KR101462723B1 - 폴리펩타이드 기반 블록 공중합체 및 이의 제조방법, 및 이를 이용한 고분자마이셀 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 펩타이드 분해 효소에 의한 생분해성을 갖는 폴리펩타이드 기반 블록 공중합체 및 이의 제조방법, 및 이를 이용한 고분자마이셀에 관한 것이다. 본 발명에 따른 블록 공중합체는 pH에 따라 물에 대한 용해도가 달라지는 특성을 갖지만 자기 조립 현상에 의하여 마이셀을 형성하지 못하는 폴리에틸렌글리콜 계열 화합물; 및 하나의 알킬기의 말단이 NH2로 치환된 삼차아민과 글루탐산의 아미놀리시스반응 또는 트리아민과 글루탐산의 아미놀리시스반응에 의해서 형성된 폴리글루탐산 계열 화합물의 블록 공중합체이다. 본 발명의 블록 공중합체는 pH 민감성을 보유할 뿐만 아니라 생체 내 펩타이드 분해효소에 의한 생분해성을 갖는바 약물방출주기 조절과 관련된 분해 속도가 제어된다는 장점이 있다. 따라서 체내 pH 변화에 따른 표적 지향적인 약물 전달체 및 분해속도의 제어가 가능한 약물 전달체를 제공할 수 있다는 효과가 있다.

Description

폴리펩타이드 기반 블록 공중합체 및 이의 제조방법, 및 이를 이용한 고분자마이셀 {Polypeptide based block copolymer and the process for the preparation thereof, and the polymer micelles using the same}
본 발명은 펩타이드 분해 효소에 의한 생분해성을 갖는 폴리펩타이드 기반 블록 공중합체 및 이의 제조방법, 및 이를 이용한 고분자마이셀에 관한 것이다.
마이셀(micelle)은 일반적으로 양친성(兩親性), 예컨대 친수성기와 소수성기를 동시에 갖는 저분자량의 물질들이 이루는 열역학적으로 안정하고 균일한 구형의 구조를 지칭하는 것이다. 상기 마이셀 구조를 갖는 화합물에 비수용성 약물을 녹여 투입하는 경우 약물은 마이셀 내부에 존재하게 되며, 이러한 마이셀은 체내에서 온도나 pH 변화에 반응하여 표적 지향적 약물방출을 할 수 있으므로, 약물전달용 캐리어로서의 응용 가능성이 대단히 높다고 볼 수 있다.
대한민국 특허출원 제10-2001-0035265호에서는 폴리에틸렌글리콜과 생분해성 고분자를 이용한 마이셀의 제조에 관하여 기재하고 있다. 이들 물질은 모두 생분해성을 갖고 있기 때문에 생체친화성을 갖고 있다는 장점은 있으나, 체내 변화, 예컨대 pH와 같은 특정 변화에 민감한 것이 아니기 때문에 원하는 부위에서의 약물 전달이 어렵다는 단점이 있다.
또한 대한민국 특허출원 제 10-2010-0112491호에서는 폴리(β-아미노 에스터) 화합물과 폴리에틸렌글리콜 계열 화합물과의 블록 공중합체를 이용한 마이셀의 제조에 관하여 기재하고 있다. 이들 물질은 pH와 같은 특정 변화에 민감하다는 장점은 있으나, 디마이셀화 된 후 가수분해에 의해서 분해가 일어나게 되는바, 분해 속도의 제어가 불가하다는 단점이 있다.
한편, 체내의 pH 환경은 일반적으로 pH 7.4 내지 7.2를 나타내나, 암세포와 같은 비정상 세포의 주변 환경은 pH 3.0 내지 7.0으로 약산성에서 강산성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 최근에는 암세포에 특정적으로 약물을 전달하기 위해서 pH 7.0 이하에서 약물을 방출하도록 하는 연구가 이루어지고 있다.
미국등록특허 제5955509호 "pH dependent polymer micelles"은 poly(vinyl N-heterocycle)과 poly(alkylene oxide)의 블록공중합체가 pH가 6.0이상에서 마이셀을 형성하고, pH가 2-6 사이에서는 붕괴되는 pH 민감성 고분자 마이셀의 제조방법에 대하여 기술하였고, 일본공개특허 제2002-179556호 "블록 공중합체－항암제 복합체 의약제제"는 친수성 성분인 폴리에틸렌글리콜계 화합물과 소수성 성분인 폴리아미노산계화합물의 블록 공중합체가 특정 pH에서 마이셀을 형성하는 것으로 기술되어 있다.
이에 본 발명자들은, 폴리에틸렌글리콜 계열 화합물 및 삼차아민기를 포함하는 폴리글루탐산 계열 화합물로 형성된 pH 민감성 블록 공중합체를 이용하면 pH가 7.0 이하의 경우 마이셀이 붕괴되어 약물을 방출할 수 있으며, pH 0.2 차이에 의해서 마이셀이 형성되고 붕괴되는 현상이 일어나게 되어 pH 민감성을 갖는 동시에 펩타이드 효소에 의한 생분해성을 갖는바 약물방출주기와 관련있는 분해 속도의 조절이 가능하고 분해 후 잔사물의 생체독성을 줄일 수 있다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 펩타이드 분해 효소에 의한 생분해성을 갖는 폴리펩타이드 기반 블록 공중합체 및 이의 제조방법, 및 상기 블록 공중합체를 포함하는 고분자 마이셀(micelle)형 진단 및 치료제 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 펩타이드 기반 블록 공중합체를 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112012072991993-pat00001
상기 식에서
x는 10 내지 200의 정수이고,
y는 50 내지 100의 정수이고,
R1은 수소 또는 C1 -4 알킬이고,
R2는 각각 독립적으로 i)
Figure 112012072991993-pat00002
(치환기 A) 또는
Figure 112012072991993-pat00003
(치환기 B)이거나, 또는 ii)
Figure 112012072991993-pat00004
(치환기 C) 또는
Figure 112012072991993-pat00005
(치환기 B) 이고, 여기서 y 개의 R2 중 80 % 이상이 i) 상기 치환기 A이거나, 또는 ii) 상기 치환기 C이고, 상기 R3 및 R4는 C1 -6 알킬이고, 상기 n은 1 내지 6의 정수이고, 상기 n1 및 n2는 각각 독립적으로 1 내지 6의 정수이다.
