JP2006327937A - ヒト胚細胞系遺伝子構造を具えたヒト抗体構造及びその誘導フラグメント - Google Patents
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Abstract
【課題】 ヒト胚細胞系遺伝子構造を具えた新規なヒト抗体構造及びその誘導フラグメントの提供。
【解決手段】 ヒト胚細胞系VH3とVλ遺伝子構造を具えた新規ヒト抗体であって、それが個別で、或いは組み合わされてなる単株抗体が遺伝子組換えの可溶性ヒトCD152(CTLA−4)抗原と特異的に結合可能で、また、CD152表現を上昇する活性化周辺ヒトT細部との反応が可能である。
【選択図】 図5
【解決手段】 ヒト胚細胞系VH3とVλ遺伝子構造を具えた新規ヒト抗体であって、それが個別で、或いは組み合わされてなる単株抗体が遺伝子組換えの可溶性ヒトCD152(CTLA−4)抗原と特異的に結合可能で、また、CD152表現を上昇する活性化周辺ヒトT細部との反応が可能である。
【選択図】 図5
Description
本発明はヒト抗体の新規なヒト胚細胞系遺伝子配列構造に関する。その提示する配列は側鎖或いは特別に定義されるアミノ酸配列を含有せず、特にヒト胚細胞系(human germline)遺伝子構造を具えた新規なヒト抗体を指し、それはヒトCD152抗原と特異的結合可能で、ヒトCD152抗原異常に関係がある疾病の診断或いは治療に用いられる時に、有効に異種抗体の免疫性を低減し、抗体利用率を増し患者の副作用を減らすとともに、自己抗原CD152との反応の目的を達成する。
免疫グロブリン(抗体)は血清或いは体液中に存在する一種の糖蛋白(glicoproteins)である。早期の抗体の研究過程では抗原(antigen)をマウスに注射した後にその抗体生成細胞を取得し、更にマウス骨髄腫細胞株と融合することにより長期に特定単一株免疫グロブリンを分泌できる融合腫(hybridomas)を創造する必要があった。しかし、マウス蛋白配列を有する抗体投薬は経常的に患者の免疫反応(ヒト抗マウス反応)を誘発しうる。このため、非ヒト配列を排除した完全なヒト抗体を製造する必要があり、それによってこそ臨床応用価値がある。この目的を達成するため、特許文献1にはヒト免疫グロブリン遺伝子をマウス単株抗体に移植することで、ヒト化抗体を獲得する方法が記載されている。図1は周知の抗体構造表示図であり、この抗体構造は、可変領域(1a)と定常領域(1b)を包含する。該可変領域(1a)の内部にはそれぞれ三つの高度可変ドメイン(1f)があり、該高度可変ドメインに抗原と結合可能なアミノ酸が満たされている。周知のヒト化マウス由来抗体はマウス由来の可変領域或いは高度可変ドメインを遺伝工程の方式でヒト抗体の骨格中に挿入する。この技術は少数の非ヒト配列の抗体しか含有せず、当時の最も先進の製品であって、後の治療性単株抗体の追従する標準となった。
ヒト化したマウス由来抗体は既に各種疾病の治療薬物として成功しており、特に呼吸融合ウイルス(respiratory syncytial virus;RSV)等の伝統的感染性疾病のような治療薬物とされている。但し最近ますます多くの抗体がその他の疾病、例えば自己免疫疾病及び悪性腫瘍例えば転移性乳ガン、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病等である場合に用いられるようになった。抗体はまた器官排斥予防或いは動脈整形時の凝血阻止に用いられる。但しこのようなヒト化抗体は多少のマウス配列を含有しているため、患者が使用後に経常的に副作用が発生し、軽ければ発熱、悪寒、偏頭痛、嘔吐、むかつき、吐瀉、低血圧、全身疼痛、心身疲労感を引き起し、重ければ厳重な排斥現象を引き起し患者を死亡させてしまう。
