KR102358116B1 - 기체 발포형 마이셀 및 이의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 폴리에틸렌 글리콜 유도체 및 알킬클로로포메이트를 결합시켜 제조한 기체 발포형 마이셀에 관한 것이다. 본 발명의 기체 발포형 마이셀은 체내에서 순환하다가 질병 부위에 침적되어 이산화탄소를 발생시킴으로써 보다 증강된 초음파 진단 이미지를 얻을 수 있다.
Description
본 발명은 폴리에틸렌 글리콜 유도체 및 알킬클로로포메이트를 결합시켜 제조한 기체 발포형 마이셀에 관한 것이다.
많은 조영제들이 광범위하게 개발되었고, 상기 조영제들은 X-ray, 초음파, MR, CT 및 PET [Journal of Clinical Oncology 2008;26(24):4012-4021, European Journal of Nuclear Medicine 2000;27(6):619-627, Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology 2009;5(4):403-416]와 같이 임상 용도로 사용되고 있다. 신장 독성, 구토, 탈모, 신장 장애, 신장 병증 및 신원성(nephrogenic) 전신 섬유증으로 나타나는 조영제의 독성은 상기 조영제의 임상 적용을 제한해왔다[Clinical Journal of the American Society of Nephrology 2007;2(2):264-267, Investigative Radiology 2008;43(2):141-144]. 이러한 조영제의 독성은 폴리머 코팅 및 타겟-리간드 컨쥬게이션에 의해 억제될 수 있지만, 잠재적인 독성은 여전히 남아있다.
최근 들어, 무독성의 이산화탄소 기체가 조영제로서 상당한 주목을 받고 있다[European Journal of Radiology 2006;60(3):324-330, Pharmaceutical Research 2010;27(1):1-16, Artificial Cells, Blood Substitutes and Biotechnology 1988;16(1-3):411-420].
초음파 이미징 기술은 20 KHz 이상의 소리의 산란이나 반사에 따른 음향신호에 의해 얻어지고, 체내에서 해부학적, 기능적으로 조직을 영상화하는데 사용된다[Heart 1997;77(5):397-403, European Radiology 2001;11(8):1316-1328, Ultrasonic Imaging 1979;1(3):265-279]. 또한, 초음파 이미징 기술은 무삽입 또는 무수술, 간편함, 실시간 이미징 및 적은 비용과 같은 진단 도구로서의 매력적인 특성을 갖는다[Current Opinion in Pulmonary Medicine 2003;9(4):282-290].
마이크로버블(microbubble, 미세기포)이 초음파 조영제로서 적용되어 왔으나, 이들은 본질적으로 인체 투여시 혈액 내 혈액 순환에서 불안정하고, 마이크론 수준의 큰 사이즈를 가지므로 인해 혈관 침투에 제한적이다. 특히 질병 특이적 진단에 어려움이 있으며[Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition 2011;22(4-6):417-428], 암 조직 등으로의 침투가 어렵기 때문에, 암 조직의 영상화를 위한 사용에 제한적인 단점이 있다. 또한, 마이크로 버블은 생활성 분자로 기능화하기가 어렵다.
기존의 마이크로버블 초음파 조영제는 혈액에서 불안정하여 진단하고자 하는 지점까지 도달할 수 있는 마이크로버블의 농도가 낮아 정밀한 진단이 어러운 문제점을 가진다. 또한, 마이크로버블의 막(membrane)이 주로 지질로 구성되어 특정 질병을 표적으로 하는 리간드의 도입을 통한 질병 특이적 진단이 어려운 문제점을 가진다.
본 발명자들은 이러한 문제점을 해결하기 위해, 종래의 마이크로버블 초음파 조영제 및 기체 봉입형 초음파 조영제와 달리 나노입자의 형태로 체내에서 순환하다가 질병 부위에 침적되어 기체가 발생하는 기체 발포형 나노입자를 제조함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 일반식 1로 표현되는 화합물을 포함하는 기체 발포형 마이셀을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 기체 발포형 마이셀을 포함하는 초음파 조영용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 기체 발포형 마이셀을 포함하는 세포 타격을 이용한 세포 괴사유도용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 기체 발포형 마이셀에 약물이 담지되어 있는 것을 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 폴리에틸렌 글라이콜(polyethylene glycol) 및 알킬 클로로포메이트(alkyl chloroformate)를 혼합하여 폴리에틸렌 글라이콜 유도체를 합성하는 단계; 상기 폴리에틸렌 글라이콜 유도체를 아세토니트릴, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름 및 메탄올에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합용매에 용해시킨 후, 용매를 증발시키는 단계를 포함하는, 일반식 1로 표현되는 화합물을 포함하는 기체 발포형 마이셀의 제조방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 하기 일반식 1로 표현되는 화합물을 포함하는 기체 발포형 마이셀을 제공한다.
[일반식 1]
상기 일반식에서,
R1은 탄소 원자수 1 내지 2의 알킬기, H, -NH2 또는 COOH이며,
p는 12 내지 227의 정수이고,
q는 2 내지 14의 정수이다.
일 구체예에 있어서, 상기 화합물의 q는 4 내지 10의 정수, 4 내지 8의 정수, 6 내지 10의 정수 또는 8 내지 10의 정수일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 마이셀은 직경이 150 내지 500 nm 일 수 있다.
