WO2017195745A1 - 培地、アルブミン非含有培地用添加剤および多能性幹細胞の培養方法 - Google Patents

培地、アルブミン非含有培地用添加剤および多能性幹細胞の培養方法 Download PDF

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WO2017195745A1
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stem cells
pluripotent stem
albumin
cells
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美保 古江
佳奈 柳原
信一郎 庄司
正義 塚原
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国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所
協和発酵バイオ株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a medium for serum-free culture of pluripotent stem cells. More specifically, the present invention relates to a medium for stably serum-free pluripotent stem cells that proliferate while maintaining undifferentiation and pluripotency (hereinafter also referred to as pluripotency).
  • the present invention also relates to an additive for albumin-free medium for stably serum-free culture of pluripotent stem cells that proliferate while maintaining undifferentiation and pluripotency. Furthermore, the present invention relates to a serum-free culture method for growing while maintaining the pluripotency of pluripotent stem cells.
  • Human induced pluripotent stem cells are cells that can be induced by introducing 3-4 factor genes into somatic cells.
  • Pluripotent stem cells including human iPS cells have an infinite proliferation ability and have the ability to differentiate into almost all cells in the body (pluripotency). From this characteristic, it is expected that living tissue is artificially produced from a pluripotent stem cell in vitro and transplanted to be applied to cell therapy and regenerative medicine for diseases that have been difficult to treat.
  • pluripotent stem cells may be used as an alternative to difficult-to-obtain human cells. Screening of new drugs, evaluation of drug efficacy, toxicity evaluation of chemical substances, etc., elucidation of the occurrence mechanism, or relationship between gene mutation and disease It is expected to be applied to elucidation.
  • Pluripotent stem cells are preferably cultured in a serum-free medium having a known composition.
  • pluripotent stem cells are cultured using a medium supplemented with an alternative serum factor KSR (knockout-serum replacement) and fibroblast growth factor-2 (FGF-2), mouse fetal tissue-derived fibroblasts, and the like.
  • KSR serum factor receptor
  • FGF-2 fibroblast growth factor-2
  • Use as feeder cells in a medium in which an extracellular matrix such as matrigel, vitronectin, laminin or fibronectin or a recombinant protein thereof is coated without using feeder cells, and FGF-2 or the like is added to the culture supernatant of feeder cells or the like. It has been cultured. In these cultures, heterogeneous components or cells are mixed, and unknown components are mixed at unknown concentrations.
  • KSR is said to be serum-free, but contains animal-derived components with lot differences, and its composition is not disclosed. Furthermore, there is a lot difference with respect to feeder cells and matrigel, and there is a concern that foreign cells may be mixed. When foreign-derived components or cells are mixed in this way, it becomes a factor that makes the culture unstable, and further, it can be infected by viruses or pathogens common to humans and animals, or it can be a foreign antigen, so it is preferably removed from the culture.
  • extracellular matrix components such as vitronectin, laminin or fibronectin or recombinants thereof are used as scaffolding materials, and all of the components are known as culture media.
  • Serum-free medium chemically defined serum-free medium is used. Examples of the medium include TeSR1 medium, TeSR-E8 medium, STEMPRO medium, and hESF-FX medium.
  • the main composition of these media is inorganic salts, amino acids with high glucose-containing DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium) or DMEM / F12 (medium in which DMEM and F12 medium are mixed at 1: 1) as a basic medium. It contains vitamins, sugars and trace components, and is further supplemented with insulin, transferrin, albumin, lipids, growth factors, etc. or mercaptoethanol.
  • albumin particularly human-derived albumin or recombinant albumin is expensive, and the biological activity varies depending on the manufacturer and origin, which can be a factor that makes the medium unstable.
  • bovine-derived albumin also varies in biological activity depending on the manufacturer and lot, and may be contaminated with pathogens. In medical applications, it is necessary to confirm the origin of biological origin, which is expensive.
  • albumin since albumin has an action of conjugating an additive factor in the medium to reduce its effect, if albumin is contained in the medium, it is difficult to detect the influence of the additive factor with high sensitivity. Therefore, it is desirable to replace albumin with a component other than protein or remove it from the medium.
  • Patent Document 1 discloses a medium for culturing a mammal-derived cell line that continuously produces a recombinant protein, which is substantially free of protein components.
  • Patent Document 1 exemplifies an inclusion compound of ⁇ -cyclodextrin, an unsaturated fatty acid and a fat-soluble vitamin as an albumin substitute. It is also disclosed that a mammalian cell line can be cultured by adding a microemulsion of Pluronic (registered trademark) F-68, which is a pluronic nonionic surfactant, and a fat-soluble factor.
  • Pluronic registered trademark
  • Patent Document 2 discloses a method for producing a recombinant protein by culturing animal cells in a protein-free medium, which is supplemented with Pluronic® F-68. A method for producing a recombinant protein in a culture medium is disclosed.
  • Patent Document 3 discloses that polyethylene glycol is used as a substitute for albumin in a medium for culturing animal cells or tissue cells.
  • Non-Patent Document 1 includes a culture medium for embryonic stem cells (ES cells) and polyvinyl alcohol as a substitute for albumin. The addition is disclosed.
  • ES cells embryonic stem cells
  • polyvinyl alcohol as a substitute for albumin. The addition is disclosed.
  • Non-Patent Document 2 discloses that Pluronic (registered trademark) F-68 promotes the differentiation of mesenchymal stem cells (Mesenchymal stem cells).
  • pluripotent stem cells can be cultured while maintaining their undifferentiation and pluripotency.
  • pluripotent stem cells can be cultured while maintaining their undifferentiation and pluripotency, but the cost is high and lots are often not stable.
  • human-derived or recombinant albumin which is a medium component
  • bovine albumin from which biological origin can be confirmed are expensive.
  • the biological activity differs depending on the manufacturer, origin, and transport route, which can be a factor that makes the medium unstable.
  • the present invention provides an albumin-free medium for serum-free culture of pluripotent stem cells that can maintain the undifferentiation and pluripotency of pluripotent stem cells, and is pluripotent.
  • Providing an additive to albumin-free medium for stable and inexpensive serum-free culture of stem cells, and serum-free culture that allows stable and inexpensive growth while maintaining the undifferentiation and pluripotency of pluripotent stem cells It aims to provide a method.
  • the present inventors have found that the above problem can be solved by using at least one selected from the group consisting of a pluronic nonionic surfactant, an animal hydrolyzate and a nonanimal hydrolyzate.
  • the present invention has been completed.
  • the present invention relates to the following (1) to (10).
  • Serum-free pluripotent stem cells that contain at least one selected from the group consisting of pluronic nonionic surfactants, animal hydrolysates and non-animal hydrolysates and do not contain albumin Medium for culturing.
  • the medium according to (1) further comprising at least one of a lipid mixture and water-soluble oleic acid.
  • the pluronic nonionic surfactant is Pluronic (registered trademark) F-68.
  • Non-albumin for serum-free culture of pluripotent stem cells containing at least one selected from the group consisting of pluronic nonionic surfactants, animal hydrolysates and non-animal hydrolysates Additive for medium contained.
  • the culture method according to (8), wherein the serum-free medium is a medium further containing at least one of a lipid mixture and water-soluble oleic acid.
  • the non-animal-based hydrolyzate is EX-CELL (registered trademark) CD Hydrogenate Fusion (manufactured by Sigma-Aldrich).
  • the culture medium albumin-free medium additive and culture method of the present invention
  • at least one selected from the group consisting of a pluronic nonionic surfactant, an animal hydrolyzate and a non-animal hydrolyzate is provided.
  • pluripotent stem cells can be cultured without adding serum-derived components, albumin and recombinants thereof to the medium, and can be stably and inexpensively grown while maintaining their undifferentiation and pluripotency be able to.
  • pluripotent stem cells can be proliferated by serum-free culture having a known composition, which is useful in various researches or regenerative medicine. Therefore, it is possible to remove the anxiety of consumers that arises when using the components derived from mammals and provide highly safe medical care.
  • albumin has an action of conjugating an additive factor to attenuate its effect.
  • the albumin according to the medium of the present invention that does not contain albumin and the additive for a medium not containing albumin, the albumin has high sensitivity. The influence of the additive factor can be detected. Therefore, the medium and the albumin-free medium additive of the present invention are also useful for drug efficacy, toxicity evaluation or screening of low molecular weight compounds.
