KR101419137B1

KR101419137B1 - 약물전달을 위한 기체생성 약물전달체 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101419137B1
Application number: KR1020120149513A
Authority: KR
Inventors: 이은성; 이정옥
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2012-12-20
Filing date: 2012-12-20
Publication date: 2014-07-14
Also published as: KR20140080084A

Abstract

본 발명은 조성물 mPEG-b-PLLA-BC(methoxy-polyethylene-glycol - b-poly-L-lactic acid - benzyl chloroformate)에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 상기 고분자 조성물과 상기 조성물의 제조방법 및 약물 전달용 또는 진단용 고분자로 사용하는 용도에 관한 것이다. 본 발명은 생체고분자 PLLA와 mPEG(methoxy-polyethylene-glycol) 를 이용하여 개발한 약물의 방출 및 기체를 생성하는 미셀로서, PLLA의 생분해성 문제를 개선하고 약물의 방출속도를 증진시키기 위하여 기체를 생성시키는 카보네이트 결합을 부여한 것으로서, 상기 카보네이트 결합의 가수분해에 의해 생성되는 이산화탄소 기체와 이에 따른 입자붕괴를 이용하여 봉입된 약물의 방출속도를 높일 수 있는 것을 특징으로 하는 발명이다.

Description

약물전달을 위한 기체생성 약물전달체 및 이의 제조방법{Gas forming drug carrier for drug delivery and preparation method thereof}

본 발명은 약물전달을 위한 기체생성 약물전달체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

약물전달시스템(Drug Delivery System, DDS)이란, 약물 방출 속도를 조절하거나 약물을 목표 부위에 효율적으로 전달하는 방법으로서, 필요한 양의 약물을 효율적으로 전달할 수 있도록 설계한 제형을 선택하여, 의약품의 부작용을 최소화하고 투여한 약물의 효능과 치료 효과를 극대화하는 기술과 시스템을 말하며, 약물방출 시스템은 목적에 따라 지속성 약물방출시스템, 제어형 방출시스템, 및 표적지향형 약물전달시스템으로 등으로 나누어 진다.

약물 전달과 치료의 효과를 향상시키기 위해, 크기가 작으면서도 효과가 뛰어난 약물전달체 개발에 힘을 쏟고 있으며. 현재 약물은 구강복용, 정맥주사, 피부를 통한 가시적 전달경로 등으로 투약되는데, 만약 나노입자를 이용하면 필요한 약물을 정확한 지점으로 전달할 수 있어 약물의 효과를 극대화할 수 있게 된다.

중합체성 미셀(micelle)은 1984년 바더 등(Bader, H. et al. Angew. Makromol. Chem. 123/124(1984) 457-485)에 의해 약물 담체로서 처음으로 제안되었다. 중합체성 미셀은 내부 코어 중에 약물을 용해시킬 수 있고 표면에 흡착시킬 수도 있는, 일반적으로 작은 크기 및 약물 방출 속도를 조절하거나 약물을 목표 부위에 효율적으로 전달하는 기능을 가질 수 있어, 수용성 환경에서 낮은 용해도를 갖는 약물에 대한 잠재적인 담체로서 출현하였다.

미셀은 종종 천연 담체, 예를 들어 바이러스 또는 지단백질(liprotein)에 비견된다. 이들 담체들은 모두 표적 세포로 운반 도중 그의 내용물(그것이 바이러스의 경우 DNA이든지 혹은 지단백질 및 미셀의 경우 수 불용성 약물이든지 간에)을 보호하는 유사한 코어-쉘 구조를 나타낸다.

지단백질은 종양이 저 밀도 지단백질에 대해 상승된 요구를 나타내기 때문에 암 세포에 대한 항종양 화합물의 표적화를 위한 비히클(vehicle)로서 제안되었다. 그러나 담체로서 지단백질의 효능은 주로 약물 혼입된 지단백질이 건강한 세포에 의해서도 인식되고 종양 상의 수용체 부위에 대해서 천연 지단백질과 경쟁하기 때문에 문제가 되었다.

중합체성 미셀은 코어(Core)-쉘(Shell) 구조를 특징으로 한다. 중합체성 미셀에 대한 약학적 연구는 각각 친수성 쉘 잔기인 A와 소수성 코어 중합체인 B를 갖는 A-B 이중블록 구조를 갖는 공중합체에 초점을 두었다. 생분해성 중합체로 이루어진 소수성 코어는 불용성 약물에 대한 수용조로서 작용하여 상기 약물을 수성 환경과 접촉하는 것으로부터 보호한다.

임상적으로 적절한 약물 담체로서 간주되기 위해서 무독성이어야 하며 신장 경로를 통해 배출될 정도로 충분히 낮은 분자량을 가져야 한다.

