PT96691B - Processo para a preparacao de microparticulas de polimeros biodegradaveis e de composicoes farmaceuticas que os contem - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

A invenção refere-se aos objectivos caracterizados nas reivindicações, nomeadamente a novas micropartículas, a composiçoes farmacêuticas que os contêm, à sua utilização no diagnóstico por ultrassons, assim como a processos para a preparaçao destas micropartícuias e das composiçoes farmacêuticas.

É já sabido que, por injecção periférica de soluçoes que contêm finas bolhas gasosas, podem ser produzidos contrastes por eco cardiais (Roelandt J., Ultrasound Med. Biol. 8: 471-492, 1982). Estas bolhas gasosas sao produzidas em soluçoes fisiologicamente aceitáveis, por exemplo por agitaçao mecânica, por outros processos de agitaçao ou por adiçao de dióxido de carbono. Todavia, no que se refere ao seu numero e tamanho, nao sao homogéneas e so podem ser reproduzidas de forma insuficiente. Em regra também nao sao estabilizadas, de modo que a sua duraçao é limitada. Os seus rAH»¥.·

diâmetros médios situam-se predominantemente acima do diâmetro dos eritrócitos, de modo que nao é possível a sua passagem pelos capilares pulmunares, com a consequente obtenção de contraste de órgãos tais como a parte esquerda do coraçao, o figado, os rins ou o baço. Além disso nao se prestam para quantificaçao, visto que o eco ultrassónico por elas produzido consiste em vários processos inseparáveis entre si, tais como formaçao de bolhas, coalescência e dissolução. Assim por exemplo, nao é possível, por meio destes agentes de contraste ultras sons, obter-se dados sobre os tempos de trânsito através da medição da evolução do contraste no miocárdio.

Na especificação EP 0 131 540 descreve-se a estabilizaçao das bolhas gasosas por açucares. Deste modo melhora-se nomeadamente a reproductibilidade e a homogeneidade do efeito de contraste, contudo estas bolhas ainda nao ultrapassam a passagem pelos pulmões.

Na especificação EP 0 122 624 e

123 235 descreve-se que o efeito estabilizador das bolhas gasosas dos açucares, de açucar-alcoois e de sais e melhorado pela adiçao de meios tensioactivos. Indica-se para estes agentes de contraste de ultrassons a acessibilidade aos capilares pulmonares e a possibilidade de representação das convulsões das arteríolas e de diversos orgaos como o figado ou o baço. 0 efeito de contraste está todavia limitado, neste caso, aos vasos, visto que as vesículas nao sao ocupadas pelas células dos tecidos.

Nenhum dos agentes de contraste de ultrassons conhecidos até ao presente permanece um longo período de tempo inalterado no corpo. Nao é pois possível uma representação do órgão com uma intensidade suficiente do sinal por meio de uma acumulaçao selectiva depois da administração intravenosa, nem quantificações.

Na Especificação DE-OS 3 803 972 é descrita uma encapsulaçao de gases, como por exemplo ar, como agente de contraste de ultrassons. 0 material de encapsu2

biodegradável, sobretudo cianoacrilato e polilactídeo,

Estas micropartículas no entanto - especialmente em grande escala, assim como tendo em vista o seu processamento posterior - sao difíceis de preparar. Assim, sobretudo a ampla distribuição de tamanhos de partículas constitui uma desvantagem.

Subsistia pois a necessidade de se dispor de agentes de contraste de ultrassons que nao possuíssem estes inconvenientes. Este objectivo é solucionado através da presente invenção, isto é, pela preparaçao das micropartículas de acordo com a invenção.

Estas microparticulas consistem em polímeros biodegradáveis, que se caracterizam por ser formados por aldeídos polimerizáveis que contêm eventualmente aditivos aptos para copolimerizaçao e/ou agentes de recticulaçao, eventualmente agentes tensioactivos ou misturas de agentes tensioactivos, gases e/ou líquidos facilmente volatilizáveis numa forma livre ou combinada, agentes de acoplamento, eventualmente biomoleculas ou macromoleculas ligadas através destes agentes de acoplamento, assim como eventualmente componentes activos para diagnóstico ou fins terapêuticos.

Os aldeídos polimerizados que tomam parte predominante na estrutura das micropartículas sao escolhidos dos seguintes aldeídos polimerizáveis:

1. Aldeídos OC , /è - insaturados, como por exemplo acroleína crotonaldeído propionaldeído

II. Derivados de acroleina ot -substituidos, como por exemplo ος -Metilacroleina ^(-Cloroacroleina «X -Fenilacroleina

cA-Etilacroleina c< -Isopropilacroleina

-n-Butilacroleina

-n-Propilacroleina

III. Dialdeídos, como por exemplo glutaraldeído, succinaldeido ou os seus derivados, ou as suas misturas com aditivos aptos para copolimerizaçao, como por exemplo: acroleina κ-substituidas, acroleinas ^-substituídas, cianoacrilato de etilo, cianoacrilatos de metilo, cianoacrilatos de butilo, cianoacrilatos de hexilo, metacrilatos de metilo, álcoois vinílicos, ácidos acrílicos, ácidos metacrilicos, cloretos de acriloilo, cloretos de metacriloilo , acrilonitrilo, metacrilonitrilo, acrilamidas, acrilamidas substituídas, metacrilatos de hidroximetilo, óxido de mesitilo, dimetilaminoetilmetacrilato-2-vinilpiridinas,

N-vinil-2-pirrolidona.

Sao preferidos entre estes acroleina e glutaraldeído.

Os agentes tensioactivos que tomam parte eventualmente na estrutura das micropartícuias sao substâncias provenientes de meios tensioactivos ionógenos ou nao ionógenos, como por exemplo oxido de polietileno polioxietileno-polioxipropilenos tais como

( η \ nic' ' F 127, Polietilenoglicol, Poloxamin 908, Polaxamer 407 sais de ácidos carboxilicos, como por exemplo oleato de sódio, ésteres de ácidos gordos de polioxietileno, como por exemplo:

estearato de polioxietileno, dioctilsulfossuccinato de sódio, aducto poliglutaraldeído-hidrogenossulfito de sodio , aducto poliacroleina-hidrogenossulfito de sodio, ácido polivinilsulfónico.

Podem ser utilizados isoladamente ou na forma das suas misturas.

Sao preferidos entre estes: o aducto de poliglutaraldeído-sulfito de sódio, o aducto poliacroleinaf R1 ( R1

-hidrogenossulfito de sódio, Pluronic ' ' F68, Pluronic ' ⁷

F 108 e Pluronic F 127.

Se os aldeídos polilerizáveis, utilizados na estrutura das micropartícuias, possuírem propriedades tensioactivas, pode prescindir-se da utilização das substâncias tensioactivas. Como exemplos destes aldeídos cita-se o glutaraldeído.

Como gases ou líquidos facilmente volatilizáveis, contidos nas micropartícuias quer numa forma livre, quer numa forma ligada - sao preferidos no presente caso liquidos com um ponto de ebulição inferior a 60°C - sao apropriados entre outros:

amoníaco ar gases nobres ou compostos de gases nobres (helio, neon, argon, senon, cripton) halogenetos de enxofre como por exemplo: hexafluoreto de enxofre,

azoto dióxido de carbono oxigénio hidrogénio hidrocarbonetos ou as suas misturas, como por exemplo:

Metano

Etano

Propano

Butano

Pentano

Neopentano

Isopentano

Giclopentano

Etileno

Propileno

Acetileno

3.3- Dimetil-l-Butino

2.3- Pentadieno

2-Metil-2-Buteno 2-Metil-l,3-Butadieno 2-Butino

2- Metil-l-Buteno

3- Metil-l-Buteno, hidrocarbonetos halogenados ou as suas misturas, como por exemplo: cloreto de metileno 1,1-dicloroetileno, cloreto de isopropilo, dibromodifluor-metano, bromometano,, esteres como por exemplo; éter dimetilico, eter dietílico ou éteres fluorados, ou compostos tais como por exemplo: Dimetilaminoacetona óxido de propileno N-EtiImetilamina

N-Etildimetilamina Furano

Sao preferidos neste caso: ar, argon, xenon, hexafluoreto de enxofre, propano, butano e furano

Como agentes de acoplamento que tomam parte na estrutura das microparticulas sao apropriados sobretudo:

I. Compostos contendo grupos amino, como por exemplo:

Hidroxilamina

Butilamina

Alilaraina

Etanolamina

Trishidroximetilaminometano ácido 3-Amino-l-propanosulfónico ácido 5-Aminovalérico acido 8-Aminooctanoico Cloridrato de D-glucosamina Aminogalactose

Aminosorbite

Aminomanite

Dietilaminoetilamina

Anilina

Sulfonilamida

Cholina

N-Metilglucamina

Piperazina

1,6-Hexanodlamina

Ureia

Hidrazina

Glicina

Alanina

Lisina

Serina

Valina

Leucina

Proteína

Albumina

Albumina de soro humano

Polilisina

Gelatina

Poliglicolaminas Aminopoliálcoois,

Sulfato de dextrano com grupos amino N-amino-polietilenoglicol (HO-PEG-NH^)