본 발명에서 용어 ‘마이셀(micelle)’은 일반적으로 양친성, 예컨대 친수성기와 소수성기를 동시에 갖는 저분자량의 물질들이 이루는 구형의 구조의 화합물을 의미한다. 상기 마이셀은 열역학적으로 안정한 특성을 가진다. 상기 마이셀 구조를 갖는 화합물에 비수용성(소수성) 약물을 녹여 투입하는 경우 상기 약물은 마이셀 내부에 존재하게 된다. 이러한 마이셀은 체내에서 온도나 pH 변화에 반응하여 표적 지향적 약물방출을 할 수 있으므로, 상기 마이셀은 약물 전달용 캐리어로서의 응용 가능성이 대단히 높다. 다만, 인체내 혈관투여시 혈관 내에서 암과 같은 특정의 질환부위에 도달하여 약물을 방출하기전까지 안정적으로 약물을 담지하느냐 하는 것이 관건이다.
본 발명의 마이셀은 알킬 클로로포메이트가 폴리에틸렌 글라이콜 유도체의 하이드록시기와 컨쥬게이트 되어 카보네이트기가 형성된 화합물을 포함한다. 본 발명에서는 이하 상기 화합물을 합성 고분자라 표현할 수 있다.
구체적으로, 상기 마이셀은 소수성 코어(core)에 존재하는 알킬 클로로포메이트와 표면(또는 쉘, shell)에 위치하는 친수성 폴리에틸렌 글라이콜 유도체 간의 카보네이트 결합을 가진다. 따라서, 알킬 클로로포메이트는 마이셀의 내부에 위치하고, 폴리에틸렌 글라이콜 유도체가 표면에 위치하고 있는 형태를 가지고 있다.
일 구체예에 있어서, 마이셀은 상기 마이셀의 표면에 표적지향 리간드가 결합된 것일 수 있다. 리간드는 마이셀 표면에 존재하는 폴리에틸렌 글라이콜 유도체의 말단 부위에 결합하여 강한 결합을 형성할 수 있다. 리간드의 특성에 따라 본 발명의 마이셀은 표적지향성을 가질 수 있다. 본 발명에서 용어 '리간드(ligand)'는 리간드 결합단백질에 결합하여 구조적인 변화를 일으키는 분자를 의미한다. 상기 리간드는 당, 아미노산, 단백질, 지질, 유기산, 금속 또는 금속이온, 산화물, 수산화물 또는 그 컨쥬게이트(conjugates), 무기이온, 아민 또는 폴리아민 및 비타민 중 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 표적하고자 하는 수용체에 특이적으로 결합(binding)하는 것이라면 제한없이 이용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명에 따른 카보네이트기를 포함하는 마이셀은 수용성 조건에서 상기 마이셀의 카보네이트기가 가수분해로 인해 끊어지면서 이산화탄소 기체를 생성하는 반응을 일으키게 된다(도 6).
일 구현예에 있어서, 본 발명은 상기 기체 발포형 마이셀을 포함하는 초음파 조영용 조성물을 제공할 수 있다. 상기에서 기술한 바와 같이, 본 발명의 기체 발포형 마이셀은 수용성 조건에서 이산화탄소를 발생시킬 수 있으며, 나노입자의 형태로 체내에서 순환하다가 질병 부위에 침적되어 기체를 발생시킬 수 있다. 따라서 원하는 질병 부위에서 보다 많은 기체의 발생이 가능하여, 질병에 관한 보다 증강된 진단 이미지를 얻을 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명에 따른 기체 발포형 마이셀의 초음파 진단능을 확인하고자 초음파 장비를 이용하여 진단능을 확인하였다. 확인 결과, 폴리에틸렌 글리콜-알킬 카보네이트를 이용하여 제조한 마이셀의 초음파 영상효과가 우수함을 확인하였다, 특히 폴리에틸렌 글리콜5000-도데실 카보네이트가 다른 합성 고분자 마이셀에 비해 월등히 높은 초음파 조영 효과가 있는 것을 확인하였다(도 12).
또한 일 구현예에 있어서, 본 발명은 상기 기체 발포형 마이셀을 포함하는 세포 타격을 이용한 세포 괴사유도용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 기체 발포형 마이셀을 사용하여 이산화탄소 기체를 발생시키는 경우, 세포 타격은 상기 기체 발포형 마이셀의 구조에 의해 생성되는 가스의 발생량과 시간을 조절하여, 상기 마이셀이 세포 내 이입된 후 발생시킬 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명에 따른 기체 발포형 마이셀의 세포 타격효과을 확인하고자 유기용매 단독 또는 혼합용매를 이용하여 제조한 마이셀을 광학이미지를 이용하여 확인하였다. 확인 결과, 단일 용매의 종류 또는 혼합용매 종류 및 혼합 비율에 따라 마이셀 입자의 기체 발생량이 각기 다름을 확인하였다(도 10 및 11).
또한 일 구현예에 있어서, 본 발명은 상기 기체 발포형 마이셀에 약물이 담지되어 있는 약물 전달용 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명에 따른 마이셀은 상기 마이셀의 내부에 약물을 담지하여, 효과적인 약물 전달용 조성물로 이용이 가능하다. 본 발명인 약물 전달용 조성물은 기체 발생을 통해 약물 유효성을 극대화할 수 있다. 특히, 상기 약물 전달용 조성물은 수용성 환경에서의 기체 발생을 통해 약물 유효성을 극대화할 수 있다. 상기 약물 전달용 조성물은 수용성 환경에서 기체를 발생시켜 약물의 방출능을 향상시킬 수 있고, 약물의 효율적인 전달 및 효능 극대화를 가능하게 할 수 있다.
