MXPA05010471A - Profarmacos inhibidores de quinasa pi-3. - Google Patents

Profarmacos inhibidores de quinasa pi-3.

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Abstract

La invencion proporciona profarmacos novedosos de inhibidores de quinasa PI-3. Los compuestos novedosos son LY294002 y los analogos de los mismos comprenden una amina reversiblemente cuaternizada.

Description

PROFÁRMACOS INHIBIDORES DE QUINASA PI-3 ANTECEDENTE DE LA INVENCIÓN 1. Campo de la invención La presente invención se relaciona a profármacos inhibidores de Pl-quinasa y métodos para usar estos inhibidores . 2. Técnica Relacionada a la Descripción Las quinasas PI-3 son una gran familia de quinasas del lipido que los fosfatidilinositol de fosforilato en la posición D3 generan un segundo mensajero importante, el 3' -fosfato de fosfatidilinositol . Los miembros de la familia quinasa PI-3 se dividen en 3 clases basadas en la homología de secuencia y el producto formado por catálisis de enzima. Las quinasas PI-3 de clase I son compuestos de 2 subunidades: una subunidad catalítica de 110 kd y una subunidad reguladora de 85 kd. Las quinasas PI-3 de clase I están involucradas en los eventos de transducción de señal importante corriente abajo de citocinas, integrinas, factores de crecimiento e immunoreceptores , que sugieren que el control de esta trayectoria pueda llevar a efectos terapéuticos importantes. La inhibición de quinasa PI-3 clase I induce al apóptosis, bloquea el tumor inducido por angiogénesis in vivo e incrementa la radiosensitividad de ciertos tumores.
LY294002 (2- (4-morfolinil) -8-fenil-4H-l-benzopiran-4-ona (Compuesto 1) es un inhibidor especifico bien conocido d quinasa PI-3 clase I y se ha demostrado por poseer la propiedades anti-cancerigenas .
(Compuesto 1) Sin embargo, las solicitudes de anti-cáncer de LY294002 se limitan severamente por su falta de solubilidad acuosa y sus farmacocinéticos escasos. Además, LY294002 no tiene propiedades especificas de tejido y se ha demostrado ser rápidamente metabolizado en animales. Debido a estos factores, LY294002 necesitarían administrarse a los intervalos frecuentes y así tendrían el potencial para también inhibir quinasas PI-3 en células normales por lo que llevan a efectos secundarios indeseables. Continúa siendo una necesidad para los inhibidores de quinasa PI-3 clase I con farmacocinéticos mejorados y propiedades farmacodinámicas . La presente invención cumple estas necesidades y proporciona otras ventajas relacionadas.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona a procompuestos que comprenden un nitrógeno cuaternario, en donde un enlace del nitrógeno cuaternario es hidrolizable y después de que la hidrólisis del enlace da un compuesto de la fórmula : en donde, Ri y R2 son independientemente H, alifático opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, hidroxilo, halógeno, alcoxi, heterociclo, ciano, amino, o, se toman juntos para formar un cicloalifático opcionalmente sustituido o arilo opcionalmente sustituido; R3 representa H, alifático opcionalmente sustituido, y arilo opcionalmente sustituido; y R4 y R5 son independientemente H, alifático opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heterociclo, ariloxi, carboxi, o, se toman juntos para formar un heterociclo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido. El pro-compuesto puede ser de la fórmula: en donde, el anillo ? es benzo; Zi y Z2 son independientemente S u 0; Ri y R2 son independientemente H, alifático opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, hidroxilo, halógeno, alcoxi, heterociclo, ciano, amino, o, se toman juntos para formar cicloalifáticos opcionalmente sustituidos o arilo opcionalmente sustituido; R3 representa H, alifático opcionalmente sustituido, y arilo opcionalmente sustituido; R4 y R5 son independientemente H, alifático opcionalmente sustituido, el arilo opcionalmente sustituido, heterociclo, ariloxi, carboxi, o, se toman juntos para formar un heterociclo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido; R6 representa H, alifático opcionalmente sustituido, arilo, carboxi, amino, heterociclo, ariloxi, opcionalmente sustituido y un agente objetivo opcionalmente sustituido con el mismo; y L representa un grupo enlazador.
El agente objetivo puede ser una vitamina, péptido, proteiría, liposoma, agente de búsqueda de hueso o agente de búsqueda de cartílago. La presente invención también se relaciona a los compuestos intermedios de la fórmula: en donde, X representa un grupo de halo, preferentemente Cl o I; Y representa -CH2-, -CH(CH3)-, -CHCPh)-, -C (CH3) (COOH) - o CH (CH (CH3) 2) -; i y Z2 son independientemente S u 0; y n = 0 a 1. La presente invención también se relaciona al uso de los pro-compuestos para el tratamiento de una condición asociada con la actividad quinasa PI-3, enfermedad inflamatoria, degeneración macular relacionada con la edad, condiciones asociadas con PTEN mutante, hipertensión, pancreatitis, úlceras, cáncer, disrupción de la función de leucocito; inducción de apóptosis; mejorar la quimiosensivilidad de células de tumor; mejorar la radiosensitividad de células de tumor; inhibir la angiogénesis inducida por tumor; inhibir los procesos angiogénicos asociados con enfermedades no cancerígenas; mejorar el funcionamiento de un stent; inhibir la fosfatidilinositol 3-quinasa en una célula entera de un paciente, que comprende administrar a un paciente con necesidad del mismo una cantidad efectiva de una composición que comprende los pro-compuestos de la presente invención. Los pro-compuestos pueden administrarse al paciente por fusión I.V. lenta. La presente invención también se relaciona a un método para suprimir la diferenciación de células progenitoras que comprenden contactar células progenitoras con una cantidad efectiva de una composición que comprende un pro-compuesto de la presente invención. La presente invención también se relaciona a la purificación de los pro-compuestos de la presente invención que comprende la adición de los pro-compuestos a una solución que comprende al menos 0.1% de ácido (v/v) . La solución que comprende el pro-compuesto es la cromatografía, preferentemente por HPLC, para aislar el pro-compuesto.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra la estructura química de EDTMP, DOTMP, ABDTMP, BAD, MTX-BP y CF-BP. La Figura 2 muestra las estructuras químicas de agentes objetos de hueso potencial. La Figura 3 muestra la reacción química para modificar un fosfonato en un agente objetivo del hueso. La Figura 4 muestra la reacción del alquilación para modificar un fosfonato en un agente objetivo del hueso. La Figura 5 muestra un concepto por modificar EDTMP y DOTMP químicamente. La Figura 6 muestra la inhibición de fagocitosis por LY294002 en células de J774. Las columnas indican índice fagocítico o porcentaje de células positivas para la respuesta fagocítica. El índice fagocítico es el número de sRBC' s (glóbulos rojos de oveja) encontrado por las células 100 J774 y el % de células fagocíticas es el % de células J774 que ha fagocitizado al menos 1 sRBC. Las barras de error representan desviación estándar de medio. La Figura 7 muestra Cromatogramas UV y ELS del Compuesto 1126 (?036-33) . La Figura 8 muestra el Espectro de Masa Positivo del Compuesto 1126 (?036-33) . La Figura 9 muestra que los inhibidores de quinasa PI 3 objetivo ??ß3 han invalidando la formación del tubo de las células EDC-CBF1 endoteliales en Matrigel.
DESCRIPCIÓN DETALLADA Antes de que los presentes compuestos, productos y composiciones y métodos se divulguen y describan, se entenderá que la terminología utilizada en la presente es para el propósito de describir sólo modalidades particulares y no se pretende limitar. Debe observarse que, como se utiliza en la especificación y las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un, " "una" y "el" incluyen los referentes plurales a menos que el contexto lo estipule claramente de otra manera. A través de esta solicitud, dónde se hace referencia a las publicaciones, las descripciones de estas publicaciones en sus totalidades se incorporan por la presente para referencia en esta solicitud para describir más completamente el estado de la técnica al cual pertenece esta invención . 1. Definiciones El término "ramificado" como se utiliza en la presente se refiere a un grupo que contiene de 1 a 24 átomos de la estructura base en donde la cadena de la estructura base del grupo contiene una o más ramificaciones subordinadas de la cadena principal, los grupos ramificados preferidos en la presente contienen de 1 a 12 átomos de la estructura base. Los ejemplos de los grupos ramificados incluyen, pero no se limitan a, isobutilo, t-butilo, isopropilo, -CH2CH2CH(CH3)CH2CH3, -CH2CH (CH2CH3) CH2CH3, -CH2CH2C (CH3) 2CH3, -CH2CH2C (CH3) 3 y similares. El término "no ramificado" como se utiliza en la presente se refiere a un grupo que contiene de 1 a 24 átomos de la estructura base en donde la cadena de la estructura base del grupo se extiende en una linea directa. Los grupos no ramificados preferidos en la presente contienen de 1 a 12 átomos de la estructura base. El término "cíclico" o "ciclo" como se utiliza en la presente sólo o en combinación se refiere a un grupo que tiene uno o más anillos cerrados, ya sea saturados o insaturados, que poseen anillos de 3 a 12 átomos de la estructura base, preferentemente 3 a 7 átomos de la estructura base. El término "inferior" como se utiliza en la presente se refiere a un grupo con 1 a 6 átomos de la estructura base. El término "saturado" como se utiliza en la presente se refiere a un grupo dónde todos los enlaces de valencia disponible de los átomos de la estructura base se unen a otros átomos. Los ejemplos representativos de los grupos saturados incluyen, pero no se limitan a, butilo, ciclohexilo, piperidina y similares. El término "insaturado" como se utiliza en la presente se refiere a un grupo dónde al menos un enlace de valencia disponible de dos átomos de estructura base adyacente no se une a otros átomos. Los ejemplos representativos de los grupos insaturados incluyen, pero no se limitan a, -CH2CH2CH=CH2, fenilo, pirrol y similares. El término "alifático" como se utiliza en la presente se refiere a un grupo de hidrocarburo cíclico ramificado o no ramificado, el cual puede estar sustituido o no sustituido y el cual puede estar saturado o insaturado, pero el cual no es aromático. El término alifático además incluye grupos alifáticos los cuales comprenden oxígeno, nitrógeno, azufre o átomos fosforosos que reemplazan uno o más carbonos de la estructura base del hidrocarburo. El término "aromático" como se utiliza en la presente se refiere a un grupo de hidrocarburo cíclico insaturado que tiene electrones p(??) 4n+2 desubicados, los cuales pueden sustituirse o no sustituirse. El término aromático además incluye grupos aromáticos, que comprenden un átomo de nitrógeno que reemplaza uno o más carbonos de la estructura base del hidrocarburo. Los ejemplos de los grupos aromáticos incluyen, pero no se limitan a, fenilo, naftilo, tienilo, furanilo, piridinilo, (is)oxazoilo y similares. El término "sustituido" como se utiliza en la presente se refiere a un grupo que tiene uno o más hidrógenos u otros átomos reemplazados de un carbono o heteroátomo adecuado y reemplazado con un grupo adicional. Los grupos sustituidos preferidos en la presente se sustituyen con uno a cinco, más preferentemente uno a tres sustituyentes . Un átomo con dos sustituyentes se denota con "di," considerando que un átomo con más de dos sustituyentes se denotado por "poli." Los ejemplos representativos de tales sustituyentes incluyen, pero no se limitan a los grupos alifáticos, grupos aromáticos, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, alcoxi, halo, ariloxi, carbonilo, acrilo, ciano, amino, nitro, grupos que contienen fosfato, grupos que contienen azufre, hidroxilo, alquilcarboniloxi, arilcarboniloxi, alcoxicarboniloxi, ariloxicarboniloxi, alquilcarbonilo, arilcarbonilo, alcoxicarbonilo, aminocarbonilo, alquilaminocarbonilo, dialquilaminocarbonilo, alquiltiocarbonilo, acilamino, amidino, imino, alquiltio, ariltio, tiocarboxilato, alquilsulfinilo, trifluorometilo, azido, heterociclilo, alquilarilo, heteroarilo, semicarbazido, tiosemicarbazido, maleimido, oximino, imidato, cicloalquilo, cicloalquilcarbonilo, dialquilamino, arilcicloalquilo, arilcarbonilo, arilalquilcarbonilo, arilcicloalquilcarbonilo, arilfosfinilo, arilalquilfosfinilo, arilcicloalquilfosfinilo, arilfosfonilo, arilalquilfosfonilo, arilcicloalquilfosfonilo, arilsulfonilo, arilalquilsulfonilo, arilcicloalquilsulfonilo, combinaciones de los mismos y sustituciones de los mismos. El término "no sustituido" como se utiliza en la presente se refiere a un grupo que no tiene ningún grupo extenso ató a esto o sustituido por esto. El término "alquilo" como se utiliza en la presente o en combinación se refiere a un grupo alifático saturado, ramificado o no ramificado. Los ejemplos representativos de los grupos alquilo incluyen, pero no se limitan a, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, ter-butilo, octilo, decilo, tetradecilo, hexadecilo, eicosilo, tetracosilo y similares. El término "alquenilo" como se utiliza en la presente o en combinación se refiere a un grupo alifático ramificado o no ramificado, insaturado que contiene al menos un enlace doble de carbono-carbono que puede ocurrir en cualquier punto estable a lo largo de la cadena. Los ejemplos representativos de los grupos alquenilo incluyen, pero no se limitan a, etenilo, E- y Z-pentenilo, decenilo y similares. El término "alquilo" como se utiliza en la presente o en combinación se refiere a un grupo alifático ramificado o no ramificado, insaturado que contiene al menos un enlace triple carbono-carbono que puede ocurrir en cualquier punto estable a lo largo de la cadena. Los ejemplos representativos de los grupos alquilo incluyen, pero no se limitan a, etinilo, propinilo, propargilo, el butinilo, hexinilo, decinilo y similares. El término "arilo" como se utiliza en la presente o en combinación se refiere a un grupo aromático sustituido o no sustituido que puede fundirse opcionalmente a otros grupos cíclicos aromáticos o no-aromáticos. Los ejemplos representativos de los grupos arilo incluyen, pero no se limitan a, fenilo, bencilo, naftilo, bencilidino, xílilo, estireno, estirilo, fenetilo, fenileno, bencentriilo y similares . El término "alcoxi" como se utiliza en la presente o en combinación se refiere a un grupo alquilo, alquenilo o alquilo unido a través de una sola unión de éter terminal. Los ejemplos de los grupos de alcoxi incluyen, pero no se limitan a, metoxi, etoxi, n-propoxi, iso-propoxi, n-butoxi, 2-butoxi, tert-butoxi, n-pentoxi, 2-pentoxi, 3-pentoxi, el isopentoxi, neopentoxi, n-hexoxi, 2-hexoxi, 3-hexoxi, 3-metilpentoxi, tluorometoxi, difluorometoxi, trifluorometoxi, clorometoxi, diclorometoxi y triclorometoxi . El término "ariloxi" como se utiliza en la presente o en combinación se refiere a un grupo arilo unido a través de una sola unión de éter terminal. El término "halógeno," "halido "o "halo" como se utiliza en la presente o en combinación se refiere a flúor "F", cloro "Cl", bromo "Br", yodo "I" y astatina "At". Los ejemplos representativos de los grupos halo incluyen, pero no se limitan a, cloroacetamido, bromoacetamido, idoacetamido y similares . El término "hetero" como se utiliza en la presente la combinación se refiere a un grupo que incluye uno o más átomos de cualquier elemento diferente a carbono o hidrógeno. Los ejemplos representativos de los grupos hetero incluyen, pero no se limitan a, aquellos grupos que contienen heteroátomos incluyen, pero no se limitan a, nitrógeno, oxigeno, azufre y fósforo. El término "heterociclo" como se utiliza en la presente se refiere a un grupo cíclico que contiene un heteroátomo. Los ejemplos representativos de heterociclos incluyen, pero no se limitan a, piridina, piperadina, pirimidina, piridazina, piperazina, pirrol, pirrolidinona, pirrolidino, morfolina, tiomorfolina, indol, isoindol, imidazol, triazol, tetrazol, furano, benzofurano, dibenzofurano, tiofeno, tlazol, benzotiazol, benzoxazol, benzotiofeno, quinolina, isoquinolina, azapina, naftopirano, furanobenzopiranona y similares . El término "carbonilo" o "carboxi" como se utiliza en la presente o en combinación se refiere a un grupo que contiene el enlace doble de un carbono-oxígeno. Los ejemplos representativos de los grupos que contienen un carbonilo incluyen, pero no se limitan a, aldehidos (es decir, formilos), cetonas (es decir, acilos) , ácidos carboxílicos (es decir, carboxilos) , amidas (es decir, amidos) , imidas (es decir, imidos), ésteres, anhídridos y similares. El término "acrilo" como se utiliza en la presente o en combinación se refiere a un grupo representado por CH2=C (Q) C (0) 0- donde Q es un grupo alifático o aromático. El término "ciano," "cianato" o "cianuro" como se utiliza en la presente o en combinación se refiere a un enlace doble carbono-nitrógeno. Los ejemplos representativos de los grupos ciano incluyen, pero no se limitan a, isocianato, isotiocianato y similares. El término "amino" como se utiliza en la presente o en combinación se refiere a un grupo que contiene un átomo de nitrógeno de estructura base. Los ejemplos representativos de los grupos aminados incluyen, pero no se limitan a, alquilamino, dialquilamino, arilamino, diarilamino, alquilarilamino, alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, carbamoilo, ureido y similares. El término "grupo que contiene fosfato" como se utiliza en la presente se refiere al menos a un grupo que contiene un átomo fosforoso en un estado oxidado. Los ejemplos representativos incluyen, pero no se limitan a, ácidos fosfónicos, ácidos fosfinicos, ésteres de fosfato, fosfinidenos, fosfinos, fosfinilos, fosfinilidonas, fosfos, fosfonos, fosforanilos, fosforanilidonas, fosforosos y similares . El término "grupo que contiene azufre" como se utiliza en la presente se refiere a un grupo que contiene un átomo de azufre. Los ejemplos representativos incluyen, pero no se limitan a, sulfhidrílos, sulfenos, sulfinos, sulfinilo, sulfos, sulfonilo, tios, tioxos y similares. El término "optativo" u "opcionalmente" como se utiliza en la presente significa que el evento o circunstancia como se describe subsecuentemente pueden o no ocurrir y que la descripción incluyendo casos dónde el evento o la circunstancia ocurre y los casos dónde no se hace. Por ejemplo, la frase "alquilo opcionalmente sustituido" significa que el grupo alquilo puede o no puede sustituirse y que la descripción incluye alquilo no sustituido y alquilo donde hay una sustitución. El término "cantidad efectiva", cuando se utiliza en referencia a un compuesto, producto o composición como se proporciona en la presente, significa una cantidad suficiente del compuesto, producto o composición para proporcionar el resultado deseado. La cantidad exacta requerida variará, dependiendo del compuesto, producto o composición particular utilizados, su modo de administración y similares. De este modo, no siempre es posible especificar una "cantidad efectiva" exacta. Sin embargo, una cantidad efectiva apropiada puede determinarse por un experto ordinario en la técnica informado por el descubrimiento instantáneo que utiliza sólo experimentación rutinaria. El término "adecuado" como se utiliza en la presente se refiere a un grupo que es compatible con los compuestos, productos o composiciones como se proporcionó en la presente. La aplicabilidad para el propósito establecido puede determinarse por un experto ordinario en la técnica que utiliza sólo' experimentación rutinaria. El término "hidrolizable" como se utiliza en la presente se refiere a, si el grupo es capaz de o propenso a hidrólisis (es decir, dividirse de la molécula o agruparse en dos o más nuevas moléculas o grupo) . 2. Compuestos La presente invención proporciona un compuesto, el cual en la división de un enlace de una amina cuaternaria proporciona un compuesto de la fórmula: (Compuesto 2) en donde, Anillo A es benzo; Zi y Z2 son independientemente S o 0; Ri y R2 son independientemente H, alifático opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, hidroxilo, halógeno, alcoxi, heterociclo, ciano, amino, o, se toman juntos para formar cicloalifáticos opcionalmente sustituidos o arilo opcionalmente sustituido; 3 representa H, alifático opcionalmente sustituido, y arilo opcionalmente sustituido; y R4 y R5 son independientemente H, alifático opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heterociclo, ariloxi, carboxi, o, se toman juntos para formar un heterociclo opcionalmente sustituidos juntos o heteroarilo opcionalmente sustituido. Preferentemente, la división de un enlace de una amina cuaternaria proporciona LY294002 (Compuesto 1) . La presente invención también proporciona un compuesto de la fórmula: (Compuesto 3) en donde, anillo A es benzo; Zi y Z2 son independientemente S u 0; Ri y R2 son independientemente H, alifático opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, hidroxilo, halógeno, alcoxi, heterociclo, ciano, amino, o, se toman juntos para formar cicloalifáticos opcionalmente sustituidos u- arilo opcionalmente sustituido; R3 representa H, alifático opcionalmente sustituido, y arilo opcionalmente sustituido; R4 y R5 son independientemente H, alifático opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heterociclo, ariloxi, carboxi, o, se toman juntos para formar un heterociclo opcionalmente sustituidos juntos o heteroarilo opcionalmente sustituido; y R6 representa H, alifático opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, alcoxi, carboxi, amino, heterociclo, ariloxi, y opcionalmente sustituido con el mismo un agente objeto; y L representa un grupo enlazador. En una modalidad preferida, los compuestos 2-3 de la presente invención son aquellos compuestos en donde, el anillo Rx A-R2 se selecciona del grupo que consiste de lo siguiente: En una modalidad preferida, los Compuestos 2-3 de la presente invención son aquellos compuestos donde, R4-N-R5 se seleccionan del grupo que consiste de lo siguiente: En otra modalidad los Compuestos 2-3 de la presente invención son aquellos compuestos donde, R6 se selecciona del grupo que consiste de lo siguiente: a. Enlazador En otra modalidad, el Compuesto 3 de la presente invención son aquellos compuestos donde, el grupo enlazador es hidrolizable. El grupo enlazador del profármaco puede dividirse por división enzimática o preferentemente por hidrólisis bajo condiciones fisiológicas que incluyen pero no se limitan a, las condiciones acuosas en animales vivientes, para proporcionar el Compuesto 2. La proporción de hidrólisis del grupo enlazador bajo las condiciones fisiológicas es preferentemente de aproximadamente 1 minuto de vida media a aproximadamente 48 horas de vida media. b. Hidrólisis El término "hidrolizable" como se utiliza en la presente se refiere a si el grupo es capaz de o propenso a hidrólisis (es decir, dividirse de la molécula o grupo en dos o más nuevas moléculas o grupos debido a la inserción neta de una molécula de agua) a una velocidad de aproximadamente 1 minuto de vida media a 48 hora de vida media. El grupo enlazador puede ser cualquier grupo que puede hidrolizarse o enzimáticamente dividirse para dar el Compuesto 2. En una modalidad preferida, el grupo enlazador es de la fórmula: Rf-¾-^ 4 R6 en donde, Z3 y Z son independientemente S o 0; y R7 representa -C¾~, -CH(CH3)-, -CH(Ph)-, -C(CH3) (COOH)- o CH(CH(CH3) 2)-.
