PRODUCTOS MÉDICOS QUE COMPRENDEN UN REVESTIMIENTO HEMOCOMPATIBLE, PRODUCCIÓN Y USO DE LOS MISMOS
La invención se refiere al uso de polisacáridos que contienen el bloque de construcción de azúcar N-acilglucosamina para la preparación de superficies hemocompatibles de dispositivos médicos, métodos para el revestimiento hemocompatible de superficies con dichos polisacáridos así como también dispositivos médicos con estas superficies hemocompatibles. En el cuerpo humano la sangre entra solamente, en casos de lesiones, en contacto con superficies diferentes al interior de los vasos sangu íneos naturales. Consecuentemente, el sistema de coagulación de la sangre se activa siempre para reducir el sangrado y para prevenir una pérdida de sangre que amenaza la vida, si la sangre entra en contacto con las superficies externas. Debido al hecho de que un implante también representa una superficie externa , todos los pacientes, quienes reciben un implante, que está en contacto permanente con la sangre, se tratan para la duración del contacto de la sangre con medicamentos , así llamados anticoagulantes, que suprime la coagulación de la sangre, de manera que los efectos secundarios considerables tienen que tomarse en cuenta. Aunque el uso de soportes de vaso, así llamados endoprotésis, el riesgo descrito de trombosis también ocurre como uno de los factores de riesgo en vasos que llevan sangre. En caso de estructuras de vaso y sellados debido a, por ejemplo, cambios arterioescleróticos especialmente de las arterias coronarias, la prótesis se utiliza para la expansión de las paredes del vaso. Fija los fragmentos de cal en los vasos y mejora las propiedades de flujo de la sangre dentro del vaso a medida que aplana la superficie del espacio interior del vaso. Adícionalmente, una prótesis conduce a una resistencia contra fuerzas de restauración eléctricas de la parte del vaso expandida. El material utilizado es en la mayoría de los casos acero inoxidable. La trombosis de la prótesis ocurre en menos de un por ciento de los casos ya en el laboratorio de cardio catéter como la trombosis anterior o en dos a cinco por ciento de los casos durante la recuperación en el hospital. En aproximadamente cinco por ciento de los casos las lesiones del vaso debido a la invención se causan debido al cierre arterial y la posibilidad de causar pseudo-aneurismas por la expansión existente de los vasos. Adícionalmente, la aplicación continua de heparina como antícoagulante incrementa el riesgo de sangrado. Una complicación adicional y muy frecuente es restenosis, el resellado del vaso. Aunque las prótesis reducen el riesgo de un sellado renovado del vaso, hasta ahora no son totalmente capaces de ocultar la restenosis. La tasa de resellado (restenosis) después de la implantación de una prótesis es con hasta el 30% una de las razones principales de una vista repetida al hospital para los pacientes. Una descripción conceptual exacta de la restenosis no existe en la literatura profesional. La definición morfológica más utilizada de la restenosis es que después de una PTA exitosa (angioplastia transluminal percutánea), la restenosis se define como una reducción del diámetro del vaso a menos del 50% de lo normal. Esto es un valor empíricamente definido del cual la relevancia hemodinámica y la relación con síntomas - 3 -clínicos carece de una base científica masiva. En praxis, el agravio clínico del paciente con frecuencia se observa como un signo de restenosis de la parte del vaso anteriormente tratada . Las lesiones del vaso causadas durante la implantación de las prótesis originan reacciones de inflamación, que juegan un papel importante para el proceso de curación durante los primeros siete días. Los procesos actuales en la presente se encuentran entre otros conectados con la liberación de los factores de crecimiento, que inician una proliferación incrementada de las células del músculo liso y conducen con esto a una rápida restenosis, un sellado renovado del vaso debido al crecimiento no controlado. Aún después de un par de semanas, cuando la prótesis se desarrolla en el tejido del vaso sangu íneo y se rodea totalmente por las células del músculo liso, las cicatrizaciones pueden ser muy distintivas (hiperplasia neoíntima) y conducen a no solamente una cobertura de la superficie de la prótesis sino que también al sellado del espacio interior total de la prótesis. Se ha tratado en vaso resolver el problema de restenosis por el revestimiento de las prótesis con heparina (J. Whórle er a/., European Herat Journal (2001 ) 22, 1808-1 816). Heparina se conduce como un anticoagulante solamente en la primer causa mencionada y además es capaz de encontrar su efecto total solamente en solución. El primer problema es mientras tanto caso totalmente evitable de manera medicamentosa por la aplicación de anticoagulantes. El problema adicional se propone resolverse ahora al inhibir el crecimiento de las células del músculo liso localmente en la prótesis. Ésto se lleva a cabo por ejemplo, por prótesis o prótesis radioactivas, que contienen agentes activos farmacéuticos. Consecuentemente existe una demanda en materiales hemocompatibles, no trombógenos, que no se detectan como superficie externa y en caso de contacto de sangre no activa el sistema de coagulación y conduce a la coagulación de la sangre, con la cual un factor importante para los procesos estimulantes de la restenosis se elimina. El soporte se supone otorgarse por la adición de agentes activos que deben suprimir las reacciones de inflamación o que deben controlar el proceso de calentamiento que acompañan la división celular. Las tomas son enormes en esta área de producción de una prótesis que pueden reducir la restenosis en esta manera o eliminarse totalmente. En la presente diferentes posibilidades de realización se examinan en numerosos estudios. El tipo de construcción más común consiste de una prótesis, que se reviste con una matriz adecuada , usualmente un polímero bioestable . La matriz incluye un agente antiflogístico o antiproliferativo que se libera en pasos temporalmente controlados y debe suprimir las reacciones de inflamación y la división celular excesiva. US-A- 5 891 108 revela , por ejemplo, una prótesis moldeada hueca, que puede contener agentes activos farmacéuticos en su interior, que pueden liberarse por un número diverso de salidas én la prótesis. Mientras que EP-A-1 127 582 describe una prótesis que muestra en su superficie canales de 0. 1 -1 mm de profundidad y 7-1 5 mm de longitud , que son adecuados para la implementación de un agente activo. Estos - 5 -receptores de agente activo liberan, similarmente a las salidas de la prótesis hueca, el agente activo farmacéutico contenido en una concentración puntualmente alta y sobre un periodo de tiempo relativamente largo, que conduce al hecho, de que las células del múscu lo liso ya no son o solamente son muy capaces de manera retrasada de rodear la prótesis. Como una consecuencia, la prótesis se expone más tiempo a la sangre, que conduce de nuevo a sellados de vaso incrementados por trombosis (Lilistro F. , Colombo A. , Late acute trombosis after paclitaxel eluting stent implantation, Herat (2001 ) 86 262-4). Un planteamiento para este problema se representa por el revestimiento de fosforilcolina de biocompatibles (WO 01 01 957), como aqu í fosforilcolina , u n componte de la membrana de célula eritrocítica, debe crear una superficie no trombógena como ingrediente de la capa de polímero no biodegradable revestida en la prótesis. Dependiendo de su peso molecular el agente activo se absorbe por la capa de polímero de fosforilcolina que contiene polímero o se absorbe en la superficie . El objeto de la presente invención es proporcionar dispositivos méd icos hemocompatiblemente revestidos así como también métodos de revestimiento hemocompatible y el uso de dispositivos médicos hemocompatiblemente revestidos, especialmente prótesis, para prevenir o reducir las reacciones indeseadas como, por ejemplo, restenosis. Especialmente el objeto de la presente invención es proporcionar prótesis que permiten un crecimiento interior controlado, continuo de la prótesis, en un lado por supresión de las reacciones celulares en los días primarios y semanas después de la implantación por el soporte de los agentes seleccionados y combinaciones de agente por el otro lado al proporcionar una superficie biocompatible resp inerte atrombógena, que garantiza que con la reducción de la influencia del agente ninguna reacción a la superficie externa existente tiene lugar, lo que también puede conducir a complicaciones a largo plazo. Las intenciones de crear una simulación casi perfecta de las condiciones atrombógenas nativas de la parte de un vaso sanguíneo que se ubica en el lado sanguíneo son enormes. EP-B-0 333 730 describe un proceso para producir substratos hemocompatibles por receso, adhesión y/o modificación y