CN106279581B - 一种pH响应/膜粘附性两亲性嵌段共聚物及其制备方法 - Google Patents

一种pH响应/膜粘附性两亲性嵌段共聚物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种pH响应/膜粘附性双功能两亲性嵌段共聚物及其制备方法，以等电点(pKa)为5.0～6.5的甲基丙烯酸或丙烯酸作为pH响应单体，以pH不敏感亲水性的甲基丙烯酸氨乙基酯作为膜粘附性单体，采用电子转移活化剂再生‑原子转移自由基活性聚合方法(ARGET ATRP)，先制备pH响应单体与疏水单体的嵌段共聚物，并以此作为大分子引发剂，再对膜粘附性单体甲基丙烯酸氨乙基酯进行ARGETATRP聚合，最后经过酸解反应，制得pH响应/膜粘附性两亲性嵌段共聚物。该嵌段共聚物能够在水溶液中自组装形成核‑壳结构胶束，胶束具有较好pH敏感性和膜粘附性、较低临界胶束浓度，较小胶束粒径，可用于多肽或蛋白类药物口服治疗应用的药物传输体系。

Description

一种pH响应/膜粘附性两亲性嵌段共聚物及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医药功能高分子聚合物材料领域，具体涉及一种具有pH敏感性和膜粘附性的两亲性嵌段共聚物及其制法。
背景技术
口服给药具有使用方便、费用相对便宜、病人顺应性好等诸多优点，是一种更容易被病人接受的常规治疗方式。但是，口服给药过程受很多因素限制，导致药物在胃肠道中的生物利用度低，尤其是多数多肽类和蛋白类药物(如胰岛素)，由于这类药物分子量较大、脂溶性较差，生物膜通透性低，而且胃肠道内存在大量肽水解酶和蛋白水解酶，药物口服容易发生首过效应而被分解消化，因而多肽和蛋白类药物的口服治疗应用仍然面临巨大挑战。
嵌段聚合物是由两种或两种以上不同性质的聚合物链段连接而成的特殊聚合物，嵌段聚合物的分子组成可以根据自身需求而自由设计，使聚合物同时兼具多种优异性能。两亲性嵌段共聚物能够在水溶液中自组装形成具有核-壳结构的聚合物胶束，聚合物胶束具有较小的粒径，较低的临界胶束浓度，较大的药物增溶空间，结构稳定性较好等优点，将其用于口服给药载体，不仅能为药物包载提供一定体积的稳定空间，并且作为一个特殊的传输工具直接把药物送到特定的组织或器官，发挥药理作用。
含pH敏感性单体的两亲性聚合物胶束作为口服药物载体，可以根据环境pH值的不同来控制药物释放速率，pH敏感聚合物一般含有可离子化的基团，随着pH值的不同，可离子化基团的离子化能力发生改变，当达到其等电点(pKa)时，这种变化非常明显，比如聚甲基丙烯酸(PMAA)、聚丙烯酸(PAA)等含有羧基酸的聚合物，其pKa值为5.0～6.5，当环境pH值小于pKa值时，羧基去离子化，大于pKa值时，羧基发生解离亲水性增加；而人体胃肠道pH值存在较大差异，人体胃部环境pH值为1.0～2.5，人体肠道环境pH值为5.1～7.8，这类pH响应聚合物胶束可保持其结构在胃部环境中稳定，减少药物在胃部的释放，当到达肠道部位时，胶束结构发生改变，药物慢慢地被释放出来，因此可用于肠道药物释放的输送体系。由于小肠上皮细胞膜粘附层带负电荷，带正电荷的聚合物胶束可与其相互作用，使胶束紧密地粘附在膜粘附层，延长胶束在肠道的停留时间，促进药物的完全释放，同时胶束表面正电荷还有利于打开细胞紧密连接，促进药物吸收，提高药物生物利用度[HsuL.W，Ho Y.C，ChuangE.Y，Effects of pH on molecular mechanisms of chitosan-integrin interactionsand resulting tight-junction disruptions，Biomaterials，2013，34(3)：784-793]。