Un ejemplo representativo de la hidrólisis del grupo enlazador del profármaco para dar el Compuesto 2 se presenta en el (Esquema 1) , en donde Z3 y Z4 independientemente es cada uno 0. La hidrólisis o la división enzimática del éster R6 da un hemiaminal que se colapsa con liberación del aldehido R7, por los que el Compuesto 2 de generación comprende una amina terciaria libre. R6 y R7 pueden seleccionarse para dar diferentes proporciones de conversión de regreso a la amina terciaria libre. Por ejemplo, sustitución incrementada a R6 o R7, o una combinación de la misma, puede incrementar la estabilidad hacia la hidrólisis. Además, los grupos eliminados de electrón en la porción R6 disminuyen la estabilidad. Además en la variación de Re o R7 descrita en la presente, los factores adicionales pueden variar la estabilidad de la amina cuaternaria en N. Bodor, Journal of Medicinal Chemistry 1980, vol 23 #5 pp 469-480 "Drugs Soft. 1. Labile Quaternary Ammonium Salts as Sofá Antimicrobials" ; y G. Brouillette et al; Journal of Pharmaceutical Sciences, 1996, vol 85 #6, pp620-623, los contenidos de las cuales se incorporan en la presente para referencia.
ESQUEMA 1 c. Agente objetivo En otra modalidad, los compuestos de la presente invención son aquellos compuestos donde, R6 demás comprende uno o más agentes (T) objetivo covalentemente unidos al mismo. Los agentes objetivos permiten a los profármacos de la presente invención enviar selectivamente a los tipos específicos de células, tejidos, órganos o estructuras extracelulares . Como se discutió anteriormente, el tratamiento con el Compuesto 1 (LY294002) sufre de biodisponibilidad escasa, metabolismo rápido y efectos secundarios porque el compuesto no es ningún tejido específico. Por consiguiente, es muy deseable limitar la ubicación del fármaco en esa área de tratamiento o al menos prevenirlo de alcanzar los tejidos dónde si puede provocar efectos secundarios y asegurarse en cualquier momento particular efectivo, pero no excesivo, se utilizan cantidades de fármaco. El uso de los agentes objetivos puede permitir a los profármacos de la presente invención concentrarse en el sitio de tratamiento en lugar de distribuirse uniformemente a lo largo del cuerpo entero o ser metabolizado prematuramente o excretó demasiado rápido. Entregándose una vez en el sitio de tratamiento, el enlazador puede enzimáticamente dividirse o hidrolizarse como se describió en lo anterior para dar el Compuesto 2. Además, el uso de los agentes objetivo puede limitar la dosificación requerida para administrarse para lograr una concentración efectiva del fármaco en el sitio de tratamiento. El uso de agentes objetivo también puede permitirse para la dosificación más poco frecuente o incluso los métodos alternativos de administración para lograr una concentración efectiva del fármaco en el sitio de tratamiento. El agente objetivo se une preferencialmente a los compuestos de la presente invención mediante un enlace covalente que puede formarse por los métodos incluyendo, pero no limitados a, un grupo nucleofilico o electrofilico del agente objetivo que se hace reaccionar covalentemente con un grupo electrofilico o nucleofilico (respectivamente) en el enlazador . En una modalidad de la presente invención, los Compuestos 2-3 de la presente invención son aquellos compuestos donde, R6-T se selecciona del grupo que consiste de lo siguiente: Los agentes objetivo que pueden hacerse reaccionar con los profármacos de la presente invención incluye, pero no se limita a, hidratos de carbono, vitaminas, péptidos, proteínas, nucleósidos , nucleótidos, ácidos nucleicos, liposomas, lípidos, agentes buscadores de huesos y agente de búsquedaes de cartílagos. El agente objetivo también puede ser una molécula que se une por un receptor en un tejido deseado y opcionalmente transportado en una célula por un proceso mediado por el receptor. Los ejemplos representativos de tales agentes objetivo incluyen, pero no se limitan a, diazepinas que se unen a los receptores benzodiazepina periféricos (PBRs) presentes en las células glial en el cerebro. Se discuten los ejemplos representativos de tales diazepinas en G. Trapani, et al. Bioconjugate Chem. 2003, vol 14, el pp830-839 "Periferal Benzodiazepine Receptor Ligand-Melphalan Conjugates for Potencial Selective Drug Delivery to Brian Tumors" los contenidos de las cuales se incorporan para referencia . Las vitaminas representativas que pueden usarse como agentes objetivo incluyen, pero no se limitan a, folato vitamina B12 o vitamina C. El término "folato" abarca los derivados de ácido fólicos con capacidad para unir con los receptores folato. Los ejemplos representativos de los folatos que pueden usarse como agentes objetivo incluyen, pero no se limitan a, ácido fólico, ácido folínico, ácido pteropoliglutámico, y pteridinas de enlace del receptor-folato tal como tetrahidropterinas , dihidrofolatos, tetrahidrofolatos y sus análogos deaza y dideaza. Otros folatos adecuados son análogo folato incluyendo, pero no limitados a, aminopterina, ametopterina (metotrexato) , Ni0-metilfolato, 2-deamino-hidroxifolato, análogos deaza tal como 1-deazametopterina o 3-deazametopterina, y 3' 5' -dicloro4-amino-4-desoxi-Nio-itietilpteroIl-ácido glutámico (diclorometotrexato) . Los métodos de las moléculas conjugadas a folatos que son adecuados para el enlace covalente a los compuestos de la presente invención en las patentes Norteamericanas Nos. 6,576,239, 5,820,847, 5,688,488, 5,108,921, 5,635,382 y 5,416,016 los contenidos de las cuales se incorporan en la presente para referencia. Los métodos para conjugar las moléculas a vitamina C que son adecuados para el enlace covalente del compuesto de la presente invención se describen en S. Manfrdini J. Med. Chem. Vol 45, pp559-562, 2002 los contenidos de las cuales se incorporan en la presente para referencia. Los péptidos y peptidomiméticos representativos que pueden usarse como agentes objetivo incluyen, pero no se limitan a, un péptido que contiene RGD seleccionado del grupo que consiste de RGDs, c(RGDfK), vitronectina, fibronectina, agonistas del receptor somatostatina y antagonistas del receptor somatostatina. Pueden usarse moléculas que se unen al receptor avb3 integrina y actúan como antagonistas que pueden usarse en agentes objetivo como se describe en la Patente Norteamericanas Nos. 6,552,079, 6,426,353B, WO 2002/40505A2 y Publicaciones de Patentes Norteamericanas 2002/0055499, 2002/0061885, 2002/0065291, 2002/0072500, U.S. 2002/0072518; W. Arap et al. Science vol 279, número 16, 1998, pp 377-380; RJ Kok et al. Biojonjugate Chem. 2002, vol 13, ppl28-135; DA Sipkins et. al.. Nature Medicine vol 4, number 5,1998 pp623-626; PM Winter et al. Cáncer Research 2003, vol 63, pp5838-5843; and JD Hood et al. Science vol 296, pp2404-2407; los contenidos de las cuales se incorporan en la presente para referencia. Las proteínas representativas que pueden usarse como agentes objetivo incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos o fragmentos de los mismos, tal como un anticuerpo monoclonal de tumor-específico o fragmento del mismo. Los agentes buscadores de hueso pueden usarse como agentes objetivo incluyendo, pero no se limitan a, fosfonato, ácido fosfónico, ácido aminometilfosfónico, fosfato, polifosfato y polipéptidos unidos por hidroxiapatita . Otros péptidos incluyen clorotoxin (SU6, 429, 187B1, ) y factor de tejido (G. M. Lanza, at al. "Targeted Antiproliferative Drug Delivery to Vascular Smooth Muscle Cells with a Magnetic Resonance Imaging Nanoparticle Contrast Agent"; Circulation, 2002 volume 106 pp2842-2847 ) . Otros agentes objetivo adecuados incluyen anticuerpos. Los anticuerpos pueden ser de clases IgG, IgM, IgA, IgD o IgE o fragmentos o derivados de los mismos, incluyendo Fab, F(ab' )2, Fd y anticuerpos de cadena sencilla, diacuerpos, anticuerpos específicos, anticuerpos bifuncionales y derivado de los mismos. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal, anticuerpo policlonal, anticuerpo de afinidad purificada o mezclas de los mismos los cuáles muestran especificidad de enlace suficiente a un epitope deseado o una secuencia derivada de los mismos. Los anticuerpos pueden ser un anticuerpo quimérico. Los anticuerpos pueden dirigirse contra una variedad de determinantes antigénicos que incluyen aquéllos asociados con tumores, histocompatibilidad y otros antígenos de superficie de célula, bacteria, hongo, virus, enzimas, toxinas, fármacos y otras moléculas biológicamente activas. Los antígenos asociados con tumores para los cuales los anticuerpos pueden específicamente ser reactivos incluyen, pero no se limitan a, tales antígenos como se incluyen, pero no se limita a, antígeno carcinoembriónico (CEA) , mucinas tal como TAG-72, antígenos de glóbulos grasos de leche humana, antiagente de suero de próstata (PSA) , antígeno de membrana específica próstata (PSMA) , PS (fosfatidil serina) y receptores incluyendo, pero no se limitan a, IL-2, EGF, VEGF y receptores de transferina. Otros antígenos representativos asociados con tumores incluyen, pero no se limitan a, aquellos tumores asociados a antígenos descritos en Zalcberg y McKenzie, J. Clin. Oncology, vol. 3; p . 876-82 (1985), WO 01/68709A1, y Publicación de Patente Norteamericana US2004/0009122A1, los contenidos de las cuales se incorporan en la presente para referencia. Otros agentes objetivo adecuados incluyen glucosa, galactosa, mannosa, mannosa 6-fosfato, hormonas (por ejemplo insulina, hormona de crecimiento, y similares) , los factores de crecimiento o citocinas (por ejemplo TGFB, EGF, factor de crecimiento similar a insulina, y similares) , YEE (GalNAcAH) . sub.3 o derivados, cobalamina, a-2 macroglobulinas, asialoglicoproteina, albúmina, texapirina, metalotexapirina, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo (por ejemplo Fab) , región variable de anticuerpo de cadena sencilla (scFv) , transferina, cualquier vitamina y cualquier coenzima. El agente objetivo también puede ser un agente que envía el profármaco a los huesos. Los agentes objetivo del hueso incluyen, pero no se limitan a, EDTMP DOTMP, y ABEDTMP que se describen en las patentes Norteamericanas No. 4,937,333, 4,882,142, 5,064,633 y WO-94/00143, los contenidos de las cuales se incorporan en la presente para referencia. Pueden unirse DOTMP y EDTMP a la porción del enlazador por cualquier método incluyendo, pero no limitado a, la química de acoplamiento mostrada en Figura 3 y la química de alquilación mostrada en la Figura 4 donde el grupo de R puede tener un grupo electrofílico o nucleofílico apropiado que reacciona con el grupo nucleofílico o electrofílico (respectivamente) de la porción del enlazador. Se proporcionan detalles - adicionales de la química de acoplamiento en Tetrahedro 1999,55, ppl2997-13010, los contenidos de las cuales se incorporan para referencia. Se proporcionan detalles adicionales de la química de alquilación en Proc. SPIE-Int. Soc. Opte. Eng. 1999,3600 (Biomedical Imagn. Reporters Dyes & Instrumental, pp99-106; patente Norteamericana No. 5,177, 054; J Med. C em. 1994,37, 498-511 ; Tetrahedron Letters, 1989, 30 #51 pp7141-7144 ; y patente Norteamericana No. 5,955, 453, los contenidos de las cuales se incorporan para referencia. El agente objetivo puede usarse para enviar el profármaco a los huesos como un sitio de depósito de descarga lenta para los compuestos de la presente invención. El agente objetivo puede ser una porción que busca el hueso (osteotrópico) unida a los compuestos de la presente invención mediante un enlazador dividible del ácido unido a la amina cuaternaria. Los ejemplos de un enlazador dividible por ácido incluyen, pero no se limitan a, un enlace orto ácido-amida. Bajo las condiciones acídicas el enlace de amida proteína-ACL-3 se divide fácilmente que libera el grupo amino nativo de la funcionalidad amida como se describe en WO-94/00143 los contenidos de la cual se incorpora para referencia. Durante la resorción del hueso osteoclástico, que involucra un mecanismo mediado acídico, el enlace que une el profármaco para deshuesar puede ser dividirse liberando los compuestos de la presente invención. El agente objetivo utilizado para enviar los profármacos a los huesos, puede ser una molécula que se une con receptores de la muesca. La señalización de la muesca representa un papel clave en el desarrollo y diferenciación de varias cepas hematopoyéticas . Como se discutió en Jundt et al., Blood, 102(11): 928a (2003), la señalización de muesca inducida por ligando es un factor de crecimiento novedoso para las células de mieloma múltiples y sugiere que estas interacciones contribuyen a linfomagenesis de mieloma múltiple in vivo. El agente objetivo del hueso puede tener una afinidad elevada por iones de calcio en hidroxiapatita, el constituyente principal de hueso. El compuesto de la invención puede ser diferente al hueso tal como los depósitos de calcio en las arterias, corazón, riñon o vesícula. Sin embargo, el agente objetivo del hueso ideal y selectivamente se une al tejido de hueso. Un agente objetivo del hueso de la invención se atrae al tejido del hueso del sujeto, preferentemente los enlaces al hueso con una afinidad más elevada que los tejidos sin hueso y permanece el enlace por una cierta longitud de tiempo por lo que entrega la composición a un ambiente del hueso. En otros términos, el agente objetivo del hueso preferentemente se une al tejido de hueso con al menos 2-dobleces de mayor afinidad (por ejemplo al menos 3-dobleces, al menos 5-dobleces, al menos 10-dobleces, o al menos 25-dobleces de mayor afinidad) que el agente objetivo del hueso se une a los tejidos sin hueso. El agente objetivo del hueso reversiblemente se une al tejido del hueso, significa que el agente objetivo del hueso se libera eventualmente desde el hueso y se expele del cuerpo. El agente objetivo del hueso puede permanecer unido al tejido del hueso durante un periodo suficiente de tiempo para permitir al profármaco cuaternario hidrolizable, por lo que envía el fármaco activo a las células objetivo (por ejemplo células de médula ósea) . El agente objetivo del hueso puede permanecer unido al hueso durante aproximadamente 1 día (por ejemplo, aproximadamente 2 días, aproximadamente 3 días o aproximadamente 7 días) a aproximadamente 1 año (por ejemplo, aproximadamente 330 días, aproximadamente 365 días o aproximadamente 400 días) después de lo cual el agente objetivo del hueso se expele del cuerpo. El agente objetivo del hueso puede permanecer unido al hueso durante aproximadamente 7 días (por ejemplo, aproximadamente 7 días, aproximadamente 14 días o aproximadamente 21 días) a aproximadamente 6 meses (por ejemplo, aproximadamente 90 días, aproximadamente 120 días o aproximadamente 150 días) . Por ejemplo, un profármaco objetivo de hueso puede permanecer unido al hueso por 30 días, durante el cual el tiempo del fármaco libera. Después de aproximadamente 45 días el agente objetivo del hueso se . libera del hueso y en eventualmente se excretaría. Así, un agente objetivo del hueso para el uso en la invención puede seleccionarse basado en los cinéticos ligados al tejido del hueso. Los agentes objetivo del hueso candidato pueden tamizarse in vitzo determinando afinidad al tejido del hueso (por ejemplo, hidroxiapatita) en, por ejemplo, un formato multi-pozo. Los agentes objetivo del hueso candidato también pueden tamizarse in vivo evaluando la proporción y temporización de excreción de los agentes objetivo del hueso candidato del cuerpo. En este respeto, el agente objetivo del hueso preferentemente se expele del cuerpo por medio de los ríñones . El agente objetivo del hueso deseablemente se selecciona del grupo que consiste de un fosfato, un fosfonato, un bisfosfonato, un hidroxibisfosfonato, un ácido aminometilenfosfónico y un ácido peptídico. El agente objetivo del hueso de la invención puede llevar uno, más de uno, o una mezcla de estos grupos. Por ejemplo, el agente objetivo del hueso puede ser un fosfonato, significando que el agente objetivo del hueso puede comprender un fosfonato, dos fosfonatos o tres o más fosfonatos. Un agente objetivo del hueso adecuado para el uso en la invención es EDTMP (etilen diamina-N, N, N' , N' -tetraquis (ácido metilenfosfónico) , la estructura química de la cual se establece en Figura 1, FDA actualmente aprobada (Quadramet ) como el complejo radiactivo 153Sm para enviar una dosis de radiación selectiva a metástasis de hueso para el alivio de dolor. EDTMP es un fosfonato que contiene cuatro grupos de ácido fosfónico y es por consiguiente un tetrafosfonato . Se localizan selectivamente compuestos tales como 153Sm-EDT P en hueso dónde los tumores están presentes contra el hueso normal en una proporción de más de 10:1, probablemente debido a la producción metabólica de calcio es muy alta en la región metastática. El 153Sm-EDTMP supuestamente se absorbe por el esqueleto en metástasis de hueso osteoblástico y se aclara del plasma. Esa porción del compuesto que no se acumula en el esqueleto supuestamente se excreta rápidamente, y la excreción está casi completa dentro de 6 horas después de la administración (Jimonet et al., Heterocycles, 36, 2745 (1993) ) . Se piensa que el alivio del dolor es debido a la radiación que se origina del isótopo unido a las metástasis del hueso osteoblástico que tiene algún efecto en las células de tumor metástaticas cercanas. Otro sistema de hueso-objetivo clínicamente útil es DOTMP (la estructura química de la cual se establece en Figura 1, ahora en pruebas clínicas Fase III (denominada STR, radiación objetivo de esqueleto) como el complejo 166Ho radiactivo diseñado para enviar dosis grandes de radiación selectivamente a la médula ósea para el tratamiento de micloma múltiple. Debe observarse que el complejo 166Ho-DOTMP radiactivo se localiza en el sistema de esqueleto e irradia la médula ósea cercana que aloja las células del mieloma malignas. Como el sistema 153Sm-EDTMP, el fosfonato que no se localiza en el hueso se aclara a través de la orina y fuera del cuerpo. En general, la captación del esqueleto es de aproximadamente 20 a aproximadamente 50% de la dosis inyectada y la localización en las áreas del esqueleto con infiltración del tumor se ilustra en Figura 7 de Bayouth et al., J. Nucí. Med. , 36, 730 (1995). Preferentemente, el agente objetivo del hueso es un ácido polifosfónico . El ácido polifosfónico ha sido demostrado en las moléculas biológicamente activas sustancialmente objetivo designado en el tejido del hueso. Por ejemplo, la conjugación (mediante la química de isotiocianato) de ácidos poliaminofosfónicos, tal como ABDTMP (la estructura química de la cual se establece en Figura 1, en los factores de crecimiento (para estimular la formación del hueso) exitosamente resultados en la selección de los factores de crecimiento en los huesos de ratas (véase, por ejemplo, Solicitud de Patente Internacional WO 94/00145) . Similarmente, los agentes objetivo del hueso se han acoplado a las proteínas. Por ejemplo bisfosfonatos que se conjugan a la albúmina de suero humano exitosamente enviados a la proteína en el hueso in vitro (Biotechnol. Prog, 16, 258 (2000)) y in vivo {Biotechnol. Prog, 16, 1116 (2000)). La utilidad de los agentes buscadores de hueso se extiende más allá de la entrega de proteínas al hueso e incluye, por ejemplo, moléculas terapéuticas pequeñas. Un conjugado que comprende un bisfosfonato buscador de hueso y un agente de alquilación, tal como BAD (la estructura química de la cual se establece en la Figura 1, se ha generado (véase, por ejemplo, Wingen et al., J. Cáncer Res. Clin. Oncol. , 111, 209 (1986) ) . En esta molécula, el agente de alquilación no es específico en su interacción con su objetivo (ADN) y, de este modo, no hay ningún requisito para la división entre el bisfosfonato (es decir, el agente de búsqueda de hueso) y la porción de alquilación. La eficacia demostrada del agente de alquilación de bisfosfonato en un modelo osteosarcoma de rata utilizando BAD. Otras series de los estudios han sido realizados utilizando el metotrexato del agente antifolato antineoplástico que ha sido covalentemente unido a los bisfosfonatos, MTX-BP designado y se muestra en Figura 1 (véase, por ejemplo, Sturtz et al., Eur. J. Med. Chem. r 27, 825 (1992); Sturtz et al. Eur. J. Med. Chem., 28, 899 (1993); y Hosain et al., J. Nucí. Med., 37, 105 (1996)). utilizando Tc-99m marcado MTX-BP, se determinó que alrededor del 15% de la dosis inyectada se localizó en el esqueleto después de 4 horas con aproximadamente 61% de la dosis excretadas (Hosain, supra) . MTX-BP además se demostró cinco veces mayor que la actividad anticancerígena comparada con metotrexato sólo en los modelos de animal de osteosarcoma trasplantado (Sturtz 1992, supra) . El trabajo similar ha sido descrito utilizando CF-BP, un grupo carboxifluoresceina con un bisfosfonato adjunto cuya estructura química se establece en Figura 1 (Fujisaki et al., Journal of Drug Targeting, 4, 117 (1994)). En esta molécula, el grupo CF es un marcador fluorescente, en farmacocinéticos cuantitativos y biodistribución y se conecta al agente objetivo del hueso a través de un enlace éster que es susceptible a la hidrólisis in vivo, los estudios en ratas inyectadas intravenosamente indicó que se ubicó CF-BP en el hueso y sirvió como un mecanismo de liberación lenta para CF generado mediante la hidrólisis general de la unión de éster (Fujisaki, supra) . En otra modalidad, el agente de búsqueda de hueso puede ser un péptido, tal como (Asp) s y (Glu)6. La. secuencia del péptido rico en ácido de osteonectin glicoproteína que se encuentra en abundancia en el hueso y dentina, tiene una fuerte afinidad al hidroxiapatito (Fujisawa et al., Fujisawa et al., Biochimica et Biophysica Acta, 53, 1292 (1996)). De este modo, los ligandos de péptido que comprenden aminoácidos ácidos son candidatos ideales para los agentes objetivo del hueso. De hecho, (Glu)io, cuando se une a la biotina, estrepavidina etiquetado exitosamente reclutado a hidroxiapatita (descrita además en Chu y Orgel, Bioconjugate Chem. , 8, 103 (1997) y la Solicitud de Patente Internacional WO 98/35703) . Además, la vida media biológica del isotiocianato de fluoresceina conjugada a (Asp) 6 fue 14 dias en el fémur (Kasugai et al., Journal of Bone and Mineral Research, 15 (5), 936 (2000)), 15 (5), 936 (2000)) el cual es una vida media aceptable para el agente objetivo del hueso de la invención. Igualmente, el suministro de los conjugados de estradiol- (Asp) ß al hueso se ha demostrado en animales ovariectomizados con inhibición concomitante de pérdida de hueso de tipo osteoporéctico Kasugai et al., Journal of Bone and Mineral Research (Suppl 1), 14, S534 (1999)) . Se cree que el enlace (Asp) ß al hueso se metaboliza durante el proceso de resorción de hueso mediado por osteoclasts. Por consiguiente, el ligando de péptido acidico no sólo proporciona un medio de los compuestos de reclutamiento al hueso, sino también proporciona un mecanismo de los compuestos de liberación lenta en las células del hueso y el tejido circundante. Otros ejemplos de agente objetivo del huesos incluyen, pero no se limitan a amino- e hidroxi-alquil fosfoico y ácidos hidroxibisfosfónico; los ácidos hidroxibisfosfónicos incluyen alendronato, pamidronato, ácido 4-aminobutilfosfónico, 1-hidroxietano-l, ácido 1-difosfónico y ácido aminometilenbisfosfónico; fosfatos tales como ácido pitico; y ácidos aminometilenfosfónico tal como ácido N,N-bis (metilfosfono) -4-amino-benzoico y nitrilotri (ácido metilfosfónico) . Se muestran ejemplos no limitantes de algunos agentes objetivo de los huesos en la Figura 2. Preferentemente, el agente objetivo del hueso es un ácido aminometilenfosfónico . Por "ácido aminometilenfosfónico" se entiende un compuesto que contiene una porción -NCH2PO3H, dónde el grupo amino tiene uno, dos o tres grupos de ácidos metilenfosfónico unidos, y pueden sustituirse además con otras porciones químicas. Un ácido aminometilenfosfónico puede incluir uno o más grupos de ácido fosfónico y uno o más grupos aminados. Los ejemplos de estos ácidos aminometilenfosfónico incluyen, pero no se limitan a los compuestos F a través de N establecido en la Figura 2. Se prevé que estos agentes objetivo del hueso y otros agentes objetivo del hueso pueden unirse a través de uno de los heteroátomos o por modificación química que instala un punto de enlace adicional. Por ejemplo, EDTMP puede conectarse a un enlazador por uno de los oxígenos fosforosos para crear una unión de fosfonato, como se ilustra en la Figura 3 (véase por ejemplo Vieira de Almedia et al., Tetrahedron, 55, 12997-13010 (1999).) El oxígeno fosforoso puede también alquilarse como se muestra en la Figura 4, dónde el grupo R puede tener, por ejemplo, un grupo amino suspendido, proveer un punto de enlace secundario para la unión a, por ejemplo, un PEG activo. Otros tipos de alquilación que podrían utilizarse en la invención incluyen pero no se limitan a los ejemplos similar a aquellos que involucran DOTMP, como se ha descrito además en Chavez et . al., Biomedical ImagiTtg : Reporters, Dyes , & Instumentation, Contag & Sevick-Muracia, Eds . , Proc. SPIE, Vol. 3600, 99-106 (Julio, 1999), o como se muestra por otros ácidos fosfónicos además descritos en, por ejemplo, la Patente Norteamericana 5,177,064, Patente Norteamericana 5, 955,453, de Lombaert et al., J. Med. Chern., 37, 498-511 (1994) e Iyer et al., Tetrahedron Letters, 30(51), 7141-7144 (1989) . Alternativamente, para la modificación quimica, EDTMP puede, por ejemplo, modificarse para generar ABDTMP mediante la instalación de un grupo de anilina como se describe además en, por ejemplo, la Figure 1 de la Solicitud de Patente Internacional WO 94/00145) . La amina de anilina está entonces disponible para formar, por ejemplo, un enlace de amida. DOMTP podría modificarse similarmente, como se describe en la Figura 5. Los términos "fosfonato, fosfato y aminometilenfosfonato" significan que abarcan los ácidos fosfónicos, los ácidos fosfóricos y ácidos aminometilenfosfónico, respectivamente, así como cualquier sal, ésteres hidrolizables y los profármacos de los ácidos a base de fósforo de los mismos. En el pH biológico de 7.4 en la sangre o el pH más acídico alrededor del hueso, una cierta porción del fosfato o fosfonato del agente objetivo del hueso puede desprotonarse y puede reemplazarse con un contraión.
