JP2010507363A - ウイルスワクチン候補のための無血清ウイルス増殖プラットフォーム - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
本発明はウイルスの増殖方法に関する。特に、本発明は、ウイルス増殖のための最適化条件を提供する。以下のパラメータ、すなわち培地への添加物としての脂質濃縮物、感染前から感染後の温度のシフト、感染多重度、及び感染前培地への血清添加、の最適化を提供する。特に、本発明は初めて、ウイルスを感染させた細胞を、既知組成脂質濃縮物(CDLC)を含む培地中で培養することによるウイルスの増殖方法を提供する。別の実施形態において、CDLCは、ウイルス感染細胞の培養のための実質的に血清を含まない培地に添加される。また別の実施形態において、本発明は、直接ビーズ間移行方法によるウイルス細胞培養物の増殖を提供する。
ヒトパラインフルエンザウイルス1〜3型(hPIV1-3)及び呼吸器合胞体ウイルス(RSV)及びヒトメタニューモウイルス(hMPV)は、パラミクソウイルス科の非分節型のマイナス鎖RNAウイルスである。パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)は、モノネガウイルス目(Mononegavirales)内の科であり、パラミクソウイルス亜科(Paramyxovirinae)とニューモウイルス亜科(Pneumovirinae)からなる。パラインフルエンザウイルスは、パラミクソウイルス科のレスピロウイルス属(Respirovirus)のメンバー(PIV1、PIV2及びPIV3)である。ヒト呼吸器合胞体ウイルス(hRSV)は、ニューモウイルス属(Pneumovirus)の1種であり、世界中で幼児及び小児の間の下気道感染症の単一の最も重要な原因である(Domachowske & Rosenberg, 1999, Clin. Microbio. Rev. 12(2):298-309)。hMPVは、軽度な上気道疾患から重篤な細気管支炎及び肺炎までの範囲の、hRSV感染により引き起こされるものを連想させる臨床症状を有するパラミクソウイルス科の新規メンバーである(Van Den Hoogen et al., 2001, Nature Medicine 7:719-724)。ヒトメタニューモウイルスのゲノム構成はvan den Hoogen et al., 2002, Virology 295:119-132に記載されている。合わせて、hPIV3及びRSV及びhMPVは、入院にまで至らせる小児呼吸器疾患の全症例のおよそ三分の一を占めると考えられている(Hall, 2001, N Eng J Med 344:1917-1927)。
パラインフルエンザウイルス(PIV)感染は、幼児と小児で重症の呼吸器疾患を引き起こす(Taoら、1999, Vaccine 17:1100-08)。感染性パラインフルエンザウイルス感染症は、世界中で呼吸器感染症にかかった小児患者のすべての入院数の約20%を占める。同上。
呼吸器合胞体ウイルス(RSV)は、幼児と小児の重症の下気道疾患の主原因である(Feigenら(編)、1987、Textbook of Pediatric Infectious Diseases中、ダブリュー・ビー・ソンダース(WB Saunders)、フィラデルフィア、1653〜1675頁;New Vaccine Development, Establishing Priorities、第1巻、1985、ナショナルアカデミープレス(National Academy Press)、ワシントンDC、397〜409頁;及びRuuskanenら、1993, Curr. Probl. Pediatr. 23:50-79)。RSV感染の毎年の流行性は世界的に明らかであるが、ある季節のRSV疾患の発症率と重症度は地域により変動する(Hall, 1993, Contemp. Pediatr. 10:92-110)。北半球の温帯地域では、これは通常晩秋に始まり晩春に終わる。1次RSV感染はほとんど6週齢〜2才の小児で起き、まれに院内流行中に生後4週間以内に起きる(Hallら、1979, New Engl. J. Med. 300:393-396)。RSV感染のリスクの高い小児には、特に限定されないが、早産児(Hallら、1979, New Engl. J. Med. 300:393-396)、気管支肺異形成の小児(Groothuisら、1988, Pediatrics 82:199-203)、先天性心疾患(MacDonaldら、New Engl. J. Med. 307:397-400)、先天性又は後天性免疫不全症(Ograら、1988, Pediatr. Infect. Dis. J. 7:246-249;及びPohlら、1992, J. Infect. Dis. 165:166-169)、及び嚢胞性繊維症(Abmanら、1988, J. Pediatr. 113:826-830)がある。RSV感染で入院した心疾患又は肺疾患の幼児の死亡率は、3%〜4%である(Navasら、1992, J. Pediatr. 121:348-354)。
最近、軽い上気道疾患から重症の細気管支炎と肺炎の、ヒト呼吸器合胞体ウイルス(hRSV)感染が引き起こす症状を思わせる臨床症状を有する28人の小児から、パラミクソウイルス科の新しいメンバーが単離された(Van Den Hoogenら、2001, Nature Medicine 7:719-724)。この新しいウイルスは、配列相同性と遺伝子配置に基づきヒトメタニューモウイルス(hMPV)と命名された。研究によりさらに、オランダのほとんどすべての子供は5才までにhMPVに暴露され、このウイルスは少なくとも半世紀ヒトの中を循環していることが証明された。さらにこの感染症の季節性はRSVと類似しており、冬の数ヶ月がピークである(Robinson, 2005, J. Med. Virol. 76:98-105; Williams, 2004, New Engl. J. Med. 350:443-450)。しかしながら、hMPVは、RSVとは異なり、低い率ではあるが年間を通して単離することができる(Robinson, 2005, J. Med. Virol. 76:98-105; Williams, 2004, New Engl. J. Med. 350:443-450)。hMPV感染のリスク因子もまたRSVで見出されるものと類似している。ヒトメタニューモウイルスによる感染の最も高い罹患率は、幼児、高齢者及び免疫不全者において見出されている。ヒトメタニューモウイルスによる感染は、早産の危険のある小児における疾患、未熟児の慢性肺疾患、鬱血性心疾患、及び免疫不全の顕著な負担である(Robinson, 2005, J. Med. Virol. 76:98-105; Williams, 2004, New Engl. J. Med. 350:443-450)。ヒトメタニューモウイルスは最近、北アメリカの患者から単離された(Peretら、2002, J. Infect. Diseases 185:1660-1663)。
組換えウシPIV3ベクターを、ウシPIV3における融合(F)タンパク質及び血球凝集素ノイラミニダーゼ(HN)糖タンパク質の遺伝子を、それぞれヒトPIV3及びNH遺伝子と置き換えることにより構築したことが報告されている(Haller et al., 2000, J Virol 74:11626-11635)。後の刊行物(Tang et al., 2003, J Virol 77:10819-10828)では、RSV F遺伝子のウシ-ヒトPIV3ベクター骨格への挿入によって、RSV Fタンパク質を発現するキメラウイルスを作製したことが記載されている。このキメラウイルスはMEDI-534と名づけられた。これは、動物研究において、生弱毒化二価ワクチンとして機能した。すなわち、MEDI-534で免疫したハムスター及び非ヒト霊長類が、RSV及びhPIV3によるチャレンジからの防御を示し、そしてそれらの動物は、RSV中和抗体及びhPIV3血液凝集阻害血清抗体を生成した(Tang et al., 2003, 前掲;Tang et al., 2004, 前掲)。