非ヒト配列を含有しない抗体を達成するため、すでに実験マウスの免疫グロブリン胚細胞系遺伝子を遺伝工程の方式で置換して一組のヒトの免疫グロブリン胚細胞系遺伝子となした後、抗原を使用してこのような遺伝子をマウスに移植して完全ヒト抗体を獲得することに成功した者がいる。但し実験マウス遺伝子空間は有限であり、全てのヒト抗体胚細胞系遺伝子をカバーすることはできず、軽鎖遺伝子ではヒトのκ胚細胞系遺伝子しか入れることはできず(非特許文献1)、このため生成できる抗体の多様反応性が制限される。特許文献2には具体的にヒト免疫グロブリン遺伝子をマウスに移植することにより有限な完全ヒト抗体を獲得する方法が記載されている。
非特許文献2及び3に記載されているように、本件発明者は1994年に体外定位免疫法(site−directed in vitro)を開発し、ヒト周辺血を材料として完全ヒト抗体を取得している。近年、上述の従来の技術の欠点に対して、ヒトCD152抗原を例として一系列の細心の技術を開発し、特許文献3にそれが記載されている。
本発明は、上述の体外定位免疫法と特許文献3に記載の技術に基づき、ヒトCD152抗原を材料としてヒト胚細胞系アミノ酸構造を具備する新規ヒト抗体構造を鑑別し、異なるヒト血液固有の多様性、独特の体外培養技術と分子生物学方法を融合し、これにより新規構造の完全ヒト抗体を取得する。それはヒトVH3及びVλ胚細胞系遺伝子の独特の構造を具えているため、トランスジェニックマウスを使用しても獲得できない。
図1に示されるように、1分子の抗体蛋白質は2本の重鎖(heavy chains)ポリペプチドと2本の軽鎖(light chains)ポリペプチドで構成され、重鎖と軽鎖は更に可変領域(variable region)と定常領域(constant region)を包含し、重鎖と軽鎖の可変領域が共同で光源結合部位(antigen binding site)を構成し、抗原と決定部位(epitope)結合可能であり、分子の抗体と二つの分子の抗原決定部位結合の最良の効果を達成できる。重鎖は定常領域により更に、μ、β、γ、δ、εの五種類に細分され、軽鎖はλとκの二種類を有する。抗体の遺伝子は多くのフラグメントで構成され、ヒト抗体を例に挙げると、κ軽鎖、λ軽鎖と重鎖の遺伝子はそれぞれ第2、第22及び第14染色体に位置する。図2に示されるように、抗原との結合に関係のある抗体可変領域は、それぞれV、(D)とJ等の2〜3種類の胚細胞系遺伝子フラグメントで構成され、そのうち、V胚細胞系遺伝子の貢献度は最大で、これらのフラグメントが配列組合せの方式により、各種の抗体を生成する。V−(D)−J遺伝情報は並びにこのような組合せにより生成した抗体即ち胚細胞系抗体(germline antibody)と称される。現在既に重鎖の胚細胞系遺伝子がVH1からVH7の7大類型に分けられて軽鎖の胚細胞系遺伝子にλとκの二大類型があることが公認されている。
生理状態下で、胚細胞系抗体の「高度可変ドメイン」とその他の可変領域は続けて体細胞遺伝子の突然変異を進行し、不断に新たに修飾された抗体群及び新たな多様性を発生するのみならず、抗原と更に緊密に結合できる高親和力抗体を選択できる。本発明の主要な目的は、上述の胚細胞系抗体の特性を利用し、マウス由来抗体ヒト化の欠点を防止することにあり、ゆえに本発明はヒト胚細胞系抗体アミノ酸を再設計し、特にヒトCD152抗原との結合の親和力を高める。
請求項1の発明は、ヒトCD152抗原との結合特性を具えたヒト抗体或いはその誘導フラグメントであって、その重鎖アミノ酸配列と軽鎖アミノ酸配列がヒト胚細胞系VH3とVλ遺伝子より誘導されたものであることを特徴とする、ヒトCD152抗原との結合特性を具えたヒト抗体或いはその誘導フラグメントとしている。
請求項2の発明は、請求項1記載のヒト抗体において、ヒト胚細胞系VH3とVλ遺伝子を具備し、ヒトCD152抗原表現過多或いは不足に関係する疾病の診断又は治療に用いられるとともに、自己抗原CD152との反応を達成することを特徴とする、ヒト抗体としている。
