KR20140127251A - Ｆｃ-수용체 기재 친화성 크로마토그래피 - Google Patents

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Abstract

본원에는 일반적으로 그리고 예를 들어, 항체 및 참조 항체의 체류 시간의 비를 측정함으로써 항체의 생체 내 반감기를 측정하기 위한, 친화성 크로마토그래피 리간드로서의 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 및 베타-2-마이크로글로불린 (b2m) 의 부동화된 비-공유 복합체의 용도가 보고되어 있다.

Description

ＦＣ-수용체 기재 친화성 크로마토그래피 {FC-RECEPTOR BASED AFFINITY CHROMATOGRAPHY}
본원에는 친화성 리간드로서 부동화된 인간 신생아 Fc 수용체를 포함하는 친화성 크로마토그래피 컬럼의 용도 및 이의 용도에 관한 것이다.
면역글로불린은 일반적으로 2 개의 소위 경쇄 폴리펩티드 (경쇄) 및 2 개의 소위 중쇄 폴리펩티드 (중쇄) 를 포함한다. 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 각각은 항원과 서로 반응할 수 있는 결합 영역을 포함하는 가변 도메인 (가변 영역) (일반적으로 폴리펩티드 사슬의 아미노 말단 부분) 을 함유한다. 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 각각은 불변 영역 (일반적으로 카르복실 말단 부분) 을 포함한다. 중쇄의 불변 영역은 i) Fc 감마 수용체 (FcγR) 를 가지고 있는 세포, 예컨대 식세포에 대한, 또는 ii) 브람벨 (Brambell) 수용체라고도 공지된 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 를 가지고 있는 세포에 대한 항체의 결합을 매개한다. 이것은 또한 보체 (C1q) 와 같은 고전적인 보체계의 인자를 포함하는 일부 인자에 대한 결합을 매개한다.
신생아 Fc 수용체 (FcRn) 는 또한 MHC 계열 I-연관 수용체로서 공지되어 있다 (리뷰를 위해서는 문헌 [Ward, E.S. and Ober, R.J., Advances in Immunology 103 (2009) 77-115] 를 참조함). 연구에서는 상기 수용체가 성년기 동안 IgG 수준 및 분포를 조절하는 것을 담당할 뿐 아니라 (Ghetie, V., et al., Nat. Biotechnol. 15 (1997) 637-640; Israel, E.J., Immunology 89 (1996) 573-578; Junghans, R.P. and Anderson, C.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996) 5512-5516), 다양한 세포 유형 및 조직에서 복합적인 다른 역할을 하는 것으로 제시된다 (예를 들어 문헌 [Akilesh, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105 (2008) 967-972; Dickinson, B.L., et al., J. Clin. Invest. 104 (1999) 903-911; Kim, H., et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49 (2008) 2025-2029; Spiekermann, G.M., et al., J. Exp. Med. 196 (2002) 303-310; Zhu, X., et al., J. Immunol. 166 (2001) 3266-3276] 참조). FcRn 오르소로그는 마우스, 래트, 사람, 양, 소, 주머니 쥐, 돼지 및 낙타를 비롯한 많은 종으로부터 단리되었고 (Adamski, F.M., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 435-444; Ahouse, J.J., et al., J. Immunol. 151 (1993) 6076-6088; Kacskovics, I., et al., J. Immunol. 164 (2000) 1889-1897; Kacskovics, I., et al., Dev. Comp. Immunol. 30 (2006) 1203-1215; Kandil, E., et al., J. Immunol. 154 (1995) 5907-5918; Mayer, B., et al., Immunology 107 (2002) 288-296; Schnulle, P.M. and Hurley, W.L., Vet. Immunol. Immunopathol. 91 (2003) 227-231; Simister, N.E. and Mostov, K.E., Nature 337 (1989) 184-187; Story, C.M., et al., J. Exp. Med. 180 (1994) 2377-2381), 상기 수용체가 모든 포유류 종에 본질적으로 존재한다는 것을 나타낸다. FcRn 의 복합적인 역할은 세포 내의 리소좀 분해로부터 IgG 를 분류해내고 원형질 막에서의 외분비작용 동안 결합된 카고를 방출시키는 그 능력에 따라 다르다 (Ober, R.J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 11076-11081; Ober, R.J., et al., J. Immunol. 172 (2004) 2021-2029; Prabhat, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104 (2007) 5889-5894). 또한, IgG 트래피킹 경로 및 생체 내 거동을 조절하는 잠재력이 제시되어, 마우스에서 이들의 반감기를 증가시키기 위한 항체의 조작에 관한 초기 연구 (Ghetie et al., supra) 는 생물약학 산업에서의 집중적인 관심의 분야로 팽창해왔다 (Dall'Acqua, W.F., et al., J. Biol. Chem. 281 (2006) 23514-23524; Hinton, P.R., et al., J. Biol. Chem. 279 (2004) 6213-6216; Hinton, P.R., et al., J. Immunol. 176 (2006) 346-356; Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604).
