CN113930353B - 一种耐亚硒酸盐的粘质沙雷氏菌及其还原特性鉴定方法 - Google Patents

一种耐亚硒酸盐的粘质沙雷氏菌及其还原特性鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种耐亚硒酸盐的粘质沙雷氏菌QZB‑1及其还原特性鉴定方法，其保藏编号为GDMCC No.61777。耐亚硒酸盐的粘质沙雷氏菌可耐180mmol/L的高浓度亚硒酸盐，可将有毒的亚硒酸盐还原成低毒的单质纳米硒；将粘质沙雷氏菌株在含有亚硒酸盐的LB培养基中进行培养；测定不同温度、pH和盐浓度对所述粘质沙雷氏菌株生长的影响；对所述粘质沙雷氏菌株进行16S rDNA分析鉴定。本发明在含有亚硒酸盐浓度为1mmol/L的LB培养基中培养时，快速生成红色纳米硒，并在36h内还原亚硒酸盐95％，在微生物治理硒污染水体及土壤等方面有很好的应用前景。

Description

一种耐亚硒酸盐的粘质沙雷氏菌及其还原特性鉴定方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种耐亚硒酸盐的粘质沙雷氏菌及其还原特性鉴定方法。
背景技术
硒(Se)是人体健康所必需的微量元素之一，在过去几十年中受到越来越多的关注。硒元素主要是硒蛋白的组成部分，在甲状腺素代谢、抗氧化防御、免疫功能、生育能力维持、心血管健康，甚至癌症治疗中起着基础性作用。
硒在地壳中的分布极不均匀。土壤和沉积物中硒的浓度范围为0.01至1200 mg/kg。从中国东北部的黑龙江省到西南边境的云南省有一条宽阔的低硒带。据估计，中国72％的国土缺硒(<0.1mg/kg)，约7亿人受到不同程度的硒缺乏的直接影响。以心肌病变和退行性骨关节病为特征的克山病和大骨节病等地方病是典型的缺硒综合征。
硒在高浓度下毒性极大。在中国湖北省恩施和印度旁遮普省都有记录在案的由于硒中毒的慢性和急性事件。与其他金属和类金属相比，硒摄入的范围非常窄，从缺硒到硒中毒水平为40μg/d～400μg/d。人类硒的主要膳食来源于植物体，尽管硒不是植物的必需营养元素。因此，了解影响硒在环境中的动态分布和地球化学行为的因素以及硒是如何进入食物链的，具有重要意义。
微生物在环境中硒的运输和转化过程中起着关键作用，从而影响植物对硒的抗性，进而影响植物对硒的吸收和转运。大量微生物，特别是土壤和水生细菌，被发现能够耐受并还原有毒硒Se(VI)变成元素硒纳米颗粒(SeNPs)。
生物合成SeNPs具有独特的光谱和光学性质、良好的热稳定性、较高的抗氧化活性以及在污染物去除甚至癌症治疗方面的潜力。因此，这些菌株可用于环境污染的修复和SeNPs的绿色合成。在微生物世界中，普遍存在还原环境中的硒化物和硒酸盐的能力。然而，大多数从非含硒环境中分离出来的细菌菌株对硒的耐受性有限，对氧化阴离子的还原效率较小。相比之下，富硒土壤的细菌通常对硒非常耐受，并且能够有效地减少硒氧阴离子，表明这是一种适应性进化。
粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)，又称灵杆菌，是一种产生鲜红色素的细菌，存在于土壤、空气和水中，可生长在动、植物性食品中。粘质沙雷氏菌细菌中最小者，约0.5×(0.5～1.0)微米，近球形短杆菌，但形态多样。粘质沙雷氏菌广泛分布于自然界，是水和土壤中的常居菌群，亦是临床上常见的条件致病菌，人们已从为害植物体器官上的多种有害昆虫体内分离获得了具有杀虫活性的粘质沙雷氏菌。但现有技术中关于耐亚硒酸盐的粘质沙雷氏菌及其还原特性鉴定的相关技术方案尚未见报道。因此，亟需一种耐亚硒酸盐的粘质沙雷氏菌及其还原特性鉴定方法。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有技术中关于耐亚硒酸盐的粘质沙雷氏菌及其还原特性鉴定的相关技术方案尚未见报道。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种耐亚硒酸盐的粘质沙雷氏菌及其还原特性鉴定方法。
本发明是这样实现的，一种耐亚硒酸盐的粘质沙雷氏菌，所述耐亚硒酸盐的粘质沙雷氏菌可耐180mmol/L的高浓度亚硒酸盐，从富硒土壤中筛选获得。所述耐亚硒酸盐的粘质沙雷氏菌为QZB-1，其保藏编号为GDMCC No.61777。
进一步，所述耐亚硒酸盐的粘质沙雷氏菌可高效地将有毒的亚硒酸盐还原成低毒的纳米硒。
本发明的另一目的在于提供一种应用所述的耐亚硒酸盐的粘质沙雷氏菌的耐亚硒酸盐的粘质沙雷氏菌的还原特性鉴定方法，所述耐亚硒酸盐的粘质沙雷氏菌的还原特性鉴定方法包括以下步骤：
