KR101647187B1 - 신규한 온도감응성 및 양이온성 공중합체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 제1단위체 및 알킬비닐이미다졸리움 화합물을 포함하는 제2단위체를 포함하는 온도감응성 및 양이온성 공중합체; 이의 제조방법; 및 이를 포함하는 마이셀 또는 하이드로겔 내에 약물이 담지된 약물 전달체에 관한 것이다.

Description

신규한 온도감응성 및 양이온성 공중합체 및 이의 용도{Novel temperature responsive and cationic copolymer and use thereof}
본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 제1단위체 및 알킬비닐이미다졸리움 화합물을 포함하는 제2단위체를 포함하는 온도감응성 및 양이온성 공중합체; 이의 제조방법; 및 이를 포함하는 마이셀 또는 하이드로겔 내에 약물이 담지된 약물 전달체에 관한 것이다.
환경에 민감한 물질은 온도, pH, 이온세기, 전기장, 자기장 또는 빛 등의 외부 자극에 대해 가역적인 반응을 나타내므로 생물의학적 활용이 가능할 것으로 여겨지고 있다. 특히, 상기 자극 중 온도 및 pH는 인간 조직에 있어서 다양한 질병에 의해 변화할 수 있고, 외부적인 유도에 의해 쉽게 조절될 수 있는 인자이므로 원하는 범위에서 온도- 또는 pH-감응성을 나타내는 물질을 발굴하고자 하는 노력이 진행되고 있다(L. Zhang et al ., Adv. Mater., 2007, 19: 2988; W.Y. Seow et al ., Biomaterials, 2007, 28: 1730).
폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(poly(N-isopropylacrylamide); p-NIPAAm)는 알려진 열감응성 고분자 중 하나이며, 저임계용액온도(lower critical solution temperature; LCST)인 32℃에서 수화된 불규칙 나선(또는 팽창된 소구체)로부터 팽창이 감소된 소형 구체로의 가역적 열감응성 상전이를 나타내므로(K. Otake et al ., Macromolecules, 1990, 23: 283-289), 이의 생물의학적 적용이 널리 연구되고 있다. 그러나, p-NIPAAm은 체온 미만의 너무 낮은 LCST를 가지므로, 체온 미만의 넓은 온도 범위에서 지연된(tedious) 약물-방출 프로파일 및 너무 낮은 약물전달능(약 0.1 mg 미만의 약물/1.0 mg 고분자)으로 인해 약물전달시스템으로서의 적용 가능성이 제한되고 있다(M. Caldorera-Moore and N. A. Peppas, Adv. Drug Deliv. Rev., 2009, 61: 1391). 이와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 지금까지는 친수성 p-NIPAAm 부분을 상대적으로 소수성인 고분자 부분과 결합시켜 열감응성 p-NIPAAm 계 공중합체를 제조해왔다. 이와 같이 제조된 공중합체는 LCST를 조절할 수 있는 등의 장점을 나타내기는 하였으나(L. D. Taylor and L. D. Cerankowski, J. Polym. Sci. Polym. Chem., 1975, 13: 2551-2570), 약물 봉입 수준이 낮고 pH 민감성 및 약물 방출 패턴에 있어서 만족할만한 향상을 달성하지 못하였다(J. E. Chung et al ., J. Controlled Release, 1999, 62: 115-127).
이에 본 발명자들은, 열감응성 고분자인 p-NIPAAm계 고분자를 이용하여 LCST를 조절가능하고 약물전달체로 제조시 약물의 봉입효율이 높고 병변으로의 약물전달능을 향상시킬 수 있는 공중합체를 발굴하고자 예의 연구노력한 결과, NIPAAm와 알킬비닐이미다졸리움 화합물의 공중합체가 체온 이상 임상적 고열온도 이하의 LCST를 가지며, 이로부터 형성된 음이온성 또는 극성 약물이 높은 효율로 봉입된 마이셀 또는 하이드로겔 형태의 약물전달체는 체내 환경에서 방출 거동이 개선되어 병변으로의 약물전달능이 향상됨을 확인하였으며, 또한 새롭게 합성된 양이온성 공중합체는 0.125 mg/ml 이하의 농도에서 세포독성을 나타내지 않음을 확인함으로서 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 제1단위체 및 알킬비닐이미다졸리움 화합물을 포함하는 제2단위체를 포함하는 온도감응성 및 양이온성 공중합체를 제공하는 것이다:
[화학식 1]
Figure 112014067161268-pat00001
본 발명의 다른 목적은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 제1단위체 및 알킬비닐이미다졸리움 화합물을 포함하는 제2단위체를 포함하는 온도감응성 및 양이온성 공중합체의 제조방법으로서, 비닐이미다졸을 알킬 화합물과 반응시켜 알킬비닐이미다졸리움 화합물을 준비하는 제1단계; 및 상기 알킬비닐이미다졸리움 화합물을 상기 화학식 1로 표시되는 화합물과 공중합화하는 제2단계를 포함하는 온도감응성 및 양이온성 공중합체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 제1단위체 및 알킬비닐이미다졸리움 화합물을 포함하는 제2단위체를 포함하는 온도감응성 및 양이온성 공중합체의 제조방법으로서, 단량체로서 상기 화학식 1로 표시되는 화합물과 비닐이미다졸을 공중합화하는 제1단계; 및 상기 제1단계로부터 형성된 공중합체를 알킬 화합물과 반응시켜 이미다졸의 질소원자에 알킬기를 도입하는 제2단계를 포함하는 온도감응성 및 양이온성 공중합체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 제1단위체 및 알킬비닐이미다졸리움 화합물을 포함하는 제2단위체를 포함하는 온도감응성 및 양이온성 공중합체를 포함하는 마이셀 내에 약물이 담지된 약물 전달체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 제1단위체 및 알킬비닐이미다졸리움 화합물을 포함하는 제2단위체를 포함하는 온도감응성 및 양이온성 공중합체를 포함하는 하이드로겔 내에 약물이 담지된 약물 전달체를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 제1단위체 및 알킬비닐이미다졸리움 화합물을 포함하는 제2단위체를 포함하는 온도감응성 및 양이온성 공중합체를 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112014067161268-pat00002
상기 식에서,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소 또는 직쇄 또는 분지쇄 C1 -15-알킬;
R3은 직쇄 또는 분지쇄 C1 -15-알킬렌;
X는 수소, 또는 직쇄 또는 분지쇄 C1 -15-알킬이 치환 또는 비치환된 아크릴아미도이며,
비닐기를 통해 중합함.
바람직하게, 상기 화학식 1의 화합물은 N-알킬아크릴아미드, N-알킬메타크릴아미드 또는 N,N'-알킬렌비스아크릴아미드로서, 상기 알킬은 직쇄 또는 분지쇄 C1 -15-알킬이고, 상기 알킬렌은 직쇄 또는 분지쇄 C1 -15-알킬렌일 수 있다. 보다 바람직하게, 상기 화학식 1의 화합물은 N-이소프로필아크릴아미드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 단백질 및 유전자 등을 포함하는 음이온성 약물 또는 이외의 극성 약물을 고효율로 봉입하는 동시에, 상기 약물을 표적위치에 효과적으로 전달할 수 있는, 온도에 따라 방출거동이 조절되는 약물전달체를 제공할 수 있는 담체로서 신규한 양이온성 공중합체를 발굴한 것에 기초한다.
본 발명의 온도감응성 및 양이온성 블록 공중합체의 제1블록을 형성하는 상기 화학식 1의 화합물은 C1 -15-알킬에 결합된 또는 C1 -15-알킬렌으로 연결된 하나 이상의 아크릴아미도기를 포함하는 것이 특징이다. 상기 아크릴아미도기의 탄소-탄소 이중결합을 통해 중합함으로써 하나의 블록을 형성할 수 있다.
상기 화학식 1로 표시되는 대표적인 화합물인 "N-이소프로필아크릴아미드(N-isopropylacrylamide; NIPAAm)"는 온도감응성 고분자로 알려진 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)를 구성하는 단량체로서, 모노머 자체로는 독성을 지니지만, 자체로서 형성된 중합체 및 다른 물질을 추가로 포함하여 형성된 공중합체는 비독성이다.