pH响应性或膜粘附性等单一功能的胶束给药无法同时克服药物在胃部易降解、在肠道吸收度低等障碍。专利申请CN 101891870-A公布了一种以甲基丙烯酸叔丁酯和丙烯酸叔丁酯为pH响应单体的胶束，pH敏感性较好，胶束壳层为亲水性的甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯，胶束带负电荷，膜粘附性较差。Zhang，Y等用巯基基团表面修饰pH敏感的聚丙烯酸聚合物来制备纳米粒，膜粘附性较弱[Zhang Y，Wu X，Meng L，Zhang Y，Ai R， Qi N，eta1.ThiolatedEudragit nanoparticles for oral insulin delivery：preparation，characterization and in vivo evaluation，Iht J Pharm，2012，436(1-2)：341-350]。Cui，F.等制备了羧化壳聚糖类纳米粒胶束并用来包载胰岛素，表面正电荷反转为负电荷，膜粘附性下降[CuiF.Y，Qian F，ZhaoZ.M，Preparation，characterization，and oraldelivery of insulin loaded carboxylated chitosan graftedpoly(methylmethacrylate)nanoparticles，Biomacromolecules，2009，10(5)，1253-1258]。PiyasiMukhopadhyay等利用具有膜粘附性的壳聚糖和pH敏感性的海藻酸盐与胰岛素混合制备具有核-壳结构的纳米粒，将pH敏感性和膜粘附性分开，制备工艺较复杂，纳米粒仍带负电荷，膜粘附性功能受到限制[Mukhopadhyay P，Chakraborty S，Bhattacharya S，pH-sensitive chitosan/alginate core-shell nanoparticles for efficient and safeoral insulin delivery，Int J BiolMacromol，2015，72：640-648]。
发明内容
本发明的目的在于设计合成一种具有pH响应/膜粘附性双功能集成的两亲性嵌段共聚物，提供了一种pH响应/膜粘附性两亲性共聚物的制备方法。
本发明总体构思如下：将疏水单体与pH敏感单体设计成嵌段共聚形式，再与亲水性的膜粘附性单体共聚得到两亲性嵌段共聚物，聚合物在水溶液中自组装形成胶束，疏水单体与pH敏感单体互相缔合构成胶束疏水内核，提供一定体积的载药空间，亲水性的膜粘附单体伸展在外形成胶束的壳层，能够与小肠粘附层相互作用，发挥膜粘附性。选择甲基丙烯酸(MAA)作为pH敏感性单体和pH不敏感亲水性的甲基丙烯酸氨乙基酯作膜粘附性单体；MAA中含有可离子化的羧基，pKa值约为5.0～6.5，在pH值为1.0～2.5的人体胃液环境中，去离子化，表现为疏水性，而在pH值为5.2～7.5的人体肠道环境中，易发生解离，亲水性增加；甲基丙烯酸氨乙基酯中含有氨基，在pH小于8时，易质子化带正电。聚合物胶束作为口服给药载体时，在胃液酸性环境下，MAA去离子化，胶束结构稳定，药物包载在胶束内核，释放缓慢，进入肠道系统，胶束的正电荷特性使其粘附在小肠上皮细胞，同时MAA发挥pH敏感性，羧基逐步解离，胶束开始溶胀，结构松散，药物缓慢释放出来，膜粘附性功能能够延长胶束在肠道内的停留时间并促进药物吸收。
即先制备pH敏感单体与疏水单体的共聚pH敏感嵌段，并以此嵌段共聚物作为大分子引发剂，再与膜粘附性单体共聚得到两亲性嵌段共聚物，最后将pH敏感单体上的叔丁基和膜粘附性单体上的保护基团一同酸解即得到pH响应/膜粘附性两亲性嵌段共聚物。
本发明技术方案如下：
1、一种pH响应/膜粘附性两亲性嵌段共聚物的结构式为：
Figure GSB0000182973360000031
其中，x＝20～40，y＝20～50，z＝20～50，优选x＝25～35，y＝30～45，z＝25～45，数均分子量为5000～20000g/mol，优选6000～14000g/mol。
2、根据1所述的一种pH响应/膜粘附性两亲性嵌段共聚物，其特征在于：
(1)以甲基丙烯酸(MAA)为pH敏感单体，采用甲基丙烯酸(MAA)与疏水基团甲基丙烯酸甲酯(MMA)的共聚嵌段形式构成pH敏感片段，其结构式为：
