KR20220136459A - Pd-1 축 결합 길항제 및 탁산을 이용한 암 치료 방법 - Google Patents

Pd-1 축 결합 길항제 및 탁산을 이용한 암 치료 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 암을 가진 개체에서 암을 치료하고 면역 기능을 증진하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 상기 방법은 PD-1 축 결합 길항제 및 탁산을 투여하는 것을 포함한다.

Description

PD-1 축 결합 길항제 및 탁산을 이용한 암 치료 방법{METHODS OF TREATING CANCERS USING PD-1 AXIS BINDING ANTAGONISTS AND TAXANES}
관련 출원에 대한 상호-참조
본 명세서는 2013년 12월 17일에 출원된 U.S. 가출원 특허 제61/917,264호에 대한 우선권을 주장한다.
발명의 분야
본 발명은 PD-1 축 결합 길항제 및 탁산을 투여함으로써 암을 치료하고 암을 가진 개체의 면역 기능을 증진하기 위한 방법에 관한 것이다.
발명의 배경
T-세포로 두 가지 상이한 신호를 전달하는 것은 항원-제시 세포(APC)에 의한 휴지기 T 림프구의 림프구 활성화를 위해 널리 받아들여지는 모델이다. 이러한 모델은 또한 자기와 비-자기의 구분 및 면역 내성을 제공한다. 일차 신호, 또는 항원-특이적 신호는 주조직적합성-복합체(MHC)의 맥락에서 제시된 외부 항원 펩티드의 인식 후에 T-세포 수용체(TCR)를 통해 전달된다. 이차 신호, 또는 보조-자극 신호는 APC 상에 발현된 보조-자극 분자에 의해 T-세포로 전달되고 T-세포가 클론 확대, 사이토킨 분비 및 수식인자 기능을 촉진하도록 유도한다. 보조-자극의 부재에서, T-세포는 항원 자극에 대해 불응성이 될 수 있고, 이는 외부 또는 내부 항원에 대해 관용원성 반응을 일으킨다.
두-신호 모델에서, T-세포는 양성 및 음성 이차 보조-자극 신호를 모두 받는다. 그러한 양성 및 음성 신호의 조절은 숙주의 보호성 면역 반응은 최대화하는 동시에, 면역 내성을 유지하고 자가면역을 방지하는데 중요하다. 음성 이차 신호는 T-세포 내성의 유도를 위해 필요한 것으로 여겨지며, 양성 신호는 T-세포 활성화를 촉진한다. 단순한 두-신호 모델이 미경험(naive) 림프구에 대한 유효한 설명을 제공하고 있지만, 숙주의 면역 반응은 역동적인 과정이며, 보조-자극 신호 또한 항원-노출된 T-세포에 제공될 수 있다.
보조-자극 신호의 조작이 세포-기반 면역 반응을 증진하거나 종결시키는 수단을 제공하기 때문에 보조-자극 메커니즘은 치료적 관심을 받고 있다. T 세포 기능장애 또는 무반응은 PD-L1 및 PD-L2를 포함하는 리간드에 결합하는 저해 수용체인, 프로그램 세포사(programmed death) 1 폴리펩티드 (PD-1)의 발현 유도 및 지속과 동시에 일어난다. 많은 암에서 PD-L1는 과발현되며 흔히 나쁜 예후와 연계된다. 정상 조직 내 T 림프구 및 말초 혈액 T 림프구와 대조적으로, 대부분의 종양-침투성 T 림프구는 주로 PD-1을 발현하는데, 이는 종양-반응성 T 세포에서 PD-1의 상향-조절이 항-종양 면역 반응 장애에 기여할 수 있음을 암시한다. 이는 PD-1-발현 T 세포와 상호작용하는 PD-L1-발현 종양 세포에 의해 매개된 PD-L1 신호전달의 부당한 이용이, T 세포 활성화를 약화시키고 면역 감시를 피하기 때문일 수 있다. 그러므로, PD-L1/PD-1 상호작용의 저해는 종양의 CD8+ T 세포-매개 사멸을 증진할 수 있다.
최적의 치료적 처리는 PD-1 수용체/리간드 상호작용의 차단을 종양 성장을 직접 저해하는 물질과 함께 병행할 수 있다. 다양한 암의 발달을 치료, 안정화, 예방, 및/또는 지연하기 위한 최적의 요법을 향한 수요가 존재한다.
발명의 요약
본 발명은 PD-1 축 결합 길항제 및 탁산을 투여함으로써 암을 치료하고 암을 가진 개체의 면역 기능을 증진하기 위한 방법에 관한 것이다.
한 양태에서, 본 발명은 개체에서 암을 치료하거나 진행을 지연시키기 위해 개체에게 유효량의 인간 PD-1 축 결합 길항제 및 탁산을 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제는 PD-1 결합 길항제, PD-L1 결합 길항제, 및 PD-L2 결합 길항제로 이루어진 군에서 선택된다.
상기 양태의 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제는 PD-1 결합 길항제이다. 일부 구체예에서, PD-1 결합 길항제는 PD-1이 이의 리간드 결합 상대에 결합하는 것을 저해한다. 일부 구체예에서, PD-1 결합 길항제는 PD-1이 PD-L1에 결합하는 것을 저해한다. 일부 구체예에서, PD-1 결합 길항제는 PD-1이 PD-L2에 결합하는 것을 저해한다. 일부 구체예에서, PD-1 결합 길항제는 PD-1이 PD-L1 및 PD-L2 둘다에 결합하는 것을 저해한다. 일부 구체예에서, PD-1 결합 길항제는 항체이다. 일부 구체예에서, PD-1 결합 길항제는 MDX-1106(니볼루맙), MK-3475(람브롤리주맙), CT-011(피딜리주맙), 및 AMP-224로 이루어진 군에서 선택된다.
상기 양태의 다른 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제는 PD-L1 결합 길항제이다. 일부 구체예에서, PD-L1 결합 길항제는 PD-L1이 PD-1에 결합하는 것을 저해한다. 일부 구체예에서, PD-L1 결합 길항제는 PD-L1이 B7-1에 결합하는 것을 저해한다. 일부 구체예에서, PD-L1 결합 길항제는 PD-L1이 PD-1 및 B7-1 둘다에 결합하는 것을 저해한다. 일부 구체예에서, PD-L1 결합 길항제는 항체이다. 일부 구체예에서, 항체는 다음으로 이루어진 군에서 선택된다: YW243.55.S70, MPDL3280A, MDX-1105, 및 MEDI4736. 일부 구체예에서, 항체는 서열 번호:19의 HVR-H1 서열, 서열 번호:20의 HVR-H2 서열, 및 서열 번호:21의 HVR-H3 서열을 포함하는 중사슬; 및 서열 번호:22의 HVR-L1 서열, 서열 번호:23의 HVR-L2 서열, 및 서열 번호:24의 HVR-L3 서열을 포함하는 경사슬을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체는 서열 번호:26의 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 부위 및 서열 번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 부위를 포함한다.
상기 양태의 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제는 PD-L2 결합 길항제이다. 일부 구체예에서, PD-L2 결합 길항제는 항체이다. 일부 구체예에서, PD-L2 결합 길항제는 면역접합체(immunoadhesin)이다.
상기 양태의 전술된 구체예 중 어느 하나에서, 암은 제한없이, 유방암(가령 삼중-음성 유방암(TNBC)), 방광암(가령 요로상피 방광암(UBC), 근침윤성 방광암, 및 BCG-불응성 비-근침윤성 방광암), 대장암, 직장암, 폐암(가령 편평 또는 비-편평일 수 있는 비-소세포 폐암), 교모세포종, 비-호지킨성 림프종(NHL), 신세포암(가령 신세포 암종), 전립선암, 간암, 췌장암, 연-조직 육종, 카포시 육종, 유암종, 두경부암, 위암, 식도암, 전립선암, 자궁내막암, 신장암, 난소암, 중피종, 및 헴(heme) 악성종양(가령 골수형성이상 증후군(MDS) 및 다중 골수종)일 수 있다. 특정한 구체예에서, 암은 폐암(가령 편평 또는 비-편평일 수 있는 비-소세포 폐암), 방광암(가령 UBC), 유방암(가령 TNBC), 신세포 암종, 흑색종, 대장암, 및 헴 악성종양(가령 골수형성이상 증후군(MDS) 및 다중 골수종)일 수 있다. 일부 구체예에서, 폐암은 편평 또는 비-편평일 수 있는 비-소세포 폐암이다. 일부 구체예에서, 방광암은 UBC이다. 일부 구체예에서, 유방암은 TNBC이다. 일부 구체예에서, 헴 악성종양은 MDS 또는 다중 골수종이다.
상기 양태의 전술된 구체예 중 어느 하나에서, 개체는 암을 가지거나 암을 가진 것으로 진단받았다. 일부 구체예에서, 개체 내 암세포는 PD-L1를 발현한다.
상기 양태의 전술된 구체예 중 어느 하나에서, 치료는 개체에서 응답을 유발할 수 있다. 일부 구체예에서, 응답은 완전관해(complete response)이다. 일부 구체예에서, 응답은 치료의 중지 후에 지속되는 응답이다. 일부 구체예에서, 응답은 치료의 중지 후에 지속되는 완전관해이다.
상기 양태의 전술된 구체예 중 어느 하나에서, 탁산은 PD-1 축 결합 길항제 전에, PD-1 축 결합 길항제와 동시에, 또는 PD-1 축 결합 길항제 다음에 투여된다. 일부 구체예에서, 탁산은 나브-파클리탁셀(ABRAXANE®), 파클리탁셀, 또는 도세탁셀이다. 일부 구체예에서, 탁산은 나브-파클리탁셀(ABRAXANE®)이다. 일부 구체예에서, 탁산은 파클리탁셀이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 암을 가진 개체에서 면역 기능을 증진하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 유효량의 PD-1 축 결합 길항제 및 탁산을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 개체에서 CD8+ T 세포는 PD-1 축 결합 길항제 및 탁산을 투여하기 전에 비해 향상된 프라이밍(priming), 활성화, 증식 및/또는 세포용해 활성을 갖는다. 일부 구체예에서, CD8+ T 세포의 수는 상기 조합을 투여하기 전에 비해 상승된다. 일부 구체예에서, CD8+ T 세포는 항원-특이적 CD8+ T 세포이다. 일부 구체예에서, Treg 기능은 상기 조합을 투여하기 전에 비해 억제된다. 일부 구체예에서, T 세포 고갈은 상기 조합을 투여하기 전에 비해 감소된다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제는 PD-1 결합 길항제, PD-L1 결합 길항제 및 PD-L2 결합 길항제로 이루어진 군에서 선택된다.
상기 양태의 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제는 PD-1 결합 길항제이다. 일부 구체예에서, PD-1 결합 길항제는 PD-1이 이의 리간드 결합 상대에 결합하는 것을 저해한다. 일부 구체예에서, PD-1 결합 길항제는 PD-1이 PD-L1에 결합하는 것을 저해한다. 일부 구체예에서, PD-1 결합 길항제는 PD-1이 PD-L2에 결합하는 것을 저해한다. 일부 구체예에서, PD-1 결합 길항제는 PD-1이 PD-L1 및 PD-L2 둘다에 결합하는 것을 저해한다. 일부 구체예에서, PD-1 결합 길항제는 항체이다. 일부 구체예에서, PD-1 결합 길항제는 MDX-1106(니볼루맙), MK-3475(람브롤리주맙), CT-011(피딜리주맙), 및 AMP-224로 이루어진 군에서 선택된다.
상기 양태의 다른 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제는 PD-L1 결합 길항제이다. 일부 구체예에서, PD-L1 결합 길항제는 PD-L1이 PD-1에 결합하는 것을 저해한다. 일부 구체예에서, PD-L1 결합 길항제는 PD-L1이 B7-1에 결합하는 것을 저해한다. 일부 구체예에서, PD-L1 결합 길항제는 PD-L1이 PD-1 및 B7-1 둘다에 결합하는 것을 저해한다. 일부 구체예에서, PD-L1 결합 길항제는 항체이다. 일부 구체예에서, 항체는 다음으로 이루어진 군에서 선택된다: YW243.55.S70, MPDL3280A, MDX-1105, 및 MEDI4736. 일부 구체예에서, 항체는 서열 번호:19의 HVR-H1 서열, 서열 번호:20의 HVR-H2 서열, 및 서열 번호:21의 HVR-H3 서열을 포함하는 중사슬; 및 서열 번호:22의 HVR-L1 서열, 서열 번호:23의 HVR-L2 서열, 및 서열 번호:24의 HVR-L3 서열을 포함하는 경사슬을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체는 서열 번호:26의 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 부위 및 서열 번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 부위를 포함한다.
상기 양태의 다른 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제는 PD-L2 결합 길항제이다. 일부 구체예에서, PD-L2 결합 길항제는 항체이다. 일부 구체예에서, PD-L2 결합 길항제는 면역접합체(immunoadhesin)이다.
상기 양태의 전술된 구체예 중 어느 하나에서, 암은 유방암(가령 삼중-음성 유방암(TNBC)), 방광암(가령 요로상피 방광암(UBC), 근침윤성 방광암, 및 BCG-불응성 비-근침윤성 방광암), 대장암, 직장 암, 폐암 (가령 편평 또는 비-편평일 수 있는 비-소세포 폐암), 교모세포종, 비- 림프종(NHL), 신세포 암(가령 신세포 암종), 전립선암, 간암, 췌장암, 연-조직 육종, 카포시 육종, 유암종, 두경부암, 위암, 식도암, 전립선암, 자궁내막암, 신장암, 난소암, 중피종, 및 헴 악성종양(가령 골수형성이상 증후군 및 다중 골수종)일 수 있다. 특정한 구체예에서, 암은 폐암(가령 편평 또는 비-편평일 수 있는 비-소세포 폐암), 방광암(가령 UBC), 유방암(가령 TNBC), 신세포 암종, 흑색종, 대장암, 및 헴 악성종양(예컨대, 골수형성이상 증후군(MDS) 및 다중 골수종)일 수 있다. 일부 구체예에서, 폐암은 편평 또는 비-편평일 수 있는 비-소세포 폐암이다. 일부 구체예에서, 방광암은 UBC이다. 일부 구체예에서, 유방암은 TNBC이다. 일부 구체예에서, 헴 악성종양은 MDS 또는 다중 골수종이다.
일부 구체예에서, 개체 내 암세포는 PD-L1를 발현한다. 일부 구체예에서, 탁산은 나브-파클리탁셀(ABRAXANE®), 파클리탁셀, 또는 도세탁셀이다. 일부 구체예에서, 탁산은 나브-파클리탁셀(ABRAXANE®)이다. 일부 구체예에서, 탁산은 파클리탁셀이다.
상기 양태 중 어느 하나의 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및/또는 탁산은 정맥내로, 근육내로, 피하로, 국소로, 경구로, 경피로, 복강내로, 안와내로, 이식에 의해, 흡입에 의해, 척추강내로, 심실내로, 또는 비강내로 투여된다.
상기 양태 중 어느 하나의 일부 구체예에서, 본 방법은 유효량의 화학요법제를 투여하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 화학요법제는 백금-계 화학요법제이다. 일부 구체예에서, 백금-계 화학요법제는 카르보플라틴이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 개체에서 암을 치료하거나 진행을 지연시키기 위한 의약의 제조에서 인간 PD-1 축 결합 길항제의 용도에 관한 것이며, 여기서 의약은 인간 PD-1 축 결합 길항제 및 임의의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하고, 및 여기서 치료는 의약을 탁산 및 임의의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물과 함께 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 개체에서 암을 치료하거나 진행을 지연시키기 위한 의약의 제조에서 탁산의 용도에 관한 것이며, 여기서 의약은 탁산 및 임의의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하고, 및 여기서 치료는 의약을 인간 PD-1 축 결합 길항제 및 임의의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물과 함께 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 개체에서 암을 치료하거나 진행을 지연시키는데 사용하기 위한 인간 PD-1 축 결합 길항제 및 임의의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물에 관한 것이며, 여기서 치료는 상기 조성물을 제2 조성물과 병행 투여하는 것을 포함하고, 여기서 제2 조성물은 탁산 및 임의의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 개체에서 암을 치료하거나 진행을 지연시키는데 사용하기 위한 탁산 및 임의의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물에 관한 것이며, 여기서 치료는 상기 조성물을 제2 조성물과 병행 투여하는 것을 포함하고, 여기서 제2 조성물은 인간 PD-1 축 결합 길항제 및 임의의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 PD-1 축 결합 길항제 및 임의의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 의약, 및 개체에서 암을 치료하거나 진행을 지연시키기 위해 의약을 탁산 및 임의의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물과 함께 병행 투여하기 위한 설명을 포함하는 패키지 삽입물을 포함하는 키트에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 PD-1 축 결합 길항제 및 임의의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제1 의약, 및 탁산 및 임의의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제2 의약을 포함하는 키트에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 키트는 추가로 개체에서 암을 치료하거나 진행을 지연시키기 위해 제1 의약 및 제2 의약을 투여하기 위한 설명을 포함하는 패키지 삽입물을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 탁산 및 임의의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 의약, 및 개체에서 암을 치료하거나 진행을 지연시키기 위해 의약을 PD-1 축 결합 길항제 및 임의의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물과 함께 병행 투여하기 위한 설명을 포함하는 패키지 삽입물을 포함하는 키트에 관한 것이다.
전술된 양태 중 어느 하나에서, PD-1 축 결합 길항제는 PD-1 결합 길항제, PD-L1 결합 길항제, 및 PD-L2 결합 길항제로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제는 PD-1 결합 길항제이다. 일부 구체예에서, PD-1 결합 길항제는 PD-1이 이의 리간드 결합 상대에 결합하는 것을 저해한다. 일부 구체예에서, PD-1 결합 길항제는 PD-1이 PD-L1에 결합하는 것을 저해한다. 일부 구체예에서, PD-1 결합 길항제는 PD-1이 PD-L2에 결합하는 것을 저해한다. 일부 구체예에서, PD-1 결합 길항제는 PD-1이 PD-L1 및 PD-L2 둘다에 결합하는 것을 저해한다. 일부 구체예에서, PD-1 결합 길항제는 항체이다. 일부 구체예에서, PD-1 결합 길항제는 MDX-1106(니볼루맙), MK-3475(람브롤리주맙), CT-011(피딜리주맙), 및 AMP-224로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제는 PD-L1 결합 길항제이다. 일부 구체예에서, PD-L1 결합 길항제는 PD-L1이 PD-1에 결합하는 것을 저해한다. 일부 구체예에서, PD-L1 결합 길항제는 PD-L1이 B7-1에 결합하는 것을 저해한다. 일부 구체예에서, PD-L1 결합 길항제는 PD-L1이 PD-1 및 B7-1 둘다에 결합하는 것을 저해한다. 일부 구체예에서, PD-L1 결합 길항제는 항체이다. 일부 구체예에서, 항체는 다음으로 이루어진 군에서 선택된다: YW243.55.S70, MPDL3280A, MDX-1105, 및 MEDI4736. 일부 구체예에서, 항체는 서열 번호:19의 HVR-H1 서열, 서열 번호:20의 HVR-H2 서열, 및 서열 번호:21의 HVR-H3 서열을 포함하는 중사슬; 및 서열 번호:22의 HVR-L1 서열, 서열 번호:23의 HVR-L2 서열, 및 서열 번호:24의 HVR-L3 서열을 포함하는 경사슬을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체는 서열 번호:26의 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 부위 및 서열 번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 부위를 포함한다.
전술된 양태 중 어느 하나에서, 탁산은 나브-파클리탁셀(ABRAXANE®), 파클리탁셀, 또는 도세탁셀일 수 있다. 일부 구체예에서, 탁산은 나브-파클리탁셀(ABRAXANE®)이다. 일부 구체예에서, 탁산은 파클리탁셀이다.
본 명세서에 기술된 다양한 양태 중 하나, 일부, 또는 모든 특징은 조합되어 본 발명의 다른 구체예를 형성할 수 있음이 주지된다. 본 발명의 이들 및 다른 양태는 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 본 발명의 이들 및 다른 구체예가 이어지는 상세한 설명에 의해 더욱 상술된다.
본 발명은 PD-1 축 결합 길항제 및 탁산을 투여함으로써 암을 치료하고 암을 가진 개체의 면역 기능을 증진하기 위한 방법에 관한 것이다.
도면의 간략한 설명
도 1은 항-PD-L1 항체 및 파클리탁셀+카르보플라틴의 병행 요법이 C57BL/6 마우스의 동계(syngeneic) MC38 대장 종양 모델에서 대조 항체 또는 파클리탁셀+카르보플라틴 단독과 비교할 때 상승적 항-종양 효과를 나타냄을 보여주는 그래프이다. 그래프는 시간의 함수로서 각각의 처리 군의 종양 부피의 삼차 스플라인 정합(cubic spline fit)을 보여준다. 삼차 스플라인 정합은 처리 군당 모든 데이터와 정합하는 가장 매끄러운 곡선을 선택하는 수학적 알고리즘이다. 대략 100-200 mm3로 확립된 피하 MC38 종양을 갖는 마우스에 80 mg/kg의 단일-용량 카르보플라틴을 복강내(IP) 주입하고 더하여 10 mg/kg의 파클리탁셀을 정맥내(IV) 주입하고, 항-gp120 항체 또는 항-PD-L1(클론 25A1 mIgG2a.DANA)을 10 mg/kg씩 3주 동안 한 주에 3차례 투여하여 처리하였다. N=10 마우스/군이다.
도 2A 및 2B는 C57BL/6 마우스의 동계 MC38 대장 종양 모델에서 덱사메타손(Dex)이 항-PD-L1 항체(αPD-L1) 단독요법의 효능을 제거함을 보여주는 그래프이다. 도 2A는 각각의 처리 군의 종양 부피의 삼차 스플라인 정합을 보여주며, 도 2B는 개별적인 마우스에 대한 플롯을 보여준다(격자상(Trellis) 플롯) (검은색 곡선은 각각의 처리 군에 대한 종양 부피의 삼차 스플라인 정합을 보여준다). 도 2B의 각각의 그래프는 대조군의 삼차 스플라인 정합을 나타내는 파선을 내포한다. 도 2B에 있어서, 대략 300 mm3의 수평한 파선은 진행 부피에 대한 기준이다(2x 초기 종양 부피). 32 mm3미만의 종양 부피(도 2B에서 수평한 파선으로 표시됨)가 눈에 보이지만 정확히 측정하기에는 너무 작다. 대략 100-200 mm3로 확립된 피하 MC38 종양을 갖는 마우스에 단일 용량의 식염수 또는 덱사메타손을 4 mg/kg씩 IV 처리하고 12시간 후에, 대조 항-gp120 항체 또는 항-PD-L1(클론 25A1.mIgG2a.DANA)을 3주동안 한 주에 3차례 10 mg/kg씩 IP로 처리하였다. N=10 마우스/군이다.
도 3은 OTI 입양 T 세포 전이 및 백신처리 모델에서 덱사메타손이 항원-특이적 T 세포 반응을 저해함을 보여주는 그래프이다. CD8+ T 세포를 OTI Thy1.1 마우스로부터 정제하고 IV로 2.5 백만개 세포/마우스를 주입하였다. 다음날 수용자 마우스에 전장 오브알부민에 융합된 250 ng의 항-DEC205를 IP로, 이에 더하여 단일 용량의 식염수 또는 4 mg/kg의 덱사메타손을 IV로 백신처리하였다. 이틀 후에 마우스를 안락사시키고 비장으로부터 총 OTI CD8+ 세포를 유세포 분석기로 계수하였다. N= 5 마우스/군이고, 각각의 표시는 개별적인 마우스를 나타낸다. P 값을 양측-검정 독립표본 t-시험에 의해 산출하였다.
도 4A 및 4B는 항-PD-L1 항체 및 나브-파클리탁셀(ABRAXANE®, Abx)+카르보플라틴(Carbo)의 병행 요법이 C57BL/6 마우스의 동계 MC38 대장 종양 모델에서 강한 상승적 항-종양 효과를 나타내고 90일을 초과하여 유지되는 지속적인 완전 관해(4/8 마우스)를 성취함을 보여주는 그래프이다. 그래프는 시간의 함수로서 종양 부피를 보여준다. 도 4A는 각각의 처리 군의 종양 부피의 삼차 스플라인 정합을 보여주며, 도 4B는 개별적인 마우스에 대한 격자상 플롯을 보여준다(검은색 곡선은 각각의 처리 군에 대한 종양 부피의 삼차 스플라인 정합을 보여준다). 도 4B의 각각의 그래프는 대조군의 삼차 스플라인 정합을 나타내는 파선을 내포한다. 도 4B에 있어서, 대략 600 mm3의 수평한 파선은 진행 부피에 대한 기준이다(2x 초기 종양 부피). 32 mm3미만의 종양 부피(도 4B에서 수평한 파선으로 표시됨)가 눈에 보이지만 측정하기에는 너무 작다. 대략 300 mm3로 확립된 피하 MC38 종양을 갖는 마우스에 항-gp120 대조 항체 또는 항-PD-L1 항체(클론 YW243.55.S70 mIgG2a.DANA)를 IP 주입에 의해 10 mg/kg씩 3주 동안 한 주에 3차례 투여하고, 더하여 식염수 또는 카르보플라틴을 IP로 매주 75 mg/kg씩 3주 동안 및 ABRAXANE®을 매주 15 mg/kg씩 iv로 3주 동안, 나타난 바와 같이 처리하였다. N=8 마우스/군이다.
도 5A 및 5B은 항-PD-L1 항체 및 나브-파클리탁셀(ABRAXANE®)+카르보플라틴 요법으로 MC38 일차 종양이 치유된 전술된 마우스(도 1A에 기술된 완전 관해를 성취한 마우스)가 항-종양 T 세포 기억 응답을 일으켰음을 보여주는 그래프이다. 신규한 MC38 종양 세포를 이용하여 이차로 재-시도한 결과, 종양은 치유된 마우스에서 100%(4/4) 성장에 실패했다. 도 5A는 이차 시도 7일 후에 수확된 비장세포가 일차-시도 미경험 마우스에 필적하는 수의 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 가짐을 보여준다. 도 5B는 PMA 및 이오노마이신을 이용한 시험관내 자극에서, 세포내 사이토킨 염색으로 평가했을 때 치유된 마우스로부터의 T 세포가 일차-시도된 마우스에 비해 향상된 인터페론-γ(IFN-γ) 생산을 가짐을 나타내는 유세포 계측 분석 결과를 보여준다. 오차 바(error bar)는 n=5 (일차 시도 마우스) 또는 n=4 (치유된 마우스, 이차 시도)의 표준 편차를 나타내며 유세포 계측 점 플롯은 각각의 군으로부터의 마우스 한 마리를 대표한다. P 값을 양측-검정 독립표본 t-시험에 의해 산출하였다.
도 6A 및 6B는 탁산 및 카르보플라틴과 항-PD-L1 항체(MPDL3280A)의 병행 요법의 효능을 검사하는 단계 1b 임상 시험으로부터의 결과를 보여주는 그래프이다. 도 6A는 MPDL3280A, 나브-파클리탁셀(ABRAXANE®) 및 카르보플라틴을 이용한 처리 후 시간에 따른 종양 크기 변화를 보여주는 그래프이다. 명목 응답률(ORR)은 3명의 완전관해(CR) 및 6명의 부분관해(PR)로 9/14 환자였다. 도 6B는 MPDL3280A와 파클리탁셀+카르보플라틴을 이용한 처리 후 시간에 따른 종양 크기 변화를 보여주는 그래프이다. ORR은 2명의 부분관해로 2/6 환자(33%)였다.
발명의 구체예의 상세한 설명
I. 정의
본 발명을 더 상세하게 서술하기 이전에, 본 발명이 당연히 변동할 수 있는 특정한 조성물 또는 생물학적 시스템에 제한되지 않음이 이해되어야 한다. 또한 본 명세서에서 사용된 용어가 단지 특정한 구체예를 기술할 목적을 위함이며, 제한할 의도가 없음이 이해되어야 한다.
본 상세한 설명 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "하나" 및 "그것"은 본문이 명백하게 달리 언급하지 않는 한 복수를 또한 포함한다. 따라서, 예를 들면, "분자"에 대한 언급은 임의로 둘 이상의 그러한 분자의 조합, 등을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "약"은 당해 기술 분야의 숙련가에게 널리 공지된 개별 수치에 대한 일반적인 오차 범위를 지칭한다. 본 명세서에서 "약" 수치 또는 척도의 언급은 해당 수치 또는 척도 그 자체에 대한 전형을 포함(및 서술)한다.
본 명세서에 기술된 본 발명의 양태 및 구체예가 양태 및 구체예를 "포함하고", "이들로 이루어지고", 및 "이들을 필수로 하여 구성된" 것을 포함함이 이해되어야 한다.
용어 "PD-1 축 결합 길항제"는 PD-1 축 결합 상대와 이의 하나 이상의 결합 상대의 상호작용을 저해하여서, PD-1 신호전달 축에 대한 신호전달로 야기되는 T-세포 기능장애를 제거하고 - 그 결과 T-세포 기능(예컨대, 증식, 사이토킨 생산, 및/또는 표적 세포 제거)을 저장 또는 향상하는 분자를 지칭한다. 본 명세서에서 사용된 PD-1 축 결합 길항제는 PD-1 결합 길항제, PD-L1 결합 길항제, 및 PD-L2 결합 길항제를 포함한다.
용어 "PD-1 결합 길항제"는 PD-1와 이의 하나 이상의 결합 상대, 가령 PD-L1 및/또는 PD-L2의 상호작용으로 생성된 신호 전달을 감소, 차단, 저해, 제거 또는 방해하는 분자를 지칭한다. 일부 구체예에서, PD-1 결합 길항제는 PD-1의 이의 하나 이상의 결합 상대에 대한 결합을 저해하는 분자이다. 특정한 양태에서, PD-1 결합 길항제는 PD-L1 및/또는 PD-L2에 대한 PD-1의 결합을 저해한다. 예를 들면, PD-1 결합 길항제는 항-PD-1 항체, 이의 항원-결합 단편, 면역접합체, 융합 단백질, 올리고펩티드, 그리고 PD-1과 PD-L1 및/또는 PD-L2의 상호작용으로 생성된 신호 전달을 감소, 차단, 저해, 제거 또는 방해하는 기타 분자를 포함한다. 한 구체예에서, PD-1 결합 길항제는 PD-1을 통해 T 림프구 매개 신호전달에서 발현되는 세포 표면 단백질에 의해 매개되거나 이를 통한 음성 보조-자극 신호를 감소시켜 오작동하는 T-세포를 덜 오작동하게 만든다(예컨대, 항원 인식에 대한 수식인자 반응을 향상시킴). 일부 구체예에서, PD-1 결합 길항제는 항-PD-1 항체이다. 특정한 양태에서, PD-1 결합 길항제는 본 명세서에 기술된 MDX-1106(니볼루맙)이다. 또 다른 특정한 양태에서, PD-1 결합 길항제는 본 명세서에 기술된 MK-3475(람브롤리주맙)이다. 또 다른 특정한 양태에서, PD-1 결합 길항제는 본 명세서에 기술된 CT-011(피딜리주맙)이다. 또 다른 특정한 양태에서, PD-1 결합 길항제는 본 명세서에 기술된 AMP-224이다.
용어 "PD-L1 결합 길항제"는 PD-L1과 이의 하나 이상의 결합 상대, 가령 PD-1 및/또는 P7-1의 상호작용으로 생성된 신호 전달을 감소, 차단, 저해, 제거 또는 방해하는 분자를 지칭한다. 일부 구체예에서, PD-L1 결합 길항제는 PD-L1의 이의 결합 상대에 대한 결합을 저해하는 분자이다. 특정한 양태에서, PD-L1 결합 길항제는 PD-1 및/또는 B7-1에 대한 PD-L1의 결합을 저해한다. 일부 구체예에서, PD-L1 결합 길항제는 항-PD-L1 항체, 이의 항원-결합 단편, 면역접합체, 융합 단백질, 올리고펩티드 및 PD-L1과 이의 하나 이상의 결합 상대, 가령 PD-1 및/또는 B7-1의 상호작용으로 생성된 신호전달을 감소, 차단, 저해, 제거 또는 방해하는 기타 분자를 포함한다. 한 구체예에서, PD-L1 결합 길항제는 PD-L1을 통해 T 림프구 매개 신호전달에서 발현되는 세포 표면 단백질에 의해 매개되거나 이를 통한 음성 보조-자극 신호를 감소시켜 오작동하는 T-세포를 덜 오작동하게 만든다(예컨대, 항원 인식에 대한 수식인자 반응을 향상시킴). 일부 구체예에서, PD-L1 결합 길항제는 항-PD-L1 항체이다. 특정한 양태에서, 항-PD-L1 항체는 본 명세서에 기술된 YW243.55.S70이다. 또 다른 특정한 양태에서, 항-PD-L1 항체는 본 명세서에 기술된 MDX-1105이다. 또 다른 특정한 양태에서, 항-PD-L1 항체는 본 명세서에 기술된 MPDL3280A이다. 또 다른 특정한 양태에서, 항-PD-L1 항체는 본 명세서에 기술된 MEDI4736이다.
