JP2002512942A - ヒアルロナン系像形成剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 特異な細胞を標的として作動するヒアルロナン系像形成剤を提供する。 【解決手段】 この像形成剤はヒアルロナン（ＨＡ）と造影剤とを含む。この像形成剤はＨＡをガドリニウムと錯化させたもの、又はリポソームあるいは超常磁性酸化鉄と錯化させたものでもよい。ヒアルロナン系像形成剤の製造方法はＨＡの溶液を造影剤の溶液と混合させることからなる。このヒアルロナン系像形成剤の画像化方法はヒアルロナン系像形成剤を用い、磁気共鳴によりガン細胞を可視化することを含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （技術分野） 本発明は、像形成剤に係わり、特に特定の細胞を標的するのに有用なヒアルロ
ナン系像形成剤に関する。

【０００２】 （発明の背景） ヒアルロナン（ＨＡ）として知られているヒアルロナンは、Ｄ−グルクロン酸
およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンが交互するものからなる線状多糖類とし
て天然に存在し、ナトリウム塩として使用されることもある。このヒアルロナン
は原核生物の或るもの、および真核生物の殆ど全てにより産生される古来からの
分子である。このヒアルロナンは細胞外マトリックスの一部として結合組織中に
隔離され、眼のガラス体又は関節中に大量に蓄積される。

【０００３】 ヒアルロナンの合成は傷害の発展および応答の間において厳密に規制され、そ
の生産はヒトの腫瘍の進行の間に高められる。ＨＡが細胞外マトリックス内にて
隔離される場合、その主たる役割はその顕著な粘弾性に基づく生物理学的なもの
と思われる。しかし、比較的最近の研究によれば、ＨＡは、ＣＤ４４およびＲＨ
ＡＭＭと呼ばれる２つのレセプター（もし、これらが細胞上に発現されている場
合）と、高い親和性（Ｋｄ、ほぼ１０^-9Ｍ）を以て特異的に相互作用することが
報告されている。ＣＤ４４はＨＡ結合タンパク質の結合モジュール類に属し、Ｒ
ＨＡＭＭは別のタンパク質属に属している。これら２つのレセプターの発現は或
る種のヒトの腫瘍にて高められる。

【０００４】 ＣＤ４４およびＲＨＡＭＭの双方は、細胞の運動性および増殖を規制するのに
重要な役割を果しており、これら双方は、実験的腫瘍進行の間およびそれに続く
傷害への応答の際に過剰に発現する。更に、ＲＨＡＭＭおよびＣＤ４４に対する
抗体は、継代培養、傷害および腫瘍遺伝子による形質転換に応答して細胞の運動
性を抑制することが報告されている。特異的ＣＤ４４同形型の過剰発現は実験的
腫瘍の転移特性を高め、ＲＨＡＭＭの過剰発現はマウスの線維芽細胞の変形を生
じさせる。細胞の運動性および増殖に対するＣＤ４４およびＲＨＡＭＭのこれら
の作用はこれらのＨＡ結合能を絶対的に必要とする。ＣＤ４４およびＲＨＡＭＭ
の過剰発現は、骨髄腫、膵臓ガン、肺ガンおよび乳ガンなどのヒトの腫瘍に関係
するということも特に意外なことではない。乳ガンにおける特異的ＣＤ４４イソ
型の過剰発現の役割およびその前兆のためのその利用については、明らかではな
いが、しかしＲＨＡＭＭの過剰発現、特に第１次腫瘍における細胞の小さな部分
集合および転移における過剰発現は２つの地理的に別の固体群における哀れな結
果の前兆である。更にＲＨＡＭＭの過剰発現は、リンパ節の状態および無転移生
存などの一般に用いられている腫瘍パラメータの前兆値を高める。興味深いこと
に、ヒトの腫瘍においてＣＤ４４およびＲＨＡＭＭ発現のレベルはしばしば逆比
例し、これはこれらのレセプターがヒトの腫瘍形成の間に重複的に機能すること
を示唆しているのかも知れない。磁気共鳴画像処理などの画像化のためには、Ｃ
Ｄ４４およびＲＨＡＭＭ細胞、腫瘍存在の前兆を示す他の細胞を標的とする必要
がある。

【０００５】 磁気共鳴（ＭＲ）画像処理は体の中の水素富化化合物（水および脂質）に含ま
れる水素原子核からの信号に基づくものである。画像のコントラストは主として
異なる組織の２つの固有の特性、具体的には水素量（スピン密度）およびプロト
ン緩和時間（Ｔ₁，Ｔ₂およびＴ₂ ^* ）に依存する。ＭＲ造影剤は、これを含む組
織のプロトン緩和時間を短縮させ、従って、ＭＲ画像の信号強度を変化させる。
ＭＲ造影剤には２つのタイプ、すなわち内因的なものと、外因的なものとがある
。前者のタイプのものは内因性鉄の多くの型、例えばフェリチンからなる。後者
のタイプのものは（典型的には）ガドリニウム（Ｇｄ³⁺）イオンの小さなキレー
ト錯体および被覆酸化鉄の大きな粒子からなり、一般に静脈注射により導入され
る。

【０００６】 超常磁性材料は弱い外部磁界内においても極めて大きい磁気モーメントを表す
。組織中の超常磁性酸化鉄粒子に関係する大きい磁気モーメントは局所的磁界不
均等性を生じさせ、これは磁気共鳴画像化において病変の顕著性を増大させるこ
とにより病変の検知をより容易にするのに利用することができる。標的組織内で
の造影剤の蓄積が特異的であればあるほど、得られる病変組織のコントラストは
更によくなる。理想的条件下において、有用な磁性酸化鉄造影剤は一旦、注入さ
れたときは、その一体性が維持され、急速な代謝から回避され、標的を選択的に
認識し、それに結合するものでなければならない。残念ながら、殆どのコロイド
状超常磁性酸化鉄はマクロファージ単球食細胞システムの細胞により急速に摂取
され、有用な量のラベルが特異的組織に移送されるのを妨害されることになる。

【０００７】 これらの造影剤を特異的組織に移送させるためには、それらを“キャリア”シ
ステム内に組み込む必要がある。その一般的キャリアとしては、たんぱく質、抗
体、多糖類、細胞およびリポソームがある。

【０００８】 両親媒性分子、例えば界面活性剤又は脂質は水中で自己集合し、ミセル、二重
層、チューブ又は液胞などの構造を形成する。自然はこのような分子の多くの例
を提供しており、全ての細胞および生物体の安定性および機能において重要な役
割を果している。過去２０年において、化学者は多数の両親媒性物質を合成する
のに成功しており、特に水溶性ポリマーであって共有結合により少数の疎水基が
それに結合されたものからなる疎水変性ポリマーを合成するのに成功している。

【０００９】 リポソームは脂質二重層からなる液胞であり、水性ポケットを内包している。
これらの水性プールには、薬剤や像形成試薬などの水溶性剤を導入させることが
できる。更に、脂溶性分子をリポソーム二重層に溶解させることもできる。すな
わち、リポソームは広範の分子を担持させるのに使用することができる。この特
性は生体内薬剤移送システムの設計に利用されてきた。Hyal Pharmaceutical 社
による最近の特許出願（PCT/GB97/02665,１９９７年９月２９日出願）にはヒア
ルロナン−リポソーム組成物を形成し、これを投薬システムとして利用すること
ができることを示している。ここで、ヒアルロナン変性リポソームの薬剤キャリ
アとしての動作は、脂質二重層内へのポリマーの確実な係留に直接的に関係する
ものであることを思い起こすことが重要である。１つの特に重要な点は、脂質／
ポリマー錯体の寿命である。この二重層に対し大きい親和性を示す巨大分子の或
るものは、実際には結合状態と遊離状態との間の急速な動的平衡となっている。
その場合、リポソームは血流内に注射された後、極めて急速にそのポリマーコー
ト層を失うことになる。従って、従来のポリマー／リポソームシステムのこの欠
点を改善する必要がある。

【００１０】 最も広く検討されている多糖類キャリアはアラビノギャラクタンであり、これ
は天然の多糖類であり、肝細胞においてレセプターに対し親和性を有するものと
思われる。他の多糖類、例えばフコイダン、マンナン、キトサンについても研究
がなされている。これらの化合物の殆どは肝臓、脾臓、腎臓、肺に主として生物
分配される。

【００１１】 疎水変性された多糖類の製造および特性についても調査がなされ、生物工学お
よび薬剤に利用されている。この研究はポリマー、例えばアルキル長鎖のような
種々の疎水基により部分的に置換されたプルラン、デキストラン、マンナン、更
にコレステロールについて集中してなされてきた。その結果、これらの多糖類は
リポソーム表面を効果的に被覆し、外部からの刺激、例えばｐＨ、イオン強度、
酵素および血清タンパクによる生体内生物分解に対し、従来のリポソームと比較
してより安定であることが実証された。同様の作用が疎水変性されたポリ（Ｎ−
アルキルアクリルアミド）で保護されたリポソームについても見出されている。

【００１２】 常磁性金属錯体は外因性ＭＲ造影剤である。ガドリニウムは常磁性金属で多数
の不対電子を含有し、従って理論的に最も効果的なＴ１緩和金属であり、ＭＲ像
形成のための造影媒体として使用することができる。しかし、遊離Ｇｄ³⁺として
投与した場合、この金属は極めて毒性である。しかぢ、キレート剤に結合した場
合、その毒性は失われるが、その常磁性としての特徴は依然として維持される。
超常磁性酸化鉄の場合のように、許容し得る造影剤として使用する場合は、厳格
な要件がこのＧｄ³⁺キレート剤に課せられる。すなわち、水溶性および貯蔵安定
性のような標準的薬学的特性の他、３つの主な要求が課せられる。すなわち、ａ
）十分な緩和性（陽子緩和向上の効率）、ｂ）特異的生体内分配、およびｃ）生
体内安定性、排泄性および非毒性である。Ｇｄ³⁺画像向上製品は市販されている
。２つのこのような製品が商標、Ｏｍｎｉｓｃａｎ（Sanofi Winthrop社）およ
びＭａｇｎｅｖｉｓｔ（Berlex Canada社）の名称で市販されている。

【００１３】 画像向上剤の組織および血液−脳バリアの浸透を向上させるための多くの方法
が開発されている。可なりの進歩がなされてきたが、そのような方法の殆どは欠
点を有し、一般に適用されていない。例えば、多くの画像向上剤は肝臓又はその
他の器官において細胞により摂取され、意図する部位への到達が妨げられること
が見出されている。

【００１４】 （発明の概要） 上記およびその他の課題を達成するため、本発明は、特異的細胞を標的として
向かわすためのＨＡ系コントラスト向上性像形成剤を提供することを目的とする
。 このＨＡ系コントラスト造影剤は特異的細胞を標的とし、十分な緩和性を示
し、その他、特異的生体内分布、生体内安定性、排泄性および非毒性により特徴
づけられる。 本発明のＨＡ系造影剤には３つのタイプ、すなわち、ＨＡ−錯化ガドリニウム
（ＨＡ−Ｇｄ又はＧｄ−ＨＡ）、ＨＡ−錯化常磁性酸化鉄（ＨＡ−Ｆｅ）、およ
びリポソームで錯化したＨＡ−Ｇｄ（ＨＡ−Ｇｄ−リポソーム）がある。 ガドリニウムはＨＡキャリア内にて製造することができ、これによりＨＡ−Ｇ
ｄゲルを生産させ、或いはガドリニウムはＨＡに結合された錯化剤に結合させる
ことができる。リポソームは適宜、ＨＡ−Ｇｄ結合物に組込むこともできる。 超常磁性酸化鉄はＨＡキャリア内にて製造することができ、これによりＨＡ−
酸化鉄ナノ複合材を生産させ、これは粘弾性ゲル、フェロ流体又は乾燥粉体とし
て分離することができる。