따라서, 상기 약물 전달용 조성물은 세포괴사 유도와 동시에 추가적인 약물 전달에 의한 치료 효과를 동시에 얻을 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 약물은 화학약물, 단백질, 펩타이드 또는 뉴클레오타이드일 수 있다. 상기 화학약물은 특별하게 제한되지 않으며, 암세포 생성 억제, 암세포 생장 억제 또는 생장 지연, 암 치료, 암 세포 이동 및 침윤에 따른 전이 억제, 또는 암 줄기세포 치료 효과를 갖는 약물을 이용할 수 있다. 상기 단백질 또는 펩타이드는 특별하게 제한되지 않으며, 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소 저해제, 신호전달단백질 또는 그 일부분, 항체 또는 그 일부분, 단쇄항체, 결합단백질 또는 그 결합도메인, 항원, 부착단백질, 구조단백질, 조절단백질, 독소단백질, 사이토카인, 전사조절 인자, 혈액 응고인자 및 백신 등을 이용할 수 있다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 폴리에틸렌 글라이콜(polyethylene glycol) 및 알킬 클로로포메이트(alkyl chloroformate)를 혼합하여 폴리에틸렌 글라이콜 유도체를 합성하는 단계; 및
상기 폴리에틸렌 글라이콜 유도체를 아세토니트릴, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름 및 메탄올에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합용매에 용해시킨 후 용매를 증발시키는 단계를 포함하는, 하기 일반식 1로 표현되는 화합물을 포함하는 기체 발포형 마이셀의 제조방법을 제공한다:
[일반식 1]
상기 일반식에서,
R1은 탄소 원자수 1 내지 2의 알킬기, H, -NH2 또는 COOH이며,
p는 12 내지 227의 정수이고,
q는 2 내지 14의 정수이다.
일 구체예에 있어서, 상기 화합물의 q는 4 내지 10의 정수, 4 내지 8의 정수, 6 내지 10의 정수 또는 8 내지 10의 정수일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 혼합용매는 메틸렌 클로라이드와 아세토니크릴, 클로로포름 또는 메탄올의 혼합용매이고, 이에 제한되는 것은 아니나 상기 혼합용매의 혼합비율, 즉, 메틸렌 클로라이드:(아세토니트릴, 클로로포름 또는 메탄올)의 혼합비율은 3 내지 1 : 1 내지 3 또는 2 내지 1 : 1 내지 2 또는 2 : 1 일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글라이콜의 분자량(Mn)은 550 내지 10000 g/mol일 수 있다.
이하, 본 발명의 기체 발포형 마이셀 제조방법을 상세히 살펴본다.
1. 합성 고분자 폴리에틸렌 글리콜-알킬 카보네이트의 제조
마이셀 제조에 앞서, 마이셀을 이루기 위한 합성 고분자를 먼저 제조한다.
우선, 폴리에틸렌 글리콜과 알킬 클로로포메이트 각각을 아세토니트릴에 용해시켜 폴리에틸렌 글리콜 용액 및 알킬 클로로포메이트 용액을 준비한다. 준비된 폴리에틸렌 글리콜 용액에 알킬 클로로포메이트 용액을 첨가한 후 교반한다. 상기 교반이 완료된 혼합물에 피리딘을 첨가한 후 반응시켜 폴리에틸렌 글리콜-알킬 카보네이트를 제조한다.
한 구체예로서, 폴리에틸렌 글리콜 용액은 폴리에틸렌 글리콜 0.2 내지 0.8 mmol을 아세토니트릴 2 내지 6 ml에 용해시켜 준비될 수 있고, 알킬 클로로포메이트 용액은 알킬 클로로포메이트 1 내지 3 mmol을 아세토니트릴 3 내지 7 ml에 용해시켜 준비될 수 있다.
또한 한 구체예로서, 이에 제한하는 것은 아니나 상기 폴리에틸렌 글리콜 용액에 알킬 클로로포메이트 용액을 첨가한 뒤, 2 내지 10분, 3 내지 8분 또는 4 내지 6분 동안 교반할 수 있다. 예를 들면, 5분 동안 교반할 수 있다.
한 구체예로서, 상기 교반이 완료된 혼합물에 피리딘 1.5 내지 3.5 mmol을 첨가한 후, 0 내지 5℃ 에서 20 내지 40분간 반응시킨 뒤, 상온에서 24시간 반응시켜 폴리에틸렌 글리콜-알킬 카보네이트를 제조할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 폴리에틸렌 글리콜은 이에 제한되는 것은 아니나, 분자량이 550 내지 10000 g/mol, 750 내지 8000 g/mol, 1000 내지 6000 g/mol 일 수 있으며, 예를 들어 2000 g/mol 또는 5000 g/mol 일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 알킬 클로로포메이트는 지방족 화합물일 수 있으며, 탄소수 4 내지 10, 탄소수 4 내지 8, 탄소수 6 내지 10 또는 탄소수 8 내지 10의 알킬기를 가지는 클로로포메이트일 수 있다. 예를들어, 알킬 클로로포메이트로 부틸 클로로포메이트, 옥틸 클로로포메이트 또는 도데실 클로로포메이트가 사용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기와 같은 방법으로 제조된 폴리에틸렌 글리콜-알킬 카보네이트는 FT-IR 분광법 및 NMR 분석을 통하여 확인할 수 있다.