請求項3の発明は、請求項1記載のヒト抗体において、重鎖アミノ酸配列と配列番号1(SEQ ID NO1)のアミノ酸配列順序が少なくとも70%の配列同一性を有することを特徴とする、ヒト抗体としている。
請求項4の発明は、請求項1記載のヒト抗体において、軽鎖アミノ酸配列と配列番号2(SEQ ID NO2)のアミノ酸配列順序が少なくとも70%の配列同一性を有することを特徴とする、ヒト抗体としている。
請求項2の発明は、請求項1記載のヒト抗体において、ヒト胚細胞系VH3とVλ遺伝子を具備し、ヒトCD152抗原表現過多或いは不足に関係する疾病の診断又は治療に用いられるとともに、自己抗原CD152との反応を達成することを特徴とする、ヒト抗体としている。
請求項3の発明は、請求項1記載のヒト抗体において、重鎖アミノ酸配列と配列番号1(SEQ ID NO1)のアミノ酸配列順序が少なくとも70%の配列同一性を有することを特徴とする、ヒト抗体としている。
請求項4の発明は、請求項1記載のヒト抗体において、軽鎖アミノ酸配列と配列番号2(SEQ ID NO2)のアミノ酸配列順序が少なくとも70%の配列同一性を有することを特徴とする、ヒト抗体としている。
本発明はヒト抗体の新規なヒト胚細胞系遺伝子配列構造に関する。その提示する配列は側鎖或いは特別に定義されるアミノ酸配列を含有せず、特にヒト胚細胞系(human germline)遺伝子構造を具えた新規なヒト抗体を指し、それはヒトCD152抗原と特異的結合可能で、ヒトCD152抗原異常に関係がある疾病の診断或いは治療に用いられる時に、有効に異種抗体の免疫性を低減し、抗体利用率を増し患者の副作用を減らすとともに、自己抗原CD152との反応の目的を達成する。
上述の目的を達成するため、本発明は二種類の新規なヒト胚細胞系抗体アミノ酸の構造を提供する。この構造はそれぞれ重鎖アミノ酸配列(配列番号1;SEQ ID NO:1)と、軽鎖アミノ酸配列(配列番号2;SEQ ID NO:2)とされ、且つ図3及び図4に示されるように、両者はVH3及びVλ由来のヒト胚細胞系抗体アミノ酸配列である。
本発明の重鎖アミノ酸配列(配列番号1;SEQ ID NO:1,代表番号VHnovel)に、図3を組み合わせた詳細な説明は、以下のようである。VHnovelのアミノ酸配列と全ての既知の抗体一級構造対比後にVHnovelは遺伝子バンクデータベース登録番号(accession number)がAB019439のVH3−30及びVH3−33の二種類のヒト胚細胞系抗体より誘導されたものであり、98個のアミノ酸中に、僅かに10個の差異がだけであることが分かった。
図4に示されるように、配列分析対比により、我々は本発明の軽鎖構造内容(SEQ ID NO:2,代表番号VLnovel)配列が、遺伝子バンクデータベース登録番号(accession number)がBAC0118、S78058及びCAA38313)等の三つのヒト胚細胞系Vλ軽鎖構造の抗体に対応し、これによりVLnovelもVλ軽鎖家族の一員であり、89個のアミノ酸中に僅かに7個の差異があることが分かった。
前述の新規な配列構造はヒトCD152抗原と専用に結合される(図5)。且つ前述の新規な構造は活性化(図6)されたヒトT細胞専用に作用し、CD152がT細胞活性化後に生成される蛋白質である事実が反映されている。
実施方式:
一.抗−CD152類抗体の生成
