MX2011003180A - Metodo para cultivar celulas, propagar y purificar virus. - Google Patents

Abstract

Se presenta un medio de cultivo de células libre de suero novedoso y métodos para cultivar células MDCK, en particular, células MDCK no tumorigénicas. Se proveen métodos para producir virus de la influenza (v. gr., particularmente virus de la influenza adaptados al frío, y/o sensibles a la temperatura, y/o atenuados) que eliminan la necesidad de un paso de intercambio de medio de cultivo de células. El medio y métodos novedosos son útiles para hacer crecer virus, en cultivo de células a título alto. La presente invención además provee métodos de purificación para purificar virus de la influenza con recuperación global alta de virus vivos y da por resultado niveles de ADN de células hospederas (HCD), proteína de células hospederas (HCP) y endonucleasa no específica (V. GR., Benzonase), que están por debajo de las especificaciones requeridas por las agencias reguladoras.

Description

METODO PARA CULTIVAR CELULAS, PROPAGAR Y PURIFICAR VIRUS Campo de la Invención La presente invención se refiere a un medio de cultivo de células novedoso y métodos para cultivar células, en particular células MDCK no tumorigénicas . La presente invención además se refiere a métodos para producir virus (v.gr., influenza, RSV) en cultivo de células. La presente invención también provee métodos para la purificación de virus asociados con células de céjlulas adherentes que crecen en un biorreactor para el desarrollo de vacunas.

Antecedentes de la Invención La vacunación es la medida de salud pública más importante para prevenir enfermedad causada por infección viral . El uso efectivo de vacunas depende de poder producir rápidamente grandes cantidades de material de vacuna (v.gr., virus) de una fuente estable y fácil de cultivar. El desarrollo rápido de vacunas y su abundante disponibilidad es crítico en el combate de muchas enfermedades humanas y de animales. Los retrasos en la producción de vacunas y déficit en su cantidad pueden causar problemas para hacer frente a brotes de enfermedad. Por ejemplo, estudios recientes sµgiere que existe causa de preocupación con respecto a los tiempos largos requeridos para producir vacunas contra influenza pandémica. Véase, por ejemplo, Wood, J. M . , 2001, Philos.

Ref.218955 Trans . R. Soc . Lond. B. Biol . Sci, 356:1953. Por consiguiente, esfuerzos recientes para producir vacunas se han enfocado en el crecimiento de virus para vacunas en cultivo de células.

Virus de la Influenza En particular, el uso de células Madin Darby Canine Kidney (riñon de canino Madin Darby) (MDCK, por sus siglas en inglés) ha sido seguido por un número de grupos. Véase, por ejemplo, U.S. 6,455,298; U.S. 2005/0118140; U.S. 2005/0118698; U.S. 6,825,306; WO2005/113758 ; y Radaeva, I. F., et al. Vopr. Virusol. (2005) 50: 43-6. Sin embargo, muchas de las líneas de células MDCK existentes adolecen de uno o más defectos que incluyen tumorigenicidad, el requerimiento de suero de animal en cultivo de células, y bajos rendimientos de virus de la influenza adecuados para usarse en vacunas. Además, muchos de los procesos de cultivo de células que han sido desarrollados para la producción de material de vacuna de estas líneas de células a menudo requieren numerosas manipulaciones que incluyen pasos de intercambio de medio y el uso de grandes cantidades de virus para inoculación. Además, debido a la emergencia continua (o re-emergencia) de diferentes cepas de influenza, nuevas vacunas contra la influenza son generadas cada temporada con base en las cepas de influenza circulantes. Infortunadamente, alguna vacuna contra las cepas de influenza es más difícil de hacer crecer a altos rendimientos. El rendimiento de cada lote de material derivado de cultivo de células no sólo define la capacidad de producción sino también tiene impacto en el costo de fabricación del producto por lo que es deseable la mejora del rendimiento viral (es decir, título viral pico) .

Recientemente, medio libre de suero novedoso y líneas de células no tumorigénicas que pueden hacer crecer cepas de vacunas a títulos muy altos y procesos para la producción de material viral en biorreactores desechables se han desarrollado (véase, U.S. 2006/0188977; y U.S.S.N. 11/855,769 presentada el 14 de septiembre de 2007) . La presente invención expande este trabajo y provee medio de cultivo de células novedoso, procesos escalables eficientes altamente reproducibles para la producción de grandes cantidades de material de vacuna en biorreactores de células MDCK, en particular, líneas de células no tumorigénicas, sin la necesidad de intercambio de medio, y procesos de purificación corriente abajo robustos para la producción de una vacuna atenuada viva altamente purificada. Los métodos provistos por la presente invención son robustos y requieren manipulación mínima y son efectivos en cuanto a costos.

Virus de Sincicio Respiratorio (RSV) El virus de sincicio respiratorio (RSV, por sus siglas en inglés) humano es la causa principal de infección del tracto respiratorio inferior (LRTI) en bebés y niños pequeños y es responsable de morbidez y mortalidad considerables. Un total de 18 millones de personas son infectadas cada año en los siete mercados más importantes (E.U.A., Japón, Francia, Alemania, Italia, España, R.U.), los cuales incluyen tres millones de adultos y casi 400,000 bebés prematuros. Anualmente, sólo en los E.U.A., se estima que 70,000-125,000 hospitalizaciones son atribuidas a LRTI por RSV. Dos subgrupos de RSV A y B antigénicamente diversos están presentes en poblaciones humanas. El RSV es también reconocido como un agente importante de infección en adultos inmuno-comprometidos y en personas de edad avanzada. Debido a la resistencia incompleta a reinfección por RSV inducida por infección natural, el RSV puede infectar múltiples veces durante la niñez y la vida. La meta de inmunoprofilaxis de RSV es inducir suficiente resistencia para prevenir la enfermedad severa que puede estar asociada con infección por RSV. Las estrategias actuales para desarrollar vacunas contra RSV principalmente giran en torno a la administración de antígeno viral purificado o el desarrollo de RSV atenuados vivos para administración intranasal . Sin embargo, hasta la fecha ño ha habido vacunas aprobadas para RSV.

El AR genómico viral no es infeccioso como AR desnudo. El genoma del ARN de RSV es herméticamente encapsulado con la mayor proteína de nucleocápside (N) : y está asociado con la fosfoproteína (P) y la subunidad de polimerasa grande (L) . Estas proteínas forman el núcleo de la nucleoproteína, que es reconocido como la unidad mínima de infectividad (Brown et al., 1967, J. Virol . 1: 368-373).

A pesar de décadas de investigación, no se ha desarrollado una vacuna contra RSV comercialmente disponible segura y efectiva para la prevención de morbidez y mortalidad severas asociada con infección de RSV. Una vacuna de virus inactivado con formalina ha fracasado en proveer protección contra infección de RSV y de hecho conduce a síntomas exacerbados durante infección subsecuente por el virus de tipo silvestre en bebés (Kapikian et al., 1969, Am. J. Epidemiol . 89:405-21; Chin et al., 1969, Am. J. Epidemiol. 89:449-63). Desde entonces, los esfuerzos se han enfocado en el desarrollo de mutantes atenuados vivos obtenidos por métodos recombinantes , mutagénsis química y pasada por frío del RSV de tipo silvestre para mutantes sensibles a la temperatura (Gharpure et al., 1969, J. Virol. 3: 414-21; Crowe et al., 1994, Vaccine 12: 691-9). Sin embargo, la purificación de virus atenuados vivos de sus proteínas asociadas a células, que cumpliría con los lineamientos reguladores para tratamiento profiláctico eficaz de infección de RSV, ha probado ser evasiva hasta ahora.

De manera similar al virus de la influenza, RSV se hace crecer en una línea de células estable en donde-el virus está estrechamente asociado con la célula hospedera, lo que hace difícil de purificar el virus de las proteínas asociadas a células mientras mantiene una unidad mínima de infectividad . Como adición a la complejidad, el RSV es frágil (v.gr., sensible al esfuerzo cortante) . Estos factores, en los que el virus está predominantemente asociado con la célula hospedera y es frágil, han hecho difícil purificar el virus del extracto de la célula hospedera (v.gr., ADN y proteínas) mientras da por resultado una composición inmunogénica clínicamente aceptable que comprende virus atenuados vivos. Es por estas razones, en parte, por qué no hay vacunas comercialmente disponibles para RSV. Por consiguiente, no hay necesidad de un proceso de purificación que se pueda usar para purificar RSV y otros virus asociados con células para la preparación y formulación de composiciones inmunogénicas .

Sumario de la Invención La presente invención provee un medio de cultivo de células libre de suero y procesos escalables eficientes altamente reproducibles para la producción de grandes cantidades de material de vacuna en biorreactores , que incluyen biorreactores de un solo uso y biorreactores reutilizables estándares (v.gr., biorreactores de acero inoxidable y recipiente de vidrio) .

En un aspecto, la presente invención provee un medio de cultivo de células libre de suero enriquecido que soporta la proliferación de células MDCK (v.gr., células MDCK no tumorigénicas) a una alta densidad de células y elimina la necesidad de un paso de intercambio de medio para obtener títulos virales altos.

En particular, la presente invención provee métodos para la replicación de virus de la influenza (v.gr., adaptados al frío, y/o sensible a la temperatura, y/o atenuado) en células MDCK a título alto, v.gr. , un logio TCID50/mL y/o un logio FFU/mL de por lo menos aproximadamente 7.4, o por lo menos aproximadamente 7.6, o por lo menos aproximadamente 7.8, o por lo menos aproximadamente 8.0, o por lo menos aproximadamente 9.0, o por lo menos aproximadamente 10.0 sin un paso de intercambio de medio antes de la infección.

En otro aspecto, la presente invención provee métodos mejorados para la propagación de células no tumorigénicas en microportadores que incluyen métodos de transferencia esfera a esfera. En otro aspecto, el medio de cultivo de células libre de suero enriquecido de la invención mantiene las características no tumorigénicas de células MDCK no tumorigénicas usadas para la inoculación inicial. En otros aspectos, el medio de cultivo de células libre de suero enriquecido de la invención se usa para establecer y mantener líneas de células MDCK no tumorigénicas.

En otro aspecto, la presente invención provee métodos para purificar virus vivos asociados con células (v.gr., influenza, RSV) de células adherentes que crecen en cultivo de células (v.gr., cultivo de células MDCK Vera) que dan una recuperación global de virus de por lo menos 30%, en donde el virus purificado comprende menos de 0.1 ng de HCD, y menos de 0.3 g de HCP, y menos de 0.0050 ng de nucleasa no específica por 7.0±0.5 logi0 FFU de virus.

Breve Descripción de las Figuras La figura 1 es una gráfica de la densidad de células viables (VCD) y viabilidad de la célula (V%) en biorreactores 4x 2L del día 0 al día 4 de cultivo. Los biorreactores se cultivaron mediante el uso de las condiciones de proceso del reactor de siembra (SR) detallado en la tabla 7. Los datos de 2dps para SR 4 no están disponibles.

La figura 2 muestra fotografías (tomadas a amplificación de 10X) tomadas en tiempos de muestreo intermedios entre 0 y 40 minutos para reactores de siembra 3x 2L (SR) para experimento 1, 3 y 4 durante tripsinización B2B. La tripsinización realizada en biorreactores por el protocolo de transferencia esfera a esfera.

La figura 3 es una gráfica de la densidad de células viables (VCD) y viabilidad de la célula (V%) en reactores de producción final 12x 2L (FPR) . Los biorreactores del experimento 3 (FPR3.X.X) fueron infectados en 5 dps (-120 hps) y los de otros experimentos infectados en 4 dps . Después de la infección, los datos de VCD y viabilidad de la célula para el experimento 4 no estaban disponibles.

La figura 4 muestra fotografías (tomadas a amplificación de lOOx) tomadas a 4dps para reactores de producción final 12x 2L para todos los experimentos.

La figura 5 muestra fotografías (tomadas a amplificación de lOOx) tomadas en 3 dpi para reactores de producción final 9x 2L (FPR) para todos los experimentos.

La figura 6 muestra una gráfica de títulos de virus ca A/Uruguay (AAJ) , ca A/South Dakota (A/S) y ca B/Florida (B/F) en el tiempo para las células que crecieron originalmente en reactores de siembra 4x2L y después se cultivaron seguido por infección en reactores de producción final 12x 2L (FPR) para todos los experimentos. Nota: cada punto de datos representa el promedio de tres réplicas de prueba. Los títulos de virus por abajo del límite de detección (< 6.4 logio FFU/mL o < 2.4 logi0 FFU/mL si se están diluidos) no se registran.

Las figuras 7A-7B muestran perfiles de producción de virus en el tiempo para las cepas producidas mediante el uso del proceso de 67% de intercambio de medio (67% MX) versus procesos sin intercambio de medio (0% MX) . Gráficas para cepas ca A/ isconsin/67/05 y ca A/Uruguay se muestran en la figura 7A, paneles izquierdo y derecho, respectivamente, gráficas para ca A/South Dakota y ca B/Florida se muestran en la figura 7B, paneles izquierdo y derecho, respectivamente.

Las figuras 8A-8B presentan diagramas de flujo de un proceso de transferencia esfera a esfera. El proceso ilustrado en la figura 8A utiliza dos pasos de lavado cada uno de los cuales utiliza una solución de sal con pH regulado (DPBS) que comprende un agente quelatador (EDTA) y una proteasa (TrypLE™) a una concentración final de sólo 0.05X que efectúa desprendimiento de células dentro de -30 minutos. El proceso ilustrado en la figura 8B utiliza 2-3 pasos de lavado que utilizan una solución de sal con pH regulado (DPBS) seguido por incubación con un agente quelatador (EDTA) a una concentración final de -0.5 mM que efectúa desprendimiento de células dentro de -60 minutos en ausencia de cualquier proteasa.

Las figuras 9A-9B. presentan el filtro y aparejos de tubo usados para el filtro de filtración de flujo directo (DFFl) (parte superior de la figura 9A) , los aparejos de tubo de patín GE Healthcare Uniflux (parte inferior de la figura 9A) , los aparejos de tubo de patín GE Healthcare AKTAprocess (parte superior de la figura 9B) , y el anillo de filtro de filtración de flujo directo 2 (DIFF2) (parte inferior de la figura 9B) .

Las figuras 10A-10B presenta el esquema del proceso de purificación inicial la en paralelo con el proceso de purificación mejorado Ib en la figura 10A. Modificaciones adicionales se detallan en el esquema presentado en la figura 10B. Los detalles de cada proceso se proveen en los ejemplos 3 y 4.

La figura 11 presenta la curva de rastro de flujo de operación #8 de TFF1.

La figura 12 presenta las características de flujo de presión de columna BPG 100 y BPG 200 CS .

La figura 13 presenta el cromatograma de elución de columna CS de operación #9.

La figura 14 presenta la curva de rastreo de flujo del proceso de operación #8 TFF2 8XDF.

La figura 15 presenta una gráfica de las células viables por mL (símbolos rellenos/líneas sólidas) y el por ciento de viabilidad (símbolos abiertos/líneas discontinuas) durante aproximadamente 432 horas de cultivos para células serialmente divididas y propagadas en ausencia de proteasa (diamantes y cuadros) , células serialmente divididas y propagadas mediante el uso de mezcla de EDTA/proteasa (triángulos) , y células independientemente divididas y propagadas mediante el uso de métodos de proteasa estándares (círculos) .

La figura 16 presenta gráficas de los títulos de ca A/ isconsin/67/07 (superior) , ca B/Malaysia/2506/04 (inferior) obtenidos de cada paso de células serialmente divididas y propagadas en ausencia de proteasa (diamantes y cuadros) , células serialmente divididas y propagadas mediante el uso de mezcla de EDTA/proteasa (triángulos) , y células independientemente divididas y propagadas mediante el uso de métodos de proteasa estándares (cuadros abiertos) . Las gráficas muestran que los títulos de por lo menos 8.0 log10 FFU/mL se obtienen mediante el uso de células divididas y propagadas por el proceso de ausencia de proteasa y el proceso de EDTA/proteasa.

Las figuras 17A-17B presentan gráficas de las células viables por mL (símbolos rellenos/líneas sólidas) y el por ciento de viabilidad (símbolos abiertos/líneas discontinuas) para tres operaciones de simulación de producción (figura 17A y figura 17B, superior) . Incluido en cada gráfica está el reactor (es) de siembra, operación (es) de reactor de producción de simulación mediante el uso de ATF y operación (es) de producción de control no mediante el uso de ATF. También en la figura 17B (inferior) se presenta una gráfica de los títulos de ca B/Malaysia/2506/04 obtenidos durante dos operaciones de simulación de producción que muestran que los títulos son comparables para operaciones realizadas mediante el uso de ATF y sin ATF.

La figura 18 presenta fotografías de fluidos removidos de biorreactores mediante el uso del proceso! de ATF que muestra que están libres de microportadores . El panel izquierdo muestra el lavado de microportador removido mediante el uso de ATF durante esterilización de microportador, el panel derecho muestra el medio removido mediante el uso de ATF durante el paso de intercambio de 66% de medio de cultivo de células MDCK.

Las figuras 19A-19D presentan los cromatogramas de elución de operaciones de columna de resina de prueba A-D con elución de NaCl 1 M (figuras 19A-19D, respectivamente) . Estos cromatogramas muestran que las resinas de prueba de las figuas 19A y 19B parecieron mostrar picos de elución múltiples separados que tenían un pico más pequeño (véase flecha en la figura 19B) mientras que las resinas de prueba de las figuras 19C y 19D mostraron un solo pico con espaldones de pico y características heterogéneas (véase flecha en la figura 19D) .

Las figuras 20A-20B presentan los cromatogramas de elución de las operaciones de columna de resina de prueba C y D con elución de NaCl 2 M (figuras 20A y 20B, respectivamente) , que muestra que el pico de elución fue agudizado mediante el uso de una elución de NaCl 2 M.

Las figuras 21A-21C presentan los cromatogramas de elución de operaciones de columna de resina de prueba C para ca A/Wisconsin, ca A/Solomon Islands y ca B/Malaysia, figuras 21A, 21B y 21C, respectivamente, que muestra que los perfiles de pico son similares y consistentes.

Las figuras 22A-22C presentan los cromatogramas de elución de operaciones de columna. Las figuras 22A y 22B muestran la elución para ca A/Wisconsin, y ca B/Malaysia, respectivamente, para columna de resina de prueba D que muestra que los perfiles pico son similares y consistentes. La figura 22C muestra los cromatogramas de pico de elución de resina de prueba D a escala de columna XK-50.

Las figuras 23A-23F presentan fotografías de cultivos de células de la figura 23A células no tratadas, y células tratadas durante 60 minutos con la figura 23B; 0.5 mM de EDTA, la figura 23C 1 mM de EDTA, la figura 23D 2 mM de EDTA, la figura 23E 5 mM de EDTA y la figura 23F 10 mM de EDTA.

Las figuras 24A-24F presentan fotografías de cultivos de células de células pre-tratadas con 2 mM de EDTA, seguido por tratamiento con 0.0125X TrypLE (figuras 24A y 24D) , 0.025X TrypLE (figuras 24B y 24E) y 0.05X TrypLE (figuras 24C y 24F) . Las fotografías se tomaron a 0 minutos después de la adición de TrypLE (figuras 24A, 24B y 24C) y nuevamente a 60 minutos después de la adición de TrypLE (figuras 24D, 24E y 24F) .

Descripción Detallada de la Invención La presente invención provee procesos escalables eficientes altamente reproducibles para la producción de grandes cantidades de virus (v.gr., virus de la influenza o RSV) o antígeno viral para uso profiláctico, de diagnóstico, inmunoterapéutico o terapéutico en biorreactores de células adherentes (v.gr., células MDCK, en particular, líneas de células no tumorigénicas o células Vero) . En particular, la presente invención provee métodos robustos para la producción de virus de la influenza o de sincicio respiratorio adaptados al frío, y/o sensibles a la temperatura, y/o atenuados, a título alto que no requieren ningún intercambio de medio.

Además, la presente invención provee un medio de cultivo que soporta el cultivo de células MDCK (v.gr., células MDCK no tumorigénicas) y soporta la replicación de virus que incluyen, pero no se limitan a virus de la influenza (v.gr., virus de la influenza adaptados al frío, y/o sensibles a la temperatura, y/o atenuados) a título alto sin la necesidad de ningún intercambio de medio.

Además, la presente invención también provee métodos de preparación de material de vacuna (v.gr. , virus de la influenza) de células MDCK (v.gr., células MDCK no tumorigénicas) , y métodos de prevención de infección por influenza al utilizar material de vacunas producidos en células MDCK. Ningún virus asociado con células (v.gr. influenza y RSV) puede ser purificado por un proceso descrito en la presente y/o contenido en una composición inmunogénica descrito en la presente. Como se usa en la presente, "un virus asociado con células" se refiere a un virus en el cual aproximadamente 60% o más del título del virus se encuentra asociado con células infectadas con virus adherentes como se determina por cualquier técnica conocida por un experto en la técnica. Los métodos de la invención son particularmente útiles para la producción de cepas de influenza adaptadas al frío/sensibles a la temperatura/atenuados {ca/ts/att) (v.gr., aquellos en FluMist8) y RSV (v.gr., rA2cp248/404/l030ASH) .

Viruses que pueden crecer en células MDCK no tumorigénicas y/o células Vera incluyen pero no se limitan a virus de ARN de cadena negativa, que incluyen pero no se limitan a virus de la influenza, RSV, virus de la parainfluenza 1, 2 y 3, y metapneumovirus humano, así como otros virus, que incluyen virus de ADN, retrovirus, virus de ARN de cadena positiva, virus de ARN de cadena negativa, virus de ARN.de doble cadena, que incluyen pero no se limitan a papovavirus, virus de estomatitis vesicular, virus de vaccinia, Coxsackievirus, reovirus, parvovirus, adenovirus, virus de poliomielitis, virus del sarampión, virus de la rabia y virus de herpes.

Definiciones La tumorigenicidad, como se usa en la presente, tiene el significado ordinario atribuido a este término por un experto en la técnica. La tumorigenicidad es, en una modalidad, determinada por el modelo de ratón sin pelo: adulto (v.gr., Stiles et al., 1976, Cáncer Res, 36:1353, y ejemplo 5 más adelante) .

La tumorigenicidad también puede ser probada por otros ensayos, por ejemplo, por inyección en un embrión de pollo y/o aplicación tópica al corioalantoides (Leighton et al., 1970, Cáncer, 26:1024).

El término "recombinante" indica que el material (v.gr., un ácido nucleico o proteína) ha sido artificialmente o sintéticamente (no naturalmente) alterado por intervención humana .

La alteración se puede realizar en el material dentro de, o removido de, su ambiente o estado natural. De manera específica, cuando se refiere a un virus, v.gr., un virus de la influenza, el virus es recombinante cuando es producido por la expresión de un ácido nucleico recombinante. Un virus recombinante además puede incorporar una ' o más mutaciones introducidas en el genoma. Un virus recombinante también puede ser un virus rearreglados cuando comprende componentes derivados de más de una cepa viral progenitora.

El término "rearreglo", cuando se refiere a un virus, indica que el virus incluye componentes genéticos y/o polipéptidos derivados de más de una cepa o fuente viral progenitora. Por ejemplo, un rearreglo de 7:1 incluye 7 segmentos genómicos virales (o segmentos de gen) derivados de un primer virus progenitor, y un solo segmento genómicó viral complementario, v.gr., que codifica hemaglutinina o neuraminidasa, de un segundo virus progenitor. Un rearreglo de 6:2 incluye 6 segmentos genómicos, muy comúnmente los 6 genes internos de un primer virus progenitor, y dos segmentos complementarios, v.gr., hemaglutinina y neuraminidasa, de un virus progenitor diferente.

El término "aproximadamente," como se usa en la presente, a menos que se indique otra cosa, se refiere a un valor que es no más de 10% por arriba o por abajo del valor que es modificado por el término. Por ejemplo, el término "aproximadamente 5 pg/kg" significa un intervalo de 4.5 pg/kg a 5.5 pg/kg. Como otro ejemplo, "aproximadamente 1 hora" significa un intervalo de 54 minutos a 66 minutos.

Los términos "sensible a la temperatura", "adaptado al frío" y "atenuado" son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el término "sensible a la temperatura" ("ts") indica que el virus presenta una reducción de 100 veces o más en título a una temperatura más alta, v.gr., 39°C en relación con una temperatura más baja, v.gr., 33°C para cepas de influenza A, y que el virus presenta una reducción de 100 veces o más en título a una temperatura más alta, v.gr., 37°C en relación con una temperatura más baja, v.gr., 33°C para cepas de influenza B. Por ejemplo, el término "adaptadas al frío" ("ca") indica que el virus presenta una tasa de crecimiento más alta a una temperatura más baja, v.gr., 25°C dentro de 100 veces de su crecimiento a una temperatura más alta, v.gr., 33°C. Por ejemplo, el término "atenuado" ("afcfc") indica que el virus se replica en las vías aéreas superiores de hurones pero no es detectable en tejidos de pulmón, y no causa enfermedad similar a la influenza en el animal. Se entenderá que el virus con fenotipos intermedios, es decir, virus que presentan reducciones de título menores de 100 fold a 39°C (para cepa de virus A) o 37°C (para cepa de virus B) , que presentan crecimiento a 25°C que es más de 100 veces que su crecimiento a 33°C (v.gr., dentro de 200 veces, 500 veces, 1000 veces, 10,000 veces menos), y/o presentan crecimiento reducido en los pulmones en relación con el crecimiento en las vías aéreas superiores de hurones (es decir, parcialmente atenuados) y/o enfermedad similar a la influenza reducida en el animal, también son virus útiles abarcados por la invención. El crecimiento indica cantidad viral como se indica por título, tamaño o morfología de placa, densidad de partículas u otras medidas conocidas por los expertos en la técnica.

Células Los virus asociados con células descritos en la presente se pueden propagar en cualesquiera células adherentes que permitan que el virus crezca a títulos que permitan el uso del virus. En una modalidad, las células adherentes permiten que los virus asociados con células crezcan a títulos comparables con aquellos determinados para el virus de tipo silvestre correspondiente. En una modalidad específica, los virus asociados con células descritos en la presente se propagan en células que son susceptibles a infección por el virus .

En una modalidad, los virus asociados con células descritos en la presente son propagados en células de mamífero. Las células de mamífero representativas en las que los virus asociados con células descritos en la presente se pueden propagar incluyen, pero no se limitan a, células Vera, células CHO, células Hep-2, células MBCK, células MDCK, células MRC-5, células HeLa y células LLC-MK2. En una modalidad específica, - los virus asociados con células descritos en la presente, que incluyen virus de sincicio respiratorio, se propagan en células Vera. En otra modalidad específica, los virus asociados con células, que incluyen virus de la influenza, se propagan en células MDCK.

Células MDCK Se sabe que las células MDCK soportan el aislamiento y replicación de numerosos virus que incluyen pero no se limitan a varios virus que incluyen pero no se limitan a ortomixovirus , paramixovirus , rabdovirus y flavovirus. En particular, las células MDCK se usan ampliamente para la producción de virus de la influenza. Sin embargo, como se señaló antes, algunas líneas de células MDCK son tumorigénicas . Si la tumorigenicidad es de preocupación reguladora, la presente invención provee métodos para proliferar células MDCK no tumorigénicas y usar las mismas para la producción de virus de la influenza. Por consiguiente, en una modalidad, los métodos de la invención utilizan células MDCK no tumorigénicas. En otra modalidad, el método de la invención utiliza células MDCK independientemente de la tumorigencidad .

Las líneas de células MDCK no tumorigénicas que se pueden utilizar en los métodos de la invención incluyen pero no se limitan a, aquellos que han sido depositados en el American Type Culture Collection (Depósito Norteamericano de Cultivos Tipo) (10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209), depositados el 5 de enero de 2005 y con Nos. de deposito de ATCC asignados PTA-6500 y PTA-6503 (designados MDCK-S y MDCK-SF 103, respectivamente); aquellos depositados el 5 de octubre de 2006 y con Nos. de deposito de ATCC asignados PTA-7909 y PTA-7910, (designados subclones 1-A y 1-B, respectivamente) .

Otras células MDCK que pueden ser utilizadas incluyen, pero no se limitan a, aquellas que han sido depositadas en el American Type Culture Collection y se les han asignado los Nos. de depósito de ATCC PTA-6501 y PTA-6502 (designadas MDCK-SF101 y MDCK-SF 102, respectivamente); aquellas a las que se les han asignado los Nos. de depósito de ATCC CRL-12042 (designadas MDCK.5F1); aquellas a las que se les han asignado los Nos. de depósito de ATCC: ATCC CCL34; CRL-2286; y CRL-2285.

En una modalidad específica, las células MDCK no tumorigénicas usadas en los métodos de la invención son no tumorigénicas en el modelo de ratón sin pelo adulto (véase, Stiles et al . ) . En otra modalidad específica, las células MDCK no tumorigénicas usadas en los métodos de la invención son no tumorigénicas cuando inyectadas en un embrión de pollo y/o tópicamente aplicadas al corioalantoides (véase, Leighton et al., Id) . En otra modalidad adicional, las células no tumorigénicas MDCK usadas en los métodos de la invención son no tumorigénicas en el modelo de ratón sin pelo adulto pero no cuando se inyectan en un embrión de pollo y/o se aplican tópicamente al corioalantoides. En otra modalidad más, las células MDCK no tumorigénicas usadas en los métodos de la invención son no tumorigénicas en el modelo de ratón sin pelo adulto y cuando se inyectan en un embrión de pollo y/o se aplican tópicamente al corioalantoides. En otra modalidad adicional, las células MDCK no tumorigénicas usadas en los métodos de la invención son no tumorigénicas después de por lo menos 20 pasadas, o después de por lo menos 30 pasadas, o después de por lo menos 40 pasadas, o después de por ló menos 50 pasadas, o después de por lo menos 60 pasadas, o después de por lo menos 70 pasadas, o después de por lo menos 80 pasadas, o después de por lo menos 90 pasadas, o después de por lo menos 100 pasadas. En otras modalidades adicionales, células MDCK no tumorigénicas usadas en los métodos de la invención son no tumorigénicas después de por lo menos 20 pasadas, o después de por lo menos 30 pasadas, o después de por lo menos 40 pasadas, o después de por lo menos 50 pasadas, o después de por lo menos 60 pasadas, o después de por lo menos 70 pasadas, o después de por lo menos 80 pasadas, o después de por lo menos 90 pasadas, o después de por lo menos 100 pasadas en un medio libre de suero de la invención (v.gr., MediV SFM 105 + TE, MediV SFM 109, y MediV SFM 110) .

La tumorigenicidad puede ser cuantificada en numerosas formas conocidas por un experto en la técnica. Un método comúnmente utilizado es determinar el valor de "TD50" que se define como el número de células requeridas para inducir tumores en 50% de los animales probados (véase, v.gr., Hill R. The TD50 assay for tumor cells. En: Potten C, Hendry J, editors. Cell clones. London: Churchill Livingstone ; 1985. p. 223) . En una modalidad, las células MDCK no tumorigénicas usadas en los métodos de la invención tienen un valor de TD50 de entre aproximadamente 1010 a aproximadamente 101, o entre aproximadamente 108 a aproximadamente 103, o entre aproximadamente 107 a aproximadamente 104. En una modalidad específica, las células MDCK no tumorigénicas usadas en los métodos de la invención tienen un valor de TD50 de más de aproximadamente 1010, o de más de aproximadamente 109, o de más de aproximadamente 108, o de más de aproximadamente 107, o de más de aproximadamente 106, o de más de aproximadamente 105, o de más de aproximadamente 104, o de más de aproximadamente 103, o de más de aproximadamente 102, o de más de aproximadamente 101. En una modalidad específica, las células MDCK no tumorigénicas usadas en los métodos de la invención tienen un valor de TD50 de 107 o más.

Además, se contempla que las células MDCK no tumorigénicas usadas en el método de la invención también son no oncogénicos . Los métodos para determinar si las células son oncogénicas generalmente implican la inoculación de lisados de células y/o ADN en especies de roedores recién nacidos y evaluación de cualquier formación de tumor con el tiempo (véase, por ejemplo, Nowinski y Hays, 1978, J. Virol, 27: 13-8; Peeper, et al, 2002, Nat Cell Biol, 4:148-53; Code of Federal Regulation (CFR) , "Oncogenicity" , Título 40, Vol . 8, capítulo 1, sección 798.330, pp . 160- 164). Por ejemplo, lisados de células y/o ADN de por lo menos 107 equivalentes de células son inyectados en roedores recién nacidos (v.gr., hámster, ratones desnudos, ratas) típicamente menos de 4 días de edad que después son monitoreadas hasta por cinco meses o más. Las pruebas de oncogenicidad son realizadas rutinariamente por compañías de pruebas comerciales (v.gr., BioReliance, véase Protocols #001031 y #001030) . En una modalidad, lisados de células y/o ADN de por lo menos 105, o por lo menos 106, o por lo menos 107 células MDCK no tumorigénicas usadas en los métodos de la invención no inducen formación de tumor en 2 meses, o en 3 meses, o en 4 meses, o en 5 meses, o en 6 meses, o más, cuando se inyectan a especies de roedores recién nacidos. En otra modalidad, 0.01 mg, o 0.02 mg, o 0.03 mg, o 0.04 mg, o 0.05 mg, o 0.06 mg, o 0.07 mg, o 0.08 mg, o 0.09 mg, o 0.10 mg, o más, ADN de las células MDCK no tumorigénicas usadas en los métodos de la invención no inducen formación de tumor en 2 meses, o en 3 meses, o en 4 meses, o en 5 meses, o en 6 meses, o más, cuando se inyectan a especies de roedores recién nacidos.

Se contempla que las células MDCK (v.gr., células MDCK no tumorigénicas) usadas en los métodos de la invención soportan la replicación de virus que incluyen pero no se limitan a ortomixovirus (que incluyen cepas de influenza A y/o B) , paramixovirus (que incluyen RSV A y/o B, metapneumovirus y virus de parainfluenza humanos 1, 2 y/o 3), rabdovirus y flavovirus .

En una modalidad específica, las células MDCK (v.gr., células MDCK no tumorigénicas) usadas en los métodos de la invención soportan la replicación de virus de la influenza adaptados al frío sensibles a la temperatura, atenuados tales como aquellos encontrados, por ejemplo, en FluMist® (Belshe et al, 1998, N Engl J Med 338:1405; Nichol et al, 1999, JAMA 282:137; Jackson et al., 1999, Vaccine, 17:1905) y/o virus rearreglados que comprenden el esqueleto (v.gr., los segmentos de gen restantes) de estos virus o que comprenden el esqueleto (o uno o más segmento (s) de ARNv) de virus de la influenza que tienen una o más de las siguientes características: adaptados al frío, atenuados y sensibles a la temperatura.

Una indicación de la capacidad de una célula para soportar replicación viral es el rendimiento de virus infecciosos obtenidos de un cultivo de células infectado. El rendimiento viral se puede determinar por numerosas pruebas diseñadas para medir infección y/o crecimiento viral. Por ejemplo, el rendimiento viral puede ser cuantificádo al determinar la concentración de virus presente en una muestra de conformidad con una prueba de dosis de cultivo de tejido mediana (TCID50) que mide viriones infecciosos, una prueba de foco fluorescente (FFA) que detecta antígenos de virus dentro de células infectadas en una monocapa de cultivo de células (véase, por ejemplo, U.S. 7,262,045). Los valores de TCID50 a menudo se reportan como el logio TCID50/mL y los valores de FFA a menudo se reportan como logio FFU/mL (unidades de foco fluorescente/mL) . Los métodos útiles para la producción de virus de la influenza incluyen, pero no se limitan a, aquellos descritos en la publicación de patente WO 08/105931 (véase, en particular, el ejemplo 12) .

En una modalidad específica, las células MDCK (v.gr., células MDCK no tumorigénicas) usadas en los métodos de la invención soportan la replicación de virus de la influenza ((v.gr., cepas ca/ts) a un log10 TCID50/mL y/o a logi0 FFU/mL de por lo menos aproximadamente 7.6, por lo menos aproximadamente 7.8, por lo menos aproximadamente 8.0, por lo menos aproximadamente 8.2,. por lo menos aproximadamente 8.4, por lo menos aproximadamente 8.6, por lo menos aproximadamente 8.8, por lo menos aproximadamente 9.0, por lo menos aproximadamente 9.2, por lo menos aproximadamente 9.4, por lo menos aproximadamente 9.6, por lo menos aproximadamente 9.8, por lo menos aproximadamente 10.0. En otra modalidad específica, las células MDCK usadas en los métodos de la invención soportan la replicación de virus de la influenza ((v.gr., cepas ca/ts) a un logio TCID50/mL y/o un logio FFU/mL de por lo menos aproximadamente 7.6, por lo menos 7.8, por lo menos 8.0, por lo menos 8.2,. por lo menos 8.4, por lo menos 8.6, por lo menos 8.8, por lo menos 9.0, por lo menos 9.2, por lo menos 9.4, por lo menos 9.6, por lo menos 9.8, por lo menos 10.0. En ciertas modalidades específicas, las células MDCK usadas en los métodos de la invención son no tumorigénicas .

El virus de la influenza de tipo silvestre usado en la preparación de las cepas de vacuna para vacunación anual contra influenza epidémica son recomendados anualmente por el Vaccines and Related Biological Products Advisory Commitee (Comité de Asesoramiento de Vacunas y Productos Biológicos Relacionados) a los Centers for Biologies Evaluatipn and Research (Centros para Evaluación e Investigación Biológicas (CBER) o la Organización Mundial de la Salud (OMS) y la European Medicines Evaluation Agency (Agencia Europea de Evaluación de Medicinas) (EMEA) , y se proveen a fabricantes por la FDA o los Centers for Disease Control and Prevention (Centros para Control y Prevención de Enfermedades) (CDC) . Estas cepas pueden ser usadas para la producción de cepas de vacuna de rearreglo que generalmente combinan los genes NA y/o HA del virus de tipo silvestre con los segmentos de gen restantes derivados de un virus donador (a menudo referido como un virus donador maestro o MDV) que tendrá ciertas características deseables. Por ejemplo, una cepa MDV puede ser adaptada al frío, y/o sensible a la temperatura, y/o attenuada, y/o tener una tasa de crecimiento alta. Las modalidades que siguen inmediatamente adelante se refieren a versiones adaptadas al frío, y/o sensibles a la temperatura, y/o atenuadas de diferentes cepas de influenza (v.gr. , cepas de tipo silvestre recomendadas por una o más organizaciones de salud) . Esos virus de la influenza adaptados al frío, y/o sensibles a la temperatura, y/o atenuados se pueden hacer al obtener virus recombinantes y/o de rearreglo de la influenza que comprenden los segmentos de gen HA y NA de la cepa de interés y los segmentos de gen restantes de una cepa de influenza adaptada al frío, y/o sensible a la temperatura, y/o atenuada adecuada (también referida aquí como un esqueleto "adaptado al frío, sensible a la temperatura, atenuadá") tal como, por ejemplo, los virus de la influenza adaptados al frío, sensibles a la temperatura, atenuados encontrados en FluMist® (ca A/Ann Arbor/6/60 y ca B/Ann Arbor/l/66) . Como se usa en la presente, un virus recombinante y/o de rearreglo que comprende segmentos de gen HA y NA de un virus de la influenza cepa de tipo silvestre y los segmentos de gen restantes de un virus de la influenza que es adaptado al frío y/o sensible a la temperatura y/o atenuado. Virus de rearreglo y/o recombinantes también son referidos por la designación de cepa de tipo silvestre precedida por uno o más de los identificadores "ca", "att", "ts", por ejemplo un virus recombinante y/o de rearreglo que comprende segmentos de gen HA y NA de A/New Caledonia/20/99 y los segmentos restantes de un virus de la influenza adaptado al frío, sensible a la temperatura, atenuado (v.gr. , A/Ann Arbor/6/60) pueden ser designados simplemente "ca A/New Caledonia/20/99".

En ciertas modalidades, las células MDCK (v.gr., células MDCK no tumorigénicas) usadas en los métodos de la invención soportan la replicación de una versión adaptada al frío, y/o sensible a la temperatura, y/o atenuada (v.gr., de reordenamiento) de por lo menos una cepa de la influenza (v.gr., una cepa de la influenza A, una cepa de la influenza B) recomendada y/o provista anualmente por una o más organizaciones de salud que incluyen pero no se limitan al CBER, la OMS, la EMEA, la FDA y el CDC, a un logio TCID50/mL y/o un logio FFU/mL de por lo menos aproximadamente 7.6, por lo menos aproximadamente 7.8, por lo menos aproximadamente 8.0, por lo menos aproximadamente 8.2, . por lo menos aproximadamente 8.4, por lo menos aproximadamente 8.6, por lo menos aproximadamente 8.8, por lo menos aproximadamente 9.0, por lo menos aproximadamente 9.2, por lo menos aproximadamente 9.4, por lo menos aproximadamente 9.6, por lo menos aproximadamente 9.8, por lo menos aproximadamente 10.0. En otra modalidad específica, las células MDCK (v.gr., células DCK no tumorigénicas) usadas en los métodos de la invención soportan la replicación de una versión adaptada al frío, y/o sensible a la temperatura, y/o atenuada (v.gr., de rearreglo) de por lo menos una cepa de influenza (v.gr., una cepa de la influenza A, una cepa de influenza B) recomendada y/o provista anualmente por una o más organizaciones de salud que incluyen pero no se limitan al CBER, la OMS, la EMEA, la FDA y el CDC, a un logio TCID50/mL y/o un logio FFU/mL de por lo menos aproximadamente 7.6, por lo menos 7.8, por lo menos 8.0, por lo menos 8.2, por lo menos 8.4, por lo menos 8.6, por lo menos 8.8, por lo menos 9.0, por lo menos 9.2, por lo menos 9.4, por lo menos 9.6, por lo menos 9.8, por lo menos 10.0. En ciertas modalidades específicas, las células MDCK used en los métodos de la invención son no tumorigénicas.

En ciertas otras modalidades, las células MDCK (v.gr., células MDCK no tumorigénicas) usadas en los métodos dé la invención soportan la replicación de una versión adaptada al frío, y/o sensible a la temperatura, y/o atenuada de por lo menos una cepa de influenza A. Se contempla que la cepa de influenza A puede ser de cualquier subtipo (v.gr., ?? ?, H3N2, H7N7, H5 1, H9N2, ?? ? , H2N2) . Actualmente, por lo menos 16 diferentes subtipos de HA y 9 diferentes subtipos de NA han sido identificados en virus de influenza A. Por consiguiente, la cepa de influenza A puede comprender cualquier combinación de subtipos HA y NA actualmente conocidos o identificados en el futuro y/o puede ser un rearreglo. En ciertas modalidades específicas, las células MDCK usadas en los métodos de la invención son no tumorigénicas .

En ciertas otras modalidades, las células MDCK (v.gr., células MDCK no tumorigénicas) usadas en los métodos de la invención soportan la replicación de una versión adaptada al frío, y/o sensible a la temperatura, y/o atenuada de por lo menos una cepa de influenza B. Los virus de influenza B no son actualmente divididos en subtipos basados en sus proteínas hemaglutinina y neuraminidasa ; en vez de ser clasificadas por linaje. Actualmente, cepas de virus de influenza B son divididas en dos linajes, los linajes B/Yamagata y B/Victoria de los cuales hay numerosos sub-linajes. Por consiguiente, la cepa de influenza B puede ser derivada de cualquier linaje y/o sub- linaje actualmente conocido o identificado en el futuro y/o puede ser un rearreglo. En ciertas modalidades específicas, las células MDCK usadas en los métodos de la invención son no tumorigénicas.

Medio y Método de Cultivo de Células La presente invención provee medio de cultivo de células libre de suero y procesos escalables eficientes altamente reproducibles para la producción de grandes cantidades de material de vacuna en biorreactores , que incluyen biorreactores de un solo uso, biorreactores reutilizables estándares (v.gr., biorreactores de acero inoxidable y recipiente de vidrio) . En particular, la presente invención provee métodos para la replicación de virus de la influenza (v.gr., adaptados al frío, y/o sensibles a la temperatura, y/o atenuados) a título alto, v.gr., un logi0 TCID50/mL y/o un logio FFU/mL de por lo menos aproximadamente 7.4, o por lo menos aproximadamente 7.6, o por lo menos aproximadamente 7.8, o por lo menos aproximadamente 8.0, o por lo menos aproximadamente 9.0, o por lo menos aproximadamente 10.0. En un aspecto, la presente invención provee un medio de cultivo de células libre de suero enriquecido que soporta la proliferación de células MDCK (v.gr., células MDCK no tumorigénicas) a una densidad de células alta y elimina la necesidad de un paso de intercambio de medio para obtener títulos virales altos. La eliminación de un paso de intercambio de medio ofrece varias ventajas tales como disminución en tiempo de proceso y uso de medio. Más aún, reduce el número de operaciones requeridas durante la fabricación, que a su vez disminuye las probabilidades de contaminación. En otro aspecto, la presente invención provee métodos mejorados para la propagación de células no tumorigénicas en microportadores que incluyen métodos de transferencia esfera a esfera. En otro aspecto, el medio de cultivo de células libre de suero enriquecido de la invención mantiene las características no tumorigénicas de células MDCK no tumorigénicas.

Medio Libre de Suero Enriquecido Un experto en la técnica apreciará que el medio de cultivo de células usado para proliferar células puede tener impacto en una o más características de las células que incluyen, pero no se limitan a, que son no tumorigénicas, que son no oncogénicas, que crecen como células adherentes, que crecen como células no adherentes, que tienen una morfología tipo epitelio, que soportan la replicación de varios virus cuando se cultivan, y que soportan la replicación de virus de la influenza a título alto como se describe en la presente. Para reducir el riesgo de contaminación por agentes adventicios (v.gr., micoplasma, virus y priones) El uso de suero o extractos de animales en aplicaciones de cultivo de tejido para la producción de material terapéutico (v.gr., vacuna) se debe reducir al mínimo, o incluso eliminar. Además, la reducción al mínimo del número de manipulaciones requeridas durante un proceso de cultivo de células puede disminuir significativamente las probabilidades de contaminación. Por consiguiente, la presente invención provee medio de cultivo libre de suero enriquecido útil para la proliferación de células MDCK (v.gr. , células MDCK no tumorigénicas) y producción de material de vacuna mediante el uso de métodos de cultivo por lotes. En particular el "medio de cultivo libre de suero enriquecido de la invención (también referido aquí como "medio libre de suero de la invención" y "medio de la invención") se puede usar en métodos de cultivo por lotes que no utilizan intercambio de medio, o suplementacióh . Por consiguiente, el desarrollo y uso del medio libre de suero de la invención supera uno de los problemas operacionales más desafiantes en la producción of material de vacuna basado en cultivo de células (v.gr., virus de la influenza), el requerimiento de intercambio de medio/suplementación.

En una modalidad, el medio libre de suero: de la invención suporta la proliferación de células MDCK no tumorigénicas, en donde las células se mantienen no tumorigénicas después de la proliferación en el medio (es decir, después de la pasada) . En una modalidad específica, las células MDCK son no tumorigénicas después de por lo menos 20 pasadas, o después de por lo menos 30 pasadas, o después de por lo menos 40 pasadas, o después de por lo menos 50 pjasadas, o después de por lo menos 60 pasadas, o después de ;por lo menos 70 pasadas, o después de por lo menos 80 pasadas, o después de por lo menos 90 pasadas, o después de por ló menos 100 pasadas en un medio libre de suero de la invención.

En otra modalidad, el medio libre de suero de la invención soporta la proliferación de células MDCK (v.gr., células MDCK no tumorigénicas) a densidad alta. En una modalidad específica, el medio libre de suero de la invención soporta la proliferación de células MDCK a una densidad de por lo menos 5 x 105 células/mL, por lo menos 6 x 105 células/mL, por lo menos 7 x 105 células/mL, por lo menos 8 x 105 células/mL, por lo menos 9 x 105 células/mL, por lo menos 1 x 106 células/mL, por lo menos 1.2 x 106 células/mL, por lo menos 1.4 x 106 células/mL, por lo menos 1.6 x 106 células/mL, por lo menos 1.8 x 106 células/mL, por lo menos 2.0 x 106 células/mL, por lo menos 2.5 x 106 células/mL, por lo menos 5 x 106 células/mL, por lo menos 7.5 x 106 células/mL, o por lo menos 1 x 107. En otra modalidad específica, el medio libre de suero de la invención soporta la proliferación de células MDCK no tumorigénicas.

En otra modalidad adicional, medio libre de suero de la invención soporta la proliferación de MDCK (v.gr., células MDCK no tumorigénicas) células a densidad alta y subsecuente replicación de virus de la influenza a título alto sin la necesidad de un paso de intercambio de medio. En una modalidad específica, el medio libre de suero de la invención soporta la proliferación de células MDCK a densidad alta y subsecuente replicación de virus de la influenza (v.gr., cepas ca/ts) a un logio TCID50/mL y/o un logi0 FFU/mL de por lo menos 6.0, o por lo menos 6.2, o por lo menos 6.4, o por lo menos 6.6, o por lo menos 6.8, o por lo menos 7.0, o por lo menos 7.2, o por lo menos 7.4, o por lo menos 7.6, o por lo menos 7.8, o por lo menos 8.0, o por lo menos 8.2, o por lo menos 8.4, o por lo menos 8.6, o por lo menos 8.8, o por lo menos 9.0 , o por lo menos 9.2, o por lo menos 9.4, o por lo menos 9.6, o por lo menos 9.8 o por lo menos 10.0 sin la necesidad de un paso de intercambio de medio. En otras modalidades específicas, medio libre de suero de la invención soporta la proliferación de células MDCK no tumorigénicas a densidad alta y replicación subsecuente de virus de la influenza que incluye, pero no se limita a virus de la influenza descrito anteriormente.

En una modalidad, el medio libre de suero de la invención comprende un hidrolizado vegetal. Los hidrolizados vegetales incluyen pero no se limitan a, hidrolizados dé uno o más de los siguientes: maíz, semilla de maíz, guisante, soya, malta, papa y trigo. Los hidrolizados vegetales pueden ser producidos por hidrólisis enzimática y generalmente contienen una mezcla de péptidos, aminoácidos libres y factores de crecimiento. Los hidrolizados vegetales se obtienen fácilmente de un número de fuentes comerciales que incluyen, por ejemplo, Marcor Development, HyClone and Organo Technie. También se contempla que los hidrolizados de levadura pueden ser utilizados en lugar de, o en combinación con hidrolizados vegetales. Los hidrolizados de levadura se obtienen fácilmente de un número de fuentes comerciales que incluyen, por ejemplo, Sigma-Aldrich, USB Corp, Gibco/BRL y otros. En ciertas modalidades, hidrolizados sintéticos se pueden usar además de o en lugar de hidrolizados vegetales o de levadura. En ciertas modalidades, el medio libre de suero de la invención comprende un hidrolizado vegetal a una concentración final de entre aproximadamente 0.1 g/L a aproximadamente 5.0 g/L, o entre aproximadamente 0.5 g/L a aproximadamente 4.5 g/L, o entre aproximadamente 1.0 g/L a aproximadamente 4.0 g/L, o entre aproximadamente 1.5 g/L a aproximadamente 3.5 g/L, o entre aproximadamente 2.0 g/L a aproximadamente 3.0 g/L. En una modalidad específica, el medio libre de suero de la invención comprende un hidrolizado vegetal a una concentración final de 2.5 g/L. En otra modalidad específica, el medio libre de suero de la invención comprende un hidrolizado de trigo , a una concentración final de 2.5 g/L.

En otra modalidad, medio libre de suero de la invención comprende un suplemento de lípido. Los lípidos que se pueden usar para suplementar el medio de cultivo incluyen pero no se limitan a suplementos de lípidos derivados de animales y plantas químicamente definidos así como lípidos sintéticamente derivados. Los lípidos que pueden estar presentes en un suplemento de lípido incluyen pero no se limitan a, colesterol, ácidos grasos saturados y/o insaturados (v.gr., ácido araquidónico, linoleico, linolénico, mirístico, oleico, palmítico y esteárico) . El colesterol puede estar presente a concentraciones entre 0.10 mg/mL y 0.40 mg/mL en un abastecimiento de 100X de suplemento de lípido. Los ácidos grasos pueden estar presentes en concentraciones entre 1 µg/ h y 20 µg/mL en un abastecimiento de 100X de suplemento de lípido. Los lípidos adecuados para formulaciones de medio son fácilmente obtenidos de un número de fuentes comerciales que incluyen, por ejemplo HyClone, Gibco/BRL y Sigma-Aldrich . En ciertas modalidades, el medio libre de suero de la invención comprende un concentrado de lípido químicamente definido a una concentración final de entre aproximadamente 0. IX a aproximadamente 2X, o entre aproximadamente 0 · 2X a aproximadamente 1.8X o entre aproximadamente o;. , 3X a aproximadamente 1.7X, o entre aproximadamente 0 • 4X a aproximadamente 1.6X, o entre aproximadamente 0 .5X a aproximadamente 1.5X, o entre aproximadamente 0 . SX a aproximadamente 1.4X, o entre aproximadamente 0 .7X a aproximadamente 1.3X, o entre aproximadamente 0 .8X y aproximadamente 1.2X. En una modalidad específica, el medio libre de suero de la invención comprende una solución de concentrado de lípido químicamente definido (CDCL) j a una concentración final de IX. En otra modalidad específica, el medio libre de suero de la invención comprende la solución de concentrado de lípido químicamente definido (CDCL) (Tabla 5) a una concentración final de IX.

En otra modalidad, el medio libre de suero de la invención comprende elementos traza. Los elementos traza que se pueden usar incluyen pero no se limitan a, CuSC4*5H20, ZnS04*7H20, Selenita-2Na, citrato férrico, MnS04'H20, Na2Si03'9H20, ácido molíbdico-sal de amonio, NH4V03, NiS04*6H20, SnCl2 (anhidro), A1C13*6H20, AgN03, Ba(C2H302) 2, KBr , CdCl2, CoCl2*6H20, CrCl3 (anhidro), NaF, Ge02, KI , RbCl, ZrOCl2-8H20. Las soluciones de abastecimiento concentradas de elementos traza son fácilmente obtenidas de un número de fuentes comerciales que incluyen, por ejemplo, Cell Grow (véase Nos. de Catálogo 99-182, 99-175 y 99-176) . En ciertas modalidades, el medio libre de suero de la invención comprende soluciones de elementos traza A, B y C (Tabla 4) a una concentración final de entre aproximadamente 0. IX· a aproximadamente 2X, o entre aproximadamente 0.2X a aproximadamente 1.8X o entre aproximadamente 0 .3X a aproximadamente 1. 7X, O entre aproximadamente 0 .4X a aproximadamente 1. 6X, O entre aproximadamente 0 .5X a aproximadamente 1. 5X, O entre aproximadamente 0 .6X a aproximadamente 1. 4X, O entre aproximadamente 0 .7X a aproximadamente 1. 3X, O entre aproximadamente 0. 8X and aproximadamente 1 .2X.. En una modalidad especifica, el medio libre de suero de la invención comprende soluciones de elementos traza A, B y C (Tabla 4) a una concentración final de IX.