상기 "알킬비닐이미다졸리움 화합물(alkyl vinyl imidazolium compound)"은 서로 이격된 2개의 질소원자를 포함하는 5각 고리형 구조에 2개의 이중결합을 포함하는 이미다졸에 비닐기와 알킬기가 치환된 화합물인 알킬비닐이미다졸로부터 유래한 화합물일 수 있다. 바람직하게, 상기 비닐기 및 알킬기는 이미다졸 상의 각기 다른 질소원자에 치환될 수 있다. 특히 알킬기가 치환된 질소원자는 양이온을 형성하여 상대 음이온과 공존하는 이온성 화합물의 형태로 존재할 수 있다. 한편 상기 비닐기를 통해 중합화할 수 있으므로 이를 기본 골격으로 하여 측쇄에 알킬이미다졸리움 화합물을 포함하는 고분자를 형성할 수 있다. 또한 이는 양이온성 화합물이므로 이를 포함하는 중합체 또는 공중합체는 상기 양이온성 부분을 통해 음이온성 물질 바람직하게는 단백질, 유전자 등의 음이온성 약물 또는 극성 물질과 상호작용할 수 있다.
바람직하게, 상기 알킬비닐이미다졸리움 화합물은 상대 음이온(counter anion)으로 할라이드, PO4 3 -, SO4 2 -, NO3 -, AcO-, BF4 -, SbF6 2 -, PF6 -, OTf-(CF3SO3 -) 또는 NTF2 -(N(CF3SO2)2 -)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이때, 전체 공중합체를 구성하는 단량체에 대해 알킬비닐이미다졸리움 화합물을 1 내지 50 몰% 포함할 수 있다. 상기 알킬비닐이미다졸리움 화합물의 함량이 1 몰% 미만인 경우에는 p-NIPAAm 자체의 LCST인 32℃에 가까운 값을 가지므로, 정상체온 이상의 고열 온도에서 전이를 나타내는 본 발명의 목적을 달성할 수 없다. 한편, 알킬비닐이미다졸리움 화합물의 함량이 50 몰%를 초과하는 경우에는 LCST가 나타나지 않게 즉, 온도 감응성이 사라지게 될 수 있다. 또한, 상기 알킬비닐이미다졸리움 화합물의 함량이 1 몰% 미만인 경우에는 음이온성 약물과 상호작용 가능한 부분인 공중합체 내의 양이온성 부분이 적어 약물전달체로서 사용할 때 원하는 정도의 약물 봉입효율을 나타낼 수 없으며, 알킬비닐이미다졸리움 화합물의 함량이 50 몰%를 초과하는 경우에는 상대적으로 양이온성 부분이 많아 고온에서도 용매 중에 용해되어 버리므로, 즉 마이셀 등의 약물전달체를 형성하지 못하게 될 수 있다.
본 발명의 공중합체는 38℃ 내지 42℃의 LCST(lower critical solution temperature)를 갖도록 조절가능한 것이 특징이다. 38℃는 체온보다 약간 높은 온도이고, 42℃는 임상적으로 나타나는 고열에 해당하는 온도로, 상기 온도 범위 내에 LCST가 존재한다는 것은 이로부터 제조한 약물전달체는 체내에서 특히 정상 체온보다 다소 높은 온도를 나타내는 병변까지 전달될 수 있으며, 선택적으로 병변에서 약물을 방출할 수 있음을 의미하는 것이다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 제1단위체 및 알킬비닐이미다졸리움 화합물을 포함하는 제2단위체를 포함하는 온도감응성 및 양이온성 공중합체의 제조방법으로서, 비닐이미다졸을 알킬 화합물과 반응시켜 알킬비닐이미다졸리움 화합물을 준비하는 제1단계; 및 상기 알킬비닐이미다졸리움 화합물을 상기 화학식 1로 표시되는 화합물과 공중합화하는 제2단계를 포함하는 온도감응성 및 양이온성 공중합체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 제1단위체 및 알킬비닐이미다졸리움 화합물을 포함하는 제2단위체를 포함하는 온도감응성 및 양이온성 공중합체의 제조방법으로서, 단량체로서 상기 화학식 1로 표시되는 화합물과 비닐이미다졸을 공중합화하는 제1단계; 및 상기 제1단계로부터 형성된 공중합체를 알킬 화합물과 반응시켜 이미다졸의 질소원자에 알킬기를 도입하는 제2단계를 포함하는 온도감응성 및 양이온성 공중합체의 제조방법을 제공한다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 예컨대, N-이소프로필아크릴아미드를 포함하는 제1단위체 및 알킬비닐이미다졸리움 화합물을 포함하는 제2단위체를 포함하는 온도감응성 및 양이온성 공중합체는 1) 비닐이미다졸과 알킬 화합물로부터 알킬이미다졸리움 화합물을 준비하여 이를 N-이소프로필아크릴아미드와 공중합화하거나, 2) N-이소프로필아크릴아미드와 비닐이미다졸을 먼저 공중합화한 후 형성된 공중합체를 알킬 화합물과 반응시켜 알킬기를 도입함으로써 제조할 수 있다.
상기 알킬 화합물은 음이온으로서 할라이드, PO4 3 -, SO4 2 -, NO3 -, AcO-, BF4 -, SbF6 2-, PF6 -, OTf-(CF3SO3 -) 또는 NTF2 -(N(CF3SO2)2 -)를 포함하는 화합물을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 공중합화는 개시제의 존재 하에 또는 UV 조사에 의해 개시되는 반응일 수 있으며, 이때 상기 개시제로는 유기과산화물, 산화환원제, 퍼설페이트 또는 아조화합물 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 당업계에 공지된 공중합화 반응에 사용될 수 있는 개시제를 사용할 수 있다.
또는 상기 공중합화하는 단계는 활성제를 추가로 포함하여 수행될 수 있다. 상기 활성제 즉, 중합 개시제로는 테트라메틸에틸렌디아민(TEMED), 암모늄설페이트, 리보플라빈, 리보플라빈-5'-포스페이트, 2-히드록시-2-메틸프로파논 및 2,2-디에톡시아세토페논 또는 이들을 조합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 제1단위체 및 알킬비닐이미다졸리움 화합물을 포함하는 제2단위체를 포함하는 온도감응성 및 양이온성 공중합체를 포함하는 마이셀 내에 약물이 담지된 약물 전달체를 제공한다.
본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 제1단위체 및 알킬비닐이미다졸리움 화합물을 포함하는 제2단위체를 포함하는 공중합체는 온도감응성 공중합체인 동시에 양이온성 공중합체이므로 양이온성을 나타내는 부분을 통해 음이온성 물질과 인력을 나타낼 수 있다. 따라서, 본 발명의 공중합체는 내부에 음이온성 물질을 봉입하여 수십 내지 수백 나노미터 수준의 직경을 갖는 나노구조물을 형성할 수 있으므로 음이온성 약물을 위한 약물전달체로 사용할 수 있다. 이와 같이, 바람직하게, 상기 본 발명의 공중합체에 의해 형성되는 약물전달체에 봉입될 수 있는 약물은 단백질, 유전자 또는 음이온성 약물일 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니며, 음이온성 또는 극성을 띠는 물질로서 본 발명의 양이온성 공중합체와의 상호작용에 의해 이에 의해 형성되는 나노구조물의 내부에 봉입될 수 있는 치료용 물질이면 제한없이 사용할 수 있다. 본 발명의 약물전달체에 봉입될 수 있는 물질은 천연 또는 합성 물질일 수 있으며, 음이온성 또는 극성을 띠는 물질이면 제한없이 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 공중합체로부터 제조된 약물전달체는, 바람직하게, 38℃ 내지 42℃의 병변에서 선택적으로 약물을 방출하는 것이 특징이다. 상기 본 발명의 공중합체는 온도감응성 물질로 공중합체 중의 각 성분의 함량 등을 조절하여 LCST를 체온보다 높은 38℃에서 임상적 고열 온도인 42℃ 사이의 범위로 조절할 수 있으므로, 정상 체온보다 다소 높은 온도를 나타내는 병변에서 선택적으로 약물을 방출할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 제1단위체 및 알킬비닐이미다졸리움 화합물을 포함하는 제2단위체를 포함하는 온도감응성 및 양이온성 공중합체를 포함하는 하이드로겔 내에 약물이 담지된 약물 전달체를 제공한다.