쉘은 미셀 안정화 및 원형질 단백질 및 세포막과의 상호작용에 기여한다. 상기는 대개 친수성, 비-생분해성, 생체 적합성 중합체로 이루어진다. 상기 담체의 생체 분포는 주로 상기 친수성 쉘의 성질에 의해 지시된다.

다른 중합체들, 예를 들어 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(PNIPA) 및 폴리알킬아크릴산은 미셀에 대해 온도 또는 pH 감수성을 부여하며, 결국 생체 접착성을 부여하는데 사용될 수 있다. 표적화 잔기와의 결합을 위해 표면에 작용기들이 존재하는 미셀이 또한 공지되어 있다. 예를 들어 문헌[Scholz, C. et al., Macromolecules 28(1995) 7295-7297]을 참조하시오.

초음파(ultrasound)는 종양검사, 태아진단 등 일상적 임상에서 초음파 검사에 사용되며 널리 쓰이고 있다. 초음파 검사는 초음파가 뼈, 근육, 지방 등 조직의 경계면과 같은 서로 다른 매질의 경계를 만나게 되면 굴절, 반사, 산란 등이 일어나는 것을 이용한다. 이러한 굴절, 반사, 산란의 빛을 대비 영상(contrast image)으로 이미지화하여 진단이 이루어진다.

대부분의 초음파 검사는 피부에 초음파 장치를 대고 초음파의 투과력을 이용해 복부 속 장기를 관찰한다. 그러나 피부로부터 거리가 먼 장기 같은 조직은 초음파의 투과력으로는 관찰하기 어렵다.

따라서 초음파가 임상에 응용된 이래 좀 더 깊은 장기까지 볼 수 있고, 정확한 진단을 위해 반사상의 대비를 극대화시키는 문제가 대두되었다. 이를 위한 노력의 일환으로 초음파 조영제(ultrasound contrast agent)의 개발이 다각도로 이루어지고 있다.

한편, 고분자 미셀(micelle)은 혈류 내에서 희석되어 붕괴되는 문제점이 있으며, 또한 기존의 쉘 가교 고분자 미셀은 구조를 안정하게 유지할 수 없는 문제가 있으며, 소수성 고분자인 PLGA(poly D,L-lactide-co-glycolide) ) 또는 PLLA(poly L-lactic acid)로 구성된 양친성 고분자를 이용한 약물전달체의 경우, 생체적합성 고분자로서 약물전달시스템에 주로 이용되고 있다. 또한 pH, 온도와 같은 물리화학적 자극에 반응할 수 있는 또 다른 양친성 고분자와 물리적 또는 화학적으로 혼합하여 약물방출량을 증진하는 방법이 사용되기 하지만, PLLA 또는 PLGA의 약물전달체로서의 문제점들이 제시되고 있다.

PLGA 또는 PLLA의 느린 생분해성과 그에 따른 약물의 방출 효율이 낮아 질병치료에 있어 문제점이 있다. 약물 방출 속도가 느리거나 방출 효율이 낮은 경우, 질병의 치료가 불가능 또는 지연되거나 후천성 다중약물내성이 발생할 가능성을 높여 복용량을 늘려도 치료 효과가 떨어지며, 세포독성의 위험이 있으므로, 효과적으로 약물을 전달하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.

또한 조영제로 사용되는 경우 기존의 조영제의 경우 마이크로버블의 지속시간이 3~4분에 불과하며, 건강한 조직과 질병이 걸린 조직간에 대조가 명확하지 않으며, 또한 cm단위만 관측이 가능하며, 또한 방사선 피폭이나 요오드계 조영제는 신체에 위험할 수 있다.

또한, 의료업계에서는 약물의 효율적 전달을 위해 고분자 미셀에 대한 약학적, 제제화 응용에 대한 연구가 진행되고 있으며, 고분자 미셀(micelle)은 양친성 블록 공중합체에 의해 형성되며 소수성부분(코어) 및 친수성부분(쉘)의 구조를 가진다. 이러한 양친성 고분자에 의해 형성된 미셀은 난용성 약물의 가용화 문제를 개선하기 위하여 약물전달체로서 많이 응용되고 있지만 현재까지 개발된 약물전달체의 경우 목적하는 효과를 도출하지 못하고 있어 보다 개량된 기술개발이 필요한 실정이다.

이에 본 발명에서는 생체고분자 PLLA와 mPEG(methoxy-polyethylene-glycol) 를 이용하여 개발한 약물의 방출 및 기체를 생성하는 미셀로서, PLLA의 생분해성 문제를 개선하고 약물의 방출속도를 증진시키기 위하여 기체를 생성시키는 카보네이트 결합을 부여한 것으로, 상기 카보네이트 결합의 가수분해에 의해 생성되는 이산화탄소 기체와 이에 따른 입자붕괴를 이용하여 봉입된 약물의 방출속도를 높일 수 있는 기체 생성 약물전달체 및 이의 제조 기술을 제공함에 특징이 있다.