Además, el intercambio de protón para el calcio es un evento inherente para el enlace del agente objetivo del hueso en la hidroxiapatita en la invención. Sin embargo, la preparación y administración de la composición que contiene el agente objetivo del hueso puede o no pueden requerir la protonación completa de los ácidos fosforosos en la misma. Por consiguiente, el ácido fosfónico, ácido fosfórico y ácido aminometilenfosfónico se extrae y utiliza intercambiablemente con fosfato, fosfonato y aminometilenfosfonato . Mientras ningún ásteres particularmente preferidos, biológicamente hidrolizables de los ácidos a base de fósforo también pueden utilizarse en el uso in vivo de los profármacos objetivo del hueso. Similármente, los profármacos de los ácidos a base de fósforo también pueden utilizarse in vivo para enmascarar la acidez de la composición durante, por ejemplo, la formulación ¦ y administración. El agente objetivo también puede ser un agente que se objeta basado en las propiedades del tejido particular. Los ejemplos representativos de tales agentes objetivo incluyen, pero no se limitan a, polímeros que se localizan selectivamente en tejidos del tumor debido al efecto EPR (permeabilidad y retención mejoradas) como se describió en H. Maeda et al "Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics : A Review"; Journal of Controlled Reléase, 2000 vol 63, pp 271-284, los contenidos de las cuales se incorporan para referencia. Otros polímeros representativos son N- (2-hidroxipropil) metacrilamida (HPMA) y (poli) ácidos L-glutámicos . El agente objetivo también puede comprender una porción RGD. Como se discutió en Curnis et al., C ncer Research, 64 (2): 565-571 (2004), proteínas de fusión RGD objetivo de las porciones RGD en la vasculatura interactuando con interacción con los receptores de adhesión de célula, incluyendo integrina ?ß3- 3. Síntesis A. Sistema del Anillo principal Los compuestos de la presente invención pueden sintetizarse utilizando LY294002 (Compuesto 1) como un producto de inicio. LY294002 (Compuesto 1) puede obtenerse comercialmente o sintetizado como se describió en el Ejemplo 1 o como se describió en la Patente Norteamericana No. 5,703, 075, los contenidos de las cuales se incorporan en la presente para referencia. Un experto ordinario en la técnica también puede sintetizar los compuestos de la presente invención que utilizan el Compuesto 2 como un producto de inicio . b. Preparación de Derivados del Sistema del Anillo Principal El sistema del anillo principal de los Compuestos 2 y 3 puede derivarse del sistema del anillo principal de LY294002 (Compuesto 1) . Los derivados del sistema del anillo principal del Compuesto 3 pueden prepararse como se describió en la Patente Norteamericana No. 5, 703 , 075, los contenidos de los cuales se incorporan en la presente para referencia, para la preparación de los derivados del anillo principal de LY294002 (Compuesto 1) . Los derivados del sistema del anillo principal del Compuesto 3 también pueden prepararse utilizando los compuestos comercialmente disponibles incluyendo, pero no limitados a, 2-hidroxi-acetofenonas sustituidas . c. Preparación de los Derivados del Anillo de Morfolina Los derivados de amina del Compuesto 3 pueden prepararse por el desplazamiento del grupo de tioalquil en el Ejemplo 1 bajo condiciones que varian de la temperatura ambiente a las condiciones impelentes (exceso de nucleófila y calor a 110 °C) . Cualquier nitrógeno primario o secundario que contiene nucleófilo puede reaccionar para dar las sustituciones amina alternativas en la estructura del anillo morfolina (incluyendo análogos de morfolina diferentes) . La síntesis de los ejemplos representativos de tales derivados amina del Compuesto 3 se describen en la presente en los Ej emplos . d. Preparación de Esteres Como se describió en lo anterior, los ésteres pueden usarse para formar los compuestos cuaternarios de la presente invención. Los compuestos cuaternarios de la presente invención se forman preferentemente utilizando ésteres de halo. En una modalidad preferida, los compuestos cuaternarios de la presente invención se forman utilizando ésteres de clorometilo. Numeroso ésteres de clorlometilo útiles en la preparación de los compuestos de la presente invención están disponible de las fuentes comerciales. Además, los ésteres de clorometilo pueden sintetizarse como se describió en WO 02/42265, WO 94/23724 y las patentes Norteamericanas. 4,444,686, 4,264,765 y 4,342,768, los contenidos de las cuales se incorporan en la presente. e . Cuaternización Los profármacos de la presente invención pueden prepararse por cuaternización de la amina terciaria del Compuesto 1 o Compuesto 2 con un éster de halometilo, por ejemplo, como se describió en el Ejemplo 4 y Ejemplo 6. Los compuestos de amina cuaternaria generalmente no son reversibles bajo las condiciones moderadas. Sin embargo, los compuestos cuaternarios de la presente invención son fácilmente hidrolizables como se discutió anteriormente. Los ésteres de halometilo que pueden usarse para cuaternizar la amina terciaria del Compuesto 1 o Compuesto 2 están comercialmente disponibles o pueden prepararse como se describió en los Ejemplos siguientes f . enlazadores Los profármacos de la presente invención también pueden prepararse por cuaternización de la amina terciaria del Compuesto 1 o Compuesto 2 con un enlazador que comprende dos grupos funcionales al menos. El enlazador puede ser cualquier enlazador natural o sintético que es capaz de cuaternizar la amina terciaria y también es capaz de covalentemente unirse a una molécula objetivo o ya puede unirse a una molécula objeto. Los enlazadores se comprenden preferentemente de un átomo tal como oxigeno o azufre, una unidad tal como -NH-, -C¾-, -C(O)-, -C(0)NH- o una cadena de átomos. La masa molecular de un enlazador está típicamente en el rango de aproximadamente 14 a 200, preferentemente en el rango de 14 a 96 con una longitud de hasta aproximadamente seis átomos. Los ejemplos representativos de los enlazadores incluyen pero no se limitan a un grupo alifático saturado o insaturado que se sustituye opcionalmente y en donde uno o dos · carbonos saturados de la cadena son opcionalmente reemplazados por -C(0)-, -C(0)C(0)-, -CONH-, -CONHNH-, -C(0)0-, -0C(0)-, -NHC02-, -O-, -NHCONH-, -OC(0)NH-, -NHNH-, -NHCO-, -S-, -SO--SO2- , -NH-, -S O2MH- , o -NHS O2- . El primer grupo funcional del enlazador se utiliza para cuaternizar la amina terciaria como se discutió anteriormente. Un primer grupo funcional preferido es un halometil éster incluyendo, pero no limitado a, clorometiléster e yodometil éster. El segundo grupo funcional del enlazador puede usarse covalentemente unido a un agente objeto. El segundo grupo funcional puede ser un grupo electrofilico o un grupo nucleofilico . Los segundos preferidos funcionales por grupos objetivo covalentemente unidos son isotiocianato, maleimida haloacetamida, imidoéster, tioftalimida, ester de N-hidroxisuccinimilof disulfuro de piridilo, azida de fenilo, carboxilo (y cloruros ácidos de los mismos) , amino, acil hidrozida, semicarbazida, tiosemicarbazida, diazonio, hidrazina, azida, aminoalquilurea, aminoalquiltiourea, halotriazina y meta (dihidroxiboril) feniltiourea . Otras porciones reactivas adecuadas que pueden ser adecuadas para las uniones covalentemente que une los profármacos de la presente invención a agentes objetivo incluyen disulfidos, nitrenos, sulfonamidas, carbodiimidas, cloruros de sulfonilo, bencimidatos, -COCH3 y-S03H.
El segundo grupo funcional apropiado dependerá del grupo funcional del agente objetivo con el cual el enlace covalente se formará y por su susceptibilidad a la pérdida de la actividad biológica como consecuencia de formar un tipo dado de unión. Si el agente objetivo es una proteína, el segundo grupo funcional puede ser reactivo con los grupos de la cadena lateral de aminoácidos que constituyen la estructura base del polipéptido. Tales grupos de cadena secundaria incluyen los grupos carboxilo de residuos de ácido aspártico y ácido glutámico, los grupos amino de residuos de lisina, los grupos aromáticos de tirosina e histidina, y los grupos sulfidrilo de residuos císteina. Los grupos laterales de carboxilo presentados por un agente objetivo tal como una estructura base de polipéptido pueden "hacerse reaccionar con los segundos grupos funcionales por medio de una reacción de carbodiimida soluble. Los grupos laterales amino presentados por un agente objetivo pueden hacerse reaccionar con segundos grupos funcionales isotiocianato, isocianato o halotriazina para efectuar la unión de los profármacos de la presente invención. Alternativamente, los grupos laterales amino en el agente objetivo pueden unirse a los compuestos de los profármacos de esta invención que portan los grupos reactivos de amina por medio de los agentes bifuncionales, tal como dialdehídos e imidoésteres . Pueden acoplarse grupos aromáticos presentados por un agente objetivo a los profármacos de esta invención mediante los derivados diazonio. Los grupos sulfidrilo en las moléculas del agente objetivo puede hacerse reaccionar con maleimidas o con grupos reactivos del agente objetivo haloalquilo tal como yodoacetamida . Los grupos sulhidrilo libres adecuados para tales reacciones pueden generarse de los enlaces de disulfido de la inmunoglobulina de proteina o pueden introducirse por derivatización química. La unión a los grupos sulfidrilo libres generados en la región de la cadena intra-pesada de inmunoglobulinas no interfiere con el sitio de enlace antígeno de la inmunoglobulina pero puede convertirse al anticuerpo incapaz de activar el complemento. Cuando el agente objetivo es una proteína glicosilada, una alternativa para formar una unión a los compuestos de la presente invención mediante el estructura base del polipéptido es formar una enlace covalente con la cadena de hidrato de carbono de la glicoproteína de acuerdo a los métodos tales como aquéllos de McKearn, et. Al., EPO 88,695. De este modo, las cadenas laterales de carbohidrato de los anticuerpos pueden selectivamente seleccionarse para generar aldehidos que pueden entonces hacerse reaccionar ya sea con grupos reactivos de amina para formar una base Schiff o con grupos reactivos de hidrazina, semicarbazida o tiosemicarbazida, para dar los enlaces de hidrazona semicarbazona o tiosemicarbazona correspondientes. Estos mismos métodos pueden emplearse para unir los profármacos de esta invención en los agentes objetivo no proteináceos tales como carbohidratos y polisacáricos . Una porción de reacción del agente objetivo alternativo es útil para unir a los carbohidratos y polisacáridos sin necesidad para la oxidación previa es el grupo dihidroxiborilo, tal como se presenta en los derivados meta (dihidroxiboril) feniltiourea . Este grupo se hace reaccionar con los agentes objetivo que contienen un 1,2-cis-diol, que forma un boroatoéster cíclico de 5 miembros, y de este modo es útil con aquellos carbohidratos, polisacáridos y glicoproteínas que contienen este grupo. Los derivados dihidroxiborilo también pueden ser útiles para unirse a los profármacos de esta invención en ribonucleósidos, ribonucleótidos y ácidos ribonucleicos, ya que la ribosa contiene un grupo 1,2-cis-diol en la posición 2', 3', como se describe por Rosenberg, et al., Biochemistry, 11, 3623-28 (1972) . Los desoxiribonucleótidos y los agentes objetivo ADN no pueden unirse a los presentes profármacos en esta forma cuando el grupo 3 r hidroxilo está ausente. Los últimos agentes objetivo pueden, sin embargo, conjugarse a los derivados isotiocianato de los profármacos primero formando un derivado de alilamina del desoxiribonucleótido tal como se describe por Engelhardt, et al., EPO 97,373.
Cuando el agente objetivo se une con los profármacos de esta invención en una célula intacta, ya sea que las porciones de reacción del polipéptido o reacción de carbohidrato puedan emplearse. Hwang y Wase, Biochim. Biophys. Acta, 512,54-71 (1978), describen el uso del derivado diazonio del quelator EDTA bifuncional de Sundberg, et al., J. Med. Chem. , 17,1304 (1974), en eritrositos y plaquetas etiquetadas con indio-111. El grupo dihidroxiborilo se hace reaccionar con una variedad de bacteria, virus y microorganismos, véase Zittle, Advan. Enzym. , 12 493 (1951) y Burnett, et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. , 96,157-62 (1980) . Los enlaces preferidos que se utilizan para cuaternizar covalentemente la amina terciaria del Compuesto 1 o Compuesto 2 y son de la fórmula: (Compuesto 4) en donde, X representa un grupo halo; Y representa -CH2-, -CH(CH3)-, -CH(Ph)-, -C(CH3) (COOH)- o CH (CH(CH3) 2) - i y Z2 son independientemente S u O; y n = 0 En una modalidad, el Compuesto 4 de la presente invención es aquel de los compuestos en donde, X representa Cl o I; Y representa -CH2-, -CH(CH3)-, -CH(Ph)-, -C(CH3) (COOH)- o CH(CH(CH3)2)-; ? y Z2 son independientemente 0; y n=0. En otra modalidad, el Compuesto 4 de la presente invención son aquellos compuestos en donde, X representa Cl o I; Y representa -CH2-, -CH(C¾)-, -CH(Ph)-, -C(CH3) (COOH)- o CH(CH(CH3)2)-; ?? y Z2 son independientemente 0; y n = 1. El compuesto 4 proporciona enlazadores con una estructura base carboxilica de alquilo y arilo que proporciona flexibilidad en la proporción de la división del nitrógeno cuaternario final. Los enlazadores del Compuesto 4 pueden prepararse utilizando los productos de inicio comercialmente disponibles como se describe en el Ejemplo 5. g. Purificación Los compuestos de la presente invención pueden aislarse utilizando métodos de purificación normales. El enlace idrolizable de los compuestos de la presente invención puede ser propenso a hidrólisis durante la purificación de los compuestos. La presente invención también se dirige a métodos para purificar los compuestos de la presente invención que comprenden agregar a los compuestos a una solución que comprende al menos 0.1% de ácido (v/v) para solubilizar el compuesto. El compuesto entonces se purifica para realizar la cromatografía, preferiblemente HPLC. h. Prueba Los profármacos de la presente invención pueden probarse para determinar la velocidad de hidrólisis del enlace hidrolizable y los productos de hidrólisis mediante la realización del análisis HPLC del profármaco expuesto a las condiciones de división como una función de tiempo. La actividad biológica de los compuestos de la presente invención puede medirse por métodos que incluyen, pero no se limitan a, fagocitosis de bloque en células J774 de línea celular de macrófago como se describe en el Ejemplo 17. La actividad biológica de los compuestos de la presente invención también puede medirse por los ensayos de enzima quinasa PI-3 como se describe por la Patente Norteamericana No. 5,480,906; K. Fuchikami et al J. Biomol Screen, 2002 Oct. pp441-450; VI Silveria et al J. Biomol. Screen, 2002, Dec. 7 (6), 507-514; BE Drees Combinatorial Chemistry and Highthroughput Screening 2003, vol 6, 321-330, los contenidos de las cuales se incorporan para referencia. i . Sales Los compuestos de la presente invención son útiles en varias formas de sal farmacéuticamente aceptable. El término "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas formas de sal que deben ser aparentes para el quimico farmacéutico, es decir, a aquellas que no son sustancialmente tóxicas y que proporcionan las propiedades farmacocinéticas deseadas, palatabilidad, absorción, distribución, metabolismo o excreción. Otros factores, más prácticos en naturaleza, que también son importantes en la selección, son costosos de las materias primas, facilidad de cristalización, rendimiento, estabilidad, higroscopicidad y fluidez del fármaco a granel resultante. Convenientemente, las composiciones' farmacéuticas pueden prepararse de los ¦ ingredientes activos o sus sales farmacéuticamente aceptables en combinación con portadores farmacéuticamente aceptables. Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la presente invención que son adecuados para el uso en los métodos y composiciones de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, sales formadas por una variedad de ácidos orgánicos e inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido sulfónico de hidroximetano, ácido bromhídrico, ácido metansulfónico, ácido sulfúrico, ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido maleico, ácido bencensulfónico, ácido toluensulfónico, ácido sulfámic, ácido glicólico, ácido esteárico, ácido láctico, ácido málico, ácido pamoico, ácido sulfanilico, ácido 2-acetoxibenzoico, ácido fumárico, ácido toluensulfónico, ácido metanesulfónico, ácido etandisulfónico, el ácido oxálico, ácido . isetónico, y varios otros incluyen sales farmacéuticamente aceptables, tales como, por ejemplo, nitratos, fosfatos, boratos, tartratos, citratos, succinatos, benzoatos, ascorbatos, salicilatos, y similares. Los cationes tales como iones de amonio cuaternario se contemplan como contraiones farmacéuticamente aceptables para las porciones aniónicas. Las sales preferidas de los compuestos de la presente invención incluyen sales de clorhidrato, sales de ácido metansulfónico y sales de ácido trifluoroacético con sales de ácido metansulfónico son más preferidas. Además, las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la presente invención pueden formarse con metales álcali tales como- sodio, potasio y litio; los metales de tierra alcalina tales como calcio y magnesio; bases orgánicas tales como diciclohexilamina, tributilamina y piridina; y aminoácidos tales como arginina, lisina y similares. Las sales farmacéuticamente aceptables de la presente invención pueden sintetizarse por métodos químicos convencionales. Generalmente, las sales se preparan hacledo reaccionar la base libre o el ácido con cantidades estoquiométricas o con un exceso del ácido o base inorgánico u orgánico que forma la sal deseada, en un solvente adecuado o combinación del solvente. En general, los contraiones de las sales de los compuestos de la presente invención se determinan mediante los reactivos utilizados para sintetizar los compuestos. Puede existir una mezcla de contraiones de las sales, dependiendo de los reactivos. Por ejemplo, donde Nal se agrega para facilitar la reacción, el contraión puede ser una mezcla de contra aniones Cl e I. Además, HPLC preparatoria puede provocar que el contraión original se intercambie por aniones de acetato cuando el ácido acético está presente en el eluyente. Los contraiones de las sales pueden intercambiarse en un contraión diferente. Los contraiones se intercambian preferiblemente por un contraión farmacéuticamente aceptable para formar las sales descritas en lo anterior. Los procedimientos para los contraiones de intercambio se describen en WO 2002/042265, WO 2002/042276 y S. D. Cías, "Quaternized Colestipol, an improved bile salt adsorbent: In Vitro studies." Journal of Pharmaceutical Science, 80(2): 128-131 (1991), los contenidos de las cuales se incorporan en la presente para referencia. Por razones de claridad, los contraiones no se muestran explícitamente en las estructuras químicas en la presente y la caracterización de los compuestos se basa en el catión cuaternario identificado .