2. 용매증발법을 이용한 마이셀 입자 제조
상기 1. 에서 제조된 합성 고분자 폴리에틸렌 글리콜-알킬 카보네이트는 용매증발법을 통하여 마이셀로 제조할 수 있다.
폴리에틸렌 글리콜-알킬 카보네이트를 유기용매에 녹이고, 질소를 이용하여 용매를 휘발시키는 용매증발법을 수행한 후, 수용액에 재분산 시켜 마이셀을 제조할 수 있다. 한 구체예로서, 폴리에틸렌 글리콜-알킬 카보네이트 5 내지 15 mg을 유기용매에 녹일 수 있다. 상기 유기용매는 통상적으로 사용되는 유기용매일 수 있으며 예를들면, 아세토니트릴, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름 및 메탄올일 수 있다.
3. 혼합용매증발법을 이용한 마이셀 입자 제조
상기 1에서 제조된 합성 고분자 폴리에틸렌 글리콜-알킬 카보네이트는 혼합용매증발법을 통하여 마이셀로 제조된다.
폴리에틸렌 글리콜-알킬 카보네이트를 혼합용매에 녹이고, 질소를 이용하여 용매를 휘발시키는 용매증발법을 수행한 후, 수용액에 재분산 시켜 마이셀을 제조할 수 있다. 한 구체예로서, 폴리에틸렌 글리콜-알킬 카보네이트 5 내지 15 mg을 유기용매에 녹일 수 있다. 상기 유기용매는 통상적으로 사용되는 유기용매일 수 있으며 예를들면, 메틸렌 클로라이드 및 아세토니트릴의 혼합용매, 메틸렌 클로라이드 및 클로로포름의 혼합용매, 메틸렌 클로라이드 및 메탄올의 혼합용매일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 혼합용매는 메틸렌 클로라이드와 다른 용매의 비율이 3 내지 1 : 1 내지 3 일 수 있다.
또한, 본 발명의 마이셀은 단독 또는 혼합용매의 종류에 따라 다양한 크기의 마이셀 입자를 가질 수 있다. 한 구체예로서, 균일한 크기의 마이셀을 수득하기 위해 메틸렌 클로라이드 단독 용매 또는 메틸렌 클로라이드/클로로포름(혼합비율: 2:1) 혼합용매를 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 마이셀은 단독 또는 혼합용매의 종류에 따라 기체 발생량이 달라질 수 있다. 한 구체예로서, 메틸렌 클로라이드/아세토니트릴(2:1) 혼합용매, 메틸렌 클로라이드/클로로포름(2:1) 혼합용매를 사용하여 많은 양의 이산화탄소 기체를 발생시킬 수 있으며, 특히 메틸렌 클로라이드/아세토니트릴(2:1)의 경우 1시간 후에 더 많은 기체를 발생시킬 수 있다.
본 발명에 따른 기체 발포형 마이셀은 체내에서 순환하다가 질병 부위에 침적되어 이산화탄소를 발생시킴으로써, 보다 증강된 초음파 진단 이미지를 얻을 수 있다.
도 1은 카보네이트기 도입을 통한 기체 발포형 마이셀을 제조하기 위한 모식도이다.
도 2 및 3은 FT-IR을 이용하여 폴리에틸렌 글리콜 알킬 카보네이트를 분석한 그래프이다.
도 4 및 5는 NMR을 이용하여 폴리에틸렌 글리콜-알킬 카보네이트를 분석한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 기체 발포형 마이셀의 수용성 조건하에서 가수분해를 통한 이산화탄소 기체 발생과정으 나타내는 모식도이다.
도 7은 폴리에틸렌 글리콜-알킬 카보네이트의 가수분해를 통한 이산화탄소 기체 발생을 나타내는 사진이다.
도 8은 H-NMR을 이용한 폴리에틸렌 글리콜2000-알킬 카보네이트 가수분해능을 나타내는 그래프이다.
도 9는 H-NMR을 이용한 폴리에틸렌 글리콜5000-알킬 카보네이트 가수분해능을 나타내는 그래프이다.
도 10은 단독 유기용매의 차이에 따른 폴리에틸렌 글리콜5000-도데실 카보네이트 마이셀의 기체 발생량 차이를 나타내는 사진이다.
도 11은 혼합용매의 차이에 따른 폴리에틸렌 글리콜5000-도데실 카보네이트 마이셀의 기체 발생량 차이를 나타내는 사진이다.
도 12는 초음파 장비를 이용한 본 발명의 기체 발포형 마이셀의 초음파 진단능 평가 결과를 나타내는 사진이다.
도 13은 초음파 장비를 이용한 본 발명의 기체 발포형 마이셀의 초음파 이미지 정량분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 14는 혼합용매의 차이에 따른 폴리에틸렌 글리콜 2000-옥틸 카보네이트 기체 발생량 차이를 나타내는 사진이다.
도 15는 폴리에틸렌 글리콜 알킬 카보네이트와 이를 이용하여 제조된 마이셀의 세포독성 결과를 나타내는 그래프이다.
도 16은 리간드가 도입된 마이셀을 형광 현미경(TE2000-E)(Nikon)으로 관찰한 사진이다.
도 17은 리간드가 도입된 마이셀의 세포 전달능을 평가 결과를 나타내는 그래프이다.
도 18은 약물이 담지된 마이셀의 세포 사멸 효과 평가 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2 및 3은 FT-IR을 이용하여 폴리에틸렌 글리콜 알킬 카보네이트를 분석한 그래프이다.
