CN110563863B - 两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物及其可逆交联胶束及制备与应用 - Google Patents

两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物及其可逆交联胶束及制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医用高分子聚合物材料技术领域，特别涉及一种两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物及其可逆交联胶束及制备与应用。所述的两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物，具体有如式Ⅰ所示结构。本发明还提供了一种基于两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物的可逆交联胶束系统，该系统的羧酸结构内核能够高效地负载水难溶性药物。该系统负载药物后，在血液等正常生理环境下，胶束的星型交联结构，具有较强的抵抗溶液稀释的能力，有效地抑制了药物的过早释放而导致的毒副作，当到达肿瘤细胞内部，通过pH/还原双重刺激响应，极大地提高了靶向快速释放药物的能力，进而提高治疗效率。
Figure DDA0002152662660000011

Description

两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物及其可逆交联胶 束及制备与应用
技术领域
本发明属于生物医用高分子聚合物材料技术领域，特别涉及一种两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物及其可逆交联胶束及制备与应用。
背景技术
近年来，聚合物胶束作为疏水抗肿瘤药物的纳米载体已显示出了明显的优势。聚合物胶束具有独特的核-壳结构，可提高水溶性，增加载药量，减少蛋白质吸附，延长体内循环时间，增加靶区药物积累等增加难溶性药物的水溶性，延长药物的体内循环时间，降低不良反应，提高药物生物利用度等优点。然而，传统的胶束系统通常存在两大问题。一是在血液和正常组织中药物过早释放，增加了毒副作用；二是在肿瘤内药物释放缓慢或释放不完全，降低了治疗效果。为了克服这些障碍，引入了由两亲性星型聚合物自组装的刺激响应型交联胶束。
星型聚合物是由数条线形链从一个核心节点散发出来所组成的树枝状聚合物，与相同分子量的线性聚合物相比，水力半径小，自组装形成的胶束结构更稳定。同时已经研究证明，在聚合物中构建交联结构形成交联胶束是提高体系稳定性的一种有效途径(专利CN201410400006.8和CN201610322771.1)，可以有效解决负载药物在血液和正常组织中过早释放问题。由形成交联的性质可以将其分为不可逆交联胶束和可逆交联胶束。不可逆交联胶束由于形成的交联结构太过稳定，无法控制药物在特定部位释放，肿瘤部位富集量低，治疗效果不佳。可逆交联胶束不仅能在血液环境中维持较好的稳定性，而且能对肿瘤微环境刺激响应，实现在特定部位的药物控制释放。通过在交联胶束中引入刺激反应位点，形成具体刺激响应的药物递释系统，能够在特定的位置，以特定的剂量，可控释放药物，从而达到高效的治疗效果。近年来，人们利用刺激响应的优势，一堆体内刺激(pH值、还原电位、氧化应激、酶、温度等)和外部刺激(光线、温度、超声波、电场和磁场等)响应聚合物胶束应运而生。为了提高药物的疗效，设计了双重或多重刺激响应系统来利用不同刺激行动之间的协同作用。基于肿瘤微环境的弱酸性和高还原性，构筑pH和氧化还原刺激响应系统成为了最有效、最重要的方法之一。Tian等基于两亲性线性聚合物制备了一种具有pH/还原双重刺激响应的核交联胶束，并用于抗癌药物的递释。研究结果表明，在肿瘤环境的低pH值和较高还原性物质(谷胱甘肽GSH)浓度下，胶束释放药物的速度更快，效率更高。(Mol.Pharmaceutics，2017，14，799-807)。专利CN201610397053.0公开了一种两亲性四臂星型聚合物及基于其的壳层可逆交联胶束系统和制备方法与应用，该胶束负载抗肿瘤药物后，在正常组织条件下，胶束的交联结构有效地阻止了药物的释放，而到达肿瘤细胞条件下，通过pH/还原双重刺激响应，交联被结构破环，药物释放显著提高。通过优化聚合物胶束的药载能力及药物释放行为、稳定性，使纳米药物递释体系得到进一步的发展及重视。
基于两亲性双响应四臂星型纳米聚合物形成的聚合物可逆交联胶束，可以高效率负载抗肿瘤药物，在正常生理环境下，胶束结构稳定性，具有较强的抵抗溶液稀释的能力，并且交联结构作为药物扩散的屏障，有效的抑制了药物的过早释放而产生的毒副作用；而在肿瘤细胞内部弱酸性和强还原性的微环境下，通过pH/还原双重刺激响应，交联结构被破坏，内核药物得到快速、可控释放，极大提高了药物递释的靶向性和治疗效果。
发明内容
为了克服传统胶束药物递释靶向性不好和治疗效果不佳等不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物，该聚合物具体为[聚甲基丙烯酸-b-SS-聚甲基丙烯酸羟乙酯-b-聚甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯]4。