또한, 본 발명은 (a) 블록 공중합체; 및 (b) 상기 블록 공중합체에 내포될 수 있는 질환의 진단을 위한 분자영상 표지자, 조영제 또는 질환의 치료를 위한 생리활성물질을 포함하는 치료제 물질을 포함하는 고분자 마이셀형 약물 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 글루탐산, 벤질에스터 및 트리포스겐을 반응시켜 하기 화학식 2의 화합물을 제조하는 단계 (단계 1); 하기 화학식 2의 화합물을 하기 화학식 3의 화합물과 공중합 반응시켜 하기 화학식 4의 화합물을 제조하는 단계 (단계 2); 및 하기 화학식 4의 화합물을 하기 화학식 5의 화합물 또는 하기 화학식 6의 화합물과 반응시키는 단계 (단계 3)를 포함하는 블록공중합체의 제조방법을 제공한다.
[화학식 2]
Figure 112012072991993-pat00006
[화학식 3]
Figure 112012072991993-pat00007
[화학식 4]
Figure 112012072991993-pat00008
[화학식 5]
Figure 112012072991993-pat00009
[화학식 6]
Figure 112012072991993-pat00010
상기 식에서 x, y, R1, R3, R4, n, n1 및 n2는 상기에서 정의한 바와 같다.
이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명의 블록 공중합체의 폴리글루탐산 계열 화합물 블록은 pH 7.0 이하에서 이온화되는 삼차아민기(-N=)를 포함하고 있으며 pH가 6.5 내지 7.0 범위인 경우 디마이셀화되고 펩타이드 분해 효소에 의해서 분해가 일어나게 되는 글루탐산기를 포함하고 있는 것을 특징으로 한다. 또한 본 발명의 블록 공중합체의 폴리글루탐산 계열 화합물 블록은 pH 7.0 이하에서 이온화되는
Figure 112012072991993-pat00011
를 포함하고 있으며 pH가 6.5 내지 7.0 범위인 경우 디마이셀화되어 펩타이드 분해 효소에 의해서 분해가 일어나게 되는 글루탐산기를 포함하고 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 상기 화학식 1의 R2는 각각 독립적으로
Figure 112012072991993-pat00012
(치환기 A), 또는
Figure 112012072991993-pat00013
(치환기 B)이고, 여기서 y 개의 R2 중 80 % 이상이 상기 치환기 A이다.
또한, 본 발명에서 상기 화학식 1의 R2는 y 개의 R2 중 88% 이상이 상기 치환기 A인 것이 바람직하다. 또한, 본 발명에서 상기 화학식 1의 R2는 y 개의 R2 중 93% 이상이 상기 치환기 A인 것이 바람직하다. 또한, 본 발명에서 상기 화학식 1의 R2는 y 개의 R2 중 96% 이상이 상기 치환기 A인 것이 보다 더 바람직하다.
더 나아가서 본 발명의 상기 화학식 1의 R2는 각각 독립적으로
Figure 112012072991993-pat00014
(치환기 C) 또는
Figure 112012072991993-pat00015
(치환기 B) 이고, 여기서 y 개의 R2 중 80 % 이상이 상기 치환기 C이다.
본 발명의 블록 공중합체는 pH 7.0 이하에서 이온화되는 삼차아민기를 포함하고 펩타이드 분해 효소에 의해서 분해가 일어나게 되는 글루탐산기를 포함하는바, 체내 pH 변화에 민감할 뿐만 아니라 특정 pH 영역에서 마이셀(micelle) 구조를 형성하게 되며 또한 pH가 6.5 내지 7.0 범위인 경우 디마이셀화되고 펩타이드 분해 효소에 의해서 분해가 일어나게 되는바 분해 속도의 제어가 가능하다는 것을 특징으로 한다.
기존의 폴리(β-아미노 에스터) 화합물은 주쇄중에 에스테르기를 가지고 있어서 가수분해에 의해서 체인이 분해가 되는바 생체 내 분해가 되었을 때 말단에 카르복실산기(-COOH)를 갖는 분해산물이 발생하게 된다. 따라서 이러한 낮은 산도를 가지는 분해산물로 인해 생체 내 조직에 치명적인 상처를 입힐 수가 있다. 이에 반해 본 발명은 폴리펩타이드를 기반으로 하여 고분자를 형성하였는바 인체 내에서 펩타이드 분해효소에 의해서 분해가 일어나게 되어 산도가 낮은 분해산물이 발생이 되지 않기 때문에 인체 친화적이다.
또한, 본 발명의 폴리펩타이드를 기반으로 하는 고분자를 형성하는 경우에 있어서 글루탐산 구조를 기반으로 사용하는 경우에 효과적으로 하나의 알킬기의 말단이 NH2로 치환된 삼차아민과 벤질-글루탐산과의 아미놀리시스 반응에 의해서 상기 화학식 1의 블록 공중합체를 제조할 수 있으며 아미놀리시스 반응의 반응시간을 조절함에 의해서
Figure 112012072991993-pat00016
을
Figure 112012072991993-pat00017
또는
Figure 112012072991993-pat00018
로 전환시키는 비율을 조절할 수 있다. 또한 전환되는 비율이 80 % 이상인 경우 특징적으로 pH 의존적인 특징을 나타내게 된다.
또한 본 발명에서는 기존의 삼차아민기를 포함하는 폴리글루탐산계열 화합물을 단독으로 사용하는 경우 pH 의존성은 나타내지만 자기 조립(self assembly) 현상에 의해 마이셀을 형성하지 못하는바, 삼차아민기를 포함하는 폴리글루탐산계열 화합물과 친수성인 폴리에틸렌글리콜 계열 화합물의 블록공중합체를 형성함으로써 자기 조립(self assembly) 현상에 의해 마이셀을 형성할 수 있도록 하였다. 따라서 본 발명에 의해서 제조된 블록 공중합체는 특정 pH에서 표적 방출이 가능한 마이셀 구조를 형성하여 질환의 진단 및 치료제로서 표적지향적 약물방출용 캐리어로 응용할 수 있다.
