BRPI1107182B1 - Composições farmacêuticas contendo ang-(1-7) ou outro agonista do receptor mas em combinação com inibidores de pi3k/akt para tratamento terapêutico anticâncer - Google Patents

Abstract

composições farmacêuticas contendo ang-(1-7) ou outro agonista do receptor mas em combinação com inibidores de pi3k/akt para tratamento terapêutico anticâncer a presente invenção descreve composições farmacêuticas contendo uma combinação de ang-(1-7) ou outro agonista do receptor mas com inibidores de pi3k/akt, para o tratamento terapêutico anticâncer. a combinação de ang-(1-7) e inibidores de pi3k/akt acarreta a inibição da progressão do câncer através da inibição do crescimento ou proliferação celular ou a ativação da morte celular por apoptose em mamíferos, particularmente em humanos.

Description

A presente invenção descreve composições farmacêuticas contendo uma combinação de Ang-(1-7) ou outro agonista do receptor Mas com inibidores de PI3K/Akt, para o tratamento terapêutico anticâncer. A combinação de Ang-(1-7) e inibidores de PI3K/Akt acarreta a inibição da progressão do câncer através da inibição do crescimento ou proliferação celular ou a ativação da morte celular por apoptose em mamíferos, particularmente em humanos.

A angiotensina-(1-7) [Ang-(1-7)] é um heptapeptídeo endógeno, componente do sistema renina-angiotensina. Esse peptídeo é gerado principalmente através da clivagem de angiotensina II (Ang II) pela enzima conversora de angiotensina 2 (ACE2) (Tipnis SR et al., 2000. A human homolog of angiotensin-converting enzyme. Cloning and functional expression as a captopril-insensitive carboxypeptidase. J Biol Chem. Oct 27;275(43):33238-43. PubMed PMID: 10924499; Santos RA et al., 2008. Recent advances in the angiotensin-converting enzyme 2-angiotensin(1-7)-Mas axis. Exp Physiol. May;93(5):519-27. Epub 2008 Feb 29. Review. PubMed PMID: 18310257).

A Ang-(1-7) contrabalanceia os efeitos fisiológicos de Ang II, como a vasoconstrição, através de sua ligação com o receptor Mas acoplado à proteína G. Também há alguns relatos da possível interação da Ang-(1-7) com os receptores ATR1 e ATR2. Além disso, recentemente foram descritos agonistas de Ang-(1-7) capazes de ativar o receptor Mas, sendo alguns deles denominados CGEN-856S, CGEN-857 e AVE0991 (Santos RA et al., 2003. Angiotensin-(1-7) is an endogenous ligand for the G protein-coupled receptor Mas. Proc Natl Acad Sci USA. Jul 8;100(14):8258-63. Epub 2003 Jun 26. PubMed PMID: 12829792; PubMed Central PMCID: PMC166216; Schmaier AH, 2003. The kallikrein-kinin and the renin-angiotensin systems have a multilayered interaction. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. Jul;285(1):R1-13. Review. PubMed PMID: 12793984; Savergnini SQ et al., 2010. Vascular relaxation, antihypertensive effect, and cardioprotection of a novel peptide agonist of the MAS receptor. Hypertension. Jul;56(1):112-20. Epub 2010 May 17. PubMed PMID: 20479330; Santos RA, Ferreira AJ, 2006. Pharmacological effects of AVE 0991, a nonpeptide angiotensin-(1-7) receptor agonist. Cardiovasc Drug Rev. Fall-Winter;24(3-4):239-46. Review. PubMed PMID: 17214600).

A Ang-(1-7) possui papel central na regulação da pressão sanguínea e na melhora da função cardíaca, através de uma ação antiarrítmica, anti- hipertrófica e antifibrótica. Além desses papéis, a Ang-(1-7) possui ação antiangiogênica, através da inibição de crescimento vascular, e ação antimitogênica, como exemplificado pela inibição da proliferação de células pulmonares cancerígenas. Dessa forma, a Ang-(1-7) possui um grande potencial para a inibição de crescimento tumoral, como, inclusive, já demonstrado experimentalmente em pacientes (Santos RA, Frézard F, Ferreira AJ, 2005. Angiotensin-(1-7): blood, heart, and blood vessels. Curr Med Chem Cardiovasc Hematol Agents. Oct;3(4):383-91. Review. PubMed PMID: 16250869; Schindler C et al., 2007. Role of the vasodilator peptide angiotensin- (1-7) in cardiovascular drug therapy. Vase Health Risk Manag. 3(1):125-37. Review. PubMed PMID: 17583183; PubMed Central PMCID: PMC1994039; Trask AJ, Ferrario CM, 2007. Angiotensin-(1-7): pharmacology and new perspectives in cardiovascular treatments. Cardiovasc Drug Rev. Summer;25(2): 162-74. Review. PubMed PMID: 17614938; Petty WJ et al., 2009. Phase I and pharmacokinetic study of angiotensin-(1-7), an endogenous antiangiogenic hormone. Clin Cancer Res. 2009 Dec 1;15(23):7398-404. Epub Nov 17. PubMed PMID: 19920106; Loot AE et al., 2002. Angiotensin-(1-7) attenuates the development of heart failure after myocardial infarction in rats. Circulation. Apr 2; 105(13): 1548-50. PubMed PMID: 11927520; Santos RA et al., 2006. Impairment of in vitro and in vivo heart function in angiotensin-(1-7) receptor MAS knockout mice. Hypertension. May;47(5):996-1002. Epub 2006 Mar 27. PubMed PMID: 16567589; Machado RD, Santos RA, Andrade SP, 2001. Mechanisms of angiotensin-(1-7)-induced inhibition of angiogenesis. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. Apr;280(4):R994-R1000. PubMed PMID: 11247819; Gallagher PE et al., 2011. Angiotensin peptides and lung cancer. Curr Cancer Drug Targets. May; 11(4):394-404. PubMed PMID: 21395552; Tailant EA, Clark MA, 2003. Molecular mechanisms of inhibition of vascular growth by angiotensin-(1-7). Hypertension. 2003 Oct;42(4):574-9. Epub 2003 Sep 2. PubMed PMID: 12953014; Gallagher PE, Tailant EA, 2004. Inhibition of human lung cancer cell growth by angiotensin-(1-7). Carcinogenesis. Nov;25(11):2045-52. Epub 2004 Jul 29. PubMed PMID: 15284177; Rodgers et al., 2006. Phase l/ll dose escalation study of angiotensin 1-7 [A(1-7)] administered before and after chemotherapy in patients with newly diagnosed breast cancer. Cancer Chemother Pharmacol. May;57(5):559-68. Epub 2005 Aug 12. PubMed PMID: 16096787, Soto-Pantoja DR et al, 2009. Angiotensin- (1-7) inhibits tumor angiogenesis in human lung cancer xenografts with a reduction in vascular endothelial growth factor. Mol Cancer Ther. Jun; 8(6): 1676-83. Epub 2009 Jun 9. PubMed PMID: 19509262).