本发明另一目的在于提供一种上述两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物的制备方法，该方法首先利用季戊四醇与2-溴异丁酰溴发生溴化反应，得到末端溴化的功能引发剂；然后以CuBr2/HMTETA/Sn(Oct)2为催化剂体系，采用上述功能引发剂，依次引发pH响应单体甲基丙烯酸的前驱单体甲基丙烯酸叔丁酯(tBMA)、第二单体甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)和亲水大分子单体甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯(PEGMA)进行电子转移活化再生原子转移自由基聚合反应(ARGET ATRP)聚合，得到前驱pH响应四臂星型聚合物[聚甲基丙烯酸叔丁酯-b-甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)-b-聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEGMA)]4(4AS-PtBMA-PHEMA-PPEGMA)；接着利用甲基丙烯酰氯，酰化星型聚合物中HEMA嵌段的羟基；再以胱胺二盐酸为交联剂，将二硫键节点引入到聚合物中，构建交联结构；最后通过水解反应去除tBMA中的叔丁基，得到最终主链上含有二硫键节点的两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物[聚甲基丙烯酸-b-SS-甲基丙烯酸羟乙酯-b-甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯]4，即4AS-PMAA-(PHEMA-SS～)-PPEGMA。
本发明再一目的在于提供一种基于上述两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物的可逆交联胶束系统，该系统为上述两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物溶于溶剂中制备得到，为pH/还原双响应的可逆交联胶束系统，其中，内核为甲基丙烯酸的pH响应疏水嵌段、中间层为含有二硫键节点的甲基丙烯酸羟乙酯嵌段，外壳为甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯亲水嵌段。
本发明第四个目的在于提供上述基于两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物的可逆交联胶束系统的应用。
本发明的第五个目的在于提供一种pH/还原双响应的可逆交联载药胶束系统，该系统是将水难溶性药物包载在聚合物胶束的pH响应甲基丙烯酸疏水内核得到；在正常生理环境(pH7.4)中，此交联胶束具有较强的抵抗溶液稀释的能力，稳定性较好，同时交联结构作为药物扩散的屏障，有效的抑制药物的过早释放；而在肿瘤细胞内部弱酸性和强还原性的微环境(pH 5.0，10mM谷胱甘肽，GSH)中，不仅羧酸结构收缩挤压释放药物，并且二硫键断裂，交联结构被破坏，胶束快速去交联化，实现药物的快速、可控释放。
本发明的目的通过下述方案实现：
一种两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物，具体为[聚甲基丙烯酸-b-SS-聚甲基丙烯酸羟乙酯-b-聚甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯]4，命名为4AS-PMAA-(PHEMA-SS～)-PPEGMA，具体有如下式Ⅰ所示结构：
Figure BDA0002152662640000041
其中，x＝6～25，y＝3～20，z＝4～30；
所述的R4为两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物的臂，具体为分子量为6366～42630的聚甲基丙烯酸-b-SS-聚甲基丙烯酸羟乙酯-b-聚甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯的三嵌段共聚物；
所述的两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物的数均分子量优选为25596～170652g/mol；
所述的两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物的制备方法，包含如下步骤：
(1)制备季戊四醇末端溴化的功能引发剂(Br4)：将季戊四醇溶于溶剂中，于冰浴条件下加入三乙胺(TEA)和2-溴异丁酰溴，进行冰浴反应；冰浴反应后升温至20～40℃继续反应，得到季戊四醇末端溴化的功能引发剂(Br4)；
(2)制备前驱pH响应四臂星型聚合物4AS-PtBMA-PHEMA-PPEGMA：将步骤(1)所制得的季戊四醇末端溴化的功能引发剂(Br4)和催化剂溴化铜溶于溶剂中，然后加入pH响应前驱单体甲基丙烯酸叔丁酯(tBMA)、配体1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺(HMTETA)，混合均匀后加入还原剂，进行加热反应；待单体tBMA转化率达到75～85％后，降低反应温度加入第二单体甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)、HMTETA和还原剂，进行保温反应；待单体HEMA转化率达到75～85％后，加入第三单体甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯(PEGMA)继续反应，得到前驱pH响应四臂星型聚合物4AS-PtBMA-PHEMA-PPEGMA；
(3)制备HEMA嵌段中羟基被酰化的四臂星型聚合物4AS-PtBMA-(PHEMA-A)-PPEGMA：将步骤(2)所制得的前驱pH响应四臂星型聚合物4AS-PtBMA-PHEMA-PPEGMA溶于溶剂中，在冰浴条件下加入三乙胺(TEA)和甲基丙烯酰氯，冰浴反应后升温至20～40℃继续反应，得到HEMA嵌段中羟基被酰化的四臂星型聚合物4AS-PtBMA-(PHEMA-A)-PPEGMA；
(4)制备主链上含有可逆交联二硫键的前驱pH响应四臂星型聚合物4AS-PtBMA-(PHEMA-SS～)-PPEGMA：将步骤(3)所制得的HEMA嵌段中羟基被酰化的四臂星型聚合物4AS-PtBMA-(PHEMA-A)-PPEGMA溶于溶剂中，然后将其装入透析袋中，于缓冲液中透析反应后，加入交联剂胱胺二盐酸继续交联反应，得到主链上含有可逆交联二硫键的前驱pH响应四臂星型聚合物4AS-PtBMA-(PHEMA-SS～)-PPEGMA；