또한 종래의 약물전달체의 경우 약물이 표적 부위에 전달된 후에, 인체 내에 잔여물질로 축적되게 되어 여러 가지 부작용을 일으킬 수 있는 문제가 있었고 이에 따라서 고안된 생분해성 고분자의 경우에는 가수분해에 의해서 생분해가 이루어지게 되는바 분해 속도의 조절이 어려운 문제점이 있었다. 이에 블록공중합체의 단량체로서 글루탐산과 같은 단백질의 구성성분을 사용하여 공중합체를 제조하였는바 디마이셀화된 공중합체가 인체 내의 펩타이이드 분해효소에 의해서 생분해되어 완전히 체외로 배출될 수 있고 분해속도를 조절할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 상기 공중합체의 수평균분자량(Mn)은 특별한 제한이 없으나, 상기 화학식 1에서 x는 10 내지 200 범위의 정수이고, y는 50 내지 100 범위의 정수인 것이 바람직하다. 또한 상기 x는 10 내지 100 의 정수이고, y는 50 내지 100 의 정수인 것이 보다 더 바람직하다. 상기 x의 값이 10 미만인 경우와 200을 초과하는 경우 최종 블록 공중합체의 분자량 조절이 어려울 뿐만 아니라 상기 블록 공중합체를 이용하여 마이셀을 형성하는 것이 용이하지 않다. 또한 상기 y의 값이 10 미만인 경우 특정 pH에서 블록 공중합체 마이셀이 형성되기 어려울 뿐만 아니라 형성되더라도 물에 용해되어 붕괴되기 쉽다. 또한, 상기 y의 값이 200을 초과하는 경우 친수성/소수성의 밸런스가 깨져 특정 pH에서 마이셀을 형성하지 못하고 침전될 수 있다.
본 발명의 상기 화학식 1에서 R1은 메틸인 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 상기 화학식 1에서 R3 및 R4는 이소프로필 또는 n-부틸인 것이 바람직하다. 또한 본 발명의 상기 화학식 1에서
Figure 112012072991993-pat00019
의 n은 2인 것이 바람직하다. 또한 본 발명의 상기 화학식 1에서
Figure 112012072991993-pat00020
의 n1 및 n2는 2인 것이 바람직하다.
본 발명의 pH 민감성 마이셀은 특정 pH, 예컨대 체내 정상 세포의 pH 범위인 pH 7.2 내지 7.8 범위에서는 안정한 마이셀을 형성하고, 암 세포와 같은 비정상 세포가 나타내는 pH 범위인 6.5 내지 7.0 범위에서는 마이셀 구조가 붕괴됨으로써, 마이셀에 내포된 진단제의 방출로 인해 암 세포를 표적적으로 진단하거나 마이셀에 내포된 치료제의 방출로 인해 암 세포를 치료하는 표적지향적인 약물 방출용 캐리어로서 사용할 수 있다. 즉, 낮은 pH(pH 7.0이하)에서 삼차아민기를 포함하는 폴리글루탐산 계열 화합물에 존재하는 삼차아민의 이온화도 증가로 인해 블록공중합체 전체가 수용성으로 변하게 되어 마이셀을 형성할 수 없게 되며, pH 7.2 내지 7.8 범위에서는 삼차아민의 이온화도가 저하되어 소수성 특징을 나타냄으로써 자기 조립에 의한 마이셀이 형성된다.
본 발명의 블록 공중합체는 유전자 전달, 약물 전달 분야 뿐만 아니라 질환의 진단 및 치료를 위한 물질을 비정상 세포에 전달함으로써, 진단 및 치료가 동시에 이루어지는 용도에 응용될 수 있다.
또한, 본 발명에서는 정상 체내 조건과 동일한 pH 7.2 내지 7.8 범위에서는 마이셀을 형성하고 암 세포와 같은 비정상 조건인 pH 7.0 이하에서는 마이셀이 붕괴되는 암 세포 표적 지향적인 마이셀을 디자인하여 적용하였으나, 상기 블록 공중합체의 구성 성분, 이들의 몰 비, 분자량 및/또는 블록 내 관능기를 적절히 변경함으로써 암세포 뿐만 아니라 유전자 변이 또는 다른 응용 분야에 표적 지향적인 마이셀을 디자인하여 이를 적용할 수 있다.
본 발명에 따라 pH 민감성 마이셀을 형성하는 블록 공중합체의 구성성분 중 하나는 당업계에 알려진 통상적인 친수성을 갖는 생분해성 화합물, 예컨대 폴리에틸렌글리콜 계열 화합물을 사용할 수 있다. 특히, 폴리에틸렌글리콜 계열 화합물은 말단에 폴리글루탐산계열 화합물과 반응할 수 있도록 아민기 등의 단일 관능기(monofunctional)를 갖는 것이 바람직하며, 일례를 들면 분자 말단 부분이 NH2로 치환된 하기 화학식 3의 화합물이 있다.
[화학식 3]
Figure 112012072991993-pat00021
상기 식에서, x는 10 내지 200 의 정수이고,
R1은 수소 또는 C1 -4 알킬이다.
본 발명에 따른 pH 민감성 블록 공중합체의 제조방법은 글루탐산, 벤질에스터 및 트리포스겐을 반응시켜 하기 화학식 2의 화합물을 제조하는 단계 (단계 1); 하기 화학식 2의 화합물을 하기 화학식 3의 화합물과 공중합 반응시켜 하기 화학식 4의 화합물을 제조하는 단계 (단계 2); 및 하기 화학식 4의 화합물을 하기 화학식 5의 화합물 또는 하기 화학식 6의 화합물과 반응시키는 단계 (단계 3)를 포함한다.