sujeción de polisacárido de superficie celular endotélica trombógena (HS I). La inmovilización de este HS I de sulfato de proteoheparano de superficie celular endotélica específica en superficies biológicas o artificiales efectúa que tales superficies revestidas sean compatibles con la sangre y adecuadas para el contacto sanguíneo permanente. Una desventaja por lo tanto es, que este proceso para la preparación de HS I tiene la primicia del cultivo de célu las endotélicas, de manera que la estabilidad económica de este proceso se limita fuertemente, debido a que el cultivo de células endotélica toma tiempo y cantidades mayores de células endotélicas cultivadas son solo obtenibles con gasto inmerso. La presente invención resuelve el objeto al proporcionar dispositivos médicos que muestran propiedades de un revestimiento de superficie de polisacáridos determinados y paclitaxel . En lugar de o junto con paclitaxel se determinan otras combinaciones de agente de resp. De medicamentos antiflogísticos así como también anti-inflamatorios de -7- simvastatina, 2-metiltiazolidina-2,4-ácido dicarboxílico y la sal de sodio correspondiente, subóxido macrocíclico (MCS) y sus derivados, tirfostiinas, D24851, timosina a-1, inhibidores de interleuquina-1 ß, proteína activada C (aPC), MSH, ácido fumárico y éster de ácido fumárico, PETN (tetranitrato de pentaeritritol), PI88, dermicidina, bacatina y sus derivados, docetaxel y derivados adicionales de paclitaxel, tacrolimo, pimecrolimo, trapidil, a- y ß- estradiol, sirolimo, colquicina, y hormona estimuladora de melanocito (a- MSH) pueden utilizarse. Los métodos para la producción de estas superficies hemocompatibles se dan en las reivindicaciones 20-31. Las modalidades preferidas pueden encontrarse en las reivindicaciones dependientes, los ejemplos así como también las figuras. La materia sujeto de la presente invención son dispositivos médicos, la superficie de los cuales se cubre al menos parcialmente con una capa hemocompatible, en donde la capa hemocompatible comprende al menos un compuesto de la fórmula 1: Fórmula 1
en donde n es un entero entre 4 y 1050 y Y representa los residuos -CHO, -COCH3, -COC2H5, -COC3H7, -COC4H COCsH , -COCH(CH3)2, -COCH2CH(CH3)2, -COCH(CH3)C2H5. -COC(CH3)3 CHzCOO., -C2H4COO-, -C3H6COO\ -C4H8COO\ También es posible utilizar cualquier sal de los compuestos de la fórmula 1 . La capa hemocompatible puede agregarse directamente en la superficie de un dispositivo médico preferentemente no hemocompatible o depositarse sobre otras capas biodegradables y/o bioestables. Además en las capas bioestables y/o biodegradables adicionales y/o hemocompatibles puede localizarse la capa hemocompatible. Además, para este agente activo paclitaxel está presente en, y/o bajo la capa hemocompatible o las capas hemocompatibles, respectivamente. El agente activo (paclitaxel) puede formar en el mismo una capa de agente activo propia en o bajo la capa hemocompatible y/o puede incorporarse en al menos una de las capas bioestable, biodegradable y/o hemocompatible. Preferentemente, los compuestos de la fórmula general 1 se utilizan , en donde Y es uno de los siguientes grupos: -CHO, -COCH3, -COC2H5 o -COC3H7. Además se prefieren los grupos -CHO, -COCH3, -COC2H5 y especialmente se prefiere el grupo -COCH3. Los compuestos de la fórmula general 1 contienen solamente una cantidad pequeña de grupos amino libre. Debido al hecho de que con la reacción de ninhidrina los grupos amino libre no podría detectarse más, debido a la sensibilidad de esta prueba, puede implicarse que menos del 2% , preferentemente menos del 1 % y especialmente menos preferido 0.5% de todos los grupos -NH-Y están presentes como grupos amino libre, es decir, dentro de este bajo porcentaje de los grupos -NH-Y, Y representa hidrógeno . Debido a que los polisacáridos de la fórmula 1 contiene grupos carboxilato y grupos amino, la fórmula general cubre sales de álcali así como también de metal de tierra alcalina de los polisacáridos correspondientes. Las sales de metal álcali como la sal de sodio, la sal de potasio , la sal de litio o la sales de metal de tierra alcalina como la sal de magnesio o la sal de calcio pueden mencionarse. Además con amoniaco, las aminas, primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria, sales de amonio de derivados de piridina, preferentemente sales de alquilamonio y sales de piridinio pueden formarse. Entre las bases, que forman las sales con los polisacáridos, se encuentran las bases orgánicos e inorgánicas como por ejemplo, NaOH, KOH, LiOH , CaC03, Fe(OH)3, NH4OH , hidróxido de tetraalquilamonio y compuestos similares. Los polisacáridos de acuerdo a la fórmula 1 poseen pesos moleculares de 2 kD a 1 5 kD, preferido de 4 kD a 1 3 kD, más preferido de 6 kD a 12 kD y especialmente preferido de 8 kD a 11 kD. La variable n es un entero en el rango de 4 a 1 050. n preferido es un entero de 9 a 400, más preferido un entero de 14 a 260 y especialmente preferido un entero entre 19 y 210. La fórmula general 1 muestra un disacárido, que tiene que observarse como el módulo básico para los polisacáridos utilizados y que forma el polisacárido por secuenciación de n-dobleces (múltiples) del módulo básico. Este módulo básico que se construye de dos moléculas de azúcar no debe interpretarse en la manera, que la fórmula general 1 solamente incluye polisacáridos con un número par de moléculas de azúcar. La fórmula implementa, por supuesto, también polisacáridos con un número impar de unidades de construcción de azúcar. Los grupos finales de los - 10 -polisacáridos se representan por grupos hidroxilo. Especialmente preferidos son los dispositivos médicos que contienen inmediatamente en la superficie del dispositivo médico una capa hemocompatible que consiste de los compuestos de acuerdo a la fórmula 1 y arriba de ella una capa de paclitaxel. La capa de paclitaxel puede difundirse parcialmente en la capa hemocompatible o tomarse totalmente por la capa hemocompatible. Se prefiere además, si al menos una capa bioestable está presente bajo la capa hemocompatible. Además, la capa hemocompatible puede revestirse totalmente y/o parcialmente con al menos una más, arriba de la capa subyacente bioestable y/o biodegradable. Se prefiere una capa hemocompatible o biodegradable externa . Una modalidad preferida contiene una capa de paclitaxel bajo la capa hemocompatible o entre la capa bioestable y hemocompatible, de manera que paclitaxel se libera lentamente a través de la capa hemocompatible . Paclitaxel puede unirse covalentemente y/o adhesivamente en y/o en la capa hemocompatible y/o la capa bioestable y/o biodegradable, en la cual la unión adhesiva se prefiere. Como substancias biodegradables para la(s) capa (s) biodegradable(s) pueden utilizarse: polivalerolactonas, poli-e-decalactonas, ácido polilactónico, ácido poliglicólico, poliláctidos, poliglucólidos, copolímeros de los poliláctidos y poliglucólidos, ???-e-caprolactona, ácido polihidroxibutanóico, polihidroxibutiratos, polihidroxivaleratos, polihidroxibutirato-co-valeratos, poli(1 ,4-dioxano-2 ,3-dionas), poli(1 ,3-dioxano-2-ona), poli-para-dioxanonas, polianhídridos tales como anhídridos - 11 -polimaléicos, polihidroximetacrilatos, fibrina , poliacinoacrilatos, policaprolactonadimetilacrilatos, ácido poli b-maléico, policaprolactonabutil-acrilatos, polímeros de multibloque tales como, por ejemplo, oligocaprolactonadioles y oligodioxanonadioles, polímeros de multibloque de éster poliéter tales como, por ejemplo, PEG y poli(butilenotereftalatos), polipivotolactonas, trimetil-carbonatos de ácido poliglucólico, policaprolactona-glucólidos, poli(g-etilglutamato), poli(DTH-iminocarbonato), poli(DTE-co-DT-carbonato), poli(bisfenol-A-iminocarbonato), poliortoésteres, trimetil-carbonatos de ácido poliglucólico, politrimetilcarbonatos, poliiminocarbonatos, poli(N-vinil)-pirrolidona , polivinilalcoholes, poliesteramidas, poliésteres glucolados, polifosfoésteres, polifosfazenos, poli[p-carboxifenoxi)propanó], ácido polihidroxipentanóico, polianh ídridos, polietilenoóxido-propolenoóxido, poliuretanos suaves, poliuretanos con residuos de aminoácido en la estructura, esteres poliéter tales como poletilenoóxido, polialquenooxalatos, poliortoésteres así como también sus copolímeros, lípidos, carraghen , fibrinógeno, almidón , colágeno, pol ímeros a base de proteína, ácidos poliamino, ácidos poliamino sintéticos, zein , zein modificado, poiihidroxiaicanoatos, ácido péctico, ácido actínico, caseína y fibrina no modificada y modificada, carboximetilsulfato, albúmina, además ácido hialurónico, quitosan y sus derivados, heparansulfatos y sus derivados, heparinas, condroitinsulfato, dextran, b-ciclodextrinas, copolímeros con PEG y polipropilenoglicol, goma arábiga , guar, gelatina, colágeno, colágeno-N-hidroxisuccinimida, lípidos, fosfolípidos, modificaciones y copolímeros y/o mezclas de las substancias arriba mencionadas.