용어 "PD-L2 결합 길항제"는 PD-L2와 이의 하나 이상의 결합 상대, 가령 PD-1의 상호작용으로 생성된 신호 전달을 감소, 차단, 저해, 제거 또는 방해하는 분자를 지칭한다. 일부 구체예에서, PD-L2 결합 길항제는 PD-L2의 이의 하나 이상의 결합 상대에 대한 결합을 저해하는 분자이다. 특정한 양태에서, PD-L2 결합 길항제는 PD-1에 대한 PD-L2의 결합을 저해한다. 일부 구체예에서, PD-L2 결합 길항제는 항-PD-L2 항체, 이의 항원 결합 단편, 면역접합체, 융합 단백질, 올리고펩티드 및 PD-L2와 이의 하나 이상의 결합 상대, 가령 PD-1의 상호작용으로 생성된 신호전달을 감소, 차단, 저해, 제거 또는 방해하는 기타 분자를 포함한다. 한 구체예에서, PD-L2 결합 길항제는 PD-L2를 통해 T 림프구 매개 신호전달에서 발현되는 세포 표면 단백질에 의해 매개되거나 이를 통한 음성 보조-자극 신호를 감소시켜 오작동하는 T-세포를 덜 오작동하게 만든다(예컨대, 항원 인식에 대한 수식인자 반응을 향상시킴). 일부 구체예에서, PD-L2 결합 길항제는 면역접합체이다.
본 명세서에서 사용된 "탁산"은 튜불린에 결합하여, 미세소관 조립 및 안정화를 촉진하고 및/또는 미세소관 해체를 방지하는 디테르펜이다. 본 명세서에서 포함된 탁산은 탁소이드 10-데아세틸박카틴 III 및/또는 이의 유도체를 포함한다. 예시적인 탁산은 파클리탁셀(즉, TAXOL®, CAS # 33069-62-4), 도세탁셀(즉, TAXOTERE®, CAS # 114977-28-5), 라로탁셀, 카바지탁셀, 밀라탁셀, 테세탁셀, 및/또는 오라탁셀을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예에서, 탁산은 알부민-코팅된 나노입자(예컨대, 나노-알부민 결합된 (나브)-파클리탁셀, 즉, ABRAXANE® 및/또는 나브-도세탁셀, ABI-008)이다. 일부 구체예에서, 탁산은 나브-파클리탁셀(ABRAXANE®)이다. 일부 구체예에서, 탁산은 CREMAPHOR® 내에 (예컨대, TAXOL®) 및/또는 Tween 가령 폴리소르베이트 80 내에 (예컨대, TAXOTERE®) 제형화된다. 일부 구체예에서, 탁산은 리포좀-캡슐화된 탁산이다. 일부 구체예에서, 탁산은 탁산의 프로드러그 형태 및/또는 공액결합된 형태이다(예컨대, 파클리탁셀에 공유적으로 공액결합된 DHA , 파클리탁셀 폴리글루멕스, 및/또는 리놀레일 카르보네이트-파클리탁셀). 일부 구체예에서, 파클리탁셀은 실질적으로 계면활성제 없이(예컨대, CREMAPHOR 및/또는 Tween-가령 TOCOSOL® 파클리탁셀의 부재에서) 제형화된다.
면역 기능장애의 맥락에서 용어 "기능장애"는 항원성 자극에 대해 면역 반응성이 감소된 상태를 지칭한다. 상기 용어는 항원 인식이 일어날 수 있는데도, 이어지는 면역 반응이 감염 또는 종양 성장을 제어하는데 효과적이지 못한 "고갈" 및/또는 "무반응" 둘 다의 공통적인 요소를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "오작동하는"은 또한 항원 인식에 대한 불응답 또는 무반응, 상세하게는, 항원 인식을 하류 T-세포 수식인자 기능, 가령 증식, 사이토킨 생산(예컨대, IL-2) 및/또는 표적 세포 파괴로 번역하는 능력이 손상된 것을 포함한다.
용어 "무반응"은 T-세포 수용체를 통해 전달된 불완전하거나 불충분한 신호로 야기된 항원 자극(예컨대, 라스(ras)-활성화의 부재 하에 세포내 Ca+2의 증가)에 대해 반응하지 않는 상태를 지칭한다. T 세포 무반응은 또한 보조-자극의 부재 하에 항원으로의 자극으로 생성되며, 세포가 보조-자극의 존재 하에서도 항원에 의한 추후 활성화에 불응성이 되게 만들 수 있다. 무반응 상태는 흔히 인터류킨-2의 존재에 의해 무효화될 수 있다. 무반응 T-세포는 클론 확대로 이어지거나 및/또는 수식인자 기능을 획득하지 않는다.
용어 "고갈"은 많은 만성 감염 및 암에서 발생하는 지속적인 TCR 신호전달로부터 일어나는 T 세포 기능장애 상태로서 T 세포 고갈을 지칭한다. 고갈은 불완전하거나 부족한 신호전달을 통해서가 아니라, 지속적인 신호전달로 인해 발생한다는 점에서 무반응과 구별된다. 고갈은 불량한 수식인자 기능, 저해 수용체의 지속적인 발현 및 기능적 수식인자 또는 기억 T 세포의 상태와 구별되는 전사 상태에 의해 규명된다. 고갈은 감염 및 종양의 최적 제어를 방해한다. 고갈은 외부의 음성 조절 경로(예컨대, 면역조절 사이토킨)뿐 아니라 세포 내부의 음성 조절(보조자극) 경로(PD-1, B7-H3, B7-H4, 등)로부터 발생될 수 있다.
"T-세포 기능의 향상"은 T-세포가 지속적인 또한 증폭된 생물학적 기능을 가지도록, 또는 고갈되거나 비활성화된 T-세포가 재생 또는 재활성화되도록 유도, 유발 또는 자극하는 것을 의미한다. T-세포 기능의 향상의 예시는 다음을 포함한다: 개입 전의 그러한 수준에 비하여 CD8+ T-세포로부터의 γ-인터페론의 분비 증가, 증식 증가, 항원 반응성(예컨대, 바이러스, 병원체, 또는 종양 제거) 증가. 한 구체예에서, 향상의 수준은 적어도 50%, 대안적으로 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 150%, 또는 200% 향상과 같다. 이러한 향상을 측정하는 방식은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다.
"T 세포 이상기능 장애"는 항원 자극에 대해 감소된 반응성을 특징으로 하는 T-세포의 장애 또는 용태이다. 특정 구체예에서, T-세포 이상기능 장애는 PD-1을 통한 신호전달이 부적절하게 감소된 것과 특정하게 연관된 장애이다. 또 다른 구체예에서, T-세포 이상기능 장애는 T-세포가 무반응이거나 또는 사이토킨을 분비하거나, 증식하거나, 세포용해 활동을 실행하는 능력이 감소된 장애이다. 특정한 양태에서, 감소된 반응성은 병원체 또는 면역원을 발현하는 종양의 비효과적인 제어를 야기한다. T-세포 기능장애를 특징으로 하는 T 세포 이상기능 장애의 예시는 미해결(unresolved) 급성 감염, 만성 감염 및 종양 면역을 포함한다.
"종양 면역"은 종양이 면역 인식 및 제거를 회피하는 과정을 지칭한다. 따라서, 치료적 개념으로서, 종양 면역은 그러한 회피가 약화될 때, 및 종양이 면역 시스템에 의해 인식되고 공격받을 때 "치료된다". 종양 인식의 예시는 종양 결합, 종양 수축 및 종양 제거를 포함한다.
"면역원성"은 특정 물질의 면역 반응을 일으키는 능력을 지칭한다. 종양은 면역원성이며 종양 면역원성의 향상은 면역 반응에 의한 종양 세포의 제거를 돕는다. 종양 면역원성의 향상의 예시는 PD-1 축 결합 길항제 및 탁산을 이용한 처리를 포함한다.
"지속된 반응"은 치료의 중지 후에도 종양 성장을 감소시키는 데 대한 지속된 효과를 지칭한다. 예를 들면, 종양 크기는 투여 단계의 시작시 크기에 비해 동일하거나 더 작게 유지될 수 있다. 일부 구체예에서, 지속된 반응은 적어도 처리 기간과 동일한 기간을 가지며, 처리 기간의 적어도 1.5X, 2.0X, 2.5X, 또는 3.0X 기간을 가진다.
본 명세서에서 사용된, "암 재발 감소 또는 저해"는 종양 또는 암의 재발 또는 종양 또는 암의 진행을 감소 또는 저해하는 것을 의미한다. 본 명세서에 개시된, 암 재발 및/또는 암 진행은 제한없이, 암 전이를 포함한다.
본 명세서에서 사용된, "완전관해" 또는 "CR"은 모든 표적 병변이 사라진 것을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된, "부분관해" 또는 "PR"은 기초선 SLD을 기준으로 삼을 때 표적 병변의 가장 긴 직경(SLD)의 총합에서 적어도 30% 감소를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된, "불변 질환" 또는 "SD"는 치료가 시작된 이래 가장 작은 SLD를 기준으로 삼을 때 표적 병변이 PR로 규정하기에 불충분하게 수축되고, PD로 규정하기에도 불충분하게 증가된 것을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된, "진행 질환" 또는 "PD"는 치료가 시작된 이래 또는 하나 이상의 신규한 병변의 존재시 기록된 가장 작은 SLD를 기준으로 삼을 때, 표적 병변의 SLD가 적어도 20% 증가된 것을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된, "진행 없는 생존"(PFS)은 치료 도중 및 이후에 치료되는 질환(예컨대, 암)이 악화되지 않는 시간의 길이를 지칭한다. 진행-없는 생존은 환자가 완전관해 또는 부분관해를 경험한 시간의 양, 뿐만 아니라 환자가 불변 질환을 경험한 시간의 양을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된, "총 응답률" 또는 "명목 응답률"(ORR)은 완전관해(CR) 비율 및 부분관해(PR) 비율의 합을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된, "총 생존"(OS)은 특정한 기간 후에 생존할 가능성이 있는 군 내 개체의 백분율을 지칭한다.
용어 "약제학적 제형"은 그러한 형태가 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 허용하고, 및 제형을 투여받는 개체에게 허용되지 않는 독성을 갖는 부가 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다. 그러한 제형은 무균이다. "약제학적으로 허용되는" 부형제(비히클, 첨가제)는 사용되는 활성 성분의 효과적인 용량을 제공하기 위해 대상 포유동물에게 합리적으로 투여될 수 있는 것들이다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "치료"는 임상 병리의 과정 도중 치료되는 개체 또는 세포의 자연적인 과정을 개조하도록 고안된 임상적인 개입을 지칭한다. 치료의 요망되는 효과는 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 차도 또는 향상된 예후를 포함한다. 예를 들면, 개체는 암성 세포의 증식 감소(또는 파괴), 질환으로 야기된 증상의 감소, 질환으로 고통받는 개체의 삶의 질 증가, 질환을 치료하기 위해 요구되는 다른 의약의 투여량 감소, 및/또는 개체의 생존 연장을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 방식으로 암과 연관된 하나 이상의 증상이 완화 또는 제거될 때 성공적으로 "치료된다".
본 명세서에서 사용된, 질환의 "진행 지연"은 질환(가령 암)의 발달을 연기, 방해, 늦춤, 지연, 안정화 및/또는 미루는 것을 의미한다. 이러한 지연은 치료되는 질환 및/또는 개체의 병력에 따라, 다양한 길이의 시간을 가질 수 있다. 당해 분야의 숙련가에게 명백할 바와 같이, 충분한 또는 상당한 지연은, 사실상, 개체에서 질환이 발생하지 않는 예방을 포함한다. 예를 들면, 암 말기 단계, 가령 전이의 발달이 지연될 수 있다.
"유효량"은 특정 장애의 측정가능한 향상 또는 예방을 일으키기 위해 요구되는 적어도 최소의 양이다. 본 명세서에서 유효량은 환자의 질환 상태, 연령, 성별, 및 체중과 같은 요인, 및 개체에서 요망되는 반응을 일으키는 작용제의 능력에 따라 달라질 수 있다. 유효량은 또한 치료제의 임의의 독성 또는 유해한 효과가 치료적으로 유익한 효과에 의해 상쇄되는 양이다. 예방적 용도에 있어서, 유익한 또는 요망되는 결과는 질환의 생화학적, 조직학적 및/또는 거동적 증상, 이의 합병증 및 질환의 발달 도중 나타나는 중간 병리적 표현형을 비롯한 위험의 제거 또는 감소, 중증도 약화, 또는 질환 개시의 지연과 같은 결과를 포함한다. 치료적 용도에 있어서, 유익한 또는 요망되는 결과는 질환으로 야기된 하나 이상의 증상 감소, 질환으로 고통받는 개체의 삶의 질 증가, 질환을 치료하기 위해 요구되는 다른 의약의 투여량 감소, 및 또 다른 의약, 가령 표적화 경유 의약의 효과 향상, 질환의 진행 지연, 및/또는 생존 연장과 같은 임상 결과를 포함한다. 암 또는 종양의 경우에, 유효량의 약물은 암 세포의 수를 줄이고; 종양 크기를 줄이고; 주변 장기로의 암 세포 침투를 저해하고(즉, 어느 정도까지 늦추거나 바람직하게는 중지시키고); 종양 전이를 저해하고(즉, 어느 정도까지 늦추고 바람직하게는 중지시키고); 어느 정도까지 종양 성장을 저해하고; 및/또는 어느 정도까지 장애와 연관된 하나 이상의 증상을 완화시키는 효과를 가질 수 있다. 유효량은 하나 이상의 투여로 투여될 수 있다. 본 발명의 목적에 있어서, 약물, 화합물, 또는 약제학적 조성물의 유효량은 직접 또는 간접적으로 예방 또는 치료적 처리를 달성하기에 충분한 양이다. 임상적 맥락에서 이해되는 바와 같이, 약물, 화합물, 또는 약제학적 조성물의 유효량은 또 다른 약물, 화합물, 또는 약제학적 조성물과 함께 성취되거나 성취되지 않을 수 있다. 따라서, "유효량"은 하나 이상의 치료제를 투여하는 맥락에서 고려될 수 있고, 단일 물질은 만약 하나 이상의 다른 물질과 함께, 요망되는 결과를 성취할 수 있거나 성취하는 경우 효과적인 양으로 제공된다고 고려될 수 있다.
본 명세서에서 사용된, "와 함께"는 하나의 치료 요법을 또 다른 치료 요법에 더하여 투여하는 것을 지칭한다. 따라서, "와 함께"는 하나의 치료 요법을 개체에게 다른 치료 요법을 투여하기 전, 도중, 또는 후에 투여하는 것을 지칭한다.
"장애"는 치료로부터 이익을 얻을 수 있는 임의의 용태이며, 문제의 장애를 포유동물에게 일으키는 병리적 용태를 비롯한 만성 및 급성 장애 또는 질환을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
용어 "세포 증식성 장애" 및 "증식성 장애"는 일정 수준의 이상 세포 증식과 연관된 장애를 지칭한다. 한 구체예에서, 세포 증식성 장애는 암이다. 한 구체예에서, 세포 증식성 장애는 종양이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "종양"은 악성이든 양성이든, 모든 신생물 세포 성장 및 증식, 및 모든 전-암성 및 암성 세포 및 조직을 지칭한다. 용어 "암", "암성", "세포 증식성 장애", "증식성 장애" 및 "종양"은 본 명세서에서 지칭된 것처럼 서로 배제하지 않는다.
용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 용태를 지칭하거나 서술한다. 암의 예시는 암종, 림프종, 아세포종, 육종, 및 백혈병 또는 림프양 악성종양을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 그러한 암의 더욱 특정한 예시는 편평세포암(예컨대, 상피 편평세포암), 폐암 가령 소-세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평 암종, 복막암, 간세포암, 위암 또는 위장암 가령 위장관암 및 위장 기질의 암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암(예컨대, 요로상피 방광암(UBC), 근침윤성 방광암(MIBC), 및 BCG-불응성 비-근침윤성 방광암(NMIBC)), 요로의 암, 간암, 유방암(예컨대, HER2+ 유방암 및 삼중-음성 유방암(TNBC), 이는 에스트로겐 수용체(ER-), 프로게스테론 수용체(PR-), 및 HER2(HER2-) 음성임), 결장암, 직장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신암 또는 신장암(예컨대, 신세포 암종(RCC), 전립선암, 음문암, 갑상선암, 간 암종, 항문암, 음경 암종, 흑색종, 표재 확장성 흑색종, 악성 흑색점 흑색종, 말단 흑색점 흑색종, 결절성 흑색종, 다중 골수종 및 B-세포 림프종(가령 저등급/소포성 비-호지킨(Hodgkin)성 림프종(NHL); 소형 림프구성(SL) NHL; 중간 등급/소포성 NHL; 중간 등급 미만성 NHL; 고등급 면역아세포 NHL; 고등급 림프모구 NHL; 고등급 소형 비-분할 세포 NHL; 거대 종양 NHL; 외투 세포 림프종; AIDS-연관 림프종; 및 발덴스트롬(Waldenstrom) 마크로글로불린혈증); 만성 림프구성 백혈병(CLL); 급성 림프모구 백혈병(ALL); 급성 골수성 백혈병(AML); 유모세포 백혈병; 만성 골수아구성 백혈병(CML); 및 이식-후 림프증식성 장애(PTLD), 골수형성이상 증후군(MDS), 그리고 모반증과 연관된 이상 혈관 증식, 수종(가령 뇌 종양 연관), 메이그즈(Meigs) 증후군, 뇌암, 뿐 아니라 두경부암, 및 연관성 전이를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 구체예에서, 본 발명의 방법 및 조성물에 의해 치료될 수 있는 암은 유방암(예컨대, 삼중-음성 유방암), 방광암(예컨대, UBC, MIBC, 및 NMIBC), 대장암, 직장암, 폐암(예컨대, 편평 또는 비-편평일 수 있는 비-소세포 폐암), 교모세포종, 비-호지킨성 림프종(NHL), 신세포암(예컨대, RCC), 전립선암, 간암, 췌장암, 연-조직 육종, 카포시 육종, 유암종, 두경부암, 난소암, 중피종, 및 헴 악성종양(예컨대, MDS 및 다중 골수종)을 포함한다. 일부 구체예에서, 암은 다음 중에서 선택된다: 소세포 폐암, 교모세포종, 신경모세포종, 흑색종, 유방 암종, 위암, 대장암(CRC), 및 간세포 암종. 다른 구체예에서, 암은 다음 중에서 선택된다: 이들 암의 전이 형태를 비롯한 비-소세포 폐암, 대장암, 교모세포종 및 유방 암종. 특정한 구체예에서, 암은 폐암(예컨대, 편평 또는 비-편평일 수 있는 비-소세포 폐암, 방광암(예컨대, UBC), 유방암(예컨대, TNBC), RCC, 흑색종, 대장암, 및 헴 악성종양(예컨대, MDS 및 다중 골수종) 중에서 선택된다. 일부 구체예에서, 폐암은 편평 또는 비-편평일 수 있는 비-소세포 폐암이다. 일부 구체예에서, 방광암은 UBC이다. 일부 구체예에서, 유방암은 TNBC이다. 일부 구체예에서, 헴 악성종양은 MDS 또는 다중 골수종이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "세포독성제"는 세포에게 유해한(예컨대, 세포사를 유발하거나, 증식을 저해하거나, 또는 달리 세포 기능을 방해하는) 임의의 물질을 지칭한다. 세포독성제는 방사성 동위원소(예컨대, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학요법제; 성장 저해제; 효소 및 이들의 단편 가령 핵산분해 효소; 및 독소 가령 소형 분자 독소 또는 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 유래의 효소적으로 활성인 독소, 가령 이들의 단편 및/또는 변이체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 세포독성제는 항-미세소관 물질, 백금 배위 복합체, 알킬화제, 항생제, 토포이소머라제 II 저해제, 대사길항물질, 토포이소머라제 I 저해제, 호르몬 및 호르몬 유사체, 신호 전달 경로 저해제, 비-수용체 티로신 키나아제 혈관형성 저해제, 면역치료제, 세포사 촉진제, LDH-A 저해제, 지방산 생합성 저해제, 세포 주기 신호 저해제, HDAC 저해제, 프로테아좀 저해제, 및 암 대사 저해제 중에서 선택될 수 있다. 한 구체예에서 세포독성제는 백금-계 화학요법제이다. 한 구체예에서 세포독성제는 EGFR의 길항제이다. 한 구체예에서 세포독성제는 N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스-(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-4-아민(예컨대, 엘로티닙, TARCEVA™)이다. 한 구체예에서 세포독성제는 RAF 저해제이다. 한 구체예에서, RAF 저해제는 BRAF 및/또는 CRAF 저해제이다. 한 구체예에서 RAF 저해제는 베무라페닙이다. 한 구체예에서 세포독성제는 PI3K 저해제이다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화합물을 포함한다. 화학요법제의 예시는 엘로티닙(TARCEVA®, Genentech/OSI Pharm.), 보르테조밉(VELCADE®, Millennium Pharm.), 디설피람, 에피갈로카테친 갈레이트, 살리노스포라미드 A, 카르필조밉, 17-AAG(젤다나마이신), 라디시콜, 락테이트 탈수소화효소 A(LDH-A), 풀베스트란트(FASLODEX®, AstraZeneca), 수니팁(SUTENT®, Pfizer/Sugen), 레트로졸(FEMARA®, Novartis), 이마티닙 메실레이트(GLEEVEC®, Novartis), 피나수네이트(VATALANIB®, Novartis), 옥살리플라틴(ELOXATIN®, Sanofi), 5-FU(5-플루오로우라실), 류코보린, 라파마이신(시롤리무스(Sirolimus), RAPAMUNE®, Wyeth), 라파티닙(TYKERB®, GSK572016, Glaxo Smith Kline), 로나파닙(SCH 66336), 소라페닙(NEXAVAR®, Bayer Labs), 게피티닙(IRESSA®, AstraZeneca), AG1478, 알킬화제 가령 티오테파 및 CYTOXAN® 시클로포스파미드; 알킬 설포네이트 가령 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘 가령 벤조도파, 카르보쿠온, 마투레도파, 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸아멜라민 가령 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸로멜라민; 아세토제닌(특히 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신(가령 토포테칸 및 이리노테칸); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065(가령 이의 아도제레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체); 크립토피신(특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 아드레노코르티코스테로이드(가령 프레드니손 및 프레드니솔론); 시프로테론 아세테이트; 5α-환원효소 가령 피나스테리트 및 두타스테리드); 보리노스탯, 로미뎁신, 파노비노스탯, 발프로산, 모세티노스탯 돌라스타틴; 알데스류킨, 탈크 듀오카마이신(가령 합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1); 엘류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코틱틴; 스폰지스타틴; 질소 머스터드 가령 클로람부실, 클로마파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥사이드 염화수소산염, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로소우레아 가령 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라님누스틴; 항생제 가령 에네딘 항생제(예컨대, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 γ1I 및 칼리케아미신 ω1I (Angew Chem. Intl. Ed. Engl. 33:183-186 (1994)); 디네미신, 가령 디네미신 A; 비스포스포네이트, 가령 클로드로네이트; 에스페라미신; 그리고 네오카르지노스타틴 발색단 및 연관된 색소단백질 에네딘 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 크로모미시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, ADRIAMYCIN®(독소루비신), 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신 가령 미토마이신 C, 미코페놀 산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포르피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사산물 가령 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU); 폴산 유사체 가령 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체 가령 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체 가령 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스우리딘; 안드로겐 가령 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-부신 가령 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 폴산 보충제 가령 후롤린 산; 머캅토퓨린아세토글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린 산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데모콜신; 디아지쿠온; 엘포미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 마이탄시노이드 가령 마이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미토잔트론; 모피담놀; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로소잔트론; 포도필린 산; 2-에틸하이드라지드; 프로카르바진; PSK® 다당류 복합체(JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); 라족산; 리족신; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누아존 산; 트리아지쿠온; 2,2',2''-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센(특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안귀딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 티오테파; 탁산; 클로람부실; GEMZAR®(젬시타빈); 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 빈블라스틴; 에토포시드(VP-16); 이포스파미드; 미토잔트론; 빈크리스틴; NAVELBINE®(비노렐빈); 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 카페시타빈(XELODA®); 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소머라제 저해제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노이드 가령 레티노산; 및 상기 어느 하나의 약제학적으로 허용되는 염, 산 및 유도체를 포함한다.
화학요법제는 또한 "백금-계" 화학요법제를 포함하며, 이는 분자의 필수 요소로서 백금을 내포하는 유기 화합물을 포함한다. 전형적으로 백금-계 화학요법제는 백금의 배위 복합체이다. 백금-계 화학요법제는 종종 당해 분야에서 "플라틴(platin)"이라고 불린다. 백금-계 화학요법제의 예시는, 카르보플라틴, 시스플라틴, 및 옥살리플라틴을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
화학요법제는 또한 (i) 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 저해하도록 작용하는 항-호르몬제 가령 항-에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절제(SERM), 가령, 예를 들면, 타목시펜(가령 NOLVADEX®; 타목시펜 시트레이트), 랄록시펜, 드롤록시펜, 아이오독시펜, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 FARESTON®(토레미펜 시트레이트); (ii) 부신 내 에스트로겐 생산을 조절하는 효소 아로마타제를 저해하는 아로마타제 저해제 가령, 예를 들면, 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, MEGASE®(메게스트롤 아세테이트), AROMASIN®(엑세메스탄; Pfizer), 포르메스타니에, 파드로졸, RIVISOR®(보로졸), FEMARA®(레트로졸; Novartis), 및 ARIMIDEX®(아나스트로졸; AstraZeneca); (iii) 항-안드로겐 가령 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드 및 고세렐린; 부세렐린, 트립테렐린, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 디에틸스틸베스트롤, 프레마린, 플루옥시메스테론, 모든 트랜스레티온산, 펜레티니드, 뿐만 아니라 트록사시타빈(1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); (iv) 단백질 키나아제 저해제; (v) 지질 키나아제 저해제; (vi) 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 비정상적인 세포 증식의 원인이 되는 신호전달 경로에서 유전자 발현을 저해하는 것들, 가령, 예를 들면, PKC-알파, Ralf 및 H-Ras; (vii) 리보자임 가령 VEGF 발현 저해제(예컨대, ANGIOZYME®) 및 HER2 발현 저해제; (viii) 백신 가령 유전자 요법 백신, 예를 들면, ALLOVECTIN®, LEUVECTIN®, 및 VAXID®; PROLEUKIN®, rIL-2; 토포이소머라제 1 저해제 가령 LURTOTECAN®; ABARELIX® rmRH; 및 (ix) 상기 어느 하나의 약제학적으로 허용되는 염, 산 및 유도체를 포함한다.
화학요법제는 또한 항체 가령 알렘투주맙(Campath), 베바시주맙(AVASTIN®, Genentech); 세툭시맙(ERBITUX®, Imclone); 파니투무맙(VECTIBIX®, Amgen), 리툭시맙(RITUXAN®, Genentech/Biogen Idec), 페르투주맙(OMNITARG®, 2C4, Genentech), 트라스투주맙(HERCEPTIN®, Genentech), 토시투모맙(Bexxar, Corixia), 및 항체 약물 접합체, 겜투주맙 오조가미신(MYLOTARG®, Wyeth)을 포함한다. 본 발명의 화합물과 조합되는 물질로서 치료 능력을 가지는 추가적인 인간화 단클론 항체는 다음을 포함한다: 아폴리주맙, 아셀리주맙, 아틀리주맙, 바피노이주맙, 비바투주맙 메르탄신, 칸투주맙 메르탄신, 세델리주맙, 세르톨리주맙 페골, 시드푸시투주맙, 시드투주맙, 다쿨리주맙, 에쿨리주맙, 에팔리주맙, 에파라투주맙, 에를리주맙, 펠비주맙, 폰톨리주맙, 겜투주맙 오조가미신, 이노투주맙 오조가미신, 이필리무맙, 라베투주맙, 린투주맙, 마투주맙, 메폴리주맙, 모타비주맙, 모토비주맙, 나탈리주맙, 니모투주맙, 놀로비주맙, 누마비주맙, 오크렐리주맙, 오말리주맙, 팔리비주맙, 파르콜리주맙, 펙푸시투주맙, 펙투주맙, 펙셀리주맙, 랄리비주맙, 라니비주맙, 레슬리비주맙, 레슬리주맙, 레시비주맙, 로벨리주맙, 루플리주맙, 시브로투주맙, 시플리주맙, 손투주맙, 타카투주맙 테트락세탄, 타도시주맙, 탈리주맙, 테피바주맙, 토실리주맙, 토랄리주맙, 투코투주맙 셀모류킨, 투쿠시투주맙, 우마비주맙, 우르톡사주맙, 우스테키누맙, 비실리주맙, 및 항-인터류킨-12(ABT-874/J695, Wyeth Research and Abbott Laboratories), 이는 인터류킨-12 p40 단백질을 인식하도록 유전자 조작된 재조합 인간 단독-서열, 전장 IgG1 λ 항체이다.
화학요법제는 또한 "EGFR 저해제"를 포함하며 이는 EGFR에 결합하거나 달리 직접 상호작용하고 이의 신호전달 활성을 방지하거나 감소시키는 화합물을 지칭하며, 대안적으로 "EGFR 길항제"로 지칭된다. 그러한 물질의 예시는 EGFR에 결합하는 항체 및 소형 분자를 포함한다. EGFR에 결합하는 항체의 예시는 MAb 579(ATCC CRL HB 8506), MAb 455(ATCC CRL HB8507), MAb 225(ATCC CRL 8508), MAb 528(ATCC CRL 8509) (US 특허 제4,943,533호를 참조) 및 이들의 변이체, 가령 키메라화 225(C225 또는 세툭시맙; ERBUTIX®) 및 재형성된 인간 225(H225) (예컨대, WO 96/40210호, Imclone Systems Inc.를 참조); IMC-11F8, 완전한 인간, EGFR-표적화 항체(Imclone); 유형 II 돌연변이 EGFR에 결합하는 항체(US 특허 제5,212,290호); US 특허 제5,891,996호에 기술된 바와 같이 EGFR에 결합하는 인간화 및 키메라 항체; 및 EGFR에 결합하는 인간 항체, 가령 ABX-EGF 또는 파니투무맙(WO98/50433호, Abgenix/Amgen를 참조); EMD 55900(Stragliotto et al,.Eur. J. Cancer 32A:636-640 (1996)); EMD7200(마투주맙) EGFR를 겨냥하지만 EGFR 결합을 위해 EGF 및 TGF-알파 둘다와 경쟁하는 인간화 EGFR 항체(EMD/Merck); 인간 EGFR 항체, HuMax-EGFR(GenMab); E1.1, E2.4, E2.5, E6.2, E6.4, E2.11, E6. 3 및 E7.6. 3로 공지되며 US 제6,235,883호에 기술된 완전 인간 항체; MDX-447(Medarex Inc); 및 mAb 806 또는 인간화 mAb 806(Johns et al., J. Biol. Chem. 279(29):30375-30384 (2004))를 포함한다. 항-EGFR 항체는 세포독성제와 공액결합될 수 있고, 따라서 면역접합체를 생성할 수 있다(예컨대, EP659439A2, Merck Patent GmbH를 참조). EGFR 길항제는 US 특허 번호: 제5,616,582호, 제5,457,105호, 제5,475,001호, 제5,654,307호, 제5,679,683호, 제6,084,095호, 제6,265,410호, 제6,455,534호, 제6,521,620호, 제6,596,726호, 제6,713,484호, 제5,770,599호, 제6,140,332호, 제5,866,572호, 제6,399,602호, 제6,344,459호, 제6,602,863호, 제6,391,874호, 제6,344,455호, 제5,760,041호, 제6,002,008호, 및 제5,747,498호, 그리고 다음의 PCT 공보: WO98/14451호, WO98/50038호, WO99/09016호, 및 WO99/24037호에 기술된 화합물과 같은 소형 분자를 포함한다. 특정한 소형 분자 EGFR 길항제는 OSI-774(CP-358774, 엘로티닙, TARCEVA® Genentech/OSI Pharmaceuticals); PD 183805(CI 1033, 2-프로펜아미드, N-[4-[(3-클로로-4-플루오로페닐)아미노]-7-[3-(4-모르폴리닐)프로폭시]-6-퀴나졸리닐]-, 디하이드로클로라이드, Pfizer Inc.); ZD1839, 게피티닙(IRESSA®) 4-(3'-클로로-4'-플루오로아닐리노)-7-메톡시-6-(3-모르폴리노프로폭시)퀴나졸린, AstraZeneca); ZM 105180((6-아미노-4-(3-메틸페닐-아미노)-퀴나졸린, Zeneca); BIBX-1382(N8-(3-클로로-4-플루오로-페닐)-N2-(1-메틸-피페리딘-4-일)-피리미도[5,4-d]피리미딘-2,8-디아민, Boehringer Ingelheim); PKI-166((R)-4-[4-[(1-페닐에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-6-일]-페놀); (R)-6-(4-하이드록시페닐)-4-[(1-페닐에틸)아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘); CL-387785(N-[4-[(3-브로모페닐)아미노]-6-퀴나졸리닐]-2-부틴아미드); EKB-569(N-[4-[(3-클로로-4-플루오로페닐)아미노]-3-시아노-7-에톡시-6-퀴놀리닐]-4-(디메틸아미노)-2-부텐아미드) (Wyeth); AG1478(Pfizer); AG1571(SU 5271; Pfizer); 이중 EGFR/HER2 티로신 키나제 저해제 가령 라파티닙(TYKERB®, GSK572016 또는 N-[3-클로로-4-[(3 플루오로페닐)메톡시]페닐]-6[5[[[2메틸설포닐)에틸]아미노]메틸]-2-푸라닐]-4-퀴나졸린아민)을 포함한다.