【００１５】 本発明の他の態様において、ＨＡ系磁気共鳴（ＭＲ）造影剤は、ＨＡレセプタ
ー、ＣＤ４４およびＲＨＡＭＭを標的にすることによりヒトの乳癌細胞をＨＡレ
セプター指向性画像化を可能とすると考えられる。 本発明の他の態様として、ＨＡ−Ｇｄ、ＨＡ−ＦｅおよびＨＡ−Ｇｄ−リポソ
ームを用い磁気共鳴（ＭＲ）画像化により乳癌の検知および画像化する方法が開
示されている。 本発明の他の態様として、ＨＡ系磁気共鳴（ＭＲ）造影剤の製造方法が開示さ
れている。 本発明の他の態様として、ＨＡ系造影剤により生体内で小さい寸法の腫瘍を判
定する方法が開示されている。 本発明の他の態様として、腫瘍細胞においてＣＤ４４およびＲＨＡＭＭを標的
とする場合のＨＡ系造影剤の役割が判定される。腫瘍細胞が良性か悪性かを判定
する方法がＨＡ系造影剤を用いてＨＡレセプタの存在の有無を測定し、ＨＡレセ
プタの存在の有無を判定することにより行われる。 なお、上記の一般的説明および以下の詳細な記載は例示に過ぎず、本発明を制
限することを意図したものでないことを理解されるべきである。

【００１６】

【実施例】

以下、本発明の具体例を図面を参照して詳述する。 ヒアルロナン（ＨＡ）系磁気共鳴（ＭＲ）造影剤は細胞のＨＡレセプター指向
性画像化を行うために用いられる。これらの細胞は、乳ガン、結腸直腸ガンおよ
び肺ガンなどの異なるガンの腫瘍細胞であってもよい。 このＨＡ系像形成剤の具体的適用としては、ヒト乳ガン細胞の可視化がある。
図１は特定のヒト乳ガン細胞系の特徴を示している。図２、３に示すように、Ｈ
Ａを３−１０ｍｇ／ｍＬ（ｍｇ ｍｌ）^-1の濃度でラットに注射した場合、その
高分子量が４８時間維持され、従って、ヒアルロナン・レセプター、ＣＤ４４お
よびＲＨＡＭＭに対し結合することができる。

【００１７】 具体的に述べると、図２はＨＡレセプター、ＣＤ４４の高いレベルを示すラッ
ト結腸直腸ガン細胞系に対する¹²⁵ Ｉ−ＨＡの標的性を示している。図３はＨＡ
レセプター、ＣＤ４４およびＲＨＡＭＭの最大レベルを示す部位であるところの
バルーンカテーテル傷害ラット頸動脈に対する¹²⁵ Ｉ−ＨＡの標的性を示してい
る。図２、３の画像の双方はりん光画像化装置を用いて検出されたものである。

【００１８】 更に、図４は６ｍｇ／ｋｇヒアルロナンの分子量分布が静脈注射２４時間後に
おいて７５０，０００ダルトン以上であることを示している。特に、このグラフ
は溶出量（ｍＬ）の関数としてのＨＡ濃度（ｎｇ／ｍＬ）と分子量（ｋＤａ）を
示している。この結果をもたらした検定はＢ１６分子量検量セファクリル５００
−ＨＲ，１．６ｘ１．５ｃｍカラムを用いて行われた。この濃度で注射したＨＡ
はその高分子量を維持し、従って、ＨＡレセプター、ＣＤ４４およびＲＨＡＭＭ
に対し相互作用し得る。

【００１９】 本発明で使用されるＨＡは平均分子量が約２０，０００ないし２００，０００
ダルトンのものである。この平均分子量のより好ましい範囲は約５０，０００な
いし１００，０００ダルトンである。ＨＡの超音波分解により平均分子量を約２
０，０００ないし５０，０００ダルトンの範囲に減少することにより超音波分解
されたＨＡから作られるＨＡ系像形成剤の浸透性が改善されるものと考えられる
。

【００２０】 同様の作用がヒトに実証され得ることに疑いはない。事実、¹²⁵ Ｉ−ＨＡがこ
れら２つのヒアルロナンレセプターが高いレベルで発現している腫瘍および傷害
の部位に特異的に堆積されることがラットにおいても示された。更に、ＲＨＡＭ
ＭおよびＣＤ４４は乳ガン進行の間に過剰に発現される。事実、ＲＨＡＭＭを過
剰に発現する第１次乳ガンにおける細胞の部分集合の存在は哀れな結果の前兆で
ある。標的させたＨＡの画像化の効力を調べるため、種々のレベルのＲＨＡＭＭ
およびＣＤ４４を発現するヒト次乳ガン細胞系を用い、ヌードラットにクセノグ
ラフとして成長させた。

【００２１】 ヒアルロナン系造影剤には３つのタイプ、すなわち、ＨＡ−錯化ガドリニウム
（ＨＡ−Ｇｄ又はＧｄ−ＨＡ）、ＨＡ−錯化常磁性酸化鉄（ＨＡ−Ｆｅ）、およ
びリポソームで錯化したＨＡ−Ｇｄ錯体がある。これらの造影剤は多糖類系酸化
鉄およびガドリニウム又はリポソーム変性ＨＡ錯体の合成および特徴化により製
造することができる。標的造影剤としてのこれらの使用を試験するため、これら
の造影剤を静脈投与した。ＨＡを乳ガン腫に指向させる際のＲＨＡＭＭおよびＣ
Ｄ４４の役割を、ＨＡ−Ｇｄ（適宜、リポソームを伴う）又はＨＡ−Ｆｅの結合
を、ＲＨＡＭＭ又はＣＤ４４に対し特異的なブロッキング抗体で又はこれらのレ
セプターのＨＡ結合領域に対して作られたアンチセンスぺプチドを用いて妨害す
ることにより評価した（下記図１７、１８の説明、参照）。

【００２２】 ＨＡの特性および標的指向性 ＨＡの物理化学的特性、その代謝性、更に病気、傷害、腫瘍変性を特徴付ける
特異的ＨＡ細胞膜レセプター部位での一貫したその上向き調節から、ＨＡが理想
的な薬剤キャリアであり、あらゆる種類の病気の兆候および薬剤のための標的剤
であることが実証された。更に、肝臓によるＨＡの摂取の原因である肝臓スカベ
ンジャーレセプターに結合する硫酸コンドロイチンの前配合用量を投与する方法
が開発された。このアプローチを利用することにより、肝臓へ向けさせるＨＡの
量を８０％以上、減少させることができる。この処置はＲＨＡＭＭおよびＣＤ４
４を発現する部位へ向うＨＡの能力を変化させるものではない。なぜならば、こ
れらのレセプターは肝臓スカベンジャーレセプターとは分子的に区別されるもの
であるからである。

【００２３】 ＨＡレセプターと悪性ガン細胞との間の結合 結腸直腸および乳ガン腫瘍およびその周囲の支質におけるＨＡの堆積の増大が
、最近になって、哀れな患者の予測および腫瘍浸潤／転移と結びつけられるよう
になった。事実、ＨＡレセプター（すなわち、ＲＨＡＭＭおよびＣＤ４４）の過
剰な発現はヒトの腫瘍進行（特に乳ガンにおける）としばしば関連する。ＨＡ−
ガドリニウム錯体は悪性腫瘍における病気の症状の画像化に使用することができ
る。より具体的には、これを悪性乳ガン細胞を優先的に検出するのに使用するこ
とができる。

【００２４】 悪性ヒト乳ガン細胞は良性ヒト乳ガン細胞と比較してより高いレベルのＨＡレ
セプターを発現し、かつ、より高い割合で標識付けＨＡを摂取することが示され
た。この摂取はＨＡに対し特異的であり、ＨＡレセプターすなわち、ＲＨＡＭＭ
およびＣＤ４４により媒介されることが示された。また、ＨＡ−Ｇｄに曝された
ヒト悪性腫瘍細胞は良性ヒト乳ガン細胞と比較してより大きい信号強度を磁気共
鳴画像（ＭＲＩ）において示し、ＨＡ−Ｇｄを腫瘍細胞を標的として向うＨＡ−
Ｇｄの有効性がin vitroにおいて証明された。ＨＡ−Ｇｄは高いレベルのＨＡレ
セプターを発現する肝臓により用量依存的に急速に摂取されることが示された。
ＨＡ−Ｇｄの信号強度は良性腫瘍から悪性腫瘍に向って急速に増大し、これは遊
離ガドリニウムの当量に関係し、信号強度の用量依存的増大を示すものではなか
った。

【００２５】 筋肉のような組織で細胞表面ＨＡレセプターを発現しないものは、遊離ガドリ
ニウムとの関連でＨＡ−Ｇｄを優先的に摂取しなかった。また、信号強度は低く
、ＨＡ−Ｇｄが増加しても信号強度は増大しない。これらの結果は、ＨＡレセプ
ターが発現されている場合であれば、その組織はＨＡ−Ｇｄを用いて強力、かつ
優先的に画像化することができることを示している。

【００２６】 ＨＡ−Ｇｄをアガロースビーズに結合させ、洗浄して非結合物質を除去し、Ｍ
ＲＩで画像化した。これを遊離ガドリニウムの当量で同じくビーズに結合させ、
洗浄して非結合物質を除去したものと比較した。このテストは細胞に対し標的と
することなしに行われた。図９に示すように、アガロースビーズに結合させたＨ
Ａ−Ｇｄの信号強度は、１ｍｇ／ｍＬより大きい濃度において遊離ガドリニウム
のものよりも可なり大きく、この濃度が上昇するにつれて信号強度も増大したが
、遊離ガドリニウムの場合は、濃度が上昇しても信号強度は実質的に一定であっ
た。これらの結果は、遊離ガドリニウムと異なり、ＨＡ−Ｇｄは特定のレセプタ
ー結合部位を提供し、それが信号強度を増大させていることを示している。

【００２７】 ラットにＨＡ−Ｇｄをその濃度を増加させて投与したところ、ヒアルロナンレ
セプターを多量に含む肝臓において、用量依存的に信号強度が上昇した。図１０
に示すように、遊離ガドリニウム（９．６ｍｇ／ｋｇのＧｄ−ＤＰＴＡおよび１
９．２ｍｇ／ｋｇのＧｄ−ＤＰＴＡ）は同様の用量依存的信号強度上昇を示さず
、信号強度は常にＨＡ−Ｇｄのものよりも低く、これはＧｄ−ＤＰＴＡが１９．
２ｍｇ／ｋｇで、ＨＡ−Ｇｄの１００ｍｇ／ｍＬ以内のガドリニウム錯体の量に
相当する場合でもそうであった。このことは、ＨＡの摂取がレセプターの媒介に
よることを実証している。 このＨＡ−Ｇｄの重量はヒアルロナンの重量に基づいて測定されたものであり
、錯化されたガドリニウムの量を反映するものではない。一般に、多糖類に結合
したヒアルロナンに対するガドリニウムの％は約３．０ないし１２．０％、より
好ましくは約５．６ないし９．６％である。