N,N'-dlamlnopolietileno-glicol ( NE^-PEG-Ní^) Anticorpos imunoglobulinas

II. Compostos contendo grupos ácido, como por exemplo: ácidos carboxílicos

ácido	acético
acido	propiónico
ácido	butírico
ácido	valerico
ácido	caprónico
ácido	caprílico
acido	caprico
ácido	láurico
acido	mirístico
ácido	palmítico
ácido	esteárico
ácido	oleico
ácido	linoleico
ácido	linolenico
ácido	ciclohexanocarboxílico
acido	fenilacético
acido	benzoilacético
ácido	clorobenzóico
acido	bromobenzoico
ácido	nitrobenzóico
acido	orto-ftálico

acido para-ftálico ácido salicílico acido hidroxibenzóico acido aminobenzóico ácido metoxibenzóico

COOH /

PEG-NH-CO-CH„CH„CO-NH-CH ζ z \

CH₂-C00H (PEG-Linker-ácido aspárgico)

PEG-Linker-ácido glutâmico PEG-Linker-DTPA

PEG-Linker-EDTA

III. Compostos contendo grupos hidroxi, como por exemplo: álcoois

Metanol

Etanol

Propanol

Butanol

Pentanol

Hexanol

Heptano.l

Octanol

Decanol

Dodecanol

Tetradecanoi

Hexadecanol

Octadecanol álcool Isopropílico álcool Isobutilíco álcool Isopentílico

Ciclopentanol

Ciclohexanol álcool Crotilico álcool Benzílico álcool Fenílico

Difenilmetanol

TrifeniImetano1 álcool cinâmico Etilenoglicol

1,3-Propanodiol Glicerina Pentaeritrite

IV. Substâncias polimerisaveis, tais como aldeídos , β-insaturados , como por exemplo: acroleina crotonaldeído propionaldeído derivados de acroleina &. -substituidos, como por exemplo:

pi. -Metilacroleina d -Cloroacroleina eÁ-Fenilacroleina ec -Etilacroleina

d. - Isopropilacroleina <<-n-Butilacroleina <X-n-Propilacroleina dialdeídos, por exemplo:

glutaraldeido, sussinaldeido ou os seus derivados ou as suas misturas com aditivos apropriados para a copolimerisaçao, como por exemplo:

acroleinas -substituídas acroleinas β -substituídas

cianoacrilatos	de	etilo
cianoacrilatos	de	metilo
cianoacrilatos	de	butilo
cianoacrilatos	de	hexilo

metacrilatos de metilo álcoois vinílicos ácios acrílicos ácidos metacrílicos cloreto de acriloilo acrilonitrilo

metacrilonitrilo acrilamidas acrilamidas substituídas metacrilatos de hidroximetilo oxido de mesitilo dimetilaminoetilmetacrilato-2-vinilpiridinas, N-vinil-2-pirrolidinona.

Sao preferidos entre estes: hidroxilamina, trishidroximetilaminometano, ácido 3-amino-l-propanosulfonico, cloridrato de D-glucosamina, (aminomanite, ureia, albumina humana, hidrazina, proteínas, poliglicolaminas, aminopoliálcoois como por exemplo

HO-PEG-NH2 ou NH2-PEG-NH2 ou compostos contendo grupos ácido como por exemplo PEG-Linker-ácido aspargico, PEG-Linker-ácido glutâmico, PEG-Linker-DTPA e PEG-Linker-EDTA, situando-se o peso molecular do polietilenoglicol (PEG) até 100.000 D, de preferência inferior a 40 000 D.

Os agentes de acoplamento citados em I, sao condensados através dos seus grupos amino aos grupos formilo que se encontram na superfície das micropartículas formadas pelos aldeídos polimerisados e eventualmente meios tensioactivos.

Igualmente ligados através dos grupos formilo encontram-se os monómeros referidos em IV, e que sao polimerisados com outros monómeros.

Os ácidos e álcoois mencionados em II. e III. sao, pelo contrário, acoplados nas micropartículas somente depois da previa transformaçao da função aldeido.

Pela escolha de biomoleculas ou macromoleculas apropriadas, ligadas através destes agentes de acoplamento, tais como por exemplo enzimas, dextrano, imunoglobulinas, anticorpos monoclonais (ver também adiante) obtêm-se micropartículas de acordo com a invenção que possuem uma especificidade a tecidos e orgãos surpreendentemente alta.

a invenção contêm eventualmente constituintes eficazes em diagnostico ou terapeuticamente, para a diagnose e terapia de tumores, como por exemplo

Doxorubicina Actinomicina Magnetite Mitomicina C Triamcinolona.

a invenção enumeradas. rendimento. assim como problemas.

As micropartículas de acordo com possuem as propriedades desejáveis já anteriormente Sao susceptiveis de fácil preparaçao e com elevados Uma ampliaçao da escala de preparaçao (up-scaling) a purificação das micropartículas, nao oferecem

As partículas possuem um estrita distribuição dimensional (monodispersas); é possível neste caso fazer o tamanho das partículas, consoante a concentração utilizada das substâncias de partida, dentro de um amplo intervalo (ver também adiante). Por controle das condiçoes da preparaçao (por exemplo, o pH) é possível também fazer variar dentro de uum amplo intervalo o peso molecular.

Uma outra vantagem consiste no facto de a reacçao para a sintese das micropartículas podem ser desenvolvida segundo diversas possibilidades aniónica por variaçao de pH, polimerização cationica por exemplo com sais de ferro, polimerização de radical com luz ultravioleta e por radiaçao ionizante.

A ampla gama de temperatura (-5 até +80°C) possível na preparaçao das micropartículas, proporciona um controle fácil do processo com rendimento optimos para os mais diversos gases ou líquidos volátilizáveis.

As partículas contêm grupos aldeído livres que podem ser acoplados por covalência mediante a reacçao química com outras moléculas. Esta possiblilidade permite

alterar conforme desejado, as propriedades de superfície das partículas sem influenciar as propriedades de formaçao de eco. Por escolha de moléculas apropriadas pode influenciar-se a estabilidade coloidal. Deste modo evita-se especialmente os fenomenos de aglomeraçao que surgem frequentemente em sistemas coloidais. Mais uma vez, este facto reveste-se de grande vantagem para desenvolvimento de uma formulação estável.

Alem da influência sobre a estabilidade, oferecem-se possibilidades de se alterar a superfície das partículas de modo que seja possível uma drug-targeting. Isto e conseguido através do acoplamento de biomoleculas ou macromoléculas apropriados (por exemplo anticorpos monoclonais) que originam uma elevada especificidade a tecidos e órgão (G. Gregoriadis, G. Poste Targeting of Drugs, Plenum Press 1988, Nova Iorque) ou para influenciação das propriedades de superfície das partículas por absorçao de moléculas (po exemplo meios tensioactivos).

Em função da escolha estas moléculas e do tamanho das micropartículas consegue-se promover uma acumulaçao de partículas no tumor ou, por exemplo, nos pulmões, no fígado, no baço e na medula óssea. A acumulaçao na medula óssea é conseguida especialmente revestindo-se pequenas partículas ( 100 nm) por exemplo com Poloxamer 407. Se as partículas forem revestidas por exemplo como Poloxamin 908, o sistema RES e sobrecarregado com estas partículas e elas permanecem na circulação sanguínea (blood pool agent).

Através de partículas acopladas com anticorpos consegue-se obter uma acumulaçao das particulas em tumores.

Também se pode realizar uma marcaçao activa (targeting) com micropartículas contendo magnetite. Através de um campo magnético aplicado exteriormente, as partículas sao acumuladas no sistema intravasal no ponto pretendido. Deste modo dispoe-se da possibilidade de investigar as proporçoes de débitos, por exemplo nos vasos sanguíneos.

Com auxílio de partículas carregadas com magnetite também é possível, mediante aplicaçao de um campo magnético alternativo accionado exteriormente, produzir temperaturas elevadas localisadas. Esta circunstância pode ser utilizada terapeuticamente, por exemplo para a destruição de tumores (terapia por hipertermia) . Além da utilização de um campo magnético alternativo, pode utilizar-se também um campo de ultrassons. Também neste caso se obtêm fortes aumentos de temperatura localisados.

A preparaçao das micropartícuias de acordo com a invenção realisa-se fazendo-se reagir uma solução aquosa contendo 0 a 40% e de preferência 0,01 a 10% p/v de um ou mais agentes tensioactivos, e 0 a 10% p/v de agentes de diagnóstico ou constituintes terapeuticamente activos, e gases ou liquidos facilmente volatilisaveis, mediante agitaçao, a uma temperatura compreendida entre -5^eC até +80²C. de preferência entre 0 e 40²C, a um valor de pH de 7 a 14 e de preferência de 9 a 13, durante um período de tempo compreendido entre 1 minuto de 24 h, de preferência 1 a 10 h, e eventualmente mediante a passagem de um gás, com um ou mais aldeídos copolimerisáveis até uma concentração, referida à mistura reactiva, de 0,1 a 50% e de preferência de 3 a 20% p/v, assim como com aditivos copolimerisáveis ate uma concentração, referida à solução reactiva, de 0 a 20% p/v e de preferência de 1 a 5% p/v, com agentes de reticulaçao até uma concentração, referida à mistura reactiva, de 0 a 5% p/v e de preferência 0,1 a 1% p/v, e fazendo-se reagir em seguida eventualmente depois da purificação - as microparticulas assim obtidas com uma solução aquosa que contêm- referida à quantidades de aldeído - até quantidades aquimoleculares do reagente de acoplamento, assim como 0 a 20% p/v e de preferência 0,01 a 10% p/v de 1 ou mais agentes tensioactivos, referios ao volume global, mediante agitaçao, durante um periodo de tempo de reacçao até 3 dias, de preferência até 2 dias, a temperaturas compreendidas de 0 a 60°C, de preferência de 5 a 30°C, a uma valor de pH compreendido entre 3 e 9 e de preferência

-se estas eventualmente a biomoléculas ou a macromoléculas.