Hyun Su Min,; Eunah Kang,; Heebeom Koo,; Jaeyoung Lee,; Kwangmeyung Kim,; Rang-Woon Park,; In-San Kim,; Youngseok Choi,; Ick Chan Kwon,; Moonhee Han,; Gas-generating polymeric microspheres for long-term and continuous in vivo ultrasound imaging.; Biomaterials. 33. 2012. 936-944.

그러므로 본 발명의 목적은 mPEG(methoxy-polyethylene-glycol)-b-PLLA(Poly L-lactic acid) 이중블록 공중합체 고분자에 BC(benzyl chloroformate)이 결합된 접합체를 유효성분으로 포함하는 기체 생성 약물전달체 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 mPEG(methoxy-polyethylene-glycol)-b-PLLA(Poly L-lactic acid) 이중블록 공중합체 고분자에 BC(benzyl chloroformate)이 결합된 기체 생성 약물전달을 위한 접합체의 제조방법을 제공한다.

이에 본 발명은 mPEG(methoxy-polyethylene-glycol)-b-PLLA(Poly L-lactic acid) 이중블록 공중합체 고분자에 BC(benzyl chloroformate)이 결합된 접합체를 유효성분으로 포함하는 기체 생성 약물전달체 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 접합체는 하기 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 기체 생성 약물전달체 조성물일 수 있다.

<화학식 1>

상기 식에서 n는 정수 50~250이고, m은 정수 12~85이다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 기체는 이산화탄소일 수 있다.

또한, 본 발명은,

a)mPEG(methoxy-polyethylene-glycol)-b-PLLA(Poly L-lactic acid)를 디클로로메탄에 용해시킨 후, BC(benzyl chloroformate)를 첨가하는 단계; 및 b) 디에틸 에테르(diethyl ether)를 첨가하여 반응시켜 침전물을 형성하는 단계를 포함하는, PLLA(Poly L-lactic acid)-mPEG(methoxy-polyethylene-glycol)에 BC(benzyl chloroformate)이 결합된 기체 생성 약물전달을 위한 접합체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 촉매로서 Triethylamine(TEA)를 사용할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 본 발명에 따른 PLLA(Poly L-lactic acid)-mPEG(methoxy-polyethylene-glycol)에 BC(benzyl chloroformate)이 결합된 접합체를 유효성분으로 포함하는 초음파 진단용 조영제를 제공한다.

본 발명에서 제조된 기체생성 미셀은 PLLA-PEG에 기체생성 카보네이트 결합을 부여하기 위해 BC(benzyl chloroformate)를 화학적으로 결합시켜 개발하였다. 본 기체생성 미셀은 시간의 경과에 따라 가수분해되는 경우 이산화탄소 기체를 생성하며 이에 따른 입자붕괴에 의해 내부에 봉입된 난용성 약물이 방출 속도를 증진시킬 수 있다. 기존 PLLA를 포함하는 약물전달체가 갖고 있는 분해성 문제를 보완할 수 있고, 기본 초음파 조영제로 사용되는 기체생성 고분자와 달리 간단한 방법으로 개발할 수 있다.

또한 본원 발명에 따른 기체생성 미셀은 BC와 PLLA의 하이드록실잔기 (hydroxyl)를 트리에틸아민(Triethylamine : TEA)을 촉매로 사용하여 간단한 방법을 통해 화학적으로 반응시켜 제조할 수 있다. 이와 같은 방법으로 합성하였을 경우, 기체생성 카보네이트 결합(carbonate linkage )을 부여할 수 있고 이에 따른 가수분해 시 미셀 내부에서 발생되는 이산화탄소 기체와 그에 따른 입자붕괴가 가능하다.

미셀의 입자붕괴는 시간에 따른 붕괴양상을 보이며 48시간 이내에 입자가 붕괴되고 그에 따른 미셀의 약물방출 효과를 보인다. 이러한 미셀의 입자붕괴에 따른 봉입된 난용성 약물의 방출 속도 증진과 암세포를 비롯한 질환세포 치료 등의 치료효과가 가능하다.

또한 가수분해로부터 발생하는 CO₂ 가스를 초음파 탐지용 조형제(Ultrasonic contrast agent)로 이용할 수 있다. 이하 문헌을 참조할 수 있다.[J.R.Eisenbrey, et.al. Development and optimization of a doxorubicin loaded poly(lactic acid) contrast agent for ultrasound directed drug delivery, J Control Release, 143, 2010, 38-44.]