【００２８】 図１１は図１０と同様の動物テストを表すものであるが、肝臓細胞の代りに髄
骨筋肉がＭＲＩにより測定されている。図１１において、ＨＡ−Ｇｄ摂取につい
ての信号強度は髄骨筋肉において肝臓におけるものよりも著しく小さくなってい
る。髄骨筋肉においては、ＨＡ−Ｇｄ信号は用量が変化しても実質的に変化せず
、遊離ガドリニウムの場合により近いものであった。すなわち、腫瘍および肝臓
細胞と異なり、髄骨筋肉は細胞表面ヒアルロナンレセプターを発現しないものと
思われる。

【００２９】 ２つのヒト次乳ガン細胞系、すなわち、ヌードマウス中に異種移植として成長
させたもので、１つは先に悪性として特徴づけられたもの（ＭＤＡ−ＭＭ−２３
１）、他の１つは先に良性として特徴づけられたもの（ＭＣＦ−７）、を細胞表
面ヒアルロナンレセプター、ＲＨＡＭＭ（黒）およびＣＤ４４（白）の発現につ
いてＦＡＣＳ分析により分析した。図１２は悪性腫瘍細胞（ＭＤＡ−ＭＭ−２３
１）がin vitroにおいて良性腫瘍細胞（ＭＣＦ−７）よりも可なり高いレベルで
発現していることを示している。すなわち、悪性細胞の画像化および処置におい
てこれらのレセプターの重要性を実証している。

【００３０】 テキサス・レッド標識付けヒアルロナンを上記の２つの悪性および良性細胞系
にin vitroで添加し、この標識付けヒアルロナンがこれら細胞系で異なって摂取
されるか否かを検査した。図１３に示すように、双方の細胞型は濃度が増大する
につれ標識付けヒアルロナンの摂取の増大を示し、また、その摂取の平坦化（限
界）を示した。これらの結果は摂取がレセプター媒介によるという考えに一致す
るものである。なぜならば、悪性腫瘍は良性腫瘍と比較して標識付けヒアルロナ
ンを約２．５倍余計に摂取しており、悪性腫瘍は良性腫瘍よりもＨＡ−Ｇｄをう
まく摂取すると思われるからである。

【００３１】 標識付けヒアルロナン摂取のために、細胞が程度の時間、標識付けヒアルロナ
ンに対し曝す必要があるのかを検査するため、更にこの摂取のプロセスにおける
ＲＨＡＭＭおよびＣＤ４４の役割を検査するため、更に幾つかの細胞系について
試験を行なった。すなわち、１０Ｔ１／２繊維芽細胞（１０Ｔ）をＲＨＡＭＭ／
ＣＤ４４（ＬＲ２１）でトランスフェクトさせた。ＲＨＡＭＭおよびＣＤ４４を
著しく発現する突然変異活性細胞系（ｃ３）を悪性（ＭＤＡ）および良性（ＭＣ
Ｆ）細胞について比較した。蛍光デキストランを背景対照として使用し、ＨＡ摂
取の特異性について検査した。その結果、図１４に示すように、ＲＨＡＭＭ又は
ＣＤ４４レセプターを著しく発現した細胞（すなわち、ＭＣＦおよびｃ３細胞系
）はテキサス・レッド標識付けヒアルロナンの特異的に高い摂取を示した。

【００３２】 良性および悪性ヒト乳ガン腫瘍細胞のペレットをＧｄ置換率の異なるＨＡ−Ｇ
ｄに曝し、ついで洗浄し、最後にコラーゲンゲル中に懸濁させた。次にＭＲＩか
らの信号強度を判定した。図１５に示すように、悪性腫瘍細胞（浸潤性、ＭＤＡ
−ＭＢ−２３１）は良性腫瘍細胞（非浸潤性、ＭＣＦ−７）と比較して、或るＧ
ｄ濃度範囲（０．５，２，１０ｍｇ／ｍＬ）において、より高い信号強度を示し
た。この信号強度はＧｄ置換率が９．４−９．６％のＧｄ−ＨＡ（標識付けＧｄ
）製剤のときに最大となった。これらの結果から、Ｇｄ−ＨＡを用いて、in vit roにおいて良性ヒト腫瘍細胞を悪性ヒト腫瘍細胞に対し異なって画像化すること
ができることが実証された。

【００３３】 悪性腫瘍細胞（浸潤性、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）をヌードラット中に異種移植
として成長させ、ついでこれらラットに１００ｍｇ／ｋｇのＧｄ−ＨＡ（５．６
％錯化させたＨＡ、“Ｂ”と呼ぶ）を注射した。対照としてＧｄ−ＨＡに曝す前
のヌードラット（“Ａ”と呼ぶ）を用いた。図１６に示すように、腫瘍内（図１
６に矢線で示した）および肝臓細胞に信号強度の増大が認められた。これらの結
果は、Ｇｄ−ＨＡ像形成剤を用いることによりin vivoでの悪性腫瘍の画像化の
高い可能性を示すものであった。

【００３４】 図１７に示すように、抗ＣＤ４４抗体、ＫＭ２０１、を１０Ｔ１／２（低いレ
セプター発現）およびＬＲ２１（高いレセプター発現／ＲＨＡＭＭトランスフェ
クション）細胞系に加えたところ、これら細胞系によるテキサス・レッド標識付
けＨＡの摂取が、抗体の非存在におけるテキサス・レッド標識付けＨＡと比較し
て可なり減少した。同様の結果が図１８の共焦蛍光画像においても認められた。
具体的に述べると、５０μｇ／ｍＬの抗ＣＤ４４抗体、ＫＭ２０１、を１０Ｔ１
／２（非経口）およびＲＨＡＭＭトランスフェクション（ＬＲ２１）細胞系に加
えたところ、これら細胞系によるテキサス・レッド標識付けＨＡの摂取は、抗体
の非存在におけるテキサス・レッド標識付けＨＡと比較して可なり減少した。す
なわち、非ブロック画像における高い解像度が得られた。

【００３５】 更に研究した結果、ＲＨＡＭＭレセプターおよび単細胞分子の共局在化がＭＤ
Ａ−ＭＢ−２３１（悪性）細胞の核に生じるが、ＭＣＦ−７（良性）細胞では核
周囲に生じることが判明した。更に、ｒａｓ分子の過剰発現は乳ガン細胞におけ
る単細胞分子およびＲＨＡＭＭレセプターの過剰発現と相関関係があることが見
出された。更に、ＲＨＡＭＭの発現は、ＭＣＦ−１０Ａ細胞におけるｒａｓプロ
ト腫瘍形成遺伝子又は突然変異活性ｒａｓ発現と関連する。最後に、ＲＨＡＭＭ
の過剰発現は、活性単細胞１、ｒａｓおよびＣＤ４４の過剰発現と関連する。

【００３６】 ＨＡ−安定化ＭＲ造影剤の製造、化学的および物理的特徴付け フェロ流体／酸化鉄 ＨＡ−安定化フェロ流体の製造には、ＨＡ−ヒドロゲルの骨格内における超常
磁性ナノ寸法酸化鉄の製造、その後のゲルのＨＡ−安定化フェロ流体への変換が
含まれる。反応温度、ｐＨおよび酸化剤の性質の全てが、ＨＡマトリックスにお
けるＦｅ²⁺酸化に影響を与え、その影響が決定される。これらの複合体は、元素
分析（Ｆｅ含量）、粉体Ｘ線結晶学、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）およびＳＱＵ
ＩＤ磁気測定により特徴付けられる。磁性ゲルから得られたフェロ流体は毛管電
気泳動、動的光散乱およびＴＥＭにより特徴付けられる。 ＨＡ−安定化ＭＲ酸化鉄を製造する他の方法は、界面活性剤又はポリマーの非
存在下でナノ寸法の磁鉄鉱を製造することからなる。この方法で得られた磁鉄鉱
は後に生理学的媒体中にて制御されたＨＡの吸着により安定化される。フェロ流
体のコロイド安定性は、混濁測定を含む種々の方法を用いてポリマー濃度の関数
としてモニターされる。

【００３７】 ＨＡ−酸化鉄の好ましい方法において、塩化第二鉄６水和物（１．０ｇ）およ
び塩化第一鉄４水和物（０．５ｇ）の水溶液（２００ｍＬ）を窒素を用い１５分
間、パージングする。ついで、ＮＨ₄ ＯＨの水溶液（５重量％）をこの溶液に激
しい撹拌下で添加してｐＨを８．０に上昇させる。この混合物をこの添加後に更
に１５分間撹拌する。得られた磁鉄鉱は磁界の下でデカンテーションにより分離
することができる。この磁鉄鉱をついで上澄液のｐＨが約６−７になるまで水洗
する。ついで、この磁鉄鉱を脱イオン水中に懸濁させ、原料溶液（３０ｍｇ／ｍ
Ｌ）を形成する。磁鉄鉱粒子の寸法は透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による測定で
、１５ｎｍプラスマイナス３ｎｍである。

【００３８】 少量の磁鉄鉱原料溶液（１．０ｍＬ）をＨＡ−ＮＨ₂ の水溶液（水Ａ５．０ｍ
Ｌ中０．０８ｇ、製造方法は以下に記載）に添加した。得られた懸濁液をマイク
ロソン超音波細胞粉砕機（出力１５に設定して２分間）を用いて超音波処理した
。再選択した流体をｐＨ７．３３のリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）を用いて洗浄し
、磁気カラムを介して溶離することにより精製した。得られた流体を最初にＮａ
ＯＨ水溶液（０．１Ｍ）を用いてｐＨ１１に調整し、ついげＨＣｌ（０．１Ｎ）
を用いてｐＨ７．３に調整した。この流体をついで０．４５ミクロンフィルター
を介して濾過した。最後にＮａＮ₃ 水溶液をこのフェロ流体に添加した（ＮａＮ ₃ の最終濃度：１０^-3Ｍ）。

【００３９】 Ｇｄ錯体 ＨＡ系ガドリニウム造影剤の製造に際し、幾つかのアプローチを採用した。 （１）ＨＡによるＧｄ³⁺の直接的結合： このプロセスにおいて重要な因子はＨＡに対するＧｄ³⁺の結合定数および他の
二価および三価カチオン、例えば亜鉛、鉄、マグネシウム、カルシウムの存在下
におけるガドリニウムに対するＨＡの選択性である。 （２）ＨＡに共有結合された錯化剤に対するＧｄ³⁺の結合：

【００４０】 図５はＧｄ³⁺と錯化し得る化合物をＨＡの主鎖に共有結合させることによるＨ
Ａの変性方法として２つのルートが可能であることを示している。ルートＡにお
いては、第１アミノ基が３つの可能なＧｄ³⁺錯化剤（図５中の１、２、３）の１
つに結合したアミンを、カルボキシル基を有するＨＡに結合させる。 他のルートＢにおいては、第１アミンをＨＡの主鎖に導入し、ついでカルボキ
シル基を有する大環状分子と反応させる。これら変性されたポリマーはついでＨ
Ａの官能基との間で錯体を形成するガドリニウムで処理する。得られた変性ポリ
マーは標準の化学的手段により特徴付けられ、ポリマーキレート剤に対するＧｄ
3+の結合定数が測定される。これらのポリマーはついでＭＲ造影剤として評価さ
れる。in vivo中で安定なガドリニウム錯体を作るため考慮すべき３つの主なフ
ァクターがある：ａ）生理学的条件下での金属／リガンド錯体の熱力学的安定定
数； ｂ）ガドリニウムについてのリガンドの選択性； ｃ）反応動力学である
。 ヒアルロナンの生理学的活性に対するガドリニウムおよび鉄キレートの作用を
検査するためには、フェロ流体およびガドリニウム錯体を精巣ヒアルロニダーゼ
で消化させる。ＨＡ系造影剤の毒性は錯化の程度を判定することにより測定され
る。