步骤一，将所述粘质沙雷氏菌株在含有亚硒酸盐的LB培养基中进行培养；
步骤二，测定不同温度、pH和盐浓度对所述粘质沙雷氏菌株的影响；
步骤三，对所述粘质沙雷氏菌株进行16S rDNA分析鉴定。
进一步，步骤一中，所述亚硒酸盐的浓度为1mmol/L。
进一步，步骤一中，将所述粘质沙雷氏菌株在含有亚硒酸盐的LB培养基中进行培养时，快速生成红色纳米硒，并在36h内还原亚硒酸盐95％。
进一步，步骤二中，所述粘质沙雷氏菌株最适的温度为30℃，适宜pH在 5～11之间，耐盐度可达7.5％的氯化钠。
本发明的另一目的在于提供一种所述的耐亚硒酸盐的粘质沙雷氏菌在硒污染环境的微生物治理中的应用。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的耐亚硒酸盐的粘质沙雷氏菌，可耐受并去除环境中有毒的四价硒。
本发明从富硒土壤中筛选出一株可耐高浓度亚硒酸盐(180mmol/L)的粘质沙雷氏菌，该菌株可高效地将有毒的亚硒酸盐还原成低毒的纳米硒，在含有亚硒酸盐浓度为1mmol/L的LB培养基中培养时，快速生成红色纳米硒，并在36 小时内还原亚硒酸盐95％左右。因为纳米硒相较于亚硒酸盐的低毒性，因此该菌株在硒污染环境的微生物治理方面也有很好的应用前景。同时，本发明还测定了不同温度、pH和盐浓度对该菌株的影响，该菌株最适的温度30℃、适宜 pH在5～11之间，耐盐度可达7.5％的氯化钠。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的耐亚硒酸盐的粘质沙雷氏菌的还原特性鉴定方法流程图。
图2是本发明实施例提供的不同pH对细菌生长的影响图。
图3是本发明实施例提供的不同温度对细菌生长的影响图。
图4是本发明实施例提供的不同盐度对细菌生长的影响图。
图5是本发明实施例提供的基于邻接法构建的细菌系统发育树图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种耐亚硒酸盐的粘质沙雷氏菌及其还原特性鉴定方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
本发明实施例提供的耐亚硒酸盐的粘质沙雷氏菌可耐180mmol/L的高浓度亚硒酸盐，可高效地将有毒的亚硒酸盐还原成低毒的纳米硒，从富硒土壤中筛选获得。所述耐亚硒酸盐的粘质沙雷氏菌为QZB-1，其保藏编号为GDMCC No.61777，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心，地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。请求保藏人和其代理人的姓名为蒋代华，地址为广西大学，广西壮族自治区南宁市西乡塘区大学东路100号，提供的生物材料名称及注明的鉴别特征为Serratia marcescens QZB-1，上述请求保藏的生物材料(株)附有1提议的分类学名称为Serratia marcescens，该生物材料(株)已于2021年7月21日由本保藏中心收到,并登记入册，根据请求,由该日起保存三十年,在期满前收到提供生物材料样品的请求后再延续保存五年，该生物材料(株)的存活性经本保藏中心于2021年7月21日检测，结果是存活。
如图1所示，本发明实施例提供的耐亚硒酸盐的粘质沙雷氏菌的还原特性鉴定方法包括以下步骤：
S101，将所述粘质沙雷氏菌株在含有亚硒酸盐的LB培养基中进行培养；
S102，测定不同温度、pH和盐浓度对所述粘质沙雷氏菌株的影响；
S103，对所述粘质沙雷氏菌株进行16S rDNA分析鉴定。
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
本发明从富硒土壤中筛选出一株可耐高浓度亚硒酸盐(180mmol/L)的粘质沙雷氏菌，该菌株可高效地将有毒的亚硒酸盐还原成低毒的纳米硒，在含有亚硒酸盐浓度为1mmol/L的LB培养基中培养时，快速生成红色纳米硒，并在36 小时内还原亚硒酸盐95％左右。因为纳米硒相较于亚硒酸盐的低毒性，因此该菌株在硒污染环境的微生物治理方面也有很好的应用前景。
测定了不同温度、pH和盐浓度对该菌株的影响，该菌株最适的温度30℃、适宜pH在5-11之间，耐盐度可达7.5％的氯化钠。
对该菌株进行了16S rDNA分析鉴定。
该菌株可耐受并去除环境中有毒的四价硒。
下面结合实验对本发明的技术方案作进一步描述。
pH对菌株生长的影响，如图2所示。