(5)制备两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物4AS-PMAA-(PHEMA-SS～)-PPEGMA：将步骤(4)所制得的主链上含有可逆交联二硫键的前驱pH响应四臂星型聚合物4AS-PtBMA-(PHEMA-SS～)-PPEGMA溶于溶剂中，于冰浴下加入三氟乙酸(TFA)，冰浴反应后升温至20～40℃继续反应以去除tBMA中的叔丁基，得到两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物4AS-PMAA-(PHEMA-SS～)-PPEGMA；
步骤(1)中反应物的摩尔份数优选如下：
季戊四醇 1份；
三乙胺 4～10份；
2-溴异丁酰溴 4～8份；
步骤(2)中反应物的摩尔份数优选如下：
Figure BDA0002152662640000051
步骤(2)中如加入第三单体甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯(PEGMA)继续反应时，HMTETA和还原剂量不足，可继续加入HMTETA和还原剂以保证反应完全；
所述步骤(3)中反应物的摩尔份数配方如下：
前驱pH响应四臂星型聚合物1份；
甲基丙烯酰氯 12～120份；
三乙胺 12～250份；
所述步骤(4)中反应物的摩尔份数配方如下：
HEMA嵌段中羟基被酰化的四臂星型聚合物 1份；
胱胺二盐酸 12～120份；
所述步骤(5)中反应物的摩尔份数配方如下：
主链上含有可逆交联二硫键的前驱pH响应四臂星型聚合物 1份；
三氟乙酸 24～250份；
步骤(1)中所述的溶剂用于提供溶液反应环境，可为本领域常用有机溶剂，如四氢呋喃；
步骤(1)中所述的冰浴反应的时间优选为2～6h，20～40℃继续反应的时间优选为24～48h；
步骤(2)中所述的溶剂用于提供溶液反应环境，可为本领域常用有机溶剂，如甲苯；
步骤(2)中所述的还原剂为本领域常用还原剂即可，如Sn(Oct)2，其用量和配体的用量相同即可，优选为0.25～2.5摩尔份；
步骤(2)中所述的加热反应的条件优选为60～90℃反应；
步骤(2)中所述的降低反应温度优选降温至50～55℃；
步骤(2)中所述的继续反应的时间优选为24～48h；
步骤(3)中所述的溶剂用于提供溶液反应环境，可为本领域常用有机溶剂，如四氢呋喃；
步骤(3)中所述的冰浴反应的时间优选为2～6h，20～40℃继续反应的时间优选为24～48h；
步骤(4)中所述的溶剂用于提供溶液反应环境，可为本领域常用有机溶剂，如二甲基甲酰胺；
步骤(4)中所述的透析袋的截留分子量优选为3500～4000Da；
步骤(4)中所述的透析反应优选为PBS缓冲液(pH 9.0)透析34h，继续交联反应的时间优选为24～48h；
步骤(5)中所述的溶剂用于提供溶液反应环境，可为本领域常用有机溶剂，如二氯甲烷；
步骤(5)中所述的冰浴反应的时间优选为0.5～2h，20～40℃继续反应的时间为4～8h；
步骤(1)反应完成后，优选将反应体系纯化、沉淀、干燥得到纯化后的产物；所述的纯化是指反应后的溶液体系先旋蒸除去溶剂，然后加入二氯甲烷溶解，并依次用HCl溶液，NaOH溶液和水萃取，所得有机相用MgSO4干燥后过滤；所述的沉淀指的是将纯化得到的洗脱液经旋转蒸发后用冷正己烷沉淀；所述的干燥指的是沉淀后的产物于25～45℃真空干燥48h；
步骤(2)反应完成后，优选将反应体系冷却、纯化、沉淀、干燥得到纯化后的产物；所述的冷却和纯化是指反应体系冷却至20～40℃后，加入THF稀释后通过中性氧化铝过滤除去催化剂；所述的沉淀指的是将旋转蒸发后浓缩液用冷正己烷沉淀；所述的干燥指的是沉淀后的产物于25～45℃真空干燥48h；
步骤(3)反应完成后，优选将反应体系纯化、沉淀、干燥得到纯化后的产物；所述的纯化是指反应后的溶液体系通过中性氧化铝柱；所述的沉淀指的是将纯化液用冷正己烷沉淀、静置分层倒去上层液、再经旋转蒸发掉溶剂；所述的干燥指的是沉淀后的产物于25～45℃真空干燥48h；
步骤(4)反应完成后，优选将反应体系纯化、干燥得到纯化后的产物；所述的纯化是指将反应后的溶液体系用去离子水透析12h(每3h换一次去离子水)，然后抽滤；所述的干燥指的是冷冻干燥纯化产物；
步骤(5)反应完成后，优选将反应体系纯化、沉淀、干燥得到纯化后的产物；所述的纯化是指反应后的溶液体系加入THF稀释后通过中性氧化铝柱除去催化剂；所述的沉淀指的是将旋转蒸发后的浓缩液用冷正己烷沉淀；所述的干燥指的是沉淀后的产物于25～45℃真空干燥48h；
所述的步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)和步骤(5)优选均在惰性气体氩气的保护和无水条件下进行；
所述的两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物在药物负载领域中的应用；
一种基于上述两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物的可逆交联胶束系统，是将上述两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物溶于溶剂中，在水中透析得到；
所述的基于两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物的可逆交联胶束系统，其内核为甲基丙烯酸的pH响应疏水嵌段、中间层为含有二硫键节点的甲基丙烯酸羟乙酯嵌段，外壳为甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯亲水嵌段；
所述的基于两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物的可逆交联胶束系统在负载水难溶性药物制备领域中的应用；
所述的水难溶性药物优选为水难溶性抗肿瘤药物，例如阿霉素DOX；
一种pH/还原双响应的可逆交联载药胶束系统，由上述基于两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物的可逆交联胶束系统负载水难溶性药物制备得到；
所述的pH/还原双响应的可逆交联载药胶束系统的制备方法，包含如下步骤：