도 1은 mPEG-b-PLLA 을 포함하는 미셀은 분해가 진행되어도 PH의 변화가 없으나, mPEG-b-PLLA-BC 을 포함하는 미셀의 경우는 CO₂ 의 발생으로 인해 시간이 경과하면 PH가 낮아지며, 이를 도시한 것이다.
도 2는 mPEG-b-PLLA 와 mPEG-b-PLLA-BC 를 동일한 조건에서 측정했을 때 mPEG-b-PLLA-BC 로 이루어진 미셀의 경우, 많은 CO₂ 기포가 발생하는 것을 시각적으로 관찰할 수 있으며, 이를 촬영한 디지털 이미지 이다.
도 3은 0시간에서 50시간을 항온 방치한 결과로서 모델 약물인 항암제 DOX(doxorubicin)를 포함하는 mPEG-b-PLLA로 이루어진 미셀 과 mPEG-b-PLLA-BC로 이루어진 미셀 의 분해정도(%)를 비교한 것이다. 이 때 (a)는 37 °C 이며 (b)는 50 °C 인 경우를 도시한 것이다.
도 4는 DOX의 투여 방법에 따른 KB 세포의 생존성(viability)을 비교한 것으로서, DOX를 전달약물로 하여 순수하게 DOX만 투여한 것과, mPEG-b-PLLA로 이루어진 미셀에 포함하여 투여한 것 및 mPEG-b-PLLA-BC로 이루어진 미셀에 포함하여 투여한 KB 세포의 생존성을 비교한 것으로서 항온방치시간(Incubation Time)은 48시간이며, 농도는 각각 1, 5, 10 mg/mL으로 변화 시키며 측정한 것을 도시한 것이다.
도 5는 미셀의 크기를 측정하기 위해서, PBS(phosphate buffered saline) 용액 150 mM, pH 7.4, 37 °C 에서 micelle 샘플(0.1 mg/mL)를 항온방치한 후 Zetasizer 3000 instrument (Malvern Instruments, USA)을 이용하여 각각 0, 6, 24, 48 시간 후에 미셀의 크기를 측정한 것으로서, 633nm 파장 및 고정 산란각(fixed scattering angle) 90° 로 하여 He-Ne 레이져 빔(Laser beam)을 조사하여 측정한 것으로서 (a)는 mPEG-b-PLLA 미셀 (b)는 mPEG-b-PLLA-BC 미셀을 도시한 것으로 양자 모두 구형의 미셀구조를 나타낸다.
도 6은 미셀 샘플의 형상을 FE-SEM(field emission scanning electron microscopy , Hitachi s-4800, Japan)를 이용하여 각각 6, 24, 48 시간 후에 측정한 것으로 (c)는 mPEG-b-PLLA 미셀 (d)는 mPEG-b-PLLA-BC 미셀을 도시한 것이다.
도 7은 미셀 블록을 Bruker Advance III(400 MHz)라는 핵자기공명분석장치 (Nuclear Magnetic Resonance : NMR)를 이용하여, H-NMR 피크(Peak)를 측정한 것이며, 기준용액으로는 TMS(tetra methyl silane)를 사용하였으며, NMR solvent 로는 DMSO-d₆(dimethyl sulfoxide) 를 사용하였다. 측정결과 BC블럭에서 CH는 δ7.52 ppm 이며, BC블럭에서 CH₂는 δ5.45 ppm 인 것을 도시한 것이다.
도 8은 미셀 블록의 가수분해 전의 mPEG-b-PLLA-BC 과 가수분해 후의 mPEG-b-PLLA을 Bruker Advance III(400 MHz) 핵자기공명분석장치(Nuclear Magnetic Resonance : NMR)를 사용하여, H-NMR 피크(Peak)를 측정한 것으로서, PBS(150mM,pH7.4) 용액에서 37°C , 48시간 후 측정한 것이다. 기준용액으로는 TMS(tetra methyl silane)를 이용하였으며, NMR solvent 로는 DMSO-d6 를 사용하였으며, 측정결과 48시간 후에는 BC블럭에서 CH인 δ7.52 ppm 값 과, BC블럭에서 CH₂인 δ5.45 ppm 값이 측정되지 않은 것을 도시한 것이다.
도 9는 미셀 내부에 약물이 결합된 형태의 모식도로서 가수분해 되면서 CO₂ 가 발생하면서 미셀이 분해되는 것을 나타낸다. 또한 탄소결합(Carbonate linkage)이 가수분해되면서 미세기포 구멍(nanobubble holes)이 발생하면서 DOX를 효율적으로 분비하는 것을 도시한 것이다.

이하, 본원 발명을 상세하게 설명한다.

mPEG-b-PLLA-BC 를 이용한 약물을 포함하는 치료제

본 발명에서 “약물을 포함한다”는 내용은 미셀 내부에 물리화학적으로 결합 또는 포괄 등이 되거나 표면에 흡착 등의 방법으로 결합이 되는 것을 의미하는 것이다.