[화학식 2]
Figure 112012072991993-pat00022
[화학식 3]
Figure 112012072991993-pat00023
[화학식 4]
Figure 112012072991993-pat00024
[화학식 5]
Figure 112012072991993-pat00025
[화학식 6]
Figure 112012072991993-pat00026
상기 제조방법의 각각의 단계를 일실시예를 들어 설명하면, 상기 글루탐산, 벤질에스터 및 트리포스겐을 반응시켜 상기 화학식 2의 화합물을 제조하는 단계 1은 먼저 무수 테트라하이드로퓨란 용매 존재 하에서 글루탐산, 벤질에스터 및 트리포스겐을 반응을 시키며 반응은 질소 환경내에 50 ℃에서 일어나는 것이 바람직하다. 반응이 완료된 후에 상기 용액을 헥산에 투입하고 1:1 헥산/에틸 아세테이트를 결정화 용매로 사용하여 재결정화시켜서 상기 화학식 2의 화합물을 얻을 수 있다.
상기 화학식 2의 화합물을 상기 화학식 3의 화합물과 공중합 반응시켜 상기 화학식 4의 화합물(PEG-b-PBLG)을 제조하는 단계 2는 먼저 상기 화학식 3의 화합물과 상기 단계 1에서 제조한 화학식 2의 벤질-L-글루탐산-N-카르복시 무수물 (BLG-NCA)을 다양한 몰 비로 무수 클로로포름에 녹여 반응시킨다. 바람직하게는 상기 화학식 2의 화합물(BLG-NCA)과 상기 화학식 3의 화합물(PEG-NH2)을 10 내지 50 대 1 의 몰비로 공중합 반응시킨다. 상기 반응은 실온에서 질소 환경 내에 72 시간 동안 수행하는 것이 바람직하다. 상기 반응이 완료된 후에, Mn=10000 내지 20000의 분자량을 갖는 폴리글루탐산 계열 화합물 블록과 폴리에틸렌글리콜 계열 블록의 공중합체가 형성된다.
상기 화학식 4의 화합물을 상기 화학식 5의 화합물과 반응시키는 단계에서는 화학식 4의 화합물을 화학식 5의 하나의 알킬기의 말단이 NH2로 치환된 삼차아민과 반응시키는 시간 조절에 의해서 화학식 4의 전체 y 개수의
Figure 112012072991993-pat00027
중 일부를
Figure 112012072991993-pat00028
로 전환하게 된다.
또는 상기 화학식 4의 화합물을 상기 화학식6의 화합물과 반응시키는 단계에서는 화학식 4의 화합물을 화학식 6의 트리아민과 반응시키는 시간 조절에 의해서 화학식 4의 화합물에서 전체 y개수의
Figure 112012072991993-pat00029
중 일부를
Figure 112012072991993-pat00030
로 전환하게 된다.
이 경우 상기 단계 2에서 제조한 화학식 4의 화합물을 무수 N,N-다이메틸포름아마이드에 녹여 상기 화학식 5의 화합물 또는 상기 화학식 6의 화합물과 반응시킨다. 상기 반응은 55 ℃에서 오일배스 (oil bath)에서 이루어지는 것이 바람직하다. 또한 반응시 2-하이드록시피리딘 (2-HP)을 추가하여 반응을 진행시키는 것이 바람직하다.
또한, 상기 단계 3에서 반응시간은 36 시간 내지 72시간인 것이 바람직하다. 반응시간을 36시간 내지 72시간을 조절하면 전체 y 개수의
Figure 112012072991993-pat00031
중 80% 이상을
Figure 112012072991993-pat00032
또는
Figure 112012072991993-pat00033
로 전환할 수 있다. 즉, 아미놀리시스 반응시간에 따라서
Figure 112012072991993-pat00034
가
Figure 112012072991993-pat00035
또는
Figure 112012072991993-pat00036
로 전환되어 아민기가 도입이 되는바, 반응시간이 증가될수록 전환되는 비율이 상승하게 된다. 본 발명의 일실시예에 의할 경우 반응시간이 36시간 미만인 경우에는 전환율이 80% 미만으로서 수용액 상에서 완전하게 용해되지 않으며 pH 민감성 특징을 갖지 않는다.
본 발명에서는 상기와 같이 합성된 블록 공중합체의 분자량 측정을 위해서 1H-NMR을 이용하였고, pH 변화에 따른 마이셀의 농도변화 및 마이셀 크기의 변화를 측정하고자 형광 분광기(Fluorescence spectrometer, FL)와 DLS(Dynamic Light Scattering, DLS)를 이용하였으며, 실제로 전술한 분석들을 통해 pH 민감성 마이셀로서의 적용 가능성을 확인할 수 있었다.
본 발명의 (a) 블록 공중합체; 및 (b) 상기 블록 공중합체에 내포될 수 있는 질환의 진단을 위한 분자영상 표지자, 조영제 또는 질환의 치료를 위한 치료제 물질을 포함하는 고분자 마이셀형 약물 조성물은 체내에 주입되었을 때 마이셀을 형성하고 있다가 암세포와 같이 국소적으로 pH가 낮은 곳에 도달하게 되면 마이셀이 붕괴됨으로써, 내포된 질환의 진단을 위한 분자영상 표지자, 조영제 또는 질환의 치료를 위한 치료제 물질을 방출을 통해 표적지향적 약물 전달이 이루어질 수 있도록 한다.
본 발명의 고분자 마이셀 형태의 블록 공중합체에 포함시킬 수 있는 분자영상 표지자, 조영제 및 치료제 물질은 특별한 제한 없이 사용할 수 있으며, 이의 비제한적인 예로는 분자영상 표지자로서 파이렌, RITC, FITC, ICG(인도시아닌그린), 산화철, 산화망간 등을 포함하며, 치료제 약물로서 항암제, 항균제, 스테로이드류, 소염 진통제, 성호르몬, 면역 억제제, 항바이러스제, 마취제, 항구토제 또는 항히스타민제 등이 있다. 또한, 전술한 성분 이외에 당업계에 알려진 통상적인 첨가제, 예컨대 부형제, 안정화제, pH 조정제, 항산화제, 보존제, 결합제 또는 붕해제 등을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 고분자 마이셀의 제조방법은 교반, 가열, 초음파 주사, 유화법을 이용한 용매증발법, 매트릭스형성 또는 유기용매를 이용한 투석법 등의 방법을 단독 또는 병행하여 사용할 수 있다.