Figure GSB0000182973360000032
其中，x＝20～40，y＝20～50，数均分子量为2000～12000g/mol，MAA中含有可离子化的羧基，其pKa值为5.0～6.5，当环境pH值小于pKa时，如人体胃液环境，其pH值为1.0～2.5，羧基去离子化，表现为疏水性，当环境pH值大于pKa时，如人体肠道坏境，其pH值为5.2～7.5，羧基发生解离，亲水性增加；
(2)以pH不敏感亲水性的甲基丙烯酸氨乙基酯为膜粘附性基团，其结构式为：
Figure GSB0000182973360000041
甲基丙烯酸氨乙基酯中含有氨基，在pH小于8时，易质子化带正电荷，可与带负电荷的小肠上皮细胞膜粘附层相互作用；
(3)两亲性嵌段共聚物能够在水溶液中自组装形成核-壳结构胶束，其中疏水单体与pH敏感单体互相缔合构成胶束疏水内核，提供一定体积的药物包载空间，亲水性的膜粘附单体伸展在外形成胶束的壳层，能够与小肠上皮细胞粘附层相互作用，发挥膜粘附作用，延长胶束在肠道内停留时间并打开细胞间紧密连接促进药物吸收，pH敏感性与膜粘附性互不干扰。
3、一种具有pH响应/膜粘附性的两亲性嵌段共聚物的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备膜粘附性单体叔丁氧羰基(Boc)保护的甲基丙烯酸氨乙基酯(Boc-AEMA)
将叔丁氧羰基保护的乙醇胺、二氯甲烷、三乙胺搅拌均匀，用冰盐浴冷却至0℃，将甲基丙烯酰氯用二氯甲烷稀释后缓慢滴入其中，滴加完后0℃下继续搅拌30min再移入室温下反应10～20h，反应结束后将反应液过滤，先用饱和碳酸氢钠溶液洗涤3次，再用去离子水洗涤3次，取有机相用适量无水硫酸镁干燥，抽滤，浓缩，沉淀，洗涤，抽滤，干燥，即得到膜粘附性单体Boc-AEMA；
(2)制备大分子引发剂P(MMA-co-tBMA)-Br
在惰性气体保护和无水条件下，将有机溶剂、pH敏感单体、疏水单体、还原剂、催化剂体系和引发剂混合，在60～100℃下反应1～4h，脱除催化剂，浓缩，沉淀，洗涤，过滤，干燥，即得到大分子引发剂P(MMA-co-tBMA)-Br；
(3)制备两亲性嵌段共聚物P(MMA-co-tBMA)-b-P(Boc-AEMA)
在惰性气体保护和无水条件下，将步骤(2)所得大分子引发剂P(MMA-co-tBMA)-Br、有机溶剂、膜粘附性单体、还原剂和催化剂体系混合，在50～100℃下反应12～24h，脱除催化剂，浓缩，沉淀，洗涤，过滤，干燥，即得到两亲性嵌段共聚物P(MMA-co-tBMA)-b-P(Boc-AEMA)；
(4)制备pH响应/膜粘附性两亲性嵌段共聚物P(MMA-co-MAA)-b-P(AEMA)
将步骤(3)所得两亲性嵌段共聚物P(MMA-co-tBMA)-b-P(Boc-AEMA)溶于适量二氯甲烷，用冰盐浴冷却至0℃，加入一定体积三氟乙酸，继续搅拌30min，再移入室温下继续反应12～24h，浓缩，沉淀，洗涤，过滤，干燥，即得到pH响应/膜粘附性两亲性嵌段共聚物P(MMA-co-MAA)-b-P(AEMA)。
4、根据3所述的制备方法，还在于：
所述疏水性单体为丙烯酸类单体中的甲基丙烯酸甲酯(MMA)；
所述pH敏感单体为甲基丙烯酸叔丁酯(tBMA)；
所述膜粘附性功能单体为甲基丙烯酸氨乙基酯；
所述步骤(2)和(3)中有机溶剂为甲苯；
所述步骤(2)和(3)催化剂体系为溴化铜(CuBr2)或氯化铜(CuCl2)与五甲基二亚乙基三胺(PMDETA)所组成的络合物，五甲基二亚乙基三胺与溴化铜的质量比为8～15，其制备方法可以是将溴化铜或氯化铜与五甲基二亚乙基三胺在20～25℃下搅拌30min；
所述步骤(2)和(3)还原剂为辛酸亚锡；
所述的步骤(2)中引发剂为2-溴异丁酸乙酯(EBriB)；
所述的步骤(2)中反应温度优选为70～80℃，反应时间优选为2～4h；
所述的步骤(3)中反应温度优选为80～85℃，反应时间优选为18～24h；
所述的步骤(2)和(3)中催化剂脱除是将反应混合液用四氢呋喃溶解稀释，过中性氧化铝层析柱除去催化剂，以四氢呋喃为洗脱剂。