  • the present invention includes a medium containing at least one selected from the group consisting of a pluronic nonionic surfactant, an animal hydrolyzate, and a non-animal hydrolyzate and does not contain albumin (hereinafter referred to as “this book”). Also referred to as “invention medium”).
  • the medium of the present invention is used for serum-free culture of pluripotent stem cells.
  • stem cells have the ability to self-replicate to produce the same cells as themselves, and to have pluripotency. Refers to cells.
  • Stem cells have hierarchies, and upper undifferentiated stem cells have high self-replicating ability and high pluripotency capable of differentiating into various cell lineages. It is known that it can only differentiate into cell lineages.
  • Cells to be mainly cultured in the medium of the present invention are cells that are relatively higher in the hierarchy, that is, undifferentiated, self-replicating stem cells (pluripotent) that sufficiently retain pluripotency. Sex stem cells).
  • the origin of pluripotent stem cells may be human or non-human animals.
  • a pluripotent stem cell refers to a self-replicating stem cell capable of differentiating into differentiated cells belonging to the three germ layers (ectoderm, mesoderm and endoderm) (also called pluripotency or pluripotency).
  • pluripotent stem cells include embryonic germ cells (Embryonic Germ Cell: EG cells), embryonic cancer cells (Embryonal Carcinoma Cell: EC cells), embryonic stem cells (Embryonic Stem Cells: ES cells), and artificial pluripotent cells. Examples include sex stem cells (induced Pluripotent Stem Cell: iPS cells) and adult pluripotent stem cells (Adult Pluripotent Stem Cell: APS cells).
  • pluripotency can be paraphrased as pluripotency, but refers to the ability to differentiate into any differentiated cell belonging to ectoderm, mesoderm and endoderm, and to germ cells. Differentiation potential can also be encompassed here. Differentiated cells are many types of cells that constitute tissues and organs in the body.
  • serum-free culture means culture without using serum. Therefore, the medium provided herein is a culture that enables proliferation of pluripotent stem cells while maintaining the undifferentiation and pluripotency of undifferentiated pluripotent stem cells without using serum. It means that. *
  • the pluronic nonionic surfactant used in the medium of the present invention means a triblock copolymer type nonionic surfactant of hydrophilic ethylene oxide (EO) and hydrophobic propylene oxide (PO). .
  • EO hydrophilic ethylene oxide
  • PO hydrophobic propylene oxide
  • Pluronic nonionic surfactants include, for example, Pluronic (registered trademark) F-61, Pluronic (registered trademark) F-68, Pluronic (registered trademark) F-71 and Pluronic (registered trademark) F-108. Among these, Pluronic (registered trademark) F-68 is preferable.
  • the content of the pluronic surfactant in the medium of the present invention is preferably 0.001% by mass or more, more preferably 0.005% by mass or more, and further preferably 0.01% by mass or more. . Moreover, it is preferable that it is 10 mass% or less, More preferably, it is 1 mass% or less, More preferably, it is 0.5 mass% or less.
  • the pluripotent stem cells can be efficiently maintained with undifferentiated and pluripotent stem cells, and the adhesion of pluripotent stem cells with undifferentiated and pluripotent maintained. It is effective for proliferation.
  • the number of pluripotent stem cells that are non-cytotoxic and maintain undifferentiated and pluripotent can be increased.
  • Examples of the animal hydrolyzate used in the culture medium of the present invention include meat hydrolyzate and casein hydrolyzate derived from mammals such as milk.
  • Examples of the non-animal hydrolyzate used in the medium of the present invention include soybean, wheat gluten, yeast extract or vegetable-derived hydrolyzate.
  • the animal-based hydrolyzate or non-animal-based hydrolyzate may be substituted for all or part of its components derived from synthesis or fermentation.
  • Examples of the animal hydrolyzate used in the medium of the present invention in which some of the components are derived from synthesis or fermentation include Casein Yeast Peptone (manufactured by Sigma-Aldrich).
  • examples of the non-animal hydrolyzate include EX-CELL (registered trademark) CD Hydrolysate Fusion (manufactured by Sigma-Aldrich).
  • the content of the animal hydrolyzate or non-animal hydrolyzate in the medium of the present invention is preferably 0.0001% by mass or more, more preferably 0.001% by mass or more, and still more preferably 0. 0.005% by mass or more. Moreover, it is preferable that it is 10 mass% or less, More preferably, it is 0.5 mass% or less, More preferably, it is 0.05 mass% or less.
  • the undifferentiation and pluripotency of the pluripotent stem cells can be efficiently maintained, and it has undifferentiation and pluripotency It is effective for adhesion and proliferation of pluripotent stem cells.
  • the number of pluripotent stem cells that have decreased cytotoxicity and maintained undifferentiated and pluripotency can be increased.
  • the medium of the present invention contains at least one selected from the group consisting of pluronic surfactants, animal hydrolysates and non-animal hydrolysates, and two or more of these may be used in combination. it can.
  • the medium of the present invention does not contain albumin.
  • Albumin includes naturally occurring albumin and recombinants thereof.
  • does not contain may be “substantially does not contain”.
  • substantially not containing includes containing in an amount that does not adversely affect.
  • the medium of the present invention may further contain at least one of a lipid mixture and water-soluble oleic acid.
  • lipid mixture means a defined (eg, chemically defined) lipid composition that is required for culturing pluripotent stem cells.
  • the lipid mixture is usually added to a medium that does not contain serum or serum replacement, thereby replacing the lipid normally added to serum or serum replacement formulations.
  • lipid mixture examples include Chemically Defined Lipid Concentrate (manufactured by Thermo Fisher Scientific, catalog number 1195031).
  • the content of the lipid mixture in the medium of the present invention is preferably 0.00001% by mass or more, more preferably 0.00005% by mass or more, and further preferably 0.0001% by mass or more. Moreover, it is preferable that it is 10 mass% or less, More preferably, it is 5 mass% or less, More preferably, it is 2 mass% or less.
  • the content is preferably 0.01 ng / ml or more, more preferably 0.1 ng / ml or more, and further preferably 1 ng / ml. More than ml. Moreover, it is preferable that it is 10 microgram / ml or less, More preferably, it is 1 microgram / ml or less, More preferably, it is 100 ng / ml or less.
  • the medium of the present invention may further contain a medium basic component.
  • the medium basic component is usually composed of a carbon source that can be assimilated by cells, a nitrogen source that can be digested, and an inorganic salt. Specific examples include inorganic salts, amino acids, glucose, and vitamins. Moreover, you may further mix
  • a basal medium known to those skilled in the art can be used.
  • MEM Minimum Essential Medium
  • BME Basic Medium Eagle
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • IMDM Iscove's Modified Dulbecco's Medium
  • GMEM Gas-gow's MEM
  • F12 Ham's F12 Medium
  • CMRL-1066 L-15 medium (Le bovitz's L-15 medium)
  • McCoy's 5A Media 199, MEM ⁇ Media, MCDB105, MCDB131, MCDB153, MCDB201, such as Williams' medium E and ESF can be mentioned.
  • nucleic acid a non-essential amino acid, a reducing agent, or the like may be added to the medium of the present invention.
  • optional components such as a pH adjuster, a buffer component, a humectant, a preservative, or a viscosity adjuster can be used.
  • Additive for albumin-free medium The present invention is characterized by containing at least one selected from the group consisting of a pluronic nonionic surfactant, an animal hydrolyzate and a non-animal hydrolyzate,
  • the present invention relates to an additive for albumin-free medium for serum-free culture of pluripotent stem cells (hereinafter also referred to as “additive of the present invention”).
  • the additive of the present invention contains at least one selected from the group consisting of pluronic nonionic surfactants, animal hydrolysates and non-animal hydrolysates, and a combination of two or more of these. It can also be used.
  • the additive of the present invention is added to a well-known medium basic component not containing albumin for serum-free culture of pluripotent stem cells while maintaining the undifferentiation and pluripotency of pluripotent stem cells.
  • a well-known medium basic component not containing albumin for serum-free culture of pluripotent stem cells while maintaining the undifferentiation and pluripotency of pluripotent stem cells.
  • the additive of the present invention is at least one selected from the group consisting of a conventionally known medium basic component, a pluronic nonionic surfactant, an animal hydrolyzate, and a non-animal hydrolyzate. Is included.
  • pluronic nonionic surfactant animal hydrolyzate and non-animal hydrolyzate, those described above can be used.