제조된 고분자 마이셀의 직경은 특별한 제한이 없으나, 10 내지 200nm 범위가 바람직하다. 또한, 상기 고분자 마이셀 약물 조성물은 경구제 또는 비경구제의 형태로 제제화하여 사용할 수 있으며, 정맥, 근육 또는 피하 주사제로 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 블록 공중합체는 pH 민감성을 보유할 뿐만 아니라 생체 내 펩타이드 분해효소에 의한 생분해성을 갖는바 분해 속도가 제어된다는 장점이 있다. 또한 가수분해에 의한 체인 분해로 인해 말단에 카르복실산기(-COOH)를 갖는 분해산물이 발생하게 되는 것을 방지할 수 있어 인체 친화적이다. 또한 블록 공중합체를 제조시 사용하는 아민 화합물을 다양화함으로서 블록 공중합체를 다양하게 변경 할 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 블록 공중합체는 체내 pH 변화에 따른 표적 지향적인 약물 전달체 및 분해속도의 제어가 가능한 인체 친화적인 약물 전달체로서 활용할 수 있다는 효과가 있다.
도 1은 제조예 1에서 제조한 벤질-L-글루탐산-N-카르복시 무수물 (BLG-NCA)의 NMR을 나타낸 것이다.
도 2는 제조예 2에서 제조한 폴리(에틸렌 글리콜)-블록-폴리(벤질-L-글루탐산)(PEG-b-PBLG)의 NMR을 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 4에서 제조한 폴리(에틸렌 글리콜)-블록-폴리(2-(다이부틸아미노)에틸-L-글루탐산) (PEG-b-PN4LG)의 NMR을 나타낸 것이다.
도 4는 상기 실시예 1 내지 4 및 비교예 1 내지 2에서 기재된 (폴리(에틸렌 글리콜)-블록-폴리(벤질-L-글루탐산)(PEG-b-PBLG)의 벤질기가 반응시간이 경과함에 따라서 (다이부틸아미노)에틸아민기로 전환되는 비율을 나타낸 그래프이다.
도 5는 폴리펩타이드 기반 블록 공중합체의 NaOH 수용액을 이용한 적정법에 의거하여 구한 pKb값을 보여주는 그래프이다.
도 6은 실시예 1 (36h), 실시예 2 (48h), 실시예 4 (72h)에서 제조한 (폴리(에틸렌 글리콜)-블록-폴리(2-(다이부틸아미노)-에틸-L-글루탐산) (PEG-b-PN4LG)의 pH 변화에 따른 마이셀의 크기변화 및 광산란(DLS)의 강도변화를 나타낸 것이다.
도 7은 실시예 1 (36h), 실시예 2 (48h), 실시예 4 (72h)에서 제조한 (폴리(에틸렌 글리콜)-블록-폴리(2-(다이부틸아미노)-에틸-L-글루탐산) (PEG-b-PN4LG)의 pH 변화에 따른 마이셀의 형광분석(FL)결과 및 실시예 2 (48h)에서 제조한 (폴리(에틸렌 글리콜)-블록-폴리(2-(다이부틸아미노)-에틸-L-글루탐산) (PEG-b-PN4LG)의 파장(nm)에 따른 형광분석(FL) 강도를 나타낸 것이다.
도 8은 실시예 2 (48h)에서 제조한 (폴리(에틸렌 글리콜)-블록-폴리(2-(다이부틸아미노)-에틸-L-글루탐산) (PEG-b-PN4LG)의 임계 미셀 농도(CMC)를 측정한 것을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1: 폴리 (에틸렌 글리콜)-블록- 폴리 (벤질-L-글루탐산) 공중합체의 제조
10g의 L-글루탐산-벤질 에스터 및 6.255g의 트리포스젠을 100 mL의 무수 테트라하이드로 퓨란과 혼합하였다. 상기 반응은 50 ℃ 질소 환경 내에서 진행되었다. 2 시간 후, 반응이 완료된 후에 상기 용액을 헥산에 투입하고 이를 1:1 헥산/에틸 아세테이트를 결정화 용매로 사용하여 2회 재결정화시켜서 벤질-L-글루탐산-N-카르복시 무수물 (BLG-NCA)을 수득하였다. 상기 수득률은 73%였다. 상기 수득한 BLG-NCA의 1H NMR (500 MHz, CDCl3)을 측정한 결과를 도 1에 나타내었다.
상기 제조된 벤질-L-글루탐산-N-카르복시 무수물 (BLG-NCA)과 의 폴리에틸렌 글리콜을 20 대 1의 몰비로 무수 클로로프름에 녹였다. 상기 반응은 실온에서 질소 환경 내에서 72 시간 동안 진행되었다. 반응이 완료된 후에, Mn=11,570 의 분자량을 갖는 폴리글루탐산 블록과 폴리에틸렌 글라이콜 블록의 공중합체인 폴리(에틸렌 글리콜)-블록-폴리(벤질-L-글루탐산)(PEG-b-PBLG)이 형성되었다. 미반응물은 과량의 에탄올/에틸에테르 혼합물로 침전시킨 다음 여과하였다.
제조예 2: 폴리 (에틸렌 글리콜)-블록- 폴리 (벤질-L-글루탐산) 공중합체의 제조
상기 제조예 1과 동일한 방법으로 제조한 벤질-L-글루탐산-N-카르복시 무수물 (BLG-NCA)과
Figure 112012072991993-pat00037
의 폴리에틸렌 글리콜을 30 대 1의 몰비로 무수 클로로프름에 녹였다. 상기 반응은 실온에서 질소 환경 내에서 72 시간 동안 진행되었다. 반응이 완료된 후에, Mn=13,541의 분자량을 갖는 폴리글루탐산 블록과 폴리에틸렌 글라이콜 블록의 공중합체인 폴리(에틸렌 글리콜)-블록-폴리(벤질-L-글루탐산)(PEG-b-PBLG)이 형성되었다. 미반응물은 과량의 에탄올/에틸에테르 혼합물로 침전시킨 다음 여과하였다. 상기 수득한 중합체의 1H NMR (500 MHz, CDCl3)을 측정한 결과를 도 2에 나타내었다.