En otra modalidad, el medio libre de suero de la invención comprende una o más hormona, factor de crecimiento y/u otras moléculas biológicas. Las hormonas incluyen, pero no se limitan a triyodotironina, insulina e hidrocortisona . Los factores de crecimiento incluyen pero no se limitan a factor de crecimiento epidérmico (EGF) , factor de crecimiento de insulina (IGF) , factor de crecimiento de transformante (TGF) y factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) . En una modalidad particular, el medio libre de suero de la invención comprende factor de crecimiento epidérmico (EGF) . Otras moléculas biológicas, incluyen citocinas (v.gr., factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) , interferones , interleucinas , TNFs) , quimiocinas (v.gr., Rantes, eotaxinas , proteínas inflamatorias de macrófagos (MIPs) ) y prostaglandinas (v.gr., prostaglandinas El y E2) . En una modalidad, el medio libre de suero de la invención comprende un factor de crecimiento a una concentración final de entre aproximadamente 0.0001 a aproximadamente 0.05 mg/L, o entre aproximadamente 0.0005 a aproximadamente 0.025 mg/L, ó entre aproximadamente 0.001 a aproximadamente 0.01 mg/L, o entre aproximadamente 0.002 a aproximadamente 0.008 mg/L, o entre aproximadamente 0.003 mg/L a aproximadamente 0.006 mg/L. En una modalidad específica, el medio libre de suero . de la invención comprende EGF a una concentración final de 0.005 mg/L. En una modalidad, el medio libre de suero de la invención comprende triyodotironina a una concentración final de entre aproximadamente lxlO"12 M a aproximadamente 10x10"12 M, o entre aproximadamente 2xl0"12 M a aproximadamente 9xl0"12 M, o entre aproximadamente 3xl0"12 M a aproximadamente 7xl0"12 M, o entre aproximadamente 4xl0~12 M a aproximadamente 6xl0~12 M. En una modalidad específica, el medio libre de suero de la invención comprende . triyodotironina a una concentración final de 5xl0~12 M. En una modalidad, el medio libre de suero de la invención comprende insulina a una concentración final de entre aproximadamente 1 mg/L a aproximadamente 10 mg/L, o entre aproximadamente 2.0 a aproximadamente 8.0 mg/L, o entre aproximadamente 3 mg/L a aproximadamente 6 mg/L. En una modalidad específica, el medio libre de suero de la invención comprende insulina a una concentración final de 5 mg/L. En ciertas modalidades, el medio libre de suero de la invención comprende una prostaglandina a una concentración final de entre aproximadamente 0.001 mg/L a aproximadamente 0.05 mg/L, o entre aproximadamente 0.005 mg/L a aproximadamente 0.045 mg/L, o entre aproximadamente 0.01 mg/L a aproximadamente 0.04 mg/L, o entre aproximadamente 0.015 mg/L a aproximadamente 0.035 mg/L, o entre aproximadamente 0.02 mg/L a aproximadamente 0.03 mg/L. En una modalidad específica, medio libre de suero de la invención comprende a prostaglandin a una concentración final de 0.025 mg/L. En otra modalidad específica, el medio libre de suero de la invención comprende prostaglandina El a una concentración final de 0.025 mg/L.

En otra modalidad adicional, los medios libres de suero de la invención son fortificados con uno o más componentes de medio seleccionados del grupo que consiste de putrescina, aminoácidos, vitaminas, ácidos grasos, y nucleósidos. En modalidades específicas, los medios libres de suero de la invención son fortificados con uno o más componentes de medio de tal manera que la concentración del componente de medio es aproximadamente 1 vez, o aproximadamente 2 veces, o aproximadamente 3 veces, o aproximadamente 4 veces, o aproximadamente 5 veces más alto o más la que es típicamente encontrada en un medio usado rutinariamente para propagar células, tal como, por ejemplo, medio de Eagle modificado por Dulbecco/medio F12 de Ham (DMEM/F12) . La composición estándar de DMEM/F12 se provee para referencia abajo en la tabla 1. En una modalidad específica, los medios libres de suero de la invención son fortificados con putrescina. En otra modalidad específica, los medios libres de suero de la invención son fortificados con putrescina de tal manera que la concentración de putrescina es aproximadamente 5 veces más alta, o más, la que es típicamente encontrada en DMEM/F12.

Los ácidos grasos que pueden ser fortificados incluyen, ácido graso insaturado, que incluyen pero no se limitan a, ácido linoleico y ácido -linolénico (también referidos como ácidos grasos esenciales) así como, ácido miristoleico, ácido palmitoleico, ácido oleico, ácido araquidónico, ácido eicosapentaenoico, ácido erúcico, ácido docosahexaenoico; ácidos grasos saturados, que incluyen pero no se limitan a, ácido butanoico, ácido hexanoico, ácido octanoico, ácido decanoico, ácido dodecanoico, ácido tetradecanoico, ácido hexadecanoico, ácido octadecanoico, ácido eicosanoico, ácido docosanoico, ácido tetracosanoico y ácidos grasos que contienen azufre que incluyen ácido lipoico. En ciertas modalidades, los medios libres de suero de la invención son fortificados con ácidos grasos adicionales además del que se provee por un suplemento de lípido como se describió antes. En una modalidad específica, los medios libres de suero de la invención son fortificados con ácido linoleico y ácido linolénico. En otra modalidad específica, los medios libres de suero de la invención son fortificados con ácido linoleico y ácido linolénico de tal manera que las concentraciones de ácido linoleico y ácido linolénico son aproximadamente 5 veces más altas, o más, de la que es típicamente encontrada en DMEM/F12.

Los aminoácidos que pueden ser fortificados incluyen los veinte aminoácidos estándares (alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutámico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina y valina) así como cistina y aminoácidos no estándares. En ciertas modalidades, uno o más aminoácidos que no son sintetizados por células MDCK no tumorigénicas , comúnmente referidos como "aminoácidos esenciales", son fortificados. Por ejemplo, ocho aminoácidos generalmente se consideran esenciales para los humanos: fenilalanina, valina, treonina, triptofano, isoleucina, metionina, leucina y lisina. En una modalidad específica, medios libres de suero de la invención son fortificados con cistina y todos los aminoácidos estándares excepto glutamina (DMEM/F12 es a menudo formulada sin glutamina, que se añade por separado) , de tal manera que las concentraciones de cistina y los aminoácidos estándares son aproximadamente 5 veces más altas, o más, de las que típicamente se encuentran en DMEM/F12. En cierta modalidad específica, los medios libres de suero de la invención comprenden glutamina a una concentración de ¦ entre aproximadamente 146 mg/L a aproximadamente 1022 mg/L, o entre aproximadamente 292 mg/L a aproximadamente 876 mg/L, o entre aproximadamente 438 mg/L a aproximadamente 730 mg/L. En otra modalidad específica, los medios libres de suero de la invención comprenden glutamina a una concentración de 584 mg/mL.

Las vitaminas que pueden ser fortificadas incluyen, pero no se limitan a, ácido ascórbico (vitamina A) , d-biotina (vitamina B7 y vit H) , D-pantotenato de calcio, colecalciferol (vitamina D3) , cloruro de colina, cianocobalamina (vitamina Bi2) , ergocalciferol (vitamina D2) , ácido fólico (vitamina B9) , menaquinona (vitamina K2) , mió- inositol , niacinamida (vitamina B3) , ácido p-aminobenzoico, ácido pantoténico (vitamina B5) , f iloquinona (vitamina Ki) , piridoxina (vitamina B6) , retinol (vitamina A) , riboflavina (vitamina B2) , alfa- tocoferol (vitamina E) y tiamina (vitamina Bi) . En una modalidad específica, los medios libres de suero de la invención son fortificados con d-biotina, pantotenato de D-calcio, cloruro de colina, cianocobalamina, ácido fólico, mió- inositol , niacinamida, piridoxina, riboflavina, y tiamina de tal manera que las concentraciones de las vitaminas indicadas son aproximadamente 5 veces más altas, o más, de la que es típicamente encontradaen DMEM/F12.

Los nucleósidos que pueden ser fortificados incluyen, pero no se limitan a, citidina, uridina, adenosina, guanosina, timidina, inosina, y hipoxantina. En una modalidad específica, los medios libres de suero de la invención son fortificados con hipoxantina y timidina de tal manera que las concentraciones de hipoxantina y timidina son aproximadamente 5 veces más altas, o más, de la que es típicamente encontrada en DMEM/F12.

Componentes adicionales que se pueden añadir al medio de cultivo de células incluyen, pero no se limitan a, bicarbonato de sodio, una fuente de carbono (v.gr. , glucosa) , y agentes aglutinantes de hierro. En una modalidad, los medios libres de suero de la invención comprenden bicarbonato de sodio a una concentración final de entre aproximadamente 1200 mg/L a aproximadamente 7200 mg/L, o entre aproximadamente 2400 mg/L y aproximadamente 6000 mg/mL, o aproximadamente 3600 mg/mL y aproximadamente 4800 mg/mL. En una modalidad específica, los medios libres de suero de la invención comprenden bicarbonato de sodio a una concentración final de 4400 mg/mL. En una modalidad, los medios libres de suero de la invención comprenden glucosa como una fuente de carbono. En otra modalidad, los medios libres de suero de la invención comprenden glucosa a una concentración final de entre aproximadamente 1 g/L a aproximadamente 10 g/L, o aproximadamente 2 g/L a aproximadamente 10 g/L, o aproximadamente 3 g/L a aproximadamente 8 g/L, o aproximadamente 4 g/L a aproximadamente 6 g/L, o aproximadamente 4.5 g/L a aproximadamente 9 g/L. En una modalidad específica, los medios libres de suero de la invención comprenden glucosa a una concentración final de 4.5 g/L. Se contempla específicamente que se puede añadir glucosa adicional a un medio libre de suero de la invención que ha de ser usado para la proliferación de células MDCK no tumorigénicas a densidad alta y subsecuente replicación de virus de la influenza para evitar agotamiento de la fuente de carbono. Por consiguiente, en ciertas modalidades, un medio libre de suero de la presente invención comprende 1-5 g/L adicionales de glucosa para una concentración final de glucosa de entre aproximadamente 5.5 g/L y aproximadamente 10 g/L.

Los agentes aglutinantes de hierro que pueden ser utilizados incluyen proteínas tales como transferrina y compuestos químicos tales como tropolona (véase, v.gr. , patentes de E.U.A. 5,045,454; 5,118,513; 6,593,140; y publicación del PCT número WO 01/16294) . En una modalidad, los medios libres de suero de la invención comprenden tropolona ( 2 -hidroxi- 2 , 4 , 6 -ciclohepatrieno- 1 ) y una fuente de hierro (v.gr., citrato de amonio férrico, sulfato de amonio férrico) en lugar de transferrina. Por ejemplo, tropolona o un derivado de tropolona estará presente en un exceso molar de concentración al hierro presente en el medio a una relación molar de entre aproximadamente 5 a 1 y aproximadamente 1 a 1. En ciertas modalidades, los medios libres de suero de la invención comprenden tropolona o un derivado de tropolona en un exceso molar de concentración al hierro presente en medio a una relación molar de aproximadamente 5 a 1, o aproximadamente 3 a l, o aproximadamente 2 a 1, o aproximadamente 1.75 a 1, o aproximadamente 1.5 a 1, o aproximadamente 1.25 a 1. En una modalidad específica, el medio libre de suero de la presente invención comprende Tropolona a una concentración final de 0.25 mg/L y citrato de amonio férrico (FAC) a una concentración final de 0.20 mg/L y (véase, v.gr. , tabla 3) .

La adición de componentes como se describió antes a una formulación de medio puede alterar la osmolalidad. Por consiguiente, en ciertas modalidades, la cantidad de uno o más componentes típicamente encontrados en DMEM/F12 es reducida para mantener una osmolalidad deseada. En una modalidad, la concentración de cloruro de sodio (NaCl) es reducida en un medio libre de suero de la invención. En otra modalidad, la concentración de NaCl en un medio libre de suero de la invención es aproximadamente entre aproximadamente 10% a aproximadamente 90%, o aproximadamente 20% a aproximadamente 80%, o aproximadamente 30% a aproximadamente 70%, o aproximadamente 40% a aproximadamente 60% de la típicamente encontrada en DMEM/F12. En una modalidad específica, la concentración final de NaCl en un medio libre de suero de la invención es 50% de la típicamente encontrada en DME /F12. En otra modalidad específica, la concentración final de NaCl en un medio libre de suero de la invención es 3500 mg/L.

En ciertas modalidades, el número de componentes derivados de animales presentes en medios libres de suero de la invención son reducidos al mínimo o incluso eliminados. Por ejemplo, proteínas recombinantes comercialmente disponibles tales como insulina y transferrina derivadas de fuentes que no son animales (v.gr., Biological Industries Cat . No. 01-818-1, y Millipore Cat. No. 9701, respectivamente) pueden ser utilizadas en lugar de proteínas derivadas de una fuente animal. En una modalidad específica, todos los componentes derivados de animales son reemplazados por productos no derivados de animales con la excepción de colesterol que puede ser un componente de una mezcla de lípidos químicamente definida. Para reducir al mínimo los riesgos típicamente asociados con productos derivados de animales, el colesterol puede ser de lana de ovejas localizado en regiones no asociadas con agentes adventicios que incluyen, pero no se limitan a priones .

En una modalidad específica, los medios libres de suero de la invención comprenden todos los componentes del medio MediV SFM 110 listado en la tabla 3, ¡a las concentraciones finales indicadas. En otra modalidad específica, los medios libres de suero de la invención consisten esencialmente de todos los componentes del medio MediV SFM 110 listado en la tabla 3, a las concentraciones finales indicadas. En otra modalidad específica, el medio MediV SFM 110 que consiste de los componentes listados en la tabla 3 es un medio libre de suero de la invención.

Tabla 1 Formulación de Medio DMEM/F12 Transferencia Esfera a Esfera En una modalidad, células MDCK no tumorigénicas son cultivadas como células adherentes sobre una superficie a la cual se unen. Las superficies adherentes sobre las : cuales pueden crecer las células de cultivo de tejido incluyen pero no se limitan a, plásticos de poliestireno modificados en la superficie, superficies revestidas de proteína (v.gr., fibronectina y/o vidrio/plástico revestidos con colágeno) así como una gran variedad de microportadores comercialmente disponibles (v.gr., esferas microportadoras de DEAE-Dextrano, tales como Dormacell, Pfeifer & Langen,- Superbead, Flow Laboratories; esferas de copolímero de estireno-trimetilamina, tales como Hillex, SoloHill, Ann Arbor; Cytodex 1 y Cytodex 3, GE Healthcare Life Science) . Las esferas microportadoras son esferas pequeñas (en el intervalo de 100-200 mieras de diámetro) que proveen un área de superficie grande para crecimiento de células adherentes por volumen de cultivo de células. Por ejemplo, un solo litro de medio puede incluir más de 20 millones de esferas microportadoras que proveen más de 8000 centímetros cuadrados de superficie de crecimiento. La elección de superficie adherente se determina por los métodos utilizados para el cultivo de las células MDCK no tumorigénicas .

En una modalidad, el microportador se usa a una concentración de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 4 g/L. En otra modalidad, el microportador se usa a una concentración de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 3 g/L. En ciertas modalidades, en el recipiente de cultivo (v.gr. biorreactor) se siembran las células MDCK que han de ser cultivadas a una densidad de siembra de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 2xl05 células/mL. En una modalidad específica, la densidad de siembra es entre aproximadamente 0.7 y aproximadamente 1.8xl05 células/mL, o entre aproximadamente 0.8 y aproximadamente 1.6xl05 células/mL, o entre aproximadamente 0.9 y aproximadamente 1.4x1O5 células/mL, o entre aproximadamente 1.0 y aproximadamente 1.2xl05 células/mL. Alternativamente, la densidad de siembra se puede calcular sobre una base por microportador . Por consiguiente, en ciertas modalidades, el recipiente de cultivo (v.gr. , biorreactor) se siembra con las células MDCK que han de ser cultivadas a una densidad de siembra de aproximadamente 10 a aproximadamente 40 células/microportador, o de aproximadamente 12 a aproximadamente 38 células/microportador, células/microportador, o de aproximadamente 14 a aproximadamente 36 células/microportador, o de aproximadamente 16 a aproximadamente 34 células/microportador, o de aproximadamente 18 a aproximadamente 32 células/microportador, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 células/microportador.

Durante el proceso de subcultivo de células adherentes (es decir, proliferación de las células, expansión del cultivo de células) , las células deben ser transferidas de una superficie de soporte confluente (v.gr., superficie del matraz, microportador, etc.) sobre una nueva superficie de soporte. Un número de métodos se puede utilizar para efectuar la transferencia de células. Por ejemplo, proteasas, que incluyen tripsina, TrypLE y colagenasa, se pueden usar para remover células de matraces o microportadores , después las células se lavan, si se desea, y se diluyen en un matraz más grande o en un volumen más grande de medio que contiene microportador para expansión. Este proceso es comúnmente referido como "división" del cultivo y puede ser cuantificado como la relación del cultivo original al cultivo final. Por ejemplo, una relación de división de 1:8 indica que 1 parte del cultivo original (v.gr., 10 mL) se añade a 7 partes de medio de cultivo fresco (v.gr., 70 mL) para dar 80 mL. Alternativamente, el número de células en el cultivo original se determina y la dilución se calcula con base en la densidad de siembra deseada y volumen del cultivo final. Es preferible usar una proteasa no derivada de animal para aplicaciones tales como, TrypLE (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Alternativamente, en cultivos de microportador, después de que las células se han desprendido del medio fresco y/o esferas microportadoras después se pueden añadir al cultivo. En algunas modalidades, el cultivo tratado con proteasa es transferido a un recipiente de cultivo más grande antes, durante o después de la adición de medio fresco y/o microportadores.

En una modalidad específica, un cultivo de células de células MDCK (v.gr., células MDCK no tumorigénicas) que crecen como células adherentes sobre microportadores son tratadas con proteasa (v.gr., TrypLE) . La proteasa puede ser inactivada (v.gr., mediante la adición de un inhibidor de proteasa tal como inhibidor de tripsina de haba) según sea necesario, y medio fresco y/o esferas microportadoras después se pueden añadir al cultivo. En algunas modalidades, el cultivo tratado con proteasa es transferido a un recipiente de cultivo más grande antes, durante o después de la adición de medio fresco y/o microportadores.

El uso de proteasas en métodos de transferencia esfera a esfera puede dar por resultado diseminación de células pobre y conteos de células bajos. Por consiguiente, la presente invención también provee métodos para efectuar transferencia esfera a esfera que reducen al mínimo o incluso eliminan la cantidad de proteasa necesaria para facilitar la transferencia esfera a esfera que incluyen pero no se limitan al método ilustrado en los ejemplos de la sección 8.3, que también se utiliza en los ejemplos de la sección 8.1. En particular, los inventores han determinado que la cantidad de proteasa necesaria para liberar las células de los microportadores se puede reducir por lo menos por 20 veces por pre-tratamiento con un agente quelatador, en particular por pre-tratamiento a un pH más alto que el usado para la proliferación de las células.

En algunas modalidades, la transferencia esfera a esfera es facilitada por pre-tratamiento de las células con un agente quelatador antes de la adición de una proteasa (v.gr., TrypLE) . En otras modalidades, la transferencia esfera a esfera es facilitada por la adición de un agente quelatador (v.gr., EDTA) e incubación a un pH por arriba del usado para proliferación celular. En una modalidad específica, un cultivo de células, de células MDCK no tumorigénicas que crecen como células adherentes sobre microportadores es tratado con un agente quelatador (v.gr., EDTA) a un pH más alto que el usado durante la proliferación de las células antes de la adición de una proteasa. En ciertas modalidades, el pH es monitoreado y ajustado según sea necesario para facilitar el desprendimiento de las células del sustrato de microportador . Después de que las células se han desprendido, entonces se puede añadir el medio fresco y/o esferas microportadoras al cultivo. En algunas modalidades, el cultivo, con o sin los microportadores originales es transferido a un recipiente de cultivo más grande antes, durante o después de la adición de medio, fresco y/o microportadores.

En ciertas modalidades, las células se lavan1 con un medio de lavado (v.gr., una solución de sal con pH regulado) antes de desprenderse. Los medios útiles para lavar células incluyen, pero no se limitan a, soluciones con H regulado con Hepes, solución salina con pH regulado con fosfato, solución salina con pH regulado con fosfato de Dulbecco, Hank ' s Balanced Salt Solución, solución salina balanceada de Earle. El proceso de lavado de las células implica reemplazar una porción o todo el medio (crecimiento y/o medio de lavado) con medio de lavado fresco (es decir, solución salina .con pH regulado). El proceso se puede repetir múltiples veces. Generalmente, las esferas microportadoras se dejan asentar durante un tiempo (v.gr., 10 a 40 minutos) y el medio de crecimiento es removido del recipiente. Opcionalmente , la remoción de medio de un cultivo de células se puede realizar mediante el uso de un dispositivo de flujo tangencial de esfuerzo cortante bajo alternante, véase, por ejemplo U.S. 6,544,424. En ciertas modalidades, entre aproximadamente 50% y aproximadamente 90% del medio (crecimiento y/o medio de lavado) es removido durante el paso de lavado. En ciertas modalidades, el medio es reemplazado por un volumen de medio de lavado (es decir, solución salina con pH regulado) que es menos de, el mismo, o mayor que, el volumen de medio que fue removido. En una modalidad, el medio de lavado se añade de tal manera que el volumen resultante de cultivo de células es entre aproximadamente 25% y aproximadamente 100% del volumen de trabajo original del cultivo de células. En una modalidad específica, un medio de lavado se añade a aproximadamente 40% a aproximadamente 60% del volumen de trabajo original del cultivo de células. En otra modalidad específica, un medio de lavado se añade a aproximadamente 90% a aproximadamente 100% del volumen de trabajo original del cultivo de células. En ciertas modalidades, las células se lavan dos o más veces.

En ciertas modalidades, el medio de lavado comprende un agente quelatador. Los agentes quelatadores que se pueden utilizar incluyen pero no se limitan a, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) , dietilentriamino-pentaacetato (DTPA) , ácido etileno-bis (oxietilen-trinitrilotetraacético (EGTA) . En una modalidad específica, el agente quelatador es EDTA. En ciertas modalidades, el medio de lavado comprende el agente quelatador a una concentración de entre aproximadamente 0.25 mM a aproximadamente 0.75 mM. En ciertas otras modalidades, el medio de lavado comprende el agente quelatador a una concentración de entre aproximadamente 0.4 mM a aproximadamente 0.6 mM. En una modalidad específica, el medio de lavado comprende el agente quelatador concentración de aproximadamente 0.5 mM.

En una modalidad, el pH del medio de lavado que comprende el agente quelatador es entre aproximadamente 7.6 y aproximadamente 8.4. En una modalidad específica, el pH del medio de lavado que comprende el agente quelatador es entre aproximadamente 7.8 y aproximadamente 8.2. En otra modalidad específica, el pH del medio de lavado que comprende el agente quelatador es entre aproximadamente 7.9 y aproximadamente 8.1. La adición de un medio de lavado que comprende un agente quelatador a un cultivo de células puede alterar el pH del cultivo de células resultante en el medio de lavado. Por consiguiente, en ciertas modalidades, el pH de un cultivo de células que es lavado con un medio de lavado que comprende un agente quelatador se ajusta a entre aproximadamente 7.6 y aproximadamente 8.4, según sea necesario, después de la adición del medio de lavado al cultivo de células. En una modalidad específica, el pH de un cultivo de células que es lavado con un medio de lavado que comprende un agente quelatador es ajustado a entre aproximadamente 7.8 y aproximadamente 8.2, según sea necesario, después de la adición del medio de lavado al cultivo de células. En otra modalidad específica, el pH de un cultivo de células que es lavado con a medio de lavado que comprende un agente quelatador es ajustado a entre aproximadamente 7.9 y aproximadamente 8.1, según sea necesario, después de la adición del medio de lavado al cultivo de células.

En ciertas modalidades, el cultivo de células es agitado después de la adición del medio de lavado que comprende el agente quelatador y previo a un paso de lavado adicional y/o la adición de una proteasa. La agitación del cultivo puede tener lugar mediante el uso de medios bien conocidos en la técnica, que incluyen pero no se limitan a, agitación, agitación oscilatoria, rotación, y similares. La velocidad y duración de agitación se determina por el volumen del cultivo, los componentes del medio de lavado, y el tipo de células en el cultivo de células. En ciertas modalidades, el cultivo de células se agita a una velocidad similar que la usada para la propagación de las células . En otras modalidades, el cultivo de células se agita a una velocidad más alta que la usada para la propagación de las células. Cuando se usa una velocidad de agitación más alta la velocidad se incrementa entre aproximadamente 10% y aproximadamente 90%, o entre aproximadamente 20% y aproximadamente 80%, o entre aproximadamente 30% y aproximadamente 70%, o entre aproximadamente 40% y aproximadamente 65%. En una modalidad específica, la velocidad de agitación usada es entre aproximadamente 40% y aproximadamente 65%. En algunas modalidades, el cultivo de células se incuba con el agente quelatador antes de la adición de proteasa con suficiente agitación para evitar que la mayoría de los microportadores se asienten en el fondo del recipiente de cultivo. En ciertas modalidades, el cultivo de células se agita durante entre aproximadamente 5 minutos y aproximadamente 60 minutos . En una modalidad específica, el cultivo de células se agita durante entre aproximadamente 20 y aproximadamente 40 minutos.

En ciertas modalidades, una proteasa (v.gr. , serina proteasa) se añade al cultivo de células durante un lavado pero después de cualquier agitación. En una modalidad específica, las células se lavan dos o más veces y la proteasa se añade durante el último lavado después de cualquier agitación. La proteasa es, en ciertos aspectos de la invención, una serina proteasa, o una cisteína proteasa, o una asparagina proteasa. En una modalidad específica, la proteasa es una serina proteasa (v.gr., tripsina, TrypLE, etc) . En otra modalidad, se usa la proteasa de Streptomyces griseus descrita en la solicitud de E.U.A. No. 11/455,818. La tripsina puede ser de una fuente animal o, muy preferiblemente, es de una fuente recombinante . La cantidad de proteasa añadida para efectuar desprendimiento bajo estas condiciones será, por lo menos 5X menor de la que se necesita si las células no han sido pre-tratadas con un agente quelatador y se podrá determinar por el volumen del volumen del cultivo y la concentración de la proteasa. A manera de ejemplo, la TrypLE™ Express comercialmente disponible provista como un abastecimiento de 10X, generalmente se usaría a una concentración final de aproximadamente IX (véase, por ejemplo, Invitrogen™ TrypLE Select Product News) para desprender células altamente adherentes, tales como células MDCK. Como se demuestra aquí (véase sección 8.3), la concentración final de TrypLE™ requerida para desprender células de microportadores es 0.05X, una reducción de 20 veces. Por consiguiente, en ciertas modalidades, la concentración final de proteasa añadida al cultivo de células es entre aproximadamente 0. IX y aproximadamente 0.0125X, o entre aproximadamente 0. IX y aproximadamente 0.0125 X, o entre aproximadamente 0. IX y aproximadamente 0.025, o entre aproximadamente 0. IX y aproximadamente 0.05 X, o entre aproximadamente 0. IX y aproximadamente 0.075 X, o entre aproximadamente 0.075X y aproximadamente 0.0125X, o entre aproximadamente 0.05X y aproximadamente 0.0125X, o entre aproximadamente 0.025X aproximadamente 0 .0125X, o entre aproximadamente 0.075X aproximadamente 0.025X o aproximadamente 0 .5X, aproximadamente 0. IX, o aproximadamente 0. 09X, aproximadamente 0.08X, o aproximadamente 0. 07X, aproximadamente 0.06X o aproximadamente 0. 05X, aproximadamente 0. 04X o aproximadamente 0.02X, en donde representa la concentración final de proteasa necesaria para desprender células que no han sido be pretratadas con un agente quelatador bajo condiciones de disociación idénticas. También se entenderá que IX puede representar la concentración de trabajo final después de dilución de un abastecimiento concentrado de proteasa (v.gr., una proteasa suministrada como un abastecimiento de 10X) y que este abastecimiento de trabajo se puede diluir adicionalmente para obtener concentraciones de menos de IX.

La transferencia esfera a esfera reproducible en fabricación gran escala generalmente hace uso de múltiples pasos de lavado, por ejemplo para asegurar que el cultivo de células pre-tratado con proteasa contenga inhibidores de proteasa mínimos o como se describió antes para reducir al mínimo y/o eliminar la necesidad de una proteasa. Sin embargo, para procesos comerciales a gran escala estos procesos de lavado pueden ser costosos de implementar y pueden dar por resultado contaminaciones que contribuyan a fallas en las operaciones de producción, falta de robustez en los procesos de fabricación y reducciones en productividad,. Por consiguiente, la presente invención provee métodos nuevos para superar estos inconvenientes al eliminar los pasos de lavado de cultivo de células durante transferencia esfera a esfera. Los métodos para efectuar transferencia esfera a esfera que reducen o incluso eliminan la necesidad de procesos de; lavado incluyen pero no se limitan al método ilustrado en los ejemplos de la sección 8.5. En particular, los inventores han determinado que el pretratamiento con un agente quelatador (v.gr., EDTA) antes del tratamiento con proteasa puede eliminar la necesidad de remover los medios de crecimiento media y lavar las células. Además, al suplementar los medios frescos con componentes de medio adicionales (v.gr., cationes divalentes y/o elementos traza) no hay necesidad de layar las células después del tratamiento con proteasa. ; En algunas modalidades, la transferencia esfera a esfera es facilitada por la adición de un agente quelatador directamente al cultivo de células (es decir, sin lavar las células) antes de la adición una proteasa (v.gr., TrypLE) . Los agentes quelatadores que se pueden utilizar en los métodos se describieron antes. En una modalidad, el agente quelatador es capaz de quelatar cationes divalentes (v.gr., Ca2+ y Mg2+) . En una modalidad específica, el agente quelatador es EDTA. En algunas modalidades el agente quelatador se añade al cultivo de células a una concentración final de entre 0.5 mM y 5 mM, o entre aproximadamente 0. 5 mM y aproximadamente 4 mM, o entre aproximadamente 0 .5 mM y aproximadamente 3 mM, o entre aproximadamente 0 .5 mM y aproximadamente 2 mM, o entre aproximadamente 0. .5 mM y aproximadamente 1.5 mM, o entre aproximadamente 0 .5 mM y aproximadamente 1 mM, o entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 5 mM, o entre aproximadamente 1 .5 mM y aproximadamente 5 mM, o entre aproximadamente 2 .0 mM y aproximadamente 5 mM, o entre aproximadamente 3 .0 mM y aproximadamente 5 mM, o entre aproximadamente 4 .0 mM y aproximadamente 5 mM, o entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente- 2 mM. En una modalidad específica, el agente quelatador se añade al cultivo de células a una concentración final de aproximadamente 2 mM. Después de la adición del agente quelatador, el cultivo de células entonces se puede incubar durante un período previo a la adición de proteasa. En algunas modalidades, el cultivo de células es incubado con el agente quelatador durante entre aproximadamente 0 min y aproximadamente 120 min, o entre aproximadamente 0 min y aproximadamente 90 min, o; entre aproximadamente 0 min y aproximadamente 60 min, o entre aproximadamente 0 min y aproximadamente 30 min, o. entre aproximadamente 30 min y aproximadamente 120 min, o entre aproximadamente 60 min y aproximadamente 120 min, o entre aproximadamente 90 min y aproximadamente 120 min, o entre aproximadamente 30 min y aproximadamente 90 min, o aproximadamente 60 min antes de la adición de proteasa. En ciertas modalidades, el cultivo de células se agita después de la adición del agente quelatador y antes de la adición de una proteasa. Las medias, velocidades y duración de agitación, se describieron antes y pueden ser optimizadas por un experto en la técnica sin experimentación extraordinaria. En una modalidad específica, el cultivo de células se incuba con el agente quelatador antes de la adición de proteasa con suficiente agitación para evitar que la mayoría de los microportadores se asienten en el fondo del recipiente de cultivo .

Antes de la adición de la proteasa el pH del cultivo de células quelatado se puede ajustar, por ejemplo, al pH óptimo para la proteasa. En una modalidad específica, el pH es ajustado a entre aproximadamente 7.8 y aproximadamente 8.2. Las proteasas que se pueden utilizar después del pretratamiento con un agente quelatador se detallaron anteriormente. En algunas modalidades, la concentración final de proteasa añadida al cultivo de células después del pretratamiento con un agente quelatador es entre aproximadamente 0. IX y aproximadamente 0.0125X, o entre aproximadamente 0. IX y aproximadamente 0.0125 X, o entre aproximadamente 0. IX y aproximadamente 0.025, o entre aproximadamente 0. IX y aproximadamente 0.05 X, o entre aproximadamente 0.; IX y aproximadamente 0.075 X, o entre aproximadamente 0.075X y aproximadamente 0.0125X, o entre aproximadamente 0.05X y aproximadamente 0.0125X, o entre aproximadamente 0.025X y aproximadamente 0.0125X, o entre aproximadamente 0.075X y aproximadamente 0.025X. En otras modalidades, la concentración final de proteasa añadida al cultivo de células después de pre-tratamiento con un agente quelatador es aproximadamente 0.09X, o aproximadamente 0.08X, o aproximadamente 0.07X, o aproximadamente 0.06X o aproximadamente 0.05X, o aproximadamente 0.04X o aproximadamente 0.02X, en donde IX representa la concentración de trabajo final después de dilución de un abastecimiento concentrado de proteasa (v.gr., una proteasa suministrada como un abastecimiento de 10X) . La duración de tratamiento con proteasa se puede determinar al monitorear el desprendimiento de células y puede variar según la concentración de proteasa usada. Los métodos para monitorear el desprendimiento de células son conocidos en la técnica e incluyen examen microscópico del cultivo de células. Una vez que las células se han desprendido, la proteasa puede ser inactivada (v.gr., mediante la adición de un inhibidor de proteasa tal como tripsina inhibidor de tripsina de haba) según sea necesario, y medio fresco y/o esferas microportadoras se pueden añadir después al cultivo. En algunas modalidades, el cultivo tratado con proteasa es transferido a un recipiente de cultivo más grande antes, durante o después de la adición de medio fresco y/o microportadores .

Para facilitar la unión nuevamente y el crecimiento de células después del tratamiento con proteasa, el medio fresco que se añade al cultivo de células es suplementado con uno o más componentes de medios que incluyen pero no se limitan a CaCl , MgCl2, MgS0 , elementos traza A, B y C. Esferas microportadoras adicionales también se añaden al cultivo. Concentraciones ilustrativas de CaCl2, MgCl2 y MgS04( en donde 90% o más de las células se unen nuevamente a microportadores se muestran en la tabla 25. Concentraciones ilustrativas de CaCl2, MgCl2, MgS04, elementos traza A, B y C, en donde las células se cuentan cuatro días después de la siembra en donde por lo menos 1.0E6 células/mL se muestran en la tabla 26. En ciertas modalidades, el medio es suplementado con entre aproximadamente 1.25 mM y aproximadamente |1,5 mM CaCl2, entre aproximadamente 0.1 mM y aproximadamente 0.2mM MgCl2, y entre aproximadamente 0.1 y aproximadamente 0.8 mM MgS04. En otras modalidades, el medio es suplementado además con aproximadamente 2X de elementos traza A, B y C. En algunas modalidades, el cultivo, con o sin los microportadores originales, es transferido a un recipiente de cultivo más grande antes, durante o después de la adición de medio suplementado fresco y microportadores .

En una modalidad, las células MDCK son cultivadas como células adherentes en un sistema de cultivo. Los sistemas de cultivo que se pueden utilizar para cultivar células MDCK incluyen por ejemplo, sistemas de cultivo por lotes y sistemas de cultivo por lotes alimentados, en donde nutrientes adicionales (v.gr., fuente de carbono, aminoácidos, etc) se añaden a medida que se agotan del medio inicial para facilitar el crecimiento a densidades de células altas. Alternativamente u opcionalmente , sistemas de cultivo por perfusión (v.gr., mediante el uso de sistemas de retención de células, tales como, por ejemplo, centrifugación, filtración, filtros de agitación y similares) se pueden usar para facilitar el intercambio de medio y/o suplementación de nutrientes agotados. En una modalidad específica, las células MDCK no tumorigénicas son cultivadas como células adherentes en un sistema de cultivo por lotes sin intercambio de medio/suplementación (v.gr., alimentación o perfusión) mediante el uso de un medio libre de suero de la invención (v.gr., MediV SFM 110) . Una guía adicional con respecto al cultivo de células MDCK (v.gr., células MDCK no tumorigénicas) como células adherentes se puede encontrar, por ejemplo, en las solicitudes de patente de E.U.A. Nos. 2003/0108860; 2005/0118140; y publicación del PCT WO 2008/105931. Los sistemas de cultivo comúnmente usados útiles para cultivo de células MDCK incluyen biorreactores de recipiente agitado.

Condiciones de Cultivo de Virus de la Influenza La presente invención provee métodos para el cultivo de células MDCK (v.gr. , células MDCK no tumorigénicas) y otras células de animales en formulaciones de medio libre de suero como se expuso anteriormente. Se contempla específicamente que condiciones de cultivo adicionales pueden jugar un papel en el mantenimiento de las propiedades de las células MDCK, que incluyen ser no tumorigénicas, ser no oncogénicas, crecer como células adherentes, crecer como células no adherentes, tener una morfología tipo epitelial, soportar la replicación de varios virus, y soportar el crecimiento de virus de la influenza (v.gr. , adaptados al frío, y/o sensible a la temperatura, y/o atenuados) a título alto, v.gr., un log10 TCID50/mL y/o un loglOFFU/mL de por lo menos aproximadamente 7.8, o por lo menos aproximadamente 8.0, o por lo menos aproximadamente 9.0. Estas condiciones de cultivo incluyen, pero no se limitan a, la elección de superficie adherente, densidad de células, temperatura, concentración de C02, método de cultivo, velocidades de agitación, contenido de oxígeno disuelto y pH.

Se contempla específicamente que las condiciones de cultivo pueden ser adaptadas en un número de formas para optimizar el crecimiento de células MDCK (v.gr., células MDCK no tumorigénicas) . Esas adaptaciones también pueden dar por resultado un incremento en la producción de material viral (v.gr., virus), como se describe, por ejemplo, en la publicación de solicitud de patente No. 2005/0118698. Alternativamente, las condiciones de cultivo pueden ser adaptadas para optimizar la producción de material de vacuna de células MDCK sin considerar el crecimiento de las células. Estas condiciones de cultivo incluyen pero no se limitan a superficie adherente, densidad de células, temperatura, C02 concentración, método de cultivo, contenido de oxígeno disuelto y pH.

En una modalidad, células MDCK (v.gr., células MDCK no tumorigénicas) son cultivadas a una concentración de C02 de por lo menos 1%, o de por lo menos 2%, o de por lo menos 3%, o de por lo menos 4%, o de por lo menos 5%, o de por lo menos 6%, o de por lo menos 7%, o de por lo menos 8%, o de por lo menos 9%, o de por lo menos 10%, o de por lo menos 20%.

En una modalidad, la concentración de oxígeno disuelto (DO) (valor de p02) es regulado ventajosamente durante el cultivo de MDCK y está en el intervalo de 5% y 100% (con base en la .saturación de aire) , o entre 10% y 60%. En una modalidad específica, la concentración de oxígeno disuelto (DO) (valor de p02) es por lo menos 10%, o por lo menos 20%, o por lo menos 30%, o por lo menos 50%, o por lo menos 60%. En una modalidad específica, la concentración de DO se mantiene a 50%. En una modalidad particular, el DO se hace fluir hasta 50% y después se mantiene a ese nivel. Los métodos para mantener los noveles de DO incluyen, por ejemplo, salpicar con oxígeno puro.

Puesto que la agitación de los cultivos de células generalmente, y la salpicadura en particular puede dar por resultado espumación, en ciertas modalidades, se añade un agente anti-espumación a un cultivo de células para reducir la espumación. Los agentes anti -espumación útiles para cultivo de células de mamífero se obtienen fácilmente de un número de fuentes comerciales que incluyen, por ejemplo, Invitrogen, Dow Corning, Sigma, y otros. Los agentes anti -espumación específicos incluyen pero no se limitan a, Antifoam C Emulsión (emulsión antiespuma C) y FoamAway™ . En una modalidad específica, Antifoam C Emulsión se añade al cultivo a entre aproximadamente 10 ppm y aproximadamente 1000 ppm, o a entre aproximadamente 25 ppm y aproximadamente 750 ppm, o entre aproximadamente 50 ppm y aproximadamente 500 ppm, o entre aproximadamente 75 ppm y aproximadamente 250 ppm, o entre aproximadamente 50 ppm y aproximadamente 150 ppm. En ciertas modalidades, el agente anti-espumación se añade al cultivo de células dos veces al día, o una vez al día, o un día sí y un día no. En otras modalidades, el agente anti -espumación se añade al medio de cultivo antes de la adición de células MDCK.

En otra modalidad, el pH del medio de cultivo usado para el cultivo de las células MDCK no tumorigénicas es regulado durante el cultivo y está en el intervalo de pH 6.4 a pH 8.0, o en el intervalo de pH 6.8 a pH 7.4. En una modalidad específica, el pH del medio de cultivo está a aproximadamente 6.4, o a aproximadamente 6.6, o a aproximadamente 6.8, o a aproximadamente 7.0, o a aproximadamente 7.2, o a aproximadamente 7.4, o a aproximadamente 7.6, o a aproximadamente 7.8, o por lo menos 8.0. En una modalidad particular, el pH del medio de cultivo es aproximadamente 7.4.

En una modalidad adicional, las células MQCK son cultivadas en un medio libre de suero de la invención a una temperatura de 25°C a 39°C. Se contempla específicamente que el cultivo temperatura se puede variar según el proceso deseado. Por ejemplo, las células MDCK no tumorigénicas se pueden hacer crecer a 37 ± 2°C para proliferación de las células y a una temperatura más baja (v.gr., 25°C a 35°C) para la producción de material de vacuna (v.gr., virus) . En otra modalidad, las células son cultivadas a una temperatura de menos de 30°C, o de menos de 31°C, o de menos de 32°C, o de menos de 33 °C, o de menos de 34 °C para la producción de material de vacuna. En otra modalidad, las células son cultivadas a una temperatura de 30°C, o 31°C, o 32°C, o 33°C, o 34 °C para la producción de material de vacuna. En una modalidad específica, las células son cultivadas ;a una temperatura de 33± 2°C para la producción de material de vacuna .

En ciertas modalidades, las células MDCK son cultivadas en un medio libres de suero de la invención en un biorreactor de recipiente agitado (v.gr. , biorreactóres de plástico de un solo uso, vidrio o acero inoxidable reutilizable) y uno o más parámetros seleccionados del grupo que consiste de temperatura, velocidad de agitación, pH, oxígeno disuelto (DO) , velocidad de flujo de 02 y C02, son monitoreados y/o controlados. En una modalidad, la temperatura se mantiene a entre aproximadamente 30°C y aproximadamente 42 °C, o entre aproximadamente 33 °C y aproximadamente 39°C, o entre aproximadamente 35°C y aproximadamente 38°C. En una modalidad específica, la temperatura se mantiene a aproximadamente entre aproximadamente 36°C y aproximadamente 38°C. En una modalidad, la velocidad de agitación se mantiene a entre aproximadamente 100 y 200 rpm. En una modalidad específica, se utiliza un biorreactor de un solo uso y la velocidad de agitación se mantiene a entre aproximadamente 80 y aproximadamente 120 rpm, o entre aproximadamente 90 y aproximadamente 100 rpm. En otra modalidad específica, se utiliza un biorreactor reutilizable y la velocidad de agitación se mantiene a entre aproximadamente 150 y aproximadamente 200 rpm, o entre aproximadamente 160 y aproximadamente 180 rpm. Las velocidades de agitación son controladas por medios bien conocidos en la técnica. El tipo y tamaño del biorreactor utilizado, así como el tipo y número de impulsor (es) usado puede requerir que la velocidad de agitación sea ajustada para aumentar al máximo el crecimiento celular y/o reducir al mínimo el daño celular.

En otra modalidad, el pH del cultivo de células MDCK se mantiene a entre aproximadamente 6.4 y pH 8.0. En una modalidad específica, el pH del cultivo de inicio es entre aproximadamente 6.8 y aproximadamente 7.6 y el pH del cultivo se mantiene a aproximadamente 7.0 y aproximadamente 7.5 durante el proceso de cultivo. El pH inicial puede ser más bajo o más alto que el intervalo deseado y se puede dejar que el pH aumente o disminuya al nivel deseado (v.gr., 7.4), en donde es mantenido. En una modalidad particular, el pH se mantiene a aproximadamente 7.4. El pH puede ser controlado al salpicar C02 y/o al añadir ácido (v.gr., HCl) o base (v.gr., NaOH, NaHC03, Na2C03) , según sea necesario.

En otra modalidad adicional, el intervalo aceptable para el DO es entre aproximadamente 100 y aproximadamente 35%. En una modalidad específica, el DO del cultivo de células MDCK se mantiene a entre aproximadamente 35% y aproximadamente 50%, o a aproximadamente 50%. En otra modalidad específica, el DO no debe caer por abajo de aproximadamente 35%. En ciertas modalidades, el DO inicial puede ser 100% y se puede dejar que el DO caiga hasta un nivel predeterminado (v.gr., 50%), en donde es mantenido. El DO es mantenido, por ejemplo, al salpicar 02. En ciertas modalidades, la velocidad de flujo de 02 se mantiene a menos de aproximadamente 2.0 L/min. En ciertas modalidades, la velocidad de flujo de C02 se mantiene a menos de aproximadamente 0.4 L/min. En otras modalidades adicionales, una velocidad de flujo total constante es mantenida (v.gr. , 40 mL/min) y N2 gaseoso es suministrado para mantener la velocidad de flujo. Por consiguiente, el suministro dé N2 gaseoso se puede calcular de 02 y C02 gaseosos usados para mantener el DO y pH.

El contenido de glucosa, glutamina, lactato,¡ otros componentes del medio, así como el pH y valor de p02; en el medio y otros parámetros, tales como agitación, pueden ser fácilmente manipulados durante el cultivo de las células MDCK no tumorigénicas, de tal manera que la densidad de células y/o producción de virus es optimizada.

Condiciones de Cultivo de Virus de Sincicio Respiratorio En una modalidad específica, las células son cultivadas antes de infección con un virus asociado con. células descrito en la presente para lograr un cierto conteo de células viables total. Por ejemplo, las células Vera1 pueden ser cultivadas en VP-SFM suplementado con 4 mM de L-glutamina y 1% CDLC) a aproximadamente 37 °C y se miden los conteos de células viables totales y viabilidad de la célula. ¡En una modalidad específica, las células son infectadas con virus asociados con células cuando se logra un cierto conteo de células viables promedio. Por ejemplo, un conteo de células viables promedio de aproximadamente 1.5 x 10 células/recipiente de cultivo de tejido o más se puede lograr antes de que las células sean infectadas con un virus asociado con células descrito en la presente, tal como RSV. En una modalidad, un conteo de células viables promedio de aproximadamente 1 x 106 células/recipiente de cultivo de tejido a aproximadamente 1 x 1014 células/recipiente de cultivo de tejido como se mide mediante el uso de, v.gr., un contador de Vi-cell, se logra antes de que las células sean infectadas con un virus asociado con células descrito en la presente. En otra modalidad, un conteo de células viables promedio de aproximadamente 1 x 10s células/recipiente de cultivo de tejido, aproximadamente 5 x 106 células/recipiente de cultivo de tejido, aproximadamente 1 x 107 células/recipiente de cultivo de tejido, o aproximadamente 5 x 107 células/recipiente de cultivo de tejido como se mide mediante el uso de, v.gr., un contador de células Vi, se logra antes de que las células sean infectadas con un virus asociado con células descrito en la presente. En otra modalidad, un conteo de células viables promedio de aproximadamente 1 x 108 células/recipiente de cultivo de tejido, aproximadamente 5 x 108 células/recipiente de cultivo de tejido, aproximadamente 1 x 109 células/recipiente de cultivo de tejido, aproximadamente 5 x 109 células/recipiente de cultivo de tejido, o aproximadamente 1 x 1010 células/recipiente de cultivo de tejido como se mide mediante el uso de, v.gr., un contador de células Vi, se logra antes de que las células sean infectadas con un virus asociado con células descrito en la presente.

Una multiplicidad de infección (MOI, por sus siglas en inglés) que se determina que es óptima para las células escogidas se usa para infectar células. En Una modalidad específica, una MOI de aproximadamente 0.0001 a aproximadamente 1 o aproximadamente 0.0005 a 0.005 se usa para infectar las células descritas en la presente. En otra modalidad, una MOI de aproximadamente 0.0001, aproximadamente 0.0005 o aproximadamente 0.00075 se usa para infectar las células descritas en la presente. En otra modalidad, una MOI de aproximadamente 0.001, aproximadamente 0.005, aproximadamente 0.0075 o aproximadamente 0.01 se usa para infectar las células descritas en la presente. En otra modalidad más, una MOI de aproximadamente 1 0.05, aproximadamente 0.075, aproximadamente 0.1 o aproximadamente 0.5 se usa para infectar las células descritas en la presente. En una modalidad específica, una MOI de aproximadamente 0.01 de rA2cp248/404/1030ASH se usa para infectar células Vera.

Células infectadas con virus asociados con células se pueden incubar durante un período en medios y bajo condiciones (v.gr., temperatura, condiciones de C02, y pH) que son apropiadas para la línea de células escogida y dan por resultado rendimientos óptimos de título de virus. Por ejemplo, las células Vera infectadas con una RSV, tal como rA2cp248/404/l030ASH, se pueden incubar en un medio SF4MegaVir (Invitrogen Corp., Carlsbad CA) suplementado con 4 mM de L-glutamina y incubada a aproximadamente 30°C durante aproximadamente 10 días sin C02 antes de que el virus sea cosechado. En algunas modalidades, las células infectadas con RSV (v.gr., células infectadas con RSV Vera) son incubadas durante aproximadamente 8 a 14 días antes de que el virus sea cosechado. En modalidades específicas, las células infectadas con RSV son incubadas durante aproximadamente 81 días, preferiblemente aproximadamente 9 días, aproximadamente 10 días, aproximadamente 11 días, o aproximadamente 12 días antes de que el virus sea cosechado.

Las células infectadas con virus asociados con células descritas en la presente pueden ser cultivadas en cualquier recipiente de cultivo de tejido conocido por un experto en la técnica. En algunas modalidades, las células infectadas con virus asociados con células son cultivadas en matraces T-75 o matraces T-225. En otras modalidades, las células infectadas con virus asociados con células son cultivadas en recipientes de cultivo de tejidos de 1 litro, 2 litros, 3 litros, 4 litros o 5 litros. En una modalidad específica, las células infectadas con virus asociados con células son cultivadas en por lo menos 40 botellas rodantes con volumen de trabajo de 500 mL. En una modalidad específica, las células infectadas con virus asociados con células son cultivadas en un recipiente de cultivo de tejido de 4 litros, tal como una botella rodante. En otras modalidades, las células infectadas con virus asociados con células - son cultivadas en recipiente de cultivo de tejidos de 10 litros, 15 litros, 20 litros o 25 litros. En otras modalidades, las células infectadas con virus asociados con células son cultivadas en recipiente de cultivo de tejidos 50 litros, 75 litros o 100 litros. En otras modalidades, las ¡células infectadas con virus asociados con células son cultivadas en recipiente de cultivo de tejidos 250 litros, 500 litros1 o 1000 litros. Los recipientes de cultivo de tejidos que se , pueden usar incluyen matraces, botellas rodantes, biorreactores y cualquier otro recipiente de cultivo de tejidos conocido por un experto en la técnica.

Producción de Material de Vacuna La presente invención provee métodos robustos para la producción de virus en cultivo de células en las cuales se usan células MDCK (v.gr. , células MDCK no tumorigénicas) para producir virus. En particular, la presente invención provee métodos para la producción de virus de la influenza a títulos altos, sin intercambio de medio o suplementación .

En una modalidad, el método para producir virus de la influenza comprende los siguientes pasos: (a) proliferar células MDCK en un medio de cultivo libre de suero, mientras se mantienen una o más condiciones de cultivo seleccionadas del grupo que consiste de una velocidad de agitación de entre aproximadamente 100 y 200 rpm, un pH de entre aproximadamente 6.0 a aproximadamente 7.8, una temperatura de entre aproximadamente 33 °C y aproximadamente 42 °C, y oxígeno disuelto (DO) entre aproximadamente 35% y aproximadamente 100%; (b) infectar las células MDCK proliferadas con un virus de la influenza sin intercambiar el medio de cultivo; y (c) incubar las células MDCK proliferadas infectadas bajo condiciones que permiten la replicación del virus de la influenza.

Los virus de la influenza que puede ser producido por los métodos de la invención se describen aquí (véase, por ejemplo, Secciones 6.2 y 6.7), e incluyen pero no se limitan a, virus rearreglados que incorporan antígenos de hemaglutinina y/o neuraminidasa seleccionados en el contexto de un virus donador maestro atenuado, sensible a la temperatura, adaptado al frío {ca/ts/att) . Por ejemplo, el virus puede comprender los esqueletos (o uno o más segmentos de AR v) del virus donador maestro que son uno o más de, v.gr., sensibles a la temperatura (ts), adaptados al frío (ca) , o atenuados (att) (v.gr., A/Ann Arbor/6/60, B/Ann Arbor/1/66, PR8 , B/Leningrad/14/17/55 , B/14/5/1, B/USSR/60/69, B/Leningrad/179/86, B/Leningrad/14/55 , B/England/2608/76 , etc.) . Los métodos para la producción de cepas de vacuna contra la influenza reordenadoras ya sea en huevos o líneas de células incluyen, por ejemplo, aquellas descritas en Kilbourne, E. D. en Vaccines (2a edición), ed. Plotkin y Mortimer, WB Saunders Co . (1988) y aquellas descritas en las publicaciones de solicitud de patente del PCT Nos. WO 05/062820 y WO 03/091401, y en las patentes de E.U.A. Nos. 6,951,754, 6,887,699, 6,649,372, 6,544,785, 6,001,634, 5,854,037, 5,824,536, 5,840,520, 5,820,871, 5,786,199, y 5,166,057 y publicaciones de solicitud de patente de E.U.A. Nos. 20060019350, 20050158342, 20050037487, 20050266026, 20050186563, 20050221489, 20050032043, 20040142003, 20030035814, y 20020164770. Otros virus de la influenza que pueden ser producidos por los métodos de la invención incluyen virus de la influenza recombinantes que pueden expresar un producto de gen heterólogo, véase, por ejemplo, publicaciones de patente de E.U.A. Nos. 2004/0241139 y 2004/0253273. En ciertas modalidades, el método se usa para producir virus de la influenza adaptados al frío, y/o sensible a la temperatura, y/o atenuados. ; En una modalidad específica, los virus de la influenza son producidos a un título viral pico log10 TCID50/mL y/o logioFFU/mL de por lo menos aproximadamente 8.0. En otras modalidades, los virus de la influenza son producidos a un título viral pico logio TCIDS0/mL y/o log10 FFU/mL de por lo menos aproximadamente 8.1, o de por lo menos 8.2, o de por lo menos 8.3, o de por lo menos 8.4, o de por lo menos 8.5, o de por lo menos 8.6, o de por lo menos 8.7, o de por lo menos 8.8, o de por lo menos 8.9, o de por lo menos 9.0.

En ciertas modalidades, las células MDCK proliferan como células adherentes . En una modalidad específica, las células MDCK son células MDCK no tumorigénicas y proliferan como células adherentes. En otra modalidad específica, las células MDCK se seleccionan del grupo que consiste de depósitos de ATCC Nos. PTA-6500, PTA-6501, PTA-6502, PTA-6503, PTA-7909 y PTA-7910) , y proliferan como células adherentes. Los biorreactores y métodos útiles para la proliferación de células adherentes se han descrito anteriormente (véase secciones 6.3.2 y 6.3.3). En otras modalidades, las células MDCK proliferan como células no adherentes. Los métodos para proliferación de células MDCK no adherentes son conocidos en la técnica, véase, por ejemplo patentes de E.U.A. No: 6,455,298. Condiciones de cultivo adicionales tales como, por ejemplo, temperatura, velocidad de agitación, pH, p02, concentración de C02, y densidad de células de siembra se describieron con detalle anteriormente (véase secciones 6.3.2 y 6.3.3) .