화학요법제는 또한 "티로신 키나제 저해제" 가령 전술된 단락에서 주목한 EGFR-표적화 약물; 소형 분자 HER2 티로신 키나제 저해제 가령 Takeda에서 입수가능한 TAK165; CP-724,714, ErbB2 수용체 티로신 키나제 경구 선택적 저해제(Pfizer 및 OSI); EGFR에 선별적으로 결합하지만 HER2 및 EGFR-과발현 세포를 모두 저해하는 이중-HER 저해제 가령 EKB-569(Wyeth에서 입수가능); 라파티닙(GSK572016; Glaxo-SmithKline에서 입수가능), 경구 HER2 및 EGFR 티로신 키나제 저해제; PKI-166(Novartis에서 입수가능); 팬(pan)-HER 저해제 가령 카네르티닙(CI-1033; Pharmacia); Raf-1 저해제 가령 ISIS Pharmaceuticals에서 입수가능하며 Raf-1 신호전달을 저해하는 안티센스 물질 ISIS-5132; 비-HER-표적화 티로신 키나제 저해제 가령 이마티닙 메실레이트(GLEEVEC®, Glaxo SmithKline에서 입수가능); 다중-표적화 티로신 키나제 저해제 가령 수니티닙(SUTENT®, Pfizer에서 입수가능); VEGF 수용체 티로신 키나제 저해제 가령 바탈라닙(PTK787/ZK222584, Novartis/Schering AG에서 입수가능); MAPK 세포외 조절된 키나제 I 저해제 CI-1040(Pharmacia에서 입수가능); 퀴나졸린, 가령 PD 153035,4-(3-클로로아닐리노) 퀴나졸린; 피리도피리미딘; 피리미도피리미딘; 피롤로피리미딘, 가령 CGP 59326, CGP 60261 및 CGP 62706; 피라졸로피리미딘, 4-(페닐아미노)-7H-피롤로[2,3-d] 피리미딘; 커큐민(디페룰로일 메탄, 4,5-비스 (4-플루오로아닐리노)프탈리미드); 니트로티오펜 모이어티를 내포하는 티르포스틴; PD-0183805(Warner-Lamber); 안티센스 분자(예컨대, HER-인코딩 핵산에 결합하는 것들); 퀴녹살린(US 특허 제5,804,396호); 트리포스틴(US 특허 제5,804,396호); ZD6474(Astra Zeneca); PTK-787(Novartis/Schering AG); 팬-HER 저해제 가령 CI-1033(Pfizer); 어피니택(Affinitac)(ISIS 3521; Isis/Lilly); 이마티닙 메실레이트(GLEEVEC®); PKI 166(Novartis); GW2016(Glaxo SmithKline); CI-1033(Pfizer); EKB-569(Wyeth); 세막시닙(Semaxinib)(Pfizer); ZD6474(AstraZeneca); PTK-787(Novartis/Schering AG); INC-1C11(Imclone), 라파마이신(시롤리무스, RAPAMUNE®); 또는 다음 특허 공보 중 어느 하나에서 기술된 것들을 포함한다: US 특허 제5,804,396호; WO 1999/09016호(American Cyanamid); WO 1998/43960호(American Cyanamid); WO 1997/38983호(Warner Lambert); WO 1999/06378호(Warner Lambert); WO 1999/06396호(Warner Lambert); WO 1996/30347호(Pfizer, Inc); WO 1996/33978호(Zeneca); WO 1996/3397호(Zeneca) 및 WO 1996/33980호(Zeneca).
화학요법제는 또한 덱사메타손, 인터페론, 콜히친, 메토프린, 시클로스포린, 암포테리신, 메트로니다졸, 알렘투주맙, 알리트레티노인, 알로푸리놀, 아미포스틴, 삼산화 비소, 아스파라기나제, BCG 생백신, 베바쿠지맙, 벡사로텐, 클라드리빈, 클로파라빈, 다르베포에틴 알파, 데니류킨, 덱스라족산, 에포에틴 알파, 엘로티닙, 필그라스팀, 히스트렐린 아세테이트, 이브리투모맙, 인터페론 알파-2a, 인터페론 알파-2b, 레날리도미드, 레바미솔, 메스나, 메톡살렌, 난드롤론, 네라라빈, 노페투모맙, 오프렐베킨, 팔리페르민, 파미드로네이트, 페가데마제, 페가스파르가제, 페그필그라스팀, 페메트렉세드 디소디움, 플리카마이신, 포르피머 소디움, 퀴나크린, 라스부리케이스, 사그라모스팀, 테모졸로미드, VM-26, 6-TG, 토레미펜, 트레티노인, ATRA, 발루비신, 졸레드로네이트, 및 졸드론산, 및 이들의 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다.
화학요법제는 또한 하이드로코르티손, 하이드로코르티손 아세테이트, 코르티손 아세테이트, 틱소코르톨 피발레이트, 트리암시놀론 아세토니드, 트리암시놀론 알코올, 모메타손, 암시노니드, 부데소니드, 데소니드, 플루오시노니드, 플루오시놀론 아세토니드, 베타메타손, 베타메타손 나트륨 포스페이트, 덱사메타손, 덱사메타손 나트륨 포스페이트, 플루오코르톨론, 하이드로코르티손-17-부티레이트, 하이드로코르티손-17-발러레이트, 아클로메타손 디프로피오네이트, 베타메타손 발러레이트, 베타메타손 디프로피오네이트, 프레드니카르베이트, 클로베타손-17-부티레이트, 클로베타솔-17-프로피오네이트, 플루오코르톨론 카프로에이트, 플루오코르톨론 피발레이트 및 플루프레드니덴 아세테이트; 면역 선택적 항-염증 펩티드(ImSAID) 가령 페닐알라닌-글루타민-글리신(FEG) 및 이의 D-이성질체 형태(feG) (IMULAN BioTherapeutics, LLC); 항-류마티스 약물 가령 아자티오프린, 시클로스포린(사이클로스포린 A), D-페니실라민, 금염, 하이드록시클로로퀸, 레플루노미데미노시클린, 설파살라진, 종양 괴사 인자 알파(TNFα) 차단제 가령 에타너셉트(Enbrel), 인플릭시맙(Remicade), 아달리무맙(Humira), 세르톨리주맙 페골(Cimzia), 골리무맙(Simponi), 인터류킨 1(IL-1) 차단제 가령 아나킨라(Kineret), T 세포 보조자극 차단제 가령 아바타셉트(Orencia), 인터류킨 6(IL-6) 차단제 가령 토실리주맙(ACTEMERA®); 인터류킨 13(IL-13) 차단제 가령 레브리키주맙; 인터페론 알파(IFN) 차단제 가령 론탈리주맙; 베타 7 인테그린 차단제 가령 rhuMAb 베타7; IgE 경로 차단제 가령 항-M1 프라임; 분비된 동형삼량체 LTa3 및 막 결합 이형삼량체 LTa1/β2 차단제 가령 항-림프독소 알파(LTa); 방사성 동위원소(예컨대, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소); 여러 다양한 시험 물질 가령 티오플라틴, PS-341, 페닐부티레이트, ET-18- OCH3, 또는 파르네실 전이효소 저해제(L-739749, L-744832); 폴리페놀 가령 퀘르세틴, 레스베라트롤, 피세아탄놀, 에피갈로카테친 갈레이트, 테아플라빈, 플라바놀, 프로시아니딘, 베툴린 산 및 이들의 유도체; 자가소화 저해제 가령 클로로퀸; 델타-9-테트라하이드로칸나비놀(드로나비놀, MARINOL®); 베타-라파콘; 라파콜; 콜히신; 베툴린 산; 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴, 및 9-아미노캄프토테신); 포도필로톡신; 테가푸르(UFTORAL®); 벡사로텐(TARGRETIN®); 비스포스포네이트 가령 클로드로네이트(예를 들면, BONEFOS® 또는 OSTAC®), 에티드로네이트(DIDROCAL®), NE-58095, 졸드론산/졸레드로네이트(ZOMETA®), 알렌드로네이트(FOSAMAX®), 파미드로네이트(AREDIA®), 틸루드로네이트(SKELID®), 또는 리세드로네이트(ACTONEL®); 및 상피 성장 인자 수용체(EGF-R); 백신 가령 THERATOPE® 백신; 페리포신, COX-2 저해제(예컨대, 셀레콕십 또는 에토리콕십), 프로테오솜 저해제(예컨대 PS341); CCI-779; 티피파르닙(R11577); 오라페닙, ABT510; Bcl-2 저해제 가령 오블리메르센 나트륨(GENASENSE®); 픽산트론; 파르네실전이효소 저해제 가령 로나파르닙(SCH 6636, SARASARTM); 및 상기 어느 하나의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체; 그리고 상기 둘 이상의 조합 가령 사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 및 프레드니솔론의 병행 요법에 대한 축약인 CHOP; 및 5-FU 및 류코보린과 조합된 옥살리플라틴(ELOXATINTM)의 치료 계획에 대한 축약인 FOLFOX를 포함한다.
화학요법제는 또한 진통, 해열 및 항-염증 효과를 갖는 비-스테로이드성 항-염증 약물을 포함한다. NSAID는 효소 시클로옥시게나제의 비-선택적 저해제를 포함한다. NSAID의 특정한 예시는 아스피린, 프로피온산 유도체 가령 이부프로펜, 페노프로펜, 케토프로펜, 플루비프로펜, 옥사프로진 및 나프록센, 아세트산 유도체 가령 인도메타신, 설린닥, 에토돌락, 디클로페낙, 에놀산 유도체 가령 피록시캠, 멜록시캠, 테녹시캠, 드록시캠, 로르녹시캠 및 이속시캠, 페남산 유도체 가령 메페남산, 메클로페남산, 플루페남산, 톨페남산, 및 COX-2 저해제 가령 셀레콕십, 에토리콕십, 루미라콕십, 파레콕십, 로페콕십, 로페콕십, 및 발데콕십을 포함한다. NSAID는 류마티스 관절염, 골관절염, 염증 관절증, 강직성 척추염, 건선성 관절염, 라이터(Reiter) 증후군, 급성 통풍, 월경곤란증, 전이성 뼈 통증, 두통 및 편두통, 수술후 통증, 염증 및 조직 상해로 인한 경도-내지-증등도 통증, 발열, 장폐색, 및 신장 산통과 같은 용태의 증상 완화를 위해 처방될 수 있다.
"성장 저해제"는 본 명세서에서 사용되는 경우 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo)에서 세포의 성장을 저해하는 화합물 또는 조성물을 가리킨다. 한 구체예에서, 성장 저해제는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포의 증식을 방지 또는 감소시키는 성장 저해 항체이다. 또 다른 구체예에서, 성장 저해제는 S 단계의 세포 백분율을 상당히 감소시키는 물질일 수 있다. 성장 저해제의 예시는 세포 주기 진행(S 단계가 아닌 장소에서)을 차단하는 물질, 가령 G1 중지 및 M-단계 중지를 유도하는 물질을 포함한다. 고전적인 M-단계 차단제는 빈카(빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁산, 및 토포이소머라제 II 저해제 가령 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드, 및 블레오마이신을 포함한다. G1을 중지시키는 이들 물질은 또한 S-단계 중지까지 이어지며, 예를 들면, DNA 알킬화제 가령 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로르에타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 및 아라-C가 있다. 부가적인 정보는 Mendelsohn 및 Israel, eds., The Molecular Basis of Cancer, 제1장, Murakami et al. 에 의한 제목 "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs"에서, 예컨대, 13페이지에서 찾을 수 있다(W.B. Saunders, Philadelphia, 1995).
"방사선 요법"은 세포에 충분한 손상을 가하기 위해 집중적인 감마선 또는 베타선을 사용하여 세포가 정상적으로 기능하는 것을 제한하거나 아예 세포를 파괴하는 것을 의미한다. 치료의 투여량 및 기간을 결정하기 위한 많은 방식이 당해 분야에 공지되어 있음이 이해될 것이다. 전형적인 치료는 한-회 투여 및 하루에 10 내지 200단위(G선)의 전형적인 투여 범위로 제공된다.
치료의 목적을 위한 "개체" 또는 "개인"은 인간, 가축 및 농장 동물을 비롯하여 포유동물로 분류된 임의의 동물, 및 동물원, 시합용, 또는 애완동물, 가령 개, 말, 고양이, 소, 등을 지칭한다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다. 개체 또는 개인은 환자일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며 상세하게는 단클론 항체(가령 전장 단클론 항체), 다클론 항체, 다중특이적 항체(예컨대, 이중특이적 항체), 및 요망되는 생물학적 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포괄한다.
"단리된" 항체는 자연적인 환경에서의 성분으로 규명되고 분리 및/또는 회수된 항체이다. 자연적 환경의 오염 성분들은 항체의 연구, 진단 또는 치료 용도를 방해할 수 있는 물질이며, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 항체는 (1) 예를 들면, 로우리(Lowry) 방법으로 측정시 항체의 중량으로 95%를 초과, 및 일부 구체예에서, 중량으로 99%를 초과하도록; (2) 예를 들면, 회전컵 배열분석장치를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개 잔기를 얻기에 충분한 수준까지, 또는 (3) 예를 들면, 코매시(Coomassie) 블루 또는 은 염색을 이용하여 환원 또는 비환원 조건하에 SDS-PAGE로 동질하다고 판단될 때까지 정제된다. 단리된 항체는 재조합 세포 내의 인시추 항체를 포함하는데 이는 항체의 자연적 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 정상적으로 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
"자연적인 항체"는 일반적으로 두 개의 동일한 경(L) 사슬 및 두 개의 동일한 중(H) 사슬로 이루어진, 약 150,000 달톤의 이형사량체 당단백질이다. 각각의 경사슬은 하나의 공유적 이황화 결합에 의해 중사술에 연결되지만, 이황화 연결의 수는 상이한 면역글로불린 이소형의 중사슬에 따라 달라진다. 각각의 중사슬 및 경사슬은 또한 사슬내 이황화 다리에 의해 일정하게 떨어져있다. 각각의 중사슬은 한쪽 말단에 수많은 불변 도메인이 달린 가변 도메인(VH)을 갖는다. 각각의 경사슬은 한쪽 말단에 가변 도메인(VL)을 가지고 다른 쪽 말단에 불변 도메인을 가지며; 경사슬의 불변 도메인은 중사슬의 첫 번째 불변 도메인과 나란하고, 경사슬 가변 도메인은 중사슬의 가변 도메인과 나란하다. 특정한 아미노산 잔기가 경사슬 및 중사슬 가변 도메인 사이에 접촉면을 형성하는 것으로 생각된다.
용어 "불변 도메인"은 항원 결합 부위를 내포하는 가변 도메인인 면역글로불린의 다른 부분에 비해 더 보존된 아미노산 서열을 가지는 면역글로불린 분자의 부분을 지칭한다. 불변 도메인은 중사슬의 CH1, CH2 및 CH3 도메인(통틀어, CH) 및 경사슬의 CHL(또는 CL) 도메인을 내포한다.
항체의 "가변 부위" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중사슬 또는 경사슬의 아미노-말단 도메인을 지칭한다. 중사슬의 가변 도메인은 "VH"로 지칭될 수 있다. 경사슬의 가변 도메인은 "VL"로 지칭될 수 있다. 이들 도메인은 일반적으로 항체의 가장 가변적인 부분이며 항원-결합 부위를 내포한다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정한 부분이 항체 중의 서열에서 광범위하게 상이하며 각각의 특정 항체가 이들의 특정 항원에 결합하고 특이성을 나타낼 때 사용되는 현상을 가리킨다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전반에 걸쳐 균등하게 분포되지 않는다. 이는 경-사슬 및 중-사슬 가변 도메인 모두에서 초가변 부위(HVR)라고 불리는 세 개의 조각에 집중된다. 가변 도메인의 더 고도로 보존된 부위는 프레임워크 부위(FR)라고 부른다. 자연적인 중사슬 및 경사슬 각각의 가변 도메인은 네 개의 FR 부위를 포함하며, 크게 세 개의 HVR로 연결된 베타-시트 배열을 채택하고, 이는 연결하는 고리를 형성하고, 일부 경우에는 베타-시트 구조의 일부를 형성한다. 각 사슬 내 HVR은 FR 부위에 의해 매우 가깝게 모여있고, 다른 사슬의 HVR을 이용하여, 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제5판, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)를 참조). 불변 도메인은 항체가 항원에 결합하는 데 직접 관여하지 않지만, 항체-의존성 세포 독성에서 항체의 참여와 같은 다양한 수식인자 기능을 나타낸다.
임의의 포유동물 종으로부터의 항체(면역글로불린)의 "경사슬"은 이들의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로, 카파("κ") 및 람다("λ")로 불리는 두 가지 분명히 구분된 유형 중 하나로 배치될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 IgG "이소형" 또는 "하위 집합"은 이들의 불변 부위의 화학적 및 항원성 특징에 의해 정의된 면역글로불린의 하위 집합 중 어느 하나를 의미한다.
항체(면역글로불린)는 이들의 중사슬의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 다양한 부류로 할당될 수 있다. 면역글로불린에는 다섯 가지 주요 부류가 존재하며: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 이들 중 몇몇은 하위 집합(이소형), 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 더욱 나뉠 수 있다. 상이한 종류의 면역글로불린에 해당하는 중사슬 불변 도메인은 각각 α, γ, ε, γ, 및 μ로 지칭된다. 상이한 종류의 면역글로불린의 아단위 구조 및 삼-차원 배열은 널리 공지되어 있고, 예를 들면, Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 제4판(W.B. Saunders, Co., 2000)에 개괄적으로 기술되어 있다. 항체는 항체와 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩티드의 공유적 또는 비-공유적 연합으로 형성된 더 큰 융합 분자의 일부일 수 있다.
용어 "전장 항체", "온전한 항체" 및 "전항체"는 본 명세서에서 실질적으로 온전한 형태로 있는 항체를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용되며, 아래에서 정의된 바와 같은 항체 단편은 지칭하지 않는다. 상기 용어는 특히 Fc 부위를 내포하는 중사슬을 갖는 항체를 지칭한다.
본 명세서의 목적을 위해 "노출된 항체"는 세포독성 모이어티 또는 방사성표지에 공액결합되지 않은 항체이다.
"항체 단편"은 바람직하게는 항체의 항원-결합 부위를 비롯한, 온전한 항체의 일부를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 명세서에 기술된 항체 단편은 항원-결합 단편이다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일-사슬 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
항체의 파파인 분해는 각각 단일 항원-결합 부위를 가지는, "Fab" 단편으로 지칭되는 두 개의 동일한 항원-결합 단편, 및 이름에서 쉽게 결정화되는 능력을 알 수 있는 잔여 "Fc" 단편을 생성한다. 펩신 처리는 두 개의 항원-결합 부위를 가지며 여전히 항원을 가교-연결할 수 있는 F(ab')2 단편을 얻는다.
"Fv"는 완전한 항원-결합 부위를 내포하는 최소의 항체 단편이다. 한 구체예에서, 두-사슬 Fv 종은 하나의 중- 및 하나의 경-사슬 가변 도메인이 조밀하고, 비-공유적으로 연합된 이량체로 이루어진다. 단일-사슬 Fv(scFv) 종에서, 하나의 중- 및 하나의 경-사슬 가변 도메인은 경 및 중사슬이 두-사슬 Fv 종에서와 유사한 "이량체" 구조로 연합할 수 있도록 유연한 펩티드 링커에 의해 공유적으로 연결될 수 있다. 이러한 배치에서 각각의 가변 도메인의 세 개의 HVR이 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 위의 항원-결합 부위를 구성한다. 도합하면, 여섯 개의 HVR이 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단 하나의 단일 가변 도메인(또는 항원에 대해 특이적인 단 세 개의 HVR만 포함하는 Fv의 절반)도 전체 결합 부위보다는 더 적은 친화성을 가지지만 항원을 인식하고 결합하는 능력을 가진다.
Fab 단편은 중- 및 경-사슬 가변 도메인을 내포하고 또한 경사슬의 불변 도메인 및 중사슬의 첫 번째 불변 도메인(CH1)을 내포한다. Fab' 단편은 항체 경첩 부위로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중사슬 CH1 도메인의 카르복시 말단에서 몇 개의 잔기의 부가로 인해 Fab 단편과 달라진다. Fab'-SH는 본 명세서에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올 기를 품고 있는 Fab'를 지칭한다. F(ab')2 항체 단편은 원래 사이에 경첩 시스테인을 가지는 Fab' 단편의 쌍으로서 제조하였다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.
"단일-사슬 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬로 존재한다. 일반적으로, scFv 폴리펩티드는 추가로 scFv가 항원 결합을 위해 요망되는 구조를 형성하도록 하는 폴리펩티드 링커를 VH 및 VL 도메인 사이에 포함한다. scFv의 검토를 위해서는 예컨대, Pluckthuen, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg 및 Moore eds., (Springer-Verlag, New York, 1994), pp. 269-315를 참조하라.
용어 "디아바디"는 두 개의 항원-결합 부위를 가지는 항체 단편을 지칭하며, 상기 단편은 동일한 폴리펩티드 사슬(VH-VL)에서 경-사슬 가변 도메인(VL)에 연결된 중-사슬 가변 도메인(VH)을 포함한다. 너무 짧아서 동일한 사슬 상의 두 개의 도메인 사이에 쌍을 형성하지 못하는 링커를 이용함으로써, 도메인은 또 다른 사슬의 상보적 도메인과 쌍을 이루게 되고 두 개의 항원-결합 부위를 생성한다. 디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있다. 디아바디는 예를 들면, EP 404,097호; WO 1993/01161호; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)에 더욱 자세히 설명되어 있다. 트리아바디 및 테트라바디는 또한 Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)에 설명되어 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "단클론 항체"는 실질적으로 동종의 항체 집단에서 수득한 항체를 가리키며, 예컨대, 개별적인 항체는 미미한 양으로 존재할 수 있는 가능한 돌연변이, 예컨대 자연-발생적인 돌연변이를 제외하고는 동일한 집단을 포함한다. 따라서, 수식어 "단클론"은 개별 항체의 혼합물이 아닌 항체의 특징을 나타낸다. 특정 구체예에서, 그러한 단클론 항체는 전형적으로 표적에 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체를 포함하며, 여기서 표적-결합 폴리펩티드 서열은 다수의 폴리펩티드 서열로부터 단일 표적 결합 폴리펩티드 서열의 선택을 포함하는 과정에 의해 수득되었다. 예를 들면, 선택 과정은 다수의 클론, 가령 하이브리도마 클론, 파지(phage) 클론, 또는 재조합 DNA 클론의 풀(pool)로부터 고유한 클론을 선택할 수 있다. 선택된 표적 결합 서열은, 예를 들면, 표적에 대한 친화성을 향상하기 위해, 표적 결합 서열을 인간화하기 위해, 세포 배양물 내 생산을 증가시키기 위해, 생체내 면역원성을 감소시키기 위해, 다중특이적 항체를 생성하기 위해, 등 추가로 개조될 수 있으며, 개조된 표적 결합 서열을 포함하는 항체는 또한 본 발명의 단클론 항체임이 이해되어야 한다. 상이한 결정인자(에피토프)를 겨냥하는 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 다클론 항체 제조와 반대로, 단클론 항체 제조에서의 각각의 단클론 항체는 항원 상의 단일 결정인자를 겨냥한다. 이들의 특이성 외에도, 단클론 항체 제조는 이들이 전형적으로 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는다는 장점이 있다.
수식어 "단클론"은 실질적으로 동종인 집단의 항체로부터 수득되는 항체의 특징을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체 생산이 필요하다고 이해되어서는 안된다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용될 단클론 항체는 다양한 기술에 의해, 가령, 예를 들면, 하이브리도마 방법(예컨대, Kohler 및 Milstein, Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 제2판 1988); Hammerling et al.: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), 재조합 DNA 방법(예컨대, U.S. 특허 제4,816,567호를 참조), 파지-전시 기술(예컨대, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004)을 참조, 및 인간 면역글로불린 좌위(loci) 또는 인간 면역글로불린 서열을 인코딩하는 유전자의 일부 또는 전부를 가지는 동물에서 인간 또는 인간-유사 항체를 제조하기 위한 기술(예컨대, WO 1998/24893호; WO 1996/34096호; WO 1996/33735호; WO 1991/10741호; Jakobovits et al., Proc. Natl.. Acad.. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); U.S. 특허 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 및 제5,661,016호; Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); 및 Lonberg et al., Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)을 참조,에 의해 제조될 수 있다.
본 명세서에서 단클론 항체는 상세하게는 중사슬 및/또는 경사슬의 일부가 특정 종에서 유래한 항체와 동일하거나 상응하는 서열에 있어서 유사하거나 특정 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하지만, 사슬(들)의 나머지 부분은 또 다른 종에서 유래한 항체와 동일하거나 상응하는 서열에 있어서 유사하거나 또 다른 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 "키메라" 항체 뿐만 아니라, 요망되는 생물학적 활성을 나타내는 한, 그러한 항체의 단편을 포함한다(예컨대, U.S. 특허 제4,816,567호; 및 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)를 참조). 키메라 항체는 PRIMATTZED® 항체를 포함하며 여기서 항체의 항원-결합 부위는 예컨대, 짧은꼬리 원숭이를 관심의 항원으로 면역화함으로써 생성된 항체로부터 유래한다.
인간이-아닌(예컨대, 쥐의) 항체의 "인간화된" 형태는 인간이-아닌 면역글로불린으로부터 유래한 최소한의 서열을 내포하는 키메라 항체이다. 한 구체예에서, 인간화된 항체는 인간 면역글로불린(수용자 항체)이며 여기서 수용자의 HVR로부터의 잔기는 요망되는 특이성, 친화성, 및/또는 능력을 가지는 인간이-아닌 종(공여자 항체) 가령 마우스, 래트, 토끼, 또는 인간이 아닌 영장류의 HVR로부터의 잔기로 대체된다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 FR 잔기는 상응하는 인간이-아닌 잔기로 대체된다. 추가로, 인간화된 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 더욱 개선하기 위해 가해질 수 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 적어도 하나의, 및 전형적으로 두 개의, 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 고리는 인간이-아닌 면역글로불린의 그것과 일치하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로불린 서열의 그것과 일치한다. 인간화된 항체는 임의로 또한 면역글로불린 불변 부위(Fc)의 적어도 한 부분, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 그것을 포함할 것이다. 더욱 상세한 내용은 예컨대, Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)을 참조하라. 또한, 예를 들면, Vaswani 및 Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle 및 Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994); 및 U.S. 특허 제6,982,321호 및 제7,087,409호를 참조하라.
"인간 항체"는 인간에 의해 제조된 항체와 동일한 아미노산 서열을 보유하는 항체 및/또는 본 명세서에 개시된 바와 같은 인간 항체를 만들기 위한 임의의 기술을 이용하여 제조된 항체이다. 이러한 인간 항체의 정의는 상세하게는 인간이-아닌 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체를 제외한다. 인간 항체는 파지-전시 라이브러리를 비롯한, 당해 분야에 공지된 다양한 기술을 이용하여 제조될 수 있다. Hoogenboom 및 Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991). 또한 인간 단클론 항체의 제조를 위해 입수가능한 것은 Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)에 기술된 방법이다. 또한 van Dijk 및 van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001)를 참조하라. 인간 항체는 항원 시도에 대해 그러한 항체를 제조하도록 변형되었지만, 내인성 좌위는 마비된 형질전환 동물, 예컨대, 면역화 제노마우스에 항원을 투여하여 제조될 수 있다(예컨대, XENOMOUSETM 기술에 관해서는 U.S. 특허 제6,075,181호 및 제6,150,584호를 참조). 또한, 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 행성된 인간 항체에 관해서는 예를 들면, Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)를 참조하라.
"종-의존성 항체"는 제1 포유류 종으로부터의 항원에 대해 제2 포유류 종으로부터의 동종의 항원에 대해서보다 더 강한 결합 친화성을 가지는 항체이다. 일반적으로, 종-의존성 항체는 인간 항원에 "특이적으로 결합" (예컨대, 약 1x10-7 M 이하, 바람직하게는 약 1x10-8 M 이하 및 바람직하게는 약 1x10-9 M 이하의 결합 친화성(Kd)값을 가짐) 하지만 제2의 인간이 아닌 포유류 종으로부터의 동종 항원에 대해서는 인간 항원에 대한 이의 결합 친화성보다 적어도 약 50 배, 또는 적어도 약 500 배, 또는 적어도 약 1000 배 더 약한 결합 친화성을 가진다. 종-의존성 항체는 상기 정의된 바와 같은 다양한 유형 중 어느 하나일 수 있지만, 바람직하게는 인간화된 또는 인간 항체이다.
용어 "초가변 부위", "HVR", 또는 "HV"는 본 명세서에서 사용되는 경우 서열이 초가변적이거나 및/또는 구조적으로 정의된 고리를 형성하는 항체 가변 도메인의 부위를 지칭한다. 일반적으로, 항체는 여섯 개의 HVR을 포함하며; 세 개는 VH에(H1, H2, H3), 및 세 개는 VL에(L1, L2, L3) 포함한다. 자연적인 항체에서, H3 및 L3은 여섯 개의 HVR 중 최대 다양성을 나타내며, H3는 특히 항체에 미세한 특이성을 부여하는 고유한 역할을 수행하는 것으로 여겨진다. 예컨대, Xu et al., Immunity 13:37-45 (2000); Johnson 및 Wu 저, Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2003)를 참조하라. 실제로, 중사슬로만 이루어진 자연발생적 카멜리드(camelid) 항체는 경사슬의 부재에서 기능하며 안정하다. 예컨대, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993); Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)를 참조하라.
수많은 HVR의 설명이 사용되고 있으며 본 명세서에 포함된다. Kabat 상보성 결정부위(CDR)는 서열 다양성을 기초로 하며 가장 흔히 사용된다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제5판. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Chothia는 오히려 구조 고리의 위치와 관계있다(Chothia 및 Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). AbM HVR은 Kabat HVR 및 Chothia 구조 고리의 절충안을 나타내며, Oxford Molecular사의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된다. "접촉" HVR은 이용가능한 복합체 결정 구조의 분석을 기초로 한다. 각각의 이들 HVR로부터의 잔기가 아래 언급된다.
고리 Kabat AbM Chothia 접촉
L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36
L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55
L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96
H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (Kabat 번호)
H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (Chothia 번호)
H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58
H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101
HVR는 다음과 같이 "연장된 HVR"을 포함할 수 있다: VL 내에 24-36 또는 24-34 (L1), 46-56 또는 50-56 (L2) 및 89-97 또는 89-96 (L3) 및 VH 내에 26-35 (H1), 50-65 또는 49-65 (H2) 및 93-102, 94-102, 또는 95-102 (H3). 가변 도메인 잔기는 이들 정의 각각에 있어서 Kabat et al., 상기와 동일, 에 따라 번호가 매겨진다.
"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 HVR 잔기가 아닌 가변 도메인 잔기이다.
용어 "Kabat 방식의 가변 도메인 잔기 번호" 또는 "Kabat 방식의 아미노산 위치 번호", 및 이들의 변형은 Kabat et al., 상기와 동일에서 항체 모음의 중사슬 가변 도메인 또는 경사슬 가변 도메인을 위해 사용된 번호 시스템을 지칭한다. 이러한 번호 시스템을 이용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 HVR의 짧아짐 또는 이들로의 삽입에 해당하는 더 적거나 더 많은 아미노산을 내포할 수 있다. 예를 들면, 중사슬 가변 도메인은 H2의 잔기 52 다음의 단일 아미노산 삽입(Kabat에 따르면 잔기 52a) 및 중사슬 FR 잔기 82 다음에 삽입된 잔기 (예컨대 Kabat에 따르면 잔기 82a, 82b, 및 82c, 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 Kabat 번호는 소정의 항체에 대해 "표준" Kabat 번호를 지닌 서열을 가진 항체의 서열과 상동적인 부위에 정렬됨으로써 결정될 수 있다.