. Composición La presente invención también abarca una composición que comprende uno o más compuestos de la presente invención. Las composiciones de la presente invención además pueden comprender uno o más ingredientes adicionales farmacéuticamente aceptables tales como alumbre, estabilizadores, agentes antimicrobiales, tampons, agentes colorantes, agentes saborizantes, adyuvantes y similares. a . Formulación Las composiciones de la presente invención pueden estar en la forma de tabletas o pastillas formuladas en una forma convencional. Por ejemplo, las tabletas y las cápsulas para la administración oral pueden contener excipientes convencionales, pero no limitarse a aglutinantes, rellenadotes , lubricantes, desintegrantes y agentes humectantes. Los aglutinantes incluyen, pero no se limitan a, jarabe, acacia, gelatina, sorbitol, tragacanto, mucilago de almidón y polivinilpirrolidona. Los rellenadotes incluyen, pero no se limitan a, lactosa, azúcar, celulosa microcristalina, almidón de maiz, fosfato de calcio y sorbitol. Los lubricante incluyen, pero no se limitan a, estearato de magnesio, ácido esteárico, talco, polietilenglicol y sílice. Los desintegrantes incluyen, pero no se limitan a, almidón de papa y glicolato almidón de sodio. Los agentes humectantes incluyen, pero no se limitan a, lauril sulfato de sodio) . Las tabletas pueden recubrirse de acuerdo a los métodos bien conocidos en la técnica. Las composiciones de la presente invención también pueden ser formulaciones líquidas, pero no limitadas a, suspensiones acuosas u oleosas, soluciones, emulsiones, jarabes y elíxires. Las composiciones también pueden formularse como un producto seco para la constitución con agua u otro vehículo adecuado antes del uso. Tales preparaciones líquidas pueden contener aditivos incluyendo, pero no limitados a, agentes de suspendiendo, agentes de emulsificación, vehículos y conservadores no acuosos. El agente de suspensión incluye, pero no se limita a, jarabe de sorbitol, metilcelulosa, jarabe de glucosa/azúcar, gelatina, hidroxietilcelulosa, carboximetilcelulosa, gel de aluminioestearato y grasas comestibles hidrogenadas. Los agentes emulsificantes incluyen, pero no se limitan a, lecitina, monooleato de sorbitan y acacia. Los vehículos no acuosos incluyen, pero no se limitan a, aceites comestibles, aceite de almendra, aceite de coco fraccionado, ésteres oleosos, propilenglicol y alcohol etílio. Los conservadores incluyen, pero no se limitan a, p-hidroxibenzoato de metilo o propilo y ácido sórbico. Las composiciones de la presente invención también pueden formularse como supositorios que pueden contener bases de supositorio incluyendo, pero no limitadas a, mantequilla de cacao o glicéridos. Las composiciones de la presente invención también pueden formularse por inhalación, que puede ser en una forma que incluye, pero no se limita a, una solución, suspensión o emulsión que puede administrarse como un polvo seco o en la forma de un aerosol utilizando un propulsor, tal como diclorodifluorometano o triclorofluorometano . Las composiciones de la presente invención también pueden ser formulaciones transdérmicas formuladas que comprenden vehículos acuosos o no acuosos incluyendo, pero no limitados a, cremas, ungüentos, lociones, pastas, yeso medicinal, parche o membrana. Las composiciones de la presente invención también pueden formularse por administración parenteral incluyendo, pero no limitada a, inyección o infusión continua. Las formulaciones para la inyección pueden estar en la forma de suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos y pueden contener agentes de formulación que incluyen, pero no se limitan a, agentes de suspensión, estabilización y dispersión. La composición también puede proporcionarse en una forma en polvo para la reconstitución con un vehículo adecuado que incluye, pero no se limitan a, agua estéril, libre de pirógeno. Las composiciones de la presente invención también pueden formularse como una preparación de depósito que puede administrarse por implantación o mediante inyección intramuscular. Las composiciones pueden formularse con materiales poliméricos o hidrofóbicos adecuados (como una emulsión en un aceite aceptable, por ejemplo), resinas de intercambio iónico o como derivados moderadamente solubles (como una sal moderadamente soluble, por ejemplo) . Las composiciones de la presente invención también pueden formularse como una preparación de liposoma. La preparación de liposoma puede comprender liposomas que. penetran las células de interés o la capa cornea, y se funde con la membrana celular, resultando en el suministro de los contenidos del liposoma en la célula. Por ejemplo, los liposomas tales como aquéllos descritos en la Patente Norteamericana No. 5,077,211 de Yarosh, Patente Norteamricana No. 4,621,023 de Redziniak et al. o Patente Norteamericana No. 4,508,703 de Redziniak et al. pueden utilizarse. Las composiciones de la invención se pretenden en condiciones de la piel objetivo que pueden administrarse antes, durante o después de la exposición de la piel del mamífero a ÜV o agentes que provocan el daño oxidativo. Otras formulaciones adecuadas pueden emplear nxosomas. Los niosomas son vesículas lípidas similares a liposomas, con membranas que consisten ampliamente en lipidos no iónicos, algunas formas de las cuales son efectivas para transportar compuestos a través de la capa cornea. 5. Tratamiento La presente invención también abarca un método para tratar a un paciente que sufre de una condición asociada con la actividad quinasa PI-3. La actividad quinasa PI-3 puede ser anormal, excesiva o constitutivamente activa. La presente invención también abarca un método para tratar enfermedad inflamatoria que comprende administrar a un paciente con necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la presente invención. Tales enfermedades y efectos de salud adversos atribuibles a la actividad de señalización quinasa PI-3 inapropiada se ha descrito en la técnica, por ejemplo U. S. 2002/0150954A1 ; US 5,504,103; US 6,518, 277B1; U.S. 6,403,588; U. S. 6,482,623; U.S. 6,518,277; U.S. 6,667,300; U.S. 20030216389; U.S. 20030195211; U.S. 20020037276 y U.S. 5,703,075 los contenidos de cuales se incorporan para referencia. La presente invención también abarca un método para mejorar la muerte celular programada mediada administrando p53 que comprende administrar a un paciente con necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la presente invención.
La presente invención también abarca un método para mejorar la quimisensibilidad de las células tumorales que comprende administrar a un paciente con necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la presente invención. La presente invención también abarca un método para mejorar la radiosensibilidad de las células tumorales que comprende administrar a un paciente con necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la presente invención. La presente invención también abarca un método para inhibir la angiogénesis inducida por tumor que comprende administrar a un paciente con necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la presente invención. La presente invención también abarca un método para inhibir un proceso angiogénico asociado con una enfermedad no cancerosa que comprende administrar a un paciente con necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la presente invención. La presente invención también abarca un método para el tratamiento de cáncer que comprende administrar a un paciente con necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la presente invención.
El compuesto puede administrarse simultánea o metronómicamente con otros tratamientos anti-cancerígenos tales como quimioterapia y terapia de radiación. El término ""simultáneo" o "simultáneamente" como se utiliza en la presente, significa que el otro tratamiento anti-cancerígeno y el compuesto de la presente invención se administraron dentro de 48 horas, preferiblemente 24 horas, más preferiblemente 12 horas, aún con mayor preferencia 6 horas y más preferiblemente 3 horas, o menos, una de la otra. El término "metronómicamente" como se utiliza en la presente significa la administración de los compuestos en momentos diferente de la quimioterapia y en cierta frecuencia a la administración repetida y/o el regimiento de la quimioterapia. El tratamiento de la quimioterapia puede comprender la administración de un agente citotóxico o agente citostático o combinación de los mismos. Los agentes citotóxicos preveen las células cancerígenas de multiplicarse por: (1) interferencia con la capacidad de la célula para reproducir el ADN y (2) inducir la muerte de la célula y/o apóptosis en las células cancerígenas. Los agentes citostáticos actúan mediante la modulación, interferencia o inhibición de los procesos de la transducción de señal celular que regulan la proliferación celular y algunas veces a niveles continuos bajos.
Las clases de los compuestos que pueden utilizarse como agentes citotóxicos incluyen los siguientes: agentes de alquilación (incluyendo, sin limitación, mostazas de nitrógeno, derivados de etilenimina, sulfonatos del alquilo, nitrosoureas y triazenos) : mostaza de uracilo, clormetina, ciclofosfamida (Cytoxan®) , ifosfamida, melfalan, clorambúcil, pipobroman, trietilen-melamina, trietilentiofosforamina, busulfan, carmustina, lomustina, streptozocina, dacarbazina y temozolomida; antimetabolitos (incluyendo, sin limitación, antagonistas de ácido fólico, análogos del pirimidina, análogos de ' purina e inhibidores de adenosin deaminasa) : metotrexato, 5-fluorouracilo, floxuridina, citarabina, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, fosfato de fludarabina, pentostatina y gemcitabina; los productos naturales y sus derivado (por ejemplo, alcaloides vinca, antibióticos antitumorales, enzimas, limfosinas y epipodofillotoxinas) : vinblastina, vincristina, vindesina, bleomicina, dactinomicina, daunorubicina, doxorubicina, epirubicina, idarubicina, ara-c, paclitaxel (el paclitaxel es comercialmente disponible como Taxol®) , mitramicina, desoxico-formicina, mitomicin-c, 1-asparaginasa, interferonas (preferentemente IFN-a) , etoposido y teniposido. Otros agentes citotóxicos proliferativos son navelbena, CPT-11, anastrazol, letrazol, capecitabina, reloxafina, ciclofosfamida, ifosamida y droloxafina .
Los agentes que afectan el microtúbulo interfieren con la mitosis celular y se conocen bien en la técnica por su actividad citotóxica. Los agentes que afectan el microtúbulo útiles en la invención incluyen, pero no se limitan a, alocolchicina (NSC 406042), halichondrina B (NSC 609395), colchicina (NSC 757) , derivados de colchicina (por ejemplo, NSC 33410), dolastatina 10 (NSC 376128), maytansina (NSC 153858), rizoxina (NSC 332598), paclitaxel (Taxol®, NSC 125973) , derivado de Taxol® (por ejemplo derivados (por ejemplo, NSC 608832), tiocolchicina NSC 361792), tritil cisteina (NSC 83265), sulfato de vinblastina (NSC 49842), sulfato del vincristina (NSC 67574) , epotilonas natural y sintética incluyendo pero no limitada a epotilona A, epotilona B y discodermolida (vea Service, (1996) , Science 274:2009) estramustina, nocodazol, MAP4, y similares. Ejemplos de tales agentes también se describen en Bulinski (1997) J. Cell Sci. 110: 3055 3064; Panda (1997) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94: 10560-10564; Muhlradt (1997) Cáncer Res. 57: 3344-3346; Nicolaou (1997) Nature 387: 268-272; Vasquez (1997) Mol. Biol. Cell. 8: 973-985; and Panda (1996) J. Biol . Chem 271: 29807-29812. También adecuados son los agentes citotóxicos tales como epidofillotoxin, una enzima antineoplástica; un inhibidor de topoisomerasa; procarbazina; mitoxantrona; complejos de coordinación de platino tales como cis-platina y carboplatina; modificadores de respuesta biológica; inhibidores de crecimiento; agentes terapéuticos antihormonales; leucovorin; tegafur; y factores de crecimiento haematopoyeticos . Los agentes citostáticos que pueden utilizarse incluyen, pero no se limitan a, hormonas y esteroides (incluyendo análogos sintéticos): 17. alfa. -etinilestradiol, dietilstilbestrol, testosterona, prednisone, fluoximesterona, propionato de dromostanolona, testolactona, megestrolacetato, metilprednisolona, metil-testosterona, prednisolona, triamcinolona, hlorotrianiseno, hidroxiprogesterona, aminoglutetimida, estramustina, medroxiprogesteronacetato, leuprolida, flutamida, toremifeno, zoladex. Otros agentes citostáticos son antiangiogénicos tales como inhibidores de metaloproteinasa matriz, y otros inhibidores VEGF, tales como anticuerpos anti-VEGF y pequeñas moléculas tales como ZD6474 y SU6668 también se incluyen. Los anticuerpos Anti-Her2 de Genetech también se utilizan. Un inhibidor EGFR adecuado es EKB-569 (un inhibidor irreversible) . También incluidos están los anticuerpos C225 Imclon inmunoespecificos para el EGFR e inhibidores src. También adecuado para el uso como un agente citostático es Casodex® (bicalutamida, Astra Zeneca) que suministra carcinomas dependientes de andrógeno no prolifcrativas . Aún otro ejemplo de un agente citostático es el antíestrógeno Tamoxifen® que inhibe la proliferación o crecimiento del estrógeno dependiendo de cáncer de mama. Los inhibidores de la transducción de las señales proliferativas celulares son agentes citostáticos . Ejemplos representativos incluyen inhibidores del factor de crecimiento epidérmicos, inhibidores Her-2, inhibidores de quinasa MEK-1, inhibidores de quinasa MAPK, inhibidores PI3, inhibidores de quinasa Src e inhibidores PDGF. Una variedad de cánceres puede tratarse de acuerdo a la presente invención, incluyendo pero no limitada a, lo siguiente: carcinoma incluyendo aquel de la vejiga (incluyendo cáncer de vejiga acelerado y metastático) , pecho, colon (incluyendo cáncer colorectal) , riñon, hígado, pulmón (incluyendo cáncer pulmonar de célula pequeña y no pequeña incluyendo cáncer pulmonar y adenocarcinoma de pulmón) , ovario, próstata, testículos, tracto genitourinario, sistema linfático, recto, laringe, páncreas (incluyendo carcinoma pancreático exocrina) , esófago, estómago, vesícula biliar, cerviz, tiroides y piel (incluyendo carcinoma de célula escamosa) ; tumores hematopoyéticos de linaje linfoide incluyendo leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de célula B, linfoma de célula T, linfoma de Hodgkins, linfoma sin Hodgkins, linfoma de célula del cabello, linfoma histiocítica y linfoma de Burketts; tumores hematopoyéticos de linaje mieloide incluyendo leucemias mielógenas agudas y crónicas, sindrome mielodisplástico, leucemia mieloide y leucemia promielocitica; tumores del sistema nervioso central y periférico incluyendo astrocitoma, neuroblastoma, glioma y schwannomas; tumores de origen mesenquimal incluyendo fibrosarcoma, rabdomioscarcoma y osteosarcoma; y otros tumores incluyendo melanoma, genodermapigmentoso, queratoactantoma, seminoma, cáncer folicular de tiroide y taratocarcinoma . Más preferiblemente, la invención se utiliza para tratar los cánceres acelerados o metastáticos de la vejiga, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer de pulmón de célula no pequeña, cáncer colorectal y cáncer de mama. La presente invención también abarca un método para tratar pancreatitis que comprende administrar a un paciente con necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la presente invención. Como se discutió en Gukovsqui et al., Gastroenterology, 126 (2): 554-66 (2004), la inhibición de quinasa PI-3 puede prevenir pancreatitis. La presente invención también abarca un método para tratar úlceras que comprenden administrar un paciente con necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la presente invención. La presente invención también abarca un método por tratar cáncer gástrico, tal como cáncer de estómago, que comprende administrar a un paciente con necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la presente invención. Como se discutió en Bacon et al., Digestive Disease Week Abstracts and Itinerary Planner, Vol . 2003, Abstract No. M921 (2003) and Rokutan et al., Digestive Disease Week Abstracts and Itinerary Planner, Vol. 2003, Abstract No. 354 (2003), PI-3 kinase is involved in the adhesión of Helicobacter pylori to gastric cells . Además, Osaki et al., Journal of Cáncer Research and Clinical Oncology, 130 (1) : 8-14 (2004) indica que un inhibidor de quinasa PI-3, tal como LY294002, puede ser útil como un agente anti-tumor para el carcinoma gástrico . La presente invención también abarca un método para mejorar la- realización de un stent que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la presente invención a un paciente con un stent, tal como un stent cardiovascular. Como se discutió en Zhou et al., Arteriesclerosis Thrombosis and Vascular Biology, 23 (11) : 2015-2020 (2003), la inhibición de quinasa PI-3 puede prevenir el daño de la "dilatación" que acompaña la colocación del stent en los vasos. Los compuestos de la presente invención en el stent o matriz de polímero de los mismos puede mejorar la solubilidad en la matriz de recubrimiento stent, mejorar la solubilidad de acuosa/suero, o mejorar la perfusión en las células inmediatamente adyacentes a la colocación del stent . La presente invención también abarca un método para tratar degeneración macular relacionada con la edad (AMD) que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la presente invención. Como se discutió en Retina, 18 de febrero de 2004, la inhibición de VEGF inhibe el sobre-crecimiento de los vasos sanguíneos asociados con AMD. Los compuestos de la presente invención pueden tratar AMD inhibiendo la angiogénesis . La presente invención también abarca un método para tratar hipertensión que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la presente invención. Como se discutió en Northcott and Watts, Hypertension, 43 (1): 125-130 (2004), la inhibición de quinasa PI-3 puede prevenir las bajas concentraciones extracelulares de Mg2+ que se asocian con la hipertensión. La presente invención también abarca un método para suprimir la diferenciación de las células progenitoras, tales como células progenitoras mieloides, que comprenden agregar una cantidad efectiva de un compuesto de la presente invención a las células progenitoras. Como se discutió en Lewis et al., Experimental Hematology, 32 (1): 36-44 (2004), la inhibición de la trayectoria de quinasa PI-3 suprime la célula progenitora mieloide.
La presente invención también abarca un método para tratar cáncer de hígado que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la presente invención. Como se discutió en Leng et al., Hepatology 38 (4). Suppl 1: 401A (2003), LY294002 inhibe la fosforilación de Akt (proteína serina/treonina cinasa B) , que es un indicador en tejidos de hígado humano. La presente invención también abarca un método para tratar condiciones asociadas- con un mutante PTEN que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la presente invención. PTEN es un gen supresor de, tumor ubicado en el cromosoma 10q23 que ha sido identificado en pacientes con enfermedad de Cowden. Como se discutió en Vega et al., Journal of Investigative, 121 (6): 1356-1359 (2003), PTEN mutante ha reducido la capacidad para inhibir la activación del proto-oncogen Akt. Los inhibidores de quinasa PI-3 pueden inhibir la fosforilación de Akt, por lo que reduce el efecto del mutante PTEN. a. Administración Las composiciones de la presente invención pueden administrarse en una forma incluyendo, pero no limitada a, oral, parenteral, sublingual, transdérmica, rectal, transmucosal, tópica, mediante inhalación, mediante administración bucal, o combinaciones de las mismas. La administración parenteral incluye, pero no se limita a, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, intratecal e intraarticular. Las composiciones de la presente invención también pueden administrarse en la forma de un implante, que permite la liberación lenta de las composiciones asi como una infusión intravenosa controlada lenta . b. Dosis Una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto requerido para el uso en terapia varia con la naturaleza de la condición que se tratada, la duración de tiempo que se desea la actividad, y la edad y la condición del paciente, y se determina finalmente por el médico. En general, sin embargo, las dosis empleadas para el tratamiento humano adulto tipicamente están en el rango de 0.001 mg/kg a aproximadamente 200 mg/kg por día. La dosis puede ser de aproximadamente 1 µg/kg a aproximadamente 100 g/kg por día. La dosis deseada puede se administrada convenientemente en una dosis sencilla o como dosis múltiples administradas en intervalos apropiados, por ejemplo, dos, tres, cuatro o más subdosis por día. Algunas veces se desean o requieren dosis múltiples . Un número de factores puede conducir a los compuestos de la presente invención que se administran en un amplio rango de dosis. Cuando dada en combinación con otros terapéuticos, la dosis de los compuestos de la presente invención puede ser dada en dosis relativamente más bajas. Además, el uso de los agentes objetivo puede permitir la dosificación necesaria para ser relativamente baja. Ciertos compuestos de la presente invención pueden administrarse en dosis relativamente elevadas debido a los factores que incluyen, pero no se limitan a, baja toxicidad, supresión elevada, proporciones bajas de división de la amina terciaria. Como un resultado, la dosis de un compuesto de la presente invención puede ser de aproximadamente 1 ng/kg a aproximadamente 100 mg/kg. La dosis de un compuesto de la presente invención puede estar en cualquier dosis incluyendo pero no limitada a aproximadamente 1 pg/kg, 25µg kg, 50 pg/kg, 75µg kg, 100 µg kg, 125 pg/kg, 150 pg/kg, 175 pg/kg, 200 pg/kg, 225 pg/kg, 250 pg/kg, 275 pg/kg, 300 pg/kg, 325 pg/kg, 350 pg/kg, 375 pg/kg, 400 pg/kg, 425 pg/kg, 450 pg/kg, 475 pg/kg, 500 pg/kg, 525 pg/kg, 550 pg/kg, 575 pg/kg, 600 pg/kg, 625 pg/kg, 650 pg/kg, 675 pg/kg, 700 pg/kg, 725 pg/kg, 750 pg/kg, 775 pg/kg, 800 pg/kg, 825 pg/kg, 850 pg/kg, 875 pg/kg, 900 pg/kg, 925 pg/kg, 950 pg/kg, 975 pg/kg, 1 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 50 mg/kg, 60 mg/kg, 70 mg/kg, 80 mg/kg, 90 mg/kg ó 100 mg/kg La presente invención tiene múltiples aspectos, ilustrados por los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplo 1 Preparación de LY29 002 Se preparó una muestra de 10 g de LY294002 de acuerdo al Esquema 2 con base en el procedimiento descrito en Víanos et al., J. Biol. Chem. 269(7) :5241 (1994), los contenidos de la cual se incorporan para referencia. El desplazamiento del grupo tiometilo de las tiocromonas tales como 12. Por aminas se ha descrito previamente (Bantick et al., J. Heterocyclic Chem, 18:679 (1981), los contenidos de la cual se incorporan para referencia) ya que tienen la ciclización de las metilfenilcetonas tales como 11 con disulfuro de carbono con alquilación concomitante del anión tiol (Vlahos et al. y Bantick et al.). La preparación de metilcetonas (por ejemplo, 11) en una reacción de una etapa a partir del ácido carboxilico (10) se realizó utilizando el procedimiento descrito en Rubottom et al., J. Org. Chem., 48:1550 (1983), los contenidos de la cual se incorporan para referencia.
Ejemplo 2 Preparación de los Análogos Cuaternarios de LY294002 Después del procedimiento del Esquema 3, la amina terciaria dé LY294002 se cuaternizó utilizando yodometano o cloruros de bencilo bajo condiciones forzadas para producir compuestos ?052-10 y el Compuesto 13B. El Ejemplo 56 describe la síntesis de un profármaco metilo cuaternario A052-10. El Ejemplo 57 describe la síntesis del profármaco pftalimido cuaternario A052-08. El Ejemplo 58 describe la síntesis de un paracarboxibencilo cuaternario ?044-78.
[0199]
[0215] describen la síntesis de un profármaco para-scn-bencilo cuaternario A044-80. ESQUEMA 3 Ejemplo 3 Preparación de los Clorómetilésteres Se prepararon intermediarios de clorometilo siguiendo el procedimiento descrito en Tsujihara, Synth Commun, 24,161, 1994. Brevemente, el ácido carboxílico apropiado se diluyó en una mezcla 50/50 de diclorometano/agua . La mezcla se enfrió en un baño de agua helada y bicarbonato de sodio (4 equivalentes) y se agregó sulfato ácido de n-tetrabutilamonio (0.05 equivalentes). Después de la agitación durante 5 minutos, se agregó clorosulfato de clorometilo (1.1 equivalentes). La solución se agitó vigorosamente durante la noche. La mezcla se transfirió a un embudo separador con más diclorometano y se lavó con solución de cloruro de sodio saturado. Los materiales orgánicos se secaron sobre sulfato de sodio y el solvente se removió para proporcionar el producto. El material se caracterizó por LC-MS y en algunos casos por espectroscopia 1H NMR. Por este procedimiento general, se prepararon los siguientes clorometilésteres representativos a partir de los siguientes ácidos carboxilicos: Tabla 1 25 *tiempo de retención HPLC-MS utilizando detección UV; ** tiempo de retención HPLC-MS del ácido carboxilico de partida utilizando detección UV; UD = indetectable debido a la falta de absorbancia de UV y sin ionización por MS Ejemplo 4 Conversión de LY2 4002 a Profármaco Cuaternario Se disolvió LY294002 (Compuesto 1) en acetonitrilo y luego cada uno de los clorometilésteres (1-1.5 equivalente) a partir del Ejemplo 3 se agregó junto con 1-2 equivalentes de yoduro de sodio. A temperatura ambiente, la reacción prosiguió solamente de manera lenta con los clorometilésteres para dar cantidades muy pequeñas del producto de amina cuaternizado junto con la precipitación del cloruro de sodio. A 65°C, la reacción prosiguió a la terminación usualmente en 4 horas. Cuando se completó la reacción (como se juzga por el análisis por LC-MS) se filtró; se concentró y luego se purificó en HPLC de fase inversa. Las fracciones se recolectaron y se liofilizaron para dar los productos deseados como polvos esponjosos. Los ejemplos preparados y purificados en esta manera se muestran en la tabla siguiente (los contra-aniones no se exhiben, pero incluyen, cloruro, yoduro, acetato o mezclas de los mismos) .