Por outro lado, a inibição da via de sinalização da fosfatidilinositol-3 cinase (PI3K) classe I vem sendo amplamente estudada como alternativa para o tratamento de câncer. A ativação dessa via aumenta a concentração de fosfatidilinositol 3,4,5 trifosfato, que desloca Akt para a membrana, recrutando outras cinases e culminando na ativação de genes relacionados ao crescimento, proliferação celular, metabolismo, e outros mecanismos biológicos. Muitos componentes dessa via estão relacionados à mitogênese e à transformação maligna de células. Existem vários trabalhos que descrevem inibidores de PI3K e de Akt com atividade anticâncer (Bowles DW, Jimeno A, 2011. New phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors for cancer. Expert Opin Investig Drugs. Apr;20(4):507-18. Review. PubMed PMID: 21395485; Vivanco I, Sawyers CL, 2002. The phosphatidylinositol 3-Kinase Akt pathway in human cancer. Nat Rev Cancer. Jul;2(7):489-501. Review. PubMed PMID: 12094235; Yang, L, 2004).

Exemplos de inibidores de PI3K e/ou Akt incluem, de forma não limitante, wortmannin, LY294002, FTY720, UCN-01, celecoxib e seus análogos, como OSU-03012 e OSU-03013, Akt-1-1, Akt-1-1,2 e API-2 (Yano, H et al., J. Biol. Chem., 263, 16178, 1993; Vlahos et al., J. Biol. Chem., 269, 5241, 1994; Lee et al., Carcinogenesis, 25(12):2397-2405, 2004; Amornphimoltham et al., Clin Cancer Res., 10(12 Pt 1):4029-37, 2004; Zhu et al., Cancer Res., 64(12):4309-18, 2004; Barnett et al., Biochem. J., 385 (Pt.2):399-408, 2005; Barnett et al., Biochem. J., 385 (Pt.2):399-408, 2005; Yang et al., Cancer Res., 64:4394-9, 2004).

Vários documentos de patente descrevem o método de inibição da PI3K ou Akt, através de compostos inibidores específicos da PI3K ou Akt como tratamento para câncer. Dentre eles, citam-se os seguintes: US 2006058321, US 5378725, US 2004242631 e US 2008188482.

O documento US 2008167251, intitulado “Angiotensin-(1-7) and Angiotensin-(1-7) Agonists for Inhibition of Cancer Cell Growth" descreve o uso de Ang-(1-7) ou agonistas do receptor de Ang-(1-7) em composições para o tratamento de câncer de mama e pulmão, não limitante.

O documento US 2009192127, intitulado "Combination therapy comprising a diaryl urea compound and a PI3, Akt kinase or mTOR inhibitors (rapamycins) for cancer treatment’, descreve composições farmacêuticas e combinações para o tratamento de câncer, compreendendo um composto de diaril uréia e um inibidor da via de sinalização PI3K/Akt.

O documento WO 2005046678, intitulado "Cancer treatment method’, descreve combinações farmacêuticas e método para o tratamento de câncer incluindo administração de um inibidor da família erb e um inibidor de PI3K e/ou Akt.

O documento WO 2005110477, intitulado "Combination therapies for cancer and proliferative angiopathies”, descreve composições e métodos para tratamento de câncer e angiopatias proliferativas incluindo um inibidor da via de sinalização Jak2/Stat3 e um inibidor da via de sinalização PI3K/Akt.

O documento WO 2010037892, intitulado "Composition comprising silibinin at determined concentrations and combined preparation comprising silibinin and a PI3K/Akt pathway inhibitor for the treatment of cancer”, descreve o uso de uma composição compreendendo silibinina ou alternativamente silibinina e um inibidor de Akt, para a preparação de um medicamento para tratamento de câncer, e uma preparação combinada de, pelo menos, silibinina e um inibidor de PI3K/Akt, para uso separadamente, simultaneamente ou sequencialmente no tratamento do câncer.