Kabat 번호 시스템은 일반적으로 가변 도메인 내의 잔기를 지칭할 때 사용된다(대략 경사슬의 잔기 1-107 및 중사슬의 잔기 1-113) (예컨대, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 제5판. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). "EU 번호 시스템" 또는 "EU 색인"은 일반적으로 면역글로불린 중사슬 불변 부위 내의 잔기를 지칭할 때 사용된다(예컨대, EU 색인은 Kabat et al., 상기와 동일에 보고되어 있다). "Kabat 방식의 EU 색인"은 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 번호를 지칭한다.
표현 "선형 항체"는 Zapata et al. (1995 Protein Eng, 8(10):1057-1062)에 서술된 항체를 지칭한다. 간략하게, 이들 항체는 한 쌍의 연결된 Fd 조각(VH-CH1-VH-CH1)을 포함하며, 이는 상보적 경사슬 폴리펩티드와 함께, 한 쌍의 항원 결합 부위를 형성한다. 선형 항체는 이중특이적 또는 단일특이적일 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "결합하다", "특이적으로 결합하다" 또는 "에 대해 특이적이다"는 측정가능하고 재현가능한 상호작용 가령 표적과 항체 사이의 결합을 지칭하며, 이는 생물학적 분자를 포함하는 불균일한 분자 집단의 존재에서 표적의 존재를 확인한다. 예를 들면, 표적(이는 에피토프일 수 있음)에 결합하거나 특이적으로 결합하는 항체는 상기 표적에 다른 표적에 결합할 때보다 더 큰 친화성, 결합능으로, 더 쉽게, 및/또는 더 길게 결합하는 항체이다. 한 구체예에서, 관련없는 표적에 대한 항체의 결합 정도는 예컨대, 방사면역측정법(RIA)으로 측정했을 대 표적에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 구체예에서, 표적에 특이적으로 결합하는 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, 또는 ≤ 0.1 nM인 해리 상수(Kd)를 갖는다. 특정 구체예에서, 항체는 상이한 종으로부터의 단백질 사이에 보존된 단백질 상의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 또 다른 구체예에서, 특이적 결합은 배타적인 결합을 포함할 수 있지만, 필수적인 것은 아니다.
II. PD-1 축 결합 길항제
본 명세서에 제공된 것은 개체에서 암을 치료하거나 진행을 지연시키기 위해 개체에게 유효량의 PD-1 축 결합 길항제 및 탁산을 투여하는 것을 포함하는 방법이다. 또한 본 명세서에 제공된 것은 암을 가진 개체에서 면역 기능을 증진하기 위해 개체에게 유효량의 PD-1 축 결합 길항제 및 탁산을 투여하는 것을 포함하는 방법이다. 예를 들면, PD-1 축 결합 길항제는 PD-1 결합 길항제, PD-L1 결합 길항제, 및 PD-L2 결합 길항제를 포함한다. PD-1(프로그램 세포사 1)은 또한 당해 분야에서 "프로그램 세포사 1", "PDCD1", "CD279", 및 "SLEB2"로 지칭된다. 예시적인 인간 PD-1은 UniProtKB/Swiss-Prot 접근번호 Q15116에서 보여진다. PD-L1(프로그램 세포사 리간드 1)은 또한 당해 분야에서 "프로그램 세포사 1 리간드 1", "PDCD1LG1", "CD274", "B7-H", 및 "PDL1"로 지칭된다. 예시적인 인간 PD-L1은 UniProtKB/Swiss-Prot 접근번호 Q9NZQ7.1에서 보여진다. PD-L2(프로그램 세포사 리간드 2)는 또한 당해 분야에서 "프로그램 세포사 1 리간드 2", "PDCD1LG2", "CD273", "B7-DC", "Btdc", 및 "PDL2"로 지칭된다. 예시적인 인간 PD-L2는 UniProtKB/Swiss-Prot 접근번호 Q9BQ51에서 보여진다. 일부 구체예에서, PD-1, PD-L1, 및 PD-L2는 인간 PD-1, PD-L1 및 PD-L2이다.
일부 구체예에서, PD-1 결합 길항제는 PD-1이 이의 리간드 결합 상대에 결합하는 것을 저해하는 분자이다. 특정한 양태에서, PD-1 리간드 결합 상대는 PD-L1 및/또는 PD-L2이다. 또 다른 구체예에서, PD-L1 결합 길항제는 PD-L1의 이의 결합 상대에 대한 결합을 저해하는 분자이다. 특정한 양태에서, PD-L1 결합 상대는 PD-1 및/또는 B7-1이다. 또 다른 구체예에서, PD-L2 결합 길항제는 PD-L2의 이의 결합 상대에 대한 결합을 저해하는 분자이다. 특정한 양태에서, PD-L2 결합 상대는 PD-1이다. 길항제는 항체, 이의 항원 결합 단편, 면역접합체, 융합 단백질, 또는 올리고펩티드일 수 있다.
일부 구체예에서, PD-1 결합 길항제는 항-PD-1 항체(예컨대, 인간 항체, 인간화된 항체, 또는 키메라 항체)이다. 일부 구체예에서, 항-PD-1 항체는 MDX-1106(니볼루맙), MK-3475(람브롤리주맙), 및 CT-011(피딜리주맙)으로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, PD-1 결합 길항제는 면역접합체(예컨대, 불변 부위(예컨대, 면역글로불린 서열의 Fc 부위)에 융합된 PD-L1 또는 PD-L2의 세포외 또는 PD-1 결합 부분을 포함하는 면역접합체이다. 일부 구체예에서, PD-1 결합 길항제는 AMP-224이다. 일부 구체예에서, PD-L1 결합 길항제는 항-PD-L1 항체이다. 일부 구체예에서, 항-PD-L1 항체는 YW243.55.S70, MPDL3280A, MDX-1105, 및 MEDI4736으로 이루어진 군에서 선택된다. 항체 YW243.55.S70는 WO 2010/077634호에 서술된 항-PD-L1이다. BMS-936559로도 공지된 MDX-1105는 WO2007/005874호에 서술된 항-PD-L1 항체이다. MEDI4736은 WO2011/066389호 및 US2013/034559호에 서술된 항-PD-L1 단클론 항체이다. MDX-1106-04, ONO-4538, BMS-936558, 또는 니볼루맙으로도 공지된 MDX-1106은 WO2006/121168호에 서술된 항-PD-1 항체이다. 람브롤리주맙으로도 공지된 MK-3475는 WO2009/114335호에 서술된 항-PD-1 항체이다. hBAT, hBAT-1 또는 피딜리주맙으로도 공지된 CT-011는 WO2009/101611호에 서술된 항-PD-1 항체이다. B7-DCIg로도 공지된 AMP-224는 WO2010/027827호 및 WO2011/066342호에 서술된 PD-L2-Fc 융합 가용성 수용체이다.
일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제는 항-PD-L1 항체이다. 일부 구체예에서, 항-PD-L1 항체는 PD-L1 및 PD-1 사이 및/또는 PD-L1 및 B7-1 사이의 결합을 저해할 수 있다. 일부 구체예에서, 항-PD-L1 항체는 단클론 항체이다. 일부 구체예에서, 항-PD-L1 항체는 Fab, Fab'-SH, Fv, scFv, 및 (Fab')2 단편으로 이루어진 군에서 선택된 항체 단편이다. 일부 구체예에서, 항-PD-L1 항체는 인간화된 항체이다. 일부 구체예에서, 항-PD-L1 항체는 인간 항체이다.
본 발명의 방법을 위해 유용한 항-PD-L1 항체, 및 이를 만들기 위한 방법의 예시는 PCT 특허 출원 WO 2010/077634호, WO 2007/005874호, WO 2011/066389호, 및 US 2013/034559호에 서술되며, 상기 문헌은 본 명세서에서 참고로서 포함된다. 본 발명에서 유용한 항-PD-L1 항체, 그리고 그러한 항체를 함유하는 조성물은 암을 치료하기 위해 탁산과 병용되어 사용될 수 있다.
항-PD-1 항체
일부 구체예에서, 항-PD-1 항체는 MDX-1106이다. "MDX-1106"의 대안적인 이름은 MDX-1106-04, ONO-4538, BMS-936558 또는 니볼루맙을 포함한다. 일부 구체예에서, 항-PD-1 항체는 니볼루맙이다(CAS 등록 번호: 946414-94-4). 더욱 추가적인 구체예에서, 서열 번호:1로부터의 중사슬 가변 부위 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 부위 및/또는 서열 번호:2로부터의 경사슬 가변 부위 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 부위를 포함하는 단리된 항-PD-1 항체가 제공된다. 더욱 추가적인 구체예에서, 중사슬 및/또는 경사슬 서열을 포함하는 단리된 항-PD-1 항체가 제공되며, 여기서:
(a) 중사슬 서열은 중사슬 서열: QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(서열 번호 NO:1)에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지며,
(b) 경사슬 서열은 경사슬 서열: EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(서열 번호:2)에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가진다.
항-PD-L1 항체
일부 구체예에서, 제형 내 항체는 중사슬 및/또는 경사슬 서열 내에 적어도 하나의 트립토판(예컨대, 적어도 두 개, 적어도 세 개, 또는 적어도 네 개)을 포함한다. 일부 구체예에서, 아미노산 트립토판은 항체의 HVR 부위, 프레임워크 부위 및/또는 불변 부위에 존재한다. 일부 구체예에서, 항체는 HVR 부위 내에 둘 또는 세 개의 트립토판 잔기를 포함한다. 일부 구체예에서, 제형 내 항체는 항-PD-L1 항체이다. PDL1, B7-H1, B7-4, CD274, 및 B7-H로도 공지된 PD-L1(프로그램 세포사 리간드 1)은 막관통 단백질이며, 이의 PD-1과의 상호작용이 T-세포 활성화 및 사이토킨 생산을 저해한다. 일부 구체예에서, 본 명세서에 기술된 항-PD-L1 항체는 인간 PD-L1에 결합한다. 본 명세서에 기술된 방법에서 사용될 수 있는 항-PD-L1 항체의 예시는 PCT 특허 출원 WO 2010/077634호 A1 및 US 8,217,149호에 서술되어 있으며, 상기 문헌은 그 전체가 본 명세서에서 참고로서 포함된다.
일부 구체예에서, 항-PD-L1 항체는 PD-L1 및 PD-1 사이 및/또는 PD-L1 및 B7-1 사이의 결합을 저해할 수 있다. 일부 구체예에서, 항-PD-L1 항체는 단클론 항체이다. 일부 구체예에서, 항-PD-L1 항체는 Fab, Fab'-SH, Fv, scFv, 및 (Fab')2 단편으로 이루어진 군에서 선택된 항체 단편이다. 일부 구체예에서, 항-PD-L1 항체는 인간화된 항체이다. 일부 구체예에서, 항-PD-L1 항체는 인간 항체이다.
WO 2010/077634호 A1 및 US 8,217,149호에 서술된 항-PD-L1 항체는 본 명세서에 기술된 방법에서 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 항-PD-L1 항체는 서열 번호:3의 중사슬 가변 부위 서열 및/또는 서열 번호:4의 경사슬 가변 부위 서열을 포함한다. 더욱 추가적인 구체예에서, 중사슬 가변 부위 및/또는 경사슬 가변 부위 서열을 포함하는 단리된 항-PD-L1 항체가 제공되며, 여기서:
(a) 중사슬 서열은 중사슬 서열: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSA(서열 번호 NO:3)에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지며,
(b) 경사슬 서열은 경사슬 서열: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR(서열 번호:4)에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가진다.
한 구체예에서, 항-PD-L1 항체는 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3 서열을 포함하는 중사슬 가변 부위를 포함하며, 여기서:
(a) HVR-H1 서열은 GFTFSX1SWIH이고 (서열 번호:5);
(b) HVR-H2 서열은 AWIX2PYGGSX3YYADSVKG이고 (서열 번호:6);
(c) HVR-H3 서열은 RHWPGGFDY이고 (서열 번호:7);
추가로 여기서: X1는 D 또는 G이고; X2는 S 또는 L이고; X3는 T 또는 S이다. 한 특정한 양태에서, X1는 D이고; X2는 S이고 X3는 T이다.
또 다른 양태에서, 폴리펩티드는 추가로 식:(HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4)에 따라 HVR 사이에 병치된 가변 부위 중사슬 프레임워크 서열을 포함한다. 또 다른 양태에서, 프레임워크 서열은 인간 공통 프레임워크 서열로부터 유래된다. 추가의 양태에서, 프레임워크 서열은 VH 하위군 III 공통 프레임워크이다. 더욱 추가적인 양태에서, 프레임워크 서열 중 적어도 하나는 다음과 같고:
HC-FR1은 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS이고 (서열 번호:8)
HC-FR2는 WVRQAPGKGLEWV이고 (서열 번호:9)
HC-FR3은 RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR이고 (서열 번호:10)
HC-FR4는 WGQGTLVTVSA이다 (서열 번호:11).
더욱 추가적인 양태에서, 중사슬 폴리펩티드는 추가로 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하는 가변 부위 경사슬과 조합되고, 여기서:
(a) HVR-L1 서열은 RASQX4X5X6TX7X8A이고 (서열 번호:12);
(b) HVR-L2 서열은 SASX9LX10S이고, (서열 번호:13);
(c) HVR-L3 서열은 QQX11X12X13X14PX15T이고 (서열 번호:14);
여기서: X4는 D 또는 V이고; X5는 V 또는 I이고; X6는 S 또는 N이고; X7는 A 또는 F이고; X8는 V 또는 L이고; X9는 F 또는 T이고; X10는 Y 또는 A이고; X11는 Y, G, F, 또는 S이고; X12는 L, Y, F 또는 W이고; X13는 Y, N, A, T, G, F 또는 I이고; X14는 H, V, P, T 또는 I이고; X15는 A, W, R, P 또는 T이다. 더욱 추가적인 양태에서, X4는 D이고; X5는 V이고; X6는 S이고; X7는 A이고; X8는 V이고; X9는 F이고; X10는 Y이고; X11는 Y이고; X12는 L이고; X13는 Y이고; X14는 H이고; X15는 A이다.
더욱 추가적인 양태에서, 경사슬은 추가로 식:(LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)에 따라 HVR 사이에 병치된 가변 부위 경사슬 프레임워크 서열을 포함한다. 더욱 추가적인 양태에서, 프레임워크 서열은 인간 공통 프레임워크 서열로부터 유래된다. 더욱 추가적인 양태에서, 프레임워크 서열은 VL 카파 I 공통 프레임워크이다. 더욱 추가적인 양태에서, 프레임워크 서열 중 적어도 하나는 다음과 같고:
LC-FR1은 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC이고 (서열 번호:15)
LC-FR2는 WYQQKPGKAPKLLIY이고 (서열 번호:16)
LC-FR3은 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC이고 (서열 번호:17)
LC-FR4는 FGQGTKVEIKR이다 (서열 번호:18).
또 다른 구체예에서, 중사슬 및 경사슬 가변 부위 서열을 포함하는 단리된 항-PD-L1 항체 또는 항원 결합 단편이 제공되며, 여기서:
(a) 중사슬은 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함하고, 여기서 추가로:
(i) HVR-H1 서열은 GFTFSX1SWIH이고; (서열 번호:5)
(ii) HVR-H2 서열은 AWIX2PYGGSX3YYADSVKG이고 (서열 번호:6)
(iii) HVR-H3 서열은 RHWPGGFDY이고, 및 (서열 번호:7)
(b) 경사슬은 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하고, 여기서 추가로:
(i) HVR-L1 서열은 RASQX4X5X6TX7X8A이고 (서열 번호:12)
(ii) HVR-L2 서열은 SASX9LX10S이고; 및 (서열 번호:13)
(iii) HVR-L3 서열은 QQX11X12X13X14PX15T이고; (서열 번호:14)
여기서: X1는 D 또는 G이고; X2는 S 또는 L이고; X3는 T 또는 S이고; X4는 D 또는 V이고; X5는 V 또는 I이고; X6는 S 또는 N이고; X7는 A 또는 F이고; X8는 V 또는 L이고; X9는 F 또는 T이고; X10는 Y 또는 A이고; X11는 Y, G, F, 또는 S이고; X12는 L, Y, F 또는 W이고; X13는 Y, N, A, T, G, F 또는 I이고; X14는 H, V, P, T 또는 I이고; X15는 A, W, R, P 또는 T이다. 특정한 양태에서, X1는 D이고; X2는 S이고 X3는 T이다. 또 다른 양태에서, X4는 D이고; X5는 V이고; X6는 S이고; X7는 A이고; X8는 V이고; X9는 F이고; X10는 Y이고; X11는 Y이고; X12는 L이고; X13는 Y이고; X14는 H이고; X15는 A이다. 더욱 다른 양태에서, X1는 D이고; X2는 S이고 X3는 T이고, X4는 D이고; X5는 V이고; X6는 S이고; X7는 A이고; X8는 V이고; X9는 F이고; X10는 Y이고; X11는 Y이고; X12는 L이고; X13는 Y이고; X14는 H이며 X15는 A이다.
추가의 양태에서, 중사슬 가변 부위는 다음: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4)처럼 HVR 사이에 병치된 하나 이상의 프레임워크 서열을 포함하고, 경사슬 가변 부위는 다음: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)처럼 HVR 사이에 병치된 하나 이상의 프레임워크 서열을 포함한다. 더욱 추가적인 양태에서, 프레임워크 서열은 인간 공통 프레임워크 서열로부터 유래된다. 더욱 추가적인 양태에서, 중사슬 프레임워크 서열은 Kabat 하위군 I, II, 또는 III 서열로부터 유래된다. 더욱 추가적인 양태에서, 중사슬 프레임워크 서열은 VH 하위군 III 공통 프레임워크이다. 더욱 추가적인 양태에서, 하나 이상의 중사슬 프레임워크 서열이 서열 번호:8, 9, 10 및 11로서 제시된다. 더욱 추가적인 양태에서, 경사슬 프레임워크 서열은 Kabat 카파 I, II, II 또는 IV 하위군 서열로부터 유래된다. 더욱 추가적인 양태에서, 경사슬 프레임워크 서열은 VL 카파 I 공통 프레임워크이다. 더욱 추가적인 양태에서, 하나 이상의 경사슬 프레임워크 서열이 서열 번호:15, 16, 17 및 18로서 제시된다.
더욱 추가적인 특정 양태에서, 항체는 추가로 인간 또는 쥐의 불변 부위를 포함한다. 더욱 추가적인 양태에서, 인간 불변 부위는 IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4로 이루어진 군에서 선택된다. 더욱 추가적인 특정 양태에서, 인간 불변 부위는 IgG1이다. 더욱 추가적인 양태에서, 쥐의 불변 부위는 IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3으로 이루어진 군에서 선택된다. 더욱 추가적인 양태에서, 쥐의 불변 부위는 IgG2A이다. 더욱 추가적인 특정 양태에서, 항체는 감소된 또는 최소의 수식인자 기능을 갖는다. 더욱 추가적인 특정 양태에서 최소의 수식인자 기능은 "수식인자-없는 Fc 돌연변이" 또는 무당화(aglycosylation)로부터 생성된다. 더욱 추가적인 구체예에서, 수식인자-없는 Fc 돌연변이는 불변 부위에서 N297A 또는 D265A/N297A 치환이다.
또 다른 구체예에서, 중사슬 및 경사슬 가변 부위 서열을 포함하는 항-PD-L1 항체가 제공되며, 여기서:
(a) 중사슬은 추가로 각각 GFTFSDSWIH (서열 번호:19), AWISPYGGSTYYADSVKG (서열 번호:20) 및 RHWPGGFDY (서열 번호:21)에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 가지는 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3 서열을 포함하고, 또는
(b) 경사슬은 추가로 각각 RASQDVSTAVA (서열 번호:22), SASFLYS (서열 번호:23) 및 QQYLYHPAT (서열 번호:24)에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 가지는 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3 서열을 포함한다.
특정한 양태에서, 서열 동일성은 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다.
또 다른 양태에서, 중사슬 가변 부위는 다음: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4)처럼 HVR 사이에 병치된 하나 이상의 프레임워크 서열을 포함하고, 경사슬 가변 부위는 다음: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)처럼 HVR 사이에 병치된 하나 이상의 프레임워크 서열을 포함한다. 또 다른 양태에서, 프레임워크 서열은 인간 공통 프레임워크 서열로부터 유래된다. 더욱 추가적인 양태에서, 중사슬 프레임워크 서열은 Kabat 하위군 I, II, 또는 III 서열로부터 유래된다. 더욱 추가적인 양태에서, 중사슬 프레임워크 서열은 VH 하위군 III 공통 프레임워크이다. 더욱 추가적인 양태에서, 하나 이상의 중사슬 프레임워크 서열이 서열 번호:8, 9, 10 및 11로서 제시된다. 더욱 추가적인 양태에서, 경사슬 프레임워크 서열은 Kabat 카파 I, II, II 또는 IV 하위군 서열로부터 유래된다. 더욱 추가적인 양태에서, 경사슬 프레임워크 서열은 VL 카파 I 공통 프레임워크이다. 더욱 추가적인 양태에서, 하나 이상의 경사슬 프레임워크 서열이 서열 번호:15, 16, 17 및 18로서 제시된다.
더욱 추가적인 특정 양태에서, 항체는 추가로 인간 또는 쥐의 불변 부위를 포함한다. 더욱 추가적인 양태에서, 인간 불변 부위는 IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4로 이루어진 군에서 선택된다. 더욱 추가적인 특정 양태에서, 인간 불변 부위는 IgG1이다. 더욱 추가적인 양태에서, 쥐의 불변 부위는 IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3으로 이루어진 군에서 선택된다. 더욱 추가적인 양태에서, 쥐의 불변 부위는 IgG2A이다. 더욱 추가적인 특정 양태에서, 항체는 감소된 또는 최소의 수식인자 기능을 갖는다. 더욱 추가적인 특정 양태에서 최소의 수식인자 기능은 "수식인자-없는 Fc 돌연변이" 또는 무당화로부터 생성된다. 더욱 추가적인 구체예에서, 수식인자-없는 Fc 돌연변이는 불변 부위에서 N297A 또는 D265A/N297A 치환이다.
또 다른 추가적인 구체예에서, 중사슬 및 경사슬 가변 부위 서열을 포함하는 단리된 항-PD-L1 항체가 제공되며, 여기서:
(a) 중사슬 서열은 중사슬 서열: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS(서열 번호:25)에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 가지고; 및/또는
(b) 경사슬 서열은 경사슬 서열: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR(서열 번호:4)에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는다.
특정한 양태에서, 서열 동일성은 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다. 또 다른 양태에서, 중사슬 가변 부위는 다음: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4)처럼 HVR 사이에 병치된 하나 이상의 프레임워크 서열을 포함하고, 경사슬 가변 부위는 다음: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)처럼 HVR 사이에 병치된 하나 이상의 프레임워크 서열을 포함한다. 또 다른 양태에서, 프레임워크 서열은 인간 공통 프레임워크 서열로부터 유래된다. 추가적인 양태에서, 중사슬 프레임워크 서열은 Kabat 하위군 I, II, 또는 III 서열로부터 유래된다. 더욱 추가적인 양태에서, 중사슬 프레임워크 서열은 VH 하위군 III 공통 프레임워크이다. 더욱 추가적인 양태에서, 하나 이상의 중사슬 프레임워크 서열이 서열 번호:8, 9, 10 및 WGQGTLVTVSS (서열 번호:27)로서 제시된다.
더욱 추가적인 양태에서, 경사슬 프레임워크 서열은 Kabat 카파 I, II, II 또는 IV 하위군 서열로부터 유래된다. 더욱 추가적인 양태에서, 경사슬 프레임워크 서열은 VL 카파 I 공통 프레임워크이다. 더욱 추가적인 양태에서, 하나 이상의 경사슬 프레임워크 서열이 서열 번호:15, 16, 17 및 18로서 제시된다.
더욱 추가적인 특정 양태에서, 항체는 추가로 인간 또는 쥐의 불변 부위를 포함한다. 더욱 추가적인 양태에서, 인간 불변 부위는 IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4로 이루어진 군에서 선택된다. 더욱 추가적인 특정 양태에서, 인간 불변 부위는 IgG1이다. 더욱 추가적인 양태에서, 쥐의 불변 부위는 IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3으로 이루어진 군에서 선택된다. 더욱 추가적인 양태에서, 쥐의 불변 부위는 IgG2A이다. 더욱 추가적인 특정 양태에서, 항체는 감소된 또는 최소의 수식인자 기능을 갖는다. 더욱 추가적인 특정 양태에서, 최소의 수식인자 기능은 원핵세포 세포 내 생산으로부터 생성된다. 더욱 추가적인 특정 양태에서 최소의 수식인자 기능은 "수식인자-없는 Fc 돌연변이" 또는 무당화로부터 생성된다. 더욱 추가적인 구체예에서, 수식인자-없는 Fc 돌연변이는 불변 부위에서 N297A 또는 D265A/N297A 치환이다.
추가의 양태에서, 중사슬 가변 부위는 다음: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4)처럼 HVR 사이에 병치된 하나 이상의 프레임워크 서열을 포함하고, 경사슬 가변 부위는 다음: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)처럼 HVR 사이에 병치된 하나 이상의 프레임워크 서열을 포함한다. 더욱 추가적인 양태에서, 프레임워크 서열은 인간 공통 프레임워크 서열로부터 유래된다. 더욱 추가적인 양태에서, 중사슬 프레임워크 서열은 Kabat 하위군 I, II, 또는 III 서열로부터 유래된다. 더욱 추가적인 양태에서, 중사슬 프레임워크 서열은 VH 하위군 III 공통 프레임워크이다. 더욱 추가적인 양태에서, 하나 이상의 중사슬 프레임워크 서열은 다음과 같다:
HC-FR1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS (서열 번호:29)
HC-FR2 WVRQAPGKGLEWVA (서열 번호:30)
HC-FR3 RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (서열 번호:10)
HC-FR4 WGQGTLVTVSS (서열 번호:27).
더욱 추가적인 양태에서, 경사슬 프레임워크 서열은 Kabat 카파 I, II, II 또는 IV 하위군 서열로부터 유래된다. 더욱 추가적인 양태에서, 경사슬 프레임워크 서열은 VL 카파 I 공통 프레임워크이다. 더욱 추가적인 양태에서, 하나 이상의 경사슬 프레임워크 서열은 다음과 같다:
LC-FR1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열 번호:15)
LC-FR2 WYQQKPGKAPKLLIY (서열 번호:16)
LC-FR3 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (서열 번호:17)
LC-FR4 FGQGTKVEIK (서열 번호:28).
더욱 추가적인 특정 양태에서, 항체는 추가로 인간 또는 쥐의 불변 부위를 포함한다. 더욱 추가적인 양태에서, 인간 불변 부위는 IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4로 이루어진 군에서 선택된다. 더욱 추가적인 특정 양태에서, 인간 불변 부위는 IgG1이다. 더욱 추가적인 양태에서, 쥐의 불변 부위는 IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3으로 이루어진 군에서 선택된다. 더욱 추가적인 양태에서, 쥐의 불변 부위는 IgG2A이다. 더욱 추가적인 특정 양태에서, 항체는 감소된 또는 최소의 수식인자 기능을 갖는다. 더욱 추가적인 특정 양태에서 최소의 수식인자 기능은 "수식인자-없는 Fc 돌연변이" 또는 무당화로부터 생성된다. 더욱 추가적인 구체예에서, 수식인자-없는 Fc 돌연변이는 불변 부위에서 N297A 또는 D265A/N297A 치환이다.
또 다른 구체예에서, 중사슬 및 경사슬 가변 부위 서열을 포함하는 항-PD-L1 항체가 제공되며, 여기서:
(c) 중사슬은 추가로 각각 GFTFSDSWIH (서열 번호:19), AWISPYGGSTYYADSVKG (서열 번호:20) 및 RHWPGGFDY (서열 번호:21)에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 가지는 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3 서열을 포함하고, 및/또는
(d) 경사슬은 추가로 각각 RASQDVSTAVA (서열 번호:22), SASFLYS (서열 번호:23) 및 QQYLYHPAT (서열 번호:24)에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 가지는 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3 서열을 포함한다.
특정한 양태에서, 서열 동일성은 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다.
또 다른 양태에서, 중사슬 가변 부위는 다음: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4)처럼 HVR 사이에 병치된 하나 이상의 프레임워크 서열을 포함하고, 경사슬 가변 부위는 다음: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)처럼 HVR 사이에 병치된 하나 이상의 프레임워크 서열을 포함한다. 또 다른 양태에서, 프레임워크 서열은 인간 공통 프레임워크 서열로부터 유래된다. 더욱 추가적인 양태에서, 중사슬 프레임워크 서열은 Kabat 하위군 I, II, 또는 III 서열로부터 유래된다. 더욱 추가적인 양태에서, 중사슬 프레임워크 서열은 VH 하위군 III 공통 프레임워크이다. 더욱 추가적인 양태에서, 하나 이상의 중사슬 프레임워크 서열이 서열 번호:8, 9, 10 및 WGQGTLVTVSSASTK(서열 번호:31)로서 제시된다.
더욱 추가적인 양태에서, 경사슬 프레임워크 서열은 Kabat 카파 I, II, II 또는 IV 하위군 서열로부터 유래된다. 더욱 추가적인 양태에서, 경사슬 프레임워크 서열은 VL 카파 I 공통 프레임워크이다. 더욱 추가적인 양태에서, 하나 이상의 경사슬 프레임워크 서열이 서열 번호:15, 16, 17 및 18로서 제시된다. 더욱 추가적인 특정 양태에서, 항체는 추가로 인간 또는 쥐의 불변 부위를 포함한다. 더욱 추가적인 양태에서, 인간 불변 부위는 IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4로 이루어진 군에서 선택된다. 더욱 추가적인 특정 양태에서, 인간 불변 부위는 IgG1이다. 더욱 추가적인 양태에서, 쥐의 불변 부위는 IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3으로 이루어진 군에서 선택된다. 더욱 추가적인 양태에서, 쥐의 불변 부위는 IgG2A이다. 더욱 추가적인 특정 양태에서, 항체는 감소된 또는 최소의 수식인자 기능을 갖는다. 더욱 추가적인 특정 양태에서 최소의 수식인자 기능은 "수식인자-없는 Fc 돌연변이" 또는 무당화로부터 생성된다. 더욱 추가적인 구체예에서, 수식인자-없는 Fc 돌연변이는 불변 부위에서 N297A 또는 D265A/N297A 치환이다.
또 추가적인 구체예에서, 중사슬 및 경사슬 가변 부위 서열을 포함하는 단리된 항-PD-L1 항체가 제공되며, 여기서:
(a) 중사슬 서열은 중사슬 서열: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTK(서열 번호:26)에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 가지고; 또는
(b) 경사슬 서열은 경사슬 서열: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR(서열 번호:4)에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는다.
일부 구체예에서, 중사슬 및 경사슬 가변 부위 서열을 포함하는 단리된 항-PD-L1 항체가 제공되며, 여기서 경사슬 가변 부위 서열은 서열 번호:4의 아미노산 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 중사슬 및 경사슬 가변 부위 서열을 포함하는 단리된 항-PD-L1 항체가 제공되며, 여기서 중사슬 가변 부위 서열은 서열 번호:26의 아미노산 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 중사슬 및 경사슬 가변 부위 서열을 포함하는 단리된 항-PD-L1 항체가 제공되며, 여기서 경사슬 가변 부위 서열은 서열 번호:4의 아미노산 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지고 중사슬 가변 부위 서열은 서열 번호:26의 아미노산 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 중사슬 및/또는 경사슬의 N-말단에서 하나, 둘, 셋, 넷 또는 다섯 개 아미노산 잔기가 결실, 치환 또는 변형될 수 있다.
또 추가적인 구체예에서, 중사슬 및 경사슬 서열을 포함하는 단리된 항-PD-L1 항체가 제공되며, 여기서:
(a) 중사슬 서열은 중사슬 서열: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(서열 번호:32)에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 가지고; 및/또는
(b) 경사슬 서열은 경사슬 서열: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(서열 번호:33)에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는다.
일부 구체예에서, 중사슬 및 경사슬 서열을 포함하는 단리된 항-PD-L1 항체가 제공되며, 여기서 경사슬 서열은 서열 번호:33의 아미노산 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 중사슬 및 경사슬 서열을 포함하는 단리된 항-PD-L1 항체가 제공되며, 여기서 중사슬 서열은 서열 번호:32의 아미노산 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 중사슬 및 경사슬 서열을 포함하는 단리된 항-PD-L1 항체가 제공되며, 여기서 경사슬 서열은 서열 번호:33의 아미노산 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 가지고 중사슬 서열은 서열 번호:32의 아미노산 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다.