상기 본 발명의 공중합체는 양이온성 공중합체이므로 물을 함유하여 하이드로겔을 형성할 수 있다. 동시에 상기 양이온성 부분을 통해 음이온성 약물과 상호작용할 수 있으므로 음이온성 약물이 내부에 봉입된 하이드로겔 형태의 약물전달체를 제공할 수 있다. 상기 약물로는 전술한 음이온성 약물들을 제한없이 사용할 수 있다.
본 발명의 약물전달체는 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사 용액의 주사제 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으나, 바람직하게는 주사제 형태로 제공될 수 있다. 전술한 바와 같이, 본 발명의 약물 전달체는 체온 이상 내지 임상적 고열 온도 이하 즉, 38℃ 내지 42℃ 사이의 온도 범위에서 LCST를 갖도록 고안된 온도감응성 공중합체로부터 제조되므로 전신투여하여도 정상 체온을 갖는 부분에서는 약물을 담지한 채로 순환하다가 다소 높은 온도를 나타내는 병변부위에서 선택적으로 약물을 방출할 수 있다.
상기 약물전달체는 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 바람직한 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제, 점적 주사제 등의 주사제일 수 있다. 주사제는 생리식염액, 링겔액 등의 수성용제, 식물유, 고급 지방산 에스테르(예, 올레인산에칠 등), 알코올 류(예, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등) 등의 비수성용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제(예, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제(예, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약학적 담체를 포함할 수 있다.
화학식 1로 표시되는 화합물 예컨대, N-이소프로필아크릴아미드 및 알킬비닐이미다졸리움 화합물을 포함하는 본 발명의 온도감응성 및 양이온성 공중합체는 체온 이상 임상적 고온 이하의 LCST를 갖도록 조절가능하므로, 이와 같이 조절된 LCST를 갖는 공중합체부터 형성된 음이온성 또는 극성 약물이 높은 효율로 봉입된 마이셀 또는 하이드로겔 형태의 약물전달체는 체내 환경에서 방출 거동이 개선되어 병변으로의 약물전달능이 향상되었을 뿐만 아니라 상기 공중합체 자체는 0.125 ㎎/㎖ 미만에서 100%에 가까운 세포생존율을 갖는 세포독성이 매우 낮은 물질임을 확인하였으므로, 표적지향성 및 선택적 약물방출능을 갖는 약물전달체로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 구체적인 실시예에 따른 폴리(NIPAAm-co-BVIm)(p-NIBIm)의 제조방법을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 2는 단량체로서 (a) [BVIm]Br과 본 발명의 구체적인 실시예에 따른 공중합체 (b) p-NIBIm, (c) p-BVIm 및 (d) p-NIPAAm의 구조식 및 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 구체적인 실시예에 따른 공중합체 p-NIBIm, p-BVIm 및 p-NIPAAm의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 구체적인 실시예에 따른 공중합체 p-NIBIm의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 구체적인 실시예에 따른 공중합체 (a) p-NIBIm, (b) p-BVIm 및 (c) p-NIPAAm의 MALDI-TOF 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 6은 DSC 스캔을 이용한 a) p-NIPAAm 및 b) IL-도핑된 p-NIBIm의 LCST 측정결과를 나타낸 도이다.
도 7은 DSC 스캔을 이용한 IL-도핑된 p-NIBIm의 LCST 측정결과를 나타낸 도이다. a)는 pH=7에서 수회 연속적인 가열 및 냉각에 따른 결과 및 b) 산성 pH 환경(pH=4~5)에서의 측정 결과를 나타낸다.
도 8는 0.1M 아세트산 및 0.2 M 소디움 아세테이트에서 pH에 따른 제타전위 변화를 나타낸 도이다.
도 9은 37℃에서 p-NIPAAm 수용액(0.5 mg/ml)의 콜로이드 안정성을 나타낸 도이다.
도 10은 p-NIPAAm 고분자 및 이의 BSA와의 복합체, p-NIPAAm/BSA의 온도 의존적 크기 변화를 나타낸 도이다.
도 11는 p-NIBIm 공중합체 및 p-NIBIm/BSA 복합체 마이셀의 SEM 이미지를 나타낸 도이다. a) 및 b)는 각각 25℃와 50℃에서 건조하여 제조한 p-NIBIm 시료를, c) 및 d)는 각각 25℃와 50℃에서 건조하여 제조한 p-NIBIm/BSA 복합체 시료를 나타낸 도이다(적색 원 및 화살표: 팽창된(swelled) 및 팽창이 감소된(deswelled) p-NIBIm 마이셀, 청색 화살표: BSA 응집).
도 12은 x축에 기지의 BSA 농도와 y축에 λmax=750 nm에서 BSA/DC 복합체의 흡광도를 플롯함으로써 작성된 검정곡선을 나타낸 도이다.
도 13는 25℃에서 p-NIBIm 및 p-NIPAAm의 상이한 BSA 봉입 용량을 나타낸 도이다. a)는 초기 BSA 농도, b)는 p-NIBIm/BSA 용액으로부터 획득한 여과액(filtrate) 및 c)는 p-NIPAAm/BSA 용액으로부터 획득한 여과액을 나타낸다.
도 14는 습윤 조건(wet condition) 하에서 p-NIBIm 공중합체의 온도 의존적 마이셀 크기 변화를 나타낸 도이다.
도 15은 p-NIBIm 공중합체의 BSA 봉입 및 방출 거동을 나타낸 도이다. a)는 초기 BSA 농도(5 ㎎/㎖), b)는 체온(37℃)에서 획득한 여과액 및 c)는 42℃에서 획득한 여과액을 나타낸다.
도 16은 37℃에서 0 내지 8 ㎎/㎖ 농도의 p-NIBIm 마이셀과 1일 또는 3일 동안 배양한 HEK 293 세포의 세포생존율을 나타낸 도이다. 데이터는 평균±S.D.로 나타내었다(n = 4).
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<물질>
N-이소프로필아크릴아미드(N-isopropylacrylamide; NIPAAm)는 ACROS(USA)로부터 구입하여 사용에 앞서 헥산(HPLC grade, Sigma-Aldrich, USA)으로 재결정하여 정제하였다. N-비닐이미다졸(N-vinylimidazole; NVIm, Sigma-Aldrich, USA), 1-브로모부탄(1-bromobutane, Sigma-Aldrich, USA), 암모늄 퍼설페이트(ammonium persulfate; APS, Sigma-Aldrich, USA) 및 N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민(N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine; TEMED, Sigma-Aldrich, USA)은 구입하여 추가적인 정제 없이 사용하였다. Bio-Rad DC 단백질 어세이 II 키트는 BMS(Korea)로부터 구입하였다. 모든 다른 시약 및 용매는 분석용 등급(analytical grade)을 구입하여 추가적인 정제 없이 사용하였다.
제조예 1: 이온성 액체( ionic liquid ; IL )로서 1-부틸-3-비닐 이미다졸리움 브로마이드의 합성
N-비닐이미다졸리움계(N-vinylimidazolium-based) 이온성 액체 단량체를 1-브로모부탄을 이용한 N-비닐이미다졸의 간단한 단일-단계 4차화 반응(quaternization reaction)을 통해 제조하였다. 2.35 g(25 mmol) N-비닐이미다졸 및 4.11 g(30 mmol) 1-브로모부탄을 포함하는 반응 혼합물을 100℃로 교반하면서 24시간 동안 가열하였다. 휘발성 물질을 완전히 증발시킨 후 진한 갈색 점성 잔여물(dark brown viscous residue)을 수득하였다. 디클로로메탄을 이용하여 단량체 생성물로서 유기염, 1-부틸-3-비닐이미다졸리움 브로마이드(1-butyl-3-vinyl imidazolium bromide; [BVIm]Br)를 수용액으로부터 추출하였다. 유기상을 증류수(distilled water; DW)로 세척하여 유기 용매를 증발시키고 완전히 진공 건조하여 5.92 g의 노란색 점성 액체를 수득하였다. 수득한 조 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(flash column chromatography, MC/메탄올)로 정제하였다(＞90 중량% 수율).