Desta forma, não foi descrito no estado da técnica o uso de composições farmacêuticas contendo inibidores de PI3K/Akt em combinação com agonistas do receptor Mas, preferencialmente Ang-(1-7), para tratamento de neoplasias, como descrito na presente invenção.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1. A Figura 1 mostra o agrupamento de perfis de (des)fosforilação tempo-dependente. Essa figura descreve os resultados do procedimento de agrupamento fuzzy c-means. Os agrupamentos foram divididos em quatro principais grupos baseados na cinética de fosforilação. As proteínas contendo fosfosítios com valores de agrupamento maiores que 0,3 estão mostradas abaixo de cada agrupamento

Figura 2. A Figura 2 mostra a porcentagem de sobrevivência de células tumorais quando tratadas com a combinação de Angiotensina 1-7 (W6) e inibidores de PI3K (wortmannin e LY294002) relativa a células sem tratamento. (A) Células tumorais de pulmão (A549) tratadas somente com Wortmaninn (Wort) em diferentes concentrações (62,50 μM, 31,25 μM, 15,63 μM, 7,81 μM e 3,91 μM) ou em combinação com angiotensina 1-7 (10’6) (Wort + Ang-(1-7)). (B) Células tumorais de próstata (Du 145) tratadas somente com LY294002 (LY) em diferentes concentrações (250 μM, 125 μM, 62,5 μM, 31,25 μM e 15,63 μM) ou em combinação com angiotensina 1-7 (W6) (LY + Ang-(1-7)). Foi utilizado o software GraphPad para a análise estatística two-way ANOVA com correção de Bonferroni. *: p< 0.05, **: p< 0.01 e ***: p< 0.001.

Figura 3. A figura 3 mostra a localização de FoxO1 em células tumorais A549 através da imunofluorescência antes (A) e após o tratamento com angiotensina 1-7 (W7) (B). As células forma marcadas com DAPI e com anticorpos anti-FoxO1 (Cellsignalling) detectados com anti-lgG de coelho conjugado com Alexa 488.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA TECNOLOGIA

A presente invenção descreve composições farmacêuticas anticâncer, caracterizadas por compreenderem agonistas do receptor Mas, preferencialmente a Angiotensina-(1-7), em combinação com inibidores de PI3K/Akt e excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis são selecionados de um grupo que compreende água, solução salina, soluções tamponadas com fosfato, solução de Ringer, solução de dextrose, solução de Hank, soluções salinas biocompatíveis contendo ou não polietilenoglicol, veículos não aquosos, como óleos fixos, óleo de sésamo, oleato de etila ou triglicerídeos, isolados ou em mistura, incluindo nanopreparações; podendo conter aditivos, como tampões, conservantes, aglutinantes, desintegrantes, diluentes, lubrificantes e/ou tensoativos.

O agonista do receptor Mas e os inibidores de PI3K/Akt podem ser administrados simultaneamente ou dentro de um intervalo de 10 minutos entre um e outro. Além disto, o agonista do receptor Mas e os inibidores de PI3K/Akt podem ser administrados em uma formulação que compreende ciclodextrinas, derivados de ciclodextrinas, lipossomos, polímeros biodegradáveis, derivados de polímeros biodegradáveis ou misturas destes sistemas; podendo ser apresentados nas formas sólida, semi-sólida ou líquida; e podendo ser administrados pelas vias oral, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, transdérmica ou como dispositivos que possam ser implantados ou injetados. O agonista do receptor Mas e os inibidores de PI3K/Akt podem ser administrados usando a mesma forma ou formas diferentes de aplicação.

As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser usadas para preparar um medicamento para tratar indivíduos acometidos por neoplasias.

A presente invenção demonstra que o tratamento de células endoteliais com Ang-(1-7) altera o estado de fosforilação de alguns componentes da via de sinalização PI3K/Akt e de diversas proteínas envolvidas em processos anti- tumorigênicos, como a regulação da proliferação celular e da angiogênese.

Demonstra também que o tratamento anti-cancerígeno utilizando Ang-(1-7) pode apresentar um efeito mais significativo quando utilizado em conjunto com inibidores da via PI3K/Akt

A identificação dos compostos cujo estado de fosforilação foi alterado pelo tratamento com Ang-(1-7) foi realizada através da utilização de uma metodologia fosfoproteômica quantitativa baseada em espectrometria de massa (MS).

A eficácia do tratamento anti-cancerígeno utilizando a combinação de Ang-(1-7) e inibidores de PI3K foi avaliada através da comparação entre a inibição do crescimento de células tumorais após o tratamento com essa combinação e o tratamento com cada uma dessas drogas isoladamente.

A localização de FoxO1, uma proteína chave no controle da proliferação celular e alvo da cascata de sinalização mediada pela via PI3K/AKT e pela via desencadeada pela angiotensina 1-7, foi realizada através de imunofluorescência em células tumorais.

A presente invenção pode ser melhor compreendida, de forma não limitante, através dos exemplos que se seguem.

Exemplo 1 - Estimulação de células endoteliais com Ang-(1-7), obtenção dos peptídeos, marcação dos peptídeos e enriquecimento de fosfopeptídeos

Células endoteliais da aorta humana (HAEC - Human Aortic Endothelial Cells - Lonza - Basel, Switzerland) foram crescidas em quatro placas de 100 mm a 37°C em meio de cultivo celular Clonetics® EGM®-2 BulletKit (Lonza - Basel, Switzerland), de acordo com especificações do fabricante, até atingirem confluência de 65%. As células foram, então, incubadas com Ang-(1-7) na concentração final de 10’7 M por 3, 5 e 20 minutos. Células não tratadas foram utilizadas como controle (tempo = 0 minutos).As células foram lisadas para extração de proteínas utilizando-se 400μL de uma solução contendo 7M uréia; 2M tiouréia; 200mM bicarbonato de trietilamônia; 0.05% RapiGest™ (Waters - Milford, USA); 0,1 M pervanadato; protease e coquetéis de inibidores de fosfatase (Roche - Mannheim, Germany)]. Após redução das pontes dissulfeto com 10mM de DTT e alquilação de grupos tióis livres com 40mM de iodoacetamida, as proteínas foram digeridas overnight (RT) com tripsina (1:50).