【００４１】 ＨＡ−Ｇｄ−リポソーム系 これらの像形成剤において、ガドリニウム錯体はリポソームの内部水性プール
中でカプセル化する。ＨＡの主鎖が部分的に疎水基で置換された疎水変性された
ＨＡ（ＨＭ−ＨＡ）２は図７に示すように、りん脂質二重層４の外表面に定着さ
れる。これらの疎水基はリポソーム二重層中に挿入させることができ、これによ
り、外方膜（リポソーム二重層）上においてＨＡについて強力な定着点が提供さ
れる。

【００４２】 リポソームは種々の方法で製造することができ、それにより直径５０ｎｍない
し１，０００ｎｍの範囲の狭い寸法分布の単層又は多層ラメラ構造の液胞を作る
ことができる。リポソームは最初にＨＭ−ＨＡ２の非存在下で得ることができ、
このＨＭ−ＨＡ２は、ＨＭ−ＨＡ２の存在下で“裸”のリポソーム水性懸濁液を
温置させることによりリポソーム膜内に定着させることができる。これら錯体の
表面飽和および安定性については、蛍光分光法、遠心分離、電子顕微鏡、ゲル透
過クロマトグラフィーなどの方法により判定することができる。ＨＭ−ＨＡ２と
の安定化の前に、薬剤又は像形成剤をリポソームに組込むこともできる。

【００４３】 ＨＡの外側層はリポソームのための標的化化合物として役立つ。カプセル化物
質は公知の任意の像形成剤、例えば市販のＭＲ像形成剤であるMagnevist（商標
）、上記のＨＡ−酸化鉄、あるいはMagnevist（商標）とＨＡ−Ｇｄとの組合せ
、又は上記のＨＡ−Ｇｄ錯化剤から選択することができる。ＨＭ−ＨＡ２は疎水
基例えば単素数約１０ないし２４のｎ−アルキル鎖又はコレステリル基を共有結
合させることにより製造することができる。更に、カルボン酸基の活性化、更に
アミドへの変換および第１ヒドロキシル基のエーテルへの変換により製造するこ
ともできる。その他、ピレン又はナフタレンなどの蛍光基をＨＡへ結合させ、リ
ポソーム膜へのＨＭ−ＨＡ２の効果的定着の探針として役立たせることもできる
。

【００４４】 その他、ＨＡをリポソームの外側膜に架橋化剤を介して定着させてもよい。こ
の架橋化剤はＨＡへ被覆する前にリポソーム中に混合させてもよい（米国特許Ｎ
ｏ．５，６０３，８７２（Margalit）参照）。 ＨＭ−ＨＡ２の構造を以下に示す。

【００４５】

【化１】

【００４６】 ここで、Ｒは（ＣＨ₂ ）n ＣＨ₃ 、３−コレステリル、又はＨ；Ｒ１はＸ（Ｃ
Ｈ₂ ）n ＣＨ₃ 、−ＮＨＣ₆ Ｈ₁₂ＮＨ−ＣＯＯ（コレステリル）、Ｈ又はＮａ⁺ である。

【００４７】 更に、ＨＭ−ＨＡ２のリポソームへの結合は一般に２工程で行うことができる
。すなわち、（ａ）被覆されていない“裸”リポソームの製造、およびＨＭ−Ｈ
Ａの存在下でのリポソーム懸濁液の温置である。この結合は蛍光分光法、ゲル透
過クロマトグラフィー、遠心分離などの方法により測定することができる。ＨＭ
−ＨＡ被覆リポソームの外部刺激、例えばｐＨ、イオン強度、血清タンパクによ
るin vitro劣化、に対する物理的化学的安定性、および表面飽和も結合測定に用
いられる検査法により評価することができる。ＭＲ造影剤、例えばガドリニウム
、は変性リポソーム内、すなわちリポソームの水性核又は脂質二重層内にカプセ
ル化することができると考えられる。得られた物質はついで他のＨＡ系造影剤の
評価に用いられている方式に従ってテストすることができる。

【００４８】 ＨＡへ結合された錯化剤へのガドリニウムの結合 図５に記載された反応形式による一連の実験において、ＨＡはエチレンジアミ
ン、ヒドラジンモノハイドレート、ジエチレントリアミン（以下に述べる）で変
性した。この場合、錯化剤はＨＡカルボキシル基の少量と結合された。その他、
錯化剤はＨＡ多糖類単位のＣ６位に結合させてもよい。最終のガドリニウム−Ｈ
Ａ錯体は上記のあらゆる方法により分析される。

【００４９】 エチレンジアミンを用いたＨＡの変性 エチレンジアミン（１．２ｇ，２０ｍｍｏｌ）を、水５０ｍＬ中のヒアルロナ
ンナトリウム溶液（２００ｍｇ，０．５０ｍｍｏｌ）に添加した。この反応混合
物のｐＨは０．１Ｎ ＨＣｌを用いて４．７５に調整した。ついで、１−エチル
−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ，３８２ｍｇ，
２．０ｍｍｏｌ）を固体で添加した。この反応混合物のｐＨを０．１Ｎ ＨＣｌ
を用いて４．７５に維持し、室温で１２時間撹拌した。その後、この反応混合物
のｐＨを１Ｎ ＮａＯＨを用いて７．０に調整した。この混合物をＹＭ３０膜を
用いて限外濾過した。得られた粘性のポリマー溶液を水で希釈した。このポリマ
ー水溶液を多量のメタノール中に加えた。析出された固体ポリマーを真空濾過に
より分離し、メタノールで洗浄し、少量の水中に再溶解させたのち、２４時間凍
結乾燥させ、エチレンジアミン変性ＨＡ３５０ｍｇを得た。

【００５０】 ジエチレントリアミンを用いたＨＡの変性 ジエチレントリアミン（２．０６ｇ，２０ｍｍｏｌ）を、水５０ｍＬ中のヒア
ルロナンナトリウム溶液（２００ｍｇ，０．５０ｍｍｏｌ）に添加した。この反
応混合物のｐＨは０．１Ｎ ＨＣｌを用いて４．７５に調整した。ついで、１−
エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ，３８２
ｍｇ，２．０ｍｍｏｌ）を固体で添加した。この反応混合物のｐＨを０．１Ｎ
ＨＣｌを用いて４．７５に維持し、室温で１２時間撹拌した。その後、この反応
混合物のｐＨを１Ｎ ＮａＯＨを用いて７．０に調整した。この混合物をＹＭ３
０膜を用いて限外濾過した。得られた粘性のポリマー溶液を水で希釈し、更に２
度目の限外濾過行った。この得られた濃縮ポリマー水溶液を２４時間凍結乾燥さ
せ、ジエチレントリアミン変性ＨＡ３４０ｍｇを得た。

【００５１】 ヒドラジンモノハイドレートを用いたＨＡの変性 ヒドラジンモノハイドレート（１．０ｇ，２０ｍｍｏｌ）を、水５０ｍＬ中の
ヒアルロナンナトリウム溶液（２００ｍｇ，０．５０ｍｍｏｌ）に添加した。こ
の反応混合物のｐＨは０．１Ｎ ＨＣｌを用いて４．７５に調整した。ついで、
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ，３
８２ｍｇ，２．０ｍｍｏｌ）を固体で添加した。この反応混合物のｐＨを０．１
Ｎ ＨＣｌを用いて４．７５に維持し、室温で１２時間撹拌した。その後、この
反応混合物のｐＨを１Ｎ ＮａＯＨを用いて７．０に調整した。この溶液を透析
バッグへ移し（分子量カットオフ：１０，０００）、水に対し徹底的に透析した
。この得られたポリマー水溶液を２４時間凍結乾燥させ、ヒドラジンモノハイド
レート変性ＨＡ３００ｍｇを得た。

【００５２】 ジエチレントリアミン・ペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）を用いたＨＡの変性 ヒアルロナンナトリウム（２００ｍｇ，０．５０ｍｍｏｌ）を水２０ｍＬ中に
溶解させた。その溶液のｐＨを塩酸水溶液および水酸化ナトリウム（０．１Ｎ）
を用いて３．５ないし４．５の範囲に調整した。この溶液に対し、ＥＤＣ（９３
ｍｇ，０．５０ｍｍｏｌ）を添加し、その溶液のｐＨを３．５ないし４．５の範
囲に調整した。更に、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）（３８．２
ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）を用い水２０ｍＬ中に溶解させた。ついで、この溶液の
ｐＨを３．５ないし４．５の範囲に調整した。この溶液に対し、ＥＤＣ（３．７
ｍｇ，０．０２ｍｍｏｌ）を添加した。これら２つの溶液を一緒に混合させた。
更に、エチレンジアミン（１０ｍｇ，０．１７ｍｍｏｌ）を添加し、その溶液の
ｐＨを３．５ないし４．５の範囲に調整した。この反応混合物を室温で２時間、
維持した。また、塩酸水溶液（１０ｍＬ，０．１Ｍ）を添加し過剰のＥＤＣを破
壊し、ｐＨをＮａＯＨ水溶液（１Ｍ）を用いて７．０に調整した。この混合物を
ＹＭ３０膜を用いて限外濾過した。得られた粘性のポリマー溶液を水で希釈し、
更に２度目の限外濾過行った。この得られた濃縮ポリマー水溶液を２４時間凍結
乾燥させ、製品２４０ｍｇを得た。

【００５３】 ３つのタイプの変性ＨＡを収率、３００ないし３５０ｍｇの範囲で得た。この
変性の後、これらをガドリニウムと錯化させた。すなわち、変性ＨＡ水溶液（５
ｍＬ、１０ｇ／Ｌ）を塩化ガドリニウム水溶液（１ｍＬ、０．０５−０．２Ｍ）
に撹拌下で滴下した。ついで、この混合物を室温で２時間保った。ついで、この
溶液を透析バッグへ移し（分子量カットオフ：１２，０００ダルトン）、透析液
中にＧｄ³⁺が検出されなくなるまで水に対し透析した。この場合のＧｄ³⁺の検出
は、指示薬としてキシレノールオレンジを用い、比色テストにより判定した。こ
の得られたＨＡ−Ｇｄ錯体を精製溶液の凍結乾燥により分離し、その結果、無色
の物質が得られた。これをついで、生理学的緩衝液に溶かし、０．５−１．０ｇ
／Ｌの濃度のＭＲ造影剤溶液を得た。この変性ＨＡ−Ｇｄ³⁺錯体の観察から、Ｈ
ＡのＣ６位への変性により錯化ガドリニウムに対する結合親和性が増大したよう
に見受けられた。その結果、ＨＡとガドリニウムとの錯体の安定性がより増大し
た。

【００５４】 ガドリニウムと錯化したＤＴＰＡ変性ヒアルロン酸の製造のための方法 ＤＴＰＡの結合によるＨＡの変性の経路が図８に示されている。ＨＡのナトリ
ウム塩がその変性のための２つの異なる経路が示され、その１つはジエチレント
リアミン・ペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）を用いたものである。 このＤＴＰＡ経路のものは、エチレンジアミン（ＥＤＡ）を用いＨＡに結合さ
れているＮＨ₂ 基で進行し、幾つかの異なる製剤が形成され、或るものはＮＨ₂ 基に対するＥＤＡの割合は異なることが見られる。ついで、ＨＡ製剤上のＮＨ₂ 基にＤＴＰＡが結合される。最後にこれらの製剤にガドリニウムが錯化され、Ｈ
Ａ−Ｇｄ−ＤＴＰＡ錯体が形成される。