En una modalidad específica, las células MDCK proliferan como células adherentes en un biorreactor de recipiente agitado. En ciertas modalidades del método, la temperatura, velocidad de agitación, pH, valor de p02, concentración de C02 y otros parámetros del medio de cultivo a cultivo las células son regulados durante el cultivo como se describió antes (véase secciones 6.3.2 y 6.3.3). En ciertas modalidades, las células MDCK proliferan a una densidad de células de entre aproximadamente 5 x 105 a aproximadamente 3 x 106. Alternativamente, u opcionalmente las células MDCK proliferan durante un período establecido. La densidad de siembra inicial, duplicación de tiempo y densidad de células final deseada determinarán el período para la proliferación. En esas modalidades, las células, por ejemplo, pueden proliferar durante 1 a 10 días, o durante 2 a 8 días, o durante 3 a 7 días. En algunas modalidades, las células MDCK proliferan durante aproximadamente 3 a aproximadamente 5 días.

En ciertas modalidades, el medio libre de suero es un medio libre de suero enriquecido como se describe en la presente (véase sección 6.3.1). En una modalidad, el medio libre de suero comprende un hidrolizado vegetal, un suplemento de lípido, elementos traza, y es fortificado con uno o más componentes de medio seleccionados del grupo que consiste de putrescina, aminoácidos, vitaminas, ácidos grasos y nucleósidos. En otra modalidad, el medio libre de suero comprende todos los componentes del medio MediV SFMllO listado en la tabla 3. En una modalidad específica, el medio libre de suero consiste esencialmente de todos los componentes del medio MediV SFM110 listado en la tabla 3. En otra modalidad específica, el medio libre de suero consiste de los componentes listados en la tabla 3 a las concentraciones finales indicadas. En ciertas modalidades, el medio libre de suero comprende glucosa a una concentración final de aproximadamente 4.5 g/L. En otras modalidades el medio libre de suero comprende glucosa a una concentración final de aproximadamente 9.0 g/L.

Los virus de la influenza que se pueden usar para infectar las células (paso (b) ) incluyen, pero no se limitan a, aquellos que se han descrito en la presente (véase, v.gr., secciones 6.2 y 6.7) . La cantidad de virus que se ha de añadir para infectar las células (referidas aquí como la "entrada viral") se pueden medir como el número de virus añadidos por célula (también comúnmente referidas como la multiplicidad de infección, o MOI) . En algunas modalidades, la infección de las células con virus se lleva a cabo mediante el uso de una entrada viral de aproximadamente 0.00001 FFU/células a aproximadamente 10 FFU/célula, o aproximadamente 0.00001 FFU/célula a aproximadamente 1 FFU/célula, o aproximadamente 0.00001 FFU/célula a aproximadamente 0.1 FFU/célula, o aproximadamente 0.00001 FFU/célula a aproximadamente 0.001 FFU/célula. En una modalidad, la infección de células con virus se lleva a cabo mediante el uso de una entrada viral de aproximadamente 0.00001 FFU/célula a aproximadamente 0.0001 FFU/célula, o aproximadamente 0.00002 FFU/célula a aproximadamente 0.0002 FFU/célula. En una modalidad específica, la infección de las células con virus se lleva a cabo mediante el uso de una entrada viral de entre 0.00001 FFU/célula a 0.00005 FFU/célula. En otra modalidad específica, la infección de las células con virus se lleva a cabo mediante el uso de una entrada viral de entre 0.0001 FFU/célula a 0.0005 FFU/célula. Las siguientes fórmulas se pueden usar para determinar la cantidad de virus que se ha de añadir: Cantidad de virus en pL = Total de células x entrada1 viral (FFU/célula) /l0Títul° de virus FFA (FFU/mL) xlOOO.

Alternativamente, la cantidad de virus usados para infectar las células (es decir, entrada viral) se determina por la concentración final de virus en el cultivo. Por ejemplo, los virus se pueden añadir a una concentración final de aproximadamente lxlO3 FFU/mL a aproximadamente O.OOlxlO3 FFU/mL, o aproximadamente O.lxlO3 FFU/mL a aproximadamente O.OlxlO3 FFU/mL. Las siguientes fórmulas se pueden usar para determinar la cantidad de virus que se han de añadir para lograr la concentración final deseada: La cantidad de virus en iL = volumen de cultivo (mL) x concentración final (FFU/mL) /10 Título de Virus FFA (FFu/mL) ?1000 _ Opcionalmente , se puede añadir una proteasa que lleva aproximadamente la digestión de la proteína precursora de hemaglutinina [HA0] y por lo tanto la adsorción del virus en las células. La adición de una proteasa se puede llevar a cabo de conformidad con la invención poco antes, simultáneamente a o poco después de la infección de las células con virus de la influenza. Si la adición se lleva a cabo simultáneamente a la infección, la proteasa sé puede añadir directamente al cultivo de células que han !de ser infectadas o, por ejemplo, como un concentrado junto con el inoculado de virus. La proteasa, en ciertos aspectos: de la invención, es una serina proteasa, o una cisteína proteasa, o una asparagina proteasa. En una modalidad, se usa tripsina. En una modalidad específica, se usa tripsina tratada con TPCK. En una modalidad, se añade tripsina al cultivo de células hasta una concentración final de 1 a 5000 mU/mL, o 5 a 1000 mU/mL, o 100 a 500 mU/mL. En una modalidad alternativa, sei añade tripsina al cultivo de células hasta una concentración final de 1 a 200 pg/mL, o 5 a 50 pg/mL, o 5 a 30 pg/mL en el medio de cultivo.

La proteasa puede ser de una fuente animal o, muy preferiblemente, es de una fuente recombinante . Las prpteasas recombinantes adecuadas para usarse se obtienen fácilmente de un número de fuentes comerciales que incluyen, por ejemplo Invitrogen (TrypLE™) y Sigma-Aldrich (TrypZean™) , como una solución de abastecimiento (v.gr., 1X-100X) . En ciertas modalidades, una proteasa recombinante se usa a una concentración final de entre aproximadamente 0.01X y aproximadamente IX, o entre aproximadamente 0.02X y aproximadamente 0 .8X o entre aproximadamente 0.03X y aproximadamente 0. 7X, o entre aproximadamente 0.04X y aproximadamente 0. 6X, o entre aproximadamente 0.05X y aproximadamente 0. .5X, o entre aproximadamente 0.06X y aproximadamente 0. ,4X, o entre aproximadamente 0.07X y aproximadamente 0 .3X, o entre aproximadamente 0.8X y aproximadamente 0. 2X. En una modalidad específica, una proteasa recombinante se usa a una concentración final de entre aproximadamente 0.02X y aproximadamente 0.06X. En otra modalidad, la proteasa es una proteasa similar a tripsina recombinante, que incluyen pero no se limitan a TrypLE™ (Invitrogen) . En otra modalidad adicional, la proteasa es de St ep omyces griseus como se describe en la solicitud de E.U.A. No. 11/455,818.

Después de la infección, el cultivo de células infectadas es cultivado además para replicar el virus, en particular hasta que un efecto citopático máximo o una cantidad máxima de virus o antígeno puede ser detectada. En una modalidad, después de la infección, las células son cultivadas a una temperatura de entre 30°C y 37°C. En ciertas modalidades, después de la infección con virus, las células son cultivadas a una temperatura de menos de 39°C, o menos de 38°C, o menos de 37°C, o menos de 36 °C, o menos de 35°C, o menos de 34°C, o menos de 33°C, o menos de 32°C, o menos de 31°C, o menos de 30°C. El cultivo de las células infectadas a temperaturas por abajo de 33°C, en particular en los intervalos de temperatura indicados anteriormente, conduce a la producción de rendimientos más altos de ciertos virus de la influenza, tales como, por ejemplo, cepas B (véase, -v.gr., publicación de patente de E.U.A. 2006/0153872) . Además, el cultivo de las células infectadas a temperaturas por abajo de 35 °C se contempla para la producción de virus de la influenza sensible a la temperatura, adaptado al frío (ts/ca) . Se contempla que el virus ts/ca también puede ser atenuado (att) . En otra modalidad, las células son cultivadas a una temperatura de menos de 30°C, o de menos de 3FC, o de menos de 32°C, o de menos de 33°C, o de menos de 34°C para la producción de cepas de influenza ts/ca. En una modalidad específica, las células son cultivadas a una temperatura de 3 FC, para la producción de cepas B de virus de la influenza. En otra modalidad adicional, después de la infección las células son cultivadas a una temperatura de 31 ±2°C.

En ciertas modalidades, la incubación de las células (paso (c) ) se lleva a cabo durante un período suficiente para producir rendimientos adecuados de virus, tal como 2 a 10 días, u opcionalmente 3 a 7 días, después de la infección. En una modalidad del método, la incubación de las células (paso (c) ) se lleva a cabo durante 2 días, o 3 días, o 4 días, o 5 días, o después de 6 días, o 7 días después de la infección.

En otras modalidades, la incubación de las células (paso (c) ) se lleva a cabo durante 40 a 96 horas después de la infección. En una modalidad específica, la incubación de las células (paso (c) ) se lleva a cabo durante aproximadamente 48 a aproximadamente 72 horas después de la infección.

En ciertas modalidades del método, las células, por ejemplo, pueden ser incubadas después de la infección con virus (paso (b) ) , de tal manera que la velocidad de agitación, pH, valor de p02, concentración de C02 y otros parámetros se mantienen como se describió antes (véase secciones 6.3.2 y 6.3.3) .

En ciertas modalidades, el método además comprende, después del paso (c) , el paso de cosechar el medio de cultivo que contiene el virus replicado (es decir, el medio de cultivo en el cual las células infectadas han crecido) . El medio de cultivo cosechado que contiene el virus replicado es también referido aquí como la "cosecha viral".

En una modalidad, cualesquiera microportadores utilizados en la propagación de las células MDCK se dejan asentar antes de cosechar el medio de cultivo que contiene el virus replicado. Opcionalmente , o alternativamente, el medio de cultivo que contiene el virus replicado puede ser cosechado mediante el uso de un dispositivo de flujo tangencial de esfuerzo cortante bajo alternante (ATF) , véase, por ejemplo U.S. 6,544,424. El uso de un dispositivo de ATF puede reducir o incluso eliminar el tiempo necesario para dejar que los microportadores se asienten antes de la cosecha. En otra modalidad, La cosecha viral es estabilizada con un regulador de pH adecuado .

En una modalidad específica, la cosecha viral es estabilizada mediante la adición de un regulador ¦ de pH concentrado que incluye pero no se limita a un regulador de pH de fosfato de sacarosa (SP) , que se puede añadir para obtener una concentración final de aproximadamente 218 mM de sacarosa, 11 mM de regulador de pH de fosfato a pH 7.0-7.4 en la cosecha viral estabilizada.

En otra modalidad específica, el paso de cosechar el medio de cultivo que contiene el virus replicado es acoplado a la purificación del virus replicado. Por ejemplo, el flujo tangencial alternante (ATF) se puede usar para cosechar el medio de cultivo que contiene el virus replicado y el material cosechado puede ser sometido directamente a uno o más de los pasos de purificación detallados anteriormente.

Purificación de Material de Vacuna La presente invención provee métodos robustos para la purificación de virus, en particular virus vivos para uso clínico que han sido replicados en cultivo de células. Los métodos de purificación de la invención se pueden usar para purificar virus de cultivos de células de mamífero que incluyen pero no se limitan a líneas de células de fibroblastos de pulmón diploides humanas (v.gr., MRC-5 y WI-38) , líneas de células de retinoblastoma humano, líneas de células de riñon humano (v.gr., PER.C6 y 293), líneas de células de pulmón de mono rhesus fetal (v.gr., FRhL2), líneas de células de riñon de mono verde africano (v.gr., Vera), y líneas de células de riñon de canino (v.gr., MDCK) . Los métodos de purificación de la invención dan una recuperación global alta del virus, en particular virus vivos y ,da por resultado niveles de ADN en célula hospedera (HCD) , proteína en célula hospedera (HCP) y endonucleasa no específica (v.gr. Benzonase) , que están por debajo de las especificaciones requeridas por las agencias reguladoras.

La reducción de la cantidad de HCD de preparaciones de virus es particularmente importante para aquellos virus que se pretenden para uso clínico en animales (que incluyen humanos) . Además, se contempla que el tamaño de cualquier HCD residual debe ser menor que el tamaño promedio de un oncogén (1,925 pares de bases) para reducir el potencial oncogénico. Por consiguiente, en un aspecto, la presente invención provee métodos para la purificación de virus de la influenza o RSV que reducen la cantidad y tamaño de cualquier HCD residual a niveles por abajo del aceptable para vacunas inyectables (la recomendación de la OMS es 10 ng por dosis para vacunas parenteralmente administradas; Griffiths, 1999, Dev Biol Stand. Basel, Karger, vol 98, pp 153-157) .

En ciertas modalidades, los virus purificados comprenden menos de aproximadamente 10 ng de HCD/dosis, o menos de aproximadamente 9 ng de HCD/dosis, o menos de aproximadamente 8 ng de HCD/dosis, o menos de aproximadamente 7 ng de HCD/dosis, o menos de aproximadamente 6 ng de HCD/dosis, o menos de aproximadamente 5 ng de HCD/dosis, o menos de aproximadamente 4 ng de HCD/dosis, o menos de aproximadamente 3 ng de HCD/dosis, o menos de aproximadamente 2 ng de HCD/dosis, o menos de aproximadamente 1 ng de HCD/dosis, o menos de aproximadamente 0.8 ng de HCD/dósis, o menos de aproximadamente 0.6 ng de HCD/dosis, o menos de aproximadamente 0.4 ng de HCD/dosis, o menos de aproximadamente 0.2 ng de HCD/dosis. En una modalidad específica, los virus purificados comprenden menos de aproximadamente 1 ng de HCD/dosis o menos de aproximadamente 0.8 ng de HCD/dosis, o menos de aproximadamente 0.6 ng de HCD/dosis, o menos de aproximadamente 0.4 ng de HCD/dosis, o menos de aproximadamente 0.2 ng de HCD/dosis.

En otras modalidades, los virus purificados son virus de la influenza y comprenden menos de aproximadamente 10 ng de HCD/7.0±0.5 logio FFU, o menos de aproximadamente 9 ng de HCD/7.0±0.5 logio FFU, o menos de aproximadamente 8 ng de HCD/7.0±0.5 logio FFU, o menos de aproximadamente 7 ng de HCD/7.0+0.5 logio FFU, o menos de aproximadamente 6 ng de HCD/7.0±0.5 logi0 FFU, o menos de aproximadamente 5 ng de HCD/7..0±0., 5 logio FFU, O menos de aproximadamente 4 : ng de HCD/7. .0±0. .5 logio FFU, O menos de aproximadamente 3 ng de HCD/7. .0±0. .5 logio FFU, O menos de aproximadamente 2 ng de HCD/7. ,0±0. .5 logio FFU, O menos de aproximadamente 1 ng de HCD/7. .0±0. .5 logio FFU, O menos de aproximadamente 0 .8 ng de HCD/7. ,0±0. .5 logio FFU, O menos de aproximadamente 0 .6 ng de HCD/7. .0±0. .5 ogio FFU, o menos de aproximadamente 0 .4 ng de HCD/7 , .0±0. .5 logio FFU, O menos de aproximadamente 0 .2 ng de HCD/7 , .0±0 , .5 logio FFU. En una modalidad específica, los virus purificados comprenden menos de aproximadamente 1 ng de HCD/7 , .0±0. .5 logio FFU o menos de aproximadamente 0 .8 ng de HCD/7 .0+0. .5 logio FFU, o menos de aproximadamente 0 .6 ng de HCD/7 .0±0 .5 logio FFU, o menos de aproximadamente 0 .4 ng de HCD/7 .0±0 , .5 logio FFU, o menos de aproximadamente 0 .2 ng de HCD/7 .0±0 .5 logio FFU. una modalidad, la cantidad de HCD se determina mediante el uso de una prueba PicoGreen. En otra modalidad, la cantidad de HCD se determina mediante el uso de una reacción en cadena de polimerasa en tiempo real (rtPC ) . Estas pruebas se pueden realizar mediante el uso de métodos ilustrados en el ejemplo provisto en la sección 8.6.

En ciertas modalidades, por lo menos aproximadamente 50%, o por lo menos aproximadamente 60%, o por lo menos aproximadamente 70%, o por lo menos aproximadamente 80% del HCD presente en los virus purificados es menos de aproximadamente 1000 pares de bases (pb) de longitud. En una modalidad específica, por lo menos aproximadamente 80% del HCD presente en los virus purificados es menos de aproximadamente 1000 pb de longitud. En otra modalidad específica, aproximadamente 90% del HCD presente en los virus purificados es menos de aproximadamente 1000 pb de longitud. En otras modalidades, por lo menos aproximadamente 40%, o por ló menos aproximadamente 50%, o por lo menos aproximadamente 60%, o por lo menos aproximadamente 70%, o por lo menos aproximadamente 80% del HCD presente en los virus purificados es menos de aproximadamente 500 pb de longitud. En una modalidad específica, por lo menos aproximadamente 60% del HCD presente en los virus purificados es menos de aproximadamente 500 pb de longitud.

En algunas modalidades, los virus purificados comprenden menos de aproximadamente 10 yg de HCP/dosis, o menos de aproximadamente 9 µg de HCP/dosis, o menos de aproximadamente 8 g de HCP/dosis, o menos de aproximadamente 7 µg de HCP/dosis, o menos de aproximadamente 6 pg de HCP/dosis, o menos de aproximadamente 5 µg de HCP/dosis, o menos de aproximadámente 4 µg de HCP/dosis, o menos de aproximadamente 3 µg de HCP/dosis, o menos de aproximadamente 2 µg de HCP/dosis, o menos de aproximadamente 1 µ de HCP/dosis, o menos de aproximadamente 0.8 µg de HCP/dosis, o menos de aproximadamente 0.6 µg de HCP/dosis, o menos de aproximadamente 0.4 yg de HCP/dosis, o menos de aproximadamente 0.2 yg de HCP/dosis. En una modalidad específica, los virus purificados comprenden menos de aproximadamente 1 ng de HCP/dosis, o menos de aproximadamente 0.8 pg de HCP/dosis o menos de aproximadamente 0.6 yg de HCP/dosis, o menos de aproximadamente 0.4 µg de HCP/dósis, o menos de aproximadamente 0.2 yg de HCP/dosis.

En otras modalidades, los virus purificados son virus de la influenza y comprenden menos de aproximadamente 10 yg de HCP/7. 0±0.5 logio FFU, o menos de aproximadamente 9 ug de HCP/7. .0±0. 5 logio FFU, o menos de aproximadamente 8 ug de HCP/7. .0±0. 5 logio FFU, o menos de aproximadamente 7 ug de HCP/7. .0±0. 5 logio FFU, o menos de aproximadamente 6 ug de HCP/7. .0±0. 5 logio FFU, o menos de aproximadamente 5 ug de HCP/7. .0+0. 5 logio FFU, o menos de aproximadamente 4 ug de HCP/7. .0±0. 5 logio FFU, o menos de aproximadamente 31 g de HCP/7. .0±0. 5 logio FFU, o menos de aproximadamente 2 ug de HCP/7. .0±0. 5 logio FFU, o menos de aproximadamente 1 ug de HCP/7. .0±0. 5 logio FFU, o menos de aproximadamente 0.8; ug de HCP/7. .0±0. 5 logio FFU, o menos de aproximadamente 0.6 ug de HCP/7. .0±0. , 5 logio FFU, o menos de aproximadamente 0.4 ug de HCP/7 , .0±0. , 5 logio FFU, o menos de aproximadamente 0.2 ug de HCP/7 , .0±0. , 5 logio FFU. En una modalidad específica, los virus purificados comprenden menos de aproximadamente 1 ng de HCP/7. .0±0. , 5 logio FFU, o menos de aproximadamente 0.8 ug de HCP/7.0±0.5 logio FFU o menos de aproximadamente 0.6 µ9 de HCP/7.0±0.5 logio FFU, o menos de aproximadamente 0.4 pg de HCP/7.0±0.5 logio FFU, o menos de aproximadamente 0.2 µg de HCP/7.0+0.5 log10 FFU.

En una modalidad, la cantidad de HCP se determina por una prueba inmunoabsorbente ligada a enzima (ELISA) mediante el uso de un anticuerpo contra HCP para detección. Esta prueba puede ser realizada mediante el uso de métodos ilustrados en el ejemplo provisto en la sección 8.6.

Los métodos para la preparación de partículas de virus inactivos/desintegrados para composiciones de vacuna son bien conocidos en la técnica y han sido utilizados durante más de 40 años. Sin embargo, estos métodos incorporan pasos desagradables, tales como el tratamiento con detergentes de formaldehído, que no puede ser utilizado para la preparación de partículas de virus intactos generalmente, ?< virus atenuados vivos en particular. Por consiguiente, la presente invención provee métodos para la purificación de virus intactos vivos (v.gr. , virus de la influenza o RSV) que utilizan membranas y condiciones para separar adecuadamente HCD y HCP de la cosecha viral . Los métodos de la presente invención dan una recuperación global alta de virus vivos. En una modalidad, la recuperación global de virus purificados es por lo menos 15%, o por lo menos 20%, o por lo menos 25%, o por lo menos 30%, o por lo menos 40%, o por lo menos 50%, o por lo menos 60%, o por lo menos 70%. Los métodos para monitorear la recuperación de virus vivos purificados incluyen pruebas diseñadas para medir infección y/o crecimiento viral. Por ejemplo, pruebas fluorescentes focales y pruebas de dosis infecciosas de cultivo de tejido mediana (TCID50) se pueden usar para monitorear la recuperación de virus de la influenza vivos purificados. En ciertas modalidades, el método de purificación de virus de la presente invención da una recuperación global de virus de por lo menos 30%, en donde los virus purificados comprenden menos de 0.1 ng de HCD, y menos de 0.3 ig HCP, y menos de 0.0050 ng de nucleasa no específica por 7.0±0.5 logio FFU de virus.

La purificación de cosechas de virus contiene múltiples pasos, que pueden ser optimizados según el virus y las condiciones de purificación. En ciertas modalidades, el proceso de purificación puede comprender cualquiera !de los siguientes, solos o en combinación, a) clarificación de cosecha viral; b) concentración y/o intercambio de regulador de pH; c) purificación por cromatografía y d) filtración estéril. Estos pasos pueden comprender pasos adicionales tales como el tratamiento con una endonucleasa no específica y estabilización de la cosecha viral o carga viral. Estos pasos se pueden realizar múltiples veces en el proceso de purificación y en un orden que aumenta al máximo la recuperación viral mientras remueve adecuadamente HCP y HCD, como se describió antes.

Los métodos útiles para la clarificación de una cosecha viral incluyen, pero no se limitan a, centrifugación, diálisis, y filtración por membrana, que incluye, pero no se limita a, métodos tales como de una sola pasada, extremo muerto, filtración de flujo directo (DFF, por sus siglas en inglés) en la cual el líquido fluye directamente a través del medio de filtro, y flujo cruzado o filtración de flujo tangencial (TFF, por sus siglas en inglés) en el cual el líquido fluye tangencial a (a lo largo de) la superficie de la membrana. Los sistemas de TFF se pueden operar para mantener una velocidad de flujo de filtrado constante (a menudo referido simplemente como "Flujo" y que pueden ser una medida como litros de permeado por metro cuadrado de membrana por hora (LMH, por sus siglas en inglés) ) o para mantener una presión de transmembrana constante (abreviada como "TMP" que se puede medir como kilogramos, por centímetro cuadrado (kg/cm2)). Sin embargo, el flujo constante y la TMP pueden ser regulados para evitar ensuciamiento de membrana. Las membranas para usarse en aplicaciones de filtración están disponibles de fuentes comerciales.

Dentro de la técnica, hay cuatro categorías comúnmente aceptadas de membranas definidas por el tamaño del material que remueven del líquido de vehículo. Estas son, de la del tamaño de poro más pequeño a la del más grande: membranas de osmosis inversa, membranas de nanofiltracion, membranas de ultrafiltracion, y membranas de microfiltracion . La filtración con las membranas antes mencionadas separa las moléculas de conformidad con su peso molecular mediante el uso de membranas con tamaños de poro específicos. Por ejemplo, la separación con membranas de osmosis inversa que tienen tamaños de poro menos de 0.001 mieras está diseñada para separar moléculas que tienen un peso molecular menos de 200 Dáltons. La filtración con membranas de nanofiltracion que tienen tamaños de poro de 0.001-0.008 mieras, inclusive, está diseñada para separar moléculas que tienen un peso molecular de 200 Dáltons a 15 kilodaltons (kDa) inclusive. La filtración con membranas de ultrafiltracion que tienen tamaños de poro de 0.005-0.1 mieras, inclusive, está diseñada para separar moléculas que tienen un peso molecular de 5 kDa - 300 kDa, inclusive. La filtración con membranas de microfiltracion que tienen tamaños de poro de 0.05-3.0 mieras, inclusive, está diseñada para separar moléculas que tienen un peso molecular de 100 kDa-3000 kDa y más grandes. Por consiguiente, la filtración por membrana puede separar moléculas de interés (v.gr., virus) de otros componentes celulares basados en exclusión de tamaño al utilizar membranas que tienen un corte de peso molecular particular (MWCO, por sus siglas en inglés) que se determina por el tamaño de poro de la membrana. El MWCO, también llamado límite de peso molecular nominal (NMWL, por sus siglas en inglés) o corte de peso molecular nominal (NMWCO, por sus siglas en inglés) , es la designación de tamaño de kilodalton para la filtración por membranas. La MWCO se define como el peso molecular de la molécula que es 90% retenida por la membrana. Por ejemplo, debido a que las moléculas del mismo peso molecular pueden tener formas significativamente diferentes, el MWCO no es una métrica exacta, sin embargo es una métrica útil y es comúnmente utilizada por fabricantes de filtros. Las membranas se pueden usar como hojas planas o en una configuración espiralmente enrollada. Las fibras huecas también se pueden usar según el tipo de método de filtración. Se puede usar cualquier número de materiales de membrana potenciales que incluye pero no se limita a celulosa regenerada, poliétersulfona (que puede o no ser modificada para alterar si carácter hidrofóbico inherente) , fluoruro de polivinilideno (PVDF) , y agregados de cerámica y óxido de metal, así como policarbonato , polipropileno, polietileno y PTFE (TEFLON®) . Se contempla que las combinaciones de métodos de filtración y tipos de membrana se pueden usar en la separación y que la capacidad de los filtros, columnas, etc., que comprenden membranas de separación se ajustarán según el volumen y/o concentración- de material que es procesado.

Los métodos útiles para concentrar y/o intercambiar regulador de pH incluyen, pero no se limitan a, diálisis, ultrafiltración (UF) y diafiltración (DF) . TFF puede incorporar ambos UF, que se pueden usar para concentrar, y DF, que se puede usar para intercambiar reguladores de pH. Además, el uso de UF y/o DF puede dar por resultado purificación adicional por el proceso de fraccionamiento que lava moléculas más pequeñas, que pueden ser contaminantes, a través de una membrana y deja moléculas de interés más grandes en el retenido. Por consiguiente, TFF, que incorpora UF y/o DF se puede usar para concentrar y/o intercambiar reguladores de pH y/o purificar., La elección de membranas para usarse en aplicaciones de filtración se ha descrito anteriormente. De conformidad con la invención, DF puede ser ya se DF discontinua o continua. En DF discontinua, la solución es concentrada, y el volumen perdido es reemplazado por un nuevo regulador de pH. En DF continuo, el volumen de solución es mantenido por el flujo entrante de solución reguladora de pH nueva, mientras la solución reguladora de pH vieja es removida .

En ciertas modalidades, el virus clarificado es concentrado aproximadamente 2X, o aproximadamente 3X, o aproximadamente 4X, o aproximadamente 5X, o aproximadamente 6X, o aproximadamente 7X, o aproximadamente 8X, o aproximadamente 9X, o aproximadamente 10X, o más, en donde "X" es igual al volumen de inicio total añadido al volumen de operación/retenido final. En una modalidad específica, el virus clarificado es concentrado entre aproximadamente 3X y aproximadamente 5X. En otra modalidad específica, el virus clarificado es concentrado aproximadamente 4X, en donde "X" es igual al volumen de inicio total añadido al volumen de operación/retenido final. En ciertas modalidades, el virus clarificado es concentrado aproximadamente 10X o más para incrementar la carga de todos los pasos de purificación subsecuentes. En ciertas modalidades, después de la concentración, aproximadamente 1 diavolumen, o aproximadamente 2 diavolúmenes, o aproximadamente 3 diavolúmenes, o aproximadamente 4 diavolúmenes, o aproximadamente 5 diavolúmenes, o aproximadamente 6 diavolúmenes, o aproximadamente 7 diavolúmenes, o aproximadamente 8 diavolúmenes, o aproximadamente 9 diavolúmenes o aproximadamente 10 diavolúmenes, o más diavolúmenes de regulador de pH son intercambiados por DF, en donde un diavolumen es el volumen total de' regulador de pH introducido al volumen de operación durante DF/retenido. En una modalidad específica, entre aproximadamente 4 diavolúmenes a aproximadamente 6 diavolúmenes de regulador de pH son intercambiados en donde un diavolumen es el volumen total de regulador de pH introducido al volumen de operación durante DF/retenido. En otra modalidad específica, aproximadamente 5 diavolúmenes of regulador de pH son intercambiados, en donde un diavolumen es el volumen total de regulador de pH introducido al volumen de operación durante DF/retenido.

En ciertas modalidades, el retenido, que comprende virus (v.gr. , influenza, SV) , es recolectado después de que el volumen deseado de regulador de pH es intercambiado. Después de la recolección del retenido, algunos virus ; pueden permanecer débilmente unidos a la membrana. Por consiguiente, en algunas modalidades, la membrana es enjuagada con regulador de pH de intercambio adicional que se añade al retenido recolectado. El retenido recolectado es también referido aquí como "carga viral condicionada" o como la "#XUF #XDF" en donde "#" indica ya sea el número de veces de la concentración o el número de diavolúmenes de regulador de pH intercambiado para los procesos de UF y DF, respectivamente. En una modalidad específica, una membrana con un M CO de 500 kDa se usa para la concentración e intercambio de regulador de pH. En algunas modalidades, la membrana se puede limpiar después del proceso y usarse de nuevo. En otras modalidades, se usa una membrana nueva para cada lote de virus clarificado. En otra modalidad específica, la cosecha clarificada es concentrada y el regulador de pH intercambiado como se ilustra en los ejemplos provistos en las secciones 8.6 y 8.6.3.

Los tipos de cromatografía útiles para la purificación de virus (v.gr., influenza o RSV) incluyen, pero ¦no se limitan a, cromatografía de afinidad así como cromatografía de intercambio de iones, y/o cromatografía de hidroxiapatita . En ciertas modalidades, se usa cromatografía de intercambio de iones. En una modalidad, se usa cromatografía de intercambio de cationes. En otra modalidad, se realiza cromatografía de intercambio de cationes a pH alto. En una modalidad, se usa cromatografía de intercambio de aniones. En una modalidad específica, se usa un intercambiador de aniones de amonio cuaternario fuerte (Q) (v.gr., Capto™ Q, GE Healthcare) En otra modalidad, se realiza cromatografía de intercambio de aniones a un pH bajo. El medio de aniones útil para cromatografía de intercambio de iones incluye, pero no se limita a, adsorbedores de membrana de aniones (v.gr., Sartobind® Q 15, D 15) y adsorbedores de membrana de cationes (v.gr., Sartobind S15 y C15) . En otra modalidad, se usa cromatografía negativa en donde las impurezas son unidas por intercambio de aniones o cationes y el virus es subsecuentemente separado o purificado de las impurezas tales como proteína y/o ácido nucleico de célula hospedera. Se contempla que la cromatografía se puede realizar en un proceso por lotes o alternativamente al utilizar un proceso de columna. En ciertas modalidades, la carga viral condicionada es purificada por cromatografía en columna.

Los métodos útiles para la remoción eficiente de contaminantes de HCD incluyen, junto con los otros pasos del proceso de purificación, tratamiento con una endonucleasa no específica (v.gr., Benzonase ). Sin embargo, para aquellos virus que están destinados para uso clínico en animales (que incluyen humanos) es deseable que la cantidad de endonucleasa no específica en el virus purificado final sea mínimo. Por consiguiente, en otro aspecto, la presente invención provee métodos para la purificación de virus que reduce la cantidad de cualquier endonucleasa no específica residual usada en el método a niveles por abajo del aceptable para vacunas inyectables.

En una modalidad, los virus purificados comprenden menos de aproximadamente 0.0060 ng, o menos de aproximadamente 0.0055 ng, o menos de aproximadamente 0.0050 ng, o menos de aproximadamente 0.0045 ng, o menos de aproximadamente 0.0040 ng, o menos de aproximadamente 0.0035 ng, o menos de aproximadamente 0.0030 ng, o menos de aproximadamente 0.0025 ng, o menos de aproximadamente 0.0020 ng, o menos de aproximadamente 0.0015 ng, o menos de aproximadamente : 0.0010 ng, o menos de endonucleasa no específica por dosis. En una modalidad específica, los virus purificados comprenden menos de aproximadamente 0.0040 ng, o menos de aproximadamente 0.0035 ng, o menos de aproximadamente 0.0030 ng, o menos de aproximadamente 0.0025 ng de endonucleasa no específica por dosis.

En otras modalidades, los virus purificados son virus de la influenza o RSV y comprenden menos de aproximadamente 0.0060 ng, o menos de aproximadamente 0.0055 ng, o menos de aproximadamente 0.0050 ng, o menos de aproximadamente 0.0045 ng, o menos de aproximadamente 0.0040 ng, o menos de aproximadamente 0.0035 ng, o menos de aproximadamente 0.0030 ng, o menos de aproximadamente 0.0025 ng, o menos de aproximadamente 0.0020 ng, o menos de aproximadamente 0.0015 ng, o menos de aproximadamente 0.0010 ng, o menos de endonucleasa no específica por 7.0 ± 0.5 logio FFU. En una modalidad específica, los virus purificados son virus de la influenza o RSV y comprenden menos de aproximadamente 0.0040 ng, o menos de aproximadamente 0.0035 ng, o menos de aproximadamente 0.0030 ng, o menos de aproximadamente 0.0025 ng de endonucleasa no específica por 7.0 ± 0.5 log10 FFU. En otra modalidad específica, los virus purificados son RSV y comprenden menos de aproximadamente 0.0040 ng, o menos de aproximadamente 0.0035 ng, o menos, de aproximadamente 0.0030 ng, o menos de aproximadamente ' 0.0025 ng de endonucleasa no específica por 5.0 ± 0.5 logi0 FFU. En otra modalidad específica adicional, la endonucleasa no especifica es Benzonase .

La esterilidad es de particular importancia ' para aquellos virus y/o componentes virales que están destinados para uso clínico en animales (que incluyen humanos) . Por consiguiente, los métodos para la purificación de virus (v.gr., influenza o RSV) de la presente invención incorporan esterilización, que se puede realizar como un paso de filtración terminal (v.gr., RSV) o mediante el uso de métodos de esterilización conocidos (v.gr., virus de la influenza). Los métodos útiles para la esterilización de componentes de vacuna (v.gr., virus, dispositivos de suministro, etc.) incluyen, pero no se limitan a, irradiación, filtración, tratamiento químico, y otros procesos adecuados. En una modalidad, el volumen de virus formulado es esterilizado por filtración. Los métodos de filtración útiles para esterilización incluyen, pero no se limitan a, u solo paso, extremo muerto, filtración de flujo directo (DFF) y filtración de flujo tangencial (TFF) , que se han descrito anteriormente. Sin embargo, debido a la naturaleza frágil de RSV, el virus no puede ser esterilizado mediante el uso de un filtro de grado de esterilización. Por lo tanto, en una modalidad, RSV es esterilizado como parte de un paso de filtración terminal durante el proceso de purificación descrito en la presente.

En la presente se proveen métodos específicos para purificar virus de la influenza y RSV para formulación de vacuna .

Purificación de Virus de la Influenza En ciertas modalidades, los virus que han de ser purificados son virus de la influenza (v.gr. , adaptados al frío, y/o sensibles a la temperatura, y/o atenuados) .

En una modalidad el método de purificación de virus de cultivo de células comprende los siguientes pasos: (a) clarificación de una cosecha viral; (b) concentración y/o intercambio de regulador de pH después del paso (a) ; (c) purificación por cromatografía después del paso (b) ; (d) concentración y/o intercambio de regulador de. pH después del paso (c) ; y (e) esterilización después del paso (d) .

En una modalidad, los virus son virus de la influenza. En una modalidad específica, los virus de la influenza son virus de la influenza adaptados al frío, y/o sensibles a la temperatura, y/o atenuados.

En una modalidad específica, los pasos (a) , (b) , (d) y (e) se realizan mediante filtración por membrana. En otra modalidad específica, los pasos (b) y (d) se realizan por filtración de flujo tangencial. En otra modalidad específica adicional, los pasos (a) y (e) se realizan por filtración de flujo directo. En otra modalidad específica adicional, el paso (b) incluye tanto la concentración por ultrafiltración como el intercambio de regulador de pH por diafiltración . En otra modalidad específica adicional, el paso (d) incluye sólo concentración. Modalidades adicionales del método de purificación de virus se detallaron anteriormente.

En una modalidad específica, el paso (c) se realiza por cromatografía en columna de afinidad. En otra modalidad específica, el paso (c) además incorpora el tratamiento con una nucleasa no específica.

Como se describió antes, los virus obtenidos de cultivo de células pueden ser estabilizados {v.gr., mediante la adición de un fosfato de sacarosa (SP) ) , después de la cosecha. Por consiguiente, los métodos de purificación de la presente invención abarcan la clarificación de una cosecha viral estabilizada. Alternativamente, los pasos de cosecha y clarificación pueden ser acoplados. Por ejemplo, se pueden usar ATF para cosechar virus de cultivo de células replicado y bombear la cosecha viral directamente al medio y/o dispositivo usado para clarificación del virus.

Por ejemplo, el medio crudo de cultivos infectados primero puede ser clarificado por centrifugación a, v.gr., 1000-2000 x g durante un tiempo suficiente para remover residuos de células y otro material de partículas grandes, v.gr., entre 10 y 30 minutos. Alternativamente, el medio se filtra a través de una membrana semi-permeable de un intervalo de tamaños de poro definido suficientemente grande para permitir el paso del virus mientras retiene células intactas y otro material de partículas grande.

En una modalidad, la cosecha viral es clarificada por DFF y/o TFF mediante el uso de una membrana MF que tiene un tamaño de poro suficientemente grande para que el virus pase a través del mismo pero suficientemente pequeño para retener células intactas y residuos celulares. En una modalidad, la cosecha viral es clarificada por DFF y/o TFF a través de por lo menos una membrana que tiene un tamaño de poro de aproximadamente 1.2 mieras o menos. En una modalidad específica, la cosecha viral es clarificada por DFF a, través de por lo menos una membrana que tiene un tamaño de poro de entre aproximadamente 1.2 mieras y aproximadamente 0.45 mieras. En otra modalidad específica, la cosecha viral es clarificada por DFF a través de una primera membrana que mantiene un tamaño de poro de 1.2 mieras y una segunda membrana que tiene un tamaño de poro de 0.45 mieras. En ciertas modalidades, se usan membranas de polipropileno y/o PVDF. En otra modalidad específica adicional, la cosecha viral es clarificada por DFF como se ilustra en el ejemplo provisto en la sección 8.6. En otra modalidad específica adicional, la cosecha de virus del cultivo de células replicado es acoplada al paso de DFF. Por ejemplo, el virus del cultivo de células replicado es cosechado y aplicado directamente al medio y dispositivo usados para DFF. El acoplamiento de los pasos de cosecha y clarificación reduce el número de manipulaciones, evita la necesidad de un tanque de cosecha y reduce el tiempo de procesamiento global .

En una modalidad, la cosecha clarificada es concentrada y/o el regulador de pH es intercambiado. En una modalidad, la concentración y/o intercambio de regulador de pH se realiza por UF y DF . En otra modalidad, se usa TFF tanto para UF como para DF. En otra modalidad más, la cosecha del virus del cultivo de células replicado es acoplada al paso de DFF que es acoplado al paso de TFF. El acoplamiento de los pasos de cosecha, clarificación y concentración/ intercambio de regulador de pH reduce el número de manipulaciones, y reduce el tiempo de procesamiento global. En ciertas modalidades, el TFF se realiza para mantener una velocidad de flujo de filtrado constante. En otras modalidades, el ' TFF se realiza para mantener una TMP constante. En ciertas modalidades, el virus clarificado es primero concentrado por UF y después el regulador de pH es intercambiado por DF. En ciertas modalidades, el virus clarificado es concentrado aproximadamente 2X, o aproximadamente 3X, o aproximadamente 4X, o aproximadamente 5X, o aproximadamente 6X, o aproximadamente 7X, o aproximadamente 8X, o aproximadamente 9X, o aproximadamente 10X, o más, en donde "X" es igual al volumen de inicio total añadido al volumen de operación/retenido final. En una modalidad específica, el virus clarificado es concentrado entre aproximadamente 3X y aproximadamente 5X. En otra modalidad específica, el virus clarificado es concentrado aproximadamente 4X, en donde "X" es igual al volumen de inicio total añadido al volumen de operación/retenido final. En ciertas modalidades, el virus clarificado es concentrado aproximadamente 10X o más para incrementar la carga de todos los pasos de purificación subsecuentes . En ciertas modalidades, después de la concentración aproximadamente 1 diavolumen , o aproximadamente 2 diavolúmenes , o aproximadamente 3 diavolúmenes , o aproximadamente 4 diavolúmenes, o aproximadamente 5 diavolúmenes, o aproximadamente 6 diavolúmenes , o aproximadamente 7 diavolúmenes, o aproximadamente 8 diavolúmenes, o aproximadamente 9 diavolúmenes o aproximadamente 10 diavolúmenes, o más diavolúmenes de regulador de pH son intercambiados por DF, en donde un diavolumen es el volumen de regulador de pH total introducido al volumen de la operación durante DF/retenido. En una modalidad específica, entre aproximadamente 4 diavolúmenes y aproximadamente 6 diavolúmenes de regulador de pH son intercambiados en donde un diavolumen es el volumen de regulador de pH total introducido al volumen de la operación durante DF/retenido. En otra modalidad específica, aproximadamente 5 diavolúmenes de regulador de pH son intercambiados, en donde un diavolumen es el volumen de regulador de pH total introducido al volumen de la operación durante DF/retenido. Se contempla que el regulador de pH de intercambio puede ser el mismo o diferente del que está presente en la cosecha viral. En una modalidad, el regulador de pH de intercambio es un regulador de pH de SP a un pH neutro. En una modalidad específica, el regulador de pH de intercambio comprende (dentro de 10% de variación de uno o más componentes) 218 mM de sacarosa, 11 mM de regulador de pH de fosfato a pH 7.0-7.4. En otra modalidad específica, el regulador de pH de intercambio consiste (dentro de 10% de variación de uno o más componentes) de 218 mM de sacarosa, 11 mM de regulador de pH de fosfato, a pH 7.0-7.4. En ciertas modalidades, el retenido, que comprende virus (v.gr., influenza) , es recolectado después de que el volumen de regulador de pH deseado es intercambiado. Después de la colección del retenido, algún virus puede permanecer débilmente unido a la membrana. Por consiguiente, en algunas modalidades, la membrana es enjuagada con regulador de pH de intercambio adicional que se añade al retenido recolectado. El retenido recolectado es también referido aquí como "carga viral condicionada" o como el "#XUF #XDF" en donde "#" indica ya sea el número de veces de la concentración o el número de diavolúmenes de intercambio de regulador de pH para los procesos de UF y DF, respectivamente. En una modalidad específica, una membrana con una MWCO de 500 kDa se usa para la concentración e intercambio de regulador de pH. En algunas modalidades, la membrana puede ser limpiada después del proceso y usada de nuevo. En otras modalidades, se usa una membrana nueva para cada lote de virus clarificado. En otra modalidad específica, la cosecha clarificada es concentrada y el intercambio de regulador de pH como se ilustra en los ejemplos provistos en las secciones 8.6 y 8.6.3.

En ciertas modalidades, la carga viral condicionada es purificada por cromatografía. En ciertas modalidades, la carga viral condicionada es purificada por cromatografía en columna. En algunas modalidades, la carga viral condicionada es purificada por cromatografía de afinidad. Una variedad de medios de cromatografía de afinidad están disponibles con propiedades de separación similares, por ejemplo, numerosos medios de cromatografía de afinidad están disponibles para la concentración y purificación de un número de virus y proteínas virales, que incluyen, pero no se limitan a agarosa de ácido (p-aminofenil) oxámico, sulfato de Cellufme™. Los métodos útiles para evaluar el rendimiento de ligandos de afinidad se ilustran en el ejemplo 8.7. En una modalidad específica, se utilizan medios de afinidad de sulfato de Cellufine™ (Chisso Corp.) para cromatografía de afinidad. En otra modalidad, se utiliza FluSelect™ para cromatografía de afinidad. En otra modalidad adicional, el ligando de unión de los medios de afinidad comprende una porción sulfato. En ciertas modalidades, la carga viral condicionada es cargada directamente sobre un medio de afinidad. En ciertas modalidades, el material no unido se puede hacer pasar sobre el medio de afinidad para facilitar la unión de virus adicionales .

En una modalidad, entre aproximadamente 109 0 y aproximadamente 1011, o entre aproximadamente 109'2 y aproximadamente 109'8, o entre aproximadamente 109'4 y aproximadamente 109'6 de partículas de virales, son cargadas por mL de medio de afinidad, en otra modalidad, por lo menos aproximadamente 109 0, o por lo menos aproximadamente 109'1, o por lo menos aproximadamente 109'2, o por lo menos aproximadamente 109'3, o por lo menos aproximadamente 109"4, o por lo menos aproximadamente 109'5, o por lo menos aproximadamente 109'6, o por lo menos aproximadamente 109'7, o por lo menos aproximadamente 109'8, o por lo 1 menos aproximadamente 109'9, o por lo menos aproximadamente 1010, o por lo menos aproximadamente 1010'2, o por lo menos aproximadamente 1010,4, o por lo menos aproximadamente 1010'6, o por lo menos aproximadamente 1010'8, o por lo menos aproximadamente 1011, partículas virales son cargadas por mL de medio de afinidad. En ciertas modalidades, las partículas virales son virus vivos. Los métodos para determinar el número de virus vivos en una muestra se describen en la presente.

En otra modalidad, entre aproximadamente 9.0 logi0 FFU y aproximadamente 11 logi0 FFU, o entre aproximadamente 9.2 logio FFU y aproximadamente 9.8 log10 FFU, o entre aproximadamente 9.4 logi0 FFU y aproximadamente 9.6 logia FFU de virus, son cargadas por mL de medio de afinidad. En otra modalidad, por lo menos aproximadamente 9.0 logi0 FFU, o por lo menos aproximadamente 9.1 logi0 FFU, o por lo menos aproximadamente 9.2 logi0 FFU, o por lo menos aproximadamente 9.3 logio FFU, o por lo menos aproximadamente 9.4 logio FFU, o por lo menos aproximadamente 9.5 logi0 FFU, o por lo menos aproximadamente 9.6 log10 FFU, o por lo menos aproximadamente 9.7 log10 FFU, o por lo menos aproximadamente 9.8 logi0 FFU, o por lo menos aproximadamente 9.9 logio FFU, o por lo menos aproximadamente 10 logm FFU, o por lo menos aproximadamente 10.1 logio FFU, o por lo menos aproximadamente 10.2 logio FFU, o por lo menos aproximadamente 10.3 logio FFU, o por lo menos aproximadamente 10.4 logi0 FFU, o por lo menos aproximadamente 10.5 logio FFU, o por lo menos aproximadamente 10.6 logio FFU, o por lo menos aproximadamente 10.7 logio FFU, o por lo menos aproximadamente 10.8 log10 FFU, o por lo menos aproximadamente 10.9 logio FFU, o por lo menos aproximadamente 11 logi0 FFU de virus son cargadas por mL de medio de afinidad. En una modalidad específica, se utiliza medio de afinidad de sulfato de Cellufine™ (Chisso Corp.) y entre 9.2 logi0 FFU y 9.8 logi0 FFU de virus son cargadas por mL de sulfato de Cellufine™. En otra modalidad específica, se utiliza medio de afinidad de sulfato de Cellufine™ (Chisso Corp.) y entre 9.4 logi0 FFU y 9.6 logio FFU de virus son cargadas por mL de sulfato de Cellufine™. En otra modalidad específica adicional, se utiliza medio de afinidad de sulfato de Cellufine™ (Chisso Corp.) y por lo menos aproximadamente 9.4 log10 FFU, o por lo menos aproximadamente 9.5 logio FFU, o por lo menos aproximadamente 9.6 logio FFU, o por lo menos aproximadamente 9.7 loglc. FFU de virus son cargadas por mL de sulfato de Cellufine™.

En una modalidad, el medio de afinidad se lava, con a suficiente volumen de regulador de pH en el cual el virus permanecerá unido al medio de afinidad (v.gr. , un SP regulador de H) , para remover contaminantes unidos y débilmente un idos del medio de afinidad. En ciertas modalidades, el regulador de pH de lavado comprende (dentro de 10% de variación de uno o más componentes) 218 mM de sacarosa, 11 mM de regulador de pH de fosfato pH 7.0-7.4. En otra modalidad específica, el regulador de pH de lavado consiste de (dentro de 10% de variación de uno o más componentes) 218 mM de sacarosa, 11 mM de regulador de pH de fosfato pH 7.0-7.4. En ciertas modalidades, los virus son eluidos del medio de afinidad después de lavado, mediante el uso de un volumen suficiente de un regulador de pH en el cual el virus no se unirá a la resina de afinidad para eluir el virus sin liberar ningún contaminante unido a la columna, y recolectado. En ciertas modalidades, el regulador de pH de elución comprende sal. Las sales útiles para la elución de virus (v.gr., influenza) de columnas de afinidad incluyen cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de amonio, cloruro de magnesio, y cloruro de calcio. Generalmente, el regulador de pH de elución se aplica a la resina ya sea como un gradiente o paso en el intervalo de concentración de 0 a 1.0M. La efectividad del catión y anión usados como las sales en el regulador de pH de elución se correlaciona con la serie Hofmeister, en donde el orden de desplazamiento para cationes comúnmente usados es: Ca24 > g+ > Na+ > K+ >NH4+ y la efectividad del orden de desplazamiento para aniones comúnmente usados es P043" > S042~ > C00" > Cl". En una modalidad, el regulador de pH de elución comprende (dentro de 10% de variación) cloruro de sodio a una concentración final de 1M. En otra modalidad, el regulador de pH de elución comprende (dentro de 10% de variación de uno o más componentes) 1 M de cloruro de sodio, 218 m de sacarosa, y 11 mM de regulador de pH de fosfato pH 7.0-7.4. El virus eluido recolectado es también referido aquí como el "material eluido purificado" . La elución del virus puede ser monitoreada al monitorear la absorbancia de ultravioleta (UV) , en particular al monitorear la absorbancia a 280 nanómetros. En algunas modalidades, la carga viral condicionada es purificada por cromatografía en columna, en donde la elución del virus es monitoreada y fracciones específicas que comprenden virus son recolectadas. Ese enfoque puede ser útil cuando es deseable reducir al mínimo el volumen del virus eluido. Eh otra modalidad específica, la carga viral condicionada es purificada por cromatografía como se ilustra en el ejemplo provisto en la sección 8.6.

En ciertas modalidades, el método de purificación de virus (v.gr., influenza) incluye el tratamiento con una endonucleasa no específica (v.gr., Benzonase ). En ciertas modalidades, el tratamiento con endonucleasa no específica ocurre temprano en la purificación de virus. En una modalidad, el tratamiento con endonucleasa no específica ocurre después del paso (a) pero antes del paso (b) . En otra modalidad, el tratamiento con endonucleasa no específica ocurre después del paso (b) pero antes del paso (c) . Alternativamente, el virus es tratado con una endonucleasa no específica durante el paso (c) . Las ventajas de este enfoque se ilustran en el ejemplo provisto en la sección 8.6. En una modalidad específica, la carga viral condicionada se une a un medio de afinidad y después se expone a un regulador de pH que comprende una endonucleasa no específica. En algunas modalidades, la endonucleasa no específica está presente en el regulador de pH a una concentración de entre aproximadamente 10 U/mL y aproximadamente 100 U/mL. En otras modalidades, la endonucleasa no específica está presente en el regulador de pH a una concentración de entre aproximadamente 40 U/mL y aproximadamente 60 U/mL. En una modalidad, la endonucleasa no específica está presente en un regulador de pH que comprende sacarosa. En una modalidad específica, la endonucleasa no específica está presente en un regulador de pH que comprende 218 mM de sacarosa, 11 mM de regulador de pH de fosfato pH 7.0-7.4. En otra modalidad específica, la endonucleasa específica está presente a una concentración final de entre aproximadamente 40 U/mL y aproximadamente 60 U/mL, en un regulador de pH que consiste de (dentro de 10% variación de uno o más componentes) 218 mM de sacarosa, 11 mM de regulador de pH de fosfato pH 7.0-7.4. En ciertas modalidades, las condiciones de carga y lavado se ajustan para asegurar que el virus unido sea expuesto a la endonucleasa no específica durante entre aproximadamente 10 minutos y aproximadamente 120 minutos. En una modalidad, las condiciones de carga y lavado se ajustan para asegurar que el virus unido sea expuesto y la endonucleasa no específica durante entre aproximadamente 40 minutos y aproximadamente 80 minutos. En otras modalidades adicionales, las condiciones de carga y lavado se ajustan para asegurar que el virus unido sea expuesto a la endonucleasa no específica durante por lo menos 10 minutos, o por lo menos 20 minutos, o por lo menos 30 minutos, o por lo menos 40 minutos, o por lo menos 50 minutos, o por lo menos 60 minutos, o! or lo menos 70 minutos, o por lo menos 80 minutos, o por lo menos 90 minutos, o por lo menos 100 minutos, o por lo menos minútos, o por lo menos 110 minutos, o por lo menos 120 minutos. En ciertos aspectos de la invención, el tiempo de exposición a la endonucleasa no específica, la concentración de la endonucleasa no específica y el volumen de endonucleasa no específica que contiene regulador de pH se puede ajustar. Por ejemplo, para reducir al mínimo el tiempo necesario para digerir contaminantes de ADN la concentración de endonucleasa no específica se puede incrementar; alternativamente para reducir al mínimo la cantidad de endonucleasa no específica utilizada, el tiempo de exposición se puede incrementar. Después del tratamiento con una endonucleasa no específica puede ser deseable lavar el medio de afinidad con un volumen suficiente de regulador de pH en el cual el virus permanecerá unido al medio de afinidad (v.gr., un regulador de pH ! de SP) para remover cualquier residuo de contaminantes de ADN digeridos. Por consiguiente, en ciertas modalidades, la resina de afinidad es lavada como se describió antes, antes y/o después del tratamiento con una endonucleasa no específica. En otra modalidad específica, la endonucleasa no específica es Benzonase . En otra modalidad especifica adicional, la carga ® viral condicionada es tratada con Benzonase al mismo tiempo que la purificación por cromatografía de afinidad, como se ilustra en el ejemplo provisto en la sección 8.6.