Ficoll−Paque(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)密度遠心(400xg)方式で、献血者より分離した周辺血単核細胞を、CD45RO MACS マイクロビーズ(Miltenyi Biotec,Auburn CA)で磁気標定し、その後、VarioMACS(Miltenyi Biotec)機器で分離する。すすいだCD45RO+ T細胞をフラスコ中で培養し、その密度は2×106 細胞/ミリリットルのRPMI−1640(HyQTM;HyClone,Logan,UT)、並びに1×不必要アミノ酸(Life Technologies,Grand Island,NY)、10%ヒト血清、50μg/mlゲンタマイシン/カナマイシン(gentamycin/kanamycin)(China Chemical & Pharmaceutical,Taipei,Taiwan)、50μM 2−メルカプトエタノール及び10μg/mlポケウィードミトゲン(pokeweed mitogen)(PWM;Sigma Chemicals)を補充する。24時間培養した後、細胞を400xg遠心にかけ、並びに移出して上清を収集し、CD45RO+ T細胞置換因子を製造し、0.45mmフィルタ膜で濾過し並びに摂氏−20度で冷凍保存する。
このほか、磁性細胞除去技術で周辺血単核細胞内の体外免疫反応を抑制できるキラー細胞族群を除去する。コロイド超磁性マイクロビーズが単株抗マウスCD8と抗−CD56抗体(Miltenyi Biotech)と結合する用法は前述したとおりである。キラー細胞除去の周辺血単核細胞の体外でのツーステップ免疫法で免疫作用を進行する。一次免疫作用の進行は、細胞を10nMのCD152抗原を含有する培養基で6日培養し、そのうち、50μM2−メルカプトエタノール、10%熱非活性化ヒト血清、0.05ng/ml rIL2(Calbiochem,San Diego,CA)及び25%(v/v)CD45RO+ T細胞置換因子が含有される。第7日目に、一次免疫細胞を取り出し並びに40%Ficoll−Paqueで遠心分離する。二次免疫反応に対して、3×107 個の細胞とCD152抗原をフラスコ中で混合し、それは事前に5μg/mlのCD40L(CD154;Vinci−Biochem,Vinci,Italy)で固定する。細胞を3−5日培養し、その培養基に5%ヒト血清、50μM 2−メルカプトエタノール及び10mM免疫抗原(peptide antigen)を補充する。
体外免疫の細胞をその後にEBウイルスに感染させる。簡単に述べると、107 個のリンパ細胞と1mlのEBウイルス含有の上清を摂氏37度で2時間培養し、この上清はEBV発生のマーモセット細胞株B95−8(American Type Culture Collection,ATCC CRL1612;Tri−Service General Hospital,Taipeiより提供)より誘導される。感染した細胞を105 /孔の数量で、96孔盤にシードし、並びにmytomycin(協和発酵,東京,日本)処理したPBMCをフィード細胞(104 /孔)として加える。抗体特異性を酵素免疫分析法で確定する。
一.抗−CD152類抗体の生成
Ficoll−Paque(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)密度遠心(400xg)方式で、献血者より分離した周辺血単核細胞を、CD45RO MACS マイクロビーズ(Miltenyi Biotec,Auburn CA)で磁気標定し、その後、VarioMACS(Miltenyi Biotec)機器で分離する。すすいだCD45RO+ T細胞をフラスコ中で培養し、その密度は2×106 細胞/ミリリットルのRPMI−1640(HyQTM;HyClone,Logan,UT)、並びに1×不必要アミノ酸(Life Technologies,Grand Island,NY)、10%ヒト血清、50μg/mlゲンタマイシン/カナマイシン(gentamycin/kanamycin)(China Chemical & Pharmaceutical,Taipei,Taiwan)、50μM 2−メルカプトエタノール及び10μg/mlポケウィードミトゲン(pokeweed mitogen)(PWM;Sigma Chemicals)を補充する。24時間培養した後、細胞を400xg遠心にかけ、並びに移出して上清を収集し、CD45RO+ T細胞置換因子を製造し、0.45mmフィルタ膜で濾過し並びに摂氏−20度で冷凍保存する。