【００５５】 表２には、重量判定による水分量、¹ Ｈ ＮＭＲ分光法により得られるＤＴＰ
Ａモル％、上記経路により形成された異なる製剤のＩＣＰ分析から得られたガド
リニウムが示されている。表３には、異なる製剤で用いられた試薬成分が示され
ている。具体的には、ＨＡ−ＣＯＯＮａ、ＤＴＰＡ、ＤＣＣ（１，３−ジシクロ
ヘキシルカルボジイミド）、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）、ＥＥＤ
Ｑ（２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジハイドロキノリン）、
およびＥＤＡの量が示されている。表４には、カラムにおける異なる製剤の保持
時間が示され、この保持時間は製剤の分子量の関数となっている。

【００５６】

【表２】

【００５７】

【表３】

【００５８】

【表４】

【００５９】 使用された試薬および物質 ＤＴＰＡで使用された試薬は：ヒアルロン酸（ナトリウム塩）、ＴＥＡＴ（１
，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン１，４，８，１１−テトラ酢酸
テトラヒドロクロリドテトラハイドレート）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン
・ペンタ酢酸）、ＤＣＣ（１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド）、Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミド、ＥＥＤＱ（２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−
１，２−ジハイドロキノリン）、塩化ガドリニウム(III)ヘキサハイドレート、
アルセナゾIII（［２，２´−（１−８−ジヒドロキシ−３，６−ジスルホナフ
タレン−２，７−ビスアゾ）−ビスベンゼン・ヒ酸］）、アセトニトリル、メタ
ノール、エチレンジアミン、トリエチルアミン、ＨＣｌ、ＮａＯＨである。Spec tra/Por 分子多孔性透析チュービング（Spectrumから）（分子量カットオフ：１
２−１４，０００）も使用された。使用された全ての水はNanopure脱イオンシス
テムを用いて精製された。

【００６０】 （下記の２：１：１０の合成。他のポリマーについて使用された試薬の量につ
いては、表３参照のこと）

【００６１】 ＨＡへのＮＨ₂ 基の結合は以下のようにして進行する：

【００６２】

【化２】

【００６３】 ＨＡ−ＣＯＯＮａ（２５０ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）を蒸留脱イオン水（２０
ｍＬ）に溶解させた。そのｐＨ（ｐＨ紙で測定）を１．０Ｎ ＨＣｌで３に調整
した。ＭｅＯＨ（１５ｍＬ）に溶したＥＥＤＱ（０．３０９ｍｇ、１．２５ｍｍ
ｏｌ）を上記ＨＡ混合物に滴下した。ついで、エチレンジアミン（０．４２ｍＬ
、６．２ｍｏｌ）を添加し、その混合物を室温で２４時間、撹拌した。

【００６４】 この混合物を２Ｌ ＭｅＯＨ／Ｈ₂ Ｏ（１：１，ｖ：ｖ）に対し３日間、透析
し、ついで２Ｌ Ｈ₂ Ｏに対し３日間、透析した（ＭＷＣＯ：１２−１４，００
０ダルトン）。この透析された混合物を焼結ガラスフィルターを用いて真空濾過
し、凍結乾燥し、明るい白色固体（１５０ｍｇ、６０％収率）を得た。

【００６５】 ＨＡ−ＮＨ₂ へのＤＴＰＡの結合は以下のようにして進行する：

【００６６】

【化３】

【００６７】 アセトニトリル（５ｍＬ）に溶したＤＴＰＡ（０．５ｇ、１．２６ｍｍｏｌ）
およびトリエチルアミン（０．８８，５ＸＤＴＰＡのモル量）を摂氏５５度で全
てのＤＴＰＡが溶解するまで撹拌した。次に、室温まで冷却させたのち、ＤＣＣ
（０．３７２ｇ、１．８ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０．
２０８ｇ、１．８ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を室温で一晩、撹拌した。

【００６８】 別の丸底フラスコ内にて、ＨＡ−ＮＨ₂ （２５０ｍｇ，０．６２ｍｍｏｌ Ｎ
Ｈ₂ 、全てのＣＯＯＮａ基がアミン化されていたとして）を水２０ｍＬ中に溶解
させ、ついで、１．０Ｎ ＮａＯＨを用いてそのｐＨを１０に調整した。 ＤＴＰＡ／アセトニトリル混合物からの析出物を真空濾過により除去し、ろ液
をＨＡ−ＮＨ₂ 溶液に添加した。この混合物を撹拌下で室温に保った。この混合
物をついで蒸発させて溶媒を除去し、得られたゲルを水中に再溶解させ、濾過し
、２Ｌ Ｈ₂ Ｏに対して３日間透析した。この混合物をついで酸性化（ｐＨ３）
し、ＹＭ３０膜（Amicon）を用いて３連続限外濾過した。この混合物をついで凍
結乾燥し明るい白色固体（１６０ｍｇ、６４％収率）を得た。

【００６９】 ＨＡ−ＤＴＰＡによるＧｄ³⁺の錯化は以下のようにして進行する：

【００７０】

【化４】

【００７１】 ＨＡ−ＤＴＰＡの１％水溶液を作り、これに０．１Ｍ ＧｄＣｌ₃ 溶液を滴下
し、得られた混合物をＹＭ３０膜（Amicon）を用いて限外濾過した。ついでＧｄ
Ｃｌ₃ を添加したが、これはｐＨ３．８９、イオン強度（ＮａＣｌ）０．１で酢
酸塩緩衝液に溶したアルセナゾIIIを用いた比色テストによる判定で、Ｇｄ³⁺が
ろ液中に検出できるまで添加を続行した。 この溶液を更に２回、限外濾過した。この場合、各濾過サイクルの後、２０ｍ
Ｌの水を加えた。このＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄを凍結乾燥したところ、明るい白色
固体を得た。 製剤ＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄポリマー（２：１：５０ｅ）はＣＯＯＨに対し最も
高いＥＥＤＱ、ＤＴＰＡおよびＥＤＡの割合を示し、最も高いＧｄ含量を与えた
。製剤ＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄ（１：１：１０）はＣＯＯＨに対し最も低い割合の
ＤＴＰＡ量を有し、最も低いＧｄ含量を示した（表２）。

【００７２】 製剤を線状ヒドロゲルカラム（Waters社）に置き、製剤の分子量を測定するＧ
ＰＣ研究の結果、ＨＡの分子量は変性後も実質的に変化することはなかった（表
４参照）。このカラムの特徴は、テストされる製剤の分子量が減少すればするほ
ど、カラム上の保持時間が増大するというものである。このＨＡは用いられた反
応条件下では劣化しなかったと思われる。

【００７３】 変性ＨＡおよびＧｄの好ましい製造方法 ＨＡをＧｄと錯化する変性方法の内、エチレンジアミン又はヒドラジンで変性
を行う方法がある。この２つの変性方法のための好ましい方法について以下に説
明する。

【００７４】 エチレンジアミンの使用 エチレンジアミンを用いてＮＨ₂ をＨＡへ結合させるための方法 １（ａ）：ＨＡ−ＣＯＯＮａ（１．０ｇ）を蒸留脱イオン水（８０ｍＬ）に
溶解させた。そのｐＨ（ｐＨ紙で測定）を塩酸（ＨＣｌ、１．０Ｎ）で３に調整
した。メタノール（１５０ｍＬ）に溶したＥＥＤＱ（７．７ｇ）を上記反応混合
物に滴下した。ついで、この混合物を透明になるまで室温で撹拌した。ついで、
エチレンジアミン（ＥＤＡ）を上記反応混合物に添加し、室温で２４時間、撹拌
した。その溶液を透析バッグ（SpectraPore膜、分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）
６，０００ないし８，０００ダルトン）に収容した。この溶液をメタノール／水
（１／１ｖ／ｖ（容量比、２．０Ｌ））に対し３日間、更に水（２Ｌ）に対し３
日間、透析を行った。得られた溶液を限外濾過により濃縮した。生成したポリマ
ーは凍結乾燥により分離した（ＨＡ−ＮＨ₂ 、３．０ｇ）。

【００７５】 ２（ａ）：ＨＡ−ＣＯＯＮａ（１．０ｇ）を蒸留脱イオン水（８０ｍＬ）に
溶解させた。そのｐＨを塩酸（ＨＣｌ、１．０Ｎ）で３に調整した。ジメチルホ
ルムアミド（１５０ｍＬ）に溶したＥＥＤＱ（７．７ｇ）を上記反応混合物に滴
下した。ついで、この混合物を透明になるまで室温で撹拌した。ついで、エチレ
ンジアミン（ＥＤＡ、８ｍＬ）を上記反応混合物に添加し、室温で２４時間、撹
拌した。その溶液を透析バッグ（SpectraPore膜、分子量カットオフ（ＭＷＣＯ
）６，０００ないし８，０００ダルトン）に収容した。この溶液をイソプロパノ
ール／水（１／１ｖ／ｖ、２．０Ｌ）に対し１昼夜、更に水（２Ｌ）に対し３日
間、透析を行った。得られた溶液を限外濾過により濃縮した。生成したポリマー
は凍結乾燥により分離した（ＨＡ−ＮＨ₂ 、０．４６ｇ）。

【００７６】 ３（ａ）：ＨＡ−ＣＯＯＮａ（２．０ｇ）を蒸留脱イオン水（２０００ｍＬ
）に溶解させた。そのｐＨを塩酸（ＨＣｌ、１．０Ｎ）で３に調整した。ジメチ
ルホルムアミド（１５０ｍＬ）に溶したＥＥＤＱ（１５．４ｇ）を上記反応混合
物に滴下した。ついで、この混合物を透明になるまで室温で撹拌した。ついで、
エチレンジアミン（ＥＤＡ、１８ｍＬ）を上記反応混合物に添加し、室温で２４
時間、撹拌した。その溶液を透析バッグ（SpectraPore膜、分子量カットオフ（
ＭＷＣＯ）６，０００ないし８，０００ダルトン）に収容した。この溶液をイソ
プロパノール／水（１／１ｖ／ｖ、２．０Ｌ）に対し１昼夜、更に水（２Ｌ）に
対し３日間、透析を行った。得られた溶液を限外濾過により濃縮した。生成した
ポリマーは凍結乾燥により分離した（ＨＡ−ＮＨ₂ 、０．９６ｇ）。

【００７７】 ＨＡ−ＮＨ₂ に対するＤＴＰＡの反応方法 １（ｂ）：ＤＴＰＡ（１．９２ｇ）のアセトニトリル（２０ｍＬ）懸濁液を
トリエチルアミン（３．４ｍＬ）の存在下で摂氏５５度で完全に溶解するまで加
熱した。ついで、その冷却した溶液中にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０．８
５ｇ）およびＤＣＣ（１．５１ｇ）を添加した。得られた懸濁液を室温で２４時
間撹拌した。次に濾過により生成白色析出物を除去した。ろ液をＨＡ−ＮＨ₂ 水
溶液（上記工程１（ａ）で得たもの０．５ｇ、水酸化ナトリウム（１．０Ｎ）の
滴下でｐＨ１０に調整した）に添加した。この反応混合物を室温で２４時間、撹
拌した。この混合物を濾過し、そのろ液を限外濾過により濃縮し、水で徹底的に
洗浄した。生成したポリマー（ＨＡ−ＤＴＰＡ）を凍結乾燥により分離した（０
．２４ｇ）。