As partículas de polialdeído obtidas depois do l^s passo da reacçao têm grupos aldeído sobre a superfície. Com estes grupos aldeído realisam-se as reacções típicas para aldeídos (R.C. Schulz, Kolloidzeit- schrift und Zeitschrift fiir Polymere, 182 (1-2), 99 (1961); Lehrbuch der organischen Chemie Organikum, VEB Verlag der Wissenschaften, Berlim, 1984). Deste modo esta-se em condiçoes de se acoplar moléculas sobre a superfície das partículas que modificam as propriedades de superfície.

Exemplos de possíveis reacções dos grupos aldeído:

-redução a álcool -oxidaçao a ácido -formaçao de oxima

-formaçao de imina, eventualmente seguida por hidrogenação e eventualmente em seguida uma N-alquilaçao

-formaçao de hidrazona eventualmente seguida por hidrogenação -formaçao de mercaptal -formaçao de acetal

-disproporcionaçao por soda caustica (reacçao de Cannizzaro)

-condensação de aldol.

acoplamento de moléculas contendo grupos amino às partículas formadas no l² passo da reacçao é realisado por reacçao com os grupos aldeído. Neste caso escolhem-se por exemplo as seguintes condiçoes experimentais.

1000 mg de partículas de poliacroleina sao postas em suspensão em 50 ml de água destilada. A esta suspensão de partículas adicionam-se 5000mg da substância a reagir e agita-se a temperatura ambiente. Em conformidade com a velocidade de reacçao a solução reactiva tem que ser

agitada: para velocidades de reacçao lentas até 48 h. A suspensão de partículas e dializadas em seguida (Cut off 10.000 d).

Se os substituintes introduzidos por exemplo através das reacções descritas acima contiveram grupos funcionais (eventualmente bloqueados intermediariamente) estes podem ser transformados, de harmonia com processos conhecidos dos especialistas, em grupos reactivos apropriados para o acoplamento de biomoléculas ou macromoléculas. Os grupos desta natureza preferidos sao, por exemplo, os grupos meleimidobenzoilo, 3-sulfomaleimido-benzoilo , 4-(maleimidometil)-ciclohexilcarbonilo, 4-^3-sulfo-(maleimido-metil)-ciclohexil-carbonilo, 4-(p-maleimidofenil)-butirilo, 3-(2-piridil-ditio)-propionilo, metacriloil-(pentametileno)-amido, bromoacetilo, iodoacetilo, 3-iodopropilo, 2-bromoetilo, 3-mercaptopropilo, 2-mercaptoetilo, fenilenoisotiocianato, 3-aminopropilo, éster benzílico, éster etílico, éster t-butílico, amino, alquilamino com 1 a 6 átomos de carbono, aminocarbonilo, hidrazino, hidrazinocarbonilo, maleimido, metacrilamido, metacriloilhidrazinocarbonilo, maleimidoamidocarbonilo, haogénio, mercapto, hidrazinotrimetilenohidrazinocarbonilo, amidometilenoamidocarbonilo, bromocarbonilo, fenilenodiazonio, isotiocianato, semicarbazido, tiosemicarbazido, isocianato.

Um grupo amino pode, por exemplo, ser convertido num grupo isotiocianato de acordo com métodos conhecidos da literatura (por exemplo, com tiofosgeno num sistema bifásico, S. Scharma, Synthesis 1978, 803, D. K.Johnson J, Med. Chem. 1989, vol 32, 236).

Por reacçao de uma função amino com um halogeneto de halogenoacetilo pode gerar-se um grupo Λ-halogenoacetamido (JACS 1969, vol 90, 4508; Chem. Pharm.

Buli. 29 (1), 128, 1981), que, tal como por exemplo o grupo isotiocianato, e apropriado para o acoplamento a biomoléculas e macromoléculas.

Como substituintes que podem ser

transformados num grupo funcional apropriado para uma ligação a uma macromolécula ou biomolecula sao apropriados, entre outros, radicais hidroxi e nitrobenzilo, hidroxi e carboxialquilo, bem como tioalquilo, tendo até 20 átomos de carbono. Sao convertidos, de acordo com processos da literatura conhecidos dos especialistas [Chem. Pharm. Buli. 33 674 (1985), Compendium of Org. Synthesis Vol. 1-5, Wiley and Sons, Inc., Houben-Weyl, Methoden det organischen Chemie, Vol. VIII, Georg Thieme Verlag, Estutgarda J. Biochem. 92, 1413, (1982)3 nos substituintes pretendidos (por exemplo, com os grupos amino, hidrazino, hidrazinocarbonilo, epóxido, anidrido, matacriloilhidrazinocarbonilo, maleimidoamidocarbonilo, halogênio, halogenocarbonilo, mercapto ou isotiocianato como grupos funcionais) tendo que realisar-se primeiro, no caso do radical nitrobenzilo uma hidrogenação catalítica (por exemplo, segundo P.N. Rylander, Catalytic Hydrogenation over Platinum Metals, Academic Press 1967) ao derivado de aminobenzilo.

Os exemplos para a transformaçao de grupos hidroxi ou amino, ligados a radicais aromáticos ou alifáticos, sao as reacções realisadas em dissolventes apropriados, tais como tetrahidrofurano, dimetoxietano ou sulfóxido de dimetilo, em sistemas aquosas bifásicos, como por exemplo água/diclorometano, na presença de um agente de captaçao de ácidos, como por exemplo hidroxido de sodio, hidreto de sódio ou carbonatos alcalinos ou alcalinoterrosos, como por exemplo carbonatos de sodio, de magnésio, de potássio, ou de cálcio, ou poli-(4-vinilpiridina) Reillex^k , a temperaturas compreendidas entre 0°C e o ponto de ebulição de cada um dos dissolventes, ams de preferência entre 20 e 60°C, com um substrato de fórmula geral I

NF-L-FU (I) na qual Nf representa um grupo nucleófugo, como por exemplo um atomo de cloro, de bromo ou de iodo, um grupo de fórmula

CHgC^H^SOg ou CFgSOg, L representa um radical de hidrocarbonato alifático, aromático, arilalifático, de cadeia ramificada ou linear ou cíclico tendo até 20 átomos de carbono, e Fu representa o grupo funcional pretendido, eventualmente na forma bloqueada (DE-OS 3 417 413).

Como exemplos dos compostos de fórmula geral I citam-se

Br(CH₂)₂NH₂, BrÇCH^OH, BrCH₂CooCH₃, BrCí^CO^Bu, Br(CH₂)₄CO₂C₂H₅ , BrCH₂C0Br, BrCH₂CONH₂, C1CH„COOC„H_S,

BrCH₂CONHNH₂, BrCH₂-CH-CH₂ , CF₃S0₃(CH₂)₃Br ,

BrCH„C^CH, BrCH„CH=CH„ , BrCH„C,H,NCS.

2 2 2 6 4

As transformações de grupos carboxi podem ser realisadas por exemplo de acordo com o método da carbodiimida (Fieser, Reagents fo Organic Synthesis 10, 142) através de um anidrido misto [Org. Prep. Proc. Int. 7, 215 (1975)] ou através de um éster activado (Adv. Org. Chem. Parte B, 472).

As microparticulas transportando o agente de acoplamento, assim obtidas, podem também ser acopladas a biomoléculas ou a macromoléculas, ds quais se saiba que se acumulam especialmente no órgão ou parte de órgão visado. Estas moléculas sao por exemplo enzimas, hormonas, polissacarídeos tais como dextrano ou maidos, porfirinas, bleomicina, insulina, prostaglandinas, hormonas esteroides, amino-açucares, aminoácidos, péptidos, tais como polilisina, proteínas (como por exemplo imunoglobulinas, anticorpos monocionals ou lecitinas) lípidos (também na forma de liposomas) e nucleótidos do tipo ADN ou ARN. Salientam-se em particular os conjugados com albuminas, como por exemplo albumina de soro humano, anticorpos como por exemplo anticorpos monocionais especificos para antigenes asociados a tumores, ou antimiosina. Em vez de macromoléculas biológicas podem também ser acoplados políme18

ÉsnraSSSEií

ros sintéticos apropriados, como por exemplo polietilenoiminas, poliamidas, poliureia, poliéteres como por exemplo polietilenoglicois e politioureias. Os agentes farmacêuticos produzidos a partir destas substâncias prestam-se por exemplo para utilização no diagnóstico de tumores e de infartes, bem como na terapia de tumores. Os anticorpos monoclonais (por exemplo, Nature 256, 495, 1975) têm, relativamente aos anticorpos policionais, a vantagem de serem específicos para um determinante antigene, possuirem uma afinidade de ligaçao definida, serem homogéneos (e consequentemente a sua obtenção em forma pura e substancialmente mais simples) e serem susceptíveis de preparaçao em grandes quantidades em culturas celulares. Nesta qualidade sao apropriados por exemplo para a representação de tumores, anticorpos monocionais ou os seus fragmentos Fab e F(ab’)2 que sao específicos, por exemplo, de tumores humanos do tracto gastrointestinal, do peito, do fígado, da bexiga, das vesículas seminais e de melanomas [Câncer Treatment Repts. 68, 317 (1984), Bio Sei. 34, 150, (1984)] ou que sao dirigidos contra antigenes enbrionais carcinomas (GEA), coriogonadotropina humana ( -HCG) ou outros antigenes estáveis em tumores, como glicoproteinas |New Engl. J. Med. 298, 1384 (1973), Patente Americana 4 331 647 | . Sao também apropriados entre outros anticorpos antimiosina, antiinsulina e antifibrina (Patente Americana 4 036 945).