도 4 및 5는 NMR을 이용하여 폴리에틸렌 글리콜-알킬 카보네이트를 분석한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 기체 발포형 마이셀의 수용성 조건하에서 가수분해를 통한 이산화탄소 기체 발생과정으 나타내는 모식도이다.
도 7은 폴리에틸렌 글리콜-알킬 카보네이트의 가수분해를 통한 이산화탄소 기체 발생을 나타내는 사진이다.
도 8은 H-NMR을 이용한 폴리에틸렌 글리콜2000-알킬 카보네이트 가수분해능을 나타내는 그래프이다.
도 9는 H-NMR을 이용한 폴리에틸렌 글리콜5000-알킬 카보네이트 가수분해능을 나타내는 그래프이다.
도 10은 단독 유기용매의 차이에 따른 폴리에틸렌 글리콜5000-도데실 카보네이트 마이셀의 기체 발생량 차이를 나타내는 사진이다.
도 11은 혼합용매의 차이에 따른 폴리에틸렌 글리콜5000-도데실 카보네이트 마이셀의 기체 발생량 차이를 나타내는 사진이다.
도 12는 초음파 장비를 이용한 본 발명의 기체 발포형 마이셀의 초음파 진단능 평가 결과를 나타내는 사진이다.
도 13은 초음파 장비를 이용한 본 발명의 기체 발포형 마이셀의 초음파 이미지 정량분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 14는 혼합용매의 차이에 따른 폴리에틸렌 글리콜 2000-옥틸 카보네이트 기체 발생량 차이를 나타내는 사진이다.
도 15는 폴리에틸렌 글리콜 알킬 카보네이트와 이를 이용하여 제조된 마이셀의 세포독성 결과를 나타내는 그래프이다.
도 16은 리간드가 도입된 마이셀을 형광 현미경(TE2000-E)(Nikon)으로 관찰한 사진이다.
도 17은 리간드가 도입된 마이셀의 세포 전달능을 평가 결과를 나타내는 그래프이다.
도 18은 약물이 담지된 마이셀의 세포 사멸 효과 평가 결과를 나타내는 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
<
실시예
1> 실험 재료
폴리에틸렌 글리콜은 Sigma Aldrich로부터 구입하여 사용하였다. 사용 가능한 폴리에틸렌 글리콜의 수평균 분자량(Mn)은 550 내지 20,000이고, 이 중 수평균 분자량이 2,000과 5,000인 폴리에틸렌 글리콜이 기체 발포형 고분자 마이셀 제조에 바람직하여, 이를 본 실험에 사용하였다.
알킬 클로로포메이트로서 사슬형 지방족 화합물인 부틸 클로로포메이트와 옥틸 클로로포메이트는 Sigma Aldrich에서 구입하였고, 도데실 클로로포메이트는 Santa Cruz Biotechnology에서 구입하여 사용하였다.
<
실시예
2> 폴리에틸렌 글리콜-
알킬
카보네이트
(합성 고분자) 합성
상기 실시예 1에서 준비한 폴리에틸렌 글리콜과 알킬 클로로포메이트를 아세토니트릴에 각각 용해시켰다. 구체적으로, 폴리에틸렌 글리콜 0.5 mmol을 아세토니트릴 4ml에 용해시켜 폴리에틸렌 글리콜 용액을 준비하였고, 알킬 클로로포메이트 2 mmol을 아세토니트릴 5ml에 첨가하여 알킬 클로로포메이트 용액을 준비하였다.
준비된 폴리에틸렌 글리콜 용액에 알킬 클로로포메이트 용액을 첨가한 후, 5분간 교반하였다. 상기 교반이 완료된 혼합물에 피리딘 2.5 mmol을 첨가한 후 0℃에서 30분간 반응시킨 뒤, 상온에서 24시간 반응시켰다. 상기 반응시킨 용액은 디에틸 에테르에서 침전시킨 후에 여과한 다음, 진공 건조기에서 3일 동안 건조시켜 합성 고분자인 폴리에틸렌 글리콜-알킬 카보네이트를 수득하였다.
폴리에틸렌 글리콜의 수평균 분자량 및 알킬 클로로포메이트의 알킬의 종류에 따라 다른 종류의 폴리에틸렌 글리콜-알킬 카보네이트(합성 고분자)가 제조된다. 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜의 수평균 분자량이 5000이고, 옥틸 클로로포메이트를 사용할 경우 폴리에틸렌 글리콜5000-옥틸 카보네이트가 제조되며, 이는 mPEG5000-8, mPEG5000-octyl carbonate라 표현할 수 있다.
<
실시예
3> 폴리에틸렌 글리콜-
알킬
카보네이트
합성의 확인
상기 실시예 2의 폴리에틸렌 글리콜-알킬 카보네이트를 제조함에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜 및 알킬 카보네이트의 결합 유무를 FT-IR 분광기(Nicholet iS50, Thermo)와 NMR600(VNMRS 600MHz, VARIAN)을 이용하여 확인하였다.
폴리에틸렌 글리콜-알킬 카보네이트의 카보네이트 결합 도입 여부에 대해 FT-IR 분광법을 이용하여 분석한 결과, 파수(wave number) 1746 cm-1에서 폴리에틸렌 글리콜-알킬 카보네이트에 카보네이트 결합이 도입된 것을 확인하였다(도 2 및 3).