所述步骤(2)中沉淀是将浓缩后所得的溶液滴加到相当于其体积10倍的甲醇与水混合液中，甲醇与水体积比为4∶1；
所述步骤(1)、(3)和(4)中沉淀是将浓缩后所得的溶液滴加到相当于其体积10倍的0℃正戊烷中沉淀；
所述步骤(4)是采用0℃的三氟乙酸同时脱除叔丁基和叔丁氧羰基，三氟乙酸的用量是pH响应单体与膜粘附性单体总摩尔量的10～20倍，优选为12～16倍；
所述步骤(1)中反应体系各物质的质量份数如下：
Figure GSB0000182973360000051
所述步骤(2)中反应体系各物质的质量份数如下：
Figure GSB0000182973360000052
Figure GSB0000182973360000061
所述步骤(3)中反应体系各物质的质量份数如下：
Figure GSB0000182973360000062
所述步骤(4)中反应体系各物质的质量份数如下：
两亲性嵌段共聚物 3～6份
二氯甲烷 50～80份
三氟乙酸 15～45份。
本发明的有益效果：
(1)本发明设计合成的pH响应/膜粘附性两亲性嵌段共聚物能够在水溶液中自组装形成核-壳结构胶束，其中，pH响应片段与疏水片段相互缔合构成胶束内核，提供一定体积的药物包载空间，亲水性的膜粘附性单体伸展在外形成壳层，发挥膜粘附作用。
(2)聚合物以pKa值为5.0～6.5的甲基丙烯酸作为pH响应单体，采用与疏水基团共聚形式，以甲基丙烯酸氨乙基酯作为膜粘附性单体，甲基丙烯酸氨乙基酯中含有氨基，在pH小于8时，易质子化带正电荷。一定单位的正电荷使胶束有效粘附在小肠上皮细胞，延长胶束在肠道内的停留时间，并打开细胞间紧密连接，促进药物吸收，同时pH敏感单体响应胃肠道pH值的差异发挥药物释放作用，pH响应与膜粘附性互不干扰。
(3)聚合物临界胶束浓度为0.0275mg/ml远低于表面活性剂临界胶束浓度，胶束纳米粒径较小，可用于多肽或蛋白类药物口服治疗应用的药物传输体系。
(4)所用制备方法具有操作简单，反应条件温和，催化剂用量少，产品质量优良等优点，并可以通过调节聚合物分子中pH响应基团或膜粘附基团的比例来满足不同口服药物的释放要求。
附图说明
图1为膜粘附性单体叔丁氧羰基保护的甲基丙烯酸氨乙基酯合成反应式。
图2为大分子引发剂P(MMA-co-tBMA)-Br合成反应式。
图3为两亲性嵌段共聚物P(MMA-co-tBMA)-b-P(Boc-AEMA)合成反应式。
图4为pH响应/膜粘附性两亲性嵌段共聚物P(MMA-co-MAA)-b-P(AEMA)合成反应式。
图5为实施例1中膜粘附性单体叔丁氧羰基保护的甲基丙烯酸氨乙基酯(Boc-AEMA)的核磁共振氢谱图(1H-NMR)，溶剂为氘代氯仿(d-CDCl3)。
图6为实施例1中大分子引发剂P(MMA-co-tBMA)-Br的核磁共振氢谱图(1H-NMR)，溶剂为氘代氯仿(d-CDCl3)。
图7为实施例1中两亲性嵌段共聚物P(MMA-co-tBMA)-b-P(Boc-AEMA)的核磁共振氢谱图(1H-NMR)，溶剂为氘代氯仿(d-CDCl3)。
图8为实施例1中所得pH响应/膜粘附性两亲性嵌段共聚物P(MMA-co-MAA)-b-P(AEMA)的核磁共振氢谱图(1H-NMR)，溶剂为氘代二甲基亚枫(d-DMSO)。
图9为实施例1中两亲性嵌段共聚物P(MMA-co-tBMA)-b-P(Boc-AEMA)的傅里叶红外图谱(FT-IR)。
图10为实施例1中所得pH响应/膜粘附性两亲性嵌段共聚物P(MMA-co-MAA)-b-P(AEMA)的傅里叶红外图谱(FT-IR)。
图11为实施例1中大分子引发剂P(MMA-co-tBMA)-Br的凝胶渗透色谱图(GPC)，流动相为四氢呋喃(THE)。
图12为实施例1两亲性嵌段共聚物P(MMA-co-tBMA)-b-P(Boc-AEMA)的GPC洗脱曲线。
图13为实施例1中pH响应/膜粘附性两亲性嵌段共聚物P(MMA-co-MAA)-b-P(AEMA)的GPC洗脱曲线。
图14为芘在不同浓度P(MMA-co-MAA)-b-P(AEMA)(实施例1产物)中的荧光光谱图。
图15为实施例1中P(MMA-co-MAA)-b-P(AEMA)的临界胶束浓度测试曲线。