일부 구체예에서, 단리된 항-PD-L1 항체는 무당화된다. 항체의 당화는 전형적으로 N-연결 또는 O-연결된다. N-연결은 아스파라긴 잔기의 곁사슬에 탄수화물 모이어티가 부착된 것을 지칭한다. X가 프롤린이 아닌 임의의 아미노산인, 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌은 아스파라긴 곁사슬에 탄수화물 모이어티가 효소적으로 부착하기 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드 내 이들 트리펩티드 서열의 존재가 가능한 당화 부위를 생성한다. O-연결 당화는 하이드록시아미노산, 비록 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시리신도 사용될 수 있지만 가장 공통적으로는 세린 또는 트레오닌에 대한 당 N-아세틸갈락토스아민, 갈락토스, 또는 자일로스 중 어느 하나의 부착을 지칭한다. 항체를 형성하기 위한 당화 부위의 제거는 상기-서술된 트리펩티드 서열 중 하나(N-연결 당화 부위에 해당)가 제거되도록 아미노산 서열을 개조함으로써 편리하게 성취된다. 개조는 당화 부위 또 다른 아미노산 잔기 내부의 아스파라긴, 세린 또는 트레오닌 잔기의 치환에 의해 이루어질 수 있다(예컨대, 글리신, 알라닌 또는 보존적 치환).
본 명세서의 구체예 중 어느 하나에서, 단리된 항-PD-L1 항체는 인간 PD-L1, 예를 들면 UniProtKB/Swiss-Prot 접근 번호 Q9NZQ7.1에 나타난 바와 같은 인간 PD-L1, 또는 이들의 변이체에 결합할 수 있다.
더욱 추가적인 구체예에서, 본 명세서에 기술된 항체 중 어느 하나를 인코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 일부 구체예에서, 핵산은 추가로 전술된 항-PD-L1 항체 중 어느 하나를 인코딩하는 핵산의 발현을 위해 적절한 벡터를 포함한다. 더욱 추가적인 특정 양태에서, 벡터는 핵산의 발현을 위해 적절한 숙주 세포 내에 존재한다. 더욱 추가적인 특정 양태에서, 숙주 세포 는 진핵 세포 또는 원핵 세포이다. 더욱 추가적인 특정 양태에서, 진핵 세포는 포유류 세포, 가령 중국 햄스터 난소(CHO) 세포이다.
항체 또는 이의 항원 결합 단편은 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여, 예를 들면, 그러한 항체 또는 단편을 제조하기에 적절한 조건 하에서, 발현을 위해 적절한 형태인 전술된 항-PD-L1 항체 또는 항원-결합 단편 중 어느 하나를 인코딩하는 핵산을 내포하는 숙주 세포를 배양하는 단계 및 항체 또는 단편을 회수하는 단계를 포함하는 과정에 의해 제조될 수 있다.
III. 항체 제조
본 명세서에 기술된 항체는 항체를 생성하기 위해 당해 분야에서 입수가능한 기술을 이용하여 제조되며, 그러한 예시적인 방법은 하기 단락에서 더 자세하게 서술된다.
항체는 관심의 항원을 겨냥한다(예컨대, PD-L1(가령 인간 PD-L1), PD1(가령 인간 PD-L1), PD-L2(가령 인간 PD-L2), 등). 바람직하게는, 항원은 생물학적으로 중요한 폴리펩티드이며 장애로 고통받는 포유동물에게 항체를 투여하는 것은 포유동물에게 치료적 이익을 줄 수 있다.
특정 구체예에서, 본 명세서에 제공된 항체는 ≤ 1μM, ≤ 150 nM, ≤ 100 nM, ≤ 50 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예컨대 10-8 M 이하, 예컨대 10-8 M 내지 10-13 M, 예컨대, 10-9 M 내지 10-13 M)인 해리 상수(Kd)를 갖는다.
한 구체예에서, Kd는 Fab 버전의 관심의 항체 및 이의 항원을 이용하여 하기 어세이에 기술되는 바와 같이 수행되는 방사성표지된 항원 결합 어세이(RIA)에 의해 측정된다. 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화성은 Fab를 최소 농도의 (125I)-표지된 항원과 함께 일련의 역가의 미표지 항원의 존재에서 평형화시키고, 이후 항-Fab 항체-코팅된 플레이트로 결합된 항원을 포획하여 측정된다(예컨대, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)를 참조). 어세이의 조건을 설정하기 위해, MICROTITER® 다중-웰 플레이트(Thermo Scientific)를 50 mM 탄산나트륨(pH 9.6) 내 5 μg/ml의 포획 항-Fab 항체(Cappel Labs)로 밤새 코팅하고, 이후 PBS 내 2% (w/v) 소혈청 알부민으로 둘 내지 다섯 시간 동안 실온에서(대략 23℃) 차단시킨다. 비-흡착 플레이트(Nunc #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원을 관심의 Fab와 단계 희석으로 혼합시킨다. 관심의 Fab를 이후 밤새 배양하고; 그러나, 배양은 평형에 도달하도록 보장하기 위해 더 긴 기간(예컨대, 약 65 시간) 동안 지속할 수 있다. 그 후에, 혼합물을 실온에서 배양하기 위해(예컨대, 한 시간 동안) 포획 플레이트로 옮긴다. 용액을 이후 제거하고 플레이트를 여덟 차례 PBS 내 0.1% 폴리소르베이트 20(TWEEN-20®)로 세척한다. 플레이트가 건조되면, 150 μl/웰의 섬광물질(MICROSCINT-20TM; Packard)을 부가하고, 플레이트를 십분 동안 TOPCOUNT™ 감마 계수기(Packard)에서 계수한다. 최대 결합의 20% 이하를 제공하는 각각의 Fab의 농도를 경쟁적 결합 어세이에서 사용하기 위해 선택한다.
또 다른 구체예에 따르면, Kd는 대략 10 반응 단위(RU)로 고정된 항원 CM5 칩과 함께 25℃에서 BIACORE®-2000 또는 BIACORE®-3000(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)를 이용하는 표면 플라스몬 공명 어세이를 이용하여 측정된다. 간략하게, 카르복시메틸화된 덱스트란 생체센서 칩(CM5, BIACORE, Inc.)을 공급사의 설명에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 염화수소산염(EDC) 및 N-하이드록시석신이미드(NHS)으로 활성화시킨다. 항원을 10 mM 나트륨 아세테이트, pH 4.8로, 5 μg/ml(대략 0.2 μM)까지 희석시킨 후에 5 μl/분의 유속으로 주입하여 대략 10 반응 단위(RU)의 커플링된 단백질을 얻는다. 항원을 주입한 뒤, 1 M 에탄올아민을 주입하여 미반응된 기를 차단한다. 동역학 측정을 위해, Fab의 두-배 단계 희석 (0.78 nM에서 500 nM로)을 0.05% 폴리소르베이트 20(TWEEN-20™) 계면활성제(PBST)가 담긴 PBS 내에서 25℃에서 대략 25 μl/분의 유속으로 주입한다. 결합 속도(kon) 및 해리 속도(koff)를 단순 일-대-일 랭뮤이어(Langmuir) 결합 모델(BIACORE® 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 이용하여 결합 및 해리 센서그램(sensorgram)을 동시에 정합시킴으로서 산출한다. 평형 해리 상수(Kd)는 비율 koff/kon로서 산출된다. 예컨대, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)를 참조하라. 만일 결합(on)-비율이 상기 표면 플라스몬 공명 어세이에 의해 106 M-1 s-1를 초과하는 경우, 결합-속도는 분광계, 가령 중지-흐름 탑재 분광광도계(Aviv Instruments) 또는 스터드 큐벳(stirred cuvette)을 이용하는 8000-시리즈 SLM-AMINCOTM 분광광도계(ThermoSpectronic)에서 측정하여 증가하는 항원 농도의 존재에서 25℃에서 PBS 내 20 nM 항-항원 항체(Fab 형태), pH 7.2의 형광 방출 강도(여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 밴드-통과)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 소광 기술을 이용하여 측정될 수 있다.
(i) 항원 제조
임의로 다른 분자에 공액결합된 가용성 항원 또는 이의 단편이 항체를 생성하기 위한 면역원으로 사용될 수 있다. 막관통 분자, 가령 수용체에 있어서, 이들의 단편(예컨대, 수용체의 세포외 도메인)이 면역원으로 사용될 수 있다. 대안적으로, 막관통 분자를 발현하는 세포가 면역원으로 사용될 수 있다. 그러한 세포는 자연적인 공급원(예컨대, 암 세포주)으로부터 유래될 수 있거나 또는 재조합 기술에 의해 막관통 분자를 발현하도록 형질전환된 세포일 수 있다. 항체를 제조하기 위해 유용한 다른 항원 및 이들의 형태가 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다.
(ii) 특정한 항체-기반 방법
다클론 항체는 바람직하게는 관련 항원 및 보강제(adjuvant)의 다중 피하(sc) 또는 복강내(ip) 주입에 의해 동물에서 유도된다. 관련 항원을 이관능성 또는 유도체화 물질, 예를 들면, 말레이미도벤조일 설포석신이미드 에스테르(시스테인 잔기를 통한 접합), N-하이드록시석신이미드(리신 잔기를 통함), 글루타르알데히드, 석신산 무수물, SOCl2, 또는 R1N=C=NR, 여기서 R 및 R1는 상이한 알킬 기,을 이용하여, 면역화될 종에서 면역원성인 단백질, 예컨대, 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소의 티로글로불린, 또는 대두 트립신 저해제에 접합하는 것이 유용할 수 있다.
동물은 예컨대, 100 μg 또는 5 μg의 단백질 또는 접합체(각각 토끼 또는 마우스에 대해)를 3 부피의 프로인트(Freund) 완전 보강제와 조합하고 용액을 여러 부위에 피내 주입함으로써 항원, 면역원성 접합체, 또는 유도체에 대해 면역화된다. 한 달 후에 동물은 프로인트 완전 보강제 내에 원래 양의 1/5 내지 1/10의 펩티드 또는 접합체로 여러 부위에 피하 주입을 통해 면역증폭(boost)된다. 칠일 내지 14 일 후에 동물의 혈액을 받고 혈청을 항체 역가를 위해 분석한다. 동물은 역가 평형에 도달할 때까지 면역증폭된다. 바람직하게는, 동물은 동일한 항원의 접합체이지만, 상이한 단백질에 공액결합된 접합체 및/또는 상이한 가교-연결 시약으로 면역증폭된다. 접합체는 또한 단백질 융합으로서 재조합 세포 배양물 내에서 만들어질 수 있다. 또한, 면역 반응을 증가시키기 위해 명반과 같은 응집제가 적절히 사용된다.
본 발명의 단클론 항체는 인간-인간 하이브리도마에 관하여 최초로 서술된 Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), 및 추가로, 예를 들면, Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 제2판 1988); Hammerling et al.: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981), 및 Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)에 서술된 하이브리도마 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 추가적인 방법은, 예를 들면, 하이브리도마 세포주로부터의 단클론 인간 자연 IgM 항체의 생산에 관한 U.S. 특허 제7,189,826호에 서술된 것들을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술(트리오마(Trioma) 기술)은 Vollmers 및 Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers 및 Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)에 기술되어 있다.
다양한 다른 하이브리도마 기술에 대해서는, 예를 들면, U.S. 특허 공보 제2006/258841호; 제2006/183887호(완전 인간 항체), 제2006/059575호; 제2005/287149호; 제2005/100546호; 및 제2005/026229호; 및 U.S. 특허 제7,078,492호 및 제7,153,507호를 참조하라. 하이브리도마 방법을 이용하여 단클론 항체를 생산하기 위한 예시적인 프로토콜은 하기와 같이 서술된다. 한 구체예에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물, 가령 햄스터는 면역화되어 면역화를 위해 사용되는 단백질에 특이적으로 결합하게 될 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도한다. 항체는 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 단편, 및 보강제, 가령 모노포스포릴 지질 A(MPL)/트레할로스 디크리노미콜레이트(TDM) (Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, MT)의 다중 피하(SC) 또는 복강내(IP) 주입에 의해 동물에서 유도된다. 본 발명의 폴리펩티드(예컨대, 항원) 또는 이의 단편은 당해 분야에 널리 공지된 방법, 가령 재조합 방법을 이용하여 제조될 수 있고, 이들 중 일부는 본 명세서에 추가로 기술된다. 면역화된 동물로부터의 혈청을 항-항원 항체에 대해 분석하고, 면역 증폭을 임의로 투여한다. 항-항원 항체를 생산하는 동물로부터의 림프구를 단리한다. 대안적으로, 림프구를 시험관내에서 면역화시킬 수 있다.
림프구는 이후 적절한 융합 물질, 가령 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 골수종 세포와 융합되어, 하이브리도마 세포를 형성한다. 예컨대, Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)을 참조하라. 골수종 세포는 효율적인 융합, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 안정한 고-수준 생산 지원을 위해 사용될 수 있고, HAT 배지와 같은 배지에 민감하다. 예시적인 골수종 세포는, 쥐의 골수종 세포주, 가령 Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. USA에서 입수가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양에서 유래한 것들, 및 American Type Culture Collection, Rockville, Md. USA에서 입수가능한 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주는 또한 인간 단클론 항체의 생산에 대해 서술된 바 있다(Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).
그렇게 제조된 하이브리도마 세포를 적절한 배양 배지, 예컨대, 융합안된, 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 저해하는 하나 이상의 물질을 함유하는 배지에 접종하고 성장시킨다. 예를 들면, 모 골수종 세포에 효소 히포잔틴 구아닌 포스포리보실 전이효소(HGPRT 또는 HPRT)가 결핍되면, 하이브리도마를 위한 배양 배지는 전형적으로 히포잔틴, 아미노프테린, 및 티미딘(HAT 배지)을 포함할 것이며, 이러한 물질이 HGPRT-결핍 세포의 성장을 차단한다. 바람직하게는, 동물-유래 혈청 가령 소태아 혈청의 사용을 줄이기 위해 예를 들면, Even et al., Trends in Biotechnology, 24(3), 105-108 (2006)에 서술된 바와 같은 무-혈청 하이브리도마 세포 배양 방법이 사용된다.
하이브리도마 세포 배양의 생산성을 향상하기 위한 수단으로서의 올리고펩티드는 Franek, Trends in Monoclonal Antibody Research, 111-122 (2005)에 서술되어 있다. 특정하게는, 표준 배양 배지는 특정 아미노산(알라닌, 세린, 아스파라긴, 프롤린), 또는 단백질 가수분해물 분획으로 농축되며, 아폽토시스는 셋 내지 여섯 가지 아미노산 잔기로 이루어진 합성 올리고펩티드에 의해 상당하게 억제될 수 있다. 펩티드는 밀리몰 또는 더 높은 농도로 존재한다.
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지는 본 발명의 항체에 결합하는 단클론 항체의 생산을 위해 분석될 수 있다. 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 단클론 항체의 결합 특이성은 면역침강 또는 시험관내 결합 어세이, 가령 방사면역측정법(RIA) 또는 효소-연관 면역 흡수 어세이(ELISA)에 의해 측정될 수 있다. 단클론 항체의 결합 친화성은, 예를 들면, 스캐차드(Scatchard) 분석에 의해 측정될 수 있다. 예컨대, Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)을 참조하라.
하이브리도마 세포가 요망되는 특이성, 친화성, 및/또는 활성의 항체를 생산하는 것으로 확인된 후에, 클론은 희석 절차를 제한하고 표준 방법으로 성장시킴으로써 서브클로닝될 수 있다. 예컨대, Goding, 상기와 동일을 참조하라. 이러한 목적을 위해 적절한 배양 배지는, 예를 들면, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수성 종양으로서 생체내에서 성장할 수 있다. 서브클론에 의해 분비되는 단클론 항체는 통상적인 면역글로불린 정제 절차 가령, 예를 들면, 단백질 A-세파로스, 수산인회석 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 배양 배지, 복수, 또는 혈청으로부터 적절히 분리된다. 하이브리도마 세포로부터 단백질을 단리하기 위한 한 가지 절차는 US 2005/176122호 및 U.S. 특허 제6,919,436호에 서술되어 있다. 상기 방법은 결합 과정에서 최소한의 염, 가령 이액성 염을 이용하는 것, 및 바람직하게는 또한 용리 과정에서 소량의 유기 용매를 이용하는 것을 포함한다.
(iii) 라이브러리-유래 항체
본 발명의 항체는 요망되는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 선별함으로써 단리될 수 있다. 예를 들면, 파지 전시 라이브러리를 생성하고 요망되는 결합 특징을 보유하는 항체에 대해 그러한 라이브러리를 선별하기 위한 다양한 방법이 당해 분야에 공지되어 있다. 추가적인 방법이 예컨대, Hoogenboom et al., Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)에서 검토되며 추가로, 예컨대, McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks 및 Bradbury, Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)에 서술되어 있다.
특정한 파지 전시 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리가 개별적으로 중합효소 사슬 반응(PCR)에 의해 클로닝되고 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합되며, 이는 이후 Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)에 서술된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 선별될 수 있다. 파지는 전형적으로 단일-사슬 Fv(scFv) 단편 또는 Fab 단편으로서 항체 단편을 전시한다. 면역화 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 제작할 필요없이 면역원에 대해 높은-친화성의 항체를 제공한다. 대안적으로 Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)에 서술된 바와 같은 임의의 면역화 없이 순수한 레퍼토리가 클로닝되어(예컨대, 인간으로부터) 광범위한 비-자기 및 또한 자가-항원에 대한 항체의 단일 공급원을 제공할 수 있다. 마지막으로, 줄기세포로부터 재배치되지 않은 V-유전자 단편을 클로닝함으로써, 그리고 무작위 서열을 내포하는 PCR 프라이머를 이용하여 고도로 가변적인 CDR3 부위를 인코딩하고 Hoogenboom 및 Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)에 서술된 바와 같이 시험관내 재배치를 달성함으로써 순수한 라이브러리가 또한 합성적으로 제조될 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 서술하는 특허 공보는 예를 들면:US 특허 제5,750,373호, 및 US 특허 공보 제2005/0079574호, 제2005/0119455호, 제2005/0266000호, 제2007/0117126호, 제2007/0160598호, 제2007/0237764호, 제2007/0292936호, 및 제2009/0002360호를 포함한다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본 명세서에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 간주된다.
(iv) 키메라, 인간화된 및 인간 항체
특정 구체예에서, 본 명세서에 제공된 항체는 키메라 항체이다. 특정한 키메라 항체가, 예컨대, U.S. 특허 제4,816,567호; 및 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)에 서술되어 있다. 한 예에서, 키메라 항체는 인간이-아닌 가변 부위(예컨대, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 또는 인간이-아닌 영장류, 가령 원숭이로부터 유래된 가변 부위) 및 인간 불변 부위를 포함한다. 추가적인 예에서, 키메라 항체는 종류 또는 하위 종류가 모 항체와 다르게 변화된 "종류 전환(class switched)" 항체이다. 키메라 항체는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
특정 구체예에서, 키메라 항체는 인간화된 항체이다. 전형적으로, 인간이-아닌 항체는 인간에 대한 면역원성을 줄이기 위해 인간화되는 반면, 인간이-아닌 모 항체의 특이성 및 친화성은 보유한다. 일반적으로, 인간화된 항체는 하나 이상의 가변 도메인을 포함하며 여기서 HVR, 예컨대, CDR, (또는 이의 일부)는 인간이-아닌 항체에서 유래하고, 및 FR(또는 이의 일부)는 인간 항체 서열에서 유래한다. 인간화된 항체는 임의로 또한 인간 불변 부위의 적어도 한 부분을 포함할 것이다. 일부 구체예에서, 인간화된 항체 내 일부 FR 잔기는, 예를 들면, 항체 특이성 또는 친화성을 회복 또는 향상시키기 위해 인간이-아닌 항체(예컨대, HVR 잔기가 유래한 항체)로부터의 상응하는 잔기로 대체된다.
인간화된 항체 및 이들은 제조하는 방법은 예컨대, Almagro 및 Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)에서 검토되며, 추가로 예컨대, Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); US 특허 제5, 821,337호, 제7,527,791호, 제6,982,321호, 및 제7,087,409호; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (SDR (a-CDR) 이식을 서술); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) ("재표면화"를 서술); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) ("FR 뒤섞기"를 서술); 및 Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 및 Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (FR 뒤섞기에 대한 "유도 선별" 접근을 서술)에 서술되어 있다.
인간화를 위해 사용될 수 있는 인간 프레임워크 부위는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: "최적합" 방법을 이용하여 선택된 프레임워크 부위(예컨대, Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)를 참조); 경사슬 또는 중사슬 가변 부위의 특정 하위군의 인간 항체의 공통 서열에서 유래한 프레임워크 부위(예컨대, Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); 및 Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)를 참조); 인간 성숙 (체세포가 변이된 것) 프레임워크 부위 또는 인간 생식세포 프레임워크 부위(예컨대, Almagro 및 Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)를 참조); 및 선별 FR 라이브러리에서 유래한 프레임워크 부위(예컨대, Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)를 참조).
특정 구체예에서, 본 명세서에 제공된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 당해 분야에 공지된 다양한 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 인간 항체는 van Dijk 및 van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)에 개괄적으로 서술되어 있다
인간 항체는 항원 시도에 대하여 온전한 인간 항체 또는 인간 가변 부위를 갖는 온전한 항체를 생산하도록 변형된 형질전환 동물에 면역원을 투여하여 제조될 수 있다. 그러한 동물은 전형적으로 내인성 면역글로불린 좌위를 대체하거나, 염색체외에 존재하거나 또는 동물의 염색체로 무작위로 통합된 인간 면역글로불린 좌위를 전부 또는 일부 내포한다. 그러한 형질전환 마우스에서, 내인성 면역글로불린 좌위는 일반적으로 비활성화된다. 형질전환 동물로부터 인간 항체를 수득하기 위한 방법의 검토를 위해, Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)를 참조하라. 또한, 예를 들면, XENOMOUSETM 기술을 서술하는 U.S. 특허 제6,075,181호 및 제6,150,584호; HUMAB® 기술을 서술하는 U.S. 특허 제5,770,429호; K-M MOUSE® 기술을 서술하는 U.S. 특허 제7,041,870호, 및 VELOCIMOUSE® 기술을 서술하는 특허 출원 공보 US 2007/0061900호를 참조하라). 그러한 동물에 의해 생성된 온전한 항체로부터의 인간 가변 부위는 예컨대, 상이한 인간 불변 부위를 조합함으로써 더욱 변형될 수 있다.
인간 항체는 또한 하이브리도마-기반 방법으로 제조될 수 있다. 인간 단클론 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주가 또한 서술된 바 있다. (예컨대, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)를 참조하라.) 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 행성된 인간 항체는 또한 Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)에 서술되어 있다. 추가적인 방법은, 예를 들면, U.S. 특허 제7,189,826호(하이브리도마 세포주로부터 단클론 인간 IgM 항체의 생산을 서술) 및 Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (인간-인간 하이브리도마를 서술)에 서술된 것들을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술(트리오마 기술)은 또한 Vollmers 및 Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers 및 Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)에 서술되어 있다.
인간 항체는 또한 인간-유래 파지 전시 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리함으로써 생성될 수 있다. 그러한 가변 도메인 서열은 이후 요망되는 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선별하기 위한 기술은 하기에 기술된다.
(v) 항체 단편
항체 단편은 전통적인 수단, 가령 효소적 절단, 또는 재조합 기술에 의해 생성될 수 있다. 특정한 경우에 전체 항체보다, 항체 단편을 이용하는 것이 유익하다. 단편의 더 작은 크기는 빠른 제거를 가능하게 하며, 충실성 종양에 대한 향상된 접근을 유도할 수 있다. 특정 항체 단편의 검토를 위해, Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134를 참조하라.
다양한 기술이 항체 단편의 생산을 위해 개발된 바 있다. 전통적으로, 이들 단편은 온전한 항체의 단백질가수분해 절단을 통해 유도되었다(예컨대, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); 및 Brennan et al., Science, 229:81 (1985)을 참조). 그러나, 이들 단편은 이제 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생산될 수 있다. Fab, Fv 및 ScFv 항체 단편은 모두 E. coli로부터 발현되고 분비될 수 있고, 따라서 이들 단편의 손쉬운 대량 생산을 가능하게 한다. 항체 단편은 위에서 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 대안적으로, Fab'-SH 단편은 E. coli로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다(Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). 또 다른 접근법에 따르면, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리될 수 있다. 재생 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하는 증가된 생체내 반-감기를 가지는 Fab 및 F(ab')2 단편이 U.S. 특허 제5,869,046호에 서술되어 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술이 숙련된 기술자에게 명백할 것이다. 특정 구체예에서, 항체는 단일 사슬 Fv 단편(scFv)이다. 예를 들면, WO 93/16185호; U.S. 특허 제5,571,894호; 및 제5,587,458호를 참조하라. Fv 및 scFv는 불변 부위가 없이 온전한 결합 부위을 가지는 유일한 종이며; 따라서, 이들은 생체내 사용 도중에 비특이적 결합을 줄이기 위해 적절할 수 있다. scFv 융합 단백질은 scFv의 아미노 또는 카르복시 말단에서 수식인자 단백질의 융합을 얻도록 구성될 수 있다. Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, 상기와 동일을 참조하라. 예를 들면 항체 단편은 또한 예컨대, U.S. 특허 제5,641,870호에 서술된 바와 같은 "선형 항체"일 수 있다. 그러한 선형 항체는 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.
(vi) 다중특이적 항체
다중특이적 항체는 적어도 두 개의 상이한 에피토프에 대해 결합 특이성을 가지며, 여기서 에피토프는 일반적으로 상이한 항원에서 유래한다. 그러한 분자는 일반적으로 두 개의 상이한 에피토프에만 결합하며(즉 이중특이적 항체, BsAb), 추가적인 특이성을 갖는 항체 가령 삼중특이적 항체가 본 명세서에서 사용되는 경우 상기 표현에 포함된다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편(예컨대 F(ab')2 이중특이적 항체)으로서 제조될 수 있다.
이중특이적 항체를 제조하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 전장 이중특이적 항체의 통상적인 생산은 두 가지 면역글로불린 중사슬-경사슬 쌍의 공동발현을 기초로 하며, 여기서 두 사슬은 상이한 특이성을 가진다 (예컨대, Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)를 참조). 면역글로불린 중사슬 및 경사슬의 무작위 조합으로 인해, 이들 하이브리도마(쿼드로마)는 10가지 상이한 항체 분자의 가능한 혼합물을 생성하며, 그 중 단 하나만 올바른 이중특이적 구조를 지닌다. 보통 친화성 크로마토그래피 단계로 이루어지는 올바른 분자의 정제는 도리어 번거롭고, 산물 수율이 낮다. 유사한 절차가 WO 93/08829호, 및 Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)에 개시되어 있다.
이중특이적 항체를 제조하기 위한 당해 분야에 공지된 한 가지 접근법은 "혹을 구멍으로(knobs-into-hole)" 또는 "돌기를 공동으로(protuberance-into-cavity)" 접근법이다(예컨대, US 특허 제5,731,168호를 참조). 이러한 접근법에서, 두 개의 면역글로불린 폴리펩티드(예컨대, 중사슬 폴리펩티드)는 각각 접촉면을 포함한다. 한 면역글로불린 폴리펩티드의 접촉면은 다른 면역글로불린 폴리펩티드 상의 상응하는 접촉면과 상호작용하고, 이를 통해 두 개의 면역글로불린 폴리펩티드가 연합할 수 있다. 이들 접촉면은 한 면역글로불린 폴리펩티드의 접촉면에 위치한 "혹" 또는 "돌기"(이들 용어는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용될 수 있다)가 다른 면역글로불린 폴리펩티드의 접촉면에 위치한 "구멍" 또는 "공동"(이들 용어는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용될 수 있다)에 상응하도록 조작될 수 있다. 일부 구체예에서, 구멍은 혹과 동일하거나 유사한 크기를 가지며 두 개의 접촉면이 상호작용할 경우, 한 접촉면의 혹이 다른 접촉면의 상응하는 구멍에 위치할 수 있도록 적절히 배치된다. 이론에 구애받는 것을 원치 않고, 이는 이종다합체를 안정화시키고 다른 종, 예를 들면 동종다합체보다 이종다합체의 형성을 촉진하는 것으로 생각된다. 일부 구체예에서, 이러한 접근법은 두 가지 상이한 면역글로불린 폴리펩티드의 이종다합체화를 촉진하여, 상이한 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는 두 가지 면역글로불린 폴리펩티드를 포함하는 이중특이적 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 혹은 작은 아미노산 곁사슬을 더 큰 곁사슬로 대체함으로써 구성될 수 있다. 일부 구체예에서, 구멍은 큰 아미노산 곁사슬을 더 작은 곁사슬로 대체함으로써 구성될 수 있다. 혹 또는 구멍은 본래의 접촉면에 존재할 수 있거나, 합성되어 도입될 수 있다. 예를 들면, 혹 또는 구멍은 접촉면을 인코딩하는 핵산 서열을 개조함으로써 합성되어 도입되어서 적어도 하나의 "본래" 아미노산 잔기를 적어도 하나의 "유입된" 아미노산 잔기로 대체할 수 있다. 핵산 서열을 개조하기 위한 방법은 당해 분야에 널리 공지된 표준 분자생물학 기술을 포함할 수 있다. 다양한 아미노산 잔기의 곁사슬 부피가 하기 표에서 보여진다. 일부 구체예에서, 본래의 잔기는 작은 곁사슬 부피(예컨대, 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글리신, 세린, 트레오닌, 또는 발린)를 가지며, 혹을 형성하기 위해 유입된 잔기는 자연발생적 아미노산이고 아르기닌, 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 본래의 잔기는 큰 곁사슬 부피(예컨대, 아르기닌, 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판)를 가지며, 구멍을 형성하기 위해 유입된 잔기는 자연발생적 아미노산이고 알라닌, 세린, 트레오닌, 및 발린을 포함할 수 있다.
표 1. 아미노산 잔기의 특성
아미노산 한-문자 축약 질량 a
(달톤) 		부피 b
(Å 3 ) 		접근가능한 표면적 c (Å 2 )
알라닌 (Ala) A 71.08 88.6 115
아르기닌 (Arg) R 156.20 173.4 225
아스파라긴 (Asn) N 114.11 117.7 160
아스파르트산 (Asp) D 115.09 111.1 150
시스테인 (Cys) C 103.14 108.5 135
글루타민 (Gln) Q 128.14 143.9 180
글루탐산 (Glu) E 129.12 138.4 190
글리신 (Gly) G 57.06 60.1 75
히스티딘 (His) H 137.15 153.2 195
이소류신 (Ile) I 113.17 166.7 175
류신 (Leu) L 113.17 166.7 170
리신 (Lys) K 128.18 168.6 200
메티오닌 (Met) M 131.21 162.9 185
페닐알라닌 (Phe) F 147.18 189.9 210
프롤린 (Pro) P 97.12 122.7 145
세린 (Ser) S 87.08 89.0 115
트레오닌 (Thr) T 101.11 116.1 140
트립토판 (Trp) W 186.21 227.8 255
티로신 (Tyr) Y 163.18 193.6 230
발린 (Val) V 99.14 140.0 155
a아미노산의 분자량 빼기 물의 분자량. Handbook of Chemistry and Physics, 제43판 Cleveland, Chemical Rubber Publishing Co., 1961로부터의 수치.
bA.A. Zamyatnin, Prog. Biophys. Mol. Biol. 24:107-123, 1972로부터의 수치.
cC. Chothia, J. Mol. Biol. 105:1-14, 1975로부터의 수치. 접근가능한 표면적은 상기 참고문헌의 도 6-20에서 확인된다.
일부 구체예에서, 혹 또는 구멍을 형성하기 위한 본래의 잔기는 이종다합체의 삼-차원 구조를 기초로 확인된다. 삼-차원 구조를 얻기 위해 당해 분야에 공지된 기술은 X-선 결정학 및 NMR을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 접촉면은 면역글로불린 불변 도메인의 CH3 도메인이다. 이들 구체예에서, 인간 IgG1의 CH3/CH3 접촉면은 네 개의 역-병렬 β-가닥에 위치한 각각의 도메인 상의 열여섯개 잔기를 포함한다. 이론에 구애받는 것을 원치 않고, 변이된 잔기는 바람직하게는 혹이 상대 CH3 도메인의 상응하는 구멍 대신, 주변 용매에 의해 제공될 수 있는 위험을 최소화하기 위해 두 개의 중심 역-병렬 β-가닥에 위치한다. 일부 구체예에서, 두 개의 면역글로불린 폴리펩티드에서 상응하는 혹 및 구멍을 형성하는 돌연변이는 하기 표에서 제공되는 하나 이상의 쌍에 해당한다.
표 2. 상응하는 혹-및 구멍-형성 돌연변이의 예시적인 집합
첫 번째 면역글로불린의 CH3 두 번째 면역글로불린의 CH3
T366Y Y407T
T366W Y407A
F405A T394W
Y407T T366Y
T366Y:F405A T394W:Y407T
T366W:F405W T394S:Y407A
F405W:Y407A T366W:T394S
F405W T394S
돌연변이는 본래의 잔기, 다음으로 Kabat 번호 시스템을 이용한 위치, 및 이후 유입 잔기로 표현된다(모든 잔기는 단일-문자 아미노산 암호로 제공된다). 다중 돌연변이는 콜론으로 구별된다.
일부 구체예에서, 면역글로불린 폴리펩티드는 상기 표 2에 나열된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 CH3 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체는 표 2의 왼쪽 컬럼에 나열된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 CH3 도메인을 포함하는 첫 번째 면역글로불린 폴리펩티드, 및 표 2의 오른쪽 컬럼에 나열된 하나 이상의 상응하는 아미노산 치환을 포함하는 CH3 도메인을 포함하는 두 번째 면역글로불린 폴리펩티드를 포함한다.