Os carcinomas do colo podem ser comprovados em diagnóstico com auxílio de conjugados de micropartículas com o anticorpo 17-1A (Centocor, USA).

No caso de conjugados de anticorpos a ligaçao do anticorpo à micropartícula nao deve conduzir a perda ou à redução da afinidade de ligaçao e da especificidade da ligaçao do anticorpo ao antigene. Isto pode ser realizado que pela ligaçao a fraeçao hidrato de carbono na parte Fc da glicoproteina ou, em alternativa, aos fragmentos Fab ou F(ab’)2, ou por ligaçao ao atomo de enxofre do anticorpo ou dos fragmentos do anticorpo.

No primeiro caso tem primeiramente

que ser realizada uma dissociação por via oxidante da unidade açúcar, para geraçao de grupos formilo aptos ao acoplamento. Esta oxidaçao pode ser realizada por via quimica com oxidantes, como por exemplo ácido periódico, metaperiodato de sódio ou metaperiodato de potássio, de harmonia com métodos conhecidos da literatura (ver por exemplo J. Histochem. and Cytochem. 22, 1084, 1974) em solução aquosa em concentrações de 1 até 100 e de preferência de 1 até 20 mg/ml, e com uma concentração do oxidane compreendida entre 0,001 até 10 mmol, de preferência 1 a 10 mmol, num intervalo de pH de cerca de 4 a 8, a uma temperatura compreendida entre 0 e 37°C e com uma duraçao da reacçao compreendida entre 15 minutos e 24 horas. Também se pode realizar a oxidaçao por via enzimática, por exemplo com auxilio de galactoseoxidase, numa concentração de enzima de 10 a 100 unidades/ml, com uma concentração de substrato de 1 a 20 mg/litro, a um valor de pH compreendido entre 5 e 8, com uma duraçao de reacçao de 1 a 8 horas e a uma temperatura compreendida entre 20 e 40°C (ver por exemplo J. Biol. Chem. 234, 445, 1959).

Aos aldeídos produzidos por oxidaçao sao ligadas micropartículas com grupos funcionais apropriados, como por exemplo hidrazina, hidrazida, hidroxilamina, fenilhidrazina, semicarbazida e tiosemicarbazida, por reacçao a 0 até 37°C, com uma duraçao de reacçao de 1 a 65 horas, a um valor de pH compreendido entre cerca de 5,5 e 8, com uma concentração de anticorpo de 0,5 a 20 mg/ml e com uma proporção molar de complexante para anticorpo-aldeído de 1:1 até 1000:1. A estabilizaçao subsequente do conjugado é realizada por redução da dupla ligaçao, por exemplo com borohidreto de sódio ou comcianoborohidreto de sódio: o redutor é neste caso uitlizado num excesso de 10 até 100 vezes (ver por exemplo J. Biol. Chem. 254, 4359, 1979).

A segunda possibilidade da ligaçao de conjugados de anticorpos parte de uma redução cuidadosa das pontes de dissulfureto da molécula de imunoglobulina; neste caso as pontes de dissulfureto sensíveis sao dissociadas entre os hidrogénios das cadeias da molécula de anticorpo, enquanto que as ligações S-S da região que liga o antigene permanecem intactas de modo que nao se da praticamente qualquer redução da afinidade de ligaçao e da especificidade de ligaçao do anticorpo (Biochem. 18, 2226, 1979, Handbook of Experimental Immunology, vol. 1, 2- edição, Blackwell Scientfic Publications Londres, 1973, capítulo 10). Estes grupos sulfidrilo livres das regiões inter-H de cadeias sao então submetidos a reacçao com grupos funcionais apropriados das micropartícuias, a 0 até 37°C, a um valor de pH de cerca de 4 até 7, e com uma duraçao de reaçao de 3 a 72 horas, com formaçao de uma ligaçao covalente que nao influencia a região de ligaçao do antigene do anticorpo. Como grupos reactivos apropriados mencionam-se por exemplo: grupos halogenoalquilo, halogenoacetilo, p-mercuribenzoato, isotiocianato, tiol, epóxido, assimcomo grupos que sejam susceptíveis de sofrer uma adiçao de Michael, como por exemplo grupos maleinimido ou metacrilo (ver por exemplo J. Amer. Chem. Soc. 101, 3097, 1979).

Para o acoplamento dos fragmentos de anticorpo com as micropartículas existe adicionalmente uma serie de Linker bifuncionais apropriados, frequentemente também susceptíveis de obtenção comercial (ver por exemplo Pierce, Handbook and General Catalogue 1986) que sao reactivos tanto face aos grupos SH dos fragmentos, como também face aos grupos amino ou hidrazino das micropartículas.

Como exemplos citam-se:

m-maleimidobenzoil-N-hidroxissuccinimidato (MBS), m-maleimidobenzoil-N-sulfossuccinimidato (sulfo-MBS),

N-succinimidil-[4-(iodoacetil)-amino]-benzoato (SIAB), succinimidil-4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato (SMCC) succinimidil-4-(p-maleimidofenil)-butirato (SMPB), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)-propionato (SDPD),

WI.HH rtRCnttftE*

4-[3-(2,5-dioxo-3-pirrolinil)-propioniloxi]-3-oxo-2,5-difenil-2,3-dihidro-tiofeno-l,l-dioxido, acetilalanilleucilalanilamin.o-p-ben.ziio, acetamido-p-tioureido-benzilo.

Podem também ser utilizadas ligações de tipo nao convalente para acoplamento à biomolécula ou à macromolécula, podendo tomar parte tanto ligações lónicas como também ligações de van der Waals e ligações de pontes de hidrogénio, em proporçoes variaveis, e ligações de amido (princípio fechadura-chave) (po exemplo avidina-biotina, anticorpo-antigene). Também sao possíveis ligações de inclusão (hospedeiro-hóspede) de pequenos complexos em grandes cavidades das macromoleculas.

princípio de acoplamento consiste em se preparar primeiro uma macromolécula bifuncional, ou pela fusão de um anticorpo-hibridoma dirigido contra antigene de tumor, com um segundo anticorpo-hibridoma dirigido contra a microparticula de acordo com a invenção, ou acoplando-se entre si quimicamente os dois anticorpos por meio de um Linker (ver por exemplo as indicações em J. Amer. Chem. Soc. 101 , 3097 (1979) ou ligando-se o anticorpo dirigido contra o antigene do tumor, eventualmente através de um Linker, a avidina (ou biotina) [D. J. Hnatowich et al, J. Nucl. Med. 28, 1294 (1987)]. Em vez dos anticorpos podem também ser utilizados os seus correspondentes fragmentos F(ab) ou Fíab'^· Para a utilização farmacêutica injecta-se primeiro a macromolécula bifuncional que se acumula no local visado, e seguidamente, após um certo intervalo de tempo, injectam-se as microparticulas de acordo com a invenção [eventualmente ligadas a biotina (ou avidina)] que sao acopladas in vivo no local visado e podem desenvolver ali a sua acçao de diagnóstico ou terapêutica. Alem disso podem também apresentar interesse para utilização outros métodos de acoplamento, como por exemplo o Reversible Radiolabeling (radiomarcaçao reversível) descrita em Protein Tailoring Food Med. Uses [Am. Chem. Soc. Symp.] (1985), 349.

Como o chamado acoplamento de fase sólida dispoe-se de um método especialmente simples para a preparaçao de conjugados de anticorpo ou de conjugados de fragmentos de anticorpo: o anticorpo é acoplado a uma fase estacionária (por exemplo, uma resina permutadora de ioes) que se encontra por exemplo numa coluna de vidro. Por lavagens sucessivas da coluna com uma solução apropriada para a geraçao de grupos aldeido, lavagem, passagem com uma solução de micropartículas funcionalizadas, lavagem e finalmente eluiçao do conjugado, obtêm-se rendimentos de conjugado muito elevados.

automática e continua de

Este processo permite a produção quaisquer quantidades de conjugados.

Também podem ser realizados por esta via outros passos de acoplamento.

Assim, também podem ser preparados, por exemplo, conjugados de fragmentos através da sequência papaina-reduçao/Linker bifuncional/micropartícula funcionalizada.

Os compostos assim obtidos sao em seguida purificados de preferência cromatograficamente.