Os peptideos (100μg) foram marcados com reagentes iTRAQ® (Applied Biosystems - Foster City, USA), e combinados na proporção de 1:1:1:1. Posteriormente, os fosfopeptídeos presentes na amostra foram enriquecidos utilizando-se TiOa e SIMAC (Larsen, MR et al., 2005. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns. Molecular & cellular proteomics : MCP 4, 873-886; Thingholm, TE et al., 2008. SIMAC (sequential elution from IMAC), a phosphoproteomics strategy for the rapid separation of monophosphorylated from multiply phosphorylated peptides. Mol Cell Proteomics 7, 661-671).

Em torno de 99% dos peptideos identificados na presente invenção contêm fosforilação, indicando um alto grau de enriquecimento desta modificação pós-traducional.

Exemplo 2 - Análise de fase reversa nanoLC-ESI MS/MS

Os fosfopeptídeos enriquecidos foram ressuspendidos em ácido fórmico (FA) 0,1% e purificados em cromatografia líquida de fase-reversa em uma coluna de 17 cm X 100 μm Reprosil-Pur C18-AQ (3 μm; Dr. Maisch GmbH - Ammerbuch, Germany) usando urn Easy-LC nanoHPLC (Proxeon - Odense, Denmark). O gradiente de cromatografia foi de 0-34% de solvente B (ACN 90%, FA 0,1%) por 200 min a uma taxa de fluxo de 250 nL/min. O instrumento LTQ-Orbitrap XL (Thermo Fisher - Waltham, USA) foi operado em um modo positivo e usando ativação multiestágio (MSA) para fragmentação MSMS (Schroeder, MJ et al., 2004. A neutral loss activation method for improved phosphopeptide sequence analysis by quadrupole ion trap mass spectrometry. Analytical chemistry 76, 3590-3598). No total, foram identificados 2243 fosfopeptídeos únicos com 99% de confidência (1% FDR).

Exemplo 3 - Processamento de dados e busca no banco de dados

Os espectros de MS/MS foram submetidos à busca no banco de dados de biblioteca de sequências humanas no banco de dados de sequências proteicas (Sprot 2010_12 version: 523,151 sequences; 184,678,199 residues) usando um servidor in-house Mascot (version 2.2.04, Matrix Science Ltd. - London, UK).

Normalização de dados e análise de significância - Duas replicatas biológicas com duas replicatas técnicas cada, foram consideradas como quatro experimentos para análise estatística. Os dados quantitativos foram normalizados utilizando a mediana. Múltiplas medidas de fosfopeptídeos foram agrupadas utilizando a função Rollup do pacote DanteR (http://www.omics.pnl.com). Regulações significativas para baixo ou para cima entre estágios experimentais foram determinadas pelas médias de valores de p. Os valores foram calculados utilizando o método estatístico “one-way ANOVA” do software DanteR e corrigidos por Benjamini-Hochberg (Benjamini, Y., and Hochberg, Y. (1995) Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. J. R. Statist. Soc. B 57, 289-300.).

Todos os peptídeos, independentemente de seus valores-p específicos, foram utilizados para detectar tendências comuns nos perfis de fosforilação induzidos pela Ang-(1-7) utilizando o algorítimo fuzzy c-means que permitiram a identificação de tendências comuns. (Xie, XL, Beni, G, 1991. A validity measure for fuzzy clustering. Pattern Analysis and Machine Intelligence, IEEE Transactions on 13, 841-847; Schwammle, V; Jensen, ON, 2010. A simple and fast method to determine the parameters for fuzzy c-means cluster analysis. Bioinformatics 26, 2841-2848).

Exemplo 4 - Localização do sítio de fosforilação

Com o objetivo de identificar os sítios de fosforilação com 99% de certeza, foram utilizados dois parâmetros, o mascot delta score (Savitski, MM et al., 2011. Confident phosphorylation site localization using the mascot delta score. Molecular & cellular proteomics : MCP 10, M110 003830) e o algoritmo Ascore (Beausoleil, AS et al., 2006. A probability-based approach for high- throughput protein phosphorylation analysis and site localization. Nature biotechnology 24, 1285-1292). Foram utilizados os parâmetros MD-score > 9 e Ascore £ 19 como pontos de corte. Os sítios de fosforilação que ainda não foram descritos na literatura foram ainda validados manualmente por inspeção de seus respectivos espectros de MSMS.

Foram identificados 1516 sítios de fosforilação localizados em 699 proteínas. Deste total, 121 sítios localizados em 79 proteínas apresentaram 5 regulação estatisticamente significativa (p < 0,05) (Tabelas I e II). Tabela I - Proteínas (des-)fosforiladas após estimulação porAng-(1-7)

Exemplo 5 - Determinação de padrões no perfil de (des)fosforilação dependentes do tempo e identificação dos fosfosítios regulados por Ang- (1-7)

Diversos sítios de fosforilação foram regulados pela Ang-(1-7). Por exemplo, pS124 na Akt1 como também pS338 na PIK3C2A atingiram seu estado máximo de fosforilação após 3 minutos (Figura 1 e Tabela II).