- 12 - Como substancias bioestables para la(s) capa(s) bioestable(s) pueden utilizarse; ácido poliacrílico y policarilatos como polimetilmetacrilato, polibutilmetacrilato, poliacrilamida, poliacrilonitrilos, poliamidas, polieteramidas, polietilenoamina, poliimidas, policarbonatos, policarbouretanos, polivinilcetonas, polivinilhalogenuros, polivinildenhalogenuros, poliviniléteres, poliisobutilenos, polivinilaromatos, polivinilésteres, polivinilpirrolidonas, polioximetilenos, politetrametilenoóxido, polietileno, polipropileno , politetrafluoroetileno , poliuretanos, poliéteruretanos, poliéteruretanos de silicona, silicona-poliuretanos, silicona-policarbonato-uretanos, elastomeros de poliolefina , poliisobutilenos, gomas EPDM, fluorosiliconas, carboximetilquitosanos, poliarileteretercetonas, polieteretercetonas, polietilenotereftalato , polivaleratos, carboximetilcelulosa , celulosa, rayón , rayontriacetatos, celulosanitratos, celulsaacetatos, hidroxietilcelulosa , ceiulosabutiratos, celulosaacetatobutiratos, copolímeros de etilvinilacetato, polisulfonas, resinas epoxi, resinas ABS, gomas EPDM, siliconas como polisiloxanos, polidimetilsiloxanos, polivinilhalógenos y copolímeros, celulsaéteres, celu lsatriacetatos, quitosanos y copol ímeros y/o mezclas de estas substancias. Es posible proporcionar cualquier dispositivo médico con las superficies hemocompatibles descritas en la presente, especialmente aquellas, que deben ser adecuadas para el contacto a largo o corto plazo con la sangre o productos sanguíneos. Tales dispositivos médicos son, por ejemplo, prótesis, órganos, vasos, aortas, válvulas cardiacas, tubos, partes del órgano, implantes, fibras, fibras huecas, endoprótesis, agujas huecas, - 13 -jeringas, membranas, bienes de estaño, recipientes de sangre, placas tritimétricas, marcapasos, medios absorbentes, medios de cromatografía, columnas de cromatografía, dializadores, partes de conexión, sensores, válvulas, cámaras centrífugas, recuperadores, endoscopios , filtros, cámaras de bomba. La presente invención se relaciona especialmente con las prótesis. Los polisacáridos de la fórmula 1 pueden formarse de heparina y/o heparansulfatos. Estos materiales son compuestos muy similares de manera estructural a la vista. Heparansulfatos ocurren ubicuamente en superficies de célula de mamíferos. En dependencia del tipo celular difieren fuertemente en el peso molecular, grado de acetilación y grado de sulfación. Heparansulfato de h ígado muestra, por ejemplo, u n coeficiente de acetilación de aproximadamente 50%, mientras que heparansulfato de glicocalix de células endotélicas puede mostrar un coeficiente de acetilación de aproximadamente 90% o más. Heparina muestra solamente un grado muy bajo de acetilación de aproximadamente hasta 5% . El coeficiente de sulfación de heparansulfato de hígado y de heparina es -2 por unidad de discárido, en caso de heparansulfato de células endoteliales próximas a 0 y en heparansulfatos de otros tipos celulares entre 0 y 2 por unidad de disacárido . Los compuestos de la fórmula general 1 se caracterizan por una cantidad de grupos sulfato por unidad de disacárido de menos de 0.05. Además, la cantidad de grupos amino libre en estos compuestos es menor a 1 % en base a todos los grupos -N H-Y. La siguiente imagen muestra una unidad de tetrasacárido de - 14 -una heparina o un heparansulfato con orientación aleatoria de los grupos sulfatos y con un coeficiente de sulfación de 2 por unidad de disacarido como es típico para heparina:
Todos los heparansulfatos tienen con heparina una secuencia común en la biosíntesis. Antes que nada la proteína núcleo con la región de unión que contiene xilosa se forma. Consiste de la xilosa y dos residuos de galactosa conectados a ella. Para las últimas de las dos unidades de galactosa un ácido glucorónico y una galactosamina se conecta alternativamente hasta que la longitud de cadena adecuada se alcanza . Finalmente, una modificación enzimática de paso diverso de este precursor de polisacárido común de todos los heparansulfonatos y de heparina se sigue por medio de sulfotransfersas y epimerasas que se generan por su terminación variable de transformación , de los amplios espectros de diferentes heparansulfonatos hasta heparina. Heparina se forma alternativamente de D-glucosamina y ácido D-glucurónico resp. ácido L-idurónico, en el cual la cantidad de ácido L-idurónico es hasta 75% . D-glucosamina y ácido D-glucurónico se conectan en un ß-1 ,4-glucosício resp. ácido L-idurónico en una unión a-1 ,4-glucosídica al disacárido, que forma las subunidades de heparina. Estas subunidades se conectan de nuevo entre sí en una manera ß-1 ,4- - 15 -glucosídica y conducen a heparina. La posición de los grupos sulfonilo es variable. En promedio una unidad de tetrasacárido contiene 4 a 5 grupos de ácido sulfúrico. Heparansulfato, también nombrado heparitinsulfato, contiene con excepción del heparansulfato de h ígado menos grupos sulfonilo N- y O-unidos como heparina pero en intercambio más grupos N-acetilo. La cantidad de ácido L-idurónico comparada con heparina es también inferior. Como es evidente en la figura 1 , los compuestos de la fórmula general (cf. Figura 1 b, como ejemplo) son estructuralmente similares al heparansulfato natural de células endoteliales, pero evitan las desventajas por el uso de sulfatos de heparan de célula endotelial. Para la actividad- antitrombótica una unidad de pentasacárido especial se hace responsable, que puede encontrarse en preparativos de heparina comerciales en aproximadamente cada 3er molécula. Las preparaciones de heparina de diferente actividad antitrombótica puede producirse por técnicas de separación especiales. En preparaciones altamente activas, por ejemplo, por antitrombin-l l l-cromatografía ("heparina de alta afinidad") esta secuencia activa se encuentra en cada molécula de heparina, aunque en, preparaciones "sin afinidad" las secuencias de pentasacárido no características y de esta manera inhibición no activa de coagulación puede detectarse. A través de la interacción con este pentasacárido, la actividad de antitrombina III, un inhibidor del factor clave de coagulación, trombina, se exponencia esencialmente (incremento de afinidad de unión hasta el factor 2x 1 03) [Stiekema J. C.J; Clin Nephrology 26, Suppl . Nr 1 , S3-S8, (1986)].