En una modalidad, los virus purificados de la influenza comprenden menos de aproximadamente 0.0060' ng, o menos de aproximadamente 0.0055 ng, o menos de aproximadamente 0.0050 ng, o menos de aproximadamente 0.0045 ng, o menos de aproximadamente 0.0040 ng, o menos de aproximadamente 0.0035 ng, o menos de aproximadamente 0.0030 ng, o menos de aproximadamente 0.0025 ng, o menos de aproximadamente 0.0020 ng, o menos de aproximadamente 0.0015 ng, o menos de aproximadamente 0.0010 ng, o menos de endonucleasa no específica por 7.0±0.5 logi0FFU. En una modalidad específica, los virus purificados de la influenza comprenden menos de aproximadamente 0.0040 ng, o menos de aproximadamente 0.0035 ng, o menos de aproximadamente 0.0030 ng, o menos de aproximadamente 0.0025 ng de endonucleasa no específica por 7.0±0.5 log10FFU. En otra modalidad específica, la endonucleasa no especifica es Benzonase . En ciertos aspectos de la invención, después de la purificación por cromatografía, el material eluido des virus purificados es concentrado y/o el regulador de pH es intercambiado. Los métodos útiles para concentrar y/o intercambiar regulador de pH se describieron anteriormente. En ciertas modalidades, el regulador de pH del material eluido de virus purificados es intercambiado mediante el uso de DF. En una modalidad, más de aproximadamente 5 diavolúmenes de regulador de pH son intercambiados por DF, en donde un diavolumen es el volumen de regulador de pH total introducido a la operación durante el DF/volumen retenido. Las ventajas de intercambiar más de aproximadamente 5 diavolúmenes se detallan en el ejemplo provisto en la sección 8.6. Én otra modalidad, aproximadamente 6 diavolúmenes, o aproximadamente 7 diavolúmenes, o aproximadamente 8 diavolúmenes, o aproximadamente 9 diavolúmenes o aproximadamente 10 diavolúmenes, o más diavolúmenes de regulador de pH son intercambiados por DF, en donde un diavolumen es el volumen de regulador de pH total introducido al volumen de la operación durante DF/retenido. En una modalidad específica, aproximadamente 8 diavolúmenes , o más diavolúmenes de regulador de pH son intercambiados por DF, en donde un diavolumen es el volumen de regulador de pH total introducido al volumen de la operación durante DF/retenido. En una modalidad específica, el regulador de pH de intercambio comprende (dentro de 10% de variación de uno o más componentes) 200 mM de sacarosa, 100 mM de regulador de pH de fosfato a pH 7.0-7.4. En otra modalidad específica, el regulador de pH de intercambio consiste (dentro de 10% variación de uno o más componentes) de 200 mM de sacarosa, 100 mM de regulador de pH de fosfato a pH 7.0-7.4. En ciertas modalidades, el retenido, que comprende virus, es recolectado después de que el volumen deseado de regulador de pH es intercambiado. Después de la recolección del retenido, algunos virus pueden permanecer débilmente unidos a la membrana. Por consiguiente, en algunas modalidades, la membrana es enjuagada con regulador de pH de intercambio adicional que se añade al retenido recolectado. El retenido recolectado es también referido aquí como "volumen de virus formulado" o como el "#XDF, " en donde "#" indica el número de diavolúmenes de regulador de pH intercambiado durante yn proceso de DF, respectivamente. En una modalidad específica, una membrana con un M CO de 500 kDa se usa para la concentración y/o intercambio de regulador de pH. En algunas modalidades, la membrana se puede limpiar después del proceso y volver a usar. En otras modalidades, una membrana nueva se usa para cada lote de material eluido purificado. En otra modalidad específica, el regulador de pH del material eluido de virus purificados es intercambiado como se ilustra en el ejemplo provisto en la sección 8.6. En otras modalidades adicionales, el. virus clarificado es concentrado por UF y el regulador de pH es intercambiado por DF como se describió antes. La incorporación de un paso de UF reducirá el volumen del volumen resultante de virus formulado. En ciertas modalidades, el material eluido de virus es concentrado aproximadamente 2X, o aproximadamente 3X, o aproximadamente 4X, o aproximadamente 5X, o más, en donde "X" es igual al volumen de inicio total añadido al volumen de operación/retenido final. En otras modalidades, el material eluido de virus es concentrado entre 2X y 4X. En una modalidad específica, el material eluido de virus es concentrado aproximadamente 2X y después el regulador de pH es intercambiado por DF como se describió antes. En una modalidad específica, el regulador de pH del material eluido de virus purificados es concentrado y el intercambio de regulador de pH como se ilustra en el ejemplo provisto en la sección 8.6.3.

En una modalidad, el volumen de virus formulado es esterilizado por DFF y/o TFF. En otra modalidad, el volumen de virus formulado es esterilizado mediante el uso de una membrana MF que tiene un tamaño de poro suficientemente grande para que el virus pase a través de la misma pero suficientemente pequeño para retener otros contaminantes. En una modalidad, el volumen de virus formulado es esterilizado por DFF y/o TFF a través de por lo menos una membrana que tiene un tamaño de poro de aproximadamente 0.45 mieras. En ciertas modalidades, se usan membranas de polipropileno y/o PVDF. En una modalidad, se añaden componentes adicionales al volumen de virus formulado antes de la esterilización. En ciertas modalidades, por lo menos un componente seleccionado del grupo que consiste de excipientes de aminoácido (v.gr., glutamato, arginina) , hidrolizado de proteína (v.gr., colágeno, gelatina), agentes quelatadores (v.gr., EDTA) y se añaden conservadores al volumen de virus formulado antes de la esterilización. En una modalidad específica, se añade glutamato, arginina y gelatina al volumen de virus formulado antes de esterilización. En otra modalidad específica, cGAG (200 mM de sacarosa, 100 mM de fosfato, 12.1% p/v de arginina, 10% de gelatina y 54 mM o 0.9% de glutamato) se añade al volumen de virus purificados en una relación de 1:9 v/v. En otra modalidad específica, se añade glutamato de monosodio, arginina y gelatina al volumen de virus formulado antes de la esterilización a una concentración final (dentro de 10% de variación) de 5.4 mM o 0.09%, 1.21% p/v, y 1.% p/v, respec ivamente. En otra modalidad específica adicional, el volumen de virus formulado es esterilizado por DFF como se ilustra en el ejemplo provisto en la sección 8.6.

En una modalidad específica, el método de purificación de virus de la influenza del cultivo de células comprende los siguientes pasos: (a) clarificación de una cosecha viral por filtración de flujo directo (DFF) a través de por lo menos una membrana que tiene un tamaño de poro de entre aproximadamente 1.2 mieras a aproximadamente 0.45 mieras; (b) concentración por ultrafiltración de flujo tangencial (UF) e intercambio de regulador de pH by diafiltración (DF) después del paso (a) mediante el uso de una membrana que tiene 500 kDa de corte de peso molecular (MWCO) ; (c) purificación por cromatografía de afinidad en columna después del paso (b) ; (d) intercambio de regulador de pH por DF después del paso (c) mediante el uso de una membrana que tiene 500 kDa de corte¦ de peso molecular (MWCO); y (e) esterilización después del paso (d) por DFF a través de por lo menos una membrana que tiene un tamaño de poro de entre aproximadamente 0.45 mieras y aproximadamente 0.22 mieras, en donde la recuperación global de virus purificados de por lo menos 30%, y en donde los: virus purificados comprenden menos de 0.1 ng de HCD, y menos de 0.3 g HCP por 7.0±0.5 logi0 FFU de virus.

En ciertas modalidades, el paso (c) además incorpora el tratamiento con una nucleasa no específica.

Parámetros adicionales que se pueden incorporar en el método de purificación de virus del cultivo de células, en particular virus de la influenza se ilustran en el ejemplo provisto en la sección 8.6 más adelante.

Purificación de RSV En una modalidad específica, los virus que han de ser purificados son virus de sincicio respiratorio (RSV) (v.gr., rA2cp248/404/l030ASH) .

En una modalidad, el método de purificación de virus del cultivo de células comprende los siguientes pasos: (a) clarificación de una cosecha viral; (b) estabilización y/o intercambio de regulador de pH después del paso (a) ; (c) concentración y/o intercambio de regulador de pH después del paso (b) ; (d) purificación por cromatografía después del paso (c) ; y (e) filtración terminal después del paso (d) . ; En una modalidad específica, el paso (a) incluye múltiples pasos de filtración. En otra modalidad específica, el paso (a) además incorpora el tratamiento con una nucleasa no específica. En otra modalidad específica, los pasos (a) y (c) se realizan por filtración de flujo directo. En otra modalidad específica, el paso (c) se realiza por filtración de flujo tangencial. En otra modalidad específica adicional, el paso (c) incluye tanto la concentración por filtración de flujo tangencial como el intercambio de regulador de pH por diafiltración . En una modalidad específica, el paso (d) se realiza por cromatografía de intercambio de iones (v.gr. intercambio de cationes) . En otra modalidad adicional, el paso (c) incluye sólo concentración. Modalidades adicionales del método de purificación de virus (v.gr., RSV) se detallan más adelante .

Los métodos de purificación de la presente invención abarcan la clarificación de una cosecha viral. El medio crudo de cultivos infectados primero pueden ser clarificados por centrifugación a, v.gr., 1000-2000 x g durante un tiempo suficiente para remover residuos de células y otro material en partículas grandes, v.gr., entre 10 y 30 minutos. Alternativamente, el sobrenadante que contiene el virus se filtra a través de una serie de membranas semi -permeables de un rango definido de tamaños de poro suficientemente grandes para permitir el paso del virus mientras retiene células intactas y otro material en partículas grandes. Este paso de clarificación en el proceso de purificación puede incluir el tratamiento con una endonucleasa no específica (v.gr., Benzonase) para degradar ADN de células hospederas en donde la cosecha viral es a) filtrada por filtración de flujo directo (DFF) ; b) tratada con una endonucleasa, no específica; y c) filtrada nuevamente por DFF .

En una modalidad, la cosecha viral es clarificada por DFF y/o TFF mediante el uso de una membrana de MF que tiene un tamaño de poro suficientemente grande para que el virus pase a través de la misma pero suficientemente pequeña para retener células intactas y residuos celulares. En ciertas modalidades, la cosecha viral es clarificada por DFF en combinación con tratamiento de una endonucleasa no específica. En una modalidad específica, la cosecha viral es filtrada a través de por lo menos una membrana que tiene un tamaño de poro de aproximadamente 10 mieras o menos, seguido por tratamiento con una endonucleasa no específica y después filtrada nuevamente a través de por lo menos una membrana que tiene un tamaño de poro de aproximadamente 3.0 mieras o menos. En una modalidad específica, el primer paso de filtro en el proceso de clarificación es a través de por lo menos una membrana que tiene un tamaño de poro de entre aproximadamente 5.0 mieras y aproximadamente 1.0 mieras. En una modalidad específica, el segundo paso de filtro en el proceso de clarificación es a través de por lo menos una membrana que tiene un tamaño de poro de entre aproximadamente 3.0 mieras y aproximadamente 0.45 mieras. En ciertas modalidades, el primer o segundo paso de filtro, solo o en combinación, usa un filtro de membrana doble, en donde dos filtros de diferentes tamaños son apilados para prevenir el taponamiento del filtro con el tamaño de poro más pequeño. En una modalidad, este filtro doble es aproximadamente 3/0.8 mieras en tamaño, en donde el filtro de 3 mieras actúa como un prefiltro para remover residuos celulares más grandes. En otra modalidad específica, la cosecha viral es clarificada por DFF a través de una primera membrana que tiene un tamaño de poro de aproximadamente 3.0 mieras y una segunda membrana que tiene un tamaño de poro de aproximadamente 3/0.8 o aproximadamente 0.65 mieras.

En ciertas modalidades, el método de purificación de virus (v.gr., RSV) incluye el tratamiento con una endonucleasa ® no específica (v.gr., Benzonase ) para degradar el AD de la célula hospedera (HCD) . En ciertas modalidades, el tratamiento de endonucleasa no específica ocurre temprano en la purificación de virus. En una modalidad, el virus se trató con una endonucleasa no específica durante el paso (a) . En una modalidad específica, la cosecha viral filtrada se mezcla con un regulador de pH que comprende una endonucleasa no específica. En algunas modalidades, la endonucleasa no específica está presente en el regulador de pH a una concentración de entre aproximadamente 5 U/mL y aproximadamente 100 U/mL. En otras modalidades, la endonucleasa no específica está presente en el regulador de pH a una concentración de entre aproximadamente 40 U/mL a aproximadamente 60 U/mL. En una modalidad específica, la endonucleasa no específica está presente a aproximadamente 50 U/mL. En una modalidad, la endonucleasa no específica está presente en un regulador de pH que comprende aproximadamente 1.0 mM a aproximadamente 10 mM de MgCl . En una modalidad específica, el regulador de pH comprende 50 U/mL de una endonucleasa no específica y 5 mM de MgCl. En otra modalidad específica, el MgCl está presente a 2 mM.

Después del primer paso de filtro en el proceso de clarificación, la endonucleasa no específica es incubada con la cosecha viral filtrada durante aproximadamente 1 hora a aproximadamente 4 horas. En una modalidad específica, la endonucleasa no específica es incubada con la cosecha viral durante aproximadamente 3 horas. En otras modalidades adicionales, la endonucleasa no específica es incubada bajo condiciones ajustadas para asegurar que el virus sea expuesto a la endonucleasa no específica durante por lo menos 10 minutos, o por lo menos 20 minutos, o por lo menos 30 minutos, o por lo menos 40 minutos, o por lo menos 50 minutos, o i por lo menos 60 minutos, o por lo menos 70 minutos, o por lo menos 80 minutos, o por lo menos 90 minutos, o por lo menos 100 minutos, o por lo menos minutos, o por lo menos 110 minutos, o por lo menos 120 minutos, o por lo menos 150 minutos, o^por lo menos 180 minutos, o por lo menos 210 minutos, o por lo menos 240 minutos. En ciertos aspectos de la invención, el tiempo de exposición a la endonucleasa no específica, la concentración de la endonucleasa no específica y el volumen de endonucleasa no específica que contiene regulador de pH se puede ajustar. Por ejemplo, para reducir al mínimo el tiempo necesario para digerir contaminantes de ADN, la concentración de endonucleasa no específica puede ser incrementada; alternativamente, para reducir al mínimo la cantidad de endonucleasa no específica utilizada, el tiempo de exposición se puede incrementar. En una modalidad específica, la endonucleasa no específica es Benzonase®. Después del tratamiento con una endonucleasa no específica, la cosecha viral filtrada, tratada, es filtrada nuevamente para remover cualquier residuo de contaminantes de ADN digeridos y residuos de célula hospedera restantes.

En ciertas modalidades, la cosecha viral clarificada tratada con Benzonase es estabilizada por la adición de un regulador de pH de fosfato de sacarosa (SP) , tris sacarosa (TS) o glutamato-fosfato de sacarosa (SPG) . Estos reguiadores de pH además pueden contener una sal tal como cloruro de sodio o cloruro de potasio. En una modalidad, el regulador de pH de TS contiene aproximadamente 2.5 mM a aproximadamente 75;mM, pH 7.2 TrisCl y aproximadamente 250 mM a aproximadamente 150 mM de sacarosa. En una modalidad específica, el regulador de pH de estabilización contiene 50 mM, pH 7.2 TrisCl y 218. mM de sacarosa. Los . reguladores de pH de TS además pueden contener, solos o en combinación, NaCl , KC1 , KH2P04 o K2HP04. En una modalidad la concentración de NaCl o KC1 es aproximadamente 125 mM a aproximadamente 175 mM. En una modalidad específica el regulador de pH de estabilización contiene 5 mM, pH 7.2 TrisCl, 175 mM de sacarosa y 150 mM de NaCl o 150 mM de KCl . En otra modalidad específica, el regulador de pH de estabilización contiene 36 mM pH 7.2 TrisCl, 214 mM de sacarosa y 150 mM de NaCl o KCl. En una modalidad, la KH2P04 o K2HPO4 está presente a aproximadamente 10 mM a aproximadamente 2.5 mM. En una modalidad específica, el regulador de pH de estabilización contiene 5 mM, pH 7.2 TrisCl, 175 mM de sacarosa, 150 mM de NaCl y 5 mM de KH2P04. En otra modalidad, el regulador de pH de estabilización es SPG, en donde el regulador de pH contiene 218 mM de sacarosa, 3.8 mM de KH2P04, 7.2 mM de K2HP04 y 5 mM de glutamato de sodio. Un experto en la técnica reconocerá que las concentraciones de los reguladores de pH de estabilización pueden ser alteradas según el virus, la cosecha viral y condiciones de purificación para obtener el rendimiento más alto de cosecha viral estabilizada.

En ciertas modalidades, la cosecha clarificada es concentrada y/o el regulador de pH es intercambiado. ;En una modalidad, concentración y/o intercambio de regulador de pH se realiza por UF y DF. En otra modalidad, TFF se usa tanto para UF como DF. En ciertas modalidades, el TFF se realiza para mantener una velocidad de flujo de filtrado constante. En otras modalidades, el TFF se realiza para mantener una TMP constante. En una modalidad específica, el paso de : UF se realiza mediante el uso de un cartucho de fibra hueca de 500 kDa (GE Healthcare) en donde la cosecha viral es concentrada 5 veces mediante el uso de una TMP de operación de 1.05 kg/cm2 y un esfuerzo cortante de 12000 seg"1. Estos parámetros pueden ser alterados según el virus y las condiciones de purificación para aumentar al máximo el rendimiento de virus último para formulación de vacuna final.

En ciertas modalidades, el virus clarificado es primero concentrado por UF y después el regulador de pH es intercambiado por DF. Se contempla que el regulador de pH de intercambio puede ser el mismo o diferente del que está presente en la cosecha viral. Además, el regulador de pH de intercambio puede ser el mismo o diferente del regulador de pH de la formulación final según los pasos de intercambio de regulador de pH adicionales. En una modalidad, el regulador de pH de intercambio es un regulador de pH de SP, TS o un citrato de sacarosa a un pH neutro. En una modalidad específica, el regulador de pH de intercambio comprende aproximadamente 7-25% p/v sacarosa, por lo que provee un intervalo bajo a alto de sacarosa de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 800 mM. En una modalidad, el regulador de pH de intercambio comprende NaCl o KCl a una concentración de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 150 mM. En otra modalidad, el regulador de pH de intercambio comprende TrisCl a una concentración de aproximadamente 2.5 mM a aproximadamente 10 mM. En otra modalidad más, el regulador de pH de intercambio comprende citrato de sodio o potasio a una concentración de aproximadamente 5.0 mM a aproximadamente 50 mM. En una modalidad, el regulador de pH de intercambio comprende fosfato de potasio a una concentración de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 150 mM. Ejemplos de reguladores de : pH de intercambio específicos incluyen, pero no se limitan a, 5 mM de TrisCl; 7-25% p/v de sacarosa; 1 mM a 150 mM de NaCl ; 20 mM de citrato de sodio o potasio, 7-25% p/v de sacarosa, 150 mM NaCl o KCl; y 100 mM de fosfato de potasio, 7-25% p/v de sacarosa, 150 mM de KCl. En una modalidad específica, el regulador de pH de intercambio comprende 25% p/v de sacarosa, aproximadamente 100 mM de regulador de pH de fosfato de potasio y aproximadamente 150 mM KCl, pH 7.2. En otra modalidad específica, el regulador de pH de intercambio comprende 25% p/v de sacarosa, aproximadamente 5 mM de TrisCl y aproximadamente 150 mM de NaCl, pH 7.2. Los componentes de regulador de pH de intercambio pueden ser modificados según el virus y las condiciones de purificación para aumentar al máximo el rendimiento viral del paso de cromatografía y el paso de filtración final.

En ciertas modalidades, la cosecha viral estabilizada es además purificada por cromatografía como se describió antes. En algunas modalidades, se usa cromatografía de intercambio de iones (v.gr. , anión o catión) . En una modalidad específica, después de reducción de volumen por UF e intercambio de regulador de pH por diafiltración de la cosecha viral clarificada, tratada, el virus es además purificado por cromatografía de intercambio de iones. Este paso de cromatografía, o paso de pulimentado, se realiza en una modalidad mediante el uso de cromatografía negativa. En esta modalidad, una superficie (v.gr. , esferas poliméricas) se deriva para - unir HCD o HCP mientras excluye la unión de las partículas virales lo que permite que el virus pase por la superficie. Este concepto también se podría aplicar a otras superficies de tal manera que el regulador de pH que comprende las partículas virales puede pasar sobre o por la superficie derivada. El proceso de cromatografía completo es libre de aditivos y fácilmente escalable para usarse en producción a gran escala de virus para formulación de vacuna. Se contempla que la cromatografía se puede realizar en un proceso por lotes o alternativamente al utilizar un proceso de columna. En ciertas modalidades, la carga viral condicionada es purificada por cromatografía en columna.

Después del paso de cromatografía, si se realiza, o el intercambio de regulador de pH, la cosecha . viral concentrada es sometida a un paso de esterilización. ?? una modalidad, el paso de esterilización es un paso de filtración terminal. En una modalidad, la filtración de terminación es DFF a través de por lo menos una membrana que tiene un tamaño de poro 3 mieras o menos. En una modalidad específica, el filtro es una membrana doble de 3/0.8 mieras. En otra modalidad específica, el filtro es aproximadamente 1 mM o menos. En un aspecto, el filtro es de 0.8, 0.65 ó 0.45 mieras.

En una modalidad específica, el método de purificación de virus de sincicio respiratorio de células infectadas con virus comprende los siguientes pasos: a. clarificar una cosecha viral que comprende; i. filtrar la cosecha viral por filtración de flujo directo (DFF) a través de por lo menos un filtro de clarificación que tiene un tamaño de poro de entre aproximadamente 10 mieras a aproximadamente 3 mieras; ii . tratar la cosecha viral con una endonucleasa no específica; iii. filtrar la cosecha viral por DFF a través de por lo menos un filtro de clarificación que tiene un tamaño de poro de entre aproximadamente 3 mieras a aproximadamente 0.45 mieras; b. estabilizar la cosecha viral clarificada con regulador de pH de sacarosa, fosfato o Tris con sal (NaCl o KC1) ; c. concentrar la cosecha viral estabilizaáa. por filtración de flujo tangencial (TFF) y realizar intercambio de regulador de pH por diafiltración (DF) mediante el uso de un cartucho de fibra hueca con el corte de peso molecular (MWCO) entre 500 kDa y 0.1 µp?; d. filtrar la cosecha viral concentrada por DFF a través de por lo menos un filtro de clarificación que tiene un tamaño de poro de entre aproximadamente 0.8 mieras y aproximadamente 0.45 mieras; por lo que el virus de sincicio respiratorio es purificado de las células infectadas con virus y tiene un título de infectividad viral final de por lo menos 5.7 logioFFU/mL En otra modalidad específica, el método de purificación comprende un paso de purificación por cromatografía de intercambio de iones después de concentrar la cosecha viral e intercambiar regulador de pH.

Composiciones de Vacuna y Métodos de Uso La invención además se refiere a virus (v.gr., influenza o RSV) que son obtenibles por un método de la invención. Estos virus se pueden formular por métodos conocidos para proveer una vacuna para administrarse a humanos o animales. El virus puede estar presente como partículas virales intactas (v.gr., virus atenuados vivos) o como virus inactivos/desintegrados (v.gr., tratados con detergentes de formaldehído) . Opcionalmente , un componente viral definido (v.gr., proteína) puede ser aislado del virus por métodos conocidos por un experto en la técnica, y usados en la preparación de una vacuna. Los métodos para la generación y formulación de partículas virales inactivas/desintegradas para composiciones de vacuna son bien conocidos en la técnica y se han utilizado durante más de 40 años.

Vacuna de Virus de la Influenza La formulación de partículas virales intactas (v.gr., virus atenuados vivos) puede incluir reguladores de pH, excipientes de aminoácido (v.gr., glutamato, arginina) , hidrolizado de proteína (v.gr., colágeno, gelatina), agentes quelatadores (v.gr., EDTA) y conservadores. Los reguladores de pH útiles para esa formulación pueden contener 200 mM de sacarosa y un regulador de pH de fosfato o histidina de pH 7.0-7.4. En ciertas modalidades, la formulación de partículas virales intactas comprende excipientes de aminoácido tales como glutamato y arginina. En ciertas otras modalidades, la formulación de partículas virales intactas comprende hidrolizados de proteína de estabilización tales como colágeno o gelatina (v.gr., gelatina porcina, piscina, aviar) . En algunas modalidades, la formulación de partículas virales intactas puede comprender virus vivos que son estábiles en forma líquida durante un período suficiente para permitir el almacenamiento "en el campo" (v.gr., en venta y comercialización cuando se refrigera a 2-8°C, 4°C, 5°C; etc.) en toda una temporada de vacunación de influenza (v.gr., típicamente de aproximadamente septiembre a marzo en el hemisferio norte) . Por lo tanto, las composiciones de virus/vacuna se desean para retener su potencia o para perder su potencia a una velocidad aceptable durante el período de almacenamiento. En otras modalidades, esas soluciones/vacunas son estables en forma líquida a una temperatura de aproximadamente 2°C a aproximadamente 8°C, v.gr. , temperatura de refrigerador. Por ejemplo, los métodos y composiciones para formular una vacuna contra la influenza atenuada estable al refrigerador se describen en la publicación de patente del PCT No. WO/2006/041819 ; también véase publicación del PCT WO/2005/014862.

Por lo tanto, en ciertas modalidades,, la invención provee una formulación de vacuna estable al refrigerador que comprende uno o más de los siguientes (dentro de 10% de variación de uno o más componentes) en las formulaciones finales: 1-5% de arginina; 1-4% de gelatina; 5-10% de sacarosa (opcionalmente en un regulador de pH de fosfato); 0.01-0.1% de ácido glutámico (monosodio, monohidrato) ; 10-150 mM de fosfato de potasio y 80-150 mM de histidina.

En una modalidad específica, la formulación de vacuna comprende uno o más de los siguientes (dentro de : 10% de variación de uno o más componentes) ,- 1-2% de arginina; 2% de gelatina; 7-10% de sacarosa (opcionalmente en un regulador de pH de fosfato) ; y 100 mM de histidina. En otra modalidad específica, la formulación de vacuna comprende uno o más de los siguientes (dentro de 10% de variación de uno o más componentes): 0.01-0.1% de ácido glutámico (monosodio, monohidrato) ; 1-2% de arginina; 1% de gelatina; y 7-10% de sacarosa en un regulador de pH de fosfato.

En ciertas otras modalidades, la invención provee una formulación de vacuna estable al refrigerador que comprende uno o más de los siguientes en las formulaciones finales: sacarosa: 6-8% en peso/volumen (p/v) ; monoclorhidrato de arginina 1-2% p/v; ácido glutámico, monohidrato de monosodio 0.05-0.1% p/v; hidrolizado de gelatina, tipo A de porcino (u otras fuentes tales como piscina o aviar) 0.5-2% p/v; fosfato dibásico de potasio 1-2%; y fosfato monobásico de potasio 0.25-1% p/v.

En una modalidad específica, la formulación de vacuna comprende uno o más de los siguientes: sacarosa: 6.84% en peso/volumen (p/v); monoclorhidrato de arginina 1.21% p/v; ácido glutámico, monohidrato de monosodio 0.094 p/v; hidrolizado de gelatina, tipo A de porcino (u otras fúentes) 1% p/v; fosfato dibásico de potasio 1.13%; y fosfato monobásico de potasio 0.48% p/v. En otra modalidad específica, la formulación de vacuna comprende todo lo siguiente: sacarosa: 6.84% en peso/volumen (p/v); monoclorhidrato de arginina 1.21% p/v; ácido glutámico, monohidrato de monosodio 0.094% p/v; hidrolizado de gelatina, tipo A de porcino (u otras fuentes) 1% p/v; fosfato dibásico de potasio 1.13%; y fosfato monobásico de potasio 0.48% p/v.

En otra modalidad específica," la formulación de vacuna comprende todo lo siguiente (dentro de 10% variación de uno o más componentes) : sacarosa: 6.84% en peso/volumen (p/v); monoclorhidrato de arginina 1.21% p/v; ácido glutámico, monohidrato de monosodio 0.094% p/v; hidrolizado de gelatina, tipo A de porcino (u otras fuentes) 1% p/v; fosfato dibásico de potasio 1.13%; y fosfato monobásico de potasio 0.48% p/v. En otra modalidad específica, la formulación de vacuna comprende todo lo siguiente (dentro de 10% variación de uno o más componentes) : sacarosa: 6.84% en peso/volumen (p/v); monoclorhidrato de arginina 1.21% p/v; hidrolizado de gelatina, tipo A de porcino (u otras fuentes) 1% p/v. En esas modalidades, las formulaciones están en regulador de pH (v.gr., un regulador de pH de fosfato de potasio (pH 7.0-7.2)) . En otra modalidad específica, las formulaciones de vacuna comprenden todo lo siguiente (dentro de 20% variación de uno o más componentes) : sacarosa: 6.84% en peso/volumen (p/v); monoclorhidrato de arginina 1.21% p/v; ácido glutámico, monohidrato de monosodio 0.094% p/v; hidrolizado de gelatina, tipo A de porcino (u otras fuentes) 1% p/v; fosfato dibásico de potasio 1.13%; y fosfato monobásico de potasio 0.48% p/v.

En otra modalidad específica adicional, la formulación de vacuna comprende todo lo siguiente (dentro de 30% variación de uno o más componentes) : sacarosa: 6.84% en peso/volumen (p/v); monoclorhidrato de arginina 1.21% p/v; ácido glutámico, monohidrato de monosodio 0.0945 p/v; hidrolizado de gelatina, tipo A de porcino (u otras fuentes) 1% p/v; fosfato dibásico de potasio 1.13%; y fosfato monobásico de potasio 0.48% p/v. En otra modalidad específica adicional, la formulación de vacuna comprende todo lo siguiente (dentro de 40% variación de uno o más componentes) : sacarosa: 6.84% en peso/volumen (p/v); monoclorhidrato de arginina 1.21% p/v; ácido glutámico, monohidrato de monosodio 0.094% p/v; hidrolizado de gelatina, tipo A de porcino (u otras fuentes) 1% p/v; fosfato dibásico de potasio 1.13%; y fosfato monobásico de potasio 0.48% p/v.

En otra modalidad específica, la formulación de vacuna comprende todo lo siguiente (dentro de 1% variación de uno o más componentes) : sacarosa: 6.84% en peso/volumen (p/v); monoclorhidrato de arginina 1.21% p/v; ácido glutámico, monohidrato de monosodio 0.094% p/v; hidrolizado de gelatina, tipo A de porcino (u otras fuentes) 1% p/v; fosfato dibásico de potasio 1.13%; y fosfato monobásico de potasio 0.48% p/v. En otra modalidad específica, la formulación de vacuna comprende todo lo siguiente (dentro de 3% variación de uno o más componentes): sacarosa: 6.84% en peso/volumen (p/v); monoclorhidrato de arginina 1.21% p/v; ácido glutámico, monohidrato de monosodio 0.094% p/v; hidrolizado de gelatina, tipo A de porcino (u otras fuentes) 1% p/v; fosfato dibásico de potasio 1.13%; y fosfato monobásico de potasio 0.48% p/v. En una modalidad específica, la formulación de vacuna puede contener, v.gr., fosfato de potasio (v.gr., por lo menos 50 mM, o por lo menos 100 mM, o por lo menos 200 mM, o por lo menos 250 mM) como un regulador de pH o alternativamente, histidina (v.gr., por lo menos 50 mM, o por lo menos 100 mM, o por lo menos 200 mM, o por lo menos 250 mM) .

Opcionalmente , el secado por aspersión, un proceso de secado rápido por el cual la alimentación líquida de formulación es atomizada por aspersión en gotas finas bajo una corriente de gas calentado seco, se puede utilizar para extender el tiempo de almacenamiento de una formulación de vacuna. La evaporación de las gotas finas da por resultado polvos secos compuestos de los solutos disueltos (véase, v.gr., publicación de patente de E.U.A. No. 2004/0042972).

Generalmente, virus o componentes virales se pueden administrar profilácticamente en un vehículo o excipiente apropiado para estimular una respuesta inmunológica específica para una o más cepas de virus. Típicamente, el vehículo o excipiente es un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, tal como agua estéril, solución salina acuosa, soluciones salinas acuosas con pH regulado, soluciones acuosas de dextrosa, soluciones acuosas de glicerol, etanol o combinaciones de las mismas. La preparación de esas soluciones que asegura esterilidad, pH, isotonicidad y estabilidad se efectúa de conformidad con protocolos establecidos en la técnica. Generalmente, un vehículo o excipiente se selecciona para reducir al mínimo efectos alérgicos y otros efectos no deseables, y para adecuar la vía de administración particular, v.gr., subcutánea, intramuscular, intranasal, etc.

Opcionalmente , la formulación para administración profiláctica del virus, o componentes de la misma, también contienen uno o más adyuvantes para incrementar la respuesta inmunológica a los antígenos de influenza. Los adyuvantes adecuados incluyen: saponina, geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias activas de superficie tales como lisolecitina , polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite o hidrocarburo, Bacille Calmette-Guerin (BCG) , Corynebacterium parvum, y los adyuvantes sintéticos QS-21 y MF59.

Generalmente, las formulaciones de vacuna se administran en una cantidad suficiente para estimular una respuesta inmunológica específica para una o más cepas de virus de la influenza. Preferiblemente, la administración del virus produce una respuesta inmunológica protectora. Las dosis y métodos para producir una respuesta inmunológica protectora contra una o más cepas virales son conocidas por. los expertos en la técnica. Por ejemplo, los virus inactivados de la influenza se proveen en el intervalo de aproximadamente 1-1000 HID50 (dosis infecciosa humana) , es decir, aproximadamente 105 -108 pfu (unidades formadoras de placa) por dosis administrada. Alternativamente, aproximadamente 10-50 g, v.gr., aproximadamente 15 µ9 HA se administra sin un adyuvante, con dosis más pequeñas administradas con un adyuvante. Típicamente, la dosis se ajustará dentro de este intervalo basado en, v.gr., la edad, condición física, peso corporal, sexo, dieta, tiempo de administración, y otros factores clínicos. La formulación profiláctica de vacuna se administra sistémicamente , v.gr., por inyección subcutánea o intramuscular mediante el uso de una aguja y jeringa, o un dispositivo de inyección sin aguja. Alternativamente, la formulación de vacuna se administra intranasalmente , ya sea por gotas, aerosol en partículas grandes (mayores que aproximadamente 10 mieras) , o aspersión en el tracto respiratorio superior. Aunque cualquiera de las vía de suministro anteriores da por resultado una respuesta inmunológica sistémica protectora, la administración intranasal confiere el beneficio añadido de producir inmunidad de la mucosal en el sitio de entrada del virus de la influenza. Para administración intranasal, vacunas de virus atenuados vivos a menudo son preferidas, v.gr., un virus de la influenza atenuado, adaptado al frío y/o sensible a la temperatura, recombinante o reordenador. Aunque la estimulación de una respuesta inmunológica protectora con una sola dosis es preferida, dosis adicionales se pueden administrar, por la misma o diferente vía, para lograr el efecto profiláctico deseado. Estos métodos se pueden adaptar para cualquier virus que incluya pero no se limite a, ortomixovirus (que incluye cepas de influenza A y B) , paramixovirus (que incluye RSV, metapneumovirus humano y parainfluenza) , rhabdovirus y flavovirus.

Vacunas contra RSV En una modalidad, presentada aquí, se proveen métodos de producir una respuesta inmunológica en un sujeto, que comprenden administrar a un sujeto que necesita la misma una cantidad efectiva de una composición inmunogénica descrita en la presente que comprende un virus purificado atenuado vivo (v.gr., RSV) . En algunas modalidades, el virus atenuado es un virus quimérico.

En una modalidad específica, presentada aquí se proveen métodos de producción de una respuesta inmunológica en un mamífero (v.gr., a human), que comprende administrar a un mamífero que necesita la misma una cantidad efectiva ,de una composición inmunogénica descrita en la presente que comprende un RSV atenuado. En una modalidad particular, los RSV atenuados es rA2cp248/404/l030ASH.

Las composiciones inmunogénicas descritas en la presente que comprenden un virus purificado atenuado vivo pueden estar en la inmunización activa de un sujeto. ;En una modalidad, presentada aquí se proveen métodos de prevención de una infección viral, que comprende administrar a un sujeto una cantidad efectiva de una composición inmunogénica descrita en la presente que comprende un virus purificado atenuado vivo, es decir, una vacuna. En algunas modalidades, un virus atenuado vivo es un virus quimérico.

En una modalidad específica, presentada aquí se proveen métodos para prevenir una infección de RSV, que comprende administrar a un mamífero (v.gr. , un humano) una cantidad efectiva de una composición inmunogénica descrita en la presente que comprende un RSV purificado atenuado vivo, es decir, una vacuna. En una . modalidad particular, un RSV atenuado vivo es rA2cp248/404/l030ASH .

Las composiciones inmunogénicas descritas en la presente que comprenden un virus purificado atenuado vivo se pueden usar en la inhibición de infecciones virales. En una modalidad, presentada aquí se proveen métodos de inhibición de una infección viral, que comprende administrar a un sujeto que necesita la misma una cantidad efectiva de una composición inmunogénica descrita en la presente que comprende un virus purificado atenuado vivo. En algunas modalidades, el virus atenuado es un virus quimérico. En una modalidad específica, presentada en la presente se proveen métodos para inhibir una infección de RSV, que comprende administrar a un mamífero (v.gr., un humano) una cantidad efectiva de una composición inmunogénica descrita en la presente que comprende un RSV atenuado purificado vivo. En una modalidad particular, el RSV atenuado es rA2cp248/404/1030ASH.

Las composiciones inmunogénicas descritas en la presente que comprende un virus purificado atenuado vivo se pueden usar para inducir una respuesta inmunológica que da por resultado una reducción en título de virus en un sujeto. En una modalidad, presentada aquí se proveen métodos de reducción del título de un virus en un sujeto, que comprende administrar una composición inmunogénica descrita en la presente que comprende un virus atenuado vivo asociado con células. En alguna modalidad, el virus atenuado es quimérico. En una modalidad específica, presentada aquí se proveen métodos para reducir el título de RSV, que comprende administrar a un mamífero (v.gr., un humano) una cantidad efectiva de una composición inmunogénica descrita en la presente que comprende un RSV atenuado vivo. En una modalidad particular, el RSV atenuado es rA2cp248/404/1030ASH .

En algunas modalidades, una cantidad efectiva de una composición inmunogénica descrita en la presente reduce el título viral en aproximadamente 2 veces, preferiblemente aproximadamente 5 veces o más, aproximadamente 10 veces , o más, o aproximadamente 20 veces o más en un sujeto desafiado por el virus en relación con un sujeto no tratado. En ciertas modalidades, una cantidad efectiva de una composición inmunogénica descrita en la presente reduce la duración y/o severidad de uno o más síntomas asociados con un virus asociado con infección de células en sujetos subsecuentemente infectados con los virus asociados con células en relación con sujetos no tratados. En algunas modalidades, una cantidad efectiva de una composición inmunogénica descrita en la presente incrementa la supervivencia de sujetos subsecuentemente infectados con los virus purificados en relación con sujetos no tratados.

La composiciones inmunogénicas descritas en la presente que comprenden un virus purificado atenuado vivo se pueden administrar a un sujeto intacto, es decir, un sujeto que no ha sido y no está actualmente infectado con el virus de interés. En una modalidad, una composición inmunogénica descrita en la presente que comprende un virus atenuado vivo asociado con células se puede administrar a un sujeto intacto que está en riesgo de desarrollar una infección viral. En una modalidad específica, una composición inmunogénica descrita en la presente que comprende un RSV atenuado vivo se puede administrar a un sujeto intacto que está en riesgo de desarrollar una infección de RSV. En una modalidad particular, el RSV atenuado es rA2cp248/404/l030ASH.

Las composiciones inmunogénicas descritas en la presente que comprende un virus purificado atenuado vivo se pueden administrar a un sujeto que anteriormente ha sido infectado con a grupo, subgrupo o cepa diferente del virus de interés. En una modalidad, una composición inmunogénica se administra a un sujeto que anteriormente ha sido infectado con un virus de un grupo, subgrupo o cepa diferente que el virus de interés y está en riesgo de desarrollar una infección con el virus de interés.

En una modalidad, una composición inmunogénica descrita en la presente que comprende un RSV atenuado vivo (v.gr., rA2cp248/404/1030ASH) se administra a un bebé humano o bebé humano nacido prematuramente. En otra modalidad, una composición inmunogénica descrita en la presente que comprende un RSV atenuado vivo (v.gr., rA2cp248/404/l030ASH) se administra a un humano con fibrosis cística, displasia broncopulmonar, enfermedad cardiaca congénita, inmunodeficiencia congénita o inmunodeficiencia adquirida. En otra modalidad, una composición inmunogénica descrita' en la presente que comprende un RSV atenuado vivo (v.gr., rA2cp248/404/l030ASH) se administra a un bebé humano en edad de gatear. En otra modalidad, una composición inmunogénica descrita en la presente que comprende a RSV atenuado vivo (v.gr., rA2cp248/404/1030ASH) se administra a un niño humano. En otra modalidad, una composición inmunogénica descrita en la presente que comprende un RSV atenuado vivo (v.gr., rA2cp248/404/l030ASH) se administra a un niño humano: en la escuela. .

En una modalidad específica, una composición i inmunogénica descrita en la presente que comprende un RSV atenuado vivo (v.gr., rA2cp248/404/l030ASH) se administra a un humano de 1 a 24 meses de edad. En otra modalidad, una composición inmunogénica descrita aquí que comprende un RSV atenuado vivo (v.gr., rA2cp248/404/l030ASH) se administra a un humano de 1 a 3 meses de edad. En otra modalidad, una composición inmunogénica descrita en la presente que comprende un RSV atenuado vivo (v.gr., rA2cp248/404/l030ASH) se administra a un humano de 6 a 24 meses de edad.

En otra modalidad, una composición inmunogénica descrita en la presente que comprende un RSV atenuado vivo (v.gr., rA2cp248/404/1030ASH) se administra a un humano que ha tenido un trasplante de médula ósea. En otra modalidad, una composición inmunogénica descrita en la presente que comprende un RSV atenuado vivo (v.gr., rA2cp248/404/1030ASH) se administra a un humano de edad avanzada. En otra modalidad, una composición inmunogénica descrita en la presente que comprende un RSV atenuado vivo (v.gr., rA2cp248/404/1030ASH) se administra a un humano en una guardería. En otra modalidad, una composición inmunogénica descrita en la presente que comprende un RSV atenuado vivo (v.gr., rA2cp248/404/l030ASH) se administra a un humano que vive en un hogar de grupo (es decir, un hogar en el cual viven 15 o más sujetos humanos) .

En una modalidad específica, una composición inmunogénica^ que comprende un RSV atenuado vivo (v.gr., rA2cp248/404/1030ASH) se administra a un sujeto humano (en una modalidad específica, el sujeto humano es un bebé humano, un bebé humano nacido prematuramente o un bebé humano en edad de gatear) antes de la estación de RSV, típicamente de noviembre a abril en el hemisferio norte. En otra modalidad, una composición inmunogénica que comprende un RSV atenuado vivo (v.gr., rA2cp248/404/l 030ASH) se administra a un sujeto humano (en una modalidad específica, el sujeto humano es un bebé humano, un bebé humano nacido prematuramente o un bebé humano en edad de gatear) durante la estación dé RSV, típicamente de noviembre a abril en el hemisferio norte. En otra modalidad, una composición inmunogénica que comprende un RSV atenuado vivo (v.gr., rA2cp248/404/l030ASH) se administra a un sujeto humano (en una modalidad específica, el ; sujeto humano es un bebé humano, a bebé humano nacido prematuramente o un bebé humano en edad de gatear) antes y durante la estación de RSV, típicamente de noviembre a abril en el hemisferio norte.

En ciertas modalidades, una composición inmunogénica descrita en la presente que comprende un virus purificado atenuado vivo no da por resultado protección complete contra una infección viral, sino que da por resultado un título viral más bajo comparado con un sujeto no tratado cuando es desafiado con el virus. En ciertas modalidades, la administración de una composición inmunogénica descrita en la presente que comprende un virus purificado atenuado vivo da por resultado una reducción de 0.5 veces, 1 veces, 2 veces, 4 veces, 6 veces, 8 veces, 15 veces, 25 veces, 50 veces o mayor en el título del virus en relación con un sujeto no tratado cuando se desafía con el virus. En algunas modalidades, la administración de una composición inmunogénica descrita en la presente que comprende un virus atenuado vivo da por resultado una reducción de 10%, preferiblemente a 25%, 50%, 75% o mayor en el título del virus en relación con un sujeto no tratado cuando es desafiado con el virus. Los beneficios de una reducción en el título viral incluyen, pero no se limitan a, síntomas menos severos de una infección viral, menos síntomas de una infección viral, y una reducción en la longitud de una infección viral.

Las composiciones inmunogénicas descritas en la presente que comprenden un virus quimérico atenuado vivo asociado con células se pueden usar para inducir una respuesta inmunológica a un antígeno no viral. La composición inmunogénica descrita en la presente que comprende un virus quimérico atenuado vivo asociados con células se pueden usar para suministrar una proteína, polipéptido o péptido de interés a un sujeto para prevenir y/o tratar una enfermedad.

Muchos métodos se pueden usar para introducir las composiciones inmunogénicas, v.gr., formulaciones de vacuna, descritas en la presente, éstas incluyen, pero no se limitan a, vías intranasal, intratraqueal , oral, pulmonar, intradérmica, intraperitoneal y parenteral (v.gr., intramuscular, intravenosa y subcutánea) . En algunas modalidades, una composición inmunogénica descrita en la presente que comprende un virus atenuado vivo asociado con células se administra por la vía natural de infección del virus. En una modalidad específica, una composición inmunogénica que comprende un RSV atenuado vivo (v.gr., rA2cp248/404/1030ASH) se administra intranasalmente . ; En procesos de inmunización, la cantidad de una composición inmunogénica que se ha de usar y el programa de inmunización serán determinadas por un médico experto1 en la técnica y se administrará por referencia a la respuesta inmunológica y títulos de anticuerpo del sujeto. En una modalidad específica, a un bebé humano, bebé humano : nacido prematuramente o un bebé humano en edad de gatear se administra una dosis de una composición inmunogénica que comprende un RSV atenuado vivo (v.gr., rA2cp248/404/1030ASH) , en donde la dosis de la composición inmunogénica comprende aproximadamente 125 a 200 FFU del RSV atenuado. En otra modalidad, a un bebé humano, bebé humano nacido prematuramente o un bebé humano en edad de gatear se administra una dosis de una composición inmunogénica que comprende un RSV atenuado vivo (v.gr., rA2cp248/404/1030ASH) , en donde la dosis: de la composición inmunogénica comprende aproximadamente 12^5 FFU, aproximadamente 150 FFU, aproximadamente 175 FFU o aproximadamente 200 FFU del RSV atenuado.

En algunas modalidades, 2-6 dosis de una composición inmunogénica que comprende aproximadamente 125 a 200 FFU de un RSV atenuado vivo (v.gr. , rA2cp248/404/1030ASH) se administra a un bebé humano, un bebé humano nacido prematuramente o un bebé humano en edad de gatear. En algunas modalidades, las dosis de la composición inmunogénica se administran ,1 a 6 meses aparte o 2 a 12 meses aparte. En una modalidad específica, 3 dosis de una composición inmunogénica que comprende aproximadamente 125 a 200 FFU de un RSV atenuado vivo (v.gr., rA2cp248/404/1030ASH) se administran a un bebé humano, un bebé humano nacido prematuramente o un bebé humano en edad de gatear 2 meses aparte. Por ejemplo, una primera dosis de una composición inmunogénica que comprende 150 FFU de un RSV atenuado vivo (v.gr., rA2cp248/404/l030ASH) se administra a un bebé menos de 1 mes de edad, una segunda dosis de la composición inmunogénica que comprende 150 FFU del RSV atenuado vivo (v.gr., rA2cp248/404/1030ASH) se administra al bebé humano a aproximadamente 2 meses de edad, y una tercera dosis de la composición inmunogénica que comprende 150 FFU del RSV atenuado vivo (v.gr., rA2cp248/404/1030ASH) se administra al bebé humano a aproximadamente 4 meses de edad.

Virus Un virus asociado con células puede ser un virus que ocurre naturalmente, un virus mutagenizado (v.gr., un virus mutado por exposición a irradiación de UV, mutágenos, y/o pasadas) , un rearreglo (para virus asociados con células con genomas segmentados), y/o un virus genéticamente manipulado. Ejemplos no limitantes de virus de ARN asociados con células incluyen virus de sincicio respiratorio (RSV) , virus de sarampión, virus de la influenza, virus espumoso humano, retrovirus tales como HTLV, lentivirus tales como VIH y SIV, y reovirus. Alternativamente, un virus asociado con células es un virus de ADN, tal como un virus de herpes. Ejemplos no limitantes de virus de ADN asociados con células incluyen virus de herpes, EBV, CMV y virus de enfermedad de Marek. En ciertas modalidades, el virus asociado con células purificado por un proceso descrito en la presente y/o contenido en una composición inmunogénica descrita en la presente es defectuoso en replicación. En una modalidad específica, una o más funciones esenciales para replicación de genoma viral y/o síntesis son defectuosos en el virus defectuoso en replicación asociado con células. En otra modalidad, una o más funciones esenciales para el ensamble de partículas virales son defectuosas en el virus defectuoso en replicación asociado con células. En otra modalidad, una o más funciones esenciales para replicación de genoma viral o síntesis y ensamble de partículas virales son defectuosas en el virus defectuoso en replicación asociado con células.

En una modalidad específica, el virus asociado con células purificadas por un proceso descrito en la presente y/o contenido en una composición inmunogénica descrita en la presente es un virus atenuado. En una modalidad particular, el virus asociado con células es un virus atenuado vivo. Un virus atenuado asociado con células puede tener, v.gr., una capacidad reducida para replicar su genoma viral, una capacidad reducida para replicarse en un hospedero destinado, una capacidad reducida para ensamblar partículas virales infecciosas, y/o una capacidad reducida para infectar una célula hospedera en relación con un virus de tipo silvestre asociado con células. La atenuación del virus asociado con células se puede probar por cualquier método conocido por un experto en la técnica. Véase, v.gr., solicitud de E.U.A. Serie No. 10/831,780, 23 de abril de 2004 (publicada el 27 de enero de 2005 como publicación de solicitud de E.U.A. No. 2005/0019891) y en particular la sección 5.7 titulada "Attenuation of Recombinant Viruses,". En algunas modalidades, el virus atenuado es producido mediante el uso de técnicas de mutagénesis bien conocidas, tales como ; asada por frío del virus o exposición a irradiación de UV y/o mutágenos. En otras modalidades, el virus atenuado es genéticamente manipulado.

Un virus asociado con células puede ser un virus quimérico. En una modalidad específica, el virus quimérico es un virus defectuoso en replicación. En una modalidad particular, el virus quimérico es un virus atenuado.

Virus dé la Influenza El medio de cultivo, métodos, procesos y composiciones de la presente son particularmente útiles para la producción y purificación de virus de la influenza para vacunas. Los virus de la influenza están hechos de un núcleo interno de ribonucleoproteína que contiene un genoma de ARN de cadena sencilla segmentado y una envoltura externa de lipoproteína revestida por una proteína de matriz. Los virus de la influenza A e influenza B contienen cada uno dé ellos ocho segmentos de ARN de sentido negativo de cadena sencilla. El genoma de influenza A codifica once polipéptidos . Los segmentos 1-3 codifican tres polipéptidos , que constituyen ARN polimerasa dependiente de ARN. El segmento 1 codifica la proteína PB2 del complejo de polimerasa. Las proteínas de , polimerasa PB1 y PA restantes son codificadas por el segmento 2 y el segmento 3, respectivamente. Además, el segmento 1 de algunas cepas de la influenza codifica una proteína pequeña, PB1-F2, producida a partir de un marco de lectura alternativo dentro de la región codificante de PB1. El segmento 4 codifica la glicoproteína de superficie de hemaglutinina (HA) implicada en unión y entrada a la célula durante la infección. El segmento 5 codifica el polipéptido de la nucleoproteína de la nucleocápside (NP) , el componente estructural mayor asociado con ARN viral. El segmento 6 codifica una envoltura de glicoproteína de neuraminidasa (NA) . El segmento 7 codifica dos proteínas de matriz, designadas MI y M2 , que son traducidas de ARNm diferencialmente empalmados. El segmento 8 codifica NS1 y NS2, dos proteínas no estructurales, que son traducidas de variantes de ARNm alternativamente empalmadas.

Los ocho segmentos de genoma de influenza B codifican 11 proteínas. Los tres genes más grandes codifican para componentes de la ARN polimerasa, PB1, PB2 y PA. El segmento 4 codifica la proteína HA. El segmento 5 codifica NP. El segmento 6 codifica la proteína NA y la proteína NB . Ambas proteínas, NB y NA, son traducidas de marcos de lectura traslapables de un ARNm biscistrónico . El segmento 7 de influenza B también codifica dos proteínas: MI y M2. El segmento El más pequeño codifica dos productos, NS1 que es traducido del .ARN de longitud completa, y NS2 que es traducido de una variante de ARNm empalmado.

Los virus rearreglados son producidos. para incorporar antígenos de hemaglutinina y/o neuraminidasa seleccionados de aislados clínicos en el contexto de una cepa maestra aprobada también llamada un virus donador maestro (MDV) . FluMist®, por ejemplo, hace uso de cepas adaptadas al frío, atenuadas, sensible a la temperatura MDV aprobada (v.gr., ca A/AnnArbor/6/60 y ca B/AnnArbor/l/66) . Otras cepas que se pueden usar como un virus donador maestro incluyen, pero no se limitan a, ca A/AnnArbor/6/60, ca B/Ann Arbor/l/66, ca A/Leningrad/134/17/57, A/PuertoRico/8/34 (PR8) , ca B/Ann Arbor/ 1/94, B/Leningrad/14/17/55 , B/USSR/60/69 , y B/Leningrad/179/86.

Un número de métodos son útiles para la generación de virus rearreglados que incluyen métodos basados en huevo y más recientemente métodos de cultivo de células Véase, v.gr., publicaciones del PCT WO 03/091401; WO 05/062820 y patentes de US NOS. 6,544,785; 6,649,372; 6,951,75, y solicitudes de patente de E.U.A. Nos. 11/455,818, 11/455,734, y 11/501,067. Se contempla que los medios y métodos de la invención son útiles para la producción de virus de la influenza que incluyen pero no se limitan a las cepas de influenza descritas aquí y virus rearreglados que comprende genes de un Virus donador maestro (v.gr., ca A/AnnArbor/6/60 , ca B/AnnArbor/l/66 , PR8, etc.). Además se contempla que los medios y métodos de la invención son útiles para la producción de virus de la influenza, que incluyen virus rearreglados, que tienen uno o más de los siguientes fenotipos, sensibles a la temperatura, adaptados al frío, atenuados. Los virus rearreglados se pueden generar por técnicas de rearreglo clásicas, por ejemplo por métodos de co-infección u opcionalmente por técnicas de rescate de plásmido (véase, v.gr., publicaciones del PCT WO 03/091401 y WO 05/062820; patentes de E.U.A. Nos. 6,544,785, 6,649,372, 6,951,754, 6,887,699, 6,001,634, 5,854,037, 5,824,536, 5,840,520, 5,820,871, 5,786,199, y 5,166,057; publicaciones de solicitud de patente de E.U.A. Nos. 20060019350, 20050158342, 20050037487, 20050266026, 20050186563, 20050221489, 20050032043, 20040142003, 20030035814, y 20020164770; y Neumann et al. (1999) Generation of influenza A virus entirely from cloned cDNAs . Proc Nati Acad Sci USA 96:9345-9350; Fodor et al. (1999) Rescue of influenza A virus from recombinant DNA. J. Virol 73:9679-9682; Hoffmann et al. (2000) A DNA transfección system for generation of influenza A virus from eight plasmids Proc Nati Acad Sci USA 97:6108-6113; WO 01/83794; Hoffmann y Webster (2000), Unidirectional RNA polymerase I-polymerase II transcription system for the generation of influenza A virus from eight plasmids, 81:2843-2847; y Hoffmann et al. (2002), Rescue of influenza B virus from 8 plasmids, 99(17): 11411-11416. Recientemente, los rearreglos han sido generados por rescate de plásmido en células MDCK {véase, v.gr., publicación del PCT WO 2007/124327; Wang y Duke; 23 de octubre de 2007, J". Virol, 4 : 102) .