Estudos anteriores baseados em Western Blot demonstraram que PIK3 classe I como também Akt1 são componentes da via de sinalização do receptor Mas e envolvidos na ativação de eNOS. Além disso, essas cinases também são componentes da via de sinalização da insulina/fator de crescimento. No entanto, identificou-se na presente invenção uma isoforma de PIK3 que pertence à classe II e não é um componente upstream da via de sinalização da Akt1. Os efeitos celulares da PIK3C2A ainda não foram elucidados completamente, mas foi descrito que essa cinase induz a translocação de GLUT4 para a membrana plasmática em resposta a estimulação por insulina. (Sampaio WO et al., 2007. Angiotensin-(1-7) through receptor Mas mediates endothelial nitric oxide synthase activation via Akt-dependent pathways. Hypertension. Jan;49(1):185-92. Epub 2006 Nov 20. PubMed PMID: 17116756, Giani et al, 2007; Kohn, AD; Kovacina, KS; Roth, RA, 1995. Insulin stimulates the kinase activity of RAC-PK, a pleckstrin homology domain containing ser/thr kinase. EMBO J 14, 4288-4295; Hara, K et al., 1994. 1-Phosphatidylinositol 3- kinase activity is required for insulin-stimulated glucose transport but not for RAS activation in CHO cells. Proc Natl Acad Sci U S A 91, 7415-7419; Okano, J et al., 2000. Falasca, M et al., 2007. The role of phosphoinositide 3-kinase C2alpha in insulin signaling. The Journal of biological chemistry 282, 28226- 28236;).

A fosforilação da S124 da Akt1 leva à sua ativação. No entanto, somente após a fosforilação da T308 e da S473 desta cinase sua ativação se completa, permitindo sua translocação para o núcleo, onde fosforila FOXO1 na T24, S256 e S319, e inativa esse fator de transcrição, o que leva à proliferação celular. A fosforilação da Ser124 da Akt1 pode contribuir para a resposta da proteína Akt aos subsequentes eventos de ativação. Dado que Sampaio e colaboradores (2007) mostraram que Ang-(1-7) pode estimular a ativação da Akt através da fosforilação da Ser473, a fosforilação da Ser124 da Akt1 nas células tratadas com Ang-(1-7) provavelmente estimula a ativação da Akt1 através da facilitação da sua total ativação através da fosforilação da Thr308 e da Ser473, portanto, estimulando as funções endoteliais. Dessa forma, para que o tratamento anti- cancerígeno utilizando Ang-(1-7) apresente um efeito mais significativo, a presente invenção sugere o uso concomitante de inibidores da via PI3K/Akt, o que silenciaria a ativação de Akt1 por Ang-(1-7), aumentando, portanto, a inibição do crescimento tumoral (Ackah E et al., 2005. Akt1/protein kinase Balpha is critical for ischemic and VEGF-mediated angiogenesis. J Clin Invest. 2005 Aug;115(8):2119-27. PubMed PMID: 16075056; PubMed Central PMCID: PMC1180542; Bellacosa A et al., 1998. Akt activation by growth factors is a multiple-step process: the role of the PH domain. Oncogene. Jul 23; 17(3):313- 25. PubMed PMID:9690513; Sampaio WO et al., 2007. Angiotensin-(1-7) through receptor Mas mediates endothelial nitric oxide synthase activation via Akt-dependent pathways. Hypertension. Jan;49(1):185-92. Epub 2006 Nov 20. PubMed PMID: 17116756).

Um dos sítios de fosforilação regulatórios de FoxO1, Ser256, foi encontrado desfosforilado nos dados experimentais da presente invenção, o que leva à ativação de FoxO1. Portanto, a Ang-(1-7) pode inibir o crescimento de tumores através da ativação de FoxO1, um fator de transcrição envolvido, entre outros mecanismos, na supressão de tumores e na inibição da angiogênese. A via de sinalização PI3K/Akt regula o fator de transcrição

FoxO1, através da fosforilação pela Akt da Ser256, Ser319 e Thr24, induzindo a translocação de FoxO1 para o citoplasma, o que leva à inibição da transcrição dependente de FoxO1 e permite a proliferação celular. Em contraste, o tratamento com Ang-(1-7) estimula a desfosforilação da Ser256 de FoxO1, provavelmente ativando-a. Além de inibir a proliferação celular, FoxO1 ativo pode inibir a migração de células endoteliais e a consequente formação de vasos sanguíneos. A desfosforilação de FoxOI em células estimuladas com Ang-(1-7) contrasta com a ativação da via de PI3K pela angiostensina-(1-7), que levaria à fosforilação de FoxOI. Provavelmente, a Ang-(1-7) ativa FoxOI por uma via independente da via PI3K/Akt. Desta forma, a presente invenção demonstra que seria interessante estimular as células com Ang-(1-7), para ativação de FoxOI e suas propriedades anti-cancerígenas, mas inibir simultaneamente a via de PI3K/Akt, potencializando a inibição da progressão do tumor (Singh A et al 2011. Harnessing the tumor suppressor function of FOXO as an alternative therapeutic approach in cancer. Curr Drug Targets. 2011 Aug;12(9):1311-21. PubMed PMID: 21443464.; Potente M et al., 2005. Involvement of Foxo transcription factors in angiogenesis and postnatal neovascularization. J Clin Invest 2005 Sep;115(9):2382-92. Epub 2005 Aug 11. PubMed PMID: 16100571; PubMed Central PMCID: PMC1184037; Zhang X et al., 2002. Phosphorylation of serine 256 suppresses transactivation by FKHR (FOXO1) by multiple mechanisms. Direct and indirect effects on nuclear/cytoplasmic shuttling and DNA binding. J Biol Chem. Nov 22;277(47):45276-84. Epub 2002 Sep 12. PubMed PMID: 12228231).