图16为不同pH值下P(MMA-co-MAA)-b-P(AEMA)(实施例1产物)胶束溶液的粒径变化曲线。
图17为不同pH值下P(MMA-co-MAA)-b-P(AEMA)(实施例1产物)胶束溶液zeta电位变化曲线。
图18为pH＝2.3时实施例1中P(MMA-co-MAA)-b-P(AEMA)胶束溶液粒径分布图。
图19为pH＝7.3时实施例1中P(MMA-co-MAA)-b-P(AEMA)胶束溶液粒径分布图。
图20为pH＝2.3时实施例1中P(MMA-co-MAA)-b-P(AEMA)胶束溶液zeta电位分布图。
图21为pH＝7.3时实施例1中P(MMA-co-MAA)-b-P(AEMA)胶束溶液zeta电位分布图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明技术方案实施方式予以说明，但又不局限于以下实施例。
实施例1
(1)合成膜粘附性单体叔丁氧羰基(Boc)保护的甲基丙烯酸氨乙基酯(Boc-AEMA)
取100ml干燥圆底烧瓶置于冰盐浴中，加入10mL无水乙醇胺和40mL二氯甲烷，磁力搅拌15min，将30g二碳酸二叔丁酯(O)用50ml二氯甲烷溶解后缓慢滴加到圆底瓶烧中，滴加完后冰盐浴中继续搅拌20min，再转移至室温下反应12小时，反应结束后将反应液先用10％溶液洗涤3次，再用去离子水洗涤3次，取有机相用适量无水干燥2h，干燥后经减压抽滤、旋转蒸发得到无色透明黏稠状液体，40℃真空干燥24h得到Boc-保护的乙醇胺。
取100ml干燥的圆底烧瓶中置于冰盐浴中，加入Boc-保护的乙醇胺(10g)、二氯甲烷(10ml)和三乙胺(TEA，10ml)，磁力搅拌30min，将甲基丙烯酰氯(7.1ml)用二氯甲烷(12ml)稀释后缓慢滴加到圆底烧瓶中，滴加完后冰盐浴中继续搅拌20min，再转移至室温下继续反应15h，反应结束后将反应液减压抽滤，滤液先用饱和溶液洗涤3次，再用去离子水洗涤3次，取有机相用适量无水干燥2h，减压抽滤，旋转蒸发部分二氯甲烷，缓慢滴加到0℃正戊烷中沉淀，正戊烷洗涤，过滤，40℃下真空干燥24h，即得到膜粘附性功能单体Boc-AEMA。
(2)合成大分子引发剂P(MMA-co-tBMA)-Br(A∶B＝30∶35，A代表疏水性单体MMA，B代表PH敏感单体tBMA，比值为疏水段与PH敏感段长度比，下同)
取50ml干燥茄形瓶，称取(9mg，0.04mmol)置于其中，用翻口橡皮塞密封，抽真空-通氩气3次，在氩气保护下依次用注射器将甲苯(10mL)、MMA(3.180mL，30mmol)、tBMA(5.715mL，35mmol)和配体PMDETA(0.105mL)加入瓶中，磁力搅拌30min形成催化剂配合物，将还原剂(0.195mL，0.6mmol)溶于3ml甲苯并注入反应瓶，继续搅拌30min，用液氮进行3次冷冻-抽气-通气-升温循环，注入引发剂EBriB(0.147ml)，在75℃油浴中反应2h。反应结束后，冷却至室温，加入20ml四氢呋喃搅拌溶解聚合物，过中性氧化铝柱子除去催化剂(以四氢呋喃为洗脱剂)，将所得溶液通过旋转蒸发浓缩，浓缩液缓慢滴加到其体积十倍的0℃甲醇/水混合溶液(体积为4∶1)中沉淀，减压抽滤并用甲醇与水的混合溶液(体积为4∶1)洗涤3次，在40℃下真空干燥24h，即得到大分子引发剂P(MMA-co-tBMA)-Br，产品呈白色粉末状。
(3)合成两亲性嵌段共聚物P(MMA-co-tBMA)-b-P(Boc-AEMA)(AB∶C＝(30∶35)∶30，AB代表疏水单体与PH敏感单体的共聚嵌段即大分子引发剂，C代表膜粘附性单体Boc-AEMA，下同)