WO 2005/047327 에는 신생아 Fc 수용체 (FcRn)-결합 폴리펩티드 변이체, 이량체성 Fc 결합 단백질 및 이와 관련된 방법이 보고되어 있다. 변형된 효과기 기능을 갖는 폴리펩티드 변이체는 WO 2006/031370 에 보고되어 있다. WO 2009/041643 에는 CDR 내의 아미노산 치환을 통해 항체의 등전점을 변형시키는 방법이 보고되어 있다. WO 2010/048313 에는 Fc-함유 융합 단백질의 제조를 위한 재조합 FcRn 및 이의 변이체가 보고되어 있다. Magistrelli, G., et al. 의 문헌에는 IgG 결합 연구를 위해 지향적 부동화를 가능하게 하는 포유류 세포에서의 로부트스 (robust) 재조합 FcRn 생성이 보고되어 있다 (J. Immunol. Meth. 출판, 온라인 이용가능 12.09.2011).
요약
본원에 보고되는 하나의 양상은 친화성 크로마토그래피 리간드로서의 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 및 베타-2-마이크로글로불린 (b2m) 의 부동화된 비-공유 복합체의 용도이다.
본원에 보고된 방법/용도에 의해, 이들의 생체 내 특성과 관련하여 가깝게 연관된 항체 종, 즉, 단일 또는 제한된 수의 아미노산 잔기가 상이한 것을 분리, 단리 및 특징화하는 것이 가능하다는 것을 발견하였다.
그러므로, 본원에 보고된 방법으로 단리된, 상이한 항체 종, 즉 하나의 아미노산 잔기 차이는 아미노산 위치에 영향을 주는 FcRn 관련 반감기를 특징화/확인하는데 사용될 수 있다.
그러므로, 본원에 보고된 방법에 의해, 하나의 모체 항체의 상이한 변이체를 분리하는 것 및 상기 변이체 사이의 특정 비를 측정하는 것을 가능하게 하며, 이러한 것은 현재 공지된 방법으로는 가능하지 않았는데 이것이 오직 개질의 합만을 제공하고 개별적인 종은 제공하지 않기 때문이다 (즉, 모체 및 변이체 1 및 변이체 2 및 변이체 1/2 의 혼합물의 경우, 질량 분광 분석은 변이체 1 포함 분자 전체, 즉, 단일 변이를 포함하는 변이체 (1) 및 또한 또한 제 2 변이를 포함하는 변이체 (1/2) 에 대해 제공된다).
이것은 i) 재조합으로 생성된 인간 베타 2 마이크로글로불린과 조합으로의 재조합으로 생성된 인간 FcRn 의 크로마토그래피 지지체 상에 대한 부동화 및 ii) 선형 pH 구배의 조합에 의해 달성될 수 있다.
제시된 조건의 경우 야생형 IgG1 항체의 체류 시간은 약 42 내지 49 분이라는 것을 발견하였다. 하나의 구현예에서, 항체 또는 IgG1 하위계열의 야생형 Fc-영역을 포함하는 Fc-융합 단백질의 체류 시간은 약 45 분이다.
FcRn 결합이 감소된 개질된 Fc-영역을 갖는 항체는 체류 시간이 짧은 반면, FcRn 결합이 향상된 개질된 Fc-영역을 갖는 항체는 체류 시간이 더 길다. 하나의 구현예에서, 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 및 베타-2-마이크로글로불린 (b2m) 의 비-공유 복합체는 고체상에 결합된다. 하나의 구현예에서, 고체상은 크로마토그래피 물질이다. 하나의 구현예에서, 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 및 베타-2-마이크로글로불린 (b2m) 의 비-공유 복합체는 비오티닐화되고, 고체상은 스트렙타비딘으로 유도된다.