将上述两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物和水难溶性药物分别溶于溶剂中，完全溶解后将两种溶液混合，搅拌，透析，得到pH/还原双响应的可逆交联载药胶束系统；
所述的溶剂为本领域常用有机溶剂，如二甲基亚砜；
所述的搅拌优选为20～40℃搅拌4h；
所述的透析优选用截留分子量为3500Da的透析袋于去离子水中透析24h；
所述的水难溶性物优选为抗癌药物阿霉素；
本发明提供的pH/还原双响应的可逆交联载药胶束系统(负载水难溶性抗肿瘤药物的pH/还原双响应可逆交联胶束系统)可控制装载的药物在正常生理环境(pH 7.4)中缓慢释放，而在肿瘤细胞内部弱酸性和强还原性的微环境(pH 5.0，10mM谷胱甘肽，GSH)中实现快速、可控释放。
本发明的机理为：
本发明首先利用季戊四醇与2-溴异丁酰溴发生溴化反应，得到末端溴化的功能引发剂。然后以CuBr2/HMTETA/Sn(Oct)2为催化剂体系，采用上述功能引发剂，依次引发前驱pH响应单体甲基丙烯酸叔丁酯(tBMA)、第二单体甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)和亲水大分子单体甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯(PE GMA)进行ARGET ATRP聚合，得到未交联的前驱pH响应四臂星型聚合物(4AS-PtBMA-PHEMA-PPEGMA)。然后利用甲基丙烯酰氯，酰化驱pH响应四臂星型聚合物中HEMA嵌段的羟基；再以胱胺二盐酸为交联剂，将二硫键节点引入到聚合物中，构建交联结构，得到主链上含有可逆交联二硫键的前驱pH响应四臂星型聚合物4AS-PtBMA-(PHEMA-SS～)-PPEGMA。最后通过水解反应去除tBMA中的叔丁基，得到最终的两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物4AS-PMAA-(PHEMA-SS～)-PPEGMA。
本发明将上述两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物溶于溶剂中，自组装形成三层聚合物胶束，其中内核为甲基丙烯酸疏水嵌段，用于包载水难溶性药物和实现对pH的刺激响应；中间层为含有二硫键的甲基丙烯酸羟乙酯疏水嵌段，用于在还原刺激下，二硫键断裂实现还原响应；外壳为甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯亲水嵌段，用于保持胶束结构的稳定性。
通过透析法，将上述基于两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物的可逆交联胶束系统包载水难溶性抗肿瘤药物阿霉素后得到pH/还原双响应的可逆交联载药胶束系统。该载药胶束在正常生理环境(pH7.4)下，稳定性较好，具有较强的抵抗溶液稀释的能力，并且交联结构作为药物扩散的屏障，有效的抑制了药物的过早释放；而在肿瘤细胞内部弱酸性和强还原性的微环境(pH 5.0，10mM谷胱甘肽，GSH)下，不仅胶束中羧酸结构收缩挤压释放药物，并且二硫键断裂，交联结构被破坏，胶束快速去交联化，内核药物得到快速、可控释放。这种两亲性pH/还原双响应四臂星型聚合物结构能在维持高载药量的前提下，提高胶束的稳定性，防止药物过早释放，降低药物毒副作用，并通过pH/还原双重刺激响应，靶向快速释放药物，提高药物治疗效率。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
(1)本发明的制备方法简单，操作易行，反应条件温和，合成的两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物结构明确，可用于制备聚合物胶束系统，满足不同药物递释系统的要求。
(2)本发明制备得到的基于两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物的可逆交联胶束系统，不仅胶束的羧酸结构内核能够高效地负载水难溶性药物，并且在血液等正常生理环境下胶束结构稳定，具有较强的抵抗溶液稀释的能力，有效地抑制了药物的过早释放而导致的毒副作。
(3)本发明制备得到的pH/还原双响应的可逆交联载药胶束系统，能够同时或者依次实现pH/还原刺激响应，靶向快速释放药物，提高药物治疗效率，为制备高效药物递释系统提供有参考价值的技术。
附图说明
图1是实施例1中功能引发剂Br4的核磁氢谱图。
图2是实施例2中前驱pH响应四臂星型聚合物4AS-PtBMA-PHEMA-PPEGMA的核磁氢谱图。
图3是实施例2中聚合物的核磁氢谱图；其中，A：星形聚合物4AS-PtBMA-(PHEMA-A)-PPEGMA，B：星形聚合物4AS-PtBMA-(PHEMA-SS～)-PPEGMA。
图4是实施例2中星型聚合物4AS-PMAA-(PHEMA-SS～)-PPEGMA的核磁氢谱图。
图5是实施例5制得的基于两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物的可逆交联胶束系统的DLS和TEM图。
图6是实施例6制得的pH/还原双响应的可逆交联载药胶束系统的DLS和TEM图。
图7是实施例6制得的pH/还原双响应的可逆交联载药胶束系统的粒径变化结果图，其中，A：胶束原液，B：1000倍水稀释后，C：4倍DMF有机溶剂稀释后。
图8是实施例6制得的pH/还原双响应的可逆交联载药胶束系统的体外释放曲线结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中所用试剂来源均可从市场购得。
实施例1：功能引发剂Br4的制备
取250mL三口烧瓶，加入搅拌子，称取季戊四醇(5.45g，40mmol)加入反应瓶中，加入溶剂四氢呋喃(100mL)后抽真空-通氩气三次；冰水浴冷却至0℃条件下，将三乙胺(22.24mL，160mmol)加入烧瓶中，然后用注射器将2-溴异丁酰溴(19.78mL，160mmol)逐滴加入到烧瓶中；先在0℃反应5h后再在室温25℃下反应24h；将反应液通过旋转蒸发除去溶剂后，加入二氯甲烷(100mL)溶解并转入分液漏斗中，依次用质量分数为3％的HCl溶液(200mL)，质量分数为2％的NaOH溶液(200mL)和水(200mL)萃取，所得有机相用MgSO4干燥后过滤；接着通过旋转蒸发除去一部分溶剂，得到的蒸馏液体用冷正己烷沉淀，最后在30℃真空干燥48h，得到季戊四醇末端溴化的功能引发剂(Br4)。合成反应式见公式(1)。利用核磁共振氢谱对分子结构和组成进行分析，结果见图1。