위에서 논의된 바와 같은 DNA의 돌연변이에 이어서, 하나 이상의 상응하는 혹- 또는 구멍-형성 돌연변이를 갖는 변형된 면역글로불린 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 당해 분야에 공지된 표준 재조합 기술 및 세포 시스템을 이용하여 발현되고 정제될 수 있다. 예컨대, U.S. 특허 제5,731,168호; 제5,807,706호; 제5,821,333호; 제7,642,228호; 제7,695,936호; 제8,216,805호; US. 특허 제2013/0089553호; 및 Spiess et al., Nature Biotechnology 31: 753-758, 2013를 참조하라. 변형된 면역글로불린 폴리펩티드는 원핵 숙주 세포, 가령 E. coli, 또는 진핵 숙주 세포, 가령 CHO 세포를 이용하여 제조될 수 있다. 상응하는 혹- 및 구멍-내포 면역글로불린 폴리펩티드는 숙주 세포에서 동시-배양으로 발현되고 이종다합체로서 동시에 함께 정제될 수 있거나, 단일 배양으로 발현되고, 개별적으로 정제되고, 및 시험관내에서 조립될 수 있다. 일부 구체예에서, 박테리아 숙주 세포의 두 가지 균주(하나는 혹을 갖는 면역글로불린 폴리펩티드를 발현하고, 다른 하나는 구멍을 갖는 면역글로불린 폴리펩티드를 발현함)는 당해 분야에 공지된 표준 박테리아 배양 기술을 이용하여 동시-배양된다. 일부 구체예에서, 두 가지 균주는 특정한 비율로 혼합되어, 예컨대, 배양물에서 동일한 발현 수준을 얻을 수 있다. 일부 구체예에서, 두 가지 균주는 50:50, 60:40, 또는 70:30 비율로 혼합될 수 있다. 폴리펩티드 발현 후에, 세포는 함께 용해될 수 있고, 단백질은 추출될 수 있다. 동종-다량체 vs. 이종-다량체 종의 존재비를 측정할 수 있게 하는 당해 분야에 공지된 표준 기술은 크기 배제 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 각각의 변형된 면역글로불린 폴리펩티드는 개별적으로 표준 재조합 기술을 이용하여 발현되며, 시험관내에서 함께 조립될 수 있다. 조립은 예를 들면, 각각의 변형된 면역글로불린 폴리펩티드를 정제하고, 혼합하고 동일한 양으로 함께 배양하고, 이황화물을 제거하고(예컨대, 디티오트레이톨을 이용한 처리), 농축하고, 폴리펩티드를 재산화시켜 성취될 수 있다. 형성된 이중특이적 항체는 양이온-교환 크로마토그래피를 비롯한 표준 기술을 이용하여 정제되고 크기 배제 크로마토그래피를 비롯한 표준 기술을 이용하여 측정될 수 있다. 이들 방법의 더 상세한 설명을 위해, Speiss et al., Nat. Biotechnol. 31:753-8, 2013를 참고하라. 일부 구체예에서, 변형된 면역글로불린 폴리펩티드는 개별적으로 CHO 세포에서 발현되고 상기 서술된 방법을 이용하여 시험관내에서 조립될 수 있다.
상이한 접근법에 따르면, 요망되는 결합 특이성을 가지는 항체 가변 도메인 (항체-항원 조합 부위)는 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다. 상기 융합은 바람직하게는 적어도 힌지(hinge), CH2, 및 CH3 부위의 일부를 포함하는 면역글로불린 중사슬 불변 도메인과 이루어진다. 경사슬 결합을 위해 필요한 부위를 가지는 첫 번째 중-사슬 불변 부위(CH1)가, 적어도 하나의 융합에서 존재하는 것이 전형적이다. 면역글로불린 중사슬 융합 및, 요망되는 경우, 면역글로불린 경사슬을 인코딩하는 DNA가 각각의 발현 벡터에 삽입되고, 적절한 숙주 유기체에 동시-형질주입된다. 이는 세 가지 폴리펩티드 사슬이 동등하지 않는 비율로 구조체에 사용되는 경우의 구체예에서 세 가지 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정하는데 큰 유연성을 제공하여 최적 수율을 제공한다. 그러나, 적어도 두 가지 폴리펩티드 사슬을 동일한 비율로 발현하는 것이 높은 수율을 야기할 때 또는 비율이 특별한 중요성을 갖지 않을 때, 하나의 발현 벡터에 둘 또는 모든 세 가지 폴리펩티드 사슬에 대해 코딩 서열을 삽입하는 것이 가능하다.
이러한 접근법의 한 구체예에서, 이중특이적 항체는 하나의 팔에 첫 번째 결합 특이성을 가지는 하이브리드 면역글로불린 중사슬, 및 다른 팔에 하이브리드 면역글로불린 중사슬-경사슬 쌍 (이것이 두 번째 결합 특이성을 제공함)으로 구성된다. 이러한 비대칭 구조는, 이중특이적 분자의 절반에만 면역글로불린 경사슬이 존재하는 것이 분리의 용이성을 제공하는 것처럼, 요망되는 이중특이적 화합물을 원치않는 면역글로불린 사슬 조합물로부터 분리하는 것을 용이하게 함이 밝혀졌다. 이러한 접근법은 WO 94/04690호에 개시되어 있다. 이중특이적 항체를 생성하는 더 자세한 사항은 예를 들면, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)를 참조하라.
WO96/27011호에 서술된 또 다른 접근법에 따르면, 항체 분자의 쌍 사이의 접촉면은 재조합 세포 배양으로부터 회수되는 이종이합체의 백분율을 최대화하기 위해 조작될 수 있다. 하나의 접촉면은 항체 불변 도메인의 CH 3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이러한 방법에서, 첫 번째 항체 분자의 접촉면으로부터의 하나 이상의 작은 아미노산 곁사슬은 더 큰 곁사슬(예컨대 티로신 또는 트립토판)로 대체된다. 큰 곁사슬(들)과 동일하거나 유사한 크기의 보상적 "공동"은 큰 아미노산 곁사슬을 더 작은 것(예컨대 알라닌 또는 트레오닌)으로 대체함으로써 두 번째 항체 분자의 접촉면 상에 형성된다. 이는 다른 원치않는 최종-산물 가령 동종이합체보다 이종이합체의 수율을 증가시키기 위한 메커니즘을 제공한다.
이중특이적 항체는 교차-연결된 또는 "이종접합된" 항체를 포함한다. 예를 들면, 이종접합체 내 항체 중 하나는 아비딘에, 다른 하나는 비오틴에 커플링될 수 있다. 그러한 항체는, 예를 들면, 원치않는 세포에 대한 면역 시스템 세포의 표적화(U.S. 특허 제4,676,980호), 및 HIV 감염의 치료(WO 91/00360호, WO 92/200373호, 및 EP 03089호)를 위해 제안된 바 있다. 이종접합 항체는 임의의 편리한 교차-연결 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 적절한 교차-연결제가 당해 분야에 널리 공지되어 있고, U.S. 특허 제4,676,980호에 수많은 교차-연결 기술과 함께 개시되어 있다.
항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성하기 위한 기술이 또한 상기 문헌에 서술되어 있다. 예를 들면, 이중특이적 항체는 화학적 연결을 이용하여 제조될 수 있다. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)은 온전한 항체가 단백질가수분해에 의해 절단되어 F(ab')2 단편을 생성하는 절차를 서술한다. 이들 단편은 디티올 복합화제 아비산 나트륨의 존재에서 환원되어 이웃자리(vicinal) 디티올을 안정화시키고 분자간 이황화물 형성을 방지한다. 생성된 Fab' 단편은 이후 티오니트로벤조에이트(TNB) 유도체로 전환된다. Fab'-TNB 유도체 중 하나는 이후 머캅토에틸아민을 이용한 환원에 의해 Fab'-티올로 재전환되고 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합되어 이중특이적 항체를 형성한다. 생성된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 부동화를 위한 물질로서 사용될 수 있다.
최근의 진보는 E. coli로부터 Fab'-SH 단편의 직접적인 회수를 용이하게 만들었고, 이는 화학적으로 커플링되어 이중특이적 항체를 형성한다. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)는 완전히 인간화된 이중특이적 항체 F(ab')2 분자의 제조를 서술하고 있다. 각각의 Fab' 단편은 E. coli로부터 각각 분비되었고 시험관내 유도 화학 커플링 처리되어 이중특이적 항체를 형성하였다.
재조합 세포 배양물로부터 이중특이적 항체 단편을 직접 제조하고 단리하기 위한 다양한 기술이 또한 기술되어 있다. 예를 들면, 이중특이적 항체는 류신 지퍼를 이용하여 제조된 바 있다. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992). Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드는 유전자 융합에 의해 두 가지 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결되었다. 항체 동종이합체는 경첩 부위에서 환원되어 단량체를 형성하고 이후 재-산화되어 항체 이종이합체를 형성하였다. 이러한 방법이 또한 항체 동종이합체의 생산을 위해 이용될 수 있다. Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)에 의해 서술된 "디아바디" 기술은 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 대안적인 메커니즘을 제공하였다. 단편은 너무 짧아서 동일한 사슬 상의 두 도메인 사이에 쌍을 형성할 수 없는 링커에 의해 경-사슬 가변 도메인(VL)에 연결된 중-사슬 가변 도메인(VH)을 포함한다. 따라서, 단편의 VH 및 VL 도메인은 또 다른 단편의 상보적 VL 및 VH 도메인과 쌍을 형성할 수 밖에 없고, 이를 통해 두 개의 항원-결합 부위를 형성한다. 단일-사슬 Fv(sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 또 다른 전략이 또한 보고된 바 있다. Gruber et al, J. Immunol, 152:5368 (1994)을 참조하라.
이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 또 다른 기술은 "이중특이적 T 세포 관여체" 또는 BiTE® 접근법이다(예컨대, WO2004/106381호, WO2005/061547호, WO2007/042261호, 및 WO2008/119567호를 참조). 이러한 접근법은 단일 폴리펩티드 상에 배치된 두 개의 항체 가변 도메인을 이용한다. 예를 들면, 단일 폴리펩티드 사슬은 두 개의 단일 사슬 Fv(scFv) 단편을 포함하며, 각각은 두 개의 도메인 사이에 분자간 연합을 허용하기에 충분한 길이의 폴리펩티드 링커에 의해 서로 떨어진 가변 중사슬(VH) 및 가변 경사슬(VL) 도메인을 갖는다. 이러한 단일 폴리펩티드는 추가로 scFv 단편 사이에 두 개의 폴리펩티드 스페이서 서열을 포함한다. 각각의 scFv는 상이한 에피토프를 인식하며, 이들 에피토프는 상이한 세포 유형에 대해 특이적이어서, 각각의 scFv가 이의 동족의 에피토프와 만났을 때 두 가지 상이한 세포 유형의 세포는 아주 가까워지거나 묶이게 될 수 있다. 이러한 접근법의 한 특정 구체예는 표적 세포, 가령 악성 또는 종양 세포에 의해 발현된 세포-표면 항원을 인식하는 또 다른 scFv에 연결된, 면역 세포에 의해 발현된 세포-표면 항원, 예컨대, T 세포 상의 CD3 폴리펩티드를 인식하는 scFv를 포함한다.
이것은 단일 폴리펩티드이므로, 이중특이적 T 세포 관여체는 당해 분야에 공지된 임의의 원핵세포 또는 진핵세포 발현 시스템, 예컨대, CHO 세포주를 이용하여 발현될 수 있다. 그러나, 단량체 이중특이적 T 세포 관여체를 단량체의 의도된 활성이 아닌 다른 생물학적 활성을 가지는 다른 다량체 종으로부터 분리하기 위해 특정한 정제 기술(예컨대, EP1691833호를 참조)이 필요할 수 있다. 한 예시적인 정제 도식에서, 분비된 폴리펩티드를 함유하는 용액은 먼저 금속 친화성 크로마토그래피를 거치고, 폴리펩티드는 이미다졸 농도의 구배로 용리된다. 상기 용출액은 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 더욱 정제되고, 폴리펩티드는 염화나트륨 농도의 구배를 이용하여 용리된다. 마지막으로, 상기 용출액은 크기 배제 크로마토그래피를 거쳐 다량체 종으로부터 단량체를 분리한다.
이가를 초과하는 항체가 고려된다. 예를 들면, 삼중특이적 항체가 제조될 수 있다. Tuft et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).
(vii) 단일-도메인 항체
일부 구체예에서, 본 발명의 항체는 단일-도메인 항체이다. 단일-도메인 항체는 항체의 중사슬 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경사슬 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 단일 폴리펩티드 사슬이다. 특정 구체예에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다(Domantis, Inc., Waltham, Mass.; 예컨대, U.S. 특허 제6,248,516호 B1를 참조). 한 구체예에서, 단일-도메인 항체는 항체의 중사슬 가변 도메인의 전부 또는 일부로 이루어진다.
(viii) 항체 변이체
일부 구체예에서, 본 명세서에 서술된 항체의 아미노산 서열 변형(들)이 고려된다. 예를 들면, 항체의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 특성을 향상하는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 변화를 도입하거나, 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 그러한 변형은, 예를 들면, 항체의 아미노산 서열 내부의 잔기의 결실, 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 결실, 삽입, 및 치환의 임의의 조합이 최종 구조체에 도달하기 위해 가해질 수 있지만, 단서로서 최종 구조체는 요망되는 특징을 지녀야 한다. 아미노산 개조가 서열이 만들어지는 시점에 대상 항체 아미노산 서열에 도입될 수 있다.
(ix) 치환, 삽입, 및 결실 변이체
특정 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 가지는 항체 변이체가 제공된다. 치환에 의한 돌연변이유발을 위한 관심의 부위는 HVR 및 FR를 포함한다. 보존적 치환은 표 1에서 "보존적 치환" 항목 아래에 보여진다. 더욱 실질적인 변화는 표 1에서 "예시적인 치환" 항목 아래 제공되며 아미노산 곁사슬 종류와 관련하여 하기에 더욱 서술된다. 아미노산 치환은 요망되는 활성, 예컨대, 보유/향상된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 향상된 ADCC 또는 CDC에 대해 선별된 관심의 항체 및 산물에 도입될 수 있다.
표 3. 예시적인 치환.
원래 잔기 예시적인 치환 바람직한 치환
Ala (A) Val; Leu; Ile Val
Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys
Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln
Asp (D) Glu; Asn Glu
Cys (C) Ser; Ala Ser
Gln (Q) Asn; Glu Asn
Glu (E) Asp; Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg
Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; 노르류신 Leu
Leu (L) 노르류신; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile
Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg
Met (M) Leu; Phe; Ile Leu
Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val; Ser Ser
Trp (W) Tyr; Phe Tyr
Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; 노르류신 Leu
아미노산은 공통된 곁-사슬 특성에 따라 군을 나눌 수 있다:
a. 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val; Leu; Ile;
b. 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
c. 산성: Asp, Glu;
d. 염기성: His, Lys, Arg;
e. 사슬 방향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;
f. 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이들 종류 중 하나의 구성원을 또 다른 종류로 교체하는 것을 의미할 것이다.
치환 변이체의 한 유형은 모 항체(예컨대, 인간화된 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 부위 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가적인 연구를 위해 선택된 생성된 변이체(들)은 모 항체에 비해 특정한 생물학적 특성의 변형(예컨대, 향상)을 가질 것이고(예컨대, 친화성 증가, 면역원성 감소) 및/또는 모 항체의 실질적으로 보유된 특정 생물학적 특성을 가질 것이다. 예시적인 치환 변이체는 친화성 성숙된 항체이며, 이는 예컨대, 본 명세서에 기술된 것들과 같은 파지 전시-기반 친화성 성숙 기술을 이용하여 편리하게 생성될 수 있다. 간략하게, 하나 이상의 HVR 잔기가 변이되고 변이체 항체는 파지 상에 전시되고 특정 생물학적 활성(예컨대 결합 친화성)에 대해 선별된다.
개조(예컨대, 치환)는 HVR에서, 예를 들면, 항체 친화성을 향상시키기 위해 가해질 수 있다. 그러한 개조는 HVR "핫스팟", 즉, 체세포 성숙 과정 도중 높은 빈도로 돌연변이를 일으키는 코돈에 의해 인코딩되는 잔기(예컨대, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)을 참조), 및/또는 SDR(a-CDR)에 가해질 수 있고, 여기서 생성된 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화성에 대해 시험된다. 이차 라이브러리로부터 구성되고 재선별됨에 의한 친화성 성숙은, 예컨대, Hoogenboom et al. Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001))에 서술된 바 있다. 친화성 성숙의 일부 구체예에서, 다양성이 임의의 다양한 방법(예컨대, 오류-유발 PCR, 사슬 혼합, 또는 올리고뉴클레오티드-유도된 돌연변이유발)에 의해 성숙을 위해 선택된 가변 유전자에 도입된다. 이차 라이브러리가 이후 생성된다. 라이브러리는 이후 요망되는 친화성을 가진 임의의 항체 변이체를 확인하기 위해 선별된다. 다양성을 도입하는 또 다른 방법은 HVR-유도된 접근법을 포함하며, 여기서 수 개의 HVR 잔기(예컨대, 한 번에 4-6 잔기)가 무작위로 생성된다. 항원 결합에 관여하는 HVR 잔기는 예컨대, 알라닌 스캔 돌연변이유발 또는 모델링을 이용하여 구체적으로 확인될 수 있다. 특히 CDR-H3 및 CDR-L3는 자주 표적화된다.
특정 구체예에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 그러한 개조가 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한 하나 이상의 HVR 내부에 일어날 수 있다. 예를 들면, 결합 친화성을 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 개조(예컨대, 본 명세서에 제공된 바와 같은 보존적 치환)가 HVR에 가해질 수 있다. 그러한 개조는 HVR "핫스팟" 또는 SDR의 외부에 일어날 수 있다. 위에서 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정한 구체예에서, 각각의 HVR는 개조되지 않거나, 하나, 둘 또는 세 개 이하의 아미노산 치환을 보유한다.
돌연변이유발을 위해 표적화할 수 있는 항체의 잔기 또는 부위를 식별하기 위한 유용한 방법은 Cunningham 및 Wells (1989) Science, 244:1081-1085에 서술된 바와 같이 "알라닌 스캔 돌연변이유발"이라 지칭된다. 상기 방법에서, 표적 잔기의 잔기 또는 기(예컨대, 하전된 잔기 가령 Arg, Asp, His, Lys, 및 Glu)가 확인되고 중성 또는 음성 하전된 아미노산(예컨대, 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 대체되어 항원과 항체의 상호작용이 영향을 받는지 여부를 확인한다. 추가적인 치환이 초기 치환에 대해 기능적 민감성을 나타내는 아미노산 위치에 도입될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 항체 및 항원 사이의 접촉점을 확인하기 위한 항원-항체 복합체의 결정 구조. 그러한 접촉 잔기 및 이웃하는 잔기는 치환을 위한 후보로서 표적화 또는 제거될 수 있다. 변이체는 이들이 요망되는 특성을 보유하는지 확인하기 위해 선별될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 하나의 잔기 내지 백 이상의 잔기를 내포하는 폴리펩티드 길이 범위의 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합, 그리고 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열간 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예시는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 효소(예컨대, ADEPT에 있어서)에 대한 항체의 N- 또는 C-말단 융합 또는 항체의 혈청 반-감기를 증가시키는 폴리펩티드를 포함한다.
(x) 당화 변이체
특정한 구체예에서, 본 명세서에 제공된 항체는 항체가 글리코실화되는 정도를 증가 또는 감소시키도록 개조된다. 항체에 대한 당화 부위의 부가 또는 결실은 하나 이상의 당화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 개조함으로써 편리하게 달성될 수 있다.
항체가 Fc 부위를 포함하는 경우, 거기에 부착된 탄수화물이 개조될 수 있다. 포유류 세포에 의해 생성되는 자연적인 항체는 전형적으로, 일반적으로 N-연결에 의해 Fc 부위의 CH2 도메인의 Asn297에 부착된 분지된, 바이안테너리(biantennary) 올리고다당류를 포함한다. 예컨대, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)를 참조하라. 올리고다당류는 다양한 탄수화물, 예컨대, 만노스, N-아세틸 글루코사민(GlcNAc), 갈락토스, 및 시알산, 뿐만 아니라 바이안테너리 올리고다당류 구조의 "줄기" 내 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항체에서 올리고다당류의 변형은 특정한 향상된 특성을 갖는 항체 변이체를 생성하기 위해 일어날 수 있다.
한 구체예에서, Fc 부위를 포함하는 항체 변이체가 제공되며 여기서 Fc 부위에 부착된 탄수화물 구조는 감소된 푸코스를 가지거나 푸코스가 결핍되며, 이는 ADCC 기능을 향상시킬 수 있다. 특정하게는, 본 명세서에서 야생형 CHO 세포에서 생성된 동일한 항체의 푸코스의 양에 비해 감소된 푸코스를 가지는 항체가 고려된다. 즉, 이들은 달리 자연 CHO 세포(예컨대, 자연적인 당화 패턴을 제조하는 CHO 세포, 가령 자연 FUT8 유전자를 내포하는 CHO 세포)에서 생성될 경우에서 보다 더 적은 양의 푸코스를 가지는 것을 특징으로 한다. 특정 구체예에서, 항체는 항체 상의 N-연결된 글리칸의 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 미만이 푸코스를 포함하는 항체이다. 예를 들면, 그러한 항체 내 푸코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 특정 구체예에서, 항체는 항체 상의 N-연결된 글리칸의 어느 것도 푸코스를 포함하지 않으며, 즉, 여기서 항체는 완전히 프코스가 없거나, 푸코스를 가지지 않거나 탈푸코실화(defucosylated)된다. 푸코스의 양은 예를 들면, WO2008/077546호에 서술된 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분석법에 의해 측정시 Asn 297에 부착된 모든 당구조(예컨대, 복합체, 혼성 및 고 만노스 구조)의 합에 비해, Asn297의 당 사슬 내부 푸코스의 평균 양을 산출함으로서 결정된다. Asn297은 Fc 부위의 약 위치 297(Fc 부위 잔기의 EU 번호)에 위치한 아스파라긴 잔기를 지칭하지만; 그러나, Asn297은 또한 항체 내 비주요 서열 변이로 인해, 위치 297의 약 ± 3 아미노산 상류 또는 하류, 즉, 위치 294 및 300 사이에 위치될 수 있다. 그러한 푸코실화 변이체는 향상된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예컨대, US 특허 공보 US 2003/0157108호(Presta, L.); US 2004/0093621호(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)를 참조하라. "탈푸코실화" 또는 "푸코스-결핍" 항체 변이체와 연관된 간행물의 예시는 다음을 포함한다: US 2003/0157108호; WO 2000/61739호; WO 2001/29246호; US 2003/0115614호; US 2002/0164328호; US 2004/0093621호; US 2004/0132140호; US 2004/0110704호; US 2004/0110282호; US 2004/0109865호; WO 2003/085119호; WO 2003/084570호; WO 2005/035586호; WO 2005/035778호; WO2005/053742호; WO2002/031140호; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). 탈푸코실화된 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예시는 단백질 푸코실화 결핍 Lec13 CHO 세포(Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); US 특허 출원 US 2003/0157108호 A1; 및 WO 2004/056312 A1호, 특히 실시예 11 참조), 및 넉아웃 세포주, 가령 알파-1,6-푸코실전이효소 유전자, FUT8, 넉아웃 CHO 세포(예컨대, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); 및 WO2003/085107호를 참조)를 포함한다.
항체 변이체는 추가로 이등분된 올리고다당류와 함께 제공되며, 예컨대, 여기서 항체의 Fc 부위에 부착된 바이안테너리 올리고다당류는 GlcNAc에 의해 이등분된다. 그러한 항체 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 향상된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 그러한 항체 변이체의 예시는, 예컨대, WO 2003/011878호; US 특허 제6,602,684호; US 2005/0123546호, 및 Ferrara et al., Biotechnology and Bioengineering, 93(5): 851-861 (2006)에 기술되어 있다. Fc 부위에 부착된 올리고다당류 내에 적어도 하나의 갈락토스 잔기를 가지는 항체 변이체가 또한 제공된다. 그러한 항체 변이체는 향상된 CDC 기능을 가질 수 있다. 그러한 항체 변이체는 예컨대, WO 1997/30087호; WO 1998/58964호; 및 WO 1999/22764호에 기술되어 있다.
특정 구체예에서, 본 명세서에 기술된 Fc 부위를 포함하는 항체 변이체는 FcγRIII에 결합할 수 있다. 특정 구체예에서, 본 명세서에 기술된 Fc 부위를 포함하는 항체 변이체는 인간 수식인자 세포의 존재에서 ADCC 활성을 가지거나 달리 인간 야생형 IgG1Fc 부위를 포함하는 동일한 항체와 비교할 때 인간 수식인자 세포의 존재에서 향상된 ADCC 활성을 갖는다.
(xi) Fc 부위 변이체
특정 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본 명세서에 제공된 항체의 Fc 부위에 도입될 수 있고, 이를 통해 Fc 부위 변이체가 생성된다. Fc 부위 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에 아미노산 변형(예컨대, 치환)을 포함하는 인간 Fc 부위 서열(예컨대, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 부위)을 포함할 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명은 전체 수식인자 기능은 아니지만 일부를 보유하는 항체 변이체를 고려하며, 이는 생체내 항체 반감기가 중요하지만 특정 수식인자 기능(가령 보체 및 ADCC)은 불필요하거나 유해한 적용분야를 위해 요망되는 후보가 될 수 있다. CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 어세이가 수행될 수 있다. 예를 들면, 항체에 FcγR 결합이 없지만(따라서 ADCC 활성도 없어질 수 있음), FcRn 결합 능력은 보유하도록 보장하기 위해 Fc 수용체(FcR) 결합 어세이가 수행될 수 있다. ADCC를 매개하기 위한 일차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만 발현하는 반면 단핵백혈구는 FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현은 Ravetch 및 Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)의 464 페이지의 표 3에 요약되어 있다. 관심의 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 어세이의 비-제한적인 예시는 U.S. 특허 제5,500,362호(예컨대 Hellstrom et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)을 참조) 및 Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad.. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 제5,821,337호(Bruggemann et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)을 참조)에 서술되어 있다. 대안적으로, 비-방사성 어세이 방법이 사용될 수 있다(예를 들면, 유세포 분석을 위한 ACTI™ 비-방사성 세포독성 어세이(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; 및 CytoTox 96® 비-방사성 세포독성 어세이(Promega, Madison, WI)를 참조하라. 그러한 에세이를 위해 유용한 수식인자 세포는 말초혈 단핵세포(PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 관심의 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예컨대, Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다. C1q 결합 에세이가 또한 항체가 C1q에 결합할 수 있고 따라서 CDC 활성이 없는지 확인하기 위해 수행될 수 있다. 예컨대, WO 2006/029879호 및 WO 2005/100402호의 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조하라. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 어세이가 수행될 수 있다(예를 들면, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg et al., Blood 101:1045-1052 (2003); 및 Cragg et al, Blood 103:2738-2743 (2004)를 참조). FcRn 결합 및 생체내 제거/반감기 측정이 또한 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다(예컨대, Petkova et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)를 참조).
감소된 수식인자 기능를 갖는 항체는 하나 이상의 Fc 부위 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329의 치환을 가지는 것들을 포함한다(U.S. 특허 제6,737,056호). 그러한 Fc 돌연변이는 잔기 265 및 297가 알라닌으로 치환된 소위 "DANA" Fc 돌연변이를 비롯한, 둘 이상의 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327에 치환을 가지는 Fc 돌연변이를 포함한다(US 특허 제7,332,581호).
FcR에 대해 향상되거나 감소된 결합을 갖는 특정한 항체 변이체가 서술되어 있다. (예컨대, U.S. 특허 제6,737,056호; WO 2004/056312호, 및 Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)를 참조하라.)
특정 구체예에서, 항체 변이체는 ADCC를 향상시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예컨대, Fc 부위의 위치 298, 333, 및/또는 334(잔기의 EU 번호)의 치환을 갖는 Fc 부위를 포함한다. 예시적인 구체예에서, Fc 부위에 다음의 아미노산 치환을 포함하는 항체는: S298A, E333A, 및 K334A이다.
일부 구체예에서, 예컨대, US 특허 제6,194,551호, WO 99/51642호, 및 Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)에 서술된 바와 같이, Fc 부위에 개조가 가해져서 개조된(즉, 향상된 또는 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC)이 생성된다.
모체의 IgG를 태아에게 전달하는 일을 담당하는(Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)) 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 증가된 반감기 및 향상된 결합을 가지는 항체는 US2005/0014934호A1(Hinton et al.)에 서술되어 있다) 이들 항체는 FcRn에 대한 Fc 부위의 결합을 향상시키는 하나 이상의 치환을 가지는 Fc 부위를 포함한다. 그러한 Fc 변이체는 하나 이상의 Fc 부위 잔기에 치환을 갖는 것들을 포함한다: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434, 예컨대, Fc 부위 잔기 434의 치환(US 특허 제7,371,826호). 또한 Fc 부위 변이체의 다른 예시에 관한 Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); U.S. 특허 제5,648,260호; U.S. 특허 제5,624,821호; 및 WO 94/29351호를 참조하라.
(xii) 항체 유도체
본 발명의 항체는 당해 분야에 공지된 및 쉽게 입수가능한 추가적인 비단백질성 모이어티를 내포하도록 더욱 변형될 수 있다. 특정 구체예에서, 항체의 유도체화를 위해 적절한 모이어티는 수용성 중합체이다. 수용성 중합체의 비-제한적인 예시는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산(동종중합체 또는 무작위 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 동종중합체, 프롤리프로필렌 옥사이드/에틸렌 산화물 공-중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올(예컨대, 글리세롤), 폴리비닐 알코올, 및 이들의 혼합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드가 물에서 이의 안정성으로 인해 제조시 장점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있고, 분지되거나 분지되지 않을 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 수는 다양할 수 있으며, 만일 하나 초과의 중합체가 부착된 경우, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화를 위해 사용된 중합체의 수 및/또는 유형은 향상되어야 할 항체의 특정한 특성 또는 기능, 항체 유도체가 소정의 조건 하에서 요법에 사용될 것인지 여부, 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 고려사항을 기초로 결정될 수 있다.
(xiii) 벡터, 숙주 세포, 및 재조합 방법
항체는 또한 재조합 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 항-항원 항체의 재조합 생산을 위해서, 항체를 인코딩하는 핵산이 단리되고 추가의 클로닝(DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능한 벡터에 삽입된다. 항체를 인코딩하는 DNA는 쉽게 단리되고 통상적인 절차를 이용하여(예컨대, 항체의 중사슬 및 경사슬을 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 탐침을 이용하여) 서열분석될 수 있다. 많은 벡터가 이용가능하다. 벡터 성분은 일반적으로 다음 중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 원점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열.
(a) 신호 서열 성분
본 발명의 항체는 직접적으로는 물론, 또한 이종 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서도 재조합되어 생산될 수 있으며, 상기 폴리펩티드는 바람직하게는 신호 서열이거나 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 가지는 다른 폴리펩티드이다. 선택된 이종 신호 서열은 바람직하게는 숙주세포에 의해 인식되고 처리되는(예컨대, 신호 단백질분해효소에 의해 절단되는) 서열이다. 자연적인 항체 신호 서열을 인식하고 처리하지 못하는 원핵 숙주 세포에 있어서, 신호 서열은 예를 들면, 알칼리성 포스파타제, 페니실린, lpp, 또는 열-안정성 장내독소 II 선도서열로부터 선택된 원핵세포 신호 서열로 치환된다. 효모 분비를 위해 자연적인 신호 서열은 예컨대, 효모 인버타제(invertase) 선도서열, 인자 선도서열 (가령 Saccharomyces 및 Kluyveromyces α-인자 선도서열), 또는 산 포스파타제 선도서열, C. albicans 글루코아밀라제 선도서열, 또는 WO 90/13646호에 서술된 신호로 치환될 수 있다. 포유류 세포 발현에서, 포유류 신호 서열 뿐만 아니라 바이러스 분비 선도서열, 예를 들면, 단순포진 gD 신호가 이용가능하다.
(b) 복제 원점
발현 및 클로닝 벡터는 모두 하나 이상의 선택된 숙주 세포에서 벡터 복제를 가능하게 하는 핵산 서열을 내포한다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서 이러한 서열은 벡터가 숙주 염색체 DNA와 독립적으로 복제할 수 있게 하고, 및 복제 원점 또는 독자적인 복제 서열을 포함하는 서열이다. 다양한 박테리아, 효모, 및 바이러스에 대해 그러한 서열이 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 원점은 대부분의 그램-음성 박테리아에서 적절하고, 2μ, 플라스미드 원점은 효모에서 적절하며, 다양한 바이러스 원점(SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유류 세포에서 벡터를 클로닝하기 위해 적절하다. 일반적으로, 복제 성분의 원점은 포유류 발현 벡터에서 필요하지 않다(SV40 원점은 전형적으로 단지 이것이 초기 프로모터를 내포하고 있기 때문에 사용될 수 있다.
