在多种肿瘤细胞中的表达比相应正常组织为高，并与肿瘤细胞的成瘤性、侵袭性及淋巴转移性有关。
CN111358949A公开了一种靶向抗肿瘤铁(Ⅲ)基纳米络合物及其制备方法，所述铁(Ⅲ)基纳米材料为铁(Ⅲ)和透明质酸接枝盐酸多巴胺(HA-DA)形成的产物，其基于透明质酸的特性能主动靶向表面CD-44受体蛋白过表达的癌细胞，具有探针分子光声成像(PA)和磁共振成像(MR)的诊断特性，且由于铁(Ⅲ)的特性对癌细胞具有化学治疗作用，从而具有诊断和治疗双重功效。
尽管如此，CN111358949A所述的纳米络合物的靶向性及细胞杀伤力仍然达不到很好的预期效果。
发明内容
为了克服现有技术中的上述问题，本发明提供一种金属-有机纳米络合物，所述化合物可以高效靶向高表达CD44的组织或细胞；进一步地，所述金属-有机纳米络合物MRI的弛豫率随着环境pH的降低而增大，呈现出pH响应的MRI，从而可以利用病变组织的低pH微环境实现pH增强的MRI成像；更进一步地，所述金属-有机纳米络合物可以将病变组织或细胞内过表达的高浓度过氧化氢转变成杀伤作用更强的羟基自由基，从而引起细胞死亡，实现化学动力治疗。
本发明所述的金属-有机纳米络合物有：
配体Ⅰ；所述配体Ⅰ为透明质酸多巴胺根离子；
配体Ⅱ；所述配体Ⅱ为单宁酸根离子；
中心金属原子，所述中心金属原子选自：Fe、Cu、Mn、Au或Ag。
进一步的，所述中心金属原子的形态是Fe(Ⅲ)。
另一方面，本发明提供一种制备如前所述的金属-有机纳米络合物的方法，所述方法包括：
步骤1：透明质酸(HA)和盐酸多巴胺发生酰胺反应，合成多巴胺修饰的透明质酸(HD)；
步骤2：向多巴胺修饰的透明质酸溶液中加入中心金属原子盐和单宁酸(TA)，合成所述的金属-有机纳米络合物(HD-Fe(Ⅲ)-TA)。
优选的，所述透明质酸、盐酸多巴胺、中心金属原子盐和单宁酸的的摩尔比为：1:(16-20)：(16-20)：(4-5)。
优选的，所述步骤1中透明质酸先用EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)在处理，并维持pH值为4-6；
优选的，所述步骤1的酰胺反应的pH值为为8-9；
优选的，所述步骤2中，所述中心金属原子盐为FeCl3；
优选的，所述步骤2中，在加入单宁酸前第一次加入所述FeCl3，并在加入单宁酸后第二次加入所述FeCl3。
优选的，所述步骤2中，第一次加入的FeCl3与单宁酸的摩尔比为(1-2):1；第二次加入的FeCl3与单宁酸的摩尔比为(2-3):1，条件是总FeCl3与单宁酸的摩尔比不大于4。
上述步骤中两次加FeCl3的目的不同，第一次的目的是为了将HD与TA连接起来，第二次的目的是以TA为铁载体，提高络合物的载铁量。此外，如果单次加入4倍于TA的铁，则会与后加入的TA形成沉淀。
本发明发现，本发明所述的HD-Fe(Ⅲ)-TA金属-有机纳米络合物具有多种现有技术所不具备的优点。
1、本发明的HD-Fe(Ⅲ)-TA络合物在pH值为7.4-5.0均表现出pH降低而弛豫率升高的特点。血液环境的pH值约为7.4，而动脉粥样硬化斑块内为酸性微环境，HD-Fe(Ⅲ)-TA络合物在pH值为7.4-5.0内表现出pH值降低而弛豫率升高的特点，有利于提高MRI造影剂在动脉粥样硬化斑块内中的弛豫率，从而提高病变组织与正常组织的信号差异，提高MRI造影剂的信噪比，有利于确定斑块的位置。
2、HD-Fe(Ⅲ)-TA相比于HA和现有技术中的HD-Fe(Ⅲ)，可以更有效地靶向CD44。
3、动脉粥样硬化斑块的发展伴随着氧化应激，即细胞产生活性氧(ROS)的过量产生，而ROS也正是化学动力疗法的关键因素之一。HD-Fe(Ⅲ)-TA能够有效降低细胞内的ROS水平，而现有技术中HD-Fe(Ⅲ)在不能有效降低ROS水平，在某些细胞中甚至提高了ROS水平。
4、HD-Fe(Ⅲ)-TA在细胞中尤其是ROS高表达的细胞中表现出不同程度的细胞毒性，说明了HD-Fe(Ⅲ)-TA可以作用化学动力疗法的纳米催化剂，特异性的杀死炎性细胞。
5、HD-Fe(Ⅲ)-TA可以特异性的靶向到动脉粥样硬化斑块内CD44高表达的炎症部位或炎性细胞，在微酸性环境下，利用炎症部位的氧化应激，实现诊断-治疗一体的MRI成像和化学动力治疗。
附图说明
图1为pH响应性体外MRI成像实验结果图；
图2为CD44靶向性实验结果图；
图3为细胞产生活性氧(ROS)实验结果图；
图4为化学动力细胞毒性实验结果图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1
多巴胺修饰透明质酸(HD)的合成
将1g分子量10000Da的透明质酸，溶解在30mL去离子水里，分别加入1.1g EDC和0.7g NHS，搅拌。用0.1M的盐酸调节反应液pH＝6.0，室温搅拌1h。加入0.8g盐酸多巴胺，用0.1M NaOH溶液调节反应液pH＝8.5，反应避光，氮气保护下继续搅拌24h。停止反应，直接将反应液装入截留分子量10000Da的透析袋中，去离子水透析48h，每隔8小时，换一次去离子水。最后，冷冻干燥得到HD，HD的结构如下所示：
Figure BDA0002715877740000051
实施例2
HD、Fe(Ⅲ)和单宁酸络合物(HD-Fe(Ⅲ)-TA)的制备