本発明は、ウイルスの増殖方法に関する。。ウイルスの増殖のための条件は、例えば本発明のウイルスワクチン候補の製造のために、有益と考えられる強固かつ高収量の細胞培養物を作製するために最適化される。
無血清培地
伝達性海綿状脳症(Asher, 1999, Dev Biol Stand 100: 103-118; Galbraith, 2002, Cytotechnology 39: 117-124)及び偶発的ウイルス(Erickson et al., 1989, Dev Biol Stand 70: 59-66)などの感染因子へのヒトの暴露に関する懸念が高まっていることを考慮して、米国(Food and Drug Administration)及び欧州(European Medicine Evaluation Agency)の規制当局は、生物製剤の製造業者に、その製造プロセスにおける動物起源物質の使用を低減及び排除するように推奨している(Castle and Robertson, 1999, Dev Biol Stand 99: 191-196)。
熱感受性はウイルス系において観察されており、レトロウイルスパッケージング細胞の培養では37℃の代わりに32℃において、感染性ウイルス粒子の収量が最大2〜15倍に増大した(Kaptein et al., 1997, Gene Therapy 4: 172-176; Kotani et al., 1994 Hum Gene Ther 5: 19-28; Lee et al., 1996, Appl Microbiol Biotechnol 45: 477-483)。
「細胞密度効果」は、バッチ培養におけるアデノウイルス産生について観察されており、感染時の細胞密度を増大させると特定のウイルス産生能が低減した(Henry et al., 2004, Biotechnol Bioeng 86: 765-774; Nadeau and Kamen, 2003, Biotechnol Adv 20: 475-489)。慣用の流加(fed-batch)手法を用いて直面した失敗と比較して(Nadeau et al, 2002; Yuk et al., 2004 Biotechnol Bioeng 86: 637-642)、アデノウイルス産生における「細胞密度効果」を克服するために還流培養物を用いた成功があり(Henry et al., 2004, Biotechnol Bioeng 86: 765-774; Yuk et al., 2004 Biotechnol Bioeng 86: 637-642)、これはバッチ及び流加条件下で蓄積する1以上の未同定阻害剤の存在についてほのめかしている。
本発明はウイルスの増殖方法に関する。ある実施形態において、本発明は、マイナス鎖RNAウイルスの増殖方法を提供する。特に、本発明は、非分節型のマイナス鎖RNAウイルス、例えばパラミクソウイルスなどの増殖方法を提供する。具体的には、本発明は、パラインフルエンザウイルス(PIV)及びRSウイルス(RSV)及びメタニューモウイルス(MPV)の増殖方法を提供する。よりさらに具体的には、本発明は、ヒト及びウシ配列を有するPIVの増殖方法を提供する。一実施形態において、本発明の方法を利用してRSVヌクレオチド配列を発現するキメラヒト/ウシPIVを増殖させる。
本発明の方法はまた、組換えウイルスゲノムからウイルスをレスキューする場合に用いることも可能である。
ADCF:動物由来成分不含
CDLC:既知組成(chemically defined)脂質濃縮物
Dpi:感染後日数
Dps:播種後日数
ΔM2-2:M2-2オープンリーディングフレーム欠失を有する組換え生弱毒化RSVウイルス(Jin et al., Vaccine, 2003 pp. 3647-52)
ΔNS-1:NS-1オープンリーディングフレーム欠失を有する組換え生弱毒化RSVウイルス((Jin et al., Vaccine, 2003 pp. 3647-52)
F:融合
FBS:ウシ胎仔血清
HMPV:ヒトメタニューモウイルス
hPIV1-3:ヒトパラインフルエンザウイルス1型、2型又は3型
HN:血球凝集素ノイラミニダーゼ
MEDI-534:キメラウシ/ヒトパラインフルエンザウイルス3型/RSウイルス(Tang et al., 2003 J Virol 77: 10819-1828)
MEDI-559:MEDI-559は、rA2cp248/404/1030ΔSHと称する生弱毒化RSVウイルスである(Karron et al., JID vol 191 p. 1093 (2005))
MOI:感染多重度
PIV3:パラインフルエンザウイルス3型
増殖:ウイルス粒子数の増大
RB:ローラーボトル
MEDI-560又はrcp45 hPIV3:wt HPIV3を冷却継代(45サイクル)した組換え体(Karron et al., Pediatr. Inf. Dis. J. 2003, 22:394-405)
RSV:呼吸器合胞体(RS)ウイルス
SFM:無血清培地
SUB:単回使用バイオリアクター
TCID50:50%組織培養感染量
Vero:アフリカミドリザル腎細胞系
v/v:体積対体積比
本発明は、ウイルスの増殖方法に関する。特定の実施形態では、頑健であり、スケーラブル(拡張可能)でありかつ生産性の高い細胞培養(これは例えば、本発明のウイルスワクチン候補の製造に有益であろう)を生成するためにウイルス増殖の条件を最適化する。一実施形態において、既知組成培地を用いて、動物起源の物質を回避又は低減し、そしてウイルス産生を増大させる。重要なパラメータを特定することができ、生産プロセスは、まず、拡張性、頑健さ、及び再現精度を決定する小規模実験で最適化することができ、後に、ウイルスの大規模生産に適合させることができる。
ウイルス、細菌及び真菌による血清の汚染は、生物医薬の製造に関する問題である。特に、伝達性海綿状脳症(Asher, 1999, Dev Biol Stand 100: 103-118; Galbraith, 2002, Cytotechnology 39: 117-124)及び偶発的ウイルス(Erickson et al., 1989, Dev Biol Stand 70: 59-66)などの感染因子へのヒトの暴露に関する懸念が高まっている。このため、製造プロセスにおける、血清を含まず、動物成分を含まず、タンパク質を含まない培地配合物の採用の原動力となっている(Castle and Robertson, 1999, Dev Biol Stand 99: 191-196)。従って、無血清培地又は実質的に無血清の培地が、細胞の培養のための標準的血清含有培地の代わりとなることが優れている。
本発明は初めて、既知組成脂質濃縮物(CDLC)を含む培地において細胞を培養することによりウイルスを増殖させる方法を提供する。本発明は、ウイルスによる感染の前に、既知組成脂質濃縮物(CDLC)を含む培地において細胞を培養することを想定している。血清を実質的に含まない規定の培地を使用する利点の1つは、汚染及び免疫原性刺激のリスクの回避である。汚染としては、限定されるものではないが、ウイルス、タンパク質及びマイコプラズマが挙げられる。理論により制限されるものではないが、無血清培地へのCDLCの添加は、細胞付着を促進し、それにより哺乳動物培養系におけるエンベロープウイルスの力価を増大する点で有効である。
ある実施形態では、対象のウイルス又はウイルス構築体に感染させる前には、血清を含有する培地中で細胞を培養し、そのウイルス又はウイルス構築体に感染させた後には、無血清培地中で細胞を培養する。特定の実施形態では、血清がウシ胎仔血清であり、培養容積の10%、培養容積の5%、培養容積の2%、又は培養容積の0.5%の濃度で存在する。ある実施形態において、血清は、限定されるものではないが、ウシ胎仔血清、ヒト結成、ウシ新生児(newborn bovine)血清、新生仔牛(newborn calf)血清、ドナーウシ血清、ドナーウマ血清とすることができる。