하나의 구현예에서, 용도는 pH 구배를 가진 친화성 크로마토그래피에서의 용도이다. 하나의 구현예에서, pH 구배는 제 1 pH 값에서 제 2 pH 값까지이고, 제 1 pH 값은 약 pH 3.5 내지 약 pH 7.5 이고 제 2 pH 값은 약 pH 6.0 내지 약 pH 9.5 이다. 하나의 구현예에서, pH 구배는 pH 값이 증가하는 구배이거나 pH 값이 감소하는 구배이다. 하나의 구현예에서, 제 1 pH 값은 약 pH 5.5 이고 제 2 pH 값은 약 pH 8.8 이거나, 또는 제 1 pH 값은 약 pH 7.4 이고 제 2 pH 값은 약 pH 6.0 이다.
하나의 구현예에서, 베타-2-마이크로글로불린은 FcRn 과 동일한 종으로부터 유래된다.
하나의 구현예에서, 용도는 항체 및 참조 항체의 체류 시간의 비를 측정함으로써 항체의 생체 내 반감기를 측정하기 위한 것이다.
하나의 구현예에서, 용도는 Fc-영역을 적어도 포함하는 항체 또는 융합 폴리펩티드를 분리하기 위한 것이다.
하나의 구현예에서, 용도는 항체의 메티오닌 산화를 측정하기 위한 것이다.
하나의 구현예에서, 용도는 항체의 올리고머화 수준을 측정하기 위한 것이다.
하나의 구현예에서, 용도는 모체 항체 또는 모체 융합 폴리펩티드와 비교하여 FcRn 에 대해 변형된 결합 친화력을 갖는 상기 개질된 항체 또는 개질된 융합 폴리펩티드에 대한 Fc-영역의 FcRn 결합 부분을 적어도 포함하는 모체 항체 또는 모체 융합 폴리펩티드의 개질된 항체 또는 개질된 융합 폴리펩티드의 라이브러리를 스크리닝하기 위한 것이다.
하나의 구현예에서, 용도는 신생아 Fc 수용체에 대해 변형된 결합을 나타내는 Fc-영역의 FcRn-결합 부분을 적어도 포함하는 항체 또는 융합 폴리펩티드를 확인하기 위한 것이다.
하나의 구현예에서, 항체는 융합 폴리펩티드의 1-특이적 항체 또는 항체 단편, 또는 융합 폴리펩티드의 2-특이적 항체 또는 항체 단편, 또는 융합 폴리펩티드의 3-특이적 항체 또는 항체 단편, 또는 융합 폴리펩티드의 4-특이적 항체 또는 항체 단편이다.
하나의 구현예에서, 용도는 IgG 제제로부터 반 항체 (half antibody) 의 제거를 위한 것이다.
하나의 구현예에서, 용도는 IgG 제제로부터 항체 응집체 및 항체 올리고머의 제거를 위한 것이다.
본원에 보고되는 하나의 양상은 위치 252 의 아미노산이 메티오닌에서 히스티딘으로 바뀌고, 위치 428 의 아미노산이 메티오닌에서 글루탐산으로 바뀐 인간 IgG1 이소형의 Fc-영역 변이체이다.
본원에 보고되는 하나의 양상은 크로마토그래피가 수행되고 야생형 IgG1 에 비해 제시된 체류 시간 윈도우 (time window) 내에 체류 시간을 갖는 항체가 선별되는 미리 결정된 생체 내 반감기를 갖는 항체를 선별하는 방법이다.
도 1 적용된 항체의 선형성 및 본원에 보고된 FcRn 컬럼을 사용하는 크로마토그래피의 곡선 하 면적.
도 2 본원에 보고된 FcRn 컬럼 상의 항-IGF-1R 항체 야생형 및 YTE-돌연변이체의 크로마토그램.
도 3 CE-SDS 분석 (A/B/C 하부 열) 에서 제시될 수 있는 바와 같은 상이한 양의 반 항체를 함유하는 상이한 항체 제제의 FcRn 크로마토그래피 (A/B/C 상부 열).
도 4 상이한 양의 항체 단량체 및 응집체를 함유하는 상이한 항체 제제의 FcRn 크로마토그래피.
도 5 크로마토그래피 분자 중의 Fc-영역의 수에 의한 FcRn 크로마토그래피 내의 체류 시간의 영향.