A promoção do crescimento celular é uma das funções-chave da Akt. Uma das principais proteínas efetoras downstream dessa via é o complexo 1 mTOR. O substrato de Akt rico em prolina de 40 kDa (PRAS40 ou Akt1S1) é um parceiro de ligação de mTOR, o qual inibe a atividade de mTOR através de sua ligação. Akt fosforila Akt1S1 na Thr246, resultando na dissociação de Akt1S1 de mTORCI e ligação de Akt1S1 à proteína 14-3-3. Células tratadas com Ang-(1-7) apresentam um aumento na desfosforilação da Thr246 de Akt1S1 comparado a células controle. Esse resultado indica que a Ang-(1-7) induz a desfosforilação de PRAS40 que irá estimular sua ligação ao mTOR e consequentemente inibí-lo. Portanto, a Ang-(1-7) está implicada na inibição do crescimento celular através do bloqueio de atividade de mTOR (Wullschleger S, Loewith R, Hall MN, 2006. TOR signaling in growth and metabolism. Cell. Feb 10;124(3):471-84. Review. PubMed PMID: 16469695; Vander Haar E et al., 2007. Insulin signalling to mTOR mediated by the Akt/PKB substrate PRAS40. Nat Cell Biol. Mar;9(3):316-23. Epub 2007 Feb 4. PubMed PMID: 17277771).

Além de FoxO1 e Akt1S1, Ang-(1-7) também pode inibir o crescimento tumoral através da regulação das proteínas MAP cinases. O fosfoproteoma de células endoteliais estimuladas com Ang-(1-7) revelou que nas células tratadas ocorre a desfosforilação de Y187 da MAPK1. A desfosforilação da MAPK1, também demonstrada por Sampaio (2007) induz a inativação da MAPK1, uma vez que esse fosfossítio regula a atividade dessa cinase. (Sampaio WO, 2007. Angiotensin-(1-7) counterregulates angiotensin II signaling in human endothelial cells. Hypertension. 2007 Dec;50(6):1093-8. Epub 2007 Nov 5. PubMed PMID: 17984366., Payne, DM et al., 1991. Identification of the regulatory phosphorylation sites in pp42/mitogen-activated protein kinase (MAP kinase). EMBO J 10, 885-892).

Além disso, Ang-(1-7) regula HDAC1, que possui papel chave na tumorigênese. Inclusive, inibidores de HDAC estão sendo testados para terapia contra o câncer humano. HDAC1 é uma enzima nuclear que desacetila resíduos de lisina na parte N-terminal de histonas H2A, H2B, H3 e H4, induzindo proliferação celular e reduzindo expressão gênica. A fosforilação da serina 421 e 423 de HDAC1 promove a sua ativação. O tratamento com Ang- (1-7) induz uma rápida desfosforilação desses sítios, o que provavelmente diminui a atividade de HDAC1 (Figura 1 e Tabela II). Como consequência, os níveis gerais de acetilação das histonas irá aumentar, tendendo, em muitos casos, a favorecer a expressão gênica e parada do ciclo celular nas fases G1 e G2 (Pflum, MK et al., 2001 Histone deacetylase 1 phosphorylation promotes enzymatic activity and complex formation. J Biol Chem 276, 47733-47741; Di Marcotullio, L et al., 2011. Protected from the inside: endogenous histone deacetylase inhibitors and the road to cancer. Biochim Biophys Acta 1815, 241- 252).

O tratamento de células endoteliais com a Ang-(1-7) induz a fosforilação da Ser338 da PI3K-C2α, fosforilação da Ser326 de Rasip 1 e fosforilação da Tyr273 de DYRK1B. Essas proteínas modulam processos em que a Ang-(1-7) também está envolvida. PI3K-C2α e DYRK1B estão envolvidos na sobrevivência celular, enquanto Rasip 1 é uma proteína essencial para a morfogênese de vasos sanguíneos. Apesar de alguns trabalhos descreverem a ação antitumorigênica de Ang-(1-7), esses autores não indicaram os mecanismos dessa ação de Ang-(1-7), que pode ser mediada pela regulação da fosforilação de proteínas como FoxOI, Akt1S1, HDAC1, PI3K-C2a, Rasip 1 e DYRK1B. (Elis W et al., 2008. Down-regulation of class II phosphoinositide 3- kinase alpha expression below a critical threshold induces apoptotic cell death. Mol Cancer Res. Apr;6(4):614-23. PubMed PMID: 18403640; Mercer SE, Friedman E, 2006. Mirk/Dyrk1B: a multifunctional dual-specificity kinase involved in growth arrest, differentiation, and cell survival. Cell Biochem Biophys. 45(3):303-15. Review. PubMed PMID: 16845176; Xu K et al., 2009. Rasipl is required for endothelial cell motility, angiogenesis and vessel formation. Dev Biol. May 15;329(2):269-79. Epub 2009 Mar 6. PubMed PMID: 19272373; PubMed Central PMCID: PMC2683470; Xu K et al., 2011. Blood vessel tubulogenesis requires Rasipl regulation of GTPase signaling. Dev Cell. Apr 19;20(4):526-39. Epub 2011 Mar 10. PubMed PMID: 21396893; PubMed Central PMCID: PMC3078994;; Gallagher PE et al, 2004. Inhibition of human lung cancer cell growth by angiotensin-(1-7). Carcinogenesis. 2004 Nov;25(11):2045-52. Epub 2004 Jul 29. PubMed PMID: 15284177.; Menon J et al, 2007. Angiotensin-(1-7) inhibits growth of human lung adenocarcinoma xenografts in nude mice through a reduction in cyclooxygenase-2. Cancer Res. 2007 Mar 15;67(6):2809-15. PubMed PMID: 17363603.).