ある実施形態では、ウイルスへの感染又は対象のウイルス構築体によるトランスフェクションの前には、細胞の増殖に最適の温度で、血清含有培地中で細胞を培養し、そして、ウイルスへの感染又は対象のウイルス構築体によるトランスフェクション後には、より低い温度(対応するウイルス又はウイルスベクターにとって標準的なインキュベーション温度と比較して)で細胞培養物をインキュベートする。特定の実施形態では、ウイルスへの感染又は対象のウイルス構築体によるトランスフェクション前には、血清含有培地中で細胞を37℃又は37℃付近(すなわち37℃±1℃)で培養し、そして、ウイルスへの感染又は対象のウイルス構築体によるトランスフェクション後には、33℃又は33℃付近(すなわち33±1℃)で細胞培養物をインキュベートする。別の実施形態において、ウイルスへの感染又は対象のウイルス構築体によるトランスフェクション前には、37℃又は37℃付近(すなわち37±1℃)で細胞を血清含有培地中で培養し、そして、ウイルスへの感染又は対象のウイルス構築体によるトランスフェクション後には、30℃又は30℃付近(すなわち30±1℃)で細胞培養物をインキュベートする。
本発明は、細胞への感染に使用するウイルス力価を変更することによりウイルス産生を最適化するための方法に関する。単一細胞に感染させるために使用するウイルスの平均数は感染多重度(MOI)と呼ばれる。ウイルスの製造において、MOIの最適なバランスが好ましい。感染あたりのウイルス接種が少なくなるとマスターウイルスバンクの寿命を延長することができるが、ウイルス接種が多くなるとより高いウイルス力価を生じることができる。
一実施形態において、小規模実験を実施して、ウイルス産生のための臨界的プロセスパラメータ及び培養条件を特定し、最適化する。特定の実施形態において、T-フラスコを小規模実験において使用して、ウイルス産生のための臨界的プロセスパラメータ及び培養条件を特定し、最適化する。別の実施形態において、T-フラスコ実験を実施して、感染の時期及び感染後の培養温度が、MEDI-534若しくはMEDI-559又は本明細書に開示するウイルス構築物(例えば限定されるものではないが、ΔM2-2、ΔNS-1若しくはrcp45 hPIV3(MEDI-560)など)の産生に及ぼす複合的影響を調べる。また別の実施形態において、T-フラスコ実験は、ウイルス産生に対する感染前培養培地の影響を評価することができる。
ある実施形態において、本発明の方法を用いて増殖させるウイルスはマイナス鎖RNAウイルスである。ある実施形態において、ウイルスは非分節型のマイナス鎖RNAウイルス、例えばパラミクソウイルスなどである。ある実施形態において、本発明の方法を用いて増殖させるウイルスは、パラインフルエンザウイルス(PIV)及びRSウイルス(RSV)及びメタニューモウイルス(MPV)である。他の実施形態において、本発明は、ヒト及びウシ配列を有するPIVの増殖方法を提供する。一実施形態において、ウイルスは、RSVヌクレオチド配列を発現するキメラヒト/ウシPIVである。特定の実施形態において、増殖させるウイルスはMEDI-534である。別の特定の実施形態において、増殖させるウイルスはMEDI-559である。
ある実施形態において、本発明の方法を用いて哺乳動物細胞系においてウイルスを増殖させる。ある実施形態において、本発明の方法を用いて足場依存的である細胞においてウイルスを増殖させる。本発明の方法により使用する足場依存性細胞は、足場依存性のタイプの細胞から誘導される細胞系、例えば限定されるものではないが、ヒト脂肪幹細胞、ヒト近位尿細管細胞、マウス平滑筋細胞、ヒト内皮細胞、ヒト腎細胞、ヒト大腸細胞、イヌ腎細胞、ハムスター卵巣細胞、ミドリザル腎細胞、ラット小腸細胞、ヒト膀胱細胞、及びヒト前立腺細胞などである。
5.7.1 ウイルス力価の測定
ウイルス力価は、当技術分野で周知の任意の方法、例えば限定されるものではないが、50%における組織培養感染量(TCID50)アッセイにより測定することができる。このアッセイは、ウイルスの能力/感染性を測定し、ウイルスを感染させることができる細胞(例えばVero細胞など)を使用する。特定の実施形態において、TCID50アッセイは次のように実施する。すなわち、Vero細胞をウイルス含有サンプルの添加の2日前に96ウエルプレートに播種する。細胞プレートのロット番号を記録し、細胞継代数が126以上であり、かつ148以下であることを確認するためのツールとして用いる。プレートは100%コンフルエントであり、プレート中の細胞は、ウエル全体において滑らかな連続する単層に分布する。細胞プレートをSkatronTM細胞洗浄機を用いて洗浄する。洗浄したプレートを33±1℃、5±1%CO2インキュベーターに移し、最小10分間インキュベートする。ウイルス増殖培地を、ウイルスの接種前に細胞プレートの各ウエルに入れる。ウイルスはVero細胞単層を含む96ウエルプレート全体で連続希釈し、続いて接種した細胞を6日間インキュベートする。次にプレートを洗浄し、パラホルムアルデヒドで固定し、Numax(登録商標)(RSV-F特異的MAb)と共にインキュベートする。これに続いて、ヤギ抗ヒト西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体と共にインキュベートし、TMB(3,3’, 5,5’-テトラメチルベンジジン, Sigma)を用いて色を検出する。分光光度計を使用して、ウエルの吸収を測定し、値を陰性対照カットオフ値と比較する。次にその単位をKarberの式で使用して、log10 TCID50力価を測定する。同じ実験から得られたサンプルを同じ日に試験し、各ウイルスサンプルにつき4つの複製を使用して、TCID50アッセイに固有のアッセイ間及びアッセイ内の変動を最小限とする。
本発明はまた、本発明のアッセイレジメンを実施するためのキットを提供する。一実施形態において、本発明のキットは無血清培地及び脂質濃縮物を含む。特定の実施形態において、キット中の無血清培地はOptiPROTM SFM又はVP-SFM又はSFM4MegaVirTMであり、脂質濃縮物はCDLCである。別の実施形態において、キットは、1又はそれ以上の容器中に、無血清培地、脂質濃縮物、及びエンベロープウイルスを感染させうる細胞のバイアルを含んでもよい。特定の実施形態において、キットは、Vero細胞のバイアルを1以上含む。別の実施形態において、キットは、無血清培地、脂質濃縮物、エンベロープウイルスを感染させうる細胞の1以上のバイアル、及びエンベロープウイルスの1以上のバイアルを含む。特定の実施形態において、キットは、MEDI-534又はMEDI-559の1以上のバイアルを含有する。 別の実施形態において、本発明のキットは、本発明の方法を実施するためのマニュアルを含む。特定の実施形態において、そのマニュアルは、以下のようなウイルスの増殖を説明する:すなわち、そこでウイルスが十分に増殖することが知られている細胞を最適増殖条件下(例えば血清存在下及び37℃)で増殖させ、細胞をCDLC富化培地(例えば血清を含まない又は血清を実質的に含まない培地)に入れ、細胞にウイルスを感染させ、感染細胞を感染前培養よりも低い温度(例えば33℃又は30℃)で培養する。
5.9 発明の実施形態
1. Vero細胞においてウイルスを増殖させる方法であって、
(a)既知組成脂質濃縮物(chemically-defined lipid concentrate, CDLC)及びマイクロキャリアを含む細胞培養培地にVero細胞を播種することを含む、第1の温度にてバイオリアクター中でVero細胞を培養する工程、
(b)工程(a)で培養したVero細胞に、第1の温度に比べて低い第2の温度にて約0.001〜約0.10の感染多重度で感染させる工程、並びに
(c)工程(c)の細胞培養物から、少なくとも7.0 log10 TCID50/mlのウイルス力価を生じるウイルスを回収する工程、
を含む方法。
2. 前記バイオリアクターが単回使用バイオリアクター(SUB)システムである、実施形態1の方法。
3. SUBが攪拌型タンクリアクターシステムである、実施形態2の方法。
4. 細胞培養培地が無血清培地である、実施形態1の方法。
5. CDLCが1%v/vの濃度まで加えられる、実施形態1の方法。
6. 細胞培養培地が、OptiPROTM SFM、VP-SFM、SFM4MegaVirTM、Ex-Cell VeroTM、又はWMEからなる群より選択される無血清培地である、実施形態4の方法。