Virus de Sincicio Respiratorio Los métodos, procesos y composiciones en la presente son particularmente útiles para la producción y purificación de RSV para vacunas. Cualquier grupo, subgrupo o cepa de RSV (v.gr., grupo A o grupo B) puede ser purificado por un proceso descrito en la presente y/o contenido en una composición inmunogénica descrito en la presente. Véase, v.gr. , Sato et al., 2005, Journal of Clinical Microbiology 43: 36-40 para una discusión de los grupos y subgrupos de RSV. En una modalidad, el RSV pertenece al grupo A. En otra modalidad, el RSV pertenece al grupo B .

El RSV purificado por un proceso descrito en la presente y/o contenido en una composición inmunogénica descrito en la presente puede ser una cepa de RSV que ocurre naturalmente, un RSV mutagenizado (v.gr., un virus mutado por exposición a irradiación de UV, mutágenos, y/o pasadas) , y/o a RSV genéticamente manipulado. En una modalidad, el genoma de RSV comprende una o más mutaciones en uno o más genes virales, tales como los genes F, G, NS1, NS2 , Mi (marco de lectura abierta ("0RF")1), M2(ORF2), SH2 , N, P, o L. En algunas modalidades, una combinación de substituciones, deleciones y/o inserciones son introducidas en el genoma de RSV. En algunas modalidades, el genoma de RSV comprende una o más mutaciones de sentido erróneo en uno o más genes virales, tales como los genes F, G, NS1, NS2 , Ml(ORFl), M2(ORF2), SH2 , N, P, o L. En algunas modalidades, el genoma de RSV comprende una deleción de una o más de todos o una porción de uno o más genes virales, tales como los genes NS1, NS2, Ml(ORFl), M2(ORF2), SH2 , N, P o L . ' En una modalidad, el RSV que puede ser purificado por un proceso descrito en la presente y/o contenido ,en una composición inmunogénica descrito en la presente es defectuoso en replicación. En una modalidad específica, el RSV que puede ser purificado por un proceso descrito en la presente y/o contenido en una composición inmunogénica descrita en la presente es atenuado. Para ejemplos no limitantes de mutaciones que puede ser introducidas; en el genoma de RSV para atenuar el virus véase, v.gr., solicitud de E.U.A. Serial No. 10/831,780, 23 de abril de 2004 (publicada el 27 de enero de 2005 como publicación de solicitud de E.U.A. No. 2005/0019891) y solicitud de E.U.A. serie No. 11/389,618, presentada el 24 de marzo dé 2006 (publicada el 20 de julio de 2006 como publicación de solicitud de E.U.A. No. 2006/0160130) . Los RSVs atenuados incluyen, pero no se limitan a, mutantes de pasada por frío (cp) (v.gr., cpRSV descritos en, v.gr., Kim et al.,; 1971, Pediatrics 48: 745-755, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad) , mutantes sensibles a la temperatura (ts) (v.gr., RSV ts-1, RSV ts-2, tslA, ts\9A, y tslC descritos en, v.gr., Crowe et al., 1993, Vaccine 11 : 1395-1404 ;¡ Crowe et al., 1995, Vaccine 13:847-855; Mills et al., 1971, J Immunol . 107:123-130; y Pringle et al., Vaccine 1993 11 :473-478) , mutantes de pasaje en frío sensibles [ a la temperatura (cpts) (v.gr., cpts248/404, cpts248/255, cpts248/955 y cp£s530/l009 ; véase, v.gr., Karron et al., 1997, J Infect Dis. 176:1428-1436) , y mutantes genéticamente manipulados (v.gr., rA2cp248/404ASH, rA2cp248/404/l030ASH, rANSl, G??2-2, y r248ñNS2 descritos en, v.gr., Karron et al., J. of Infect. Diseases 191 : 1093-1140; hitehead et al., 1999, J. Virol. 73: 3438-3442; y Collins et al., 2005, Proc. Am. Thorac . Soc . 2: 166-173).

En una modalidad específica, el RSV que puede ser purificado por un proceso descrito en la presente y/o contenido en una composición inmunogénica descrita en la presente es rA2cp248/404/1030ASH . Estos RSV atenuados contienen múltiples elementos genéticos atenuantes que son responsable de sus propiedades de sensibilidad a la temperatura y atenuación que incluyen: (i) un conjunto de 5 mutaciones de sentido erróneo en las proteínas N, F y L que atenúan RSV de pasada por frío; (ii) las modificaciones 248 y 1030 que son mutaciones separadas de sentido erróneo en la proteína L que reduce la temperatura restrictiva y confiere un fenotipo sensible a la temperatura y atenúa el virus; (iii) las modificaciones 404 que son una combinación de una substitución de nucleótido en la señal de transcripción de inicio de gen del gen M2 y una mutación de sentido erróneo en la proteína L que juntos confieren sensibilidad a la temperatura adicional; y (iv) ASH que es una deleción del gen SH entero que confiere un fenotipo atenuado. Véase la tabla 2 siguiente para los lugares de las substituciones de aminoácidos introducidas en el genoma de RSV.

Tabla 2 Substituciones de Aminoácidos Introducidas en el Genoma de RSV ?Sustituciones de aminoácidos en relación con RSV A2 de tipo silvestre En algunas modalidades, el RSV que puede ser purificado por un proceso descrito en la presente y/o contenido en una composición inmunogénica descrita : en la presente es genéticamente manipulada para expresar una o más secuencias heterólogas (es decir, el RSV es un j virus quimérico) . Las secuencias heterólogas pueden ser introducidas, v.gr. , en las secuencias codificantes de F, G, NS1, NS1, MI (0RF1) , M2(ORF2) , N, P, SH2 y/o L. Ejemplos no limitantes de secuencias heterólogas que un RSV puede ser genéticamente manipulado para expresar incluyen antígenos (v.gr., antígenos virales, antígenos bacterianos, antígenos tumorales (tales como aquellos descritos por Robbins y Kawakawi, 1996, Curr. Opin. Immunol . 8: 628-636) , antígenos de hongos, y antígenos de parásitos) , un marcador o etiqueta (v.gr., una etiqueta de bandera y una His-tag) , proteínas quiméricas (v.gr., un híbrido de proteínas RSV G de dos cepas de RSV diferentes) , y proteínas, polipéptidos o péptidos que poseen una propiedad o actividad biológica deseada (v.gr., citocinas tales como interferón (IFN)-OÍ IFN-ß, IFN-?,? IL-2, IL-7, IL-9, IL-15 e IL-22). En una modalidad específica, el RSV quimérico es atenuado. Para ejemplos no limitantes de RSVs quiméricos, véase, v.gr., solicitud de E.U.A. serie No. 10/831,780, 23 de abril de 2004 (publicada el 27 de enero de 2005 como publicación de solicitud de E.U.A. No. 2005/0Ó19891) y solicitud de E.U.A. serie No. 11/389,618, presentada el 24 de marzo de 2006 (publicada el 20 de julio de 200£ como publicación de solicitud de E.U.A. No. 2006/0160130) .

En una modalidad, RSV es genéticamente manipulado para expresar uno o más antígenos virales de un virus que pertenece a un grupo, subgrupo o cepa de RSV diferente al vector de RSV. Por ejemplo y no a manera de limitación, el vector de RSV puede ser suministrado de un RSV de grupo B y la secuencia heteróloga puede ser suministrada de un RSV de grupo A. ¡ En otra modalidad, el RSV es genéticamente manipulado para expresar uno o más antígenos virales obtenidos o derivados de un virus distinto de RSV. Ejemplos no limitantes de antígenos virales incluyen antígenos de adenoviridae (v.gr., mastadenovirus y aviadenovirus) , herpesviridae (v.gr., virus de herpes simple 1, virus de herpes simple 2, virus de herpes simple 5, virus de herpes simple 6, virus de Epstein-Barr, HHV6-HHV8 y citomegalovirus) , leviviridae (v.gr., levivirus, enterobacteria de fase MS2, alolevirus) , poxviridae (v.gr., cordopoxvirinae , parapoxvirus , avipoxvirus, capripoxvirus , leporiipoxvirus , suipoxvirus, moluscipoxvirus , y entomopoxvirinae) , papovaviridae (v.gr., poliomavirus y papilomavirus) , paramixoviridae (v.gr., paramixovirus , paravirus de la influenza 1, mobilivirus (v.gr., virus de sarampión), rubulavirus (v.gr., virus de paperas), pneumonovirinae (v.gr., pneumovirus, virus de sincicio respiratorio humano) , virus de sincicio respiratorio humano y metapneumovirus (v.gr., pneumovirus aviar y metapneumovirus humano)), picornaviridae (v.gr., enterovirus, rinovirus, hepatovirus (v.gr., virus de hepatitis A humano), cardiovirus, y aptovirus) , reoviridae (v.gr., ortoreovirus , orbivirus, rotavirus, cipovirus, fijivirus, fitoreovirus , y orizavirus) , retroviridae (v.gr., retrovirus de tipo B de mamífero, retrovirus de tipo C de mamífero, retrovirus de tipo C aviar, grupo de retrovirus de tipo D, retrovirus BLV-HTLV, lentivirus (v.gr., virus de inmunodeficiencia humana 1 y virus de inmunodeficiencia humana 2 (v.gr., HIV gpl60) , spumavirus) , flaviviridae (v.gr. , virus de hepatitis C, virus del dengue, virus del Nilo Occidental), hepadnaviridae (v.gr., virus de hepatitis B) , togaviridae (v.gr., alfavirus (v.gr.,: virus sindbis) y rubivirus (v.gr., virus de rubéola)), rabdoviridae (v.gr., vesiculovirus , lisavirus, virus efemero, citorabdovirus , y necleorhabdovirus) , arenaviridae (v.gr., arenavirus, virus de coriomeningitis linfocítica, virus Ippy, y virus lassa) , y coronaviridae (v.gr. , coronavirus y torovirus) . En una modalidad específica, el antígeno viral es suministrado a partir de un virus que da por resultado enfermedad respiratoria, tal como antígenos de influenza (v.gr., hemaglutinina H5 y H7) , antígenos de metapne dé virus de enfermedad de Newcastle, antígenos de virus Sendai, y antígenos de virus de laringotraquitis infecciosa (ILV) . En ciertas modalidades, el antígeno viral es derivado de virus de parainfluenza humana tipo 1, virus de parainfluenza humana tipo 2, virus de parainfluenza humana tipo 3, o de virus Sendai. En otra modalidad, el antígeno viral, es HIV gpl20, HIV nef, neuraminidase de virus de la influenza, hemaglutinina de virus de influenza, HTLV tax, virus de herpes simple glicoproteína (v.gr., gB, gC, gD, y gE) o antígeno de superficie de hepatitis B, proteína E de virus de hepatitis C o proteína de espiga de coronavirus.

En otra modalidad, RSV es genéticamente manipulado para expresar uno o más antígenos bacterianos (v.gr., una proteína de cubierta bacteriana o antígeno protector asociado con una bacteria) . Ejemplos no limitantes de antígenos bacterianos incluyen antígenos derivados de bacterias de la familia Aquaspirillum, familia Azospirillum, familia Azotobacteraceae, familia Bacteroidaceae, especie Bartonella, familia Bdellovibrio, especies de Campylobacte , especie Chlamydia (v.gr. , Chlamydia pneumoniae) , familia Enterobacteriaceae (v.gr., especies de Citrobacter, familia, Enterobacter aerogenes, especies de Erwinia, Escherichia coli, especies de Hafnia, especies de Klebsiella, especies de Morganella, Proteus vulgaris, Providencia, especies de Salmonella, Serratia marcescens y Shigella flexneri) , familia Gardinella, Haemophilus influenzae, familia Halobacteriaceae, familia Helicobacter, familia Legionallaceae, especies de histeria, familia Methylococcaceae, micobacterias (v.gr., Mycobacterium tuberculosis) , familia Neisseriaceae, familia Oceanospirillum, familia Pasteurellaceae, especies de Pneumococcus, especies de Pseudomonas, familia Rhizobiaceae, familia Spirillum, familia Spiroso aceae, Staphylococcus i (v.gr., Staphylococcus aureus y Staphylococcus pyrogenes resistentes a meticilina) , familia (v.gr., Streptococcus enteritidis, Streptococcus fasciae y Streptococcus pneumoniae) , familia Vampirovibr Helicobacter, familia Yersinia, Bacillus antracis y familia Vampirovibrio. lEn una modalidad especifica, el antígeno bacteriano es suministrado de bacteria que causan o están asociadas con una enfermedad respiratoria, tales como especies de Pneumococcus, Haemophilus influenzae, Streptococcus y Chlamydia pneumoniae. \ En otra modalidad, RSV es genéticamente manipulado para expresar uno o más antígenos de hongos obtenidos o derivados de un hongo patógeno. Ejemplos no limitantes de antígenos de hongos incluyen antígenos derivados de Cryptococcus neoformans; Blastomyces dermatitidis; Aiellomyces dermatitidis; Histoplasma capsulatum; Coccidioides immitis; especies de Candida, que incluyen C albicans, C tropicalis, C parapsilosis, C guilliermondii y C krusei, especies de Aspergillus, que incluyen A. fumigatus, A.flavus y A. niger, especies de Rhizopus; especies de Rhizomucor; especies de Cunninghammella; especies de Apophysomyces, que incluyen A. saksenaea, A. mucor y A. absidia; Sporothrix schenckii , Paracoccidioides brasiliensis; Pseudallescheria boydii, Torulopsis glabrata ; especies de Trichophyton, especies de Microsporum y especies de Dermatophyres . En una modalidad específica, el antígeno de hingo se deriva de un! hongo patógeno que causa o está asociado con una enfermedad respiratoria .

En otra modalidad, RSV es genéticamente manipulado para expresar uno o más antígenos de parásitos. Ejemplos no limitantes de antígenos de parásitos incluyen antígenos derivados de miembros del Phylum Apicomplexa tales como, por ejemplo, Babesia, Toxoplasma, Plas odium, Eimeria, Isospora, Atoxoplasma, Cystoisospora, Hammondia, Besniotia, Sarcocystis, Frenkelia, Haemoproteus, Leucocytozoon, Theileria, Perkinsus y Gregarina sp . ; Pneumocystis carinii; miembros del . Phylum Microspora tales como, por ejemplo, Nosema, Enterocytozoon, Encephalitozoon, Septata, Mrazekia, Amblyospora, Ameson, Glugea, Pleistophora y Microsporidium spp.; y miembros del Phylum Ascetospora tales como, por ejemplo, Haplosporidium spp., así como especies que incluyen Plasmodium falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malaria; Toxoplasma gondii; Leishmania mexicana, L. trópica, L. major, L. aethiopica, L. donovani, Trypanosoma cruzi, T. brucei, Schistosoma mansoni, S. haematobium, S. japonium; Trichinella spiralis; Wuchereria bancrofti; Brugia malayli; Entamoeba histolytica; Enterobius vermiculoarus; Taenia solium, T saginata, Trichomonas vaginalis, T hominis, T tenax; Giardia lamblia; Cryptosporidium parvum; Pneumocytis carinii , Babesia bovis, B. divergens, B. microti, Isospora belli, L hominis; Dientamoeba fragilis; Onchocerca volvulus; Ascaris lumbricoides; Necator americanis; Ancylostoma duodenale; Strongyloides stercoralis; Capillaria philippinensis; Angiostrongylus cantonensis; Hymenolepis nana; Diphyllobothrium latum; Echinococcus granulosus, E. multilocularis; Paragonimus westermani , P. caliensis; Chlonorchis sinensis; Opisthorchis felineas, G. Viverini , Fasciola hepática, Sarcoptes scabiei, Pediculus humanus; Phthirlus pubis; y Dermatobia hominis.

Modalidades Específicas 1. Un método para producir virus de la influenza en cultivo de células a un loglO TCID50/mL de por lo menos aproximadamente 8.0 y/o a un loglO FFU/mL de por lo menos aproximadamente 8.0, que comprende : (a) hacer proliferar células MDCK en un medio de cultivo libre de suero, mientras mantienen una o más condiciones de cultivo seleccionadas del grupo que consiste de: una velocidad de agitación de entre aproximadamente 100 y 200 rpm; un pH de entre aproximadamente 6.0 a aproximadamente 7.8; una temperatura de entre aproximadamente 33°C y aproximadamente 42 °C; y oxígeno disuelto (DO) de entre aproximadamente 35% a aproximadamente 100%; (b) infectar las células MDCK que proliferaron con un virus de la influenza sin intercambiar el medio de cultivo; y (c) incubar las células MDCK que proliferaron infectadas bajo condiciones que permiten replicación del virus de la influenza. 2. El método de la modalidad 1, en donde el medio de cultivo es MediV SFM 110. 3. El método de la modalidad 1 ó 2, en donde el MediV SFM 110 comprende 9 g/L de glucosa. 4. El método de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde las células MDCK proliferan como células adherentes sobre microportadores 5. El método de la modalidad 4, en doride la concentración de microportadores es entre 1 y 3 g/L. 6. El método de la modalidad 4 ó 5, en donde las células MDCK se siembran sobre microportadores a una densidad de entre 10 a 40 células/microportador y proliferan por entre 2 y 5 días. 7. El método de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde la velocidad de agitación es mantenida entre aproximadamente 100 y 200 rpm; el pH es mantenido entre aproximadamente 6.0 y aproximadamente 7.8; la temperatura es mantenida entre aproximadamente 33 °C y aproximadamente 42 °C; y el oxígeno disuelto (DO) es mantenido entre aproximadamente 35% y aproximadamente 100%. 8. El método de cualquiera de las modalidades anteriores, ' en donde las células MDCK proliferan a una velocidad de agitación de entre 150 rpm y 200 rpm. 9. El método de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde las células MDCK proliferan a un pH de entre 7.0 y 7.8. 10. El método de la modalidad 9, en donde el; pH es 7.4 ± 0.2. 11. El método de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde las células MDCK proliferan ;a una temperatura de 37+2 °C. 12. El método de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde las células MDCK son las células depositadas como acceso a ATCC No. PTA-7909 o PTA-7910. 13. El método de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde las células MDCK proliferan a una densidad de células de entre 5xl05 a 3xl06 células/mL. 14. El método de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el paso (b) se lleva a cabo mediante el uso de una entrada viral de entre O.OlxlO3 FFU/mL a O.lxlO3 FFU/mL . 15. El método de la modalidad 14, en donde el paso (b) se lleva a cabo mediante el uso de una entrada viral de entre O.OlxlO3 FFU/mL a 0.05 FFU/mL. 16. El método de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el paso (b) se lleva a cabo mediante el uso de una entrada viral de entre 0.00001 FFU/célula y; 0.0001 FFU/célula. 17. El método de la modalidad 16, en donde él paso (b) se lleva a cabo mediante el uso de una entrada viral de entre 0.00001 FFU/célula y 0.00005 FFU/célula. \ 18. El método de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde los virus de la influenza son adaptados al frío. : 19. El método de la modalidad 18, en donde los virus de la influenza son también atenuados y sensibles, a la temperatura. [ 20. El método de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el virus de la influenza es un virus de la influenza A. 21. El método de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el virus de la influenza es un virus de la influenza B. 22. El método de la modalidad 20, en donde el virus de la influenza A comprende uno o más segmentos de gen de cepa de influenza ca A/Ann Arbor/6/60. 23. El método de cualquiera de la modalidad ,21, en donde el virus de la influenza B comprende uno o más segmentos de gen de cepa de influenza ca B/ Ann Arbor/l/66. 24. El método de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde las células MDCK son incubadas a entre 30°C y 35°C durante la replicación del virus de la influenza en el paso (c) . 25. El método de la modalidad 24, en donde las células MDCK son incubadas a 33+2 °C durante la replicación del virus de la influenza en el paso (c) . 26. El método de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde las células MDCK son incubadas a una velocidad de agitación de entre 150 rpm y 200 rpm durante la replicación del virus de la influenza en el paso (c) . 27. El método de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde las células MDCK son incubadas a un pH de entre aproximadamente 7.0 y aproximadamente 7.8 durante la replicación del virus de la influenza en el paso (c) . 28. El método de la modalidad 27, en donde el pH es 7.4 ± 0.2. 29. El método de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde una proteasa está presente durante el paso (c) . 30. El método de la modalidad 29, en donde la proteasa es una serina proteasa. 31. El método de la modalidad 29 ó 30, en donde la proteasa es una proteasa libre animal, recombinante . 32. El método de la modalidad 31, en donde la proteasa está presente a una concentración final de 0.03X. 33. El método de cualquiera de las modalidades anteriores, que comprende además el paso de cosechar el medio de cultivo después de la infección. 34. El método de la modalidad 33, en donde el medio de cultivo es cosechado entre 48, horas y 72 horas después de la infección. 35. Un método para efectuar transferencia esfera a esfera de células en un cultivo de células que crece1 sobre microportadores que comprende: (a) un primer paso de lavado en el cual todo o una porción del medio de crecimiento es reemplazado por un medio de lavado que comprende un agente quelatador; ¡ (b) incubación del cultivo de células en el medio de lavado con o sin agitación; (c) adición de una proteasa al cultivo de células en el medio de lavado; (d) incubación del cultivo de células con la proteasa con o sin agitación; y (e) transferencia a un nuevo recipiente de crecimiento . 36. El método de la modalidad 35, que comprende además un segundo paso de lavado entre los pasos (b) y (c) con un medio de lavado que comprende un agente quelatador. 37. El método de la modalidad 35 ó 36, en donde medio de crecimiento fresco y/o microportadores adicionales se añaden después del paso (d) . 38. El método de cualquiera de las modalidades 35 a 37, en donde el medio de crecimiento fresco y/o microportadores adicionales se añaden antes de, durante, o después del paso (e) . 39. El método de cualquiera de las modalidades 35 a 38, en donde la concentración del agente quelatador es entre 0.4 mM y O.6 mM. 40. El método de cualquiera de las modalidades 35 a 39, en donde el pH del medio de lavado es entre 7.8 y 8.2. 41. El método de la modalidad de cualquiera de las modalidades 35 a 40, en donde la proteasa es una proteasa libre animal recombinante . 42. El método de la modalidad 41, en donde la proteasa se añade a una concentración final de entre 0.04X y 0.06X. 43. El método de cualquiera de las modalidades 35 a 42, en donde el cultivo de células se agita durante el paso (b) . 44. El método de cualquiera de las modalidades 35 a 43, en donde el cultivo de células se agita durante el paso (d) . 45. El método de la modalidad 43 ó 44, en donde el cultivo de células se agita a entre 175 rpm y 275 rpm. 46. El método de la modalidad 45, en donde el cultivo de células se agita a 230 ± 25 rpm. 47. El método de cualquiera de las modalidades 35 a 46, en donde el cultivo de células se incuba en los pasos (b) y (d) por entre 15 y 60 minutos. 48. El método de cualquiera de las modalidades 35 a 47, en donde un inhibidor de proteasa se añade después del paso (d) . 49. Un método para efectuar transferencia esfera a esfera de células en un cultivo de células que crece sobre microportadores que comprende : (a) añadir un agente quelatador al cultivo de células sin lavar las células; (b) incubar el cultivo de células en presencia del agente quelatador con o sin agitación; (c) añadir una proteasa al cultivo de células en presencia del agente quelatador; (d) incubar el cultivo de células con la proteasa con o sin agitación; y (e) añadir medio fresco adicional y suplementar el cultivo de células con uno o más componentes del medio. 50. El método de la modalidad 49, en donde uno o más componentes del medio se seleccionan del grupo que consiste de CaCl2, MgCl2, MgS04 , elementos traza A, elementos traza B, y elementos traza C. 51. El método de la modalidad 49 ó 50, en donde uno o más componentes del medio son entre 1.25 mM a 1.5 · mM de CaC12, entre 0.1 mM a 0.2 mM de MgC12, y entre 0.1 a 0.8 mM de MgS04 , 2X elementos traza A, 2X elementos traza B, y 2X elementos traza C. ! 52. El método de cualquiera de las modalidades 49 a 51, en donde el cultivo de células es transferido a un nuevo recipiente de crecimiento antes de, durante, o después del paso (e) . 53. El método de cualquiera de las modalidades 49 a 52, en donde la concentración del agente quelatador es entre 0.5 mM y 5 mM . 54. El método de la modalidad 53, en donde la concentración del agente quelatador es aproximadamente 2 mM. 55. El método de cualquiera de las modalidades 49 a 54, en donde el pH del cultivo de células se ajusta según sea necesario para estar entre 7.8 y 8.2 antes de o durante el paso (c) . 56. El método de la modalidad de cualquiera de las modalidades 49 a 55, en donde la proteasa es una proteasa libre animál recombinante . 57. El método de cualquiera de las modalidades 49 a 56, en donde la proteasa se añade a una concentración final de entre 0.04X y 0.06X. 58. El método de cualquiera de las modalidades 49 a 57, en donde el cultivo de células se agita durante el paso (b) . 59. El método de cualquiera de las modalidades 49 a 58, en donde el cultivo de células se agita durante el paso (d) . : 60. El método de la modalidad 58 ó 59, en donde el cultivo de células se agita a entre 175 rpm y 275 rpm. 61. El método de cualquiera de las modalidades 49 a 60, en donde el cultivo de células se incuba en los pasos (b) y (d) por entre 15 y 90 minutos. 62. El método de cualquiera de las modalidades 49 a 61, en donde un inhibidor de proteasa se añade después del paso (d) . 63. Un método de purificación de virus de la influenza del cultivo de células que comprende: (a) clarificación de , una cosecha viral por filtración de flujo directo (DFF) a través de por lo menos una membrana que tiene un tamaño de poro de entre aproximadamente 1.2 mieras y aproximadamente 0.45 mieras; (b) concentración por ultrafiltración de ; flujo tangencial (UF) e intercambio de regulador de pH por diafiltración (DF) después del paso (a) mediante el uso de una membrana que tiene corte de peso molecular (MWCO) de 500 kDa; (c) purificación por cromatografía de afinidad en columna después del paso (b) ; (d) concentración por UF y/o intercambio de regulador de pH por DF después del paso (c) mediante el ; uso de una membrana que tiene corte de peso molecular (MWCO) de 500 kDa; y ; (e) esterilización después del paso (d) por; DFF a través de por lo menos una membrana que tiene un tamaño de poro de entre aproximadamente 0.45 mieras y aproximadamente 0.22 "mieras, en donde la recuperación global de; virus purificado es por lo menos 30%, y en donde los; virus I purificados comprenden menos de 0.1 ng de HCD, y menos | de 0.3 yg HCP por 7.0±0.5 loglOFFU de virus. \ 64. El método de la modalidad 63, en donde sacarosa y un regulador de pH de fosfato se añaden a la cosecha viral a una concentración final, dentro de 10% variación, de 218 mM de sacarosa, 11 mM de regulador de pH de fosfato pH 7.0-7.4, antes del paso (a) . 65. El método de la modalidad 63 ó 64, en donde los pasos (a) y (b) son acoplados. 66. El método de cualquiera de las modalidades 63 a 65, en donde el paso (b) se realiza a una presión de transmembrana (TMP) de entre aproximadamente 0.7 kg/cm2 a aproximadamente 1.50 kg/cm2. 67. El método de cualquiera de las modalidades 63 a 66, en donde el paso (b) se realiza a una velocidad de reflujo de entre aproximadamente 35 litros por metro por hora (LMH) a aproximadamente 50 LMH. 68. El método de cualquiera de las modalidades 63 a 67, en donde el paso (b) se realiza a una velocidad de esfuerzo cortante de entre aproximadamente 12,000 s"1 a aproximadamente 16,000 s"1. 69. El método de cualquiera de las modalidades 63 a 68, en donde el paso (b) da por resultado una concentración de 5X y por lo menos 5 diavolúmenes de regulador de pH son intercambiados. 70. El método de cualquiera de las modalidades 63 a 69, en donde el regulador de pH de intercambio en el paso (b) comprende, dentro de 10% variación, 218 mM de sacarosa, 11 mM de regulador de pH de fosfato pH 7.0-7.4. 71. El método de cualquiera de las modalidades 63 a 70, en donde el regulador de pH intercambiado por DF ocurre en el paso (d) . 72. El método de cualquiera de las modalidades 63 a 70, en donde la concentración por UF e intercambio de regulador de pH por DF ocurre en el paso (d) . 73. El método de cualquiera de las modalidades 63 a 70 o 72 en donde el paso (d) da por resultado por lo menos una concentración de 2X. 74. El método de cualquiera de las modalidades 63 a 73, en donde por lo menos 8 diavolúmenes de regulador de pH son intercambiados en el paso (d) . 75. El método de cualquiera de las modalidades 63 a 74, en donde el regulador de pH de intercambio en el paso (d) comprende, dentro de 10% de variación, 200 mM de sacarosa, 100 mM de regulador de pH de fosfato pH 7.0-7.4. 76. El método de cualquiera de las modalidades 63 a 75, en donde entre 8.0 logio FFU y 11 logio FFU de virus de la influenza son cargadas por mL de medio de afinidad. 77. El método de la modalidad 76, en donde entre 9.0 logio FFU y 10.0 log10 FFU de virus de la influenza son cargadas por mL de medio de afinidad. 78. El método de la modalidad 76, en donde entre 9.2 lo io F U y 9.8 logi0 FFU de virus de la influenza son cargadas por mL de medio de afinidad. 79. El método de cualquiera de las modalidades 63 a 78, en donde después de que los virus son cargados, el medio de afinidad es lavado con a regulador de pH que comprende, dentro de 10% de variación, 218 mM de sacarosa, 11 : mM de regulador de pH de fosfato pH 7.0-7.4. 80. El método de cualquiera de las modalidades 63 a 79, en donde el paso (c) además incorpora exposición a un regulador de pH que comprende una endonucleasa no específica. 81. El método de la modalidad 80, en donde la longitud de exposición al regulador de pH que comprende la nucleasa no específica es entre 30 y 90 minutos. 82. El método de la modalidad 81, en donde la longitud de exposición al regulador de pH que comprende la endonucleasa no específica es 50 ± 10 minutos. 83. El método de cualquiera de las modalidades 80 a 82, en donde la endonucleasa no específica es Benzonase™. 84. El método de cualquiera de las modalidades 80 a 83, en donde el regulador de pH que comprende la endonucleasa no específica, comprende, dentro de 10% de variación, 218 mM de sacarosa, 11 mM de regulador de pH de fosfato pH 7.0-7.4, y la endonucleasa no específica a una concentración final de entre 40 U/mL y 60 U/mL. 85. El método de cualquiera de las modalidades 80 a 84, en donde después del tratamiento con el regulador de pH que comprende la endonucleasa no específica, el medio de afinidad es lavado con un regulador de pH que comprende, dentro de 10% de variación, 218 mM de sacarosa, 11 mM de regulador de pH de fosfato pH 7.0-7.4. 86. El método de cualquiera de las modalidades 80 a 85, en donde los virus purificados comprenden menos de 0.0050 ng de endonucleasa no específica por 7.0 ± 0.5 loglO FFU de virus . 87. El método de cualquiera de las modalidades 63 a 86, en donde el medio de afinidad se selecciona del grupo que consiste de Sulfato de Cellufine™ y FluSelect™. 88. El método de cualquiera de las modalidades 63 a 87, en donde los virus de la influenza son eluidos del medio de afinidad con un regulador de pH que comprende, dentro de 10% de variación, 1 M de cloruro de sodio, 218 mM de sacarosa, y 11 mM de regulador de pH de fosfato pH 7.0-7.4. 89. Virus de la influenza producido por el método de cualquiera de las modalidades 1 a 34, o 63 a 88. 90. Virus purificado de la influenza que comprende menos de 0.1 ng de HCD, y menos de 0.3 g HCP por 7.0±0.5 loglO FFU de virus, en donde los virus de la influenza fueron purificados a partir de un cultivo de células de mamífero. 91. El virus de la influenza purificado de la modalidad 90, en donde las células de mamífero se seleccionan del grupo que consiste de células de fibroblastos de pulmón diploides humanas, células de retinoblastoma humano, células de riñon humano, células de pulmón de mono rhesus fetal, células de riñon de mono verde africano y células de riñon de canino . 92. El virus de la influenza purificado de la modalidad 90, en donde las células de mamífero son células MDCK. 93. El virus de la influenza purificado de la modalidad 90, en donde las células de mamífero son cultivadas en un cultivo de células VERO. 94. Una composición inmunogénica que comprende polipéptidos del virus de la influenza de cualquiera de las modalidades 89 a 93.

Ej emplos La invención se describe ahora con referencia a los siguientes ejemplos. Estos ejemplos se proveen para el propósito de ilustración únicamente y la invención de ninguna manera debe considerarse como limitada a estos ejemplos, sino más bien debe considerarse que abarca cualquiera y todas las variaciones que se hacen evidentes como resultado de las enseñanzas que aquí se proveen. Desde luego, se apreciará que el listado específico o descripción de equipo y reactivo particulares usados, tamaños, fabricante, etc., no debe considerarse limitante sobre la invención actual, a menos que se establezca específicamente que así es. Además, se apreciará que otro equipo y reactivos que tienen desempeño similar pueden ser fácilmente sustituidos.

Medio y Procesos de Cultivo de Células Se han descrito formulaciones de medio libre de suero (v.gr., MediV SFM 107, MediV SFM 105) útiles para la proliferación de células MDCK, en particular células MDCK no tumorigénicas , a densidad alta (véase, v.gr., FL410US y G-FL414US) . Sin embargo, el trabajo mediante el uso de estas formulaciones de medio libre de suero con células MDCK no tumorigénicas adaptadas a medio libre de suero (v.gr., acceso a ATCC No. PTA-7909 o PTA-7910) reveló que, aunque los títulos virales picos razonables (generalmente medidos como; loglO FFU/mL) de virus rearreglados de la influenza se podrían obtener sin intercambio de medio, los títulos pico fueron aún más bajos que aquellos obtenidos con intercambio de medio, en el cual una porción (v.gr., -67%) del medio de crecimiento es removido y reemplazado por un medio de infección después de la proliferación de las células y antes de (o al mismo : tiempo que) la infección. Además, se requirió proteasa (TrypLE) adicional para obtener estos títulos pico. Para superar la necesidad de intercambio de medio y/o el requerimiento de adición de proteasa, se desarrolló un medio fortificado, MediV SFM 110. MediV SFM 110 comprende 5x la concentración de las vitaminas, ácido linoleico, ácido lipoico, nucleósidos, putrescina y casi todos los aminoácidos presentes n los medios previamente descritos (véase Tabla 3) . El uso de MediV SFM 110 no mejoró las densidades de células sobre aquellas obtenidas con MediV SFM 105+TE (no se muestran datos) . Sin embargo, mediante el uso de MediV SFM 110, 0% y 67% de intercambio de medio mostró títulos virales similares. .

El rendimiento de doce operaciones mediante el uso de un proceso sin intercambio de medio (MX) y células preparadas por transferencia esfera a esfera (véase el ejemplo provisto en la sección 8.2 siguiente) de cuatro reactores de siembra y que crecieron en medio MediV SFM 110 se describen más adelante. Tres virus rearreglados de las cepas de influenza adaptados al frío (ca) , sensibles a la temperatura (ts), atenuados (atfc) que comprenden la HA y NA de las cepas A/Uruguay/716/2007, A/South Dakota/6/2007 , y B/Florida/4/2006 de tipo silvestre (referidas por la designación de cepa de tipo silvestre precedidas por el identificador " ca") fueron producidas a escala de 2L y todas las tres cepas produjeron virus a un título de por lo menos 8.4 loglO FFU/mL. El desprendimiento apropiado de células en los reactores de siembra y unión de células en los reactores de producción final (FPRs) se observaron después de la transferencia esfera a esfera mediante el uso de lavado con lx DPBS y tripsinización mediante el uso de TrypLE Select y EDTA a pH8.0. Bajo la infección, estas células se muestrearon periódicamente para determinar el tiempo de cosecha óptimo. Se encontró que los títulos de virus pico se observaron a 3 días después de la infección (dpi) para todos los tipos de virus.

Cuatro operaciones para cada una de estas cepas se realizaron para verificar la capacidad de reproducción de los resultados y los datos estuvieron en línea unos con otros, ca A/Uruguay/ 716/2007 produjo el título más alto a 8.7 + 0.05 logio FFU/mL a 3 días después de la infección (dpi) , mientras que los títulos pico para ca A/South Dakota/6/2007 y ca B/Florida/4/2006 fueron 8.8 ± 0.0 log10 FFU/mL y 8.45 ± 0.25 logio FFU/mL respectivamente a 3dpi .

La capacidad de reproducción de los datos de estas operaciones indica que el proceso sin intercambio de medio es un proceso robusto. Por lo tanto, los medios fortificados mantuvieron la productividad sin intercambio o sin añadir medio o componentes. Por consiguiente, el desarrollo y uso del medio fortificado ha superado uno de los problemas operacionales más desafiantes en la producción de vacuna basada en cultivo de células contra la influenza, el requerimiento de intercambio de medio/suplementación.

Materiales y Métodos Materiales, Reactivos y Equipo: Oros materiales, equipo y reactivos que se desempeñan de manera similar pueden ser fácilmente sustituidos. 1. medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMÉM) /Ham F12 (Gibco, Grand Island, NY, Cat No. ME080012) 2. Agua MilliQ o WFI 3. Polvo de base MediV SFM 110 (Gibco, Grand Island, Y, Cat No. ME080045) 4. Glucosa (Invitrogen, Carlsbad, California, Cat No. 15023-021) 5. Selenita de sodio (Sigma, St . Louis, MO, Cat No. 6607-31)? i 6. L-Glutamina (Gibco, Grand Island, NY, Cat No. 25030-081) 7. Lípidos CD (100X) (Gibco, Grand Island, NY, Cat No. 11905-031) 1 8. Peptona de trigo (Organotechnie , SAS, La Courneuve, France, Cat No. 19559) 9. Insulina (Serological , Norcross, GA, Cat No. 4506) ; 10. T3 (Sigma, St . Louis, MO, Cat No. T5516) : 11. Hidrocortisona (Mallinckrodt , Phillipsburg, NY, Cat No. 8830 (-05) ) 12. Prostaglandina El (Sigma, St . Louis, MO, Cat No. P7527) ¡ 13. EGF (Sigma, St . Louis, MO, Cat No. E9644) ¡ 14. Citrato férrico de amonio (J T . Baker, Phillipsburg, NJ, Cat No. 1980-01) ; 15. Tropolona (Sigma, St . Louis, MO, Cat No. T89702-5G) : 16. Elemento traza A (Cellgro/Mediatech, Maiiassas, VA, Cat No. 99-182-cl) 17. Elemento traza B (Cellgro/Mediatech, Manassas, VA, Cat No. 99- 175 -el) 18. Elemento traza C (Cellgro/Mediatech, Manassas, VA, Cat No. 99-176-cl) 19. Biocarbonato de sodio (Invitrogen, Carlsbad, California, Cat. No. 91425/87-5067) 20. Regulador de pH de solución salina fosfatada de Dulbecco (DPBS) pH-7.4 (Invitrogen, Carlsbad, California, Cat No. 14190-367) 21. Bolsa de solución de EDTA - DPBS (Gibco Cat No. 14190-367) 22. 0.5M EDTA pH8 (Gibco, Grand Island, NY, Cat No. 15575-038) 23. Filtro de copa estéril de 0.2 ym (Millipore, Bedford, MA, Cat No. SCGPU05RE) 24. TrypLE Select (Gibco, Grand Island, NY, Cat No. 12563) 25. Inhibidor de haba (Worthington, Lakewood, NJ, Cat No. LS002829) 26. Cytodex 3 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, Cat No. 17-0485-03) 27. Fosfato de sacarosa (Hyclone, Logan, UT, Cat No. SH3A1578-01) 28. Bolsa estéril de 10-20L (SAFC Biosciences JRH, Lenexa, Kansas, 1329B) 29. Botellas rodantes (Corning, Corning, NY, Cat No. 3907) 30. NaOH 1M solución (EMD, Darmstadt, Alemania, Cat No. 1071) 31. Filtro estéril de 0.2 µp? (Corning, Corning, NY, Cat No. 430320, 430767) 32. Pipetas de 1 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL (V R, Brisbane, CA, Cat. Nos. 53284-700, 53283-704, 708,710, respectivamente) 33. Pipetas aspiradoras de 5 mL (VWR, Brisbane, CA, Cat NO. 53392-044) 34. Tubos de Eppendorf de 1.8 mL (USA Scientific, Ocala FL, Cat No. 1415-5510) 35. Puntas de micropipeta (Art Molecular Bioproducts, San Diego CA, Cat No. 20E, 200E and 1000E) ¦ 36. Fosfato de sacarosa, lOx (Hyclone, Logan, UT, Cat# SH3A1578-01) 37. Applikon Controller Units (Applikon Biotechnology, Foster City, CA Modelos: ADI 1010, ADI 1025) 38. Recipiente de vidrio de 3L y placa superior (Biotechnology, Foster City, CA) 39. Impulsores A310 de 6.35 cm (Lightnin, Rochester, NY) 40. Impulsor marino de 60 mm (Applikon Biotechnology, Foster City, CA) . 41. Impulsores marinos de 45 mm (Applikon Biotechnology, Foster City, CA) . 42. Bomba peristáltica ( atson Marlow Bredel Pump, ilmington, MA, Modelo 520S/R) 43. Gabinete de bioseguridad (The Baker Company, Sanford, ME, SG-600) 44. Incubador de botella rodante (Bélico Biotechnology, Vineland, NJ, Modelo 7630-80589) 45. Baño de agua (Boekel Grant, West Chester, PA, PB-1400) 46. Nucleocontador (New Brunswick Scientific, Edison, NJ, M 1293 -0000) 47. Bioperfil 400 (Nova Biomedical, Waltham, MA, Bioprofile 400) 48. Microscopio (Zeiss, Thornwood, NY, Axiovert 25) 49. Cámara digital (Nikon, Melville, NY, Modelo E5400) 50. Micropipeta (Labsystem, Boston, MA, Modelo No. P2-20, P100, P200, P1000) 51. Auxiliar de pipeta (Drummond, Broomall, PÁ, Cat . No. 4-000- 100) 52. Incubador de matraz de agitación de C02 (ATR Biotech, Laurel, MD, Modelo AJI 18) Fuente de células: Clon ID 9B9-1E4 de células MDCK libre de suero (número de acceso a ATCC PTA-7910, véase WO 08/105931) derivadas del Process Development Bank (Banco de Desarrollo de Procesos) (PDB) se cultivaron en botellas rodantes, mediante el uso de MediV SFM 105 con elementos traza A, B y C o MediV SFM 1094. La composición de MediV SFM 105 con elementos traza A, B y C es similar al medio MediV SFM 109, con la excepción de que MediV SFM 105 está hecho de líquido y MediV SFM 109 está hecho de polvo. Las células se hicieron pasar rutinariamente cada 3 a 4 días después de la siembra por SOP D02005, con la excepción de que no se realizó el lavado de 2x DPBS.

Semilla de virus: Este proceso se desarrolló con las cepas estacionales 2008/2009 FluMist®: ca A/Uruguay/716/2007 (Lote # nb3903pg94, 141900675A) , ca A/South ca Dakota/6/2007 (Lote # 141900666) , y ca B/Florida/4/2006 (141900641A) . Todas estas semillas se produjeron en huevos. Se han obtenido resultados similares para virus de siembra producidos en cultivos de células mediante el uso de métodos de rescate de plásmido (véase, por ejemplo, ang y Duke; 23 de octubre de 2007, J. Virol, 4:102; Hoffmann, et al, 2000, ' PNAS, 97 (11) : 6108-13 ; y Hoffmann, et al, 2002, PNAS, 99(17): 11411-6) Medio de cultivo: Para estas operaciones MediV SFM 105 con IX elementos traza A, B y C y un total de 4.5g/L de D-glucosa o MediV SFM 109 con un total de 4.5 ó 9.0 g/L de D-glucosa se usaron en todas las pasadas de células de rutina para operaciones en botellas rodantes y reactores de siembra (SRs) , respectivamente. Medio MediV SFM110 con un total de 9.0g/L de D-glucosa se usó para operaciones en reactores de producción final (FPRs) . Según las condiciones de siembra, la concentración anticipada de D-glucos se ajusta entre aproximadamente 4.5 y aproximadamente 9.0g/L. La composición I de cada medio de cultivo se detalla en la tabla 3. i Tabla 3 Formulaciones de Medio MediV SFM MediV SFM 105 + MediV SFM MediV SFM TEd 109 ; 110 Componente mg/L mg/L , mg/L Sales ~ J ' - Cloruro de calcio, anhidro 116.6 116.6 116.6 Cloruro de magnesio 28.64 28.64 [ 28.64 Sulfato de magnesio, anhidro 48.84 48.84 ! 48.84 Cloruro de potasio 311.8 311.8 311.8 Cloruro de sodioc 6999.5 6999.5 : 3500 Fosfato de sodio, monobásico, 62.5 62.5 62.5 monohidratado Fosfato de sodio, dibásico, anhidro 71.02 71.02 71.02 Metales traza NH4V03 0.00065 0.00065 1 0.00065 AgN03 0.00017 0.00017 ¦ 0.00017 Cloruro de aluminio 6H20 0.0012 0.0012 ! 0.0012 Ba (C2H302) 2 0.00255 0.00255 0.00255 Cloruro de cadmio (CdCl2) 0.00228 0.00228 0.00228 Cloruro de cromo (CrCl3, 0.00032 0.00032 ; 0.00032 anhidro) Cloruro de cobalto 6H20 0.00238 0.00238 : 0.00238 Sulfato cúprico, petahidratado 0.0029 0.0029 I 0.0029 Citrato férrico 1.1551 1.1551 1.1551 Nitrato férrico, nonahidratado 0.05 0.05 ; 0.05 Citrato férrico de amonio 0.2 0.2 0.2 (FAC) Sulfato ferroso, 0.417 0.417 heptahidratado i 0.417 Ge02 0.00053 0.00053 ¡ 0.00053 MnS04 H20 0.00017 0.00017 : o . oo o i7 Sal de amonio de ácido 0.00124 0.00124 0.00124 molíbdico Sulfato niqueloso (NiS04 6H20) 0.00013 0.00013 I 0.00013 Componentes no encontrados en DMEM/F12 se muestran en cursivas . bComponentes encontrados en DMEM/F12 y fortificados en MediV SFM 110 cConcentración reducida en MediV SFM 110 para mantener osmolalidad Elementos traza A, B, y C sGlucosa está presente a una concentración final de por lo menos 4.5 g/L y puede ser suplementada hasta una concentración 1 de aproximadamente 9.0 g/L.

Tabla 4 Soluciones 1000X de Elementos Traza A, B y C Solución de elementos traza ? Solución de elementos traza C Componentes mg/L Componentes mg/L CuS04 (5H20 1.60 A1C13 (6H20 1 20 ZnS04 (7H20 863.00 AgN03 0 17 Selenita (2Na 17.30 Ba (C2H302) 2 2 55 Citrato férico .1155.10 KBr 0 12 CdC12 2 28 Solución de elementos traza B CoCl2«6H20 2 38 Componentes mg/L CrCl3 (anhidro) 0 32 MnS04«H20 0.17 NaF 4 20 Na2Si03«9H20 140.00 Ge02 0 53 NH4VO3 0.65 Kl 0 17 NÍS04»6H20 0.13 RbCl 1 21 SnCl2 (anhidro) 0.12 ZrOCl2«8H20 3 22 Sal de amonio de 1.24 ácido molíbdico Tabla 5 Solución 100X de Lípidos Químicamente Definidos (CDCL) Componente FW mg/L Acido araquidónico 304.5 2 Colesterol 387 220 Acetato de DL-a-tocoferol 473 70 Acido linoleico 280 10 Acido linolénico 278.43 10 Acido mirístico 228.37 10 Acido oleico 282.46 10 Acido palmítico 256.42 10 Acido palmitoleico 254.41 10 Pluronic F68 100000 Acido esteárico 284.48 10 Tween 80 2200 Condiciones y métodos de biorreactor: Para todos los experimentos, los FPRs fueron inoculados mediante el uso de contenidos divididos 1:8 del reactor de siembra (SR) e infectados con rearreglos de los virus estacionales 2008/2009, ca A/Uruguay, ca A/South Dakota y ca B/Florida. Varios FPRs se operaron en condiciones idénticas para asegurar robustez del proceso y capturar variabilidad. Los primeros; tres experimentos se realizaron para comparar los procesos de intercambio de medio (MX) y sin intercambio de medio (No-MX) lado a lado mediante el uso de un virus 2008/2009 para cada experimento. Para cada uno de los primeros tres experimentos, 2 x 2L FPRs se operaron en replicas en condiciones idénticas, en donde no se realizó intercambio de medio en el tiempo de infección y los factores fueron infectados con las mismas cepas de virus para capturar variabilidad de proceso. ¡Por lo tanto, un total de biorreactores de 6 x 2 L se inocularon con contenido de cultivo de células de división 1:8 de SRs y se infectaron con las tres cepas de virus estacional 2008/2009 con proceso sin intercambio de medio. ! Los últimos dos experimentos se realizaron para generar más datos para el rendimiento de proceso sin intercambio de medio para las cepas 08/09. Para el ¡cuarto experimento, 3 x 2L FPRs fueron inoculados con 1 x 2L SR y fueron infectados con los tres tipos rearreglos de. virus estacionales. El experimento 5 fue una réplica del experimento 4 mediante el uso de condiciones idénticas. El experimento se repitió a fin de capturar la variabilidad del proceso de captura para evaluar el rendimiento del proceso sin intercambio de medio.

La cepa de virus usada para infección y la fuente de células usada para inocular FPRs en el experimento se describen en la tabla 6.

Tabla 6 Cepa de Virus y Fuente de Células Usadas en Infección de Reactores de Producción Final (FPRs) Experimento Fuente de FPRs Virus de células infección , (SRs) FPR1.1.1 ca A/Uruguay Experimento 1 SR1 FPR1.1.2 ca A/Uruguay FPR2.2.1 ca A/South Dakpta Experimento 2 SR2 FPR2 ca A/South Dakpta Experimento 3 FPR3 ca B/Florida FPR3 ca B/Floridá FPR4 ca A/Uruguay Experimento 4 SR3 FPR4 ca A/South Dakpta FPR4 ca B/Florida FPR5 ca A/Uruguay Experimento 5 SR4 FPR5 ca A/South Dakpta FPR5 ca B/Florida Reactores de siembra (SRs) : para todos los experimentos, las células se hicieron crecer en biorreactores de siembra ya sea a escala de 2 L o 5 L mediante el uso de 2 g/L de microportadores Cytodex 3 en un medio MediV SFM 105 que contenía elementos traza A, B y C (MediV SFM 105 + TE) p medio MediV SFM 109. La composición de MediV SFM 105 con elementos traza A, B y C es casi idéntica al medio MediV SFM 109, \ con la excepción de que MediV SFM 105 está hecho de líquido y MediV SFM 109 está hecho de polvo y contiene menos selenita de sodio. Las concentraciones de glucosa y glutamina fueron 9.0 g/L and 4mM respectivamente. Los recipientes se inocularon con 1.35 x 105 células/mililitro para experimentos 1 a 3 y 1.8 x 105 células/mililitro para los experimentos 4 y 5. El oxígeno disuelto (D. 0.) en SRs se mantuvo al 50% mediante el uso de una combinación de oxígeno puro y N2 a un flujo, total constante de 0.02 wm. El control de pH fue de dos lados mediante el uso de C02 y NaOH 1N para todos los SRs. El volumen de trabajo para SRs para el experimento 1 y el experimento 2 fueron 2 litros y 5 litros respectivamente. Ambos fueron equipados con un impulsor de marina y se agitaron a 175 RPM. Los SRs de volumen de trabajo para los experimentos 3 y 4 fueron de 2 litros. Ambos fueron equipados con 2 impulsores Lightnin y se agitaron a 175 RPM. El impacto del impulsor y el volumen de trabajo sobre el crecimiento y metabolismo celulares no son tomados en cuenta para el alcance del estudio. Para los primeros tres experimentos, los SRs fueron inoculados con 22.5 células/MC. A fin de lograr un mejor crecimiento de células, los SRs para el experimento 4 y 5 fueron inoculados a 30 células/MC. El diseño experimental que describe cada FPR con su SR respectivo se presenta en la tabla 6 y las condiciones de proceso se describen en la tabla 7 para cada SRS. Después de 4 días de la siembra, el agitador, flujo de gas y D.O. y los controles de temperatura de SRs se apagaron para permitir que los microportadores se sedimentaran y las células fueran lavadas y tripsinizadas con la mitad del volumen de trabajo del biorreactor con adición de lOx TrypLE y pH8 esencialmente como se detalla más adelante en el ejemplo provisto en la sección 8.2, más adelante. Los contenidos de SRs fueron tripsinizados mediante el uso de protocolo de transferencia B2B como se especifica en la tabla 8.

Reactores de producción final (FPRs) : Los contenidos de reactores de siembra fueron bombeados después a botellas de alimentación y 125 mL de este inoculo de células se usaron para inocular FPRs a la división de 1:8. Las células en los FPRs se hicieron crecer en medio MediV SFM 110 que contenía 9.0 g/L de concentración de glucosa. Recipientes de vidrio de FPR de 2 L fueron equipados con dos impulsores lightnin y se agitaron a 175 RP . El D. O. se controlo a 50% de saturación de aire controlado con estrategia de flujo total a 0.02 wm, en donde el flujo total constante de 40 mL/min se mantuvo en donde el suministro de N2 gaseoso se calculó a partir de 02 y C02 gaseosos (N2=40-O2-CO2) . El control de pH fue de dos lados mediante el uso de C02 y NaOH 1N para todos los FPRs. La temperatura durante la fase de crecimiento e infección fue controlada a 37°C y 33 °C respectivamente. La cepa de virus para FPRs se lista en la tabla 6 y las condiciones del proceso durante la fase de crecimiento en infección para FPRs se lista en la tabla 9.