A aplicação de Ang-(1-7) em células endoteliais também afeta o estado de fosforilação de outras proteínas não mencionadas anteriormente, alterando, provavelmente a execução de suas atividades. Foram identificadas proteínas envolvidas nos mecanismos de supressão de tumor, crescimento celular, metabolismo, apoptose e outros. As proteínas que apresentaram um aumento da fosforilação de determinados resíduos (assinalados em parênteses) compreendem: ADAM9 (pS758/pT761), AHNAK (pS559), AKAP12 (pS697/698), AKAP2 (pS135), Akt1 (pS124), ANP32B (pT244), BAG3 (pS264), CANX (pS583), CFL1 (pS3), CYBRD1 (pT285), DYRK1B (pY273), ERC1 (pS37), ESAM (pS359), FLNA (pS1459), FRMD4A (pS711), HIST1H1B (pT11), HIST1H1C (pS173), HIST1H1E (pS187), HNRNPC (pS233), HSPB1 (pS82), LARP1 (pT782/788), LMNA (pS390), LMNA (pS406/407), LMNB1 (pS391/393), MOBKL1A (pT35), NDRG1 (pS336), OSBPL10 (pS30), PAK2 (pS2), PGM2 (pS165), PHLDB1 (pS430), PIK3C2A (pS338), PLEC (pS720/4386), PXN (pS258), RASIP1 (pS326/331), SEPT2 (pS218), SMARCA4 (pT1423), SRRM1 (pS646), SRRM1 (pS653), TCOF1 (pS1350), THRAP3 (pS248/253), TJP2 (pS986), VIM (pS144), VIM (pS39, VIM (pS430), WWP2 (pS211) e YTHDC1 (pS146/pT148).

Por outro lado, o tratamento com Ang-(1-7) em células endoteliais também induziu um aumento na desfosforilação de determinados resíduos (assinalados em parênteses) de algumas proteínas, as quais compreendem: AHNAK (pS5448), AHSG (pS135) CTNND1 (pS349/352), AHSG (pS138), AKAP12 (pS1328), AKAP12 (pS696/697/698), Akt1S1 (pT246), ARPP19 (pS62), CALD1 (pS789), CAV1 (pS37), CTNND1 (pS252), DYNC1LI2 (pS194), EIF5B (pS214), FAM129B (pS679/683), FMNL2 (pS171), FOXO1 (pS256), HDAC1 (pS421/423), HIST1H1E (pT4), HNRNPA3 (pY360), HNRNPH1 (pS104), LMNA (pS414), LGC100129307 (pS237), LSM14A (pS219), LUZP1 (pS233), MAP4 (pS1073), MAP4 (pS787), MAPK1 (pY187), MARCKSL1 (pS104), MYCT1 (p149), NUCKS1 (pS19), PDCD4 (pS457), PDLIM4 (pS112), PEA15 (pS116), PGM2L1 (pS175), PML (pS518/527), SHANK3 (pT1235/pS1254), SRRM1 (pS450), SRRM1 (pS675/696/738/740), SRSF11 (pS483), TBC1D4 (pS341/588), TJP2 (pS130), TJP2 (pS415), TPR (pS2073), VIM (pS56/pY61), ZC3H18 (pS893), ZC3HC1 (pS344) e ZFYVE19 (pS354).

Em conjunto, esses dados mostram que Ang-(1-7) regula a fosforilação e, consequentemente, a atividade de proteínas envolvidas em diversos processos anti-tumorigênicos, como a regulação da proliferação celular e da angiogênese, o que não havia sido anteriormente descrito no estado da técnica.

Exemplo 6 - Sobrevivência de células tumorais submetidas a tratamento com a combinação de Angiotensina 1-7 (10'6) e inibidores de PI3K (wortmannin e LY294002).

As linhagens celulares de adenocarcinoma alveolar humana (A549) e de câncer de próstata humana (Du145) foram crescidas em meio DMEM-F12 suplementado com soro fetal bovino e os antibióticos penicilina e estreptomicina, e incubadas a 37°C e 5%CO2. Após contagem das células utilizando câmara citométrica, as linhagens foram diluídas para uma concentração de 2 x 104 células.ml-1 em meio DMEM-F12 contendo soro. 250 μl dessa preparação foram distribuídos em cada um dos poços da placa de 96 poços (Nunclon), com exceção de metade da última linha, na qual foram adicionados somente 250 μl do meio. Após dois dias de crescimento, durante sua fase logarítmica, na presença de meio DMEM-F12, as células A549 foram tratadas com wortmannin isolado ou em combinação com angiotensina 1-7 (10‘ 6); enquanto as células Du145 foram tratadas com LY294002 isolado ou em combinação com angiotensina 1-7 (10‘6). Após aspiração do meio, foram adicionados 125 μl de DMEM-F12, na ausência ou presença de angiotensina 1- 7(10’6). Para a primeira coluna, 125 μl de Wortmannin foram adicionados (250 μM) para as células A549 e 125 μl de LY294002 foram adicionados (1000 μM) para as células Du145. Foram feitas diluições seriadas: 125 μl da primeira coluna foram misturados com a próxima coluna. Em seguida, 125 μl da segunda coluna foram adicionados à terceira coluna e homogeneizados, e assim sucessivamente. Após dois dias de tratamento, essas células foram incubadas por 3 horas na presença de 25 μl de Alamar blue (Invitrogen). Após esse período, a placa foi lida por um espectrômetro utilizando filtro de 570 nm de excitação e 585 nm de emissão e os dados foram analisados usando o MS Excel e GraphPrism.