- 16 - Los grupos amino de la heparina son mayormente N-sulfatados o N-acetilados. Las posiciones de O-sulfación más importantes son C2 en el ácido idurónico así como también C6 y C3 en la glucosamina. Para la actividad del pentasacárido en la coagulación plasmática básicamente el grupo sulfato en C6 se hace responsable, en proporción más pequeña también los otros grupos funcionales. Las superficies de implantes medicinales revestidos con heparina o heparansulfatos son y permanecen solamente condicionalmente hemocompatible por el revestimiento. La heparina o heparansulfato que se agrega en la superficie artificial pierde parcialmente en una medida drástica , su actividad antitrombótica que se relaciona con una interacción restringida debido a impedimento estérico de las unidades de pentasacárido mencionadas con anitrombina III . Debido a la inmovilización de estas substancias polianiónicas, una fuerte absorción de proteína de plasma en la superficie con heparina se observa en todos los casos, lo que elimina por un lado el efecto sorprendente de coagulación de resp. de heparina de heparansulfatos e inicializa por el otro lado procesos de coagulación específica por estructura adherente y por lo tanto terciario que cambia las proteínas de plasma (por ejemplo, albúmina, fibrinógeno, trombina) y en la misma plaquetas adherentes. De esta manera, existe una correlación en, por el otro lado, entre la interacción limitada de las unidades de pentasacárido con antitrombina III por inmovilización, por el otro lado, deposiciones de proteínas de plasma en la capa de heparansulfato resp. de heparina en el implante medicinal, tienen lugar, lo que conduce a la(s) pérdida(s) de las - 17 -propiedades antitrombóticas del revestimiento y que aún, a su vez, pueden cambiarse a lo opuesto, debido a que la absorción de proteína de plasma, que ocurre durante un par de segundos, conduce a la pérdida de la superficie anticoagulacional y las proteínas de plasma adhesivas cambias su estructura terciaria, mediante lo cual la antitrombogenidad de la superficie se vuelve viceversa y una superficie trombógena se eleva . Sorprendentemente, podría detectarse, que los compuestos de la fórmula general 1 , a pesar de las diferencias estructurales al heparansulfato de resp. de heparina, aún muestran las propiedades hemocompatibles de heparina y adicionalmente después la inmovilización de los compuestos sin observar las deposiciones de proteínas de plasma, que representan una etapa inicial en la activación de la cascada de coagulación , podría observarse- Las propiedades hemocompatibles de los compuestos de acuerdo con la invención aún permanecen después de su inmovilización en superficies artificiales. Además se supone que los grupos sulfato de la resp. de heparina, los heparansulfatos son necesarios para la interacción con anitrombina III e imparten así la resp. de heparina , al heparansulfato, el efecto anticoagulatorio. Los compuestos inventivos son no activamente supresores de coagulación , es decir, anticoag ulante, debido a una desulfatación casi completa, los grupos sulfatos de los compuestos se remueven hasta una cantidad inferior por debajo de 0.2 grupos sulfatos por unidad de disacárido. Los compuestos inventivos de la fórmula general 1 pueden generarse de heparina o heparasulfatos mediante primero desulfatación - 18 -substancialmente completa del polisacárido y subsecuentemente N-acilación substancialmente completa. El término "substancialmente desulfatado completamente" se refiere a un grado de desulfatación arriba de 90% , preferido arriba de 95%, y especialmente preferido arriba de 98% . El coeficiente de desulfatación puede determinarse de acuerdo a la prueba de ninhidrina así llamada que indica grupos amino libre. La desulfatación tiene lugar en la manera como con DMMB (azul de dimetilmetileno) no se obtiene reacción de color. Esta prueba de color es adecuada para la indicación de polisacáridos sulfatados pero su límite de detección no es conocido en la literatura técnica. La desulfatación puede llevarse a cabo, por ejemplo, por pirólisis de la sal de piridinio en una mezcla de solvente. Especialmente, una mezcla de DIVISO, 1 ,4-dioxano y metanol ha probado valor. Los heparansulfatos así como también heparina se desulfata a través de hidrólisis total y subsecuentemente se reacila. Después, el número de grupos sulfato por unidad de disacárido (S/D) se determina por 13C-NMR. La siguiente tabla 1 muestra estos resultados en el ejemplo de heparina y desulfata, heparina reacetilada (Ac-heparina). Tabla 1 : Distribución de grupos funcionales por unidad de disacárido en el ejemplo de heparina y Ac-heparina como se determina por mediciones 13C- NMR
2-S , 3-S , 6-S: grupos sulfato en la posición 2, 3, 6 respectivamente
NS . grupos sulfato en los grupos amino N-Ac: grupos acetilo en los grupos amino - 19 - NH2: grupos amino libre Un contenido de sulfato de aproximadamente 0.03 grupos sulfato/unidad de disacárido (S/D) en caso de Ac-heparina en comparación con aproximadamente 2.5 grupos sulfato/unidad de disacárido en caso de heparina se obtiene reproduciblemente. Como se describe arriba la diferencia en los contenidos de sulfato de heparansulfatos de resp. de heparina tiene una influencia considerable en la actividad adversa a antitrombina II I y los efectos coagulantes de estos compuestos. Estos compuestos tienen un contenido de grupos sulfato por unidad de disacárido menor a 0.2, preferido menor a 0.07, más preferido menor a 0.05 y especialmente preferido menor a 0.03 grupos sulfato por unidad de disacárido . Por el retiro de los grupos sulfato de heparina, a los cuales el mecanismo de funcionamiento supresor de coagulación activa se acredita a, uno recibe para un refinamiento de superficie adecuado, hemocompatible, coagulación inerte de polisacárido oligo-resp. que, por el otro lado, no tiene papel activo en el proceso de coagulación y que, por el otro lado no se detecta por el sistema de coagulación como superficie externa . De acuerdo con lo anterior, este revestimiento imita exitosamente la naturaleza dada más alta estándar de hemocompatibilidad y pasividad contra los componentes activos de coagulación de la sangre. Los ejemplos 3 y 4 clarifican , que las superficies, que se reviste con los compuestos de acuerdo a la invención, especialmente se revisten covalentemente, resultan en un revestimiento pasivo, atrombógeno y hemocompatible. Esto se prueba definitivamente por el ejemplo de Ac-heparina.
- 20 - Substancialmente N-acilado completamente se refiere a un grado de N-acilación de arriba de 94%, preferido arriba de 97% y especialmente preferido arriba de 98%. La acilación pasa en tal manera completamente , que con la reacción de ninhidrina para la detección de los grupos amino libre, no se obtiene más reacción de color. Como agentes de acilación se utilizan preferentemente cloruros de ácido carboxílico, bromuros o anhídridos. El anhídrido acético, anhídrido propiónico, anhídrido butíricio, cloruro de ácido acético, cloruro de ácido propiónico o cloruro de ácido butírico son, por ejemplo, adecuados, para la síntesis de los compuestos de acuerdo con la invención . Especialmente adecuados son los anhídridos carboxílicos como agentes de acilación. Como solvente especialmente para anhíd ridos de ácido carboxílico, se utiliza agua desionizada, especialmente junto con un cosolvente que se agrega en una cantidad de 10 a 30 por ciento de volumen. Como cosolventes son metanol adecuado, etanol, D SO, D F, acetona, dioxano , THF, acetato de etilo y otros solventes polares. En caso del uso de halogenuros de ácido carboxílico preferentemente solventes libres de agua , polares tales como DMSO o DMF, se utilizan . Los compuestos inventivos de la fórmula general comprenden en la mitad de las moléculas de azúcar u n grupo carboxilato y por la otra mitad un grupo N-acilo. La presente invención describe el uso de los compuestos con la fórmula general 1 así como también sales de estos compuestos para el revestimiento , especialmente un revestimiento hemocompatible de superficies naturales y/o artificiales. Bajo "hemocompatible" la - 21 -característica de los compuestos de acuerdo la invención significa, no interactuar con los compuestos del sistema de coagulación sanguínea o las plaquetas y así no iniciar la cascada de coagulación sanguínea. Además, la invención revela polisacáridos para el revestimiento hemocompatible de superficies. Se prefieren los polisacáridos en el rango de los límites de peso molecular, mencionados. Los polisacáridos utilizados se caracterizan porque contienen la unidad de construcción de azúcar, N-acilglucosamina, en una mayor cantidad. Esto significa que 40 a 60% de las unidades de construcción de azúcar son N-acilglucosamina y substancialmente las unidades de construcción de azúcar restantes llevan cada una un grupo carboxilo. Los polisacáridos consisten generalmente en más del 95% , preferido en más del 98% , de solamente dos unidades de construcción de azúcar, mientras que una unidad de construcción de azúcar lleva un grupo carboxilo y la otra un grupo N-acilo. Una unidad de construcción de azúcar de los polisacáridos es N-acilglucosamina , N-acetilglucosamina preferida y en caso de la otra es el ácido urónico, ácido glucurónico y ácido idurónico. Se prefieren los polisacáridos, que conspiran substancialmente la glucosamina de azúcar, mientras que substancialmente la mitad de las unidades de construcción de azúcar lleva un grupo N-acilo, preferido un grupo N-acetilo, y por la otra mitad de las unidades de construcción de glucosamina lleva un grupo carboxilo que se une directamente por el grupo amino o por uno o más grupos metilenilo. En el caso de estos grupos de ácido carboxílico unidos al grupo amino se interesa que se prefieran los grupos carboximetilo o carboxietilo. Además, los polisacáridos se prefieren, lo cual - 22 -substancialmente conspira en una mitad de N-acilglucosamina , N-acetilglucosamina preferida y substancialmente conspira en la otra mitad del ácido urónico, ácido glucurónico y ácido idurónico. Se prefieren los polisacáridos, que muestran una secuencia substancialmente alterna de N-acilglucosamina y uno de los ambos ácidos urónicos. Sorprendentemente se mostró, que para las aplicaciones de acuerdo a la invención heparina substancialmente N-acetilada y especialmente desulfatada es especialmente adecuada . Heparina especialmente N-acetilada es adecuada para el revestimiento hemocompatible. El término "substancialmente" debe aclarar, que las variaciones estadísticas están por tomarse en cuenta. Una secuencia substancialmente alterna de las unidades de construcción de azúcar implica , que generalmente dos unidades de construcción de azúcar iguales se unen entre si pero no excluyen totalmente tal conexión de defecto. De acuerdo, "substancialmente a la mitad" significa casi 50% pero permite pequeñas variaciones, debido especialmente en el caso de macromoléculas biosintéticamente sintetizadas, el caso ideal nunca se alcanza y algunas variaciones siempre se toman en cuentan, debido a que las enzimas no funcionan perfectamente y en la catálisis siempre alguna tasa de error tiene que anticiparse. Mientras que en el caso de heparina natural, existe una secuencia fuertemente alterna de N-acetilglucosamina y las unidades de ácido urónico. Además, los métodos para revestimiento hemocompatible de superficies se describen , los cuales se destinan especialmente para el - 23 -contacto sanguíneo directo. En caso de estos métodos naturales, una superficie natural y/o artificial se proporciona y los polisacáridos arriba descritos se inmovilizan en esta superficie. La inmovilización de los polisacáridos en estas superficies puede lograrse a través de interacciones hidrofóbicas, fuerzas van der Waals, interacciones electroestáticas, enlaces de hidrógeno, interacciones iónicas, degradación de los polisacáridos y/o por unión covalente sobre la superficie. Se prefiere el enlace covalente de los polisacáridos (unión a l lado), más preferido el enlace de un solo punto covalente (unión al lado) y especialmente preferido es el enlace final covalente (unión final). En lo siguiente, los métodos de revestimiento de acuerdo a la invención se describen . Las superficies biológicas y/o artificiales de dispositivos médicos pueden proporcionarse con un revestimiento hemocompatible por medio del siguiente método: a) proporcionar una superficie de un dispositivo médico y b) deposición de al menos un compuesto de la fórmula general 1 de acuerdo a la reivindicación 1 como capa hemocompatible sobre su superficie y/o b') deposición de una capa bioestable y/o biodegradable sobre la superficie del dispositivo médico de la capa hemocompatible. "Deposición" debe referirse a al menos revestimiento parcial de una superficie con los compuestos adecuados, en donde los compuestos se colocan y/o inmovilizan o de alguna manera se sujetan en y/o en la superficie subyacente.