(c) 선별 유전자 성분
발현 및 클로닝 벡터는 선별가능한 마커라고도 불리는 선별 유전자를 내포할 수 있다. 전형적인 선별 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예컨대, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 또는 테트라시클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 영양요구성 결핍을 보충하는 단백질을 인코딩하거나, 또는 (c) 복합체 배지로부터 얻을 수 없는 중요한 영양요소를 공급하는 단백질, 예컨대, Bacilli에 있어서 D-알라닌 라세미화효소를 인코딩하는 유전자이다.
선별 방식의 한 예시는 숙주 세포의 성장을 중지시키기 위해 약물을 이용한다. 이종 유전자로 성공적으로 형질전환된 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 생산하며 따라서 선별 체제에서 생존한다. 그러한 우성 선별의 예시는 약물 네오마이신, 미코페놀산 및 히그로마이신을 이용한다.
포유류 세포를 위해 적절한 선별가능한 마커의 또 다른 예시는 항체-인코딩 핵산을 흡수할 능력을 갖는 세포의 식별을 가능하게 하는 것들, 가령 DHFR, 글루타민 합성효소(GS), 티미딘 키나아제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 데아미나제, 오르니틴 탈카복실화효소, 등이다.
예를 들면, DHFR 유전자로 형질전환된 세포는 DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트(Mtx)를 함유하는 배양 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 확인된다. 이들 조건 하에서, DHFR 유전자는 임의의 다른 공-형질전환된 핵산과 함께 증폭된다. 내인성 DHFR 활성이 결핍된 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주(예컨대, ATCC CRL-9096)가 사용될 수 있다.
대안적으로, GS 유전자로 형질전환된 세포는 GS의 저해제인 L-메티오닌 설폭시민(Msx)을 함유하는 배양 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 확인된다. 이들 조건 하에서, GS 유전자는 임의의 다른 공-형질전환된 핵산과 함께 증폭된다. GS 선별/증폭 시스템은 상기 서술된 DHFR 선별/증폭 시스템과 함께 사용될 수 있다.
대안적으로, 관심의 항체, 야생형 DHFR 유전자, 및 또 다른 선별가능한 마커 가령 아미노글리코시드 3'-인산전이효소(APH)를 인코딩하는 DNA 서열로 형질전환되거나 동시-형질전환된 숙주 세포(특히 내인성 DHFR을 내포하는 야생형 숙주)는 선별가능한 마커 가령 아미노글리코시드계 항생제, 예컨대, 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418에 대한 선별 물질을 함유하는 배지에서의 세포 성장에 의해 선별될 수 있다. U.S. 특허 제4,965,199호를 참조하라.
효모에서 사용하기에 적절한 선별 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다(Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)). 상기 trp1 유전자는 트립토판에서 성장할 능력이 없는 효모의 돌연변이 균주, 예를 들면, ATCC 번호 44076 또는 PEP4-1에 대한 선별 마커를 제공한다. Jones, Genetics, 85:12 (1977). 효모 숙주 세포 유전체 내 trp1 손상의 존재는 이후 트립토판의 부재에서 성장에 의해 형질전환을 검출하기 위한 효과적인 환경을 제공한다. 유사하게, Leu2-결핍 효모 균주(ATCC 20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 내포하는 공지의 플라스미드에 의해 보충된다.
또한, 1.6 μm 환형 플라스미드 pKD1로부터 유래된 벡터가 Kluyveromyces 효모의 형질전환을 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 재조합 송아지 키모신의 대량-생산을 위한 발현 시스템이 K. lactis. Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)에 보고되었다. Kluyveromyces의 산업적 균주에 의한 성숙 재조합 인간 혈청 알부민의 분비를 위한 안정한 다중-복제 발현 벡터가 또한 개시된 바 있다. Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991).
(d) 프로모터 성분
발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로 숙주 유기체에 의해 인식되며 항체를 인코딩하는 핵산에 작동가능하도록 연결된 프로모터를 내포한다. 원핵세포 숙주와 사용하기에 적절한 프로모터는 phoA 프로모터, β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼리성 포스파타제 프로모터, 트립토판(trp) 프로모터 시스템, 및 하이브리드 프로모터 가령 tac 프로모터를 포함한다. 그러나, 다른 공지의 박테리아 프로모터도 적절하다. 박테리아 시스템에서 사용하기 위한 프로모터는 또한 항체를 인코딩하는 DNA에 작동가능하도록 연결된 샤인-달가노(Shine-Dalgarno, S.D.) 서열을 내포할 것이다.
진핵세포를 위한 프로모터 서열은 공지되어 있다. 사실상 모든 진핵세포 유전자는 전사가 개시되는 부위로부터 대략 25 내지 30 염기 상류에 위치한 AT-농축 부위를 갖는다. 많은 유전자의 전사 시작점으로부터 70 내지 80 염기 상류에서 발견되는 또 다른 서열은 CNCAAT 부위이며 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있다. 대부분의 진핵세포 유전자의 3' 말단에는 암호화 서열의 3' 말단의 다중 A 꼬리의 부가를 위한 신호일 수 있는 AATAAA 서열이 존재한다. 이들 서열은 모두 진핵세포 발현 벡터에 적절하게 삽입된다.
효모 숙주와 사용하기에 적절한 프로모터 서열의 예시는 3-포스포글리세린산염 키나아제 또는 다른 당분해 효소, 가령 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소화효소, 헥소키나제, 피루브산염 탈카복실화효소, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이성질화 효소, 3-포스포글리세린산염 뮤타제, 피루브산염 키나아제, 트리오스인산 이성질화 효소, 포스포글루코스 이성질화 효소, 및 글루코키나제를 위한 프로모터를 포함한다.
성장 조건에 의해 제어되는 추가적인 전사 장점을 가지는 유도성 프로모터인 다른 효모 프로모터는 알코올 탈수소화효소 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 연관된 변성 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소화효소, 및 말토오스 및 갈락토스 이용에 관여하는 효소를 위한 프로모터 부위이다. 효모 발현에서 사용하기에 적절한 벡터 및 프로모터는 EP 73,657호에 더욱 서술되어 있다. 효모 촉진제 또한 효모 프로모터와 함께 유리하게 사용된다.
포유류 숙주 세포 내 벡터로부터의 항체 전사는 예를 들면, 바이러스 가령 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스(가령 아데노바이러스 2), 소의 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 거대세포바이러스, 레트로바이러스, 간염-B 바이러스, 원숭이 바이러스 40(SV40)의 유전체로부터 수득되거나, 이종 포유류 프로모터, 예컨대, 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터로부터, 열-충격 프로모터로부터 수득된 프로모터에 의해 제어될 수 있고, 단서 조항으로 그러한 프로모터는 숙주 세포 시스템과 화합성이어야 한다.
SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스 복제 원점을 또한 내포하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 수득된다. 인간 거대세포바이러스의 인접 초기 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 수득된다. 벡터로서 소의 유두종 바이러스를 이용하여 포유류 숙주에서 DNA를 발현하기 위한 시스템은 U.S. 특허 제4,419,446호에 개시되어 있다. 상기 시스템의 변형이 U.S. 특허 제4,601,978호에 서술되어 있다. 단순포진 바이러스로부터의 티미딘 키나아제 프로모터의 제어 하의 마우스 세포에서 인간 β-인터페론 cDNA의 발현에 대해 또한 Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982)를 참조하라. 대안적으로, Rous 육종 바이러스 긴 말단 반복이 프로모터로서 사용될 수 있다.
(e) 인핸서 요소 성분
고등한 진핵생물에 의한 본 발명의 항체를 인코딩하는 DNA의 전사는 흔히 인핸서 서열을 벡터에 삽입함으로써 증가된다. 현재 포유류 유전자로부터의 많은 촉진제 서열이 공지되어 있다(글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-태아단백질, 및 인슐린). 전형적으로, 그러나, 진핵세포 세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 수 있다. 예시는 복제 원점의 먼 사슬(bp 100-270)의 SV40 인핸서, 거대세포바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 원점의 먼 사슬의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 진핵세포 프로모터의 활성화를 위한 인핸서 요소에 대해서는 또한 Yaniv, Nature 297:17-18 (1982)를 참조하라. 인핸서는 벡터의 위치 5' 또는 3'에 있는 항체-인코딩 서열 내로 스플라이싱될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 부위 5'에 위치한다.
(f) 전사 종결 성분
진핵세포 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간, 또는 다른 다세포 유기체로부터의 유핵 세포)에서 사용되는 발현 벡터는 또한 전사의 종결 및 mRNA 안정화를 위해 필수적인 서열을 내포한다. 그러한 서열은 진핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및, 경우에 따라 3'의 미번역 부위로부터 공통적으로 입수가능하다. 이들 부위는 항체를 인코딩하는 mRNA의 미번역 부위 내 폴리아데닐화된 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 조각을 내포한다. 한 가지 유용한 전사 종결 성분은 소의 성장 호르몬 폴리아데닐화 부위이다. 발현 벡터가 개시된 WO94/11026호를 참조하라.
(g) 숙주 세포의 선별 및 형질전환
본 명세서에서 벡터 내에서 DNA를 클로닝 또는 발현하기 위해 적절한 숙주 세포는 원핵세포, 효모, 또는 상기 서술된 고등한 원핵세포이다. 이러한 목적을 위해 적절한 원핵세포는 진정세균,가령 그램-음성 또는 그램-양성 유기체, 예를 들면, 장내세균 가령 Escherichia, 예컨대, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, 예컨대, Salmonella typhimurium, Serratia, 예컨대, Serratia marcescans, 및 Shigella, 그리고 Bacilli 가령 B. subtilis 및 B. licheniformis (예컨대, 1989년 4월 12일에 간행된 DD 266,710호에 개시된 B. licheniformis 41P), Pseudomonas 가령 P. aeruginosa, 및 Streptomyces를 포함한다. 한 가지 바람직한 E. coli 클로닝 숙주는 E. coli 294(ATCC 31,446)이지만, 다른 균주 가령 E. coli B, E. coli X1776(ATCC 31,537), 및 E. coli W3110(ATCC 27,325)도 적절하다. 이들 예시는 예시적이며 제한적이지 않다.
특히 당화 및 Fc 수식인자 기능이 필요하지 않을 때, 가령 치료적 항체가 그 자체로 종양 세포 파괴에 효과를 보이는 세포독성제(예컨대, 독소)에 공액결합될 경우, 전장 항체, 항체 융합 단백질, 및 항체 단편이 박테리아에서 제조될 수 있다. 전장 항체는 순환계에서 더 큰 반감기를 갖는다. E. coli 내 생산은 더 빠르며 더 비용 효율적이다. 박테리아에서 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대하여는, 예컨대, 번역 개시 부위(TIR) 및 발현 및 분비를 최적화하기 위한 신호 서열을 서술하는 U.S. 특허 제5,648,237호(Carter et. al.), U.S. 특허 제5,789,199호(Joly et al.), U.S. 특허 제5,840,523호(Simmons et al.)를 참조하라. 또한 E. coli에서 항체 단편의 발현을 서술하는 Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 245-254를 참조하라. 발현 후에, 항체는 가용성 분획 내의 E. coli 세포 반죽으로부터 단리될 수 있고, 예컨대, 이소형에 따라 단백질 A 또는 G 컬럼을 통해 정제될 수 있다. 최종 정제는 예컨대, CHO 세포에서 발현된 항체를 정제하기 위한 과정과 유사하게 수행될 수 있다.
원핵 세포 외에도, 진핵세포 미생물 가령 사상균 또는 효모가 항체-인코딩 벡터를 위해 적절한 클로닝 또는 발현 숙주이다. Saccharomyces cerevisiae, 또는 일반적인 베이킹용 효모가 하등한 진핵세포 숙주 미생물 중에서 가장 흔히 사용된다. 그러나, 수많은 다른 속, 종, 및 균주, 가령 Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces 숙주 가령, 예컨대, K. lactis, K. fragilis(ATCC 12,424), K. bulgaricus(ATCC 16,045), K. wickeramii(ATCC 24,178), K. waltii(ATCC 56,500), K. drosophilarum(ATCC 36,906), K. thermotolerans, 및 K. marxianus; yarrowia(EP 402,226호); Pichia pastoris(EP 183,070호); Candida; Trichoderma reesia(EP 244,234호); Neurospora crassa; Schwanniomyces 가령 Schwanniomyces occidentalis; 및 사상균 가령, 예컨대, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, 및 Aspergillus 숙주 가령 A. nidulans 및 A. niger가 흔히 이용가능하며 본 명세서에서 유용하다. 치료적 단백질의 생산을 위한 효모 및 사상균의 사용을 논의하는 검토서에 관해서는, 예컨대, Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)를 참조하라.
특정 균류 및 효모 균주가 선택될 수 있고 여기서 당화 경로는 "인간화되어", 부분적으로 또는 전부 인간인 당화 패턴을 가진 항체를 생산하게 된다. 예컨대, Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006) (Pichia pastoris에서의 당화 경로의 인간화를 서술); 및 Gerngross et al., 상기와 동일을 참조하라.
글리코실화 항체의 발현을 위해 적절한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체(무척추 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예시는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 숙주 가령 Spodoptera frugiperda(애벌레), Aedes aegypti(모기), Aedes albopictus(모기), Drosophila melanogaster(초파리), 및 Bombyx mori로부터의 수많은 바큘로바이러스 균주 및 변이체 및 상응하는 허용성 곤충 숙주 세포가 확인되었다. 형질주입을 위한 다양한 바이러스 균주, 예컨대, Autographa californica NPV의 L-1 변이체 및 Bombyx mori NPV의 Bm-5 균주가 공공으로 이용가능하며, 그러한 바이러스는 본 발명에 따라 본 명세서에서 바이러스로서, 특히 Spodoptera frugiperda 세포의 형질주입을 위해 사용될 수 있다.
면화, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아, 토마토, 좀개구리밥(Leninaceae), 알팔파(M. truncatula), 및 담배의 식물 세포 배양물이 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예컨대, U.S. 특허 제5,959,177호, 제6,040,498호, 제6,420,548호, 제7,125,978호, 및 제6,417,429호를 참조하라(형질전환 식물에서 항체를 생산하기 위한 PLANTIBODIESTM 기술을 서술).
척추동물 세포는 숙주로서 사용될 수 있고, 배양물(조직 배양물) 내 척추동물 세포의 증식은 일상적인 절차가 되었다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 예시는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주(현탁액 배양물에서 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); 베이비 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 마우스 세르톨리 세포(TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포(HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암 세포주(Hep G2)이다. 다른 유용한 포유류 숙주 세포주는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 가령 DHFR- CHO 세포(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); 및 골수종 세포주 가령 NS0 및 Sp2/0을 포함한다. 항체 생산을 위해 적절한 특정 포유류 숙주 세포주의 검토를 위해, 예컨대, Yazaki 및 Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 255-268를 참조하라.
숙주 세포는 항체 생산을 위한 상기-서술된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환되고 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선별하거나, 요망되는 서열을 인코딩하는 유전자를 증폭하기 위해 적절히 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양된다.
(h) 숙주 세포의 배양
본 발명의 항체를 생산하기 위해 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 시판되는 배지 가령 햄(Ham) F10 (Sigma), 최소 필수 배지((MEM), (Sigma), RPMI-1640(Sigma), 및 둘베코(Dulbecco) 변형된 이글(Eagle) 배지((DMEM), Sigma)가 숙주 세포를 배양하기 위해 적절하다. 또한, Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), U.S. 특허 제4,767,704호; 제4,657,866호; 제4,927,762호; 제4,560,655호; 또는 제5,122,469호; WO 90/03430호; WO 87/00195호; 또는 U.S. 특허 참조 30,985호에 서술된 임의의 배지가 숙주 세포를 위한 배양 배지로서 사용될 수 있다. 임의의 이들 배지는 필요한 경우 호르몬 및/또는 다른 성장 인자(가령 인슐린, 트랜스페린, 또는 상피 성장 인자), 염(가령 나트륨 클로라이드, 칼슘, 마그네슘, 및 포스페이트), 완충제(가령 HEPES), 뉴클레오티드(가령 아데노신 및 티미딘), 항생제(가령 GENTAMYCINTM 약물), 미량 원소(마이크로몰 범위의 최종 농도로 보통 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 및 글루코스 또는 균등한 에너지 공급원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충물질이 또한 당해 분야의 숙련가에게 공지일 적절한 농도로 포함될 수 있다. 배양 조건, 가령 온도, pH, 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포에서 앞서 사용된 것들이며, 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다.
(xiv) 항체의 정제
재조합 기술을 이용할 경우, 항체는 세포내에서, 주변세포질 공간에서 생산되거나, 또는 배지로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포내에서 생산되는 경우, 첫 번째 단계로서, 숙주 세포 또는 용해된 단편인 입자상 파편이, 예를 들면, 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)는 E. coli의 주변세포질 공간에 분비되는 항체를 단리하기 위한 절차를 서술하고 있다. 간략하게, 세포 반죽은 아세트산 나트륨(pH 3.5), EDTA, 및 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF)의 존재에서 약 30분에 걸쳐 해동된다. 세포 파편은 원심분리에 의해 제거될 수 있다. 항체가 배지로 분비되는 경우, 그러한 발현 시스템으로부터의 상청액은 일반적으로 먼저 시판되는 단백질 농도 필터, 예를 들면, Amicon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 단위를 이용하여 농축된다. 프로테아제 저해제 가령 PMSF가 단백질분해를 저해하기 위해 임의의 전술된 단계에 포함될 수 있고 우연한 오염물질의 성장을 막기 위해 항생제가 포함될 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 조성물은, 예를 들면, 수산인회석 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 및 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제될 수 있고, 여기서 친화성 크로마토그래피가 전형적으로 바람직한 정제 단계 중의 하나이다. 친화성 리간드로서 단백질 A의 적합성은 항체에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종류 및 이소형에 의존적이다. 단백질 A는 인간 γ1, γ2, 또는 γ4 중사슬을 기준으로 항체를 정제하기 위해 사용될 수 있다(Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). 단백질 G는 인간 γ3에 대한 모든 마우스 이소형에 대해 추천된다(Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). 친화성 리간드가 부착된 기질은 대개의 경우 아가로스지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 물리적으로 안정한 매트릭스 가령 제어된 공극 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스로 성취할 수 있는 것보다 더 빠른 유속 및 더 짧은 처리 시간을 가능하게 한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, Bakerbond ABXTM 수지(J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)가 정제를 위해 유용하다. 단백질 정제를 위한 다른 기술 가령 이온-교환 컬럼 상의 분별, 에탄올 침전, 실리카 상의 역상 HPLC, 크로마토그래피, 헤파린 상의 크로마토그래피 음이온 또는 양이온 교환 수지(가령 폴리아스파르트산 컬럼) 상의 SEPHAROSETM 크로마토그래피, 크로마토포커싱(chromatofocusing), SDS-PAGE, 및 암모늄 설페이트 침전이 또한 회수될 항체에 따라 이용가능하다.
일반적으로, 연구, 시험, 및 임상을 위한 항체를 제조하기 위한 다양한 방법론은 상기-서술된 방법론과 일치하고 및/또는 관심의 특정한 항체에 있어서 당해 분야의 기술자에 의해 적절하게 여겨지는 바와 같은 당해 분야에 잘 정립되어 있다.
(xv) 생물학적으로 활성인 항체 선별
상기 서술된 바와 같이 제조된 항체는 치료적 관점으로부터 유익한 특성을 가지는 항체를 선별하거나 항체의 생물학적 활성을 보유하는 제형 및 조건을 선별하는 하나 이상의 "생물학적 활성" 어세이로 처리될 수 있다. 항체는 항체가 발생하게 된 항원에 결합하는 이의 능력에 대해 시험될 수 있다. 예를 들면, 당해 분야에 공지된 방법(가령 ELISA, 웨스턴 블롯, 등)이 사용될 수 있다.
예를 들면, 항-PD-L1 항체에 있어서, 항체의 항원 결합 특성은 PD-L1에 결합하는 능력을 검출하는 어세이에서 평가될 수 있다. 일부 구체예에서, 항체의 결합은 예를 들면 포화 결합; ELISA; 및/또는 경쟁적 어세이(예컨대 RIA)에 의해 결정될 수 있다. 또한, 항체는 예컨대, 치료제로서 이의 효과를 평가하기 위해 다른 생물학적 활성 어세이로 처리될 수 있다. 그러한 어세이는 당해 분야에 공지되어 있고 표적 항원 및 항체에 대한 의도된 용도에 의존적이다. 예를 들면, 항체에 의한 PD-L1 차단의 생물학적 효과는 CD8+T 세포, 림프구성 맥락수막염 바이러스(LCMV) 마우스 모델 및/또는 동계 종양 모델에서 예컨대, US 특허 제8,217,149호에 서술된 바와 같이 평가될 수 있다.
관심의 항원에 대한 특정한 에피토프에 결합하는 항체를 선별하기 위해(예컨대, PD-L1에 대한 예시의 항-PD-L1 항체의 결합을 차단하는 것들), Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow 및 David Lane (1988)에 서술된 것과 같은 일상적인 교차-차단 어세이가 수행될 수 있다. 대안적으로, 예컨대 Champe et al., J. Biol. Chem. 270:1388-1394 (1995)에 서술된 바와 같은 에피토프 맵핑이 항체가 관심의 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하기 위해 수행될 수 있다.
IV. 약제학적 조성물 및 제형
또한 본 명세서에 제공된 것은 PD-1 축 결합 길항제 및/또는 본 명세서에 기술된 항체(가령 항-PD-L1 항체) 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물 및 제형이다. 본 발명은 또한 탁산, 예컨대, 나브-파클리탁셀(ABRAXANE®), 파클리탁셀, 또는 도세탁셀을 포함하는 약제학적 조성물 및 제형을 제공한다.
본 명세서에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물 및 제형은 요망되는 정도의 순도를 가지는 활성 성분(예컨대, PD-1 축 결합 길항제 및/또는 탁산)을 하나 이상의 임의의 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여(Remington's Pharmaceutical Sciences 제16판, Osol, A. Ed. (1980)), 동결건조된 제형 또는 수성 용액의 형태로 제조될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 일반적으로 사용되는 투여 및 농도에서 수용자에게 무독성이며, 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 완충제 가령 인산, 구연산, 및 다른 유기산; 항산화제 가령 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제(가령 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤 가령 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레솔); 저 분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 가령 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체 가령 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 가령 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 단당류, 이당류, 및 다른 탄수화물 가령 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이트제 가령 EDTA; 당류 가령 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 상대-이온 가령 나트륨; 금속 복합체(예컨대 Zn-단백질 복합체); 및/또는 비이온성 계면활성제 가령 폴리에틸렌 글리콜(PEG). 본 명세서에서 예시적인 약제학적으로 허용되는 담체는 추가로 간질 약물 분산제 가령 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질(sHASEGP), 예를 들면, 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 가령 rHuPH20(HYLENEX®, Baxter International, Inc.)을 포함한다. rHuPH20를 비롯한 특정 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법이 US 특허 공보 제2005/0260186호 및 제2006/0104968호에 서술되어 있다. 한 양태에서, sHASEGP는 하나 이상의 부가적인 글리코사미노글리카나제 가령 콘드로이티나제와 조합된다.
예시적인 동결건조된 항체 제형은 US 특허 제6,267,958호에 서술되어 있다. 수성 항체 제형은 US 특허 제6,171,586호 및 WO2006/044908호에 서술된 것들을 포함하며, 후자의 제형은 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.
본 명세서에서 조성물 및 제형은 또한 필요할 경우 치료될 특정 적응증을 위한 하나 초과의 활성 성분, 바람직하게는 서로 유해한 영향을 주지 않고 보충적인 활성을 가지는 것들을 함유할 수 있다. 그러한 성분은 적절히 의도된 목적을 위해 효과적인 양과 조합되어 존재한다.
활성 성분은 마이크로캡슐 내에, 예를 들면, 코아세르베이션(coacervation) 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해, 예를 들면, 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐, 각각, 콜로이드성 약물 송달 시스템 내(예를 들면, 리포좀, 알부민 미소구체, 마이크로에멀전, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 매크로에멀전 내에 연행될 수 있다. 그러한 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences 제16판, Osol, A. Ed. (1980)에 개시되어 있다.
서방출 제제가 제조될 수 있다. 서방출 제제의 적절한 예시는 항체를 내포하는 고체 소수성 중합체의 반투성 매트릭스를 포함하며, 이러한 매트릭스는 성형된 물품, 예컨대 필름, 또는 마이크로캡슐의 형태로 되어 있다. 생체내 투여를 위해 사용될 제형은 일반적으로 무균이다. 무균성은 예컨대, 무균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성될 수 있다.
IV. 치료의 방법
본 명세서에 제공된 것은 개체에서 암을 치료하거나 진행을 지연시키기 위해 개체에게 유효량의 PD-1 축 결합 길항제 및 탁산(예컨대, 나브-파클리탁셀(ABRAXANE®) 또는 파클리탁셀)을 투여하는 것을 포함하는 방법이다. 일부 구체예에서, 치료는 치료 후 개체에서 응답을 이끌어낸다. 일부 구체예에서, 응답은 완전관해(complete response)이다. 일부 구체예에서, 치료는 치료의 중지 후에 개체에서 지속적인 응답을 이끌어낸다. 본 명세서에 기술된 방법은 향상된 면역원성, 가령 암의 치료를 위해 향상된 종양 면역원성이 요망되는 용태를 치료하는데 사용될 수 있다. 또한 본 명세서에 제공된 것은 암을 가진 개체에서 면역 기능을 증진하기 위해 개체에게 유효량의 PD-1 축 결합 길항제 및 탁산(예컨대, 나브-파클리탁셀(ABRAXANE®) 또는 파클리탁셀)을 투여하는 것을 포함하는 방법이다. 당해 분야에 공지된 또는 본 명세서에 기술된 PD-1 축 결합 길항제 및 탁산 중 임의의 것이 방법에서 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 추가로 백금-계 화학요법제를 투여하는 단계를 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 백금-계 화학요법제는 카르보플라틴이다.
일부 구체예에서, 개체는 인간이다. 일부 구체예에서, 개체는 암으로 고통받는다. 일부 구체예에서, 암은 유방암(예컨대, 삼중-음성 유방암), 방광암(예컨대, UBC, MIBC, 및 NMIBC), 대장암, 직장암, 폐암 (예컨대, 편평 또는 비-편평일 수 있는 비-소세포 폐암), 교모세포종, 비-호지킨 림프종(NHL), 신세포 암(예컨대, RCC), 전립선암, 간암, 췌장암, 연-조직 육종, 카포시 육종, 유암종 암종, 두경부암, 위암, 식도암, 전립선암, 자궁내막암, 신장암, 난소암, 중피종, 및 헴 악성종양(예컨대, MDS 및 다중 골수종)이다. 일부 구체예에서, 암은 다음 중에서 선택된다: 소세포 폐암, 교모세포종, 신경모세포종, 흑색종, 유방 암종, 위암, 대장암(CRC), 또는 간세포 암종. 특정한 구체예에서, 암은 폐암(예컨대, 편평 또는 비-편평일 수 있는 비-소세포 폐암, 방광암(예컨대, UBC), 유방암(예컨대, TNBC), RCC, 흑색종, 대장암, 및 헴 악성종양(예컨대, MDS 및 다중 골수종) 중에서 선택된다. 일부 구체예에서, 폐암은 편평 또는 비-편평일 수 있는 비-소세포 폐암이다. 일부 구체예에서, 방광암은 UBC이다. 일부 구체예에서, 유방암은 TNBC이다. 일부 구체예에서, 헴 악성종양은 MDS 또는 다중 골수종이다.
일부 구체예에서, 개체는 PD-1 축 결합 길항제 및 탁산으로 병행 치료받기 전에 암 요법으로 치료된 적이 있다. 일부 구체예에서, 개체는 하나 이상의 암 요법에 내성을 갖는 암을 갖는다. 일부 구체예에서, 암 요법에 대한 내성은 암의 재발 또는 불응성 암을 포함한다. 재발은 치료 후, 원래 위치 또는 새로운 위치에 암이 다시 나타난 것을 가리킬 수 있다. 일부 구체예에서, 암 요법에 대한 내성은 항암 요법으로의 치료 도중 암의 진행을 포함한다. 일부 구체예에서, 암 요법에 대한 내성은 암이 치료에 응답하지 않는 것을 포함한다. 암은 치료의 시작 시 내성일 수 있거나 치료 도중에 내성이 될 수 있다. 일부 구체예에서, 암은 초기 단계 또는 말기 단계이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 병행 요법은 PD-1 축 결합 길항제 및 탁산의 투여를 포함한다. PD-1 축 결합 길항제 및 탁산(예컨대, 나브-파클리탁셀(ABRAXANE®) 또는 파클리탁셀)은 당해 분야에 공지된 임의의 적절한 방식으로 투여될 수 있다. 예를 들면, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 연속적으로(상이한 시점에) 또는 동시에(동일한 시점에) 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제는 탁산과 별개의 조성물에 존재한다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제는 탁산과 동일한 조성물에 존재한다.
PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 동일한 투여 경로 또는 상이한 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제는 정맥내로, 근육내로, 피하로, 국소로, 경구로, 경피로, 복강내로, 안와내로, 이식에 의해, 흡입에 의해, 척추강내로, 심실내로, 또는 비강내로 투여된다. 일부 구체예에서, 탁산은 정맥내로, 근육내로, 피하로, 국소로, 경구로, 경피로, 복강내로, 안와내로, 이식에 의해, 흡입에 의해, 척추강내로, 심실내로, 또는 비강내로 투여된다. 유효량의 PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 질환의 예방 또는 치료를 위해 투여될 수 있다. PD-1 축 결합 길항제 및/또는 탁산의 적절한 투여량은 치료될 질환의 유형, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 개체의 임상적 용태, 개체의 병력 및 치료에 대한 응답, 및 담당 전문의의 재량에 따라 결정될 수 있다.
일반적인 권고로서, 인간에게 투여되는 항체(예컨대, 항-PD-L1 항체)의 치료적으로 효과적인 양은 투여가 한 회 이상이든 상관없이 환자 체중의 약 0.01 내지 약 50 mg/kg의 범위에 있을 것이다. 일부 구체예에서, 사용된 항체는 예를 들면 매일 약 0.01 내지 약 45 mg/kg, 약 0.01 내지 약 40 mg/kg, 약 0.01 내지 약 35 mg/kg, 약 0.01 내지 약 30 mg/kg, 약 0.01 내지 약 25 mg/kg, 약 0.01 내지 약 20 mg/kg, 약 0.01 내지 약 15 mg/kg, 약 0.01 내지 약 10 mg/kg, 약 0.01 내지 약 5 mg/kg, 또는 약 0.01 내지 약 1 mg/kg 투여된다. 일부 구체예에서, 항체는 15 mg/kg으로 투여된다. 그러나, 다른 투여 계획이 유용할 수 있다. 한 구체예에서, 본 명세서에 기술된 항-PD-L1 항체는 21-일 주기의 제1일에 약 100 mg, 약 200 mg, 약 300 mg, 약 400 mg, 약 500 mg, 약 600 mg, 약 700 mg, 약 800 mg, 약 900 mg, 약 1000 mg, 약 1100 mg, 약 1200 mg, 약 1300 mg, 약 1400 mg, 또는 약 1500 mg의 용량으로 인간에게 투여된다. 일부 구체예에서, 항-PD-L1 항체 MPDL3280A는 매 삼주마다(q3w) 1200 mg IV로 투여된다. 투여량은 단일 용량 또는 다중 용량(예컨대, 2 또는 3회 용량), 가령 주사로서 투여될 수 있다. 병행 투여로 투여되는 항체의 투여량은 단일 치료에 비해 감소될 수 있다. 이러한 요법의 진행은 통상의 기술에 의해 쉽게 관찰된다.