このほか、磁性細胞除去技術で周辺血単核細胞内の体外免疫反応を抑制できるキラー細胞族群を除去する。コロイド超磁性マイクロビーズが単株抗マウスCD8と抗−CD56抗体(Miltenyi Biotech)と結合する用法は前述したとおりである。キラー細胞除去の周辺血単核細胞の体外でのツーステップ免疫法で免疫作用を進行する。一次免疫作用の進行は、細胞を10nMのCD152抗原を含有する培養基で6日培養し、そのうち、50μM2−メルカプトエタノール、10%熱非活性化ヒト血清、0.05ng/ml rIL2(Calbiochem,San Diego,CA)及び25%(v/v)CD45RO+ T細胞置換因子が含有される。第7日目に、一次免疫細胞を取り出し並びに40%Ficoll−Paqueで遠心分離する。二次免疫反応に対して、3×107 個の細胞とCD152抗原をフラスコ中で混合し、それは事前に5μg/mlのCD40L(CD154;Vinci−Biochem,Vinci,Italy)で固定する。細胞を3−5日培養し、その培養基に5%ヒト血清、50μM 2−メルカプトエタノール及び10mM免疫抗原(peptide antigen)を補充する。
体外免疫の細胞をその後にEBウイルスに感染させる。簡単に述べると、107 個のリンパ細胞と1mlのEBウイルス含有の上清を摂氏37度で2時間培養し、この上清はEBV発生のマーモセット細胞株B95−8(American Type Culture Collection,ATCC CRL1612;Tri−Service General Hospital,Taipeiより提供)より誘導される。感染した細胞を105 /孔の数量で、96孔盤にシードし、並びにmytomycin(協和発酵,東京,日本)処理したPBMCをフィード細胞(104 /孔)として加える。抗体特異性を酵素免疫分析法で確定する。
二.本発明の新規構造と組換えヒトCD152抗原の結合性
図4は本発明の独特ヒト胚細胞系抗体アミノ酸構造と組換えヒトCD152抗原の結合性を示す。酵素免疫分析法を使用し、まず室温で1μg/mlの、BHK細胞表現の組換えヒトCD152(CTLA−4)−muIg融合蛋白(Ancell Corporation,Bayport,MN)、1μg/ml単株マウスIgG2a(Ancell)、10μg/孔の牛血清白蛋白(BSA;Sigma,St.Louis,MO)或いは破傷風類ウイルス(ADImmune Corporation,Taichung,Taiwan)をマイクロ滴定盤上に塗布して一晩置く。新規構造抗体を0.5M塩化ナトリウム及び0.1%Tween−20を含有する10mMリン酸ナトリウムバッファ液、pH8.0で濃度が1μg/mlとなるまで希釈する。塗布処理後の滴定盤を希釈した培養基上清で培養し、洗浄後に、過酸化酵素標定したヒトIgG或いはλ軽鎖を認識する山羊抗体(Zymed Loboratories,So.San Francisco,CA)でインキュベートし、100μlのクロモゲニック基質OPD(Sigma)を加えて現像する。30分反応させた後、1M硫酸を加えて停止し、且つその発生する吸光を490nm下において判読する。図示されるように、本発明のヒト胚細胞系抗体アミノ酸構造は組換えヒトCD152抗原と特異的に結合し、関係のない抗原と単株マウスIgG2a、牛血清白蛋白或いは破傷風ウイルスとは、いずれとも明らかな結合反応を認められない。