실시예 1: IL - 도핑된 공중합체, 폴리 ( NIPAAm - co - BVIm ) 또는 p - NIBIm ,의 합성 및 특성분석
p-NIPAAm계 및 N-부틸이미다졸리움 모이어티를 갖는 부분적 양이온성 공중합체, 폴리(NIPAAm-co-BVIm)를 합성하였고, 그 방법을 도 1에 개략적으로 나타내었다. 1.13 g(10 mmol) NIPAAm 및 0.30 g(1 mmol) 1-부틸-3-비닐이미다졸리움 브로마이드([BVIm]Br)를 40 ㎖ 증류수에 용해시키고 개시제(initiator)로서 10 ㎕(0.5 mmol) 암모늄퍼설페이트(APS) 용액(10%(w/v)) 및 활성제(activator)로서 15 ㎕(0.1 mmol) 테트라메틸에틸렌디아민(TEMED)을 상기 용액에 첨가하였다. 중합화에 앞서, 반응 용액을 질소로 최소한 30분 동안 정화하여(purged) 산소를 제거하였다. 80℃에서 24시간 동안 중합화를 수행하였다. 반응이 진행되는 동안 반응 용액은 다소 노란색으로 변하고 점성을 띠었다. 반응이 완결된 후, 수용액으로부터 MC로 추출하고 증류수에 대해 3일 동안 투석(멤브레인 튜빙, 분자량 컷오프 12,000 내지 14,000 Da, Spectrum Laboratories, Savannah, GA, USA)하여 모든 가능한 불순물을 제거한 후 동결건조하였다. 순수한 고체물질(solid mass)로서 공중합체를 수득하기 위하여, 20 ㎖의 차가운 증류수에 투명하게 용해시킨 고분자 생성물을 60℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고 침전된 흰색 고체를 원심분리하여 수용액으로부터 분리하였다. 상기 과정을 3회 더 반복하여 추가 정제하였다. 최종적으로 20 ㎖의 차가운 증류수에 용해시킨 정제된 고분자 생성물을 동결건조하여 흰색 탈지면(cotton wool) 같은 형태로 1.38 g의 고분자 생성물을 수득하였다(약 96.5 중량% 수율).
비교예 1: 참조 고분자로서 폴리 (1-부틸-3- 비닐이미다졸리움 브로마이드), p -BVIm 및 폴리 (N- 이소프로필아크릴아미드 ), p - NIPAAm 의 합성
N-비닐이미다졸리움계 이온성 액체 고분자, p-BVIm 및 폴리(N-이소프로필아크릴아미드), p-NIPAAm를 하기와 같이 합성하였다. 20 mmol 1-부틸-3-비닐이미다졸리움 브로마이드([BVIm]Br) 또는 N-이소프로필아크릴아미드를 20 ㎖ 증류수에 용해시키고 개시제로서 10 ㎕(0.5 mmol) APS 용액(10%(w/v)) 및 활성제로서 15㎕(0.1 mmol) TEMED를 상기 용액에 첨가하였다. 중합화에 앞서, 반응 용액을 질소로 최소한 30분 동안 정화하여(purged) 산소를 제거하였다. 실온에서 1시간 동안 중합화를 수행하였다. 수용액 중의 모든 가능한 불순물을 증류수에 대해 3일 동안 투석(멤브레인 튜빙, 분자량 컷오프 12,000 내지 14,000 Da, Spectrum Laboratories, Savannah, GA, USA)하여 제거하였다. 수득한 p-BVIm 조 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(MC/메탄올)로 정제하는(＞90-80 중량% 수율) 한편, 메틸렌 클로라이드로 서너번 세척하여 순수한 p-NIPAAm를 수득하였다.
실시예 2: 고분자의 특성 분석
2.1. 화학적 특성
FT-IR(Nicolet 380, Thermo Fisher, USA) 및 1H-NMR(Bruker, Ultrashield 400 PLUS, USA) 분광법을 이용하여 상기 실시예로부터 합성한 단량체 및 고분자 생성물의 화학적 특성분석을 수행하였다. FT-IR 스펙트럼은 에탄올에 용해시킨 공중합체 용액(5 중량%)으로 코팅한 KBr 윈도우를 사용하여 측정하였다. 생성물의 1H-NMR 스펙트럼은 용매로서 d6-디메틸술폭사이드를 이용하여 400 MHz에서 측정하였다.
본 발명에 있어서, 주요 부분(major part)으로서 상대적으로 소수성인 NIPAAm 성분(component) 및 부수적 부분(minor part)으로서 친수성(이온성) N-비닐이미다졸리움 성분(이미다졸리움계 이온성 액체)을 갖는 영구적 이온성 및 온도 감응성 공중합체를, 합성 약물, 유전자 및 단백질을 포함하는, 특히 음으로 하전된(또는 이온성 또는 고도의 극성) 게스트 분자를 위한 전달체로서 고안하고 합성하였다(도 1). 도 1에 나타난 바와 같이, NIPAAm와 1-부틸-3-비닐이미다졸리움 브로마이드([BVIm]Br)의 10:1 몰비로의 공중합화를 통해 IL 모이어티의 p-NIPAAm 고분자 사슬 내로의 화학적 통합(chemical integration)을 달성하였다. 실질적으로, 공중합체 사슬 내에서 양으로 하전된(또는 친수성) 이미다졸리움 모이어티 농도를 조절하는 것은 물에 대한 용해도, LCST, 표면전하, IEP에서 pH, 마이셀 크기, 적정 온도에서 게스트 분자-교환(또는 -부착 및 -탈착) 능력 및 약물전달에 대한 능력과 같은 열감응성 약물-전달체의 가장 중요한 물리화학적 및 형태학적 성질을 조절하는 효과적인 방법일 수 있다. 공중합화에 앞서, N-비닐이미다졸과 1-브로모부탄의 C-N 커플링을 통해 N-비닐이미다졸리움계 이온성 액체 단량체([BVIm]Br; 1-부틸-3-비닐이미다졸리움 브로마이드)를 준비하였다(도 2의 1H-NMR 스펙트럼 참조). 이후 10 몰% [BVIm]Br 단량체를 이용하여 NIPAAm 단량체와의 공중합화를 수행하여 폴리(NIPAAm-co-BVIm) 또는 p-NIBIm를 제조하였다. 전술한 바와 같이, 친수성 IL 단위의 화학적 도핑은 순수한 p-NIPAAm 고분자에 비해 열민감성 고분자의 가장 중요한 물리화학적 성질을 변화시킬 수 있을 것으로 여겨지므로, 가장 적합한 LCST 범위(38 내지 42℃) 및 우수한 약물-전달 능력을 나타내기 위한 제조된 공중합체 사슬 내에서 양이온성 단위의 최적의 농도(10 몰%)를 IL 단량체 농도를 0으로부터 10 몰%까지 점차적으로 증가시킴으로서 결정하였다.
공중합체 p-NIBIm 내에서 두가지 성분, NIPAAm 및 [BVIm]Br의 존재를 확인하기 위하여, FT-IR(도 3) 및 1H-NMR 스펙트럼(도 2 및 4)을 얻고 단일 고분자(homopolymer), p-NIPAAm 및 p-BVIm의 것과 비교하였다. 그 결과, FR-IR 스펙트럼에서 p-NIBIm의 특성 피크가 하기와 같이 관찰되었다: 3030~2874 cm-1(BVIm 단위의 sp2 C-H 신장(stretching); NIPAAm 및 BVIm 단위의 sp3 C-H 신장), 1670~1580 cm-1(NIPAAm 단위의 C=O 신장 및 BVIm 단위의 C=C 및 C=N 신장), 1535 cm-1(NIPAAm 단위의 C(=O)-N-H 굽힘(bending)), 1458 cm-1(NIPAAm 및 BVIm 단위의 CH2 굽힘), 1366 cm-1(NIPAAm 및 BVIm 단위의 CH3 굽힘), 및 1030~1300 cm-1(NIPAAm 및 BVIm 단위의 C-N 신장). 상기 특성 피크와 더불어, 물의 넓은 특성 밴드가 p-NIBIm 시료에 대해 3200~3600 cm-1에서 나타났으며, 이는 공중합체성 유도체의 친수성을 나타내는 것이다. p-NIBIm 공중합체의 1H-NMR 스펙트럼을 도 4에 나타내었다. 이는 NIPAAm 및 BVIm 단량체 단위의 양성자에 속하는 특성 피크를 나타내었다. 공중합체 사슬을 구성하는 2가지 단량체 단위의 몰비를 확인하기 위하여, 넓은 신호들(NIPAAm 단위의 이소프로필 CH 양성자에 대한 3.84 ppm에서의 피크 및 BVIm 단위의 N-CH2 양성자에 대한 4.15 ppm)의 적분을 비교하였다. 스펙트럼에서 적분은 각각 10 및 2였으며, 이는 공중합체 p-NIBIm이 10 NIPAAm 단위 당 약 1 BVIm 단위를 포함함을 나타내는 것이다. 결론적으로, FT-IR 및 1H-NMR 스펙트럼으로부터 NIPAAm 단량체와의 공중합화에 있어서 BVIm 단량체가 효과적으로 통합되었음을 확인하였다.