제조예 3: 폴리 (에틸렌 글리콜)-블록- 폴리 (벤질-L-글루탐산) 공중합체의 제조
상기 제조예 1과 동일한 방법으로 제조한 벤질-L-글루탐산-N-카르복시 무수물 (BLG-NCA)과
Figure 112012072991993-pat00038
의 폴리에틸렌 글리콜을 40 대 1의 몰비로 무수 클로로프름에 녹였다. 상기 반응은 실온에서 질소 환경 내에서 72 시간 동안 진행되었다. 반응이 완료된 후에, Mn=17,045 의 분자량을 갖는 폴리글루탐산 블록과 폴리에틸렌 글라이콜 블록의 공중합체인 폴리(에틸렌 글리콜)-블록-폴리(벤질-L-글루탐산)(PEG-b-PBLG)이 형성되었다. 미반응물은 과량의 에탄올/에틸에테르 혼합물로 침전시킨 다음 여과하였다.
실시예 1: 폴리 (에틸렌 글리콜)-블록-폴리(2-( 다이부틸아미노 )-에틸-L-글루탐산 블록 공중합체( PEG -b- PN4LG )의 제조
상기 제조예 2에서 제조한 폴리(에틸렌 글리콜)-블록-폴리(벤질-L-글루탐산)(PEG-b-PBLG) (10g)을 무수 N,N-다이메틸포름아마이드 (10 mL/1g)에 녹였다. 그리고 오일배스 (oil bath)에 투입하여 55 ℃로 승온시켰다. 그 후 2-(다이부틸아미노)에틸아민 (100g) 및 2-하이드록시피리딘 (13.82g)을 추가하였다. 36 시간 동안 반응을 진행하여 벤질기가 다이부틸 아미노기로 80% 전환되는 최종 생성물 폴리(에틸렌 글리콜)-블록-폴리(2-(다이부틸아미노)에틸-L-글루탐산)(PEG-b-PN4LG)을 에테르로 침전시킨 다음 여과하여 얻었다. 최종 생성물을 48 시간 동안 진공조건에서 건조시켰다. 전체 블록공중합체의 수평균 분자량이 12,823 인 블록공중합체를 얻었으며, 수득률은 70%이상이었다.
실시예 2: 폴리 (에틸렌 글리콜)-블록-폴리(2-( 다이부틸아미노 )-에틸-L-글루탐산 블록 공중합체( PEG -b- PN4LG )의 제조
2-(다이부틸아미노)에틸아민 및 2-하이드록시피리딘을 추가하여 진행한 반응시간이 48시간이라는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하여 전환율 88%의 전체 블록공중합체의 수평균 분자량이 13,942 인 블록공중합체를 얻었으며, 수득률은 70%이상이었다.
실시예 3: 폴리 (에틸렌 글리콜)-블록-폴리(2-( 다이부틸아미노 )-에틸-L-글루탐산 블록 공중합체( PEG -b- PN4LG )의 제조
2-(다이부틸아미노)에틸아민 및 2-하이드록시피리딘을 추가하여 진행한 반응시간이 60시간이라는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하여 전환율 93%의 전체 블록공중합체의 수평균 분자량이 12,340 인 블록공중합체를 얻었으며, 수득률은 70%이상이었다.
실시예 4: 폴리 (에틸렌 글리콜)-블록-폴리(2-( 다이부틸아미노 )-에틸-L-글루탐산 블록 공중합체( PEG -b- PN4LG )의 제조
2-(다이부틸아미노)에틸아민 및 2-하이드록시피리딘을 추가하여 진행한 반응시간이 72시간이라는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하여 전환율 96%의 전체 블록공중합체의 수평균 분자량이 12,011 인 블록공중합체를 얻었으며, 수득률은 70%이상이었다. 상기 수득한 중합체의 1H NMR (500 MHz, CDCl3)을 측정한 결과를 도 3에 나타내었다.
실시예 5: 폴리 (에틸렌 글리콜)-블록-폴리(2-( 다이이소프로필아미노 )-에틸-L-글루탐산 블록 공중합체( PEG -b- PN3LG )의 제조
상기 제조예 2에서 제조한 폴리(에틸렌 글리콜)-블록-폴리(벤질-L-글루탐산)(PEG-b-PBLG)(10g)을 무수 N,N-다이메틸포름아마이드 (10 mL/1g)에 녹였다. 그리고 오일배스 (oil bath)에 투입하여 55 ℃로 승온시켰다. 그 후 2-(다이이소프로필아미노)에틸아민 (80g) 및 2-하이드록시피리딘 (13.82g)을 추가하였다. 72 시간 동안 반응을 진행하여 벤질기가 다이부틸 아미노기로 95% 전환되는 최종 생성물 폴리(에틸렌글리콜)-블록-폴리(2-(다이이소프로필아미노)에틸-L-글루탐산)(PEG-b-PN3LG)을 에테르로 침전시킨 다음 여과하여 얻었다. 최종 생성물을 48 시간 동안 진공조건에서 건조시켰다. 전체 블록공중합체의 수평균 분자량이 12,959 인 블록공중합체를 얻었으며, 수득률은 70%이상이었다.
실시예 6: 폴리 (에틸렌 글리콜)-블록- 폴리 [(2- 아미노에틸 )-2- 아미노에틸 ]-L-글루탐산 블록 공중합체( PEG -b- PNLG )의 제조
상기 제조예 2에서 제조한 폴리(에틸렌 글리콜)-블록-폴리(벤질-L-글루탐산)(PEG-b-PBLG)(10g)을 무수 N,N-다이메틸포름아마이드 (10 mL/1g)에 녹였다. 그리고 오일배스 (oil bath)에 투입하여 55 ℃로 승온시켰다. 그 후 디에틸렌트리아민 (60g) 및 2-하이드록시피리딘 (13.82g)을 추가하였다. 72 시간 동안 반응을 진행하여 벤질기가 다이부틸 아미노기로 95% 전환되는 최종 생성물 폴리(에틸렌 글리콜)-블록-폴리[(2-아미노에틸)-2-아미노에틸]-L-글루탐산)(PEG-b-PNLG)을 에테르로 침전시킨 다음 여과하여 얻었다. 최종 생성물을 48 시간 동안 진공조건에서 건조시켰다. 전체 블록공중합체의 수평균 분자량이 14,000인 블록공중합체를 얻었으며, 수득률은 70%이상이었다.