図4は本発明の独特ヒト胚細胞系抗体アミノ酸構造と組換えヒトCD152抗原の結合性を示す。酵素免疫分析法を使用し、まず室温で1μg/mlの、BHK細胞表現の組換えヒトCD152(CTLA−4)−muIg融合蛋白(Ancell Corporation,Bayport,MN)、1μg/ml単株マウスIgG2a(Ancell)、10μg/孔の牛血清白蛋白(BSA;Sigma,St.Louis,MO)或いは破傷風類ウイルス(ADImmune Corporation,Taichung,Taiwan)をマイクロ滴定盤上に塗布して一晩置く。新規構造抗体を0.5M塩化ナトリウム及び0.1%Tween−20を含有する10mMリン酸ナトリウムバッファ液、pH8.0で濃度が1μg/mlとなるまで希釈する。塗布処理後の滴定盤を希釈した培養基上清で培養し、洗浄後に、過酸化酵素標定したヒトIgG或いはλ軽鎖を認識する山羊抗体(Zymed Loboratories,So.San Francisco,CA)でインキュベートし、100μlのクロモゲニック基質OPD(Sigma)を加えて現像する。30分反応させた後、1M硫酸を加えて停止し、且つその発生する吸光を490nm下において判読する。図示されるように、本発明のヒト胚細胞系抗体アミノ酸構造は組換えヒトCD152抗原と特異的に結合し、関係のない抗原と単株マウスIgG2a、牛血清白蛋白或いは破傷風ウイルスとは、いずれとも明らかな結合反応を認められない。
三.新規構造アミノ酸配列の鑑別
抗体新規構造はクローン非CD152特異性細胞よりcDNA配列により得られる。簡単に述べると、2×104 個の組換えヒトCD152抗原特異性反応を有する単株抗体分泌細胞より、Dynabeads(登録商標)mRNA DIRECT(登録商標)Micro Kit(Dyjnal Biotech,Oslo,Norway)で、メーカーが提供するステップによりmRNAを抽出し、分離されたmRNAを直接RT−PCR中に加えてテンプレートとなす。RT−PCRはTitan One Tube RT−PCR System(Roche Diagnostics Corporation,Indianapolis,IN)を使用し行なう。SEQ ID NO:3からSEQ ID NO:6に示されるように、反応に使用する二組のプライマーはヒト抗体遺伝子重鎖可変領域拡散配列中の第1組HuVHBackとHuJHFORを拡大でき、及びヒト抗体遺伝子軽鎖可変領域拡散配列中の第2組HuVλBackとHuVλFORを拡大できる。RT−PCRは全部で37個の循環拡大ステップを採用する。それぞれ摂氏94度で2分間の第1サイクル、摂氏94度で3分間、摂氏51度で30秒、及び摂氏68度で1分間の第2から第36サイクル、最終サイクルには摂氏68度で10分間の反応条件を使用する。
電気泳動で確定された単一族群に属するDNAフラグメントをヌクレオチド配列する。ヌクレオチド類似物(analog)には3’−ヒドロキシ族がないために特定的にDNA鎖複製を終了できる原理により配列反応を行なう。類似物上に標定された異なる蛍光を、電気泳動を用いて長さの異なるフラグメントに分離し、レーザー色光で異なる蛍光を検出し、コンピュータでDNA配列を読み出す。得られた配列を更に確認(Molecular Clinical Diagnostic Laboratory,DR.Chip Biotechnology,Inc.,Taipei,Taiwan)し並びにアミノ酸配列に変換する。
抗体新規構造はクローン非CD152特異性細胞よりcDNA配列により得られる。簡単に述べると、2×104 個の組換えヒトCD152抗原特異性反応を有する単株抗体分泌細胞より、Dynabeads(登録商標)mRNA DIRECT(登録商標)Micro Kit(Dyjnal Biotech,Oslo,Norway)で、メーカーが提供するステップによりmRNAを抽出し、分離されたmRNAを直接RT−PCR中に加えてテンプレートとなす。RT−PCRはTitan One Tube RT−PCR System(Roche Diagnostics Corporation,Indianapolis,IN)を使用し行なう。SEQ ID NO:3からSEQ ID NO:6に示されるように、反応に使用する二組のプライマーはヒト抗体遺伝子重鎖可変領域拡散配列中の第1組HuVHBackとHuJHFORを拡大でき、及びヒト抗体遺伝子軽鎖可変領域拡散配列中の第2組HuVλBackとHuVλFORを拡大できる。RT−PCRは全部で37個の循環拡大ステップを採用する。それぞれ摂氏94度で2分間の第1サイクル、摂氏94度で3分間、摂氏51度で30秒、及び摂氏68度で1分間の第2から第36サイクル、最終サイクルには摂氏68度で10分間の反応条件を使用する。