도 6 FcRn 크로마토그래피 체류 시간 상의 항체의 산화에 대한 영향.
도 7 본원에 보고된 바와 같은 FcRn 컬럼 상의 항-Abeta 항체 야생형, 및 HE-돌연변이체의 크로마토그램.
도 8 FcRn 상호작용에 대한 Met252 및 Met428 산화의 영향. 2 개월 동안 40℃ 에 저장된 IgG1 항체 샘플의 (곡선 2) FcRn 컬럼에 대한 적용은 산화된 IgG1 항체의 이중 피크 지표를 가진 초기 용리 종을 야기하는 반면, 2 개월 동안 25℃ (곡선 1) 및 -80℃ (곡선 3) 에 저장된 IgG1 항체 샘플의 FcRn 컬럼에 대한 적용은 후기에 용리되는, 사실상 중복되는 피크를 야기한다. 크로마토그래피 조건: 완충액 A (20 mM MES, 150 mM NaCl, pH 5.5), 완충액 B (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 8.2), 유속 0.5 ml/분, 완충액 A 에서 완충액 B 로의 구배: 60 분 (표준).
도 9 스트레스받은 IgG1 항체의 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 분석. 2 개월 동안 40℃ 에 저장된 IgG1 항체 샘플의 SPR 분석용 BIAcore 에 대한 적용은 야생형 및 Met252 및 Met428 산화된 IgG1 항체 종에 대해 상이한 센서그램을 보여준다.
도 10 FcRn 상호작용에 대한 항체 응집체의 영향. 고유의 샘플, 이의 단리된 단량체 및 단리된 응집체 중의 항-IL13R알파 항체의 FcRn 크로마토그래피 분석. 크로마토그래피 조건: 완충액 A (20 mM MES, 150 mM NaCl, pH 5.5), 완충액 B (20 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, pH 8.8), 유속 0.5 mL/분, 완충액 A 에서 완충액 B 로의 구배: 50 분 (표준).
도 11 항-IL13R알파 항체 응집체의 SPR 분석. 참조 표준으로서의 항-IL13R알파 항체 (곡선 1), 고유의 샘플 (3) 중의, 단리된 항-IL13R알파 항체 단량체 (곡선 2) 및 단리된 항-IL13R알파 항체 응집체 (곡선 4) 의 센서그램.
도 12 FcRn 형질전환 마우스에서의 약동학에 대한 Fc 돌연변이의 영향. 야생형 항체 또는 이의 삼중 돌연변이체 YTE 는 그룹 당 8 마리의 동물에게 10 mg/kg 의 단일 i.v. 일시 주사로서 제공되었다. 결과는 평균 ± 표준 편차 (SD) 로서 제시한다, 야생형 항체와 비교하여 유의성의 ANOVA 분석 (+++, p<0.001). A: 시간 0 부터 672 시간까지의 혈청 농도-시간 곡선 하 면적 (AUC(0-672)). B: 말단 반감기.
신생아 Fc 수용체 (FcRn) 는 생체 내 IgG 항체의 대사 경로에 중요하다.
FcRn 친화성 크로마토그래피는 이들의 피크 면적 및 체류 시간 프로파일에 의해 IgG 샘플을 구별할 수 있다. 이것은 시험관 내에서 FcRn 과 IgG 사이의 상호작용 분석을 가능하게 하고, 생체 내 약동학과 관련된 치료적 IgG 의 구조적 및 기능적 완전성에 대한 통찰력을 제시할 수 있다.
그러므로, 돌연변이체 및 야생형 IgG 의 FcRn 친화성 크로마토그래피는 생체 내 약동학의 반-정량적 예측으로서 사용될 수 있다. 게다가, FcRn 친화성 크로마토그래피는 예를 들어, IgG 배치 특성화 또는 비교 연구를 위해, FcRn-IgG 상호작용을 모니터하기 위해 사용될 수 있다.
표준화된 pH 구배 FcRn 친화성 액체 크로마토그래피 방법은 생체 내 IgG 와 FcRn 사이의 상호작용 메카니즘을 매우 닮은 조건으로 발견된다. 인간 FcRn 이 친화성 리간드로서 컬럼 상에 부동화되었고, 예를 들어, pH 5.5 에서 8.8 의 선형 pH 구배가 적용되었다.