Tabla 2 Ejemplo 5 Enlazadores de Halometilésteres Basados en los resultados del Ejemplo 3 y el Ejemplo 4, se prepararon enlazadores de halometiléster (Esquema 4 y gráfica) . El Compuesto B se preparó a partir del Compuesto A (comercialmente disponible) como se describe en el Ejemplo 3. Este compuesto se convirtió en el yodometiléster más reactivo (Compuesto C) por una reacción Finklestein disolviendo en acetona o 2-butanona y luego disolviendo 2-5 equivalentes de yoduro de sodio con lo cual se precipitó el cloruro de sodio y el yodometiléster (Compuesto C) se produjo en la solución. El compuesto C se aisló solubilizando el solvente y disolviéndolo en un solvente inmiscible en agua tal como cloruro de metileno y extrayéndolo con agua para remover el yoduro de sodio residual . El Compuesto E se preparó a partir del Compuesto D (comercialmente disponible) . Se prepararon los Compuestos F y G en una manera similar a la producción de los Compuestos B y C, respectivamente.
Ejemplo 6 Cuaternización de LY294402 con Enlazadores de Halometilo Los halometilésteres, incluyendo aquellos del Ejemplo 5, se utilizaron para cuaternizar LY294002 utilizando condiciones similares a la metodología en el Ejemplo 4. Los profármacos representativos que comprenden un enlazador con un grupo funcional libre incluyen lo siguiente: Peso Molecular [M]+=613 Peso Molecular =626.48 Peso Molecular =601.66 [ ]+=499 [ ]+=542 Peso Molecular Peso Molecular =515.57 [M]+=486 [M]+=456 preparó el Compuesto 1105 mezclando el Compuesto 1101 con el Compuesto C en acetonitrilo en donde ambos son solubles y el Compuesto 1105 del producto se separa por precipitación durante un periodo de tres días y se lava con una cantidad pequeña de acetonitrilo para dar el Compuesto 1105 sustancialmente puro (confirmado por LCMS) .
Ejemplo 7 Preparación de los Profármacos Utilizando el Compuesto 1111 Se produjo el Compuesto 1111 por el método mostrado en el Esquema 5. El Compuesto 1110 se trató con ácido trifluoroacético puro durante 1-3 horas y el TFA se purgó con argón y se secó bajo vacio para dar un sólido cristalino comprendido del Compuesto 1113. El Compuesto 1113 se disolvió entonces en 1-3 mL de cloruro de tionilo y se calentó a 65 °C durante 3-8 horas. El cloruro de tionilo se purgó con argón y luego se secó bajo vacio elevado para dar el Compuesto 1111 en rendimientos aceptables como un sólido amarillo cristalino. El Compuesto 1111 puede hacerse reaccionar como un cloruro de ácido típico con varios nucleófilos que contienen nitrógeno y que contienen hidroxilo por ejemplo, disolviéndose simplemente en metanol para dar el metiléster correspondiente Compuesto 1112.
Una muestra del Compuesto 1111 se disolvió en acetonitrilo y se trató con al menos 5 equivalentes de diferentes alcoholes en frascos separados. Después de 1 hora, las muestras se analizaron por HPLC-MS y se demostró excelente conversión >90% del Compuesto 1111 al éster correspondiente como se muestra y se caracteriza en la Tabla Ejemplo 8 Preparación de los Profármacos Conjugados de Pro-teina Utilizando el Compuesto 1111 Las proteínas se conjugan en soluci principalmente acuosa (pH 7-9) (tampón de fosfato a tampón de carbonato) utilizando un exceso de un exceso de 2-10 veces del Compuesto 1111 con relación a los grupos amino o los grupos hidroxilo que se modifican. El compuesto 1111 de cloruro ácido puede introducirse en una solución acuosa orgánica mezclada (tal como agua/acetonitrilo 50/50 o agua/THF 50/50) o se agita en cloruro de metileno en un sistema de reacción de dos fases a temperatura ambiente durante 1-24 horas. Los conjugados de proteína pueden purificarse por diálisis o ultrafiltración y se utilizan directamente.
Una alícuota de 500 µ? de la proteina transferrina 5 mg/ mL (Sigma) se mezcló en 50 mM de tampón de bicarbonato de sodio con 100 hasta de 30 mM A024-79 (100 equivalentes molares) , que se prepararon de acuerdo al Ejemplo 12, en DMSO. Después de 1 hora y 20 minutos de hacerse reaccionar a temperatura ambiente, una muestra de 50 hasta se removió y se pasó a través de una columna Sephadex G-10 (corte de peso molecular 700) para separar la proteína de las moléculas pequeñas. Una alícuota de la proteína conjugada purificada se extrajo entonces con acetonitrilo y se observó el Compuesto 1 no detectable por LC-MS. El eluyente de proteína conjugada purificada se permitió permanecer a temperatura ambiente 39 horas en cuyo tiempo la mezcla de la proteína se extrajo de nuevo con acetonitrilo y esta vez 15% de la cantidad teórica máxima del Compuesto 1 se detectó. Estos resultados indican que se unieron por mol de transferrina una relación molar de 15 moles del profármaco. Estos resultados demuestran la unión de un profármaco que soporta en enlazador electrofílico a una proteína representativa y demuestra que con el tiempo una cantidad sustancial de un inhibidor de quinasa PI3 (compuesto 1) se liberó a partir de la proteína bajo condiciones acuosas .
Ejemplo 9 Preparación de los Profármacos de Unión de Resina Utilizando el Compuesto 1111 preparó el péptido arg-gly-asp-ser (RGDS) en resina wang utilizando la química del péptido de acoplamiento FMOC/HOBT estándar utilizando todos los aminoácidos naturales. El péptido de unión de resina se hizo reaccionar con el Compuesto 1111 en DMF desde 1-24 horas, se filtró y la resina se lavó con DMF y luego con cloruro de metileno y luego se trató con ácido trifluoroacético para desdoblar el Compuesto 1126 conjugado a partir de la resina (Esquema 6) . El Ejemplo 55 describe una preparación incrementada paulatinamente del Compuesto 1111.
ESQUEMA 6 Ejemplo 10 Preparación de los Profármacos con Agentes Objetivo de Folato Utilizando el Compuesto 1111 El Compuesto 1111 tiene un grupo electrofilico que puede hacerse reaccionar con grupos amino nucleofilicos bajo condiciones acuosas u orgánicas suavemente básicas (es decir, tampón de bicarbonato de sodio de 20 mM a 500 mM) para formar un enlace de tiourea no reversible. Los grupos amino nucleofilicos adecuados se presentan en el folato de biomolécula objetivo. Las moléculas A y C de folato se conjugaron al Compuesto 1111 a través de un grupo amino en DMF mezclando en proporciones más o menos iguales en la presencia de la trietilamina o diisopropiletilamina para producir los compuestos B y D (Esquema 7) .
ESQUEMA 7 Ejemplo 11 Preparación de los Profármacos con Agentes Objetivo de Anticuerpo Utilizando el Compuesto 1111 El Compuesto 1111 se conjuga a anticuerpos monoclonales en pH 7 a 9 acuoso y luego se separa por ultrafiltración u otros métodos estándares para separar conjugados de proteina a partir de moléculas pequeñas. El conjugado realizado puede prepararse de acuerdo al Ejemplo 8.
Ejemplo 12 Preparación de los Profármacos Utilizando Esteres de N- hidroxisuccinimida Un éster menos reactivo que el Compuesto 1111 se preparó produciendo el éster activo de N-hidroxisuccinimida del Compuesto 1113 (Esquema 8) . Una muestra de 100 g del Compuesto 1113 (A024-67) se disolvió en 1 mL de THF seco junto con 53 mg de N-hidroxisuccinimida (2 equivalentes) . Con la agitación de una alícuota de 45 hasta de 1 M de diciclohexicarbodiimida en cloruro de metileno (2 equivalentes) se agregó todo a la vez. En el plazo de 3 minutos, tuvo lugar un precipitado blanco pesado formado que indica la reacción de acoplamiento. Después de permitir la reacción para agitar durante 23 horas, la mezcla de reacción se filtró y el solvente se removió a partir del filtrado para producir 172 mg del producto de éster activo sin purificar como un aceite amarillo espeso, asignado al Compuesto A024-79 y se mostró un tiempo de retención de 2.334 minutos con la masa esperada de M+=535 encontrada para este pico.
ESQUEMA 8 Compuesto 1113 Ref. No. A024-79 Al utilizar la misma química como se describe anteriormente para el Compuesto 1111, se utilizó A024-79 para conjugar las proteínas objetivo como se describe en el Ejemplo 8 y utilizado para conjugarse a un polímero se describe en el Ejemplo 74.
Ejemplo 13 Preparación de los Profármacos Utilizando el Compuesto 1105 El Compuesto 1105 tiene un grupo electrofílico que puede hacerse reaccionar con grupos amino nucleofílieos bajo condiciones acuosas u orgánicas suavemente básicas (es decir, tampón de bicarbonato de sodio desde 20 mM a 500 mM) para formar un enlace de tiourea no reversible. Los grupos amino nucleofílicos adecuados se presentan en biomoléculas objetivo tales como péptidos, proteínas y moléculas pequeñas que soportan los grupos amina tales como los derivados de vitaminas (A y C del Esquema 7) . Los ejemplos representativos de tales productos incluyen los Compuestos B y D.
ESQUEMA 9 Ejemplo 14 Preparación de Derivados del Anillo de Morfolina El compuesto tiometilo del Esquema 1 se preparó como se describe en el Ejemplo 1. Este compuesto se calentó en un solvente apropiado con o sin una cantidad catalítica de ácido acético y con un exceso del compuesto amina nucleofilica hasta que la mayoría del compuesto tiometilo se consumió. La mezcla se sometió entonces a fase inversa preparativa LC-MS para aislar el análogo de morfolina deseado. Los compuestos preparados de esta manera se muestran en la Tabla 4 junto con sus condiciones de preparación, caracterización y aislamiento mostradas en la Tabla 5. Los datos NMR para los compuestos se muestran en la Tabla 6.
Tabla 4 Tabla 5 Tabla 6 1153 ¾ N R(CDC13): S 1.60-1.65 (b s, 2H), 3.772-3.399 (t, 4H), 3.506-3.533 ft 4H), 5.474 (s, 1H), 7367- 7.550 (m, 7H), 8.178-8.202 (d, l¾ J»7.9Hz) 1154 ¾NMR(CDC ¾): & 3.533-3.644 (m, 4H) 5.491 (s, 1H), 7.370-7.541 (m, 7H) 8.173~-8.197 (d, 1H, J= " 7.76Hz) 1155 'H MR(CDOb): S 1.165-1.187 (d, 6H), 2.567-2.627 (t, 2H}, 3.580-3.640 (m, 4H) 5.496 (s, IB), 7.389-" 7.591 (m, 7H), 8.164-8.187 (d, 1H, J=7.75Hz) 1157 'H N R(CDCla): 5 1.573-1.698 (m, 6H), 3.344-3.370 (t, 4H), S.543 (s, 1H), 7.37-7.562 (m, 7H), 8.163-" 8.186 (d, lH, J = 7.8Hz) 1158 'HN RCCDCtó: 5 1.498-1.547 (m, 7H), 1.873-1.997 (m, 3H), 2.600-3.200 ( , 1H), 3.140-3.160 ( , 1H), 3.316-3.323 (m, 1H), 3-737-3.831 (m, 2H), 4.01 -4.037 (n¾ 1H), 5.624 (s, 1H), 7.387-7.582 (m, 7H), 8.163-8.187 (d, lH, J«= 7.8Hz) 1159 ¾ N R(CDC¾): d 1.5-2.3 (b 2H), 3.015 (s, 3H), 3.400-3.426 & 2H), 3.674-3.741 (t, 2H), 5.412 fs, " 1H), 7.287-7.325 (t, 1H), 7.404-7.489 (m, 6?), 8.066-8.090 (d, 1H, J = 7.75Hz) 1160 'Hmi (CDa3):5 1.077-1.178 (t, 6H), 3.255-3.308 (q, 4H), 5.447 (s, 1H), 736?-7.546 (m, 7H), 8.180-" 8.204 (d, iH, j- 8.oiHz) . ¦ 1161 ¾ NMRÍCDCfe): 53.326-3.358 (t, 2H), g 3.358 (s, 3H), g 3.517-3.542 & 2H), g 5.099 (b s, 1H), g 5.427_ (¾ 1H), g 7.373-7.565 (m, 7H), g 8.172-8.195 (d, 1H, I - 7.74 Hz) 1163 ¾mi (CDCl,): ß 3.035 (s, 3H), g 3.479-3.488 (d, 2H), g 3.806-3.888 (m, 4H), g 4.961-4.980 (t, 1H), g 5.566 (s, 1H), g 7.385-7.489 (m, 4H), g 7.555-7.586 (m, 3H), g 8.180-8.204 (d, 1H, J ¦= 8.05 Hz) ?64 ¾ NMR(CDC¾}; 6.1.931-2.103 (m, 4H), g 3.133-3.248 (b s, 5H), g 3.273-3.296 (a, 1H), g 3368-3.394 (p¾ IB), g 3.990-3.999 (bs, 1H), g 5.403 (3> 1H), g 7.374-7.556 (p¾ 7H), g 8.191-8.215 (d, 1¾ J-7.81 Hz) _..
Ejemplo 15 Análisis de HPLC Se realizó el análisis HPLC en un Shimadzu LCMS-2010 y se empleó una relación de flujo de 3 mL/minutos y una concentración B de partida de 5%. El solvente B se elevó linealmente a 95% de concentración en 5.0 minutos, se mantuvo a 95% hasta 6.0 minutos, entonces se elevó de nuevo linealmente a 5% en 6.5 minutos, en donde permaneció hasta el final del proceso en 7.5 minutos. A menos que se observe de otra manera, éste es el método utilizado en los ejemplos. El método B es un método de gradiente lento para los compuestos polares que emplea una relación de flujo de 3 mL/minutos y una concentración B de partida de 0%, en donde se mantuvo para durante el primer minuto. El solvente B se elevó linealmente a una concentración de 10% en 3.0 minutos, luego se elevó linealmente a 95% en 5.0 minutos, en donde se mantuvo hasta 6.0 minutos, y luego se elevó linealmente a 5% en 6.5 minutos, en donde permaneció hasta el final del proceso en 7.5 minutos. Además de la detección de masa, la detección LC consiste de 3 canales; absorbancia UV a 254 nm, absorbancia UV a 214 nm, y dispersión de luz evaporativa (Alltech ELSD 2000) . El detector de dispersión de luz evaporativa se activó a 50°C con un flujo de nitrógeno de 1.5 litros por minuto. La CDL (linea de desolvación química) y las temperaturas bloqueadas del Shimadzu LC -2010 estuvieron ambas a 300 °C, y el flujo de gas nebulizador de nitrógeno fue 4.5 L/minutos. Los espectros de masa negativa y positiva se detectaron de 50 a 2000 m/z . La columna fue una YMC CombiScreen ODS-AQ, S~5p de tamaño de partícula, 50 mm junto con una I.D. de 4.6 mm. La fase A móvil se hizo utilizando agua B&J de grado de HPLC con 0.1% (v/v) de HOAc agregado y la fase B móvil fue acetonitrilo B&J de grado de HPLC con 0.1% (v/v) de HOAc agregado. Este sistema dio un tiempo de retención de 1.50 a 1.60 minutos (tR =1.50-1.60) para un material comercialmente disponible, estándar (ácido 4-hidroxifenilacético; Aldrich Catalog H5000-4; p.f. 149-151°C) utilizado como un estándar de referencia.
Ejemplo 16 HPLC Preparativa Se realizó la HPLC Preparativa de Gradiente en un sistema Shimadzu compuesto de dos bombas LC-8A conectadas a un auto-muestreador SIL-10A y eluyendo sobre una columna de fase inversa (YMC, cat CCAQSOSO520WT; ODS-AQ CombiPrep, 20 mm X 50 mm) y luego se pasó a través de un separador de volumen variable MRA; la corriente más pequeña se hizo entonces de hasta 3 ml/minutos utilizando una bomba de alimentación LC-10ADVP (MeOH) y el eluyente se pasó a través de un detector UV de longitud de onda de dos canales, variable y luego se dividió bruscamente 6:1 a un detector de dispersión de luz evaporativa (activado a 50 C con un flujo de nitrógeno de 1.5 litros por minuto) y un detector de Masa Shimadzu 2010; la corriente más grande del separador MRA, se hizo fluir entonces a un manejador liquido Gilson 215 sirviendo como un recolector de fracción activado por masa, absorbancia UV o tamaño de pico ELS. Diferentes gradientes se activaron siempre iniciando con el solvente A más acuoso y se elevó a varias concentraciones de B. La fase A móvil se hizo utilizando agua B&J de grado de HPLC con 0.1% (v/v) de HOAC agregado y la fase B móvil fue acetonitrilo B&J de HPLC con 0.1% (v/v) de HOAc agregado .
Ejemplo 17 Bioactividad de los Profármacos Hidrolizados La bioactividad de LY294002 (Compuesto 1) se determinó evaluando fagocitosis en J774 macrófagos, que es una clase de trayectoria dependiente de I quinasa PI-3. Brevemente, las células J774 se tratan con LY294002 en concentraciones de 10, 1 y 0.1 µ? junto con un control de DMSO apropiado durante 1 hora en DMEM con 10% de FCS y luego sRBCs sensiblizado (glóbulos rojos de oveja) se agregaron a un objetivo a la relación realizadora igual a 100:1 durante 30 minutos a 37 °C. Las células se expusieron a choque hipotónico para remover los glóbulos rojos y la fagocitosis se determinó midiendo la concentración de hemoglobina en los lisatos celulares. Como se muestra en la Figura 1, LY294002 bloqueó significativamente la fagocitosis en todas las concentraciones en una manera dependiente de dosis. Estos resultados indican que el sistema de células J774 pueden utilizarse para evaluar rápida y fácilmente la capacidad de los compuestos de la presente invención para inhibir la actividad de la quinasa PI-3. Utilizar este método para evaluar el compuesto 1126 del profármaco enfocado a la actividad de la quinasa PI-3 se probó en concentración de 5 µ? con un tiempo de pre-incubación variable para permitir conversión in situ del profármaco para activar el fármaco (compuesto 1) . La muestra control (tamaño cero sin pre-incubación del compuesto 1126) mostró un índice fagocítico (PGI; una medida del grado de fagocitosis ocurre como un resultado al no inhibir la quinasa PI-3) de 140 mientras que el compuesto 1126 con un tiempo de. incubación de pH=7 de 2, 5 y 10 horas mostró PGI de 88,78 y 37 respectivamente. Este ejemplo demuestra que el profármaco 1126 inicialmente tiene poco o no tiene actividad de inhibición de la quinasa PI-3 y con el tiempo se convierte al fármaco bioactivo que muestra inhibición de quinasa PI-3 significativa. Otro experimento mostró que una concentración 20 µ? del compuesto 1126 en una fijación limitada por exposición (20 minutos de exposición para probar la solución, luego la remoción de la solución de prueba) tuvo un PGI de 50 contra 163 para el ensayo en blanco del solvente, 190 para el compuesto 1, y 170 pa a RGDS (tetrapéptido que es la porción objetivo del compuesto 1126) . Este ejemplo mostró las ventajas de un inhibidor de quinasa PI-3 objetivo en una fijación limitado por el tiempo de exposición. Este efecto se evaluó además repitiendo el experimento utilizando dosis disminuidas del compuesto 1126 que demuestran que 10 µ?, 3 µ?, 1 µ? y 0 µ? durante 20 minutos de tiempo de incubación seguido por la remoción del compuesto y luego 2 horas de incubación para fagocitosis ocurre para dar los PGI de 33, 143, 206 y 213 respectivamente. Este ejemplo demuestra el compuesto 1126 en una quinasa PI-3 inhibida con fijación limitada de exposición de dosis en una manera dependiente de dosis.
Ejemplo 18 Preparación del Grupo Objetivo Óseo A030-84 Una solución de 500 mg de 4~[(N-BOC) aminoetil] anilina (Aldrich) en 10 mi de dioxano se trató con paraformaldehido (400% en moles, 270 mg) y trimetilfosfito (400% en moles, 1.12 g) . La mezcla se calentó a 95 °C durante la noche. Luego, se agregaron más paraformaldehido (270 mg) y trimetilfosfito (1.12 g) y éste se calentó a 95 °C durante la noche nuevamente. La solución se enfrió, se ocupó en cloroformo (20 mL) y se lavó con cloruro de sodio saturado (20 mL) y agua (20 inL) . Los materiales orgánicos se secaron sobre sulfato de sodio y el solvente y el trimetilfosfito en exceso se removió a través de evaporación giratoria a 80 °C para proporcionar 1.723 g de un aceite transparente. La presencia del número de lote A030-74 del compuesto del titulo se confirmó por HPLC-MS de electroaspersión mostrando un tiempo de retención de tR = 2.9 minutos y una masa de 467 m/z [M+H]+ y 489 m/z [ +Na] + encontrada para la masa deseada [M=Ci8H32 208P2] - Una solución de 870 mg de A030-74 como se preparó anteriormente en 10 mL de diclorometano se trató con bromotrimetilsilano (690% en moles, 1.97 g) . La solución se agitó durante la noche. Se agregó metanol (10 mL) y la solución se agitó 15 minutos y luego se concentró para proporcionar 1.12 g de un aceite anaranjado. La presencia del compuesto del titulo se confirmó por LC- S de electroaspersión. El tiempo de retención utilizando este gradiente se encontró que es tR = 0.85 minutos y la espectrometría de masa para el producto deseado [M=CgHi6 206P2] encontrada en la m/z 309 esperada [M-H]~ operando en el modo negativo. A este producto se le asignó el número de referencia A030-84. Í06 Ejemplo 19 Síntesis del Compuesto A014 Se agregó diclorometano (15 mL) y agua destilada (15 mL) a 1.0 g de isotiocianato de 4-carboxifenilo . El matraz se enfrió en un baño de agua helada y se agregaron bicarbonato de sodio (4.0 eguivalentes) y sulfato ácido de n- tetrabutilamonio (0.05 equivalentes). Después de 10 minutos, se agregó clorosulfato de clorometilo (1.2 equivalentes). La solución se agitó vigorosamente durante la noche y se transfirió a un embudo separador con la ayuda de diclorometano (10 mL) . Las capas se separaron y los materiales orgánicos se lavaron con cloruro de sodio saturado (20 mL) . Los materiales orgánicos se secaron sobre sulfato de sodio y el solvente se removió para proporcionar 1.10 g de un sólido estanoso. La presencia del compuesto del título se indicó por un cambio en el tiempo de retención en el producto (4.2 minutos) contra el ácido carboxílico de partida (3.2 minutos) . El compuesto se confirmó también por la espectroscopia NMR de protón: 2? (CDC13) 5:8.08 (d, 2H, J8.8 Hz), 7.30 (d, 2H, J8.8 Hz) , 5.95 (s, 2H) .