Tabla 7 Condiciones de Proceso del Reactor de Siembra (SR) Puntos de fijación de parámetro Calidad controlada SR1 SR2 SR3 SR4 Glucosa (g/L) 9.0 9.0 9.0 9.0 Células iniciales/microportadores 22.5 22.5 30 ' 30 (?) Volumen de trabajo final (L) 2 5 2 2 Concentración de microportador 1 z (MC) (g/L) 2 2 2 Oxígeno disuelto 50 50 50 : 50 PH 7.4 7.4 7.4 1 7.4 Temperatura de crecimiento (°C) 37 37 37 1 37 Cantidad/tipo de impulsor 1/marino 1/marino 2/lightnin , 2/lightnin Agitación (RPM) 175 Con NaOH 1N y Con NaOH 1N y Control de pH Con NaOH 1N y ' Con NaOH C02 C02 C02 1N y C02 Flujo total (constante en toda la operación) 40 40 40 40 (mL/min) SFM105 con Medio usado elementos SFM109 SFM109 SFM109 traza A, B C Tabla 8 Condiciones de Tripsinizacion Mediante el Uso de Protocolo de Esfera a Esfera Pasos Especificaciones y puntos de fijación Valores Dnidade 1. Remover medio 80 % 2. Añadir 0.5 mM de solución de lavado ADTA/DPBS al volumen de 80 '% tratamiento original 3. Iniciar agitación al valor original 15 ± 5 'min 4. Detener la agitación para permitir disminuir MCs 15 + 5 ¡min 5. Remover medio y DBPS 80 6. Añadir 0.5 mM de solución de lavado ADTA/DPBS a la mitad del 50 % volumen de tratamiento original 7. Fijar la velocidad del agitador 250 ;RPM 8. Iniciar los controles de DO y temperatura a los fijados 50, 37 :%, °c originalmente 9. Ajustar la fijación de pH en el controlador 8.0 'pH 10. Añadir lOx TrypLE Select (X de volumen restante) 0.05 :x 11. Tiempo de tripsinizacion 50 ± 10 !min Tabla 9 Condiciones de Proceso de Reactor de Producción Final (FPR) contenido de células es concentrado 2X durant el proceso de transferencia de esfera a , esfera;. Por consiguiente, 125 mL después de esfera a esfera es equivalente a 250 mL antes ed esfera a esfera.

Procesos analíticos: Se realizó el muestreo diario de los recipientes. Las células se contaron mediante el uso de un contador Nucleocounter, y se tomaron fotografías mediante el uso de un microscopio a amplificación de lOx para examinar la morfología de las células. El pH, p02 , pC02 y concentraciones de glucosa, lactato, glutamina y amoniaco se monitorearon diariamente mediante el uso de Nova Bioprofile 400. Una re-calibración de pH del biorreactor se llevó ,a cabo cuando las diferencias entre los valores de en línea y fuera de línea fueron mayores de 0.03 pH unidades. Las muestras infectadas fueron estabilizadas con lOx de fosfato de sacarosa (SP) y se congelaron a -80°C hasta analizarse. La progresión de la replicación del virus se analizó al medir la infectividad viral por prueba fluorescente focal (FFA) esencialmente como se describe más adelante.

Prueba fluorescente focal (FFA) : Células MDCK se hicieron crecer en placas de 96 pozos en MEM/EBSS+ IX aminoácidos no esenciales + 2 mM de glutamina + PEN/Strep (VG ) a 36 ± l. °C, 5 + 2% C02 , hasta confluencia (~4 días) . El VMG se removió después y las células se lavaron con VGM fresco seguido por infección con 100 \ih de inoculo de virus (v.gr., ca A/Uruguay, ca A/South Dakota y ca B/Florida) que es diluido en serie (v.gr., 10"1, 10"2... 10"7) en VGM e incubado durante aproximadamente 19-20 horas a 33 ± 1°C, 5+ 2% de C02. Cada dilución de virus se inoculo a células en tres replicados. Después de la incubación durante aproximadamente 19-20 horas a 33+ 1°C, 5+2% de C02, las células fueron inmunoteñidas con anticuerpos anti-influenza para determinar el título del virus de las muestras de conformidad con el siguiente proceso. El medio de cultivo que contenía los virus es removido de cada placa y las placas son lavadas con 200µ1/???? de DPBS seguido por fijación en 100 pL de para formaldehído al 4% frío durante 15 + 3 minutos a temperatura ambiente. Las placas después se lavan dos veces con 250 µ?/???? de IX de solución salina con H regulado con fosfato + 0.05% de Tween 20 (TPBS) seguido por incubación de las células con anticuerpo primario especifico ya sea para cepas A o para cepas B. los anticuerpos primarios son diluidos a la dilución deseada en 0.1% de saponina, 1% de BSA, y 0.1% de azida de sodio en IX PBS (SBSA) . Después de la incubación durante 60 + 5 minutos a 37 + 1 °C, el anticuerpo primario removido, las células son lavadas tres veces con 250 yL de TPBS, y el anticuerpo secundario conjugado a colorante fluorescente (v.gr.,, anti-oveja de conejo marcado con FITC) preparado a la dilución deseada con SBSA se añade a los pozos. Después de incubación durante 60 ± 5 minutos a 37 + 1°C, el anticuerpo secundario es removido y las placas son lavadas dos veces como se describió antes y dos veces con nano agua seguido por secado con toallas de papel. Las placas después se secan con aire con las tapas cerradas en la oscuridad a temperatura ambiente por lo menos durante 10 minutos. Las señales fluorescentes son visualizadas mediante el uso de un microscopio de fluorescencia invertido a amplificación total de lOOx. Las imágenes se pueden tomar mediante el uso de software de imagen tal como el programa SPOT. Generalmente, la banda central de cada pozo es examinada y todos los focos se cuentan y sólo aquellos pozos que tienen un conteo de entre 8 y 120 focos se cuentan. El logi0 FFU/mL se calcula a partir de cada pozo contado y la media y desviación estándar de 3 pozos se calculan.

Resultados y Discusión Las células fueron inoculadas con 22.5 y 30 células/microportadores (MC) para los biorreactores de siembra para los primeros tres experimentos y los últimos dos experimentos respectivamente. La figura 1 gráfica la densidad de células viables (VCD) y viabilidad de las células (V%)para los SRs para todos los experimentos. A 4 dps las densidades de células para los reactores de siembra variaron de 0.94 a 1.14 millones de células/mililitro. La diferencia en densidad de células fue potencialmente idebida a la diferencia en concentración de células inoculadlas de 22.5 y 30 células/MC. La densidad de células a 4 días post siembra (dps) en SRs inoculado con 22.5 y 30 células/MC fueron 0.95 ± 0.01 y 1.12 ± 0.024 millones de células/mililitros respectivamente. La viabilidad de células para todos los biorreactores fue por arriba de 90%. Después de 4 días de cultivo, la transferencia esfera a esfera con lx 0.5 mM de lavado con EDTA - DPBS y lOx ¡TrypLE Select se realizó en los reactores de siembra para tripsinizar células. La tripsinización duro 30 +/- 10 minutos con muestreo intermitente para observar desprendimiento de células bajo el microscopio. Después de aproximadamente 30 a 40 minutos de tripsinización, aproximadamente 90% de células fueron desprendidas de MCs y se vieron como células individuales como se muestra en la figura 2. Las células tripsini zadas se usaron para inocular los biorreactores finales a una relación de división ;de 1:8 para todos los experimentos. El crecimiento de células para todos los FPRs se gráfico en la figura 3. Puesto que la VCD para todos los FPRs en el experimento 2 fue menor que 0.6 x 106 células/mL a 4 dps, y el cultivo de células en estos experimentaron fase lag más larga, estas células fueron infectadas en 5 pds en lugar de 5 dps. Además, los datos de VCD post-infección no estuvieron disponibles para FPRs en el experimento 4. Finalmente, a pesar de la VCD baja de menos de 0.5 x 10s células/mL, los FPRs fueron infectados en 4 dps en el experimento 5. La viabilidad estuvo por arriba de 90% para los FPRs durante la fase de crecimiento celular.

La densidad de células en el tiempo de infección para todos los FPRs se registró en la tabla 10. La variación grande se vio en la densidad de células viables. Varió de 0.44 a 1.12 x 106 células/mL. Esta diferencia se relaciono con error de conteo de células. La VCD promedio para SRs y FPRs se registra en la tabla 11. En 4 dps, la VCD promedio para SRs y FPRs es aproximadamente 1.12 x 106 células/mL y 0.73 x 106 células/mL, respectivamente.

Tabla 10 Densidad de Células Viables en la Infección para Todos los FPRs (Unidad XlO6 Células/mL) Tabla 11 Densidad de Células Viables Promedio para Todos los SRs Y FPRs 4dps VCD promedio (xl0s SRs w/? de 22.5 células/MC 0.95 ± 0.01 células/mL) SRs w/? de 30 células/MC 1-12 ± 0.024 VCD promedio a infección FPRs sin proceso MX ± 0.026 (xl0s células/mL Después de tripsinización, las células en FPRs se unieron a las esferas microportadoras a 0 dps y después empezaron a proliferar sobre la superficie de las esferas microportadoras. La mayoría de los microportadores fueron cubiertos con células y sólo algunas esferas permanecieron vacías (ninguna célula cubrió las esferas) por 4 dps. La morfología de las células fue similar en todos los experimentos. Las fotografías que muestran morfología de célula típica en 3 dps y 4 dpi se presentan en la figura 4 y figura 5 respectivamente.

En 4 ó 5 dps, los FPRs en el experimento 1, 2 y 3 fueron infectados con ca A/Uruguay, ca A/South Dakota y ca B/Florida respectivamente. Antes de infección 0.03x de lOx TrpLE Select se añadió al medio de cultivo de células. En el experimento 4 y 5, FPR individual fue infectado con una de las tres cepas estacionales ca A/Uruguay, ca A/South Dakota y ca B/Florida a 20 FFU/mL . La figura 6 muestra los títulos de virus pico que fueron alcanzados entre 68 y 74 horas postinfección (hpi) . Más aun, el título del virus permaneció alto posteriormente hasta 92 hpi .

Los títulos de virus promedio para cada tipo de cepa de virus se resumen en la tabla 12. Estos fueron 8.7, 8.8 y 8.45 logio FFU/mL para ca A/Uruguay, ca A/South Dakota y ca B/Florida, respectivamente. Esto está en línea a o por i arriba de lo que se observó para estos virus cuando se midió el intercambio de medio de 67%.

Experimentos adicionales se realizaron para comparar títulos virales para cuatro cepas (ca A/Wisconsin/67/05 , A ca A/Uruguay, ca A/South Dakota y ca B/Florida) producidas mediante el uso de proceso de medio de 67% (realizado esencialmente como se describe en la publicación de patente internacional WO 08/105931, véase ejemplo 12) versus proceso sin intercambio de medio (realizado esencialmente como se describió antes) . Por lo menos dos operaciones se realizaron para cada proceso y cepa. Se puede ver de la figura 7 que los títulos virales pico para cada cepa son comparables entre el intercambio de medio de 67% y el proceso sin intercambio de medio.

Tabla 12 Títulos de Virus Pico Promedio para Cada Cepa de Virusj para los FPRs ¡ Cepa de virus Título de virus Día de No. de pico promedio cosecha pico ', FPRs (loglOFFü/mL) (dpi) ca A/üruguay/716/2007 8.7± 0.05 3 4x2L ca A/SouthDakota/6 /2007 8.8± 0.0 3 ; 4x2L ca B/Florida/4/2006 8.45± 0.25 3 ; 4x2L El intercambio de medio es un paso operacional mayor en el proceso de fabricación de vacuna contra la influenza a base de cultivo de células actual. Se han hecho : muchos esfuerzos para eliminar intercambio de medio antes i de la infección ya que sin intercambio de medio la probabilidad de contaminación de microorganismos será reducida y procesos operacionales inocuos pueden ser implementados . A través ¡ de una serie de 12 operaciones de biorreactor sin intercambio de medio, los datos de rendimiento del proceso; más específicamente, desprendimiento/unión de células, crecimiento de célula y títulos de virus se colectaron para evaluar la variabilidad de un nuevo proceso de producción de vacuna y la factibilidad de inocular FPR con células directamente tomadas de SR mediante el uso de un proceso de transferencia de esfera a esfera nuevo. Tres cepas de virus, a saber, ca A/Uruguay, ca A/South Dakota y ca B/Florida fueron producidas, cada una cuatro veces sin intercambio de medio antes de la infección. Se confirmó que VCD pudo ser alcanzada hasta 1 x 106 células/mL en 4 dps en SRs y transferencia de B2B con lx DPBS, TrypLE Select y EDTA se pudo lograr exitosamente con desprendimiento de células efectivo (>90%) en reactores de siembra después de 30 a 40 minutos de tripsinización . Las células en FPRs proliferaron sobre la superficie de esferas microportadoras y alcanzaron VCD promedio de aproximadamente 0.73 x 106 células/mL en el tiempo de la infección. Los títulos de virus pico para ca A/Uruguay, ca A/South Dakota y ca B/Florida para todas las operaciones de FPR sin proceso de MX fueron 8.7+0.05, 8.8±0.0 y 8.45± 0.25 logio FFU/mL respectivamente a 3 dpi. Esto fue mejor que o en línea con el que se observó generalmente para las cepas de virus con el intercambio de medio de 67% (véase figura 8). El título de virus pico para todos los tipos de virus fue mayor de 8.4 log10 FFU/mL. Estos resultados demuestran claramente :que la transferencia de B2B y el proceso sin MX descrito aquí es un proceso muy robusto. Reducen al mínimo el uso de reactivos de medio costosos y pueden reducir la probabilidad de contaminación .

Proceso de flujo tangencial alternante (ATF) Para facilitar el intercambio de fluido in situ en biorreactores , los inventores de la presente han desarrollado un proceso de fabricación basado en cultivo de células mediante el uso de ATF para: a) lavar microportadores in situ) ; b) intercambiar medio de cultivo de células en recipientes de cultivo; y c) separar las células de producción de los materiales biológicos, vacunas y otros materiales producidos en el cultivo y cosechar los productos masivos de una manera mucho más eficiente y controlada. Como se muestra en la figura 18, no hay microportadores presentes en la bolsa de desecho después de la esterilización del microportador o después del intercambio del medio. Además, como se muestra en la tabla 13, el uso de ATF acoplado con la filtración de flujo directo durante la cosecha viral no da por resultado ningún incremento en la proteína de células hospederas o el ADN de células hospederas presente en la cosecha o el producto purificado final.

Tabla 13 ADN y Proteína de Hospedero en Material Producido en ATF ca B/Malaysia ADN (ng/mL) Proteína Título Lote: App07-60 por total ( ogio 12000S-1, 70LMH Picogreen (ug/mL) por FFU/mL) BCA Biorreactor VH 6588.8 1277.04 8.7 SP añadido a VH (SVH) 4583.2 1108.77 8.6 SVH 1 hr (ATF inicio) 6278.4 1135.20 8.6 ATF 0.25h 4755.7 1130.69 8.7 ATF 0.5h' 6776.8 1204.43 8.6 ATF 0.75h 4505.1 1128.49 8.6 ATF lh 5239.3 1155.79 8.7 TFF1 (5XUF 5XDF) 5794.5 84.18 9.1 (acoplamiento de ATF/DFF/TFF) Este ejemplo describe los procesos y parámetros usados para varias operaciones de simulación de producción que utilizaron ATF y operaciones de control que no lo utilizaron. Equipo y reactivos representativos que se pueden usar en el proceso se detallan en la tabla 14 y la tabla 15. Desde luego, otro equipo y reactivos que tienen un desempeño similar pueden ser opcionalmente sustituidos aquí y la mención específica de marcas particulares o tipos de equipos y reactivos no deben considerarse como limitantes a menos que se indique específicamente que así sea. El sistema de ATF provee un medio eficiente para fraccionar una mezcla o células en suspensión, moléculas y otras partículas. El proceso de ATF provee el medio para generar flujo tangencial rápido, de bajo esfuerzo cortante. El sistema de ATF provee el medio para confirmar el proceso. Puesto que el proceso entero es encerrado en el sistema ATF se puede usar para pre y post-esterilización de lavados de esferas microportadoras , intercambio de medio de pre-infección y durante el proceso de cosecha. El sistema de filtración consiste de un ensamble de alojamiento que puede aceptar ya sea un módulo de filtración de fibra hueco o un módulo de tamizado para fraccionamiento de partículas más grandes tales como microportadores . El alojamiento está colocado entre el recipiente del proceso o un biorreactor en un extremo y una bomba de diafragma en el otro extremo. El recipiente sirve como un contenedor de almacenamiento para el contenido que ha de ser filtrado. Una bomba de filtrado se usa para controlar la remoción de la corriente filtrada. El material no filtrado permanece en el sistema. ATF ,' es un sistema pulsante, reversible, de flujo de fluido, de un lado a otro, entre el recipiente del proceso y la bomba de diafragma. La bomba es dividida en dos cámaras con un diafragma flexible. Una de las cámaras de la bomba sirve como un depósito de líquido que está en correspondencia con el recipiente del proceso a través del módulo de tamizado. La segunda cámara de la bomba es una cámara de aire que está en correspondencia con el sistema de control de flujo de la bomba. Típicamente, la adición controlada de aire comprimido a la cámara de aire incrementa la presión en esta cámara en relación con el recipiente del proceso. Esto expande la cámara de aire, al reducir inversamente el volumen en la cámara de líquido; en el proceso que impulsa el contenido del líquido de la bomba al recipiente de proceso a través del módulo de tamizado. El flujo a través de los lúmenes del módulo de tamizado genera flujo tangencial en una dirección. Inversamente, con un recipiente ligeramente presurizado o al fijar la cámara de aire a un escape o vacío, la presión en la cámara de aire es reducida en relación con el recipiente de proceso y el flujo de líquido será del recipiente a la cámara de líquido; de la bomba que genera flujo tangencial en la otra dirección. El flujo se repite.

Tabla 14 Materiales y Reactivos Componente Proveedor Catálogo (Material sugerido MEDI)# MediV 105 SFM (9 g/L de N/A Véase tabla 2 glucosa final) anterior Comprimido de NaOH EM SX0583-3 Inhibidor de tripsina Worthington LS002829 de haba Clon de MDCK no N/A Número de acceso a tumorigénico de SF ATCC PTA-7910, véase O 08/105931 Triple Select IX Invitrogen -12563-011 Cytodex 3 Amersham 17-0485-03 Biosciences 1 DPBS (sin Ca2+ y Mg2+) Invitrogen 14190-136 Tabla 15 Lista de equipo Equipo Fabricante Modelo Bio consola Applikon ADI 1035 Bio controlador Ap likon ADI 1030 Sonda de pH de Ap likon Z001023510 biorreactor Ensamble de Applikon Z5100002MO Soladadura de tubo Terumo SCD IIB 72721T Analizador Nova Bioprofile 400 Bioprofile Bomba peristáltica Colé Parmer 7553-70 ATF2 con Refine Technology ZZ : ATF2 :MC-G1 controlador C26 Preparaciones de pre-siembra: ATF se puede utilizar para cualquier proceso en el cual el fluido es removido y/o intercambiado del biorreactor. Por ejemplo, el sistema de ATF se puede usar para remover la solución de lavado de DPBS después de hidratar las esferas microportadoras antes de la esterilización del recipiente y/o después de los pasos de autoclave el sistema de ATF se puede usar para remover la solución de lavado de DPBS y reemplazar por medio de crecimiento completo. La tabla 16 muestra los valores de control de ATF utilizados durante el intercambio de fluido en las operaciones de simulación de producción 1-3. 1. Preparar microportador Cytodex 3 y cantidad deseada en peso de Cytodex 3 (4 g para biorreactor de 2L y 10 g para biorreactor de 5L) y transferir a biorreactor estéril limpio e hidratar en 50 ~ 100 mL de IX PBS por gramo de esferas no menor de 3 , horas o durante la noche y lavar con PBS fresco. Los pasos de lavado se pueden hacer con el ATF mediante el uso de los valores detallados en la tabla 16. 2. Fijar tubo y filtros a los puertos e placa de cabeza libre. 3. Conectar sonda de DO durante la noche antes de calibración para permitir polarización (Nota: mínimo; de 6 horas) . ' 4. Calibrar las sondas de pH y DO de acuerdo con las instrucciones del fabricante y fijar al biorreactor ensamblado asegurándose que la punta de la sonda sea sumergida dentro del DPBS ya presente en el recipiente del reactor. Añadir más DPBS al recipiente del reactor si es necesario. 5. Someter a autoclave la unidad entera a 121°C durante 30 minutos a 1.05kg/cm2 en el ciclo de líquido. ' 6. Una vez sometido a autoclave y enfriado, conectar la sonda de DO, la sonda de pH y el motor del agitador. ; 7. Hacer una alícuota de NaOH 1N en botellas de alimentación pequeñas, conectar la línea de base y cebar a sus recipientes de reactor respectivos. 8. Medio de lote un día después de la inoculación (siembra) . : a. Calentar la cantidad deseada de medio de crecimiento de células (CGM) , MediV 105 SFM, en el baño de agua a 37°C. b. Drenar el DPBS del biorreactor desde el puerto de drenaje. Alternativamente, usar el sistema de ATF para drenar la solución de lavado de DPBS y reemplazar con CGM mediante el uso de los valores detallados en la tabla 16. c. Lavar las esferas una vez con CGM calentado fresco con los siguientes pasos i) Añadir volumen deseado de CGM después de drenar DPBS. ii) Encender el control de agitación a 120 ¡rpm du durante 10 minutos iii) Apagar agitación para permitir que las esferas se asienten y drenar el sobrenadante. d. Añadir el volumen deseado de CGM al biorreactor. 9. Encender aireación, control de temperatura y agitador. Puntos de fijación para la expansión de células son como sigue: pH = 7.4, temperatura = 37°C, DO = 50% de saturación de aire y agitador = entre aproximadamente, 135 a aproximadamente 175 rpm (generalmente más rápido para biorreactor más pequeño) . 10. Añadir glucosa a 9 g/L final. 11. Extraer muestras y medir por NOVA, realizar calibraciones por DO y corrección de pH (si es necesario) . 12. Encender el controlador de biorreactor y operar con una velocidad de flujo de entre 40 y 320 mL/min (para volúmenes de trabajo entre 2 a 16 L) .

Tabla 16 Valores de Control de ATF Siembra y crecimiento: Se calculan las células viables promedio por botella rodante o reactor de siembra y se transfiere la cantidad apropiada de células a una botella de alimentación de vidrio con medio calentado fresco. Una división de 1:8 directa se puede utilizar para transferencia de esfera a esfera, o alternativamente una densidad de siembre de entre aproximadamente 1 x 105 a aproximadamente 1.5 x 105 se puede usar. Cabe notar que las células pueden ser divididas mediante el uso de cualesquiera métodos de transferencia de esfera a esfera descritos en los ejemplos 8.3 u 8.4 más adelante. Los datos mostrados en la figura 17 se generaron a partir de división de células mediante el uso de protocolo de EDTA/Tripsina (ejemplo provisto en la sección 8.3) . Después de la inoculación, la muestra extraída para Nova post-inoculación y los núcleos se contaron diariamente. Una vez que el conteo de núcleos alcanzó la densidad de células deseada en 3 ~ 4 días después del cultivo, se realizó la infección con virus. Los puntos de fijación para expansión de células son como sigue: pH = 7.4, temperatura = 37°C, DO = 50% de saturación de aire y agitador = entre aproximadamente 135 a aproximadamente 175 rpm (para volúmenes de trabajo entre 2 a 16 L) .

Infección : Antes de la infección aproximadamente 66% de CGM es removido y reemplazado por medio de infección completo (CIM, DMEM/F-12, 45% de glucosa, 200 mM de L-glutamina, dilución de 1:330 de 10X TrypLE) como sigue: Todos los bucles de control son apagados y las esferas microportadoras se dejan asentar. La cantidad deseada de medio, equivalente a 66% es removida del biorreactor y reemplazada por CIM calentado fresco. Los puntos de fijación se ajustan y los bucles de controlador se encienden nuevamente. Los puntos de fijación para infección fueron los siguientes: pH = 7.4, temperatura = 33°C, DO = 50% de saturación de aire y agitador = entre aproximadamente 135 a aproximadamente 175 rpm (para volúmenes de trabajo entre 2 a 16 L) . La tabla 16 muestra las fijaciones de control jde ATF utilizadas durante el intercambio de medio en operaciones de simulación de producción 1-3. Al usar las fijaciones de control descritas en la tabla 16, la cantidad deseada del medio, equivalente a 66% es removida, mediante el uso del sistema ATF con agitación y sin permitir que las esferas microportadoras se asienten, desde el biorreactor y reemplazado por un volumen igual de CIM calentado fresco. Una vez que los puntos de fijación se alcanzan, la cantidad deseada de virus se añade. Si se desea, un control de ; núcleo se realiza antes de la infección y la cantidad de; virus necesaria para infectar el biorreactor se calcula, por ejemplo, 20- 200 MOI (FFU/mL) para cepas estacionales jo 2000 MOI (FFU/mL) para cepas pandémicas se pueden : úsar. Alternativamente, una cantidad establecida de virus ¡ a una concentración conocida (FFU/mL) se añade con base : en el volumen de trabajo del reactor. Véase, por ejemplo WO 08/105931 (ejemplo 12 en particular) .

Cosecha : En el tiempo deseado (generalmente entre 48-72 horas después de la infección) los bucles de control son apagados y las esferas microportadoras se dejan asentar. Un contenedor de bolsa estéril apropiado es fijado al puerto de salida del biorreactor y la cosecha viral es removida por una bomba peristáltica en el dispositivo de ATF. Cuando se usa una bomba peristáltica se debe de tener cuidado de que no incluya las esferas microportadoras. Una vez que la cosecha es completada, se puede añadir regulador de pH 10X SP (2.18 M de sacarosa y 110 mM de fosfato de potasio, pH 7) a la bolsa a la concentración final de IX. Cuando se utiliza ATF, el paso de cosecha puede ser directamente acoplado al paso de filtración de flujo directo como se describe en el ejemplo provisto en la sección 8.6.3, más adelante. La tabla 16 muestra las fijaciones de control de ATF utilizadas durante la cosecha en las operaciones de simulación de producción 1-4.

Proceso de transferencia de esfera a esfera . rápida con concentración baja de proteasa | Este ejemplo describe los procesos y parámetros para transferencia de esfera a esfera rápida y eficiente de células MDCK mediante el uso de solución de lavado de DPBS/O.S mM de EDTA pH 8 y una baja concentración de proteasa (v.gr. , 0.05X de TrypLE) en matraz giratorio, matraz con agitádor o biorreactor de tanque agitado. Una vista general del flujo de proceso se provee en la figura 8A. El equipo y reactivos representativos que se pueden usar en el proceso se detallan en la tabla 17, tabla 18 y tabla 19. Desde luego, otro!equipo y reactivos que se desempeñan de manera similar pueden ser opcionalmente sustituidos aquí, y mención específica de ¡marcas o tipos particulares de equipos y reactivos no \ deben considerarse como limitantes a menos que se indique específicamente que así sea.

El proceso se utilizó en las doce operaciones descritas anteriormente. Como se señaló, un desprendimiento de células apropiado en los reactores de siembra y fijación para células en FPRs se observó mediante el uso de protocolo de transferencia de esfera a esfera mediante el uso de lavado con lx DPBS con EDTA y tripsinización mediante el uso de TrypLE select a pH 8. Por lo tanto, el proceso de transferencia de esfera a esfera es rápido, eficiente y robusto.

Tabla 17 Lista de Equipo Tabla 18 Materiales y Reactivos Componente Proveedor Número de sugerido catálogo 10X TrypLE Select Invitrogen 04-0090DG Acido Sigma o Cat #E5134-500G etilendiaminotetraacético equivalente (EDTA, sal de disodio dihidratada) FW 0.5 M de EDTA pH 8 Gibco 15575-038 0.5 M de EDTA pH 8 en lab. NA Solución salina regulada en Gibco o 14190-367 su pH con fosfato de Dulbecco equivalente sa de 20L) ; sin Ca y Solución salina regulada en Gibco o 21600-069 su pH con fosfato de Dulbecco equivalente polvo 10X; sin Ca2+ y Mg2+ Tabla 19 Preparación de Solución de Lavado a pH 8 DPBS/0.5 mM de EDTA Componente Concentración Volumen (mL) DPBS N/A 1000 0.5M de EDTA pH 8 0.5wM 1 (Gibco o en lab.) pH 8.0 ±0.1 NA Preparación de medio líquido IX DPBS a partir de polvo 10X DPBS: Se añade medio en polvo a agua a temperatura ambiente con agitación suave (no se calienta el agua) . Se enjuaga el interior del contenedor para remover todos los rastros de polvo. Se diluye a un volumen deseado con agua. Se agita hasta disolverse (no se sobremezcla) . Se ajusta el pH del medio a 7.8 ± 0.1 (pH de trabajo final es 8.0) . Las unidades de pH usualmente aumentan 0.1-0.3 bajo filtración. Después de que el pH se ha ajustado, el contenedor se mantiene cerrado hasta que se filtra el medio. Se esteriliza inmediatamente mediante el uso de una membrana de 0.1 miera.

Preparación de 0.5M de EDTA de abastecimiento: Se añade 186.1 g de EDTA (disodio, dihidrato) a 800 mL de agua desionizada. Se añaden aproximadamente 20 g de comprimidos de NaOH o NaOH ION mientras se agita para llevar el pH a 8.0. Nota: Se añaden los últimos gramos"" lentamente para ¡evitar exceder el pH. El EDTA no se disolverá hasta que el pH esté alrededor de 8. Se ajusta el volumen a 1 L con agua desionizada. Se filtra con un filtro de 0.1 mieras. Se forman alícuotas en volúmenes más pequeños (200 mL cada botella) y se almacena a temperatura ambiente.

Preparación de DPBS/0.5 M de EDTA de abastecimiento: Se añade 1 mL de EDTA de abastecimiento 0.5M a pH 8 para cada litro de DPBS . Se ajusta el pH del medio a 7.8 ± 0.1 (pH del trabajo final es 8.0) si es necesario. Nota: las unidades de pH usualmente aumentarán 0.1-0.3 bajo filtración. Se filtra con un filtro de 0.1 mieras.

Procesos de lavado de IX DPBS/EDTA 0.5mM -pH 8.0: Se detiene la agitación, pH, DO, se controla la temperatura si es aplicable. Se deja que las esferas microportadoras se asientes durante 15 + 5 minutos. Se remueve a través del puerto de salida 80 + 10% de medio de crecimiento gastado. Véase tabla 20. Nota: este proceso se podría hacer mediante el uso de flujo tangencial alternante (ATF) . Se reemplaza por un volumen igual de IX DPBS/EDTA 0.5 mM -pH 8.0 de solución de lavado al recipiente de cultivo. Véase tabla 20. Se inicia la agitación a los valores originales y se lavan las células durante 25 ± 5 minutos. Se detiene la agitación y las esferas microportadoras se asientan durante 15 ± 5 minutos. Se remueve a través del puerto de salida 80 ± 10% de solución de lavado. Véase tabla 21. Nota: este proceso se podría hacer mediante el uso de ATF. Se añade IX DPBS/EDTA 0.5 mM -pH 8.0 de solución de lavado al recipiente hasta 50% de volumen de cultivo de trabajo. Véase tabla 20. La velocidad del agitador se fija a las rpm deseadas. Véase tabla 21. Se inicia el agitador, pH, DO y controles de temperatura. Se ajusta los valores de pH a 8.0. Véase tabla 21.

Tabla 20 DPBS/EDTA 0.5 mM - pH 8,0 Volumen de Lavado y Velocidad de Agitación Volumen de trabajo del bxorreactor 2 L 5 L 10 L 15 L Vol . que ha de ser 1.6 ± 0.2 4± 0.5 8 ± 1 12 ± 1.5 removido (L) Vol. que ha de ser 1.6 ± 0.2 4± 0.5 8 ± 1 12 + 1.5 añadido (L) Agitación (rpm) 175 175 134 134 Tabla 21 IX DPBS/EDTA 0.5 mM - pH 8.0 Volumen de Lavado, Velocidad de Agitación pH, Temperatura y Valores de DO Volumen de trabajo del biorreactor 2 L 5 L 10 L 15 L Vol . que ha de ser 1.6 ± 0.2 4 ± 0.5 8 ± 1 12 ± 1.5 removido (L) Vol . que ha de ser 0.6 ± 0.2 1.5 ± 0.5 3.0 ± 1.0 4.5 ± 1.5 añadido (L) Agitación (rpm) 250 250 220 , 220 pH ' 8.0 ± 0.1 8.0 ± 0.1 8.0 ± 0.1 8.,0 ± 0.1 Temperatura 37 ± 0.1°C 37 ± 0.1°C 37 ± 0.1°C 37' ± 0.1°C DO 50% · 50% 50% 50% Procedimiento de desprendimiento de células: Cuando el pH del cultivo ha alcanzado 8 ± 0.1 se añade el volumen calculado de 10X TrypLE a una concentración final de 0.05X a través del puerto de inyección o a través del puerto de medio. Véase tabla 22. Nota: también se puede realizar dilución de 1:200 del 10X TrypLE en relación con el volumen de trabajo deseado. A través el puerto de muestreo, se toman alícuotas de muestra cada 15 ± 2 minutos hasta que se desprende por completo. Nota: el desprendimiento de células sé debe completar en <60 minutos. Se añade medio basal al volumen de trabajo original del recipiente de cultivo. Se detienen todos los bucles de control excepto los controles de agitador y pH.

Procedimiento de esfera a esfera: Se transfiere el volumen deseado de células desprendidas al reactor de producción final. Véase tabla 23.

Tabla 22 Volúmenes de 10X TrypLE Volumen de trabajo del biorreactor 2 L 5 L 10 L 15 L 10X TrypLE (mL) 5 12.5 25 37.5 Tabla 23 Proceso de Transferencia de Esfera a Esfera a Reactor de Producción Final Volumen de trabajo del biorreactor 1:8 de división 2 L 5 L 10 L 15 L Vol. de células tripsinizadas 0.250 L 0.625 L 1.25 L 1'.875 L Medio de crecimiento 1.725 L 4.375 L 8.75 L 13.125 completo L26.25 g Microportadores Cytodx3 3.45 g 8.75 g 17.5 g Proceso de Transferencia de Esfera a Esfera Libre de Proteasa y Uso de ATF Uno de los principales desafíos para producir vacunas, proteínas recombinantes y otros bioterapéuticos es despender reproduciblemente las células de producción adherentes de los recipientes de cultivo y después unirlas de nuevo a recipientes de cultivo nuevos. Un proceso normalmente conocido como subcultivo de células. Esta tarea se hace particularmente difícil para la producción a base de microportadores en la fabricación a gran escala. Para asegurar que las células sean subcultivadas apropiadamente, se usan comúnmente tripsina o reactivos similares a tripsina (v.gr., TrypLE) . Sin embargo, el proceso de tripsinización puede ser difícil de controlar y los riesgos de sobretripsinización o subtripsinización pueden ser un impacto negativo sobre la robustez del proceso de fabricación e incluso reducción en productividad. Aquí se describirá un nuevo método que permite que las células de mamífero, en particular células de DCK altamente adherentes, pasen en serie sin usar tripsina o reactivos similares a la tripsina. Estos métodos hacen úso del EDTA para reemplazar la tripasina o reactivos similares a la tripsina. Este método además se puede acoplar con un dispositivo de flujo tangencial alternante (ATF) para facilitar el intercambio de fluido in situ en los biorreactores .

Con el proceso libre de proteasa recién desarrollado se han pasado exitosamente células de MDCK por más de 5 veces consecutivamente y consistentemente se ha alcanzado la viabilidad de células alta (> 90%) y densidad de células alta (> 1 X 106 células/mL) (véase figura 15) . Los inventores de la presente también han usado las células preparadas por este método para producir títulos de virus altos que incluyen virus de la influenza atenuados vivos adaptados al frío de varios subtipos diferentes. El título de virus fue por lo menos 8 log10 FFU/mL para cada una de las tres cepas de1 virus representativas que componen la vacuna estacional (cepas A/Hl, A/H3 y B) (figura 16, y no se muestran datos) . Este proceso se puede usar tanto para la producción de vacunas cómo la producción biológica a base de cultivo de células (anticuerpo monoclonal, proteína recombinante , etc.) y a pequeña escala.

Este ejemplo describe el proceso y parámetros para transferencia de esfera a esfera rápida y eficiente de células MDCK al lavar las células e incubar las células con EDTA pH8 en un matraz giratorio, matraz con agitador o biorreactor de tanque agitado en ausencia de cualquier proteasa. Equipo y reactivos representativos que se pueden usar en un proceso se detallan en la tabla 17, tabla 18 y tabla 19 anteriores. Desde luego, otro equipo y reactivos que tienen un desempeño similar pueden ser utilizados opcionalmente aquí y mención específica de marcas o tipos particulares de equipo y reactivos no deben considerarse como limitantes a menos que se indique específicamente que así sea.

DPBS IX /EDTA 0.5mM- pH 8.0 lavado y procesos de incubación : Se detiene la agitación, controles de pH, DO, temperatura si es aplicable. 1) Se dejan asentar las esferas microportadoras , 15 + 5 minutos es generalmente suficiente y se remueven -70-80% o más de medio de crecimiento gastado. Nota: este proceso se podría hacer mediante el uso de flujo tangencial alternante (ATF) . 2) Se reemplaza por volumen deseado de solución de lavado DPBS IX al recipiente de cultivo. Generalmente, un volumen igual de regulador dé pH de lavado es sugerido para lavado eficiente. 3) Se repitien los pasos (1) y (2) según se desee, generalmente un total ele tres lavados es sugerido. 4) Se remueve la solución de lavado según sea necesario para dejar el volumen deseado (v.gr. , -÷50% el volumen original) Nota: este proceso se podría hacer mediante el uso de ATF. 5) Se añade EDTA 0.5 mM - pH 8.0; a una concentración final de 0.5 mM. 6) Se inicia agitación así como los controles de pH, DO y temperatura si es aplicable. La agitación será generalmente de entre 100 a 250 rpm dependiendo del volumen de trabajo y/o impulsor. Se utiliza 100 rpm para transferencia de escala pequeña de unos cuantos cientos de mililitros o menos. Véase también, por ejemplo, tabla 21 para velocidades del agitador que se pueden usar para volúmenes de trabajo más grandes. 7) Se incuba con agitación durante 60 ± 10 minutos. Se extraen alícuotas de muestra para verificar desprendimiento de células completo. La tabla 24 detalla las condiciones utilizadas para transferencia de esfera a esfera a pequeña escala.

Una vez que las células son desprendidas, las células después están listas para dividirse. Generalmente, se añade medio de crecimiento a un volumen de trabajo deseado (v.gr., volumen original) y el volumen deseado de las células desprendidas son transferidas a un nuevo recipiente. Alternativamente, medio de crecimiento y/o microportadores adicionales se añaden al recipiente original. Para proceso a-escala ascendente a 1:5 a 1:8 de división se ha encontrado que es útil, la tabla 23 provee los detalles para divisiones de 1:8 para varios volúmenes de trabajo final. Opcionalment , el matraz original se enjuaga con medio de crecimiento y se combina con el material transferido, este volumen debe i considerarse cuando se realizan escalas ascendentes para no diluir las células demasiado. 8) Se incuba el matraz nuevo a la temperatura apropiada (aquí 37°C se usó) sin ninguna agitación durante 40-60 minutos. 9) Se inicia la agitación, así como los controles de pH, DO, y temperatura si es aplicable para el crecimiento de las células. 10) Se repiten los pasos (l)-(9) según sea necesario para propagación en serie y escala ascendente para infección.

Cultivos paralelos se propagan en serie durante cinco (5) pasadas mediante el uso del método libre de proteasa (EDTA de preparaciones comerciales o de laboratorio) esencialmente como se detalla en la tabla 24 o ETDA/TrypLE esencialmente como se detalla en el ejemplo provisto en la sección 8.2. Para células de control, células nuevas fueron tripsinizadas (las células se lavaron y se incubaron con IX TrypLE durante 15-20 minutos, el medio de crecimiento fresco se añade y las células se centrifugan durante 10 min a 1000 rpm y se vuelven a suspender en medio de crecimiento fresco) y se usa para sembrar matraces giratorios para comparación de crecimiento/viabilidad de las células y título de cada paso. Los conteos de células y viabilidad de las células con el tiempo durante el cultivo se grafican en la figura 15. Como se ve a partir de las gráficas, los conteos de células y viabilidad de los cultivos propagados mediante el uso de EDTA solo (libre de proteasa) y ETDA/TrypLE son comparables. Además, se vio generalmente que estos dos métodos producen un cultivo de densidad más alta que el método de control . Células de cada pasada de los cultivos paralelos también se usaron para producir virus de la influenza. Los títulos virales obtenidos para ca A/Wisconsin/67/07 y ca B/Malaysia/2506/04 (figura 16, paneles superior e inferió, respectivamente) fueron similares, independientemente del método de propagación usado.

Tabla 24 Condiciones de Transferencia de Esfera a Esfera Libre de Proteasa Proceso de Transferencia de Esfera a Esfera Rápido sin Lavado La presencia de cationes divalentes en medio de crecimiento puede inhibir la acción de proteasas usadas para desprender células de microportadores . Como se mostró anteriormente, EDTA se puede usar para quelatar estos cationes lo que facilita el desprendimiento de las células. Una serie de experimentos se realizaron para examinar el efecto de la concentración de EDTA sobre la morfología y desprendimiento de células. La figura 23A muestra células no tratadas. Tienen una morfología aplanada y son adheridas apretadamente a los microportadores. Las figuras 23B-23F muestran el cambio en morfología visto después de 60 minutos de exposición para incrementar cantidades de EDTA, 0.5, 1, 2, 5, y 10 mM, respectivamente. Se ve algún redondeo con los tratamientos de 0.5 y 1 mM. El tratamiento con 2 mM y mayores da por resultado redondeo y desprendimiento adicionales. Casi todas las células se desprenden de los microportadores a las concentraciones de más altas de EDTA. Con base en esas observaciones, 1-2 mM de EDTA puede facilitar el redondeo de células .

Una segunda serie de experimentos se realizó para examinar el efecto de concentración de TrypLE en presencia de 1 ó 2 mM de EDTA. Después del pretratamiento con 1 ó 2 mM de EDTA, TrypLE se añadió a los cultivos de células a una concentración final de 0.0125X, 0.025X y 0.05X y el desprendimiento se monitoreó. La figura 24 muestra el desprendimiento visto para células pre-tratadas con 2 mM de EDTA mediante el |uso de concentraciones diferentes de TrypLE con el tiempo. En el tiempo cero después de adición de TrypLE las células mostraron una morfología redondeada (figuras 24A, 24B y 24C, 0.0125X, 0¡.025X y 0.05X TrypLE, respectivamente) con poco desprendimiento;. A 60 minutos después de la adición de TrypLE, todos los dultivos mostraron algo de desprendimiento. A las concentraciones de TrypLE más bajas (0.0125X y 0.025X) no todas las células se desprendieron y se observó alguna agregación (figuras 24D y 24E, respectivamente). A 0.05X TrypLE, casi todas las células se desprendieron y se observó poca agregación (figura 24F) . Sin embargo, cuando estas células fueron transferidas a un nuevo recipiente de producción complementado con medio de crecimiento fresco no se unieron de nuevo a los microportadores viejos y nuevos, probablemente debido a quelatacion de los cationes divalentes en el medio de crecimiento fresco.

La adición de una matriz de CaCl2, MgCl2, MgS04 , y elementos traza A, B y C al medio de crecimiento se examinó para la capacidad para superar el efecto de quelatacion sobre la unión y crecimiento. La tabla 25 muestra el por ciento de refijación de células y diseminación en 4 días después de la siembra con la adición de una matriz de concentraciones de CaC12, MgCl2 y MgS04 a medio de crecimiento MediV 105 SFM. La tabla 26 muestra los conteos de células el día 4 después de la siembra con la adición de una matriz de concentraciones de CaCl2, MgCl2, MgS04 y elementos traza A, B y C, a medio de crecimiento MediV 105 SFM. Como se muestra en la tabla 26, células MDCK alcanzaron más de 1E6 células/mL y por arriba de 90% de viabilidad de las células el día 4 después de la transferencia de esfera a esfera cuando MediV 105 SFM fue suministrado con 1.5 mM de CaCl2, 0.15 mM de MgCl2 0.4 mM de MgS04( y 2X de elementos traza A, B y C. Con base en estos estudios, se realizaron experimentos adicionales para optimizar adicionalmente estos factores, por ejemplo para determinar las condiciones de crecimiento óptimas para tipos de células adicionales (v.gr. , células VERO) y/o para hacer este proceso robusto a cualquier escala de producción de virus Estudios de concentración de EDTA: células MDCK que crecieron en botellas rodantes de 850 era2 se sembraron a un biorreactor de semilla de 2L (MediV 105SFM, 2. g de microportador/L) a una densidad de 1.8 x 105 células/mL. El reactor de siembre se fijó a 7.4 de pH, que fue controlado por C02 y NaOH 1N; 50% de saturación de aire con el aire constante de 20 mL/min, 37°C de temperatura y 175 rpm de agitación. El día 4, cuando era totalmente confluente (1.2 -: 1.6E6 células/mL) 25 mL de cultivo de microportador se transfirió a matraces de 6x 100 mL, y el EDTA se añadió a cada matraz para hacer una concentración final diferente de 0.5, 1, 2, ;5, 10, 20 mM. Subsecuentemente, los matraces se incubaron 1 en un agitador orbital a 37 °C, 5% de C02 , 200 rpm durante 1 hora. El examen microscópico periódico de todos los matraces durante el período de incubación se realizó para verificar el grado de células que se volvieron esféricas en forma (se redondearon) a concentraciones de EDTA diferentes. ¡ Concentración de TrypLE Select en combinacijón con i las concentraciones optimizadas de EDTA: Células MDCK que crecieron en botellas rodantes de 850 cm2 se sembraron en reactores de siembra de 2 x 2L (MediV 105 SFM, 2! g de microportador/L) a una densidad de 1.8.x 105 célulasl/mL de I conformidad con TR #348. Los reactores de siembra se operaron durante 4 días con los mismos parámetros de biorreactor descritos anteriormente. El día 4, se añadió 1 mM de EDTA a un biorreactor, y 2 mM de EDTA al otro. Ambos fueron agitados durante 1 hora a 175 rpm. Después, el pH de : ambos biorreactores se ajustó a 8 antes de transferir las suspensiones de células de cada biorreactor a matraces con agitador de 3 x 500 mL. De cada conjunto del cultivo, 10X TrypLE Select se añadió a cada matraz para hacer concentraciones finales de 0.05X, 0.025X y 0.0125X y se incubaron a 37°C, 5% de C02 , 150 rpm en agitador orbital durante 30 minutos. Durante el período de incubación, muestras de cada conjunto se tomaron periódicamente para examen microscópico para verificar el grado de desprendimiento de células de los microportadores . En cuanto a la observación microscópica, cuando >90% de las células se habían desprendido de los microportadores, un volumen igual de inhibidor de tripsina de haba (LBTI) se añadió para detener la actividad de la tripsina.

Tabla 25 Adición de CaCl2, MgCl2, MgSQ4 a MediV 105 SFM Después de Desprendimiento de Células sin Lavado Matraz CaCl2 (mM) MgCl2 (mM) MgS04 (mM) Día 4; % de unión de células nuevamente 1 1 0.15 0.1 75% 2 1 0.2 0.8 80% ' 3 1.5 0.2 0.2 85% 4 1.5 0.2 0.1 90% 5 1.5 0.15 0.2 75% ' 6 1.5 0.15 0.8 90% 7 1 0.1 0.4 60% 8 1.25 0.15 0.45 80% : 9 1.25 0.15 0.45 95% Matraz CaCl2 (mM) MgCl2 (mM) MgS04 (mM) Día 4 % de unión de células nuevamente 10 1 0.15 0.4 30% 11 1 0.15 0.2 30% 12 1 0.2 0.4 25% 13 1 0.15 0.8 30% 14 1 0.1 0.8 55% 15 1.5 0.1 0.4 75% 16 1.5 0.1 0.2 80% 17 1 0.1 0.2 40% 18 1.5 0.1 0.8 75% 19 1 0.2 0.1 60% 20 1.5 0.15 0.4 80% 21 1 0.1 0.1 65% : 22 1-5 0.2 0.4 85% 23 1-5 0.1 0.1 80% ¦ 24 1.5 0.15 0.1 85% 25 1 0.2 0.2 75% 26 1.5 0.2 0.8 60% Tabla 26 Adición de CaCl2, MgCl2, MgSQ4 y Elementos Traza A, B y C a MediV 105 SFM Después de Desprendimiento de Células sin Lavado Matraz CaCl2 (mM) MgCl2 (mM) MgS04 (mM) TE ABC Día 4 (célúlas/mL) 1 1.5 0.1 0.8 IX 4.71E+0.5 2 1 0.2 0.8 IX 2.55E+0.5 3 1.5 0.2 0.2 IX 4.41E+0.5 4 1.5 0.2 0.1 IX 3.99E+0.5 5 1.5 0.15 0.8 IX 3.63E+0.5 6 1.25 0.15 0.45 IX 5.88E+0.5 7 1.5 0.1 0.2 IX 3.27E+0.5 8 1.5 0.15 0.4 IX 4.83E+0.5 9 1.5 0.2 0.4 IX 4.65E+0.5 10 1.5 0.1 0.1 IX 5.25E+0.5 11 1.5 0.15 0.1 IX 5.49E+0.5 12 1.5 0.1 0.8 A+BC 6.33É+0.5 13 1 0.2 0.8 A+BC 3.12E+0.5 14 1.5 0.2 0.2 A+BC 3.21E+0.5 15 1.5 0.2 0.1 A+BC 1.9SE+0.5 16 1.5 0.15 0.8 A+BC 2.85E+0.5 Matraz CaCl2 (mM) MgCl2 (mM) MgS04 (mM) TE ABC Día 4 (células/mL) 17 1.25 0.15 0.45 A+BC 5.31E+0.5 18 1.5 0.1 0.2 A+BC 3.12E+0.5 19 1.5 0.15 0.4 A+BC 5.94E+0.5 20 1.5 0.2 0.4 A+BC 5. OlE+0.5 21 1.5 0.1 0.1 A+BC 4.20E+0.5 22 1.5 0.15 0.1 A+BC 5.10E+0.5 23 1.5 0.1 0.8 2X 5.64E+0.5 24 1 0.2 0.8 2X 4.02E+0.5 25 1.5 0.2 0.2 2X 4.26E+0.5 26 1.5 0.2 0.1 2X 3.50E+0.5 27 1.5 0.15 0.8 2X 2.37E+0.5 28 1.25 0.15 0.45 2X 5.19E+0.5 29 1.5 0.1 0.2 2X 1.01E+0.5 30 1.5 0.15 0.4 2X 1.25E+0.5 31 1.5 0.2 04 2X 6.39E+0.5 32 1.5 0.1 0.1 2X 6.71E+0.5 33 1.5 0.15 0.1 2X 7.98E+0.5 Proceso de purificación para influenza producida en cultivo de células El desarrollo de un proceso de purificación a gran escala robusto para influenza producida en cultivo de células requirió desarrollo intensivo. Un proceso de etapa temprana se desarrolló en donde la cosecha viral (60-65 horas después de la infección) se bombeó a una bolsa, y 10X de regulador de pH de fosfato de sacarosa (SP) se añadió a la bolsa de cosecha viral (VH) a dilución de 1/10 (v/v) para estabilización viral. La cosecha viral estabilizada (SVH) se trató primero con Benzonase a 50 unidades/mL con 2 mM de MgCl2 a 32°C durante 3 horas para remover ADN de células hospederas MDCK (HCD) y la reacción se detuvo mediante la adición de 5 mM de EDTA. Benzonase es una endonucleasa recombinante genéticamente manipulada que degrada ADN en oligonucleótidos en presencia de iones de magnesio. La cosecha viral tratada con Benzonase fue clarificada después por 1.2 µp? de polipropileno (PP) y 0.45 µp? de filtros de cápsula de PVDF. La VH clarificada fue condicionada por ultrafiltración de 5 veces (5X) y diafiltración de 5 veces con regulador dé pH de SP en un cartucho de fibra hueca de corte de peso molecular de 500 kDa . Las partículas virales serían retenidas en el lado de retenido, mientras que la proteína de célula hospedera (HCP) , el ADN de células hospederas (HCD) y Benzonase sería diafiltrado al lado de permeado de la fibra hueca. El virus concentrado y diafiltrado fue purificado mediante el uso ' de una columna de cromatografía de sulfato de celufine (CS) para remover adicionalmente impurezas de HCD, HCP y Benzonase. CS es una resina de afinidad que se une al virus en la columna y el virus unido es eluido mediante el uso de regulador de pH de sal con alto contenido de SP. El virus purificado del material eluido de columna sería diafiltrado por cinco diavolúmenes de regulador de pH de SP100 (200 mM de sacarosa y 100 ! mM de fosfato de potasio, pH 7.2) sobre un cartucho de fibra hueca de corte de peso molecular de 500 kDa para remover el regulador de pH de elución con alto contenido de sal y formular el virus purificado. El producto de virus diafiltrado es después estabilizado mediante la adición de cGAG en una dilución: de 1/9 (v/v) y filtrado en forma estéril mediante el uso de un ', filtro de 0.22 µp? para hacer el producto volumétrico final.

Cambios sustanciales fueron implementados al proceso inicial que mejoraron la escalabilidad, la eficiencia del proceso y la calidad del producto final. Los cambios hechos en el proceso se basaron en la evaluación de recuperación y el nivel de impurezas (HCD, HCP y Benzonase) y se implementaron en el proceso estabilizado original. En total, se implementaron cinco pasos para enfrentar la escalabilidad y para mejorar la eficiencia de proceso y calidad de producto final. Primero, la cosecha viral se cambió a 48 horas después de la infección para células infectadas mediante el uso de una entrada viral de 2000 FFU/mL, este tiempo corresponde al título viral pico. Segundo, el paso de remoción de HCD se cambió de tratamiento con Benzonase de modo intermitente a un tratamiento de Benzonase en columna. Estos dos pasos juntos mejoran la calidad del producto final al reducir significativamente el nivel de HCD del material de partida y el volumen final. Tercero, la concentración de carga de : resina de CS se incrementó de 9.0 logi0 FFU/mL a 9.5 logio FFU/mL, esto reduce el tamaño de columna de producción de 4 L a 1.4 L y mejora la eficiencia del proceso. Cuarto, el segundo volumen de intercambio de regulador de pH se incrementó de 15 a 8 diavolúmenes para incrementar el aclaramiento de Benzonase. Quinto, el flujo del filtro final fue reducido a la mitad a un promedio de 25 L/m2 para evitar cualquier taponamiento durante la filtración final en las operaciones de CTM. El método final (detallado más adelante) provee proceso que da una recuperación global promedio de 43.4%, con 0.72 ng/dosis (por PicoGreen) y 0.1 ng/dosis (por PCR) HCD, 0.21 µg/dosis'de HCP y 0.0035 ng/dosis de Benzonase, todos los cuales están por abajo de las especificaciones requeridas por agencias reguladoras. La figura 10 provee una vista general de los procesos de purificación iniciales y mejorados.

Materiales y Métodos ; Materiales, reactivo y equipo: Otros materiales, equipos y reactivos que tuvieron un desempeño similar ! pueden ser fácilmente sustituidos. ; 1. Filtro 1.2 µtt? Polygard CN Opticap XL5 (Millipore Corporation, Billerica, MA, Cat . No. KN12A05HH1) 2. Filtro 0.45 µ?? Durapore Opticap XL4 (Millipore Corporation, Billerica, MA, Cat. No. KPHLA04HH3) 3. Bolsa de 50 L (Hyclone, Ltd, Logan, UT, Cat. No.