As células tumorais A549 tratadas com as doses de 31,25 μM e 7,81 μM de wortmannin em combinação com angiotensina-(1-7) apresentaram uma significativamente menor sobrevivência, quando comparadas com essas mesmas células tratadas somente com a dose correspondente de wortmannin. Para as doses de 62,50 μM, 15,63 μM e 3,91 pM, as células não apresentaram diferença significativa de porcentagem de sobrevivência, quando tratadas em conjunto com Ang-(1-7). De forma similar, foi verificado que as células Du145 tratadas com as concentrações de 125 pM, 62,5 pM e 31,25 pM de LY294002 conjuntamente com angiotensina 1-7 apresentaram uma menor sobrevivência significativa, quando comparadas com as células Du145 submetidas ao tratamento somente com a dose correspondente de LY294002. Essas células, tratadas com as doses de 250 pM e 15,63 pM, não apresentaram diferença significativa quando tratadas em combinação com Ang-(1-7). Em ambos os experimentos, o tratamento somente com angiotensina-(1-7) diminuiu a sobrevivência em cerca de 5-10% nas condições experimentais descritas (Figura 2).

Dessa forma, os resultados indicam que a combinação de angiotensina (1-7) com inibidores de PI3K, como wortmannin e LY294002, em determinadas doses, aumenta a eficácia dessas drogas na inibição de crescimento de células tumorais.

Exemplo 7. Localização de FoxOI em células tumorais A549 após o tratamento com angiotensina-(1-7).

As linhagens celulares de adenocarcinoma alveolar humana (A549) foram crescidas em meio DMEM-F12 suplementado com soro fetal bovino e os antibióticos penicilina e estreptomicina, e incubadas a 37°C e 5%CO2. Essas células foram incubadas somente com DMEM-F12, sem soro ou na presença de angiotensina 1-7 (10'7) por 10 min. A localização de FoxOI em células da linhagem A549 foi realizada através de imunolocalização com anticorpo anti- FoxO1. As células foram crescidas em lamínulas tratadas com poli-lisina e depositadas em placas de 6 poços. Primeiramente, as células foram tratadas com solução de PBS suplementada com 4% de paraformaldeído durante 15 minutos à temperatura ambiente. As lamínulas foram lavadas três vezes com PBS, e as células foram incubadas com PBS + Triton X-100 0,5% por 10 minutos, lavadas novamente, e bloqueadas com PBS + BSA 4% por 1 hora. Anticorpos policlonais primários anti-FoxO1 (Cellsignaling) foram diluídos na proporção 1:100 em PBS e aplicados na lâmina por 16 horas. No dia seguinte, a lâmina foi lavada e incubada com anticorpo secundário anti-coelho conjugado com Alexa Fluor 488 (Invitrogen), durante 1 hora. Após uma última lavagem com PBS, as lamínulas foram viradas em lâminas e seladas com VectaShield contendo DAPI. As imagens foram capturadas utilizando um microscópio confocal equipado com uma câmera DXM 1200 F. As imagens foram analisadas através do Programa Image J.

As células A549, após o tratamento com angiotensina 1-7, apresentaram uma maior intensidade de fluorescência de FoxO1 no núcleo em comparação com essas células não tratadas. Esse resultado indica que ocorre uma maior localização de FoxO1 no núcleo de células tratadas com Ang-(1-7). Dessa forma, o tratamento com Ang-(1-7) provavelmente causa a desfosforilação de FoxO1 em células A549, como demonstrado para células HAEC no exemplo 5, o que leva à migração dessa proteína para o núcleo das células tumorais, onde ela irá inibir a transcrição de genes envolvidos no crescimento e proliferação celular e ativação de genes apoptóticos. Portanto, a angiotensina 1-7 através da indução da mudança de localização de FoxO1 pode inibir o crescimento tumoral (Figura 3).

Claims (6)

1. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS ANTICÂNCER, caracterizadas por compreenderem a Angiotensina-(1-7) em combinação com inibidores de PI3K/Akt e excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

2. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS ANTICÂNCER, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pela Angiotensina-(1-7) e os inibidores de PI3K/Akt estarem compreendidos em uma formulação contendo ciclodextrinas, derivados de ciclodextrinas, lipossomos, polímeros biodegradáveis, derivados de polímeros biodegradáveis, nanossistemas ou misturas destes sistemas.

3. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS ANTICÂNCER, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelos excipientes serem selecionados de um grupo que compreende água, solução salina, soluções tamponadas com fosfato, solução de Ringer, solução de dextrose, solução de Hank, soluções salinas biocompatíveis contendo ou não polietilenoglicol, veículos não aquosos, como óleos fixos, óleo de sésamo, oleato de etila ou triglicerídeos, isolados ou em mistura, incluindo nanopreparações.

4. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS ANTICÂNCER, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelos excipientes conterem aditivos, como tampões, conservantes, aglutinantes, desintegrantes, diluentes, lubrificantes e/ou tensoativos.

5. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS ANTICÂNCER, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas por serem apresentadas nas formas sólida, semi-sólida ou líquida.

6. USO DAS COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS ANTICÂNCER definidas na reivindicação 1, caracterizado por ser para preparar um medicamento para tratar indivíduos acometidos por neoplasias.

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