  • the content of the pluronic nonionic surfactant is preferably 0.001% by mass or more when mixed with the medium basic component and used as a medium. More preferably, it is 0.005 mass% or more, More preferably, it is 0.01 mass% or more. Moreover, it is preferable that it is 10 mass% or less, More preferably, it is 1 mass% or less, More preferably, it is 0.5 mass% or less.
  • the content of the animal hydrolyzate or non-animal hydrolyzate in the additive of the present invention is 0.0001% by mass or more when mixed with the medium basic component and used as a medium. More preferably, it is 0.001 mass% or more, More preferably, it is 0.005 mass% or more. Moreover, it is preferable that it is 10 mass% or less, More preferably, it is 0.5 mass% or less, More preferably, it is 0.05 mass% or less.
  • the additive of the present invention may further contain at least one of a lipid mixture and water-soluble oleic acid.
  • a lipid mixture those described above can be used, and the content thereof is preferably 0.00001% by mass or more, more preferably 0.00005% by mass or more when the medium is prepared.
  • it is 0.0001 mass% or more.
  • it is preferable that it is 10 mass% or less, More preferably, it is 5 mass% or less, More preferably, it is 2 mass% or less.
  • the content is preferably 0.01 ng / ml or more, more preferably 0.1 ng / ml or more when the medium is prepared. Yes, more preferably 1 ng / ml or more. Moreover, it is preferable that it is 10 microgram / ml or less, More preferably, it is 1 microgram / ml or less, More preferably, it is 100 ng / ml or less.
  • non-identification such as NANOG, OCT3 / 4, SSEA-3, SSEA-4, TRA-2-54, TRA-1-60, TRA-1-80, CD90 or alkaline phosphatase is not used.
  • a differentiation marker it can be determined that cells cultured in the medium of the present invention or the medium produced using the additive of the present invention maintain undifferentiated and pluripotency. . *
  • the expression of at least one of the undifferentiation marker and the differentiation marker is confirmed at the protein level, it can be confirmed by, for example, a flow cytometry method, an immunostaining method, an ELISA or the like using a specific antibody for each marker. .
  • a flow cytometry method an immunostaining method, an ELISA or the like using a specific antibody for each marker.
  • confirming the expression of the marker at the gene level for example, it is confirmed by RT-PCR using a specific primer pair or Northern blotting using a specific probe or transcriptome analysis for each marker gene. be able to.
  • Specific examples of the method for confirming the presence or absence of marker expression by the flow cytometry method include the following methods.
  • Cells cultured in the medium of the present invention or the medium produced using the additive of the present invention are suspended in 1 ml of 10% goat serum for 30 minutes and then centrifuged, and then 30 together with a mouse antibody against the marker protein of interest. Incubate for a period of time, then wash the cultured cells three times with PBS containing 1% goat serum, react with fluorescently labeled (AlexaFluor) -conjugated goat anti-mouse IgG antibody for 30 minutes and contain 1% goat serum Cells washed 3 times with PBS and resuspended can be determined using an appropriate flow cytometry instrument.
  • AlexaFluor fluorescently labeled
  • Specific examples of the method for confirming the presence or absence of marker expression by the immunostaining method include the following methods.
  • Cells cultured in the medium of the present invention or the medium produced using the additive of the present invention are fixed with 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS, washed with PBS several times, and then blocked with 10% goat serum. , And then immunostained with a mouse antibody against the target marker protein, reacted with a fluorescently labeled (AlexaFluor) -conjugated goat anti-mouse IgG, and determined by observation with a fluorescence microscope.
  • PFA paraformaldehyde
  • AlexaFluor fluorescently labeled
  • the permeability of cells cultured with Triton X or the like is increased, and immunostaining is performed using an antibody.
  • Cells cultured with the medium of the present invention or the medium produced using the additive of the present invention are 5 with 4.5 mM citric acid, 2.25 mM sodium citrate, 3 mM sodium chloride, 65% methanol and 4% paraformaldehyde. It can be fixed for a minute, washed with distilled water, and then stained with so-called alkaline phosphatase to visualize alkaline phosphatase using an appropriate kit such as FastRed substrate kit (manufactured by Sigma).
  • the present invention contains at least one selected from the group consisting of pluronic nonionic surfactants, animal hydrolysates and non-animal hydrolysates, and does not contain albumin
  • a method for culturing pluripotent stem cells comprising culturing pluripotent stem cells while maintaining the pluripotency of pluripotent stem cells by culturing pluripotent stem cells in a serum-free medium (hereinafter referred to as pluripotent stem cells) Also referred to as “culture method of the present invention”).
  • the above-mentioned medium 1 can be used.
  • the medium used in the culture method of the present invention includes at least one selected from the group consisting of a pluronic nonionic surfactant, an animal hydrolyzate, and a nonanimal hydrolyzate. Contains and does not contain albumin.
  • the content of the pluronic nonionic surfactant in the culture medium used in the culture method of the present invention is preferably 0.001% by mass or more, more preferably 0.005% by mass or more, and further preferably. Is 0.01% by mass or more. Moreover, it is preferable that it is 10 mass% or less, More preferably, it is 1 mass% or less, More preferably, it is 0.5 mass% or less.
  • the content of the animal hydrolyzate or non-animal hydrolyzate in the medium used in the culture method of the present invention is preferably 0.0001% by mass or more, more preferably 0.001% by mass or more. Yes, more preferably 0.005% by mass or more. Moreover, it is preferable that it is 10 mass% or less, More preferably, it is 0.5 mass% or less, More preferably, it is 0.05 mass% or less.
  • the medium used in the culture method of the present invention may further contain at least one of a lipid mixture and water-soluble oleic acid.
  • a lipid mixture those described above can be used, and the content thereof is preferably 0.00001% by mass or more, more preferably 0.00005% by mass or more when the medium is prepared.
  • it is 0.0001 mass% or more.
  • it is preferable that it is 10 mass% or less, More preferably, it is 5 mass% or less, More preferably, it is 2 mass% or less.
  • the content is preferably 0.01 ng / ml or more, more preferably 0.1 ng, when the medium is prepared. / Ml or more, more preferably 1 ng / ml or more. Moreover, it is preferable that it is 10 microgram / ml or less, More preferably, it is 1 microgram / ml or less, More preferably, it is 100 ng / ml or less.
  • the culture in the culture method of the present invention is usually 33 to 40 ° C., preferably 34 to 39 ° C., more preferably 36 to 37 ° C., usually 1 to 20%, preferably 3 to 15%, more preferably 8 to In the presence of 10% carbon dioxide, it is usually carried out at a relative humidity of 75% or more, preferably 85% or more, more preferably 95% or more, and particularly preferably 100%.
  • Example 1 In a known medium (mESF Basal Medium, manufactured by Wako), 10 ⁇ g / ml insulin (Sigma-Aldrich), 5 ⁇ g / ml apo-transferrin (Sigma-Aldrich), 0.01% by mass of EX- CELL (registered trademark) CD Hydrate Fusion (manufactured by Sigma-Aldrich) and dissolved was used as a medium.
  • mESF Basal Medium manufactured by Wako
  • 10 ⁇ g / ml insulin Sigma-Aldrich
  • 5 ⁇ g / ml apo-transferrin Sigma-Aldrich
  • EX- CELL registered trademark
  • CD Hydrate Fusion manufactured by Sigma-Aldrich
  • pluripotent stem cells While culturing pluripotent stem cells in a serum-free medium containing non-animal hydrolyzate and not containing albumin, the pluripotent stem cells are maintained undifferentiated and pluripotent. It was found that pluripotent stem cells can be proliferated.
  • Example 2 DAPI was used in the same manner as in Example 1 except that 0.05% by mass Pluronic (registered trademark) F-68 (manufactured by Thermo Fisher Scientific) was used in place of EX-CELL (registered trademark) CD Hydrogenation Fusion. And the number of cells expressing OCT3 / 4 were counted.
  • Pluronic registered trademark
  • F-68 manufactured by Thermo Fisher Scientific
  • Pluronic (registered trademark) F-68 promotes differentiation of mesenchymal stem cells (Dogan et al., International International Journal of Nanomedicine 2012: 7-4849-4860). Therefore, by culturing iPS cells, which are pluripotent stem cells, in a serum-free medium containing Pluronic (registered trademark) F-68 and not containing albumin, the differentiation of iPS cells is suppressed. It was unexpected.
  • pluripotent stem cells are maintained in undifferentiated and pluripotent culture by culturing pluripotent stem cells in a serum-free medium containing pluronic nonionic surfactant and not containing albumin. However, it was found that pluripotent stem cells can be proliferated.