또한 NMR 분석을 통해 폴리에틸렌 글리콜의 OH 피크(1.86 ppm)가 폴리에틸렌 글리콜-알킬 카보네이트에서는 사라지거나 줄어들었으며, 합성된 폴리에틸렌 글리콜-알킬 카보네이트의 새로운 피크가 1.64 ppm, 1.40 ppm, 0.92 ppm에서 나타나는 것을 확인하였다(도 4 및 5).
<
실시예
4> 폴리에틸렌 글리콜-
알킬
카보네이트의
가수분해에 의한 이산화탄소 기체 발생 확인
상기 실시예 2의 합성 고분자인 폴리에틸렌 글리콜-알킬 카보네이트를 DPBS(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline)에 녹인 후, 발생한 기포 관찰을 통해 합성 고분자의 가수분해에 의한 이산화탄소 기체 발생을 확인하였다(도 6). 도데실 카보네이트기가 도입된 합성 고분자에서 가장 많은 이산화탄소에 의한 기포가 발생하였고, 다음 옥틸, 부틸 순으로 기포가 발생하는 것을 확인하였다(도 7). 즉 알킬 카보네이트의 길이가 길어질수록 더 많은 이산화탄소 기체가 발생하는 것을 확인하였다.
또한, 상기 실시예 2의 폴리에틸렌 글리콜-알킬 카보네이트를 3차 증류수에 녹인 후, 37℃에서 24시간 동안 보관하고 동결건조한 다음 1H-NMR을 통해 분석하였다. 그 결과, 폴리에틸렌 글리콜-알킬 카보네이트가 합성되면서 사라졌던 폴리에틸렌 글리콜의 OH 피크(1.86 ppm)가 가수분해를 통하여 재생성됨을 확인하였다. 이를 통해 폴리에틸렌 글리콜의 분자량이 작을수록, 그리고 도입된 알킬 카보네이트기가 길수록 가수분해에 의해 재생성된 OH 피크 면적이 증가하는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 수용액 내 이산화탄소 기체 발생량과 동일한 경향을 보이는 것이다(도데실>옥틸>부틸)(도 8 및 9).
<
실시예
5>
용매증발법을
이용한
마이셀
입자 제조
마이셀은 아세토니트릴, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름 또는 메탄올과 같은 유기용매를 이용한 용매증발법으로 제조하였다. 10 mg의 합성 고분자(실시예 2에서 제조)를 각각의 유기용매에 녹인 후, 질소를 이용하여 용매를 휘발시키는 용매증발법을 수행한 뒤, 수용액에 재분산시키는 방법으로 마이셀을 제조하였다.
100% 메틸렌 클로라이드를 유기용매로 마이셀을 제조한 결과, 166 nm 내지 202 nm의 크기를 가지는 마이셀이 제조되었으며, 수용액에 재분산하여 소량의 이산화탄소를 발생함을 광학이미지를 통하여 확인하였다(도 10).
| Size(nm) | PDI | |
| mPEG2000-butyl carbonate | 166±5 | 0.13±0.02 |
| mPEG2000-octyl carbonate | 202±13 | 0.21±0.05 |
| mPEG2000-dodecyl carbonate | 135±3 | 0.33±0.01 |
| mPEG5000-butyl carbonate | 196±11 | 0.11±0.02 |
| mPEG5000-octyl carbonate | 182±2 | 0.12±0.03 |
| mPEG5000-dodecyl carbonate | 196±11 | 0.14±0.01 |
표 1은 100% 메틸렌 클로라이드 유기용매로 제조한 마이셀 입자의 크기를 나타낸다.
<
실시예
6>
혼합용매증발법을
이용한
마이셀
입자 제조
상기 실시예 5의 결과를 토대로 합성 고분자로 가장 많은 기체를 발생시킨 폴리에틸렌 글리콜5000-도데실 카보네이트를 선택하였고, 다양한 혼합용매를 이용하여 마이셀 입자를 제조하였다. 메틸렌 클로라이드/(아세토니트릴, 클로로포름 또는 메탄올)의 비율이 2:1, 1:1, 1:2인 혼합용매를 이용한 혼합용매증발법을 수행하여 마이셀 입자를 제조하였다.
광학이미지를 이용하여 폴리에틸렌 글리콜5000-도데실 카보네이트 마이셀 입자의 기체 발생량을 확인한 결과, 클로로포름 단독 또는 메틸렌클로라이드/클로로포름 혼합용매를 사용하여 제조한 마이셀 입자의 기체 발생량이 다른 용매를 사용한 경우보타 월등히 높은 것을 확인하였다(도 11).
마이셀 입자분석을 통한 크기 및 안정성 평가 결과, 단독용매의 경우 메틸렌 클로라이드, 혼합 용매의 경우 메틸렌 클로라이드/클로로포름의 비율이 2:1인 경우를 제외하고는 균일한 크기의 마이셀 입자를 제조할 수 없음을 확인하였다.
따라서, 광학이미지와 입자분석 결과를 토대로 메틸렌 클로라이드/클로로포름(2:1) 혼합용매를 마이셀 입자 제조 용매로 최종 선택하여 다음 실험에 이용하였다.