从LB固体培养基上挑取单菌落于50ml液体培养基中培养过夜至对数期，按 5％的比例接种到不同pH的LB液体培养基中。不同pH的LB液体培养基用 0.1mol/LNaOH和0.1mol/LHCl调节培养液pH分别为4、5、6、7、8、9、10、11 (每个梯度设置3个重复)，高温高压灭菌后待使用。接种后将培养基置于30℃培养箱中120r/min避光培养24h。24h后取出，在紫外分光光度计上测定其培养基中OD600nm的波长。
温度对菌株生长的影响，如图3所示。
将配置好的50mL培养基pH调节为7.3±0.3左右，灭菌后接入5％过夜活化的菌悬液，置于温度分别为5、15、20、30、35、40℃的培养箱中120r/min避光培养24h，每种温度下设置3个重复。24h后取出，在紫外分光光度计上测定其培养基中OD600nm的波长。
盐度对菌株生长的影响，如图4所示。
将配置好的50mL培养基pH调节为7.3±0.3左右，向培养液中分别加入1、2、 3.5、5、7、10％的NaCl，灭菌后接入5％过夜活化的菌悬液，置于温度为30℃的培养箱中避光培养，每种盐度下设置3个重复。24h后取出，在紫外分光光度计上测定其培养基中OD600nm的波长。
菌株鉴定
菌株16S rRNA基因片段采用16S rRNA基因通用引物
27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACGGCTACCTTGT ACGACTT-3’)进行PCR扩增。PCR反应体系(50μL)：引物27F和引物1492R(2 0μmol/L)各1.0μL；模板DNA1.0μL；混合酶包括dNTPs(2.5mmol/L)10.0μL，10×Buffer 15.0μL，Taq酶(5.0U/μL)1μL，H2O 21μL。PCR反应程序如下：96℃3min；93℃30s，58℃30s，72℃60s，35个循环；72℃10min，PCR反应结束后，1％的琼脂糖鉴定并使用Axygen凝胶回收试剂盒回收所需PCR产物片段。菌株的PCR扩增产物由通用生物系统(安徽)有限公司完成测序，将所得到测序目的序列添加到NCBI进行Blast比对，挑选与菌株同源性最为接近的种属，使用MEGA7.0进行序列分析，以NJ法构建该菌株的系统发育树，如图5所示。
菌株最适宜的pH范围在5～10之间，除了pH为5和10，pH为6～9时对菌株生长的影响不显著；菌株最适温度为30℃，与低温相比，菌株对高温具有更高的耐性；盐度对菌株的影响较显著，随着盐度的升高，菌株生长量减少。
经过PCR产物序列测定，菌株QZB-1基因PCR产物序列长度为1397bp。将所获得的菌株16S rDNA基因序列通过GenBank中的序列进行基因序列对比，选取与菌株QZB-1同源性高，已定名的模式菌的序列信息。通过MEGA7.0 软件构建系统发育数，如图5所示，菌株QZB-1序列与Serratia marcescens strain PZ11菌株相似性最高，高达99.93％。根据系统发育树分析，鉴定菌株 QZB-1为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescen)。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种耐亚硒酸盐的粘质沙雷氏菌(Serratia marcescen)，其特征在于，所述耐亚硒酸盐的粘质沙雷氏菌从富硒土壤中筛选获得；所述耐亚硒酸盐的粘质沙雷氏菌为QZB-1，其保藏编号为GDMCC No.61777。
2.一种应用如权利要求1所述耐亚硒酸盐的粘质沙雷氏菌的还原特性鉴定方法，其特征在于，所述耐亚硒酸盐的粘质沙雷氏菌的还原特性鉴定方法包括以下步骤：
步骤一，将所述粘质沙雷氏菌株在含有亚硒酸盐的LB培养基中进行培养；
步骤二，测定不同温度、pH和盐浓度对所述粘质沙雷氏菌株的影响；
步骤三，对所述粘质沙雷氏菌株进行16S rDNA分析鉴定。
3.如权利要求2所述的耐亚硒酸盐的粘质沙雷氏菌的还原特性鉴定方法，步骤一中，所述亚硒酸盐的浓度为1mmol/L。
4.如权利要求2所述的耐亚硒酸盐的粘质沙雷氏菌的还原特性鉴定方法，步骤一中，将所述粘质沙雷氏菌株在含有亚硒酸盐的LB培养基中进行培养时，快速生成红色纳米硒，并在36h内还原亚硒酸盐95％。
5.如权利要求2所述的耐亚硒酸盐的粘质沙雷氏菌的还原特性鉴定方法，步骤二中，所述粘质沙雷氏菌株最适的温度为30℃，适宜pH在5～11之间，耐盐程度达到7.5％的氯化钠。
6.一种如权利要求1所述的耐亚硒酸盐的粘质沙雷氏菌在硒污染环境的微生物治理中的应用。
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