- 24 - Bajo "substancialmente las unidades de construcción de azúcar" debe entenderse que 93% de las unidades de construcción de azúcar restantes, preferido 96% y especialmente preferido 98% del 60-40% restante de las unidades de construcción de azúcar llevan un grupo carboxilo. Una superficie no hemocompatible y/o no revestida se proporciona preferentemente. Superficies "no hemocompatibles" deben referirse a tales superficies que pueden activar el sistema coagulador sanguíneo, de esta manera son más o menos trombógenas. Una modalidad alternativa comprende los pasos: a) proporcionar superficie de un dispositivo médico y b) deposición de al menos un polisacárido inventivo de acuerdo a la fórmula 1 , b') deposición de una capa bioestable sobre la superficie del dispositivo médico y d') deposición de una capa hemocompatible adicional de al menos un polisacárido inventivo de acuerdo ala fórmula 1 . La última modalidad asegura, aún en el caso de, por ejemplo, daño mecánico de la capa polimérica y con la misma también de la capa hemocompatible exterior, que el revestimiento de superficie no pierde su característica de ser compatible con la sangre. Bajo superficie "biológica o artificia se encuentra la combinación de un dispositivo médico artificial con una parte artificial a entenderse, por ejemplo, corazón del puerco con una válvula cardiaca - 25 - artificial . Las capas únicas se depositan preferentemente mediante métodos de rociado o inmersión, mientras que uno puede depositar también paclitaxel al mismo tiempo con la deposición de una capa sobre la superficie del dispositivo médico, que se implementa entonces en la capa respectiva covalentemente y/o adhesivamente unida. De esta manera, es posible al mismo tiempo con la deposición de una capa hemocompatible sobre el dispositivo médico depositar el agente activo paclitaxel . Las substancias para las capas biodegradables o bioestables se clasifican arriba. Sobre esta primer capa bioestable y/o biodegradable o hemocompatible es entonces posible en una etapa no compulsiva adicional c) para depositar una capa de agente de paclitaxel. En una modalidad preferida, paclitaxel se une covalentemente en la capa subyacente. También paclitaxel se deposita preferentemente mediante métodos de rociado o sumergimiento en y/o en la capa hemocompatible o la capa bioestable . Después de la etapa b) o la etapa c) una etapa adicional d) puede seguir, la cual implementa la deposición de al menos una capa biodegradable y/o al menos una capa bioestable sobre la resp. de capa hemocompatible, la capa de paclitaxel . De acuerdo a las modalidades alternativas después de la etapa b') o etapa c) una etapa d') puede seguir, la cual implementa la deposición de al menos un compuesto de la fórmula general 1 como capa hemocompatible en la resp. de capa biodegradable y/o bioestbale, la capa de paclitaxel. Preferentemente después del paso b') sigue la etapa d').
- 26 - Después de la etapa d) resp. d ) la deposición de placlitaxel puede tener lugar en y/o sobre la al menos capa bioestable y/o biodegradable o la capa hemocompatible. Las capas únicas así como también placlitaxel se depositan preferentemente y/o implementan mediante rociado o sumersión sobre y/o en la capa subyacente. De acuerdo a una modalidad preferida la capa bioestable se deposita en la superficie del dispositivo médico y se cubre completa o incompletamente con una capa hemocompatible que (preferentemente covalentemente) se une a la capa bioestable. Preferentemente, la capa hemocompatible comprende heparina de origen nativo de derivados regioselectivamente sintetizados de diferentes coeficientes de sulfación (grados de sulfación) y coeficientes de acilación (grados de acilación) en el rango de peso molecular del pentasacárido, que es responsable para la actividad antitrombótica , hasta el peso molecular estándar de la heparina que se puede comprar de 1 3 kD, heparansuifato y sus derivados, oligo y polisacáridos de glucocalix eritrocitico, heparina N-reacilada y desulfatada, quitosna N-carboximetilado y/o parcialmente N-acetilado así como también mezclas de estas substancias. Sujeto de la invención también son dispositivos médicos que se revisten hemocompatiblemente de acuerdo a uno de los métodos mencionados en la presente. En el caso de los dispositivos médicos es preferentemente una materia prótesis. Las prótesis convencionales, que pueden revestirse de acuerdo a los métodos inventivos, consiste de acero inoxidable, nitinol y otros metales y aleaciones o de polímeros sintéticos.