【００７８】 ２（ｂ）：ＤＴＰＡ（２．０ｇ）のアセトニトリル（２０ｍＬ）懸濁液をト
リエチルアミン（３．４ｍＬ）の存在下で摂氏５５度で完全に溶解するまで加熱
した。ついで、その冷却した溶液中にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０．９ｇ
）およびＤＣＣ（１．５０ｇ）を添加した。得られた懸濁液を室温で２４時間撹
拌した。次に濾過により生成白色析出物を除去した。ろ液をＨＡ−ＮＨ₂ 水溶液
（上記工程３（ａ）で得たもの０．５ｇ、水酸化ナトリウム（１．０Ｎ）の滴下
でｐＨ１０に調整した）に添加した。この反応混合物を室温で２４時間、撹拌し
た。この混合物を濾過し、そのろ液を限外濾過により濃縮し、水で徹底的に洗浄
した。生成したポリマー（ＨＡ−ＤＴＰＡ）を凍結乾燥により分離した（１．０
ｇ）。

【００７９】 ＨＡ−ＤＴＰＡのＧｄ(III)との錯化 水（０．１Ｍ）に溶したＧｄＣｌ₃ の溶液をＨＡ−ＤＴＰＡの水溶液（１．０
％ｗ／ｗ）に添加した。過剰のＧｄ(III)を限外濾過し、水で徹底的に洗浄した
。得られたポリマー（ＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄ）を凍結乾燥により回収した。Ｇｄ
含量は検量用標準ＧｄＣｌ3 を用い中性子活性化法により判定した。 製剤ａ： Ｇｄ含量３．５ｗｔ％、ＨＡ−Ｇｄ０．５９ｇ 製剤ｂ： Ｇｄ含量９．４ｗｔ％、ＨＡ−Ｇｄ０．７１ｇ 製剤ｃ： Ｇｄ含量９．２ｗｔ％、ＨＡ−Ｇｄ１．０ｇ

【００８０】 ヒドラジンの使用 ＨＡへのヒドラジンの結合 水（２５ｍＬ）に溶した１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチル
カルボキシジイミド（ＤＥＣ、１．０ｇ）の溶液を、蒸留脱イオン水（５０ｍＬ
）に溶解させたＨＡ−ＣＯＯＮａ（１．０ｇ）の溶液中に添加した。その溶液の
ｐＨを塩酸（ＨＣｌ、１．０Ｎ）で３．２に調整した。ついで、この混合物を透
明になるまで室温で撹拌した。ついで、水（５０ｍＬ）に溶したアジピン酸ジヒ
ドラジン（ＡＤＨ、４．１ｇ）の溶液を上記反応混合物に添加し、室温で２４時
間、撹拌した。得られた溶液を限外濾過により濃縮した。生成したポリマーは凍
結乾燥により分離した（ＨＡ−ＡＤＨ、０．６ｇ）。

【００８１】 ＨＡ−ＡＤＨへのＤＴＰＡの結合 水（１００ｍＬ）に溶したＨＡ−ＡＤＨ（０．６ｇ）の溶液に対し、ＤＥＣ
（１．０ｇ）およびＤＴＰＡ（１．８ｇ）を添加し、その溶液のｐＨを塩酸（Ｈ
Ｃｌ、１．０Ｎ）で３に調整した。ついで、この混合物を２４時間、室温で撹拌
し、限外濾過により精製した。生成したポリマー（ＨＡ−ＤＴＰＡ）を凍結乾燥
により分離した（０．５９ｇ）。

【００８２】 ＨＡ−ＤＴＰＡのＧｄ(III)との錯化 水（０．１Ｍ）に溶したＧｄＣｌ₃ の溶液をＨＡ−ＤＴＰＡの水溶液（１．０
％ｗ／ｗ）に添加した。過剰のＧｄ(III)を限外濾過し、水で徹底的に洗浄した
。得られたポリマー（ＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄ）を凍結乾燥により回収した（０．
５２ｇ；Ｇｄ含量：３．５ｗｔ％）。

【００８３】 酸化鉄系像形成剤 酸化鉄の超常磁性型はイオン性多糖類中に容易に形成することができ、これを
ＨＡと錯化し、像形成剤を得ることができる。得られたナノ複合体は安定な水性
フェロ流体に崩壊させることができる。ＨＡは磁性ナノ複合体の製造のため、お
よび後のフェロ流体形成のテンプレートとして使用される。架橋性イオン（Ｆｅ ²⁺ ）はナノ結晶性酸化鉄の現場形成のための反応中心として役立つ。第１鉄イオ
ンの酸化は殆どが酸化鉄の超常磁性型（マグヘマイト（ガンマーＦｅ₂ Ｏ₃ ）又
は磁鉄鉱（Ｆｅ₃ Ｏ₄ ））の形成につながる。脱水ゲルの室温飽和磁化は、Ｆｅ
２１％（ｗ／ｗ）を含む乾燥試料の場合、３０ｋＯｅで１２ｅｍｕ ｇ^-1であっ
た。これらのゲルは水中の超音波処理又はＬ−アスコルビン酸での処理により強
力な磁性のコロイド的に安定なフェロ流体に変換される。このフェロ流体は透過
型顕微鏡（ＴＥＭ）分析により、２５−４０ｎｍのサブミクロンの結晶性酸化鉄
粒子であることが判明した。これら粒子の電子解析パターンには、ガンマーＦｅ ₂ Ｏ₃ およびＦｅ₃ Ｏ₄ の特徴的解析リングが示された。なお、これら２つの相
を区別することは困難であった。

【００８４】 準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）によるこのフェロ流体の寸法分布分析により、３つ
の粒子分布の存在が判明した。この検出された１つの粒子分布は２０−５０ｎｍ
の寸法範囲であった。このＱＥＬＳ測定は、ＨＡの残留鎖により安定化された酸
化鉄粒子の寸法分布を生じさせるため、ＴＥＭの結果と比較して若干大きいサイ
ズのものは酸化物粒子を囲むポリマー鎖のコロナに原因するものと思われる。更
に、ヒストグラムにより１２５−２５０ｎｍの範囲のより大きい粒子が判明した
。これはより小さな粒子の凝縮物を表していると思われる。４ｎｍを中心とする
他の信号は遊離ＨＡによるものである。

【００８５】 フェロ流体の表面電荷特性は毛管電気泳動により判定された。ＨＡ−酸化鉄粒
子（フェロ流体）は中性マーカーとして使用したカフェインの後の広い帯域とし
て溶離し、それにより、このフェロ流体がマイナス電荷の粒子からなることを示
した。このマイナス電荷はＨＡ中のカルボキシレート基の存在によるものであり
、酸化鉄粒子を安定化している。この粒子の電気泳動運動性およびゼータ電位は
エレクトロフェログラムから計算した。フェロ流体中の粒子の表面特性に対する
ｐＨ、イオン強度および印加電圧の影響を調べるため、ｐＨ、イオン強度および
印加電圧を変化させて実験を行った。これらの実験の結果から、ｐＨおよび印加
電圧は実験の範囲では電気泳動運動性に対し有意な影響がないことが判明した。
電気泳動運動性は、ｐＨ６ないし１１、印加電圧１５、２０および２５ｋＶで１
０および２５ｍＭリン酸塩緩衝液についての全てのサンプルは３ｘ１０^-8ｍ² ／
Ｖ．ｓｅｃ（ゼータ電位＝−４０ｍＶ）であった。しかしながら、緩衝液の濃度
が減少したとき、電気泳動運動性は増大した（図６参照）。より高い緩衝液濃度
においては、粒子上の表面電荷は減少した。なぜならば、Ｎａ⁺ およびＰＯ₄ ^3- イオンの増加は粒子の周りの電気二重層を圧縮し、粒子表面上のマイナス荷電基
を覆ってしまうからである。

【００８６】 ナノ複合体を製造するため、１０ｇ／ＬのＨＡ溶液を、メタノール／水（５０
／５０ｖ／ｖ）に溶した０．１ＭのＦｅＣｌ₂ 溶液にて製造した。その結果、ゲ
ル化が直ちに生じ、ＦｅＣｌ₂ 溶液に大きな、透明黄色ヒドロゲルフラグメント
が形成された。この懸濁液を静窒素雰囲気下で室温に３時間保持した。その後、
ＨＡゲルフラグメントをメタノール／水（５０／５０ｖ／ｖ）で完全に洗浄し、
錯化されなかったＦｅ²⁺イオンをゲルから除去した。メタノール／水（５０／５
０ｖ／ｖ）に溶したＮａＯＨの０．５Ｍ溶液を洗浄したゲルに添加し、錯化Ｆｅ ²⁺ イオンを加水分解した。この溶液を窒素ガスで２時間、バブリングした。つい
で、更に２時間、酸素でバブリングし、褐色のゲルを形成した。この反応サイク
ル（充填）を同一のゲルバッチで５回、繰り返した。その結果、各充填および酸
化の後、ＨＡゲルは暗色化し、磁性が増大し、５回の充填サイクルの後には暗褐
色ゲルとなった。このナノ複合ゲルの凍結乾燥サンプルを磁気特性について測定
し、Ｘ線回折により相分析を行った。

【００８７】 フェロ流体を得るため、このゲル状製品を遠心分離し、洗浄し、メタノールを
除去し、ついで脱イオン水中に再分散させた。更に、Ｌ−アスコルビン酸の水溶
液（１ｍＭ）をこの懸濁液に添加し、その結果えられた混合物を室温で２４時間
、撹拌し、ついで３０分間超音波処理した。これを１０，０００ＭＷＣＯ ＤＩ
ＡＦＬＯ膜を用い、６０ｐｓｉの窒素ガス圧で限外ろ過した。その結果、ＨＡに
より安定化された酸化鉄の均一懸濁液（フェロ流体）を得た。このフェロ流体は
固形分は懸濁液１ｍＬ当たり６．６ｍｇ（乾燥）であり、鉄（Ｆｅ）含量は乾燥
固形分の４０重量％であった（元素分析により判定）。

【００８８】 このフェロ流体の寸法の分析はＴＥＭおよびＱＥＬＳで行った。ＴＥＭサンプ
ルはフェロ流体を２−プロパノールに分散させて作成し、その懸濁液の１滴をカ
ーボン被覆ＴＥＭグリッド上に滴下し、乾燥させた。ＱＥＬＳについては、フェ
ロ流体の希釈懸濁液を脱イオン水中にて作成した。毛管電気泳動（ＣＥ）を用い
、フェロ流体粒子の表面電荷および電気運動性を特徴付けた。ＣＥについてのサ
ンプルは、ＨＡの５％（ｖ／ｖ）（フェロ流体に基づく）およびカフェイン原料
溶液（１ｍｇ／ｍＬ）の５％（ｖ／ｖ）をリン酸ナトリウム緩衝液に添加するこ
とにより作成した。カフェインは中性マーカーとして作用し、電気浸透流れの計
算のために用いることができる。実験は、室温で、ｐＨ５．５−１１（１ｍＭ、
１０ｍＭ、２５ｍＭリン酸塩緩衝液濃度）、更に印加電圧１５ないし３０ｋＶで
行った。前述のように、ＨＡ−鉄酸化物の電気泳動運動性は約３ｘ１０^-8ｍ² ／
Ｖ．ｓｅｃであった。