7. 既知組成脂質濃縮物が、プルロニックF-68、エチルアルコール、コレステロール、Tween 80、酢酸DL-α-トコフェロール、ステアリン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、アラキドン酸、及びリノレン酸のうちの1以上を含む、実施形態1の方法。
8. 既知組成脂質濃縮物が、プルロニックF-68、エチルアルコール、コレステロール、Tween 80、酢酸DL-α-トコフェロール、ステアリン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、アラキドン酸、及びリノレン酸を含む、実施形態1の方法。
9. 既知組成脂質濃縮物が、100,000mg/LのプルロニックF-68、100,00mg/Lのエチルアルコール、220mg/Lのコレステロール、2,200mg/LのTween 80、70mg/Lの酢酸DL-α-トコフェロール、10mg/Lのステアリン酸、10mg/Lのミリスチン酸、10mg/Lのオレイン酸、10mg/Lのリノール酸、10mg/Lのパルミチン酸、10mg/Lのパルミトレイン酸、2mg/Lのアラキドン酸、及び10mg/Lのリノレン酸を含む、実施形態1の方法。
10. 工程(a)が、約50〜約150rpmの攪拌速度での培養物の攪拌を利用する、実施形態1の方法。
11. 前記攪拌が断続的である、実施形態10の方法。
12. 工程(a)の前記培養条件が、約35%〜約100%の溶存酸素(DO)量を利用する、実施形態11の方法。
13. 第1の温度が約36℃〜約38℃である、実施形態1の方法。
14. 第2の温度が約30℃〜約33℃である、実施形態1の方法。
15. マイクロキャリア濃度が約1〜約4g/Lである、実施形態1の方法。
16. 工程(a)の前記細胞培養物のpHが約6.6〜約7.6である、実施形態1の方法。
17. 工程(a)の後で且つ工程(b)の前に細胞培養培地の約50%〜約90%を交換する、実施形態1の方法。
18. 細胞培養培地を、同じ組成を有する細胞培養培地と交換する、実施形態16の方法。
19. 細胞培養培地を、異なる組成を有する細胞培養培地と交換する、実施形態16の方法。
20. 感染多重度が約0.01である、実施形態1の方法。
21. 工程(c)においてVero細胞を2〜12日間培養する、実施形態1の方法。
22. ウイルスがマイナス鎖RNAウイルスである、実施形態1の方法。
23. マイナス鎖RNAウイルスが非分節型ウイルスである、実施形態21の方法。
24. ウイルスがパラミクソウイルスである、実施形態22の方法。
25. パラミクソウイルスが組換えパラインフルエンザウイルス又は組換え呼吸器多核体ウイルス又は組換えメタニューモウイルスである、実施形態23の方法。
26. パラインフルエンザウイルスがウシパラインフルエンザウイルスである、実施形態24の方法。
27. ウシパラインフルエンザウイルスがさらに1以上のヒトパラインフルエンザウイルスのヌクレオチド配列を含む、実施形態25の方法。
28. 組換えパラインフルエンザウイルスがさらに呼吸器多核体ウイルスのヌクレオチド配列を含む、実施形態26の方法。
29. 前記回収されたウイルスが少なくとも8.0 log10TCID50/mlのウイルス力価を生じる、実施形態1の方法。
30. 前記回収されたウイルスが少なくとも9.0 log10TCID50/mlのウイルス力価を生じる、実施形態1の方法。
31. 前記Vero細胞を約0.5×105〜2×105細胞/mlの密度で播種する、実施形態1の方法。
32. 工程(a)において前記Vero細胞を少なくとも約8×105細胞/mlの細胞密度にまで培養する、実施形態1の方法。
33. 工程(a)の前記細胞培養物の体積が少なくとも1.5Lである、実施形態1の方法。
34. 工程(a)の前記細胞培養物の体積が少なくとも30Lである、実施形態2の方法。
35. 血清を実質的に含まない細胞培養培地中にウイルスを含むVero細胞培養物上清であって、前記上清が少なくとも7.0 log10 TCID50/mlのウイルス力価を生じる、Vero細胞培養物上清。
36. 前記上清が濃度約0.5〜約2.5g/Lのグルコースを含む、実施形態34の上清。
37. 前記上清が濃度約1.0〜約2.0g/Lの乳酸塩を含む、実施形態34の上清。
38. 前記上清が濃度約2.0〜約4.0g/Lのグルタミンを含む、実施形態34の上清。
39. 前記上清が濃度約1.25〜約2.5mMのアンモニウムイオンを含む、実施形態34の上清。
40. 前記上清が少なくとも8.0 log10 TCID50/mlのウイルス力価を生じる、実施形態34の上清。
41. ウイルスがマイナス鎖RNAウイルスである、実施形態34の上清。
42. マイナス鎖RNAウイルスが非分節型ウイルスである、実施形態40の上清。
43. ウイルスがパラミクソウイルスである、実施形態41の上清。
44. パラミクソウイルスが組換えパラインフルエンザウイルス又は組換え呼吸器多核体ウイルス又は組換えメタニューモウイルスである、実施形態42の上清。
45. パラインフルエンザウイルスがウシパラインフルエンザウイルスである、実施形態43の上清。
46. ウシパラインフルエンザウイルスがさらに1以上のヒトパラインフルエンザウイルスのヌクレオチド配列を含む、実施形態44の上清。
47. 組換えパラインフルエンザウイルスがさらに呼吸器多核体ウイルスのヌクレオチド配列を含む、実施形態45の上清。
48. 工程(a)においてトリプシンを加えない、実施形態10の方法。
49. 工程(a)における前記培養物を、新しいマイクロキャリアを含む新しい培養培地を用いて1:1又は1:5で分割(split)する、実施形態48の方法。
50. 前記分割が工程(b)の前又は感染前に培養中少なくとも1回又は少なくとも2回行われる、実施形態49の方法。
51. 前記方法が、30Lのウイルス採集バッチあたり少なくとも2,000,000、少なくとも9,000,000、少なくとも12,000,000、少なくとも120,000,000のワクチン用量を産生する、実施形態1又は50の方法。
Vero細胞のバイアル(ATCC CCL-81、継代数121)をDMEM+5%(v/v)FBS中で解凍した後、FBS添加培地中で4回継代培養し、それから動物由来成分を含まないOptiPROTM SFM中における無血清増殖に直接馴化した(direct adaptation)。無血清Vero細胞は、OptiPROTM SFM中で10〜15回継代培養した後にバンクとして保管した。以下に挙げる実験で使用したVero細胞は、OptiPROTM SFMバンクを源とした。
足場依存性Vero細胞を、対応する培養体積(T-75フラスコに対し35mL、T-225フラスコに対し100mL、及び850cm2のローラーボトル(RB)に対し350mL)中に5×104細胞/mLで慣用的に播種し、播種後3〜5日(dps)継代培養した。4〜5dps継代培養した培養物については、3dpsに各培養物に対して完全な培地交換を行った。継代培養に備えて、使用済み培地(spent media)を吸引し、細胞をDPBSで2回濯いだ。フラスコからVero細胞を剥離するために、トリプシン-EDTAの0.05%溶液(T-75フラスコでは3mL、T225-フラスコでは6mL、及びRBでは10mL)と共に37℃にてインキュベートした。細胞を剥離させた後、同じ量のアオイマメ(lima bean)トリプシンインヒビター(Worthington Biochemical Corporation, Lakewood, NJ)を加えてトリプシン活性をクエンチした。感染しなかった全てのVero細胞については、T-フラスコ培養物を37℃/5%CO2/95%Rhインキュベーター内で維持し、RB培養物は37℃のインキュベーター中0.3rpmで稼動させたローラーボトル装置に配置した。