SH30712.04) j 4. Bolsa de 10 L (Hyclone, Ltd, Logan, UT, Cat No. SH30712.12) 5. Fibra hueca, 500KD, 4.800 cm2 (GE Healthcare, Uppsala, Suecia, Cat. No. UFP-500-C-6A) ; 6. Fibra hueca, 500KD, 290 cm2 (GE Healthcare, Uppsala, Suecia, Cat. No. UFP-500-C-3X2MA) ¡ 7. Resina de sulfato de Cellufine (Chisso Corporation, Tokyo, Japón, Cat. No. 19847) | 8. Anillo en O de brida (GE Healthcare, Uppsala, Suecia, Cat. No. 18-8494-01) 9. Anillo en O adaptador (GE Healthcare, Uppsala, Suecia, Cat. No. 18-8475-01) 10. Soporte de lecho, 23 µt?, pieza de extremo (GE Healthcare, Uppsala, Suecia, Cat. No. 18-9252-01) 11. Soporte de lecho, 23 µt?, adaptador (GE Healthcare, Uppsala, Suecia, Cat. No. 18-1103-08) 12. Empaques 25 mm i.d. 6 mm, EPDM (GE Healthcare, Uppsala, Suecia, Cat. No. 18-0019-27) 13. Válvulas de 4 puertos-2 vías (GE Healthcare, Uppsala, Suecia, Cat. No. 18-5757-01) 14. Cápsula de filtro Sartopore2 300, 0.45 ym/0.22 ym, 300cm2 (Satorius, MA, Cat. No. 5441307H5-00-B) 15. Cápsula de filtro Sartopore2 150, 0.45 µp?/0.22 ym, 150cm2 (Satorius, MA, Cat. No. 5441307H4--00--B) 16. Botellas de PETG de 1 L (Nalgene, Rochester, NYU, Cat. No. 2019-1000) 17. Botellas de PETG de 2 L (Nalgene, Rochester, NYU, Cat. No. 2019-2000) 18. Tubo de silicón curado con platino MasterFlex L/S tamaño 24 (Colé Parmer, Vernon Hills, IL, Cat. No. 96410-24) ; 19. Tubo de silicón curado con platino MasterFlex L/S tamaño 36 (Colé Parmer, Vernon Hills, IL, Cat. No. 96410-36) 20. Regulador de H de fosfato de sacarosa 1 X (Hyclone, Ltd, Logan, UT, Cat . No. SH3A1577) - regulador de pH 218 mM de sacarosa y 11 mM de fosfato de potasio, pH 7 ¡ 21. Regulador de pH de 1XSP/1M NaCl (Hyclone, Ltd, Logan, UT, Cat. No. SH3A2034) 22. Regulador de pH de SP100 (Hyclone, Ltd, Logan, UT, Cat. No. SH3A1796) - regulador de pH de 200 mM de sacarosa y 100 mM de fosfato de potasio, pH 7.2 23. Regulador de pH de cGAG (Hyclone, Ltd, ¡Logan, UT, Cat. No. SH3A1795) i 24. Benzonase (EMD, Darmstadt, Alemania, Cat. No. 1.01697.0002) ! 25. 1 M MgCl2 (Sigma, St . Louis, Missouri, C t . No. M 1028, lote # 085K8920) j 26. Kits Quant-iT PicoGreen dsDNA (Invitrogen, Eugene, Oregon, Cat. No. P11496, lote # 22987) j 27. NaOH 0.5 N, diluido de NaOH 10 N (VWR, West Chester, Pennsylvania, Cat. No. VW3247-7) ! 28. Bomba peristáltica (Watson Marlow ! Inc., Wilmington, MA, Modelos 520U, 520S y 520DÍ) i 29. Mezclador de onda (GE Healthcare, Uppsala, Suecia, Cat. No. Mixer20/50EH) : 30. Deslizador cromatográfico de proceso AKTA (GE Healthcare, Uppsala, Suecia, Cat. No. 28409334) ; 31. Deslizador de filtración UnifluxlÓ (GE Healthcare, Uppsala, Suecia, Cat . No. 28920799) 32. Columna de cromatografía BPG 100 (GE Healthcare, Uppsala, Suecia, Cat. No. 18-1103-01) 33. Columna de cromatografía BPG 200 (GE Healthcare, Uppsala, Suecia, Cat. No. 18-1103-11) 34. Flexstand (GE Healthcare, Uppsala, Suecia, Cat. NO. 56-4107-54) Tabla 27 Lotes de Cosecha Viral de Biorreactores de un Solo Uso' (con 67% de Intercambio de Medio) Cosecha viral de cultivo de células (VH) : El detalle de crecimiento de células MDCK y producción de virus se describe en la publicación de patente internacional WO 08/105931 (véase en particular ejemplo 12) . Todas las operaciones de producción viral se realizaron en un biorreactor de un solo uso (SUB) con un proceso de -÷67% de intercambio de medio y las células fueron infectadas ¡ usando una entrada viral de 2000 FFU/mL. El virus fue cosechado a aproximadamente 60-65 hr (operaciones 1-7) o 48 horas (operaciones 8-9) después de la infección de células MDCK. Los microportadores en el SUB se dejaron asentar por no menos de 45 minutos antes de la cosecha viral (VH) . Aproximadamente 18 L de virus se bombeó a una bolsa de 50 L a aproximadamente 0.2 L/min, y 2 L de regulador de pH 10X SP se bombeó en la misma bolsa para estabilización de cosecha de virus (SVH) . Después de mezclarse, las mezclas se tomaron a etapas de S H para probar para infectividad por pruebas de FFA, HCD y HCP.1 El siguiente proceso se puede utilizar para acoplar directamente el paso de cosecha viral al paso de filtración de flujo directo. El volumen apropiado de regulador de pH ; 10X SP se añade al biorreactor para obtener una cosecha: viral estabilizada (SVH) que comprende una concentración final de aproximadamente IX SP, los microportadores puede dejarse asentar y la cosecha viral es acoplada junto con los pasos de DFF y TFF mediante el uso de ATF. Por ejemplo, en un estudio de acoplamiento de ATF/DFF/TFF, SVH fue bombeado directamente desde el biorreactor al sistema de ATF mediante la bomba de alimentación de muestra. El permeado del ATF después se hizo pasar a través de cápsulas de DFF en línea y, finalmente al tanque de procesamiento Uniflux. La operación del sistema ATF se detalla en el manual de operación de ATF. Los puntos de fijación del sistema de ATF a ciclos de presión y escape, específicos para la presión de altura y cabeza del biorreactor, fueron de 3 L/min y 1.8 L/min, respectivamente, para biorreactores de 10 L y 20 L. La velocidad de flujo de la bomba de alimentación de muestra Uniflux (velocidad de flujo de permeado de ATF) se fijó para coincidir con el flujo de permeado de TFF específico por cada experimento. El proceso 5XUF5XDF se detallan más adelante. Todos los materiales de 5XUF5XDF fueron adicionalmente purificados hasta el paso de cromatografía de CS, como se detalla más adelante.

Filtración de flujo directo 1 (DFF1) : Un aparejo de filtración se preparó y se sometió a autoclave un día antes de la cosecha viral. El dibujo del aparejo de filtro que muestra la cápsula de filtro de polipropileno de 1.2 µ?? de Polygard CN y la cápsula de filtro de 0.45 µp? de Durapore PVDF se detalla en la figura 9A, panel superior. Aproximadamente 20 L de SVH se bombearon a través del ensamble de aparejo cerrado a 1.5 litros por minuto (LPM) , y los filtros se cebaron con el SVH que pasó a través de ellos. El área de superficie de membrana total fue de 1800 cm2 para la cápsula de filtro de polipropileno de 1.2 µp? de Polygard CN y 1900 cm2 para la cápsula de filtro de 0.45 µ?? de Durapore PVDF. A una velocidad de flujo de filtración de 1.5 LPM, el flujo para los filtros de 1.2 µ??? y 0.45 µp\ fueron 500 litros por m2 de área por hora (LMH) y 474 LMH, respectivamente. La carga real de para los filtros de 1.2 µt? y 0.45 µta fue de 111 y 105 L/m2, respectivamente. El filtrado clarificado se recogió como DFF1 en una bolsa de 20 L. El filtrado de DFF1 se muestreó y se probó para infectividad por FFA, y para HCD y HCP residuales.

Filtración de flujo tangencial, ultrafiltración de 1, 5X (UF) /diafiltración de 5X (DF) (TFF1) : Aparejos de tubería para el patín de Uniflux se prepararon y se sometieron a autoclave el día anterior de la cosecha viral . Todos las extracciones de aparejo de tuberías se detallan en la figura 9A, panel inferior. Un patín de Uniflux™ se usó para realizar el paso de TFF1 mediante el uso de los siguientes parámetros de operación. El patín de Uniflux es un sistema automatizado de filtración mediante separaciones por membrana configurado para operar cartuchos de fibra hueca. Una fibra hueca dé corte de peso molecular de 500 kDa (MWCO) con un tamaño de lumen de 0.5 mm y área de superficie de membrana total de 4.80Ó cm2 y longitud de trayectoria de 60 cm se usó. Este proceso 'da una carga de DFF1 final de 41.7 L/m2 de área de superficie de membrana que está en el intervalo óptimo de 40 a 150 L/m2 para el proceso de TFF1 como se evaluó anteriormente. Para las operaciones 1-6, el mismo cartucho de fibra hueca se limpió después del proceso y se volvió a utilizar. Para las operaciones 7-9, una nueva fibra hueca se preparó y se usó para cada operación. Nuevos cartuchos de fibra hueca se prepararon al enjuagar con agua desionizada (DI) durante 90 minutos para remover el conservador de glicérol, sanear con NaOH 0.5 N durante 1 hora y equilibrar con regulador de pH IX SP hasta que el pH es 7.0 antes de cada operación. El proceso de 5XUF/5XDF entero se operó mediante el uso de un patín Uniflux programado a una velocidad de esfuerzo cortante de 16000 s"l y a un TMP constante de 1.4 kg/cm2.

El volumen entero de DFFl se procesó a través del patín Uniflux. Aproximadamente 5 L de DFFl se bombearon primero al tanque de procesamiento Uniflux. La línea de permeado se cerró inicialmente para establecer una velocidad de flujo de recirculación (retenido) de 8.6 L/min, que es equivalente a una velocidad de esfuerzo cortante de 16000s"l. Después de 5 minutos de recirculación, el proceso 5XUF se inició. La línea de permeado se abrió para permitir que impurezas menores de 500 kDa tales como HCP y ADN pasaran a través de la membrana, mientras que la válvula de control de retenido se cerró gradualmente para lograr un punto de fijación de presión de transmembrana (PTM) de 1.4 bar (1.42 kg/cm2) . El filtrado de DFFl restante se bombeó continuamente al tanque de procesamiento para mantener un nivel del tanque constante de 5 + 0.1 L hasta que el volumen entero de DFFl se alimentó al tanque. Después de que todo el material de ; DFFl se alimentó, la bomba de alimentación se detuvo y el retenido se siguió concentrando hasta que el volumen de retenido final alcanzó 4 L o 16 L de permeado y se colectó. El retenido de 4 L (5XUF) se diafiltró por intercambio de regulador de pH con 5X diavolúmenes de regulador de pH IX SP (20 L) y el proceso se operó a la velocidad de esfuerzo cortante y TMP como se describe antes. La línea de regulador de pH de diafiltración se abrió y la bomba de alimentación se inició nuevamente para bombear en regulador de pH IX SP. Los procesos 5XDF terminaron después de que 20 L de permeado de diafiltración se colecto. Al final de 5XDF, la válvula de control de retenido se abrió completamente y la línea de permeado se cerró nuevamente para permitir que la recirculación del sistema barriera cualquier virus recuperable que fuera débilmente unido sobre la superficie de la membrana de fibra hueca durante el proceso. El retenido, que contenía el producto de virus concentrado y diafiltrado, fue retenido y colectado en una bolsa de producto de 10 L. Para las últimas dos operaciones de purificación (8 y 9) , se introdujo un paso adicional de enjuague de regulador de pH después de la colección de retenido. Aproximadamente 1.5 L de IX SP se bombeó al tanque de procesamiento y se recirculó durante otros 5 minutos con la línea de permeado cerrada. Este enjuague de regulador de pH también se colectó en la misma bolsa de producto de 10 L y la bolsa se marcó como producto 5XUF 5XDF TFF1 y el volumen total fue de aproximadamente 5.5 L. El producto de TFF1 se muestreó para prueba para infectividad por FFA, y HCD y HCP. El cartucho de fibra hueca y sistema Uniflux se limpiaron después de cada operación del proceso con NaOH 0.5 N durante 1 hr mediante el uso de una velocidad de flujo de recirculación de 8.6 L/min.

Empaque de columna de sulfato de Cellufine (CS) BPG 100/200 y evaluación de columna: Resina CS se almacenó en 20% de etanol en aproximadamente 50% de suspensión. La cantidad de resina requerida para empaque de una columna BPG 100 o BPG 200 se calculó mediante el uso de una relación de compresión de 1.1. Las columnas BPGIOO y BPG200 fueron empacadas a la altura del lecho objetivo de 17.5 cm o volumen de lecho objetivo de 1.37 L y 5.50 L, respectivamente. La cantidad de resina como se calculó se preparó al realizar un intercambio de regulador de pH dos veces con regulador de pH IX SP, seguido por un intercambio de regulador de pH una vez con regulador de pH IX SP/1M NaCl.

Las columnas BPG 100 y BPG 200 se ensamblaron de conformidad con las instrucciones del fabricante. Una columna de vaciado preparó, se saneó con NaOH 0.5 N y se enjuagó con agua DI antes de usarse. El regulador de pH IX SP se usó para empacar mediante flujo la resina de CS en una columna BPG 100 y 500 cm/hr para generar una altura de lecho de columna de 15 - 20 cm (17.5 cm de objetivo) mediante el uso de un patín AKTAprocess™ . El patín AKTAprocess es un sistema de cromatografía de líquidos automatizado.

La suspensión de resina preparada en regulador de pH IX SP/1M NaCl se vació a lo largo de la pared lateral de la columna de vaciado y cualquier resina residual que quedaba en la pared se enjuagó con agua en una botella de chorro. La resina se dejó asentar a una altura de lecho de resina de por lo menos 10 cm por abajo del nivel del líquido. El adaptador superior se insertó en la columna sin alterar el lecho de resina y después se aseguró con tornillos/tuercas de retención. Una válvula de 4 puertos-2 vías (válvula 4-2) se instaló en la entrada de la columna. Los cuatro puertos diferentes se conectaron como sigue: 1 - Entrada de columna de sistema AKTAprocess 2 - Purga manual de columna (conectada a línea de desecho o recirculación) 3 - Conector de prueba de espiga (un seguro lure hembra usado para inyectar soluciones de sal alta para prueba de HETP) 4 - Entrada de columna BPG 100/200 La salida inferior de columna BPG100 se ¡conectó después a una salida de columna de sistema AKTA. Antes de bajar el adaptador de columna, las conexiones para la válvula 4-2, puertos 3 y 4 fueron verificados. El adaptador superior fue bajado lentamente al lecho de resina y un volumen pequeño de regulador de pH se purgó del puerto 3 de la válvula 4-2. Esto aseguró que la entrada del adaptador superior se purgara con regulador de pH.

La válvula 4-2 se cambió después para conectar los puertos 1 y 2. El regulador de pH IX SP se conectó a la entrada del sistema AKTA y el flujo se inició a 500 cm/hr primero para desviar la columna en este punto a través del puerto de purga de columna (puerto 2 en la válvula 4-2) . Cuando la velocidad de flujo alcanzó 500 cm/hr en el medidor de flujo, la válvula 4-2 se ajustó rápidamente de modo que los puertos 1 y 4 se conectaran. Cuando el lecho de resina alcanzó la altura del lecho objetivo, el cierre di adaptador se bajó al lecho de resina. Estos pasos se repitieron hasta que no hubo cambio en la altura del lecho de resina y el adaptador alcanzó el lecho de resina. El adaptador después se bajó 1-3 mm para comprimir el lecho de resina para evitar cualquier espacio superior entre el adaptador y el lecho de resina.

Antes de la evaluación de empaque, la columna CS se equilibró con IX SP para establecer una línea basal de conductividad estable. El empaque de. columna se evaluó al inyectar IX SP/1M NaCl al 2% del volumen de columna (CV) mediante el uso del conector de prueba espiga (puerto 3 a 4 en la válvula 4-2) . La columna se equilibró con el IX SP a una velocidad de flujo de 50 cm/hr (puerto 1 a 4 en la válvula 4-2) . El pico de conductividad apareció a aproximadamente 1/2 del CV. El pico de conductividad resultante en el software Unicorn se usó para evaluar la altura de placa de , columna (HETP) y asimetría de pico. Una vez que la HETP de , columna deseada se alcanzó, la columna fue saneada y almacenada NaOH 0.5N antes de usarse.

Cromatografía de sulfato de Cellufine (CS) : Aparejos de tubería para el patín AKTAprocess se prepararon y se sometieron a autoclave el día anterior a la cosecha ¡ viral . Todos las extracciones de aparejo de tubería se detallan en la figura 9B, panel superior. El proceso de cromatografía: entero fue automatizado por el método programado. : Todas las trayectorias de flujo del patín de aparejo AKTAprocess fueron manualmente equilibradas con IX SP antes de cada operación. Al inicio del proceso, la columna fue primero equilibrada con 3 volúmenes de columna (CV) de IX SP a una velocidad de flujo lineal de 150 cm/hr. El volumen entero de 5XUF 5XDF TFF1 se cargó después sobre la columna y el material no unido fue colectado como flujo pasante. Después! de la carga, la columna se lavó con 1 CV de IX SP a 150 cm/hr seguido por 2.5 CV de IX SP que contenía 50 U/mL de Benzonase y 2 mM de MgCl2 (IX SPB) a 50 cm/hr para un' tratamiento de Benzonase en columna. La velocidad de flujo lineal disminuida y el volumen de lavado con IX SPB calculado dejó que la resina de columna tuviera un tiempo de contacto de Benzonase de 50 minutos. La columna después se lavó con 1 CV de IX SP a 50 cm/hr para reemplazar el último tratamiento con Benzonase en columna de CV de IX SPB y 1 CV adicional de IX SP a 150 cm/hr. El virus unido fue eluido de la columna con 3 CV de regulador de pH IX SP/1M NaCl . El material eluido de CS fue colectado en una bolsa de 10 L y la colección del pico de elución 'se basó en la absorbancia de UV (lectura de A28o de 50 mAU a 50 mAU (0.1 OD a 0.1 OD) mediante el uso de una longitud de trayectoria de 5 mm de celda de flujo de UV. El volumen de elución de CS de columna BPG 100 es de aproximadamente 0.6 a 0.9 L. La columna y sistema AKTAprocess fueron saneados con NaOH 0.5 N después de cada operación de proceso. La carga de la columna, flujo pasante, lavado y eluido se muestrearon para prueba para infectividad por FFA, Benzonase, HCD y HCP.: Filtración de flujo tangencial 2, 8XDF (TFF2) : La preparación y uso de Flexstand se realizó de conformidad con las instrucciones del fabricante. Se usó una fibra hueca de CO de A 500 kDa con un tamaño de lumen de 0.5 mm, longitud de trayectoria de 60 cm y área de superficie de membrana total de 290 cm2. Con esta área de membrana de tamaño y el volumen de elución de CS descrito anteriormente, la carga final estaba en el intervalo de 20-50 L/m2 de área de superficie de membrana, que es el intervalo óptimo para el proceso TFF2 como s evaluó anteriormente. Una fibra hueca nueva se preparó en el Flexstand el día anterior de la cosecha viral . La fibra hueca se enjuagó con agua DI durante 90 minutos para remover el conservador de glicerol, se saneó con NaOH 0.5 N durante 1 hora y se equilibró con regulador de pH SP 100 hasta que se alcanzó un pH de 7.2.

El volumen entero de material eluido de: CS se procesó a través del sistema Flexstand. La línea de permeado se cerró inicialmente para permitir la recirculación de material eluido CS a una velocidad de flujo de alimentación de 0.5 L/min para generar una velocidad de esfuerzo cortante de 16,000 s"1. Después de la recirculación durante 5 minutos, la línea de permeado se abrió para iniciar la diafiltración . Al mismo tiempo, regulador de pH SP100 se bombeó a través de la línea de diafiltración y la válvula de control de retenido fue gradualmente para obtener una presión de transmembrana (TMP) , de 1.4 - 1.47 kg/cm2. El volumen del depósito de retenido se mantuvo constante a un volumen igual al volumen de elución de CS (intervalo de 0.4-0.8) para el proceso entero al controlar la velocidad de flujo de la bomba de la línea de diafiltración SP100. Antes de la operación 8, el material eluido , CS fue diafiltrado con 5X diavolúmenes de regulador de pH SP 100. El material eluido CS fue intercambiado por regulador de pH con los 8X diavolúmenes de regulador de pH SP100 para las operaciones 8-9 de purificación. Al final de la diafiltración, la válvula de retenido se abrió completamente y la línea de permeado se cerró nuevamente para permitir la recirculación del sistema durante 5 minutos antes de la recuperáción del producto. El producto diafiltrado se drenó en una bolsa de producto de 10 litros. El producto diafiltrado se muestreó para probar para infectividad por FFA, Benzonase, HCD y HCP. El cartucho de fibra hueca y sistema se limpiaron con NaOH 0.5 N durante 1 hora a una velocidad de flujo de recirculación de 0.5 L/min.

Filtración de flujo directo 2 (DFF2): El aparejo de filtro se preparó y se sometió a autoclave el día anterior de la cosecha viral. El trazo de aparejo de filtro se detalla en la figura 9B, panel inferior. La cápsula de membrana de poliéter sulfona de 0.22 usada tenía un área de superficie total de 150 cm2 para los operaciones 1-5 y 300 era2 para las operaciones 6-9. El paso de filtración estéril final DFF2 se realizó en el gabinete de bioseguridad .

Se añadió gelatina de glutamato-arginina concentrada (cGAG) al producto 8XDF a una dilución de 1:9. (v/v) para hacer la formulación final del virus purificado. El virus formulado se bombeó a través del ensamble de aparejo cerrado a aproximadamente 0.38 LPM para la cápsula de 300 cm2, y el filtro se cebó mediante el uso del producto final. El filtrado se colectó en botellas estériles de 2 L como el producto de volumen final. A una velocidad de flujo de filtración de 0.38 LPM, el flujo para los filtros de 300 cm2 fue 760 LMH . La carga de volumen formulada para el área de membrana estuvo en el intervalo de 20-150 L/m2. El producto de volumen final filtrado de 0.22 se muestreó para probar la infectividad por niveles de FFA, Benzonase, HCD y HCH. El producto de volumen final se puso en alícuotas en varias alícuotas de 1-, 10- y 100 mL y se congeló instantáneamente y se almacenó -80°C.

Análisis y cálculos de la muestra: Todas las muestras enviadas para análisis se congelaron instantáneamente y se almacenaron en -80°C. Las pruebas de HCP se realizaron esencialmente como se describe más adelante. La prueba de HCD se hizo mediante el uso de los métodos de PicoGreen y PCR esencialmente como se describe más adelante. El tamaño del HCD se analizó por el método de mareaje directo de psoralen-biotina (transferencia) y tinción directa en geles de agarosa. La prueba de cuantificación de Benzonase fue esencialmente como se describe más adelante. Todos los valores que sei son en ng o calculados por dosis se basan en el titulo 7 de loglO FFU por dosis (una dosis también se refiere comúnmente como 107 FFU) .

Determinaciones de ADN de célula hospedero residual : ADN de célula hospedero MDCK residual se cuantifica mediante el uso de un método de PCR en tiempo real de formato de micropozos . El objetivo de la prueba es una secuencia única dentro del gen de subunidad de citocromo oxidasa I (Cox I) de perros. Usando un conjunto de cebadores de oligonucleótido optimizados, un producto de PCR específico de MDCK Cox I se genera a partir de una plantilla y se detecta por colorante verde SYBR®. El formato de micropozos acomoda los calibradores de ADN a través de un amplio intervalo dinámico (1000 a 0.1 ng/mL) . Los controles positivos y negativos apropiados se incluyen en cada prueba. El ADN de la muestra de prueba se deriva mediante el uso de un kit de extracción de ADN. Las cantidades de ADN de muestra por arriba del límite inferior de cuantificación de 0.1 ng/mL se calcularán a partir de la curva estándar. La exactitud estará dentro de 75 a 125% con base en la recuperación del control de espiga. Los resultados reportados serán la cantidad de ADN promedio: de los replicados de extracción de la muestra que producen valores de recuperación de espiga de 50 a 150%. Estos análisis se: pueden realizar mediante el uso de kits comercialmente disponibles, tales como el kit Quant-iT PicoGreen (Invitrogen, Eugene, Oregon, Cat . No. P11496) , al seguir el proceso descrito en el kit.

Determinaciones de proteína de célula hospedera residual : La proteína de célula hospedera residual , (MDCK) (HCP) se determina por la prueba inmunoabsorbente ligada a enzima (ELISA) mediante el uso de un anticuerpo de, conejo biotinilado primario contra HCP (de un cultivo de MDCK no infectado) y conjugado de peroxidasa de rábano picante-estreptavidina (HRPO) . Los anticuerpos contra lisado de células MDCK son absorbidos sobre una microplaca de poliestireno . Una solución de bloqueo que contiene albúmina de suero de bovino se añade para saturar los sitios de unión excesiva. Cuando una dilución de muestra de artículo de prueba se añade a la placa revestida, la MDCK HCP, si está presente, se unirá a los anticuerpos revestidos. Un anticuerpo marcado con biotina primaria contra lisado de MDCK producido en conejos se añade a la placa, seguido por conjugado de estreptavidina marcado con peroxidasa de rábano picante (HRPO) . Finalmente, el sustrato de HRPO se añade y un lector de placa de ELISA se usa para medir la intensidad del producto final coloreado formado. La intensidad del color desarrollado es proporcional a la cantidad de MDCK HCP presente en el artículo de prueba. Una curva estándar se genera a partir del calibrador de lisado de célula MDCK de concentración de proteína conocida. A partir de una curva estándar, la concentración de proteína de lisado de células MDCK se determina .

Determinaciones de Benzonase residual: La actividad de Benzonase se determina por la capacidad para digerir ADN de esperma de arenque. El artículo de prueba, en duplicado, se compara contra una curva estándar de Benzonase, en la cual las lecturas se miden con un espectrofotómetro a 260 nm. El por ciento de recuperación de espiga (actividad de Benzonase) se calcula para determinar la U/mL de Benzonase neta. La actividad de Benzonase neta de un estándar de referencia de espiga sería entre 1.1 y 1.9 U/mL, el coeficiente de correlación sería > 0.995, la actividad en la dilución de la muestra sin espiga sería >0.7 U/mL para la actividad que ha de ser cuantificable y el por ciento de recuperación de espiga sería entre 80 y 120%.

Resultados y Discusión Todas las operaciones de SUB mostraron título de cosecha que variaba de 8.0 a 8.6 logi0 FFU/mL. Los resultados de recuperación de HCD y HCP usados para evaluar el rendimiento de cada una de las operaciones de purificación se resumen en la Tabla 28, Tabla 29 y Tabla 30. Las siguientes secciones se resumirán y describirán los cambios hechos para mejorar la eficiencia del proceso y la calidad del producto final. El desarrollo del proceso para los esquemas de purificación inicial y final se resume en la figura 10, que muestra los principales cambios de las operaciones de purificación temprana a las operaciones de purificación tardías . .

Tabla 28 Resumen de la Recuperación para las Operaciones de Purificación 1-9 VH-CCD: cultivo de células de cosecha de virus, VH-PD: purificación de cosecha de virus * la: tratamiento con Benzonase en bolsa de SVH bag; Ib: tratamiento con Benzonase en columna ?Prueba de FFA basada en Ant -NA en lugar de Anti-HA § fibra hueca de 14_0_0 cm2 (fibra hueca de 290 cm2 para el resto) # Filtro de 150 cm2 (filtro de 300 cm2 para operaciones 6 a 9) t 8X DF (5X DF para el resto) Varios de los cambios de proceso se indican en NEGRITAS Tabla 29 Resumen de HCD para Operaciones de Purificación 5 10 * la: tratamiento con Benzonase en bolsa; Ib: tratamiento con Benzonase en columna Prueba de HCD basada en PCR de tiempo real, la prueba de Picogreen también se realizó para las operaciones 2 a 9 Varios de los cambios de proceso se indican en NEGRITAS 15 Tabla 30 Resumen de HCP para las Operaciones de Purificación 2-9 5 * la: tratamiento con Benzonase en bolsa; Ib: tratamiento con Benzonase en columna Tabla 31 Aclaramiento de ADN Global para las Operaciones de Purificación 2-9 10 Tabla 32 Resumen de Benzonase Residual para las Operaciones de Purificación 2-9 10 * la: tratamiento con Benzonase en bolsa; Ib: tratamiento con Benzonase' en columna Varios de los cambios de proceso se indican en NEGRITAS Tabla 33 Resumen de Atributos de Proceso para Todas las Operaciones de Purificación 5 10 * la: tratamiento con Benzonase en bolsa; Ib: tratamiento con Benzonase en columna ""Prueba de FFA basada en Anti-NA en lugar de Anti-HA § Basado en título de VH-PD Varios de los cambios de proceso se indican en NEGRITAS SVH - Cambio en tratamiento con Benzonase de SVH a tratamiento con Benzonase en columna: En el proceso inicial, el tratamiento con Benzonase se realizó en el paso SVH para remover el ADN de la célula hospedera. Este paso de proceso implicó mezclar 20 L de SVH con 50 U/mL de Benzonase durante tres horas a 32°C antes de realizar el paso DF'Fl . En operaciones de purificación 1 a 4, se añadió Benzonase al paso SVH mientras que en las operaciones de purificación 5 a 9, el tratamiento con Benzonase se eliminó del paso de SVH y se realizó como un proceso de tratamiento con Benzonase en columna durante el paso de cromatografía de CS mediante; el uso de regulador de pH de cromatografía que contenía 50 Ú/mL de Benzonase y un tiempo de contacto de resina de 50 minutos. Como se muestra en la tabla 29, las operaciones de purificación 2 a 4, el nivel de HCD no se redujo notablemente en términos de ng por dosis entre SVH y DFF1 ; sin embargo, en las operaciones de purificación 5 a 9, el nivel de ' HCD se I redujo apreciablemente después del paso de cromatografía CS en columna con Benzonase. El nivel de HCD del producto volumétrico final analizado para PCR y PicoGreen se encontró que era mucho más bajo para las operaciones de purificación 5 a 9 (0.84 -1.42 ng/dosis) en relación con las operaciones de purificación 1 a 4 (3.25 a 40.49 ng/dosis) . Este cambio no sólo mejoró la calidad del producto final al reducir el HCD de volumen final a un nivel menor que o igual a 1 ng/dosis, sino también incrementó la eficiencia del proceso al reducir el tiempo de tratamiento con Benzonase y la cantidad de tiempo de Benzonase requerido. El impacto del tratamiento de Benzonase en columna se describirá adicionalmente en la sección de cromatografía de CS .

DFF1 : Como se muestra en la tabla 28, el paso DFF1 mostró buena recuperación (78.3-154.6%), excepto por la operación 4 (52.7%) . El paso DFF1 removió las células y residuos de células y usualmente no mostró pérdida en :título. Este paso también removió alguna cantidad de de HCD (Tabla 29) , pero no HCP (Tabla 30) . El área de membrana de ambos filtros (1.2 y 0.45 µp?) usados para filtrar 20 L de SVH se basó en la capacidad de ambos filtros y se determinó previamente de un estudio de Vmáx/Pmáx a escala descendente mediante el uso de un factor seguro de 2.6 y 1.5, respectivamente. Para una velocidad de flujo de filtración de 1.5 LPM, el flujo para los filtros 1.2 µ?t? y 0.45 µp? fueron 500 LMH y 474 LMH, respectivamente. La carga de SVH real para los filtros de 1.2 y 0.45 µ?? fueron de 111 y 105 L/m2, respectivamente .

TFF1 - Cambios en preparación y método de recuperación para mejorar la recuperación de pasos de TFF1 : Las primeras seis operaciones de purificación mostraron una pérdida gradual en recuperación de potencia en el paso TFF1 para cada operación de 107.2% a 30.3% (Tabla 28). Para operaciones de purificación 1 a 6, el cartucho de fibra hueca de TFF1 se limpió con NaOH 0.5 N y se volvió a utilizar después del proceso. No se sabe si la eficacia de limpieza del cartucho de fibra hueca fue suficiente para remover completamente las capas de gel después de cada operación y esto podría dar por resultado una disminución en recuperación de virus después del paso de proceso. Para generar una recuperación de paso más consistente, se implementaron tres cambios principales al protocolo existente que empezó con operación de purificación 7. Primero, una nueva fibra hueca se usó para cada operación para eliminar la posibilidad de un limpieza insuficiente de la fibra hueca. Segundo, el retenido concentrado se recirculó en el cartucho de fibra hueca durante 5 minutos con la válvula de retenido abierta y válvula de permeado cerrada antes de que el producto de TFF1 se colectara. Esto removió cualquier capa de gel potencial que se pudo haber formado sobre la superficie de la membrana durante el proceso de concentración y diafiltración y permitió la recuperación. Tercero, un paso de enjuague de regulador de pH adicional se realizó con la misma velocidad de flujo de recirculación y un tiempo (5 minutos) para recuperar virus residual en el cartucho de fibra hueca y el enjuague de regulador de pH se colectó junto con el producto. Después de estos cambios implementados , la recuperación de pasos de TFF1 permaneció consistentemente alta, aproximadamente 75-80%, para las operaciones de purificación 7 a 9 (Tabla 28) . La figura 11 muestra una curva de flujo típica para el proceso de TFF1 de realizarse a esfuerzo cortante de 16000 s"1 y TMP constante a 1.4 kg/cm2 (operación de purificación 8) . El flujo disminuyó a medida que la solución de virus se volvió más concentrada (5XUF) y continuó disminuyendo cuando el paso de diafiltración empezó, pero incrementó ligeramente hacia el final del paso de diafiltración (5XDF) . El flujo varió de 70-100 LMH para todas las operaciones de purificación y pareció estar relacionado con el título del virus y la turbidez del filtrado de DFF1. El incremento ligero en el flujo al final del paso de diafiltración probablemente se debió a la remoción adicional de impurezas de HCP y HCD al final de 5XDF . Como se muestra en la tabla 30, la mayor parte (80-90%) de las impurezas ; de HCP fueron removidas en el primer paso de TFF (TFF1) , debido a que cualquier o HCP menor de 500 kDa sería removido : en el permeado. La terminación del intercambio de regulador de pH de cosecha de virus al IX SP se mostró en el trazo de conductividad disminuido de 12.5 mS/cm a 1 mS/cm al final del proceso 5XDF (figura 11) . \ Tratamiento con Benzonase en columna de CS para incrementar la remoción de HCD: Los experimentos iniciales se diseñaron mediante el uso de una columna de CS a [ escala pequeña con altura de lecho de 10 cm y una concentración de carga de virus de aproximadamente 9.0 logi0 FFU por mL de resina. A medida que el proceso se mejoró, la concentración de carga de virus por mL de resina, la velocidad de flujo' lineal y la altura del lecho de columna fueron llevadas linealmente a escala. En un título de carga de 9.0 log10 FFU/mL de resina, un volumen de lecho de 4 L de CS se requeriría para procesar 20 L de cosecha del virus estabilizado con un título de cosecha de 8.3 logio FFU/mL. En operaciones de desarrollo 1 a 5, 4 L de resina CS se empacaron en columna BPG 200 (diámetro interior de 20 cm (d.i.)) a una altura de lecho final de 12.5 cm. Durante el empaque de la columna BPG 200 a 200 cm/hr, la retropresión excedió la presión de empaque recomendada de 2.5 bar (figura 12) . El estudio de capacidad de unión dinámica se realizó y eso mostró que la resina de CS realmente podría unirse a aproximadamente 9.7 logio FFU/mL de resina bajo las condiciones de empaque anteriormente descritas. Como tal, a una carga de virus de 9.5 log10 FFU/mL de resina, sólo 1.3 L de resina CS se requeriría para procesar 20L de cosecha de virus estabilizado con un título de cosecha de 8.:3 log10 FFU/mL.

Una columna BPG 200 empacada con 1.3 litros de resina CS dio por resultado una altura de lecho de columna final de 4.5 cm. Una reducción drástica en la altura de lecho de columna da una resolución más baja comparada con la 'columna empacada con una altura de lecho de 15-29 cm (típico para procesos de gran escala) . El inicio de la operación de purificación 6, una columna de BPG 100 se empacó a una ' altura de lecho objetivo de 17.5 cm +/- 2.5 cm para dar un volumen de columna de CS 1.4 litros. Para la columna de BPG 100, una velocidad de flujo de empaque de 500 cm/hr se usó y la presión de empaque resultante no excedió el límite de presión de empaque recomendada de la resina, que es diferente a la presión de empaque para la columna BPG 200 (figura 12) .

Al comparar las operaciones de purificación 6 a 9 (BPG 100) con las operaciones de purificación 2 a 5 (BPG 200) , una recuperación de paso de material eluido de CS similar que promedio 54% y 59%, respectivamente, cuando la carga real se incrementó de 8.4-8.9 logi0 FFU/mL de resina (columna BPG 200) y 9-9.3 logio FFU/mL de resina (columna BPG 100) (tabla 28). En términos de rendimiento de columna para remoción de HCD como se realizó con el uso del tratamiento con Benzonase en columna, las operaciones de purificación 6 a 9 (BPG 100) mostraron niveles de HCD de material eluido de CS comparables (0.3 - 1.5 ng/dosis) al nivel de HCD del material eluido de CS (1.2 ng/dosis) en la operación de purificación 5 (BPG 200) (Tabla 29) . Aunque el rendimiento de columna fue similar, la reducción del tamaño de columna mejoró la eficiencia del proceso al reducir el volumen de material eluido de CS y preparación de regulador de pH y será importante cuando se mueva a fabricación a escala mayor. La figura 13 muestra un cromatograma típico para el pico de virus individual eluido de la columna CS BPG 100 (operación 9) .

Como se muestra en la tabla 31, el aclaramiento de HCD global para tratamiento con Benzonase de columna (operaciones 5 a 9) fue mejor que el tratamiento con Benzonase en modo de lotes (operaciones 2 a 4. El porcentaje de HCD permaneció después de que la purificación del virus para el tratamiento con Benzonase varió de 0.15 - 3.4% (operaciones 2 a 4), mientras que el porcentaje de HCD que permaneció después de la purificación de virus para el tratamiento con Benzonase en columna varió de 0.02 - 0.15% (operaciones 5 a 9) . El tratamiento con Benzonase en columna en el paso CS se mostró que tiene una remoción de HCD global más alta que el tratamiento con Benzonase de modo por lotes en el paso SVH, lo que da por resultado un nivel de ADN inferior del volumen final .

Existen varias ventajas para usar tratamiento con Benzonase en columna comparado con el tratamiento con Benzonase en modo de lotes. Primero, la eficiencia del proceso se incrementa al combinar dos pasos de proceso en uno y al remplazar las 3 horas del tratamiento con Benzonase en el paso de SVH por un tratamiento de Benzonase de 1 hora para leí paso en columna de CS . Segundo, la cantidad total de Benzonase requerido en el proceso es reducida. El tratamiento con Benzonase en modo de lotes requiere un millón de unidades de Benzonase para una cosecha de virus de 20 litros, mientras que el tratamiento con Benzonase en columna sólo requiere 200 000 unidades de Benzonase. Por lo tanto, el tratamiento con Benzonase en columna reduce la cantidad total de Benzonase necesaria en cinco veces.

TFF2- Incremento de volumen de diafiltración sobre TFF2 para incrementar aclaramiento de Benzonase: Como se muestra en la tabla 28, la recuperación del paso para TFF2 para todas las 9 operaciones de purificación fue consistentemente por arriba de 64% (64-150.8%). En la operación 3, el volumen de elución de CS fue de 3.2 litros. Con el uso de una fibra hueca de 290 era2, la carga de material eluido de CS sobre la membrana de fibra hueca se incrementó a 110 L/m2 y el ^tiempo de proceso total fue de 6 horas. Una membrana de fibra hueca de 1400 cm2 se usó en las siguientes dos operaciones consecutivas para evitar el tiempo de ¡proceso largo y para mantener la concentración de carga aproximadamente 20" - 50 L/m2 estabilizada en estudios a escala pequeña. Sin embargo, al empezar con la operación 6, el tamaño de columna se cambio de 4 litros a 1.4 litros, y el volumen de elución también disminuyó a no más de 0.9 litros. Esta reducción en volumen de material eluido fue directamente proporcional al tamaño de la columna. En las operaciones 6 a 9, un cartucho de fibra hueca de 290 cm2 se usó para mantener una concentración de carga de material eluido de CS a 20 - 50 L/m2. La figura 14 muestra una curva de trazó fijo del proceso de TFF2 para operación de purificación 8, que se realizó a 16000 s"1 de velocidad y esfuerzo constante y una TMP constante de 1.47 kg/ era2. El flujo de TFF2 fue razonablemente estable a lo largo del proceso de diafiltración lo que indica que las condiciones de operación no causaron , ningún ensuciamiento. El flujo varió de 80-110 LMH para todas las operaciones .

El volumen de intercambio de regulador de pH de TFF2 también se incrementó de 5 diavolúmenes a 8 diavolúmenes para incrementar el aclaramiento de Benzonase. Como se muestra en la tabla 32, cuando el proceso cambió a un paso de tratamiento con Benzonase en columna (operación 5) , el nivel de Benzonase de material eluido de CS fue de >75 ng/mL, lo que indica que Benzonase se une a la columna de CS y se co-eluye con el producto de virus. La unión de Benzonase a la columná de CS también fue confirmado al evaluar las muestras del flujo pasante de 1 CV a 4 CV después de IX SPB. Las muestras de flujo pasante su muestra que tienen niveles de Benzonase bajos (tabla 32) . Por lo tanto, el volumen de intercambio de regulador de pH de TFF2 se incrementó de 5 diavolúmenes a 8 diavolúmenes en operaciones de purificación 8 y ' 9 para incrementar el aclaramiento de Benzonase a un nivel por abajo del límite de detección (LOD) . Como resultado, el nivel de Benzonase se redujo 4-5 veces adicional al incrementar la diafiltración de 5XDF a 8XDF. Este cambio redujo el nivel de Benzonase en el volumen final a por abajo del LOD, que es menor que 0.1 ng/dosis (Tabla 32) .

DFF2 - Incremento del tamaño del filtro para filtración estéril final del volumen final: Como se muestra en la tabla 28, la recuperación del paso promedio con el uso de 150 cm2 y 300 cm2 0.22 µt? de filtro final son 88.3-111.1% y 65.8-108%, respectivamente. El filtro de 300 cm2 se escogió como el tamaño de filtro final para evitar cualquier taponamiento de la corriente de alimentación durante la filtración estéril final en las operaciones de campaña de CTM. El área de membrana usada para filtrar 0.6 - 1 L de volumen final se basó en estudios a escala pequeña que previamente establecieron que la carga estaba en el intervalo de 20 -150 L/m2. La velocidad de flujo de filtración fue de 0.38 LPM para los filtros de 300 cm2 y el flujo para los filtros fue; de 760 LMH. La carga real para los filtros fue de 20-33 L/m2, que está dentro del intervalo determinado a partir de los estudios a escala pequeña.

Cambio de tiempo de cosecha de proceso corriente arriba (SUB)de 3 dpi a 2 dpi: Al empezar con la operación de purificación 8, el tiempo de cosecha viral se cambio de 3 dpi (cosecha de 60 - 65 horas) a 2 dpi (cosecha de 48 horas) . El tpitulo viral pico se observó a dpi de 48 horas cuando una entrada viral de 0.001 a 0.003 FFU/célula se usó. El cambio en el tiempo de cosecha dio por resultado la reducción en el nivel de HCD y HCP de partida como se muestra en el paso SVH para operaciones de purificación 8 y 9 (Tabla 29 y Tabla 30) . Este cambio también dio por resultado un nivel de impureza más bajo de HCD y HCP en el producto de volumen final (Tabla 29 y Tabla 30) y por lo tanto mejoró la calidad del producto final.

El proceso de purificación implementado dio buena recuperación y pureza viral : El proceso implementado completo se demostró en las operaciones de purificación 8 y, 9. La recuperación del título global promedio de estas dos operaciones de 43.4%, con un nivel de impureza de HCD promedio de 0.72 ng/dosis (por PicoGreen) y 0.1 ng/dosis (por PCR) , nivel de impureza de HCP de 0.21 g/dosis y nivel de impureza de Benzonase 0.0035 ng/dosis, todos los cuales están por debajo de las especificaciones de volumen purificadas.

En resumen, se hicieron varios cambios al proceso de purificación inicial para mejorar la eficiencia del proceso y la calidad del producto final que incluía, 1) la cosecha viral se cambio de 3 dpi a 2 dpi para obtener un nivel de impureza de HCD y HCP en SVH, 2) el paso de tratamiento de HCD se cambió de tratamiento con Benzonase en modo de lote a SVH a tratamiento con Benzonase en columna con CS para mejorar la degradación y remoción de HCD global, 3) la concentración de carga objetivo de la resina de CS se incrementó de 9.0 logi0FFA/mL a 9.5 logioFFA/mL, lo que reduce el tamaño de columna de 4 L a 1.4 L, 4) el volumen de intercambio de regulador de pH de formulación final para TFF2 se incrementó de 5 diavolúmenes; a 8 diavolúmenes para remoción de Benzonase mejorada, y 5) la carga de filtración estéril final se redujo a la mitad a un promedio de 25 L/m2 para evitar cualquier taponamiento durante la filtración final en las operaciones de CTM.

El proceso de purificación final en la figura 10 y los datos para todas las operaciones de purificación se resumen en la tabla 33. La recuperación de virus global promedio basada en el título para el proceso de purificación mejorado fue 43.4%, con un nivel de impureza promedio de 0.0035 ng/dosis para Benzonase, 0.72 ng/dosis (PicoGreen) y 0.1 ng/dosis (PCR) para HCD y 0.19 µg/dosis para HCP . Esos niveles de impureza están por debajo de las especificaciones. Los volúmenes finales para las operaciones de purificación 6 a 9 se analizaron por análisis de tamaño de ADN usando un método de mareaje directo con psoralen-biotina (transferencia) y un método de tinción directa (gel de agarosa) . La; señal predominante en estos análisis mostró una distribución de tamaño de ADN de = 500 pb (no se muestran datos) .

Proceso de Purificación Modificado para Influenza Producida por Cultivos de Células Modificaciones adicionales que se pueden hácer al proceso de purificación de gran escala robusto descritos en el ejemplo provisto en la sección 8.6 se delinean en la figura 10b y se describen con detalle más adelante. En particular, los pasos de cosecha, clarificación y TFF1 se pueden acoplar para evitar la necesidad de un tanque de cosecha, reducir el número de manipulaciones y mejorar el tiempo de procesamiento global. Para una operación de acoplamiento más suave, la operación de TFF1 se puede cambiar de TMP constante a flujo constante. Además, o alternativamente, se usa TMP inferior (inferior a 1.4 kg/cm2, por ejemplo entre aproximadamente 0.7 kg/cm2 (12,000 S"1) y aproximadamente 1.0 kg/cm2 (16,000' S"1) ) . Un paso de 2X UF se puede añadir al paso de TFF2 para disminuir el volumen masivo. Opcionalmente , un 10XUF se usa en TFF1 para duplicar potencialmente la carga en todos los pasos de purificación subsecuentes.

La tabla 34 resume los cambios de parámetro, recuperación y HCD para varias operaciones de purificación. Estas operaciones utilizaron virus producido en MediV SFM 110 sin intercambio de medio esencialmente como se describió antes (véase el ejemplo provisto en la sección 8.1) . Todas las operaciones de purificación se realizaron esencialmente como se describe para el proceso Ib (véase el ejemplo provisto en la sección 8.6) excepto por lo indicado más adelante. Operaciones #25, #27 y #30 se realizaron al acoplar los pasos de cosecha, DFF y TFF1. Para estas operaciones, TFF1 se operó a flujo constante ( (50 LMH, velocidad de esfuerzo cortante de 12,000 s"1) . Las operaciones #24, #26 y #31 se realizaron sin acoplamiento de los pasos de cosecha, DFF y TFF1. Para estas operaciones, TFF1 se operó a TMP inferior (0.7 kg/cm2 de velocidad de esfuerzo cortante de 16,000 s"1) . La carga viral condicionada se dividió para el paso de CS y se procesó ya sea a 2 mM de MgCl2 o 10 mM de MgCl2. El análisis de ADN mostró que al incrementar la concentración de MgCl2 no se redujo el tamaño de ADN (no se muestran datos) . Sin embargo, en un caso, el rendimiento se redujo (véase tabla 34) .

La tabla 35 resume los cambios de parámetros, recuperación y HCD para varias operaciones de purificación de virus producidos en MediV SFM 105 con intercambio de medios. Esas operaciones utilizaron virus producidos esencialmente como se describe en la publicación de patente internacional WO 08/105931 (en particular, ejemplo 12) . Todas las operaciones de purificación se realizaron esencialmente como se describe para el proceso Ib (véase el ejemplo provisto en la sección 8.6) excepto como se indica más adelante, las operaciones #40, #41 y #42 se realizaron, al acoplar los pasos de cosecha, DFF y TFF1. Para estas operaciones, TFF1 se realizó ya sea a un flujo constante ( (35 LMH, velocidad de esfuerzo cortante de 12,000 s"1) a una TMP constante (0.7 kg/cm2 velocidad de esfuerzo cortante 10 de 12,000 s"1) . Las operaciones con flujo constante se realizaron a pequeña escala y se procesaron solo para el paso de CS . La operación #43 se realizó sin acoplar los pasos de cosecha, DFF y TFF1.

Juntos, estos estudios indican que el material del proceso MediV SFM 110 (no MX) y MediV SF 105 (con MX) mostró características de Flux/TMP similares. El uso de esfuerzo cortante más bajo (12,000 S-I) , TMP más baja (0.7 kg/cm2) y flujo más bajo (35 LMH) no dio por resultado un tiempo de proceso de TFF de paso más largo sino que el tiempo de proceso global se puede acortar cuando el acoplamiento de los pasos de cosecha, DFF y TFF1 es implementado . La concentración final de HCD para estas operaciones de purificación se vio que estaba entre 0.01-0.6 ng/dosis que es comparable con la obtenida en el proceso Ib descrito anteriormente. Los rendimientos globales fueron generalmente por arriba de 30%.

Tabla 34 Resumen de HCD y Rendimiento para Cambios de Parámetro Adicionales sin MX Tabla 35 Resumen de HCD y rendimiento para cambios de parámetro adicionales con MX *operaciones a flujo constante se realizaron a escala pequeña y se procesaron solo al paso de columna de CS **#40 se mantuvo después de TFF1 durante el fin de semana debido a la cosecha del viernes j Evaluación de Resinas para Purificación de Virus de Influenza Sulfato de Cellufine (CS) es un gel de afinidad que se une al virus y el virus se eluye de la columna mediante el uso de un regulador de pH de fosfato de sacarosa con alto contenido de sal (SP) . Como se describió antes, el gel de Sulfato de Cellufine se puede usar en el paso de cromatografía en columna para remover adicionalmente ADN de célula hospedera (HCD) , impurezas de proteína de célula hospedera (HCP) y contaminante de Benzonase® introducidos durante el paso de lavado de columna (tratamiento con Benzonase en columna) para la degradación de ADN de célula hospedera durante la fabricación de materiales de vacuna adecuados para ensayos clínicos. La capacidad de unión para el gel CS es de 9.72 logio FFU por mL de gel determinado por el estudio de capacidad de unión dinámica con cepa de virus ca B/Malaysia/2506/04 (no se muestran datos) . Con base : en la capacidad de unión del gel, los volúmenes de columna calculados para un proceso basado en cultivo de células de vacuna trivalentes 400-L y 1600-L son 25 L (40 cm x 20 cm) y 100 L (80 cm x 20 cm) , respectivamente. Con la consideración de 20-30% de pérdida de las partículas infecciosas totales en la primera filtración de flujo directo (DFF1) y paso de filtración de flujo tangencial (TFF1) antes de la carga de la columna de CS, cada tamaño de columna objetivo a cada ¡ escala de proceso se dejaría que purificara el título de cosecha viral hasta 8.7 log10 FFU/mL sin exceder la capacidad del gel de CS . Sin embargo, la identificación de un gel de cromatografía alternativo con capacidad de unión a virus más alta proveería un incremento en la capacidad de producción global sin la necesidad de escala ascendente de purificación adicional.

El siguiente ejemplo detalla la evaluación de seis resinas de afinidad adicionales (designadas resinas A-F) mediante el uso del proceso de purificación esencialmente como se detalló antes (véase ejemplo provisto en la sección 8.6) . En resumen, mediante el uso de ca B/Malaysia 2506/04 como la cepa modelo, la cosecha viral (VH) w estabilizada por el regulador de pH de sacarosa-fosfato (SP) fue clarificada por filtros de cápsula de polipropileno de 1.2 µp? (PP) y polivinilideno (PVDF) de 0.45 pm. La VH clarificada fue acondicionada por ultrafiltración (UF) 5 veces (5X) y diafiltración (DF) 5 veces (5X) con regulador de pH de sacarosa-fosfato (SP) mediante el uso de un cartucho de fibra hueca de corte de peso molecular de 500 kDa. El virus concentrado y diafiltrado fue después purificado sobre las columnas de cromatografía de prueba para remover adicionalmente impurezas de ADN de la célula hospedera (HCD) , proteína de célula hospedera (HCP) y contaminante de Benzonase introducidos durante el paso de lavado de columna (tratamiento con Benzonase en columna) para la degradación de ADN. de la célula hospedera. También se realizaron comparaciones directas entre las nuevas resinas de rendimiento más alto y el ¡gel CS actualmente utilizado. En resumen, se usaron diferentes lotes de cosecha viral para evaluar el rendimiento de purificación de las resinas de prueba C y D comparado son sulfato de Cellufine. La evaluación incluye el rendimiento de, paso, capacidad de unión, y los niveles de impurezas (v.gr. , HCD, HCP y Benzonase") . Mediante el uso de este tipo de evaluación, el rendimiento de nuevas resinas se puede evaluar eficientemente .

Materiales y Métodos Materiales, reactivos y equipo: Otros materiales, equipo y reactivos que tienen un desempeño similar pueden ser fácilmente sustituidos. 1. Lotes de cosecha de virus (ca B/Malaysia 2506/04, ca A/ isconsin 67/05, ca A/Solomon Islands 03/06, ca A/Wisconsin67/05 , ca A/South Dakota/6/2007 ) usados en estos estudios se cosecharon a 48-68 horas después de la infección, los títulos de cosecha eran entre 8.7-8.9 loglO FFU/mL. La cosecha viral clarificada se procesó con material de ultrafiltración (UF) 5X y diafiltración (DF) 5X por filtración de flujo tangencial (TFF1) todo realizado esencialmente como se detalla en la sección 8.6 anterior, con títulos finales de 8.6-9.4 loglO FFU/mL como las cargas de columna. 2. kits Quant-iT PicoGreen dsDNA (Invitrogen, Eugene, Oregon, Cat . No. Pl 1496) 3. Regulador de pH de IX SP, pH 7.0 (Hyclone, Ltd, Logan, UT, Cat. No. SH3 Al 577.03) o preparado con 6.5 mM de fosfato dibásico de potasio, 4.5 mM de fosfato monobásico de potasio, y 218 mM de sacarosa. Para 1 L de IX SP, 6.5 mL de solución 1 M de fosfato dibásico de potasio, 4.5 mL de solución 1 M de fosfato monobásico de potasio, 74.62 g de sacarosa se mezclaron y se disolvieron en H20 a un volumen final de 1 L. El pH se ajustó a 7.0 con H3P04 1 N o KOH 1 N si es necesario 4. Regulador de pH de IX SP, 1 M NaCl se preparó con 9.5 mM de fosfato dibásico de potasio, 1.5 mM de fosfato de potasio monobásico, 218 mM de sacarosa, y 1 M de NaCl. Para 1 L de IX SP, regulador de pH de 1 M de NaCl, 9.5 mL de solución 1 M de fosfato dibásico de potasio, 1.5 mL de solución 1 M de fosfato monobásico de potasio, 74.62 g de sacarosa, y 58.44 g de cloruro de sodio (NaCl) se mezclaron y se disolvieron en H20 a una volumen final de 1 L . El pH se ajustó a 7.0 con H3P04 1 N o KOH 1 N si es necesario 5. Solución de IX SPB contiene 2 mM de MgCl2 y 50 U/mL de Benzonase. Para preparar 50 mL de IX SPB, 100: µL de MgC12 1 M y 7.65 µL de Benzonase (327 U/mL) se añadieron a 49.9 mL de IX SP 6. Fosfato dibásico de potasio, K2HP04 (Sigma, St .