<
실시예
7> 메틸렌 클로라이드/클로로포름(2:1) 혼합용매를 이용한
마이셀
입자 제조
상기 실시예 6에서 도출해낸 메틸렌 클로라이드/클로로포름(2:1) 혼합용매을 이용하여 제조한 마이셀 입자의 크기를 측정하였다. 그 결과, 입자의 크기는 203 nm 내지 472 nm로 100% 메틸렌 클로라이드를 사용한 경우보다 넓은 크기의 범위를 가지는 것을 확인하였다(표 2).
| Size(nm) | PDI | |
| mPEG2000-butyl carbonate | 235±8 | 0.21±0.04 |
| mPEG2000-octyl carbonate | 472±62 | 0.30±0.13 |
| mPEG2000-dodecyl carbonate | - | - |
| mPEG5000-butyl carbonate | 203±44 | 0.35±0.12 |
| mPEG5000-octyl carbonate | 256±18 | 0.13±0.03 |
| mPEG5000-dodecyl carbonate | 405±41 | 0.35±0.03 |
표 2는 메틸렌 클로라이드/클로로포름(2:1) 혼합용매을 이용하여 제조한 마이셀 입자의 크기를 나타낸다.
<
실시예
8> 메틸렌 클로라이드/클로로포름(2:1) 혼합용매를 이용하여 제조한
마이셀
입자의 초음파
진단능
측정
초음파 장치(Vevo770; Visualsonics)를 이용하여 기체 발포형 마이셀의 초음파 진단능을 평가하였다. 그 결과, 폴리에틸렌 글리콜5000-도데실 카보네이트가 다른 합성 고분자에 비해 월등히 높은 초음파 영상효과를 보이는 것을 확인하였다(도 12).
초음파 이미지를 정량분석해 보면, 도데실 카보네이트기가 결합된 합성 고분자로 제조한 마이셀이 다른 알킬 카보네이트기가 결합된 마이셀에 비해 높은 초음파 조영효과를 보였다. 특히 폴리에틸렌 글리콜5000-도데실 카보네이트의 경우 1시간 내에서는 5~10배 증가된 효과를 보이는 것을 확인하였다(도 13).
<
실시예
9>
혼합용매법을
이용한 폴리에틸렌 글리콜-
알킬
카보네이트
기체발생량 및 성질의 조절 확인
폴리에틸렌 글리콜2000-옥틸 카보네이트를 혼합용매법을 이용하여 마이셀을 제조하였다. 이때 혼합용매로는 메틸렌 클로라이드/아세토니트릴(2:1), 메틸렌 클로라이드/클로로포름(2:1) 및 메틸렌 클로라이드/메탄올(2:1)을 사용하였다. 상기와 같은 혼합용매를 이용하여 제조된 마이셀은 혼합된 유기용매의 종류에 따라서 각기 다른 기체 발생 양상을 보여주었다. 메틸렌 클로라이드/아세토니트릴(2:1)과 메틸렌 클로라이드/클로로포름(2:1)에서는 많은 양의 이산화탄소 기체가 발생함을 확인하였으며, 특히 메틸렌 클로라이드/아세토니트릴(2:1)의 경우 1시간 후에 더 많은 기체를 발생하였다. 이러한 결과는 혼합용매의 종류를 달리함을 통해 마이셀의 기체 발생 시간 및 양을 조절할 수 있음을 확인한 것이다(도 14).
<
실시예
10>
마이셀의
세포독성 분석
폴리에틸렌 글리콜 알킬 카보네이트 자체의 세포독성과 상기 고분자를 이용하고 용매로 메틸렌 클로라이드/클로로포름(2:1)를 사용하여 제조한 마이셀의 세포 독성을 HeLa 세포를 이용하여 확인하였다. 그 결과, 폴리에틸렌 글리콜 알킬 카보네이트와 마이셀은 아무것도 처리하지 않은 대조군과 큰 차이를 보이지 않아, 낮은 독성을 가지는 것을 확인하였다(도 15).
<
실시예
11>
마이셀의
리간드 특이적
전달능
분석
리간드가 결합된 마이셀을 제조한 후, 형광 이미지로 관찰하였다.
리간드가 결합된 마이셀은 하기와 같이 제조하였다.
먼저, 아미노기를 가지는 아미노에틸렌 글리콜(aminopolyethylene glycol)과 리간드를 몰비 1:1의 비율로 EDC/NHS 반응시켜, 리간드가 결합된 폴리에틸렌 글리콜을 제조하였다. 그 후, 4일간 투석하고, 0.2 um 필터로 여과시킨 후 동결건조하였다. 상기 리간드가 결합(도입)된 폴리에틸렌 글리콜과 알킬클로로포메이트를 실시예 2의 방법으로 반응시켜 리간드가 도입된 폴리에틸렌 글리콜 알킬 카보네이트(합성 고분자)를 제조하였다. 그 후, 상기 리간드가 도입된 폴리에틸렌 글리콜 알킬 카보네이트와 폴리에틸렌 글리콜 알킬 카보네이트를 1:10의 무게 비율로 사용하여 마이셀을 제조하였다. 이 때, 용매로 메틸렌 클로라이드/클로로포름(2:1)를 사용하였다.
한편, 형광물질 cy5.5가 도입된 폴리에틸렌 글리콜 알킬 카보네이트 및 마이셀은 리간드 대신 cy5.5를 사용하고, 마이셀 제조시 무게비를 1:100으로 사용한 것을 제외하고는 리간드가 도입된 폴리에틸렌 글리콜 알킬 카보네이트가와 동일한 방법으로 제조하였다.