  • Example 3 Instead of EX-CELL (registered trademark) CD Hydrate Fusion, 0.2% by mass of lipid mixture (Chemically Defined Lipid Concentrate, manufactured by Thermo Fisher Scientific, catalog number 1195031) and 0.05% by mass of Pluronic (registered trademark) ) The number of cells stained with DAPI and the number of OCT3 / 4 expressing cells were counted in the same manner as in Example 1 except that a medium supplemented with F-68 (manufactured by Thermo Fisher Scientific) was used.
  • plurinic nonionic surfactant was obtained by culturing pluripotent stem cells in a serum-free medium containing no albumin in a medium containing a lipid mixture in addition to a pluronic nonionic surfactant. It was found that the effect of proliferating pluripotent stem cells was further increased while maintaining the undifferentiation and pluripotency of pluripotent stem cells as compared with the case where the agent was contained alone in the medium.
  • Example 4 Instead of 0.01% by mass of EX-CELL® CD Hydroylate Fusion, 0.05% by mass of Pluronic® F-68 (manufactured by Thermo Fisher Scientific) and 0.005% by mass of EX -The number of cells stained with DAPI and the number of cells expressing OCT3 / 4 were counted in the same manner as in Example 1 except that a medium supplemented with CELL (registered trademark) CD Hydrate Fusion (manufactured by Sigma-Aldrich) was used. did.
  • plurinic nonionic interface was obtained by culturing pluripotent stem cells in a medium containing albumin-free serum-free medium containing pluronic nonionic surfactant and non-animal hydrolyzate.
  • the effect of proliferating pluripotent stem cells while maintaining the undifferentiation and pluripotency of pluripotent stem cells compared to the case where an active agent and a non-animal hydrolyzate are each contained alone in the medium was found to increase.
  • Example 5 A medium supplemented with 0.05% by mass Pluronic (registered trademark) F-68 (manufactured by Thermo Fisher Scientific) and 10 ng / mL of water-soluble oleic acid instead of EX-CELL (registered trademark) CD Hydrogenation Fusion The number of cells stained with DAPI and the number of OCT3 / 4-expressing cells were counted in the same manner as Example 1 except that they were used.
  • Pluronic registered trademark
  • F-68 manufactured by Thermo Fisher Scientific
  • plurinic nonionicity is obtained by culturing pluripotent stem cells in a serum-free medium containing no albumin in a medium further containing water-soluble oleic acid in addition to the pluronic nonionic surfactant. It was found that the effect of proliferating pluripotent stem cells was increased while maintaining the undifferentiation and pluripotency of pluripotent stem cells, compared with the case where a surfactant alone was included in the medium. .
  • a serum-free medium containing at least one selected from the group consisting of a pluronic nonionic surfactant, an animal hydrolyzate, and a nonanimal hydrolyzate and not containing albumin. It was found that by culturing sexual stem cells, pluripotent stem cells can be proliferated while maintaining the undifferentiated and pluripotency of pluripotent stem cells. Moreover, by further containing at least one of a lipid mixture and water-soluble oleic acid in the medium, the effect of proliferating pluripotent stem cells can be further improved while maintaining the undifferentiated and pluripotency of pluripotent stem cells. I understood.

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Abstract

本発明は、多能性幹細胞の未分化性および多能性(多分化能)を維持し得る、多能性幹細胞を無血清培養するためのアルブミン非含有培地、アルブミン非含有培地用添加剤および培養方法を提供することを目的とする。本発明の多能性幹細胞を無血清培養するためのアルブミン非含有培地、およびアルブミン非含有培地用添加剤、および培養方法で用いられる培地は、プルロニック系非イオン性界面活性剤、動物系加水分解物および非動物系加水分解物からなる群より選ばれる少なくとも1つを含有することを特徴とする。

Description

培地、アルブミン非含有培地用添加剤および多能性幹細胞の培養方法
 本発明は、多能性幹細胞を無血清培養するための培地に関する。更に詳細には、本発明は、未分化性および多能性(以下、多分化能ともいう。)を維持しつつ増殖する多能性幹細胞を安定して無血清培養するための培地に関する。
 また、本発明は、未分化性および多能性を維持しつつ増殖する多能性幹細胞を安定して無血清培養するためのアルブミン非含有培地用添加剤に関する。さらに、本発明は、多能性幹細胞の多能性を維持しながら増殖させる無血清培養方法に関する。
 ヒト人工多能性幹細胞(induced pluripotent stem cells:iPS細胞)は、体細胞に3~4因子の遺伝子等を導入することにより誘導できる細胞である。ヒトiPS細胞を含む多能性幹細胞は無限増殖の能力を有し、体内の殆ど全ての細胞に分化する能力(多能性)をもつ。この特性から、多能性幹細胞から生体組織を生体外で人工的に作製し、移植することにより、これまで治療が困難であった疾患に対する細胞治療、再生医療への応用が期待されている。また、入手困難なヒト細胞の代替として多能性幹細胞を使用できる可能性があり、新規薬剤のスクリーニング、薬効等の評価、化学物質等の毒性評価、発生機構解明または遺伝子変異と疾患との関連の解明などへの応用が期待されている。