【００８９】 その他の方法として、メタノール／水（５０／５０ｖ／ｖ）に溶したＦｅＣｌ ₂ 溶液（０．２Ｍ、２５ｍＬ）を窒素で１５分間、バブリングすることにより脱
ガスして磁性ゲルを製造してもよい。メタノール／水（５０／５０ｖ／ｖ）に溶
したＨＡ溶液（１０ｇＬ^-1を２５ｍＬ）を、１６Ｇ針を備えた注射器を用い、激
しい撹拌下で滴下した。その結果、ゲル化が直ちに生じた。この混合物を窒素雰
囲気下で３時間、撹拌した。これを遠心分離し、この溶液からＦｅ²⁺付加ＨＡゲ
ルを分離した。このゲルをメタノール／水で３回洗浄し、過剰のＦｅ²⁺を除去し
た。この洗浄したゲルを、メタノール／水（５０／５０ｖ／ｖ）に溶した０．５
Ｍ水酸化ナトリウム溶液２５ｍＬを収容したフラスコ内に仕込んだ。この混合物
を室温で２３時間、撹拌し、ついで、更に２時間、酸素でバブリングし、褐色の
磁性ゲルを形成した。上記手順（充填）を５回、繰り返して磁性ＨＡゲルサンプ
ルを得た。その結果、各充填および酸化の後、ＨＡゲルは暗色化し、磁性が増大
し、５回の充填サイクルの後には暗褐色ゲルを得た。

【００９０】 ５回の充填サイクルの後に分離したゲル（２０ｍｇ）を、超音波バスにて１．
０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝６．９３）２ｍＬ中に分散させた。他の
ゲルサンプル（１０ｍｇ）を超音波バスにて１．０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ＝６．９３）１ｍＬ中に分散させた。更に、Ｌ−アスコルビン酸の水溶液
（１．０ｍＭ、１ｍＬ）をこの分散液に添加し、その結果えられた混合物を３０
分間超音波処理した。これを室温で、水に対し透析し精製した。これら双方の懸
濁液はＭＲ画像化剤として有用であると考えられる。

【００９１】 ゲルおよび流体の特徴付け ＨＡ−酸化鉄ゲル内の鉄含量の測定 ＨＡ−酸化鉄ゲルのサンプルを水で２回濯ぎ、ついで凍結乾燥した。３つの
異なるサンプル（７−８ｍｇ）を正確に重量測定し、３つの試験管にそれぞれ収
容した。ついで、濃塩酸（２ｍＬ）を添加しこれらサンプルを溶解させた。得ら
れた溶液をろ過した。ろ液を１０ｍＬフラスコに移し、脱イオン水で１０ｍＬに
希釈した。この溶液を２５ｍＬフラスコに移し、これにＮＨ₂ ＯＨ、ＨＣｌ（２
．５ｍＬ、５０ｇＬ^-1）の水溶液およびｏ−フェナントロリン（５ｍＬ、１．０
ｇＬ^-1）水溶液５ｍＬを添加した。この混合物を１．２Ｍの酢酸ナトリウム緩衝
液（１．２Ｍ、ｐＨ＝３．５）を用いて２５ｍＬに希釈した。吸光度は５１０ｎ
ｍで測定した。このデータは、公知の濃度の溶液から確立された検量曲線を用い
、Ｆｅ含量に変換された。表５は、２回、３回、４回および５回の連続的充填後
のゲルの鉄含量を示している。

【００９２】

【表５】

【００９３】 ＨＡ−酸化鉄の総炭水化物含量の測定 フェノール水溶液（０．０５ｍＬ、８０％ｗ／ｗ）をＨＡ−酸化鉄（２ｍＬ、
５−４０マイクログラム／ｍＬ）の懸濁液に添加した。濃硫酸（５ｍＬ）を液体
表面にできるだけ接近させて急速に添加した。この溶液を室温で１０分間、保持
した。ついで、撹拌して水バス内に収容し摂氏３０度で２０分間保った。４９０
ｎｍでの溶液の吸光度を測定し、炭水化物含量はＨＡで得られた検量曲線を用い
て計算した。

【００９４】 ＨＡ系像形成剤のヒト乳ガン細胞系に対する結合能力の評価 ヒト乳ガン細胞系に対するＨＡ系像形成剤の結合能力を判定するため、蛍光染
料Ｃｙ３、テキサスレッド、又は他の適当な染料を、リポソームと錯化させたＨ
Ａ像形成剤に結合させた。この結合能力の検討はＣｙ３−ＨＡ単独のものを含み
、ＭＲ像形成剤との結合が細胞表面への結合能力を変化させるか否かを判定した
。リポソームと錯化させたＨＡ像形成剤はリポソーム内へのカプセル化のため細
胞中での保持時間がより長くなるものと考えられる。Ｃｙ３−ＨＡは、ＨＡ（Ｆ
ＩＴＣ−ＨＡ）を用いるところの５９０ｎｍで発光するフルオレセイン・イソチ
オシアナート・フルオロクロムの製造方法と同一の手法で製造された。このＨＡ
（ＦＩＴＣ−ＨＡ）はＨＡ／細胞表面相互作用の研究のために広く使用されてい
る。ＨＡのＣｙ３を用いた標識付けはＨＡの結合特性に影響を与えることはない
。Ｃｙ３は急速に消滅しないのでＦＩＴＣよりも優れている。

【００９５】 図１に記載した細胞系はこの研究のために使用ことができる。なぜならば、Ｈ
Ａレセプターの発現が十分に記載されているからである。細胞をフロー細胞計算
（ＦＡＣＳ）分析のために作成し、ついでＣｙ３−ＨＡ像形成剤を用い、氷上で
１時間、保温した。活細胞を基底から解放させ、ＦＩＴＣ ＩＬＡ±抗体と共に
保温し、リン酸塩緩衝塩溶液（ＰＢＳ）で洗浄し、ついで５９０ｎｍの波長でフ
ローサイトメータを用い細胞表面蛍光分析を行った。また、結合特異性を判定す
るため、幾つかのアプローチを用いた：ａ）非標識ＨＡの１００倍過剰の存在下
で、細胞をＣｙ３−ＨＡ系像形成剤と共に保温した；ｂ）ストレプトマイセス・
ヒアルロニダーゼで処理したＣｙ３−ＨＡ系像形成剤と共に細胞を保温し、ＨＡ
を崩壊させ、レセプターに結合しないようにした。最後に、表１に記載した細胞
系の表面のＨＡレセプターの存在を、ＲＨＡＭＭおよびＣＤ４４に対するモノク
ローン抗体であって市販のもの（Applied Bioligand, Man, Can）を用いてＦＡ
ＣＳ分析で確認した。総括的に、これらの実験は、Ｃｙ３−ＨＡと同様に、ＨＡ
像形成剤が細胞表面に特異的に結合することを実証するものと考えられる。細胞
系が異なるレベルのＨＡレセプターを示すから、これらの実験の結果は、ＨＡレ
セプター表示と結合されたＣｙ３−ＨＡ系像形成剤との相関関係を実証するもの
である。

【００９６】 ヌードラットにおけるヒト乳ガン腫に対するＨＡ系像形成剤の標的指向能力の 評価 ＨＡ系像形成剤に対し特異的に結合する乳ガン細胞系のうち、ＨＡ系像形成剤
に対し最も強く結合する細胞系およびＨＡ系像形成剤に対し最も弱く結合する細
胞系は、ＲＨＡＭＭおよびＣＤ４４レセプターのいずれか、又は双方の役割を確
認するものであると思われる。ヌードラットにおいて異種移植として成長したこ
れらの細胞系に向けて指向する選択されたＨＡ系像形成剤の能力が判定された。
すなわち、ヒト乳ガン細胞（１０⁶ ）をヌードラットに皮下注射し、触知可能な
腫瘍サイズにまで成長させる手法により、これら細胞がin vivoでＣＤ４４およ
びＲＨＡＭＭを発現することが確認された。この腫瘍を切り取り、単一細胞を得
ることによりＲＨＡＭＭおよびＣＤ４４の細胞表面表示について分析し、ＲＨＡ
ＭＭおよびＣＤ４４抗体の細胞表面結合性をＦＡＣＳで定量した。確認のため、
たんぱく質溶解物を作り、ＲＨＡＭＭおよびＣＤ４４の存在についてもウエター
ンブロック検査で検出した。更に、ｍＲＮＡを腫瘍細胞から得ると共に、適当な
プライマーを用いてＲＨＡＭＭおよびＣＤ４４の双方のＲＴ−ＰＣＲ分析を行っ
た。

【００９７】 選択された細胞系（１０⁶ 細胞／ラット）を注射し、大きなサイズの腫瘍を得
るため、種々の期間に亘り腫瘍を成長させた。上記研究から選ばれたＨＡ系像形
成剤を125 Ｉで標識付けし、標的指向性をりん光画像化により確認し得るように
した。全ての動物をＭＲで画像化することができる。なぜならば、この方法はり
ん光画像化より感度が高いからである。実験のため、最初に１０ｍｇ／ｋｇの硫
酸コンドロイチンを動物たちに注射し、肝臓内でＨＡを取り上げるスカベンジャ
ーレセプターを下向き調節した。ついで、二重標識付けＨＡ像形成剤を１時間後
に静脈注射し、りん光画像化し、これら動物のＭＲ画像を取った。なお、このタ
イミングは問題とはならない。なぜならば、ＨＡは腫瘍に対し１２−２４時間、
その標的指向性を維持することが研究により確認されているからである。これら
実験によりＨＡ像形成剤がヒト乳ガン腫瘍を標的として作動し、ＭＲ画像化法を
用いて画像化できる最小の大きさの腫瘍を実証し得ることが認められた。

【００９８】 ＨＡ系像形成剤の標的指向させるＣＤ４４およびＲＨＡＭＭの役割 この標的指向におけるＣＤ４４およびＲＨＡＭＭの役割は幾つかのアプローチ
により直接的に実証し得ると考えられる。第１のアプローチにおいては、ヒト骨
髄腫細胞に対しＦＩＴＣ−ＨＡの結合をブロックする抗体を使用することができ
る。この抗体をin vivoで使用する前に、Ｃｙ−ＨＡへの結合を抑制するこれら
抗体の能力についてＦＡＣＳ分析を用いて検査する。ＨＡ系像形成剤の標的指向
に対するこれら抗体の作用をＭＲ画像化法により、まず、in vitroで行い、つい
でin vivoで行った。しかし、レセプター抗体の最適濃度を実験的に詳細に調べ
るため、標的化をブロックするこれら試薬の能力を最初に検査した。すなわち、
硫酸コンドロイチンの静脈注射の１時間後で、上記ＨＡの注射の０ないし１５分
前に、これら抗体を動物に対し静脈注射した。

【００９９】 この標的指向に対するこれら抗体の作用は注射後の種々の時間で定量化するこ
とができる。レセプターへのＨＡの結合は複雑であり、骨髄腫細胞に対するＨＡ
の結合に影響する抗体が乳ガン細胞に対するＨＡの結合に影響を及ぼさないこと
もあり得る。もし、これらの抗体がin vitroでＨＡの結合をブロックするのに有
効でない場合は、ＣＤ４４およびＲＨＡＭＭのＨＡ結合領域に対するアンチセン
ス・ぺプチドが使用される。このアプローチはin vivoにおいてＡＴ−１レセプ
ターを良好にブロックするのに利用することができる。ＣＤ４４およびＲＨＡＭ
Ｍの双方はＨＡに結合するためには塩基性アミノ酸モチーフの存在を必要とし、
この領域に対するアンチセンスペプチドが作られる。これらは上述のように抗体
のためにin vitro又はin vivoで投与される。ＨＡの分布に対するペプチドの作
用はＦＡＣＳにより評価される。有効な濃度範囲は実験的に決定することができ
る。