비교예 1: 폴리 (에틸렌 글리콜)-블록-폴리(2-( 다이부틸아미노 )-에틸-L-글루탐산 블록 공중합체( PEG -b- PN4LG )의 제조
2-(다이부틸아미노)에틸아민 및 2-하이드록시피리딘을 추가하여 진행한 반응시간이 12시간이라는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하여 전환율 40%의 전체 블록공중합체의 수평균 분자량이 11,115 인 블록공중합체를 얻었으며, 수득률은 70%이상이었다.
비교예 2: 폴리 (에틸렌 글리콜)-블록-폴리(2-( 다이부틸아미노 )-에틸-L-글루탐산 블록 공중합체( PEG -b- PN4LG )의 제조
2-(다이부틸아미노)에틸아민 및 2-하이드록시피리딘을 추가하여 진행한 반응시간이 24시간이라는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하여 전환율 63%의 전체 블록공중합체의 수평균 분자량이 11,216 인 블록공중합체를 얻었으며, 수득률은 70%이상이었다.
실험예 1. 반응시간에 따른 전환율 평가
상기 실시예 1 내지 6에서 제조한 (폴리(에틸렌 글리콜)-블록-폴리(2-(다이부틸아미노)-에틸-L-글루탐산) 공중합체(PEG-b-PNLG)를 반응시간에 따라 시료를 채취하여 1H-NMR로 전환율을 평가하였다 (도 4). 즉 1H-NMR 상에서 삼차아민기를 가진 PNLG의 특정 피크 면적이 증가하는 것을 측정하여 전환율을 평가하였다. 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 반응시간이 증가할수록, 삼차아민기로 전환되는 비율이 향상되는 것을 확인할 수 있었다.
고분자의 종류 반응 시간 변환 비율
제조예 1 PEG-b-PBLG 72 h -
제조예 2 PEG-b-PBLG 72 h -
제조예 3 PEG-b-PBLG 72 h -
비교예 1 PEG-b-PN4LG 12 h 40 %
비교예 2 PEG-b-PN4LG 22 h 63 %
실시예 1 PEG-b-PN4LG 36 h 80 %
실시예 2 PEG-b-PN4LG 48 h 88 %
실시예 3 PEG-b-PN4LG 60 h 93 %
실시예 4 PEG-b-PN4LG 72 h 96 %
실시예 5 PEG-b-PN3LG 72 h 95 %
실시예 6 PEG-b-PNLG 72 h 95 %
실험예 2. pH 변화에 따른 마이셀의 변화 측정
실험예 2-1. pH 민감성 공중합체의 pKb 값의 측정
실시예 1 내지 5에서 제조한 반응시간에 따라서 분자량이 서로 다른 블록 공중합체(PEG-b-PNLG)를 사용하여 NaOH 수용액을 이용한 적정법에 의거하여 pKb값을 측정하였다 (도 5). 도 5에 나타낸 바와 같이 반응시간이 증가할수록, 즉 삼차아민기를 가진 PNLG가 많이 생성될수록 산염기 변곡점이 급격하게 변하면서 pKb 값이 다소 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 측정된 pKb의 값을 하기 표 3에 기재하였다.
실험예 2-2. pH 민감성 공중합체의 pH 변화에 따른 마이셀의 크기변화 및 광산란( DLS )의 강도변화 측정
동적 광산란법을 이용하여 (DLS: Dynamic Light Scattering) pH 7.8, pH 7.4, pH 7.2, pH 7.0, pH 6.8, pH 6.6에서의 실시예 1 내지 6에서 제조한 (폴리(에틸렌글리콜)-블록-폴리(2-(다이부틸아미노)-에틸-L-글루탐산) (PEG-b-PN4LG)의 마이셀의 크기 및 강도 변화를 측정하였다 (도 6).
실험 결과, pH 7.0 이상에서는 일정한 크기를 갖는 마이셀이 존재하는 것을 알 수 있으나, pH 7.0 미만에서는 PN4LG가 완전히 이온화되어 마이셀이 전혀 형성되지 않는다는 것을 확인할 수 있었다.
이로서, 소수성인 PN4LG와 친수성인 PEG 화합물과의 공중합에 의해 형성된 본 발명의 블록 공중합체는 공중합체 내 존재하는 양친성(兩親性)과 pH 변화에 따른 가역적인 자기 조립 현상을 통해 고분자 마이셀(micelle)을 형성 및 붕괴할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
또한 나머지 제조예 1 내지 3에서 제조한 공중합체 및 반응시간을 12 시간 및 22시간으로 조절한 공중합체의 경우에는 비수용성이거나 수용액상에서 완전하게 용해되지 않는다는 것을 확인하였다 (표 2).
고분자의 종류 반응 시간 수용액에 대한 용해도
제조예 1 PEG-b-PBLG 72 h 비수용성
제조예 2 PEG-b-PBLG 72 h 비수용성
제조예 3 PEG-b-PBLG 72 h 비수용성
비교예 1 PEG-b-PN4LG 12 h 비수용성
비교예 2 PEG-b-PN4LG 22 h 완전하게 녹지 않음
실시예 1 PEG-b-PN4LG 36 h pH의존적
실시예 2 PEG-b-PN4LG 48 h pH의존적
실시예 3 PEG-b-PN4LG 60 h pH의존적
실시예 4 PEG-b-PN4LG 72 h pH의존적
실시예 5 PEG-b-PN3LG 72 h pH의존적
실시예 6 PEG-b-PNLG 72 h pH의존적
실험예 2-3. pH 민감성 공중합체의 형광분석( FL )변화를 측정
실시예 1, 실시예 2, 실시예 4에서 제조한 (폴리(에틸렌 글리콜)-블록-폴리(2-(다이부틸아미노)-에틸-L-글루탐산) (PEG-b-PNLG)의 pH 변화에 따른 마이셀의 형광분석(FL)변화를 측정하였다 (도 7). 형광 분광기(Fluorescence spectrometer)를 통해서는 직접적으로 마이셀(micelle)의 거동 변화를 알 수 없기 때문에 소수성 발광물질인 파이렌(pyrene)을 이용하였다.