2.2. 평균 분자량 결정
양이온성 공중합체의 평균 분자량을 결정하기 위하여 MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption ionization time of flight) 질량 분광법(Voyager-DE STR; Negative Polarity)을 이용하였다. 10 mg 공중합체 시료를 1 ㎖ 물에 용해시키고 α-시아노-4-히드록시신남산(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid; HCC) 기질 용액과 1:9의 비율(v/v, 고분자 : 기질(matrix))로 혼합하였다. MALDI-TOF 중량 스펙트럼은 공중합체의 상응하는 평균 분자량(corresponding average molar mass)을 나타내었다.
구체적으로, MALDI-TOF 질량분광법을 이용하여 IL-도핑된 공중합체, p-NIBIm의 분자량 분포를 결정하고 그 결과를 참조로서 각각 NIPAAm 및 [BVIm]Br 단량체로부터 동일한 방법으로 준비한 p-NIPAAm 및 p-BVIm에 대한 결과와 비교하였다. 도 5 및 6에 나타난 바와 같이, 공중합체의 수평균 및 질량평균 분자량(Mn 및 Mw)은 각각 약 1353 및 2001 g/mol로 확인되었으며, 분자량 분포(Mw/Mn)는 1.47이었다. 한편, p-NIPAAm의 Mn 및 Mw은 각각 약 1998 및 2521 g/mol, Mw/Mn = 1.26이었다. p-BVIm의 경우, Mn 및 Mw은 약 2102 및 2114 g/mol로 기록되었다(Mw/Mn = 1.0).
2.3. IL - 도핑된 공중합체, p- NIBIm 의 열적 거동 및 이의 LCST( lower critical solution temperature ) 결정
상기 실시예에 따라 제조된 고분자의 열적거동을 DSC(DSC 131 evo, setaram, France)를 이용하여 확인하였다. 증류수에 용해시킨 시료 고분자 수용액을 5.0 중량% 농도로 준비하였다. 흡열성 및 발열성 피크는 각각 25℃ 내지 60℃ 사이에서 2℃/분의 속도로 가열 및 냉각하는 과정에서 각각 나타났다.
구체적으로, IL-도핑된 공중합체, p-NIBIm의 열적 거동을 DSC를 이용하여 확인하고, 이를 참고로서 합성한 단일 고분자, p-NIPAAm 및 p-BVIm에 대한 결과와 비교하였다. 그 결과, p-NIPAAm의 수용액 시료(5 중량%)는 가열 과정에 있어서 32.1℃(LCST)에서 흡열피크 및 냉각 과정에 있어서 29.0℃에서 발열피크를 나타내었다(도 6a). 반면, p-BVIm의 경우에는 5℃로부터 60℃까지 범위의 온도에서 어떠한 상전이도 나타나지 않았다. 그러나, IL-도핑된 공중합체는 서너번의 연속적인 가열 및 냉각 순환을 통해 확인한 바, 명확한 상전이 및 우수한 가역성(reversibility)을 나타내었다(도 6b 및 7a). 도 6b에는 가열 과정에서 공중합체 생성물의 흡열피크가 38.2℃(LCST)에서 나타났으며, 냉각 과정에서 발열피크가 36.2℃에서 나타났다. p-NIBIm의 온도 반응적 성질(temperature responsive property)은 IL-도핑된 공중합체 내에서 상대적 소수성(또는/및 비이온성) 및 친수성(또는/및 이온성) 부분의 공존에 의해 유도될 수 있다. p-NIBIm에 대한 상대적으로 넓은 피크는 공중합체 분자 내에서 이미다졸 단위의 다소 상이한 농도(분포)와 관련된 것으로 여겨진다. 또한, 마이셀을 구성하는 공중합체의 양이온성 단위(이미다졸리움 단위) 간의 반발(repulsion)이 마이셀의 상전이 온도를 증가시킴으로써 공중합체 마이셀의 LCST의 p-NIPAAm 마이셀에 비해 더 높은 온도로의 이동을 유발할 수 있다. 이론적으로, p-NIPAAm 내로 약 1.0 몰% BVIm 단위의 도핑은 약 0.6℃ 만큼의 LCST 증가를 나타내었다. 상전이 온도가 체온(37℃)과 고열온도(42℃) 사이에 있으므로 p-NIBIm에 대해 얻어진 LCST 값(38.2℃)은 생체 내 적용에 있어서 매우 의미있는 것이다. 이러한 형태의 LCST 이동은 또한 아민 작용기를 갖는 열-민감성 고분자의 LCST가 산성 주변 조건 하에서 양성자화에 의해 더 높은 온도로 이동한다는 기존의 보고와도 부합하는 것이다. 그러나, 이와 달리, 영구 양이온성 모이어티를 갖는 p-NIBIm 공중합체는 산성 pH 환경(pH 4 내지 5)에 의해 영향을 받지 않으며, 이들의 LCST 값 또한 변하지 않는다(도 7b). 이는 표적 자리로 정확하게 약물을 전달하기 위한 효율적인 시스템으로서 적용 가능성을 나타내는 것이다. 이로부터, 고분자 사슬 내로의 영구적 양이온성 모이어티의 도입은 봉입효율 및 표적 자리로 약물분자의 전달 안정성을 증가시키는데 매우 효과적임을 확인할 수 있었다.
2.4. 부분 이온성 공중합체, p- NIBIm 의 표면전하
IL-도핑된 p-NIBIm 공중합체의 양이온적 특성을 확인하기 위하여, p-NIPAAm, p-NIBIm 및 p-BVIm의 제타(ξ) 전위 값을 실온의 0.1M 아세트산 및 0.2M 소디움 아세테이트의 완충계에서 Zeta Sizer를 이용하여 pH(3 내지 10)의 함수로 측정하였다. 도 8에 나타난 바와 같이, 초기 비이온성 고분자, p-NIPAAm은 pH= 8.6에서 등전점(isoelectric point; IEP) 및 IEP(pH=4에서 약 11.5 mV의 최대값) 미만의 양성 제타 전위값을 나타내었다. 이는 아미드 작용기로 구성된 고분자 사슬(및 이의 LCST)이 pH-의존적이며 중성 조건에서 약한 양전하를 띰을 나타내는 것이다. 그러나, IL-도핑된 공중합체, p-NIBIm의 경우에 있어서, pH 4 내지 10의 범위에서 IEP가 나타나지 않았으며, 이는 외부 pH 변화와 무관하게 영구적 양전하를 가짐을 나타내는 것이다. pH 4 내지 10의 범위에서 p-NIBIm의 제타 전위 변화는 단지 약 8 mV였으며, 이는 양이온성 BVIm 모이어티의 단지 10 몰%가 공중합체 마이셀의 전하 및 LCST에 영향을 주는 주요 인자임을 의미한다. 이러한 결과는 pH-비의존적 양이온성 BVIm 모이어티 및 약한 pH-의존적 NIPAAm 모이어티의 공존에 의해 야기될 수 있다. NIPAAm 모이어티만이 공중합체 마이셀의 전하 및 LCST에 다소 영향을 주는 양성자화 또는 탈양성자화 과정에 반응하였다. 추가로, 도 4로부터 100% BVIm 단위로 구성된 다중 양이온성(poly-cationic) IL-폴리머, p-BVIm이 pH 7에서 약 32.5 mV의 극히 높은 제타 전위 값 및 pH 4 내지 10의 범위에서 제타 전위 값의 pH-비의존적 거동을 나타냄을 확인하였다. 증가하는 농도로 BVIm 단위를 포함하는 3가지 다른 고분자는 pH 7에서 예컨대, p-NIPAAm에 대해 +0.3 mV, p-NIBIm 에 대해 +9.8 mV 및 p-BVIm 에 대해 +32.5 mV의 증가하는 제타 전위 값을 나타내었다.