将32mg的HD溶解在3.2mL pH＝5.0的缓冲溶液中，加入100μL FeCl3溶液(100mM)，充分搅拌。再加入600μL单宁酸(TA)溶液(30mg/mL)，充分搅拌。再加入300μL FeCl3溶液(100mM)，充分搅拌。用PBS调节溶液pH＝7.4，得到HD-Fe(Ⅲ)-TA，其具有如下所示的结构：
Figure BDA0002715877740000061
上述结构中
Figure BDA0002715877740000062
实施例3
pH响应性体外MRI成像实验
Gd-DOTA：
Figure BDA0002715877740000063
通用电气药业(上海)；
HD-Fe(Ⅲ)采用如CN111358949A所述的方法制得。
分别用磷酸缓冲溶液和醋酸缓冲溶液配置pH为7.4、6.5和5.5的Gd-DOTA，HD-Fe(Ⅲ)和HD-Fe(Ⅲ)-TA的溶液，其中Gd或Fe的摩尔浓度分别0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mM。体外分别测试其MRI信号值，拟合曲线，计算弛豫率，结果如图1所示。
血液环境的pH值约为7.4，而动脉粥样硬化斑块内为酸性微环境，造影剂的弛豫率如果和pH值成反比，就能有效提高成像效果，从而提高病变组织与正常组织的信号差异，提高MRI造影剂的信噪比，有利于确定斑块的位置。图1中，分别在不同pH条件下记录了HD-Fe(Ⅲ)，Gd-DOTA和HD-Fe(Ⅲ)-TA的MRI成像信号，并以此计算不同pH下的弛豫率。当pH 7.4-6.5时，HD-Fe(Ⅲ)和Gd-DOTA并没有表现出pH降低增强弛豫率的性质，当pH降为5.0时，才表现出不同程度的pH增强效果。HD-Fe(Ⅲ)-TA在pH7.4-5.0表现出pH降低而弛豫率升高的特点。此外，值得注意的是，HD-Fe(Ⅲ)-TA的弛豫率在不同的pH下始终大于Gd-DOTA。以上结果表明，HD-Fe(Ⅲ)-TA的MRI效果优于临床使用的Gd-DOTA以及HD-Fe(Ⅲ)。
实施例4
CD44靶向性实验
取高表达CD44的肝癌细胞HepG2和低表达CD44的LO2，小鼠巨噬细胞RAW264.7和经LPS刺激的RAW264.7，分别用生理盐水，透明质酸(HA)+HD-Fe(Ⅲ)-TA和HD-Fe(Ⅲ)-TA处理细胞，与上述细胞共培养4h。随后用PBS洗涤3次，收集细胞，ICP测量细胞中的Fe含量，测量结果如图2所示。
透明质酸靶向CD44，为了排除HD-Fe(Ⅲ)-TA中HA的靶向影响，采用透明质酸(HA)+HD-Fe(Ⅲ)-TA，HA与处理细胞后，可以使CD44与HA作用位点饱和，从而屏蔽HA的靶向作用，由此确定并突出HD-Fe(Ⅲ)-TA中非HA介导的靶向性。
图2中，LO2细胞CD44表达阴性，HepG2细胞CD44表达阳性，RAW264.7细胞经LPS刺激后，CD44的表达增加，HD-Fe(Ⅲ)-TA显示出对于CD44高表达细胞的显著靶向性，即使经过HA处理后，HD-Fe(Ⅲ)-TA仍让显示出很高的靶向性。上述结果证明HD-Fe(Ⅲ)-TA可以有效靶向CD44高表达的细胞。
实施例5
细胞产生活性氧(ROS)实验
取高表达CD44的肝癌细胞HepG2和低表达CD44的LO2，小鼠巨噬细胞RAW264.7和经LPS刺激的RAW264.7，分别用生理盐水、单宁酸(TA)、HD-Fe(Ⅲ)和HD-Fe(Ⅲ)-TA处理2h后，以DCFHDA为ROS探针，流式细胞仪测试细胞产生ROS情况，测试结果如图3所示。
动脉粥样硬化斑块的发展伴随着氧化应激，即ROS的过量产生，而ROS也正是化学动力疗法的关键因素之一。因此检测细胞内ROS的产生对评价化学动力疗法治疗动脉粥样硬化具有重要意义。图3结果表明，TA和HD-Fe(Ⅲ)-TA能够有效降低细胞内的ROS水平，而HD-Fe(Ⅲ)在LO2和RAW264.7细胞中却表现出提高ROS的趋势，在HepG2和LPS刺激的RAW264.7细胞中没有降低ROS产生的作用。TA发挥自身抗氧化的作用来降低细胞内ROS的产生。值得注意的是，与TA相比，HD-Fe(Ⅲ)-TA表现出更强的降低ROS产生的能力。
实施例6
化学动力细胞毒性实验
取高表达CD44的肝癌细胞HepG2和低表达CD44的LO2，小鼠巨噬细胞RAW264.7和经LPS刺激的RAW264.7，分别接种在96孔板中，分别用单宁酸(TA)、HD-Fe(Ⅲ)和HD-Fe(Ⅲ)-TA处理细胞48h，MTT法计算细胞存活率。单宁酸和HD-Fe(Ⅲ)-TA(以单宁酸浓度计算)浓度为：0、10、20、40、60、80和100μg/mL，HD-Fe(Ⅲ)浓度为：0、100、200、300、400、500和600μg/mL。测试结果如图4所示。
由图4可以看出，在实验的浓度范围内，TA和HD-Fe(Ⅲ)几乎没有细胞毒性。然而HD-Fe(Ⅲ)-TA在四种细胞中都表现出不同程度的细胞毒性，尤其是在ROS高表达的细胞，HepG2和LPS刺激的RAW264.7细胞，表现出更强的细胞毒性。以上结果说明了HD-Fe(Ⅲ)-TA可以作用化学动力疗法的纳米催化剂，特异性的杀死炎性细胞。
综上所述，HD-Fe(Ⅲ)-TA可以特异性的靶向到CD44高表达的炎症部位、肿瘤细胞或炎性细胞中，例如，动脉粥样硬化斑块，在微酸性环境下，利用炎症部位的氧化应激，实现诊断-治疗一体的MRI成像和化学动力治疗。