10-6M의 파이렌을 함유하는 pH 6.0인 버퍼용액을 만들었으며, 실시예 1 내지 6에서 제조된 각 공중합체를 1㎎/㎖의 농도로 녹인 후 pH 8.0으로 용액의 pH를 높였다. 이후 5M의 염산 수용액을 적가하여 pH를 5.5 내지 8.0의 범위로 변화시켰으며, 이에 따라 형광 분광기를 통해 마이셀의 농도 변화로 인해 나타나는 방출되는 에너지의 변화를 측정하였다.
실험예 2-4. pH 민감성 공중합체의 임계 미셀 농도( CMC )를 측정
실시예 1 내지 4에서 제조한 (폴리(에틸렌 글리콜)-블록-폴리(2-(다이부틸아미노)-에틸-L-글루탐산) (PEG-b-PN4LG)의 pH 6.8, 6.9, 7.0, 7.1에서 임계 미셀 농도(CMC)를 측정하였다 (도 8).
실험 결과, 본 발명의 블록 공중합체는 pH 7.4에서는 안정한 마이셀을 형성하였으며, pH 7.0에서는 마이셀이 전혀 형성되지 않는다는 것을 확인할 수 있었다(도 8). 이는 낮은 pH(pH 7.0이하)에서 PNLG에 존재하는 삼차아민의 이온화도 증가로 인해 PNLG 전체가 수용성으로 변하게 되어 상기 공중합체가 마이셀을 형성할 수 없게 되며, pH 7.4에서는 PNLG의 이온화도가 저하되어 소수성 특징을 나타냄으로써 자기 조립에 의한 마이셀을 형성하는 것을 의미한다. 측정된 임계 미셀 농도의 값을 하기 표 3에 기재하였다.
실험예 2-5. pH 민감성 공중합체의 크기 측정
동적 광산란법을 이용하여 (DLS: Dynamic Light Scattering)이용하여 pH=7.4에서 실시예 1 내지 4의 (폴리(에틸렌 글리콜)-블록-폴리(2-(다이부틸아미노)-에틸-L-글루탐산) (PEG-b-PNLG)의 크기를 측정하였다. 측정된 미셀의 지름 값을 하기 표 3에 기재하였다.
고분자의 종류 Mn pKb CMC (mg/mL) Size (pH 7.4)
제조예 1 PEG-b-PBLG 11,570 - - -
제조예 2 PEG-b-PBLG 13,541 - - -
제조예 3 PEG-b-PBLG 17,045 - - -
비교예 1 PEG-b-PN4LG 11,115 - - -
비교예 2 PEG-b-PN4LG 11,216 - - -
실시예 1 PEG-b-PN4LG 12,823 6.32 0.020 46.0 nm
실시예 2 PEG-b-PN4LG 13,942 6.55 0.019 45.2 nm
실시예 3 PEG-b-PN4LG 12,340 6.65 0.019 42.0 nm
실시예 4 PEG-b-PN4LG 12,011 6.69 0.017 40.0 nm
실시예 5 PEG-b-PN3LG 12,959 8.30 - -
실시예 6 PEG-b-PNLG 14,000

Claims (11)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 펩타이드 기반 블록 공중합체:
    [화학식 1]
    Figure 112012072991993-pat00039

    상기 식에서
    x는 10 내지 200의 정수이고,
    y는 50 내지 100의 정수이고,
    R1은 수소 또는 C1 -4 알킬이고,
    R2는 각각 독립적으로 i)
    Figure 112012072991993-pat00040
    (치환기 A) 또는
    Figure 112012072991993-pat00041
    (치환기 B)이거나, 또는 ii)
    Figure 112012072991993-pat00042
    (치환기 C) 또는
    Figure 112012072991993-pat00043
    (치환기 B) 이고,
    여기서 y 개의 R2 중 80 % 이상이 i) 상기 치환기 A이거나, 또는 ii) 상기 치환기 C이고,
    상기 R3 및 R4는 C1 -6 알킬이고, 상기 n은 1 내지 6 의 정수이고, 상기 n1 및 n2는 각각 독립적으로 1 내지 6의 정수이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 y 개의 R2 중 88 % 이상이 상기 치환기 A인 것을 특징으로 하는 블록 공중합체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 y 개의 R2 중 93 % 이상이 상기 치환기 A인 것을 특징으로 하는 블록 공중합체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 y 개의 R2 중 96 % 이상이 상기 치환기 A인 것을 특징으로 하는 블록 공중합체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1에서 R1은 메틸인 것을 특징으로 하는 블록 공중합체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1에서 R3 및 R4는 이소프로필 또는 n-부틸인 것을 특징으로 하는 블록 공중합체.
  7. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1에서 n은 2인 것을 특징으로 하는 블록 공중합체.
  8. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1에서 n1 및 n2는 2인 것을 특징으로 하는 블록 공중합체.
  9. (a) 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 블록 공중합체; 및
    (b) 상기 블록 공중합체에 내포된 분자영상 표지자, 조영제 또는 치료제 물질을 포함하는 고분자 마이셀형 제제.
  10. 글루탐산, 벤질에스터 및 트리포스겐을 반응시켜 하기 화학식 2의 화합물을 제조하는 단계 (단계 1);
    하기 화학식 2의 화합물을 하기 화학식 3의 화합물과 공중합 반응시켜 하기 화학식 4의 화합물을 제조하는 단계 (단계 2); 및
    하기 화학식 4의 화합물을 하기 화학식 5의 화합물 또는 하기 화학식 6의 화합물과 반응시키는 단계 (단계 3)를 포함하는 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 블록공중합체의 제조방법.
    [화학식 2]
    Figure 112012072991993-pat00044

    [화학식 3]
    Figure 112012072991993-pat00045

    [화학식 4]
    Figure 112012072991993-pat00046

    [화학식 5]
    Figure 112012072991993-pat00047

    [화학식 6]
    Figure 112012072991993-pat00048

    상기 식에서 x, y, R1, R3, R4, n, n1 및 n2는 제1항에서 정의한 바와 같다.
  11. 제10항에 있어서, 상기 단계 3에서 반응시간을 36 시간 내지 72시간으로 하는 것을 특징으로 하는 블록 공중합체의 제조방법.
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