Ejemplo 20 Síntesis del Compuesto A014-48 Se trató con yoduro de sodio (1.2 equivalentes) una solución de 250 mg de clorometiléster (preparada a través del procedimiento descrito en ?014-52) en 2 mL de acetona y la solución se agitó durante la noche. La solución se filtró, el solvente se removió, y el residuo se extrajo en el diclorometano (10 mL) . La solución se lavó con 10% (p/v) de sulfito de sodio (10 mL) , 5% (p/v) de bicarbonato de sodio (10 mL) y agua (10 mL) . Los materiales orgánicos se secaron sobre sulfato de sodio y el solvente se removió para proporcionar 137 mg de un sólido verde claro. La presencia del compuesto del titulo se indicó por un cambio en el tiempo de retención en el producto de yodometiléster (4.4 minutos) contra el clorometiléster de partida (4.2 minutos). El compuesto se confirmó también por espectroscopia NMR de protón: ½ (CDC13) d: 8.04 (d, 2H, J8.8 Hz), 7.29 (dr 2H, J8.1 Hz) , 6.15 (s, 2H) .
Ejemplo 21 Síntesis del Compuesto A014-76 Se trató con yoduro de sodio (1.2 equivalentes) una solución de 387 mg de clorometiléster (preparada a través del procedimiento descrito en A014-52) en 6 mL de 2-butanona y la solución se calentó 10 horas. La solución se filtró, el solvente se removió, y el residuo se extrajo en diclorometano (10 mL) . La solución se lavó con 10% (p/v) de sulfito de sodio (10 mL) , 5% (p/v) de bicarbonato de sodio (10 mL) , y agua (5 mL) . Los materiales orgánicos se secaron sobre sulfato de sodio y el solvente se removió para proporcionar 310 mg de un sólido estanoso. La presencia del compuesto del título se indicó por un cambio en la retención del producto de yodometiléster (4.4 minutos) contra el clorometiléster de partida (4.2 minutos). Ejemplo 22 Síntesis del Compuesto A018-24 MOCHjfe ftOCHjJj trató una solución de 64 mg de 2-p-nitrobencil 1, 4, 7, 10-tetraazaciclododecano (Macrociclicos ) en 500 µ? de dioxano con paraformaldehído (50 mg) y trimetilfosfito (207 mg) . La mezcla se calentó a 85 °C y luego se removió el solvente a través de evaporación giratoria a 75°C. Se agregó cloroformo (10 mL) y la solución se lavó con cloruro de sodio saturado (2 x 10 mL) y agua (2 x 10 mL) . Los materiales orgánicos se secaron sobre sulfato de sodio y el solvente se removió para proporcionar un aceite café. Éste se purificó a través de LC para proporcionar el material deseado. La presencia del compuesto del titulo se confirmó por electroaspersión LC-MS A; tR =1.8 minutos. MS [IY C27H53N5O14P4 ] m/z 796 (MH+) , 818 (Mna+) .
Ejemplo 23 Síntesis del Compuesto A022-32 trató con bromotrimetilsilano (72 mg) una solución de 33 mg del macrociclo fosfonado (preparado en A018-24) en 700 µ? de diclorometano . La mezcla se agitó durante la noche y luego se agregó más bromotrimetilsilano (36 mg) y ésta se agitó 3 días adicionales. Se agregó metanol (500 mL) y se agitó la solución 1 hora, y luego los materiales volátiles se removieron para dar un aceite café. La adición del metanol precipitó un sólido café, el cual se filtró y se secó. Éste se purificó a través de LC para proporcionar 2.7 mg del material deseado. La presencia del compuesto del título se confirmó por electroaspersión LC-MS A; tR = 1.5 minutos. MS [M=Ci9H37N5Oi4P4] m/z 682 (M-H~) , 340 [ (M-2H) /2)2_] . El grupo nitro se reduce utilizando métodos estándares de reducción agitando por ejemplo con 5% de paladio en catalizador de carbono en metanol bajo una atmósfera de hidrógeno puro. La mezcla se filtró entonces (teniendo cuidado de evitar la exposición al aire al catalizador) y el solvente evaporado dio la amina.
Ejemplo 24 Síntesis del Compuesto A022 Se calentó a 100 °C una mezcla del ácido fosforoso (1.26 g) , ácido clorhídrico 6 M (19.5 mL) y p-xilendiamina (1.0 g) . A ésta se le agregó 37% (p/p) de formaldehído acuoso (1.15 mL) y la mezcla se agitó a 100 °C durante la noche. La mezcla se filtró y el agua se removió por evaporación giratoria a 80 °C para proporcionar 2.11 g de un sólido blanco. La presencia del compuesto del titulo se confirmó por electroaspersión LC-MS utilizando el método B; tR = 1.8 minutos MS- [M=Ci0Hi8 2O6P2] m/z 325 (MH+) .
Ejemplo 25 Síntesis del Compues-to ?018-12 Se trató con paraformaldehido (592 mg) y trimetilfosfito (2.44 g) una solución de 928 mg de N-BOC-1,4-diaminobutano en 10 mL de dioxano . La mezcla se agitó a 108 °C durante la noche y el solvente se removió por evaporación giratoria a 75°C. Se agregó cloroformo (10 mL) y la solución se lavó con cloruro de sodio saturado (2 x 10 mL) y agua (2 x 10 mL) . Los materiales orgánicos se secaron sobre sulfato de sodio y el solvente se removió para proporcionar 1.55 g de un aceite. La presencia del compuesto del titulo se confirmó por electroaspersión LC-MS; tR = 2.4 minutos MS [M=C15H34N208P2] m/z 455 (MNa+) . Ejemplo 26 Síntesis del Compuesto A026- Se trató con bromotrimetilsilano (2.2 g) una solución de 783 mg del fosfonato (preparada en A018-12) en 18 mL de diclororaetano . La solución se agitó durante la noche y se agregó metanol (10 mL) y la mezcla se agitó durante 2 horas. Los materiales volátiles se removieron para proporcionar 1.22 g de un aceite amarillo. La presencia del compuesto del titulo se confirmó por electroaspersión LC-MS utilizando el método B; tR = 0.4 minutos, MS [M=C6Hig 206P2] m/z 275 (M-fT) .
Ejemplo 27 Síntesis del Compuesto A030 Se trató con paraformaldehído (270 mg) y trimetilfosfito (1.12 g) una solución de 500 mg de 4-[(N-BOC) aminoetil] anilina en 10 mL de dioxano . La mezcla se calentó a 95 °C durante la noche. Luego, se agregaron más paraformaldehido (270 mg) y trimetilfosfito (1.12 g) y éste se calentó a 95 °C durante la noche nuevamente. La solución se enfrió, se extrajo en el cloroformo (20 mL) y se lavó con cloruro de sodio saturado (20 mL) y agua (20 mL) . Los materiales orgánicos se secaron sobre sulfato de sodio y el solvente y el trimetilfosfito en exceso se removieron a través de evaporación giratoria a 80 °C para proporcionar 1.72 g de un aceite transparente. La presencia del compuesto del titulo se confirmó por electroaspersion LC-MS: tR = 2.9 minutos, MS [M=C18H32 208P2] m/z 467 (MH+) ; 489 (MNa+) .
Ejemplo 28 Síntesis del Compuesto ?030 trató con bromotrimetilsilano (1.97 g) una solución de 870 mg de A030-74 en 10 mL de diclorometano . La solución se agitó durante la noche. Se agregó metanol (10 mL) y la solución se agitó 15 minutos, y luego se concentró para proporcionar 1.12 g de un aceite anaranjado. La presencia del compuesto del título se confirmó por electroaspersion LC-MS utilizando el método B; tR = 0.85 minutos. MS [M=C9H16N206P2] m/z encontrado para 309 [M-H]~.
Ejemplo 29 Síntesis del Compuesto ?035 2.0 g de una porción del ácido 4-aminometilbenzoico (Aldrich) se disolvió en 20 mL de agua conteniendo 0.64 g de NaOH sólido. Se agregó una porción de 3.18 g de anhídrido Boc (Aldrich) y la mezcla se permitió agitar durante la noche. La mezcla se ajustó a pH=2 por la adición cuidadosa de 15 mL de HC1 2N. El sólido blanco resultante se filtró y se secó para dar 2.9997 g del producto. El producto se caracterizó por LCMS (tiempo de retención 2.901 minutos y se observó el ión de la masa M-H deseada en 250 m/z) .
Ejemplo 30 Síntesis del Compuesto ?030-6 Se disolvió una porción de 1.5 de A35-66 en 17 mL de THF seco junto con 0.59 g de N-hidroxisuccinimida (Aldrich) y luego se trató todo a la vez con 6 mL de diciclohexilcarbodiimida 1 M (Aldrich) en diclorometano con agitación. Después de dos días, el precipitado blanco (diciclohexilurea) se extrajo por filtración y el filtrado se rotoevaporó bajo vacío para producir 2.8146 g de un sólido blanco caracterizado por LCMS (tiempo de retención 3.299 minutos y la M+H deseada se observó en 349 m/z) .
Ejemplo 31 Síntesis del Compuesto A035 Se disolvió una porción de 500 mg de ?035-6 en 5 mL de THF seco y se trató con 1.002 mL (10 equivalentes) de etilendiamina (EDA) y se permitió agitar durante 2 horas. La solución se decantó entonces a partir del sólido formado. El solvente y el EDA en exceso se removió entonces a partir de la solución decantada por rotoevaporacion bajo vacío para dar 0.8728 g del sólido blanco; el producto se caracterizó por LCMS (tiempo de retención 1.608 minutos y la M+H deseada se observó en 294 m/z).
Ejemplo 32 Síntesis del Compuesto A032 trató una solución de 872 mg de la amina (preparada en A035-14) en 10 mL de dioxano con paraformaldehído (535 mg) y trimetilfosfito (2.21 g) . La mezcla se calentó a 100 °C durante la noche y luego se removió el solvente por evaporación giratoria a 80 °C para dar un sólido café. Se agregó cloroformo (25 mL) y la solución se lavó con agua (15 mL) . Los materiales orgánicos se secaron sobre sulfato de sodio y el solvente se removió para proporcionar 241 mg de un semi-sólido amarillo. Éste se purificó a través de LC para proporcionar 58.8 mg del material deseado. La presencia del compuesto del titulo se confirmó por electroaspersión LC-MS; tR = 2.6 minutos MS [M=C2iH37 309P2] m/z 538 (MH+) , 560 (MNa+) .
Ejemplo 33 Síntesis del Compuesto A032 Se trató con bromotrimetilsilano (156 mg) una solución de 54.6 mg de fosfonato (preparada en ?032-24) en 1 mi de diclorometano (156 mg) . La mezcla se agitó durante la noche. Se agregaron etanol (0.5 mL) y agua (3 gotas) y ésta se agitó 1 hora y luego los materiales volátiles se removieron y el material se secó bajo vacio. Éste se extrajo en agua (1 mL) y se liofilizó para proporcionar 59 mg de un sólido estanoso. La presencia del compuesto del titulo se confirmó por electroaspersion LC-MS utilizando el método B; tR = 0.4 minutos. MS [M=Ci2H2iN307P2] m/z 380 (M-H~) , 382 (MH+) , 404 (MNa+) .
Ejemplo 34 Síntesis del Compuesto A026-60 A026-60 preparado a través del procedimiento de Kantoci, D., Kenike, J.K., Wechter, W.J. Syn. Commun. , 1996, 26(10), 2037: Una mezcla de N-bencil-N-metilamina (20.0 g) , dietilfosfito (70.7 g) y trietilortoformiato (29.3 g) se agitó bajo argón a reflujo (150°C) durante 5 horas. Se removió etanol a través de evaporación giratoria a 70 °C, y la mezcla se calentó de nuevo a reflujo durante la noche. La solución se diluyó con 600 mL de cloroformo y se lavó con 1 M de hidróxido de sodio (3 x 100 mL) y cloruro de sodio saturado (3 x 150 mL) . Los materiales orgánicos se secaron sobre sulfato de sodio y el solvente se removió para proporcionar 74.0 g de un aceite amarillo claro. 10.0 g de este material se sometió a cromatografia en columna de gel de sílice utilizando 14:4:1 de acetato de etilo : hexano :metanol como eluyente. Esto proporciona 6.08 g de un aceite transparente. La presencia del compuesto del título se confirmó por electroaspersión LC-MS; tR = 3.4 minutos, MS [M=C17H3iN06P2] m/z 408 (MH+) , 430 (MNa+) , 471 (MNa-CH3CN+) .
Ejemplo 35 Síntesis del Compuesto A030-54 A030-6 A030-54 (se conoce el compuesto, CAS # 80475-00-9), preparado a través del procedimiento de Kantoci, D., Kenike, J.K., Wechter, W. J. Syn. Commun, 1996, 26(10), 2037. Una solución de 4.52 g de bencilamina fosfonada (preparada a través de A026-60) en metanol (45 mL) se trató con 10% de paladio en carbono (200 mg) y se sometió a una atmósfera de hidrógeno durante la noche. El paladio/carbono se filtró para proporcionar 2.98 g de un aceite amarillo claro. La presencia del compuesto del título se confirmó por electroaspersión LC-MS utilizando el método A; tR = minutos. MS [M=Ci0H25NO6P2] m/z 318 (MH4) .
Ejemplo 36 Síntesis del Compuesto A039-16 A039-16 A039-16: Una muestra de 500 mg de ácido 4-clorometilbenzoico (Aldrich) se disolvió en 8 mL de THF y se trató todo a la vez con 5 equivalentes de etilendiamina (Aldrich) (983 uL) . Después de 24 horas, el solvente se despojo bajo vacio elevado y el sólido blanco (93%) se caracterizó por LCMS (tiempo de retención 0.4 minutos y el M+H deseado se observó a 195 m/z).
Ejemplo 37 Síntesis del Compuestos A038-24 Una mezcla de 679 mg del aminoácido (preparada a través de A039-16) , 37% (p/p) de formaldehído acuoso (1.04 mL) , ácido fosforoso (1.15 g) y ácido clorhídrico concentrado (12.1 M) (2.3 mL) en dioxano (10 mL) se agitó a 100 °C durante la noche. El solvente se removió a través de evaporación giratoria a 75°C y la mezcla se centrifugó y el sólido se desechó. Se agregó al liquido más solución de formaldehido (1.04 mL.) , ácido fosforoso (1.15 g) , ácido clorhídrico concentrado (2 mL) y dioxano (10 mL) y ésta se agitó de nuevo durante la noche a 100 °C. El solvente se removió a través de evaporación giratoria a 75 °C para proporcionar un aceite espeso. Éste se purificó a través de LC para proporcionar 276 mg de un sólido café. La presencia del compuesto del título se confirmó por electroaspersion LC-MS utilizando el método A; tR = 0.6 minutos. MS [M=Ci3H23N2011P3] m/z 475 (M-H-) , 477 (MH+) .
Ejemplo 38 Síntesis del Compuesto A038-50 Una mezcla de 6.0 g de Fmoc-Lys-OH (Advanced ChemTech) en metanol (25 mL) y agua (25 mL) se trató con 37% (p/p) de formaldehido acuoso (6.06 mL) y dimetilfosfito (8.96 g) . La mezcla se agitó a 80 °C durante 2 horas, se enfrío y se extrajo con diclorometano (1 x 100 mL, 2 x 50 mL) . Los materiales orgánicos se lavaron con cloruro de sodio saturado (50 mL) , se secaron sobre sulfato de magnesio durante 30 minutos, y el solvente se removió para proporcionar 10.17 g de un aceite verde claro. La presencia del compuesto del titulo se confirmó por electroaspersión LC-MS utilizando el método A; tR = 3.3 minutos. MS [M=C27H38 2010P2] m/z 613 (MH+) , 636 (MNa+) .
Ejemplo 39 Síntesis del Compuesto A038 Una solución de 23.9 mg de Fmco-Lys-OH fosfonado (preparada a través de A038-50) en diclorometano (1 mL) se trató con bromotrimetilsilano (60 mg) . La mezcla se agitó durante la noche. La presencia del compuesto del titulo se confirmó por electroaspersión LC-MS utilizando el método A; tR = 3.4 minutos MS [M=C23H3o 2OioP2] m/z 555 (M-H") .
Ejemplo 40 Síntesis del Compuesto A038-76 Una solución de 112.9 mg de Fmoc-Lys-OH fosfonado (preparada a través de A038-50) en ácido clorhídrico 6 M (3 mL) se agitó a 80°C durante 2 días. Se agregó agua (9 mL) y después de 2 días más la mezcla se centrifugó y el líquido se decantó. El sólido se secó bajo vacío para proporcionar 86.8 mg de un sólido blanquecino. La presencia del compuesto del título se confirmó por electroaspersión LC-MS utilizando el método A; tR = 3.1 minutos. MS [M=C23H3o 2OioP2] m/z 555 (M- H~) .
Ejemplo 41 Síntesis del Compuesto A038 Una solución de 500 mg de Fmoc-Lys-OH (Advanced ChemTech) en dioxano (5 mL) se trató con 37% (p/p) de formaldehído acuoso (303 L) , ácido fosforoso (333 mg) y ácido clorhídrico concentrado (12.1 M) (674 µ??) . La mezcla se agitó a 90 °C durante la noche, el solvente se removió a través de evaporación giratoria a 75°C. La presencia del compuesto del título se confirmó por electroaspersión LC-MS utilizando el método B; tR = 5.4 minutos. MS [M=C23H3oN2Oi0P2] m/z 555 (M-H~) .
Ejemplo 42 Síntesis del Compuesto A042 Una solución de 1.29 g del aminoácido protegido con Boc (preparado anteriormente como el lote A035-66) en 15 mL de tetrahidrofurano se trató con N-hidroxisuccinimida (623 mg) y 1, 3-diciclohexilcarbodiimida 1.0 M en diclorometano (5.4 mL) . La mezcla se agitó durante la noche y se filtró un precipitado blanco y el sobrenadante se concentró para proporcionar 1.89 g de un sólido blanco. La presencia del compuesto del título se indicó por la presencia de una señal ÜV en 3.3 minutos .
Ejemplo 43 Síntesis del Compuesto A042 ? una solución de 2.1 g de tris- (2-aminoetil) amina en 20 mL de tetrahidrofurano se agregó en gotas una solución de 1.0 g del éster activado (preparado a través de A042-18) en 20 mL de tetrahidrofurano durante un periodo de 40 minutos. La mezcla se agitó durante la noche resultando en un precipitado que se filtró y se concentró a través de evaporación giratoria para proporcionar 2.10 g de un aceite amarillo. La. presencia del compuesto del titulo se confirmó por electroaspersion LC-MS utilizando el método A; tR = 1.4 minutos. MS [M^gR^NsOs] m/z 380 (MH+) , 402 (MNa+) .
Ejemplo 44 Síntesis del compuesto A042 Se trató una solución de 2.08 g de amina (preparada a través de A042-26) en dioxano (20 mL) con paraformaldehido (1.50 g) y dimetilfosfito (6.85 g) . La mezcla se agitó a 90°C durante la noche y el solvente se removió a través de evaporación giratoria a 70°C. Se agregó diclorometano (50 mL) y éste se lavó con cloruro de sodio saturado (25 mL) y agua (25 mL) . Los materiales orgánicos se secaron sobre sulfato de sodio y el solvente se removió. El residuo se purificó a través de LC para proporcionar 123.8 mg de un aceite amarillo. La presencia del compuesto del titulo se confirmó por electroaspersion LC-MS utilizando el método D; tR = 2.2 minutos. MS [M=C31H6a 50i5P4] m/z 868 (MH+) .
Ejemplo 45 Síntesis del Compuesto A042 Se trató con 194 mg de bromotrimetilsilano una solución de 111.1 mg de diamina fosfonada (preparada a través de A042-32) en 1 mL de diclorometano . Después de 5 horas, se agregó metanol (1 mL) , la mezcla se agitó durante 1 hora, y el solvente se removió para proporcionar 113.9 mg de un sólido estanoso. La presencia del compuesto del titulo se confirmó · por electroaspersion LC-MS utilizando el método B; tR = 1.0 minutos MS m/z 328 [ (M+2H/2 ) 2+) ] , 656 (MH+) . El compuesto se analizó también por espectroscopia NMR de protón: ½ (CDC13) d: 7.77 (d, 2H, J8.1 Hz) , 7.43 (d, 2H, J8.2 Rz) , 4.1-3.3 (m, 33H) .
Ejemplo 46 Síntesis del Compuesto A026 trató con bromotrimetilsilano (2.89 g) una solución de 750 mg del fosfonato (preparado a través de A030-54) en 24 mi de diclorometano . La solución se agitó durante la noche. Se agregó metanol (10 mL) y la solución se agitó durante 2 horas y el solvente se removió para proporcionar un aceite amarillo, el cual se liofilizó, resultando en 364 mg de un sólido blanco. La presencia del compuesto del titulo se confirmó por electroaspersión LC-MS utilizando el método B; tR = 0.6 minutos. MS [M=C2H9N06P2] m/z 204 (M-fT) .
Ejemplo 47 Síntesis del Compuesto A042 A042-96 (ter-butilfosfito) : Se trató con 2-metil-2-propanol (7.41 g) una solución de 4.10 g de ácido fosforoso en 100 mL de tetrahidrofurano . Se agregó una solución de 1.0 M de 1 r 3-diciclohexilcarbodiimida en diclorometano (100.0 mL) , resultando en la formación de un sólido blanco. La mezcla se agitó durante la noche y el sólido se filtró y el solvente se removió para proporcionar 6.82 g de un aceite amarillo. La presencia del compuesto del titulo se confirmó por GC-MS . Se encontraron los siguientes fragmentos: 57 [(CH3)3C+], 83 [HP(OH)3+], 123 [ (HO) 2PC (C¾) 2+] .
Ejemplo 48 Síntesis del Compuesto A042 Se calentó a 90 °C durante la noche una mezcla de etanolamina (858 mg) , para ormaldehido (1.05 g) , ter-butilfosfito (preparada a través de A042-96, 6.82 g) en benceno (100 mL) , resultando en un liquido sobre un aceite espeso. El liquido se decantó y se concentró a través de evaporación giratoria, resultando en un aceite que se sometió a cromatografía en columna de gel de sílice utilizando 10% de metanol en diclorometano como eluyente. Se obtuvo un aceite transparente (436 ing) . La presencia del compuesto del titulo se confirmó por electroaspersión LC-MS utilizando el método ?; tR = 3.6 minutos. MS [M=C2oH45N07P2] m/z 496 (MNa+) .