	Pr	eparam-se partículas com dimensão
compreendidas	entre 0,04 - 100 jim, de preferência 0,1 - 40 jum.
0 tamanho das partículas é	influenciado essencialmente por
variaçao da	concentração de	partida do monómero, do agente
tensioactivo,	e pelo valor do	pH.
	Exemplos para a sao determinada:	preparaçao de partículas de dimen-
ls)	Concentração de	acroleina: 10% (p/v)
	concentração de	agente tensio-
	activo:	1,5% (p/v)
	pH:	10,0
	temperatura	4°C.

Se encolherem estas condiçoes obtêm-se então partículas com um diâmetro médio de 750nm.

22)

concentração concentração activo: pH:

temperatura:

de acroleina: de meio tensio20% (p/v)

0,2% (p/v) 10,0 2°C.

Nestas condiçoes obtêm-se partículas com um diâmetro médio de 40 jum.

3⁹) Nas mesmas condiçoes mencionadas em 2²), mas com uma concentração de acroleina de 10% (p/v), obtêm-se partículas com um diâmetro médio de 8 ^um.

4²) concentração de acroleina:

concentração de meio tensioactivo pH:

diâmetro médio de partículas

10% (p/v)

0,5% (p/v) 11,0 560 nm.

5^e) Nas mesmas condiçoes indicadas em 4^e) mas apenas com um valor de pH de 9, produz-se um diâmetro médio de partículas de 3,2 ^im.

Como meios tensioactivos utiliza-se o aducto poliglutaraldeido-hidrogenossulfito de sódio (PGL)..

Uma vez do aducto poliglutaraldeído-hidrogenossulfito de sódio (PGL) pode também ser utilizado o aducto poliacroleina-hidrogenossulfito de sódio (PAC-SO^), sem que se observe qualquer influência sobre o tamanho de partículas.

Sintese de PGL:

Uma solução aquosa a 25% de glutaraldeído é purificada por carvao activado. Em seguida, fazendose passar azoto na solução aquosa, elimina-se da solução o oxigénio. Adicionalmente uma solução tampao (tampao de fosfoto, 1 molar) é ajustada a pH 11. A solução tampao é também tornada isenta de oxigénio por passagem de azoto. A solução tampao

e a solução de glutaraldeído sao postas em contacto e, sob atmosfera de azoto, procede-se á polimerização durante 72 horas. Seguidamente o polímero e separado por filtraçao e lavado com acetona e água. 0 polímero lavado é seco em estufa de secagem por vácuo a 45°C. Em 30 ml de água que contêm 12,5g de hidrogenossulfito de sódio dissolvem-se 5 g de poliglutaraldeido. A solução é dialisada contra água destilada. Em seguida a solução e liofilizada.

As partículas de acordo com a invenção sao postas em suspensão em soluçoes aquosas sem que occora uma agregaçao das partículas. Para a preparaçao de uma formulação galenica que seja aplicavel por via parentérica, utilizam-se soluçoes aquosas que contêm aditivos isotonizantes, tais como cloreto de sódio, açucar-álcoois (manite, sorbite, xilite, etc) ou açucares (glucose ou fructose). Para ajustamento do pH podem escolher-se tampões tais como trometamol/HCl, ácido citrico/soda caustica, etc.

Sintese de PAC-SO^:

A. Num balao de três tubuladuras equipado com ampola de decantaçao e agitador introduzem-se 100 ml de água destilada e, fazendo-se passar azoto, elimina-se o oxigénio. Seguidamente adicionam-se a esta água 1,829 g de K₂S₂0g que se dissolvem depois de o ter dissolvido completamente, adicionam-se a esta solução 20 ml de acroleina recém-destilada. Seguidamente dissolve-se 1,14 g de nitrato de prata em 5 ml de agua e adicionam-se e polimeriza-se sob agitaçao durante duas horas. 0 polímero que precipita é separado por filtraçao, e lavado várias vezes com água e em seguida, para eliminação dos ioes prata, poe-se de novo em suspensão durante 1 hora em 1 litro de água na qual se dissolveram 1,63 g de tiosulfato de sodio. 0 polimero e separado por filtraçao e e seco em estufa de secagem em vácuo a 45°C. 0 polímero seco é triturado grosseiramente num almofariz e dissolvem-se 10 g deste polímero triturado em 100 ml de hidrogenossulf ito de sódio (a 37%). Seguidamente a solução é dialisada contra água destilada (cut off 5000 d). 0 dialisado é utilizado como meio tensioactivo

para a preparaçao das micropartículas de poliacroleina.

B. Num balao de fundo redondo introduzem-se

100 ml de água destilada. Mediante agitaçao adicionam-se-lhe 20 ml de acroleina recém-destilada. Em seguida, por adiçao de soda cáustica (solução 2N) ajusta-se o pH da mistura reactiva ao valor 10,5 promove-se a polimerização mediante agitaçao durante 2 horas. 0 polimero que precipita é removido por filtração, e lavado varias vezes com agua e e seco em estufa de secagem em vácuo 45°C. Dissolvem-se 10 g do polímero em

100 ml de solução de hidrogenossulfito de sódio (a 37%) . A solução é dializada contra água bidestilada (cut off 5000 d). 0 resíduo é utilizado como agente tensioactivo na preparaçao de micropartículas de poliacroleina.

Exemplos

1^B) 100 ml de uma formulação contêm:

particulas	100 mg
trometamol:		2,4mg
+HC1 para pH=7,4
manite:		5500mg
água:	até	lOml.
100 ml de uma formulação	contêm:
partículas:		50 mg
cloreto de sódio:		860 mg
agua	ate	100 ml

Pode impedir-se que as partículas sobrenadem tornando a densidade média das partículas sensivelmente comparável à do veículo envolvente.

Este objectivo pode ser conseguido por adiçao de substâncias de maior densidade (agentes de contraste de raios X, magnetite). Esta possibilidade interessa especialmente no caso de partículas com um pequeno teor de polialdeido.

Os meios farmacêuticos de acordo com a invenção contêm 0,1 pg a 100 mg de micropartícula/ml, de preferência 10 jig a 1 mg de micropartículas/ml de formulação

galénica e sao em regra ajustados para uma dose de 0,01 ml a 10 ml/kg, de preferência 0,1 a 1 ml/kg de peso corporal. Estão previstas para aplicaçao entérica e parentérica.

Para utilização na terapia por hipertermia os meios farmacêuticos de acordo com a invenção sao em regra utilizados em quantidades entre 0,001 a 10 mg e de preferência entre 0,01 e 1 mg por g de tumor.

Os exemplos que se seguem permitem elucidar em pormenor a invenção sem contudo a limitarem aos mesmos.

Métodos para a preparaçao dos agentes de contraste .

l^s Passo da reacçao:

A) Uma solução aquosa contendo o meio tensioactivo (0,01 a 57o p/ν') e arrefecida mediante agitaçao , a 0°C. Neste caso faz-se borbulhar um gás na solução. 0 pH da solução é ajustado com soda cáustica ao valor de pH pretendido (de preferência compreendido entre 9 e 13). A esta solução adicionam-se o monómero ou a mistura de monoméros. Passados 30 minutos reduz-se a velocidade de agitaçao. Decorrida 1 hora a mistura ractiva é diluída com a solução aquosa contendo o meio tensioactivo indicada anteriormente. A velocidade agitaçao e nocamente reduzida. Passadas 4 horas as micropartícuals isentas de gás que precipitam sao decantados da restante suspensão e removidas. A suspensão decantada é dialisada para se purificar o meio de contraste de monómeros residuais. Rendimento: 80-90%.

B) Uma solução aquosa que contêm o meio tensioactivo e a quantidade de monómeros pretendida é arrefecida a 0°C. Neste caso faz-se burbulhas o gás desejado, mediante agitaçao, na solução. Em seguida, com soda cáustica ajusta-se o valor de pH da solução, preferivelmente a um valor compreendido entre 9 e 13. Decorrida uma hora a mistura reactiva e diluida. Passadas 3 a 4 h a suspensão contendo as microparticulas é separada do polímero que precipita e que é descartado.

A suspensão Rendimento :

Exemplo 1

Introduzem-se num balao 91 ml duma solução de agente tensioactivo aquoso a 0,5%. 0 valor do pH da solução é ajustado ao valor 11 com solução 0,2N de hidróxido de sódio. Faz-se borbulhar azoto na solução. Ã solução de meio tensioactivo a 0,5%, arrefecida a 0°C, adicionam-se gota a gota 9,5 ml de acroleina recém-destilada. Passada uma hora adicionam-se a mistura reactiva mais 100 ml de asoluçao de agente tensioactivo a 0,5%. Decorridas 3 h a suspensão contendo as microparticulas é decantada para separar o polímero precipitado e é purificada por diálise.

Exemplo 2

Introduzem-se num balao 82 ml de uma solução aquosa de meio tensioactivo a 0,08%. A solução é arrefecida a 0°C. Â solução arrefecida adicionam-se 18 ml de acroleina recém-destilada. Faz-se borbulhar an solução argon, mediante agitaçao. Passada uma hora o pH da solução e ajustado ao valor i2 cora uma solução 0,2 R de hidróxido de sódio. Decorridas 2 h adicionam-se 100 ml da solução de meio tensioactivo a 0,o8%. Passadas 3 h a suspensão é decantada e dialisada.