 多能性幹細胞の培養は、既知組成からなる無血清培地で培養することが望ましい。一般的に、多能性幹細胞の培養は、代替血清因子KSR(knockout-serum replacement)および線維芽細胞増殖因子-2(FGF-2)を添加した培地と、マウス胎児組織由来線維芽細胞等をフィーダー細胞として用いて行う。または、フィーダー細胞を用いず、マトリジェル、ビトロネクチン、ラミニン若しくはファイブロネクチンなどの細胞外マトリックスまたはその組換えタンパク質などをコーティングして、フィーダー細胞等の培養上清にFGF-2等を添加した培地で培養されている。これらの培養では、異種由来成分または異種細胞が混入し、未知成分が未知の濃度で混入してしまう。
 KSRは無血清であると言われているが、ロット差のある動物由来成分を含み、その組成は公開されていない。さらに、フィーダー細胞やマトリジェルに関してもロット差があり、異種細胞が混入する可能性も懸念される。このように異種由来成分または異種細胞が混入すると、培養が不安定となる要因となり、さらに人畜共通のウイルスや病原体による感染や異種抗原となり得るため、培養中から除かれることが好ましい。
 そのため、現在では、多能性幹細胞を安全に培養するために、ビトロネクチン、ラミニン若しくはファイブロネクチンなどの細胞外マトリックス成分またはその組換え体を足場材料として用い、培地として、その構成成分のすべてが既知である無血清培地chemically defined serum-free mediumが用いられている。当該培地としては、例えば、TeSR1培地、TeSR-E8培地、STEMPRO培地またはhESF-FX培地などが挙げられる。
 これらの培地の主な組成は、高グルコース含有DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s medium)またはDMEM/F12(DMEMとF12培地を1:1で混合した培地)を基礎培地として、無機塩類、アミノ酸、ビタミン、糖類および微量成分を含み、さらにインシュリン、トランスフェリン、アルブミン、脂質群等、増殖因子等またはメルカプトエタノール等を加えたものとなっている。
 これらの培地添加成分の中でも、アルブミン、特にヒト由来アルブミン、あるいはリコンビナントアルブミンは高価であり、メーカーや由来によって生物活性が異なり、培地が安定しない要因となりうる。また、ウシ由来アルブミンも、メーカーやロットにより生物活性が異なり、病原体の混入の可能性があり、医療応用する場合には、生物由来起源の確認が必要となるため高価となる。さらに、アルブミンは培地中の添加因子を抱合してその効果を減弱させる作用を有するため、アルブミンが培地に含まれていると、該添加因子の影響を高感度に検出しにくい。したがって、アルブミンを蛋白質以外の成分で代替するか、または培地から除去することが望ましい。
 ほ乳動物由来細胞株を培養した例ではあるが、アルブミンを蛋白質以外の成分で代替した培地として以下のものが知られている。
 特許文献1には、組換え蛋白質を持続的に産生するほ乳動物由来細胞株を培養するための培地であって、実質的にタンパク質成分を含まない培地が開示されている。特許文献1には、アルブミン代替物として、α-シクロデキストリンと不飽和脂肪酸、脂溶性ビタミンとの抱接化合物が例示されている。また、プルロニック系非イオン性界面活性剤であるPluronic(登録商標)F-68と脂溶性因子とのマイクロエマルジョンの添加によってもほ乳動物由来細胞株の培養が可能であることが開示されている。
 特許文献2には、タンパク質を含まない培地中で動物細胞を培養し、組換えタンパク質を製造する方法が開示されており、該特許文献には、Pluronic(登録商標)F-68が補充された培地中で組換えタンパク質を生産する方法が開示されている。
 特許文献3には、動物細胞または組織細胞を培養するための培地に、アルブミン代替物としてポリエチレングリコールを用いることが開示されている。
 幹細胞を培養した例では、アルブミンを蛋白質以外の成分で代替した培地として、非特許文献1には、胚性幹細胞(embryonic stem cell:ES細胞)の培養用培地に、アルブミン代替物としてポリビニルアルコールを添加することが開示されている。
 一方、非特許文献2には、Pluronic(登録商標)F-68は、間葉系幹細胞(Mesenchymal stem cell)の分化を促進することが開示されている。
日本国特許第2696001号公報 日本国特許第4257685号公報 日本国特開2004-135672号公報
Ludovic Vallier et. al., PLoS ONE, volume 4, e6082 (2009) Dogan et al., International Journal of Nanomedicine 2012:7 4849-4860
 しかしながら、これらのいずれの文献においても、アルブミンを含有しない培地にプルロニック系非イオン性界面活性剤、動物系加水分解物および非動物系加水分解物からなる群より選ばれる少なくとも1つを添加することにより、多能性幹細胞を、その未分化性および多能性を維持しつつ培養し得ることについては記載も示唆もされていない。
 また、従来の公知の培地では、多能性幹細胞をその未分化性および多能性を維持したまま培養できているものの、コストが高く、ロットが安定しない場合が多くある。特に、培地成分であるヒト由来やリコンビナントのアルブミン、生物由来起源が確認できるウシアルブミンは高価である。更にメーカー、由来、輸送経路によって生物活性が異なり、培地が安定しない要因となり得る。
 したがって、本発明は、多能性幹細胞の未分化性および多能性を維持し得る、多能性幹細胞を安定且つ安価に無血清培養するためのアルブミン非含有培地を提供すること、多能性幹細胞を安定且つ安価に無血清培養するためのアルブミン非含有培地に対する添加剤を提供すること、および多能性幹細胞の未分化性および多能性を維持しながら安定且つ安価に増殖させる無血清培養方法を提供することを目的とする。
 本発明者らは、プルロニック系非イオン性界面活性剤、動物系加水分解物および非動物系加水分解物からなる群より選ばれる少なくとも1つを用いることにより、上記課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成させた。
 すなわち、本発明は、以下の(1)~(10)に関する。
(1)プルロニック系非イオン性界面活性剤、動物系加水分解物および非動物系加水分解物からなる群より選ばれる少なくとも1つを含有し、且つアルブミンを含有しない、多能性幹細胞を無血清培養するための培地。
(2)さらに脂質混合物および水溶性オレイン酸の少なくとも一方を含有する(1)に記載の培地。
(3)プルロニック系非イオン性界面活性剤が、Pluronic(登録商標)F-68である(1)または(2)に記載の培地。
(4)非動物系加水分解物がEX-CELL(登録商標)CD HydrolysateFusion(シグマ-アルドリッチ社製)である(1)~(3)のいずれか1に記載の培地。
(5)プルロニック系非イオン性界面活性剤、動物系加水分解物および非動物系加水分解物からなる群より選ばれる少なくとも1つを含有する、多能性幹細胞を無血清培養するためのアルブミン非含有培地用添加剤。
(6)さらに脂質混合物および水溶性オレイン酸の少なくとも一方を含有する(5)に記載のアルブミン非含有培地用添加剤。
(7)非動物系加水分解物がEX-CELL(登録商標)CD Hydrolysate Fusion(シグマ-アルドリッチ社製)である(5)または(6)に記載のアルブミン非含有培地用添加剤。
(8)プルロニック系非イオン性界面活性剤、動物系加水分解物および非動物系加水分解物からなる群より選ばれる少なくとも1つを含有し、且つアルブミンを含有しない無血清培地中で多能性幹細胞を培養することにより、多能性幹細胞の多能性を維持しながら多能性幹細胞を増殖させる、多能性幹細胞の培養方法。
(9)無血清培地が、さらに脂質混合物および水溶性オレイン酸の少なくとも一方を含有する培地である、(8)に記載の培養方法。
(10)非動物系加水分解物がEX-CELL(登録商標)CD Hydrolysate Fusion(シグマ-アルドリッチ社製)である(8)または(9)に記載の培養方法。
 本発明の培地、アルブミン非含有培地用添加剤および培養方法によれば、プルロニック系非イオン性界面活性剤、動物系加水分解物および非動物系加水分解物からなる群より選ばれる少なくとも1つを含有することにより、培地に血清由来成分、アルブミンおよびその組換え体を添加することなく、多能性幹細胞を培養し、その未分化性および多能性を維持しつつ、安定且つ安価に増殖させることができる。
 本発明の培地、アルブミン非含有培地用添加剤および培養方法によれば、既知組成からなる無血清培養による多能性幹細胞の増殖が可能であり、種々の研究または再生医療等において役立ち、血清等のほ乳動物由来成分を使用する際に生ずる需要者の不安を取り除き、安全性の高い医療を提供することが可能である。
 また、上記したように、アルブミンには添加因子を抱合してその効果を減弱させる作用があるが、アルブミンを含有しない本発明の培地、およびアルブミン非含有培地用添加剤によれば、高感度な該添加因子の影響の検出が可能となる。したがって、本発明の培地およびアルブミン非含有培地用添加剤は、低分子化合物などの薬効、毒性評価またはスクリーニングなどにも有用である。
1.培地
 本発明は、プルロニック系非イオン性界面活性剤、動物系加水分解物および非動物系加水分解物からなる群より選ばれる少なくとも1つを含有し、且つアルブミンを含有しない培地(以下、「本発明の培地」ともいう。)に関する。
 本発明の培地は、多能性幹細胞を無血清培養するために用いられるものであり、本明細書において、「幹細胞」とは、自分と同じ細胞を作る自己複製能と、多分化能を有する細胞のことをいう。
 幹細胞には階層(hierarchy)があり、上位の未分化の幹細胞は自己複製能が高く、さまざまな細胞系列に分化できる多能性も高いが、下位になるほど自己複製能は失われていき特定の細胞系列にしか分化できないようなることが知られている。