본원 발명에 의해 미셀 내부에 포함될 수 있는 약물의 대상 질병은 염증성 질환, 심혈관계질환, 폐질환, 신경계질환, 당뇨병, 안구질환, 악성종양 등 뿐만 아니라 HIV, SAS 등과 같은 바이러스 감염증에도 사용될 수 있다. 따라서 전달될 수 있는 약물 역시 소염제, 진통제, 항암제, 항생제, 백신, 등 실시예에 한정되지 않는다. 또한 약물의 투여 방법은 주사제, 경구투여제, 경피투여제, 경점막투여제 등 다양하게 사용될 수 있다.

여기에 사용되는, “약물을 포함하는” 의 의미는 "약물-로딩된(drug-loaded)" 또는 "캡슐화된 (encapsulated)" 및 그 파생어들과 상호 교환되어 사용된다. 본 발명에 따라. 소정의 예에 있어서, 약물 또는 치료제는 코어 외부의 친수성 쉘(shell) 부분에 위치할 수 있다. 이 경우 역시 약물을 포함하는 것으로 볼 수 있다.

치료제를 미셀에 포함시키는 것은 예비 성형된 미셀을 함유하는 용액에 화합물을 수중 유적형 과정 또는 투석법에 의해 용해시켜 수행할 수 있으며, 치료제는 중합체성 미셀 내에 포착시키고 치료에 유효량을 투여할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따라 사용되는 치료제는 미셀 내에 효율적으로 포함시키기 위해서는 소수성이 유리하다. 그러나, 이온성 미셀과 반대로 하전된 친수성 화합물, 예를 들어 올리고뉴클레오티드간에 안정한 복합체를 형성시키는 것도 가능할 수 있다. 보다 적합한 약물로는 소수성(수불용성)인 항종양 화합물 (예를 들어 독소루비신(DOX), 불충분하게 가용성인 대사길항 물질(예: 마이토마이신) 및 알킬화제(예: 카르무스틴)가 있다.

더욱이, 약물을 화학적 결합에 의해 또는 투석, 유화 기법, 수성 매질 중에서의 약물과 미셀의 단순한 평형 또는 물에 대한 약물중합체 고체 분산액의 용해를 통한 물리적 포착에 의해 본 발명의 중합체성 미셀 조성물에 혼입시킬 수 있다.

약물을 포함하는 미셀은 일명 용매 증발 기법에 의해 제조할 수 있다. 문헌(Liggins, R. T. and Burt, H., Paclitaxel loaded poly(L-lactic acid) microspheres: Properties of microspheres made with low molecular weight polymers, Int. J. Pharm. 2001, 222(1), 19-33; Liggins, R. T., et. al., Paclitaxel loaded poly(L-lactic acid) microspheres for the prevention of intraperitoneal carcinomatosis after a surgical repair and tumor cell spill, Biomaterials, 2000, 21(19), 1959-1969)을 참조할 수 있다. 또한, 문헌 (Burt, H. M., et. al., Controlled delivery of Taxol from microspheres composed of a blend of ethylene-vinyl acetate copolymer and poly(d,l lactic acid), Cancer Lett. 1995, 88(1), 73-79))을 참조할 수 있다. 또한, 마이크로구는 일명 용매 추출 기법에 의해 제조할 수 있다. 예를 들면, 문헌(Feng, S. and Huang, G., Effects of emulsifiers on the controlled release of paclitaxel(Taxol) from nanospheres of biodegradable polymers, J. Control. Release 2001, 71(1), 53-59; Shiga, K. et. al., Preparation of poly(d,l-lactide) and copoly(lactide-glycolide) microspheres of uniform size, J. Pharm. Pharmacol. 1996, 48(9), 891-5)을 참조할 수 있으며, 이들 양 문헌은 그 전체 내용이 본 명세서에 참고 인용되어 있다. 또한, 문헌(Schaefer, M. J. and Singh, J., Effcts ofadditives on stability of etoposide in PLGA microspheres, Drug Dev. Ind. Pharm. 2001, 27(4), 345-350)을 참조할 수 있다.

약물의 물리적인 포착은 일반적으로 투석 또는 수중 유적형 유화 과정에 의해 수행된다. 투석법은 약물 및 공중합체 모두 용해되는 용매, 예를 들어 에탄올 등을 사용할 수 있으며. 선택성 용매로 대체함에 따라 상기 과정 중에 상기 중합체의 소수성 부분이 회합되어 상기 불용성 약물이 혼입된 미셀 코어를 형성한다. 유기 용매의 완전한 제거는 상기 투석을 수 일에 걸쳐 연장시킴으로써 수행될 수 있다. 수중 유적형 유화 방법에서, 수 불용성 휘발성 용매, 예를 들어 클로로포름 중의 약물의 용액을 상기 공중합체의 수용액에 가하여 수중 유적형 유화액을 제조한다.