取50mL干燥茄形反应瓶，加入大分发剂P(MMA-co-tBMA)-Br(2.041g)(步骤(2)产物)，Boc-AEMA(1.72g)，(9mg，0.04mmol)，用翻口橡皮塞密封，抽真空-通氩气3次，在氩气保护下依次注入甲苯(12mL)、PMDETA(0.105ml)，磁力搅拌1h，使其溶解和形成催化剂配合物，将还原剂(0.195ml，0.6mmol)溶于3ml甲苯中再注入反应瓶中，继续搅拌30min，用液氮进行3次冷冻-抽气-通气-升温循环，置于80℃油浴中反应24h，反应结束后加入20ml四氢呋喃溶解聚合物，过中性氧化铝柱子除去催化剂(以四氢呋喃为洗脱剂)，所得溶液通过旋转蒸发浓缩，浓缩液缓慢滴加到0℃正戊烷中沉淀，减压抽滤并用正戊烷洗涤，40℃下真空干燥24h，即得到两亲性嵌段共聚物P(MMA-co-tBMA)-b-P(Boc-AEMA)，产品呈白色粉末状。
(4)合成pH响应/膜粘附性两亲性嵌段共聚物P(MMA-co-MAA)-b-P(AEMA)(A∶B∶C＝30∶35∶30，A代表疏水单体MMA，B代表PH敏感单体MAA，C代表膜粘附性单体AEMA，下同)
取50ml干燥圆底烧瓶置于冰盐浴中，加入0.5g两亲性嵌段共聚物P(MMA-co-tBMA)-b-P(Boc-AEMA)(步骤(3)产物)和6mL二氯甲烷，磁力搅拌20min，缓慢滴入三氟乙酸(3.5mL)，滴加完后在0℃下继续搅拌30min，再移至常温下反应15h，旋转蒸发除去二氯甲烷后加入4ml四氢呋喃使聚合物溶解，缓慢滴加到0℃正戊烷中沉淀，减压抽滤并用正戊烷洗涤，40℃下真空干燥24h，即得到pH响应/膜粘附性两亲性嵌段共聚物P(MMA-co-MAA)-b-P(AEMA)，产品呈白色粉末状。
实施例2
(1)膜粘附性单体叔丁氧羰基(Boc)保护的甲基丙烯酸氨乙基酯(Boc-AEMA)的合成同实施例1中步骤(1)。
(2)合成大分子引发剂P(MMA-co-tBMA)-Br(A∶B＝30∶45)
取50ml干燥茄形瓶，称取(9mg，0.04mmol)置于其中，用翻口橡皮塞密封，抽真空-通氩气3次，在氩气保护下依次用注射器将甲苯(12mL)、MMA(3.180mL，30mmol)、tBMA(7.35mL，45mmol)和配体PMDETA(0.130mL)加入瓶中，磁力搅拌30min形成催化剂配合物，将还原剂(0.195mL，0.6mmol)溶于3ml甲苯并注入反应瓶中，继续搅拌30min，用液氮进行3次冷冻-抽气-通气-升温循环，注入引发剂EBriB(0.147ml)，在75℃油浴中反应2h。反应完成后，冷却至室温，加入25ml四氢呋喃搅拌使其溶解稀释，过中性氧化铝柱子除去催化剂(以四氢呋喃为洗脱剂)，将所得溶液通过旋转蒸发浓缩，浓缩后缓慢滴加到十倍量甲醇/水(体积为4∶1)中沉淀，减压抽滤并用甲醇与水的混合液(体积为4∶1)洗涤3次，40℃下真空干燥24h，即得到大分子引发剂P(MMA-co-tBMA)-Br，产品呈白色粉末状。
(3)合成两亲性嵌段共聚物P(MMA-co-tBMA)-b-P(Boc-AEMA)(AB∶C＝(30∶45)∶30)
取50mL干燥茄形反应瓶，加入大分子引发剂P(MMA-co-tBMA)-Br(1.917g)(步骤(2)产物)，Boc-AEMA(1.376g)，(9mg，0.04mmol)，用翻口橡皮塞密封，抽真空-通氩气3次，在氩气保护下依次注入甲苯(12mL)、PMDETA(0.130ml)，搅拌使其溶解和形成催化剂配合物，将还原剂(0.195ml，0.6mmol)溶于3ml甲苯中再注入反应瓶中，继续搅拌30min，用液氮进行3次冷冻-抽气-通气-升温循环，置于80℃油浴中反应24h，反应结束后加入30ml四氢呋喃溶解聚合物，过中性氧化铝柱子除去催化剂(以四氢呋喃为洗脱剂)，所得溶液通过旋转蒸发浓缩，浓缩后缓慢滴加到0℃正戊烷中沉淀，减压抽滤并用正戊烷洗涤，40℃下真空干燥24h，得到两亲性嵌段共聚物P(MMA-co-tBMA)-b-P(Boc-AEMA)，产品呈白色粉末状。
(4)合成pH响应/膜粘附性两亲性嵌段共聚物P(MMA-co-MAA)-b-P(AEMA)(A∶B∶C＝30∶45∶30)
取50ml干燥圆底烧瓶置于冰盐浴中，加入0.5g步骤(3)所得嵌段共聚物P(MMA-co-tBMA)-b-P(Boc-AEMA)和6mL二氯甲烷，磁力搅拌20min，缓慢滴入三氟乙酸(4mL)，在0℃下反应30min，再移至常温下继续反应15h，旋转蒸发除去二氯甲烷后加入4ml四氢呋喃使聚合物溶解，缓慢滴加到0℃正戊烷中沉淀，减压抽滤并用正戊烷洗涤，40℃下真空干燥24h，即得到pH响应/膜粘附性两亲性嵌段共聚物P(MMA-co-MAA)-b-P(AEMA)，产品呈白色粉末状。