Ejemplo 49 Síntesis del Compuesto A029-34 Para preparar ácido 4-isotiocianatofenilacetico, 1.3 mL (13.5 mmoles, 2 equivalentes), se agregó tiofosgeno a 1.0 g del ácido 4-aminofenilacético (6.61 mmoles) [Aldrich] y 3.73 g de carbonato de potasio anhidro (4 equivalentes.) suspendido en 20 mL de THF seco. La suspensión se agitó durante 15 minutos a temperatura ambiente seguida por un calentamiento de 4 horas en un baño de aceite de silicio a 85 °C. La solución se enfrió y se pasó a través de un lecho de celite de una pulgada en una jeringa de filtro. La solución se recolectó en un matraz de fondo redondo y el solvente se removió bajo presión reducida. La muestra se almacenó en un desecador al vacio durante dos horas, luego se disolvió en una mezcla de acetona-agua, se congeló y liofilizó para dar 1.65 g de un sólido negruzco. El compuesto se identificó por un cambio en el tiempo de retención en el cromatograma LCMS a 3.32 minutos .
Ejemplo 50 Síntesis del Compuesto A040-22 A040-22 Para preparar el clorometiléster del ácido 4-isotiocianatofenilacético, 0.530 g del ácido 4-isocianatofenilacético (2.7 inmoles) se disolvió en 5.0 mL de cloruro de metileno en un frasco de vidrio, al cual se agregó 0.044 g de sulfato ácido de tetra-n~butil-amonio (catalizador de transferencia de fase - 0.05 equivalentes) y 0.866 g de bicarbonato de sodio (4 equivalentes) disuelto en 5.0 mL de agua. La solución se agitó en un baño de hielo durante diez minutos. A la mezcla fria se, agregó 0.520 g de clorosulfato de clorometilo (ACROS Chemical - 1.2 equivalentes) y se agitó durante 4 horas con la temperatura que se eleva gradualmente a la temperatura ambiente. La capa orgánica se separó en un embudo separador, se lavó con 10 mL de salmuera saturada y se secó sobre sulfato de sodio anhidro. El solvente se removió bajo vacio para dar 0.703 g del aceite crudo. El producto se identificó por la formación de un nuevo pico en LCMS con un tiempo de reacción de 4.268 minutos y la desaparición del pico que corresponde al material de partida.
Ejemplo 51 Síntesis del Compuesto A040-26 Para preparar la sal cuaternaria del ácido 4-isotiocianatofenilacético derivado del Compuesto 1101, el Compuesto 1101 (.300 g, 1.0 mmol) y .582 g de yoduro de godio (4 equivalentes) se disolvieron en 4.0 mL de acetonitrilo seco en un frasco de un dracma. El clorometiléster del ácido 4-isotiocianatofenilacético (compuesto A040-22) en 2.0 mL de acetonitrilo seco se agregó con agitación. La mezcla se calentó en un baño de aceite de silicona a 65 °C durante cinco horas, verificando el progreso de la reacción por LCMS. Cuando la mayoría del material de partida del Compuesto 1101 se consumió la mezcla de reacción utilizando tiempo de retención de LCMS preparativo de 3.019 minutos, m+ = 513. Un rendimiento de 194.1 mg de 94% del producto puro se obtuvo e identificó por LCMS. El compuesto A040-26 se hizo reaccionar entonces con agentes objetivo que soportan el nucleófilo como se describe por los métodos descritos en los ejemplos utilizando el compuesto 1105 para preparar profármacos objetivo útiles.
Ejemplo 52 Síntesis del Compuesto A044-52 Para preparar el N-bencilo, se disolvieron N-metil carbamoil clorometiléster, 0.300 mg (324 uL, d=0.942), bencilmetilamina y 640 uL de diisopropiletilamina (1.5 equivalentes) en 2.0 mL de cloruro de metileno seco y se enfrió en un baño helado. Cuando la solución se enfrió, se agregó 330 uL de cloroformiato de clorometilo (1.5 equivalentes) en 2.0 mL de cloruro de metileno seco y se agitó durante 2 horas, permitiendo gradualmente a la solución elevarse a temperatura ambiente. La solución amarilla se colocó en un embudo separador y se lavó con 2 x 10 mL de 1N HC1, 1 x 10 mL de agua y 2 x 10 mL de 1 N de bicarbonato de sodio. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio y se concentró bajo presión reducida. El carbamato de clorometilo se obtuvo como 0.95 g de un aceite amarillo y se identificó en el LCMS como un componente activo de uv con un tiempo de retención de 3.520 minutos. Para preparar la sal cuaternaria de N-bencilo, se disolvieron N-metilcarbamoilmetilo del Compuesto 1101, 0.5 g del Compuesto 1101 y 0.5 g de yoduro de sodio (20 equivalentes) en 5.0 mL de acetonitrilo seco en un frasco de vidrio. El clorometiléster de N-bencilo, N-metilcarbamoilo se agregó a la solución, luego se colocó en un baño de aceite a 65 °C durante la noche. El producto se identificó por LCMS y se purificó por LCMS preparativo para dar 169.5 mg (21.5% de rendimiento teórico) de un sólido asignado A044-52 con un tiempo de retención de 2.731 minutos, M+ = 485 y 90% de pureza .
Ejemplo 53 Síntesis del Compuesto A044-62 Para preparar sal cuaternaria de N-bencilo, se mezclaron N-metil-carbamoilmetilo del Compuesto 1157, 22 mg del Compuesto 1157, 20 mg de yoduro de sodio (2.0 equivalentes) y 30.7 mg de clorometiléster de N-bencil-N-metilcarbonmoilo (2.0 equivalentes) en 500 uL de acetonitrilo seco en un frasco de vidrio, y se calentaron en un baño de aceite a 65 °C durante la noche. El producto se identificó a través de LCMS y se purificó por LCMS preparativo. Se obtuvo 5.4 mg (15.5% de rendimiento teórico) de un compuesto con un tiempo de retención de 2.810 minutos, M+ = 483 y 98% de pureza .
Ejemplo 54 Síntesis del Compuesto ?044 Para preparar la sal cuaternaria de bencil formoil-1-etilo del Compuesto 1101, se agregó 200 uL de cloroformiato de 1-cloroetilo a 100 uL de alcohol bencílico en 2.0 mL de cloruro de metileno seco en un frasco de vidrio incubado a 0°C en un baño de hielo. A la solución fría se agregó 200 uL de piridina, la cual provocó la formación de un precipitado blanco en el plazo de pocos minutos. La agitación se continuó a temperatura ambiente durante la noche. Diez mL de cloruro de metileno se agregó a la mezcla, la cual se lavó entonces con 1 x 10 niL de 0.5 M de HC1, 1 x 10 mL de agua y 1 x 10 mL de 0.5 N de solución de bicarbonato de sodio. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio y el solvente se removió bajo presión reducida. El formiato de bencil-1-cloroetilo se identificó como un componente activo uv con un tiempo de retención de 3.933 minutos. A 100 mg del Compuesto 1001 y 100 mg de Nal (20 equivalentes) disuelto en 1.0 mL de acetonitrilo seco se agregó 107 mg (1.5 equivalentes) del formiato de bencil-1-cloroetilo. La mezcla se calentó a 65 °C durante la noche. El LCMS indicó la presencia del material de partida para 107 mg adicionales (1.5 equivalentes) de formiato de bencil-1-cloroéter se agregó y el calentamiento continuó otras 24 horas. El LCMS identificó un producto que podría separarse a partir del material de partida con cromatografía de gradiente retrasada. El compuesto deseado se aisló utilizando LCMS preparativo para dar 13.7 mg (8.7% de rendimiento teórico) de un compuesto con un tiempo de retención de 4.690 minutos, M= + 488 en 98.6% de pureza.
Ejemplo 55 Síntesis del Compuesto 1126 Para preparar clorometil-t-butilsuccinato, monosuccinato de t-butilo (Aldrich) , 2.0 g, el cual se disolvió en 8.0 mi de cloruro de metileno se agregó a un frasco de vidrio que contiene 4.0 g de carbonato de potasio y 0.24 g de sulfato ácido de tetra n-butil amonio en 8.0 mL de agua con agitación en un baño de hielo. Después de 15 minutos, se agregó 1.3 mL de clorosulfato de clorometilo (Acros) a la capa de cloruro de metileno y la mezcla de reacción se agitó con la temperatura elevándose lentamente a la temperatura ambiente, la capa orgánica se separó y se lavó con 1 x 10 mL de agua y 1 x 10 mL de la solución de salmuera saturada. La solución se secó sobre sulfato de sodio anhidro y el solvente se removió bajo presión reducida. 3 g de un aceite amarillo pálido se obtuvo y se asignó al número de lote A047-71. Se disolvieron 3 g de A047-71 de lo anterior en 36 mL de acetonitrilo y se trataron con 1.8 g del Compuesto 1101 y 1.8 g de Nal y se colocaron en un calentador con agitación durante 16 horas. La mezcla de reacción (incluyendo el precipitado) se dividió entre agua y cloruro de metileno y la capa de cloruro de metileno se separó, se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se evaporó para dar un aceite oscuro. Este aceite se disolvió en 5 mL de acetonitrilo y se almaceno en el congelador durante dos días. El precipitado amarillo que se formo entonces se filtró y se lavó con 3 mL de acetonitrilo y se secó para dar 2.8435 g de >95% del producto de pureza asignado al lote ?046-67?, tiempo de retención 2.719 minutos, [M+] de 494 m/z. Todo este producto se disolvió en 10 mL de cloruro de tionilo y se calentó a 65 °C durante 4 horas. Se removió el cloruro de tionilo en exceso bajo vacio y se secó el aceite amarillo bajo alto vacio para producir 1.9906g del cloruro ácido (Compuesto, 1111) como un sólido crujiente amarillo. El sólido se utilizó directamente en reacciones subsecuentes. Para acoplar el cloruro ácido y el péptido de FMOCedRGDS del Compuesto 1101, se mezclaron en un matraz de fondo redondo bajo gas Argón 1.26 g de cloruro del Compuesto 1111 y 5.6 g del péptido RGDS removido de-FMOC (ambos secos en un desecador de vacio sobre pentóxido Fosforoso) . A los sólidos se agregaron 270 uL de piridina seca en 28 mL de cloruro de metileno y la mezcla se agitó para disolver el cloruro ácido. La mezcla se colocó en un agitador orbital durante una hora. La solución se redujo a través de una jeringa de plástico fritada y se lavó con 2 x 10 mL de cloruro de metileno y el solvente se drenó. A la resina se agregó 500 ul de anisol seguido por 20 mL de una solución de TFA/cloruro de metileno 50/50. Se le permitió a la resina permanecer en la solución de TFA durante tres horas con agitación ocasional. La solución de TFA se retiró a partir de la resina. La resina se lavó con 10 mL de cloruro de metileno la cual se combinó con la solución de TFA. La solución de TFA se colocó en cuatro frascos que se secaron por soplado con gas Argón. Cada frasco se trató con múltiples lavados de éter y de nuevo se secó con soplado con gas Argón. El producto se identificó por LCMS y se purificó en diecisiete corridas utilizando LCMS de fase inversa preparativa. Las corridas combinadas produjeron 163.7 mg de 96% del producto puro (lote asignado a036-33) con un tiempo de retención de 1.768 minutos, M+=853 y [M+H] /2 a 427 m/z. El cromatograma LC-MS y el espectro de masa para este compuesto se muestran en la Figura 7 y la Figura 8. En la Figura 7 el eje x es tiempo en minutos y el eje y para el cromatograma superior es unidades de mili-absorbancia para el detector UV a 254 nm y para el cromatograma inferior es milivoltios detectados por el detector de dispersión de luz. En la Figura 8, el eje x es la relación de masa a carga (m/z) y el eje y es la intensidad del conteo de ión de masa.
ESQUEMA 10 Ejemplo 56 Síntesis del Compuesto A052 Para la preparación de la sal cuaternaria ftalimidometilo del Compuesto 1101, se disolvió una mezcla de 100 mg del Compuesto 1101 y 100 mg de yoduro de sodio (2.0 equivalentes) en 3.0 mi de acetonitrilo seco. A la mezcla se agregaron 128 mg de clorometilftalimida (Aldrich) y el frasco se calentó en un baño de aceite a 55 °C durante cuatro dias. El producto se identificó por LCMS como un pico nuevo con un tiempo de retención de 3.984 minutos, + = 467.
Ejemplo 57 Síntesis del Compuesto A052 Para la preparación de la sal cuaternaria de ftalimidometilo del Compuesto 1101, se disolvió una mezcla de 100 mg del Compuesto 1101 y 100 mg de yoduro de sodio (2.0 equivalentes) en 3.0 mi de acetonitrilo seco. A la mezcla se agregaron 120 mg de clorometilftalimida y el frasco se calentó en un baño de aceite a 55 °C durante cuatro dias. El producto se identificó por LCMS como un nuevo pico con Rf = 3.984, + = 467.
Ejemplo 58 Síntesis del Compuesto A044 Para preparar la sal cuaternaria de 4-Carboxibencilo del Compuesto 1101, se mezclaron 300 mg del Compuesto 1101, 400 mg de yoduro de sodio y 500 mg de ácido clorometilbenzoico en un frasco de vidrio y se suspendieron en 4.0 mi de acetonitrilo seco. La reacción se calentó en un baño de aceite a 65 °C y se verificó durante dos semanas por LCMS. La solución se filtró a través de una jeringa de plástico fritada que habia sido adaptada con un filtro de 2 mieras adicional. El compuesto deseado se aisló utilizando LCMC preparativo y tuvo un tiempo de retención de 3.717 minutos, M+ = 442. ün rendimiento de 27.7 mg de 96% de pureza se obtuvo. El grupo ácido carboxilico del compuesto A044-78 se convierte a un grupo reactivo por a) la reacción con N-hidroxisuccinimida como se describe por el método en el Ejemplo 31 para preparar el éster activo de NHS o b) la conversión al cloruro ácido como se describe por el método en el Ejemplo 56. Cualquiera de estos grupos reactivos se hacen reaccionar entonces con la amina nucleofilica o los grupos alcoholes de los agentes objetivo utilizando métodos descritos en los Ejemplos previos para dar conjugados de profármaco objetivo.
Ejemplo 59 Síntesis del Compuesto A044 Para preparar la sal cuaternaria de 4-Isocianatobencilo del Compuesto 1101, una mezcla de 300 mg del Compuesto 1101, se disolvieron 450 mg de yoduro de sodio (3.0 equivalentes) y 490 mg (3.0 equivalentes) de bencenisocianato de 4-clorometilo en 4.0 mi de acetonitrilo seco y se calentó aceite en un baño de aceite a 65°C durante 2 días. El LCMS indicó que la reacción ha llegado a la terminación debido a la ausencia del material de partida (Compuesto 1101) . El producto se identificó como un nuevo pico con un tiempo de retención de 4.577 minutos, M+ = 439. El compuesto A044-80 se hizo reaccionar con grupos nucleofilicos de varios agentes objetivo para producir conexiones de carbamato o urea a los agentes objetivo, por los métodos de los Ejemplos utilizando el compuesto 1105 y A040-26.
Ejemplo 60 Síntesis del Compuesto A044-4 Para preparar la sal cuaternaria del pivaloilmetilo del Compuesto 1101, se agregaron en gotas 100 mg de cloruro de pivaloilo (2.0 equivalentes) a una mezcla de 100 mg del Compuesto 1101 y 100 mg de yoduro de sodio (2.0 equivalentes) en 2.0 mi de acetonitrilo seco. La mezcla se calentó en un baño de aceite a 65 °C durante 2 horas. Los sólidos se filtraron utilizando una jeringa de plástico fritada adaptada con ün filtro- de 2 mieras. El compuesto se identificó y se aisló utilizando LCMS preparativo. Un sólido amarillo con un tiempo de retención de 2.735 minutos, M+ = 422 se obtuvo con un rendimiento de 102.3 mg de 93.7% de pureza.
Ejemplo 61 Síntesis del Compuesto A040-70 Para preparar la sal cuaternaria del acetoximetilo del Compuesto 1101, se disolvió 1.0 g del Compuesto 1101 en 10 mL de acetonitrilo seco en un frasco de vidrio, y se agregó 1.0 g de acetato de bromometilo (2.0 equivalentes) y se permitió agitar a temperatura ambiente durante la noche. El LCMS indicó la presencia del material de partida, de manera que la reacción se calentó a 65 °C en un baño de aceite durante 8 horas. Los licores madre se decantaron a partir del sólido y los sólidos se lavaron con una pequeña cantidad de acetonitrilo frió. El sólido se secó en un desecador al vacio durante la noche. El producto se identificó como 264 mg de un sólido blanco con un tiempo de retención de 2.204 minutos, M+ = 380 el cual fue 97% puro. Se encontró que este compuesto tiene muy alta solubilidad al agua; una solución milimolar de 32.5 de este compuesto en solución salina regulada con fosfato se preparó disolviendo 27 mg en 1.865 mL de solución salina regulada con fosfato con un pH resultante de alrededor de 4. Una alícuota de 50 uL de esta solución (la cual contiene 1.625 uMoles del Compuesto 1101 como un profármaco) se inyectó en la vena de la cola de un ratón desnudo sin efectos adversos observables que ilustran la falta de toxicidad para la forma del profármaco mientras que la inyección de 1.04 uMoles del Compuesto 1101 provocó muerte inmediata en tres de entre los tres ratones. Adicionalmente, se administró 250 uL de esta solución de 32.5 mM del compuesto A040-70 a un ratón desnudo y se analizó por cebadura oral. Después de 5, 15 y 30 minutos, se obtuvieron 40 uL de sangre de ratón y se analizaron por LC-MS (después de la extracción utilizando acetonitrilo) para demostrar que los niveles de sangre combinada del profármaco A040-70 y el compuesto 1 fueron 1.8, 4.97 y 4.80 micromolares a los puntos de tiempo respectivos. Este resultado demuestra la biodisponibilidad oral del fármaco activo a partir del profármaco in vivo. La sal de cloruro se obtiene disolviendo este compuesto A040-70 en una cantidad mínima de agua y pasando a través de un lecho de resina de intercambio de ión tal como Dowex 22 (forma de cloruro) disponible de Aldrich y luego lavando con agua y secado por congelamiento el eluyente combinado para dar un sólido que posee un ión de cloruro ntercambiado para el ión de bromuro.
Ejemplo 62 Preparación del profármaco que soporta polioxietileno solubilidad de agua no iónica Se disolvió una porción de 78 mg del compuesto 1 en 2 mL de acetonitrilo junto con 76 mg de Nal y se trató todo a la vez con 144 mg de clorometiléster 7A029-62 y se agitó a 65 °C durante 5 horas. La reacción se purificó por LC-MS de fase inversa para dar 72 mg (51% de rendimiento) del sólido amarillo ?027-85 con un tiempo de retención de 2.30 minutos y se caracterizó por tener un espectro de masa que tiene M+ = 556 como se espera para C30H38NO9. Una muestra pequeña se introdujo dentro del regulador de fosfato a pH =7.4 seguido por LC-MS con el transcurso del tiempo con lo cual una porción sustancial del profármaco se convierte de nuevo al compuesto 1 con una vida media estimada de conversión de aproximadamente 3 horas.
Ejemplo 63 Preparación de un profármaco objetivo del hueso del Compuesto 1 Se agregó una porción de 20 uL de 75 mMolar 042-70 (1.5 uMoles) en agua a un frasco que contiene 500 mMolar de regulador de fosfato (11 frascos en 11 diferentes pH que varían desde 3.0 a 8.0 en incrementos de 0.5 unidades). Después de la mezcla, cada frasco se trató entonces con 50 uL de 60 uMolar del Compuesto 1111 en acetonitrilo (3.0 uMoles = 2 equivalentes con relación al grupo amino del agente objetivo del hueso) y se mezcló con agitación. Después de una hora una alícuota de 3 uL de cada frasco se inyectó en HPLC y el área pico UV se determinó para el material de partida y el producto deseado y por el producto de hidrólisis acuosa, Compuesto 1101. Únicamente las muestras en pH de 6, 6.5, 7, 7.5 y 8 se encontraron por tener cantidades significativas de profármaco objetivo de hueso deseadas A046-89P (tiempo de retención 2.50 minutos; [M+] encontrado para 1075 m/z C42H59N6019P4) [M+H] /2 = 538 m/z también encontrado). Este ejemplo demuestra que el pH óptimo para la síntesis del profármaco objetivo del hueso bajo estas condiciones es pH = 7.0, el cual dio aproximadamente 42% de rendimiento teórico del profármaco objetivo de hueso deseado del compuesto 1 que posee 4 grupos de ácido fosfónico. Después de 24 horas, el análisis de esta misma solución que permanece por ese tiempo en pH=7.0 indicó que el producto objetivo se había convertido completamente de nuevo al compuesto 1 demostrando reversibilidad bajo condiciones fisiológicamente relevantes.
Ejemplo 64 Eficacia In vivo del Compuesto 1126 Contra Célula No Pequeña de Cáncer de Pulmón Ratones desnudos machos de 4-6 semanas de edad que pesan alrededor de 30 gramos se inocularon subcutáneamente en el flanco derecho con 5 millones de células tumorales (células cancerígenas de pulmón de célula no pequeña humana: H1299) en el día 0. Después de 14 días de permitir a los tumores crecer, los animales se dividieron en 3 grupos de 5 animales cada uno . Un grupo recibió el control de vehículo solo. Un grupo recibió inyecciones en la vena de la cola dos veces por día (i.v) de 50 uL de volumen de solución de 24.4 milimolar del Compuesto 1126 en solución salina regulada con fosfato que corresponde a un nivel de dosis de 25 mg/kg/dia del componente activo del profármaco (es decir, compuesto 1) . El último grupo recibió inyecciones de la vena de la cola dos veces por dia (i.v) de 50 uL, de volumen de una solución de 4.9 milimolar del Compuesto 1126 en solución salina regulada con fosfato que corresponde a un nivel de 5 mg/kg/dia del componente activo del profármaco (compuesto 1) Los tumores se midieron cada tres dias utilizando calibradores para determinar el volumen de tumor y los pesos de los animales se registraron cuando los animales se sacrificaron en el dia 27. Los resultados se muestran en la Tabla 7 e indican la reducción del volumen del tumor fuerte contra el control para ambos niveles de dosis en el primer punto de datos únicamente 3 dias después del tratamiento (Dia 17) y continuando a través del final del estudio: Tabla 7 *Comparado al vehículo únicamente de animales control Las dosis de dos veces por día fueron bien toleradas durante el periodo de administración de dos semanas. Los resultados de eficacia anteriores se acompañaron por una carencia de diferencia estadísticamente significativa en los pesos del cuerpo del animal entre el grupo control y los dos grupos de tratamiento que como una medida general de toxicidad total indicó el profármaco objetivo tiene una carencia deseable de toxicidad.