Claims (9)

1.一种金属有机纳米络合物，其特征在于具有：
配体Ⅰ；所述配体Ⅰ为多巴胺修饰的透明质酸，其由透明质酸和盐酸多巴胺发生酰胺反应得到；
配体Ⅱ；所述配体Ⅱ为单宁酸根离子；
中心金属原子，所述中心金属原子选自Fe（Ⅲ）。
2.一种制备如权利要求1所述的金属有机纳米络合物的方法，其特征在于，所述方法包括：
步骤1：透明质酸和盐酸多巴胺发生酰胺反应，合成多巴胺修饰的透明质酸；
步骤2：向多巴胺修饰的透明质酸溶液中加入中心金属原子盐和单宁酸，合成得到所述的金属-有机纳米络合物。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中透明质酸先用EDC和NHS处理。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，所述中心金属原子盐为FeCl3。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，在加入单宁酸前第一次加入所述FeCl3，并在加入单宁酸后第二次加入所述FeCl3。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，第一次加入的FeCl3与单宁酸的摩尔比为（1-2）:1；第二次加入的FeCl3与单宁酸的摩尔比为（2-3）:1，条件是总FeCl3与单宁酸的摩尔比不大于4。
7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述透明质酸、盐酸多巴胺、中心金属原子盐和单宁酸的摩尔比为：1:（16-20）：（16-20）：（4-5）。
8.一种金属有机纳米络合物，其特征在于，由如权利要求2-7任一项所述的方法制备得到。
9.一种造影剂，其特征在于含有如权利要求1、8任一项所述的金属有机纳米络合物。
CN202011073342.8A 2020-10-09 2020-10-09 一种靶向cd44的金属有机络合物及其制备方法 Active CN112266425B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011073342.8A CN112266425B (zh) 2020-10-09 2020-10-09 一种靶向cd44的金属有机络合物及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011073342.8A CN112266425B (zh) 2020-10-09 2020-10-09 一种靶向cd44的金属有机络合物及其制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112266425A CN112266425A (zh) 2021-01-26
CN112266425B true CN112266425B (zh) 2021-08-24