MEDI-534ウイルスの構築は以前に詳細に記載されている(Tang et al., 2003)。全ての実験において感染に用いるウイルスのシードストックを生成するために、プラスミドレスキュー(Tang et al., 2003(上掲))により得たMEDI-534を、OptiPROTM SFM中で3日間増殖させたVero細胞のT-225フラスコ培養物に、0.001の感染多重度(MOI)にて加えた。4dpiに培養培地を回収し、10%(v/v)スクロースリン酸で安定化させた後、複数の1mLクリオバイアル中に分取した。ウイルスのシードストックを-80℃にて保存し、使用する直前にのみ解凍した。
T-75フラスコに、(特に断らない限り)35mL OptiPROTM SFM中の1.75×106Vero細胞を播種し、37℃/5%CO2/95%Rhのインキュベーター内で維持した。感染させる時、使用済み培地を各フラスコから取り除き、細胞を2×10mL DPBSで濯いだ。各培地条件のうち1つのフラスコをトリプシン処理し、細胞数を数えた。培養物を感染させるために、残りのフラスコに、適当なMOIのMEDI-534を含むDMEM(特に断らない限り)を加えた。感染後、5%CO2オーバーレイ(overlay)で、加湿したインキュベーター内にてT-フラスコを維持した。
各850cm2ローラーボトル(RB)に、選択した増殖培地中で1.5×107個のVero細胞を播種し、0.3rpmの定速回転で37℃にて維持した。全ての例において、基本増殖培地は、OptiPROTM SFM又はウイルス産生用無血清培地(VP-SFM)(これらもGIBCO/Invitrogen (Carlsbad, CA)より市販されているADCF SFM)とした。幾つかの例では、基本増殖培地に、JRH Biosciences, Inc.(Lenexa, KS)から入手したウシ胎仔血清(FBS)、又はGIBCO/Invitrogenから購入した既知組成の脂質濃縮物(CDLC)を添加した。OptiPROTM+0.5%FBS及びVP-SFM+1%CDLCにおける増殖曲線を作成するために、各培地において同じRB培養物を2つずつ作製してトリプシン処理し、毎日細胞数を数えた。ウイルス産生プロフィールを作成するために、使用済み培地を各RBから除去し、感染直前(3dps)に細胞を300mLのDPBSで濯いだ。各培地条件のうち少なくとも1つのフラスコをトリプシン処理し、細胞数を数えてフラスコあたりの細胞収量を決定し、MOI 0.001で感染させるために加えるのに適当なウイルスの量を計算した。特に断らない限り、MEDI-534を含む500mLのウイリアムスE培地(WME)、すなわち既知組成のADCF基本培地を、感染時に残りのフラスコの各々に加えた。感染後、全てのRBを3rpmの定速回転で33℃にてインキュベートした。
増殖培地は、0.5%(v/v)FBSを添加したOptiPROTM又は1%(v/v)CDLCを添加したVP-SFMとした。CytodexTM 1マイクロキャリアを再水和し、製造業者(Amersham Biosciences AB, Uppsala, Sweden)の推奨にしたがって滅菌した。次にマイクロキャリアビーズを、使用前に適当な増殖培地で1回濯いだ。播種の2時間前に、各250mLガラススピナーフラスコ(Bellco Biotechnology, Inc., Vineland, NJ)に、2g/L CytodexTM 1を含む選択した増殖培地200mLを満たし、60rpmで攪拌させながら37℃/5%CO2/95%Rhにてインキュベートした。スピナーフラスコに接種するために、容器1つあたり2×107個のVero細胞を加えた。全ての培養物を、感染前に、攪拌を60rmpに維持したまま37℃/5%CO2/95%Rhにてインキュベートした。増殖曲線を作成するために、よく混ぜたサンプルをスピナーフラスコから毎日取り出し、核の数を数えた。感染させる前に、各スピナーフラスコからサンプルを取り出して核の数を数え、MOI 0.001で感染させるためのウイルスの量を算出した。感染に備えて、全てのスピナーフラスコの攪拌を停止した。マイクロキャリアービーズが沈降したら、使用済み培地のうちの90%を、MOI 0.001のMEDI-534を含むWMEと交換した。感染後、60rmpで一定に攪拌しながら33℃/5%CO2/95%Rhにて培養物をインキュベートした。
溶存酸素(DO)を空気飽和度50%に維持した3Lの攪拌型タンクバイオリアクター(Applikon, Foster City, CA)内で、バイオリアクター実験を行った。各バイオリアクターは、ADI 1030 Bio Controller(Applikon)及びADI 1035 Bio Console(Applikon)を備えていた。CytodexTM 1マイクロキャリアを用意し、製造業社の指示書に従って使用した。接種の3時間前に、3つのバイオリアクターそれぞれを、1%(v/v) CDLC及び2g/L CytodexTM 1を添加した2LのVP-SFMで満たした。バイオリアクターの内容物を、加熱ブランケット(heating blanket)で37℃まで温め、シングル・マリン・インペラ(single marine impellers)で60rpmで攪拌した。これら3つのバイオリアクターにおけるpH設定値はそれぞれ7.0、7.2及び7.4であった。培養物のpHは、入口ガス中のCO2のパーセンテージによって、及び入口ガス中のCO2のパーセンテージが0%に減少した後に1N NaOH溶液を加えることにより、指定されたレベルに制御した。1つの実験で使用される全ての細胞が同じ継代歴(passage history)を持つように、各実験における全てのバイオリアクターに、複数のRBからプールした細胞を接種した。バイオリアクターの内容物を毎日サンプリングして核数を数え、増殖曲線を作成した。感染に備え、バイオリアクターでの攪拌を停止した。マイクロキャリアビーズが沈降したら、使用済み培地のうち90%を、MOI 0.001のMEDI-534を含むWMEと交換した。感染後、pH及びDO設定値は変えなかったが、温度の設定値を33℃に下げて、攪拌を100rpmに上げた。
感染させたT-フラスコ及びRB培養物の中の培地をサンプリングした後、10%(v/v)スクロースリン酸を加えてウイルスサンプルを安定化させた。感染させたスピナーフラスコ及びバイオリアクターからサンプリングした後、サンプル中のマイクロキャリアビーズを沈降させて、回収した培養上清を10%(v/v)スクロースリン酸で安定化させた。スクロースリン酸で安定化させた全てのウイルスサンプルは、分析するまでただちに−80℃にて保存した。
T-フラスコ及びRBから得た細胞を、血球計又はCedex細胞計数/生死細胞テストシステム(Cedex cell counting and cell viability testing system)(Innovatis Inc., Malvern, PA)のいずれかを製造業社の指図書に従って用いて数えた。マイクロキャリア培養物中の細胞密度は、0.1Mクエン酸中の0.1%クリスタルバイオレット溶液によって放出された核を数えることにより決定した(Hu and Wang, 1987, Biotechnol Bioeng 30: 548-557)。インハウス50%組織培養感染量(in-house 50% tissue culture infective dose(TCID50))アッセイで感染性ウイルス力価を測定し、結果をlog10 TCID50/mLで数量化した。TCID50アッセイに固有のアッセイ間及びアッセイ内の結果の変動を最小限に抑えるために、同じ実験から生じたサンプルは可能な限り同じ日にテストし、各ウイルスサンプル毎に4つの反復試験(複製)を使用した。
MEDI-534産生のための臨界プロセス・パラメータ及び培養条件を確認し、最適化するために、小規模のT-75フラスコ実験を行った。MEDI-534産生に及ぼす感染多重度(MOI)の影響を調べた(図1)。3つのMOIすなわち0.1、0.01及び0.001は、匹敵するピークウイルス力価(6 log10 TCID50/mL)を生ずることが分かったが、最も低い2つのMOIすなわち0.0001及び0.00001は、少なくとも1 log10 TCID50/mLだけ低い最大ウイルス力価を生じた。従って、ウイルス収量を最大にしつつウイルスシードストックを節約するために、後続実験における感染では、0.01〜0.001の範囲のMOIを使用した。