- 27 - Las prótesis de acuerdo a ia invención se reviste de acuerdo con la capa hemocompatible covalentemente unida preferida de la fórmula 1 . Una segunda capa cubre esta primer capa hemocompatible completamente o también incompletamente. Esta segunda capa conspira preferentemente paclitaxel. El revestimiento hemocompatible de una prótesis proporciona por un lado la compatibilidad sanguínea necesaria y reduce asi el riesgo de trombosis y también la contención de reacciones de inflamación debido la intrusión y la ausencia de una superficie no endógena, y paclitaxel, que se prefiere que se distribuya de manera homogénea sobre la superficie total de la prótesis proporciona que la cobertura de la superficie de la prótesis con las células, especialmente músculo liso y células endoteliales, tiene lugar en una manera controlada, de manera que el interjuego de reacciones de trombosis y reacciones de inflamación, la liberación de factores de crecimiento, proliferación y migración de células durante el proceso de recuperación proporciona la generación de una nueva capa celular "reparada", que se refiere como neoíntima . De esta manera, el uso de paclitaxel, covalentemente y/o adhesivamente unido a la capa subyacente y/o covalentemente y/o adhesivamente implementada en al menos una capa, asegura, que este agente activo se fija libre continuamente y en dosis pequeñas, de manera que la población de la superficie de la prótesis por las células no se inhibe, sin embargo, una población excesiva y el crecimiento interior de las células en el lumen del vaso se evita. Esta combinació de ambos efectos concede la habilidad a la prótesis de acuerdo a la invención , de desarrollarse rápidamente en la pared del vaso y reduce tanto el riesgo de restenosis - 28 -como el riesgo de trombosis. La liberación de paclitaxel se expande por un periodo de 1 a 12 meses, preferentemente 1 a 3 meses después de la implementación . Paclitaxel se contiene preferido en una concentración activa farmacéutica de 0.001 -1 0 mg por cm2 de superficie de prótesis, preferido 0.01 -5 mg y especialmente preferido 0.1 -1 .0 mg por cm2 de superficie de prótesis. Los agentes activos adicionales pueden contenerse en concentración similar en la misma o en la capa hemocompatible. Las cantidades aplicadas de polímero son por capa entre 0.01 mg a 3 mg, preferido 0.20 mg a 1 mg y especialmente preferido entre 0.2 mg a 0.5 mg . Tales prótesis revestidas liberan el agente activo, paclitaxel, controlado y continuamente y por lo tanto, son excelentemente adecuados para la prevención y reducción de restenosis. Estas prótesis con un revestimiento hemocompatible se generan, a medida que uno proporciona prótesis y depósitos preferidos covalentemente una capa hemocompatible de acuerdo a la fórmula general , que oculta la superficie del implante permanentemente después de la liberación del agente activo y así después la descomposición de la influencia del agente activo. La modalidad preferida de las prótesis de acuerdo a la invención muestra un revestimiento, que consiste de al menos dos capas. Así nombrada como segunda capa es esa capa, que se deposita en la primer capa. De acuerdo al diseño de dos capas, la primera capa conspira la capa hemocompatible, que substancialmente se cubre completamente por una segunda capa , que consiste de placlitaxel, que se une covalentemente - 29 -y/o adhesivamente a la primer capa. La capa de paclitaxel se disuelve lentamente, de manera que el agente activo se libera de acuerdo a la velocidad del proceso de solución. La primer capa hemocompatible garantiza la compatibilidad sangu ínea necesaria de ia prótesis en el grado a medida que el agente activo se remueve. Por la liberación del agente activo la adhesión de células se reduce fuertemente solamente por un cierto periodo de tiempo y una adhesión controlada , auxiliar se permite, en donde la capa externa se ha degradado ya ampliamente. Finalmente, la capa hemocompatible permanece como superficie atrombógena y oculta la superficie externa en tal manera, que no puede ocurrir más la reacción que amenaza la vida. Las prótesis pueden generarse por un método del revestimiento biocompatible de prótesis, a las cuales los siguientes principios se aplican: a. proporción de una prótesis b. deposición de una capa hemocompatible covalentemente unida , preferida c. cobertura substancialmente completa de la capa hemocompatible por un método de rociado o sumergimiento con el agente activo antriproliferativo , paclitaxel. Las prótesis de acuerdo a la invención resuelven tanto el problema de trombosis aguda como el problema de hiperplasia neoíntmia después de una implantación de prótesis. Además, las prótesis inventivas se estudian especialmente bien , debido a su revestimiento para la liberación continua de uno o más agentes activos inmunosupresores. Debido a esta - 30 -capacidad de la liberación de agente activo continuo, auxiliar en una cantidad requerida , las prótesis inventivamente revestidas previenen el peligro de restenosis casi completamente. Las superficies artificiales y/o naturales que se han revestido de acuerdo al método arriba descrito con una capa hemocompatible de polisacáridos arriba mencionados, son especialmente adecuados como partes de reemplazo de órgano de resp. de implantes, que están en contacto directo con el circuito sanguíneo y la sangre, preferentemente en la forma de prótesis en combinación con un agente activo antiproliferativo, preferentemente, paclitaxel, para la prevención de restenosis. Los dispositivos médicos inventivamente revestidos son adecuados especialmente pero no solamente para el contacto sanguíneo permanente y directo, pero muestran sorprendentemente también la característica de reducir o aún prevenir la adhesión de proteínas en tales superficies revestidas. La adhesión de proteínas de plasma en superficies externas que entran en contacto con la sangre es una etapa inicial y esencial para los eventos adicionales que conciernen al reconocimiento y la acción de implementación del sistema sanguíneo. Esto es por ejemplo importante en los diagnósticos in vitro de fluidos corporales. De esta manera, la deposición del revestimiento inventivo previene o al menos reduce, por ejemplo, la adhesión no específica de proteínas en placas de microconcentración u otros medios de soporte que se utilizan para métodos de detección de diagnóstico, esto perturba generalmente las reacciones de prueba sensibles y puede conducir a una falsificación del resultado del análisis.
- 31 - Por el uso del revestimiento de acuerdo a la invención en medios de absorción o medios de cromatografía, la adhesión no específica de proteínas también se previene o reduce, mediante lo cual mejores separaciones pueden lograrse y los productos de mayor pureza pueden generarse.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra una unidad de tetrasacárido de una heparina o heparansulfato con distribución estática de los grupos sulfato y un coeficiente de sulfación de 2 por unidad de disacárido como es típico para heparina (figura 1 a). Para comparación de las similitudes estructurales, figura 1 b, muestra un ejemplo de un compuesto de acuerdo a la fórmula general en la descripción. La figura 2 muestra la influencia de una prótesis coronaria de acero inoxidable modificada de superficie, expandido por tubo PVC en la pérdida de plaqueta (pérdida PLT). Una prótesis coronaria de acero inoxidable no revestida se mide como referencia. Como valor cero el nivel de la pérdida de plaqueta en caso del tubo PVC sin prótesis coronaria de acero inoxidable se fija . Así, SH1 es una prótesis covalentemente revestida de heparina, SH2 es una prótesis revestida de condroitinsulfato; SH3 es una prótesis revestida con polisacáridos obtenidos de glicocalix eritrocítico y SH4 es prótesis coronaria de acero inoxidable covalentemente revestida con Ac-heparina. La figura 3 muestra una presentación esquemática de la tasa de restenosis con prótesis covalentemente revestidas con heparina N- - 32 -reacetilada (Ac-heparina) y completamente desulfatada y con oligo y polisacáridos de prótesis revestidas de glicocalix eritrocítico (polisacárido de eritro glicoc.) en comparación con la prótesis no revestida y con prótesis revestidas de ácido poiiacrílico (PAS) después de 4 semanas de tiempo de implantación en el puerco. La figura 4 es angiografía coronaria cuantitativa; las imágenes de las secciones transversales a través del segmento de vaso que contiene la prótesis de una prótesis revestida de Ac-heparina (a.) y como comparación de una prótesis no revestida (unco) (b ). Después de cuatro semanas en el animal de experimento (puerco) una diferencia clara en el espesor de las neointimas formadas puede observarse. La figura 5 es un diagrama de elusión de paclitaxel de la prótesis (sin medio de soporte)
EJEMPLOS Ejemplo 1 Síntesis de heparina reacetilada desulfatada 100 mi resina de intercambio de catión de amberlita IR-122 se agregan en una columna de 2 cm de diámetro, con 400 mi de 3M HCI en la forma H+ convertida y enjuagada con agua destilada, hasta que el eluido estuvo libre de cloruro y pH neutral. 1 g de sodio-heparina se disuelve en 10 mi de agua, se agrega en la columna de intercambio de catión y eluye con 400 mi de agua. El eluido se agrega gota a gota en un receptor con 0.7 g de piridina y después se concentra con piridina a pH 6 y se liofiliza. 0.9 g de sal de heparina-piridinio se agregan en un matraz - 33 -redondo con un condensador de reflujo con 90 mi de una mezcla 6/3/1 de
DMSO/1 ,4-dioxan/metanol (v/v/v) y se calientan por 24 horas a 90°C.