Louis, Missouri, "Cat. No. P3786) 7. Fosfato monobásico de potasio, KH2P04 (Sigma, St . Louis, Missouri, Cat. No. P5379) 8. Fosfato dibásico de potasio K2HP04 1 M (174.18 g) se disolvió en H20 a un volumen final de 1 L 9. Fosfato monobásico de potasio KH2P04 1 M (136.09 g) se disolvió en H20 a un volumen final de 1 L 10. Sacarosa (EMD, Gibbstown, New Jersey, Cat. No. 1.07653.9012) 11. NaCl (EMD, Gibbstown, New Jersey, Cat. No. 7760) 12. MgCl2 1 M (Sigma, St . Louis, Missouri, Cat. No.

M1028) 13. Benzonasee (EMD, Darmstadt, Alemania, Ca't . No. 1.07653.9012, 353 U/µ?) 14. NaOH 0.5 , diluido de NaOH 10 N (VWR, West Chester, Pennsylvania, Cat.No. VW3247-7) : 15. Filtros de 0.22 µ? (Millipore, Billerica, Massachusetts, Cat No. SCGPUl IRE) [ .16. Botellas modificadas con Polietilen tereftalato-glicol (PETG) (Nalgene, Rochester, New York) : 1 L (Cat. No. 2019-1000) ; 2 L (Cat. No. 2019-2000) ; 125 mL (Cat. No.: 2019- I 0125) ; 250 mL (Cat. No. 2019-0250) ', 17. Tubos cónicos (Corning, Corning, New York) : 15 mL (Cat. No. 430052) ; 50 mL (Cat. No. 630829) ; i 18. Filtro Polygard CN Opticap XL5 de de 1.2 im (Millipore Corporación, Billerica, Massachusetts, Cat. No. K 12A05HH1) ; 19. Filtro Durapore Opticap XL4 de 0.^45 ym (Millipore Corporación, Billerica, Massachusetts, Cat. No. KPHLA04HH3) 20. 20 L Bag (Hyclone, Ltd, Logan, UT, Cat. No. SH30712.03) ; ! 21. Bolsa de 50 L (Hyclone, Ltd, Logan, UT, Cat. No. SH30712.04); ' 22. Fibra hueca, 500 kDa, 4,800 cm2 (GE Healthcare, Uppsala, Suecia, Modelo No. UFP-500-C-6A) ; ¡ 23. Fibra hueca, 500 kDa, 1, 400 cm2 (GE Healthcare, Uppsala, Suecia, Modelo No. UFP-500-C-3x2 MA) ; 24. Columnas Omnifit (0.66 cm x 20 cm y 1 cm x 20 cm) (Bio-Chem Valve Inc. Coldhams Lañe, Cambridge) 25. Columna XK-16 de 16 mm x 20 cm (GE Healthcare, Uppsala, Suecia) 26. Akta Explorer 100 (GE Healthcare, Uppsala, Suecia) 27. Lector de microplacas SpectraMax GEMINI EM (Molecular Devices, Sunnyvale, California) : 28. Medidor de pH Thermo Orion (Thermo Scientific, altham, Massachusetts) ; 29. Medidor de conductividad CDM210 (Radiometer Analytical, Lyon, Francia).

Preparación de resinas de prueba: Se almacenaron resinas en etanol al 20%. La cantidad deseada de (v.gr., 42 mL) de una suspensión de resina al 50% se aplicó con pipeta a un tubo cónico de 50 mL y se hizo girar a 1000 rpm durante 10 minutos. El líquido se removió y la resina se resuspendió con 21 mL de regulador de pH de empaque (IX SP+ NaCl 1 M, pH 7.0) . El intercambio de la resina al regulador de pH de empaque se repitió tres veces.

Preparación de una columna de prueba XK-16 (16 mm x 10 cm) o resina CS : Todas las partes de una columna vacía se limpiaron con agua y se secaron antes de empacarse. La columna se ensambló de conformidad con las instrucciones del fabricante. El adaptador de columna se insertó en la parte inferior de la columna y el tubo del adaptador se conectó con una jeringa de 30 mL. La columna se colocó verticalmente y se sujetó sobre una plataforma. Con 10 mL del regulador de pH de empaque se llenó la columna y la jeringa inferior se jaló hasta que 2 cm del regulador de pH quedaron en la columna. La resina de prueba preparada se vació en la columna sin introducir burbujas de aire y se asentó por gravedad. Después de que se asentó la resina, la columna se llenó con el regulador de pH de empaque . El adaptador superior se insertó cuidadosamente en la columna sin introducir burbujas dé aire. La columna después se conectó al sistema AKTA Explorer y se empacó a 500 cm/hr (16.7 mL/min) durante aproximadamente 20 minutos con el regulador de pH de empaque hasta que la altura del lecho de columna no cambia. El adaptador superior se ajustó 1-2 mra en la parte superior del gel . La altura del lecho, de columna empacada final fue de 10 cm, que .es igual a un volumen de columna de 20 mL . Una columna Omnifit de tamaño más pequeño (0.66 cm x 17 cm) , que es igual a 5.8 mL de gel cuando se empacó se usó para estudios de capacidad de unión dinámica con resinas de prueba y geles de CS . La columna de resina de prueba empacada fue saneada con NaOH 1 N durante 1 hora y re-equilibrada con regulador de pH IX SP a pH 7.0. La columna CS empacada fue saneada con NaOH 0.5 N durante !l hora y re-equilibrada con regulador de H IX SP a pH 7.0.

Preparación de la Ultrafiltración 5X y Diafiltración 5X (5X UF/5X DF) Carga de virus condicionada para resina de prueba y columnas de sulfato de Cellufine: 15 o 20 L de la cosecha de virus estabilizado con IX SP de un biorreactor de 15 L o un biorreactor de 30 L SUB (los detalles del crecimiento de células MDCK y producción de virus se describen en la publicación de patente internacional O 08/105931, véase, en particular, ejemplo 12) se filtró a través de una cápsula de pre-filtro de 1800 cm2 1.2 ym y una cá'sula de filtro de 1900. cm2 0.45 µp? a una velocidad de flujo de 1.5 L/min y se colectó en una bolsa Hyclone de 20-L. La filtración de flujo directo (DFF1) se purificó después mediante el uso de filtración de flujo tangencial (TFF1) por ultrafiltración de 5 veces (5X UF) y diafiltración de 5 veces (5X DF) con regulador de pH IX SP mediante el uso del sistema Flexstand esencialmente como se describe para el proceso mejorado anterior (véase el ejemplo provisto en la sección 8.6) . El paso de TFF1 se realizó a una velocidad de esfuerzo cortante de 16000 s"1 y una TMP a 1.4 kg/cm2 mediante el uso de un 1400 cm2 or a 4800 cm2 cartucho de fibra hueca de corte de peso molecular de 500-kDa para la mayoría de los lotes, cosecha viral ca B/Malaysia lote #1 se realizó a una velocidad de esfuerzo cortante de 12000 s"1 y TMP a 1.0 kg/cm2 y cosecha viral de ca B/Malaysia lote #2 se realizó a una velocidad de esfuerzo cortante de 12,000 s"1 y flujo constante de 70 LMH. La solución de virus de 5X UF/5X DF, se puso en alícuotas a 100 mL por botella. Todas las botellas se congelaron en hielo seco y se almacenaron a -80°C como la resina de prueba y material de carga de columna CS .

Condiciones de operación de columna de resina de prueba y sulfato de Cellufine: Los parámetros operacionales para las operaciones de columna de resina de prueba (16 mm x 10 cm) fueron esencialmente las mismas que se detallaron antes para la columna BPG 100. En resumen, la columna primero se equilibró con 3 volúmenes de columna (CV) de IX SP y la cantidad deseada de solución de virus de 5X UF/5X DF sé cargó en la columna a una velocidad de flujo de 150 cm/hr (5 mL/min para columna de 1.6 cm x 10 cm XK-16 y 0.85 mL/min para columna Omnifit de 0.66 cm x 17 cm) . Después de 1 CV de lavado con IX SP regulador de pH, IX SPB se cargó en la columna a 50 cm/hr (85 mL de IX SPB con 1.7 mL/min para columna 1.6 cm x 10 cm XK-16 y 15 mL de IX SPB con 0.3 mL/min para columna Ómnifit de 0.66 cm x 17 cm) para tratamiento con Benzonase . en columna con un tiempo de contacto de 50 minutos. La columna después se lavó con el primer 1 CV de IX SP a 50 cm/hr y el segundo 1 CV de IX SP a una velocidad de flujo lineal de 150 cm/hr. El virus unido fue eluido con 3 CV de IX SP que contenía NaCl 1 M, pH 7.0 regulador de pH a una velocidad de flujo lineal de 150 cm/hr. El pico de elución fue colectado de 20 mAU a 20 mAU (0.1 O.D. a 0.1 O.D.) a A2so nm. Las fracciones se colectaron para carga de resina de prueba, flujo pasante, lavado con Benzonase, y material eluido. Todas las muestras se pusieron en alícuotas, se congelaron en hielo seco y se almacenaron a -80 °C para análisis de infectividad por FFA (prueba de enfoque fluorescente) y análisis de ADN por prueba de PicoGreen.

Evaluación de purificación de columnas de resina de prueba : Las columnas de resina de prueba empacadas (16 mm x 10 cm) se cargaron individualmente con material 5XUF/5XDF TFF1 de la cepa de virus ca B/Malaysia a la concentración de carga de 9.0 loglO FFU/mL. Para evitar la carga de volumen pequeño, la solución de carga de virus 5XUF/5XDF fue prediluida 2.5 veces con regulador de pH IX SP del título de 9.4 loglO FFU/mL a 9.0 loglO FFU/mL antes de la carga. 50 mL de que la solución de virus fuera cargada al objetivo en 9.4 loglO FFU/mL de gel para cada operación de columna. El cálculo se basó en el título de virus de carga por el volumen de carga y se dividió entre el volumen de la columna de CS, log (10A(9.0 FFU/mL) x 50 mL/20 mL volumen de columna) = 9.4 loglO FFU/mL de gel. La carga de virus, flujo pasante, lavado con Benzonase y fracciones de material eluido se colectaron para cada operación. Todas las muestras se pusieron en alícuotas, se congelaron en hielo seco y se almacenaron a -80°C para análisis de infectividad por FFA y para análisis cuantitativos de HCD, HCP y Benzonase.

Estudio de capacidad de unión de columnas de resina de prueba : Las columnas de resina de prueba (16 mm x 10 cm) se cargaron con material 5XUF/5XDF TFF1 de la cepa de virus ca B/Malaysia a la concentración de carga de 9.0 loglO FFU/mL. La solución de carga de virus 5XUF/5XDF se pre-diluyó con regulador de pH IX SP del título de 9.4 loglO FFU/mL a 9.0 loglO FFU/mL antes de la carga. Cuatro diferentes intervalos de carga de virus total a 9.4, 9.9, 10.2 y 10.5 loglO FFU/mL de gel se realizaron para evaluar la capacidad de unión de las resinas de prueba. Para cada operación, la carga de virus, flujo pasante y muestras dé material eluido se colectaron y analizaron para título de infectividad por la prueba de enfoque fluorescente (FFA) esencialmente como se describió antes (véase el ejemplo provisto en la sección 8.1) y para análisis de ADN de la célula hospedera (HCD) mediante el uso del kit Quant-iT PicoGreen esencialmente después del proceso descrito en el kit . El nivel de HCD del material eluido de la columna en términos de título de ng por 107 dosis se calculó como HCD (ng/mL) / (10A (título de material eluido de CS loglO FFU/mL - 7.0 loglO FFU/dosis))= HCD (ng/dosis) . El nivel de proteína de célula hospedera (HCP) y Benzonase™ también se determinaron esencialmente como se describió antes (véase el ejemplo provisto en la sección 8.6) .

Estudio de capacidad de unión dinámica de sulfato de Cellufine y resinas de prueba: El material TFF1 (5X UF/5X DF) material para diferentes lotes de ca A/Malasia y ca A/Wisconsin se usó para realizar los estudios de capacidad de unión dinámica en columna para investigar el efecto del material de lote sobre el rendimiento y capacidad de unión de resinas de prueba en comparación con gel de CS. La solución de virus TFF1 (5X UF/5X DF) se cargó en las columnas de CS y resina de prueba a 150 cm/hr. La cantidad de carga de virus fue dirigida a 10.5; a 10.7 logio FFU/mL de gel. El cálculo se basó en el título de virus de carga por el volumen de carga y dividido entre el volumen de columna de CS, log (10a (título de carga de TFF1 (logi0 FFU/mL) ) x volumen de carga (mL) /volumen de columna (mL) ) = carga objetivo a logio FFU/mL de gel. El flujo pasante se colectó como un volumen de columna 1 (CV) en cada tubo de fracción. Las fracciones de flujo pasante se probaron para título por FFA. En la curva de rompimiento del gel CS se gráfico como el volumen de flujo pasante versus el porcentaje de la concentración de, título de virus en el flujo pasante en relación con la concentración de título de carga. La capacidad de unión dinámica se determinó como la cantidad máxima de virus que se puede unir al gel hasta alcanzar 10% de la concentración de virus de carga en el flujo pasante. El volumen (X) a 10% de rompimiento de virus se usó después para calcular la capacidad de unión (Y) del gel, que es el título de virus de carga por el volumen a 10% de rompimiento y dividido entre el volumen de columna, log (10A (título dé carga (loglO FFU/mL)) x (mL) /volumen de la columna (mL) ) = Y logio FFU/mL de gel.

Estudios de intervalo de carga: Tres lotes diferentes de material de ca B/Malasia TFF1 (5X UF/5X DF) se usaron para realizar los estudios de intervalo de carga para comparar el efecto del material del lote sobre el rendimiento de las resinas de prueba C y D en comparación con el gel CS. Los intervalos de carga objetivos para cada lote individual y para cada gel de columna se listan en la tabla 34. La carga de columna, flujo pasante y material; eluido de columna para cada operación se colectaron y analizaron mediante el uso de las pruebas de FFA y HCD. ! Rendimientos de paso de purificación: El rendimiento de paso de purificación de columna se calculó a partir del título de virus eluido por del volumen de elución divididó entre el título de virus cargado y el volumen cargado, 10a (título de material eluido de CS FFU/mL) x volumen de elución/ (10Ai(título de carga de CS de FFU/mL) x volumen de carga) . i Tabla 36 i Estudios de Intervalo de Carga de Sulfato de Cellufine y Columnas de Resina de Prueba C y D Gales Lote #1 de ca Lote #2 de ca Lote #3 de ca B/Malaysia carga B/Malaysia carga B/Malaysia carga de virus (log10 de virus (log10 de virus (log10 FFU/mL de gel) FFU/mL de gel) FFU/mL de gel) CS 9.5 9.9 9.:9 9.7 10.1 10 ;.2 9.9 10.4 10.5 : 10.2 Resina de prueba C 9.4 9.8 NA ; 9.9 10.1 NÁ 10.2 10.4 NA Resina de prueba D 9.4 9.8 9.;9 10.2 10.1 10^.2 10.4 10;.5 Resultados y Discusión Para las operaciones de purificación sobre las resinas de prueba A-D, cada columna se cargó con el material de TFF1 de la cepa de virus de ca B/Malaysia 5XUF/5XDF a la concentración de carga de 9.0 logi0 FFU/mL. La cantidad objetivo de carga de virus fue de 9.4 logi0 FFU/mL de g l para cada operación. El virus se eluyó de la columna mediante el uso de tres volúmenes de columna (CV) de regulador de pH de SP con NaCl 1 M. El cromatograma de elución para columna de resina de prueba A-D se muestra en la figura 19, paneles A-D, respectivamente. Como se muestra en la figura 19, las resinas de prueba A y B parecieron mostrar picos de elución múltiples separados mientras que las resinas de prueba C y D mostraron un solo pico con espaldones de pico y características heterogéneas.

La tabla 37 resume los resultados de cuatro operaciones de purificación que comparan los rendimientos del paso, niveles de contaminantes de impurezas eluidas de columna HCD, HCP y Benzonase. Las resinas de prueba C y D tuvieron rendimientos de paso más altos (103.5% y 76.5%) comparados con las resinas de prueba A y B y la resina de prueba B dio el rendimiento de paso más bajo (14.5%) . En términos de los niveles de impureza de HCD, ca B/Malaysia purificado con resinas de prueba C y D tuvo niveles de HCD más bajos (0.07 y 0.08 ng/dosis) comparado con las resinas de prueba A y B (0.14 y 0.67 ng/dosis) . Los niveles de HCP para ca B/Malaysia purificada con resina de prueba C (0.27 ng/dosis) y resina de prueba D (0.21 ng/dosis) fueron similares a la res;ina de prueba A (0.26 ng/dosis), pero menores que la resina de prueba B (0.87 ng/dosis) . Los niveles de Benzonase de ca B/Malaysia purificada con las resinas de prueba C y D (0.25 y 0.31 ng/dosis) fueron más bajas que las resinas de prueba A y B (1.78 y 2.60 ng/dosis) .

Tabla 37 Comparación de Rendimientos de Paso de Resina de Prueba, Niveles de HCP, HCP y Benzonase En la tabla 38, el título del virus en el flujo pasante para las cuatro operaciones de resina de prueba mostró ser ya sea muy bajo (2.2% de partículas infecciosas totales en relación con la carga de la resina de prueba C) o límite de detección (LOD) indicó que el virus se unió en su mayoría al gel a una carga de 9.4 logi0 FFU/mL de gel. La resina de prueba C tuvo una cantidad más alta de virus en el flujo pasante que sugirió que la resina de prueba C puede tener una capacidad de unión más baja en comparación con las otras tres resinas de pruebas. La fracción de lavado de Benzonase de estas cuatro operaciones también mostró ser ya sea no detectable o un porcentaje muy bajo de virus (1.2% para resina de prueba C y 0.9% para resina de prueba D) . Los resultados de determinación selectiva iniciales de las cuatro operaciones de purificación con las resinas de prueba indicaron que la \ resina de prueba C y D se desempeñaron mejor en relación con los otros dos geles en términos de rendimientos de paso y los niveles de impureza de material eluido y contaminantes.

Tabla 38 Comparación del Flujo Pasante de las Resinas de Prueba y Fracciones de Lavado de Benzonase LOD - Límite de detección Los resultados de la determinación selectiva de las resinas de prueba A-D a una carga de 9.4 log10 FFU/mL de gel mostraron que el virus se unió en su mayoría, por lo tahto una cantidad más alta de carga viral a niveles de 9.4, 9.9, 10.2 y 10.5 logio FFU/mL de gel se seleccionaron para evaluar la capacidad de unión de estas resinas. Además, las resina de prueba E y F también se evaluaron. El impacto en los rendimientos de paso y los niveles de impureza de HCD a estos niveles de carga también se evaluó. Los resultados del estudio de capacidad de unión se resumen a continuación. La tabla 39 lista los resultados de capacidad de unión de las resinas de prueba C y D. La tabla 40 lista los resultados de capacidad de unión de las resinas de prueba A, B, E y F.

Tabla 39 Estudio de Capacidad de Unión de Resinas de Prueba C y D (Elución de NaCl 1M o 2M) LOD - Límite de detección Tabla 40 Estudio de Capacidad de Unión de Resinas de prueba A, B, E y F (Elución de NaCl 1M) LOD - Límite de detección En la tabla 39, los resultados de operación, a 9.4 log10 FFU/mL de carga de gel para resinas de prueba C y D se compararon con el regulador de pH de SP, elución de NaCl 1 M de y NaCl 2 M, respectivamente. Una elución de NaCl 2 M se realizó para evaluar ya sea los picos de elución de la resina de prueba C y D que se obtendrían en el pico individual en relación con los picos observados con la elución de NaCl 1 M. Como se muestra en la figura 20, el pico de elución se agudizó con elución de NaCl 2 M para ambos geles sin las características heterogéneas (compárese con figura 19B con 20A y figura 19D con 20B) . Como se muestra en la tabla 39, la elución de NaCl 2 M no afecta los rendimientos dé paso significativamente para las resinas de prueba C y D, al considerar la recuperación basada en título de 103.5 a 90.2% para la resina de prueba C y de 76.5 a 59.7% para la resina de prueba D. Los niveles de HCD del materia eluido en términos de ng por dosis se incrementó ligeramente para ambos geles cuando se eluyó con NaCl 2 M; se incrementó de 0.07 a 0.2 ng/dosis para la resina de prueba C y de 0.08 a 0.11 ng/dosis para resina de prueba D. Para la evaluación de impacto sobre el nivel de HCD a una cantidad más alta de carga de virus, a medida que la cantidad de carga se incrementó de 9.4 a 9.9 log io FFU/mL de gel, el nivel de HCD del material eluido para resina de prueba C se incrementó de 0.2 a 1.26 ng/dosis, pero el rendimiento de paso no fue afectado (90.2% versus 94.4%). El incremento adicional de la carga a 10.2 log10 FFU/mL de gel mostró un incremento en la cantidad de rompimiento de virus (14.4%) en la fracción de flujo pasante lo que dio por resultado un rendimiento disminuido (79.4%) y un aumento del nivel de HCD incrementado en el material eluido (2.19 ng/dosis) para la resina de prueba C. Debido a que la curva de rompimiento no se evaluó para cada gel, la capacidad de unión se estimó cuando no más de 2% del virus apareció en el flujo pasante para la cantidad correspondiente de carga de virus. Por lo tanto, 9.9' logi0 FFU/mL de gel fue la capacidad de unión estimada de la resina de prueba C. Como se muestra en la tabla 39, para la resina de prueba D, un incremento en la carga de virus de 9.5 a 10.2 log10 FFU/mL de gel dio por resultado un incremento en el nivel de HCD de 0.11 ng/dosis a 0.98 ng/dosis, pero sin un efecto mayor sobre el rendimiento de paso (59.7% a 79.7%) . Esto se debe a que un pequeño porcentaje de virus fue detectado en el flujo pasante '(1.4%) , incluso a una carga de 10.2 logio FFU/mL de gel . Por lo tanto, 10.2 logio FFU/mL de gel se estimó que era la capacidad de unión de la resina de prueba D.

En resumen, la capacidad de unión estimada para la resina de prueba C y D fue 9.9 y 10.2 logio FFU/mL de gel, respectivamente. La resina de prueba D tuvo aproximadamente dos veces más alta capacidad de unión que la resina de prueba C en este conjunto de estudios con la cepa ca B/Malaysia. Cuando la cantidad de carga de virus se incrementó, niveles de HCD del material eluido para resina de prueba C y D también se incrementó. La comparación de los geles al mismo nivel de carga de 10.2 logio FFU/mL de gel, el valor de HCD del nivel por dosis para la resina de prueba C (2.19 ng/dosis) fue más alto que la resina de prueba D (0.98 ng/dosis) por lo que el impacto sobre el nivel de HCD para la resina de prueba C fue más notable que la resina de prueba D a una carga de virus más alta. En términos del rendimiento de paso que compara ¡ varias cantidades de carga de virus, la resina de prueba C dio rendimientos de paso ligeramente más altos que resina de prueba D .

Los resultados de determinación selectiva iniciales indicaron que las resinas de prueba C y D dieron mejores resultados de purificación comparados con las resinas de prueba A y B cuando los estudios se realizaron a una carga de 9.4 logio FFU/mL de gel . A fin de evaluar si la resina de prueba A y B, así como dos resinas de prueba adicionales (? y F) pudieron dar capacidades de unión más alta que las resinas de prueba C y D, los estudios de capacidad de unión se realizaron con resinas de prueba A, B( E y F y se evaluaron para rendimientos de paso. Los resultados se resumen en la tabla 40. En este juego de operaciones de purificación, el virus de unión se eluyó con regulador de pH de SP NaCl 1 M, que es la condición de regulador de pH de elución usada para el paso de cromatogra ía CS descrito en el ejemplo provisto en la sección 8.6.

Como se muestra en la tabla 40, la capacidad de unión estimada para la resina de prueba E fue entre 9.9 a 10.2 logio FFU/mL de gel, debido a que en estos dos intervalos de carga, el porcentaje de virus en el flujo pasante se incrementó desde no detectado hasta 8.3%. Para la resina de prueba A, la capacidad de unión estimada fue entre 10.2 a 10.5 logio FFU/mL de gel debido a que el porcentaje de virus en el flujo pasante se incrementó desde no detectado hasta 6.3% en estos dos intervalos de carga. Las capacidades de unión para las resinas de prueba B y E se estimó que eran por lo menos > 9.9 logi0 FFU/mL de gel, debido a que no se realizaron operaciones a intervalos de carga más altos.

Cuando se evaluó el impacto sobre los niveles de HCD a cantidades más altas de carga de virus, los niveles de HCD para las resinas de pruebas A, B, E y F se incrementó cuando la carga de virus se incrementó de 9.4 a 9.9 logi0 FFU/mL de gel . Niveles de HCD aún más altos se observaron para las resinas de pruebas A y E cuando la carga se incrementó hasta 10.2 y 10.5 logio FFU/mL de gel. A la misma cantidad de carga de virus (9.9 logi0 FFU/mL de gel) con las resinas de prueba C y D, niveles de HCD más altos se observaron en la fracción de elución para varias de las resinas de prueba (3.43 ng/dosis para la resina de prueba A, 2.9 ng/dosis para la resina de prueba B, 5.31 ng/dosis para la resina de prueba E y 1.24 ng/dosis para la resina de prueba F) (tabla 40) . Por lo tanto, el impacto sobre los niveles de la HCD para las resinas de prueba A, B, E y F con la carga de virus más alta fue más remarcable que para las resinas de pruebas C y D.

El rendimiento de paso disminuyó de 82% a 47.8% para la resina de prueba E cuando la carga del virus se incrementó de 9.4 a 10.2 logio FFU/mL de gel (tabla 40). Para la 1 resina de prueba A, el rendimiento de paso también disminuyó (69.4% a 51.5%) cuando la carga el virus se incrementó de 9.4 a 10.5 logio FFU/mL de gel. Tanto la resina de prueba B como la resina de prueba F mostraron rendimientos de paso bajo relativos (11.7% y 34.9%) comparados con las resinas de , rueba E y A (52.0% y 61.5%) con la misma cantidad de carga de virus (9.9 logio FFU/mL de gel) . La misma tendencia se observó a una carga de virus de 9.4 logi0 FFU/mL de gel con rendimientos de paso más altos para la resina de prueba E (82%) y resina de prueba A (69.4%) comparado con resina de prueba B (14.5%) . La comparación de las resinas de prueba, resinas de prueba C y D dio rendimientos de paso más altos que las resinas de prueba A, B, E y F a diferentes intervalos de carga de virus. Las resinas de prueba C , y D se evaluaron adicionalmente con diferentes cepas de virus y lotes de cosecha para comparar el rendimiento con el gel CS actual.

La resina de prueba C se usó para evaluar la purificación de otras cepas de virus. Las figuras 21A y 21B muestran el cromatograma pico de elución de las operaciones de purificación de ca A/ isconsin y ca A/Solomon Islands, respectivamente, mediante el uso de una columna de resina de prueba C. Los perfiles pico fueron muy similares y consistentes con las operaciones de purificación para la cepa ca B/Malaysia (figura 21C) . La tabla 41 lista los rendimientos de paso y niveles de HCD en el material eluido para la purificación de las cepas ca B/Malaysia, ca A/Solomon Islands y ca A/Wisconsin. Todos los virus unidos en la columna y menores de 1% de las partículas de virus infecciosas totales en relación con la carga se observaron en el flujo pasante bajo las condiciones de carga a 9.4 a 10.0 FFU/mL de gel. Los rendimientos de paso de las tres cepas varió de 78.9 a 112.5%, que fueron relativamente comparables para las tres cepas, y fueron comparables con rendimientos altos previos para leal gel de resina de prueba C. Los niveles de ADN de las célula hospedera aún fueron bajos cuando la carga estuvo por debajo de 9.8 logio FFU/mL de gel, sin embargo, el nivel de ADÑ en el material eluido se incrementó a 1.34 ng/dosis cuando la cantidad de carga de virus alta se aplicó (a 10 logi0 FFU/mL de gel) . Un incremento similar en el nivel de HCD se observó para el estudio de capacidad de unión mediante el uso de gel de resina de prueba C con la cepa ca B/Malaysia en el estudio previo. Los resultados indicaron que las resinas de prueba dieron rendimiento similar cuando se purificaron con diferentes cepas.

Tabla 41 Resumen de Resultados de Purificación de las Cepas ca B/Malaysia, ca A/Wisconsin y A/Solomon Islands Mediante el Uso de Columna de Resina de Prueba C La purificación de cepas ca A/Wisconsin y ca B/Malaysia se evaluó mediante el uso de gel de resina de prueba D. Las figuras 22A y 22B muestran el cromatograma de pico de elución para elución de virus. Los perfiles de elución de pico fueron similares para las dos cepas y la recuperación de purificación para este paso fue alta con el intervalo esperado (<2 ng/dosis) de los niveles de HCD para la fracción de material eluido de ambas cepas (tabla 42) .

Tabla 42 Resumen de Resultados de Purificación de las Cepas ca B/Malaysia y ca A/Wisconsin Mediante el Uso de Columna de Resina de Prueba D LOD - Límite de detección Un estudio de capacidad de unión dinámica se realizó con material de TFF 1 (5XUF 5XDF) para ca B/Malaysia y ca A/Wisconsin, y tres lotes diferentes de ca B/Malaysia con la carga de virus objetivo total de 10.5 a 10.7 logio FFU/mL. En el inicio del rastreo de A2so nm, la carga de virus fue relativamente plana. Después de un cierto volumen de carga, la A2so se incrementó significativamente y gradualmente alcanzó una meseta que indicaba que la columna había excedido la capacidad de columna por lo que permitió rompimiento de virus. El porcentaje de virus en el flujo pasante se calculó al dividir el título de virus de cada fracción de flujo pasante entre el título de carga y al multiplicar por 100. La curva de rompimiento se gráfico con el porcentaje de concentración de virus en el flujo pasante versus el volumen cargado. La capacidad de unión dinámica i del gel se define como la capacidad de unión por mililitro de gel cuando la fracción de flujo pasante alcanza ¡10% de rompimiento a través de la concentración de virus en relación con la concentración de carga.

Para la columna CS, cuando 18 mililitros del virus se cargan, 5% de virus aparece en la fracción de; flujo pasante. Cuando una capacidad de unión de 10% de rompimiento se alcanza, aproximadamente 19 mililitros de solución de virus se cargó. Esto representó una carga de 9.8 logi0 FFU por mL de gel (logi0 ( 10? ( 9.3 ) x 19 mL/5.8 mL) = 9.8 logio FFU por mL de gel) . Por lo tanto, 9.72 log10 FFU/mL de gel se determinó que era la capacidad de unión dinámica para ¡el gel CS con la cepa ca B/ alaysia/2506/04 lote #2. De ¡manera similar, cuando 27 mililitros de virus se cargó ¡en la columna de resina de prueba C y 24 mililitros de virus se cargo en la columna de resina de prueba D, 10% del! virus apareció en las fracciones de flujo pasante. La capacidad de unión dinámica de las resinas de prueba C y D se determinó que era de 9.96 y 9.92 logi0 FFU/mL de gel, respectivamente, con el mismo lote de ca S/Malaysia. Las ^capacidades dé unión dinámica para las resinas de prueba C, D y columnas CS con varios lotes de ca B/Malaysia y cepas se resume en la¡ tabla 43. Como se muestra en la tabla 43, la capacidad de unión dinámica varió y pareció ser dependiente del nivel de HCD y HCP en el material de carga. La capacidad de unión dinámica de CS y las columnas de resina de prueba C y D fueron aceptadas por el nivel de HCD del material de carga; mientras más alto es el nivel de HCD del material de carga, más baja será la capacidad de unión dinámica del gel . La capacidad de unión dinámica del gel parece ser menos afectada por el nivel de HCP del material de carga. Se formuló la hipótesis de que algo del ADN de las células hospederas se une al virus por lo que interfiere con la unión cinética del virus al ligando de la superficie del gel, lo que da por resultado la capacidad de unión más baja observada para lotes de virus con niveles de ADN más altos. Entre los cuatro lotes mostrados en la tabla 43, la capacidad de unión dinámica de gel CS varió de 9.7 !a 10.4 logio FFU/mL de gel, la capacidad de unión para la resina de prueba C varió de 9.9 a 10.7 logio FFU/mL de resiná y la capacidad de unión para la resina de prueba B varió de 9.9 a por arriba de 10.7 loglO FFU/mL de gel. En general, la capacidad de unión dinámica de las resinas de prueba C y D fue más alta (~2 veces) comparado con el gel CS bajo las condiciones evaluadas. La capacidad de unión dinámica del gel de prueba D fue algunas veces más alta en algunos lotes y por lo menos comparable con el gel de resina de prueba C.

Tabla 43 Resumen de Capacidad de Unión Dinámica para Diferentes Lotes de Virus *logl0 FFU/mL de gel.

Después de comparar la capacidad de unión dinámica de CS con las resinas de prueba C y D, se realizaron operaciones individuales mediante el uso de tres lotes de ca B/Malaysia para evaluar el rendimiento de pasos y la remoción de HCD para CS y resinas de prueba mediante el uso :de las mismas condiciones de carga. Los intervalos de título de carga objetivo para cada lote se seleccionaron para el estudio de conformidad con la capacidad de unión dinámica del lóte . La tabla 44 resume el rendimiento de paso de purificación y los niveles de HCD a varios intervalos de carga de virus para purificación de columna de CS, resina de prueba C y resina de prueba D de ca B/Malaysia lote 1. La capacidad de unión estimada para resina de prueba C y D fue de 9.9 y 10.2 logio FFU/mL de gel, respectivamente. La resina de prueba D tuvo aproximadamente dos veces más alta la capacidad de unión que la resina de prueba C en estos estudios. La capacidad de unión para CS fue 9.7 logio FFU/mL de gel3 mediante el uso del mismo lote de material . Tanto la resina de prueba C como la resina de prueba D tuvieron una capacidad de unión más alta (2 y 4 veces) que en CS . Cuando la cantidad de carga de virus se incrementó, los niveles de HCD del material eluido para las resinas de prueba C y D también se incrementó. Al comparar los geles al mismo nivel de carga de 10.2 log10 FFU/mL de gel, el nivel de HCD por dosis para la resina de prueba C (2.19 ng/dosis) fue más alta que para la resina de prueba D (0.98 ng/dosis) . Por lo tanto, el incremento en el nivel de HCD del material eluido fue similar para la resina de prueba D y gel CS cuando la carga de virus se incrementó. Sin embargo, para el gel de resina de prueba C, el incremento en el nivel de HCD fue más notorio en comparación con el gel CS . El rendimiento de paso con varias cantidades de carga de virus fue comparable o ligeramente con la resina de prueba C comparada con la resina de prueba D. en comparación con la columna CS, las columnas de resina de prueba C y D dieron rendimiento de paso más altos cuando la purificación de virus se realizó a una condición de carga de virus más alta. En general, la resina de prueba en D tuvo una capacidad de unión más alta y un rendimiento de purificación mejor comparado con CS y la resina de prueba C.

Tabla 44 Comparación de CS y Resinas de Prueba C y D con ca B/Malaysia Lote 2 LOD-Límite de detección La tabla 45 resume los rendimientos de paso de purificación y niveles de HCD a varios intervalos de carga de virus para la purificación de columna con ca b/Malaysia lote 2 mediante el uso de CS, resina de prueba C y resina de ; rueba D. Las capacidades de unión para la resina de prueba C y D y CS fueron 9.96, 9.92 y 9.80 logio FFU/mL de| gel, respectivamente. La resina de prueba C y D tuvo una capacidad de unión ligeramente más alta que el gel CS . Cuando la carga de virus estuvo cerca de la capacidad de unión dinámicá, 9.8-9.9 logio FFU/mL de gel, los rendimientos de paso para los tres geles fueron comparables a 47.5%-62.8%. A una carga de virus más alta, 10.1 logio FFU/mL de gel, los rendimientos de paso para CS disminuyo drásticamente a 25.2% y la resina de prueba C disminuyo a 50.2% mientras que la resina de prueba D permaneció similar a 63.2%. Cuando la carga se incrementó a 10.4 logio FFU/mL de gel, el rendimiento de paso de CS disminuyo adicionalmente a 12.6% mientras que la resina de prueba C y D dio una disminución a 49.8 y 39.5%, respectivamente. Los rendimientos de paso de la resina de prueba C y D fueron considerablemente más altos que el gel CS .

Tabla 45 Comparación de CS y resinas de prueba C y D con ca B/Malaysia Lote 2 tlogio FFU/mL de gel Cuando la cantidad de carga de virus se incrementó, los niveles de HCD del material eluido para los geles CS, resina de prueba C y D también se incrementaron. La comparación de los geles a la misma cantidad de carga de virus 9.8 a 10.4 loglO FFU/mL de gel, el nivel de HCD por dosis para la resina de prueba C (0.97, 2.51, 2.93 ng/dosis) fue más alta que el valor de CS (0.5, 1.91, 2.43 ng/dosis) y el valor de HCD para la resina de prueba D fue más bajo (LOD, 1.67, 1.21 ng/dosis) . El incremento en el nivel de HCD en' virus purificado mediante el uso de resina de prueba C fue mayor que para el gel CS . El incremento en el nivel de HCD del material eluido fue similar para la resina de prueba D y gel CS, aunque menor para la resina de prueba D. En general, la resina de prueba D tuvo una capacidad de unión más alta y rendimiento de purificación mejor (rendimiento de paso y nivel de HCD) comparado con CS y resina de prueba C particularmente cuando se llevó a una condición de carga de virus más alta.

Después de evaluar el rendimiento de purificación global de la resina de prueba C y D con la columna CS para los dos lotes previos de ca B/Malaysia, la resina de prueba de se escogió para estudios de purificación para a comparar adicionalmente el gel CS mediante el uso de ca B/Malaysia, lote #3. Los resultados se resumen en la tabla 46. Para este lote, la capacidad de unión dinámica de CS y resina de prueba D fueron comparables con 10.2 logio FFU/mL de gel para CS y 10.1 log10 FFU/mL de gel para resina de prueba D. cuándo se compara el rendimiento con varias cantidades de carga de virus, los niveles de HCD fueron comparables entre el gel CS y resina de prueba D (todos menos 1.1 ng/dosis) . Para los rendimientos de paso, especialmente a una carga de virus más alta de 10.2 y 10.5 log10 FFU/mL de gel, la resina de prueba D dio rendimientos de paso ligeramente mejores (52.8 y 65.8%) que el gel CS (46.2 y 55.2%).

Tabla 46 Comparación de CS y Flu 4 de con ca B/ alaysia Lote; #3 tlogio FFU/mL de gel Para evaluar la escalabilidad de la purificación, el gel de resina de prueba D sé empacó en una columna XK-50 :(5 era x 17 cm) para escalar ascendentemente aproximadamente 25: veces. Una cosecha viral en biorreactor de 10 litros, TVCC-2 cepa ca A/South Dakota Lote #32, se procesó después de estabilización de SP, DFF1 y TFF1 (UF 5X y DF 5X) como se describió en los métodos para el material de carga de columna. El material de TFF1 \ (UF 5X y DF5X) se cargó en la columna de resina de prueba D y CS XK-50 columnas (5 cm x 17 cm) respectivamente. Las condiciones de columna y parámetros operacionales que incluían la carga y la velocidad de flujo lineal de lavado, el tratamiento con Benzonase en columna y los pasos de elución fueron los : mismos que el proceso TVCC-1 (escala de 20 litros) y la operación a escala pequeña descrita en la sección de métodos. La figura 22C muestra los cromatogramas de pico de elución de la resina de prueba D a escala de columna XK-50. El pico de elución mostró un pre-pico pequeño al principio de la elución seguido por un solo pico principal sin las características múltiples del pico de elución como se observó en el cromatograma de elución de, escala pequeña (figuras 22A y 22B. la tabla 47 resume los rendimientos de paso de purificación y niveles de HCD de material eluido para las operaciones de columna de resina de prueba D y CS.: A una carga de virus total de 10.0 logi0 FFU/ mL de gel, la operación de purificación a escala ascendente piloto de resina de prueba D dio un rendimiento de paso comparable (75.6%) y niveles [ de HCD bajos (0.15 ng/dosis) que demuestran la escalabilidad del gel de resina de prueba D. estos resultados cuando se comparan ' con la operación de columna CS XK-50 mostraron que el nivel de HCD del material eluido de la columna de resina de prueba D fue dos veces más bajo que el material eluido de la columna CS. ¦ Tabla 47 Comparación de CS y Purificación de Columna de FlueSelect 4 XK-50 con ca A/South Dakota tlogio FFU/mL de gel Un total de seis resinas de prueba se determinaron selectivamente y se evaluaron para purificación de vi us. La evaluación incluyó evaluación del rendimiento de paso, capacidad de unión, y el nivel de impurezas. Las resinas de prueb C y D tuvieron mejores capacidades de unión, rendimientos de pasó mas altos y niveles de impurezas de HCD más bajos en relación con las otras cuatro resinas de prueba. El rendimiento de pasos de resina de prueba B y F fueron demasiado bajos para ser considerados para preparaciones a escala comercial . La capacidad de unión de resinas de prueba A y E fueron ligeramente más altas o comparables en relación con la resina de prueba C y D; sin embargo, el rendimiento de pasos no fue tan alto y las impurezas de HCD incrementaron a niveles mucho más altos en cantidades de carga de virus más altas. Al comparar las resinas de prueba C y D, aunque se observaron rendimientos de paso ligeramente mejores para la resina de prueba C, la resina de prueba D pareció tener una capacidad de unión más alta y menos impacto sobre los niveles de cantidad de HCD cuando se cargó una cantidad de virus más alta. Esto sugirió que las resinas de prueba C y D son geles de cromatografía que podrían ser considerados para usarse en purificaciones a escala comercial. Evaluaciones de rendimiento adicionales que incluían la capacidad de unión, rendimiento de pasos y el nivel de ADN de la célula hospedera en el material eluido de la columna de las resinas de prueba C y: D en comparación con geles de sulfato de Cellufine mostró que el gel de resina de prueba D es mejor que la resina de prueba C por lo que se seleccionó como una alternativa para CS para evaluación de escala ascendente adicional. Con la evaluación de : cuatro diferentes lotes de virus, la capacidad de unión dinámica de las resinas de prueba C y D fue aproximadamente 2 veces más alta (en algunos lotes) o por lo menos comparable con el sulfato de Cellufine. La resina de prueba D tuvo una capacidad de unión similar o más alta que la resina de prueba C. En términos del rendimiento de paso y niveles de ADN de la célula hospedera, la resina de prueba D tuvo un rendimiento similar comparado con la resina de prueba C pero un rendimiento generalmente más alto que CS a la cantidad de condición de carga de virus más alta. Con una carga de virus incrementada, el impacto sobre el incremento en el nivel de HCD del material eluido fue similar para la resina de prueba D y gel CS pero el impacto sobre el incremento en el nivel de HCD del material eluido fue más notable para la resina de prueba C. El nivel de HCD del material eluido de resina de prueba D fue comparable con CS para todos losé lotes evaluados. Finalmente, la evaluación a escala ascendente ¡ piloto de la operación de la columna de resina de prueba D XK-50 mostró un rendimiento de purificación y nivel de ADN de hospedero bajo en el material eluido que demuestra escalabilidad y el potencial para ser usada como un gel de cromatografía alternativo para fabricación del proceso de influenza basado en cultivo de células.

Purificación de RSV Filtros y Cartuchos 1) filtro nominal Sartopure PP2 de 8-µp? 2) filtro nominal Sartopure PP2 de 3-pm 3) filtro nominal Sartopure PP2 de 0.65-µ?? 4) Filtro de membrana Sartoclean CA de 3.0/0.8-µp? 5) Filtro Millipak 100 PVDF de 0.45-ym 6) Cartucho de fibra hueca UF/DF, tamaño de poro de membrana de 500 KDa, el d.i. del lumen puede ser 0.5 mm o 1.0 mm, la longitud de trayectoria puede variar de 30 - 60 cm ' Compuestos químicos 1) Sacarosa 2) Tris. Cl 3) KC1 4) KH2P04 5) K2HP04 6) NaCl 7) KC1 8) EDTA 9) Trehalosa 10) SFM4MegaVir 11) Citrato de sodio 12) Citrato de potasio , 13) Benzonase ; 14) NaOH 15) NaOCl 1) Mezclador de onda con unidad de calentamiento (Wave Biotech Modelo # 20/50EH; 2) Bolsas Stedim de 10 L (Cat# FBP10381) 3) Garrafas 4) Pipetas 5) Botellas (250 mL, 1 L Nalgene) 6) Plataforma de GE Flex ; 7) Bombas (Watson Marlow 520 S, 620Di) , 8) Báscula (Sartorius, Modelo # EB60EDE-1 ; Sartorius Modelo # CP4202S) , Diagrama de Flujo de Descripción de Proceso de Purificación de RSV Metodología 1) Virus RSV (v.gr., rA2cp248/404/l030ASH) se hace crecer en células Vera. La plataforma de producción actual usa un biorreactor de 10 -L. La cosecha de virus (VH) contiene medio de infección de SFM4MegaVir (Hyclone) . ¦ 2) Virus de cosecha viral se pone en acervo . en una bolsa Stedim de 10-L y se filtra a través de un filtro.de 8 o 3 pm a una presión de alimentación de 1.05 kg/cm2 y con una carga de 4-5 mL VH/cm2 del área de filtración efectiva (EFA) para el 3-µ?t? de filtro o 27 mL VH/cm2 del EFA para el filtro de 8-µ??. El filtrado se colectó y se pesó en una bolsa de Stedim de 10-L. 3) La cosecha viral clarificada se trata con 50 U/mL de Benzonase a 32 ± 3°C durante 3 hr . La cosecha se hace oscilar a 30 oscilaciones/min (rpm) y a un ángulo de 3o. 4) La VH tratada con Benzonase, clarificada se filtra a través de un filtro Sartorius Sartopure PP2 de 0.65-ym con una carga de 16 - 18 mL de VH tratada con Benzonase, clarificada/cm2 de la EFA para el filtro. a. El filtrado de 0.65-µtt? es después estabilizado con regulador de pH de estabilización que comprende 36 mM TrisCl, 214 mM de sacarosa y 150 mM de NaCl o KCl . 5) El filtrado estabilizado es almacenado durante la noche (16 ± 3 hr) y se usa como el material de alimentación para el paso de ultrafiltración (concentración) . 6) El paso de ultrafiltración se realiza mediante el uso de un cartucho de fibra hueca de 500-kDa de GE Healthcare con el d.i. de lumen de 0.5 - 1 mm. La carga de filtrado de 0.65-µ?t? estabilizada en el cartucho es de 10 mL por : cm2 de área de membrana. La alimentación se concentra 5 veces mediante el uso de una presión de transmembrana (TMP) operacional de 1.05 kg/cm2 y una velocidad de esfuerzo cortante de 12000 seg"1. 7) El material concentrado es diafiltrado con el regulador de pH de diafiltración (8-10-veces de intercambio de regulador de pH basado en volumen del concentrado) . El regulador de pH de intercambio comprende Tris (5 mM) ; Sacarosa (25 % p/v) ; NaCl (150 mM) ; pH 7.2. 8) El material diafiltrado se hace pasar a través de un filtro terminal (filtro Millipak de 0.45-µp?) con una carga de 4 - 5 mL/cm2. El filtrado es el material volumétrico final (sustancia de fármaco) y se pone en alícuotas en botellas. Todas las alícuotas de sustancia de fármaco viral de RSV son congeladas instantáneamente en un baño de metanol-hielo seco o mediante el uso de un congelador de velocidad controlada.

Aunque la invención anterior se ha descrito en algún detalle para propósitos de claridad y entendimiento, estará claro para un experto en la técnica a partir de una lectura de esta descripción que varios cambios en forma y detalle se pueden hacer sin apartarse del alcance verdadero de la invención. Por ejemplo, todas las técnicas y aparatos descritos anteriormente se pueden usar en varias combinaciones. Todas las publicaciones, patentes, solicitudes de patente, u otros documentos citados en esta solicitud son incorporados por referencia en su totalidad para todos los propósitos al mismo grado como si cada publicación, patente, solicitud de patente, individual, u otro documento^ fuera indicado individualmente para ser incorporado por referencia para todos los propósitos. Además, las siguientes solicitudes de patente provisionales de los Estados Unidos: 60/845,121 presentada el 16 de septiembre de 2006; 60/871,721 presentada el 22 de diciembre de 2006; 60/917,008 presentada el 9 de mayo de 2007; 60/951,813 presentada el 25 de julio de 2007; 61/099,749 presentada el 24 de septiembre de 2008; 61/104,933 presentada el 13 de octubre de 2008; 61/122,456 presentada el 15 de diciembre de 2008; 61/187721 presentada el 17 de junio de 2009, y la solicitud de patente de los Estados Unidos 11/855,769 presentada el 14 de septiembre de 2007 son incorporadas por referencia en su totalidad.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (20)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un método para producir virus de la influenza en cultivo de células a un logio TCID50/mL de por lo! menos aproximadamente 8.0 y/o a un logi0 FFU/mL de por lo menos aproximadamente 8.0, caracterizado porque comprende: (a) proliferar células MDCK adherentes en un medio de cultivo libre de suero sobre microportadores , mientras se mantiene una o más condiciones de cultivo seleccionadas del grupo que consiste de: una velocidad de agitación dé entre aproximadamente 100 y 200 rpm; un pH de entre aproximadamente 6.0 a aproximadamente 7.8; una temperatura de . entre aproximadamente 33 °C y aproximadamente 42°C; y oxígeno disuelto (DO) de entre aproximadamente 35% y aproximadamente 100%; ! (b) infectar las células MDCK que proliferaron con un virus de la influenza sin intercambiar el medio de cultivo; y (c) incubar las células MDCK que proliferaron infectadas bajo condiciones que permiten replicacion del virus de la influenza.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el medio de cultivo es ediV SFM 110.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la concentración de microportadqres es entre 1 y 3 g/L, y las células MDCK se siembran; sobre microportadores a una densidad de entre 10 j y 40 células/microportador y proliferaron por entre 2 y 5 días.

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las células MDCK son de la línea de células depositadas como acceso a ATCC No. PTA-7909 ;o PTA-7910.

5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las células MDCK proliferan ja una densidad de células de entre 5 x 105 y 3 x 106 células/mL.

6. El método de conformidad con la reivindicación 1, i caracterizado porque el paso (b) se lleva a cabo mediante el uso de una entrada viral de entre 0.01 x 103 FFU/mL jy 0.05 FFU/mL . ;

7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paso (b) se lleva a cabo mediante el uso de una entrada viral de entre 0.00001 FFU/célula y 0.00005 FFU/célula. j

8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el virus de la influenza comprend uno o más segmentos de gen de cepa de influenza ca A/Ann Arbór/6/60 o cepa de influenza ca B/Ann Arbor/1/66.

9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las células MDCK son incubadas a 33 ± 2°C durante la replicación del virus de la influenza en el paso (c) .

10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las células MDCK son incubadas a una velocidad de agitación de entre 150 rpm y 200 rpm, un pH de entre aproximadamente 7.0 y aproximadamente 7.8, y en donde una proteasa está presente durante la replicación del virus de la influenza en el paso (c) .

11. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además el paso de cosechar el medio de cultivo entre 48 horas y 72 horas después de la infección .

12. Un método de purificación de virus de la influenza del cultivo de células caracterizado porque comprende : (a) clarificación de una cosecha viral por filtración de flujo directo (DFF, por sus siglas en inglés) a través de por lo menos una membrana que tiene un tamaño de poro de entre aproximadamente 1.2 mieras y aproximadamente 0.45 mieras; (b) concentración por ultrafiltración de flujo tangencial (UF) e intercambio de regulador de pH por diafiltración (DF) después del paso (a) mediante el uso de una membrana que tiene corte de peso molecular (M CO) de 500 kDa; (c) purificación por cromatografía de afinidad en columna después del paso (b) ; (d) concentración por UF y/o intercambio de regulador de pH por DF después del paso (c) mediante el uso de una membrana que tiene corte de peso molecular (MWCO) de 500 kDa ; y (e) esterilización después del paso (d) por DFF a través de por lo menos una membrana que tiene un tamaño de poro de entre aproximadamente 0.45 mieras a aproximadamente 0.22 mieras, en donde la recuperación global de virus purificado es por lo menos 30%, y en donde los, virus purificados comprenden menos de 0.1 ng de HCD, y menos de 0.3 µg HCP por 7.0 ± 0.5 log10 FFU de virus.

13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque sacarosa y un regulador de1 pH de fosfato se añaden a la cosecha viral a una concentración final, dentro de 10% de variación, de 218 mM de sacarosa, 11 mM de regulador de pH de fosfato pH 7.0-7.4, antes del paso (a) , en donde el regulador de pH de intercambio en el paso (b) comprende, dentro de 10% de variación, 218 mM de sacarosa, 11 mM de regulador de pH de fosfato pH 7.0-7.4, y en donde los pasos (a) y (b) son acoplados.

14. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el paso (b) se realiza a una presión I de transmembrana (TMP) de entre aproximadamente .70-kg/cm2 y aproximadamente 1.4 kg/cm2, una velocidad de reflujo de entre aproximadamente 35 litros por metro por hora (LMH) y aproximadamente 50 LMH y en donde el paso (b) da por resultado una concentración de 5X y por lo menos 5 diavolúmehes de regulador de pH son intercambiados.

15. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque tanto la concentración por UF como el intercambio de regulador de pH por DF ocurren en el paso (d) lo que da por resultado por lo menos una concentración de 2X y el intercambio de por lo menos 8 diavolúmenes de regulador de pH, en donde el regulador de pH de intercambio en el paso (d) comprende, dentro de 10% de variación, 200 mM de sacarosa, 100 mM de regulador de pH de fosfato pH 7.0-7.4.

16. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque entre 8.0 logio FFU y 11 logio ;FFU de virus de la influenza son cargadas por mL de medio de afinidad en el paso (c) y en donde el paso (c) además incorpora la exposición a una endonucleasa no específica.

17. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque los virus purificados comprenden menos de 0.0050 ng de endonucleasa no específica por 7.0+0.5 logio FFU de virus.

18. Virus de la influenza purificados caracterizados porque comprenden menos de 0.1 ng de HCD, y menos de 0.3 µ de HCP por 7.0±0.5 logio FFU de virus, en donde los virus de la influenza fueron purificados de un cultivo de células de mamífero.

19. El virus de la influenza purificado de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque las células de mamífero son células MDCK.

20. Una composición inmunogénica caracterizada porque comprende polipéptidos del virus de la influenza de la reivindicación 18.