Exemplo 3

Introduzem-se num balao 70 ml da solução aquosa de meio tensioactivo a 0,08% que contém 10% de dimetilformamida. 0 pH da solução é ajustado ao valor 11,5 com solução 0,2N de hidroxido de sodio. A solução e arrefecida a 0°C. Seguidamente faz-se borbulhar nesta azoto. A esta solução adicionam-se 30 ml de acroleina recém-destilada, gota a gota. Decorrida uma hora adicionam-se à solução 100 ml da solução de meio tensioactivo a 0,08%. Passadas 4 h a suspensão é separada do polimero precipitado e purificada.

Exemplo 4

Introduzem-se num balao 91 ml de solução aquosa a 0,5% do agente tensioactivo, a qual contêm 5% de magnetite, e arrefece-se a 0°C. 0 pH da solução é ajustado com soda cáustica 0,2N ao valor 12, Faz-se borbulhar azoto através da solução. À solução arrefecida a 0°C adicionam-se 9 ml de acroleina recem-destilada, gota a gota. Passada uma hora adiciona-se à mistura reactiva 100 ml da solução a 0,5% do agente tensioactivo. A suspensão contendo as micropartícuias é separada do polímero precipitado, por decantaçao, e é dialisada.

Exemplo 5

Introduzem-se num balao 91 ml de souluçao a 0,5% do meio tensioactivo. 0 pH da solução é ajustado a 12 por adiçao de solução 0,2N de hidróxido de sódio. A solução é arrefecida a 0°C. Através da solução faz-se borbulhar argon. A esta solução adicionam-se gota a gota 9 ml de acroleina recém-destilada cue contêm 5% de cianoacrilato de butilo. Passada uma hora adicionam-se mais lOOml da solução a 0,5% do meio tensioactivo. A suspensão ó separada do sedimento e purificada.

Exemplo 6

Introduzem-se num balao 91 ml de uma solução aquosa a 0,08% do meio tensioactivo. 0 pH da solução e ajustado a 10,5 por adiçao de solução 0,2N de hidróxido de sódio. A solução é arrefecida a 0°C. Através da solução faz-se borbulhar azoto. A esta solução adicionam-se gota a gota 9 ml de acroleina recém-destilada que contêm 20% de «L-metilacr oleina. Passada uma hora adicionam-se mais 100 ml da solução a 0,08% do meio tensioactivo. Decorridas 2 h a suspensão de microesferas ó separada do sedimento e purificada.

Exemplo 7

Introduzem-se 91 ml de solução aquosa a 0,08% do meio tensioactivo, que contêm 25% de isopentano, num balao. A solução é arrefecida a 0°C. A esta solução adicionam-se, mediante agitaçao, 9 ml de lada. Passadas 2 h a mistura reactiva é tículas sao purificadas por lavagem com sao de novo postas em suspensão em água.

filtrada. As microparágua. As microesferas

Solução de meio tensioactivo: aducto de poliglutaraldeído-hidrogenosulfito de sódio.

2^a passo da reacçao

Uma suspensão de micropartículas de poliacr oleina em agua destilada é ajustada a um valor de pH de 6,5 por adiçao de solução 0,01 N de ácido clorídrico. A esta suspensão, mediante agitaçao, à temperatura ambiente, um excesso do ligante aminado. 0 pH desta solução é previamente ajustado ao valor 8 por adiçao de solução 0,01N de hidróxido de sódio.

Em seguida agita-se, consoante a velocidade da reacçao, até 48 h à temperatura ambiente. Para eliminação do excesso do ligante aminado dialisa-se contra agua.

Eventualmente as bases de Schiff formadas sao reduzidas às aminas por adiçao de redutores.

Exemplo 8

1000 mg de micropartículas de poliacroleina do exemplo 1 sao postas em suspensão em 50 ml de água. A esta suspensão adicionam-se 1000 mg de ácido 3-aminopropano-l-sulfónico e agita-se à temperatura ambiente 48 h. Seguidamente a suspensão e dialisada contra agua.

Em seguida mistura-se com 150 mg de cianoborohidreto de sódio e agita-se a pH 7,5 durante 24 horas. Esta suspensão é em seguida dialisada contra água.

Eventualmente a amina pode ser alquilada, ou pode ser acetilada com ácido cloroacético, anidrido acético ou anidrido de ácido diglicólico.

Exemplo 9 l^^ggggffiSSaffianBEEnsca;

-Wrs^srsjmsiK·— tf

1000 mg de microparticulas de poliacroleina do exemplo 2 sao postas em suspensão em 50 ml de agua. A esta suspensão adicionam-se 1000 mg de fosfato de 3-aminopropano e agita-se à temperatura ambiente 48 horas. Seguidamente a suspensão e dialisada contra água.

Em seguida mistura-se com 150 mg de cianoborohidreto de sódio e agita-se a pH 7,5 24 horas. A suspensão é em seguida dialisada contra água.

Eventualmente a amina pode ser alquilada, ou pode ser acetilada com ácido cloroacético, com anidrido acético ou com anidrido do acido diglicolico.

Exemplo 10

1000 mg de microparticulas de poliacroleina do exemplo 3 sao postas em suspensão em 50 ml de agua. A esta suspensão adicionam-se 1000 mg de ácido 8-amino-octanoico e agita-se à temperatura ambiente 24 horas. Seguidamente a suspensão é dialisada contra água.

Em seguida mistura-se com 150 mg de cianoborohidreto de sodio e agita-se 24 horas a pH 7,5. A suspensão é depois dialisada contra água.

Eventualmente a amina pode ser alquilada, ou pode ser acetilada com ácido cloroacético, com anidrido acético ou com anidrido do acido diglicolico.

Exemplo 11

1000 mg de microparticulas de poliacroleina do exemplo 4 sao postas em suspensão em 50 ml de água. A esta suspensão adicionam-se 1000 mg de ácido 5-aminovalerico e agita-se a temperatura ambiente 36 horas. Seguidamente a suspensão é dialisada contra água.

Em seguida mistura-se com 150 mg de cianoborohidreto de sódio e agita-se 24 horas a pH 7,5. Esta suspensão e depois dialisada contra água.

A amina pode eventualmente ser

alquilada ou pode -ser acetilada com ácido cloroacético, com anidrido acético ou com anidrido do ácido diglicólico.

Exemplo 12

1000 mg de micropartícuias de poliacroleina do exemplo 5 sao postas em suspensão em 50 ml de agua. A esta suspensão adicionam-se 1000 mg de cloridrato de D-glucosamina e agita-se â temperatura ambiente 30 horas. Seguidamente dialisa-se a suspensão contra agua.

Em seguida mistura-se com 150 mg de cianobor ohidr eto de sódio e agita-se 24 horas a pH 7,5. Esta suspensão é depois dialisada contra água.

A amina pode eventualmente ser alquilada, ou pode ser acetilada com ácido cloroacético, com anidrido acético ou com anidrido do acido diglicólico.

Exemplo 13

1000 mg de micropartículas de poliacroleina de exemplo 6 sao postas em suspensão em 50 ml de água. A esta suspensão adicionam-se 1000 mg de hexametilenodiamina e agita-se à temperatura ambiente 24 horas. Seguidamente a suspensão e dialisada contra água.

Em seguida misturam-se com 150 mg de cianoborohidreto de sodio e agita-se 24 horas a pH 7,5. Esta suspensão é depois dialisada contra água.

A amina pode eventualmente ser alquilada, ou ser acetilada com ácido cloroacético, com anidrido acético ou com anidrido do ácido diglicólico.

Exemplo 14

1000 mg de micropartículas de poliacroleina do exemplo 7 sao postas em suspensão em 50 ml de água. A esta suspensão adicionam-se 1000 mg de polilisina (PM=32 600 Dalton) e agita-se á temperatura ambiente 30 horas.

Seguidamente a suspensão e lavada com agua.

Exemplo 15

1000 mg de micropartículas de poliacroleina do exemplo 5 sao postas em suspensão em 2,5 ml de agua. A esta suspensão adicionam-se 250 mg de albumina de soro humano dissolvidos em 2,5 ml de água e agita-se 8 horas á temperatura ambiente. Em seguida a suspensão é dialisada contra água destilada (cut off 100 000).

Exemplo 16

1000 mg de micropartículas de poliacroleina do exemplo 4 sao postas em suspensão em 50 ml de água. A esta suspensão adicionam-se 1000 mg de (2-dietilamino)-etilamina e agita-se 20 horas a temperatura ambiente. Em seguida a suspensão é dialisada contra água.

Exemplo 17

300 mg de micropartículas de poliacroleina do exemplo 1 sao postas em suspensão em 7,5 ml de agua destilada. A esta suspensão adicionam-se 750 mg de ácido 3-aminopropano-l-sulfónico dissolvidos em 7,5 ml de água e agita-se 24 horas à temperatura ambiente. Seguidamente a suspensão é dialisada contra água destilada (cut off 1000 D).

Exemplo 18

200 mg de micropartículas de poliacroleina do exemplo 7 sao postas em suspensão em 5 ml de água destilada. A esta suspensão adicinoam-se 500 mg de lisina, dissolvidos em 5 ml de água, e agita-se 24 horas à temperatura ambiente. Seguidamente a suspensão é dialisada contra água destilada (cut off 5 000 D).