【０１００】 他のアプローチとして、ヒト結合性ファージ・ディスプレイ・ライブラリーを
使用して、ヒトのためマウスに保存されているＣＤ４４およびＲＨＡＭＭのＨＡ
結合モチーフを認識し得る抗体を分離することができる。これらのシーケンスに
対するモノクローンおよびポリクローン抗体を得ることが試みられたが、ポリク
ローン応答を得ることができなかった。しかし、上記、ファージ・ライブラリー
を使用することにより、これらの領域を認識し得るヒト抗体を得ることができる
。 これらのヒト抗体の回収によりＨＡ結合に対するそれらの影響を試験するの
に使用することが可能となる。すなわち、これらの抗体はＣＤ４４およびＲＨＡ
ＭＭレセプターと結合しＨＡ又はＨＡ系造影剤がこれらに結合するのを防止する
。従って、これらの抗体はＨＡの細胞への結合におけるＣＤ４４およびＲＨＡＭ
Ｍの役割を明確にすることができる。

【０１０１】 中枢神経系（ＣＮＳ）疾患におけるＨＡ−Ｇｄ造影剤の役割 ＣＮＳ疾患のためのＨＡ−Ｇｄ造影剤の３つの使用例が、脳腫瘍、脳卒中誘発
傷害、アルツハイマー型神経退化などの画像化についてなされた。ガドリニウム
は現在、ＣＮＳの画像化に使用されているが、血管−脳バリアの破裂が生じた部
位でのみしか有効でない。従って、無傷な脈管領域を包含する腫瘍全体を可視化
するのには有効ではない。アルツハイマー病において、現在のＭＲ画像はひどい
組織衰弱のみ可視化することができ、従って、病気の進行の後期のみに有効であ
る。脳卒中の場合、傷つけられた組織をＭＲで可視化することができるが、炎症
細胞の管脈への浸潤により媒介されるような二次的プロセスを介して更に傷害を
及ぼすような生体力学的変化が進行している管脈系全体を明らかにすることはで
きない。

【０１０２】 上記疾患のそれぞれにおいて、中枢神経又は関連する血管におけるヒアルロナ
ン（ＨＡ）レセプターの上向き調節作用が明らかに認められる。これらのレセプ
ターにはＨＡレセプター、ＲＨＡＭＭおよびＣＤ４４が含まれる。細胞内接合分
子（ＩＣＡＭ−１）のレベルもこれらの疾患で上昇し、このＩＣＡＭは、ＨＡと
結合する肝臓内皮ＨＡレセプターと同一と見ることができる。 ＨＡ／ガドリニウム接合体はガドリニウムが現在、有効に使用されているＣＮ
Ｓ組織のみならず、血管脳バリアが無傷でありＨＡレセプターの増加を示す領域
のＭＲ画像化を可能とすると考えられる。なお、このＨＡレセプターの増加は潜
在的局所傷害を反映する管脈および組織機能の変化を示すものである。この有用
性は高揚したＨＡレセプターと組織傷害との関連の証拠に基づくものである。

【０１０３】 本発明の種々の具体例について説明したが、これらは単に説明のためのもので
あるから、当業者が本発明の要旨を逸脱することなく、種々変更、置換し得るこ
とは明らかであり、従って、それらの変更、置換も本発明の範囲に含まれること
を理解されたい。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ヒト乳ガン細胞系の特徴を示す表である。

【図２】 放射性同位元素標識付けＨＡのラットの腫瘍との関連を示すヌードラットのシ
ンチグラム像である。

【図３】 放射性同位元素標識付けＨＡのラットの頸動脈との関連を示すヌードラットの
シンチグラム像である。

【図４】 ヒアルロナンを静脈注射した後のヒアルロナンの分子量分布を示すグラフ図で
ある。

【図５】 ＨＡをガドリニウム錯化剤に結合させるための２つの方式を示す図である。

【図６】 ＨＡ−酸化鉄粒子の電気泳動運動性に対するリン酸塩緩衝液のｐＨおよび濃度
の影響を示すグラフ図である。

【図７】 リポソームを錯化された疎水変性されたＨＡを示す図である。

【図８】 ペンタ酢酸ジエチレントリアミン（ＤＴＰＡ）を結合させ、ガドリニウムと錯
化させることによるＨＡの変性のための経路を示す図である。

【図９】 セファロースビーズに結合させたＨＡ−Ｇｄと遊離ＧｄのＭＲＩ信号強度を濃
度の関数として示すグラフ図である。

【図１０】 肝臓におけるＨＡ−Ｇｄと遊離Ｇｄの信号強度を時間の関数として示すグラフ
図である。

【図１１】 骨格筋におけるＨＡ−Ｇｄと遊離Ｇｄの信号強度を時間の関数として示すグラ
フ図である。

【図１２】 良性および悪性腫瘍細胞におけるＣＤ４４およびＲＨＡＭＭ細胞表面レセプタ
ーの発現をＦＡＣＳ分析を用いて示すグラフ図である。

【図１３】 良性および悪性腫瘍細胞におけるテキサスレッド標識付けＨＡの摂取を濃度の
関数として示すグラフ図である。

【図１４】 異なるレベルのＨＡレセプターを発現する異なる細胞系による標識付けＨＡの
摂取（内面化）を時間の関数として示すグラフ図である。

【図１５】 良性および悪性腫瘍細胞のＭＲＩ信号強度をＨＡ−Ｇｄ置換レベル（％）の関
数として示すグラフ図である。

【図１６】 ＨＡ−Ｇｄを注射したラットにおける特定の組織での信号強度を示す図である
。

【図１７】 抗ＣＤ４４抗体、ＫＭ２０１の標識付けＨＡの信号強度に対する影響を示すも
ので、このＨＡはＨＡレセプターを発現する異なる細胞系に添加されている。

【図１８】 異なる細胞系における標識付けＨＡの摂取に対する抗ＣＤ４４抗体、ＫＭ２０
１の影響を示す共焦蛍光画像を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 ノジイ，ジェームス，アイ． カナダ アール３ピー ０エム７ マニト ウバ ウイニペグ マッククリーリイ ロ ード 1662 (72)発明者 ターリイ，エヴァ，アン カナダ エム４ヴイ １アール４ オンタ リオ トロント セント．クレア アヴェ ニュ ウエスト 234 スイート 104 (72)発明者 ウイニク，フラーンソワーズ，マルタン カナダ エル９エイチ ６ピー８ オンタ リオ ダンダス ナンバー208 メイン ストリート 50 Ｆターム(参考） 4C085 HH07 JJ05 KB08 KB12 KB45 KB79 LL18 4C096 AA11 AB04 AC10 AD19 FC14

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒアルロナンおよびガドリニウムを具備してなるＨＡ系像形
   成剤。
2. 【請求項２】 ヒアルロナン、ガドリニウムおよびリポソームを具備してな
   るＨＡ系像形成剤。
3. 【請求項３】 ヒアルロナンおよび酸化鉄を具備してなるＨＡ系像形成剤。
4. 【請求項４】 ジエチレントリアミンペンタ酢酸を更に具備してなる請求項
   １記載のＨＡ系像形成剤。
5. 【請求項５】 ガドリニウムを３ないし１２重量％含む請求項４記載のＨＡ
   系像形成剤。
6. 【請求項６】 ガドリニウムを５．６ないし９．６重量％含む請求項４記載
   のＨＡ系像形成剤。
7. 【請求項７】 ヒアルロナンの平均分子量が約２０，０００ないし２００，
   ０００である請求項６記載のＨＡ系像形成剤。
8. 【請求項８】 ヒアルロナンの平均分子量が約５０，０００ないし１００，
   ０００である請求項６記載のＨＡ系像形成剤。
9. 【請求項９】 カルボキシル基を有するヒアルロナンをエチレンジアミンと
   結合させてＮＨ₂ −変性ヒアルロナンを形成する工程と、 このＮＨ₂ −変性ヒアルロナンをジエチレントリアミンペンタ酢酸と接触させ
   てＤＴＰＡ−変性ヒアルロナンを形成する工程と、 このＤＴＰＡ−変性ヒアルロナンをガドリニウムと接触させてＨＡ−ガドリニ
   ウム像形成剤を形成する工程と、 を具備してなるＨＡ−Ｇｄ像形成剤の製造方法。
10. 【請求項１０】 カルボキシル基を有するヒアルロナンを水と結合させてＨ
    Ａ溶液を形成する工程と、 このＨＡ溶液に塩酸を加えてＨＡ溶液のｐＨを約３．０に調整する工程と、 メタノール溶液中にて上記ＨＡ溶液に２−エトキシ−１−エトキシカルボニル
    −１，２−ジヒドロキノリンを添加する工程と、 このＨＡ溶液をエチレンジアミンと接触させる工程と、 このＨＡ溶液をアルコールおよび水からなる溶液を用いて透析する工程と、 このＨＡ溶液を水を用いて透析する工程と、 このＨＡ溶液を濃縮し、凍結乾燥させてＮＨ₂ −変性ヒアルロナンを形成する
    工程と、 ジエチレントリアミンペンタ酢酸のアセトニトリル溶液にトリエチルアミンを
    添加してＤＴＰＡ溶液を形成する工程と、 上記ＮＨ₂ −変性ヒアルロナンをこのＤＴＰＡ溶液−変性ヒアルロナンと接触
    させてＨＡ−ＤＴＰＡ溶液を形成する工程と、 このＨＡ−ＤＴＰＡ溶液のｐＨを約１０．０にて維持する工程と、 このＨＡ−ＤＴＰＡ溶液を凍結乾燥させてＤＴＰＡ変性ヒアルロナンを形成す
    る工程と、 このＤＴＰＡ変性ヒアルロナンを塩化ガドリニウム水溶液と接触させてＨＡ−
    ＤＴＰＡ−Ｇｄ溶液を形成する工程と、 このＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄ溶液を凍結乾燥させてＨＡ−ガドリニウム像形成剤
    を形成する工程と、 を具備してなるＨＡ−Ｇｄ像形成剤の製造方法。
11. 【請求項１１】 ヒアルロナンを塩化鉄と接触させてゲルを形成する工程と
    、 該ゲルから非錯化酸化鉄を除去する工程と、 該ゲルを水酸化物で処理する工程と、 該ゲルを酸素を用いてバブリングさせて磁性ゲルを形成する工程と、 を具備してなるＨＡ−酸化鉄像形成剤の製造方法。
12. 【請求項１２】 ＨＡレセプターの存在の有無を測定することにより腫瘍細
    胞の良性又は悪性を判定する方法であって、 腫瘍細胞にヒアルロナン系像形成剤およびヒアルロナンを含まない像形成剤と
    接触させる工程と、 これら像形成剤により発生した信号を比較してＨＡレセプターの存在の有無を
    判定する工程と、 このＨＡレセプターの存在の有無から腫瘍細胞の良性又は悪性を評価する工程
    と、 を具備してなる方法。
13. 【請求項１３】 細胞系へのＨＡ系像形成剤の結合をテストする方法であっ
    て、 ＨＡ系像形成剤に蛍光染料をラベリングして標識像形成剤を形成する工程と、 該標識像形成剤に対し、細胞系からの細胞群を添加して信号を発生させる工程
    と、 該信号から細胞の結合を判定する工程と、 を具備してなる方法。
14. 【請求項１４】 ＨＡ系像形成剤を用いて動物の画像化する方法であって、 該動物に硫酸コンドロイチンを投与する工程と、 該動物にＨＡ系像形成剤を投与する工程と、 該動物を画像化する工程と、 を具備してなる方法。
15. 【請求項１５】 該動物がヒトであり、該ＨＡ系像形成剤がヒアルロナンお
    よびガドリニウムを含むものである請求項１４記載の方法。
16. 【請求項１６】 該ＨＡ系像形成剤がジエチレントリアミンペンタ酢酸を更
    に含むものである請求項１５記載の方法。
17. 【請求項１７】 該画像化工程が磁気共鳴画像処理によるものである請求項
    １６記載の方法。