感染の時期及び感染後の培養温度がMEDI-534産生に及ぼす複合的な影響を調べるために、T-フラスコ実験を行った(図2a及び2b)。播種後5日目(5dps)で培養物に感染させることにより、3dpsと比較すると、感染時のVero細胞の数は0.6×107細胞/フラスコから1.7x107細胞/フラスコに増大した。3dpsで感染させた培養物において達成したピークウイルス力価(図2a)は、5dpsで感染させた培養物において測定されたもの(図2b)よりもやや高かった。従って、感染時のVero細胞の数を増やしても、DEMI-534産生を促進することはなかった。しかし、感染後の培養温度を低くシフトする(37℃から33℃に)ことにより、少なくとも1 log10TCID50/mLもピークウイルス力価を著しく上昇させた。フォローアップ研究により、感染後の培養温度が29℃、31℃及び35℃では同じような傾向が見られたが、感染後の温度が33℃の場合よりはやや低いMEDI-534力価を生じたことが分かった。したがって、更に行った全ての実験において、感染後のインキュベーション温度は33℃を使用した。
T-フラスコ実験で、感染前の培養培地がウイルス産生に及ぼす影響を評価した(表I)。感染前の増殖培地を強化するために、播種時にVero培養物にFBSを添加した。OptiPROTM SFMにFBSを加えたところ、3dpsに測定された細胞収量はほぼ倍となり、最大ウイルス力価は少なくとも5倍増大した。FBSの添加レベルを0.5%、2%及び5%としたところ、同等の細胞収量((1.0〜1.1)×107細胞/フラスコ)及びウイルス力価((7.6〜7.8)log10 TCID50/mL)をもたらし、このことは、FBS濃度を上げても細胞の増殖やウイルス産生をさらに高めるものではないことを示唆している。レトロウイルスのパッケージング細胞系で行われた同様の実験において、Lee及びその共同研究者は、血清を加えてレトロウイルスベクターの力価を二倍に増やしたが、ウイルス産生がテストした血清添加範囲(1%〜20%)において用量依存的であることを見出した(Lee et al., 1996, Appl Microbiol Biotechnol 45:477-48)。
T-フラスコを用いたFBS滴定実験の再現精度及びスケーラビリティ(拡張性:scalablity)を決定するために、播種時に0.5%及び2% FBSを添加したRB培養物において細胞収量及びMEDI-534産生を測定した(図3)。OptiPROTM SFM培養物の細胞収量は、培養物を1.5x107細胞/RBで接種したとしても、3dpsでたったの1.9x107細胞/RBであった。これに対し、Vero細胞のT-フラスコ培養物は、OptiPROTM SFM中1.75x106細胞/フラスコで播種したのだが、3日後の培養物中の細胞数は3倍であった(表I)。これらの結果は、OptiPROTM SFMが静置培養における細胞増殖を優先的にサポートすることを示している。OptiPROTM SFMに0.5%(v/v)及び2%(v/v) FBSを添加した場合、RB培養物における細胞増殖は、T-フラスコ培養物において観察されたものと相関していた、即ちT-フラスコ(表I)及びRB培養物(図3の図表の説明文)の両方において3日後に細胞数は約6倍に増大していた。3dpsで、OptiPROTM+0.5%(v/v) FBS及びOptiPRO TM+2%(v/v) FBS培養物は、9.3×107細胞/RB及び10.4×107細胞/RBで、それぞれ匹敵する細胞収量をあげた。T-フラスコの結果(表I)と一致して、FBSを添加したRB培養物は、OptiPROTM SFM培養物に比べて著しく高いウイルス力価を生じた。感染前の増殖培地(OptiPROTM SFM)にFBSを添加することで成し得た成功は、細胞増殖及びウイルス産生に対して培養培地により発揮される影響を示している。
FBSの代わりに無血清代替として既知組成脂質濃縮物(CDLC)を評定した。さらに、この実験は、OptiPROTM SFMとVP-SFM(Vero細胞の増殖及びワクチン産生をサポートするために同じ製造業社(GIBCO/Invitrogen)により開発された他の動物由来成分を含まない(ADCF) SFM)との比較も行った。5つの異なる感染前培地について複製で2つずつ作製したRBは、3dpsで以下の細胞収量(図4a)及びピークウイルス力価(図4b)を生じた。データは、表II中に平均±標準偏差で示してある。
2つの感染前増殖培地、すなわちOptiPROTM+0.5%(v/v)FBS及びVP-SFM+1%(v/v)CDLC-における細胞増殖(図5a)及びウイルス産生(図5b)のキネティックスを測定した。FBSを添加した培養物は無血清培地に比べて約30%多くの細胞を産生したが、ピークウイルス力価は同等であった(8.1 log10 TCID50/mL)。MEDI-534産生のキネティックスは感染前培養培地によって明らかに影響を受ける。最大ウイルス力価はOptiPROTM+0.5%(v/v)FBS及びVP-SFM 1%(v/v) CDLC培養物ではそれぞれ4dpi及び5dpiに検出された(図5b)。
VP-SFM中0.5%(v/v)、1%(v/v)及び2%(v/v)のCDLCで滴定したVero培養物は、似たような細胞収量(図6a)及びMEDI-534産生(図6b)を示した。更に行った全ての実験は、感染前無血清Vero細胞増殖培地としてVP-SFM+1%(v/v)CDLCを使用した。
感染後SFMとしてVP-SFM又はVP-SFM+1%(v/v)CDLCを、公知組成の既知組成ADCF SFMであるウイリアムスE培地(WME)(Williams and Gunn, 1974)に置き換えることが実効可能かどうかを調査した(図7)。WMEは非感染培地中ではVero細胞の増殖をサポートしなかったが、感染後培地として優れた性能を示した。VP-SFM+1%(v/v)CDLC、VP-SFM及びWME中で測定された最大ウイルス力価(平均±標準偏差で表わす)はそれぞれ、(7.5±0.2)log10 TCID50/mL、(7.6±0.1)log10 TCID50/mL及び(8.1±0.2)log10 TCID50/mLに相当するものであった。産生プロセスにおける動物由来成分の使用を最低限に抑えるため及び精製プロセスにおいて起こり得る複雑な問題を最小限に抑えるために、血清を添加した培地はテストしなかった。その結果、後に続くMEDI-534を用いた感染は、ウイルス産生培地としてWMEのみを使用した。
スピナーフラスコ実験で、マイクロキャリアにおいて血清を添加した培地(OptiPROTM+0.5%(v/v)FBS)及び無血清培地(VP-SFM+1%(v/v)CDLC)がVero細胞増殖(図8a)及びMEDI-534感染(図8b)をサポートする能力を対比させた。両培地において培養したVero細胞は、CytodexTM 1及びCytodexTM 3上で増殖した。RBでの観察結果(図5a)と一致して、OptiPROTM+0.5%(v/v)FBS培養物はVP-SFM+1%(v/v)CDLC培養物よりも早く増殖した。両感染前培地は、同時に(4dpi)同じピークウイルス力価8.1 log10 TCID50/mLを生じた。しかし、感染性ウイルス力価は、血清を添加した培養物のペアにおいて4dpiから7dpiにかけて平均で2.6 log10 TCID50/mL低下したのに対し、2つの無血清培養物におけるウイルス力価は同じ期間の間に平均で0.4 log10 TCID50/mLしか低下しなかった。RBにおけるOptiPROTM+0.5%(v/v)培養物は、感染性ウイルス力価においてこのような相当量の低下を示さず(図4b及び図5b)、スピナーフラスコ培養物におけるこの現象の原因となるメカニズムは分かっていない。この実験における結果に基づいて、この後に行われたマイクロキャリア実験では全て、Vero細胞の感染前増殖培地としてVP-SFM+1%(v/v)CDLCを使用した。