Después de 823 mg de cloruro de piridinio se agregan y calientan adicionalmente 70 horas a 90°C. Después se diluye con 100 mi de agua y concentra con hidróxido de sodio diluido a pH 9. La heparina desulfatada se dializa contra agua y liofiliza . 100 mg de la heparina desulfatada se disuelven en 1 0 mi de agua, enfrían a 0°C y agregan con 1 .5 mi de metanol bajo agitación . A esta solución se agregan 4 mi de dowex 1 x4 resina de intercambio de anión en la forma de OH" y después 1 50 µ? de anh ídrido acético y se agita por 2 horas a
4°C. Entonces, la resina se remueve por filtración y la solución se dializa contra agua y liofiliza . Ejemplo 2 Síntesis de heparina N-propionilada desulfatada 1 00 mi resina de intercambio de catión de de amberlita IR-122 se agregan en una columna de 2 cm de diámetro , con 400 mi de 3M HCI en la forma H+ convertida y enjuagada con agua destilada , hasta que el eluido estuvo libre de cloruro y pH neutral. 1 g de sodio-heparina se disuelve en 10 mi de agua , se agrega en la columna de intercambio de catión y eluye con 400 mi de agua. El eluido se agrega gota a gota en un receptor con 0.7 g de piridina y después se concentra con piridina a pH 6 y se liofiliza . 0.9 g de sal de heparina-piridinio se agregan en un matraz redondo con un condensador de reflujo con 90 mi de una mezcla 6/3/1 de DMSO/1 ,4-dioxan/metanol (v/v/v) y se calientan por 24 horas a 90°C. Después de 823 mg de cloruro de piridinio se agregan y calientan - 34 -adicionalmente 70 horas a 90°C. Después se diluye con 100 mi de agua y concentra con hidróxido de sodio diluido a pH 9. La heparina desulfatada se dializa contra agua y liofiliza. 1 00 mg de la heparina desulfatada se disuelven en 1 0 mi de agua, enfrían a 0°C y agregan con 1 .5 mi de metanol bajo agitación . A esta solución se agregan 4 mi de dowex 1 x4 resina de intercambio de anión en la forma de OH" y después 192 µ? de anh ídrido propiónico y se agita por 2 horas a 4°C. Entonces, la resina se remueve por filtración y la solución se dializa contra agua y liofiliza. Ejemplo 3 Mediciones de hemocompatibilidad de compuestos de acuerdo a la fórmula general 1 por ISO 10933-4 (mediciones in vitro) Para la medición de la hemocompatibilidad de los compuestos de acuerdo con las membranas de celulosa de la fórmula 1 , tubos de silición y prótesis de acero inoxidable se revisten covalentemente con un compuesto de acuerdo con la fórmula 1 y prueban contra heparina así como también contra el correspondiente, en las pruebas únicas se utilizaron superficies de material sin revestir. 3.1 Membranas de celulosa (cuprofan) revestidas con heparina reacetilada, desulfatada (Ac-heprina) Para la examinación de las interacciones fisiológicas coaguladoras entre sangre total cifrada y las membranas de cuprofan revestido de heparina resp. de Ac-heparina, el sistema de perfusión abierta de la cámara Baumgartner modificada por Sakariassen se utiliza [Sakariassen K.S et al., J. Lab. Clin. Med. 1 02:522-535 (1983)]. La cámara - 35 -se compone de cuatro partes de construcción más uniones roscadas y agujas cónicas y se fabrica de polimetilmetacrilato y permite la investigación paralela dos membranas modificadas, de manera que en cada paso una cobertura estática se incluye. La construcción de esta cámara permite las condiciones de perfusión cuasi-laminar. Después de 5 minutos de perfusión a 37°C las membranas se extraen y después la fijación de las plaquetes adherentes, se mide la ocupación de plaqueta . Los resultados respectivos se establecen en relación con la matriz subendotelial altamente trombógena como negativa estándar con un 100% de ocupación de plaqueta . La adhesión de las plaquetas tiene ligar después antes de la formación de la capa de proteína de plasma en el material externo. El fibrinógeno de proteína de plasma actúa como cofactor de la agregación de plaqueta . Tal activación inducida de las plaquetas resulta en la unión de varias proteínas de plasma asociadas con coagulación, como por ejemplo, vitronectina , fibronectina y factor von Willebrand en la superficie de plaqueta. Por su influencia finalmente ocurre la agregación irreversible de las plaquetas. La ocupación de plaqueta presenta en las interacciones descrita una cantidad aceptada para la trombogenidad de superficies en caso del contacto de la superficie externa de la sangre. A partir del hecho de que la consecuencia se origina ; lo inferior de la ocupación de plaqueta está en la superficie prefundada, lo más alto es la hemocompatibilidad de la superficie examinada a juzgarse. Los resultados de las membranas revestidas de Ac-heparina y revestidas de heparina examinada muestran claramente la mejora de la - 36 -hemocompatibilidad de la superficie externa a través del revestimiento con heparina Ac. Las membranas revestidas de heparina muestran una ocupación de plaqueta de 45-65%, mientras que las superficies de heparina Ac muestran valores de 0-5% (referencia a matriz subendotelial con 1 00% de ocupación de plaqueta). La adhesión de las plaquetas en la superficie Ac-heparinada se agrava extremadamente debido a lo ausente, para la activación de plaquetas de proteínas de plasma esenciales. A pesar de esto, la superficie revestida de heparina con la absorción de proteínas de plasma inmediatamente incipientes ofrece precondiciones óptimas para activación , deposición y agregación de plaquetas, y por último la sangre reacciona con los mecanismos de defensa correspondientes a la superficie externa insertada. La Ac-heparina cumple más que la heparina los requerimientos a la hemocompatibiiidad de la superficie externa. La interacción de absorción de proteína de plasma y ocupación de plaqueta como cuanto dirigido para la trombogenidad de una superficie, en dependencia del revestimiento ofrecido por la sangre, se hace especialmente bien por esta prueba in vitro. De esta manera , la utilización de heparina covalentemente unida como superficie operativa antitrombótica se limita fuertemente o no es posible del todo. Las interacciones de heparina inmovilizada con sangre invierten ellas mismas la superficie revestida de heparina, opuesta, indeseada que se vuelve trombógena. Obviamente, la importancia del entendimiento de heparina como una antitrombótica no es transferible a heparina covalentemente inmovilizada. En la aplicación sistémica en forma disuelva puede desdoblar - 37 -completamente sus propiedades. Pero si la heparina no se inmoviliza covalentemente, sus propiedades antitrombóticas, si están todas, son solamente de vida corta . Diferente es la Ac-heparina heparina "sin afinidad"), que debido a la desulfación y N-reacetilación de hecho totalmente pierde las propiedades antitrombóticas activas de la molécula inicial , pero adquiere a su vez las propiedades atrombógenas distintivas, que se funda de manera demostrada en la pasividad contra antitrombina III t la falta de afinidad hacia los procesos de iniciación de coagulación y permanecen después de unión covalente. Así, la heparina Ac y de esta manera los compuestos de la fórmula general 1 en total son óptimamente adecuadas para el camuflaje de superficies externas en contacto con el sistema de coagulación. 3.2 Inmovilización en silicona A través de un tubo de silicón de 1 m de largo con 3 mm de diámetro interior, 100 mi de una mezcla de etanol/agua 1 /1 (v/v) se bombea en un movimiento circular por 30 minutos a 40°C. Después de 2 mi 3-(trietoxisilil)-propilamina se agregan y bombean en un movimiento circular por u n adicional de 1 5 horas a 40°C. Después se enjuaga en cada caso por 2 horas con 100 mi de etanol/agua y 100 mi de agua . 3 mg de la heparina deacetilada y heparina reacetilada (Ac-heparina) se disuelven a 4°C en 30 mi de 0.1 de regulador MES pH 4.75 y se mezcla con 30 mg CME-CID (N-ciclohexil-N'-(2- morfolinoetil)carbodiimidametil-p-toluenosulfonato). Esta solución se bombea en un movimiento circular por 1 5 horas a 4°C a través del tubo . Después se enjuaga con agua, 4 M de solución NaCI y agua en cada caso - 38 - por 2 horas. 3.3 Determinación del número de plaqueta (EN30993-4) En un tubo de silicona de 1 m de largo con 3 mm de diámetro interior dos tubos de vidrio que se ajustan a la forma de 2 cm de largo se colocan. Después, el tubo se cierra con un entubado que se encoge a un círculo y se llena bajo exclusión de aire a través de las jeringas con una 0. 1 54 de solución NaCI. Al hacer esto una jeringa se utiliza para llenarla con la solución y la jeringa exterior se utiliza para remover el aire . La solución se intercambia bajo exclusión de aire (libre de burbuja) con las dos jeringas contra sangre total citrada de una persona prueba saludable. Entonces los agujeros de espacio de las jeringas se cierran al empujar los tubos de vidrio sobre ellos y el tumo se sujeta en una bomba de diálisis. La sangre se bombea por 1 0 minutos con una velocidad de flujo de 1 50 ml/min . El contenido de plaqueta de la sangre se mide antes y después de la perfusión con un contador coulter. Para tubos de silicona sin revestir la pérdida de plaqueta fue de 10%. En contraste la pérdida fue en los tubos de silicón, que se revisten de acuerdo al ejemplo 5.2, en promedio 0% (nú mero de experimentos: n=3). También en este sistema de prueba dinámico se muestra , que la activación de plaquetas en una su perficie revestida de Ac-heparina se reduce. Simultáneamente, puede registrarse, que la inmovilización de heparina ejecuta un efecto negativo en la hemocompatibilidad de la superficie utilizada. Contra esto Ac-heparina no muestra, de acuerdo a su natu raleza pasiva , efectos en contacto con las plaquetas. 3.4 Experimentos de sangre total en prótesis coronarias de acero - 39 -inoxidable 316 LVM En línea con los experimentos de biocompatibilidad las prótesis de acero inoxidable 316 LMV de 31 mm de largo se revisten covalentemente con Ac-heparina. En caso de una superficie total de 2 cm2 y un coeficiente de ocupación de aproximadamente 20 pm/cm2 de superficie de prótesis la carga de tal prótesis es aproximadamente 0.35 µg de Ac-heprina . Como comparación, en caso de profilaxis de trombosis la tasa de aplicación diaria usual de heparina es en contraste 20-30 mg y de esta manera correspondería a al menos 60.000 veces el valor. Estos experimentos se llevan a cabo con el sistema de ciclo