 本発明の培地で主として培養しようとする細胞は、階層的には比較的上位に位置する細胞、すなわち、未分化状態であって、多能性が充分保持された自己複製可能な幹細胞(多能性幹細胞)である。多能性幹細胞の由来は、ヒト由来であっても非ヒト動物由来であってもよい。
 多能性幹細胞とは、三胚葉(外胚葉、中胚葉および内胚葉)に属する分化細胞に分化する能力(多分化能、多能性ともいう)のある自己複製可能な幹細胞のことをいう。
 多能性幹細胞としては、例えば、胚性生殖細胞(Embryonic Germ Cell:EG細胞)、胚性癌細胞(Embryonal Carcinoma Cell:EC細胞)、胚性幹細胞(Embryonic Stem Cell:ES細胞)、人工多能性幹細胞(induced Pluripotent Stem Cell:iPS細胞)および成体多能性幹細胞(Adult Pluripotent Stem Cell:APS細胞)などが挙げられる。
 本明細書において、「多能性」とは、多分化能とも言い換えることができるが、外胚葉、中胚葉および内胚葉に属するいずれの分化細胞にも分化しうる能力をいい、生殖細胞への分化能もここでは包含されうる。なお、分化細胞は、体内の組織や臓器を構成する多種類の細胞である。
 本明細書中において、「無血清培養」とは、血清を用いない培養であることを意味する。したがって、本明細書において提供される培地は、血清を用いずとも、未分化の多能性幹細胞の未分化性と多能性とを維持しつつ、多能性幹細胞の増殖を可能とする培養であることを意味する。 
 本発明の培地に用いられるプルロニック系非イオン性界面活性剤とは、親水性のエチレンオキシド(EO)と疎水性のプロピレンオキシド(PO)とのトリブロック共重合型の非イオン界面活性剤を意味する。
 プルロニック系非イオン性界面活性剤としては、例えば、Pluronic(登録商標)F-61、Pluronic(登録商標)F-68、Pluronic(登録商標)F-71およびPluronic(登録商標)F-108などが挙げられ、この中でも、Pluronic(登録商標)F-68が好ましい。
 本発明の培地におけるプルロニック系界面活性剤の含有量は、0.001質量%以上であることが好ましく、より好ましくは0.005質量%以上であり、さらに好ましくは0.01質量%以上である。また、10質量%以下であることが好ましく、より好ましくは1質量%以下であり、さらに好ましくは0.5質量%以下である。
 プルロニック系界面活性剤の含有量を前記範囲とすることにより、多能性幹細胞の未分化性および多能性を効率よく維持でき、未分化性および多能性を維持した多能性幹細胞の接着と増殖に有効である。また、細胞毒性がなく、未分化性および多能性を維持した多能性幹細胞数を増加させることができる。
 本発明の培地に用いられる動物系加水分解物としては、例えば、ミート加水分解物、およびミルク由来などのほ乳類由来カゼイン加水分解物等が挙げられる。本発明の培地に用いられる非動物系加水分解物としては、例えば、ダイズ、コムギグルテン、イーストエキスまたは野菜由来加水分解物等が挙げられる。
 動物系加水分解物または非動物系加水分解物は、その成分の全部または一部が、合成または発酵に由来するものに代替されていてもよい。
 本発明の培地中で使用される、成分の一部が合成または発酵に由来するものに代替された動物系加水分解物としては、例えば、Casein Yeast Peptone(シグマ-アルドリッチ社製)が挙げられる。また、非動物系加水分解物としては、例えば、EX-CELL(登録商標)CD Hydrolysate Fusion(シグマ-アルドリッチ社製)が挙げられる。
 本発明の培地における動物系加水分解物または非動物系加水分解物の含有量は、0.0001質量%以上であることが好ましく、より好ましくは0.001質量%以上であり、さらに好ましくは0.005質量%以上である。また、10質量%以下であることが好ましく、より好ましくは0.5質量%以下であり、さらに好ましくは0.05質量%以下である。
 動物系加水分解物または非動物系加水分解物の含有量を前記範囲とすることにより、多能性幹細胞の未分化性および多能性を効率よく維持でき、未分化性および多能性を持った多能性幹細胞の接着と増殖に有効である。また、細胞毒性が減少し、未分化性および多能性を維持した多能性幹細胞数を増加させることができる。
 本発明の培地においては、プルロニック系界面活性剤、動物系加水分解物および非動物系加水分解物からなる群より選ばれる少なくとも1つを含有し、これらのうち2種類以上を組み合わせて用いることもできる。
 本発明の培地は、アルブミンを含有しないものである。アルブミンには天然由来のアルブミンおよびその組換え体も包含する。本明細書において、「含有しない」とは、「実質的に含有しない」ことであればよい。「実質的に含有しない」とは、悪影響を及ぼさない程度で含有することを包含する。
 本発明の培地は、更に脂質混合物および水溶性オレイン酸の少なくとも一方を含有していてもよい。本明細書において、「脂質混合物」とは、多能性幹細胞を培養するのに必要とされる、規定された(例えば化学的に規定された)脂質組成物を意味する。脂質混合物は、通常、血清または血清代替物を含有しない培地に添加され、それにより、通常は血清または血清代替物の調合物に添加される脂質を代替するものである。
 脂質混合物としては、例えば、Chemically Defined Lipid Concentrate(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、カタログ番号11905031)が挙げられる。
 本発明の培地における脂質混合物の含有量は、0.00001質量%以上であることが好ましく、より好ましくは0.00005質量%以上であり、さらに好ましくは0.0001質量%以上である。また、10質量%以下であることが好ましく、より好ましくは5質量%以下であり、さらに好ましくは2質量%以下である。脂質混合物の含有量を前記範囲とすることにより、未分化性および多能性を維持した細胞数が増加し、その効果はアルブミン添加と同程度である。また、細胞毒性がなく未分化性および多能性を維持した細胞が増加する。
 また、本発明の培地に水溶性オレイン酸を含有させる場合、その含有量は、0.01ng/ml以上であることが好ましく、より好ましくは0.1ng/ml以上であり、さらに好ましくは1ng/ml以上である。また、10μg/ml以下であることが好ましく、より好ましくは1μg/ml以下であり、さらに好ましくは100ng/ml以下である。水溶性オレイン酸の含有量を前記範囲とすることにより、未分化性および多能性を維持した細胞数が増加し、その効果はアルブミン添加と同程度である。また、水溶性オレイン酸の細胞毒性が消失し、未分化性および多能性を維持した細胞数が増加する。
 本発明の培地には、更に培地基礎成分を含んでいてもよい。培地基礎成分とは、通常細胞が同化し得る炭素源、消化しうる窒素源および無機塩からなるものである。具体的には、例えば、無機塩類、アミノ酸、グルコースおよびビタミン類が挙げられる。また培地基礎成分には、必要に応じて微量栄養促進物質または前駆物質などの微量有効物質をさらに配合してもよい。
 このような培地基礎成分としては、当業者に公知の基礎培地を使用することができ、例えば、MEM(Minimum Essential Medium)、BME(Basal Medium Eagle)、DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)、EMEM(Eagle’s minimal essential medium)、IMDM(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium)、GMEM(Glas-gow’s MEM)、F12(Ham’s F12 Medium)、DMEM/F12、RPMI1640、RD、BMOC-3(Brinster’s BMOC-3 Medium)、CMRL-1066、L-15培地(Leibovitz’s L-15 medium)、McCoy’s 5A、Media 199、MEM αMedia、MCDB105、MCDB131、MCDB153、MCDB201、Williams’ medium EおよびESFなどが挙げられる。
 また、本発明の培地には、必要により、核酸、非必須アミノ酸または還元剤などを添加してもよい。さらに必要であれば、pH調整剤、緩衝剤成分、保湿剤、防腐剤または粘度調整剤等の任意成分を使用することもできる。
2.アルブミン非含有培地用添加剤
 本発明は、プルロニック系非イオン性界面活性剤、動物系加水分解物および非動物系加水分解物からなる群より選ばれる少なくとも1つを含有することを特徴とする、多能性幹細胞を無血清培養するためのアルブミン非含有培地用添加剤(以下、「本発明の添加剤」ともいう。)に関する。
 本発明の添加剤は、プルロニック系非イオン性界面活性剤、動物系加水分解物および非動物系加水分解物からなる群より選ばれる少なくとも1つを含有し、これらのうち2種類以上を組み合わせて用いることもできる。
 本発明の添加剤は、従来公知の、アルブミンを含まない培地基礎成分に添加して、多能性幹細胞の未分化性および多能性を維持しつつ、多能性幹細胞を無血清培養するために使用することができる。
 上述のように、本発明の添加剤は、従来公知の培地基礎成分に、プルロニック系非イオン性界面活性剤、動物系加水分解物および非動物系加水分解物からなる群より選ばれる少なくとも1つを含有させるものである。
 プルロニック系非イオン性界面活性剤、動物系加水分解物および非動物系加水分解物については上述したものを使用することができる。
 本発明の添加剤中の、上記プルロニック系非イオン性界面活性剤の含有量は、上記培地基礎成分に混合し、培地としたときの濃度が、0.001質量%以上であることが好ましく、より好ましくは0.005質量%以上であり、さらに好ましくは0.01質量%以上である。また、10質量%以下であることが好ましく、より好ましくは1質量%以下であり、さらに好ましくは0.5質量%以下である。