实施例3
芘荧光探针法测定pH响应/膜粘附性两亲性嵌段共聚物的临界胶束浓度。
(1)配制一定浓度的芘溶液：准确称取2.43mg芘溶于10ml丙酮中，移液至100ml容量瓶中，用丙酮定容，配成浓度为12×10-5M的芘溶液备用。取5ml 12×10-5M的芘溶液用丙酮稀释成6×10-5M。
(2)样品溶液的配制：称取10mg两亲性嵌段共聚物(实施例1产物)P(MMA-co-MAA)-b-P(AEMA)溶于3ml丙酮中，搅拌下准确加入10ml去离子水，搅拌过夜使丙酮完全挥发，得到1mg/ml聚合物母液，将聚合物母液稀释成一系列0.0001～1mg/ml的溶液，取10支10ml干净容量瓶，每支加入0.1ml 6×10-5M芘溶液，然后加入上述一系列不同浓度的聚合物溶液配制成样品液，使每支容量瓶中芘的浓度为6×10-7M。
(3)荧光光谱测试：以373nm波长发射，激发和发射的宽带均为1.25nm，在范围为300～350nm的波长内扫描，以与处吸收强度比与聚合物浓度对数作图，图中/比值增加的转折点即为聚合物的临界胶束浓度，详细曲线见图15，P(MMA-co-MAA)-b-P(AEMA)的临界胶束浓度为0.0275mg/ml，远低于普通表面活性剂的CMC值，如十二烷基硫酸钠的CMC值为2.31mg/ml。
实施例4
制备聚合物胶束溶液并测试不同pH值下胶束溶液粒径大小和zeta电位。
采用透析法制备pH敏感/膜粘附性双功能两亲性嵌段共聚物胶束溶液。称取100mgP(MMA-co-MAA)-b-P(AEMA)(实施例1产物)溶于20mlDMF中，室温下搅拌12小时，然后将聚合物溶液转移至预先处理的透析袋中(MWCO 3500)，置于1L去离子水中，常温下透析24小时，前12小时内，每2小时更换一次去离子水，后12小时，每6小时更换一次去离子水，透析完毕，将所得胶束溶液用0.45μm过滤膜过滤后移入100ml容量瓶中，用去离子水定容，取一定体积的胶束溶液用0.1mol/lHCl盐酸调节其pH值，室温下用马尔文电位粒度仪表征其不同pH值下胶束粒径大小和zeta电位。胶束溶液粒径大小随pH值不同而不同，pH在2～3时胶束溶液澄清，平均粒径为500nm，pH在6.5～7.5时胶束溶液变浑浊，平均粒径为100nm～200nm，具有pH敏感性；zeta电位亦随着pH值不同而不同，pH在2～3时zeta电位大于40mv，pH在7～8时zeta电位有所降低但仍大于20mv，较高的正电荷使其具有膜粘附性。

Claims (7)

1.一种pH响应/膜粘附性两亲性嵌段共聚物，其特征在于：两亲性嵌段共聚物的结构式为：
Figure FSB0000185720380000011
其中，x＝20～40，y＝20～50，z＝20～50，数均分子量为5000～20000g/mol。
2.根据权利要求1所述的一种pH响应/膜粘附性两亲性嵌段共聚物，其特征在于：
(1)以甲基丙烯酸(MAA)为pH敏感单体，采用甲基丙烯酸(MAA)与疏水基团甲基丙烯酸甲酯(MMA)的共聚嵌段形式构成pH敏感片段，其结构式为：
Figure FSB0000185720380000012
其中，x＝20～40，y＝20～50，数均分子量为2000～12000g/mol，MAA中含有可离子化的羧基，其pKa值为5.0～6.5，当环境pH值小于pKa时，羧基去离子化，表现为疏水性，当环境pH值大于pKa时，羧基发生解离，亲水性增加；
(2)以pH不敏感亲水性的甲基丙烯酸氨乙基酯为膜粘附性基团，其结构式为：
Figure FSB0000185720380000013
甲基丙烯酸氨乙基酯中含有氨基，在pH小于8时，易质子化带正电荷，可与带负电荷的小肠上皮细胞膜粘附层相互作用；
(3)两亲性嵌段共聚物能够在水溶液中自组装形成核-壳结构胶束，其中疏水单体与pH敏感单体互相缔合构成胶束疏水内核，提供一定体积的药物包载空间，亲水性的膜粘附单体伸展在外形成胶束的壳层，能够与小肠上皮细胞粘附层相互作用，发挥膜粘附作用，延长胶束在肠道内的停留时间并打开细胞间紧密连接促进药物吸收，pH敏感性与膜粘附性互不干扰。