Terbiscan LAb에 의해 p-NIBIm 공중합체 용액(0.5 ㎎/㎖)의 콜로이드 안정성을 확인하였다. 구체적으로, 수용액을 72시간 동안 37℃에서 12회 스캔하였다. 880 nm 파장의 펄스 근적외선 광원(pulsed near infrared light source)의 후산란광(backscattered light)(또는 투과; or transmission)을 측정하여 확인하였다(도 9). 전체 스캔 시간 동안, 시료 용액에 의한 후산란된 광흐름(light flux)의 어떠한 감지할만한 변화도 관찰되지 않았으며, 이는 용액 중에서 p-NIBIm 공중합체 마이셀이 고도로 안정하고 균일하게 분산되어 있음을 나타내는 것이다. 후반 스캐닝 시간 중에 발생하는 광흐름의 변동(fluctuations)은 37℃의 닫힌 반응계sodptj 형성된 공기 방울에 의해 유발되었다.
실시예 3: BSA 분자를 불포함 또는 포함하는 고분자 마이셀의 평균 크기 및 제타전위의 결정
습윤 조건 하에서 게스트 분자(BSA)를 포함 또는 불포함하는 고분자 마이셀의 평균 크기를 25℃ 내지 45℃ 사이에서 3℃ 간격으로 가열과정 동안 Zeta Sizer nano ZS90(Malvern, France)를 이용하여 측정하였다. 1.0 mg BSA를 포함 또는 불포함하는 1.0 ㎖ 고분자 수용액(0.01 중량%, 4℃에서 제조)을 완충제로 0.1M 아세트산 및 0.2M 소디움 아세테이트의 혼합물을 이용하여 제조하였다. 가우시안 형태의 곡선으로 이들의 크기 분포 곡선을 얻었다. 모든 경우에서 크기 분포 곡선은 최대값을 가로지르는 수직선에 대해 거의 대칭이었다. 최대값은 평균크기이며, 기저(base)로부터 양끝 사이의 거리는 표준편차를 반영한다. 건조상태에서 BSA 분자를 포함 또는 불포함하는 마이셀의 형태를 SEM(S-4300, HITACHI, Japan)으로 분석하였다. 이를 위하여, 고분자 용액(0.1 mg/㎖)을 커버글라스 상에 떨어뜨리고 암실에서 25℃ 및 50℃로 밤새도록 건조시켰다. Zetasizer(ZEN 3600, Malvern)로 실온에서 완충제로 0.1M 아세트산 및 0.2M 소디움 아세테이트의 혼합물을 이용하여 pH의 함수(pH 3 내지 10)로 제타(ξ) 전위 값을 기록하였다. 원하는 pH를 HCl 또는 NaOH 용액으로 조절하고 pH-측정기(Orion 3 star, thermo scientific, Singapore)로 pH 값을 측정하였다. 모든 측정은 각 실험군에 대해 최소 3회 반복하여 수행하고 평균값을 표준편차와 함께 나타내었다.
실시예 4: 체온에서 p- NIBIm 의 콜로이드 안정성 결정
TurbiScane LAb(Leanontech, 펄스 적외선 광원; 880 nm)을 이용하여 p-NIBIm 용액의 콜로이드 안정성을 확인하였다. 35 mm 높이의 공중합체 용액(0.5 ㎎/㎖)을 37℃에서 길이방향으로 매 6시간 마다 72시간 동안 스캔하였다. 시료 용액에 의해 후산란된(투과된) 빛(135°)을 측정하였다.
실시예 5: IL - 도핑된 공중합체 마이셀 , p- NIBIm 및 이의 BSA 와의 복합체, p-NIBIm/BSA의 온도에 따른 크기 및 형태 변화
습윤 조건 하에서 25℃로부터 45℃까지 범위에서 온도 변화에 따른 p-NIBIm 마이셀 및 p-NIBIm/BSA 복합체 마이셀의 크기(또는 부피) 변화를 Zeta Sizer로 확인하였다. 구체적으로, BSA를 포함(1.0 중량%) 또는 불포함하는 IL-도핑된 공중합체, p-NIBIm의 수용액 시료(0.1 중량%)를 기기에 주입하였다. 도 5에 나타난 바와 같이, 순수한 p-NIBIm 시료의 마이셀 부피는 온도가 25℃로부터 45℃까지 증가함에 따라 약 8.09×10-15 cm3(직경에 있어서 253±12.1 nm로부터 90.5±7.8 nm로 감소)만큼 감소하였다. 이때, 25 내지 37℃ 사이에서 느린 감소를 나타내었으며, LCST(38 내지 39℃) 근처에서는 빠른 수축을 나타내었다. 상기 크기 감소는 팽창된 소구체(swelled globules)의 상전이 및 소형 구체(compact globules)로의 부피 축소에 기인한다. 반면, 비이온성 고분자, p-NIPAAm는 동일한 온도 조건 하에서 단지 3.05×10-15 cm3(직경에 있어서 180.6±5.1 nm로부터 39.8±3.6 nm로 감소)의 부피 수축을 나타내었으며, 31℃ 미만에서 약간의 초기 감소를 갖는 LCST(32 내지 34℃) 근처에서 빠른 감소된 팽창(rapid deswelling)을 나타내었다(도 10). 영구양전하(permanent positive charge)를 갖는 공중합체 p-NIBIm는 p-NIPAAm에 비해 하기와 같은 성질을 나타내었다: 약 6℃ 더 높은 LCST, 테스트한 전체 온도 범위에서 직경에 있어서 1.4 내지 2.3배 더 큰 마이셀 크기 및 cm3 단위에서 약 2.7배 더 큰 부피 수축. 전술한 바와 같이, p-NIBIm의 분자량(Mn, Mw)은 p-NIPAAm의 분자량 보다 작았다. 그럼에도 불구하고, 마이셀 직경의 증가는 공중합체 마이셀 내부에서 양전하를 띤 이미다졸리움 고리 간의 강한 반발력에 의해 야기될 수 있다. 또한, 테스트한 온도 범위(25 내지 45℃)에서 IL-도핑된 공중합체(p-NIBIm)의 마이셀 수축 수준이 비이온성 고분자(p-NIPAAm)에 대한 수축 수준보다 훨씬 더 높음을 인지해야만 한다. 상기 모든 결과는 LCST 아래에서 팽창된 마이셀로 존재할 수 있는 p-NIBIm 공중합체가 양으로 하전된 호스트 분자와 음으로 하전된 게스트 분자 간의 전하-전하 상호작용에 의해 약물, 유전자 및 단백질을 포함한 음으로 하전된 분자에 대해 높은 흡착효율을 나타낼 수 있을 것으로 기대할 수 있다. 또한, LCST에서 높은 수준의 마이셀 수축은 팽창된 소구체로부터 비용매화된(desolvated) 소형 구체로의 열-감응성 상전이를 통한 봉입된 게스트 분자의 효율적인 방출이 가능함을 나타내는 것이다.
다음으로 IL-도핑된 p-NIBIm 마이셀이 LCST 미만 및 초과하는 온도에서 음으로 하전된 모델 분자로서 단백질 BSA를 각각 봉입 및 방출할 수 있는지를 확인하였다. 구체적으로, 단백질 BSA를 포함하는 수용성 p-NIBIm 시료의 온도 의존적 마이셀 크기 변화를 Zeta Sizer를 이용하여 25 내지 45℃ 범위에서 확인하고(도 5), p-NIPAAm에 대한 결과와 비교하였다(도 10). 0.1 mg 고분자, p-NIBIm 또는 p-NIPAAm 및 1.0 mg BSA를 포함하는 1.0 ㎖ 복합체 수용액을 기기에 주입하였다. 도 5 및 도 10에 나타난 바와 같이, 25℃에서 p-NIBIm/BSA 및 p-NIPAAm/BSA 복합체 마이셀의 크기는 각각 직경에 있어서 491.0±7.2 nm 및 332.0±9.8 nm로 나타났으며, 평균 부피는 각각 약 62.0×10-15 cm3 및 19.1×10-15 cm3로 나타났다. 각각의 LCST를 초과하여 추가로 온도를 증가시켰을 때, p-NIBIm/BSA 복합체 마이셀의 부피는 약 61.9×10-15 cm3 만큼 감소하였으며(직경에 있어서 25℃에서 491.0±7.2 nm로부터 45℃에서 55±6.5 nm로 변화), 25 내지 37℃ 사이에서 느린 감소 및 LCST 근처(37 내지 42℃)에서 빠른 수축을 나타내는 한편, p-NIPAAm/BSA 복합체 마이셀은 부피에 있어서 약 18.7×10-15 cm3의 감소를 나타내었으며(직경에 있어서 25℃에서 332±9.8 nm로부터 45℃에서 89±5.7 nm로 변화), 25 내지 39℃ 사이에서 느리고 일관적인 감소를 나타내었다. p-NIBIm/BSA 복합체 마이셀은 LCST 근처의 특정한 범위(38 내지 42℃)에서 강하게 수축하는 반면, p-NIPAAm/BSA 복합체 마이셀은 25 내지 45℃의 전체 범위에 걸쳐 지속적으로 수축하였다. p-NIPAAm/BSA 복합체 마이셀에 비해 p-NIBIm/BSA 복합체 마이셀의 약 3.3 배 더 큰 부피 및 부피 축소는 더 높은 약물의 봉입 및 방출 용량을 반영하는 것이다.