Ensaios in vitro

Em experiências in vitro, por medição de reflexo da amplitude do eco de suspensões comprovam-se as boas propriedades acústicas de micropartículas de acordo com a invenção, seleccionadas como exemplos:

Para elucidação dos ensaios in vitro e das imagens obtidas a partir dos mesmos:

o aparelho de medida consiste num emissor de ultrassons combina33

do com um receptor de ultrassons e uma cuvete de medida com a amostra. Para a medição das propriedades acústicas da amostra e enviado um impulso de ultrassons. 0 impulso é disperso na parede de vidro da cuvete, atravessa a amostra e, caso a amostra nao seja apta a gerar ecos, é depois disperso na parede posterior da cuvete. A reflexão do impulso de ultrassons é medido pelo receptor e é indicada por uma modificação da amplitude (ver figuras).

Na fig. 1 está representado o comportamento de reflexão da água (como exemplo de uma amostra nao geradora de eco). Reconhecem-se nitidamente as amplitudes de reflexão da parede anterior (a 3 /isec) e da parede posterior (a cerca de 16 jisec) da cuvete.

Se se dispuzer de uma amostra geradora de eco produz-se um comportamento de reflexão como está representado nas figs. 2 a 4. 0 sinal reflectido da parede da cuvete nao é captado, visto que o impulso de ultrassons é dissipado pela acçao inversa da amostra geradora de eco, ou é modificada de tal modo que ja nao se capta no receptor qualquer reflexão.

Determinaram-se as amplitudes de reflexão de suspensões aquosas de partículas dos exemplos 8 (fig. 2), 11 (fig.3) e 15 (fig. 4), cada um numa concentração de 0,5 mg/ml.

Ensaios in vivo

Para a realizaçao de um ensaio ecocardiográfico a um cao com cerca de 10 kg de peso (Beagle) utilizam-se os agentes de contraste de acordo com a invenção, do seguinte modo:

a partir do frasco com a suspensão pronta para utilização toma-se 1 ml da solução que contêm 40 jig/ml de partículas acopladas com albumina (exemplo 15) em solução a 5% de glucose. A injecção deste agente de contraste e realizada na Vena Saphena ramus caudalis através de uma torneira de três vias, aberta de todos os lados, com uma velocidade de injecção de pelo * ax^CMcnsHnHÉEgKV^

menos 1 ml/segundo, mas preferivelmente com uma velocidade de 3 ml/segundo, seguida por uma injecção posterior de 5 ml de soro fisiológico (a 0,9%). A injecção posterior é realizada para se obter um bolo de agente de contraste que permaneça o mais longo tempo possível. Antes da injecção (fig. 5) colocase um dispositivo de 4 câmaras apical no animal de ensaio, com uma cabeça ultrassónica comercial para ecocardiografia, na parede do tórax (desvio transtoráxico) e fixa-se com um grampo. Antes, durante e depois da injecção o desvio ultrassónico sobre o ecran do aparelho de ensaio com ultrassons é observado visualmente e eventualmente é registado num suporte magnético (vídeo) ou é documentado com uma impressora vídeo. Esta montagem de ensaio corresponde á técnica actual e é conhecida dos especialistas.

Quando o agente de contraste de ultrassons alcança a metade direita do coraçao realizam-se os efeitos de contraste em Farddoppler, em imagem de eco bidimensional ou imagem de eco no modo M. 0 agente de contraste marca primeiro o sangue da aurícula direita, seguidamente é contrastado o ventrículo direito e finalmente é contrastada a artéria pulmonar. Neste caso dá-se um enchimento homogéneo que se mantém por tempo suficiente para um ensaio de diagnóstico. Enquanto as cavidade da parte direita do coraçao se enchem de novo com sangue nao contrastado (decréscimo e desaparecimento da ecogenidade nas cavidades do coraçao) o agente de contraste, depois da passagem pelos pulmões (trnascapilar) alcança as veias pulmonares, enche depois a aurícula esquerda, o ventrículo esquerdo e o sistema de alta pressão que se segue. 0 efeito de contraste na cavidades da parte esquerda do coraçao permanece por mais longo tempo do que na parte direita do coraçao. Alem da contrastaçao das cavidades da parte esquerda do coraçao realiza-se também uma contrastaçao de outros órgãos, revelados pela irrigaçao sanguínea.

A fig. 6 mostra o enchimento do ventrículo esquerdo com o agente de contraste.

A utilização dos agentes de contraste de

ultrassons de acordo com a invenção nao está limitada à visualização do fluxo sanguíneo no sistema de vasos sanguíneos, sendo igualmente possível uma contrastaçao de cavidades do corpo. Como consequência de representação da irrigaçao sanguí-

nea, pode também realizar-se com bastante êxito de outros orgãos com estes agentes de contraste.	a investigação
	REIVINDICA	ÇÕES
	- lâ - Processos	para a	preparaçao de
micropartículas	constituídas por	polímeros	biodegradáveis

que sao formados por adeídos polimerizáveis que contêm eventualmente aditivos aptos para copolimerizaçao e/ou agentes de recticulaçao, eventualmente agentes tensioactivos ou misturas de agentes tensioactivos, gases e/ou líquidos facimente volatilizáveis numa forma livre ou combinada, agentes de acoplamento, eventualmente biomoléculas ou macromoléculas ligadas através destes agentes de acoplamento, assim como eventualmente componentes actios para diagnóstico ou fins terapêuticos, caracterizado por se fazer reagir, por mistura, uma solução aquosa contendo 0 a 40% e de preferência 0,01 a 10% p/v de agentes tensioactivos e 0 a 10% p/v de agentes de diagnóstico ou constituintes terapeuticamente activos, e gases ou líquidos facilmente volatilizáveis, a uma temperatura compreendida entre -5°C e +80°C, de preferência entre 0 e 40°C, a um valor de pH compreendido entre 7 e 14 e de preferência entre 9 e

13, durante um período compreendido entre 1 min. a 24 h e de preferência entre 1 a 10 h, e eventualmente mediante a passagem de um gás, com 1 ou mais aldeídos copolimerizáveis até uma concentração, referida à mistura reactiva, de 0,1 a 50% e de preferência 3 a 20% p/ v, assim como com aditivos copolimerisáveis até uma concentração, referida à solução reactiva, de 0 a 20%, de preferência 1 a 5% p/v, com agentes

de retieulaçâo até uma concentração, referida à mistura reactiva, de 0 a 5%, de preferência 0,1 a 1% p/v, em em seguida - eventualmente depois da purificação - se fazerem reagir as micropartícuias assim obtidas com uma solução aquosa que contêm - referida à quantidade de aldeído - até quantidades equimoleculares do reagente de acoplamento, assim como 0 a 20% e de preferência 0,01 a 10% p/v de 1 ou mais agentes tensioactivos referidos ao volume global, mediante agitaçao, durante um período de reacçao até 3 dias, de preferência até 2 dias , a temperaturas compreendidas de 0 a 60°G, de preferência de 5 a 30°C, a uma valor de pH compreendido de 3 a 9 e de preferência de 5 a 8, e - eventualmente depois da purificação - se ligarem estas eventualmente a biomoléculas ou macromoléculas.

- 2§ Processo de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado por se obterem micropartícuias que sao apropriadas para utilização no diagnóstico por ultrassons.

- 3^â Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obterem micropartículas que sao apropriadas para utilização em hipertermia parcial artificial.

_ 4ã _

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obterem micropartículas que podem ser desviadas por um campo magnético exterior.

- 5^ã Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obterem micropartículas nas quais os aldeídos polimerisáveis sao escolhidos de:

I. aldeídos X, ^-insaturados, como por exemplo acroleina, crotonaldeído propionaldeído

II.

Derivados de acroleina -substituidos, como por exemplo

Jv -Metilacr oleina -si -Gloroacroleina ot-Fenilacroleina ιΑ-Etilacroleina

-Isopropilacroleina cs-n-Butilacroleina e<-n-Propilaacroleina

III. Dialdeídos, como por exemplo glutaraldeido, succinaldeído ou os seus derivados, ou as suas misturas com aditivos aptos para copolimerizaçao, como por exemplo:

acroleina -substituídas, acroleina - substituídas, cianoacrilato de etilo, cianoacrilatos de metilo, cianoacrilatos de butilo, cianoacrilatos de hexilo, metacrilatos de metilo álcoois vinílicos, ácidos acrílicos, ácidos metacrílicos, cloretos de acriloilo cloretos de metacriloilo, acrilonitrilo, metacrilonitrilo, acrilamidas , acrilamidas substituídas, metacrilatos de hidroximetilo, óxido de mesitilo, dimetilaminoetilmetacrilat0-2-vinilpiridinas, N-vinil-2-pirrolidinona.

- 6^ Processo de acordo com a reivindica38 çao 1, caracterizado por se obterem microparticulas nas quais os agentes tensioactivos eventualmente incorporados sao escolhidos de substâncias tensioactivas ionogenias ou nao ionogénlas, como por exemplo.