3.一种具有pH响应/膜粘附性的两亲性嵌段共聚物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备膜粘附性单体叔丁氧羰基(Boc)保护的甲基丙烯酸氨乙基酯(Boc-AEMA)
将叔丁氧羰基保护的乙醇胺、二氯甲烷、三乙胺搅拌均匀，用冰盐浴冷却至0℃，将甲基丙烯酰氯用二氯甲烷稀释后缓慢滴入其中，滴加完后0℃下继续搅拌30min再移入室温下反应10～20h，反应结束后将反应液过滤，先用饱和碳酸氢钠溶液洗涤3次，再用去离子水洗涤3次，取有机相用适量无水硫酸镁干燥，抽滤，浓缩，沉淀，洗涤，抽滤，干燥，即得到膜粘附性单体Boc-AEMA；
(2)制备大分子引发剂P(MMA-co-tBMA)-Br
在惰性气体保护和无水条件下，将有机溶剂、pH敏感单体、疏水单体、还原剂、催化剂体系和引发剂混合，在60～100℃下反应1～4h，脱除催化剂，浓缩，沉淀，洗涤，过滤，干燥，即得到大分子引发剂P(MMA-co-tBMA)-Br；
(3)制备两亲性嵌段共聚物P(MMA-co-tBMA)-b-P(Boc-AEMA)
在惰性气体保护和无水条件下，将步骤(2)所得大分子引发剂P(MMA-co-tBMA)-Br、有机溶剂、膜粘附性单体、还原剂和催化剂体系混合，在50～100℃下反应12～24h，脱除催化剂，浓缩，沉淀，洗涤，过滤，干燥，即得到两亲性嵌段共聚物P(MMA-co-tBMA)-b-P(Boc-AEMA)；
(4)制备pH响应/膜粘附性两亲性嵌段共聚物P(MMA-co-MAA)-b-P(AEMA)
将步骤(3)所得两亲性嵌段共聚物P(MMA-co-tBMA)-b-P(Boc-AEMA)溶于适量二氯甲烷，用冰盐浴冷却至0℃，加入一定体积三氟乙酸，继续搅拌30min，再移入室温下继续反应12～24h，浓缩，沉淀，洗涤，过滤，干燥，即得到pH响应/膜粘附性两亲性嵌段共聚物P(MMA-co-MAA)-b-P(AEMA)；
所述疏水单体为丙烯酸类单体中的甲基丙烯酸甲酯(MMA)；
所述pH敏感单体为甲基丙烯酸叔丁酯(tBMA)；
所述步骤(2)中反应体系各物质的质量份数如下：
Figure FSB0000185720380000021
所述步骤(3)中反应体系各物质的质量份数如下：
Figure FSB0000185720380000022
Figure FSB0000185720380000031
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：
所述步骤(2)和(3)中有机溶剂为甲苯；
所述步骤(2)和(3)催化剂体系为溴化铜(CuBr2)与五甲基二亚乙基三胺(PMDETA)所组成的络合物，五甲基二亚乙基三胺与溴化铜的质量比为8～15；
所述步骤(2)和(3)还原剂为辛酸亚锡；
所述的步骤(2)中引发剂为2-溴异丁酸乙酯(EBriB)；
所述步骤(1)中反应体系各物质的质量份数如下：
Figure FSB0000185720380000032
所述步骤(4)中反应体系各物质的质量份数如下：
两亲性嵌段共聚物 3～6份
二氯甲烷 50～80份
三氟乙酸 15～45份。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述沉淀是将浓缩后所得的溶液滴加到相当于其体积10倍的甲醇与水混合液中，甲醇与水体积比为4∶1。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)和(3)所述沉淀是将浓缩后所得的溶液滴加到相当于其体积10倍的0℃正戊烷中沉淀。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)是采用0℃的三氟乙酸同时脱除叔丁基和叔丁氧羰基。
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