 本発明の添加剤中の、上記動物系加水分解物または非動物系加水分解物の含有量は、上記培地基礎成分に混合し、培地としたときの濃度が、0.0001質量%以上であることが好ましく、より好ましくは0.001質量%以上であり、さらに好ましくは0.005質量%以上である。また、10質量%以下であることが好ましく、より好ましくは0.5質量%以下であり、さらに好ましくは0.05質量%以下である。
 本発明の添加剤には、更に脂質混合物および水溶性オレイン酸の少なくとも一方を含有させてもよい。脂質混合物としては上述したものを使用することができ、その含有量は、培地を作製した時に、0.00001質量%以上であることが好ましく、より好ましくは0.00005質量%以上であり、さらに好ましくは0.0001質量%以上である。また、10質量%以下であることが好ましく、より好ましくは5質量%以下であり、さらに好ましくは2質量%以下である。
 また、本発明の添加剤に水溶性オレイン酸を含有させる場合、その含有量は、培地を作製した時に、0.01ng/ml以上であることが好ましく、より好ましくは0.1ng/ml以上であり、さらに好ましくは1ng/ml以上である。また、10μg/ml以下であることが好ましく、より好ましくは1μg/ml以下であり、さらに好ましくは100ng/ml以下である。
 本発明の培地、または本発明の添加剤を用いて製造した培地により培養される細胞が未分化性および多能性を維持している細胞であるか否かを確認する方法としては、例えば、各種マーカー(タンパク質)に対する抗体を用いて、未分化マーカーの発現の検出および分化マーカーの発現の不検出の少なくとも一方により判定する方法、各種マーカー(遺伝子)の発現の検出により判定する方法、細胞の形態学的特徴を観察する方法、並びに特定の分化誘導因子の刺激により特定の細胞に分化する能力を発揮できるか否かを判定する方法が挙げられる。
 前記マーカーを用いて判定する方法においては、NANOG、OCT3/4、SSEA-3、SSEA-4、TRA-2-54、TRA-1-60、TRA-1-80、CD90またはアルカリホスファターゼ等の未分化マーカーが発現している場合は、本発明の培地、または本発明の添加剤を用いて製造した培地により培養した細胞が未分化性および多能性を維持していると判断することができる。 
 前記未分化マーカーおよび分化マーカーの少なくとも一方の発現をタンパク質レベルで確認する場合には、例えば、各マーカーに対する特異抗体を用いて、フローサイトメトリー法、免疫染色法またはELISA等により確認することができる。前記マーカーの発現を遺伝子レベルで確認する場合には、例えば、各マーカー遺伝子に対する、特異的プライマー対を用いたRT-PCR若しくは特異的プローブを用いたノーザンブロッティングまたはトランスクリプト―ム解析等によって確認することができる。
 前記フローサイトメトリー法によりマーカーの発現の有無を確認する方法としては、具体的には例えば、次の方法が挙げられる。本発明の培地、または本発明の添加剤を用いて製造した培地により培養した細胞を1mlの10%ヤギ血清中に30分間懸濁後遠心分離し、次に対象のマーカータンパク質に対するマウス抗体とともに30時間インキュベートし、その後当該培養細胞を、1%ヤギ血清を含有するPBSで3回洗浄し、蛍光標識(AlexaFluor)-結合化ヤギ抗マウスIgG抗体と30分間反応させ、1%ヤギ血清を含有するPBSで3回洗浄し、再懸濁した細胞を適切なフローサイトメトリー用機器を用いて判定することができる。
 前記免疫染色法によりマーカーの発現の有無を確認する方法としては、具体的には例えば、次の方法が挙げられる。本発明の培地、または本発明の添加剤を用いて製造した培地により培養した細胞を、PBS中4%パラホルムアルデヒド(PFA)で固定後、複数回PBSにて洗浄後、10%ヤギ血清でブロッキングを行った後、対象マーカータンパク質に対するマウス抗体を用いて免疫染色し、蛍光標識(AlexaFluor)結合ヤギ抗マウスIgGと反応させ、蛍光顕微鏡観察により判定することができる。なお、マーカータンパク質が細胞質内にある場合には、トライトンXなどで培養した細胞の透過性を増加させて、抗体を用いて免疫染色を行う。
 前記アルカリホスファターゼの発現の有無を確認する方法としては、具体的には例えば、次の方法が挙げられる。本発明の培地、または本発明の添加剤を用いて製造した培地により培養した細胞を、4.5mMクエン酸、2.25mMクエン酸ナトリウム、3mM塩化ナトリウム、65%メタノールおよび4%パラホルムアルデヒドで5分間固定し、蒸留水にて洗浄し、次にFastRed基質キット(シグマ社製)等の適当なキットを用い、アルカリホスファターゼを可視化する、いわゆるアルカリホスファターゼ染色することができる。
3.多能性幹細胞の培養方法
 本発明は、プルロニック系非イオン性界面活性剤、動物系加水分解物および非動物系加水分解物からなる群より選ばれる少なくとも1つを含有し、且つアルブミンを含有しない無血清培地中で多能性幹細胞を培養することにより、多能性幹細胞の多能性を維持しながら多能性幹細胞を増殖させることを特徴とする、多能性幹細胞の培養方法(以下、「本発明の培養方法」ともいう。)に関する。
 本発明の培養方法に用いられる培地としては、上記1の培地を使用することができる。上記1に記載のとおり、本発明の培養方法に用いられる培地には、プルロニック系非イオン性界面活性剤、動物系加水分解物および非動物系加水分解物からなる群より選ばれる少なくとも1つを含有し、且つアルブミンを含有しない。
 本発明の培養方法に用いられる培地における、プルロニック系非イオン性界面活性剤の含有量は、0.001質量%以上であることが好ましく、より好ましくは0.005質量%以上であり、さらに好ましくは0.01質量%以上である。また、10質量%以下であることが好ましく、より好ましくは1質量%以下であり、さらに好ましくは0.5質量%以下である。
 本発明の培養方法に用いられる培地における、動物系加水分解物または非動物系加水分解物の含有量は、0.0001質量%以上であることが好ましく、より好ましくは0.001質量%以上であり、さらに好ましくは0.005質量%以上である。また、10質量%以下であることが好ましく、より好ましくは0.5質量%以下であり、さらに好ましくは0.05質量%以下である。
 本発明の培養方法に用いられる培地には、更に脂質混合物および水溶性オレイン酸の少なくとも一方を含有させてもよい。脂質混合物としては上述したものを使用することができ、その含有量は、培地を作製した時に、0.00001質量%以上であることが好ましく、より好ましくは0.00005質量%以上であり、さらに好ましくは0.0001質量%以上である。また、10質量%以下であることが好ましく、より好ましくは5質量%以下であり、さらに好ましくは2質量%以下である。
 また、本発明の培養方法に用いられる培地に水溶性オレイン酸を含有させる場合、その含有量は、培地を作製した時に、0.01ng/ml以上であることが好ましく、より好ましくは0.1ng/ml以上であり、さらに好ましくは1ng/ml以上である。また、10μg/ml以下であることが好ましく、より好ましくは1μg/ml以下であり、さらに好ましくは100ng/ml以下である。
 本発明の培養方法における培養は、通常33~40℃、好ましくは34~39℃、より好ましくは36~37℃にて、通常1~20%、好ましくは3~15%、より好ましくは8~10%の二酸化炭素の存在下で、通常75%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは95%以上、特に好ましくは100%の相対湿度下で行なうことが好ましい。
 本発明の培養方法により培養した細胞が、未分化性および多能性を維持しているか否かを確認する方法としては、上記2に記載の方法を挙げることができる。
 次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
[実施例1]
 公知の培地(mESF Basal Medium、和光社製)に、10μg/mlのインスリン(シグマ-アルドリッチ社製)、5μg/mlのアポ-トランスフェリン(シグマ-アルドリッチ社製)、0.01質量%のEX-CELL(登録商標)CD Hydrolysate Fusion(シグマ-アルドリッチ社製)を添加して、溶解させたものを培地として用いた。細胞としては、ヒトiPS細胞253G1株(京都大学iPS細胞研究所樹立、iPSアカデミアジャパンより入手)を用いた。
 上記培地を、細胞培養用24穴プレート(住友ベークライト社製)に1mLずつ加え、上記細胞を、10%のCO存在下、37℃にて3日間培養した。培養した細胞について、4’,6-ジアミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)で核を染色し、染色された細胞の数をIn cell analyzer(GEヘルスケア社製)を用いてカウントした。また、未分化マーカー遺伝子OCT3/4を発現している細胞のOCT3/4タンパク質を免疫染色し、同様にして、細胞数をカウントした。
 その結果、0.01質量%のEX-CELL(登録商標)CD Hydrolysate Fusionを培地に添加した場合、添加しなかった場合に比べ、DAPIで染色された細胞数が1.28倍に、OCT3/4発現細胞数が1.33倍に増加していた。また、DAPIで染色された細胞数に対するOCT3/4発現細胞数の割合は、EX-CELL(登録商標)CD Hydrolysate Fusionを培地に添加しなかった試験区で74.4%、0.01質量%のEX-CELL(登録商標)CD Hydrolysate Fusionを培地に添加した試験区で77.2%であり、同等であった。
 この結果から、非動物系加水分解物を含有し、且つアルブミンを含有しない無血清培地中で多能性幹細胞を培養することにより、多能性幹細胞の未分化性および多能性を維持しながら、多能性幹細胞を増殖できることがわかった。
[実施例2]
 EX-CELL(登録商標)CD Hydrolysate Fusionに代え、0.05質量%のPluronic(登録商標)F-68(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)を用いた以外、実施例1と同様にして、DAPIで染色された細胞数およびOCT3/4発現細胞数をカウントした。
 その結果、0.05質量%のPluronic(登録商標)F-68を培地に添加した場合、添加しなかった場合に比べ、DAPIで染色された細胞数が1.22倍に、OCT3/4発現細胞数が1.20倍に増加していた。また、DAPIで染色された細胞数に対するOCT3/4発現細胞数の割合は、Pluronic(登録商標)F-68を培地に添加しなかった試験区で74.4%、0.05質量%のPluronic(登録商標)F-68を培地に添加した試験区で73.0%であり、同等であった。
 上述したように、Pluronic(登録商標)F-68は、間葉系幹細胞の分化を促進するという報告(Dogan et al., International Journal of Nanomedicine 2012:7 4849-4860)がある。したがって、Pluronic(登録商標)F-68を含有し、且つアルブミンを含有しない無血清培地で多能性幹細胞であるiPS細胞を培養することにより、iPS細胞の分化が抑制されるという当該結果は、予期せぬものであった。
 この結果から、プルロニック系非イオン性界面活性剤を含有し、且つアルブミンを含有しない無血清培地中で多能性幹細胞を培養することにより、多能性幹細胞の未分化性および多能性を維持しながら、多能性幹細胞を増殖できることがわかった。
[実施例3]
 EX-CELL(登録商標)CD Hydrolysate Fusionに代え、0.2質量%の脂質混合物(Chemically Defined Lipid Concentrate、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、カタログ番号11905031)および0.05質量%のPluronic(登録商標)F-68(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)を添加した培地を用いた以外は、実施例1と同様にして、DAPIで染色された細胞数およびOCT3/4発現細胞数をカウントした。
 その結果、培地にPluronic(登録商標)F-68および脂質混合物を添加すると、Pluronic(登録商標)F-68のみを添加した場合と比べ、DAPIで染色された細胞数およびOCT3/4発現細胞数がともに1.09倍に増加していた。また、DAPIで染色された細胞数に対するOCT3/4発現細胞数の割合は、Pluronic(登録商標)F-68のみを添加した試験区で99.1%、Pluronic(登録商標)F-68および脂質混合物を添加した試験区で99.0%であり、同等であった。
 この結果から、アルブミンを含有しない無血清培地に、プルロニック系非イオン性界面活性剤に加えてさらに脂質混合物を含有させた培地で多能性幹細胞を培養することにより、プルロニック系非イオン性界面活性剤を単独で該培地に含有させた場合と比較して、多能性幹細胞の未分化性および多能性を維持しながら、多能性幹細胞を増殖させる効果がより高まることがわかった。
[実施例4]
 0.01質量%のEX-CELL(登録商標)CD Hydrolysate Fusionに代え、0.05質量%のPluronic(登録商標)F-68(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)および0.005質量%のEX-CELL(登録商標)CD Hydrolysate Fusion(シグマ-アルドリッチ社製)を添加した培地を用いた以外は、実施例1と同様にして、DAPIで染色された細胞数およびOCT3/4発現細胞数をカウントした。
 その結果、培地にPluronic(登録商標)F-68およびEX-CELL(登録商標)CD Hydrolysate Fusionを添加すると、Pluronic(登録商標)F-68を単独で培地に添加した場合よりも、DAPIで染色された細胞数およびOCT3/4発現細胞数がともに1.09倍に増加していた。また、DAPIで染色された細胞数に対するOCT3/4発現細胞数の割合は、Pluronic(登録商標)F-68のみを添加した試験区、Pluronic(登録商標)F-68およびEX-CELL(登録商標)CD Hydrolysate Fusionを添加した試験区でともに99.1%であり、同等であった。
 また、EX-CELL(登録商標)CD Hydrolysate Fusionを単独で培地に添加した試験区と比べた場合も、Pluronic(登録商標)F-68およびEX-CELL(登録商標)CD Hydrolysate Fusionを添加した試験区では、DAPIで染色された細胞数およびOCT3/4発現細胞数がともに増加していた。
 この結果から、アルブミンを含有しない無血清培地に、プルロニック系非イオン性界面活性剤および非動物系加水分解物を含有させた培地で多能性幹細胞を培養することにより、プルロニック系非イオン性界面活性剤および非動物系加水分解物をそれぞれ単独で該培地に含有させた場合と比較して、多能性幹細胞の未分化性および多能性を維持しながら、多能性幹細胞を増殖させる効果がより高まることがわかった。
[実施例5]
 EX-CELL(登録商標)CD Hydrolysate Fusionに代え、0.05質量%のPluronic(登録商標)F-68(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)および10ng/mLの水溶性オレイン酸を添加した培地を用いた以外は実施例1と同様にして、DAPIで染色された細胞数およびOCT3/4発現細胞数をカウントした。
 その結果、培地にPluronic(登録商標)F-68および水溶性オレイン酸を添加すると、Pluronic(登録商標)F-68を単独で添加した場合よりも、DAPIで染色された細胞数およびOCT3/4発現細胞数がともに1.17倍に増加していた。また、DAPIで染色された細胞数に対するOCT3/4発現細胞数の割合は、Pluronic(登録商標)F-68のみを添加した試験区、Pluronic(登録商標)F-68および水溶性オレイン酸を添加した試験区でともに99.1%であり、同等であった。
 この結果から、アルブミンを含有しない無血清培地に、プルロニック系非イオン性界面活性剤に加えて水溶性オレイン酸をさらに含有させた培地で多能性幹細胞を培養することにより、プルロニック系非イオン性界面活性剤を単独で該培地に含有させた場合と比較して、多能性幹細胞の未分化性および多能性を維持しながら、多能性幹細胞を増殖させる効果がより高まることがわかった。
 上記の結果から、プルロニック系非イオン性界面活性剤、動物系加水分解物および非動物系加水分解物からなる群より選ばれる少なくとも1つを含有し、且つアルブミンを含有しない無血清培地で多能性幹細胞を培養することにより、多能性幹細胞の未分化性および多能性を維持しながら多能性幹細胞を増殖できることがわかった。また、該培地にさらに脂質混合物および水溶性オレイン酸の少なくとも一方を含有させることにより、多能性幹細胞の未分化性および多能性を維持しながら多能性幹細胞を増殖させる効果をより向上できることがわかった。
 本発明を特定の態様を参照して詳細に説明したが、本発明の精神と範囲を離れることなく様々な変更および修正が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、2016年5月9日付けで出願された日本特許出願(特願2016-093922)に基づいており、その全体が引用により援用される。また、ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。

Claims (10)

  1.  プルロニック系非イオン性界面活性剤、動物系加水分解物および非動物系加水分解物からなる群より選ばれる少なくとも1つを含有し、且つアルブミンを含有しない、多能性幹細胞を無血清培養するための培地。
  2.  さらに脂質混合物および水溶性オレイン酸の少なくとも一方を含有する請求項1に記載の培地。
  3.  プルロニック系非イオン性界面活性剤が、Pluronic(登録商標)F-68である請求項1または2に記載の培地。
  4.  非動物系加水分解物がEX-CELL(登録商標)CD Hydrolysate Fusion(シグマ-アルドリッチ社製)である請求項1~3のいずれか1項に記載の培地。
  5.  プルロニック系非イオン性界面活性剤、動物系加水分解物および非動物系加水分解物からなる群より選ばれる少なくとも1つを含有する、多能性幹細胞を無血清培養するためのアルブミン非含有培地用添加剤。
  6.  さらに脂質混合物および水溶性オレイン酸の少なくとも一方を含有する請求項5に記載のアルブミン非含有培地用添加剤。
  7.  非動物系加水分解物がEX-CELL(登録商標)CD Hydrolysate Fusion(シグマ-アルドリッチ社製)である請求項5または6に記載のアルブミン非含有培地用添加剤。
  8.  プルロニック系非イオン性界面活性剤、動物系加水分解物および非動物系加水分解物からなる群より選ばれる少なくとも1つを含有し、且つアルブミンを含有しない無血清培地中で多能性幹細胞を培養することにより、多能性幹細胞の多能性を維持しながら多能性幹細胞を増殖させる、多能性幹細胞の培養方法。
  9.  無血清培地が、さらに脂質混合物および水溶性オレイン酸の少なくとも一方を含有する培地である、請求項8に記載の培養方法。
  10.  非動物系加水分解物がEX-CELL(登録商標)CD Hydrolysate Fusion(シグマ-アルドリッチ社製)である請求項8または9に記載の培養方法。
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