Ejemplo 65 Eficacia In Vivo del Compuesto 1126 Contra Cáncer de Cerebro Se produjo un estudio de animal como se describe en el Ejemplo anterior, excepto que se utilizó una línea celular de cáncer de cerebro (U87 G) y con el tratamiento iniciando en el día 7 de manera que la primera medida de volumen de tumor ocurrió en el día 10. Los resultados del Compuesto 1126 contra esta línea de célula cancerígena se muestran en la Tabla 8 e indican efectividad y una carencia deseable de toxicidad: Tabla 8 Ejemplo 66 Los Inhibidores de PI 3 quinasa alfa y objetivo invalidaron la formación de las células endoteliales EDC-CBPl en Matrigel La formación del tubo representa en algún grado la formación de angiogénesis in vivo. En este ejemplo, se determinó qué grados de inhibidores de PI3 quinasa (incluyendo los profármacos del inhibidor PI3 quinasa) podrían inhibir la formación del tubo. Se colocaron en placa Matrigel en pozos de placas de 12 pozos y se solidificaron en 37 °C durante 2 horas. Se colocaron en la parte superior de la capa Matrigel células endoteliales 1 x 105 EDC-CBFl en la presencia de PBS, RADfV (péptido de control negativo cíclico) , RGDfV (péptido de control positivo cíclico) , RADS (péptido de control negativo lineal) , compuesto 1, o el Compuesto 1126 en una concentración de 20 °M durante la noche. Las gráficas se tomaron entonces utilizando un microscopio. Los tubos bien formados pueden visualizarse en los pozos control PBS (panel izquierdo superior de la Figura) . No hubo mucha diferencia en los pozos que contienen RGDfV-, RADfV- o RGDS- comparados con el control PBS. La formación del tubo fue significativamente menor en los pozos que contiene el Compuesto 1101- y el Compuesto 1126.
Ejemplo 67 Los inhibidores de PI3 quinasa objetivo indujeron la actividad transcripcional p53 en HBECs Este experimento probó el efecto · de los inhibidores de PI 3 quinasa (Compuesto 1 y la versión de profármaco objetivo del Compuesto 1; Compuesto 1126) en la inducción de la actividad de la luciferaza p53. El procedimiento de transfección fue similar a aquel descrito en la literatura para verificar la transcripción p53. El compuesto 1 (6 horas de exposición) indujo más del doble de la actividad de la luciferaza que el control y la versión objetivo del compuesto 1 (Compuesto 1126) tuvo incluso mejor capacidad para inducir la actividad de la luciferaza p53 (a casi 3 veces) . Esta inducción de la función de p53 se demostró para invalidarse por el inhibidor p53, la pifitrina alfa a una concentración de 20 uM. La co-transfección del Akt activo catalítico inhibió también la función p53 inducida por estos compuestos. Este resultado mostró que la transcripción de p53 inducida por los inhibidores de quinasa PI3 es corriente debajo de Akt en la cascada de señalización completa y el profármaco objetivo del Compuesto 1126 dio una inducción mejorada de p53 contra el fármaco no objetivo, Compuesto 1.
Ejemplo 68 Purificación del Compuesto 1126 La mezcla de reacción A044-84 (2.33 g) se pesó en muestras separadas de 0.33 g y se disolvió inmediatamente antes de la cromatografía preparativa en 800 µ? de una solución que contiene 1 parte por volumen de acetonitrilo, 1 parte por volumen de agua, y 1% en volumen del ácido acético. Se inyectaron 400 µ? de esta solución para cada prueba de cromatografía preparativa. El eluyente de la bomba A fue agua B&J (365-4) con 0.1% de ácido acético agregado, y el eluyente de la bomba B fue acetonitrilo B&J (015-4) con 0.1% de ácido acético agregado. Inicialmente, el eluyente fue 10% B, luego se elevó linealmente a 34% B durante un periodo de 4 minutos, luego se elevó linealmente a 95% B en 4.25 minutos y se mantuvo ahí hasta 5.25 minutos, luego se elevó de nuevo linealmente a una concentración de partida de 10% B en 5.50 minutos. El flujo de bombeo total fue 20 mL/minutos. La re-equilibración del sistema se logró mientras el automuestreador estuvo tomando muestras para la siguiente prueba. Al utilizar este gradiente, el producto con los picos de espectro de masa positiva a 853 (m/z=l) y 427 (m/z=2) eluido a 3.37 minutos. Las fracciones se recolectaron durante las pruebas de cromatografía preparativa cuando la señal detectada en ELSD excedió 10 mv. Las fracciones que contienen el producto se diluyeron con un exceso doble de agua (por volumen) y se congelaron en un recipiente de liofilización utilizando un baño de hielo seco-acetona inmediatamente después de la recolección. Después de la liofilización durante un periodo de 24-48 horas de un total de 180 mg del Compuesto 1126 como un sólido esponjoso con una pureza de 95% se obtuvo. Este ejemplo demuestra que con el control del pH cuidado el Compuesto 1126 del profármaco inestable puede aislarse en pureza elevada utilizando métodos de separación de fase inversa de base acuosa.
Ejemplo 69 Preparación del Profármaco reactivo a SCN Una porción de 184 mg del A014-48 preparado por el método del Ejemplo 20 se disolvió con 154 mg del Compuesto 1 en 12 mL de acetonitrilo y se agitó a temperatura ambiente. Después de 16 horas el LC-MS indicó aproximadamente 65% de conversión al compuesto quat deseado de manera que una adición de 45 mg del compuesto de yodo se agregó y después de 22 horas adicionales la reacción ha llegado a 80% de terminación de manera que 40 mg adicionales del compuesto de yodo se agregó y se permitió agitar 24 horas adicionales. Los sólidos se centrifugaron entonces y se lavaron con acetonitrilo para dar 282.6 mg (45% de rendimiento) del producto deseado en pureza elevada caracterizado por un tiempo de retención de 2.89 minutos y mostrando el M+ de 499 deseado para C28H23N205S como el compuesto COMPUESTO 1105. Al permanecer en metanol el compuesto "1105, reacciona limpiamente con metanol para dar el compuesto A013-94 con un tiempo de retención de 2.78 minutos y la M+ esperada de 531 para C29H27N206S. Este ilustra la reacción del profármaco isocianato con un alcohol para dar una conjugación de carbamato para el enlazador. El profármaco intermedio de isotiocianato se hizo reaccionar también con varias aminas en cloruro de metileno (opcionalmente en la presencia de trietilamina) incluyendo aminas secundarias para dar productos de urea como A017-55 (tiempo de retención 2.84 minutos mostrando el M+ de 644 deseado m/z para C35H38N307S) ; A017-57 (tiempo de retención 2.46 minutos mostrando el M+ de 616 deseado m/z para C33H34N307S) ; y A027-15 ((tiempo de retención 2.82 minutos mostrando el M+ deseado de 816 m/z para C38H48N3011P2S . Estos ejemplos demuestran la reacción en rendimiento excelente del profármaco de isotiocianato con un grupo diverso de nucleófilos para dar los productos enlazados deseados. El compuesto A017-55 se hizo reaccionar además con ácido trifluoroacético el cual dio sorprendentemente el compuesto cíclico A017-59 durante el curso de desdoblamiento del grupo t-butilo (tiempo de retención 2.47 minutos mostrando el M+ deseado de 570 m/z para C31H28N306S) . Este ejemplo demostró que la química adicional puede realizarse en el grupo enlazador de los compuestos del profármaco. En el tampón de fosfato en pH=7.4, cantidades significativas de este compuesto se convierten de nuevo al compuesto 1 durante un periodo de 17 horas, seguido por LC-MS .
Ejemplo 70 Toxicidad Aguda del Compuesto 1 contra Profármaco Objetivo Se determinó el Compuesto 1 administrado intravenosamente para tener 100% de mortalidad en el plazo de 5 minutos de administración en tres ratones desnudos en un nivel de dosis de 16 mg/kg. El Compuesto 1126, preparado por el método del Ejemplo 56, cuando se inyectó intravenosamente a un nivel de dosis más elevado de 37% (22 mg/kg) en tres ratones desnudos mostró 0% de mortalidad incluso después de 1 hora de observación. Este ejemplo demuestra la capacidad de formulación mejorada de los profármacos y la toxicidad disminuida de los profármacos del Compuesto 1.
Ejemplo 71 Análogo del Compuesto 1 Durante la preparación del intermediario A046-67SM tal como se describe para el Compuesto 1126 en el Ejemplo 56, se observó un producto lateral. Este material se purificó por LC-MS para dar un solo compuesto, A037-94, consistente por NMR de protón con la estructura propuesta y dando un tiempo de retención de 3.00 minutos y un espectro de masa mostrando el [M+H]+ esperado de 338 m/z (abundancia muy baja) y masa más prominente [M+H+41 (ACN) ] a 379 m/z. Este ejemplo demuestra el aislamiento de un análogo novedoso del compuesto 1 adecuado para la modificación del profármaco adicional.
Ejemplo 72 Uso del Profármaco para Aplicar el Compuesto 1 en Ratones Se inyectaron ratones con un millón de células cancerígenas de pulmón de células no pequeñas (H1299) subcutáneamente y se les permitió madurar aproximadamente 7 días hasta que la masa tumoral fuera aproximadamente 10 a 15 mm por 7 a 9 mm de dimensiones. Los animales se inyectaron con el profármaco objetivo, Compuesto 1126, ya sea i.v. (50 uL) o i.p. (50 uL) con soluciones de 32.6 mMolares del Compuesto 1126 en solución salina regulada con fosfato. Después de 60 minutos, se sacrificaron los ratones y los tumores se removieron. Tres piezas pequeñas de los tumores se recobraron y se picaron en trozos. Después de madurar durante 24 horas para permitir a todo el profármaco convertirse al compuesto 1, las muestras tumorales se extrajeron con acetonitrilo . La cuantificación por LC-MS indicó que las concentraciones del compuesto 1 extraibles (como la suma del compuesto 1 y derivadas del Compuesto 1126) fue 157±7 nanomolares en las piezas tumorales para la inyección I.P. Y 271±17 nanomolares en las piezas tumorales para la inyección I.V. Este ejemplo demuestra el suministro del Compuesto 1 al tejido tumoral utilizando un profármaco objetivo.
Ejemplo 73 Reversibilidad de los Profármacos para formar el Compuesto 1 Se disolvieron los Compuestos del Profármaco en agua o en DMSO (si no libremente soluble en agua) y luego se diluyeron al menos 10 veces en 50 mM de tampón de fosfato a pH = 7.4 o pH = 4.8 y se les permitió permanecer a temperatura ambiente. La concentración final de los compuestos en el ambiente acuoso varió desde 50 a 500 uMOlares. Las alícuotas se tomaron y analizaron con el tiempo por LC-MS para determinar tanto la desaparición del profármaco como confirmar la aparición del fármaco (compuesto 1) . Se encontró que el compuesto 1126 tiene una vida media de aproximadamente 1 hora a pH=7.5 y una vida media de aproximadamente 64 horas a pH=4.8. Se encontró que el compuesto 1110 tiene una vida media de aproximadamente 10 horas a pH=7. y más de 120 horas a pH=4.8. Se encontró que el compuesto A040-80 tiene una vida media de aproximadamente 10 horas a pH=7. . Estos ejemplos demuestran que químicamente, los profármacos se convierten al fármaco (compuesto 1) y la desaparición del profármaco es muy dependiente de pH con la conversión teniendo lugar mucho más rápido en el pH fisiológico y sustancialmente más lento en pH acídico .
Ejemplo 74 Síntesis del Conjugado de Localización de Tumor Los compuestos que soportan el grupo electrofílico (tales como el compuesto A036-48B, 1105, 1107, 1111, A024-79, y 1113) pueden hacerse reaccionar con grupos nucleofílicos que soportan polímeros tales como alcoholes, grupos amino y tiol. La N- (2-hidroxipropil) metilacrilamida (HP A) que tiene el peso molecular de 2000 a 100,000 se hace reaccionar con el compuesto 1111 en exceso en un solvente orgánico no prótico tal como cloruro de metileno o tetrahidrofurano en la presencia de trietilamina o diisopropiletilamina y luego se separa por cromatografía de exclusión de tamaño, ultracentrifugación o precipitación en otro solvente tal como metanol o éter. El polímero así precipitado o separado está sustancialmente libre del 1111 y se utiliza como un conjugado de localización de tumor que libera el compuesto 1 activo prolongado en la cercanía del tumor resultante en efectos anti-tumor y anti-angiogénicos . Asimismo, los ácidos poliglutámicos pueden convertirse a grupos que soportan poli-nucleofílicos por la reacción de los ácidos carboxílicos con diaminas en exceso utilizando el acoplamiento de carbodiimida seguida por la cromatografía de exclusión de tamaño o purificación de HPLC de fase inversa para obtener versiones poli-nucleofílicas de ácidos poliglutámicos. Estos polímeros pueden hacerse reaccionar directamente con porciones en exceso de los compuestos 1111 o 1105 o A036-48B o ?024-79 en un solvente de organismo aprótico tal como cloruro de metileno o tetrahidrofurano en la presencia de trietilamina o diisopropiletilamina y luego se separa por cromatografía de exclusión de tamaño, ultracentrifugación, o precipitación en otro solvente tal como metanol o éter. El polímero poli-conjugado así precipitado o separado está sustancialmente libre del profármaco residual de peso molecular bajo y se utiliza como un conjugado de localización de tumor que libera el compuesto 1 activo prolongado en la cercanía del tumor que resulta en efectos anti-tumor y anti-angiogénicos.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un pro-compuesto que comprende un nitrógeno cuaternario, en donde una unión del nitrógeno cuaternario es hidrolizable y después de la hidrólisis de tal unión produce un compuesto de la fórmula: en donde, Ri y ?½ son independientemente H, arilo alifático opcionalmente sustituido, arilo, hidroxilo, halógeno, alcoxi, heterociclo, ciano, amino opcionalmente sustituido, o se tomen juntos para formar un arilo opcionalmente sustituido o alifático opcionalmente sustituido; R3 representa H, alifático opcionalmente sustituido, y arilo opcionalmente sustituido; y R4 y R5 son independientemente H, alifático opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heterociclo, ariloxi, carboxi o se toman juntos para formar un heterociclo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido. 2. El compuesto de la reivindicación 1, en donde Ri-Anillo A-R2 se selecciona del grupo que consiste: i62 4. Un compuesto de la fórmula: en donde, El anillo A es benzo; Zi y Z2 son independientemente S u O; Ri y R2 son independientemente H, arilo alifático opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, hidroxilo, halógeno, alcoxi, heterociclo, ciano, amino, o se toman juntos para formar un arilo cicloalifático opcionalmente sustituido o arilo opcionalmente sustituido; R3 representa H, arilo alifático opcionalmente sustituido, y arilo opcionalmente sustituido; R y R5 son independientemente H, alifático opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heterociclo, ariloxi, carboxi o se toman juntos para formar un heterociclo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido; Re representa H, alifático opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, alcoxi, carboxi, amino, heterociclo, ariloxi y sustituido opcionalmente con eso un agente objetivo; y L representa un grupo enlazador. 5. El compuesto de la reivindicación 4, en donde Ri-Anillo A-R2 se selecciona del grupo que consiste de: 6. El compuesto de la reivindicación A, en donde R4-N-R5 se selecciona del grupo que consiste de: i66 compuesto de la fórmula en donde, el anillo A es benzo; Zi, Z2, Z3 y Z4 son independientemente S u 0; Ri y R2 son independientemente H, arilo alifático opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, hidroxilo, halógeno, alcoxi, heterociclo, ciano, amino, o se toman juntos para formar un arilo cicloalifático opcionalmente sustituido o arilo opcionalmente sustituido; R3 representa H, arilo alifático opcionalmente sustituido, y arilo opcionalmente sustituido; R4 y R5 son independientemente H, alifático opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heterociclo, ariloxi, carboxi o se toman juntos para formar un heterociclo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido; R6 representa H, arilo opcionalmente sustituido, arilo, alcoxi, carboxi, amino, heterociclo, ariloxi y sustituido opcionalmente con eso un agente objetivo; y R7 representa -CH2-, -CH(CH3)-, -CH(Ph)-, C (CH3) (COOH) - o -CH(CH(CH3)2)-; ?? 10. El compuesto de la reivindicación 8, en donde R4-N-R5 se selecciona del grupo que consiste de: 11. El compuesto de la reivindicación 8, en donde R6 se selecciona del grupo que consiste de: 171 12. El compuesto de la reivindicación 8, en donde unión entre R7 y la amina cuaternaria es hidrolizable. 13. Un compuesto de la fórmula: en donde, el anillo A es benzo; Zi y Z2 son independientemente S u O; Ri y R2 son independientemente H, arilo alifático opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, hidroxilo, halógeno, alcoxi, heterociclo, ciano, amino, o se toman juntos para formar un cicloalifático opcionalmente sustituido o arilo opcionalmente sustituido; R3 representa H, alifático opcionalmente sustituido, y arilo opcionalmente sustituido; R4 y R5 son independientemente H, arilo alifático opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heterociclo, ariloxi, carboxi o se toman juntos para formar un heterociclo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido; R6 representa H, alifático opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, alcoxi, carboxi, amino, heterociclo, ariloxi y sustituido opcionalmente con eso un agente objetivo; y R7 representa -CH2-, -CH(CH3)-, -CH(Ph)-, C(CH3) (COOH)- o CH(CH(CH3)2)-; y T representa un agente objetivo. 14. El compuesto de la reivindicación 13, en donde Ri-Anillo A-R2 se selecciona del grupo que consiste de: 15. El compuesto de la reivindicación 13, en donde R4-N-R5 se selecciona del grupo que consiste de: 16. El compuesto de la reivindicación 13, en donde R6 se selecciona del grupo que consiste de: 17. El compuesto de la reivindicación 13, en donde el agente objetivo se selecciona del grupo que consiste de vitaminas, péptidos, proteínas, liposomas, agentes de búsqueda de hueso, y agentes de búsqueda de cartílago. 18. El compuesto de la reivindicación 17, en donde la vitamina es folato o vitamina C. 19. El compuesto de la reivindicación 17, en donde el péptido es un péptido que contiene RGD, seleccionado del grupo que consiste de RGDs, c(RGDfK), vitronectina, fibronectina, agonistas del receptor de la somatostatina y antagonistas del receptor de la somatostatina. 20. El compuesto de la reivindicación 17, en donde la proteína es un anticuerpo monoclonal específico de tumor o fragmento del mismo. 21. El compuesto de la reivindicación 17, en donde el agente de búsqueda de hueso se selecciona del grupo que consiste de un fosfonato, ácido fosfórico, ácido aminometilfosfónico, fosfato, polifosfato y polipéptidos de unión de hidroxiapatita . 22. El compuesto de la reivindicación 21, en donde el agente de búsqueda de hueso es EDTMP, DOTMP, ABDTMP, BAD, MTX-BP, CF-BP, (Asp)6, (Glu) 6, alendronato, pamidronato, ácido 4-aminobutilfosfónico, ácido 1-hidroxietano-l, 1-difosfónico, ácido aminometilenbisfosfónico, ácido fítico y ácido N,N-bis (metilfosfono) -4-amino-benzoico . 23. ün compuesto de la fórmula: en donde X representa un grupo halo; Y representa -CH2-, -CH(CH3)-, -CH(Ph)-, -C(CH3) (COOH) - o CH(CH(CH3) 2) -; i y Z2 son independientemente S u 0; y n = 0 a 1. 24. El compuesto de la reivindicaión 23, en donde X representa Cl o I; Y representa -CH2-, -CH(CH3)-, -CH(Ph)-, -C(CH3) (COOH) - o CH(CH(CH3)2)-; Zi y Z2 son cada uno 0; y n = 0. 25. El compuesto de la reivindicaión 23, en donde Zi y Z2 son cada uno 0; y n = 0. 26. ün método para purificar un compuesto de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1-21, que comprende : (a) agregar una composición que comprende el compuesto de una solución, en donde la solución comprende al menos 0.1% por (v/v) en cada ácido; (b) agregar la solución de (a) que comprende el compuesto de un sistema de cromatografía; y (c) aislar el compuesto. 27. El método de la reivindicación 26, en donde el sistema de cromatografía es HPLC. 28. Un método para tratar a un paciente que sufre de una condición asociada con la actividad quinasa PI-3 comprende administrar a un paciente con necesidad del mismo una cantidad efectiva de una composición que comprende un compuesto de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1-21. 29. Un método para tratar una enfermedad inflamatoria que comprende administrar a un paciente con necesidad del mismo una cantidad efectiva de una composición que comprende un compuesto de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1-21. 30. Un método de la reivindicación 28, en donde la composición además comprende uno o más agentes terapéuticos adicionales. 31. El método de la reivindicación 30, en donde uno o más agentes terapéuticos se selecciona del grupo que consiste de los agentes de alquilación, antimetabolitos, asparaginasa, vincristina, vinblastina, antraciclinas, agentes de disrupción de microtúbulo, taxol, herceptina, gemcitabana, y etopósldos. 32. Un método para inducir apóptosis en un paciente que comprende administrar a un paciente con necesidad del mismo una cantidad efectiva de una composición que comprende un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-21. 33. Un método para mejorar la quimiosensibilidad de las células tumorales que comprende administrar a un paciente con necesidad del mismo una cantidad efectiva de una composición que comprende un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-21. 34. Un método para mejorar la radiosensibilidad de las células tumorales que comprende administrar a un paciente con necesidad del mismo una cantidad efectiva de una composición que comprende un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-21. 35. Un método para inhibir la angiogénesis inducida por tumor que comprende administrar a un paciente con necesidad del mismo una cantidad efectiva de una composición que comprende un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-21. 36. Un método para inhibir el proceso de angiogénesis asociado con las enfermedades no cancerígenas que comprende administrar a un paciente con necesidad del mismo una cantidad efectiva de una composición que comprende un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-21. 37. Un método para tratar pancreatitis que comprende administrar a un paciente con necesidad del mismo una cantidad efectiva de una composición que comprende un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-21. 38. Un método para tratar úlceras que comprende administrar a un paciente con necesidad del mismo una cantidad efectiva de una composición que comprende un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-21. 39. Un método para tratar cáncer gástrico que comprende administrar a un paciente con necesidad del mismo una cantidad efectiva de una composición que comprende un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-21. 40. Un método para tratar cáncer de higado que comprende administrar a un paciente con necesidad del mismo una cantidad efectiva de una composición que comprende un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-21. 41. Un método para mejorar el funcionamiento de un stent que comprende administrar a un paciente con necesidad del mismo una cantidad efectiva de una composición que comprende un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-21. 42. Un método para tratar una degeneración macular relacionada con la edad que comprende administrar a un paciente con necesidad del mismo una cantidad efectiva de una composición que comprende un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-21. 43. Un método para tratar condiciones asociadas con un PTEN mutante que comprende administrar a un paciente con necesidad del mismo una cantidad efectiva de una composición que comprende un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-21. 44. Un método para tratar hipertensión que comprende administrar a un paciente con necesidad del mismo una cantidad efectiva de una composición que comprende un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-21. 45. Un método para la disrupción de la función de leucocito con una cantidad efectiva de una composición que comprende un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-21. 46. Un método para la supresión de la diferenciación de las células progenitoras que comprende contactar las células progenitoras con una cantidad efectiva de una composición que comprende un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-21. 47. ün método para inhibir fosfatidilinositol 3-quinasa en una célula completa de un mamífero que comprende administrar a un paciente con necesidad del mismo un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-21. 48. El método de la reivindicación 47 en donde la administración es mediante infusión I.V lenta.
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