용매가 증발됨에 따라 미셀-약물 결합물이 형성된다. 후자의 방법에 대한 투석 과정의 주요 이점은 잠재적으로 독성인 용매의 사용을 피할 수 있다는 것이다.

내부 코어와 약물 사이의 반데르발스(Van der Waals) 상호작용은 미셀의 안정성을 증가시킨다고 알려져 있다.

mPEG -b- PLLA - BC 를 포함하는 초음파 조영제( Ultrasonic Contrast Agent )

본원 발명은 기존의 초음파 조영제들과는 달리 방사선이나 유해한 요오드계 조영제가 아닌 탄소결합이 가수분해되면서 발생하는 CO₂가 마이크로 또는 나노 미세기포를 형성하는 것을 이용하는 것이므로, 친환경적이고 신체에 무해하며 생체적합성(biocompatible)이 높으면서도 경제적이다. 또한 기존 조영제들과 달리 마이크로 또는 나노 버블은 오랜 지속시간을 갖으며, 질병에 걸린 세포가 흡수하는 경우, 건강한 조직과 질병에 걸린 조직 사이의 대조가 명확하게 나타나 병변의 위치와 크기까지 정확하게 확인할 수 있으며, 검출 능력이 cm단위에서 mm단위까지 강화될 수 있다.

기존의 초음파용 조영제의 경우 기체발생이 가능한 전구체를 내부에 봉입하여 사용한 반면, 본원 발명에서는 고분자 말단에 기체발생이 가능한 화학결합(카보네이트 결합)을 부여하였으며, 이 같은 화학결합 부여에 의한 기체발생 방법은, 나노입자 내부에 약물과 전구체와 같은 2가지 이상의 약물을 봉입해야하는 문제를 개선해서, 이미 화학적으로 개조된 나노입자 내부에 단지 약물만 봉입함으로써 쉽게 약물방출용 나노입자를 제조할 수 있다는 장점이 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

mPEG -b- PLLA - BC ( methoxy - polyethylene - glycol -

b- poly -L- lactic acid - benzyl chloroformate )의 크기 및 구조 분석

본 발명자들은 하기 화학식 Ⅰ로 표시되는 구조를 갖는 접합체를 제조하위해, poly(L-lactic acid : PLLA)와 poly (ethylene glycol : PEG)의 화학적 결합에 의해 형성된 양친성 블록 공중합체인 PLLA-PEG에 기체 생성 카보네이트 결합을 부여하기 위해 PLLA의 하이드록실잔기와 benzyl chloroformte(BC)의 접합시킨 접합체로 이루어진 기체 생성 미셀(micelle)을 제조하였다.

미셀(micelle)은 일반적으로 양친성(兩親性), 예컨대 친수성기와 소수성기를 동시에 갖는 저분자량의 물질들이 이루는 열역학적으로 안정하고 균일한 구형의 구조를 지칭하는 것이다. 또한 미셀구조는 구형을 이루며, 미셀의 내부를 코어(Core)라 하며 미셀의 겉껍질 부분을 쉘(Shell) 이라고도 한다. 상기 미셀 구조를 갖는 화합물에 약물을 녹여 투입하는 경우 약물은 미셀 내부 또는 표면에 존재하게 되며, 이러한 미셀은 체내에서 환경 변화에 반응하여 약물을 방출을 할 수 있으므로, 약물전달용 캐리어로서 이용된다. 본 실시예에 따라 제조된 미셀은 PLLA-PEG 양친성 고분자를 통해 제조된 것으로, 가수분해 시에 이산화탄소를 발생시킬 수 있다. 특히 입자 내부에 난용성 약물이 봉입되어있을 때 이산화탄소 기체에 의해 붕괴되어진 입자내부를 통해 난용성 약물의 방출 속도를 증진시킬 수 있는 특징이 있다. 미셀 블록을 Bruker Advance III(400 MHz)라는 핵자기공명분석장치 (Nuclear Magnetic Resonance : NMR)를 이용하여, H-NMR 피크(Peak)를 측정한 것이며, 기준용액으로는 TMS(tetra methyl silane)를 사용하였으며, NMR solvent 로는 DMSO-d₆(dimethyl sulfoxide) 를 사용한 결과 BC블럭에서 CH는 δ7.52 ppm 이며, BC블럭에서 CH₂는 δ5.45 ppm 이다.

또한, 미셀 블록의 가수분해 전의 mPEG-b-PLLA-BC 과 가수분해 후의 mPEG-b-PLLA을 Bruker Advance III(400 MHz) 핵자기공명분석장치(Nuclear Magnetic Resonance : NMR)를 사용하여, PBS(150mM,pH7.4) 용액에서 37°C , 48시간 후 측정한 결과 BC블럭에서 CH인 δ7.52 ppm 값 과, BC블럭에서 CH₂인 δ5.45 ppm 값이 측정되지 않았으므로 48시간이 경과하면 대부분의 mPEG-b-PLLA-BC 이 분해된다는 것을 알 수 있었다.