óxido de polietileno, polioxletlleno-polioxipropilenos, tais como Pluronic^) F 68, Pluronic^) F 108, Pluronic ^(R) F 127,

Polietilenoglicol, Poloxamin 908, Polaxamer 407 sais de ácidos carboxílicos como por exemplo oleato de sódio, ésteres de ácidos gordos de polioxietileno, como por exemplo estearato de polioxietileno, dioctilsulfosuccinato de sódio, aductos poliglutaraldeido-hidrogenossulfito de sódio, aductos poliacroleina-hidrogenossulfito de sódio, ácido polivinilsulfónico.

_ 7§ _

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obterem microparticulas que contêm como gases ou líquidos facilmente volatillizáveis, amónia, ar, gases nobres ou compostos de gases nobres (hélio, neon, argon, xenon, cripton) halogenetos de enxofre, como por exemplo hexafluoreto de enxofre, azoto, dióxido de carbono, oxigénio, hidrogénio, hidrocarbonetos ou as suas misturas como por exemplo

Metano

Etano

Propano

Butano

Pentano

Neopentano

Isopentano

Ciclopentano

Etileno

Propileno

Acetileno

3.3- Dimetil-l-Butino

2.3- Pentadieno 2-Metil-2-Buteno 2,Metil-l,3-Butadieno

2-Butino

2- Metil-l-Buteno

3- Metil-l-Buteno, hidrocarbonetos halogenados ou as suas misturas, como por exemplo cloreto de metileno,

1,1-dicloroetileno, cloreto de isopropilo, dibromodifluormetano, bromometano, éteres como por exemplo éter dimetílico, eter dietílico ou eteres fluorados, ou compostos como por exemplo Dimetilaminoacetona

Propilenoóxido

N-Etilmetilamino

N-Etildimetilamino Furano

- 8- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obterem micropartícuias que contêm como agentesde acoplamento

I. Compostos contendo grupos amino, como por exemplo:

,ti ti

Hidroxilamina

Butilamina

Alilamina

Etanolamina

Trishidroximetilaminometano

Ácido 3-amino-l-propansulfónico

5-Aminovalerico

8-Aminooctanoico

Cloridrato de D-Glucosamina

Aminogalactose

Aminosorbite

Aminomanite

Dietilaminoetilamina

Anilina

Sulfonilamida

Colina

N-Metilglucamina

Piperazina

1,6-Hexanodiamina

Ureia

Hidrazina

Glicina

Alanina

Lisina

Serina

Valina

Leucina

Petidos

Proteínas

Albumina

Albumina de soro humano

Polilisina

Gelatina

Poliglicolaminas

Aminopoliálcoois sulfato de dextrano com grupos amino N-Aminopolietilenoglicol (HO-PEG-NH2)

II.

Ν,Ν'-Diaminopolietilenoglicol (Ní^-PEG-NE^)

Anticorpos

Imunoglobulinas.

Compostos contendo grupos acido, como exemplo ácidos carboxílicos tais como ácidos acético, propiónico, butírico, valerico , caprónico, caprílico, cáprico, laurico, mirístico, palmítico, esteárico, oleico, linolénico, ciclohexanocarboxílico, fenilacetico, benzoilacêtico, por clorobenzoico, bromobenzoico, nitrobenzoico, ortoftálico, metaftálico, paraftálico, salicílico, hidroxibenzoico, aminobenzoico, metoxibenzoico, peg-nh-co-ch₂ch₂-co-nh-ch

COOH ch₂-cooh (PEG-Linker-Ácido aspárgico) PEG-Linker-Ácido glutânico PEG-Linker-DTPA

PEG-Linker-EDTA

III. Compostos contendo grupos hidroxi, como por exemplo:

álcoois

Metanol

Etanol

Propanol

Butanol

Pentanol

Hexanol

Heptanol

Octanol

Decanol

Dodecanol

Tetradecanol

Hexadecanol

Octadecanol

Álcool isopropílico

Álcool isobutílico

Álcool isopentílico

Ciclopentanol

Ciclohexanol

Álcool crotílico

Álcool benzílico

Álcool fenílico

Difenilmetanol

Trifenilmetanol

Álcool cinâmico

Etilenoglicol

1,3-Propandiol

Glicerina

Pentaeritrite

IV. Substâncias polimerizáveis, tais como aldeídos ,/3-insaturados , como por exemplo acroleina, crotonaldeído, propionaldeído,

derivados de acroleina -substituídos como por exemplo

-Metilacroleina

-Cloroacroleina

-Fenilacroleina

-Etilacroleina

-Isopropilacroleina

-n-Butilacroleina

-n-Propilacroleina dialdeidos, como por exemplo glutaraldeido, succinaldeído ou os seus derivados, ou as misturas com aditivos aptos à copolimerizaçao, como por exemplo

Acroleina oc- substituídas,

Acroleinas /^-substituidas, cianoacrilatos de metilo, cianoacrilatos de butilo, cianoacrilatos de hexilo, metacrilatos de metilo, álcoois vinílicos, ácidos acrílicos, ácidos rnetacrilicos, cloretos de acriloilo, acrilonitrilo, metacrilonitrilos, acrilamidas, acrilamidas substituidas, metacrilatos de hidroximetilo, óxido de mesitilo, dimetilaminoetilmetacrilato-2-vinilpiridinas, N-vinil-2-pirrolidinona.

- 9- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obterem micropartícuias que contêm como biomoleculas ou macromoleculas compostos específicos de orgãos ou tecidos, como por exemplo anticorpos monoclonais.

- 10^a Processo de acordo com a reivindicaçaol, caracterizado por se obterem micropartículas que contêm componentes apropriados para fins de diagnóstico ou terapeuticamente activos, para a diagnose e terapia de tumores, como por exemplo

Doxorubicina Actinomicina Magnetite Mitomicina C Triamcinolona.

- 11^a Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obterem micropartículas que têm um diâmetro compreendido entre 0,1 e 40 um.

- 12^ã -

Claims (1)

1. Processo para a preparaçao de composiçoes farmacêuticas contendo as micropartículas preparados de acordo com os processos das reivindicações anteriores e eventualmente aditivos galénicos correntes, caracterizado por se dissolverem ou porem em suspensão em agua as micropartículas, de modo que a concentração de micropartículas esteja compreendida entre 1 ug a 100 mg por ml e de preferência 10 ug a 1 mg por ml da formulação final, e eventualmente em combinação com os aditivos galénicos correntes, conferindo-se-lhe uma forma apropriada para aplicaçao entérica ou parentérica.

   A requerente reivindica a prioridade do pedido de patente alemao apresentado em 9 de Fevereio de 1990, sob o n^a . P 40 04 430.0.

   Lisboa, 7 de Fevereiro de 1991.

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   RESUMO

   PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE MICROPARTlCULAS DE POLÍMEROS BIODEGRADÁVEIS E DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE OS CONTEM

   A invenção refere-se a um processo para a preparaçao de micropartícuias constituídas por polímeros biodegradáveis que sao formado por aldeidos polimerizáveis que contêm eventualmente aditivos aptos para copolimerizaçao e/ou agentes de recticulaçao, eventualmente agentes tensioactivos ou misturas de agentes tensioactivos, gases e/ou líquidos facilmente volatilizáveis numa forma livre ou combinada, agentes de acoplamento, eventualmente biomoleculas ou macromoléculas ligadas através destes agentes de acoplamento, assim como eventualmente componentes activos para diagnóstico ou fins terapêuticos, que compreende fazer-se reagir, por misturas, uma solução aquosa contendo 0 a 40% e de preferência 0,01 a 10% p/v de agentes tensioactivos e 0 a 10% p/v de agentes de diagnóstico ou constituintes terapeuticamente activos, e gases ou líquidos facilmente volatilizáveis, a uma temperatura compreendida entre -5°C e +80°C, de preferência entre 0 e 40°C, a um valor de pH compreendido entre 7 e 14 e de preferência entre 9 e 13, durante um período compreendido entre 1 min. a 24 h e de preferência entre 1 a 10 h, e eventualmente mediante a passagem de um gás, com 1 ou mais aldeidos copolimerizáveis até uma concentração, referida à solução reactiva, de 0 a 20%, de preferência 1 a 5% p/v, com agentes de reticulaçao até uma concentração, referida à mistura reactiva, de 0 a 5%, de preferência 0,1 a 1% p/v, e em seguida - eventualmente depois de purificação - fazerem-se reagir as micropartícuias assim obtidos com uma solução aquosa que contêm - referida a quantidade de aldeido - até quantidades equimoleculares do reagente de acoplamento, assim como 0 a 20% e de preferência 0,01 a 10% p/v de 1 ou mais agentes tensioactivos referidos ao volume global, mediante 'Λ.

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   X agitaçao, durante um período de reacçao até 3 dias, de preferência até 2 dias, a temperaturas compreendidas de 0 a 60°C, de preferência de 5 a 30°C, a um valor de pH compreendido de 3 a 9 e de preferência de 5 a 8, e - eventualmente depois da purificação - ligarem-se estas eventualmente a biomoléculas ou macromoléculas.

   ’S2T '001 'SÁ '05 '52 '0 '52- '05- 'SÁ- '00T-'S2VTempo (jjs) apnniduJV òpnitl duj\f ’52Τ ΌΟΓ 'SZ. ’0S '55 '0 '55- '05- 'SZ- ‘001-'S2T-