Figure BDA0002152662640000111
实施例2：两亲性双响应的四臂星型纳米聚合物4AS-PMAA-(PHEMA-SS～)-PPEGMA的制备(x:y:z＝9:6:6)
(1)制备前驱pH响应聚合物4AS-PtBMA-PHEMA-PPEGMA：取100mL干燥茄形瓶装入搅拌子，称取实施例1制得的引发剂(Br)4(442mg，0.6mmol)、催化剂CuBr2(11.2mg，0.05mmol)置于茄形瓶中然后用反口橡皮塞封口，抽真空-通氩气三次；依次用注射器将溶剂甲苯(24mL)、单体tBMA(3.07g，21.6mmol)、配体HMTETA(65μL，0.24mmol)(用2mL甲苯溶剂溶解)加入瓶中，搅拌10分钟使催化剂配合物形成；再将还原剂Sn(Oct)2(78μL，0.24mmol)溶于甲苯中加入反应瓶中，搅拌5分钟后转入70℃油浴中搅拌反应；待单体tBMA转化率达到80％后，先降温到55℃，然后加入第二单体HEMA(1.87g，14.4mmol)、配体HMTETA(65μL，0.24mmol)和还原剂Sn(Oct)2(78μL，0.24mmol)，55℃保温反应；待转化率达到80％后，加入第三单体PEGMA(6.84g，14.4mmol)继续进行反应48h；反应完成后，冷却至室温25℃，加入50mL THF并搅拌使其溶解，然后用中性氧化铝柱子过滤除去催化剂(以THF作洗脱剂)。经过旋转蒸发去除多余溶剂，得到的浓缩液缓慢加入到冷正己烷中沉淀，最后在30℃真空干燥48h，得到产物前驱pH响应四臂星型聚合物4AS-PtBMA-PHEMA-PPEGMA。合成反应式见公式(2)。利用核磁共振氢谱对分子结构和组成进行分析，结果见图2。
Figure BDA0002152662640000112
(2)制备HEMA嵌段中羟基被酰化的四臂星型聚合物4AS-PtBMA-(PHEMA-A)-PPEGMA：称取步骤(1)所制得的前驱pH响应四臂星型聚合物4AS-PtBMA-PHEMA-PPEGMA(3.36g，0.2mmol)于四氢呋喃(30mL)中密封搅拌至溶解，接着搭建冰浴装置，再用注射器滴加三乙胺(5.56mL，40mmol)和甲基丙烯酰氯(缩写为A，0.97mL，10mmol)，在冰浴中反应2h后再在室温25℃反应24h。反应结束后通过中性氧化铝层析柱过滤，然后逐滴到冷正己烷中沉淀、静置分层倒去上层溶液、旋转蒸发除掉溶剂后继续在30℃真空干燥48h，得到产物HEMA嵌段中羟基被酰化的四臂星型聚合物4AS-PtBMA-(PHEMA-A)-PPEGMA。合成反应式见公式(3)。利用核磁共振氢谱对分子结构和组成进行分析，结果见图3。
Figure BDA0002152662640000121
(3)制备主链上含有还原响应节点的两亲性四臂星型聚合物4AS-PtBMA-(PHEMA-SS～)-PPEGMA：称取步骤(2)制得的HEMA嵌段中羟基被酰化的四臂星型聚合物4AS-PtBMA-(PHEMA-A)-PPEGMA(30mg，1.67μmol)溶解于二甲基甲酰胺(30mL)中，接着将溶剂倒于透析袋(MWCO＝3.5kDa)中，于PBS缓冲液(50mM，pH 9.0)中透析34h，透析过程中前18h内，每3h更换一次缓冲液，后16h每8h更换一次缓冲液。透析结束后，取出透析袋内溶液于烧杯中，测试pH，应为9.0左右，若低于9.0，取少量NaOH溶液(0.1mol/L)调节pH到9.0；再取交联剂胱胺二盐酸(18.8mg，83.5μmol)加入到烧杯中，室温25℃下搅拌继续交联24h；将交联后的产物置于透析袋中，于去离子水中透析12h，透析过程中每3h换一次去离子水，透析结束后抽滤透析液，最后通过冷冻干燥冷藏保存交联产物，即主链上含有可逆交联二硫键的前驱pH响应四臂星型聚合物4AS-PtBMA-(PHEMA-SS～)-PPEGMA(Mn＝37685)。合成反应式见公式(4)。利用核磁共振氢谱对分子结构和组成进行分析，结果见图3。
Figure BDA0002152662640000131
(4)制备两亲性双响应的四臂星型纳米聚合物4AS-PMAA-(PHEMA-SS～)-PPEGMA：称取步骤(3)制得的主链上含有可逆交联二硫键的前驱pH响应四臂星型聚合物4AS-PtBMA-(PHEMA-SS～)-PPEGMA(6g，0.16mmol)于50mL圆底烧瓶中，加入搅拌子和二氯甲烷(10mL)溶解，用冰水浴冷却至0℃，在快速搅拌下逐滴缓慢加入三氟乙酸(1.53mL，20mmol)，在0℃反应30min后再将混合液在室温25℃下反应4h以除去叔丁基；反应完成后，反应液用THF稀释并通过中性氧化铝柱除去催化剂，蒸发除去溶剂后，得到的浓缩液缓慢加入到冷正己烷中沉淀，最后在30℃真空干燥48h，得到产物两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物(Mn＝34101)。合成反应式见公式(5)。利用核磁共振氢谱对分子结构和组成进行分析，结果见图4。
Figure BDA0002152662640000132
实施例3：两亲性双响应的四臂星型纳米聚合物4AS-PMAA-(PHEMA-SS～)-PPEGMA的制备(x:y:z＝6:20:30)