한편, 수용액에서 p-NIBIm 마이셀의 온도 의존적 형태 변화를 SEM으로 확인하였다. 25℃(LCST 미만) 및 50℃(LCST 초과)에서 유리기재 상에 수용액 시료(0.01 중량%) 방울을 건조시켜 시료를 준비하였다. 도 11a 및 11b에 나타난 바와 같이, SEM 이미지는 25℃에서 건조한 시료에서 섬유성 다발-유사 응집체(약 3 μm 미만의 길이)을 나타내었다. 공중합체 분자는 저온에서 수화된 불규칙 나선(hydrated random coils) 또는 팽창된 소구체로 존재하였으며, 상기 나선 또는 팽창된 소구체는 건조 과정 동안 섬유성 다발-유사 응집체로 모이거나 붕괴될 수 있다. 건조 온도를 50℃까지 증가시켰을 때, 섬유성 다발-유사 형태는 직경 500 nm 미만의 소형 구체로 급격히 변화하였다. SEM 이미지를 자세히 관찰하면, 상기 소형 구체는 서너개의 직경 200 nm 미만의 더 작은 구체의 응집인 것을 확인할 수 있다.
또한 BSA와의 복합체 형성 후 형태 변화를 SEM으로 확인하였다. 구체적으로, 0.01 mg 고분자 및 0.1 mg BSA를 함유하는 1.0 mL 고분자-BSA 복합체 수용액(0.011 wt%)을 사용하였다. 25℃에서 건조 후, 섬유상 다발-유사 응집체(길이 약 3 μm 미만)로부터 구형 응집체(직경 약 1.5 μm 미만)로의 현저한 형태적 변화 및 구형 응집체 내부에 봉입된 BSA 분자의 응집체가 관찰되었다(각각 도 4c의 빨간- 및 파란-화살표 참조). 구형 응집체는 느슨한 공간을 가지며, 이는 25℃의 습윤 조건 하에서 다량의 BSA 분자가 봉입된 팽창되고 수화된 소구체로서 존재함을 나타내는 것이다. 도 4d에 나타난 바와 같이, 소형 구체-유사 응집체(compact globule-like aggregates)는 또한 50℃의 더 높은 건조 온도에서 나타났으며, 이들의 평균 크기 또한 BSA를 포함하지 않는 자유 p-NIBIm 응집체의 크기(직경 약 200 nm 미만)까지 회복되었다. 나아가, 가열 과정 동안 대량의 BSA가 봉입된 팽창된 소구체로부터 상전이 및 크기 수축을 통해 방출되는 BSA 응집체의 큰 규모 또한 확인하였다. 결과적으로, SEM 결과는 형태 및 크기 변화가 25 내지 50℃ 범위에서 팽창된 소구체로부터 탈용매화된 소형 구체로 p-NIBIm 마이셀의 열-감응성 상전이를 통해 일어나는 p-NIBIm 마이셀의 온도-의존적 BSA 봉입 및 방출거동과 관련됨을 나타낸다.
실시예 6: p- NIBIm 의 온도 의존적 BSA 봉입 및 방출량의 결정
고분자 마이셀 내에 온도-의존적으로 봉입되는 및 마이셀로부터 방출되는 BSA 분자의 양은 Bio-Rad DC 어세이를 이용하여 결정할 수 있다. Bio-Rad DC-단백질 어세이는 계면활성제 가용화(detergent solubilization)에 이어지는 변형된 로리 단백질 어세이법(modified Lowry protein assay method)에 기초한 비색분석법(colorimetric assay)이다. 용액 시료 중의 BSA의 양은 펩타이드 용액에 대한 0.20 내지 1.0 mg/㎖ 범위에 걸친 검정곡선을 이용하여 결정하였다. 4℃에서 1.0 ㎖ 고분자 수용액(0.1w/v%) 및 1.0 ㎖ BSA 수용액(1.0 w/v%)을 조합하여 3가지 시료 용액을 준비하였다. 시료 용액을 각각 25, 36 및 42℃의 수조에서 인큐베이션하고 각 온도에서 실린지를 구비한 PTFE 막여과기(0.1 ㎛ pore size, Advantec, Japan)를 통해 여과하였다. 100 ㎕의 각각의 여과액(filtrate solution)을 3개의 새로운 튜브에 넣고, 500 ㎕ 시약 A'(20㎕ 시약 S 및 1.0 ㎖ 시약 A의 혼합물) 및 4 ㎖ 시약 B를 각 튜브에 첨가한 후 즉시 볼텍싱하였다. 15분 후, UV-vis 분광광도계(1601PC, Shimadzu)를 이용하여 750 nm에서 각 시료의 흡광도를 측정하였다. 모든 측정은 각 실험군(25, 36 및 42℃에서)에 대해 최소 3회 반복하여 수행하고 평균값을 표준편차와 함께 나타내었다.
전술한 바와 같이, Bio-Rad DC-단백질 어세이를 이용하여 봉입된 및 방출된 BSA 농도를 정량적으로 분석하였다. 구체적으로, 1.0 mg 열감응성(thermo-sensitive) 고분자(p-NIBIm 또는 p-NIPAAm) 및 10 mg BSA 분자를 포함하는 3가지 수용액 시료(2 ㎖)를 4℃에서 제조하고 상기 3개 시료의 온도를 각각 25℃(실온), 37℃(체온) 및 42℃(임상적 고열온도; clinical hyperthermic temperature)까지 서서히 증가시켰다. 각 시료 용액을 각각의 온도에서 PTFE 막여과기(0.1 ㎛ pore size, Advantec, Japan)를 구비한 실린지 필터를 통해 빠르게 여과하고, 각 여과액에 DC 단백질 어세이 시약을 첨가하여 λmax=750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 기지의 BSA 농도를 x 축에 λmax=750 nm에서 BSA/DC 복합체의 흡광도를 y 축에 플롯하여 작성한 표준 곡선을 이용하여 여과액 중의 및 고분자 마이셀에 봉입된 BSA 농도를 계산하였다(도 12). 도 13는 25℃에서 p-NIBIm와 p-NIPAAm 시료의 상이한 BSA-봉입 용량을 나타낸다. 1.0 mg p-NIBIm 고분자에 봉입된 BSA 양은 p-NIPAAm의 경우에 보다 5배 더 많은 것으로 나타났다. 예컨대, p-NIBIm에 대해 3.28 mg, p-NIPAAm에 대해 0.64 mg이었다. 이와 같은 정량적 분석 결과는 25℃에서 Zeta Sizer에 의해 측정한 마이셀 부피 증가에 대한 결과와 일치하였다(도 14). 이는 p-NIBIm 마이셀의 더 높은 BSA 흡착 능력이 공중합체 사슬의 팽창된 마이셀 내에서의 음으로 하전된 BSA 분자와 양으로 하전된 이미다졸리움 고리 간의 전하-전하 상호작용에 기인함을 나타낸다.