HepG2 세포를 콘포칼 디쉬(confocal dish)에 1×105 cells/well로 배양시키고, cy5.5가 도입된 마이셀을 처리하였다. 2시간 후 배지를 제거하여 PBS로 3회 세척한 후, 4% 포름알데히드로 고정하였다. DAPI로 염색한 후 마운트하고, 형광 현미경(TE2000-E)(Nikon)으로 관찰하였다.
형광 현미경으로 확인한 결과, RGD 리간드가 도입된 마이셀을 처리한 세포에서 높은 적색 형광 신호가 관찰되었으며, 이를 통해 리간드 도입으로 인한 세포 내 전달능이 향상되었음을 확인하였다(도 16).
또한 육안으로 관찰된 결과를 수치화하기 위해 이미지 J 소프트웨어(National Institutes of Health)를 사용하여 형광 강도를 정량하였다. 그 결과, 리간드(RGD)가 결합된 마이셀(RGD-PEG2000-8 및 RGD-PEG5000-8)이 리간드가 도입되지 않은 마이셀과 비교하여 7 내지 11배의 향상된 세포 전달능을 가짐을 확인하였다.
<
실시예
12> 약물 담지
마이셀의
세포 사멸 효과 분석
폴리에틸렌 글리콜 알킬 카보네이트 마이셀에 약물인 독소루비신(DOX)을 담지시킨 후, 세포 사멸 효과를 평가하였다.
약물(DOX):폴리에틸렌 글리콜 알킬 카보네이트(1:99)로 구성된 약물 담지 마이셀은 마이셀의 제조 과정에서 약물이 용해된 메틸렌 클로라이드를 사용하여, 혼합용매증발법(혼합용매로 메틸렌 클로라이드/클로로포름(2:1) 사용)을 수행하여 제조하였다.
HepG2 세포를 12 well 플레이트에 1×105 cells/well로 배양시키고, 약물 담지 마이셀을 다양한 농도(0.01 내지 1 mg/ml)로 처리한 후, 37℃, 5% CO2 하에서 12시 간 동안 배양하였다. 12시간 후 배지를 제거하여 PBS로 1회 세척하고, DMEM 배지 (10% FBS, 1%페니실린/스트렙토마이신)에서 36시간 동안 배양하였다. 세포를 PBS로 3회 세척하였고, MTT 용액(50ug/ml)을 2시간 동안 각 웰에 처리하였다.
생성된 포르마잔 결정(formazan crystal)을 DMSO로 용해시키고, 흡광도를 540 nm에서 UV/VIS 분광기를 이용해 측정하였다.
그 결과, 약물 담지 마이셀(PEG5000-8-DOX 및 RGD-PEG5000-8-DOX)은 약물이 봉입되지 않은 그룹과 비교하여 3.32 내지 5.47 배의 세포사멸 효과를 가짐을 확인하였다.
특히, 리간드가 결합된 마이셀에 약물을 담지시킬 경우, 세포사멸 효과가 더욱 우수함을 확인하였다(도 18)
Claims (9)
- 하기 일반식 1로 표현되는 화합물을 포함하는 기체 발포형 마이셀을 포함하며, 상기 마이셀은 직경이 150 내지 500 nm인 초음파 조영용 조성물:
[일반식 1]
상기 일반식에서,
R1은 탄소 원자수 1 내지 2의 알킬기, H, -NH2 또는 COOH이며,
p는 45 내지 113의 정수이고,
q는 8 내지 10의 정수이다.
- 삭제
- 하기 일반식 1로 표현되는 화합물을 포함하는 기체 발포형 마이셀에 약물이 담지되어 있으며, 상기 마이셀은 직경이 150 내지 500 nm인 약물 전달용 조성물:
[일반식 1]
상기 일반식에서,
R1은 탄소 원자수 1 내지 2의 알킬기, H, -NH2 또는 COOH이며,
p는 45 내지 113의 정수이고,
q는 8 내지 10의 정수이다.
- 삭제
- 제1항 또는 제3항에 있어서,
상기 마이셀의 표면에 표적지향 리간드가 결합되는 것을 더 포함하는 것인 기체 발포형 마이셀.
- 제3항에 있어서,
상기 약물은 화학약물, 단백질, 펩타이드 또는 뉴클레오타이드인 것인 약물 전달용 조성물.
- 폴리에틸렌 글라이콜(polyethylene glycol) 및 알킬 클로로포메이트(alkyl chloroformate)를 혼합하여 폴리에틸렌 글라이콜 유도체를 합성하는 단계;
상기 폴리에틸렌 글라이콜 유도체를 아세토니트릴, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름 및 메탄올에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합용매에 용해시킨 후 용매를 증발시키는 단계를 포함하는,
하기 일반식 1로 표현되는 화합물을 포함하며, 직경이 150 내지 500 nm인 기체 발포형 마이셀의 제조방법:
[일반식 1]
상기 일반식에서,
R1은 탄소 원자수 1 내지 2의 알킬기, H, -NH2 또는 COOH이며,
p는 45 내지 113의 정수이고,
q는 8 내지 10의 정수이다.
- 제7항에 있어서,
상기 혼합용매는 메틸렌 클로라이드와 아세토니트릴, 클로로포름 또는 메탄올의 혼합용매이고,
혼합비율은 3 내지 1 : 1 내지 3인 것인 기체 발포형 마이셀 제조방법.
- 제7항에 있어서,
상기 폴리에틸렌 글라이콜의 분자량(Mn)은 550 내지 10000 g/mol인 것인 기체 발포형 마이셀 제조방법.
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