(1)制备前驱pH响应聚合物4AS-PtBMA-PHEMA-PPEGMA：取250mL干燥茄形瓶装入搅拌子，称取实施例1制得的引发剂(Br)4(736mg，1mmol)、催化剂CuBr2(44.7mg，0.2mmol)置于茄形瓶中然后用反口橡皮塞封口，抽真空-通氩气三次；依次用注射器将溶剂甲苯(44mL)、单体tBMA(3.41g，24mmol)、配体HMTETA(340μL，1.25mmol)(用2mL甲苯溶剂溶解)加入瓶中，搅拌10分钟使催化剂配合物形成，再将还原剂Sn(Oct)2(405μL，1.25mmol)溶于甲苯中加入反应瓶中，搅拌5分钟后转入60℃油浴中搅拌反应；待单体tBMA转化率达到80％后，先降温到50℃，然后加入第二单体HEMA(10.4g，80mmol)、配体HMTETA(340μL，1.25mmol)和还原剂Sn(Oct)2(405μL，1.25mmol)，50℃保温反应；待转化率达到80％后，加入第三单体PEGMA(57g，120mmol)继续进行反应48h；反应完成后，冷却至室温25℃，加入50mL THF并搅拌使其溶解，然后用中性氧化铝柱子过滤除去催化剂(以THF作洗脱剂)。经过旋转蒸发去除多余溶剂，得到的浓缩液缓慢加入到冷正己烷中沉淀，最后在45℃真空干燥48h，得到产物前驱pH响应四臂星型聚合物4AS-PtBMA-PHEMA-PPEGMA。
(2)制备HEMA嵌段中羟基被酰化的四臂星型聚合物4AS-PtBMA-(PHEMA-A)-PPEGMA：称取步骤(1)所制得的前驱pH响应四臂星型聚合物4AS-PtBMA-PHEMA-PPEGMA(6.29g，0.1mmol)于四氢呋喃(30mL)中密封搅拌至溶解，接着搭建冰浴装置，再用注射器滴加三乙胺(3.47mL，25mmol)和甲基丙烯酰氯(1.16mL，12mmol)，在冰浴中反应6h后再在室温25℃反应48h；反应结束后通过中性氧化铝层析柱过滤，然后逐滴到冷正己烷中沉淀、静置分层倒去上层溶液、旋转蒸发除掉溶剂后继续在45℃真空干燥48h，得到产物HEMA嵌段中羟基被酰化的四臂星型聚合物4AS-PtBMA-(PHEMA-A)-PPEGMA。
(3)制备主链上含有还原响应节点的两亲性四臂星型聚合物4AS-PtBMA-(PHEMA-SS～)-PPEGMA：称取步骤(2)所制得的HEMA嵌段中羟基被酰化的四臂星型聚合物4AS-PtBMA-(PHEMA-A)-PPEGMA(30mg，0.44μmol)溶解于二甲基甲酰胺(30mL)中，接着将溶剂倒于透析袋(MWCO＝3.5kDa)中，于PBS缓冲液(50mM，pH 9.0)中透析34h，透析过程中前18h内，每3h更换一次缓冲液，后16h每8h更换一次缓冲液。透析结束后，取出透析袋内溶液于烧杯中，测试pH，应为9.0左右，若低于9.0，取少量NaOH溶液(0.1mol/L)调节pH到9.0；再取交联剂胱胺二盐酸(11.9mg，52.8μmol)加入到烧杯中，室温25℃下搅拌继续交联48h；将交联后的产物置于透析袋中，于去离子水中透析12h，透析过程中每3h换一次去离子水，透析结束后抽滤透析液，最后通过冷冻干燥冷藏保存交联产物，即主链上含有可逆交联二硫键的前驱pH响应四臂星型聚合物4AS-PtBMA-(PHEMA-SS～)-PPEGMA(Mn＝142142)。
(4)制备两亲性双响应的四臂星型纳米聚合物4AS-PMAA-(PHEMA-SS～)-PPEGMA：称步骤(3)所制得的主链上含有可逆交联二硫键的前驱pH响应四臂星型聚合物4AS-PtBMA-(PHEMA-SS～)-PPEGMA(7.1g，0.05mmol)于50mL圆底烧瓶中，加入搅拌子和二氯甲烷(10mL)溶解，用冰水浴冷却至0℃，在快速搅拌下逐滴缓慢加入三氟乙酸(0.96mL，12.5mmol)，在0℃反应2h后再将混合液在室温25℃下反应8h以除去叔丁基；反应完成后，反应液用THF稀释并通过中性氧化铝柱除去催化剂，蒸发除去溶剂后，得到的浓缩液缓慢加入到冷正己烷中沉淀，最后在45℃真空干燥48h，得到产物两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物(Mn＝139454)。
实施例4：两亲性双响应的四臂星型纳米聚合物4AS-PMAA-(PHEMA-SS～)-PPEGMA的制备(x:y:z＝25:3:4)
(1)制备前驱pH响应聚合物4AS-PtBMA-PHEMA-PPEGMA：取100mL干燥茄形瓶装入搅拌子，称取实施例1制得的引发剂(Br)4(736mg，1mmol)、催化剂CuBr2(11.2mg，0.05mmol)置于茄形瓶中然后用反口橡皮塞封口，抽真空-通氩气三次；依次用注射器将溶剂甲苯(24mL)、单体tBMA(14.22g，100mmol)、配体HMTETA(34μL，0.125mmol)(用2mL甲苯溶剂溶解)加入瓶中，搅拌10分钟使催化剂配合物形成；再将还原剂Sn(Oct)2(40μL，0.125mmol)溶于甲苯中加入反应瓶中，搅拌5分钟后转入90℃油浴中搅拌反应；待单体tBMA转化率达到80％后，先降温到55℃，然后加入第二单体HEMA(1.56g，12mmol)、配体HMTETA(34μL，0.125mmol)和还原剂Sn(Oct)2(40μL，0.125mmol)，55℃保温反应；待转化率达到80％后，加入第三单体PEGMA(7.6g，16mmol)继续进行反应24h；反应完成后，冷却至室温25℃，加入50mL THF并搅拌使其溶解，然后用中性氧化铝柱子过滤除去催化剂(以THF作洗脱剂)。经过旋转蒸发去除多余溶剂，得到的浓缩液缓慢加入到冷正己烷中沉淀，最后在25℃真空干燥48h，得到产物前驱pH响应四臂星型聚合物4AS-PtBMA-PHEMA-PPEGMA。
(2)制备HEMA嵌段中羟基被酰化的四臂星型聚合物4AS-PtBMA-(PHEMA-A)-PPEGMA：称取步骤(1)所制得的前驱pH响应四臂星型聚合物4AS-PtBMA-PHEMA-PPEGMA(2.16g，0.1mmol)于四氢呋喃(30mL)中密封搅拌至溶解，接着搭建冰浴装置，再用注射器滴加三乙胺(0.12mL，1.2mmol)和甲基丙烯酰氯(0.12mL，1.2mmol)，在冰浴中反应2h后再在室温25℃反应24h；反应结束后通过中性氧化铝层析柱过滤，然后逐滴到冷正己烷中沉淀、静置分层倒去上层溶液、旋转蒸发除掉溶剂后继续在25℃真空干燥48h，得到产物HEMA嵌段中羟基被酰化的四臂星型聚合物4AS-PtBMA-(PHEMA-A)-PPEGMA。