電気泳動で確定された単一族群に属するDNAフラグメントをヌクレオチド配列する。ヌクレオチド類似物(analog)には3’−ヒドロキシ族がないために特定的にDNA鎖複製を終了できる原理により配列反応を行なう。類似物上に標定された異なる蛍光を、電気泳動を用いて長さの異なるフラグメントに分離し、レーザー色光で異なる蛍光を検出し、コンピュータでDNA配列を読み出す。得られた配列を更に確認(Molecular Clinical Diagnostic Laboratory,DR.Chip Biotechnology,Inc.,Taipei,Taiwan)し並びにアミノ酸配列に変換する。
四.新規構造と活性化されたヒトT細胞作用
図5は本発明の特異ヒト胚細胞系抗体アミノ酸構造の、フロー細胞分析機により測定した活性化されたヒトT細胞に対する反応性を示す。健康血液より分離した周辺血単核リンパ細胞を、400xg密度遠心分離の方式でFicoll−Paque(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)勾配上で分離する。細胞をその後リン酸ナトリウムバッファで二度洗浄し、並びに100xg遠心分離し収集する。分離したリンパ細胞は濃度が5μg/mlのフィトヘムアグルチニン(phytohemagglutinin,GE Heatth care)で刺激する。摂氏37度の5%CO2 の湿った環境中で72時間培養し、そのうちのヒトT細胞を活性化する。活性化T細胞の本発明のヒト抗体構造の反応を評価する。それは、活性化細胞を200xgで遠心分離し、更に冷たい80%アルコールに懸濁させ、並びに激烈に振動、混合して最終密度が1×106 /mlとなるようにする。更に細胞を摂氏4度で少なくとも30分間培養する。アルコールで固定した細胞をその後、遠心分離し並びに1μgの本発明のヒト抗体構造或いは非関係対照ヒト抗体(Biodesign,Saco,ME)で15分間作用させてFITC標定したマウス抗ヒト抗体(Biotechnology Associates,Birmingham,AL)で15分間再作用させ、FACSCalibur フロー細胞分析機にCell Questソフトウエア(Becton Dickinson,Mountain View,CA)でその反応比例を決定する。
図5は本発明の特異ヒト胚細胞系抗体アミノ酸構造の、フロー細胞分析機により測定した活性化されたヒトT細胞に対する反応性を示す。健康血液より分離した周辺血単核リンパ細胞を、400xg密度遠心分離の方式でFicoll−Paque(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)勾配上で分離する。細胞をその後リン酸ナトリウムバッファで二度洗浄し、並びに100xg遠心分離し収集する。分離したリンパ細胞は濃度が5μg/mlのフィトヘムアグルチニン(phytohemagglutinin,GE Heatth care)で刺激する。摂氏37度の5%CO2 の湿った環境中で72時間培養し、そのうちのヒトT細胞を活性化する。活性化T細胞の本発明のヒト抗体構造の反応を評価する。それは、活性化細胞を200xgで遠心分離し、更に冷たい80%アルコールに懸濁させ、並びに激烈に振動、混合して最終密度が1×106 /mlとなるようにする。更に細胞を摂氏4度で少なくとも30分間培養する。アルコールで固定した細胞をその後、遠心分離し並びに1μgの本発明のヒト抗体構造或いは非関係対照ヒト抗体(Biodesign,Saco,ME)で15分間作用させてFITC標定したマウス抗ヒト抗体(Biotechnology Associates,Birmingham,AL)で15分間再作用させ、FACSCalibur フロー細胞分析機にCell Questソフトウエア(Becton Dickinson,Mountain View,CA)でその反応比例を決定する。