<화학식 I>

상기 식에서 n는 정수 50~250이고, m은 정수 12~85이다.

< 실시예 2>

mPEG -b- PLLA - BC 의 크기 및 형상 변화 분석

미셀의 크기를 측정하기 위해서, PBS(phosphate buffered saline) 용액 150 mM, pH 7.4, 항온방치시간(incubation time)37 °C 에서 micelle 샘플(0.1 mg/mL)를 Zetasizer 3000 instrument (Malvern Instruments, USA)을 이용하여 633nm 파장 및 고정 산란각(fixed scattering angle) 90° 로 하여 He-Ne 레이져 빔(Laser beam)을 조사하여 측정하였다.

mPEG-b-PLLA-BC 미셀의 평균크기는 대략 286 nm 로 측정되었다. 또한 미셀 입자의 크기 변화는 도5에 나타내고 있으며, 형상의 변화는 도6에 나타내고 있다. 또한 평균크기는 입자의 평균적인 직경을 의미하는 것으로서 특정 입자의 직경이 아닌 샘플 입자들의 통계적인 평균 직경을 의미하는 것이다. 도 5에 따르면 mPEG-b-PLLA로 이루어진 미셀의 크기변화는 시간경과에 불구하고 일정하나, mPEG-b-PLLA-BC로 이루어진 미셀의 경우 48시간 경과 후에 갑자기 크기가 커짐을 알 수 있다. 또한 도 6에 따르면 mPEG-b-PLLA 미셀 의 경우 형태가 원형을 지속적으로 유지하나, mPEG-b-PLLA-BC 미셀의 경우 24시간 경과 후의 형태와 48시간 경과 후 형태가 크게 변함을 알 수 있다. 따라서 mPEG-b-PLLA-BC 미셀을 약물전달체로 사용하는 경우가 크기 및 형태의 변화가 현저하여 빠르고 효율적인 약물전달체임을 알 수 있다.

< 실시예 3>

mPEG -b- PLLA - BC 의 제조방법

제조에 사용되는 재료인 Triethylamine (TEA), benzyl chloroformate (BC), dichloromethane (DCM), diethyl ether, doxorubicin -HCl (DOX -HCl), benzne, L-glutamine, and dimethyl sulfoxide (DMSO) 은 Sigma-Aldrich (USA)로부터 구매하였다. mPEG-b-PLLA-BC 중합체의 합성은 하기 반응식 Ⅰ에 나타낸 것과 같다. 즉, 하기 화학식 Ⅱ에 나타난 PLLA 와 하기 화학식 Ⅲ에 나타난 BC의 하이드록실잔기를 트리에틸아민(TEA)을 촉매로 사용하여 화학적 반응시켰다. 이와 같은 방법으로 합성하였을 경우, 기체생성 카보네이트 결합을 부여할 수 있으며, mPEG-b-PLLA 의 하이드록시말단(terminal hydroxyl (-OH))은 BC(benzyl chloroformate : C₆H₅CH₂OOCl) 와 결합된다. 보다 구체적으로, 먼저 mPEG를 톨루엔에 완전히 녹인 후, 2:1 비율로 PLLA와 촉매제로 스태너스 옥테이트(Stannous octate) 첨가하여 하기 화학식 Ⅱ에 나타난 PLLA-mPEG 을 합성하고, 이후 상기 혼합물을 120℃에서 10시간 교반시킨 후 반응된 용액은 에틸 에테르를 사용하여 침전물을 형성시켰다. 이후 상기 침전 물을 진공건조 시킨 후 다이메틸설프옥시드용액(DMS)에 용해한 다음, 상기 용액을 투석막 (Spectra/Por: 2,000 MW)으로 옮겨 1차 증류수에서 합성되지 않은 mPEG와 PLLA를 투석을 이용하여 제거시켰다. 이후 투석시킨 용액은 1일 동안 동결건조 하여 분말을 얻었고, 상기 합성된 mPEG-b-PLLA(0.2mM)는 디클로로메탄에 완전히 녹인 후, BC(1mM)를 첨가하고 트리에틸아민(1mM)를 첨가하여 반응시켰다. 이후 디에틸 에테르를 첨가하여 침전물을 형성하게 한 후, 여과시켜 접합체를 수득하였다. 또한, 상기 반응에서 촉매로서 TEA(Triethylamine) 1mM 을 추가하여 반응시켰다.

<화학식 Ⅱ>

상기 식에서 n는 정수 50~250이고, m은 정수 12~85이다.

<화학식 Ⅲ>

<반응식 Ⅰ>

상기 식에서 n는 정수 50~250이고, m은 정수 12~85이다.