(3)制备主链上含有还原响应节点的两亲性四臂星型聚合物4AS-PtBMA-(PHEMA-SS～)-PPEGMA：称取步骤(2)制得的HEMA嵌段中羟基被酰化的四臂星型聚合物4AS-PtBMA-(PHEMA-A)-PPEGMA(30mg，1.34mmol)溶解于二甲基甲酰胺(30mL)中，接着将溶剂倒于透析袋(MWCO＝3.5kDa)中，于PBS缓冲液(50mM，pH 9.0)中透析34h，透析过程中前18h内，每3h更换一次缓冲液，后16h每8h更换一次缓冲液。透析结束后，取出透析袋内溶液于烧杯中，测试pH，应为9.0左右，若低于9.0，取少量NaOH溶液(0.1mol/L)调节pH到9.0。再取交联剂胱胺二盐酸(3.63mg，16.1mmol)加入到烧杯中，室温25℃下搅拌继续交联24h；将交联后的产物置于透析袋中，于去离子水中透析12h，透析过程中每3h换一次去离子水，透析结束后抽滤透析液，最后通过冷冻干燥冷藏保存交联产物，即主链上含有可逆交联二硫键的前驱pH响应四臂星型聚合物4AS-PtBMA-(PHEMA-SS～)-PPEGMA(Mn＝45674)。
(4)制备两亲性双响应的四臂星型纳米聚合物4AS-PMAA-(PHEMA-SS～)-PPEGMA：称取步骤(3)制得的主链上含有可逆交联二硫键的前驱pH响应四臂星型聚合物4AS-PtBMA-(PHEMA-SS～)-PPEGMA(4.6g，0.1mmol)于50mL圆底烧瓶中，加入搅拌子和二氯甲烷(10mL)溶解，用冰水浴冷却至0℃，在快速搅拌下逐滴缓慢加入三氟乙酸(0.18mL，2.4mmol)，在0℃反应0.5h后再将混合液在室温25℃下反应4h以除去叔丁基；反应完成后，反应液用THF稀释并通过中性氧化铝柱除去催化剂，蒸发除去溶剂后，得到的浓缩液缓慢加入到冷正己烷中沉淀，最后在25℃真空干燥48h，得到产物两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物(Mn＝35370)。
实施例5：基于两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物的可逆交联胶束系统的制备
将两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物4AS-PMAA-(PHEMA-SS～)-PPEGMA(60mg)(实施例2制得)溶于二甲基亚砜中，搅拌4h使其溶解后转入透析袋中，在去离子水中透析24h，透析过程中每4h更换一次去离子水。透析液经孔径为0.45μm过滤器过滤后，冷冻干燥后，得白色粉末状固体即为基于两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物的可逆交联胶束系统。
利用动态光散射法(DLS)和透射电镜(TEM)测定空白交联胶束(未载药)的粒径、分布、zeta电位和形貌(如图5)。DLS测得空白胶束的粒径Dh为122.9nm，PDI为0.147，zeta电位为-14.41mV。TEM测定空白交联胶束呈球形，粒径约为100nm。
实施例6：pH/还原双响应的可逆交联载药胶束系统的制备
将两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物4AS-PMAA-(PHEMA-SS～)-PPEGMA(60mg)(实施例2制得)和抗肿瘤药物DOX·HCl(14mg)分别溶于二甲基亚砜中，得到聚合物溶液和DOX·HCl溶液；DOX·HCl溶液加入TEA(为了脱去HCl)搅拌24h，得到DOX碱溶液；将DOX碱溶液和聚合物溶液混合后25℃继续搅拌4h，随后转入截留分子量为3500Da的透析袋中于去离子水中透析24h，透析过程中前8h每4h换一次水，随后每隔6h更换一次。透析液经孔径为0.45μm过滤器过滤后，冷冻干燥后，得红色粉末状固体即为pH/还原双响应的可逆交联载药胶束系统。
利用紫外可见光谱法检测上述pH/还原双响应的可逆交联载药胶束系统，计算得到的载药量为14.73％，包封率为74.05％。利用DLS和TEM测定载药交联胶束的粒径、分布、zeta电位和形貌(如图6)。DLS测得载药交联胶束的粒径Dh为160.4nm，PDI为0.173，zeta电位为-20.22mV。TEM测定上述pH/还原双响应的可逆交联载药胶束系统呈球形，粒径约为140nm。
实施例7：pH/还原双响应的可逆交联载药胶束系统的稳定性测试
取实施例6中制备的pH/还原双响应的可逆交联载药胶束系统溶液(1mg/mL)，分别用去离子水稀释1000倍和有机溶剂二甲基甲酰胺稀释5倍，静置24h后，用DLS测试其粒径变化(如图7)。经大量去离子水和有机溶剂稀释后，胶束粒径只是溶胀变大，并没有出现解离成更小单体，说明该pH/还原双响应的可逆交联载药胶束系统具有较好的稳定性。
实施例8：pH/还原双响应的可逆交联载药胶束系统的体外释放行为
利用荧光光谱研究了不同生理条件下的体外药物释放行为。具体步骤如下：将实施例6中制备的5mg pH/还原双响应的可逆交联载药胶束系统溶解于5ml四种不同的缓冲液((1)pH 7.4、(2)pH 5.0、(3)pH 7.4+10mM GSH、(4)pH 5.0+10mM GSH)中，待胶束溶液稳定30min后转入透析袋(MWCO＝3.5kDa)，并将每个透析袋浸泡在装有95mL相应缓冲溶液的烧杯中，放置在摇床上，于温度310K，转速为100rpm下进行药物释放。在预先确定的时间间隔内，取4mL样品进行荧光光谱分析，同时补充4mL新鲜缓冲液。用荧光光谱法测定不同时间释放液中DOX浓度，绘制体外释放曲线(如图8)。
由图8可知，在pH7.4正常生理条件下(如血液)，DOX的释放非常缓慢，到110h仅有19.5％的累积释放量。到pH降低到弱酸性(pH5.0)条件下，DOX的累积释放量110h内达到81.1％，因为此pH/还原双响应的可逆交联载药胶束系统在此pH下PMAA内核去质子化，增强了疏水内核和疏水抗肿瘤药物DOX之间的疏水-疏水作用，导致交联胶束收缩挤压释放出DOX。当再引入10mM GSH，在(pH5.0+10mM GSH)的肿瘤细胞内，DOX的累积释放量在3h内高达到61.9％，110h后达到91.3％。在此条件下不仅羧酸结构收缩挤压释放药物，并且二硫键断裂，交联结构被破坏，胶束快速去交联化，实现药物的快速释放。通过不同生理条件下的药物释放行为说明实施例6制备的pH/还原双响应的可逆交联载药胶束系统，可以在pH/还原双重刺激响应下实现药物的靶向可控释放，提高药物的治疗效果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物，其特征在于具体有如下式Ⅰ所示结构：