上述の実施方式は本発明の説明のために提示されたものであり、本発明の主張する権利範囲はその特許請求の範囲の記載に準じ、上述の実施例に限定されない。
11 可変領域 12 軽鎖
13 定常領域 14 重鎖
15 高度可変ドメイン 17 S−S結合
20 カッパ(κ)軽鎖 22 ラムダ(λ)軽鎖
24 重鎖
30 重鎖第1ボーンフレームドメイン 31 重鎖第1高度可変ドメイン
32 重鎖第2ボーンフレームドメイン 33 重鎖第2高度可変ドメイン
34 重鎖第3ボーンフレームドメイン 1〜98 重鎖アミノサン順序
※: 上列アミノ酸形式と同じ
40 軽鎖第1ボーンフレームドメイン 41 軽鎖第1高度可変ドメイン
42 軽鎖第2ボーンフレームドメイン 43 軽鎖第2高度可変ドメイン
44 重鎖第3ボーンフレームドメイン 1〜89 軽鎖アミノサン順序
● ヒトCD152抗原 □ 単株マウスIgG2a
◇ 牛血清白蛋白 ▲ 破傷風ウイルス
60 非関係対照ヒト抗体と未活性化のヒトT細胞作用のフロー細胞分析図
62 新規構造と未活性化のヒトT細胞作用のフロー細胞分析図
64 非関係対照ヒト抗体と活性化のヒトT細胞作用のフロー細胞分析図
66 新規構造と活性化のヒトT細胞作用のフロー細胞分析図
13 定常領域 14 重鎖
15 高度可変ドメイン 17 S−S結合
20 カッパ(κ)軽鎖 22 ラムダ(λ)軽鎖
24 重鎖
30 重鎖第1ボーンフレームドメイン 31 重鎖第1高度可変ドメイン
32 重鎖第2ボーンフレームドメイン 33 重鎖第2高度可変ドメイン
34 重鎖第3ボーンフレームドメイン 1〜98 重鎖アミノサン順序
※: 上列アミノ酸形式と同じ
40 軽鎖第1ボーンフレームドメイン 41 軽鎖第1高度可変ドメイン
42 軽鎖第2ボーンフレームドメイン 43 軽鎖第2高度可変ドメイン
44 重鎖第3ボーンフレームドメイン 1〜89 軽鎖アミノサン順序
● ヒトCD152抗原 □ 単株マウスIgG2a
◇ 牛血清白蛋白 ▲ 破傷風ウイルス
60 非関係対照ヒト抗体と未活性化のヒトT細胞作用のフロー細胞分析図
62 新規構造と未活性化のヒトT細胞作用のフロー細胞分析図
64 非関係対照ヒト抗体と活性化のヒトT細胞作用のフロー細胞分析図
66 新規構造と活性化のヒトT細胞作用のフロー細胞分析図
Claims (4)
- ヒトCD152抗原との結合特性を具えたヒト抗体或いはその誘導フラグメントであって、その重鎖アミノ酸配列と軽鎖アミノ酸配列がヒト胚細胞系VH3とVλ遺伝子より誘導されたものであることを特徴とする、ヒトCD152抗原との結合特性を具えたヒト抗体或いはその誘導フラグメント。
- 請求項1記載のヒト抗体において、ヒト胚細胞系VH3とVλ遺伝子を具備し、ヒトCD152抗原表現過多或いは不足に関係する疾病の診断又は治療に用いられるとともに、自己抗原CD152との反応を達成することを特徴とする、ヒト抗体。
- 請求項1記載のヒト抗体において、重鎖アミノ酸配列と配列番号1(SEQ ID NO1)のアミノ酸配列順序が少なくとも70%の配列同一性を有することを特徴とする、ヒト抗体。
- 請求項1記載のヒト抗体において、軽鎖アミノ酸配列と配列番号2(SEQ ID NO2)のアミノ酸配列順序が少なくとも70%の配列同一性を有することを特徴とする、ヒト抗体。
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