Chandler hemodinámico establecido [A. Henseler, B. Oedekoven, C. Anderson, K. Mottaghy; KARDIOTECHNIK 3 (1 999)] . Las prótesis revestidas y no revestidas se expanden y se prueban en tubos PVC (PVC de grado médico) con 600 mm de longitud y 4 mm de diámetro interior. Los resultados de estos experimentos confirman lo anterior a los tubos de silicona tratados en los experimentos. Lo inicial a la pérdida de plaqueta atribuida a la prótesis en la perfusión de 50% se reduce por el refinamiento de la superficie de prótesis con Ac-heparina por más del 80%. La influencia en el tubo expandido, de las prótesis coronarias de superficie modificada por la pérdida de plaqueta se evalúa además en pruebas Chandler durante una perfusión de sangre total de 45 minutos. Para esto principalmente el tubo PVC libre de prótesis se analiza, el resultado de esto es el valor cero. El tubo vacío muestra una pérdida de plaqueta promedio de 27.4% considerando la sangre del donador a una aberración estándar de solamente 3.6%. Este valor base subrayado en - 40 -diferentes prótesis de superficie modificada se expande en los tubos PVC y se analizan bajo condiciones análogas casando la pérdida de plaqueta . Ocurre también en este caso, que la superficie cubierta con la prótesis, que solamente considera aproximadamente 0.84% de la superficie de prueba total, causa un efecto reproducible y significativo en el contenido de plaqueta. De acuerdo al tubo vacío (valor base) el análisis de la prótesis química no revestida en la superficie, pulida produce una pérdida de plaqueta promedio adicional de 22.7%. Con lo mismo se causa que se compare con el tubo vacío PVC menor a 1 % de superficie externa medible, una pérdida de plaqueta comparable. Un resultado director es que el acero inoxidable medicinal 316 LMV utilizado como material de prótesis induce aproximadamente 1 00 veces daño de plaqueta más fuerte en comparación con una superficie PVC de grado médico, aunque esta superficie de prueba solamente considera 0.84% de la superficie total . Los revestimientos de superficie analizados en las prótesis coronarias de acero inoxidable muestran que son capaces de reducir muy claramente las enormes dimensiones del daño de plaqueta inducido por prótesis (ver fig . 2). Como se prueba más efectivo con 81 .5% de Ac-heparina (SH4). En los efectos de las prótesis revestidas con Ac-heparina en la pérdida de plaqueta se considera entonces que resultan buenos valores congruentes. La correlación de la pérdida de plaqueta en la resp. de perfusión, la adhesión de las plaquetas a las superficies ofrecidas, muestra la confiabilidad de las mediciones. 3.4. 1 Revestimiento hemocompatible covalente de prótesis - 41 - Prótesis no expandidas de acero inoxidable medicinal 31 6 L V se desgrasasan en baño ultrasónico por 1 5 minutos con acetona y etanol y se secan a 100°C en el closet cerrado. Entonces se sumergen por 5 minutos en un 2% de solución de 3-aminopropiltrietoxisilno en una mezcla de etanol/agua (50/50: (v/v)) y después se secan por 5 minutos a 1 00°C. Después, las prótesis se enjuagan con agua desmineralizada durante la noche. 3 mg de heparina reacetilada y desulfatada se disuelven a 4°C en 30 mi 0.1 M regulador MES (2-(IM-morfolino)ácido etano sulfónico) pH 4.75 y se mezcla con 30 mg N-ciclohexil-N'-(2-morfolinotil)carbodiimida-metil-p-toluenosulfonato. En esta solución 10 prótesis se agitan por 1 5 horas a 4°C . Después se enjuagan con agua, 4M de solución NaCI y agua en cada caso por 2 horas. 3.4.2 Determinación del contenido de glucosamina de las prótesis revestidas por HPLC. Hidrólisis: Las prótesis revestidas se dan en tubos de hidrólisis pequeños y se abandonan con 3 mi 3 M HCI por exactamente un minuto a temperatura ambiente. Las sondas de metal se remueven y los tubos se incuban hasta enfriarse , evaporan tres veces hasta secarse y toman 1 mi de agua filtrada y desgasada y se miden contra un estándar también hidrolizado en HPLC.
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Ejemplo 4 Examinación in vivo de prótesis coronarias revestidas (fig . 5) 4. 1 Examinaciones in vivo de prótesis coronarias revestidas con Ac- heparina Debido a los datos de hemocompatibilidad, que Ac-heparina prod uce en los experimentos in vitro, la adecuación de la superficie de heparina Ac como revestimiento atrombógeno de prótesis de metal se trata in vivo (experimento animal). El objeto de los experimentos fue principalmente evaluar la influencia del revestimiento de heparina Ac en la reacción de vaso inducida por prótesis. A pesar del registro de eventos trombóticos posibles, los parámetros releva ntes para procesos restenóticos como área neoíntima , lumen de vaso y grado de estenosis se registran . Para las examinaciones se utilizan puercos de 6-9 meses de edad, u no para vasodilatación de prótesis por un tiempo largo establecido y aprobado del modelo animal. Como se espera en estos experimentos n inguno de los casos trombóticos posteriores, subagudos ni agudos se registran , lo que puede valorarse como prueba para las propiedades atrombógena de Ac-heparina . Después de cuatro sema nas, los animales se despachan - 43 - (eutanizan), los segmentos de arteria coronaria con prótesis se extraen y se analizan histomorfométricamente. Las indicaciones a una toxicidad subcrónica o aguda posible, reacciones de alergia o irritaciones ulteriores como consecuencia de la implantación de prótesis revestidas con Ac-heparina, no se observan durante la fase experimental completa, especialmente en la examinación histológica. Durante la implantación de prótesis asi como también ios conjuntos de datos coronarios-angiográficos se aciertan , lo que permite una interpretación con respecto a la reacción del vaso con la implantación de la prótesis. La diferencia entre la prótesis de control sin revestir y la prótesis revestida de Ac-heparina es inambigua. La generación de una capa neoíntima distintita es en el caso de la prótesis de control sin revestir muy bien observada. Ya después de cuatro semanas, el efecto promocional de proliferación de la superficie prótesis no revestida en el tejido circundante ocurre en tal grado, que por último el peligro de la oclusión del vaso en el área de prótesis se da . Contrario en el caso de prótesis revestidas de Ac-heparina una capa neoíntima claramente más delgada se observa, lo que argumenta un crecimiento interior bien modulado de la prótesis bajo mantenimiento de un lumen de vaso libre, amplio. Los datos angiográficos coronarios e histomorfométricos detallados substancian esta conclusión, como puede observarse congruentemente, que a través del revestimiento de Ac-heparina (SH4) la hiperplasia neoíntima ("restenosis") se representa por aproximadamente 17-20% en comparación con la prótesis de control no revestida. Este resultado - 44 -es inesperado y remarcablemente al mismo tiempo. De manera segura no se demanda de una superficie atrombógena para tener una influencia también en procesos que conducen a una hiperplasía neoíntima, es decir, para prevenir la restenosis, además a la preposición de características hemocompatibles. Por el otro lado con una ocupación permanente densa de la superficie de prótesis con Ac-heparina un contacto de célula directa a la superficie de metal se previene. Como en la literatura técnica la emisión de ciertos iones metálicos en el tejido próximo al implante se trata cono una razón probable de restenosis, una potencia anti-restenócio podría encontrarse por uno de la prevención causada por revestimiento de un contacto de metal directo. Por el otro lado, tal efecto secundario positivo es pausado, debido a la superficie de prótesis atrombógena pasiva con la ausencia de una agregación de plaqueta también los efectos proliferativos de los factores de crecimiento así liberados están por perderse . De esta manera, un inicio importante del efecto de lumen , estímulo de la proliferación neoíntima se omite. Ejemplo 3 Revestimiento de las prótesis con taxol por el método de rociado La vía del ejemplo 1 y ejemplo 2 preparado como prótesis no expandidos se balancena y cuelgan horizontalmente en una barra de metal delgada (d=0.2 mm), que se pega en el eje de rotación de la rotación y equipo de alimentación y gira con 28 r/min. Las prótesis se fijan de esa manera, que el interior de las prótesis no toca la barra . Una amplitud de - 45 -alimentación de 2.2 cm y una velocidad de alimentación de 4 cm/s y una distancia de 6 cm entre la prótesis y la válvula rociadora, la prótesis se rocía con la solución de rocío particular. Después de secar (aproximadamente 1 5 minutos) a temperatura ambiente y próxima al humo durante la noche se equilibra de nuevo. Fabricación de la solución de rocío: 44 mg de taxol se disuelven en 6 g de cloroformo
Ejemplo 6 Determinación de la conducta de elusión en regulador PBS Por prótesis en un matraz suficientemente pequeño 2 mi de regulador PBS-se agrega, sella con para-película e incuba en el closet de secado a 37°C. Después de expirar de los intervalos de tiempo elegidos en cada caso, la solución en exceso se detuba y su absorción UV a 306 nm se mide.