Figure FDA0003444993220000011
其中，x＝6～25，y＝3～20，z＝4～30。
2.根据权利要求1所述的两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物，其特征在于：
所述的两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物的数均分子量为25596～170652g/mol。
3.权利要求1所述的两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物的制备方法，其特征在于包含如下步骤：
(1)制备季戊四醇末端溴化的功能引发剂：将季戊四醇溶于溶剂中，于冰浴条件下加入三乙胺和2-溴异丁酰溴，进行冰浴反应；冰浴反应后升温至20～40℃继续反应，得到季戊四醇末端溴化的功能引发剂；
(2)制备前驱pH响应四臂星型聚合物4AS-PtBMA-PHEMA-PPEGMA：将步骤(1)所制得的季戊四醇末端溴化的功能引发剂和催化剂溴化铜溶于溶剂中，然后加入pH响应前驱单体甲基丙烯酸叔丁酯、配体1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺，混合均匀后加入还原剂，进行加热反应；待单体tBMA转化率达到75～85％后，降低反应温度加入第二单体甲基丙烯酸羟乙酯、HMTETA和还原剂，进行保温反应；待单体HEMA转化率达到75～85％后，加入第三单体甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯继续反应，得到前驱pH响应四臂星型聚合物4AS-PtBMA-PHEMA-PPEGMA；
(3)制备HEMA嵌段中羟基被酰化的四臂星型聚合物4AS-PtBMA-(PHEMA-A)-PPEGMA：将步骤(2)所制得的前驱pH响应四臂星型聚合物4AS-PtBMA-PHEMA-PPEGMA溶于溶剂中，在冰浴条件下加入三乙胺(TEA)和甲基丙烯酰氯，冰浴反应后升温至20～40℃继续反应，得到HEMA嵌段中羟基被酰化的四臂星型聚合物4AS-PtBMA-(PHEMA-A)-PPEGMA；
(4)制备主链上含有可逆交联二硫键的前驱pH响应四臂星型聚合物4AS-PtBMA-(PHEMA-SS～)-PPEGMA：将步骤(3)所制得的HEMA嵌段中羟基被酰化的四臂星型聚合物4AS-PtBMA-(PHEMA-A)-PPEGMA溶于溶剂中，然后将其装入透析袋中，于缓冲液中透析反应后，加入交联剂胱胺二盐酸继续交联反应，得到主链上含有可逆交联二硫键的前驱pH响应四臂星型聚合物4AS-PtBMA-(PHEMA-SS～)-PPEGMA；
(5)制备两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物4AS-PMAA-(PHEMA-SS～)-PPEGMA：将步骤(4)所制得的主链上含有可逆交联二硫键的前驱pH响应四臂星型聚合物4AS-PtBMA-(PHEMA-SS～)-PPEGMA溶于溶剂中，于冰浴下加入三氟乙酸，冰浴反应后升温至20～40℃继续反应以去除tBMA中的叔丁基，得到两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物4AS-PMAA-(PHEMA-SS～)-PPEGMA。
4.根据权利要求3所述的两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中反应物的摩尔份数优选如下：
季戊四醇 1份；
三乙胺 4～10份；
2-溴异丁酰溴 4～8份；
步骤(2)中反应物的摩尔份数优选如下：
Figure FDA0003444993220000021
Figure FDA0003444993220000031
所述步骤(3)中反应物的摩尔份数配方如下：
前驱pH响应四臂星型聚合物 1份；
甲基丙烯酰氯 12～120份；
三乙胺 12～250份；
所述步骤(4)中反应物的摩尔份数配方如下：
HEMA嵌段中羟基被酰化的四臂星型聚合物 1份；
胱胺二盐酸 12～120份；
所述步骤(5)中反应物的摩尔份数配方如下：
主链上含有可逆交联二硫键的前驱pH响应四臂星型聚合物 1份；
三氟乙酸 24～250份。
5.权利要求1或2所述的两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物在制备药物载体中的应用。
6.一种基于两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物的可逆交联胶束系统，其特征在于是将权利要求1或2所述的两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物溶于溶剂中，在水中透析得到。
7.权利要求6所述的基于两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物的可逆交联胶束系统在负载水难溶性药物制备领域中的应用。
8.一种pH/还原双响应的可逆交联载药胶束系统，其特征在于由权利要求7所述的基于两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物的可逆交联胶束系统负载水难溶性药物制备得到。
9.权利要求8所述的pH/还原双响应的可逆交联载药胶束系统的制备方法，其特征在于包含如下步骤：
将权利要求1或2所述的两亲性pH/还原双响应四臂星型纳米聚合物和水难溶性药物分别溶于溶剂中，完全溶解后将两种溶液混合，搅拌，透析，得到pH/还原双响应的可逆交联载药胶束系统。
10.根据权利要求9所述的pH/还原双响应的可逆交联载药胶束系统的制备方法，其特征在于：
所述的水难溶性物为抗癌药物阿霉素。
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