Family

ID=74338389

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011073342.8A Active CN112266425B (zh) 2020-10-09 2020-10-09 一种靶向cd44的金属有机络合物及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112266425B (zh)

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014126537A1 (en) * 2013-02-13 2014-08-21 Agency For Science, Technology And Research A Polymeric System for Release of an Active Agent
CN107670036B (zh) * 2017-09-30 2020-12-08 中国科学院长春应用化学研究所 一种铁配位聚合物纳米颗粒的解离方法及其应用
CN111330024B (zh) * 2020-01-16 2021-08-03 浙江大学 一种基于透明质酸和多酚的铁基肿瘤诊疗纳米材料及其制备方法和应用
CN111358949A (zh) * 2020-04-12 2020-07-03 广西师范大学 一种靶向抗肿瘤铁(iii)基纳米材料的制备和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN112266425A (zh) 2021-01-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20120107229A1 (en) Novel nano-probes for molecular imaging and targeted therapy of diseases
US10555965B2 (en) Environment-responsive hyaluronic acid nanoparticles
US20030199687A1 (en) Biocompatible materials and probes
JPWO2005095494A1 (ja) 新規水溶性フラーレン、その製造方法およびそれを含む活性酸素発生剤
Yang et al. GE11-PDA-Pt@ USPIOs nano-formulation for relief of tumor hypoxia and MRI/PAI-guided tumor radio-chemotherapy
Cheng et al. Construction and evaluation of PAMAM–DOX conjugates with superior tumor recognition and intracellular acid-triggered drug release properties
CN105008402A (zh) 近红外色素结合的透明质酸衍生物和包括其的光学成像用造影剂
Mansur et al. Supramolecular magnetonanohybrids for multimodal targeted therapy of triple-negative breast cancer cells
WO2015039555A1 (zh) 基于氧化石墨烯材料的造影剂及其制备方法
TW200906440A (en) Polymers conjugated with platinum drugs
Sun et al. Low molecular weight heparin-based reduction-sensitive nanoparticles for antitumor and anti-metastasis of orthotopic breast cancer
CN108478815B (zh) 一种吡啶修饰的树状大分子铜络合物杂化纳米材料的制备方法
CN111182926A (zh) 包含胆红素衍生物及金属的粒子
Marradi et al. Paramagnetic Gd-based gold glyconanoparticles as probes for MRI: tuning relaxivities with sugars
US20110064676A1 (en) Diagnostic and therapeutic nanoparticles
JP2002512942A (ja) ヒアルロナン系像形成剤
CN110200943A (zh) 一种聚氨基酸配位纳米粒子及其制备方法和作为在声动力肿瘤治疗的药物的应用
Yin et al. Peptide-decorated ultrasmall superparamagnetic nanoparticles as active targeting MRI contrast agents for ovarian tumors
RU2361617C2 (ru) Вольфрамовые частицы в качестве рентгеноконтрастных веществ
KR20100120971A (ko) 가돌리늄 착물, 그 제조방법, 및 그것을 포함하는 ｍｒｉ 조영제
Xin et al. Stearic acid-grafted chitooligosaccharide nanomicelle system with biocleavable gadolinium chelates as a multifunctional agent for tumor imaging and drug delivery
CN112266425B (zh) 一种靶向cd44的金属有机络合物及其制备方法
Sembo-Backonly et al. Cyclodextrins: promising scaffolds for MRI contrast agents
Champagne et al. Synthesis and Unprecedented Complexation Properties of β-Cyclodextrin-Based Ligand for Lanthanide Ions
Tao et al. Fe3O4 Nanoparticles Embedded in Pectin–Doxorubicin Composites as pH-Responsive Nanoplatforms for Tumor Diagnosis and Therapy by T 1-Weighted Magnetic Imaging

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant