KR20230028478A - 항-ctla-4 항체 및 이의 사용 방법 - Google Patents

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코르넬리아 앤 문트
게르드 리터
데이비드 쉬아
제드 데이비드 월초크
타하 멀고브
데이비드 아담 사비츠키
마크 아서 핀데이스
니콜라스 스튜어트 윌슨
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Abstract

본 발명은 인간 CTLA-4에 특이적으로 결합하고, CTLA-4 기능을 길항하는 항체를 제공한다. 또한, 상기 항체를 포함하는 약학적 조성물, 상기 항체를 코딩하는 핵산, 상기 항체를 제조하기 위한 발현 벡터 및 숙주 세포, 및 상기 항체를 사용하여 대상을 치료하는 방법을 제공한다.

Description

항-CTLA-4 항체 및 이의 사용 방법{ANTI-CTLA-4 ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF}
관련 출원
본 출원은 2015년 5월 29일 출원된 미국 가출원 번호 제62/168,391호, 2015년 6월 19일 출원된 제62/182,363호; 2015년 7월 9일 출원된 제62/190,653호; 2015년 11월 18일 출원된 제62/257,202호; 2016년 1월 19일 출원된 제62/280,263호; 2016년 2월 8일 출원된 제62/292,500호; 2016년 2월 12일 출원된 제62/294,558호; 2016년 4월 15일 출원된 제62/323,226호의 이익을 주장하며, 상기 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
기술분야
본 발명은 인간 CTLA-4에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.
T-림프구는 항원에 대한 적응 면역 반응의 핵심이다. 미접촉(naive) T-세포의 완전 활성화에는 적어도 두개의 신호가 필요하다(Bretscher 1999, Proc Natl Acad Sci USA 96:185-90). 첫 번째, 항원-특이적 신호는 항원-제시 세포(APC)상의 T-세포 수용체(TCR)와 MHC/펩타이드 복합체의 상호작용에 의해 제공된다. 두 번째, 공동-자극 신호는 T-세포 상의 수용체와 항원 제시 세포(APC) 상의 리간드 사이의 상호작용에 의해 제공된다. TCR/MHC 및 공동-자극 상호작용 모두의 참여는 칼슘-칼시뉴린 및 RAS 미토겐-활성화 단백질 키나아제를 포함하는 다수의 세포내 경로를 통한 T-세포 활성화 및, IL-2와 같은 사이토킨을 포함하는, 다수의 이펙터 화합물에 대한 전사 인자의 수반되는 활성화를 유도한다. 상기 현상은 T-세포의 증식, CD4+ 헬퍼 T-세포(TH) 풀의 생성 및 활성화된 CD8+ 세포독성 T-세포의 확장을 유도한다. T-세포 활성화를 위해서는 공동-자극이 중요할 뿐만 아니라, TCR/MHC 관련 접종이 없으면 아네르기 및/또는 세포자멸사가 일어난다.
다수의 양성 및 음성 공동-자극 경로가 T-세포 조절에 관여하지만, 가장 중요한 것은 T-세포상의 CD28과 APC상의 B7-1(CD80) 및 B7-2(CD86) 사이이다. CD28은 TH1 표현형 세포로의 T-세포 분화를 촉진하고, B 세포에 의한 항체 생산 및 T-세포의 활성화를 향상시킨다. 수지상 세포(DC) 및 B 세포와 같이 APC 상에 발현되는 B7-1 및 B7-2는 중첩되지만, 별개의 기능을 갖는다. B7-2는 구성적으로 발현되며, TCR/MHC 접종(신호 1)과 일치하는 APC 상에서 급속히 상향조절된다. B7-1 발현은 휴지 세포에서 매우 낮지만, 전형적으로 연장된 T-세포 자극 후에 유도된다. 상기 차이는 B7-2가 T-세포 활성화의 초기화에 중요할 수 있지만, B7-1은 면역 반응을 영속시키는데 더 큰 역할을 할 수 있음을 시사한다.
T-세포 활성화 후, 음성 조절 수용체 세포독성 T-림프구 항원 4(CTLA-4)가 T-세포 상에서 상향조절된다(Alegre et al., 2001, Nat Rev Immunol 1:220-8). CTLA-4는 CD28과 구조적으로 상동성이지만, B7-1 및 B7-2 리간드 모두에 보다 밀접하게 결합한다. CTLA-4는 여러 가지 방법으로 면역 반응을 억제한다: B7 리간드에 대해 CD28과 경쟁하여 공동-자극을 차단하고; 그것은 T-세포 활성화를 억제하기 위해 부정적으로 신호하고; 트랜스-세포내유입(trans-endocytosis)에 의해 반대편 세포로부터 CD80과 CD86을 포획하여 CD28을 통한 보조자극 손상을 유발할 수 있다(Krummel and Allison, 1995, J Exp Med 182:459-465; Walunas et al., 1994, Immunity 1:405-413; Qureshi et al., 2011, Science 332:600-603).
면역 반응의 촉진 및 유지에 있어서 B7 공동-자극 경로의 중요한 역할을 감안할 때, 이 경로를 길항하도록 설계된 치료제는 자가면역 질병 및 장애의 치료에 유망하다.
본 발명은 인간 CTLA-4에 특이적으로 결합하고, CTLA-4 기능, 예를 들어, CTLA-4-매개된 면역 억제를 길항하는 항체를 제공한다. 또한, 상기 항체를 포함하는 약학적 조성물, 상기 항체를 코딩하는 핵산, 상기 항체를 제조하기 위한 발현 벡터 및 숙주 세포, 및 상기 항체를 사용하여 대상을 치료하는 방법이 제공된다. 본원에 기술된 항체는 항원(예를 들어, 종양 항원)에 반응하여 T-세포 활성화를 증가시키고, 및/또는 Treg-매개된 면역 억제를 감소시킴으로써 대상에서 암을 치료하는데 특히 유용하다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 상보성 결정 영역 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 상보성 결정 영역 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 항체를 제공하며:
(a) CDRH1은 SYX1MX2(서열번호: 22)의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 X1은 S 또는 A이고; X2는 N 또는 S이고;
(b) CDRH2는 SISSSSSYIYYADSVKG(서열번호: 2)의 아미노산 서열을 포함하고;
(c) CDRH3은 VGLMGPFXI(서열번호: 23)의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 X는 D 또는 N이고;
(d) CDRL1은 RASQSVX1X2YLX3(서열번호: 24)의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 X1은 S 또는 G이고; X2는 R, S 또는 T이고; X3은 G 또는 A이고;
(e) CDRL2는 X1X2SX3RAT(서열번호: 25)의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 X1은 G 또는 A이고; X2는 A 또는 T이고; X3은 T, S, R 또는 N이고; 그리고
(f) CDRL3은 QQYGX1SPX2T(서열번호: 26)의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 X1은 S 또는 T이고; X2는 W 또는 F이다.
특정 구현예에서, CDRH1은 서열번호: 1 및 27로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, CDRH3은 서열번호: 3 및 28로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, CDRL1은 서열번호: 4, 29 및 30으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, CDRL2는 서열번호: 5 및 31-35로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, CDRL3은 서열번호: 6, 36 및 37로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열번호: 1, 2 및 3; 27, 2 및 3; 또는, 27, 2 및 28에 개시된, CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3은 각각 서열번호: 4, 5 및 6; 29, 32 및 36; 29, 33 및 37; 30, 31 및 6; 29, 34 및 6; 또는, 29, 35 및 37에 개시된 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3은 각각 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5 및 6에 개시된 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상보성 결정 영역 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 상보성 결정 영역 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 CTLA-4 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공하며:
(a) CDRH1은 SYX1MX2(서열번호: 22)의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 X1은 S 또는 A이고; X2는 N 또는 S이고;
(b) CDRH2는 SISSSSSYIYYADSVKG(서열번호: 2)의 아미노산 서열을 포함하고;
(c) CDRH3은 VGLMGPFXI(서열번호: 23)의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 X는 D 또는 N이고;
(d) CDRL1은 RASQSVX1X2YLX3(서열번호: 24)의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 X1은 S 또는 G이고; X2는 R, S 또는 T이고; X3은 G 또는 A이고;
(e) CDRL2는 X1X2SX3RAT(서열번호: 25)의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 X1은 G 또는 A이고; X2는 A 또는 T이고; X3은 T, S, R 또는 N이고; 그리고
(f) CDRL3은 QQYGX1SPX2T(서열번호: 26)의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 X1은 S 또는 T이고; X2는 W 또는 F이다.
특정 구현예에서, CDRH1은 서열번호: 1 및 27로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, CDRH3은 서열번호: 3 및 28로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, CDRL1은 서열번호: 4, 29 및 30으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, CDRL2는 서열번호: 5 및 31-35로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, CDRL3은 서열번호: 6, 36 및 37로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열번호: 1, 2 및 3; 27, 2 및 3; 또는, 27, 2 및 28에 개시된 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3은 각각 서열번호: 4, 5 및 6; 29, 32 및 36; 29, 33 및 37; 30, 31 및 6; 29, 34 및 6; 또는, 29, 35 및 37에 개시된 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상보성 결정 영역 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 상보성 결정 영역 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 CTLA-4 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공하며, CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3은 각각 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5 및 6에 개시된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 72의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 7 및 38-42로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 7 및 38-42로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 93의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 94의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 76의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 97의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 인간 IGHV3-21 생식세포 서열(예를 들어, 서열번호: 9의 아미노산 서열을 갖는, IGHV3-21*01)로부터 유래된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 8 및 43-47로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 8 및 43-47로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 항체는 서열번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 항체는 인간 IGKV3-20 생식세포 서열(예를 들어, 서열번호: 10의 아미노산 서열을 갖는 IGKV3-20*01) 또는 인간 IGKV3-11 생식세포 서열(예를 들어, 서열번호: 11의 아미노산 서열을 갖는 IGKV3-11*01)로부터 유래된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 서열번호: 7 및 38-42로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 CTLA-4 단백질에 특이적으로 결합하는, 단리된 항체를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호: 8 및 43 내지 47로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 CTLA-4 단백질에 특이적으로 결합하는, 단리된 항체를 제공한다 .
또 다른 양태에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간 CTLA-4 단백질에 특이적으로 결합하는, 단리된 항체를 제공하며, 상기 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은, 각각 서열번호: 7 및 8; 7 및 44; 7 및 45; 38 및 8; 38 및 45; 39 및 43; 39 및 45; 39 및 46; 39 및 47; 40 및 43; 40 및 8; 40 및 44; 40 및 45; 41 및 8; 41 및 44; 41 및 45; 41 및 47; 42 및 43; 또는 42 및 45에 개시된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 93의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 94의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 76의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 97의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 인간 IGHV3-21 생식세포 서열로부터 유래된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 인간 IGKV3-20 생식세포 서열 또는 인간 IGKV3-11 생식세포 서열로부터 유래된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 CTLA-4 단백질에 특이적으로 결합하는, 단리된 항체를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 각각 서열번호: 7 및 8에 개시된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 항체와 인간 CTLA-4 단백질에 대한 결합에 대해 교차-경쟁하는 단리된 항체를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 각각 서열번호: 7 및 8에 개시된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 항체와 동일한, 인간 CTLA-4 단백질 상의 에피토프에 결합하는, 단리된 항체를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 인간 CTLA-4의 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 77의 잔기 140-141을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 이들로 구성된, 인간 CTLA-4의 에피토프에 결합한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 77의 잔기 140-141로 구성된 인간 CTLA-4의 에피토프에 결합한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 77의 잔기 140 및 141로 구성된 그룹으로부터 선택된 인간 CTLA-4의 1개 이상의 잔기에 결합한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 77의 잔기 140-143을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 이들로 구성된, 인간 CTLA-4의 에피토프에 결합한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 77의 잔기 140-143으로 구성된 인간 CTLA-4의 에피토프에 결합한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 77의 잔기 135-143을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 이들로 구성된, 인간 CTLA-4의 에피토프에 결합한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 77의 잔기 135-143으로 구성된 인간 CTLA-4의 에피토프에 결합한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 77의 잔기 140-149를 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 이들로 구성된, 인간 CTLA-4의 에피토프에 결합한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 77의 잔기 140-149로 구성된 인간 CTLA-4의 에피토프에 결합한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 77의 잔기 135-149를 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 이들로 구성된, 인간 CTLA-4의 에피토프에 결합한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 77의 잔기 135-149로 구성된 인간 CTLA-4의 에피토프에 결합한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 77의 잔기 80-82를 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 이들로 구성된, 인간 CTLA-4의 에피토프에 결합한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 77의 잔기 80-82로 구성된 인간 CTLA-4의 에피토프에 결합한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 인간 CTLA-4 단백질에 항체가 결합된 후 중수소가 첨가될 때, 인간 CTLA-4 단백질에서 수소를, 서열번호: 77의 잔기 140-141을 포함하는 영역내 중수소로 치환하는 것은 수소/중수소 치환에 의해 결정된 바와 같이, 항체의 부재하에 인간 CTLA-4 단백질에서 수소를 동일한 영역내 중수소로 치환하는 것과 비교하여 실질적으로 감소된다. 특정 구현예에서, 인간 CTLA-4의 영역은 서열번호: 77의 잔기 140-143을 포함한다. 특정 구현예에서, 인간 CTLA-4의 영역은 서열번호: 77의 잔기 135-143을 포함한다. 특정 구현예에서, 인간 CTLA-4의 영역은 서열번호: 77의 잔기 140-149를 포함한다. 특정 구현예에서, 인간 CTLA-4의 영역은 서열번호: 77의 잔기 135-149를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체를 인간 CTLA-4 단백질에 결합한 후 중수소가 첨가될 때, 서열번호: 77의 잔기 80-82를 포함하는 영역내 중수소로 인간 CTLA-4 단백질에서 수소를 치환하는 것은 수소/중수소 치환에 의해 결정된 바와 같이, 항체의 부재하에 인간 CTLA-4 단백질에서 수소를 동일한 영역내 중수소로 치환하는 것과 비교하여 실질적으로 감소된다.
특정 구현예에서, 항체는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 구성된 그룹으로부터 선택된 중쇄 불변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 중쇄 불변 영역은 IgG1이다. 특정 구현예에서, 중쇄 불변 영역은 IgG2이다. 특정 구현예에서, 항체는 인간 IgGκ 및 IgGλ로 구성된 그룹으로부터 선택된 경쇄 불변 영역을 포함한다.
특정 구현예에서, 항체는 야생형 인간 IgG 중쇄 불변 영역의 변이체인 인간 IgG 중쇄 불변 영역을 포함하며, 상기 변이체 인간 IgG 중쇄 불변 영역은 인간 Fc 감마 수용체에 결합하는 야생형 인간 IgG 중쇄 불변 영역보다 높은 친화도로, FcγRIIB 및 FcγRIIA로 구성된 그룹으로부터 선택된 인간 Fc 감마 수용체에 결합한다. 특정 구현예에서, 항체는 야생형 인간 IgG 중쇄 불변 영역의 변이체인 인간 IgG 중쇄 불변 영역을 포함하며, 상기 변이체 인간 IgG 중쇄 불변 영역은 인간 FcγRIIB에 결합하는 야생형 인간 IgG 중쇄 불변 영역보다 높은 친화도로, 인간 FcγRIIB에 결합한다. 특정 구현예에서, 변이체 인간 IgG 중쇄 불변 영역은 변이체 인간 IgG1, 변이체 인간 IgG2, 또는 변이체 인간 IgG4 중쇄 불변 영역이다. 특정 구현예에서, 변이체 인간 IgG 중쇄 불변 영역은 EU 넘버링 시스템에 따라, 다음 아미노산 돌연변이: G236D, P238D, S239D, S267E, L328F 및 L328E 중 하나 이상을 포함한다. 특정 구현예에서, 변이체 인간 IgG 중쇄 불변 영역은 EU 넘버링 시스템에 따라, S267E 및 L328F; P238D 및 L328E; P238D로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 돌연변이 세트, 및 E233D, G237D, H268D, P271G 및 A330R; P238D, E233D, G237D, H268D, P271G 및 A330R; G236D 및 S267E; S239D 및 S267E; V262E, S267E 및 L328F; 및 V264E, S267E 및 L328F로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, 변이체 인간 IgG 중쇄 불변 영역은 인간 FcγRIIIA, 인간 FcγRIIA 또는 인간 FcγRI에 대한 IgG의 친화도를 감소시키는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, FcγRIIB는 대식세포, 단핵구, B 세포, 수지상 세포, 내피 세포 및 활성화된 T 세포로 구성된 그룹으로부터 선택된 세포 상에서 발현된다.
특정 구현예에서, 항체는 야생형 인간 IgG 중쇄 불변 영역의 변이체인 인간 IgG 중쇄 불변 영역을 포함하며, 상기 변이체 인간 IgG 중쇄 불변 영역은 인간 Fc 감마 수용체에 결합하는 야생형 인간 IgG 중쇄 불변 영역보다 높은 친화도로 인간 Fc 감마 수용체에 결합한다. 특정 구현예에서, 인간 Fc 감마 수용체는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 포함한다. 특정 구현예에서, 인간 Fc 감마 수용체는 FcγRIIIA, FcγRIIA 및 FcγRI로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 인간 Fc 감마 수용체는 FcγRIIIA이다. 특정 구현예에서, 변이체 인간 IgG 중쇄 불변 영역은 EU 넘버링 시스템에 따라, 다음 아미노산 돌연변이: G236A, S239D, F243L, T256A, K290A, R292P, S298A, Y300L, V305I, A330L, I332E, E333A, K334A, A339T 및 P396L 중 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 특정 구현예에서, 변이체 인간 IgG 중쇄 불변 영역은 EU 넘버링 시스템에 따라 S239D; T256A; K290A; S298A; I332E; E333A; K334A; A339T; S239D 및 I332E; S239D, A330L 및 I332E; S298A, E333A 및 K334A; G236A, S239D 및 I332E; 및 F243L, R292P, Y300L, V305I 및 P396L로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 돌연변이 세트를 포함한다. 특정 구현예에서, 변이체 인간 IgG 중쇄 불변 영역은 EU 넘버링 시스템에 따라 다음 아미노산 돌연변이: S239D, A330L 및 I332E를 포함한다. 특정 구현예에서, 변이체 인간 IgG 중쇄 불변 영역은 EU 넘버링 시스템에 따라 다음 아미노산 돌연변이: S239D 및 I332E를 포함한다. 특정 구현예에서, 변이체 인간 IgG 중쇄 불변 영역은 EU 넘버링 시스템에 따라 다음 아미노산 돌연변이: S239D 및 I332E를 포함하는 변이체 인간 IgG1 중쇄 불변 영역이다. 특정 구현예에서, 항체는 탈푸코실화된(afucosylated) Fc 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 종양내 전달을 위해 제형화된다. 특정 구현예에서, 항체 또는 약학적 조성물은 종양내로 투여된다. 특정 구현예에서, 항체는 종양 드레이닝(draining) 림프절로 전달하기 위해 제형화된다. 특정 구현예에서, 항체 또는 약학적 조성물은 종양 드레이닝 림프절로 전달된다. 특정 구현예에서, 항체는 피하 전달을 위해 제형화된다. 특정 구현예에서, 항체 또는 약학적 조성물은 피하로 전달된다.
특정 구현예에서, 인간 Fc 감마 수용체는 FcγRIIc이다. 특정 구현예에서, 인간 Fc 감마 수용체는 대식세포, 단핵세포, B 세포 및 수지상 세포로 구성된 그룹으로부터 선택된 세포 상에서 발현된다. 특정 구현예에서, 항체는 인간 항체이다. 특정 구현예에서, 항체는 CTLA-4에 길항적이다. 특정 구현예에서, 항체는 인간 CD80 또는 인간 CD86에 대한 인간 CTLA-4 단백질의 결합을 억제한다.
특정 구현예에서, 항체는 세포독성제, 세포증식억제제, 독소, 방사성핵종 또는 검출가능한 표지에 접합된다.
일 구현예에서, 본 발명은 약제로서 사용하기 위한 본 발명의 항체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 면역요법을 위한 약학적 조성물 또는 약제를 제조하기 위한 본 발명의 항체의 용도에 관한 것이다. 바람직하게는, 면역요법은 대상의 항원에 반응하여, 선택적으로 암을 치료하거나, 감염성 질병을 치료 또는 예방하기 위해 T-세포 활성화를 증가시키는 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 진단용으로 사용하기 위한 본 발명의 항체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 생물학적 샘플에서의 인간 CTLA-4의 시험관내 검출을 위한 본 발명의 항체의 용도에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 항-CTLA-4 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 항체의 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 인간 CTLA-4에 결합하는 항체를 생산하는 방법을 제공하며, 이 방법은 숙주 세포를 배양하여 폴리뉴클레오타이드가 발현되고, 항체가 생산되도록 하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상의 항원에 반응하여 T-세포 활성화를 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에 개시된 유효량의 항-CTLA-4 항체 또는 약학적 조성물을 대상에 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 유효량의 항-CTLA-4 항체 또는 본원에 개시된 약학적 조성물을 대상에 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 항-CTLA-4 항체 또는 약학적 조성물은 피하 또는 정맥내 투여된다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 항-CTLA-4 항체 또는 약학적 조성물은 선택적으로 3주마다 1회 간격으로 0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 6 mg/kg 또는 10 mg/kg으로 정맥내 투여된다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 항-CTLA-4 항체 또는 약학적 조성물은 종양내로 투여된다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 항-CTLA-4 항체 또는 약학적 조성물은 선택적으로 3주마다 1회 간격으로 0.01 mg/kg, 0.03 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 1 mg/kg 또는 3 mg/kg으로 종양내 투여된다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 항-CTLA-4 항체 또는 약학적 조성물은 선택적으로 3주마다 1회 간격으로 0.03 ㎎/㎏, 0.1 ㎎/㎏ 또는 0.3 ㎎/㎏으로, 종양내 투여된다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 항-CTLA-4 항체 또는 약학적 조성물은 전신투여에 의해 주어진 투여량보다 5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배 또는 200배 이하 낮은 투여량으로 종양내로 투여된다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 항-CTLA-4 항체 또는 약학적 조성물은 전신투여에 의해 주어진 투여량보다 10배 이하 낮은 투여량으로 종양내 투여된다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 항-CTLA-4 항체 또는 약학적 조성물은 전신투여에 의해 주어진 투여량보다 100배 이하 낮은 투여량으로 종양내 투여된다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 항-CTLA-4 항체 또는 약학적 조성물은 종양내로 투여되고, 상기 방법은 대상에게 추가의 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 추가의 치료제는 전신투여된다. 특정 구현예에서, 대상은 고형 종양을 갖고, 추가의 치료제는 항-PD-1 항체이다. 특정 구현예에서, 항-PD-1 항체는 펨브롤리주맙(pembrolizumab) 또는 니볼루맙(nivolumab)이다. 특정 구현예에서, 대상은 두경부 편평세포암종을 가지며, 추가의 치료제는 항-EGFR 항체이다. 특정 구현예에서, 항-EGFR 항체는 세툭시맙(cetuximab)이다. 특정 구현예에서, 대상은 HER2+ 유방암을 갖고, 추가 치료제는 항-HER2 항체이다. 특정 구현예에서, 항-HER2 항체는 트라스투주맙(trastuzumab)이다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 화학요법제를 대상에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 화학요법제는 전신투여된다. 특정 구현예에서, 화학요법제는 젬시타빈(gemcitabine)이다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 항-CTLA-4 항체 또는 약학적 조성물은 종양내로 투여되고, 대상은 진행성 또는 전이성 고형 종양을 갖는다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 항-CTLA-4 항체 또는 약학적 조성물은 종양내로 투여되고, 대상은 두경부암(예를 들어, 재발성/난치성 두경부 편평세포암종)을 갖는다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 항-CTLA-4 항체 또는 약학적 조성물은 종양내로 투여되고, 대상은 유방암(예를 들어, 재발성/난치성 HER2+ 유방암)을 갖는다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 항-CTLA-4 항체 또는 약학적 조성물은 종양 드레이닝 림프절로 전달된다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 항-CTLA-4 항체 또는 약학적 조성물은 국소 투여(예를 들어, 피하 투여)를 통해 전달된다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 항-CTLA-4 항체 또는 약학적 조성물은 0.01 mg/kg, 0.03 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 1 mg/kg 또는 3 ㎎/㎏의 국소 투여(예를 들어, 피하 투여)를 통해 전달된다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 항-CTLA-4 항체 또는 약학적 조성물은 전신투여에 의해 주어진 투여량보다 5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배 또는 200배 이하 낮은 투여량으로 국소 투여(예를 들어, 피하 투여)를 통해 전달된다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 항-CTLA-4 항체 또는 약학적 조성물은 전신투여에 의해 주어진 투여량보다 10배 이하 낮은 투여량으로 국소 투여(예를 들어, 피하 투여)를 통해 전달된다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 항-CTLA-4 항체 또는 약학적 조성물은 전신투여에 의해 주어진 투여량보다 100배 이하 낮은 투여량으로 국소 투여(예를 들어, 피하 투여)를 통해 전달된다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 항-CTLA-4 항체 또는 약학적 조성물은 국소 투여(예를 들어, 피하 투여)를 통해 전달되며, 상기 방법은 대상에게 추가의 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 추가의 치료제는 백신이다. 특정 구현예에서, 백신은 항원 펩타이드와 복합체화된 열 쇼크 단백질을 포함하는 열 쇼크 단백질 펩타이드 복합체(HSPPC)를 포함한다. 일 구현예에서, 열 쇼크 단백질은 gp96 단백질이고, 종양-관련 항원 펩타이드와 복합체를 이루며, HSPPC는 대상으로부터 수득된 종양으로부터 유래된다. 특정 구현예에서, 열 쇼크 단백질은 hsc70, hsp70, hsp90, hsp110, grp170, gp96, 칼레티큘린(calreticulin), 이들의 변이체 및 상기 둘 이상의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 열 쇼크 단백질은 hsc70이다. 특정 구현예에서, 열 쇼크 단백질은 hsp70이다. 특정 구현예에서, 항원 펩타이드는 합성이다. 특정 구현예에서, 대상은 암을 갖는다. 특정 구현예에서, 대상은 감염성 질병을 갖는다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 대상에게 추가의 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 추가의 치료제는 화학요법제 또는 체크포인트(checkpoint) 표적화제이다. 특정 구현예에서, 체크포인트 표적화제는 길항제 항-PD-1 항체, 길항제 항-PD-L1 항체, 길항제 항-PD-L2 항체, 길항제 항-CTLA-4 항체, 길항제 항-TIM-3 항체, 길항제 항-LAG-3 항체, 길항제 항-CEACAM1 항체, 길항제 항-GITR 항체, 길항제 항-OX40 항체 및 길항제 항-CD137 항체, 길항제 항-DR3 항체, 길항제 항-TNFSF14 항체 및 길항제 항-CD27 항체로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 추가의 치료제는 방사선요법이다. 특정 구현예에서, 추가의 치료제는 인돌레아민-2,3-디옥시게나제(IDO)의 억제제이다. 적합한 IDO 억제제는 에파카도스태트(epacadostat), F001287, 인독시모드(indoximod) 및 NLG919를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 특정 구현예에서, 추가의 치료제는 백신이다. 특정 구현예에서, 백신은 항원 펩타이드와 복합체화된 열 쇼크 단백질을 포함하는 열 쇼크 단백질 펩타이드 복합체(HSPPC)를 포함한다. 일 구현예에서, 열 쇼크 단백질은 gp96 단백질이고, 종양-관련 항원 펩타이드와 복합체화되며, HSPPC는 대상으로부터 수득된 종양으로부터 유래된다.
일 구현예에서, 본 발명은 약제로서 사용하기 위한, 본 발명의 항체, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 본 발명의 벡터, 및/또는 본 발명의 재조합 숙주 세포에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 진단제로 사용하기 위한 본 발명의 항체, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 본 발명의 벡터 및/또는 본 발명의 재조합 숙주 세포에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 생물학적 샘플내 인간 CTLA-4의 시험관내 검출을 위한 본 발명의 항체, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 본 발명의 벡터 및/또는 본 발명의 재조합 숙주 세포의 용도에 관한 것이다.
일 양태에서, 본원에는 약제로서 사용하기 위한, 본원에 개시된 항-CTLA-4 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는, 약학적 조성물이 제공된다.
일 양태에서, 본원에는 진단제로 사용하기 위한, 본원에 개시된 항-CTLA-4 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
일 양태에서, 본원에는 본원에 기술된 항-CTLA-4 항체, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 본 발명의 벡터 및/또는 본 발명의 재조합 숙주 세포, 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 일 양태에서, 약학적 조성물은 약제 및/또는 진단제로 사용하기 위한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 항원에 반응하여 T-세포 활성화를 증가시키는 방법에 사용하기 위한, 본 발명의 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 재조합 숙주 세포 및/또는 약학적 조성물에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 대상내 항원에 반응하여 T-세포 활성화를 증가시키는 방법에 사용하기 위한, 본 발명의 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 재조합 숙주 세포 및/또는 약학적 조성물에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 대상내 항원에 반응하여 T-세포 활성화를 증가시키는 방법에 사용하기 위한, 본 발명의 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 재조합 숙주 세포 및/또는 약학적 조성물에 관한 것으로서, 상기 방법은 본 발명의 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 재조합 숙주 세포 및/또는 약학적 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료 방법에 사용하기 위한, 본 발명의 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 재조합 숙주 세포 및/또는 약학적 조성물에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 대상의 암 치료 방법에 사용하기 위한, 본 발명의 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 재조합 숙주 세포 및/또는 약학적 조성물에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 대상의 암 치료 방법에 사용하기 위한, 본 발명의 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 재조합 숙주 세포 및/또는 약학적 조성물에 관한 것으로, 상기 방법은 본 발명의 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 재조합 숙주 세포 및/또는 약학적 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 약제로 사용하기 위한, (a) 본 발명의 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 재조합 숙주 세포 및/또는 약학적 조성물 및 (b) 추가의 치료제, 바람직하게는 항-PD-1 항체에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료 방법에 사용하기 위한, (a) 본 발명의 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 재조합 숙주 세포 및/또는 약학적 조성물 및 (b) 추가의 치료제, 바람직하게는 항-PD-1 항체에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, 암은 고형 종양이다. 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 재조합 숙주 세포 및/또는 약학적 조성물은 대상에게 종양내 투여되고, 바람직하게는 0.01 mg/kg, 0.03 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 또는 3 mg/kg으로 선택적으로는 3주마다 1회 간격으로 대상에게 종양내 투여된다.
일 양태에서, 본 발명은 (a) 본 발명의 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 재조합 숙주 세포 및/또는 약학적 조성물 및 (b) 추가의 치료제, 바람직하게는 항-PD-1 항체를 포함하는 약학적 조성물, 키트 또는 부분 키트에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 약제로서 사용하기 위한, (a) 본 발명의 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 재조합 숙주 세포 및/또는 약학적 조성물 및 (b) 항-EGFR 항체, 및 임의로 (c) 화학요법제에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료 방법에 사용하기 위한, (a) 본 발명의 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 재조합 숙주 세포 및/또는 약학적 조성물 및 (b) 항-EGFR 항체, 및 임의로 (c) 화학요법제에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, 암은 두경부 편평세포암종이다. 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 재조합 숙주 세포 및/또는 약학적 조성물은 대상에게 종양내 투여되고, 바람직하게는 0.01 mg/kg, 0.03 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 또는 3 mg/kg으로 선택적으로는 3주마다 1회 간격으로 대상에게 종양내 투여된다.
일 양태에서, 본 발명은 (a) 본 발명의 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 재조합 숙주 세포 및/또는 약학적 조성물 및 (b) 항-EGFR 항체, 및 임의로 (c) 화학요법제를 포함하는 약학적 조성물, 키트 또는 부분 키트에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 약제로서 사용하기 위한, (a) 본 발명의 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 재조합 숙주 세포 및/또는 약학적 조성물 및 (b) 항-HER2 항체 및 임의로 (c) 화학요법제에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 HER2+ 유방암의 치료 방법에 사용하기 위한, (a) 본 발명의 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 재조합 숙주 세포 및/또는 약학적 조성물 및 (b) 항-HER2 항체 및 임의로 (c) 화학요법제에 관한 것이다. 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 재조합 숙주 세포 및/또는 약학적 조성물은 대상에게 종양내 투여되고, 바람직하게는 0.01 mg/kg, 0.03 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 또는 3 mg/kg으로, 선택적으로는 3주마다 1회 간격으로 대상에게 종양내 투여된다.
일 양태에서, 본 발명은 (a) 본 발명의 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 재조합 숙주 세포 및/또는 약학적 조성물 및 (b) 항-HER2 항체 및 임의로 (c) 화학요법제를 포함하는 약학적 조성물, 키트 또는 부분 키트에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료 방법에 사용하기 위한, 본 발명의 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 재조합 숙주 세포 및/또는 약학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 항체, 뉴클레오타이드, 벡터, 재조합 숙주 세포 및/또는 약학적 조성물은 대상에게 종양내 투여되고, 바람직하게는 0.01 mg/kg, 0.03 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 또는 3 mg/kg으로, 선택적으로는 3주마다 1회 간격으로 대상에게 종양내 투여된다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료 방법에 사용하기 위한, 본 발명의 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 재조합 숙주 세포 및/또는 약학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 재조합 숙주 세포 및/또는 약학적 조성물은 대상에게 피하 또는 정맥내 투여되고, 바람직하게는 0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 6 mg/kg, 또는 10 mg/kg으로, 선택적으로는 3주마다 1회 간격으로 대상에게 정맥내 투여된다.
일 양태에서, 본 발명은 약제로서 사용하기 위한, (a) 본 발명의 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 재조합 숙주 세포 및/또는 약학적 조성물 및 (b) 추가의 치료제에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, 추가의 치료제는 화학요법제 또는 체크포인트 표적화제 또는 인돌레아민-2,3-디옥시게나제(IDO)의 억제제 또는 백신이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료 방법에 사용하기 위한, (a) 본 발명의 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 재조합 숙주 세포 및/또는 약학적 조성물 및 (b) 추가의 치료제에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, 추가의 치료제는 화학요법제 또는 체크포인트 표적화제 또는 인돌레아민-2,3-디옥시게나제(IDO)의 억제제 또는 백신이다.
일 양태에서, 본 발명은 (a) 본 발명의 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 재조합 숙주 세포 및/또는 약학적 조성물 및 (b) 추가의 치료제를 포함하는 약학적 조성물, 키트 또는 부분 키트에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, 추가의 치료제는 화학요법제 또는 체크포인트 표적화제 또는 인돌레아민-2,3-디옥시게나제(IDO)의 억제제 또는 백신이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료 방법에 사용하기 위한, 및/또는 항원에 반응하여 T-세포 활성화를 증가시키는 방법에 사용하기 위한, 본 발명의 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 재조합 숙주 세포 및/또는 약학적 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 재조합 숙주 세포 및/또는 약학적 조성물이 종양 드레이닝 림프절로 전달된다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료 방법 및/또는 대상내 항원에 반응하여 T-세포 활성화를 증가시키는 방법에서, 본 발명의 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 재조합 숙주 세포 및/또는 약학적 조성물의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 재조합 숙주 세포 및/또는 약학적 조성물은 종양 드레이닝 림프절로 전달된다.
일 양태에서, 본 발명은 면역요법용 약제를 제조하기 위한, 예를 들어 대상내 항원에 반응하여 T-세포 활성화를 증가시키기 위한, 암을 치료하기 위한, 또는 전염성 질병을 치료 또는 예방하기 위한, 본 발명의 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 재조합 숙주 세포 및/또는 약학적 조성물의 용도에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 면역요법용 약제를 제조하기 위한, 예를 들어 대상내 항원에 반응하여 T-세포 활성화를 증가시키기 위한, 암을 치료하기 위한, 또는 전염성 질병을 치료 또는 예방하기 위한, 본 발명의 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 재조합 숙주 세포 및/또는 약학적 조성물의 용도에 관한 것으로서, 본 발명의 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 재조합 숙주 세포 및/또는 약학적 조성물이 종양 드레이닝 림프절로 전달된다.
일 양태에서, 본 발명은 면역요법용 약제를 제조하기 위한, 예를 들어 대상내 항원에 반응하여 T-세포 활성화를 증가시키기 위한, 암을 치료하기 위한, 또는 전염성 질병을 치료 또는 예방하기 위한, (a) 본 발명의 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 재조합 숙주 세포 및/또는 약학적 조성물 및 (b) 항-HER2 항체 및 임의로 (c) 화학요법제의 용도에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 면역요법용 약제를 제조하기 위한, 예를 들어 대상내 항원에 반응하여 T-세포 활성화를 증가시키기 위한, 암을 치료하기 위한, 또는 전염성 질병을 치료 또는 예방하기 위한, (a) 본 발명의 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 재조합 숙주 세포 및/또는 약학적 조성물 및 (b) 항-HER2 항체 및 임의로 (c) 화학요법제의 용도에 관한 것으로서, 본 발명의 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 재조합 숙주 세포 및/또는 약학적 조성물은 종양 드레이닝 림프절로 전달된다.
본 발명은 인간 CTLA-4에 특이적으로 결합하고, CTLA-4 기능, 예를 들어 CTLA-4-매개된 면역 억제를 길항하는 항체를 제공한다. 또한, 상기 항체를 포함하는 약학적 조성물, 상기 항체를 코딩하는 핵산, 상기 항체를 제조하기 위한 발현 벡터 및 숙주 세포, 및 상기 항체를 사용하여 대상을 치료하는 방법을 제공한다. 본원에 개시된 항체는 항원(예를 들어, 종양 항원)에 반응하여 T-세포 활성화를 증가시키고, 따라서 암을 치료하거나, 대상에서 감염성 질병을 예방 또는 치료하기 위해 특히 유용하다. 본원에 개시된 항체는 또한 암을 치료하거나, 감염성 질병을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물의 제조에, 또는 이를 위한 약제 제조에 사용하기에 유용하다.
5.1 정의
본원에 사용된 바와 같이, 수치 또는 수치 범위를 변경하는데 사용되는 용어 "약" 및 "대략"은 값 또는 범위의 의도된 의미 내에서, 값 또는 범위보다 5% 내지 10% 이상 및 5% 내지 10% 이하의 편차가 잔존함을 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "CTLA-4"는 세포독성 T-림프구-관련 단백질 4를 지칭한다. CTLA-4 뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 서열은 당 분야에 잘 알려져 있다. 예시적인 인간 CTLA-4 아미노 서열은 GenBank 기탁 번호 GI: 15778585에 개시되어 있으며, 예시적인 마우스 CTLA-4 아미노 서열은 GenBank 기탁 번호 GI: 15778586에 개시되어있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체" 및 "항체들"은 전장 항체, 항체의 항원-결합 단편 및, 항체 CDR, VH 영역 또는 VL 영역을 포함하는 분자를 포함한다. 항체의 예로는 단클론 항체, 재조합 생성 항체, 단일특이성 항체, 다중특이성 항체(이중특이성 항체 포함), 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 면역글로불린, 합성 항체, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄 분자를 포함하는 사량체 항체, 항체 경쇄 단량체, 항체 중쇄 단량체, 항체 경쇄 이량체, 항체 중쇄 이량체, 항체 경쇄-항체 중쇄 쌍, 인트라바디, 이종접합 항체, 단일 도메인 항체, 1가 항체, 단일 쇄 항체 또는 단일-쇄 Fvs(scFv), 카멜화 항체, 아피바디(affybody), Fab 단편, F(ab')2 단편, 디설파이드-결합된 Fvs(sdFv), 항-이디오타입(항-Id) 항체(예를 들어, 항-항-Id 항체를 포함), 및 상기 중 임의의 하나의 항원-결합 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 항체는 다클론 항체 집단을 지칭한다. 항체는 면역글로불린 분자의 임의의 형태(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 또는 IgY), 임의의 유형(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 또는 IgA2) 또는 임의의 하위유형(예를 들어, IgG2a 또는 IgG2b)일 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 항체는 IgG 항체, 또는 한 유형(예를 들어, 인간 IgG1 또는 IgG4) 또는 이의 하위유형이다. 특정 구현예에서, 항체는 인간화 단클론 항체이다. 또 다른 특정 구현예에서, 항체는 인간 단클론 항체이다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 항체는 IgG1 또는 IgG2 항체이다.
본원에 사용된 용어 "VH 영역" 및 "VL 영역"은 FR(프레임워크 영역) 1, 2, 3 및 4, 및 CDR(상보성 결정 영역) 1, 2 및 3을 포함하는 단일 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 각각 지칭한다(Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest. (NIH Publication No. 91-3242, Bethesda 참조).
본원에서 사용된 용어 "CDR" 또는 "상보성 결정 영역"은 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드 모두의 가변 영역 내에서 발견되는 비인접 항원 결합 부위를 의미한다. 상기 특정 영역은 Kabat et al., J. Biol. Chem. 252, 6609-6616 (1977) 및 Kabat et al., Sequences of protein of immunological interest. (1991), 및 by Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) 및 by MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)에 기술되어 있으며, 여기서 상기 정의는 서로 비교될 때 아미노산 잔기의 중첩 또는 부분 집합을 포함한다. 상기 인용된 참고문헌 각각에 의해 정의된 바와 같은 CDR을 포함하는 아미노산 잔기가 비교를 위해 제시된다. 바람직하게는, 용어 "CDR"은 서열 비교에 기초한 Kabat에 의해 정의된 바와 같은 CDR이다. CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 중쇄 CDR을 나타내고, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3은 경쇄 CDR을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "EU 넘버링 시스템"은 Edelman, G.M. et al., Proc. Natl. Acad. USA, 63, 78-85 (1969) and Kabat et al, in "Sequences of Proteins of Immunological Interest", U.S. Dept. Health and Human Services, 5th edition, 1991에 기술된 바와 같이 항체의 불변 영역에 대한 EU 넘버링 협약을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "프레임워크(FR) 아미노산 잔기"는 면역글로불린 쇄의 프레임워크 영역의 아미노산을 지칭한다. 본원에서 사용된 용어 "프레임워크 영역" 또는 "FR 영역"은 가변 영역의 일부이지만, (예를 들어, CDR의 Kabat 정의를 사용하여) CDR의 일부가 아닌 아미노산 잔기를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, Fc와 관련하여 "탈푸코실화" 또는 "탈푸코실화된(afucosylated)"이란 용어는 EU 인덱스(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))에 따라 넘버링된, 인간 IgG1 Fc 영역의 잔기 297, 또는 비-IgG1 또는 비인간 IgG1 면역글로불린내 대응 잔기에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 퓨코스의 실질적인 결핍을 지칭한다. 따라서, 다수의 푸코실화된 항체를 포함하는 조성물에서, 항체의 Fc 영역의 잔기 297에 직접 또는 간접적으로(예를 들어, 개재되어 있는 당을 통해) 항체의 적어도 70%가 푸코실화되지 않을 것이며, 일부 구현예에서 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%가 Fc 영역의 잔기 297에서 직접 또는 간접적으로 푸코실화되지 않을 것이다.
본원에 사용된 용어 "특이적으로 결합하는"은 적어도 약 1×10~6 M, 1×10-7 M, 1×10-8 M, 1×10-9 M, 1×10-10 M, 1×10-11 M, 1×10-12 M 이하의 해리 상수(Kd)로 항원에 결합하는, 및/또는 비특이적 항원에 대한 친화력보다 적어도 2배 이상 큰 친화도로 항원에 결합하는 항체의 능력을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "에피토프"는 당 분야의 용어이며, 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 항원의 국소 영역을 지칭한다. 에피토프는 예를 들어 폴리펩타이드의 연속적인 아미노산(선형 또는 연속 에피토프)일 수 있거나, 에피토프는 예를 들어 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들의 2개 이상의 비-인접 영역으로부터 함께 유래될 수 있다(구성적, 비선형, 불연속적 또는 비-인접 에피토프). 특정 구현예에서, 항체가 결합하는 에피토프는 예를 들어 NMR 분광학, X-선 회절 결정학 연구, ELISA 분석, 질량 분광법과 결합된 수소/중수소 교환(예를 들어, 액체 크로마토그래피 전자분무 질량 분광법), 어레이-기반 올리고-펩타이드 스캐닝 분석법 및/또는 돌연변이유발 맵핑(예를 들어, 부위-지정 돌연변이유발 맵핑)에 의해 측정될 수 있다. X-선 결정학을 위해, 결정화는 당 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 수행될 수 있다(예를 들어, Giege R et al., (1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4): 339-350; McPherson A (1990) Eur J Biochem 189: 1-23; Chayen NE (1997) Structure 5: 1269-1274; McPherson A (1976) J Biol Chem 251: 6300-6303). 항체:항원 결정(crystal)은 잘 알려진 X-선 회절 기술을 사용하여 연구될 수 있으며, X-PLOR(Yale University, 1992, distributed by Molecular Simulations, Inc.; see e.g. Meth Enzymol (1985) volumes 114 & 115, eds Wyckoff HW et al.,; U.S. 2004/0014194) 및 Buster(Bricogne G (1993) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt 1): 37-60; Bricogne G (1997) Meth Enzymol 276A: 361-423, ed Carter CW; Roversi P et al., (2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10): 1316-1323)와 같은 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 정제될 수 있다. 돌연변이유발 맵핑 연구는 당업자에게 공지된 임의의 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 기술을 포함하는 돌연변이유발 기술에 대한 설명은 예를 들어 Champe M et al., (1995) J Biol Chem 270: 1388-1394 and Cunningham BC & Wells JA (1989) Science 244: 1081-1085를 참조한다. 특정 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 에피토프는 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 연구를 사용하여 결정된다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료하다", "치료하는" 및 "치료"라는 용어는 본원에 기술된 치료 또는 예방 조치를 지칭한다. "치료"의 방법은 질병 또는 장애 또는 재발성 질병 또는 장애의 하나 이상의 증상을 예방하거나, 치료하거나, 지연시키거나, 중증도를 감소시키거나 완화시키기 위해, 또는 상기 치료가 없을 때 기대되는 것 이상으로 대상의 생존을 연장시키기 위해, 상기 질병 또는 장애를 갖거나 상기 질병 또는 장애를 가질 경향이있는 대상에게 항체를 투여하는 것을 사용한다.
본원에 사용된 바와 같이, 대상에게 치료제를 투여하는 것과 관련하여 용어 "유효량"은 원하는 예방 또는 치료 효과를 달성하는 치료제의 양을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "대상"은 임의의 인간 또는 비-인간 동물을 포함한다.
수소-중수소 교환은 하기 단계들을 포함하는 분석을 사용하여 평가된다: (a) 수성 완충액 중에서 CTLA-4 단독 또는, 항체와 조합한 CTLA-4의 용액을 취하고, 이 용액을 예를 들어, 0, 60, 300, 1800 및 7200초 동안 중수소 산화물 라벨링 버퍼의 약 90% 부피/과량의 부피로 희석하는 단계; (b) pH를 낮춤으로써 수소를 중수소로 교환하는 것을 퀸칭(quenching)시키는 단계; (c) 샘플을 프로테아제 분해 및 질량 분광분석하는 단계; 및 (d) CTLA-4 단백질분해성 펩타이드내 중수소 혼입을 계산하고, 항체의 존재 또는 부재하에 중수소 혼입을 비교하는 단계. 상기 분석에 의해 평가된 바와 같이, 항-CTLA-4 항체의 존재하에 수소/중수소 교환이, 항체의 부재하에 수소/중수소 교환과 비교하여 적어도 10%까지 감소된다면, CTLA-4 단백질분해성 펩타이드의 중수소와 수소의 교환은 "감소"된다 .
5.2 항-CTLA-4 항체
일 양태에서, 본 발명은 인간 CTLA-4에 특이적으로 결합하고, CTLA-4 기능을 길항하는 항체를 제공한다. 예시적인 항체의 아미노산 서열은 본 명세서의 표 1 내지 표 6에 개시되어있다.
Figure pat00001
Figure pat00002
Figure pat00003
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특정 구현예에서, 본 발명은 인간 CTLA-4 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공하며, 상기 단리된 항체는
(a) SYX1MX2(서열번호: 22)(여기서, X1은 S 또는 A이고; X2는 N 또는 S임)의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1; 및/또는
(b) SISSSSSYIYYADSVKG(서열번호: 2)의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2; 및/또는
(c) VGLMGPFXI(서열번호: 23)(여기서, X는 D 또는 N임)의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3; 및/또는
(d) RASQSVX1X2YLX3(서열번호: 24)(여기서, X1은 S 또는 G이고; X2는 R, S 또는 T이고; X3은 G 또는 A임)의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1; 및/또는
(e) X1X2SX3RAT(서열번호: 25)(여기서, X1은 G 또는 A이고; X2는 A 또는 T이고; X3은 T, S, R 또는 N임)의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2; 및/또는
(f) QQYGX1SPX2T(서열번호: 26)(여기서, X1은 S 또는 T이고; X2는 W 또는 F임)의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함한다.
특정 구현예에서, 항체는 상기 VH CDR 중 1개, 2개 또는 3개 모두를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 표 2의 항체 중 하나의 CDRH1을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 표 2의 항체 중 하나의 CDRH2를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 표 2의 항체 중 하나의 CDRH3을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 표 2의 항체 중 하나의 VH CDR 중 1개, 2개 또는 3개 모두를 포함한다(예를 들어, 표 2의 1열에 있는 VH CDR, 예를 들어 모든 VH CDR은 항체 AGEN1884w로부터 유래됨). 특정 구현예에서, 항체는 본원에 기술된 VH 프레임워크를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 표 4에 개시된 항체의 VH 프레임워크 영역(예를 들어, 표 4의 1열에 있는 프레임워크 영역 중 1개, 2개, 3개 또는 4개)을 포함한다.
특정 구현예에서, 항체는 상기 VL CDR 중 1개, 2개 또는 3개 모두를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 표 3의 항체 중 하나의 CDRL1을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 표 3의 항체 중 하나의 CDRL2를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 표 3의 항체 중 하나의 CDRL3을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 표 3의 항체 중 하나의 VL CDR 중 1개, 2개 또는 3개 모두를 포함한다(예를 들어, 표 3의 1열에 있는 VL CDR, 예를 들어 모든 VL CDR은 항체 AGEN1884w로부터 유래됨). 특정 구현예에서, 항체는 본원에 기술된 VL 프레임워크 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 표 5에 개시된 항체의 VL 프레임워크 영역(FR)(예를 들어, 표 5의 1열에 있는 프레임워크 영역 중 1개, 2개, 3개 또는 4개)을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 상보성 결정 영역 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 상보성 결정 영역 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 CTLA-4 단백질에 특이적으로 결합하는, 단리된 항체를 제공하며,
(a) CDRH1은 SYX1MX2(서열번호: 22)(여기서, X1은 S 또는 A이고; X2는 N 또는 S임)의 아미노산 서열을 포함하고;
(b) CDRH2는 SISSSSSYIYYADSVKG(서열번호: 2)의 아미노산 서열을 포함하고;
(c) CDRH3은 VGLMGPFXI(서열번호: 23)(여기서 X는 D 또는 N임)의 아미노산 서열을 포함하며;
(d) CDRL1은 RASQSVX1X2YLX3(서열번호: 24)(여기서, X1은 S 또는 G이고; X2는 R, S 또는 T이고; X3은 G 또는 A임)의 아미노산 서열을 포함하며;
(e) CDRL2는 X1X2SX3RAT(서열번호: 25)(여기서, X1은 G 또는 A이고; X2는 A 또는 T이고; X3은 T, S, R 또는 N임)의 아미노산 서열을 포함하며; 그리고
(f) CDRL3은 QQYGX1SPX2T(서열번호: 26)(여기서, X1은 S 또는 T이고; X2는 W 또는 F임)의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, CDRH1은 서열번호: 1 및 27로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, CDRH3은 서열번호: 3 및 서열번호: 28로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, CDRL1은 서열번호: 4, 29 및 30으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, CDRL2는 서열번호: 5, 31-35로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, CDRL3은 서열번호: 6, 36 및 37로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 표 2의 항체의 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3은 각각 표 3의 항체의 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 상보성 결정 영역 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 CTLA-4 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공하며, 상기 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 서열번호: 1, 2 및 3; 27, 2 및 3; 또는 27, 2 및 28에 개시된 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 상보성 결정 영역 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 CTLA-4 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공하며, 상기 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3은 서열번호: 4, 5 및 6; 29, 32 및 36; 29, 33 및 37; 30, 31 및 6; 29, 34 및 6; 또는 29, 35 및 37에 개시된 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 상보성 결정 영역 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 상보성 결정 영역 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 CTLA-4 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공하며, 상기 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3은 각각 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5 및 6; 1, 2, 3, 29, 32 및 36; 1, 2, 3, 29, 33 및 37; 27, 2, 3, 4, 5 및 6; 27, 2, 3, 29, 33 및 37; 1, 2, 3, 30, 31 및 6; 1, 2, 3, 29, 34 및 6; 1, 2, 3, 29, 35 및 37; 27, 2, 28, 4, 5 및 6; 27, 2, 28, 29, 32 및 36; 27, 2, 28, 29, 33 및 37; 또는 27, 2, 28, 29, 35 및 37에 개시된 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 항체는 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 상기 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 영역은 각각 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5 및 6에 개시된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 항체의 CDR은 면역글로불린 구조 루프의 위치를 지칭하는 Chothia 넘버링 방식에 따라 결정될 수 있다(예를 들어, Chothia C & Lesk AM, (1987), J Mol Biol 196: 901-917; Al-Lazikani B et al., (1997) J Mol Biol 273: 927-948; Chothia C et al., (1992) J Mol Biol 227: 799-817; Tramontano A et al., (1990) J Mol Biol 215(1): 175-82; 및 미국특허 제7,709,226호 참조). 전형적으로, Kabat 넘버링 규칙을 사용할 때, Chothia CDRH1 루프는 중쇄 아미노산 26 내지 32, 33 또는 34에 존재하고, Chothia CDRH2 루프는 중쇄 아미노산 52 내지 56에 존재하며, Chothia CDRH3 루프는 중쇄 아미노산 95 내지 102에 존재하는 반면, Chothia CDRL1 루프는 경쇄 아미노산 24 내지 34에 존재하고, Chothia CDRL2 루프는 경쇄 아미노산 50 내지 56에 존재하고, Chothia CDRL3 루프는 경쇄 아미노산 89 내지 97에 존재한다. Kabat 넘버링 규칙을 사용하여 넘버링될 때 Chothia CDRH1 루프의 끝은 루프의 길이에 따라 H32와 H34 사이에서 달라진다(이는 Kabat 넘버링 구성표는 H35A 및 H35B에 삽입부가 있기 때문이며; 35A 또는 35B가 존재하지 않으면 루프는 32로 끝나고; 35A만 존재하면 루프는 33으로 끝나고; 35A 및 35B가 모두 존재하면 루프가 34에서 끝남).
특정 구현예에서, 본 발명은 본원의 표 6에 개시된 항체의 VL의 Chothia VL CDR을 포함하는 항체(예를 들어, AGEN1884w 또는 AGEN2041w)인, 인간 CTLA-4 단백질에 특이적으로 결합하는, 단리된 항체를 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 본원의 표 6에 개시된 항체의 Chothia VH CDR을 포함하는 항체(예를 들어, AGEN1884w 또는 AGEN2041w)인, 인간 CTLA-4 단백질에 특이적으로 결합하는, 단리된 항체를 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 본원의 표 6에 개시된 항체의 Chothia VH CDR 및 Chothia VL CDR을 포함하는 항체(예를 들어, AGEN1884w 또는 AGEN2041w)인, 인간 CTLA-4 단백질에 특이적으로 결합하는, 단리된 항체를 제공한다. 특정 구현예에서, 인간 CTLA-4 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 Chothia 및 Kabat CDR이 동일한 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 인간 CTLA-4 단백질에 특이적으로 결합하고, Kabat CDR 및 Chothia CDR의 조합을 포함하는, 단리된 항체를 제공한다.
특정 구현예에서, 항체의 CDR은 Lefranc M-P, (1999) The Immunologist 7: 132-136 and Lefranc M-P et al., (1999) Nucleic Acids Res 27: 209-212에 기술된 바와 같은 IMGT 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다. IMGT 넘버링 체계에 따르면, CDRH1은 26 내지 35 위치에 있고, CDRH2는 51 내지 57 위치에 있고, CDRH3은 93 내지 102 위치에 있고, CDRL1은 27 내지 32 위치에 있고, CDRL2는 50 내지 52 위치에 있고, 및 CDRL3은 89 내지 97 위치에 있다. 특정 구현예에서, 본 발명은 IMGT 넘버링 시스템에 의해 결정된 바와 같이, 예를 들어 Lefranc M-P (1999) 상동 및 Lefranc M-P et al., (1999) 상동에 기술된 바와 같이, 인간 CTLA-4 단백질에 특이적으로 결합하고, 본원의 표 6에 개시된 항체(예를 들어, AGEN1884w 또는 AGEN2041w)의 CDR을 포함한다.
특정 구현예에서, 항체의 CDR은 MacCallum RM et al., (1996) J Mol Biol 262: 732-745에 따라 결정될 수 있다. 또한, 예를 들어 Martin A. "Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains," in Antibody Engineering, Kontermann and Dubel, eds., Chapter 31, pp. 422-439, Springer-Verlag, Berlin (2001)을 참조한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 MacCallum RM et al에 개시된 방법에 의해 결정된 바와 같이, 인간 CTLA-4 단백질에 특이적으로 결합하고, 본원의 표 6에 개시된 항체(예를 들어, AGEN1884w 또는 AGEN2041w)의 CDRs를 포함하는 항체를 제공한다.
특정 구현예에서, 항체의 CDR은 Kabat CDRs 및 Chothia 구조 루프 사이의 중간물을 나타내는, AbM 초가변 영역을 지칭하는 AbM 넘버링 체계에 따라 결정될 수 있으며, Oxford Molecular의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된다(Oxford Molecular Group, Inc.). 특정 구현예에서, 본 발명은 인간 CTLA-4 단백질에 특이적으로 결합하고, AbM 넘버링 체계에 의해 결정된 바와 같이 본원의 표 6에 개시된 항체(예를 들어, AGEN1884w 또는 AGEN2041w)의 CDR을 포함하는 항체를 제공한다.
따라서, 특정 구현예에서, 본 발명은 인간 CTLA-4 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공하며, 상기 항체는 서열번호: 7에 개시된 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 영역 아미노산 서열 및 서열번호: 8에 개시된 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 영역 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 각각의 CDR은 Kabat 정의, Chothia 정의, Kabat 정의와 Chothia 정의의 조합, IMGT 넘버링 시스템, AbM 정의 또는 CDR의 접촉 정의에 따라 정의된다.
특정 구현예에서, 본 발명은 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 CTLA-4 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공하며, 상기 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 영역은 각각 서열번호: 16, 17, 18, 19, 20 및 21에 개시된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 서열번호: 72의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 CTLA-4 단백질에 특이적으로 결합하는, 단리된 항체를 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 인간 IGHV3-21 생식세포 서열로부터 유래된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 CTLA-4 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 프레임워크 1, 프레임워크 2, 프레임워크 3, CDRH1 및 CDRH2로부터 선택된 하나 이상의 영역(예를 들어, 상기 영역 중 2개, 3개, 4개 또는 5개)은 인간 IGHV3-21 생식세포 서열로부터 유도될 수 있다. 일 구현예에서, 프레임워크 1, 프레임워크 2, 프레임워크 3, CDRH1 및 CDRH2는 모두 인간 IGHV3-21 생식세포 서열로부터 유도된다.
특정 구현예에서, 본 발명은 서열번호: 7 및 38-42로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%(예를 들어, 적어도 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 CTLA-4 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 7 및 38-42로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 7에 개시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 12에 개시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 93에 개시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 14에 개시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 94에 개시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 76에 개시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 97에 개시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 서열번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 CTLA-4 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 인간 IGKV3-20 또는 IGKV3-11 생식세포 서열로부터 유래된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 CTLA-4 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 프레임워크 1, 프레임워크 2, 프레임워크 3, CDRL1 및 CDRL2로부터 선택된 하나 이상의 영역(예를 들어, 2개, 3개, 4개 또는 5개 영역)은 인간 IGKV3-20 또는 IGKV3-11 생식세포 서열로부터 유래될 수 있다. 일 구현예에서, 프레임워크 1, 프레임워크 2, 프레임워크 3, CDRL1 및 CDRL2는 모두 인간 IGKV3-20 또는 IGKV3-11 생식세포 서열로부터 유도된다.
특정 구현예에서, 본 발명은 서열번호: 8 및 43-47로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%(예를 들어, 적어도 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 CTLA-4 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 8 및 43-47로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 8에 개시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 13에 개시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 15에 개시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 인간 IGHV3-21 생식세포 서열로부터 유래된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 인간 IGKV3-20 또는 IGKV3-11 생식세포 서열로부터 유래된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 CTLA-4 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 프레임워크 1, 프레임워크 2, 프레임워크 3, CDRH1 및 CDRH2로부터 선택된 하나 이상의 영역(예를 들어, 상기 영역 중 2개, 3개, 4개 또는 5개)은 인간 IGHV3-21 생식세포 서열로부터 유도될 수 있다. 일 구현예에서, 프레임워크 1, 프레임워크 2, 프레임워크 3, CDRH1 및 CDRH2는 모두 인간 IGHV3-21 생식세포 서열로부터 유래된다. 프레임워크 1, 프레임워크 2, 프레임워크 3, CDRL1 및 CDRL2(예를 들어, 상기 영역 중 2개, 3개, 4개 또는 5개 영역)로부터 선택된 하나 이상의 영역은 인간 IGKV3-20 또는 IGKV3-11 생식세포 서열로부터 유래될 수 있다. 일 구현예에서, 프레임워크 1, 프레임워크 2, 프레임워크 3, CDRL1 및 CDRL2는 모두 인간 IGKV3-20 또는 IGKV3-11 생식세포 서열로부터 유래된다.
특정 구현예에서, 본 발명은 서열번호: 7 및 38-42로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%(예를 들어, 적어도 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 8 및 43-47로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%(예를 들어, 적어도 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 CTLA-4 단백질에 특이적으로 결합하는, 단리된 항체를 제공한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 7 및 38-42로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 8 및 43-47로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 각각 서열번호: 7 및 8; 7 및 44; 7 및 45; 38 및 8; 38 및 45; 39 및 43; 39 및 45; 39 및 46; 39 및 47; 40 및 43; 40 및 8; 40 및 44; 40 및 45; 41 및 8; 41 및 44; 41 및 45; 41 및 47; 42 및 43; 또는 42 및 45에 개시된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 93의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 94의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 76의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호: 97의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 각각 서열번호: 7 및 8에 개시된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 항체와 인간 CTLA-4 단백질에 대한 결합에 대해 교차-경쟁하는 단리된 항체를 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 각각 서열번호: 7 및 8에 개시된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 항체로서 인간 CTLA-4 단백질 상의 동일한 에피토프에 결합하는 단리된 항체를 제공한다.
임의의 Ig 불변 영역이 본원에 개시된 항체에서 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, Ig 영역은 인간 IgG1 또는 인간 IgG2 중쇄 불변 영역이다.
특정 구현예에서, 본원에 기술된 항체의 IgG 영역은 예를 들어, 야생형 Fc 영역, 예를 들어 IgG1 Fc를 갖는 항체와 비교하여, CD32B(FcγRIIB 또는 FCGR2B로도 알려짐)에 대한 증가된 친화도를 갖는다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 항체는 CD32A(FcγRIIA) 및 CD16(FcγRIIIA) 모두에 대해, CD32B(FcγRIIB)에 대해 선택적으로 증가된 친화도를 갖는다. CD32B에 대한 증가된 친화도를 초래하는 서열 변경은 당 분야, 예를 들어 Mimoto et al., Protein Engineering, Design & Selection 10: 589-598 (2013), Chu et al., Molecular Immunology 45: 3926-3933 (2008), and Strohl, Current Opinion in Biology 20: 685-691 (2009)에 공지되어 있으며, 상기 각각은 전체가 본원에 참고문헌으로 인용된다. 특정 구현예에서, 항체는 EU 인덱스(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, Bethesda (1991))에 따라 넘버링된, G236D, P238D, S239D, S267E, L328F 및 L328E, 및 이들의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택된 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역, 예를 들어 IgG1 불변 영역 또는 그의 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 S267E 및 L328F 치환을 포함하는 중쇄 불변 영역, 예를 들어 IgG1 불변 영역 또는 그의 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 P238D 및 L328E 치환을 포함하는 중쇄 불변 영역, 예를 들어 IgG1 불변 영역 또는 그의 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 P238D 치환 및 E233D, G237D, H268D, P271G, A330R 및 이들의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택된 치환을 포함하는 중쇄 불변 영역, 예를 들어 IgG1 불변 영역 또는 그의 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 P238D, E233D, G237D, H268D, P271G 및 A330R 치환을 포함하는 중쇄 불변 영역, 예를 들어 IgG1 불변 영역 또는 그의 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 G236D 및 S267E를 포함하는 중쇄 불변 영역, 예를 들어 IgG1 불변 영역 또는 그의 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 S239D 및 S267E를 포함하는 중쇄 불변 영역, 예를 들어 IgG1 불변 영역, 또는 그의 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 V262E, S267E 및 L328F를 포함하는 중쇄 불변 영역, 예를 들어 IgG1 불변 영역, 또는 그의 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 V264E, S267E 및 L328F를 포함하는 중쇄 불변 영역, 예를 들어, IgG1 불변 영역, 또는 그의 단편을 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에 기술된 항체의 IgG 영역은 예를 들어 야생형 Fc 영역, 예를 들어 IgG1 Fc를 갖는 항체와 비교하여, FcγRIIIA에 대해 증가된 친화도를 갖는다. FcγRIIIA에 대한 증가된 친화도를 초래하는 서열 변경은 당 분야에, 예를 들어 Kellner et al., Methods 65: 105-113 (2014), Lazar et al., Proc Natl Acad Sci 103: 4005-4010 (2006), Shields et al., J Biol Chem. 276(9):6591-6604 (2001)에 공지되어 있으며, 상기 각각은 그 전체가 참고문헌으로 본원에 포함된다. 특정 구현예에서, 항체는 EU 인덱스(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, Bethesda (1991))에 따라 넘버링된, G236A, S239D, F243L, T256A, K290A, R292P, S298A, Y300L, V305I, A330L, I332E, E333A, K334A, A339T, 및 P396L 및 이들의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역, 예를 들어 IgG1 불변 영역, 또는 그의 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 S239D를 포함하는 중쇄 불변 영역, 예를 들어 IgG1 불변 영역, 또는 그의 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 T256A를 포함하는 중쇄 불변 영역, 예를 들어 IgG1 불변 영역, 또는 그의 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 K290A를 포함하는 중쇄 불변 영역, 예를 들어 IgG1 불변 영역, 또는 그의 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 S298A를 포함하는 중쇄 불변 영역, 예를 들어 IgG1 불변 영역, 또는 그의 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 I332E를 포함하는 중쇄 불변 영역, 예를 들어 IgG1 불변 영역 또는 그의 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 E333A를 포함하는 중쇄 불변 영역, 예를 들어, IgG1 불변 영역, 또는 그의 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 K334A를 포함하는 중쇄 불변 영역, 예를 들어 IgG1 불변 영역 또는 그의 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 A339T를 포함하는 중쇄 불변 영역, 예를 들어 IgG1 불변 영역 또는 그의 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 S239D 및 I332E를 포함하는 중쇄 불변 영역, 예를 들어, IgG1 불변 영역, 또는 그의 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 S239D, A330L 및 I332E를 포함하는 중쇄 불변 영역, 예를 들어 IgG1 불변 영역, 또는 그의 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 S298A, E333A 및 K334A를 포함하는 중쇄 불변 영역, 예를 들어, IgG1 불변 영역 또는 그의 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 G236A, S239D 및 I332E를 포함하는 중쇄 불변 영역, 예를 들어 IgG1 불변 영역 또는 그의 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 F243L, R292P, Y300L, V305I 및 P396L을 포함하는 중쇄 불변 영역, 예를 들어 IgG1 불변 영역 또는 그의 단편을 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에 기술된 항체는 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC) 활성을 나타낸다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 항체는 자연 살해 세포 매개된 세포 고갈을 개시한다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 항체는 자연 살해 세포에 의해 침윤된 종양을 치료하기 위해 사용된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 항체는 항체-의존성 세포성 식균작용(ADCP) 활성을 나타낸다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 항체는 대식세포 매개된 세포 고갈을 개시한다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 항체는 대식세포에 의해 침윤된 종양을 치료하는데 사용된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 항체는 종양내 조절 T 세포를 선택적으로 고갈시킨다.
특정 구현예에서, 본원에 기술된 항체는 활성화된 상태에서 인간 CTLA-4 단백질에 결합하는 활성화가능한 항체이다. 특정 구현예에서, 활성화가능한 항체는 절단되지않은 상태의 항체가 인간 CTLA-4 단백질에 결합하는 것을 억제하는 마스킹 모이어티, 및 항체에 커플링된 하나 이상의 절단가능한 모이어티를 포함하며, 예를 들어, 절단가능한 모이어티는 종양 미세환경에 풍부한 프로테아제에 대한 기질로서 기능하는 폴리펩타이드이다. 예시적인 활성화가능한 항체는 예를 들어 본원에 참고로 인용된 미국특허 제8,513,390호 및 제8,518,404호 및 미국 특허출원 공개번호 US 2014/0255313, US 2014/0010810, US 2014/0023664에 기술되어있다. 특정 구현예에서, 활성화가능한 항체는 야생형 인간 IgG 중쇄 불변 영역의 변이체인 인간 IgG 중쇄 불변 영역을 포함하며, 상기 변이체 인간 IgG 중쇄 불변 영역은 인간 FcγRIIIA에 결합하는 야생형 인간 IgG 중쇄 불변 영역보다 높은 친화도로 인간 FcγRIIIA에 결합한다.
5.3 약학적 조성물
본원에는 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제에서 원하는 순도를 갖는 본원에 기술된 항-CTLA-4 항체를 포함하는 조성물이 제공된다(Remington 's Pharmaceutical Sciences(1990) Mack Publishing Co., Easton, PA). 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수혜자에게 비 독성이며, 인산염, 시트르산염 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 방부제(예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저 분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는, 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 복합체(예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다.
특정 구현예에서, 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 내에 본원에 기술된 항-CTLA-4 항체 및 임의로 하나 이상의 추가의 예방 또는 치료제를 포함한다. 특정 구현예에서, 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 내에 본원에 기술된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 유효량 및 임의로 하나 이상의 추가의 예방 또는 치료제를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 약학적 조성물에 포함된 유일한 유효 성분이다. 본원에 기술된 약학적 조성물은 CTLA-4 활성을 억제하고, 암 또는 감염성 질병과 같은 질환을 치료하는데 유용할 수 있다.
일 양태에서, 약제로서 사용하기 위한, 본 발명의 항-CTLA-4 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물이 본원에 제공된다.
일 양태에서, 암의 치료 방법에 사용하기 위한, 본 발명의 항-CTLA-4 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물이 본원에 제공된다.
비경구 제제에서 사용되는 약학적으로 허용가능한 담체는 수성 비히클, 비 수성 비히클, 항균제, 등장제, 완충제, 산화 방지제, 국소 마취제, 현탁 및 분산제, 유화제, 금속이온봉쇄제 또는 킬레이트제 및 다른 약학적으로 허용가능한 물질을 포함한다. 수성 비히클의 예는 염화나트륨 주사, 링거 주사, 등장성 덱스트로스 주사, 멸균수 주사, 덱스트로스 및 락테이티드 링거 주사를 포함한다. 비 수성 비경구 비히클은 식물성 유래의 고정유, 면실유, 옥수수 기름, 참기름 및 땅콩유를 포함한다. 정균성 또는 진균성 농도의 항균제는 페놀 또는 크레졸, 수은제, 벤질 알콜, 클로로부탄올, 메틸 및 프로필 p-히드록시벤조산 에스테르, 티메로살, 벤즈알코늄 클로라이드 및 벤즈에토늄 클로라이드를 포함하는 다중-투여 용기에 포장된 비경구제에 첨가될 수 있다. 등장제는 염화나트륨 및 덱스트로스를 포함한다. 완충제에는 인산염과 시트르산염이 포함된다. 항산화제에는 황산수소나트륨이 포함된다. 국소 마취제에는 프로카인 히드로클로라이드가 포함된다. 현탁 및 분산제는 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스 및 폴리비닐피롤리돈을 포함한다. 유화제에는 폴리소르베이트 80(TWEEN® 80)이 포함된다. 금속 이온의 격리제 또는 킬레이트제는 EDTA를 포함한다. 약학적 담체는 또한, 물 혼화성(water miscible) 비히클을 위한 에틸 알콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜; 및 pH 조정을 위한 수산화나트륨, 염산, 시트르산 또는 락트산을 포함한다.
약학적 조성물은 대상에게 임의의 투여 경로로 제형화될 수 있다. 투여 경로의 특정 예는 비내, 경구, 폐, 경피, 피내 및 비경구를 포함한다. 피하, 근육내 또는 정맥내 주사에 의해 특징되는 비경구 투여 또한 본원에서 고려된다. 주사제는 액체 용액 또는 현탁액, 주사 전 액체 용액 또는 현탁액, 또는 유제로 적합한 고체 형태의 통상적인 형태로 제조될 수 있다. 주사용제, 용액 및 유제는 또한 하나 이상의 부형제를 함유한다. 적합한 부형제는 예를 들어 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤 또는 에탄올이다. 또한, 원한다면, 투여될 약학적 조성물은 소량의 비-독성 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 안정화제, 용해도 증강제, 및 기타 상기 제제들, 예컨대 예를 들어, 나트륨 아세테이트, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레이트 및 시클로덱스트린을 함유할 수 있다.
항체의 비경구 투여를 위한 제제는 주사할 준비가 된 멸균 용액, 멸균 건조 가용성 제품, 예컨대 피하 정제를 포함하는, 사용직전에 용매와 조합될 준비가 된 동결건조 분말, 주사될 준비가 된 무균 현탁액, 사용직전에 비히클과 조합될 준비가 된 멸균 건조 불용성 생성물 및 멸균 유제를 포함한다. 용액은 수성 또는 비수성 중 어느 하나일 수 있다.
정맥내 투여되는 경우, 적합한 담체는 생리식염수 또는 인산염 완충식염수(PBS), 및 증점제 및 가용화제, 예컨대 글루코스, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜 및 이들의 혼합물을 함유하는 용액을 포함한다.
항체를 포함하는 국소 혼합물은 국소 투여 및 전신투여에 대해 기술된 바와 같이 제조된다. 생성된 혼합물은 용액, 현탁액, 에멀젼 등일 수 있고, 크림, 겔, 연고, 에멀젼, 용액, 엘릭서, 로션, 현탁액, 팅크, 페이스트, 포말, 에어로졸, 관주(irrigation), 스프레이, 좌제, 붕대, 피부 패치 또는 국소 투여에 적합한 임의의 기타 제제로 배합될 수 있다.
본원에 기술된 항-CTLA-4 항체는 흡입과 같은 국소 적용용 에어로졸로서 배합될 수 있다(예를 들어, 미국특허 제4,044,126호, 제4,414,209호 및 제4,364,923호 참조, 이는 염증성 질병, 특히 천식 치료에 유용한 스테로이드의 전달을 위한 에어로졸을 기술함). 기도로 투여하기 위한 상기 제형은 네뷸라이저용 에어로졸 또는 용액의 형태로 되어 있거나, 또는 단독으로 또는 락토스와 같은 비활성 담체와 조합하여, 흡입용 초미세 분말로서 존재할 수 있다. 상기 경우, 제형의 입자는 일 구현예에서 50 마이크론 미만, 일 구현예에서 10 마이크론 미만의 직경을 가질 것이다.
본원에 기술된 항-CTLA-4 항체는 겔, 크림 및 로션의 형태로 눈에서와 같이 피부 및 점막으로 국소 적용하기 위한, 및 안구내 적용을 위한, 또는 대조내(intracisternal) 또는 척수내 적용을 위한, 국부적 또는 국소 적용을 위해 배합될 수 있다. 경피 전달 및 눈 또는 점막 투여를 위해, 또는 흡입 요법을 위해 국소 투여가 고려된다. 항체의 단독 또는 다른 약학적으로 허용가능한 부형제와 조합한 비강 용액을 또한 투여할 수 있다.
이온토포레틱 및 전기영동 장치를 포함하는 경피 패치는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 항체를 투여하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 패치는 미국특허 제6,267,983호, 제6,261,595호, 제6,256,533호, 제6,167,301호, 제6,024,975호, 제6,010,715호, 제5,985,317호, 제5,983,134호, 제5,948,433호 및 제5,860,957호에 개시되어있다.
특정 구현예에서, 본원에 기술된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 약학적 조성물은 용액, 유제 및 다른 혼합물로서 투여하기 위해 재구성될 수 있는 동결건조된 분말이다. 그것은 또한 고체 또는 젤로 재구성 및 제형화될 수 있다. 동결건조된 분말은 본원에 기술된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 이의 약학적으로 허용가능한 유도체를 적합한 용매에 용해시킴으로써 제조된다. 일부 구현예에서, 동결건조된 분말은 무균이다. 용매는 분말, 또는 분말로부터 제조된 재구성된 용액의 안정성 또는 다른 약리학적 성분을 개선시키는 부형제를 함유할 수 있다. 사용될 수 있는 부형제는 덱스트로스, 소르비톨, 프룩토스, 옥수수 시럽, 자일리톨, 글리세린, 글루코스, 수크로스 또는 다른 적합한 제제를 포함할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 용매는 또한 일 구현예에서 대략 중성의 pH에서 완충액, 예컨대 시트르산염, 인산 나트륨 또는 인산 칼륨 또는 당업자에게 공지된 다른 상기 완충액을 함유할 수 있다. 당업자에게 공지된 표준 조건 하에서 동결건조시킨 후 용액을 멸균 여과하여 목적하는 제형을 제공한다. 일 구현예에서, 생성된 용액은 동결건조를 위해 바이알에 분배될 것이다. 각 바이알에는 화합물의 단일 투여량 또는 다중 투여량이 포함될 것이다. 동결건조된 분말은 약 4℃ 내지 실온과 같은 적당한 조건하에 저장할 수 있다. 이 동결건조된 분말을 주사용수로 재구성하면 비경구 투여에 사용하기 위한 제형이 제공된다. 재구성을 위해, 동결건조된 분말을 멸균 수 또는 다른 적합한 담체에 첨가한다. 정확한 양은 선택된 화합물에 따라 다르다. 상기 양은 경험적으로 결정될 수 있다.
본원에 기술된 항-CTLA-4 항체 및 본원에서 제공된 다른 조성물은 또한 치료받고자하는 대상의 신체의 특정 조직, 수용체 또는 다른 영역을 표적으로 하도록 제형화될 수 있다. 많은 상기 표적화 방법은 당업자에게 잘 알려져있다. 상기 모든 표적화 방법은 본 발명의 조성물에 사용하기 위해 본원에서 고려된다. 예를 들어, 참조 타겟팅 방법의 비-제한적인 예를 위해, 예를 들면, 미국특허 제6,316,652호, 제6,274,552호, 제6,271,359호, 제6,253,872호, 제6,139,865호, 제6,131,570호, 제6,120,751호, 제6,071,495호, 제6,060,082호, 제6,048,736호, 제6,039,975호, 제6,004,534호, 제5,985,307호, 제5,972,366호, 제5,900,252호, 제5,840,674호, 제5,759,542호 및 제5,709,874호를 참조한다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 종양을 표적으로한다.
생체내 투여에 사용되는 조성물은 무균일 수 있다. 이는 예를 들어 무균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.
5.4 사용 방법
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 항-CTLA-4 항체를 사용하여 대상을 치료하는 방법을 제공한다. CTLA-4 기능의 억제로부터 이익을 얻을 수 있는 대상의 질병 또는 장애는 본원에 개시된 항-CTLA-4 항체를 사용하여 치료될 수 있다. 본원에 개시된 항-CTLA-4 항체는 종양에 대한 면역계 내성을 억제하는데 특히 유용하며, 따라서 암을 가진 대상에 대한 면역요법으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 본 발명은 대상의 항원에 반응하여 T-세포 활성화를 증가시키는 방법을 제공하며, 이 방법은 본원에 개시된 바와 같은 유효량의 항-CTLA-4 항체 또는 이의 약학적 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 유효량의 항체 또는 약학적 조성물을 대상에 투여하는 단계를 포함하는, 대상의 암을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 대상은 이전에 면역요법을 받았다. 특정 구현예에서, 대상자는 이전에 임의의 면역요법을 받지 않았다. 특정 구현예에서, 암은 진행성 또는 전이성 암이다. 본원에 개시된 항-CTLA-4 항체 또는 약학적 조성물로 치료될 수 있는 암은 제한없이 고형암(예를 들어, 재발성 또는 난치성 고형암, 및 진행성 또는 전이성 고형암), 암종, 육종, 흑색종(예를 들어, III 단계 또는 IV 단계 흑색종), 소세포폐암, 비-소세포폐암, 요로상피암, 난소암, 전립선암(예를 들어, 전이성 호르몬 불응성 전립선암 및 진행성 전이성 전립선암), 췌장암, 유방암(예를 들어, HER2+ 유방암(예를 들어, 재발성/난치성 HER2+ 유방암)), 두경부암(예를 들어, 재발성/난치성 두경부 편평세포암종(HNSCC)), 신경교종, 악성 신경교종, 다형성 교아종, 뇌 전이, 메르켈암, 위암, 위식도암, 신장세포암종, 포도막흑색종, 대장암, 자궁 경부암, 림프종(예를 들어, 재발성 또는 난치성 림프종), 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 백혈병 및 다발성 골수종을 포함한다. 특정 구현예에서, 암은 본원에 개시된 항-CTLA-4 항체 또는 약학적 조성물의 종양내 투여로 치료된다. 본원에 개시된 항-CTLA-4 항체 또는 약학적 조성물의 종양내 투여로 치료할 수 있는 암은 제한없이, 고형 종양(예를 들어, 진행성 또는 전이성 고형 종양), 두경부암(예를 들어, 재발성/난치성 두경부 편평세포암종(HNSCC)) 및 유방암(예를 들어, HER2+ 유방암(예를 들어, 재발성/난치성 HER2+ 유방암))을 포함한다.
본원에 개시된 항-CTLA-4 항체 또는 약학적 조성물로 치료할 수 있는 추가의 암은 제한없이, B 세포 림프종(예를 들어, B 세포 만성 림프구성 백혈병, B 세포 비-호지킨 림프종, 피부 B 세포 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종), 기저 세포암종, 방광암, 모세포종, 뇌전이, 유방암, 버킷 림프종, 암종(예를 들어, (위식도 접합의) 선암종), 자궁경부암, 대장암, 결장암(결장암 및 직장암), 자궁내막암종, 식도암, 유잉육종, 여포성 림프종, 위암, 위식도 접합암종, 위장암, 아교 모세포종(예를 들어, 새로 진단된 또는 재발성 다형성 교아종), 신경교종, 두경부암(예를 들어, 두경부 편평세포 암종), 간 전이, 호지킨 림프종 및 비호지킨 림프종, 신장암(예를 들어, 신장세포암종 및 윌름 종양), 후두암, 백혈병(예를 들어, 만성 골수성 백혈병, 모양 세포성 백혈병), 간암(예를 들어, 간암종 및 간종양), 폐암(예를 들어, 비-소세포 폐암 및 소세포 폐암), 림프모구 림프종, 림프종, 맨틀 세포 림프종, 전이성 뇌 종양, 전이성 암, 골수종(예를 들어, 다발성 골수종), 신경아세포종, 안구 흑색종, 구강인두암, 골육종, 난소암, 췌장암(예를 들어, 췌장관 선암종), 전립선암(예를 들어, 호르몬 재발성(예를 들어, 거세저항성), 전이성 암, 전이호르몬 불응성 암(예를 들어, 거세 저항성, 안드로겐 독립성)), 신장 세포암종(예를 들어, 전이성), 타액선암종, 육종(예를 들어, 횡문근육종), 피부암(예를 들어, 흑색종(예를 들어, 전이성 흑색종)), 연조직 육종, 고형 종양, 편평 세포암종, 활막 육종, 고환암, 갑상선암, 이행세포 암(요로상피세포암), 포도막 흑색종(예를 들어, 전이성), 사마귀모양암종, 외음부 암, 및 발텐스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom macroglobulinemia)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 치료된 암은 인간 육종 또는 암종, 예를 들어 섬유 육종, 점액 육종, 지방 육종, 연골 육종, 골육종, 척삭종, 혈관 육종, 내피 육종, 림프관 육종, 림프관 내피 육종, 활막종, 중피종, 유잉 종양(Ewing's tumour), 평활근육종(leiomyosarcoma), 횡문근육종, 결장 암종, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평상피 세포암종, 기저 세포 암종, 선암, 한선암종, 피지선 암종, 유두 암종, 유두 선암, 낭종암, 골수암종, 기관지 암종, 신세포 암종(예를 들어, 전이성), 간세포암, 담관 암종, 융모암종, 정상피종, 배아 암종, 윌름 종양 (Wilm's tumour), 자궁경부암, 고환 종양, 폐 암종, 소세포 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종, 다형교아종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관아세포종, 청신경종, 핍지교종, 수막종, 흑색종, 신경아세포종, 또는 망막아종이다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 치료되는 암은 급성 림프구성 백혈병 또는 급성 골수성 백혈병(예를 들어, 골수세포성 백혈병, 전골수성 백혈병, 골수 단핵구성 백혈병, 단핵구성 백혈병 및 적백혈병); 만성 백혈병(만성 골수성(과립구성) 백혈병 또는 만성 림프구성 백혈병); 호지킨 병; 비-호지킨 병; 급성 골수성 백혈병; B-세포 림프종; T-세포 림프종; 역행성 대세포성 림프종; 안구내 림프종; 여포성 림프종; 소장 림프종; 또는 비장 변연부 림프종(splenic marginal zone lymphoma)이다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 치료된 암은 다발성 골수종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 중쇄병, 위장관 기질 종양, 두경부암(예를 들어, 하인두의 편평세포 암종, 후두의 편평세포 암종, 구강인두의 세포암종, 또는 후두의 우췌상암종), 자궁내막 간질 육종, 비만 세포 육종, 성인 연조직 육종, 자궁 육종, 메르켈 세포 암종, 요로상피암종, 뇌전이가 있는 흑색종, 포도막흑색종, 간 전이를 갖는 자궁 흑색종, 비소세포 폐암, 직장암 또는 골수이형성 증후군을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법에 따라 치료된 암은 전이성이다.
특정 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 치료되는 암은 전립선 암, 유방암, 폐암, 결장 직장암, 흑색종, 기관지 암, 방광암, 뇌 또는 중추 신경계 암, 말초 신경계 암, 자궁암, 또는 자궁내막암, 구강암, 또는 인두암, 비호지킨 림프종, 갑상선암, 신장 암, 담관 암, 소장 또는 맹장암, 타액선 암, 갑상샘암, 부신 암, 편평세포암, 중피종, 골암, 흉선종양/흉선암종, 교아세포종, 골수이형성 증후군, 연조직 육종, DIPG, 선암, 골육종, 연골 육종, 백혈병 또는 췌장암을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 치료된 암은 암종(예를 들어, 선암), 림프종, 모세포종, 흑색종, 육종 또는 백혈병을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 치료된 암은 편평세포 암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 위장암, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 췌장암, 교아세포종, 신경교종, 자궁경부암, 난소암, 간암(예를 들어, 간암종 및 간종양), 방광암, 유방암, 염증성 유방암, 메르켈 세포 암종, 대장 암, 결장직장암, 위암, 방광암, 자궁 내막 암종, 골수종(예를 들어, 다발성 골수종), 타액선, 암종, 신장암(예를 들어, 신세포 암종, 및 윌름 종양), 기저세포 암종, 흑색종, 전립선 암, 외음부 암, 갑상선암, 고환암, 식도암, 장액성 선암 또는 다양한 유형의 두경부암을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 치료된 암은 섬유조직형성 흑색종, 염증성 유방암, 흉선종, 직장암, 항문 암 또는 외과적 치료가능하거나 비-외과적 치료가능한 뇌간 신경아교종을 포함한다. 특정 구현예에서, 암은 고형 종양이다. 또 다른 특정 구현예에서, 암은 다형성 교아종(glioblastoma multiforme)이다. 일부 구현예에서, 다형성 교아종은 재발성이다. 일부 구현예에서, 다형성 교아종은 새로 진단된다. 일부 구현예에서, 다발성 교아종은 비-메틸화 MGMT 프로모터를 갖는 대상에 존재한다. 일부 구현예에서, 다형성 교아종은 베바시주맙 치료에 대하여 난치성이다. 일부 구현예에서, 다형성 교아종은 베바시주맙 요법을 받지 않은 대상에 존재한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 치료되는 암은 전이성 흑색종(예를 들어, 내성 전이성 흑색종), 전이성 난소 암 또는 전이성 신장세포 암종이다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 치료되는 암은 이필리무맙에 대하여 내성인 흑색종이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 치료되는 암은 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙에 대하여 내성인 흑색종이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 치료된 암은 이필리무맙 및 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙에 대하여 내성인 흑색종이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 유효량의 항-CTLA-4 항체 또는 이의 약학적 조성물을 대상에 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 감염성 질병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 감염(예를 들어, 바이러스 감염, 세균 감염, 진균 감염, 원충 감염 또는 기생충 감염)을 예방 및/또는 치료하는 방법이 제공된다. 상기 방법에 따라 예방 및/또는 치료된 감염은 본원에서 확인된 감염 인자에 의해 유발될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 항-CTLA-4 항체 또는 이의 조성물은 대상에게 투여되는 유일한 활성제이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 항-CTLA-4 항체 또는 이의 조성물은 감염성 질병의 치료를 위한 항-감염 치료(예를 들어, 항바이러스제, 항균제, 항진균제 또는 구충제)와 조합하여 사용된다.
본원에 기술된 항-CTLA-4 항체 또는 약학적 조성물에 의해 치료 및/또는 예방될 수 있는 감염성 질병은 박테리아, 기생충, 균류, 원생 동물(protozae) 및 바이러스를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 감염 인자에 의해 유발된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 항-CTLA-4 항체 또는 약학적 조성물에 의해 치료 및/또는 예방되는 감염성 질병은 바이러스에 의해 유발된다. 본원에 기술된 방법에 따라 예방 및/또는 치료될 수 있는 바이러스성 질병 또는 바이러스성 감염은 A형 간염, B형 간염, C형 간염, 인플루엔자(예를 들어, A형 인플루엔자 또는 B형 인플루엔자), 수두, 아데노바이러스, 단순 헤르페스 바이러스 타입 I(HSV-I), 단순 헤르페스 바이러스 타입 II(HSV-II), 우역, 라이노바이러스, 에코바이러스, 로타바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 유두종 바이러스, 파포바 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 에키노 바이러스, 아르보바이러스(arbovirus), 헌타바이러스(huntavirus), 콕사키 바이러스, 볼거리 바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 폴리오 바이러스, 천연두, 엡스타인 바 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 타입 I(HIV-1), 인간 면역결핍 바이러스 타입 II(HIV-II), 및 바이러스성 수막염, 뇌염, 뎅기열 또는 천연두와 같은 바이러스성 질병의 치료제를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
예방 및/또는 치료될 수 있는 세균 감염은 대장균(Escherichia coli), 폐렴막대균(Klebsiella pneumoniae), 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris), 스타필로코커스 비리단스(Staphylococcus viridans), 및 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)에 의해 야기된 감염을 포함한다. 본원에 기술된 방법에 따라 예방 및/또는 치료될 수 있는 박테리아(예를 들어, 대장균(Escherichia coli), 폐렴막대균(Klebsiella pneumoniae), 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris), 스타필로코커스 비리단스(Staphylococcus viridans), 및 녹농균(Pseudomonas aeruginosa))에 의한 세균성 질병은 마이코박테리아 리케차(Mycobacteria rickettsia), 마이코플라즈마(Mycoplasma), 나이세리아(Neisseria), 폐렴 연쇄상구균(S. pneumonia), 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi)(라임병), 탄저균(Bacillus antracis)(앤스랙스(anthrax)), 파상풍(tetanus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 스타필로코커스(Staphylococcus), 마이코박테리아(mycobacterium), 페르티수스(pertissus), 콜레라(cholera), 페스트(plague), 디프테리아(diptheria), 클라미디아(chlamydia), 황색 포도상구균(S. aureus) 및 레지오넬라(legionella)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본원에 기술된 방법에 따라 예방 및/또는 치료될 수 있는 원생동물에 의해 유발되는 원생 질병 또는 원생동물 감염은 레이시마니아, 콕시듐감염증(coccidiosis), 파동편모충 주혈흡충(trypanosoma schistosoma) 또는 말라리아를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 본원에 기술된 방법에 따라 예방 및/또는 치료될 수 있는 기생충에 의해 야기된 기생충 질병 또는 기생충 감염은 클라미디아 및 리케차를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
본원에 기술된 방법에 따라 예방 및/또는 치료할 수 있는 진균성 질병 또는 진균성 감염은 칸디다(Candida) 감염, 접합균증(zygomycosis), 칸디다 유선염(Candida mastitis), 잠복성 트리코스포론미아를 동반한 진행성 파종성 트리코스포로니스증(progressive disseminated trichosporonosis with latent trichosporonemia), 파종성 칸디다증(disseminated candidiasis), 폐 파라콕시디오이데스진균증(pulmonary paracoccidioidomycosis), 폐 아스페르길루스증(pulmonary aspergillosis), 폐포자충 폐렴(Pneumocystis carinii pneumonia), 크립토코쿠스 뇌막염(cryptococcal meningitis), 콕시디오이데스 뇌수막염(coccidioidal meningoencephalitis) 및 뇌척수액 혈관염, 아스페르길루스 니제르(Aspergillus niger) 감염, 진균성 각막염(Fusarium keratitis), 부비동 진균증(paranasal sinus mycoses), 아스페르길루스 푸미가투스 심내막염(Aspergillus fumigatus endocarditis), 경골연골발육부전증(tibial dyschondroplasia), 칸디다 글라브라타 질염(Candida glabrata vaginitis), 구인두 칸디다증(oropharyngeal candidiasis), X-관련성 만성 육아종성 질병(X-linked chronic granulomatous disease), 무좀(tinea pedis), 피부 칸디다증(cutaneous candidiasis), 진균성 태반염(mycotic placentitis), 파종성 트리코스포로니스증(disseminated trichosporonosis), 알레르기 기관지폐 아스페르길루스증(allergic bronchopulmonary aspergillosis), 진균 각막염(Myscotic keratitis), 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans infection) 감염, 진균성 복막염, 커불라리아 엽고병(Curvularia geniculata) 감염, 포도구균성 안내염(staphylococcal endophthalmitis), 스포로트릭스증(sporotrichosis), 및 백선증(dermatophytosis)에 의해 유발된 질병을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
특정 구현예에서, 감염성 질병은 급성이다. 특정 구현예에서, 감염성 질병은 만성이다. 특정 구현예에서, 감염성 질병은 예를 들어, 웨스트 나일 바이러스, 세인트 루이스 뇌염 바이러스, 포와센 바이러스(powassan virus), 진드기-매개 뇌염 바이러스, 뎅기 바이러스, 지카 바이러스, 키사누르 산림 질병 바이러스, 황열병 바이러스 및 치쿤군야(chikungunya) 바이러스와 같은 플라비 바이러스(flavivirus)에 의해 유발된다. 특정 구현예에서, 감염성 질병은 에볼라 바이러스에 기인한다. 특정 구현예에서, 감염성 질병은 인플루엔자 바이러스에 의해 유발된다. 특정 구현예에서, 감염성 질병은 인간 면역결핍 바이러스(HIV), B형 간염 바이러스(HBV) 또는 C형 간염 바이러스(HCV)에 의해 유발된다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 항-CTLA-4 항체 또는 이의 약학적 조성물은 바이러스성 조절을 촉진한다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 항-CTLA-4 항체 또는 이의 약학적 조성물은 바이러스 저장소를 제거한다.
본 발명은 일 양태에서, 약제로 사용하기 위한, 본 발명의 항-CTLA-4 항체 및/또는 본 발명의 항-CTLA-4 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 본 발명의 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 일 양태에서, 면역요법(예를 들어, 대상내 항원에 대하여 반응하여 T-세포 활성화를 증가시키기 위한, 암을 치료하기 위한, 또는 감염성 질병을 치료 또는 예방하기 위한 면역요법)을 위한 약학적 조성물 또는 약제를 제조하기 위한, 본 발명의 항-CTLA-4 항체 및/또는 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 조합하는 그의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 일 양태에서, 암 치료 방법에 사용하기 위한, 본 발명의 항-CTLA-4 항체 및/또는 본 발명의 항-CTLA-4 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 본 발명의 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 일 양태에서, 종양에 대한 면역계 내성을 억제하는 방법 및/또는 암을 가진 대상을 위한 면역요법에 사용하기 위한, 본 발명의 항-CTLA-4 항체 및/또는 본 발명의 항-CTLA-4 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 본 발명의 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 일 양태에서, 감염성 질병의 치료 방법에 사용하기 위한, 본 발명의 항-CTLA-4 항체 및/또는 본 발명의 항-CTLA-4 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 본 발명의 약학적 조성물에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 상기 방법은 대상에게 추가의 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 추가의 치료제는 화학요법제 또는 체크포인트 표적화제이다. 특정 구현예에서, 체크포인트 표적화제는 길항제 항-PD-1 항체, 길항제 항-PD-L1 항체, 길항제 항-PD-L2 항체, 길항제 항-CTLA-4 항체, 길항제 항-TIM-3 항체, 길항제 항-LAG-3 항체, 길항제 항-CEACAM1 항체, 작용제 항-GITR 항체, 작용제 항-OX40 항체, 작용제 항-CD137 항체, 작용제 항-DR3 항체, 작용제 항-TNFSF14 항체 및 작용제 항-CD27 항체로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 체크포인트 표적화제는 길항제 항-PD-1 항체이다. 특정 구현예에서, 체크포인트 표적화제는 길항제 항-PD-L1 항체이다. 특정 구현예에서, 체크포인트 표적화제는 길항제 항-LAG-3 항체이다. 특정 구현예에서, 추가의 치료제는 종양 괴사인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원 또는 종양 괴사인자 슈퍼패밀리 구성원에 대한 작용제이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 (a) 본 발명의 항-CTLA-4 항체 및/또는 본 발명의 항-CTLA-4 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 본 발명의 약학적 조성물 및 (b) 약제로서 사용하기 위한 추가의 치료제에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, 추가의 치료제는 화학요법제 또는 체크포인트 표적화제이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 암의 치료 방법에 사용하기 위한, (a) 본 발명의 항-CTLA-4 항체 및/또는 본 발명의 항-CTLA-4 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 본 발명의 약학적 조성물 및 (b) 추가의 치료제에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 감염성 질병의 치료 방법에 사용하기 위한, (a) 본 발명의 항-CTLA-4 항체 및/또는 본 발명의 항-CTLA-4 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 본 발명의 약학적 조성물 및 (b) 추가의 치료제에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본원에 개시된 항-CTLA-4 항체는 IDO(인돌아민-(2,3)-디옥시게나제) 및/또는 TDO(트립토판 2,3-디옥시게나제)와 같은 면역조절 효소(들)을 표적으로 하는 화합물과 조합하여 대상에게 투여된다. 특정 구현예에서, 상기 화합물은 에파카도스태트(epacadostat, Incyte Corp; 예를 들어, 그 전체가 본원에 참고로 인용된 WO 2010/005958 참조), F001287(Flexus Biosciences), 인독시모드(NewLink Genetics) 및 NLG919(NewLink Genetics)로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 화합물은 에파카도스태트이다. 또다른 구현예에서, 화합물은 F001287이다. 또 다른 구현예에서, 화합물은 인독시모드이다. 또 다른 구현예에서, 화합물은 NLG919이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 약제로 사용하기 위한, (a) 본 발명의 항-CTLA-4 항체 및/또는 본 발명의 항-CTLA-4 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 본 발명의 약학적 조성물 및 (b) 면역조절 효소를 표적으로 하는 화합물에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, 화합물은 IDO 및/또는 TDO를 표적으로 한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 암 치료방법에 사용하기 위한, (a) 본 발명의 항-CTLA-4 항체 및/또는 본 발명의 항-CTLA-4 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 본 발명의 약학적 조성물 및 (b) 면역조절 효소를 표적으로하는 화합물에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, 화합물은 IDO 및/또는 TDO를 표적으로 한다.
특정 구현예에서, 본원에 개시된 항-CTLA-4 항체는 백신과 조합하여 대상에게 투여된다. 특정 구현예에서, 백신은 열 쇼크 단백질계 종양 백신 또는 열 쇼크 단백질계 병원체 백신이다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 항-CTLA-4 항체는 열 쇼크 단백질계 종양-백신과 조합하여 대상에게 투여된다. 열 쇼크 단백질(HSP)은 모든 종류에 편재하는 매우 보존된 단백질계열이다. 그들의 발현은 독소에의 노출, 산화 스트레스 또는 글루코스 부족을 포함하여, 열 쇼크 또는 다른 형태의 스트레스의 결과로 훨씬 더 높은 수준으로 강력하게 유도될 수 있다. 분자량에 따라 5개의 계열이 분류되었다: HSP-110, HSP-90, HSP-70, HSP-60 및 HSP-28. HSP는 T-세포 활성화를 유도하는, 대식세포 및 수지상 세포(DC)와 같은 항원 제시 세포(APC)의 교차-제시 경로를 통해 면역원성 펩타이드를 전달한다. HSP는 종양-특이적 면역을 유도할 수 있는 복합체를 형성하는 종양-관련 항원 펩타이드의 샤페론 담체(chaperone carrier) 역할을 한다. 죽어가는 종양 세포에서 방출되면, HSP-항원 복합체는 항원 제시 세포(APCs)에 의해 흡수되며, 상기 항원은 항-종양 CD8+및 CD4+ T 세포의 활성화를 유도하는 MHC 클래스 I 및 클래스 II 분자에 결합하는 펩타이드로 가공된다. 종양 제제로부터 유래된 HSP 복합체에 의해 유도된 면역은 특히 각 대상의 암에 의해 발현되는 독특한 항원 펩타이드 레퍼토리에 대해 유도된다.
열 쇼크 단백질 펩타이드 복합체(HSPPC)는 항원 펩타이드와 비공유 결합된 열 쇼크 단백질로 구성된 단백질 펩타이드 복합체이다. HSPPC는 타고난 면역 반응과 적응 면역 반응 모두를 유도한다. 특정 구현예에서, 항원 펩타이드(들)은 치료되는 암에 대한 항원성을 나타낸다. HSPPC는 막 수용체(주로 CD91)를 통해 APC에 의해 또는 Toll-유사 수용체에 결합함으로써 효율적으로 점유된다. HSPPC 내재화로 인해 자연 살해 세포(NK), 단핵구 및 Th1 및 Th2-매개 면역 반응의 활성화를 유도하는 케모카인 및 사이토카인 생산으로 APCs의 기능적 성숙이 발생한다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 사용되는 HSPPC는 항원 펩타이드와 복합체화된 스트레스 단백질의 hsp60, hsp70 또는 hsp90 계열로부터의 하나 이상의 열 쇼크 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, HSPPC는 hsc70, hsp70, hsp90, hsp110, grp170, gp96, 칼레티큘린 또는 이 둘 이상의 조합물을 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에 기술된 항-CTLA-4 항체는 암을 치료하기 위해, 열 쇼크 단백질 펩타이드 복합체(HSPPC), 예를 들어 열 쇼크 단백질 펩타이드 복합체-96(HSPPC-96)과 조합하여 대상에게 투여된다. HSPPC-96은 항원 펩타이드와 복합체를 이루는 96 kDa 열 쇼크 단백질(Hsp), gp96을 포함한다. HSPPC-96은 대상의 종양으로부터 제조된 암 면역요법이며, 암의 항원성 "지문(fingerprint)"을 함유한다. 특정 구현예에서, 상기 지문은 특정 대상의 특정 암세포에만 존재하는 독특한 항원을 함유하며, 대상의 면역계가 특정 암 지문을 가진 임의의 세포를 인식하고, 공격하도록 자극시키기 위해 백신을 주사한다.
특정 구현예에서, HSPPC, 예를 들어, HSPPC-96은 대상의 종양 조직으로부터 생산된다. 특정 구현예에서, HSPPC(예를 들어, HSPPC-96)는 치료되는 암 또는 이의 전이 유형의 종양으로부터 생산된다. 또 다른 특정 구현예에서, HSPPC(예를 들어, HSPPC-96)는 치료되는 대상에게 자가항원이다. 특정 구현예에서, 종양 조직은 비-괴사성 종양 조직이다. 특정 구현예에서, 적어도 1 g(예를 들어, 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9 또는 적어도 10 g)의 비-괴사성 종양 조직을 백신 요법을 생산하는데 사용한다. 특정 구현예에서, 외과적 절제술 후, 비-괴사성 종양 조직은 백신 제조에 사용하기 전에 냉동된다. 일부 구현예에서, HSPPC, 예를 들어, HSPPC-96은 정제 기술에 의해 종양 조직으로부터 분리되고, 여과되고, 주사가능한 백신에 대해 제조된다. 특정 구현예에서, 대상에게 HSPPC, 예를 들어, HSPCC-96을 6 내지 12회 투여한다. 상기 구현예에서, HSPPC, 예를 들어, HSPPC-96, 투여량은 첫 4회 투여량에 대해 매주 투여될 수 있으며, 이후 2-8회 추가 투여량에 대해 격주로 투여될 수 있다.
본원에 기술된 방법에 따라 사용될 수 있는 HSPPC의 추가의 예는 본원에 전체적으로 참고 문헌으로 포함된 다음의 특허 및 특허 출원, 즉 미국특허 제6,391,306호, 제6,383,492호, 제6,403,095호, 제6,410,026호, 제6,436,404호, 제6,447,780호, 제6,447,781호 및 제6,610,659호에 개시되어있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 약제로서 사용하기 위한, (a) 본 발명의 항-CTLA-4 항체 및/또는 본 발명의 항-CTLA-4 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 본 발명의 약학적 조성물 및 (b) 백신에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, 백신은 열 쇼크 단백질계 종양 백신 또는 열 쇼크 단백질계 병원체 백신이다. 바람직한 구현예에서, 백신은 열 쇼크 단백질계 바이러스 백신이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 암 치료 방법에 사용하기 위한, (a) 본 발명의 항-CTLA-4 항체 및/또는 본 발명의 항-CTLA-4 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 본 발명의 약학적 조성물 및 (b) 백신에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, 백신은 열 쇼크 단백질계 종양 백신이다.
항-CTLA-4 항체 및 추가의 치료제(예를 들어, 화학요법제, 체크포인트 표적제, IDO 억제제 및/또는 백신)는 별도의 투여 형태로서 개별적으로, 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 항-CTLA-4 항체는 비경구로 투여되고, IDO 억제제는 경구 투여된다.
특정 구현예에서, 본원에 개시된 항-CTLA-4 항체는 종양내로 대상에 투여된다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 항-CTLA-4 항체는 추가의 치료제와 함께 종양내로 대상에게 투여된다. 특정 구현예에서, 추가의 치료제는 전신투여된다. 특정 구현예에서, 대상은 고형 종양을 갖는다. 특정 구현예에서, 대상은 두경부 편평세포 암종(HNSCC)을 갖는다. 특정 구현예에서, 대상은 HER2+ 유방암을 갖는다. 특정 구현예에서, 전신투여되는 추가의 치료제는 항-PD-1 항체(예를 들어, 펨브롤리주맙 또는 니볼루맙)이다. 특정 구현예에서, 전신투여되는 추가의 치료제는 항-EGFR 항체(예를 들어, 세툭시맙)이다. 특정 구현예에서, 전신투여되는 추가의 치료제는 항-HER2 항체(예를 들어, 트라스투주맙)이다. 특정 구현예에서, 전신투여되는 추가의 치료제는 화학요법제(예를 들어, 겜시타빈)이다. 특정 구현예에서, 대상은 고형 종양을 갖고, 전신투여되는 추가의 치료제는 항-PD-1 항체(예를 들어, 펨브롤리주맙 또는 니볼루맙)이다. 특정 구현예에서, 대상은 두경부 편평세포 암종(HNSCC)을 갖고, 전신투여되는 추가의 치료제는 항-EGFR 항체(예를 들어, 세툭시맙)이다. 특정 구현예에서, 대상은 HER2+ 유방암을 갖고, 전신투여되는 추가의 치료제는 항-HER2 항체(예를 들어, 트라스투주맙)이다. 특정 구현예에서, 대상은 화학요법제(예를 들어, 겜시타빈)를 추가로 투여받았다. 일 양태에서, 본 발명은 암 치료 방법에 사용하기 위한, 항-CTLA-4 항체 및/또는 본 발명의 약학적 조성물, 및 선택적으로 추가의 치료제에 관한 것이며, 상기 항-CTLA-4 항체, 및/또는 본 발명의 약학적 조성물이 대상에게 종양내 투여된다. 바람직한 일 구현예에서, 추가의 치료제가 대상에게 투여되고, 보다 바람직하게는 추가의 치료제가 대상에게 전신투여된다.
특정 구현예에서, 항-PD-1 항체가 본원에 개시된 방법에 사용된다. 특정 구현예에서, 항-PD-1 항체는 Bristol-Myers Squibb에 의해 개발된 BMS-936558 또는 MDX1106으로도 알려진 니볼루맙이다. 특정 구현예에서, 항-PD-1 항체는 람브롤리주맙(Lambrolizumab) 또는 MK-3475로도 알려진, Merck & Co.에 의해 개발된 펨브롤리주맙이다. 특정 구현예에서, 항-PD-1 항체는 CT-011로도 알려진, CureTech에 의해 개발된 피딜리주맙(Pidilizumab)이다. 특정 구현예에서, 항-PD-1 항체는 AMP-514로도 알려진, Medimmune에 의해 개발된 MEDI0680이다. 특정 구현예에서, 항-PD-1 항체는 Novartis Pharmaceuticals에 의해 개발된 PDR001이다. 특정 구현예에서, 항-PD-1 항체는 Regeneron Pharmaceuticals에 의해 개발된 REGN2810이다. 특정 구현예에서, 항-PD-1 항체는 Pfizer에 의해 개발된 PF-06801591이다. 특정 구현예에서, 항-PD-1 항체는 BeiGene에 의해 개발된 BGB-A317이다. 특정 구현예에서, 항-PD-1 항체는 AnaptysBio 및 Tesaro에 의해 개발된 TSR-042이다. 특정 구현예에서, 항-PD-1 항체는 Hengrui에 의해 개발된 SHR-1210이다.
본원에 개시된 치료 방법에 사용될 수 있는 항-PD-1 항체의 추가의 비-제한적인 예가 하기 특허 및 특허출원에 개시되어 있으며, 이는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참고로 인용된다: 미국 특허 제6,808,710호; 미국특허 제7,332,582호; 미국특허 제7,488,802호; 미국특허 제8,008,449호; 미국특허 제8,114,845호; 미국특허 제8,168,757호; 미국특허 제8,354,509호; 미국특허 제8,686,119호; 미국특허 제8,735,553호; 미국특허 제8,747,847호; 미국특허 제8,779,105호; 미국특허 제8,927,697호; 미국특허 제8,993,731호; 미국특허 제9,102,727호; 미국특허 제9,205,148호; 미국 공개특허 공보 US 2013/0202623 A1; 미국 공개특허 공보 US 2013/0291136 A1; 미국 공개번호 US 2014/0044738 A1; 미국 공개특허 공보 US 2014/0356363 A1; 미국 공개번호 US 2016/0075783 A1; 및 PCT 공개번호 WO 2013/033091 A1; PCT 공개번호 WO 2015/036394 A1; PCT 공개번호 WO 2014/179664 A2; PCT 공개번호 WO 2014/209804 A1; PCT 공개번호 WO 2014/206107 A1; PCT 공개번호 WO 2015/058573 A1; PCT 공개번호 WO 2015/085847 A1; PCT 공개번호 WO 2015/200119 A1; PCT 공개번호 WO 2016/015685 A1; 및 PCT 공개번호 WO 2016/020856 A1.
특정 구현예에서, 항-PD-L1 항체는 본원에 개시된 방법에 사용된다. 특정 구현예에서, 항-PD-L1 항체는 Genentech에 의해 개발된 아테졸리주맙(atezolizumab)이다. 특정 구현예에서, 항-PD-L1 항체는 AstraZeneca, Celgene 및 Medimmune에 의해 개발된 두르발루맙(durvalumab)이다. 특정 구현예에서, 항-PD-L1 항체는 Merck Serono 및 Pfizer에 의해 개발된, MSB0010718C로도 공지된 아벨루맙이다. 특정 구현예에서, 항-PD-L1 항체는 Bristol-Myers Squibb에 의해 개발된 MDX-1105이다. 특정 구현예에서, 항-PD-L1 항체는 Amplimmune 및 GSK에 의해 개발된 AMP-224이다.
본원에 개시된 치료 방법에 사용될 수 있는 항-PD-L1 항체의 비-제한적인 예는 하기 특허 및 특허 출원에 개시되어 있으며, 이는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참고로 인용된다: 미국특허 제7,943,743호; 미국특허 제8,168,179호; 미국특허 제8,217,149호; 미국특허 제8,552,154호; 미국특허 제8,779,108호; 미국특허 제8,981,063호; 미국특허 제9,175,082호; 미국 공개번호 US 2010/0203056 A1; 미국 공개번호 US 2003/0232323 A1; 미국 공개번호 US 2003/0323249 A1; 미국 공개번호 US 2014/0341917 A1; 미국 공개번호 US 2014/0044738 A1; 미국 공개번호 US 2015/0203580 A1; 미국 공개번호 US 2015/0225483 A1; 미국 공개번호 US 2015/0346208 A1; 미국 공개번호 US 2015/0355184 A1; 및 PCT 공개번호 WO 2014/100079 A1; PCT 공개번호 WO 2014/022758 A1; PCT 공개번호 WO 2014/055897 A2; PCT 공개번호 WO 2015/061668 A1; PCT 공개번호 WO 2015/109124 A1; PCT 공보 No. WO 2015/195163 A1; PCT 공개번호 WO 2016/000619 A1; 및 PCT 공개번호 WO 2016/030350 A1.
특정 구현예에서, 항-LAG-3 항체가 본원에 개시된 방법에 사용된다. 특정 구현예에서, 항-LAG-3 항체는 Bristol-Myers Squibb에 의해 개발된 BMS-986016이다. 특정 구현예에서, 항-LAG-3 항체는 Novartis에 의해 개발된 LAG525이다. 특정 구현예에서, 항-LAG-3 항체는 GSK에 의해 개발된 GSK2831781이다.
본원에 개시된 치료 방법에 사용될 수 있는 항-LAG-3 항체의 비-제한적인 예는 하기 특허 및 특허 출원에 개시되어 있으며, 이는 모든 목적을 위해 그의 전체 내용이 본원에 참고로 인용된다: 미국 특허 제9,244,059호; 미국 공개번호 US 2011/0150892 A1; 미국 공개번호 US 2014/0093511 A1; 미국 공개번호 US 2014/0286935 A1; 미국 공개번호 US 2015/0259420 A1; 및 PCT 공개번호 WO 2015/042246 A1; PCT 공개번호 WO 2015/116539 A1; PCT 공개번호 WO 2015/200119 A1; 및 PCT 공개번호 WO 2016/028672 A1.
특정 구현예에서, 항-EGFR 항체는 본원에 개시된 방법에 사용된다. 특정 구현예에서, 항-EGFR 항체는 Bristol-Myers Squibb 및 ImClone에 의해 개발된 세툭시맙, Abgenix 및 Amgen에 의해 개발된 파니투무맙(panitumumab), CMI Cuba 및 YM BioSciences에 의해 개발된 니모투주맙(nimotuzumab), ImClone에 의해 개발된 네시투무맙(necitumumab), Genmab에 의해 개발된 잘루투무맙(zalutumumab), Takeda에 의해 개발된 마투주맙(matuzumab), Merck Serono와 Symphogen에 의해 개발된 Sym004, Glycart와 Roche에 의해 개발된 임가투주맙(imgatuzumab), Genentech와 Roche에 의해 개발된 둘리고투맙(duligotumab), Abbott에 의해 개발된 데파툭시주맙(depatuxizumab), Abbvie에 의해 개발된 데파툭시주맙 마포도틴(depatuxizumab mafodotin), Adimab과 Merrimack에 의해 개발된 MM-151, Green Cross에 의해 개발된 GC1118, Amgen and ImmunoGen에 의해 개발된 AMG 595, Glycotope에 의해 개발된 CetuGEX, ImmunoGen에 의해 개발된 라프리툭시맙 엠탄신(laprituximab emtansine), GenMab 및 Janssen Biotech에 의해 개발된 JNJ-61186372, Sinocelltech에 의해 개발된 SCT200, Lilly에 의해 개발된 LY3164530, Shanghai Henlius에 의해 개발된 HLX07 또는 Synermore에 의해 개발된 SYN004이다.
특정 구현예에서, 항-HER2 항체는 본원에 개시된 방법에 사용된다. 특정 구현예에서, 항-HER2 항체는 Genentech 및 Roche에 의해 개발된 트라스투주맙, Genentech 및 Roche에 의해 개발된 트라스투주맙 엠탄신, Genentech에 의해 개발된 퍼투주맙, Fresenius에 의해 개발된 에르투막소맙(ertumaxomab), MacroGenics에 의해 개발된 마르게툭시맙(margetuximab), Merrimack에 의해 개발된 MM-111, Celltrion에 의해 개발된 CT-P06, Pfizer에 의해 개발된 PF-05280014, Merrimack에 의해 개발된 MM-302, Merck & Co에 의해 개발된 SB3, Shanghai CP Guojian에 의해 개발된 CMAB302, Glycotope에 의해 개발된 TrasGEX, Ambrx와 Zhejiang Medicine에 의해 개발된 ARX788, Synthon에 의해 개발된 SYD985, Bristol-Myers Squibb 및 f-star에 의해 개발된 FS102, Biocad에 의해 개발된 BCD-022, Amgen에 의해 개발된 ABP 980, Daiichi Sankyo에 의해 개발된 DS-8201a, Shanghai Henlius에 의해 개발된 HLX02, 또는 Biocon과 Mylan에 의해 개발된 CANMAb이다.
본원에 기술된 항체 또는 약학적 조성물은 다양한 경로에 의해 대상에게 전달될 수 있다. 이들은 비경구, 비강내, 뇌척수강내, 경구, 피내, 국소, 근육내, 복강내, 경피, 정맥내, 종양내, 결막 및 피하 경로를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 폐 투여는 또한, 예를 들어 흡입기 또는 네뷸라이저의 사용, 및 스프레이로서 사용하기 위한 에어로졸화제와의 배합에 의해 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 항체 또는 약학적 조성물은 피하 또는 정맥내로 전달된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 항체 또는 약학적 조성물은 종양내로 전달된다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 항-CTLA-4 항체 또는 약학적 조성물은 종양 드레이닝 림프절로 전달된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 항체 또는 약학적 조성물은 국소 투여(예를 들어, 피하 투여)를 통해 전달된다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 항-CTLA-4 항체 또는 약학적 조성물은 전신 전달된다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 항-CTLA-4 항체 또는 약학적 조성물은 국소 전달된다.
일 양태에서, 본 발명은 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 본 발명의 항-CTLA-4 항체 및/또는 약학적 조성물, 및 선택적으로 추가의 치료제에 관한 것이며, 상기 본 발명의 항-CTLA-4 항체 및/또는 약학적 조성물은 대상에게 종양내로 전달되거나, 대상의 종양 드레이닝 림프절로 전달되거나, 국소 투여(예를 들어, 피하 투여)를 통해 대상에게 전달된다.
질환의 치료 및/또는 예방에 효과적일 항체 또는 조성물의 양은 질병의 성질에 의존할 것이며, 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다.
조성물에 사용되는 정확한 투여량은 또한 투여 경로, 및 이로 인한 감염 또는 질병의 심각성에 따라 다를 것이며, 실무자의 판단 및 각 대상의 상황에 따라 결정되어야한다. 예를 들어, 유효한 투여량은 또한 투여 방법, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태(연령, 체중 및 건강 포함), 환자가 사람인지 동물인지의 여부, 투여된 다른 약제, 또는 치료가 예방적인지 또는 치료적인지의 여부에 따라 다양할 수 있다. 일반적으로, 환자는 인간이지만 트랜스제닉 포유동물을 포함한 비-인간 포유동물도 치료될 수 있다. 치료 투여량은 안전성과 효능을 최적화하기 위해 최적으로 적정된다.
특정 구현예에서, 본원에 기술된 항-CTLA-4 항체 또는 약학적 조성물은 0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 6 mg/kg, 10 mg/kg, 약 0.1 mg/kg, 약 0.3 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 6 mg/kg 또는 약 10 mg/kg의 투여량으로(예를 들어, 정맥내 주사를 통해) 대상에게 투여된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 항-CTLA-4 항체 또는 약학적 조성물은 상기 기술된 투여량으로, 3주마다 (예를 들어, 정맥내 주사를 통해) 대상에게 투여된다.
일 양태에서, 본 발명은 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 본 발명의 항-CTLA-4 항체 및/또는 약학적 조성물, 및 선택적으로 추가의 치료제에 관한 것이며, 상기 본 발명의 항-CTLA-4 항체 및/또는 약학적 조성물은 0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 6 mg/kg, 10 mg/kg, 약 0.1 mg/kg, 약 0.3 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 6 mg/kg 또는 약 10 mg/kg의 양으로, 보다 바람직하게 3주마다 대상에게 투여된다.
특정 구현예에서, 본원에 기술된 항-CTLA-4 항체 또는 약학적 조성물은 3주마다 0.1 mg/kg 또는 약 0.1 mg/kg으로 대상에게 (예를 들어, 정맥내 주사를 통해) 투여된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 항-CTLA-4 항체 또는 약학적 조성물은 3주마다 0.3 mg/kg 또는 약 0.3 mg/kg으로 대상에게 (예를 들어, 정맥내 주사를 통해) 투여된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 항-CTLA-4 항체 또는 약학적 조성물은 3주마다 1 mg/kg 또는 약 1 mg/kg으로 대상에게 (예를 들어, 정맥내 주사를 통해) 투여된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 항-CTLA-4 항체 또는 약학적 조성물은 3주마다 3 ㎎/㎏ 또는 약 3 ㎎/㎏으로 대상에게 (예를 들어, 정맥내 주사를 통해) 투여된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 항-CTLA-4 항체 또는 약학적 조성물은 3주마다 6 ㎎/㎏ 또는 약 6 ㎎/㎏으로 대상에게 (예를 들어, 정맥내 주사를 통해) 투여된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 항-CTLA-4 항체 또는 약학적 조성물은 3주마다 10 mg/kg 또는 약 10 mg/kg으로 대상에게 (예를 들어, 정맥내 주사를 통해) 투여된다.
특정 구현예에서, 본원에 기술된 항-CTLA-4 항체 또는 약학적 조성물은 0.01 mg/kg, 0.03 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 약 0.01 mg/kg, 약 0.03 mg/kg, 약 0.1 mg/kg, 약 0.3 mg/kg, 약 1 mg/kg 또는 약 3 mg/kg의 종양내 주사를 통해 대상에게 투여된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 항-CTLA-4 항체 또는 약학적 조성물은 상기 투여량으로 3주마다 종양내 주사를 통해 대상에게 투여된다.
특정 구현예에서, 본원에 기술된 항-CTLA-4 항체 또는 약학적 조성물은 3주마다 0.01 mg/kg 또는 약 0.01 mg/kg의 종양내 주사를 통해 대상에게 투여된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 항-CTLA-4 항체 또는 약학적 조성물은 3주마다 0.03 mg/kg 또는 약 0.03 mg/kg의 종양내 주사를 통해 대상에게 투여된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 항-CTLA-4 항체 또는 약학적 조성물은 3주마다 0.1 mg/kg 또는 약 0.1 mg/kg의 종양내 주사를 통해 대상에게 투여된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 항-CTLA-4 항체 또는 약학적 조성물은 3주마다 0.3 mg/kg 또는 약 0.3 mg/kg의 종양내 주사를 통해 대상에게 투여된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 항-CTLA-4 항체 또는 약학적 조성물은 3주마다 1 mg/kg 또는 약 1 mg/kg의 종양내 주사를 통해 대상에게 투여된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 항-CTLA-4 항체 또는 약학적 조성물은 3주마다 3 mg/kg 또는 약 3 mg/kg의 종양내 주사를 통해 대상에게 투여된다.
특정 구현예에서, 본원에 기술된 항-CTLA-4 항체 또는 약학적 조성물은 0.01 mg/kg, 0.03 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 약 0.01 mg/kg, 약 0.03 mg/kg, 약 0.1 mg/kg, 약 0.3 mg/kg, 약 1 mg/kg 또는 약 3 mg/kg의 국소 투여(예를 들어, 피하 투여)를 통해 대상에게 투여된다.
본원에 기술된 항-CTLA-4 항체는 또한 면역분석법, 예컨대 효소결합 면역흡착측정법(ELISA), 면역 침전 또는 웨스턴 블롯팅을 포함하는, 당업자에게 공지된 전형적인 면역조직학적 방법을 사용하여 생물학적 샘플에서 CTLA-4 단백질 수준을 분석하는데 사용될 수 있다. 적합한 항체 분석 라벨은 당 분야에 공지되어 있으며, 글루코스 옥시다아제와 같은 효소 표지; 요오드(125I, 121I), 탄소(14C), 황(35S), 삼중 수소(3H), 인듐(121In) 및 테크네튬(99Tc)과 같은 방사성 동위원소; 발광 라벨, 예컨대 루미놀; 및 플루오레세인 및 로다민과 같은 형광 라벨 및 비오틴을 포함한다. 상기 표지는 본원에 기술된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 표지하는데 사용될 수 있다. 대안으로, 본원에 기술된 항-CTLA-4 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 인식하는 제2 항체를 표지하고, CTLA-4 단백질 수준을 검출하기 위해 항-CTLA-4 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 조합하여 사용할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명은 생체외 생물학적 샘플내 CTLA-4 단백질 수준을 분석 및/또는 검출하기 위한, 본 발명의 항-CTLA-4 항체의 용도에 관한 것이다.
CTLA-4 단백질의 발현 수준에 대한 분석은 제1 생물학적 샘플내 CTLA-4 단백질의 수준을 직접적으로(예를 들어, 절대 단백질 수준을 측정 또는 추정함으로써) 또는 상대적으로(예를 들어, 제2 생물학적 샘플내 질병 관련 단백질 수준과 비교함으로써), 질적으로 또는 정량적으로 측정 또는 추정하는 것을 포함한다. 제1 생물학적 샘플내 CTLA-4 폴리펩타이드 발현 수준을 측정하거나 추정하여, 표준 CTLA-4 단백질 수준과 비교할 수 있으며, 이 표준은 장애를 가지지 않은 개체로부터 수득된 제2 생물학적 샘플로부터 취해진 것이거나, 또는 장애를 가지지 않은 개체군으로부터 수준을 평균화함으로써 측정된 것이다. 당해 기술 분야에서 이해되는 바와 같이, 일단 "표준" CTLA-4 폴리펩타이드 수준이 알려지면, 비교를 위한 표준으로서 반복적으로 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "생물학적 샘플"은 대상, 세포주, 조직 또는 CTLA-4를 잠재적으로 발현하는 세포의 다른 공급원으로부터 수득된 임의의 생물학적 샘플을 지칭한다. 동물(예를 들어, 인간)로부터 조직 생검 및 체액을 얻는 방법은 당 분야에 잘 알려져있다. 생물학적 샘플에는 말초 단핵 혈액 세포가 포함된다.
본원에 기술된 항-CTLA-4 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 당업자에게 공지되고, 표준이고, 본 기술에 기초한 시험관내 및 생체내 적용을 포함하는, 예후, 진단, 모니터링 및 스크리닝 용도에 사용될 수 있다. 면역계 상태 및/또는 면역 반응의 시험관내 평가 및 감정을 위한 예후, 진단, 모니터링 및 스크리닝 검사 및 키트를 사용하여 면역계-이상을 가지고 있거나 가질 것으로 의심되는 환자를 포함하여, 또는 예상되는 또는 원하는 면역계 반응, 항원 반응 또는 백신 반응과 관련하여, 환자 샘플을 평가하기 위해 예측, 진단 및 모니터링할 수 있다. 면역계 상태 및/또는 면역 반응의 평가 및 감정은 또한 상이한 약제 또는 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 대한, 약물의 임상 시험을 위한, 또는 특정 화학요법제 또는 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 그의 조합의 투여를 위한 환자의 적합성을 결정하는데 유용하다. 이 유형의 예후 및 진단 모니터링 및 평가는 유방암의 HER2 단백질에 대한 항체를 활용하여 실제로 실시되고 있으며(HercepTestTM, Dako), 이 분석법은 Herceptin®을 사용하는 항체 치료에 대한 환자 평가에 사용된다. 생체내 적용에는 직접 세포 치료 및 면역계 조절 및 면역 반응의 무선 영상이 포함된다.
일 양태에서, 본 발명은 진단용으로 사용하기 위한, 본 발명의 항-CTLA-4 항체 및/또는 약학적 조성물에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 면역계-기능장애 및/또는 암의 예측, 진단 및/또는 모니터링 방법에 사용하기 위한 본 발명의 항-CTLA-4 항체 및/또는 약학적 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 시험관내 대상의 생물학적 샘플내 CTLA-4 단백질 수준을 검정 및/또는 검출하여 대상의 면역계-기능이상 및/또는 암을 예측, 진단 및/또는 모니터링하기 위한, 본 발명의 항-CTLA-4 항체의 용도에 관한 것이다.
일 구현예에서, 항-CTLA-4 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 생검 샘플의 면역조직화학에 사용될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 항-CTLA-4 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CTLA-4의 수준, 또는 그의 막 표면 상에 CTLA-4를 함유하는 세포의 수준을 검출하는데 사용될 수 있으며, 상기 수준은 특정 질병 증상과 연관될 수 있다. 본원에 기술된 항-CTLA-4 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 검출가능한 또는 기능적 표지를 지닐 수 있다. 형광 라벨이 사용되는 경우, 현재 이용가능한 현미경 및 형광-활성화 세포 분류기 분석(FACS) 또는 당 분야에 공지된 두 방법의 조합이 특정 결합 구성원을 동정하고, 정량화하는데 이용될 수 있다. 본원에 기술된 항-CTLA-4 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 형광 표지를 지닐 수 있다. 예시적인 형광 표지는 예를 들어 반응성 및 접합된 프로브, 예를 들어 아미노쿠마린(Aminoocoumarin), 플루오레세인 및 텍사스 레드, Alexa Fluor 염료, Cy 염료 및 DyLight 염료를 포함한다. 항-CTLA-4 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 동위 원소 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 67Cu, 90Y, 99Tc, 111In, 117Lu, 121I, 124I, 125I, 131I, 198Au, 211At, 213Bi, 225Ac 및 186Re와 같은 방사성 표지를 지닐 수 있다. 방사성 표지가 사용되는 경우, 당 분야에 공지된 현재 이용가능한 카운팅 절차를 이용하여 CTLA-4(예를 들어, 인간 CTLA-4)에 대한 항-CTLA-4 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 특이적 결합을 확인하고, 정량화할 수 있다. 표지가 효소인 경우에, 당 분야에 공지되어 있는 바와 같이, 현재 이용되는 비색 분석, 분광광도법, 형광분광광도법, 전류측정법 또는 가스측정법 중 어느 하나에 의해 검출을 수행할 수 있다. 이는 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 CTLA-4 사이에 복합체를 형성할 수 있는 조건 하에 샘플 또는 대조군 샘플을 항-CTLA-4 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 접촉시킴으로써 달성될 수 있다. 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 CTLA-4 사이에 형성된 임의의 복합체가 검출되고, 샘플 및 대조군에서 비교된다. CTLA-4에 대해 본원에 기술된 항체의 특이적 결합을 고려하여, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 세포 표면상의 CTLA-4 발현을 특이적으로 검출하는데 사용될 수 있다. 본원에 기술된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 또한 면역친화성 정제를 통해 CTLA-4를 정제하는데 사용될 수 있다. 또한, 예를 들어, CTLA-4 또는 CTLA-4/CTLA-4 리간드 복합체의 존재 범위를 정량적으로 분석하기 위한 시험 키트의 형태로 제조될 수 있는 분석 시스템이 본원에 포함된다. 상기 시스템 또는 시험 키트는 표지된 성분, 예를 들어 표지된 항체 및 하나 이상의 추가의 면역화학 시약을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 (1) 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 CTLA-4 사이의 복합체를 형성시키는 조건하에, 샘플 및 임의로 대조군 샘플을 항-CTLA-4 항체 및 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계, 및 (2) 샘플 및 임의로 대조군내에서 형성된 복합체를 검출 및 비교하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플내 CTLA-4 단백질 수준을 분석 및/또는 검출하기 위한 시험관내 방법에 관한 것이다.
5.5 항-CTLA-4 항체 생성을 위한 폴리뉴클레오타이드, 벡터 및 방법
또 다른 양태에서, CTLA-4(예를 들어, 인간 CTLA-4) 항원에 특이적으로 결합하는 본원에 기술된 항체 또는 그의 단편(예를 들어, 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 벡터, 예를 들어 숙주 세포(예를 들어, 대장균 및 포유동물 세포)에서 재조합 발현을 위한 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 본원에 제공된 임의의 항체를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 뿐만 아니라 상기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터, 예를 들어, 숙주 세포, 예를 들어, 포유동물 세포에서 그의 효과적인 발현을 위한 발현 벡터를 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다.
본원에서 사용된 "분리된" 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산 분자는 핵산 분자의 천연 공급원(예를 들어, 마우스 또는 인간)에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 분리된 것이다. 또한, cDNA 분자와 같은 "분리된" 핵산 분자는 재조합 기술에 의해 제조될 때 다른 세포 물질 또는 배양 배지가 실질적으로 없거나 또는 화학적으로 합성될 때 화학 전구물질 또는 다른 화학물질이 실질적으로 존재할 수 없다. 예를 들어, "실질적으로 없다"라는 용어는 약 15%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0.5% 또는 0.1% 미만(특히 약 10% 미만)의 다른 물질, 예를 들어 세포 물질, 배양 배지, 다른 핵산 분자, 화학 전구물질 및/또는 다른 화학물질을 갖는 핵산분자 또는 폴리뉴클레오타이드의 제조예를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 항체를 코딩하는 핵산 분자(들)은 분리되거나 정제된다.
특정 양태에서, CTLA-4 폴리펩타이드(예를 들어, 인간 CTLA-4)에 특이적으로 결합하고, 본원에 기술된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편 뿐만 아니라, CTLA-4 폴리펩타이드에 대한 결합에 대해 상기 항체와(예를 들어, 투여량-의존 방식으로) 경쟁하거나, 상기 항체의 것과 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다.
특정 양태에서, 본원에 기술된 항체의 경쇄 또는 중쇄를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 본원에 제공된다. 폴리뉴클레오타이드는 본원에 기술된 항체의 VL FR 및 CDR을 포함하는 경쇄를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다(예를 들어, 표 1 참조).
또한, 예를 들어, 코돈/RNA 최적화, 이종 신호 서열로의 대체 및 mRNA 불안정성 요소의 제거에 의해 최적화된 항-CTLA-4 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 본원에 제공된다. 코돈 변화를 도입하고, 및/또는 mRNA내 억제 영역을 제거함으로써, 재조합 발현을 위한 항-CTLA-4 항체 또는 그의 단편(예를 들어, 경쇄, 중쇄, VH 도메인 또는 VL 도메인)을 코딩하는 최적화된 핵산을 생성시키는 방법은 따라서 예를 들어, 미국특허 제5,965,726호; 제6,174,666호; 제6,291,664호; 제6,414,132호; 및 제6,794,498호에 기술된 최적화 방법을 적용함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, RNA 내의 잠재적 스플라이스 부위 및 불안정성 요소(예를 들어, A/T 또는 A/U 풍부한 요소)는 재조합 발현을 위한 RNA의 안정성을 증가시키기 위해 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산을 변경하지 않고 변이될 수 있다. 상기 변경은 예를 들어, 동일한 아미노산에 대한 대체 코돈을 사용하여 유전자 암호의 중축(degeneracy)을 이용한다. 일부 구현예에서, 보존적 돌연변이, 예를 들어, 원래의 아미노산과 유사한 화학적 구조 및 성질 및/또는 기능을 갖는 유사한 아미노산을 코딩하는 하나 이상의 코돈을 변경시키는 것이 바람직할 수 있다. 상기 방법은 항-CTLA-4 항체 또는 그의 단편의 발현을 최적화되지 않은 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 항-CTLA-4 항체의 발현에 비하여 적어도 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배 또는 100배 이상 증가시킬 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에 기술된 항-CTLA-4 항체 또는 그의 단편(예를 들어, VL 도메인 및/또는 VH 도메인)을 코딩하는 최적화된 폴리뉴클레오타이드 서열은 본원에 기술된 항-CTLA-4 항체 또는 그의 단편(예를 들어, VL 도메인 및/또는 VH 도메인)을 코딩하는 최적화되지 않은 폴리펩타이드 서열의 안티센스 (예를 들어, 상보적인) 폴리뉴클레오타이드로 혼성화될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 항-CTLA-4 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 고 엄격 조건 하에서 본원에 기술된 항-CTLA-4 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 최적화되지 않은 폴리뉴클레오타이드 서열의 안티센스 폴리뉴클레오타이드로 혼성화한다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 항-CTLA-4 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 고 엄격, 중간 또는 저 염격 혼성화 조건 하에서, 본원에 기술된 항-CTLA-4 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 최적화되지않은 뉴클레오타이드 서열의 안티센스 폴리뉴클레오타이드로 혼성화한다. 혼성화 조건에 관한 정보는, 예를 들어, 본원에 참고로 인용된 미국 특허출원 공보 US 2005/0048549호(예를 들어, 단락 72-73)에 기술되어, 이를 참조한다.
당 분야에 공지된 임의의 방법에 의해, 폴리뉴클레오타이드를 수득하고, 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정할 수 있다. 본원에 기술된 항체를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어 표 1에 기술된 항체 및 상기 항체의 변형된 버전은 당 분야에 공지된 방법을 사용하여 결정될 수 있으며, 즉, 특정 아미노산을 코딩하는 것으로 알려진 뉴클레오타이드 코돈은 상기 방법으로 조립되어, 항체를 코딩하는 핵산을 생성한다. 항체를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오타이드는 간략하게는 항체를 코딩하는 서열의 부분을 함유하는 중첩 올리고뉴클레오타이드의 합성단계, 상기 올리고 뉴클레오타이드의 어닐링 및 결찰 단계, 및 PCR에 의한 결찰된 올리고뉴클레오타이드의 증폭 단계를 포함하는, (예를 들어, Kutmeier G 등 (1994), BioTechniques 17: 242-6에 기술된 바와 같이) 화학적으로 합성된 올리고 뉴클레오타이드로부터 조립될 수 있다.
대안으로, 본원에 기술된 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 당 분야에 잘 공지된 방법(예를 들어, PCR 및 다른 분자 클로닝 방법)을 사용하여 적합한 공급원(예를 들어, 하이브리도마)으로부터의 핵산으로부터 생성될 수 있다. 예를 들어, 공지된 서열의 3' 및 5' 말단에 혼성화가능한 합성 프라이머를 사용하는 PCR 증폭은 관심 항체를 생산하는 하이브리도마 세포로부터 수득된 게놈 DNA를 사용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 증폭 방법은 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 수득하는데 사용될 수 있다. 상기 PCR 증폭 방법은 항체의 가변 경쇄 영역 및/또는 가변 중쇄 영역을 코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 수득하는데 사용될 수 있다. 증폭된 핵산은 숙주 세포내 발현 및 추가 클로닝, 예를 들어, 키메라 및 인간화 항체를 생성하기 위해 벡터내로 클로닝될 수 있다.
특정 항체를 코딩하는 핵산을 함유하는 클론이 이용가능하지 않지만 항체 분자의 서열이 공지된 경우, 면역글로불린을 코딩하는 핵산은 서열의 3' 및 5' 말단으로 혼성화가능한 합성 프라이머를 사용한 PCR 증폭에 의해, 또는 특정 유전자 서열에 특이적인 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용하여 클로닝함으로써, 적당한 공급원(예를 들어, 본원에 기술된 항체를 발현하도록 선택된 하이브리도마 세포와 같은, 항체를 발현하는 임의의 조직 또는 세포로부터 분리된 핵산, 바람직하게는 폴리 A+ RNA로부터 생성된 cDNA 라이브러리 또는 항체 cDNA 라이브러리)으로부터 화학적으로 합성되거나 얻어져서, 예를 들어 항체를 코딩하는 cDNA 라이브러리로부터 cDNA 클론을 동정할 수 있다. 이어서, PCR에 의해 생성된 증폭된 핵산은 당 분야에 잘 알려진 임의의 방법을 사용하여 복제가능한 클로닝 벡터내로 클로닝될 수 있다.
본원에 기술된 항-CTLA-4 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 사용함으로써(예를 들어, 항-CTLA-4 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함으로써), 용이하게 분리 및 시퀀싱될 수 있다. 하이브리도마 세포는 상기 DNA의 공급원 역할을 할 수 있다. 일단 분리된 경우, DNA는 발현 벡터에 위치될 수 있으며, 대장균(E. coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포(예를 들어, CHO GS System™(Lonza)제 CHO 세포), 또는 그렇지 않으면 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 골수종 세포와 같은 숙주 세포로 형질감염되어, 재조합 숙주 세포에서 항-CTLA-4 항체의 합성을 얻는다.
전체 항체를 생성하기 위해, VH 또는 VL 뉴클레오타이드 서열, 제한 부위 및, 제한 부위를 보호하기 위한 플랭킹 서열을 포함하는 PCR 프라이머를 사용하여 scFv 클론에서 VH 또는 VL 서열을 증폭시킬 수 있다. 당업자에게 공지된 클로닝 기술을 이용하여, PCR 증폭 VH 도메인을 중쇄 불변 영역, 예를 들어, 인간 감마 4 불변 영역을 발현하는 벡터로 클로닝될 수 있고, PCR 증폭된 VL 도메인을 경쇄 불변 영역, 예를 들어 인간 카파 또는 람다 불변 영역을 발현하는 벡터내로 클로닝할 수 있다. 특정 구현예에서, VH 또는 VL 도메인을 발현하기 위한 벡터는 EF-1α 프로모터, 분비 신호, 가변 영역을 위한 클로닝 부위, 불변 도메인 및 네오마이신과 같은 선택 마커를 포함한다. VH 및 VL 도메인은 또한 필수 불변 영역을 발현하는 하나의 벡터내로 클로닝될 수 있다. 이어서, 중쇄 전환 벡터 및 경쇄 전환 벡터는 세포주내로 공동-형질감염시켜, 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 IgG와 같은 전장 항체를 발현하는 안정한 또는 일시적인 세포주를 생성시킨다.
DNA는 또한, 예를 들어, 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 치환함으로써, 또는 면역글로불린 코딩 서열에 비-면역글로불린 폴리펩타이드에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부를 공유 결합시킴으로써 변형될 수 있다.
고 엄격성, 중간 또는 저 엄격성 혼성화 조건 하에서 본원에 기술된 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드로 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드도 제공된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 폴리뉴클레오타이드는 고 엄격성, 중간 또는 저 엄격성 혼성화 조건 하에서 본 명세서에 제공된 VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드로 혼성화한다.
혼성화 조건은 당 분야에 기술되어 있고, 당업자에게 공지되어있다. 예를 들어, 엄격한 조건에서의 혼성화는 약 45℃에서 6× 염화나트륨/시트르산나트륨(SSC)에서 필터-결합된 DNA로 혼성화한 후, 약 50-65℃에서 0.2×SSC/0.1% SDS에서 1회 이상 세척하는 단계를 포함할 수 있으며; 매우 엄격한 조건 하에서의 혼성화는 약 45℃에서 6×SSC 내의 필터-결합된 핵산으로 혼성화한 후, 약 68℃에서의 0.1×SSC/0.2% SDS에서 1회 이상 세척하는 단계를 포함할 수 있다. 다른 엄격한 혼성화 조건 하에서의 혼성화는 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어, Ausubel FM et al., eds., (1989) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., New York at pages 6.3.1-6.3.6 and 2.10.3에 기술되어 있으며, 이를 참조한다.
특정 양태에서, CTLA-4(예를 들어, 인간 CTLA-4)에 특이적으로 결합하는 본원에 기술된 항체(또는 그의 항원-결합 단편)를 (예를 들어, 재조합으로) 발현하는 세포(예를 들어, 숙주 세포) 및 관련된 폴리뉴클레오타이드 및 발현 벡터가 제공된다. 항-CTLA-4 항체, 숙주 세포, 바람직하게는 포유동물 세포에서의 재조합 발현을 위한 단편을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터(예를 들어, 발현 벡터)가 본원에 제공된다. 또한, 본원에 기술된 항-CTLA-4 항체를 재조합적으로 발현시키는 벡터(예를 들어, 인간 또는 인간화 항체)를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 특정 양태에서, 숙주 세포로부터 상기 항체를 발현시키는 단계를 포함하는, 본원에 기술된 항체를 생산하는 방법이 제공된다.
CTLA-4(예를 들어, 인간 CTLA-4)에 특이적으로 결합하는 본원에 기술된 항체(예를 들어, 전장 항체, 항체의 중쇄 및/또는 경쇄, 또는 본원에 기술된 단일 쇄 항체)의 재조합 발현은 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 발현 벡터의 제작을 수반한다. 일단 본원에 기술된 항체 분자, 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 또는 그의 단편(예를 들어, 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 수득되면, 항체 분자 생산용 벡터는 당 분야에 공지된 기술을 사용하여 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다. 따라서, 뉴클레오타이드 서열을 코딩하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 경쇄 또는 중쇄)을 함유하는 폴리뉴클레오타이드를 발현함으로써 단백질을 제조하는 방법이 본원에 기술되어있다. 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 경쇄 또는 중쇄) 코딩 서열 및 적절한 전사 및 번역 제어 신호를 함유하는 발현 벡터를 제조할 수 있다. 상기 방법은 예를 들어, 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체내 유전자 재조합을 포함한다. 또한, 프로모터에 조작가능하게 연결되는, 본원에 기술된 항체 분자, 항체의 중쇄 또는 경쇄, 항체 또는 그의 단편의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 또는 중쇄 또는 경쇄 CDR을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 복제가능한 벡터가 제공된다. 상기 벡터는 예를 들어, 항체 분자의 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있으며(예를 들어, 국제 공개번호 WO 86/05807 및 WO 89/01036; 및 미국특허 제5,122,464호 참조), 및 항체의 가변 영역은 전체 중쇄, 전체 경쇄 또는 전체 중쇄와 경쇄 모두의 발현을 위해 상기 벡터내로 클로닝될 수 있다.
발현 벡터는 통상적인 기술에 의해 세포(예를 들어, 숙주 세포)에 전달될 수 있으며, 이어서 생성된 세포는 통상적인 기술에 의해 배양되어 본원에 기술된 항체 또는 그의 단편을 생성할 수 있다. 따라서, 숙주 세포내 상기 서열의 발현을 위한 프로모터에 조작가능하게 연결되는, 본원에 기술된 항체 또는 그의 단편, 또는 그의 중쇄 또는 경쇄, 또는 그의 단편, 또는 본원에 기술된 단일 쇄 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 숙주 세포가 본원에 제공된다. 특정 구현예에서, 이중-쇄 항체의 발현을 위해, 중쇄 및 경쇄 모두를 코딩하는 벡터는 개별적으로, 이하에서 설명하는 바와 같이 전체 면역글로불린 분자의 발현을 위해 숙주 세포에서 공동-발현될 수 있다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 본원에 기술된 항체의 중쇄 및 경쇄 또는 그의 단편 모두를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 함유한다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 두개의 상이한 벡터, 본원에 기술된 항체의 중쇄 또는 중쇄 가변 영역 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제1 벡터, 및 본원에 기술된 항체의 경쇄 또는 경쇄 가변 영역 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제2 벡터를 함유한다. 다른 구현예에서, 제1 숙주 세포는 본원에 기술된 항체의 중쇄 또는 중쇄 가변 영역, 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제1 벡터를 포함하고, 제2 숙주 세포는 본원에 기술된 항체의 경쇄 또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제2 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 세포에 의해 발현되는 중쇄/중쇄 가변 영역은 본원에 기술된 항-CTLA-4 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 형성하기 위해 제2 세포의 경쇄/경쇄 가변 영역과 연합된다. 특정 구현예에서, 상기 제1 숙주 세포 및 상기 제2 숙주 세포를 포함하는 숙주 세포의 개체군이 본원에 제공된다.
특정 구현예에서, 본원에 기술된 항-CTLA-4 항체의 경쇄/경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제1 벡터, 및 본원에 기술된 항-CTLA-4 항체의 중쇄/중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제2 벡터를 포함하는 벡터 개체군이 본원에 제공된다.
본원에 기술된 항체 분자를 발현시키기 위해 다양한 숙주-발현 벡터 시스템을 이용할 수 있다(예를 들어, 미국특허 제5,807,715호 참조). 상기 숙주-발현 시스템은 관심있는 코딩 서열이 생성되고, 순차적으로 정제될 수 있는 비히클을 나타내지만, 적당한 뉴클레오타이드 코딩 서열로 형질전환되거나 형질감염될 때 본래의 위치에서 본원에 기술된 항체 분자를 발현할 수 있는 세포를 나타낸다. 이들은 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아(예컨대, 대장균 및 바실루스 서브틸리스(B.subtilis))와 같은 미생물; 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모(예컨대, 사카로마이세스 피치아(Saccharomyces Pichia)); 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예컨대, 바큘로바이러스)에 의해 감염된 곤충 세포 시스템; 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 감염되거나, 또는 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템(예를 들어, 클라미도모나스 레인하르드티이(Chlamydomonas reinhardtii)와 같은 녹조류); 또는 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)를 함유하는 재조합 발현 구조물을 보유하는 포유동물 세포 시스템(예를 들어, COS(예를 들어, COS1 또는 COS), CHO, BHK, MDCK, HEK 293, NS0, PER.C6, VERO, CRL7O3O, HsS78Bst, HeLa 및 NIH 3T3, HEK-293T, HepG2, SP210, R1.1, B-W, L-M, BSC1, BSC40, YB/20 및 BMT10 세포)과 같은 포유동물 세포 시스템을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 발현시키기 위한 세포는 CHO 세포, 예를 들어 CHO GS System™(Lonza)의 CHO 세포이다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 항체를 발현하기 위한 세포는 인간 세포, 예를 들어 인간 세포주이다. 특정 구현예에서, 포유동물 발현 벡터는 pOptiVEC™ 또는 pcDNA3.3이다. 특정 구현예에서, 특히 전체 재조합 항체 분자의 발현을 위한 대장균(Escherichia coli) 또는 진핵 세포(예를 들어, 포유동물 세포)와 같은 박테리아 세포가 재조합 항체 분자의 발현에 사용된다. 예를 들어, 인간 사이토메갈로바이러스로부터의 주요 중간 조기 유전자 프로모터 요소와 같은 벡터와 함께, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포와 같은 포유동물 세포는 항체에 대한 효과적인 발현 시스템이다(Foecking MK & Hofstetter H (1986) Gene 45: 101-5; and Cockett MI et al., (1990) Biotechnology 8(7): 662-7). 특정 구현예에서, 본원에 기술된 항체는 CHO 세포 또는 NS0 세포에 의해 생성된다. 특정 구현예에서, CTLA-4(예를 들어, 인간 CTLA-4)에 특이적으로 결합하는 본원에 기술된 항체를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 발현은 구성적 프로모터, 유도성 프로모터 또는 조직 특이적 프로모터에 의해 조절된다.
박테리아 시스템에서, 다수의 발현 벡터는 발현되는 항체 분자를 위한 용도에 따라 유리하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 항체 분자의 약학적 조성물의 생성을 위해 다량의 상기 항체가 생성되는 경우, 용이하게 정제되는 고수준의 융합 단백질 생성물의 발현을 지시하는 벡터가 바람직할 수 있다. 상기 벡터는 융합 단백질이 생성되도록 lac Z 코딩 영역과 프레임 내에서 항체 코딩 서열이 벡터에 개별적으로 결찰될 수 있는 대장균 발현 벡터 pUR278(Ruether U & Mueller-Hill B(1983) EMBO J 2: 1791-1794); pIN 벡터(Inouye S & Inouye M(1985) Nuc Acids Res 13: 3101-3109, Van Heeke G & Schuster SM(1989) J Biol Chem 24: 5503-5509); 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, pGEX 벡터는 글루타티온 5-트랜스퍼라제(GST)와의 융합 단백질로서 외래 폴리펩타이드를 발현하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 상기 융합 단백질은 가용성이며, 유리 글루타티온의 존재 하에 매트릭스 글루타티온 아가로스 비드에 흡착 및 결합됨으로써, 용해된 세포로부터 용이하게 정제될 수 있다. pGEX 벡터는 트롬빈 또는 인자 Xa 프로테아제 절단 부위를 포함하도록 설계되어, 복제된 표적 유전자 산물이 GST 모이어티로부터 유리될 수 있다.
곤충 시스템에서, 예를 들어, 오토그라파 캘리포니카(Autographa californica) 핵 다각체병 바이러스(AcNPV)가 외래 유전자를 발현하는 벡터로서 사용될 수 있다. 이 바이러스는 스포돕테라 프루지페르다(Spodoptera frugiperda) 세포에서 성장한다. 항체 코딩 서열은 바이러스의 비-필수 영역(예를 들어, 폴리헤드린 유전자)에 개별적으로 클로닝되고, AcNPV 프로모터(예를 들어, 폴리헤드린 프로모터)의 제어하에 놓일 수 있다.
포유동물 숙주 세포에서, 다수의 바이러스계 발현 시스템이 사용될 수 있다. 아데노바이러스가 발현 벡터로 사용되는 경우, 관심있는 항체 코딩 서열이 아데노바이러스 전사/번역 제어 복합체, 예를 들어, 후기 프로모터 및 삼부 리더 서열에 결찰될 수 있다. 이 키메라 유전자는 시험관내 또는 생체내 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈에 삽입될 수 있다. 바이러스 게놈의 비-필수 영역(예를 들어, E1 또는 E3 영역)에 삽입하면 감염된 숙주에서 생존가능하고, 항체 분자를 발현할 수 있는 재조합 바이러스가 생성될 것이다(예를 들어, Logan J & Shenk T (1984) PNAS 81(12): 3655-9 참조). 삽입된 항체 코딩 서열의 효율적인 번역을 위해 특정 개시 신호도 요구될 수 있다. 상기 신호는 ATG 개시 코돈 및 인접한 서열을 포함한다. 또한, 개시 코돈은 전체 삽입물의 번역을 보장하기 위해 원하는 코딩 서열의 리딩 프레임과 같은 위상에 있어야 한다. 상기 외인성 번역 제어 신호 및 개시 코돈은 천연 및 합성의 다양한 기원일 수 있다. 발현 효율은 적절한 전사 인핸서 요소, 전사 종결인자 등을 포함시킴으로써 향상될 수 있다.(예를 들어, Bitter G et al., (1987) Methods Enzymol. 153: 516-544 참조).
또한, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나, 원하는 특정 방식으로 유전자 산물을 변형 및 가공하는 숙주 세포 균주가 선택될 수 있다. 단백질 생성물의 상기 변형(예를 들어, 글리코실화) 및 가공(예를 들어, 절단)은 단백질의 기능에 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질 및 유전자 산물의 번역 후 가공 및 변형을 위한 특성 및 특이적 메카니즘을 갖는다. 발현된 외래 단백질의 정확한 변형 및 가공을 보장하기 위해 적절한 세포주 또는 숙주 시스템이 선택될 수 있다. 이를 위해서 유전자 산물의 1차 전사, 글리코실화 및 인산화를 적당하게 처리하기 위한 세포 기구를 보유한 진핵생물 숙주 세포가 사용될 수 있다. 상기 포유동물 숙주 세포는 CHO, VERO, BHK, Hela, MDCK, HEK293, NIH 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O 및 T47D, NS0(임의의 면역글로불린쇄를 내생적으로 생성하지 않는 뮤린 골수종 세포주), CRL7O3O, COS(예를 들어, COS1 또는 COS), PER.C6, VERO, HsS78Bst, HEK-293T, HepG2, SP210, R1.1, B-W, L-M, BSC1, BSC40, YB/20, BMT10 및 HsS78Bst-세포를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 항-CTLA-4 항체는 CHO 세포와 같은 포유동물 세포에서 생산된다.
특정 구현예에서, 본원에 기술된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 감소된 퓨코스 함량을 가지거나 또는 퓨코스 함량을 갖지 않는다. 상기 항체는 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 항체는 불완전하거나 퓨코실레이트 능력이 결핍된 세포에서 발현될 수 있다. 특정 예에서, α1,6-퓨코실 전이효소의 두 대립유전자의 녹아웃을 갖는 세포주는 감소된 퓨코스 함량을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 생성시키는데 사용될 수 있다. Potelligent® 시스템(Lonza)은 감소된 퓨코스 함량을 갖는 항체 또는 항원-결합 단편을 생성하는데 사용될 수 있는 시스템의 예이다.
재조합 단백질의 장기간, 고-수율 생산을 위해, 안정한 발현 세포가 생성될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 항-CTLA-4 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 안정적으로 발현하는 세포주가 조작될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에서 제공된 세포는 본원에 기술된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 형성하도록 결합하는 경쇄/경쇄 가변 영역 및 중쇄/중쇄 가변 영역을 안정적으로 발현한다.
특정 양태에서, 바이러스성 복제기원을 포함하는 발현 벡터를 사용하는 것보다, 숙주 세포는 적절한 발현 조절 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결인자, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선택적 마커에 의해 조절되는 DNA로 형질전환될 수 있다. 외래 DNA/폴리뉴클레오타이드의 도입 후, 조작된 세포가 농축 배지에서 1-2일동안 성장한 다음, 선택 배지로 전환될 수 있다. 재조합 플라스미드의 선택도 마커는 선택에 대한 내성을 부여하고, 세포가 플라스미드를 그의 염색체에 안정적으로 통합시키고, 성장하여 중심(focus)을 형성하게 하며, 차례로 클로닝되어 세포주로 확대될 수 있다. 이 방법은 유리하게는 본원에 기술된 항-CTLA-4 항체 또는 그의 단편을 발현하는 세포주를 조작하는데 사용될 수 있다. 상기 조작된 세포주는 항체 분자와 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하는 조성물의 스크리닝 및 평가에 특히 유용할 수 있다.
각각 tk-, hgprt- 또는 aprt-세포에서의 단순 포진 바이러스 티미딘 키나아제(Wigler M et al.,(1977) Cell 11(1): 223-32), 하이포크산틴구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Szybalska EH & Szybalski W (1962) PNAS 48(12): 2026-2034) 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Lowy I et al., (1980) Cell 22(3): 817-23) 유전자를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다수의 선택 시스템들이 사용될 수 있다. 또한, 항대사물질 저항성은 하기 유전자들에 대한 선택을 기반으로 하여 사용될 수 있다: 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr(Wigler M et al., (1980) PNAS 77(6): 3567-70; O'Hare K et al., (1981) PNAS 78: 1527-31); 마이코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt(Mulligan RC & Berg P (1981) PNAS 78(4): 2072-6); 아미노글리코시드 G-418에 대한 내성을 부여하는 neo(Wu GY & Wu CH (1991) Biotherapy 3: 87-95; Tolstoshev P (1993) Ann Rev Pharmacol Toxicol 32: 573-596; Mulligan RC (1993) Science 260: 926-932; and Morgan RA & Anderson WF (1993) Ann Rev Biochem 62: 191-217; Nabel GJ & Felgner PL (1993) Trends Biotechnol 11(5): 211-5); 및 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hygro(Santerre RF et al., (1984) Gene 30(1-3): 147-56). 재조합 DNA 기술의 분야에서 일반적으로 공지되어 있는 방법은 원하는 재조합 클론을 선택하기 위해 일상적으로 적용될 수 있으며, 상기 방법은 예를 들어 Ausubel FM et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler M, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); and in Chapters 12 and 13, Dracopoli NC et al., (eds.), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colbere-Garapin F et al., (1981) J Mol Biol 150: 1-14에 기술되어있으며, 이들은 이후에 참고문헌으로 전문 통합된다.
항체 분자의 발현 수준은 벡터 증폭에 의해 증가될 수 있다(리뷰를 위해서는 Bebbington CR & Hentschel CCG, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3 (Academic Press, New York, 1987) 참조). 항체를 발현하는 벡터 시스템의 마커가 증폭될 수 있는 경우, 숙주 세포의 배양물에 존재하는 억제제 수준의 증가는 마커 유전자의 복제 수를 증가시킬 것이다. 증폭된 영역이 항체 유전자와 관련되기 때문에, 항체의 생산 또한 증가할 것이다(Crouse GF et al., (1983) Mol Cell Biol 3: 257-66).
숙주 세포는 본원에 기술된 2개 이상의 발현 벡터, 중쇄 유래된 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 벡터 및 경쇄 유래된 폴리펩타이드를 코딩하는 제2 벡터에 의해 동시-형질감염될 수 있다. 두 벡터는 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드의 동일한 발현을 가능하게 하는 동일한 선택가능한 마커를 함유할 수 있다. 숙주 세포는 상이한 양의 2개 이상의 발현 벡터에 의해 동시-형질감염될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:12, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45 또는 1:50의 제1 발현 벡터와 제2 발현 벡터의 비율 중 어느 하나의 비율로 형질감염될 수 있다.
대안적으로는, 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드 모두를 코딩하고, 발현할 수 있는 단일 벡터가 사용될 수 있다. 상기 상황에서, 경쇄는 과도한 무독성 중쇄를 피하기 위해 중쇄 전에 배치되어야한다(Proudfoot NJ (1986) Nature 322: 562-565; 및 Kohler G (1980) PNAS 77: 2197-2199). 중쇄 및 경쇄의 코딩 서열은 cDNA 또는 게놈 DNA를 포함할 수 있다. 발현 벡터는 모노시스트론(monocistronic) 또는 멀티시스트론(multistronic)일 수 있다. 멀티시스트론 핵산 구조물은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상, 또는 2-5, 5-10 또는 10-20개 범위의 유전자/뉴클레오타이드 서열을 코딩할 수 있다. 예를 들어, 바이시스트론(bicistronic) 핵산 구조물은 프로모터, 제1 유전자(예를 들어, 본원에 기술된 항체의 중쇄), 및 제2 유전자 및 (예를 들어, 본원에 기술된 항체의 경쇄)를 이 순서로 포함할 수 있다. 상기 발현 벡터에서, 두 유전자의 전사는 프로모터에 의해 유도될 수 있는 반면, 제1 유전자로부터의 mRNA의 번역은 캡-의존성 스캐닝 메커니즘에 의해 이루어질 수 있고, 제2 유전자로부터의 mRNA의 번역은 예를 들어 IRES에 의한 캡-독립성 메커니즘에 의해 이루어질 수 있다.
본원에 기술된 항체 분자가 재조합 발현에 의해 생성되면, 면역글로불린 분자의 정제를 위한 당 분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화도, 특히 단백질 A 이후 특정 항원에 대한 친화도 및 사이징(sizing) 컬럼 크로마토그래피), 원심 분리, 차등(differential) 용해도, 또는 단백질 정제를 위한 다른 표준 기술에 의해 정제될 수 있다. 또한, 본원에 기술된 항체는 본원에 기술된 이종 폴리펩타이드 서열에 융합되거나, 그렇지 않으면 정제를 용이하게하기 위해 당 분야에 공지되어있다.
특정 구현예에서, 본원에 기술된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 분리되거나 정제된다. 일반적으로, 단리된 항체는 단리된 항체와 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 존재하지 않는 항체이다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 본원에 기술된 항체의 제제는 세포 물질 및/또는 화학적 전구물질을 실질적으로 함유하지 않는다. "세포 물질이 실질적으로 없다"는 용어는 항체가 분리되거나 재조합적으로 생산된 세포의 세포 성분으로부터 분리되는 항체의 제제를 포함한다. 따라서, 세포 물질이 실질적으로 없는 항체는 약 30%, 20%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0.5% 또는 0.1%(건조 중량 기준)의 이종성 단백질(본원에서 "오염 단백질"이라고도 함) 및/또는 항체의 변이체, 예를 들어 항체 또는 다른 버전의 항체(예를 들어, 항체 단편)의 상이한 후-번역 변형된 형태를 갖는 항체의 제제를 포함한다. 항체가 재조합적으로 생산될 때, 일반적으로 배양 배지가 실질적으로 없으며, 즉 배양 배지는 단백질 제제의 부피의 약 20%, 10%, 2%, 1%, 0.5% 또는 0.1% 미만을 나타낸다. 항체가 화학 합성에 의해 생성되는 경우, 일반적으로 화학 전구물질 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없으며, 즉 화학 전구물질 또는, 단백질의 합성에 관여하는 다른 화학물질로부터 분리된다. 따라서, 항체의 상기 제제는 관심있는 항체 이외의 약 30%, 20%, 10% 또는 5%(건조 중량 기준) 미만의 화학 전구물질 또는 화합물을 갖는다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 항체는 분리되거나 정제된다.
CTLA-4(예를 들어, 인간 CTLA-4)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편은 항체 합성을 위한 당 분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 화학적 합성 또는 재조합 발현 기술에 의해 제조될 수 있다. 다르게 명시되지 않는한, 본원에 기술된 방법은 분자 생물학, 미생물학, 유전 분석, 재조합 DNA, 유기 화학, 생화학, PCR, 올리고뉴클레오타이드 합성 및 변형, 핵산 혼성화 및 당해 기술 분야의 관련 분야의 통상적인 기술을 사용한다. 상기 기술은 예를 들어 본원에 인용된 참고 문헌에 기술되어 있으며, 문헌에서 충분히 설명되어있다. 예를 들어 Maniatis T et al., (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook J et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook J et al., (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel FM et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987 and annual updates); Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (1987 and annual updates) Gait (ed.) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein (ed.) (1991) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Birren B et al., (eds.) (1999) Genome Analysis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press를 참조한다.
특정 구현예에서, 본원에 기술된 항체는 합성, 예를 들어 DNA 서열의 유전 공학을 통한 생성을 포함하는 임의의 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체(예를 들어, 재조합 항체)이다. 특정 구현예에서, 상기 항체는 생체 내에서 동물 또는 포유동물(예를 들어, 인간)의 항체 생식세포 레퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않는 서열(예를 들어, DNA 서열 또는 아미노산 서열)을 포함한다.
일 양태에서, 본원에 기술된 세포 또는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, CTLA-4(예를 들어, 인간 CTLA-4)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제조하는 방법이 본원에 제공된다. 특정 양태에서, 본원에 기술된 세포 또는 숙주 세포(예를 들어, 본원에 기술된 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포 또는 숙주 세포)를 사용하여, 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 발현(예를 들어, 재조합적으로 발현)시키는 단계를 포함하는, CTLA-4(예를 들어, 인간 CTLA-4)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제조하는 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 세포는 분리된 세포이다. 특정 구현예에서, 외인성 폴리뉴클레오타이드가 세포내로 도입되었다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 세포 또는 숙주 세포로부터 수득된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 이 방법은 생체 외에서 수행된다.
다클론 항체를 생산하는 방법은 당 분야에 공지되어있다(예를 들어, Chapter 11 in: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5th Ed., Ausubel FM et al., eds., John Wiley and Sons, New York 참조).
단클론 항체는 하이브리도마, 재조합 및 파지 디스플레이 기술, 또는 이들의 조합의 사용을 포함하여 당 분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 단클론 항체는 당 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 Harlow E & Lane D, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling GJ et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563 681 (Elsevier, N.Y., 1981)에 교시된 기술들을 포함하는, 하이브리도마 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "단클론 항체"는 하이브리도마 기술을 통해 생성된 항체에 국한되지 않는다. 예를 들어, 단클론 항체는 본원에 기술된 항체 또는 그의 단편, 예를 들어 상기 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 외인성으로 발현하는 숙주 세포로부터 재조합적으로 생산될 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에 사용된 "단클론 항체"는 단일 세포(예를 들어, 재조합 항체를 생산하는 하이브리도마 또는 숙주 세포)에 의해 생성된 항체이며, 상기 항체는 예를 들어 ELISA 또는 당 분야에 공지된 다른 항원-결합 또는 경쟁적 결합 분석 또는 본원에서 제공된 실시예에 의해 측정된 바와 같이, CTLA-4(예를 들어, 인간 CTLA-4)에 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 단클론 항체는 키메라 항체 또는 인간화 항체일 수 있다. 특정 구현예에서, 단클론 항체는 1가 항체 또는 다가(예를 들어, 2가) 항체이다. 특정 구현예에서, 단클론 항체는 단일 특이적 또는 다중 특이적 항체(예컨대, 이중 특이적 항체)이다. 본원에 기술된 단클론 항체는 예를 들어, Kohler G & Milstein C (1975) Nature 256: 495에 기술된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 예를 들어, 본원에 기술된 기술을 사용하여 파지 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 클론 세포주 및 이에 의해 발현된 단클론 항체의 다른 제조 방법은 당 분야에 잘 알려져있다(예를 들어, Chapter 11 in: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5th Ed., Ausubel FM et al., supra 참조).
하이브리도마 기술을 사용하여 특정 항체를 생산하고, 스크리닝하는 방법은 일반적이고, 당 분야에 잘 알려져있다. 예를 들어, 하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 양, 염소, 토끼, 래트, 햄스터 또는 마카크 원숭이와 같은 다른 적절한 숙주 동물을 면역시켜, 면역화에 사용된 단백질(예를 들어, CTLA-4(예를 들어, 인간 CTLA-4))에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도할 수 있다. 대안적으로, 림프구가 생체 외에서 면역화될 수 있다. 그런 다음 림프구를 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적절한 융합 제제를 사용하여 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성시킨다(Goding JW (Ed), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). 또한, 동물을 면역화시키기 위해 RIMMS(반복적인 면역화 다중 부위) 기술을 사용할 수 있다(Kilpatrick KE et al., (1997) Hybridoma 16:381-9, 그 전체가 참고문헌으로 포함됨).
일부 구현예에서, 마우스(또는 래트, 원숭이, 당나귀, 돼지, 양, 햄스터 또는 개와 같은 다른 동물)는 항원(예를 들어, CTLA-4(예를 들어, 인간 CTLA-4))으로 면역화될 수 있으며, 일단 면역 반응이 검출되면, 예를 들어, 항원에 특이적인 항체가 마우스 혈청에서 검출되고, 마우스 비장이 수확되고, 비장 세포가 분리된다. 그 다음, 잘 알려진 기술에 의해 비장 세포가 임의의 적합한 골수종 세포, 예를 들어 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC®)(Manassas, VA)에서 입수가능한 세포주 SP20의 세포에 융합되어, 하이브리도마를 형성시킨다. 하이브리도마는 제한 희석에 의해 선택되고, 복제된다. 특정 구현예에서, 면역화된 마우스의 림프절이 수확되고, NS0 골수종 세포와 융합된다.
융합되지않은 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 바람직하게 함유하는 적합한 배양 배지에 상기 제조된 하이브리도마 세포가 접종되고, 배양된다. 예를 들어, 모 골수종 세포에 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(HGPRT 또는 HPRT)가 없으면, 하이브리도마의 배양 배지는 HGPRT-결핍된 세포의 성장을 방해하는 물질인 하이포크산틴, 아미놉테린 및 티미딘(HAT 배지)을 포함할 것이다.
특정 구현예는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 안정한 높은 수준의 생산을 지원하고, HAT 배지와 같은 배지에 민감한 골수종 세포를 사용한다. 상기 골수종 세포주 중에는 NS0 세포주와 같은 뮤린 골수종 세포주 또는, 미국 캘리포니아 주 샌디에고(San Diego, CA, USA)의 Salk Institute Cell Distribution Center(살크 인스티튜트 세포 분배 센터)에서 입수할 수 있는 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양에서 유래된 세포주 및 미국 메릴랜드 주 로크빌(Rockville, MD, USA)의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)에서 입수가능한 SP-2 또는 X63-Ag8.653 세포가 있다. 인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주는 또한 인간 단클론 항체의 생산에 대해 기술되어있다(Kozbor D (1984) J Immunol 133: 3001-5; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).
하이브리도마 세포가 성장하고있는 배양 배지를 CTLA-4(예를 들어, 인간 CTLA-4)에 대한 단클론 항체의 생산에 대해 분석한다. 하이브리도마 세포에 의해 생성된 단클론 항체의 결합 특이성은 당 분야에 공지된 방법, 예를 들어 면역침강법 또는 방사성 면역 분석법(RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA)과 같은 시험관내 결합 분석법에 의해 측정된다.
목적하는 특이성, 친화성 및/또는 활성의 항체를 생성하는 하이브리도마 세포가 확인된 후, 클론은 한계 희석 과정에 의해 서브클로닝되고, 표준 방법에 의해 성장될 수 있다(Goding JW(Ed), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 상동). 상기 목적을 위한 적당한 배양 배지는 예를 들어, D-MEM 또는 RPMI 1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양으로서 생체내에서 성장할 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 단클론 항체는 통상적인 면역글로불린 정제 과정들, 예를 들어 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화도 크로마토그래피에 의해 배양 배지, 복수 유체 또는 혈청으로부터 적당히 분리된다.
본원에 기술된 항체는 특정 CTLA-4(예를 들어, 인간 CTLA-4)를 인식하고, 당업자에게 공지된 임의의 기술에 의해 생성될 수 있는 항체 단편을 포함한다. 예를 들어, 본원에 기술된 Fab 및 F(ab')2 단편은 (Fab 단편을 생성하기 위한) 파파인 또는 (F(ab')2 단편을 생성하기 위한) 펩신과 같은 효소를 사용하여 면역글로불린 분자의 단백질분해 절단에 의해 생성될 수 있다. Fab 단편은 항체 분자의 2개의 동일한 아암(arm) 중 하나에 상응하며, 중쇄의 VH 및 CH1 도메인과 쌍을 이루는 완전한 경쇄를 함유한다. F(ab')2 단편은 힌지 부위의 디설파이드 결합에 의해 연결된 항체 분자의 2개의 항원-결합 아암을 함유한다.
또한, 본원에 기술된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 당 분야에 공지된 다양한 파지 디스플레이 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 파지 디스플레이 방법에서, 기능성 항체 도메인은 그들을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는 파지 입자의 표면 상에 표시된다. 특히, VH 및 VL 도메인을 코딩하는 DNA 서열은 동물 cDNA 라이브러리(예를 들어, 감염된 조직의 인간 또는 뮤린 cDNA 라이브러리)로부터 증폭된다. VH 및 VL 도메인을 코딩하는 DNA는 PCR에 의해 scFv 링커와 함께 재조합되고, 파지미드 벡터로 클로닝된다. 벡터가 대장균에서 전기천공되고, 대장균이 헬퍼 파지로 감염된다. 상기 방법에 사용되는 파지는 전형적으로 fd 및 M13을 포함하는 섬유상 파지이며, VH 및 VL 도메인은 통상 파지 유전자 III 또는 유전자 VIII 중 어느 하나에 재조합적으로 융합된다. 특정 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 발현하는 파지는 예를 들어, 표지된 항원 또는 고체 표면 또는 비드에 결합되거나 포획된 항원을 사용하여 항원으로 선택되거나 동정될 수 있다. 본원에 기술된 항체를 제조하는데 사용될 수 있는 파지 디스플레이 방법의 예는 Brinkman U et al., (1995) J Immunol Methods 182: 41-50; Ames RS et al., (1995) J Immunol Methods 184: 177-186; Kettleborough CA et al., (1994) Eur J Immunol 24: 952-958; Persic L et al., (1997) Gene 187: 9-18; Burton DR & Barbas CF (1994) Advan Immunol 57: 191-280; PCT 출원번호 PCT/GB91/001134; 국제공보 WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/1 1236, WO 95/15982, WO 95/20401, 및 WO 97/13844; 및 미국특허 제5,698,426호, 제5,223,409호, 제5,403,484호, 제5,580,717호, 제5,427,908호, 제5,750,753호, 제5,821,047호, 제5,571,698호, 제5,427,908호, 제5,516,637호, 제5,780,225호, 제5,658,727호, 제5,733,743호 및 제5,969,108호에 개시된 방법들을 포함한다.
상기 문헌에 기술된 바와 같이, 파지 선택 후, 파지로부터의 영역을 코딩하는 항체가 인간 항체, 또는 임의의 다른 목적하는 항원 결합 단편을 포함하여 전체 항체를 생성하기 위해 분리 및 사용될 수 있으며, 예를 들어 이하에 기술된 바와 같이 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 및 박테리아를 포함한 임의의 목적하는 숙주에서 발현될 수 있다. Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편과 같은 항체 단편을 재조합적으로 생산하는 기술은 또한 PCT 공개 공보 제WO 92/22324호; Mullinax RL et al., (1992) BioTechniques 12(6): 864-9; Sawai H et al., (1995) Am J Reprod Immunol 34: 26-34; and Better M et al., (1988) Science 240: 1041-1043에 개시된 것과 같은 당 분야에 공지된 방법을 사용하여 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 전체 항체를 생성하기 위해, VH 또는 VL 뉴클레오타이드 서열, 제한 부위 및 제한 부위를 보호하기 위한 플랭킹 서열을 포함하는 PCR 프라이머가 주형, 예를 들어 scFv 클론으로부터 VH 또는 VL 서열을 증폭하기 위해 사용될 수 있다. 당업자에게 공지된 클로닝 기술을 이용하여, PCR 증폭된 VH 도메인은 VH 불변 영역을 발현하는 벡터로 클로닝될 수 있으며, PCR 증폭된 VL 도메인은 VL 불변 영역, 예를 들어, 인간 카파 또는 람다 불변 영역을 발현하는 벡터로 클로닝될 수 있다. VH 및 VL 도메인은 또한 필수 불변 영역을 발현하는 하나의 벡터로 클로닝될 수 있다. 이어서, 중쇄 전환 벡터 및 경쇄 전환 벡터가 세포주 내로 공동 형질감염되어, 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 IgG와 같은 전장 항체를 발현하는 안정한 또는 일시적인 세포주를 생성시킨다.
키메라 항체는 항체의 상이한 부분이 상이한 면역글로불린 분자로부터 유래된 분자이다. 예를 들어, 키메라 항체는 인간 항체의 불변 영역에 융합된 마우스 또는 래트 단클론 항체의 가변 영역을 함유할 수 있다. 키메라 항체를 생산하는 방법은 당 분야에 공지되어있다. 예를 들어, Morrison SL (1985) Science 229: 1202-7; Oi VT & Morrison SL (1986) BioTechniques 4: 214-221; Gillies SD et al., (1989) J Immunol Methods 125: 191-202; 및 미국특허 제5,807,715호, 제4,816,567호, 제4,816,397호 및 제6,331,415호를 참조한다.
인간화 항체는 미리 결정된 항원에 결합할 수 있고, 실질적으로 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역 및 실질적으로 비-인간 면역글로불린(예를 들어, 뮤린 면역글로불린)의 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함한다. 특정 구현예에서, 인간화 항체는 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 적어도 일부를 포함한다. 항체는 또한 중쇄의 CH1, 힌지, CH2, CH3 및 CH4 영역을 포함할 수 있다. 인간화 항체는 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE, 및 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는 임의의 이소타입을 포함하는 임의의 부류의 면역글로불린으로부터 선택될 수 있다. 인간화 항체는 CDR-이식(유럽 특허 제EP 239400호; 국제 공개 WO 91/09967호; 및 미국특허 제5,225,539호, 제5,530,101호, 제5,585,089호), 베니어링 또는 리서페이싱(유럽특허 제EP 592106호 및 제519596호; Padlan EA (1991) Mol Immunol 28(4/5): 489-498; Studnicka GM et al., (1994) Prot Engineering 7(6): 805-814; and Roguska MA et al., (1994) PNAS 91: 969-973), 사슬 셔플링(chain shuffling)(미국특허 제5,565,332호) 및 예를 들어, 미국특허 제6,407,213호, 미국특허 제5,766,886호, 국제 공개번호 WO 93/17105; Tan P et al., (2002) J Immunol 169: 1119-25; Caldas C et al., (2000) Protein Eng. 13(5): 353-60; Morea V et al., (2000) Methods 20(3): 267-79; Baca M et al., (1997) J Biol Chem 272(16): 10678-84; Roguska MA et al., (1996) Protein Eng 9(10): 895 904; Couto JR et al., (1995) Cancer Res. 55 (23 Supp): 5973s-5977s; Couto JR et al., (1995) Cancer Res 55(8): 1717-22; Sandhu JS (1994) Gene 150(2): 409-10 and Pedersen JT et al., (1994) J Mol Biol 235(3): 959-73에 개시된 기술들을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 다양한 기술들을 사용하여 제조될 수 있다. 또한, 본 명세서에서 그 전체가 참고로 인용된 미국 출원 공개번호 US 2005/0042664 A1(2005년 2월 24일)을 참조한다.
다중 특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체)를 제조하는 방법이 예를 들어, 미국특허 제7,951,917호; 제7,183,076호; 제8,227,577호; 제5,837,242호; 제5,989,830호; 제5,869,620호; 제6,132,992호 및 제8,586,713호에 기술되어 있다.
단일 도메인 항체, 예를 들어 경쇄가 없는 항체는 당 분야에 널리 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. Riechmann L & Muyldermans S (1999) J Immunol 231: 25-38; Nuttall SD et al., (2000) Curr Pharm Biotechnol 1(3): 253-263; Muyldermans S, (2001) J Biotechnol 74(4): 277-302; 미국특허 제6,005,079호; 및 국제공보 WO 94/04678, WO 94/25591 및 WO 01/44301을 참조한다.
또한, CTLA-4 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 항원을 "모방(mimic)"시키는 항-이디오타입 항체를 생성시키는데 차례로 이용될 수 있다.(예를 들어, Greenpan NS & Bona CA(1989) FASEB J 7(5): 437-444 및 Nissinoff A(1991) J Immunol 147(8): 2429-2438 참조).
특정 구현예에서, 본원에 기술된 항-CTLA-4 항체와 동일한 CTLA-4(예를 들어, 인간 CTLA-4) 에피토프에 결합하는, 본원에 기술된 항체는 인간 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 항체 중 어느 하나가 CTLA-4(예를 들어, 인간 CTLA-4)에 결합하는 것을 경쟁적으로 차단(예를 들어, 투여량-의존적 방식으로)하는 본원에 기술된 항체는 인간 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 인간 항체는 당 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 기능적 내인성 면역글로불린을 발현할 수 없지만 인간 면역글로불린 유전자를 발현할 수 있는 트랜스제닉 마우스가 사용될 수 있다. 특히, 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자 복합체가 무작위로 또는 상동성 재조합에 의해 마우스 배아 줄기 세포에 도입될 수 있다. 대안적으로, 인간 가변 영역, 불변 영역 및 다양성 영역이 인간 중쇄 및 경쇄 유전자 이외에 마우스 배아 줄기 세포에 도입될 수 있다. 마우스 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자는 상동 재조합에 의한 인간 면역글로불린 유전자좌의 도입과 별도로 또는 동시에 비-기능적으로 될 수 있다. 특히, JH 영역의 동형접합성 결실은 내인성 항체 생산을 방해한다. 변형된 배아 줄기 세포가 확대되고, 배반포에 미세주입하여 키메라 마우스를 생산한다. 그런 다음 키메라 마우스를 사육하여 인간 항체를 발현하는 동형접합성 자손을 생산한다. 트랜스제닉 마우스는 선택된 항원, 예를 들어 항원(예를 들어, CTLA-4)의 전부 또는 일부로 정상적인 방식으로 면역화된다. 항원에 대한 단클론 항체는 통상적인 하이브리도마 기술을 사용하여 면역화된 트랜스제닉 마우스로부터 수득할 수 있다. 트랜스제닉 마우스가 보유하고있는 인간 면역글로불린 형질전환유전자는 B 세포 분화동안 재배열하고, 이어서 등급 전환 및 체세포 돌연변이를 겪는다. 따라서, 상기 기술을 사용하여, 치료학적으로 유용한 IgG, IgA, IgM 및 IgE 항체를 생산할 수 있다. 인간 항체 생산을 위한 이 기술의 개요는 Lonberg N & Huszar D(1995) Int Rev Immunol 13:65-93을 참조한다. 인간 항체 및 인간 단클론 항체를 생산하는 상기 기술 및 상기 항체를 생산하기 위한 프로토콜에 대한 상세한 설명은 예를 들어 국제 공개번호 WO 98/24893, WO 96/34096 및 WO 96/33735; 및 미국특허 제5,413,923호, 제5,625,126호, 제5,633,425호, 제5,569,825호, 제5,661,016호, 제5,545,806호, 제5,814,318호 및 제5,939,598호를 참조한다. 인간 항체를 생성할 수 있는 마우스의 예는 XenomouseTM(Abgenix, Inc., 미국특허 제6,075,181호 및 제6,150,184호), HuAb-MouseTM(Mederex, Inc./Gen Pharm, 미국특허 제5,545,806호 및 제5,569,825호) Trans Chromo MouseTM(Kirin) 및 KM MouseTM(Medarex/Kirin)을 포함한다.
CTLA-4(예를 들어, 인간 CTLA-4)에 특이적으로 결합하는 인간 항체는 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 항체 라이브러리를 사용하여 상기 기술된 파지 디스플레이 방법을 포함하는 당 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한, 미국특허 제4,444,887호, 제4,716,111호 및 제5,885,793호; 국제 공개번호 WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 및 WO 91/10741을 참조한다.
일부 구현예에서, 인간 항체는 마우스-인간 하이브리도마를 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 엡스타인-바아 바이러스(EBV)로 형질전환된 인간 말초혈액 림프구는 마우스 골수종 세포와 융합하여, 인간 단클론 항체를 분비하는 마우스-인간 하이브리도마를 제조할 수 있으며, 상기 마우스-인간 하이브리도마는 표적 항원(예를 들어, CTLA-4(예를 들어, 인간 CTLA-4))에 특이적으로 결합하는 인간 단클론 항체를 분비하는 것을 결정하도록 스크리닝될 수 있다. 상기 방법은 공지되어 있으며, 당 분야에 기술되어있으며, 예를 들어, Shinmoto H et al., (2004) Cytotechnology 46: 19-23; Naganawa Y et al., (2005) Human Antibodies 14: 27-31을 참조한다.
5.6 키트
또한, 본원에 기술된 하나 이상의 항체 또는 이의 약학적 조성물 또는 접합체를 포함하는 키트가 제공된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 하나 이상의 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 같이, 본원에 기술된 약학적 조성물의 성분 중 하나 이상으로 채워지는 1개 이상의 용기를 포함하는 약제 팩 또는 키트가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 키트는 본원에 기술된 약학적 조성물 및 임의의 예방적 또는 치료적 제제, 예컨대 본원에 기술된 것들을 함유한다. 특정 구현예에서, 키트는 예를 들어 파이토헤마글루티닌(PHA) 및/또는 포르볼 미리스테이트 아세테이트(PMA)와 같은 T-세포 분열촉진제 또는 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 같은 TCR 복합체 자극 항체를 함유할 수 있다. 선택적으로 상기 용기(들)과 관련된 것은 의약품이나 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관이 규정한 형태로 통보될 수 있으며, 통보는 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매에 대한 기관의 승인을 반영한다.
또한, 상기 방법에서 사용될 수 있는 키트가 제공된다. 일 구현예에서, 키트는 하나 이상의 용기에 본원에 기술된 항체, 바람직하게는 정제된 항체를 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 키트는 대조군으로서 실질적으로 분리된 CTLA-4 항원(예를 들어, 인간 CTLA-4)을 함유한다. 다른 특정 구현예에서, 본원에 기술된 키트는 CTLA-4 항원과 반응하지않는 대조군 항체를 추가로 포함한다. 또 다른 특정 구현예에서, 본원에 기술된 키트는 CTLA-4 항원에 대한 항체의 결합을 검출하기 위한 하나 이상의 요소를 포함한다(예를 들어, 항체는 형광 화합물, 효소 기질, 방사성 화합물 또는 발광 화합물과 같은 검출가능한 기질에 접합될 수 있거나, 또는 제1 항체를 인식하는 제2 항체가 검출가능한 기질에 접합될 수 있다). 특정 구현예에서, 본원에 제공된 키트는 재조합적으로 생산되거나 화학적으로 합성된 CTLA-4 항원을 포함할 수 있다. 키트에 제공된 CTLA-4 항원은 또한 고체 지지체에 부착될 수 있다. 보다 구체적인 구현예에서, 상기 키트의 검출 수단은 CTLA-4 항원이 부착된 고체 지지체를 포함한다. 상기 키트는 또한 부착되지 않은 리포터-표지된 항-인간 항체 또는 항-마우스/래트 항체를 포함할 수 있다. 이 구현예에서, CTLA-4 항원에 대한 항체의 결합은 상기 리포터-표지된 항체의 결합에 의해 검출될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 생물학적 샘플내 인간 CTLA-4의 시험관내 분석 및/또는 검출을 위한 본 발명의 키트의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 인간 CTLA-4에 특이적으로 결합하고, CTLA-4 기능을 길항하는 항체를 제공한다. 또한, 상기 항체를 포함하는 약학적 조성물, 상기 항체를 코딩하는 핵산, 상기 항체를 제조하기 위한 발현 벡터 및 숙주 세포, 및 상기 항체를 사용하여 대상을 치료하는 방법을 제공한다.
도 1a는 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된 바와 같은, 이량체 및 단량체 재조합 인간, 사이노몰구스(cynomolgus), 마우스 및 래트 CTLA-4에 대한 항-CTLA-4 항체 AGEN1884 및 기준 항-CTLA-4 IgG1 항체의 결합 친화도(KD)을 나타내는 표이다 다. 도 1b는 유동 세포계측법에 의해 측정된 바와 같은, CTLA-4-발현 세포에 대한 AGEN1884w, 기준 항-CTLA-4 IgG1 항체 및 IgG1 이소타입 대조군의 결합을 나타내는 그래프이다. 평균 형광 강도(MFI)를 계산하고, 일정 범위의 항체 농도에 대해 플롯팅하였다. 도 1c 및 1d는 이소타입 대조군 IgG1 항체에 대하여 도시된, 관련 계열 구성원(재조합 인간 CD28, ICOS, BTLA, 및 PD-1 및 재조합 사이노몰구스 PD-1)과 대조되는, 재조합 인간(rh) 및 사이노몰구스(rc) CTLA-4에 결합하는 AGEN1884 및 기준 항-CTLA-4 IgG1 항체의 선택도를 나타낸다. 상기 결합은 서스펜션 어레이 기술에 의해 측정되었으며, 3개의 상이한 항체 농도(10, 100 및 1000 ng/ml)에서의 평균 형광 강도(MFI)가 도 1c에 도시된다. 도 1d는 도 1c에 도시된 데이터에 기초한 상대적인 결합 친화도의 요약 표이다.
도 2a는 활성화된 1차 인간 CD4+ T 세포에 대한 AGEN1884w, 항-CTLA-4 기준 항체 및 IgG1 이소타입 대조군 항체의 결합을 나타낸다. 간단히 말하면, 새로 분리된 CD4+ T 세포는 유동 세포계측법에 의한 항체 결합 분석에 앞서 5일 동안 플레이트-결합된 항-CD3 및 항-CD28 항체를 사용하여 자극되었다. 평균 형광 강도(MFI)는 다양한 항체 농도를 통해 계산되었다. 도 2b는 활성화된 (3일간 재조합 IL-2를 갖는 항-CD3 및 항-CD28) 1차 사이노몰구스 CD8+ T 세포를 사용한 농도 적정을 통한 IgG1 이소타입 대조군 항체와 비교한 AGEN1884 및 항-CTLA-4 기준 항체의 세포내 결합을 나타낸다. 데이터는 유동 세포계측법에 의해 생성되었으며, 총 CD8+ T 세포 집단의 비율로서 CTLA-4+ T 세포의 퍼센트로 나타내었다. 도 2c는 파이토헤마글루티닌-자극된 CD4+ 인간, 사이노몰구스, 래트 또는 마우스 T 세포에 대한 AGEN1884w 및 IgG1 이소타입 대조군 항체의 결합을 시험하는 유동 세포계측법 분석 결과를 나타낸다.
도 3a는 서스펜션 어레이 기술을 사용하는 리간드 차단 분석의 개략도이다. 도 3b 및 3c는 AGEN1884, 기준 항-CTLA-4 IgG1 항체, 또는 이소타입 대조군(IgG1) 항체의 투여량 적정(100%)의 부재(100%) 또는 존재하에 CTLA-4 접합된 비드에 결합하는 재조합 CD80-Fc(도 3b) 및 CD86-Fc 단백질(도 3c)의 백분율을 나타낸다. 도 3d는 증가하는 농도의 AGEN1884, 기준 항-CTLA-4 IgG1 항체, 또는 이소타입 대조군(IgG1) 항체의 존재하에 CTLA-4 발현 T 세포(Jurkat)에 결합하는 재조합 CD80-Fc 및 CD86-Fc의 백분율을 나타낸다. 도 3e는 직접 형광색소-접합된 AGEN1884w 또는 기준 항-CTLA-4 IgG1 항체가 첨가되기 전에, CTLA-4 발현 T 세포(Jurkat)를 CD80-Fc 또는 CD86-Fc의 적정 투여량과 함께 배양한 분석법의 결과를 나타낸다. 평균 형광 강도(MFI)를 계산하여, CD80-Fc 또는 CD86-Fc 농도의 범위에 대해 플롯팅하였다.
도 4a는 스타필로코커스 엔테로톡신 A(SEA) 자극시에 1차 인간 PBMC의 배양물상 항-CTLA-4 항체의 기능적 활성을 나타낸다. 구체적으로, 도 4a는 IgG1 이소타입 대조군과 비교하여, AGEN1884w 및 기준 항-CTLA-4 IgG1 항체의 투여량-반응에 대한 반응시 IL-2 생성의 배율 변화를 나타낸다. 오차(error) 막대는 삼중 웰로부터의 표준 편차를 나타낸다. 도 4b 및 4c는 CTLA-4의 차단이 T 세포 활성화를 유도한다는 사실을 보여주는 IL-2-루시퍼라제 리포터 분석 결과이다. IL-2 프로모터의 조절하에 루시퍼라제 리포터 유전자 이외에 세포 표면 CTLA-4를 구성적으로 발현하도록 조작된 인간 T 세포주(Jurkat)를 동시-발현하는 CD3 및 CD28은 CD80과 CD86을 발현한 항원 제시 세포주(Raji)와 공동-배양하였다. 도 4b는 유동 세포계측법에 의해 측정된 바와 같은 Raji 세포상의 CD80 및 CD86의 발현을 나타내는 한 쌍의 히스토그램이다. TCR 신호전달은 증가하는 농도의 AGEN1884w 또는 IgG1 이소타입 대조군 항체의 존재 하에서 항-CD3 항체를 사용하여 개시되었다. 도 4c는 이소타입 대조군 항체에 비해 AGEN1884w의 농도가 증가함에 따라 IL-2 유전자 활성화를 위한 대리 표지자인, 루시퍼라제 발현의 배율 증가를 보여준다. 도 4d 및 4e는 고농도의 항-CD3 항체의 존재하에 1차 CD8+ T 세포로부터 IFNγ 생산을 감소시키는 항-CTLA-4 항체 AGEN1884w의 능력을 시험하는 분석 결과이다. 증가 농도의 가용성(도 4d) 또는 플레이트-결합된(도 4e) AGEN1884w 또는 IgG1 이소타입 대조군 항체의 존재하에 1차 인간 T 세포를 항-CD3 항체(10 μg/ml)로 자극했다. 시험된 항체 농도에 대해 CD8+IFNγ+T 세포의 백분율을 플로팅한다. 점선은 항-CD3 항체 자극의 부재하에 CD8+IFNγ+T 세포의 빈도를 나타낸다. 도 4f는 스타필로코커스 엔테로톡신 A(SEA) 자극시에 1차 인간 PBMC의 배양액에 대한, 항-CTLA-4 항체 AGEN1884w의 단독 또는 항-LAG-3 항체 AGEN1746, 항-PD-1 항체 니볼루맙 또는 항-PD-1 항체 펨브롤리주맙과 조합된 것의 기능적 활성을 나타내는 그래프이다. IL-2 농도의 평균 및 표준 편차가 표시된다. IC는 이소타입 대조군을 의미한다.
도 5a는 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된 바와 같은, 이량체 및 단량체 재조합 인간 및 사이노몰구스 CTLA-4에 대한 AGEN2041w, 기준 항-CTLA-4 IgG1 항체 및 기준 항-CTLA-4 IgG2 항체의 결합 친화도(KD)를 나타낸다. 도 5b는 유동 세포계측법 분석에서 측정한 바와 같이, CTLA-4-발현 세포에 대한 AGEN2041w, 기준 항-CTLA-4 IgG2 항체 및 IgG2 이소타입 대조군의 결합을 나타내는 그래프이다. 평균 형광 강도(MFI)를 계산하고, 시험된 상이한 항체 농도에 대해 플로팅했다. 도 5c는 서스펜션 어레이 기술로 측정한 바와 같은, 증가하는 농도의 AGEN2041w 또는 기준 항-CTLA-4 IgG2 항체(비드를 첨가하기 전에 12, 37, 111, 333, 1000, 3000 및 9000 ng/ml)의 존재하에 CTLA-4에 결합하는 CD80 및 CD86의 백분율을 나타내는 그래프이다. 도 5d 및 5e는 관련 계열 구성원(재조합 인간 CD28, ICOS, BTLA 및 PD-1; 및 재조합 사이노몰구스 PD-1)과 대조되는, 재조합 인간(rh) 및 사이노몰구스(rc) CTLA-4에 결합하는 AGEN2041w 및 기준 항-CTLA-4 IgG2 항체의 선택도가 각각 이소타입 대조군 IgG2 항체에 대하여 시험되는, 도 1c 및 1d에 도시된 것과 유사한 표이다. 도 5d는 서스펜션 어레이 기술에 의해 측정된 MFI 값을 도시하고, 도 5e는 도 5d에 도시된 데이터에 기초한 요약 표이다.
도 6a는 스타필로코커스 엔테로톡신 A(SEA) 자극시에 1차 인간 PBMC의 배양물에 대한 항-CTLA-4 항체의 기능적 활성을 나타낸다. 도 6a는 IgG1 및 IgG2 이소타입 대조군 항체와 비교하여, AGEN1884w 및 AGEN2041w의 투여량-반응에 대한 IL-2 생성의 배율 변화를 나타낸다. 오차 막대는 삼중 웰에서 표준 편차를 나타낸다. 도 6b는 AGEN2041w 및 IgG2 이소타입 대조군 항체를 시험하는 IL-2-루시퍼라제 리포터 분석으로부터의 결과를 나타내는 그래프이다. IL-2 유전자 활성화를 위한 대리 표지자인 루시퍼라제 발현의 배율 증가는 AGEN2041w 및 이소타입 대조군 항체의 증가하는 투여량에 대해 나타난다.
도 7a는 유동 세포계측법 분석에서 측정된 바와 같은, CTLA-4-발현 세포에 대한 AGEN1884w-105(안정한 클론 105에 의해 생성된 AGEN1884w), 기준 항-CTLA-4 IgG1 항체 및 IgG1 이소타입 대조군의 결합을 보여주는 그래프이다. 평균 형광 강도(MFI)를 계산하고, 항체 적정에 대해 플로팅하였다. 도 7b는 스타필로코커스 엔테로톡신 A(SEA) 자극 후 AGEN1884w-105, 기준 항-CTLA-4 IgG1 항체 및 IgG1 이소타입 대조군에 의해 증강된 IL-2 생산을 시험하는 분석의 결과이다. 도 7b에서, 6개의 생물학적 복제물 및 IL-2의 배수 변화의 평균값(막대)이 도시되어 있다.
도 8a, 8b 및 8c는 각각 FcγRIIAH131(도 8a), FcγRIIB(도 8b) 및 FcγRIIIAV158(도 8c)를 발현하는 CHO 세포에 대한 항체의 투여량 적정의 결합 곡선이다. 2차 검출 항체의 평균 형광 강도(MFI)가 플로팅된다. 오차 막대는 삼중항의 표준 편차를 나타낸다. 시험된 항체는 AGEN1884w-FortiCHO, AGEN1884w-PowerCHO, AGEN2041w, 기준 항-CTLA-4 IgG1 항체 및 IgG1 이소타입 대조군 항체였다.
도 9a 및 9b는 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된 바와 같이, 인간 FcγRIIA(도 9a) 또는 인간 FcγRIIIA(도 9b)에 결합된 AGEN1884w-FortiCHO, AGEN1884w-PowerCHO, AGEN2041w 및 기준 항-CTLA-4 IgG1 항체의 항체 농도의 범위에서 3개의 샘플의 평균 반응(반응 단위, RU)을 나타내는 그래프이다.
도 10a는 Fc 감마 수용체 IIIA(FcγRIIIA) 유전자 리포터 분석의 개략도이다. 도 10b-10g는 FcγRIIIA V158 변이체 또는 FcγRIIIA F158 변이체를 발현하는 리포터 세포주를 활성화시키기 위한 AGEN1884w-105 또는 AGEN1884w(도 10b, 10c, 10f 및 10g에서 AGEN1884w-105; 도 10d 및 10e에서 AGEN1884w)의 능력이 기준 항-CTLA-4 IgG1 항체(도 10b 및 10c), AGEN2041w(도 10d 및 10e), 및 AGEN1884w N297A 변이체(도 10f 및 10g)와 비교된 리포터 분석으로부터의 결과이다. 상대 조명 단위(RLU)는 일정 범위의 항체 농도에 대해 플로팅된다.
도 11은 CTLA-4-발현 표적 세포에 항체가 결합하였을때, FcγRIIAH131 변이체를 발현하는 리포터 세포주를 활성화시키는 능력에 대하여, AGEN2041w, 기준 항-CTLA-4 IgG2 항체 및 IgG2 이소타입 대조군 항체가 시험된 리포터 분석의 결과이다. 상대 조명 단위(RLU)는 일정 범위의 항체 농도에 대해 플로팅된다.
도 12a는 유동 세포계측법 분석에서 측정된 바와 같은, CTLA-4-발현 세포에 대한 AGEN1884w-105, AGEN1884w-N297A 변이체 및 IgG1 이소타입 대조군의 결합을 나타내는 그래프이다. 평균 형광 강도(MFI)를 계산하고, 시험된 상이한 항체 농도에 대해 플로팅했다. 도 12b는 스타필로코커스 엔테로톡신 A(SEA) 자극 후 AGEN1884w-105, AGEN1884w-N297A 및 IgG1 이소타입 대조군에 의해 유도된 IL-2 생성을 시험하는 분석 결과이다. 도 12b에서, 6개의 생물학적 복제물 및 IL-2의 배수 변화의 평균값(막대)이 도시되어 있다.
도 13a 및 13b는 항-CTLA-4 항체의 길항 활성에 대한 FcR 결합 억제의 영향을 시험하는 분석으로부터의 결과이다. 도 13a에는, 7개의 생물학적 복제물 및 IL-2의 배수 변화의 평균값(막대)이 도시되어 있다. 도 13b에는, IL-2 생성물의 7개의 생물학적 복제물(pg/ml)이 도시되어 있다.
도 14는 10㎍/㎖의 AGEN1884w, AGEN1884w-N297A, AGEN1884w-S267E/L328F, AGEN1884w-S239D/A330L/I332E, AGEN2041w, IgG1 이소타입 대조군 항체, 또는 IgG2 이소타입 대조군 항체에 반응하여 스타필로코커스 엔테로톡신 A(SEA) 자극시에 인간 PBMC의 IL-2 생성을 나타낸 그래프이다. IL-2 생산의 평균값(막대)은 시험된 각 항체에 대해 도시되어 있다.
도 15는 AGEN1884w, 기준 항-CTLA-4 IgG1 항체 또는 이소타입 대조군 항체의 투여량 적정과 함께 이펙터 세포의 존재하에 표적 세포 용해율을 나타내는 그래프이다. 세포 표면 상에 CTLA-4를 구성적으로 발현시키도록 조작된 Jurkat 세포를 표적 세포로 사용하고, NK92-FcγRIIIA 세포를 이펙터 세포로 사용하였다.
도 16은 CTLA-4에 대한 CD80-Fc-His, CD86-Fc-His, 기준 항-CTLA-4 IgG1 항체 및 AGEN1884의 결합 친화도(KD)를 비교한다. Walker and Sansom Nat. Rev. Immunology 2011은 Walker and Sansom Nat. Rev. Immunol. (2011) 11(12):852-63을 인용한다. Xu et al., JI 2012는 Xu et al., J Immunol. (2012) 189(9):4470-7을 인용한다.
도 17a는 인간 CTLA-4(서열번호: 77), 사이노몰구스 원숭이 CTLA-4(서열번호: 84), 마우스 CTLA-4(서열번호: 85) 및 래트 CTLA-4(서열번호: 86)에 대한 서열 정렬이다. 점은 대응하는 인간 잔기와 동일한 잔기를 나타낸다. *(별표)는 완전히 보존된 단일 잔기가 있는 위치를 나타낸다. :(콜론)은 매우 유사한 특성을 가진 그룹 간의 보존을 나타낸다. .(마침표)는 약하게 비슷한 성질의 그룹들 사이의 보존을 나타낸다. 도 17b 및 17c는 인간 CTLA-4(서열번호: 77), 사이노몰구스 원숭이 CTLA-4(서열번호: 84), 인간 CD28(서열번호: 87), 인간 ICOS(서열번호: 88), 인간 BTLA(서열번호: 89) 및 인간 PD-1(서열번호: 90)에 대한 서열 정렬이다. 인간 CTLA-4가 AGEN1884w-Fab에 결합될 때 중수소 섭취의 강한 감소를 나타내는 두 영역은 도 17a-c에서 밑줄이 그어져 있으며: Q80VT82 및 Y135PPPYYLGIGNGTQI149이다. 도 17d는 단백질 데이터 뱅크 파일(3osk 및 1i8l)에서의 X-선 좌표의 복합 어셈블리이다. 이 복합 구조 분석은 CTLA-4 및 B7-1 클러스터의 데이지-체인 클러스터링(daisy-chain clustering)을 나타낸다. 이것은 시그널링 능력이있는 면역 복합체의 가장 간단한 올리고머 형태로 생각되는 인간 CTLA-4 이량체와 함께 인간 B7-1 이량체의 모델을 제공한다. CTLA-4와 B7-1 사이의 접촉 부위는 M134YPPPYY140 영역을 포함하지만, 이러한 특정 모티프에 한정되지는 않는다. 도 17e는 인간 CTLA-4에 대한 AGEN1884w-Fab의 결합 모델이다. 도 17a 내지 도 17e의 선행 기술에서 인용된 CTLA-4의 모든 잔기는 서열번호: 77에 따라 넘버링되어있다.
도 18a 및 18b는 사이노몰구스 원숭이에서의 T 세포 의존성 항원 반응(TDAR) 연구로부터의 결과이다. AGEN1884w(10 mg/kg), 기준 항-CTLA-4 IgG1 항체(3 mg/kg)(도 18a), AGEN2041w(10 mg/kg)(도 18b) 또는 대조군 물품(도 18a 및 18b)은 1일째 및 29일째에 HBsAg 백신과 함께 정맥내 투여(느린 볼루스)(뒷다리에 30 μg)를 통해 제공했다. 이중 샘플을 ELISA를 사용하여 항-HBsAg(IgG) 혈청 역가에 대하여 분석하였다. 데이터 포인트는 각 치료 그룹에서 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 19a 및 19b는 각각 가변 중쇄 BADD411-2354(서열번호: 7), BADD412-2356(서열번호: 38), BADD412-2357(서열번호: 39), BADD412-2358(서열번호: 40), BADD412-2359(서열번호: 41), 및 BADD412-2360(서열번호: 42), 및 가변 경쇄 BADD412-2367(서열번호: 43), BADD412-2376(서열번호: 8), BADD412-2382(서열번호: 44), BADD412-2384(서열번호: 45), BADD412-2390(서열번호: 46), 및 BADD412-2393(서열번호: 47)의 서열 정렬이다. 개시된 중쇄 및 경쇄 CDR은 Kabat에 따라 결정된다.
도 20a-20e는 서스펜션 어레이 기술에 의해 측정된 바와 같이 19개의 항-CTLA-4 항체(AGEN1884-AGEN1902)의 투여량 적정의 존재하에 CTLA-4 결합 비드에 결합하는 재조합 CD80-PE 또는 CD86-PE의 백분율을 나타내는 그래프이다.
본 섹션의 실시예는 한정의 방식이 아닌 예시의 방식으로 제공된다.
실시예 1: 항-CTLA-4 항체의 특성화
본 실시예는 인간 CTLA-4에 결합하는 항체의 특성화를 기술한다. 특히, AGEN1884로 명명된 항체는 하기 기술된 다수의 분석에서 특성화되었다. 항-CTLA-4 항체 AGEN1884는 서열번호: 93의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 항체 AGEN1884는 경쇄 불변 도메인에서 Kabat에 따라 넘버링된, T109S 치환(즉, 야생형 Fc 서열에 대해 109번 위치의 세린에 의한 트레오닌의 치환)을 함유하는 인간 IgG1 항체이며, 불변 영역에 대한 프레임내 가변 영역의 클로닝을 용이하게 한다. 이 돌연변이는 항체 결합 또는 기능에 영향을 미치지 않는 보존적 변형이다. Kabat에 따라 넘버링된 109번 위치에 트레오닌을 함유하는 AGEN1884w라고 명명된 야생형 대응물도 생성되었다. 항체 AGEN1884w는 서열번호: 93의 중쇄 및 서열번호: 13의 경쇄를 포함하는 인간 IgG1 항체이다.
1-1. 표면 플라즈몬 공명에 의한 동역학적 분석
표면 플라즈몬 공명을 사용하여 항-CTLA-4 항체 AGEN1884 및 기준 항-CTLA-4 IgG1 항체(BIAcore® T100/T200 민감성 개선 시스템(GE Healthcare) 및 Fab-포획 분석)의 친화도를 측정하였다. 모든 상호작용은 25℃에서 1×DPBS(PAA, H15-002) + P20(0.05%, Pierce, 28320)을 러닝 완충액으로 사용하여 분석하였다. 고정화 항-인간 Fab 항체(GE Healthcare, Fab Capture Kit, 28958325)를 통해 CM5 센서 칩(GE Healthcare, Series S CM5, BR-1005-30)의 칩 표면에 항-CTLA-4 항체(8 μg/ml의 러닝 버퍼)가 포획되었다. CTLA-4 항원의 비특이적 상호작용을 검출하기 위해, 항체 포획은 플로우 셀 2에서만 수행되는 반면, 플로우 셀 1에서는 포획 항체가 고정화되었다. 항-CTLA-4 항체의 포획 후, CTLA-4 항원은 유동 세포를 통해 상이한 양으로 주입되었다. 특히, 재조합 인간 CTLA-4-Fc(R&D Systems, # 7268-CT), 재조합 인간 CTLA-4(Sino Biological, # 11159-H08H), 재조합 사이노몰구스 CTLA-4-Fc(Sino Biological, # 90213-C02H), 및 재조합 사이노몰구스 CTLA-4(Sino Biological, # 90213-C08H)를 100 nM, 25 nM, 및 6.25 nM에서 수행하고; 및 재조합 마우스 CTLA-4-Fc(R&D, # 434-CT), 재조합 래트 CTLA-4-Fc(Sino Biological, # 81069-R02H), 및 재조합 래트 CTLA-4(Sino Biological, # 81069-R08H)를 400 nM, 100 nM, 및 25 nM에서 수행하였다. 빈 곡선(러닝 버퍼만)도 각 진행에 포함되었다. 10 ㎕/분의 유속으로 연합을 90초 동안 진행하고, 600초 동안 해리시켰다. 30 μl/분으로 60초 동안 10 mM 글리신 pH 2.0(GE Healthcare, BR-1003-55)으로 각 실행 후 재생 단계가 수행되었다. Rmax의 전역 적합도를 갖는 Langmuir 1:1 모델을 적용한 BIAcore® T200 평가 소프트웨어 버전 2.0.1을 사용하여 결합 곡선을 평가했다. 상기 값으로부터, 다양한 항원에 대한 AGEN1884 및 기준 항-CTLA-4 항체의 친화도(KD)를 계산하여, 도 1a에 나타내었다. 본 연구에서 사용된 재조합 모노머 사이노몰구스 CTLA-4, 마우스 CTLA-4-Fc 및 모노머 래트 CTLA-4는 품질 관리 평가에 실패했다. 50% 응집을 나타내는 재조합 마우스 CTLA-4-Fc 단백질에 대한 항-CTLA-4 항체의 결합은 비특이적 상호작용에 의한 것 같았다. 표면 플라즈몬 공명 분석은 AGEN1884w에 대해 360 nM, 120 nM, 40 nM 및 13.3 nM의 품질 관리 평가를 통과한 재조합 마우스 CTLA-4-Fc(Sino Biological, # 81069-R02H)를 사용하여 2회 반복되었다. AGEN1884w는 마우스 CTLA-4에 대하여 검출가능한 결합을 나타내지 않았다.
1-2. CTLA-4를 과발현하는 세포에 결합하는 항체
10% FBS(Gemini Bio Products), 100㎍/ml 하이그로마이신 B(Gibco) 및 500 ㎍/ml G418(Promega)을 함유하는 RPMI1640(Life Technologies)에서 인간 CTLA-4를 과발현하는 Jurkat 세포(Promega)를 유지하였다. 항체로 염색하기 전에, 세포를 FACS 완충액(2% FBS 함유 PBS)에서 1회 세척하였다. 10㎍/ml에서 시작하는, AGEN1884w, 기준 항-CTLA-4 IgG1 항체 및 IgG1 이소타입 대조군의 연속 희석액을 100㎕ 부피의 96-웰 둥근 바닥 플레이트 상의 이중 웰에 첨가하고, 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 세포를 150 μl FACS 완충액으로 3회 세척하고, 4℃에서 30분 동안, 0.25 μl PE 접합된 마우스 항-인간 카파 항체(Invitrogen)를 함유하는 100 μl FACS 완충액으로 염색하였다. 이어서, 세포를 2회 세척하고, 100㎕ FACS 완충액에 재현탁시켰다. 샘플은 LSRFortessa(BD Biosciences)에서 구입하였다. 평균 형광 강도(MFI)는 FlowJo 소프트웨어(FlowJo, LLC)를 사용하여 분석하고, Prism 6(GraphPad Software)을 사용하여 플로팅했다. 도 1b에 도시된 바와 같이, 항체 AGEN1884w는 Jurkat 세포의 표면 상에 발현된 인간 CTLA-4에 결합하였다.
1-3. CTLA-4 항체 선택도 분석
CTLA-4에 대한 AGEN1884의 선택도를 멀티플렉스 분석으로서 서스펜션 어레이 기술을 사용하여 면역글로불린 슈퍼패밀리의 다른 구성원에 대하여 평가하였다. 표준 NHS-에스테르 화학을 사용하여, 다수의 면역글로불린 슈퍼패밀리 구성원을 Luminex® 마이크로스피어에 화학적으로 결합시켰다. AGEN1884, 기준 항-CTLA-4 IgG1 항체 및 IgG1 이소타입 대조군의 정제 물질을 분석 완충액(Roche 11112589001)에서 10 ng/ml, 100 ng/ml 및 1000 ng/ml로 희석하였다. 간단히 말하면, 각 희석액 25 μl를 96 하프-웰(half-well) 필터 플레이트(Millipore, MABVN1250)에서 1시간 동안 5 μl 분석 완충액에서 1500 Luminex® 마이크로스피어와 함께 암실(20℃, 650 rpm)에서 배양하였다. Luminex® 마이크로스피어는 COOH 비드 표면과의 아민 커플링을 통해 재조합 인간 CTLA-4-Fc(R&D Systems, # 7268-CT), 재조합 사이노몰구스 CTLA-4-Fc(Sino Biological, # 90213-C02H), rhCD28-Fc(R&D, # 342-CD-200), rhICOS-Fc(R&D, # 169-CS-050), rhBTLA-Fc(Sino Biological, # 11896-H02H), rhPD-1-Fc(R&D Systems, # 1086-PD), 또는 재조합 사이노몰구스 PD-1-Fc(사내에서 생산됨)와 커플링되었다. 1:3 희석 시리즈(0.08-540 ng/ml)의 인간 IgG1 표준(Sigma, I5154) 25 μl의 복제본을 사용하여 표준 곡선이 생성되었다. R-PE(2.5 μg/ml; JIR 109-116-098, AbDSerotec Rapid RPE Antibody Conjugation Kit, LNK022RPE)로 표지된 염소 항-인간 IgG F(ab)2 60 μl와 추가 1시간의 배양시간(20℃, 650 rpm)을 사용하여 검출을 수행하였다. Luminex® 200 시스템(Millipore)을 사용하여 플레이트를 분석하였다. 총 100개의 비드를 48 μl 샘플 체적에서 1웰당 계수하였다. 상기 언급된 재조합 단백질에 대한 특이적 또는 비특이적 결합을 측정하기 위해, PE MFI 값을 사용하였다.
도 1c 및 1d에 도시된 바와 같이, 항체 AGEN1884는 인간 및 사이노몰구스 CTLA-4에 대한 특이적 결합을 입증하였다. 시험한 농도에서 다른 나열된 면역글로불린 슈퍼패밀리 구성원에 대한 유의미한 결합이 관찰되지 않았다.
1-4. 활성화된 T 세포에 의해 발현된 CTLA-4에 대한 항체 결합
다음으로, 활성화된 인간 T 세포의 표면 상에 발현된 CTLA-4에 대한 AGEN1884w의 결합을 조사하였다. 건강한 공여체 백혈구연층(donor buffy coat)(Research Blood Components, LLC)으로부터 Ficoll 구배 밀도 분리를 통해 분리된 인간 PBMC를 마그네틱 비드(Stemcell Technologies)를 사용하여 본래 그대로의 CD4+ T 세포에 대해 농축시켰다. 10% 인간 AB 혈청(Sigma)을 1×106/ml로 보충한 RPMI1640 배지에 CD4+ T 세포의 풍부한 개체군을 재현탁했다. 100 ㎕ 중의 1×105개의 세포를 항-CD3 항체(3 ㎍/ml, BD Biosciences) 및 항-CD28 항체(10 ㎍/ml, BD Biosciences)로 미리-코팅된 평평한 바닥 96 웰 플레이트의 각 웰에 접종하고, 37℃ 및 5% CO2에서 배양하였다. 5일째에, 뮤즈 세포분석기(Muse Cell Analyzer)(EMD Millipore)를 사용하여 세포를 풀링하고, 계수하였다. 10 μg/ml에서 시작하여 96-웰 둥근 바닥 플레이트 상에서 연속 희석된, 100 μL의 AGEN1884w, 기준 항-CTLA-4 IgG1 항체 및 IgG1 이소타입 대조군으로 4℃에서 30분 동안 50,000개의 세포를 염색하였다. 세포를 150 μl FACS 완충액으로 3회 세척하고, 0.25 μl PE 마우스 항-인간 카파 항체(Invitrogen) 및 1 μl의 APC-CD4(BD Bioscience)를 함유하는 100 μl FACS 완충액으로 4℃에서 30분 동안 염색하였다. 이어서, 세포를 2회 세척하고, 100㎕의 FACS 완충액에 재현탁시켰다. 샘플은 FACSCanto II System(BD Biosciences)에서 얻었다. CD4+ T 세포에서 PE의 평균 형광 강도(MFI)를 FlowJo 소프트웨어(FlowJo, LLC)를 사용하여 분석하였다. 도 2a에 도시된 바와 같이, AGEN1884w는 활성화된 인간 CD4+ T 세포의 표면 상에 발현된 CTLA-4에 결합하였다.
사이노몰구스(마카카 파시큘라리스(Macaca fascicularis)) CTLA-4에 대한 항체 AGEN1884의 결합 특성을 유동 세포계측법 분석에 의해 분석하였다. 10% 소태아혈청, 10mM HEPES 및 1X Pen/Strep-글루타민이 보충된 RPMI-1640 배지에서 3일 동안 50 U/ml IL-2(BioLegend, 589106)의 존재하에 37℃ 및 5% CO2에서 피콜(ficoll) 구배를 통해 분리된 사이노몰구스 PBMCs(Biomedical Primate Research Center, Netherlands)를 플레이트-결합된 8 μg/ml 항-CD3(BD, 557052) 및 0.1 μg/ml 항-CD28 항체(eBioscience, Cat. 16-0289-85)를 사용하여 활성화시켰다. 활성화 후, 세포를 FACS 완충액(2% FBS 함유 PBS)에서 1:100으로 희석한 항-CD8a 항체(eBioscience, 9043-0087-120)와 함께 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척하고, 제조사의 프로토콜에 따라 BD Bioscience Kit(51-2090KZ)의 Cytofix/Cytoperm 과정에 적용하였다. 9 내지 0.037 μg/ml의 AGEN1884, 기준 항-CTLA-4 IgG1 항체 및 IgG1 이소타입 대조군을 1:3으로 순차적으로 희석하여 세포에 적용하였다. 샘플을 200㎕의 FACS 완충액에 현탁시키고, FACS Diva 유동 세포계수기(BD Biosciences)를 사용하여 분석하였다. 세포내 염색에 사용된 경우, 항-CTLA-4 항체 AGEN1884는 활성화된 사이노몰구스 CD8+ T 세포에 대한 결합을 나타냈다(도 2b).
또한, 인간, 사이노몰구스 원숭이(인도차이나), 래트 또는 마우스로부터의 말초 혈액 단핵 세포(PBMCs)를 96-웰 둥근 바닥 조직 배양 플레이트(1×105 세포/웰)의 웰에 분주하고, 10% 소태아혈청, 15 mM HEPES, 100 IU/ml 페니실린, 100 mg/ml 스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민, 100 IU/ml IL-2(Peprotech) 및 1 μg/ml 파이노헤마글루티닌(PHA)(Roche)을 보충한 RPMI-1640에서 37℃ 및 5% CO2에서 4일동안 자극하였다. 자극 후, 세포를 세척하고, 5% 열-불활성화된 인간 AB 혈청(Sigma-Aldrich)을 첨가하여 Fc 수용체를 차단하고, 항체의 비특이적 결합을 방지하였다. 세포를 다시 세척하고, 희석된 APC-접합된 항-CD4 항체(클론 OKT4, GK15 또는 W3/25; Biolegend) 100㎕ 중에 재현탁시켰다. 암실에서 45분 동안 배양한 후, 세포를 3회 세척하고, 제조사의 지시에 따라 FoxP3/전사 인자 염색 완충액 세트(eBioscience)를 사용하여 투과성화하였다. 투과성화(permeabilization) 후, 세포를 4℃ 암실에서 45분 동안 0.00003 μg/ml 내지 10 μg/ml 범위의 형광 표지된(Pacific Blue™) AGEN1884w 또는 이소타입 대조군 항체의 연속 희석액과 함께 배양하였다. 세포를 Becton Dickinson LSRFortessa™를 사용하여 유동 세포계측법 분석 전에 2회 세척하였다. FlowJo 소프트웨어(버전 10)를 사용하여 데이터를 분석했다. 도 2c에 도시된 바와 같이, 항체 AGEN1884w는 PHA-자극된 CD4+ 인간 및 사이노몰구스 T 세포에 결합하였지만, 래트 또는 마우스 T 세포에는 결합하지 않았다.
1-5. 리간드 차단 활동
항-CTLA-4 항체가 리간드 CD80 및 CD86의 결합을 차단하는지 여부를 측정하기 위해, 서스펜션 어레이 기술(도 3a에 도시된 개략도)을 사용하여 랭킹 분석 설정을 수행하였다. 5㎕ 분석 완충액 중 1200개의 Luminex® 비드(Luminex Corp, #14 LC10014-01)를 96-웰 하프-영역 플레이트(Corning, Inc., 3884)의 각 웰에 첨가하였다. 비드를 COOH 비드 표면과의 아민 커플링을 통해 CTLA-4 항원(rhCTLA-4-Fc, R&D, # 7268-CT)과 커플링하였다. 50 μg/ml의 CTLA-4 항원 및 1×107 Luminex 비드/ml를 사용하여 커플링 반응을 수행하였다. 표준 NHS 에스테르 화학을 사용하여, 항원의 1차 아민기와 비드 표면 상의 카르복실기기 사이에 카르보디이미드 결합을 형성하는데 사용되었다(Luminex Xmap cookbook chapter 3).
단백질에 대한 항원 커플링은 설포-NHS(N-히드록시설포숙신이미드)의 존재하에 EDC(1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 히드로클로라이드) 시약으로 마이크로스피어 카르복실기를 먼저 활성화시켜 설포-NHS-에스테르 중간체를 형성하는 동안의 간단한 2-단계 카르보디이미드 과정이다. 이어서, 반응성 중간체는 표적 분자(항체, 단백질 또는 펩타이드)의 1차 아민과의 반응으로 치환되어, 공유 아미드 결합을 형성한다. 결합된 비드를 20℃ 및 650 rpm에서 1시간 동안 다른 농도의 항-CTLA-4 항체(비드를 첨가하기 전에 웰 당 25 μl 분석 완충액에서 9000 ng/ml 내지 12 ng/ml의 농도)와 함께 배양하였다. 시험된 항-CTLA-4 항체는 AGEN1884, 기준 항-CTLA-4 IgG1 항체 및 IgG1 이소타입 대조군 항체이다. 이후 1 nM 농도의 R-PE 표지된 CD-80(R&D Systems, # 140-B1) 또는 CD86(R&D Systems, # 141-B2) 30μl를 각 웰에 첨가하여, 60 ㎕의 총 웰 부피를 제공했다(웰 당 1200개의 비드 및 표지된 CD80 또는 CD86의 최종 농도 0.5 nM). 리간드의 라벨링은 제조사의 프로토콜에 따라 R-PE 라벨링 키트(AbDSerotec, LYNX 래피드 RPE 항체 접합 키트, LNK023RPE)를 사용하여 사내에서 이루어졌다. Luminex® 200 시스템(Millipore)을 사용하여 플레이트를 분석하였다. 100개의 비드를 50 μl 샘플 용량으로 1 웰당 계수하였다. 리간드 차단 잠재력은 리간드 단독 대조군의 비경쟁 신호(100% 결합)의 MFI 값을 사용하여 계산하였다. PE 검출가능 신호는 항원에 대한 리간드 결합을 나타내었다. AGEN1884는 56 ng/ml의 추정된 IC50으로 CTLA-4에 대한 CD80(도 3b) 및 CD86(도 3c)의 결합을 억제하였다.
다음으로, 세포-표면 발현된 CTLA-4에 대한 재조합 CD80-Fc 및 CD86-Fc의 결합을 차단하는 항-CTLA-4 항체의 능력을 시험하였다. 간단히 말하면, CTLA-4 발현 T 세포(Jurkat)를 증가하는 농도의 AGEN1884w, 기준 항-CTLA-4 IgG1 항체 또는 IgG1 이소타입 대조군 항체(0, 0.001, 0.004, 0.012, 0.037, 0.11, 0.33, 0.99 및 2.96 μg/ml), 이어서 고정 농도(0.625 μg/ml)의 형광 표지된 CD80-Fc 또는 CD86-Fc와 함께 배양하였다. CD80-Fc 또는 CD86-Fc에 의해 결합된 세포의 백분율은 유동 세포계측법에 의해 측정되었다. 도 3d에 도시된 바와 같이, AGEN1884w 및 기준 항-CTLA-4 IgG1 항체는 CTLA-4를 발현하는 Jurkat 세포에 대한 CD80-Fc 및 CD86-Fc의 결합을 억제하였다.
또한, 항-CTLA-4 항체 AGEN1884w를 세포 표면 발현된 CTLA-4 및 재조합 CD80 또는 CD86의 예비-형성된 복합체를 파괴시키는 능력에 대해 시험하였다. 간단히 말해, 세포 표면에서 CTLA-4를 구성적으로 발현하도록 조작된 Jurkat 세포를 연속 희석된 CD80-Fc 또는 CD86-Fc(R&D Systems)(10 내지 0.0002 μg/ml)와 함께 4℃의 96-웰 둥근 바닥 플레이트에서 30분 동안 배양하였다. 세척 후, 고정 농도(67 nM)의 형광 표지된 (PerCP-CY5.5) AGEN1884w 또는 기준 항-CTLA-4 IgG1 항체를 첨가하고, 플레이트를 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 플레이트를 다시 세척하고, 세포를 PBS 중의 1% 파라포름알데히드(Alfa Aear) 100 μl에 재현탁시켰다. Becton Dickinson FACSCanto™ 유동 세포계측기를 사용하여 샘플을 분석하고, FlowJo 소프트웨어(버전 10)를 사용하여 데이터를 분석했다. 항체 AGEN1884w는 CTLA-4 및 CD80 또는 CD86의 미리-형성된 복합체를 투여량 의존 방식으로 파괴시켰다(도 3e).
1-6. 스타필로코커스 엔테로톡신 A(SEA) 자극 후 인간 T-세포에 항-CTLA-4 항체가 미치는 효과
1차 인간 T 세포에 대한 항-CTLA-4 항체의 기능적 활성을 스타필로코커스 엔테로톡신 A(SEA) 자극 후에 평가하였다. 페니실린, 스트렙토마이신 및 10% FBS(Hyclone)가 보충된 RPMI1640에 동결보존된 PBMC(105 세포/웰)를 96-웰 NUNCLON 델타 표면 플레이트(NUNCTM)에 첨가하였다. 증가하는 항체 농도 3.2, 16, 80, 400, 2000, 10000, 50000 ng/ml 및 100 ng/ml의 SEA(Toxin Technologies)의 존재하에, 37℃, 5% CO2, 97% 습도에서 5일간 세포를 배양하였다. 시험된 항체는 AGEN1884w, 기준 항-CTLA-4 IgG1 항체 및 IgG1 이소타입 대조군이었다. 정화된 상등액을 수집하여 분석할 때까지 -80℃에서 보관하였다. IL-2의 역가는 전기화학발광(electrochemiluminescence, MSD)에 의해 생성되었다.
도 4a에 나타낸 바와 같이, AGEN1884w는 SEA 자극의 존재하에 T 세포의 IL-2 생산을 증가시켰다.
1-7. 항-CTLA-4 항체가 IL-2-루시퍼라제 리포터 세포주에 미치는 효과
IL-2-루시퍼라제 리포터 분석을 사용하여, 항-CTLA-4 항체 AGEN1884w의 기능적 활성을 추가로 분석하였다. 간단히 말하면, CD28을 내인성으로 발현하는 인간 T 세포주(Jurkat)는 세포 표면 CTLA-4 및 IL-2 프로모터에 의해 구동되는 루시퍼라제 리포터 유전자를 구성적으로 발현하도록 조작되었다. 조작된 Jurkat 세포주를 CD80 및 CD86을 발현하는 항원 제시 세포주(Raji)와 함께 배양하였다. 마우스 항-인간 CD3 항체 및 염소 항-마우스 IgG(H+L) 항체에 의해 T 세포 수용체(TCR) 트리거링(triggering)(신호 1)을 달성하였으며; 및 Raji 세포 상에서 발현되는 CD80 및 CD86에 의해 보조자극 신호전달(신호 2)을 트랜스로 제공하였다. Raji 세포 상에서의 CD80과 CD86의 발현은 유동 세포계측법(도 4b)에 의해 확인되었다. Jurkat T 세포주 상에서의 TCR 가교결합은 T 세포 활성화를 위한 대리 표지자인 루시퍼라제 생산을 유도하는 IL-2 발현을 유발하였다. 이 두 세포주의 공동 배양은 억제성 공동-수용체 CTLA-4(Jurkat 세포상에서 발현됨)를 T 세포 활성화를 억제하는 천연 리간드 CD80 및 CD86(Raji 세포에서 발현됨)과 연결시켰으며, 이는 루시퍼라제 발현의 부족에 의해 입증된다. 이 억제는 AGEN1884w가 CTLA-4와 그의 리간드 CD80 및 CD86의 상호작용을 차단하고, 상기 리간드의 상호자극적 T 세포 동시-수용체 CD28과의 상호작용을 이동시킴으로써 증가하는 농도의 AGEN1884w(0 내지 300 ㎍/ml) 첨가시에 완화되었다. 루시퍼라제 발현은 Bio-GloTM 시약을 사용하여 정량화하였으며, 결과 데이터를 사용하여, 최대 배수 응답값(IgG1 이소타입 대조군 항체와 비교하여 AGEN1884w로 배 증가)을 측정하였다.
도 4c에 도시된 바와 같이, 항-CTLA-4 항체 AGEN1884w는 IL-2-루시퍼라제 리포터 분석에서 T 세포의 CTLA-4 매개된 저해를 투여량-의존적으로 해제하였다.
1-8. 항-CTLA-4 항체의 작용제 활성의 결여
CTLA-4 순방향 신호전달을 매개하는 AGEN1884w의 잠재성을 평가하였다. Miltenyi Pan T 세포 마이크로비드 키트를 사용하여 말초 혈액 단핵 세포로부터 1차 CD3-발현 인간 T 세포를 분리하고, 플레이트-결합된 항 CD3 항체(클론 SP34, 10 ㎍/ml)와 함께 배양하여 TCR 신호전달을 활성화시켰다. AGEN1884w 또는 IgG1 이소타입 대조군 항체는 가용성 또는 플레이트-결합된 포맷(0.003 내지 50 μg/ml) 중 하나에 TCR 활성화의 맥락에서 포함되었다. Brefeldin A(BD GolgiPlug™)와의 배양 4일 및 최종 6시간 배양후, 항-CD3 항체(APC Cy7, 클론 SP34), 항-CD8 항체(PE Cy7, 클론 SK1) 및 항-CD4 항체(PercP Cy5.5, 클론 L200)를 포함하는 표면 계통 마커에 대한 형광색소 결합된 항체로 세포를 염색한 후, Cytofix-Cytoperm™(Beckton Dickinson)으로 세포를 투과성화하였다. 세포내 사이토카인 생산을 평가하기 위해, 항-IFNγ 항체(Alexa fluor 647, 클론 B27) 및 항-TNFα 항체(PE, 클론 Mab11)로 세포를 염색하였다. FACSCanto II를 사용하여 유동 세포계측법 분석을 위해 세포를 획득하고, Flowjo 버전 10에 의해 데이터 분석을 수행했다.
가용성(도 4d) 또는 플레이트-결합된(도 4e) AGEN1884w의 농도 증가는 IgG1 이소타입 대조군 항체와 비교하여 CD8+IFNγ+T 세포의 백분율에 영향을 미치지 않았다. 50 μg/ml의 높은 농도에서 AGEN1884w는 CTLA-4 작용제 항체로 작용하지 않았다.
1-9. 항-LAG-3 항체 또는 항-PD-1 항체와의 조합
다음으로, 스타필로코커스 엔테로톡신 A(SEA)로 차선으로 자극된 PBMC를 사용하여 항-CTLA-4 항체 AGEN1884w를 항-LAG-3 길항제 항체 또는 항-PD-1 길항제 항체와의 상승 작용에 대하여 시험하였다. 간단하게 말하면, 96-웰 NUNCLON 델타 표면 플레이트(NUNC™)내 NormocinTM(Invivogen #ant-nr) 및 10% 열-불활성화된 FBS(Gibco, Invitrogen Corporation)가 보충된 RPMI1640에 105 세포/웰로 저온보존된 인간 PBMC(연구 혈액 성분)를 플레이팅하였다. 5 μg/ml 항-LAG-3 IgG1 항체 AGEN1746, 니볼루맙(Nivolumab)(lot AAB5719, Myoderm), 펨브롤리주맙(lot 7002688300, Myoderm), IgG1 이소타입 대조군, 또는 IgG4 이소타입 대조군과 함께 10 μg/ml 용해성 AGEN1884w 또는 IgG1 이소타입 대조군의 존재하에 37℃, 5% CO2 및 97% 습도에서 5일간 세포를 100 ng/ml SEA(Toxin Technologies))와 함께 배양하였다. 시험된 항체 및 각각의 농도는 도 4f에 도시되어 있다. 이 분석에 사용된 항-LAG-3 항체 AGEN1746은 미국 출원 공개번호 US 2011/0150892(본원에 참고로 인용됨)에 제공된 항체 25F7의 가변 영역에 기초하여 생성되었다. AGEN1746은 서열번호: 91의 아미노산 서열의 중쇄 및 서열번호: 92의 아미노산 서열의 경쇄를 포함한다(표 8). 정화된 상등액을 수집하여 분석할 때까지 -80℃에서 보관하였다. AlphaLISA(Perkin Elmer)를 사용하여 IL-2 사이토킨을 검출하였다. IL-2 농도의 평균 및 표준 편차를 계산하였다.
Figure pat00018
도 4f에 도시된 바와 같이, 항-CTLA-4 항체 AGEN1884w와 항-LAG-3 항체 AGEN1746, 항-PD-1 항체 니볼루맙 또는 항-PD-1 항체 펨브롤리주맙의 조합은 단일-제제 치료하면서 SEA 초항원에 의해 차선으로 자극된 PBBC로부터의 IL-2 생산을 높였다.
실시예 2: 항-CTLA-4 항체와 IgG 1 또는 IgG 2 불변 영역의 비교
본 실시예에서, 인간 IgG1 항체인 AGEN1884w는 인간 IgG2 항체, AGEN2041w로 전환되었다. 항체 AGEN2041w는 AGEN1884w와 동일한 중쇄 가변 영역 및 동일한 경쇄를 공유하지만, 인간 IgG2 불변 영역을 포함한다. 항체 AGEN2041w는 서열번호: 94의 중쇄 서열 및 서열번호: 13의 경쇄 서열을 포함한다.
또한, 돌연변이된 Fc 영역을 갖는 다수의 AGEN1884w를 시험하여 항-CTLA-4 항체의 길항 활성에 대한 FcγR 상호작용의 영향을 조사하였다. AGEN1884w-N297A는 서열번호: 95의 중쇄 서열 및 서열번호: 13의 경쇄 서열을 포함한다. AGEN1884w-S267E/L328F는 서열번호: 96의 중쇄 서열 및 서열번호: 13의 경쇄 서열을 포함한다. AGEN1884w-S239D/A330L/I332E는 서열번호: 97의 중쇄 서열 및 서열번호: 13의 경쇄 서열을 포함한다. 모든 잔기는 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다.
2-1. IgG 2 불변 영역을 갖는 항-CTLA-4 항체의 결합, 리간드 차단 및 선택도 분석
항-CTLA-4 항체 AGEN2041w, 기준 항-CTLA-4 IgG1 항체 및 기준 항-CTLA-4 IgG2 항체의 친화도를 섹션 1-1.에 기술된 바와 같이 표면 플라즈몬 공명에 의해 분석하였다. 시험된 CTLA-4 항원은 재조합 인간 CTLA-4-Fc(R&D Systems, # 7268-CT), 재조합 인간 CTLA-4(Sino Biological, # 11159-H08H), 재조합 사이노몰구스 CTLA-4-Fc(Sino Biological, # 90213-C02H), 및 재조합 사이노몰구스 CTLA-4(Sino Biological, # 90213-C08H)였다. 친화도 값을 도 5a에 나타내었다.
다음으로, 인간 CTLA-4를 과발현하는 Jurkat 세포에 대한 AGEN2041w의 결합을 섹션 1-2.에 기술된 분석과 유사한 유동 세포계측법 분석에서 분석하였다. 간단히 말하면, 인간 CTLA-4(Promega)를 과발현하는 Jurkat 세포를 먼저 AGEN2041w, 기준 CTLA-4 IgG2 항체 또는 IgG2 이소타입 대조군의 순차 희석에 의해, 및 이어서 APC-접합된 마우스 항-인간 카파 항체(Invitrogen)로 염색하였다. 샘플을 FACSCanto II(BD Biosciences)에서 수득하고, FlowJo 소프트웨어(FlowJo, LLC)를 사용하여 평균 형광 강도(MFI)를 분석하였다. AGEN2041w는 인간 CTLA-4를 과발현하는 Jurkat 세포에 결합하였다(도 5b).
AGEN2041w, 기준 항-CTLA-4 IgG2 항체 및 IgG2 이소타입 대조군의 리간드 차단 활성을 섹션 1-5.에서 기술된 바와 같은 서스펜션 어레이 기술을 사용하여 조사하였다. 도 5c에 도시된 바와 같이, AGEN2041w는 CTLA-4에 대한 CD80 및 CD86의 결합을 억제하였다.
AGEN2041w 및 기준-항-CTLA-4 IgG2 항체의 선택도를 섹션 1-3.에서 기술된 바와 같이 서스펜션 어레이 기술을 사용하여 IgG2 이소타입 대조군 항체와 비교하였다. 도 5d 및 5e에 도시된 바와 같이, AGEN2041w는 인간 및 사이노몰구스 CTLA-4에 특이적으로 결합한다. 관련 계열 구성원(재조합 인간 CD28, ICOS, BTLA 및 PD-1; 및 재조합 사이노몰구스 PD-1)에 대한 중요한 결합은 관찰되지 않았다.
2-2. 스타필로코커스 엔테로톡신 A(SEA) 자극 후 인간 T-세포에 대한 IgG 1 또는 IgG 2 불변 영역을 갖는 항-CTLA-4 항체의 효과
IL-2의 유도를 위한 1차 인간 PBMC 분석에서 항-CTLA-4 항체 AGEN1884w 및 AGEN2041w의 기능적 활성을 시험하였다. 섹션 1-6.에 기술된대로 분석을 수행하였다. 간단히 말하면, 0.016, 0.08, 0.4, 2.0, 10, 50 및 250 μg/ml 및 100 ng/ml의 SEA(Toxin Technologies)의 증가하는 항체 농도의 존재하에 인간 PBMC를 5일 동안 배양하였다. 시험된 항체는 항-CTLA-4 항체 AGEN1884w 및 AGEN2041w, IgG1 이소타입 대조군 및 IgG2 이소타입 대조군이었다. IL-2의 역가는 전기화학발광법(electrochemiluminescence, MSD)에 의해 측정하였다.
도 6a에 도시된 바와 같이, AGEN1884w 및 AGEN2041w는 모두 SEA 자극 후 IL-2 생성을 자극하였다.
2-3. IgG 2 불변 영역을 갖는 항-CTLA-4 항체의 IL-2-루시퍼라제 리포터 세포주에 대한 효과
다음으로, 상기한 것과 유사한 IL-2-루시퍼라제 리포터 분석법을 사용하여 항-CTLA-4 항체 AGEN2041w의 기능적 활성을 평가하였다. 요컨대, IL-2 프로모터의 하류에 표면 CTLA-4 및 루시퍼라제 리포터 유전자를 발현하도록 유전적으로 조작된 T 세포(Jurkat)를 증가하는 농도의 AGEN2041w 또는 IgG2 이소타입 대조군을 함유하는 웰에 첨가하였다. 이어서, CD80 및 CD86을 내인성으로 발현하고, "T 세포 활성화제"를 발현하도록 유전자 조작된 Raji 세포를 세포 배양물에 첨가하였다. "T 세포 활성화제"는 T 세포 활성화를 유도하는 항원 독립적 방식으로 T 세포 수용체(TCR)에 결합하는 독점적인 세포 표면 수용체이다. 유전적으로 조작된 Jurkat 세포주에서 TCR을 자극하면 루시퍼라제 생산을 유도하는 IL-2 발현이 유발된다. 이 분석에 AGEN2041w를 첨가하면, CTLA-4(Jurkat 세포에서 발현됨)와 그의 천연 리간드가 CD80 및 CD86(Raji 세포에서 발현됨)의 결합을 차단시켜, 루시퍼라제 생산을 증강시킨다. Bio-GloTM을 사용하여 루시퍼라제 농도를 정량하고, 결과 데이터를 사용하여 최대 배수 응답 값을 측정하였다(항체가 없는 기저 루시퍼라제 활성과 비교하여 AGEN2041w에 의해 배 증가).
도 6b에 도시된 바와 같이, AGEN2041w의 농도를 증가시키면 투여량-의존적인 방식으로 T 세포 활성화가 개선되었다. 대조적으로, IgG2 이소타입 대조군은 시험된 최고 농도에서도 루시퍼라제 발현을 증진시키지 않았다.
2-4. 안정한 클론에 의해 생산된 AGEN1884w의 특성화
본 실시예에서, 안정한 클론 105에 의해 생성된 AGEN1884w(AGEN1884w-105)를 세포-표면 발현 CTLA-4에 대한 결합 및 1차 인간 PBMC 분석에서의 기능적 활성에 대해 조사하였다.
인간 CTLA-4를 과발현하는 Jurkat 세포에 대한 AGEN1884w-105의 결합은 섹션 1-2.에 기술된 분석과 유사한 유동 세포계측법 분석에서 분석되었다. 간단히 말하면, 인간 CTLA-4를 과다 발현하는 Jurkat 세포(Promega)를 AGEN1884w-105, 기준 항-CTLA-4 IgG1 항체 또는 IgG1 이소타입 대조군의 연속 희석에 의해, 및 이어서 PE-접합된 마우스 항-인간 카파 항체(Invitrogen)에 의해 먼저 염색하였다. 샘플을 FACSCanto II(BD Biosciences)에서 수득하고, FlowJo 소프트웨어(FlowJo, LLC)를 사용하여 평균 형광 강도(MFI)를 분석하였다. AGEN1884w-105는 인간 CTLA-4를 과발현하는 Jurkat 세포에 결합하였다(도 7a).
IL-2 생성을 유도하는 AGEN1884w-105의 능력을 섹션 1-6.에 기술된 분석과 유사한 분석으로 조사하였다. 간단히 말하면, 100 ng/ml의 SEA(Toxin Technologies) 및 20 μg/ml의 AGEN1884w-105, 기준 항-CTLA-4 IgG1 항체 또는 IgG1 이소타입 대조군의 존재하에 인간 PBMC를 5일 동안 배양하였다. 전기화학발광법(MSD)에 의해 IL-2의 역가를 측정하였다. 도 7b에 도시된 바와 같이, AGEN1884w-105는 SEA 자극 후 IL-2 생성을 유도하였다.
2-5. 표면-발현된 Fc 감마 수용체에 대한 항-CTLA-4 항체의 결합
CHO 세포의 표면 상에 발현된 인간 FcγRIIA, FcγRIIB 및 FcγRIIIA에 대한 항-CTLA-4 항체의 결합을 유세포 분석에 의해 측정하였다. 간단히 말하면, 인간 FcγRIIAH131, FcγRIIB 또는 FcγRIIIAV158을 코딩하는 cDNA로 CHO 세포를 형질 감염시켜, 다음 CHO 세포주: rCHO-huFcγRIIA+, rCHO-huFcγRIIB+ 및 rCHO-huFcγRIIIA+를 생성시켰다. 0.0056-1000 μg/ml 범위의 항체의 투여량 적정의 결합을 수행하고, 파이코에리트린(PE)(Jackson Immune Research)과 접합된 항-인간 F(ab') 2차 항체에 의해 1차 항체를 검출하였다. 샘플을 유동 세포계측법으로 시험하고, PE 평균 형광 강도(MFI) 값을 분석하고, 결합 곡선을 생성하는데 사용하였다. 시험된 항체는 AGEN1884w, AGEN2041w, 기준 항-CTLA-4 IgG1 항체 및 IgG1 이소타입 대조군 항체였다. 본 연구에서는 2개의 다른 성장 매질: Life Technologies Inc.제 성장 매질 CD FortiCHO™/Thermo(AGEN1884w-FortiCHO) 및 Lonza제 성장 매질 PowerCHO™ 2(AGEN1884w-FowerCHO)를 사용하여, AGEN1884w를 생성하였다. 기준 항-CTLA-4 IgG1 항체는 AGEN1884w의 것과는 다른 IgG1 알로타입을 함유한다. IgG1 이소타입 대조군 항체는 1000㎍/ml에서만 시험하였다.
도 8a에 도시된 바와 같이, AGEN1884w-FortiCHO, AGEN1884w-PowerCHO 및 AGEN2041w는 기준 항-CTLA-4 IgG1 항체보다 더 개선된, FcγRIIAH131-발현 세포에 대한 결합을 나타냈다. 유사하게, FcγRIIB-발현 세포에 대한 AGEN1884w-PowerCHO 및 AGEN1884w-FortiCHO의 결합은 기준 항-CTLA-4 IgG1 항체(도 8b)의 결합보다 더 강했다. 모든 IgG1 항체, AGEN1884w-FortiCHO, AGEN1884w-PowerCHO 및 기준 항-CTLA-4 IgG1 항체는 세포 표면 상에 발현된 FcγRIIIAV158에 유사하게 결합하였다(도 8c). AGEN2041w는 IgG1 항체보다 더 약한, FcγRIIB(도 8b) 및 FcγRIIIAV158(도 8c)에 대한 결합을 나타냈다.
2-6. 재조합 Fc 감마 수용체에 대한 항-CTLA-4 항체의 결합
인간 FcγRIIA 및 FcγRIIIA에 대한 항-CTLA-4 항체, AGEN1884w-FortiCHO, AGEN1884w-PowerCHO, AGEN2041w 및 기준 항-CTLA-4 IgG1 항체의 결합을 표면 플라즈몬 공명(BIAcore® 3000)을 사용하여 측정하였다.
FcγRIIA와의 결합을 위해, 표준 아민 화학을 사용하여 CM5 칩에 직접 고정화 방법을 적용하였다. 재조합 인간 FcγRIIA-His 단백질을 10μg/ml의 농도로 소듐 아세테이트 용액, pH 4.0으로 희석하고, 5㎕/분의 유속으로 8분의 주입을 사용하여 유동 세포 2 및 4에 고정시켰다. 기준 유동 세포로서 사용된 유동 세포 1 및 3은 허위결합(sham-coupled)되었으며, 즉, FcγRIIA없이 유동 세포 2 및 4에서와 같이 유동 세포 상에서 아민 커플링 제제가 러닝되었다. 각 유동 세포에 대해 HBS-EP Biacore 러닝 완충액 중 1mg/ml의 트라스투주맙을 사용하여 100㎕/분의 유속으로 0.5분 주입하는동안, 고정화된 FcγRIIA 표면의 성능을 시험하였다.
FcγRIIIA와의 결합을 위해, 고정화된 항-테트라 His 항체를 통해 CM5 칩에 캡쳐 방법을 수행하였다. 마우스 항-His 항체를 10μg/ml의 농도로 소듐 아세테이트 용액, pH 5.0에서 희석하고, 표준 아민 화학을 통해 10㎕/분의 유속으로 5분 주입을 사용하여 4개의 모든 유동 세포에 고정시켰다. FcγRIIIA-His의 용액을 5 ㎕/분의 유속으로 2분 동안 1 ㎍/ml의 농도로 주입함으로써 재조합 인간 FcγRIIIA-His 단백질을 칩 표면에 포획하였다.
분석하기 전에 모든 시험 항체를 Biacore 러닝 완충액으로 완충액 교환하였다. 완충액 교환된 샘플 및 중간 스톡 용액의 단백질 농도는 Nanodrop 1000 분광광도계를 사용하여 280 nm에서 흡광도를 측정함으로써 측정하였다.
각 샘플을 2배 희석하기 위해 1000 ㎍/ml에서 시작하는 8-포인트 농도 시리즈로 분석하였다. Biacore 제어 소프트웨어 버전 4.1 및 BIAevaluation 소프트웨어 버전 4.1을 사용하여 데이터를 수집하고, 처리했다. 투여량 반응 곡선은 5개의 매개변수 로지스틱(5PL) 모델에 적합하였다. 사용된 기본 곡선 가중 계수는 다음과 같다:
분산 = 0.02 × 응답(RU)1.8
또한 StatLIA 버전 3.2를 사용하여 결합 데이터를 분석하였다. 평행도(parallelism)는 StatLIA에서 카이-제곱 테스트에 의해 평가하였다(P <0.01).
인간 FcγRIIA 및 인간 FcγRIIIA에 대한 AGEN1884w-FortiCHO, AGEN1884w-PowerCHO, AGEN2041w 및 기준 항-CTLA-4 IgG1 항체의 평균 응답(공명 단위)을 각각 도 9a 및 9b에 나타내었다.
2-7. Fc 감마 수용체 IIIA 리포터 세포주에 대한 항-CTLA-4 항체의 효과
AGEN1884w가 활성화된 Fc 감마 수용체를 통해 CTLA-4 및 신호를 공동 작용시키는 능력을 표적 세포와 함께 Fc 감마 수용체 IIIA(FcγRIIIA)(Promega)를 발현하는 리포터 세포주를 사용하여 평가하였다(도 10a에 도시된 분석 모식도)). 이 분석에서, 인간 CTLA-4를 발현하는 Jurkat 세포를 표적 세포로 사용하였다. FcγRIIIA, V158 변이체(높은 친화도) 또는 F158 변이체(낮은 친화도)를 안정적으로 발현하는 조작된 Jurkat 세포, 및 반딧불이 루시퍼라제의 발현을 유도하는 NFAT 반응 요소를 이펙터 세포로서 사용하였다. 분석은 제조사의 지시에 따라 수행되었다. 간단히 말하면, CTLA-4를 발현하는 표적 세포(25,000개의 세포) 25㎕를 96-웰 흰색의 평평한 바닥 플레이트에서 4㎍/ml로 시작하는 연속 희석된 항체 25㎕와 혼합하였다. 그 후 25㎕의 150,000개의 이펙터 세포를 웰에 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 밤새 배양하였다. 항원이 표적 세포의 표면 상에 위치하는 항체/항원 복합체와 FcγRIIIA와의 결합은 이펙터 세포의 프로모터/리포터 구조물에 신호전달하여 루시퍼라제 유전자 전사를 일으킨다. 다음날, 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내 30분간 냉각시켰다. 각 웰에 75㎕의 상온 Bio-Glo 시약(Promega)을 첨가하고, EnVison 멀티모드 플레이트 리더(Multimode Plate Reader)(Perkin Elmer)로 발광을 측정하고, 상대 발광 단위(RLU)를 기록했다. 시험된 항체는 AGEN1884w-105 또는 AGEN 1884w(도 10b, 10c, 10f 및 10g의 경우 AGEN1884w-105, 및 도 10d 및 10e의 경우 AGEN1884w); AGEN1884w-N297A(도 10f 및 10g); AGEN2041w(도 10d 및 10e); 기준 항-CTLA-4 IgG1 항체(도 10b 및 10c); 및 IgG1 이소타입 대조군 항체(도 10b-10g)이었다.
CTLA-4를 발현하는 세포에 결합될 때, IgG1 항체 AGEN1884w-105는 FcγRIIIA V158 변이체(도 10b) 및 FcγRIIIA F158 변이체(도 10c) 모두를 활성화시켰다. 예상한 바와 같이, IgG2 항체 AGEN2041w는 FcγRIIIA를 통해 신호전달하지 않았다(도 10d 및 10e). 이 리포터 분석의 특이성을 확인하기 위해, AGEN1884w(AGEN1884w-N297A)의 Fc 수용체(FcR)-무활동(silent) 변이체를 동일한 분석에서 시험하였고, 이 변이체는 FcγRIIIA를 통해 신호전달하지 않았다(도 10f 및 10g).
2-8. Fc 감마 수용체 IIA 리포터 세포주에 대한 항-CTLA-4 항체의 효과
다음으로, 표적 세포(인간 CTLA-4를 발현하는 Jurkat 세포)와 함께 FcγRIIA(Promega)를 발현하는 리포터 세포주를 사용하여, AGEN2041w가 CTLA-4와 공동결합하고, FcγRIIA를 통해 신호전달하는 능력을 평가하였다. 고친화성 131 H/H 다형성을 갖는 FcγRIIA를 발현하는 Jurkat 세포 및 반딧불이 루시퍼라제의 발현을 유도하는 NFAT 반응 요소를 이펙터 세포로서 사용하였다. 간단히 말하면, 표적 세포(6×106 세포/ml) 25 μl를 96-웰 흰색의 분석 플레이트의 복제 웰에서 0.1 μg/ml로 시작하는 연속 희석된 항체 25 μl와 혼합하였다. 시험된 항체는 AGEN2041w, 기준 항-CTLA-4 IgG2 항체 및 IgG2 이소타입 대조군 항체였다. 그 다음, 25 μl의 이펙터 세포(6×106 세포/ml)를 각 웰에 첨가하여 1:1 이펙터 대 표적 비율을 얻었다. 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 20시간 동안 배양하였다. 이 배양 후, Bio-Glo 루시퍼라제 분석시약(Promega)을 실온에서 해동시키고, 75㎕를 각 웰에 첨가하였다. 5-10 분 이내에 EnVision 멀티라벨 플레이트 리더(PerkinElmer)를 사용하여 발광을 측정하였다. 각각의 샘플 판독값으로부터 배경 발광을 뺀 후, 조정된 상대 발광 단위(RLU)를 기록하였다.
도 11에 도시된 바와 같이, CTLA-4를 발현하는 세포에 결합될 때, IgG2 항체 AGEN2041w는 FcγRIIAH131을 활성화시켰다.
2-9. Fcγ 수용체 결합이 항-CTLA-4 항체의 길항 활성에 미치는 효과
본 실시예에서, FcγR 결합이 항-CTLA-4 항체의 길항 활성에 미치는 효과를 조사하였다.
먼저, 세포-표면 발현된 CTLA-4에 대한 AGEN1884w-105 및 AGEN1884w-N297A의 결합을 섹션 1-2.에 기술된 분석과 유사한 유동 세포계측법 분석으로 비교하였다. 간단히 말하면, 인간 CTLA-4를 과다 발현하는 Jurkat 세포(Promega)를 AGEN1884w-105, AGEN1884w-N297A 또는 IgG1 이소타입 대조군, 이어서 PE-접합된 마우스 항-인간 카파 항체(Invitrogen)의 연속 희석으로 먼저 염색하였다. 샘플을 FACSCanto II(BD Biosciences)에서 수득하고, 평균 형광 강도(MFI)를 FlowJo 소프트웨어(FlowJo, LLC)를 사용하여 분석하였다. AGEN1884w-105 및 AGEN1884w-N297A는 인간 CTLA-4를 과발현하는 Jurkat 세포와 유사한 결합을 나타내었다(도 12a).
다음으로, 시험관내 기능 활성에 대한 Fc 수용체(FcR) 결합에 대한 의존성을 섹션 1-6.에 기술된 분석과 유사한 분석법으로 평가하였다. 간단히 말하면, 100 ng/ml의 SEA(Toxin Technologies) 및 20 μg/ml의 AGEN1884w-105, AGEN1884w-N297A 또는 IgG1 이소타입 대조군의 존재하에 인간 PBMC를 5일 동안 배양하였다. IL-2의 역가는 전기화학발광법(MSD)에 의해 측정하였다.
세포-표면 발현된 CTLA-4(도 12a)와 유사한 결합에도 불구하고, AGEN1884w-N297A는 1차 인간 PBMC 분석에서 AGEN1884w-105와 비교하여 감소된 IL-2 분비 강화(potentiation)를 나타내었다(도 12b).
기능적 활성에 대한 FcR 관여 조건의 추가 증거로서, 항-CTLA-4 항체를 FcR 차단제의 존재 또는 부재하에 IL-2 분비를 유도하는 능력에 대해 시험하였다.
페니실린, 스트렙토마이신 및 10% FBS(Hyclone)가 보충된 RPMI1640 중의 저온보존된 PBMC(105 세포/웰)를 96-웰 NUNCLON 델타 표면 플레이트(NUNCTM)에 첨가하였다. 37℃, 5% CO2, 97% 습도에서 5일간 FcR 차단제의 존재 또는 부재하에 세포를 SEA(Toxin Technologies) 100 ng/ml 및 항-CTLA-4 IgG1 항체 또는 인간 IgG1 이소타입 대조군 10 μg/ml와 함께 배양하였다. 시험된 항-CTLA-4 항체는 기준 IgG1 항체(도 13a) 및 AGEN1884w-105(도 13b)이었다. FcR 차단제는 항-CD16(Biolegend # 302013), 항-CD32(R&D # AF1330) 및 항-CD64(R&D # AF1257) 항체(각각 10㎍/ml)(도 13a) 또는 항-CD32 항체(eBiosciences # 16-0329-81) 단독(도 13b)이었다. 도 13b의 대조군에서는, 도면에 도시된 바와 같이, AGEN1884w-105 및 인간 IgG1 이소타입 대조군을 마우스 IgG1 이소타입 대조군(Biolegend # 400124)과 함께 배양하였다. 정화된 상등액을 수집하여 분석할 때까지 -80℃에서 보관하였다. IL-2의 역가는 전기화학발광법(MSD)에 의해 생성되었다.
CD16, CD32 및 CD64에 대한 항체(도 13a) 또는 CD32에 대한 항체(도 13b)를 사용하는 FcR 차단은 상기 주요 인간 PBMC 분석에서 IL-2 분비를 유도하는 항-CTLA-4 항체의 능력을 감소시켰다.
다음으로, 변이된 Fc 영역을 갖는 다수의 항-CTLA-4 항체의 기능적 활성을 PBMC를 사용하여 시험하였다. 간단히 말하면, 96-웰 NUNCLON 델타 표면 플레이트(NUNC™)에서 NormocinTM(Invivogen) 및 10% 열-불활성화 FBS(Gibco, Invitrogen Corporation)가 보충된 RPMI1640 내 웰당 105개의 세포로, 저온보존된 인간 PBMC(Research Blood Components)를 플레이팅하였다. 142 ng/ml의 SEA(Toxin Technologies) 및 10 μg/ml의 AGEN1884w, AGEN1884w-N297A, AGEN1884w-S267E/L328F, AGEN1884w-S239D/A330L/I332E, AGEN2041w, IgG1 이소타입 대조군 항체 또는 IgG2 이소타입 대조군 항체의 존재 하에서 세포를 37℃, 5% CO2 및 97% 습도에서 5일 동안 배양하였다. 정화된 상등액을 수집하여 분석할 때까지 -80℃에서 보관하였다. IL-2의 농도는 ELISA에 의해 측정하였다.
FcγRIIIA와의 결합을 증진시키는 Fc 부위의 삼중 돌연변이 S239D/A330L/I332E를 갖는 AGEN1884w는 야생형 IgG1 Fc 부위를 갖는 AGEN1884w보다 더 많은 IL-2 분비를 자극하였다(도 14).
2-10. Fc 매개된 이펙터 세포 포텐셜
본 실시예에서, 항체 AGEN1884w는 NK 세포 세포독성을 매개하는 능력에 대해 분석하였다. 요컨대, 세포 표면에 CTLA-4를 구성적으로 발현하도록 조작된 Jurkat 세포(표적 세포)를 96-웰 둥근 바닥 플레이트에서 1×104 세포/웰로 배양하였다. 증가된 농도의 AGEN1884w, 기준 항-CTLA-4 IgG1 항체 또는 이소타입 대조군 항체(모두 0 내지 10 ㎍/ml) 및 5×104 NK92-FcγRIIIA 세포(이펙터 세포)를 표적 세포에 첨가하였다. 37℃ 및 5% CO2에서 6시간 동안 배양한 후, 제조사의 지시에 따라 세포독성 검출 키트(LDH)(Roche)를 사용하여 상등액에서 방출된 젖산 탈수소효소(LDH)의 광도계 정량화로 표적 세포의 용해를 평가했다. 데이터는 SoftMax® 프로 마이크로플레이트 데이터 수집 및 분석 소프트웨어(Pro Microplate Data Acquisition & Analysis Software)를 사용하여 수집했다. 모든 항체 농도를 3번 시험하였다.
도 15에 도시된 바와 같이, 항체 AGEN1884w는 이펙터 세포의 존재하에 표적 세포를 발현하는 CTLA-4의 용해를 효과적으로 매개한다.
2-11. 항-CTLA-4 항체의 에피토프 맵핑
AGEN1884w의 Fab 단편(AGEN1884w-Fab)과 인간 CTLA-4의 세포외 도메인의 상호반응은 수소-중수소 교환(HDX) 질량 분광법에 의해 연구되었다. pH 7.4의 인산염 완충 식염수 용액 중의 CTLA-4 세포외 도메인만을 단독으로 또는 AGEN1884w-Fab와 조합하여, 10배량의 중수소 산화물 라벨링 완충액으로 희석하고, 다양한 시간(0, 60, 300, 1800 및 7200초)동안 실온에서 배양하였다. 4M 구아니딘 하이드로클로라이드, 0.85M TCEP(트리스(2-카르복시에틸)포스핀) 완충액 1체적을 첨가함으로써 수소에 대한 중수소의 교환을 퀸칭시키고, 최종 pH는 2.5였다. 그 후, 샘플을 온-컬럼 펩신/프로테아제 타입 XIII 분해 및 LC-MS 분석에 적용하였다. 질량 스펙트럼은 MS 전용 모드로 기록했다. 중수소 결합을 계산하기 위해, 주어진 펩타이드의 질량 스펙트럼을 추출된 이온 크로마토그램 피크에 걸쳐 조합하고, 가중된 평균 m/z를 계산하였다. 고유 펩타이드의 질량(0 분)에서 가중된 평균 질량까지의 질량 증가는 중수소 통합 수준에 해당한다. 추가 분석을 위해, 모든 펩타이드에 대해, 교환 시간에 대한 중수소 생성 곡선을 플로팅하고, HDExaminer 소프트웨어에 의해 비교했다.
대부분의 CTLA-4 펩타이드는 항-인간 CTLA-4 Fab 존재 유무에 관계없이 동일하거나 유사한 중수소 수준을 나타내었다. 그러나, 몇몇 펩타이드 세그먼트는 Fab 결합시 중수소 결합을 유의미하게 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 본 단락의 모든 잔기는 서열번호: 77에 따라 넘버링된다. Q80VT82(서열번호: 78) 및 Y135PPPYYLGIGNGTQI149(서열번호: 79)의 두 영역은 인간 CTLA-4가 Fab에 결합될 때 강한 중수소 보호를 경험했다. 중수소 섭취의 가장 큰 감소가 Y140L141에서 관찰되었으며, CTLA-4에서 AGEN1884w의 에피토프의 주요 특징인 것으로 나타났다. AGEN1884w가 강하게 결합하는 인간 및 사이노몰구스 원숭이 CTLA-4의 서열 검사는 141번 위치에서 류신에 대한 메티오닌 치환을 제외하고는 상기 두 영역에서 거의 완전한 서열 동일성을 나타낸다(도 17a). 대조적으로, AGEN1884w는 4개의 위치 중 3개의 위치에서 Y140LGI143(서열번호: 80)에서 인간 CTLA-4와 상이한 마우스 또는 래트 CTLA-4(데이터는 나타내지 않음)에 임의의 상당한 정도로 결합하지 않는다(도 17a). 추가 선택도 데이터는 AGEN1884w가 CD28, ICOS, BTLA 및 PD-1(데이터는 나타내지않음)을 포함하는 다른 관련 CD28 계열 구성원이 아닌 인간 및 사이노몰구스 원숭이 CTLA-4에 높은 특이성으로 결합한다는 것을 보여준다. 상기 관련 단백질 간의 서열 비교는 Y140LGI143(서열번호: 80) 서열(도 17b)에서 비-CTLA-4 단백질 모두가 상이함을 나타내며, AGEN1884w의 결합에 대한 이 에피토프의 중요성을 추가로 뒷받침한다.
2-12. 사이노몰구스 원숭이에 있어서 T-의존성 항체 반응(TDAR) 연구
사이노몰구스 원숭이에서의 8주 TDAR 연구는 AGEN1884w 및 AGEN2041w가 B형 간염 백신(ENERIX-G®)(HBsAg)에 대한 T 세포-의존성 항체 반응을 강화시키는 능력을 조사하기 위해 수행되었다. HBsAg 백신은 1일(프라임)과 29일(부스트)에 뒷다리에 3회 피하 주사로 주사 당 10μg(총 30μg) 투여하였다. 1일과 29일째에 백신 항원과 함께 AGEN1884w(N=6) 또는 AGEN2041w(N=6)을 정맥내 볼루스 주사(10mg/kg)로 2회 투여했다. 동일한 투여 스케줄을 사용하여, 동물의 대조군 그룹(N=3)에 HBsAg 백신을 기준 항-CTLA-4 IgG1 항체 3mg/kg과 함께 제공하고, 동물의 다른 대조군(N=6)에는 HBsAg를 대조군 물품: 20 mM 트리스 하이드로클로라이드, 100 mM NaCl, 1% 만니톨, 0.10 mM DTPA, 0.01% 폴리소르베이트 80, pH 7.0과 함께 투여받았지만, 항-CTLA-4 항체는 없었다. 8주 연구 동안, 연구를 통해 선택된 시간 지점(데이 -20, -7, 데이 +15, +29, +43, +59 및 +69)에서 수집된 혈청 샘플에 대해 항-HBsAg(IgG) 분석을 진행하였다. 혈청 역가를 비색 ELISA 분석법으로 측정하였다.
AGEN1884w, AGEN2041w, 기준 항-CTLA-4 IgG1 항체 또는 대조군 물품을 투여받은 동물은 제2 백신 투여 후 측정가능한 항체가를 갖는 정상적인 병적 반응을 가졌으며, 그 후 정점에 도달하고, 감소하였다(도 18a 및 18b). 그러나, AGEN1884w, AGEN2041w 및 기준 항-CTLA-4 IgG1 항체는 항-CTLA-4 항체의 부재하에 제공된 대조군 물품보다 항-HBsAg IgG 반응을 증강시키는 것으로 나타났다.
실시예 3: 항-CTLA-4 항체의 특성화
본 실시예에서, 하기 19개의 항-CTLA-4 항체가 결합 및 리간드 차단에 대해 특성화되었다: AGEN1884, AGEN1885, AGEN1886, AGEN1887, AGEN1888, AGEN1889, AGEN1890, AGEN1891, AGEN1892, AGEN1893, AGEN1894, AGEN1895, AGEN1896, AGEN1897, AGEN1898, AGEN1899, AGEN1900, AGEN1901, 및 AGEN1902. 상기 항체의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열이 표 6에 개시되어있다. 도 19a 및 19b는 각각 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 서열 정렬을 나타낸다.
3-1. 항-CTLA-4 항체의 결합 및 리간드 차단 분석
상기 기술된 19개의 항-CTLA-4 항체의 친화도를 섹션 1-1.에서 기술된 것과 유사한 분석에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 분석하였다. 시험된 CTLA-4 항원은 재조합 인간 CTLA-4-Fc(R&D Systems, # 7268-CT)였다. 항-CTLA-4 항체(러닝 완충액에서 6 ㎍/ml)를 CM5 센서 칩의 칩 표면에 포획하였다. 19개의 항체는 nM 친화도를 갖는 재조합 인간 CTLA-4에 결합하였다(데이터는 나타내지 않음).
섹션 1-5에 기술된 것과 유사한 분석에서 서스펜션 어레이 기술을 사용하여 19개의 항-CTLA-4 항체의 리간드 차단 활성을 조사하였다. 리간드 차단은 상이한 농도의 항-CTLA-4 항체(비드를 첨가하기 전에 3,000 ng/ml 내지 12 ng/ml)의 존재 하에서 시험하였다. 도 20a-20e에 도시된 바와 같이, 19개의 항-CTLA-4 항체 모두가 CD80 및 CD86에 대한 CTLA-4의 결합을 차단하였다.
본 발명은 본원에 기술된 특정 구현예에 의해 범위가 한정되지 않는다. 실제로, 상기 설명 및 첨부된 도면으로부터 기술된 것에 추가하여 상세한 설명에 더해 본 발명의 다양한 변형이 당업자에게 명백해질 것이다. 상기 변형은 첨부된 청구범위의 범주 내에 속한다.
본원에 인용된 모든 참고문헌(예를 들어, 공보 또는 특허 또는 특허출원)은 각각의 개별적인 참고문헌(예를 들어, 공보 또는 특허 또는 특허 출원)이 구체적으로 및 개별적으로 모든 목적을 위해 그 전체가 참고 문헌으로 인용되는 것과 동일한 목적으로 전체적으로, 그리고 모든 목적을 위해 본원에 통합된다. 다른 구현예는 하기 청구범위 내에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> AGENUS INC. LUDWIG INSTITUTE FOR CANCER RESEARCH LTD MEMORIAL SLOAN-KETTERING CANCER CENTER <120> ANTI-CTLA-4 ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF <130> IPA171346-US-D1 <150> 62/168,391 <151> 2015-05-29 <150> 62/182,363 <151> 2015-06-19 <150> 62/190,653 <151> 2015-07-09 <150> 62/257,202 <151> 2015-11-18 <150> 62/280,263 <151> 2016-01-19 <150> 62/292,500 <151> 2016-02-08 <150> 62/294,558 <151> 2016-02-12 <150> 62/323,226 <151> 2016-04-15 <160> 97 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> obtained from a synthetic library <400> 1 Ser Tyr Ser Met Asn 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> obtained from a synthetic library <400> 2 Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> obtained from a synthetic library <400> 3 Val Gly Leu Met Gly Pro Phe Asp Ile 1 5 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> obtained 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215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 <210> 96 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> obtained from a synthetic library <400> 96 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Gly Leu Met Gly Pro Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Glu His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 <210> 97 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Obtained from a synthetic library <400> 97 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Gly Leu Met Gly Pro Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Asp 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445

Claims (24)

  1. 상보성 결정 영역 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 상보성 결정 영역 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 인간 CTLA-4 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체로서,
    (a) CDRH1이 SYX1MX2(서열번호: 22)의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 X1은 S 또는 A이고; X2는 N 또는 S이고;
    (b) CDRH2가 SISSSSSYIYYADSVKG(서열번호: 2)의 아미노산 서열을 포함하고;
    (c) CDRH3이 VGLMGPFXI(서열번호: 23)의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 X는 D 또는 N이고;
    (d) CDRL1이 RASQSVX1X2YLX3(서열번호: 24)의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 X1은 S 또는 G이고; X2는 R, S 또는 T이고; X3은 G 또는 A이고;
    (e) CDRL2가 X1X2SX3RAT(서열번호: 25)의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 X1은 G 또는 A이고; X2는 A 또는 T이고; X3은 T, S, R 또는 N이고; 그리고
    (f) CDRL3이 QQYGX1SPX2T(서열번호: 26)의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 X1은 S 또는 T이고; X2는 W 또는 F인, 단리된 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    (a) CDRH1이 서열번호: 1 및 27로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고/하거나;
    (b) CDRH3이 서열번호: 3 및 28로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고/하거나;
    (c) CDRL1이 서열번호: 4, 29 및 30으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고/하거나;
    (d) CDRL2가 서열번호: 5 및 31 내지 35로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고/하거나;
    (e) CDRL3이 서열번호: 6, 36 및 37로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체.
  3. 제1항에 있어서,
    (a) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3이 각각 서열번호: 1, 2 및 3; 27, 2 및 3; 또는, 27, 2 및 28에 개시된, CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하고/하거나;
    (b) CDRL1, CDRL2 및 CDRL3이 각각 서열번호: 4, 5 및 6; 29, 32 및 36; 29, 33 및 37; 30, 31 및 6; 29, 34 및 6; 또는, 29, 35 및 37에 개시된 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체.
  4. 제1항에 있어서,
    (a) 중쇄 가변 영역이 서열번호: 72의 아미노산 서열을 포함하고/하거나;
    (b) 경쇄 가변 영역이 서열번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체.
  5. 제1항에 있어서,
    (a) 중쇄 가변 영역이 서열번호: 7 및 38 내지 42로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고/하거나;
    (b) 경쇄 가변 영역이 서열번호: 8 및 43 내지 47로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체.
  6. 제1항에 있어서, 항체가 중쇄 및 경쇄를 포함하되,
    (a) 중쇄가 서열번호: 12, 14, 74 내지 76, 및 93 내지 97로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고/하거나;
    (b) 경쇄가 서열번호: 13 또는 15의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체.
  7. 제1항에 있어서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역이 각각 서열번호: 38 및 8; 38 및 45; 39 및 45; 39 및 46; 39 및 47; 40 및 43; 40 및 45; 41 및 8; 42 및 43; 또는 42 및 45에 개시된 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체.
  8. 제1항에 있어서, 중쇄 및 경쇄를 포함하되,
    중쇄 및 경쇄가 각각 서열번호: 12 및 15; 93 및 15; 14 및 13; 14 및 15; 94 및 13; 94 및 15; 74 및 13; 74 및 15; 75 및 13; 75 및 15; 76 및 13; 76 및 15; 95 및 13; 95 및 15; 96 및 13; 96 및 15; 97 및 13; 또는 97 및 15에 개시된 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체.
  9. 제1항에 있어서, 항체가 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 구성된 그룹으로부터 선택된 중쇄 불변 영역; 및/또는 인간 카파 경쇄 불변 영역 및 인간 람다 경쇄 불변 영역으로 구성된 그룹으로부터 선택된 경쇄 불변 영역을 포함하는, 단리된 항체.
  10. 제1항에 있어서, 항체가 야생형 인간 IgG 중쇄 불변 영역의 변이체인 인간 IgG 중쇄 불변 영역을 포함하고, 여기서 상기 변이체 인간 IgG 중쇄 불변 영역이 인간 Fc 감마 수용체에 결합하는 상응하는 야생형 인간 IgG 중쇄 불변 영역보다 높은 친화도로 인간 Fc 감마 수용체에 결합하되, 임의로 상기 변이체 인간 IgG 중쇄 불변 영역이 변이체 인간 IgG1, 변이체 인간 IgG2, 또는 변이체 인간 IgG4 중쇄 불변 영역인, 단리된 항체.
  11. 제10항에 있어서, 인간 Fc 감마 수용체가 FcγRIIB, FcγRIIIA, FcγRIIA, 또는 FcγRI인, 단리된 항체.
  12. 제11항에 있어서, 인간 Fc 감마 수용체가 FcγRIIIA 또는 FcγRIIB이고, 변이체 인간 IgG 중쇄 불변 영역이 다음을 포함하는, 단리된 항체:
    (a) EU 넘버링 시스템에 따르는 다음의 아미노산 돌연변이 중 하나 이상: G236D, P238D, S239D, S267E, L328F 및 L328E; 또는
    (b) EU 넘버링 시스템에 따르는 다음으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 돌연변이 세트: S267E 및 L328F; P238D 및 L328E; P238D과, E233D, G237D, H268D, P271G 및 A330R; P238D, E233D, G237D, H268D, P271G 및 A330R로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 치환; G236D 및 S267E; S239D 및 S267E; V262E, S267E 및 L328F; 및 V264E, S267E 및 L328F.
  13. 제11항에 있어서, 인간 Fc 감마 수용체가 FcγRIIIA, FcγRIIA, 또는 FcγRI 이고, 변이체 인간 IgG 중쇄 불변 영역이 다음을 포함하는, 단리된 항체:
    (a) EU 넘버링 시스템에 따르는 다음의 아미노산 돌연변이 중 하나 이상: G236A, S239D, F243L, T256A, K290A, R292P, S298A, Y300L, V305I, A330L, I332E, E333A, K334A, A339T, 및 P396L; 또는
    (b) EU 넘버링 시스템에 따르는 다음으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 돌연변이 세트: S239D; T256A; K290A; S298A; I332E; E333A; K334A; A339T; S239D 및 I332E; S239D, A330L, 및 I332E; S298A, E333A, 및 K334A; G236A, S239D, 및 I332E; 및 F243L, R292P, Y300L, V305I, 및 P396L.
  14. 제1항에 있어서, 항체가 탈푸코실화된(afucosylated) Fc 영역을 포함하는, 단리된 항체.
  15. 상보성 결정 영역 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 상보성 결정 영역 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 인간 CTLA-4 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체로서,
    (a) VH가 서열번호: 7에 개시된 VH 아미노산 서열의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하고, VL이 서열번호: 8에 개시된 VL 아미노산 서열의 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하거나;
    (b) VH가 서열번호: 7에 개시된 VH 아미노산 서열의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하고, VL이 서열번호: 44에 개시된 VL 아미노산 서열의 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하거나;
    (c) VH가 서열번호: 7에 개시된 VH 아미노산 서열의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하고, VL이 서열번호: 45에 개시된 VL 아미노산 서열의 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하거나;
    (d) VH가 서열번호: 38에 개시된 VH 아미노산 서열의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하고, VL이 서열번호: 8에 개시된 VL 아미노산 서열의 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하거나;
    (e) VH가 서열번호: 38에 개시된 VH 아미노산 서열의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하고, VL이 서열번호: 45에 개시된 VL 아미노산 서열의 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하거나;
    (f) VH가 서열번호: 39에 개시된 VH 아미노산 서열의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하고, VL이 서열번호: 43에 개시된 VL 아미노산 서열의 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하거나;
    (g) VH가 서열번호: 39에 개시된 VH 아미노산 서열의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하고, VL이 서열번호: 45에 개시된 VL 아미노산 서열의 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하거나;
    (h) VH가 서열번호: 39에 개시된 VH 아미노산 서열의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하고, VL이 서열번호: 46에 개시된 VL 아미노산 서열의 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하거나;
    (i) VH가 서열번호: 39에 개시된 VH 아미노산 서열의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하고, VL이 서열번호: 47에 개시된 VL 아미노산 서열의 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하거나;
    (j) VH가 서열번호: 40에 개시된 VH 아미노산 서열의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하고, VL이 서열번호: 43에 개시된 VL 아미노산 서열의 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하거나;
    (k) VH가 서열번호: 40에 개시된 VH 아미노산 서열의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하고, VL이 서열번호: 8에 개시된 VL 아미노산 서열의 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하거나;
    (l) VH가 서열번호: 40에 개시된 VH 아미노산 서열의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하고, VL이 서열번호: 44에 개시된 VL 아미노산 서열의 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하거나;
    (m) VH가 서열번호: 40에 개시된 VH 아미노산 서열의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하고, VL이 서열번호: 45에 개시된 VL 아미노산 서열의 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하거나;
    (n) VH가 서열번호: 41에 개시된 VH 아미노산 서열의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하고, VL이 서열번호: 8에 개시된 VL 아미노산 서열의 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하거나;
    (o) VH가 서열번호: 41에 개시된 VH 아미노산 서열의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하고, VL이 서열번호: 44에 개시된 VL 아미노산 서열의 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하거나;
    (p) VH가 서열번호: 41에 개시된 VH 아미노산 서열의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하고, VL이 서열번호: 45에 개시된 VL 아미노산 서열의 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하거나;
    (q) VH가 서열번호: 41에 개시된 VH 아미노산 서열의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하고, VL이 서열번호: 47에 개시된 VL 아미노산 서열의 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하거나;
    (r) VH가 서열번호: 42에 개시된 VH 아미노산 서열의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하고, VL이 서열번호: 43에 개시된 VL 아미노산 서열의 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    (s) VH가 서열번호: 42에 개시된 VH 아미노산 서열의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하고, VL이 서열번호: 45에 개시된 VL 아미노산 서열의 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체.
  16. 제15항에 있어서, CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3이 Kabat, Chothia, IMGT, MacCallum RM 등, 및 AbM으로 구성된 군으로부터 선택되는 넘버링 체계에 따라 정의되는, 단리된 항체.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가
    (a) 인간 항체이고/이거나;
    (b) CTLA-4에 대해 길항적이고/이거나;
    (c) 인간 CD80에 또는 인간 CD86에 대한 인간 CTLA-4 단백질의 결합을 억제하는, 단리된 항체.
  18. 세포독성제, 세포증식억제제(cytostatic agent), 독소, 방사성핵종 또는 검출가능한 표지에 접합되는, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 단리된 항체를 포함하는 접합체.
  19. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 단리된 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
  20. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 단리된 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역, 또는 상기 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  21. 제20항의 단리된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
  22. 재조합 숙주 세포로서,
    (a) 제20항의 폴리뉴클레오타이드;
    (b) 제21항의 벡터; 또는
    (c) 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 단리된 항체의 중쇄 가변 영역 또는 중쇄를 코딩하는 제1 단리된 폴리뉴클레오타이드, 및 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 단리된 항체의 경쇄 가변 영역 또는 경쇄를 코딩하는 제2 단리된 폴리뉴클레오타이드
    를 포함하는, 재조합 숙주 세포
  23. 제22항의 숙주 세포를 배양하여 폴리뉴클레오타이드가 발현되고 항체가 생산되도록 하는 단계를 포함하는, 인간 CTLA-4에 결합하는 항체의 제조 방법.
  24. 제1항 내지 제16항, 및 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 하기에 사용하기 위한 단리된 항체 또는 약학적 조성물:
    (a) 대상에서 항원에 반응하여 T-세포 활성화를 증가시킴;
    (b) 암을 치료함; 및/또는
    (c) 감염성 질환을 치료함.
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