MEDI-534力価に対して感染時期が及ぼす影響をマイクロキャリア培養物で考察した。ウイルス力価が3dpi及び5dpiで感染させた培養物では同等量であったというT-フラスコでの観察結果(表1)と一致して、4、5及び6dpiに感染させた、複製で2つずつ作製したスピナー培養物は、ほぼ同等のピークMEDI-534力価を生じた(表II)。この「細胞密度効果」は、バッチ培養におけるアデノウイルス産生で観察されており、特異的ウイルス産生能は感染時に細胞密度を増加させることにより低下した(発明の背景、Henry et al., 2004, Biotechnol Bioeng 86: 765-774, Nadeau and Kamen, 2003, Biotechnol Adv 20: 475-489)。培養時間を短くするために、以下の実験では4dpiにマイクロキャリア培養物を感染させた。
無血清MEDI-534産生プロセスのスケーラビリティを査定し培養物のpHに対する細胞増殖及びウイルス産生の依存を評価するために、バイオリアクター実験を行った。3つの並行するバイオリアクター培養物を、それぞれpH設定値7.0、7.2及び7.4に維持した。バイオリアクター培養物中の感染前細胞増殖(図9a)及びウイルス産生プロフィール(図9b)は、VP-SFM+1%CDLCスピナーフラスコ培養物で観察されたもの(図8)と似ていた。このバイオリアクター実験を繰り返すと、8 log10 TCID50/mLの最大ウイルス力価を持つ同様の傾向がみられた。これらの結果は、マイクロキャリアのプロセスを、バイオリアクター内でスケールアップさせることができることを示し、また、細胞増殖及びウイルス産生がpH7.0〜7.4の範囲内で比較的pH依存的であることも示している。T-フラスコ、RB及びスピナーフラスコ培養物中のpHは一般的にかなり変化し、幾つかの例では明白な有害効果もなく培養が進行するに従いpHは7.6から6.8に低下した。
バイオリアクター・プロセスにおけるRSVワクチン産生能を向上させるために、Applikon 3Lバイオリアクターを用いてVero細胞増殖の向上(bettering)を調べた。細胞密度が高ければ、ウイルスを産生する細胞数が多いので、ウイルス力価が高くなると思われる。前のプロセス(段落[00167]を参照されたい)では、2g/LのマイクロキャリアCytodexTM 1及び60rpmの攪拌速度を用いた。Vero細胞増殖及びRSVワクチン産生に対してより早い攪拌速度及びより高いCytodexTM 1密度を調べた。
細胞系及び培養物の維持
Vero細胞系(ATCC CCL-81)を無血清増殖条件用に馴化してバンクとして保管した。このワーキング・セル・バンク(WCB 29Apr03 PN532AC(SF)03BA01 PJS)に由来する細胞を全ての実験で使用した。
MEDI-560はcp45の誘導株であり、hPIV3ウイルスに対する生きた弱毒化ワクチンの候補である。MEDI-560ウイルスのシードストックを−80℃で保存し、使用直前にのみ解凍した。
MEDI-560産生のための感染パラメータを、T25フラスコ中でまずスクリーニングした。T-25フラスコに、4mM L-グルタミン及び1% CDLCを添加したVP-SFM 12mL中6×105個のVero細胞を播種し、37℃/5%CO2/95%Rhインキュベーター内で維持した。播種後3日目に感染を行った。2つのT25フラスコ中の細胞数は、TrypLE溶液で細胞を剥離してVi-Cell生死細胞オートアナライザー(Vi-Cell Cell Viability Analyzer)(Beckman Coulter, Miami, FL. Model Vi-Cell XR)で細胞の数を数えることにより測定した。2つのフラスコから得た平均細胞数を用いて、感染多重度(MOI)0.01 TCID50/細胞に基づいて感染に使用するウイルスシードの量を計算した。複製で2つ作製したT25フラスコに、3種の感染培地(SFM4MegaVir(Hyclone, Logan, UT)、ウイリアムスE培地(Lonza)、及びEx-Cell Vero (SAFC Biosciences JRH):全て4mM L-グルタミンを添加した)中において2つの温度(32℃及び30℃)にてMEDI-560を感染させ、表IVに表わしたように3つの時点(感染後5、6、及び7日目、すなわちdpi)で採集した。培養物は5%CO2/95%Rhのインキュベーター内で維持した。採集する際、各条件の複製で作製した2つのフラスコから使用済み培養培地サンプルを回収し、10%(v/v)の10Xスクロースリン酸(10X SP)緩衝液で安定化させた。全てのサンプルを凍結させ、-60℃以下で保存した。感染性ウイルス力価は、TCID50アッセイを用いて測定した。
3Lの攪拌型タンクバイオリアクター(Applikon, Foster City, CA)で小規模のバイオリアクター実験を行った。各バイオリアクターにはADI 1030 Bio Controller(Applikon)及びADI 1035 Bio Console(Applikon) を備え付けた。CytodexTM 1マイクロキャリアを用意し、製造業社の指示書に従って使用した。
SUB(50L SUB ベーシック・ハードウェア・ユニット)(Hyclone, Logan, UT, Part No. SH3B1744.01))中でのVero細胞増殖では、SUBにおいて30LのVero細胞増殖培地中2g/LのCytodex 1マイクロキャリアと共に1e5細胞/mLの密度で細胞を播種した。NaOH溶液の添加及びCO2のスパージングにより、pHを7.1±0.05に制御した。温度は37℃に維持した。初期培養時間の間、溶存酸素は100%からフロートし、細胞が増殖するに従い、純粋な酸素をスパージングすることにより、空気飽和度50%に維持した。培養初日の間、攪拌速度は125rpmに維持し、残りの期間は100rpmに減速した。
感染させたT-フラスコ及びRB培養物中の培地をサンプリングした後、10%(v/v)スクロースリン酸を加えてウイルスサンプルを安定化させた。感染させたスピナーフラスコ及びバイオリアクターからサンプリングした後、サンプル中のマイクロキャリアビーズを沈降させ、回収した培養上清を、10%(v/v)10Xスクロースリン酸グルタメート緩衝液(10X SPG)で安定化させた。分析するまで、SPGで安定化させた全てのウイルスサンプルをただちに−80℃にて保存した。
T-フラスコ及びRBから得た細胞数及び細胞生存率は、血球計又はVi-Cellアナライザーを用いて製造業社の説明書に従って操作し測定した。バイオリアクター培養物から得た細胞濃度は、ヌクレオカウンター(Nucleocounter)(New Brunswick Scientific, Edison, NJ, M1293-0000)を用いて決定した。Bioprofile 400計器(Nova Biomedical, Waltham, MA, Bioprofile 400)を用いて、グルコース、乳酸塩(lactate)、グルタミン及びアンモニウムの濃度を分析した。ウイルス複製の進行は、50%組織培養感染量(TCID50)アッセイを用いてウイルス感染力を測定することにより分析し、結果をlog10 TCID50/mLで量を示した。
T25フラスコにおける感染パラメータのスクリーニング
異なる感染条件下で使用済み培養培地中の感染性MEDI-560力価をTCID50アッセイにより測定し、図15に表わす。SFM4MegaVir培地中30℃にて感染させた場合(最も高い力価は6dpiに得られた)を例外とした全ての条件で、5dpiに最も高い力価が得られた。SFM4MegaVir及びウイリアムスE培地で30℃という感染条件は、それぞれ8.4及び8.5 logs TCID50/mLという同等のピーク力価を生じた。これらのデータは、MEDI-560が、SFM4MegaVir及びウイリアムスE培地の両方において32℃よりも30℃の方が、より安定であることを表わしている。
図16は、ミリリッターあたりの細胞で測定された細胞密度(細胞/mL)と共に、感染前段階の間の3つのバイオリアクター培養物の細胞増殖プロフィールを表わす。図17は、平方センチメーターあたりの細胞で測定された細胞密度(細胞/cm2)と共に細胞増殖プロフィールを表わす。