37℃의 마이셀 내에 남아있는 BSA 농도 및 38 내지 42℃ 사이에서 마이셀로부터 추가로 방출되는 BSA 농도를 각각 p-NIBIm 고분자 시료에 대한 봉입된 및 방출된 BSA 양으로 취하였다. 따라서, p-NIBIm에 대한 BSA 분자의 봉입 및 방출 테스트를 4℃에서 준비한 시료 용액의 온도를 체온(37℃) 및 임상적 고열온도(42℃)까지 상승시킴으로써 수행하였다. 도 15에 나타난 바와 같이, 2개 p-NIBIm/BSA 용액 시료의 온도를 각각 37 및 42℃까지 증가시켰을 때, 각각 1.4 mg 및 0.38 mg의 BSA가 공중합체 마이셀 내에 잔존하였다. 이는 1.0 mg p-NIBIm가 체온에서 1.4 mg BSA를 봉입할 수 있고 38 내지 42℃ 사이에서 팽창된 공중합체 마이셀의 감소된 팽창 과정을 통해 37℃의 마이셀 내에 남은 BSA 양의 1.02 mg(72.9 %)을 압출할 수 있는 반면, p-NIPAAm 마이셀은 25℃에서 단지 0.64 mg을 봉입하고 체온 미만에서 거의 모든 BSA 분자를 압출할 수 있음을 나타낸다. 결론적으로, p-NIBIm은 체온 내지 고열온도 사이에서 표적 사이트로 1.0 mg 고분자 당 약 1.0 mg 약물을 전달할 수 있으므로 IL-도핑된 공중합체 p-NIBIm는 p-NIPAAm와 달리 BSA 단백질과 같은 음으로 하전된 분자의 스마트 전달 시스템으로 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
실시예 7: 세포독성 어세이
제조업자(Dojindo Laboratories, Japan)의 지시에 따라 세포 계수용 키트(Cell Counting Kit-8; CCK-8)를 이용하여 p-NIBIm의 세포독성을 확인하였다. 인간 배아 신장 세포주(human embryonic kidney cell line), HEK 293은 American Type Culture Collection(ATCC, USA)으로부터 구입하였으며, 약 90% 및 5% CO2를 포함하는 습식인큐베이터에서 37℃에서 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS; Gibco, USA), 100 U/㎖ 페니실린 및 100 g/㎖ 스트렙토마이신(Gibco, USA)을 포함하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium; Sigma, USA)을 이용하여 유지하였다. 세포독성을 확인하기 위하여, HEK 293 세포 현탁액 100 ㎕를 5×103 세포/웰의 농도로 96-웰 마이크로플레이트에 분주하고 밤새도록 전배양하였다. 배양배지로 2-배 연속 희석하여 8 ㎎/㎖ 내지 0.03125 ㎎/㎖ 범위의 일련의 농도의 p-NIBIm 마이셀 용액을 준비하였다. 각 농도의 용액을 10 ㎕씩 각 웰에 첨가하고(n=4), 1 내지 3일 동안 계속하여 배양하였다. 각 시점에서, 각 웰에 CCK-8을 10 ㎕ 첨가하고 2시간 더 배양한 후, 마이크로플레이트 리더(PerkinElmer, USA)를 사용하여 450 nm에서 흡수파장에서 광학밀도(optical density; OD)를 측정하였다. 하기의 수식을 이용하여 세포생존율을 계산하였다: 세포생존율(cell viability; %)=(ODp - NIBim/ODcontrol)×100, 상기 ODcontrol 및 ODp - NIBim은 각각 고분자 부재시 및 고분자 존재시 측정값이다.

Claims (19)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 제1단위체 및 알킬비닐이미다졸리움 화합물을 포함하는 제2단위체를 포함하는 약물전달체 제조용 온도감응성 및 양이온성 랜덤 공중합체로서,
    전체 공중합체를 구성하는 단량체에 대해 알킬비닐이미다졸리움 화합물을 10 내지 17 몰% 포함하여,
    38℃ 내지 42℃의 LCST(lower critical solution temperature)를 갖는 것인 랜덤 공중합체:
    [화학식 1]
    Figure 112016023433466-pat00003

    상기 식에서,
    R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소 또는 직쇄 또는 분지쇄 C1-15-알킬;
    R3은 직쇄 또는 분지쇄 C1-15-알킬렌;
    X는 수소, 또는 직쇄 또는 분지쇄 C1-15-알킬이 치환 또는 비치환된 아크릴아미도이며,
    비닐기를 통해 중합함.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 화학식 1의 화합물은 N-알킬아크릴아미드, N-알킬메타크릴아미드 또는 N,N'-알킬렌비스아크릴아미드로서, 상기 알킬은 직쇄 또는 분지쇄 C1-15-알킬이고, 상기 알킬렌은 직쇄 또는 분지쇄 C1-15-알킬렌인 것인 온도감응성 및 양이온성 랜덤 공중합체.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 화학식 1의 화합물은 N-이소프로필아크릴아미드인 것인 온도감응성 및 양이온성 랜덤 공중합체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 알킬비닐이미다졸리움 화합물은 상대 음이온(counter anion)으로 할라이드, PO4 3-, SO4 2-, NO3 -, AcO-, BF4 -, SbF6 2-, PF6 -, OTf-(CF3SO3 -) 또는 NTF2 -(N(CF3SO2)2 -)를 포함하는 것인 온도감응성 및 양이온성 랜덤 공중합체.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 제1단위체 및 알킬비닐이미다졸리움 화합물을 포함하는 제2단위체를 포함하는 온도감응성 및 양이온성 공중합체의 제조방법으로서,
    비닐이미다졸을 알킬 화합물과 반응시켜 알킬비닐이미다졸리움 화합물을 준비하는 제1단계; 및
    상기 알킬비닐이미다졸리움 화합물을 하기 화학식 1로 표시되는 화합물과 공중합화하는 제2단계를 포함하는 온도감응성 및 양이온성 공중합체의 제조방법으로서,
    상기 공중합화는 개시제의 존재 하에 또는 UV 조사에 의해 개시되는 것인 제조방법:
    [화학식 1]
    Figure 112016023433466-pat00004

    상기 식에서,
    R1 내지 R3 및 X는 청구항 제1항에 정의된 바와 같음.
  8. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 제1단위체 및 알킬비닐이미다졸리움 화합물을 포함하는 제2단위체를 포함하는 온도감응성 및 양이온성 공중합체의 제조방법으로서,
    단량체로서 하기 화학식 1로 표시되는 화합물과 비닐이미다졸을 공중합화하는 제1단계; 및
    상기 제1단계로부터 형성된 공중합체를 알킬 화합물과 반응시켜 이미다졸의 질소원자에 알킬기를 도입하는 제2단계를 포함하는 온도감응성 및 양이온성 공중합체의 제조방법:
    [화학식 1]
    Figure 112015072183102-pat00005

    상기 식에서,
    R1 내지 R3 및 X는 청구항 제1항에 정의된 바와 같음.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    상기 알킬 화합물은 할라이드, PO4 3-, SO4 2-, NO3 -, AcO-, BF4 -, SbF6 2-, PF6 -, OTf-(CF3SO3 -) 또는 NTF2 -(N(CF3SO2)2 -)를 포함하는 것인 온도감응성 및 양이온성 공중합체의 제조방법.
  10. 제8항에 있어서,
    공중합화는 개시제의 존재 하에 또는 UV 조사에 의해 개시되는 것인 온도감응성 및 양이온성 공중합체의 제조방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 개시제는 유기과산화물, 산화환원제, 퍼설페이트 또는 아조화합물인 것인 온도감응성 및 양이온성 공중합체의 제조방법.
  12. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    공중합화하는 단계는 활성제를 추가로 포함하는 것인 온도감응성 및 양이온성 공중합체의 제조방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 활성제는 테트라메틸에틸렌디아민(TEMED), 암모늄설페이트, 리보플라빈, 리보플라빈-5'-포스페이트, 2-히드록시-2-메틸프로파논 및 2,2-디에톡시아세토페논 또는 이들을 조합인 것인 온도감응성 및 양이온성 공중합체의 제조방법.
  14. 제1항에 기재된 온도감응성 및 양이온성 랜덤 공중합체에 의해 형성된 마이셀; 및 상기 마이셀 내에 담지된 약물을 포함하는 약물 전달체.
  15. 제1항에 기재된 온도감응성 및 양이온성 랜덤 공중합체에 의해 형성된 하이드로겔; 및 상기 하이드로겔 내에 담지된 약물을 포함하는 약물 전달체.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서,
    38℃ 내지 42℃의 병변에서 특이적으로 약물을 방출하는 것인 약물 전달체.
  17. 삭제
  18. 제14항 또는 제15항에 있어서,
    상기 약물전달체는 주사제 형태인 것인 약물 전달체.
  19. 제14항 또는 제15항에 있어서,
    상기 약물은 단백질, 유전자, 이외의 음이온성 약물, 또는 극성 약물인 것인 약물 전달체.
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