< 실험예 1>

m PEG -b- PLLA 와 mPEG -b- PLLA - BC 의 분해에 따른 pH 변화 비교

도 1에 나타난 것과 같이 37 °C에서 항온방치(incubation)하면서, 0~50 시간을 측정한 결과, mPEG-b-PLLA로 이루어진 미셀은 분해 시간이 경과해도 PH의 변화가 없으나, mPEG-b-PLLA-BC로 이루어진 미셀의 경우는 CO₂의 발생으로 인해 시간이 경과할수록 용액이 산성이 되어 PH가 낮아지는 것으로 나타났다.

< 실험예 2>

mPEG -b- PLLA 와 mPEG -b- PLLA - BC 의 기포발생 정도의 비교

mPEG-b-PLLA로 이루어진 미셀과 mPEG-b-PLLA-BC로 이루어진 미셀을 동일한 조건에서 항온방치했을 때 mPEG-b-PLLA-BC로 이루어진 미셀의 경우가 더 많은 기포를 발생시킴을 시각적으로 관찰할 수 있으며, 도 2에 나타난 것과 같이 디지털 이미지로 알 수 있다. PBS (150 mM, pH 7.4) 용액에서 37 °C 였으며 각각 10 mg/mL 씩 측정하였으며 12시간 후의 사진이다.

< 실험예 3>

DOX 를 포함하는 mPEG -b- PLLA 과 mPEG -b- PLLA - BC 의 분해정도 (%) 비교

DOX를 전달약물로 측정한 실험예로서 0에서 50시간을 항온방치한 결과로서 (a)는 37 °C 이며 (b)는 50 °C 이다. 실험결과 mPEG-b-PLLA-BC 를 약물전달체로 사용한 경우가 mPEG-b-PLLA로 이루어진 미셀을 약물전달체로 사용한 경우보다 2배 정도 높은 방출율을 보이는 것을 알 수 있으며, 특히 온도가 상승할수록 약물 방출율이 높아짐을 알 수 있다. 따라서 본원 발명인 mPEG-b-PLLA-BC로 이루어진 미셀이 약물전달체로서 약물방출 속도와 방출량이 우수함을 판단할 수 있다.

< 실험예 4>

DOX 의 투여 방법에 따른 KB 세포의 생존성 ( viability )

DOX를 순수하게 DOX만 투여한 것과, mPEG-b-PLLA로 이루어진 미셀에 결합하여 투여한 것, mPEG-b-PLLA-BC로 이루어진 미셀에 결합하여 투여한 것으로 KB 세포의 생존성을 비교한 것으로서 각각 농도를 1, 5, 10 mg/mL으로 변화시켰으며, 투여 48시간 후 측정하였다.

KB cells(비인두 표피암 조직에서 유래된 배양세포)을 RPMI-1640 배지에서 2mM의 L-glutamine과 1%의 penicillin-streptomycin, 10%의 FBS, 5%의 CO₂ 를 대기압 하에서 37°C.에서 항온배양 한다 (5X10⁶cells/mL).

플라스크에 단일 세포층을 형성하면 0.25%(w/v) trypsin 과 0.03%(w/v) EDTA 를 이용해서 세포를 회수한 후 RPMI-1640 배지를 포함하는 well plates에 옮기고 24시간 배양된 것을 사용한다.

도 5에서 알 수 있듯이 투여량이 증가할수록 KB세포의 생존성은 낮아지며 모든 투여량 변화 데이터에서 알 수 있듯이 mPEG-b-PLLA-BC 미셀 형태로 약물을 투여한 경우가 mPEG-b-PLLA 미셀 형태로 투여한 경우보다 생존성이 낮다는 것을 알 수 있다. 따라서 mPEG-b-PLLA-BC로 이루어진 미셀이 효율적인 항암제 전달체임을 알 수 있다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에 대한 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

PLLA(Poly L-lactic acid)-mPEG(methoxy-polyethylene-glycol)에 BC(benzyl chloroformate)이 결합된 접합체를 유효성분으로 포함하는 이산화탄소 생성 약물전달체 조성물.
제1항에 있어서,
상기 접합체는 하기 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 이산화탄소 생성 약물전달체 조성물:
<화학식 1>

상기 식에서 n는 정수 50~250이고, m은 정수 12~85이다.
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a)mPEG(methoxy-polyethylene-glycol)-b-PLLA(Poly L-lactic acid)를 디클로로메탄에 용해시킨 후, BC(benzyl chloroformate)를 첨가하는 단계; 및
b) 디에틸 에테르(diethyl ether)를 첨가하여 반응시켜 침전물을 형성하는 단계를 포함하는,
PLLA(Poly L-lactic acid)-mPEG(methoxy-polyethylene-glycol)에 BC(benzyl chloroformate)이 결합된 이산화탄소 생성 약물전달을 위한 접합체의 제조방법.
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