Vero細胞培養物を効率的に拡張するために、Vero細胞を付着させたマイクロキャリアビーズからそれらの細胞を剥離した後、新しく加えたマイクロキャリアビーズに付着させて増殖させる必要がある。Vero細胞をマイクロキャリアビーズから剥離して拡張するために、典型的にはトリプシン/EDTAが使用されていた(Sugawara K., et al., Biologicals 2002, 30, 303-314)。しかし、この手法は培養培地の除去及び大量のトリプシン/EDTAの使用を伴うものである。これは、扱いが難しく、コストが高く、且つ汚染の危険性が高い。
Claims (51)
- 血清を実質的に含まない細胞培養培地中にウイルスを感染させたVero細胞を含むVero細胞培養物であって、前記培養物が少なくとも7.0 log10 TCID50/mlのウイルス力価を生じる、Vero細胞培養物。
- 前記細胞培養培地が濃度約0.5〜約2.5g/Lのグルコースを含む、請求項1記載の培養物。
- 前記細胞培養培地が濃度約1.0〜約2.0g/Lの乳酸塩を含む、請求項1記載の培養物。
- 前記細胞培養培地が濃度約2.0〜約4.0g/Lのグルタミンを含む、請求項1記載の培養物。
- 前記細胞培養培地が濃度約1.25〜約2.5mMのアンモニウムイオンを含む、請求項1記載の培養物。
- 前記培養物が少なくとも8.0 log10 TCID50/mlのウイルス力価を生じる、請求項1記載の培養物。
- ウイルスがマイナス鎖RNAウイルスである、請求項1記載の培養物。
- マイナス鎖RNAウイルスが非分節型ウイルスである、請求項7記載の培養物。
- ウイルスがパラミクソウイルスである、請求項8記載の培養物。
- パラミクソウイルスが組換えパラインフルエンザウイルス又は組換え呼吸器多核体ウイルス又は組換えメタニューモウイルスである、請求項9記載の培養物。
- パラインフルエンザウイルスがウシパラインフルエンザウイルスである、請求項10記載の培養物。
- ウシパラインフルエンザウイルスがさらに1以上のヒトパラインフルエンザウイルスのヌクレオチド配列を含む、請求項11記載の培養物。
- 組換えパラインフルエンザウイルスがさらに呼吸器多核体ウイルスのヌクレオチド配列を含む、請求項10記載の培養物。
- Vero細胞においてウイルスを増殖させる方法であって、
(a)既知組成脂質濃縮物(chemically-defined lipid concentrate, CDLC)及びマイクロキャリアを含む細胞培養培地にVero細胞を播種することを含む、第1の温度にてバイオリアクター中でVero細胞を培養する工程、
(b)工程(a)で培養したVero細胞に、第1の温度に比べて低い第2の温度にて約0.001〜約0.10の感染多重度で感染させる工程、並びに
(c)工程(c)の細胞培養物から、少なくとも7.0 log10 TCID50/mlのウイルス力価を生じるウイルスを回収する工程、
を含む方法。 - 前記バイオリアクターが単回使用バイオリアクター(SUB)システムである、請求項14記載の方法。
- SUBが攪拌型タンクリアクターシステム(stirred tank reactor system)である、請求項15記載の方法。
- 細胞培養培地が無血清培地である、請求項14記載の方法。
- CDLCが1%v/vの濃度まで加えられる、請求項14記載の方法。
- 細胞培養培地が、OptiPROTM SFM、VP-SFM、SFM4MegaVirTM、Ex-Cell VeroTM、又はWMEからなる群より選択される無血清培地である、請求項14記載の方法。
- 既知組成脂質濃縮物が、プルロニックF-68、エチルアルコール、コレステロール、Tween 80、酢酸DL-α-トコフェロール、ステアリン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、アラキドン酸、及びリノレン酸のうちの1以上を含む、請求項14記載の方法。
- 既知組成脂質濃縮物が、プルロニックF-68、エチルアルコール、コレステロール、Tween 80、酢酸DL-α-トコフェロール、ステアリン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、アラキドン酸、及びリノレン酸を含む、請求項14記載の方法。
- 既知組成脂質濃縮物が、100,000mg/LのプルロニックF-68、100,00mg/Lのエチルアルコール、220mg/Lのコレステロール、2,200mg/LのTween 80、70mg/Lの酢酸DL-α-トコフェロール、10mg/Lのステアリン酸、10mg/Lのミリスチン酸、10mg/Lのオレイン酸、10mg/Lのリノール酸、10mg/Lのパルミチン酸、10mg/Lのパルミトレイン酸、2mg/Lのアラキドン酸、及び10mg/Lのリノレン酸を含む、請求項14記載の方法。
- 工程(a)が、約50〜約150rpmの攪拌速度での培養物の攪拌を利用する、請求項14記載の方法。
- 前記攪拌が断続的である、請求項23記載の方法。
- 工程(a)の前記培養条件が、約35%〜約100%の溶存酸素(DO)量を利用する、請求項23記載の方法。
- 第1の温度が約36℃〜約38℃である、請求項14記載の方法。
- 第2の温度が約30℃〜約33℃である、請求項14記載の方法。
- マイクロキャリア濃度が約1〜約4g/Lである、請求項14記載の方法。
- 工程(a)の前記細胞培養物のpHが約6.6〜約7.6である、請求項14記載の方法。
- 工程(a)の後で且つ工程(b)の前に細胞培養培地の約50%〜約90%を交換する、請求項14記載の方法。
- 細胞培養培地を、同じ組成を有する細胞培養培地と交換する、請求項14記載の方法。
- 細胞培養培地を、異なる組成を有する細胞培養培地と交換する、請求項14記載の方法。
- 感染多重度が約0.01である、請求項14記載の方法。
- 工程(c)においてVero細胞を2〜12日間培養する、請求項14記載の方法。
- ウイルスがマイナス鎖RNAウイルスである、請求項14記載の方法。
- マイナス鎖RNAウイルスが非分節型ウイルスである、請求項35記載の方法。
- ウイルスがパラミクソウイルスである、請求項36記載の方法。
- パラミクソウイルスが組換えパラインフルエンザウイルス又は組換え呼吸器多核体ウイルス又は組換えメタニューモウイルスである、請求項37記載の方法。
- パラインフルエンザウイルスがウシパラインフルエンザウイルスである、請求項38記載の方法。
- ウシパラインフルエンザウイルスがさらに1以上のヒトパラインフルエンザウイルスのヌクレオチド配列を含む、請求項39記載の方法。
- 組換えパラインフルエンザウイルスがさらに呼吸器多核体ウイルスのヌクレオチド配列を含む、請求項38記載の方法。
- 前記回収されたウイルスが少なくとも8.0 log10TCID50/mlのウイルス力価を生じる、請求項14記載の方法。
- 前記回収されたウイルスが少なくとも9.0 log10TCID50/mlのウイルス力価を生じる、請求項14記載の方法。
- 前記Vero細胞を約0.5×105〜2×105細胞/mlの密度で播種する、請求項14記載の方法。
- 工程(a)において前記Vero細胞を少なくとも約8×105細胞/mlの細胞密度にまで培養する、請求項14記載の方法。
- 工程(a)の前記細胞培養物の体積が少なくとも1.5Lである、請求項14記載の方法。
- 工程(a)の前記細胞培養物の体積が少なくとも30Lである、請求項15記載の方法。
- 工程(a)においてトリプシンを加えない、請求項14記載の方法。
- 工程(a)における前記培養物を、新しいマイクロキャリアを含む新しい培養培地を用いて1:1又は1:5で分割(split)する、請求項48記載の方法。
- 前記分割が工程(b)の前又は感染前に培養中少なくとも1回又は少なくとも2回行われる、請求項49記載の方法。
- 前記方法が、30Lのウイルス採集バッチあたり少なくとも2,000,000、少なくとも9,000,000、少なくとも12,000,000、少なくとも120,000,000のワクチン用量を産生する、請求項14又は50記載の方法。
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