일반적인 권고로서, 인간에게 투여되는 탁산(예컨대, 나브-파클리탁셀(ABRAXANE®) 또는 파클리탁셀)의 치료적으로 효과적인 양은 투여가 한 회 이상이든 상관없이 약 25 내지 약 300 mg/m2 (예컨대, 약 25 mg/m2, 약 50 mg/m2, 약 75 mg/m2, 약 100 mg/m2, 약 125 mg/m2, 약 150 mg/m2, 약 175 mg/m2, 약 200 mg/m2, 약 225 mg/m2, 약 250 mg/m2, 약 275 mg/m2, 또는 약 300 mg/m2)의 범위일 것이다. 예를 들면, 일부 구체예에서, 약 100 mg/m2의 나브-파클리탁셀(ABRAXANE®)이 투여된다. 일부 구체예에서, 나브-파클리탁셀(ABRAXANE®)은 매주(q1w) 100 mg/m2로 IV로 투여된다. 일부 구체예에서, 약 200 mg/m2의 파클리탁셀이 투여된다. 일부 구체예에서, 파클리탁셀은 매 3주마다 200 mg/m2로 IV로 투여된다. 일부 구체예에서, 탁산(예컨대, 나브-파클리탁셀(ABRAXANE®) 또는 파클리탁셀)은 매주, 매 2주, 매 3주, 매 4주 마다, 각각의 21-일 주기의 제1일, 8일, 및 15일에, 또는 각각의 28-일 주기의 제1일, 8일, 및 15일에 투여될 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 추가적인 요법을 더욱 포함할 수 있다. 추가적인 요법은 방사선 요법, 수술(예컨대, 소괴 절제술 및 유방 절제술), 화학 요법, 유전자 요법, DNA 요법, 바이러스 요법, RNA 요법, 면역 요법, 골수 이식, 나노요법, 단클론 항체 요법, 또는 전술된 것들의 조합일 수 있다. 추가적인 요법은 보조 또는 신보조 요법의 형태일 수 있다. 일부 구체예에서, 추가적인 요법은 소형 분자 효소 저해제 또는 항-전이제의 투여이다. 일부 구체예에서, 추가적인 요법은 부작용 제한제(예컨대, 치료의 부작용의 발생 및/또는 중증도를 감소시키도록 의도되는 물질, 가령 항-어지러움제, 등)의 투여이다. 일부 구체예에서, 추가적인 요법은 방사선 요법이다. 일부 구체예에서, 추가적인 요법은 수술이다. 일부 구체예에서, 추가적인 요법은 방사선 요법과 수술의 병행이다. 일부 구체예에서, 추가적인 요법은 감마선 조사이다. 일부 구체예에서, 추가적인 요법은 PI3K/AKT/mTOR 경로를 표적하는 요법, HSP90 저해제, 튜불린 저해제, 아폽토시스 저해제, 및/또는 화학예방제이다. 추가적인 요법은 본 명세서에 기술된 하나 이상의 화학요법제일 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 PD-1 축 결합 길항제 및 탁산과 함께 백금-계 화학요법제를 투여하는 단계를 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 백금-계 화학요법제는 카르보플라틴이다. 카르보플라틴의 투여 및 투여량은 당해 분야에 널리-공지되어 있다. 카르보플라틴의 예시적인 투여량은 6 mg/ml의 표적 곡선하 면적(AUC)으로 투여된다. 일부 구체예에서, 카르보플라틴은 매 3주 마다 정맥 내로 투여된다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 항-PD-L1 항체 MPDL3280A를 1200 mg로 IV로 매 삼주 마다(q3w) 투여되고, 나브-파클리탁셀(ABRAXANE®)을 100 mg/m2로 IV로 매주(q1w), 및 카르보플라틴을 6 mg/ml의 표적 AUC로 IV로 매 3주 마다(q3w) 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 항-PD-L1 항체 MPDL3280A를 1200 mg로 IV로 매 삼주 마다(q3w) 투여되고, 파클리탁셀을 200 mg/m2로 IV로 매3주 마다, 및 카르보플라틴을 6 mg/ml의 표적 AUC로 IV로 매 3주 마다(q3w) 투여하는 것을 포함한다.
V. 기타 병행 요법
또한 본 명세서에 제공된 것은 개체에서 암을 치료하거나 진행을 지연시키기 위해 개체에게 인간 PD-1 축 결합 길항제 및 탁산을 또 다른 항암제 또는 암 요법과 함께 투여하는 것을 포함하는 방법이다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 개체에세 인간 PD-1 축 결합 길항제, 탁산, 및 백금-계 화학요법제를 또 다른 항암제 또는 암 요법과 함께 투여하는 것을 포함하는 방법이다.
일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 화학 요법 또는 화학요법제와 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 방사선 요법 또는 방사선요법제와 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 표적화 요법 또는 표적화요법제와 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 면역 요법 또는 면역요법제, 예를 들면 단클론 항체와 함께 투여될 수 있다.
이론에 구애받는 것을 원치 않고, 활성화 보조-자극 분자를 촉진하거나 음성 보조-자극 분자를 저해함으로써 T 세포 자극을 향상하는 것은 종양 세포사를 촉진하여 이를 통해 암을 치료하거나 진행을 지연할 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 활성화 보조-자극 분자를 겨냥하는 작용제와 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 활성화 보조-자극 분자는 CD40, CD226, CD28, OX40, GITR, CD137, CD27, HVEM, 또는 CD127을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 활성화 보조-자극 분자를 겨냥하는 작용제는 CD40, CD226, CD28, OX40, GITR, CD137, CD27, HVEM, 또는 CD127에 결합하는 작용제 항체이다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 저해성 보조-자극 분자를 겨냥하는 길항제와 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 저해성 보조-자극 분자는 CTLA-4(또한 CD152로도 공지됨), PD-1, TIM-3, BTLA, VISTA, LAG-3, B7-H3, B7-H4, IDO, TIGIT, MICA/B, 또는 아르기나제를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 저해성 보조-자극 분자를 겨냥하는 길항제는 CTLA-4, PD-1, TIM-3, BTLA, VISTA, LAG-3, B7-H3, B7-H4, IDO, TIGIT, MICA/B, 또는 아르기나제에 결합하는 길항제 항체이다.
일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 CTLA-4(또한 CD152로도 공지됨), 예를 들면, 차단 항체를 겨냥하는 길항제와 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 이필리무맙(또한 MDX-010, MDX-101, 또는 YERVOY®로도 공지됨)과 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 트레멜리무맙(또한 티실리무맙 또는 CP-675,206로도 공지됨)과 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 B7-H3(또한 CD276으로도 공지됨), 예를 들면, 차단 항체를 겨냥하는 길항제와 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 MGA271과 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 TGF 베타를 겨냥하는 길항제, 예를 들면, 메텔리무맙(또한 CAT-192로도 공지됨), 프레솔리무맙(또한 GC1008로도 공지됨), 또는 LY2157299와 함께 투여될 수 있다.
일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 키메라 항원 수용체(CAR)을 발현하는 T 세포(예컨대, 세포독성 T 세포 또는 CTL)의 입양 전이를 포함하는 치료와 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 우성-음성 TGF 베타 수용체, 예컨대, 우성-음성 TGF 베타 유형 II 수용체를 포함하는 T 세포의 양자 전이를 포함하는 치료와 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 HERCREEM 프로토콜을 포함하는 치료와 함께 투여될 수 있다(예컨대, ClinicalTrials.gov 식별자 NCT00889954를 참조).
일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 CD137을 겨냥하는 작용제(또한 TNFRSF9, 4-1BB, 또는 ILA로도 공지됨), 예를 들면, 활성화 항체와 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 우레루맙(또한 BMS-663513로도 공지됨)과 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 CD40을 겨냥하는 작용제, 예를 들면, 활성화 항체와 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 CP-870893과 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 OX40(또한 CD134로도 공지됨)을 겨냥하는 작용제, 예를 들면, 활성화 항체와 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 항-OX40 항체(예컨대, AgonOX)과 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 CD27을 겨냥하는 작용제, 예를 들면, 활성화 항체와 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 CDX-1127과 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 인돌아민-2,3-디옥시게나제(IDO)를 겨냥하는 길항제와 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, IDO 길항제와 함께인 것은 1-메틸-D-트립토판이다(또한 1-D-MT로도 공지됨).
일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 항체-약물 접합체와 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 항체-약물 접합체는 메르탄신 또는 모노메틸 오리스타틴 E(MMAE)를 포함한다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 항-NaPi2b 및 항체-MMAE 접합체(또한 DNIB0600A 또는 RG7599로도 공지됨)과 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 트라스투주맙 엠탄신(또한 T-DM1, 아도-트라스투주맙 엠탄신, 또는 KADCYLA®, Genentech로도 공지됨)과 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 DMUC5754A와 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 엔도텔린 B 수용체(EDNBR)를 표적하는 항체-약물 접합체, 예를 들면, MMAE와 접합된 EDNBR을 겨냥하는 항체와 함께 투여될 수 있다.
일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 혈관형성 저해제와 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 VEGF를 겨냥하는 항체, 예를 들면, VEGF-A와 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 베바시주맙(또한 AVASTIN®, Genentech로도 공지됨)과 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 앤지오포이에틴 2(또한 Ang2로도 공지됨)를 겨냥하는 항체와 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 MEDI3617과 함께 투여될 수 있다.
일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 항종양성 물질과 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 CSF-1R을 표적하는 물질(또한 M-CSFR 또는 CD115로도 공지됨)과 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 항-CSF-1R(또한 IMC-CS4로도 공지됨)과 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 인터페론, 예를 들면 인터페론 알파 또는 인터페론 감마와 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 로페론(Roferon)-A(또한 재조합 인터페론 알파-2a로도 공지됨)과 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 GM-CSF(또한 재조합 인간 과립구 대식 세포 콜로니 자극 인자, rhu GM-CSF, 사그라모스팀, 또는 LEUKINE®로도 공지됨)와 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 IL-2(또한 알데스류킨 또는 PROLEUKIN®로도 공지됨)과 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 IL-12와 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 CD20을 표적하는 항체와 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, CD20을 표적하는 항체는 오비누투주맙(또한 GA101 또는 GAZYVA®로도 공지됨) 또는 리툭시맙이다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 GITR을 표적하는 항체와 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, GITR을 표적하는 항체는 TRX518이다.
일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 암 백신과 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 암 백신은 펩티드 암 백신이며, 이는 일부 구체예에서 맞춤형 펩티드 백신이다. 일부 구체예에서 펩티드 암 백신은 다원자가의 긴 펩티드, 다중-펩티드, 펩티드 칵테일, 혼성 펩티드, 또는 펩티드-펄스(pulsed) 수지상 세포 백신이다(예컨대, Yamada et al., Cancer Sci, 104:14-21, 2013를 참조). 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 보조제와 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 TLR 작용제를 포함하는 치료, 예를 들면, 폴리-ICLC(또한 HILTONOL®로도 공지됨), LPS, MPL, 또는 CpG ODN과 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 종양 괴사 인자(TNF) 알파와 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 IL-1과 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 HMGB1과 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 IL-10 길항제와 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 IL-4 길항제와 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 IL-13 길항제와 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 HVEM 길항제와 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 ICOS 작용제와 함께, 예컨대, ICOS-L의 투여에 의해, 또는 ICOS를 겨냥하는 작용제 항체와 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 CX3CL1을 표적하는 치료와 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 CXCL9를 표적하는 치료와 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 CXCL10을 표적하는 치료와 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 CCL5를 표적하는 치료와 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 LFA-1 또는 ICAM1 작용제와 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 셀렉틴(Selectin) 작용제와 함께 투여될 수 있다.
일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 표적화 요법과 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 B-Raf의 저해제와 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 베무라페닙(또한 ZELBORAF®로도 공지됨)과 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 다브라페닙(또한 TAFINLAR®로도 공지됨)과 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 엘로티닙(또한 TARCEVA®로도 공지됨)과 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 MEK의 저해제, 가령 MEK1(또한 MAP2K1로도 공지됨) 또는 MEK2(또한 MAP2K2로도 공지됨)와 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 코비메티닙(또한 GDC-0973 또는 XL-518로도 공지됨)과 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 트라메티닙(또한 MEKINIST®로도 공지됨)과 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 K-Ras의 저해제와 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 c-Met의 저해제와 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 오나르투주맙(또한 MetMAb로도 공지됨)과 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 Alk의 저해제와 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 AF802(또한 CH5424802 또는 알렉티닙으로도 공지됨)과 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 포스패티딜이노시톨 3-키나제(PI3K)의 저해제와 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 BKM120과 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 이델라리십(또한 GS-1101 또는 CAL-101로도 공지됨)과 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 페리포신(또한 KRX-0401로도 공지됨)과 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 Akt의 저해제와 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제는 MK2206과 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 GSK690693과 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 GDC-0941과 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 mTOR의 저해제와 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 시롤리무스(또한 라파마이신으로도 공지됨)과 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 템시롤리무스(또한 CCI-779 또는 TORISEL®로도 공지됨)과 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 에버롤리무스(또한 RAD001로도 공지됨)과 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 리다포롤리무스(또한 AP-23573, MK-8669, 또는 데포롤리무스로도 공지됨)과 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 OSI-027과 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 AZD8055과 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 INK128과 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 이중 PI3K/mTOR 저해제와 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 XL765과 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 GDC-0980과 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 BEZ235(또한 NVP-BEZ235로도 공지됨)과 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 BGT226과 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 GSK2126458과 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 PF-04691502과 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 PF-05212384(또한 PKI-587로도 공지됨)과 함께 투여될 수 있다.
VI. 제조 물품 또는 키트
본 발명의 또 다른 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및/또는 탁산을 포함하는 제조 물품 또는 키트가 제공된다. 일부 구체예에서, 제조 물품 또는 키트는 개체에서 암을 치료하거나 진행을 지연시키기 위해 또는 암을 가진 개체의 면역 기능을 증진하기 위해 PD-1 축 결합 길항제를 탁산과 함께 이용하기 위한 설명서를 포함하는 패키지 삽입물을 더욱 포함한다. 본 명세서에 기술된 임의의 PD-1 축 결합 길항제 및/또는 탁산은 제조 물품 또는 키트 내에 포함될 수 있다.
일부 구체예에서, PD-1 축 결합 길항제 및 탁산은 동일한 용기 또는 개별 용기에 담긴다. 적절한 용기는, 예를 들면, 병, 바이알, 봉투 및 주사기를 포함한다. 용기는 다양한 재료 가령 유리, 플라스틱(가령 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리올레핀), 또는 금속 합금(가령 스테인리스강 또는 하스텔로이)로부터 형성될 수 있다. 일부 구체예에서, 용기는 제형을 담으며 라벨을 달고 있고, 또는 관련되며, 용기는 사용을 위한 설명사항을 지시할 수 있다. 제조 물품 또는 키트는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 사용 설명서가 있는 패키지 삽입물을 비롯한 상업적인 및 사용자 입장에서 요망되는 다른 재료를 더욱 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 제조 물품은 하나 이상의 또 다른 물질(예컨대, 화학요법제, 및 항-신생물제)을 더욱 포함한다. 하나 이상의 물질을 위해 적절한 용기는, 예를 들면, 병, 바이알, 봉투 및 주사기를 포함한다.
본 명세서는 당해 분야의 기술자가 본 발명을 실시할 수 있게 하기에 충분한 것으로 생각된다. 본 명세서에 나타나고 서술된 것들 외에도 본 발명의 다양한 변형이 전술된 명세서로부터 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이고 첨부된 청구범위의 범위 내에 속한다.
실시예
본 발명은 이어지는 실시예를 참고로 더욱 완전히 이해될 것이다. 실시예는 그러나 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 본 명세서에 기술된 예시 및 구체예는 오로지 설명의 목적을 위함이며 이에 비추어 다양한 변형 또는 변화가 당해 분야의 숙련가에게 제안될 수 있고 본 명세서의 사상 및 이해 범위 및 첨부된 청구범위의 범위 내에 포함됨이 이해된다.
실시예 1: MC38 대장 종양 모델에서 지속가능한 완전관해를 달성한 항-PD-L1 항체 및 나브-파클리탁셀(ABRAXANE®)+ 카르보플라틴을 이용한 병행 치료
재료 및 방법
생체내 종양 모델
MC38 대장 종양 세포주는 Genentech에서 유지하였다. 7-10주령 C57BL/6 암컷 마우스(Charles River Laboratories; Hollister, CA)에게 0.1 백만 개의 MC38 세포를 우측 한쪽 옆구리에 피하 접종하였다. 종양이 대략 100-300mm3의 평균 종양 부피에 이르면, 마우스를 모으고 무작위로 처리군을 나누고 및 항체 및/또는 화학 처리를 이어지는 제1일에 시작하였다.
혼합 모델링 접근법을 사용하여 시간에 따른 동일한 동물로부터의 종양 부피의 반복된 측정치를 분석하였다(Pinheiro et al. nmle: Linear and Nonlinear Mixed Effects Models. R. 패키지 버전 3.1-108 (2013)). 이러한 접근법은 연구가 끝나기 전에 반복된 측정치 및 소규모의 중단치를 모두 다룬다. 삼차 회귀 스플라인을 사용하여 상이한 처리에서의 log2(종양 부피)의 시간 경과에 대한 비선형 프로파일을 정합하였다. 정합은 nlme 패키지, 버전 3.1 108(R Foundation for Statistical Computing; Vienna, Austria)을 이용하는 R, 버전 2.15.2 내에서 선형 혼합 효과 모델을 통해 수행하였다.
도 5A-5B에 나타난 MC38 재시도 실험에 있어서, 앞서 항-PD-L1+ABRAXANE®+카르보플라틴 조합으로 처리하여 치유된 마우스에 일차 종양 시도했던 옆구리 반대편에 0.1 백만 개의 MC38 세포를 피하로 접종하였다. 동시에, 미경험 암컷 C57BL/6 마우스에 또한 0.1 백만 개의 MC38 세포를 접종하였다. 칠일 후에, 모든 마우스를 안락사시키고 유세포 계측 분석을 위해 비장을 수확하였다. 모든 동물 연구는 동물복지법(Animal Welfare Act)에 언급된 가이드라인 및 실험동물의 보호와 이용을 위한 지침(The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals) 및 실험동물 운영위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC) 가이드라인을 준수하여 수행하였다.
재-시도 마우스의 비장세포 배양물의 시험관내 자극
비장세포를 96 웰 U-바닥 플레이트에서 1 백만 세포/웰을 삼중복으로 10 ng/ml의 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA) 및 1 μg/ml의 이오노마이신(Sigma-Alrich; St. Louis, MO) 더하기 GOLGIPLUG™(브레펠딘 A)(BD Biosciences; San Jose, CA)와 함께 4시간 동안 37℃에서 배양하였다. 세포를 수확하고 표면 마커 CD4 FITC(플루오레세인 이소티오시아네이트), CD3 PE(피코에리트린), 및 CD8 PerCp-Cy5.5(BD Biosciences)로 염색하고 얼음 위에서 4% 파라포름알데히드로 30분간 고정하였다. 세포를 1x 투과화 완충액(BD Biosciences)으로 투과화시키고 래트 항-마우스 항-인터페론-γ(IFN-γ)-알로피코시아닌(APC)-공액결합된 항체 또는 래트 IgG1-APC 이소형 대조 항체(BD Biosciences)로 염색하고 BD Biosciences LSRII에서 FACSDIVA™ 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. FlowJo 소프트웨어(TreeStar)를 이용하여 유세포 계측 분석을 수행하였다.
항체 및 처리
모든 처리 항체는 Genentech에서 제조하였다. 대조 항체는 항-gp120 쥐의 IgG1(mIgG1), 클론 10E7.1D2였다. 항-PD-L1는 인간/마우스 역전 키메라, 클론 YW243.55.S70 mIgG2a.DANA이거나 전부 마우스인 클론 25A1 mIgG2a.DANA였다. ABRAXANE®은 Abraxis Bioscience, Inc.(Celgene; Summit, NJ의 계열사)로부터 수득하였다. 카르보플라틴은 Hospira, Inc.(Lake Forest, IL)에서 수득하였다. 덱사메타손은 West-Ward Pharmaceuticals(Eatontown, NJ)에서 수득하였다. 투여 스케쥴 및 투여 경로는 도면의 간단한 설명에서 지시된 바와 같았다. 항체를 PBS 또는 20mM 히스티딘 아세테이트, 240mM 수크로스, 0.02% 폴리소르베이트 20, pH 5.5 내에 희석하였다. 화학요법제 및 덱사메타손은 식염수에 희석하였다.
생체내 백신 연구
OTI Thy1.1 CD8+ T 세포를 공여자 OTI Thy1.1 암컷 비장 및 장간막 림프절(Genentech 콜로니)로부터 MACS CD8 단리 키트(Miltenyi Biotec)를 이용하는 음성 선별에 의해 단리하였다. 정제된 CD8+ 세포를 CFSE(Life Technologies; Grand Island, NY)로 표지하고 2.5x106개 세포를 암컷 C57BL/6 암컷 수용자(Charles River Laboratories)에 정맥내로(IV) 주입하였다. 다음날, 마우스에게 전장 오브알부민(Genentech에서 생산된 것)에 융합된 250 ng의 항-DEC205를 복강내 주입(IP)에 의해 그리고 식염수 또는 덱사메타손 4 mg/kg로 IV 주입하여 백신을 접종하였다. 접종하고 이틀 후에, 마우스를 안락사시키고 분석을 위해 비장을 수확하였다. 비장 세포 현탁액의 총 세포 수를 공지 농도의 고정된 양의 형광 비드(카타로그 번호 9003-53-6, Polysciences, Inc.; Warrington, PA)에 등장하는 생존 세포 비율을 이용하는 유세포 분석에 의해 측정하였다. OTI CD8+T 세포를 Thy1.1 PE-Cy7 및 CD8 Pacific Blue(BD Biosciences)로의 염색에 의한 유세포 분석으로 확인하고 BD Biosciences LSRII에서 FACSDIVA™ 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. FlowJo 소프트웨어(TreeStar)를 이용하여 유세포 계측 분석을 수행하였다.
결과
이러한 연구는 전임상 마우스 종양 모델에서 암 요법의 맥락에서 항-PD-L1 항체의 효능을 평가하였다. 동계 MC38 대장 종양 모델에서 항-PD-L1 항체(클론 25A1 mIgG2a.DANA) 및 파클리탁셀+카르보플라틴의 병행 치료는 대조 항체 또는 파클리탁셀+카르보플라틴을 단독으로 처리한 경우와 비교할 때 상승적 항-종양 반응을 생성하였다(도 1). 10%의 마우스(1/10)가 병용된 항-PD-L1 및 파클리탁셀+카르보플라틴 처리에 대해 부분관해를 가진데 비해, 대조 항체 또는 파클리탁셀+카르보플라틴 단독 군에서는 그러한 마우스가 없었다(도 1). 종양 크기의 감소를 나타낸 강한 항-종양 반응은 부분관해(PR)로서 표시하였고, 본 실시예에서 초기 종양 부피로부터 >50% 및 <100%의 감소로 정의하였고, 또는 완전관해는, 본 실시예에서 종양 부피의 100% 감소로 정의하였다. 항-PD-L1 항체 및 파클리탁셀+카르보플라틴의 병행 처리는 또한 진행까지의 시간(time to progression)을 지연시켰다. 대조 항체에 있어서 진행까지의 시간(TTP)(본 실시예에서 초기 종양 부피의 5x로서 정의됨)은 11일이었고, 파클리탁셀+카르보플라틴에 있어서 15.5일이었으며, 항-PD-L1 항체 및 파클리탁셀 + 카르보플라틴의 병행 처리에 있어서는 25일이었다.
임상적 설정에서, 파클리탁셀(이것은 잠재적으로 독성인 용매 내에 제형화됨)로의 처리는 전형적으로 과민 반응의 가능성을 늦추기 위해 코르티코스테로이드 가령 덱사메타손의 예비투약을 수반한다. 그러나, 코르티코스테로이드 가령 덱사메타손은 면역억제 효과를 가지며 T 세포 반응을 저해할 수 있고, 이는 다시 PD-1 축 결합 길항제, 가령 항-PD-L1 물질의 활성을 감소시킬 수 있다. 동일하게, 덱사메타손의 투여는 동계 MC38 대장 종양 모델에서 단일-물질 항-PD-L1 처리의 효능을 없앴다(도 2A 및 2B). 게다가, 덱사메타손은 OTI 입양 T 세포 전이 및 백신 모델에서 항원-특이적 T 세포 반응을 저해하였다(도 3). 그러므로, 이론에 구애됨을 바라지 않고, 코르티코스테로이드 가령 덱사메타손을 이용한 처리는 PD-1 축 결합 길항제, 가령 항-PD-L1 요법의 이익 중 일부를 약화 또는 상쇄시킬 수 있고, 이를 통해 T 세포 기능의 향상 및 항-종양 반응, 가령 CD8+ T 세포-매개 종양 파괴를 촉진하는 이의 능력을 감소시킨다.
항-PD-L1 항체(키메라 YW243.55.S70.mIgG2a.DANA) 및 나브-파클리탁셀(ABRAXANE®)+카르보플라틴의 병행 처리는 동계 MC38 대장 종양 모델에서 대조 항체, 단일-물질 항-PD-L1 항체, 또는 ABRAXANE®+카르보플라틴 단독을 이용한 처리에 비해 예상치 못할 정도로 강한 상승적 항-종양 효능을 나타내었다(도 4A 및 4B). 병용된 항-PD-L1 항체 및 ABRAXANE®+카르보플라틴 요법은 4/8 마우스에서 90일을 초과하여 지속되는 지속가능한 완전관해를 성취하였다(도 4A 및 4B). 이러한 상승작용은 항-PD-L1 및 파클리탁셀+카르보플라틴 병행 처리의 결과로 관찰된 상승작용보다 훨씬 강하였다. TTP(5x 초기 종양 부피)는 대조 항체 단독에 있어서 11.5일, 항-PD-L1 항체 단독에 있어서 9일, ABRAXANE®+카르보플라틴 단독에 있어서 13.5일이었고, 4/8 마우스가 완전한 회귀를 보인 항-PD-L1 항체 및 ABRAXANE®+카르보플라틴의 병행 요법에서는 적용할 수 없었다. 이는 항-PD-L1 항체 및 ABRAXANE®+카르보플라틴의 병행 요법이 항-PD-L1 항체 및 파클리탁셀+카르보플라틴 병행 치료보다 더 높은 강도로 진행까지의 시간을 강하게 지연시킴을 나타낸다. 추가로, 조합 항-PD-L1 및 ABRAXANE®+카르보플라틴 처리로부터 치유된 모든 마우스(즉, 완전관해를 나타내는 마우스)는 동일한 MC38 종양 세포주를 이용한 이차 시도를 완전히 거부할 수 있었으며, 이는 상기 요법이 T 세포 기억 응답을 생성함을 나타낸다(도 5A-5B). 이들 치유된 마우스로부터의 비장세포의 시험관내 재-자극은 미경험 일차 시도 마우스에 비교한 CD4+T 및 CD8+T 세포 모두로부터의 향상된 인터페론-감마(IFN-γ) 생산에 의해 관찰된 것과 같은 증가된 T 세포 수식인자 기능을 나타내었다(도 5A-5B).
놀라울 정도로 강한 항-종양 상승적 활성 및 완전관해를 얻고 T 세포 기억 반응을 생성하는 예기치 못한 능력은 PD-1 축 결합 길항제 및 탁산, 가령 나브-파클리탁셀(ABRAXANE®)을 이용한 병행 요법에 대한 중요한 치료적 장점을 나타낸다. 추가적으로, 파클리탁셀 처리와 달리, 나브-파클리탁셀(ABRAXANE®) 처리는 전형적으로 코르티코스테로이드, 가령 덱사메타손을 이용한 예비투약을 수반하지 않는다. 본 명세서에 제시된 결과는 PD-1 축 결합 길항제(가령 항-PD-L1 항체) 및 나브-파클리탁셀(ABRAXANE®)을 이용한 병행 요법이 또한 코르티코스테로이드의 사용을 피할 수 있는 더 단순한 치료 계획을 가능하게 하고 이를 통해 잠재적인 역효과의 가능성을 줄일 수 있음을 나타낸다.
실시예 2: 항-PD-L1 항체와 나브-파클리탁셀(ABRAXANE®) 및 카르보플라틴을 이용한 병행 치료는 비-소세포 폐암을 가진 환자의 단계 1b 임상 실험에서 완전관해를 성취하였다
단계 1b 임상 연구를 수행하여 비-소세포 폐암(NSCLC)을 가지는 환자에 대하여 탁산(나브-파클리탁셀(ABRAXANE®) 또는 파클리탁셀) 및 카르보플라틴과 병용된 항-PD-L1 항체(MPDL3280A)의 병행 치료의 효능을 평가하였다.
본 임상 연구를 위한 투여 프로토콜은 아래와 같았다:
1) MPDL3280A/ABRAXANE®/카르보플라틴 병행 요법: (a) MPDL3280A을 1200 mg로 IV로 매 3주 마다(q3w) 투여; (b) ABRAXANE®을 100 mg/m2로 IV로 매주 마다(q1w); 및 (c) 카르보플라틴을 6 mg/ml의 표적 곡선하 면적(AUC)으로 IV로 매 3주 마다(q3w).
2) MPDL3280A/파클리탁셀/카르보플라틴 병행 요법: (a) MPDL3280A을 1200 mg로 IV로 매 3주 마다(q3w) 투여; (b) 파클리탁셀을 200 mg/m2로 IV로 매 3주 마다(q3w); 및 (c) 카르보플라틴을 6 mg/ml의 표적 AUC로 IV로 매 3주 마다(q3w).
표 4는 ABRAXANE® 및 카르보플라틴과 병용으로 MPDL3280A로 처리된 14명의 환자의 연구 결과를 나타낸다. 표 5는 파클리탁셀 및 카르보플라틴과 병용으로 MPDL3280A로 처리된 6명의 환자의 연구 결과를 나타낸다.
표 4: 조합 MPDL3280A/ABRAXANE®/카르보플라틴 처리의 효능
결과 백분율(n/N)
명목 응답률(ORR) 64.3%(9/14)
완전관해(CR) 21.4%(3/14)
부분관해(PR) 42.9%(6/14)
불변 질환(SD) 28.6%(4/14)
진행성 질환(PD) 7.1%(1/14)
표 5: 조합 MPDL3280A/파클리탁셀/카르보플라틴 처리의 효능
결과 백분율(n/N)
명목 응답률(ORR) 33.3%(2/6)
완전관해(CR) 0
부분관해(PR) 33.3%(2/6)
불변 질환(SD) 66.7%(4/6)
진행성 질환(PD) 0
표 4 및 도 6A에 나타난 바와 같이, MPDL3280A 및 나브-파클리탁셀(ABRAXANE®)+카르보플라틴을 이용한 병행 치료는 64.3% 명목 응답률(ORR, CR+PR)과 함께 예기치 못하게 강한 항-종양 효능을 나타내었다. 놀랍게도, 조합 MDPL3280A 및 나브-파클리탁셀(ABRAXANE®)+카르보플라틴 요법으로 처리된 환자의 21.4%(3/14)가 완전관해(즉, 검출가능한 종양 질량의 완전한 부재)를 성취하였다. 42.9%(6/14)의 환자는 부분관해를 경험하였다.
MPDL3280A 및 파클리탁셀+카르보플라틴을 이용한 병행 치료는 시험된 비교적 작은 샘플 크기에서 비록 조합 MPDL3280A/나브-파클리탁셀(ABRAXANE®)+카르보플라틴 요법에 비해 다소 덜 강력했으나 또한 항-종양 효능을 나타내었다. 조합 MPDL3280A 및 파클리탁셀+카르보플라틴 요법의 ORR은 33.3%였고, 두 응답군이 모두 부분관해를 경험하였다(표 5 및 도 6B).
실시예 1에 제시된 전-임상 연구와 동일하게, 놀라울 정도로 강한 항-종양 활성 및 지속적인, 완전관해를 얻는 예기치 않은 능력은 PD-1 축 결합 길항제(가령 항-PD-L1 항체) 및 탁산, 가령 나브-파클리탁셀(ABRAXANE®)을 이용한 병행 요법에 대한 중요한 치료적 장점을 나타낸다.
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Asn Ser Gly Ala Leu Thr 145 150 155 160 Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys 180 185 190 Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 195 200 205 Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala 210 215 220 Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 225 230 235 240 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 245 250 255 Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val 260 265 270 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 275 280 285 Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 290 295 300 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly 305 310 315 320 Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 325 330 335 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr 340 345 350 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 355 360 365 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 370 375 380 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 385 390 395 400 Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe 405 410 415 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 420 425 430 Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 <210> 2 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 3 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 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Construct <400> 11 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 1 5 10 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> Xaa <222> (5)..(5) <223> Xaa is D or V <220> <221> Xaa <222> (6)..(6) <223> Xaa is V or I <220> <221> Xaa <222> (7)..(7) <223> Xaa is S or N <220> <221> Xaa <222> (9)..(9) <223> Xaa is A or F <220> <221> Xaa <222> (10)..(10) <223> Xaa is V or L <400> 12 Arg Ala Ser Gln Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Ala 1 5 10 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> Xaa <222> (4)..(4) <223> Xaa is F or T <220> <221> Xaa <222> (6)..(6) <223> Xaa is Y or A <400> 13 Ser Ala Ser Xaa Leu Xaa Ser 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is Y, G, F, or S <220> <221> Xaa <222> (4)..(4) <223> Xaa is L, Y, F, or W <220> <221> Xaa <222> (5)..(5) <223> Xaa is Y, N, A, T, G, F, or I <220> <221> Xaa <222> (6)..(6) <223> Xaa is H, V, P, T, or I <220> <221> Xaa <222> (8)..(8) <223> Xaa is A, W, R, P, or T <400> 14 Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Thr 1 5 <210> 15 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 15 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 16 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 17 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 17 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 18 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 1 5 10 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 19 Gly Phe Thr 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  1. 유효량의 인간 PD-1 축 결합 길항제 및 탁산을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 암을 치료하거나 진행을 지연시키기 위한 방법의 용도.
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