예를 들어, 분석용 FcRn 친화성 크로마토그래피는 피크 패턴 및 체류 시간 프로파일에 의해 IgG 샘플 및 변이체의 확인 및 특징화를 가능하게 한다. 방법은 1) 상이한 Fab 단편을 가진 동일한 IgG, 2) 비-산화된 IgG 형태로부터의 산화된 IgG 형태, 3) 단량체로부터의 응집체, 및 4) Fc-영역 내에 변이를 갖는 항체를 구별할 수 있게 한다.
야생형 IgG 와 관련해 변이체 IgG (Fc-영역 변이체) 의 FcRn 친화성 크로마토그래피 프로파일에서의 변화가 생체 내 약동학 프로파일의 예측인 것이 밝혀졌다. 상기 결과는 FcRn 친화성 크로마토그래피가 FcRn-IgG 상호작용, IgG 완전성, 및 최대 그러한 IgG 의 특징분석을 위한 유용한 신규 방법임을 입증한다.
I. 정의
용어 "약" 은 이어지는 수치 값의 +/- 20 % 의 범위를 나타낸다. 하나의 구현예에서, 용어 "약" 은 이어지는 수치 값의 +/- 10 % 의 범위를 나타낸다. 하나의 구현예에서, 용어 "약" 은 이어지는 수치 값의 +/- 5 % 의 범위를 나타낸다.
용어 "변경" 은 개질된 항체 또는 융합 폴리펩티드를 수득하기 위한 Fc-영역의 FcRn 결합 부분을 적어도 포함하는 모체 항체 또는 융합 폴리펩티드 내의 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환, 부가, 또는 결실을 나타낸다.
용어 "아미노산 치환" 은 하나 이상의 존재하는 아미노산 잔기를 또다른 상이한 아미노산 잔기로 대체하는 것을 나타낸다 (대체 아미노산 잔기). 대체 아미노산 잔기는 "자연 발생적 아미노산 잔기" 일 수 있고, 알라닌 (3 자리 코드: ala, 1 자리 코드: A), 아르기닌 (arg, R), 아스파라긴 (asn, N), 아스파르트산 (asp, D), 시스테인 (cys, C), 글루타민 (gln, Q), 글루탐산 (glu, E), 글리신 (gly, G), 히스티딘 (his, H), 이소류신 (ile, I), 류신 (leu, L), 라이신 (lys, K), 메티오닌 (met, M), 페닐알라닌 (phe, F), 프롤린 (pro, P), 세린 (ser, S), 트레오닌 (thr, T), 트립토판 (trp, W), 티로신 (tyr, Y), 및 발린 (val, V) 으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
용어 "아미노산 삽입" 은 하나 이상의 아미노산 잔기의 아미노산 서열 내의 미리 결정된 위치에의 도입을 나타낸다. 하나의 구현예에서, 삽입은 1 개 또는 2 개의 아미노산 잔기의 삽입일 것이다. 삽입된 아미노산 잔기(들) 은 임의의 자연 발생적 또는 비-자연 발생적 아미노산 잔기일 수 있다.
용어 "아미노산 결실" 은 아미노산 서열 내의 미리 결정된 위치에의 하나 이상의 아미노산 잔기의 제거를 나타낸다.
용어 "항체" 는 본원에서 가장 넓은 범위로 사용되고, 이들이 FcRn-결합 특성을 나타내기만 한다면 단일클론 항체, 폴리클론 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 2-특이적 항체), 및 항체 단편을 비롯한 다양한 항체 구조를 포함한다.
용어 "완충액 성분" 은 용액인 경우 예를 들어, 산성 또는 염기성 성분의 부가 또는 방출로 인한 용액의 pH 값의 수치를 변화시킬 수 있는 성분을 나타낸다.
용어 "CH2 도메인" 은 대략 EU 위치 231 에서 EU 위치 340 까지 (Kabat 에 따른 EU 넘버링 시스템) 확장되는 항체 중쇄 폴리펩티드의 일부를 나타낸다. 하나의 구현예에서, CH2 도메인은 SEQ ID NO: 1: APELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVWDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQ E STYRWSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAK 의 아미노산 서열을 갖는다.
용어 "CH3 도메인" 은 대략 EU 위치 341 에서 EU 위치 446 까지 확장되는 항체 중쇄 폴리펩티드의 일부를 나타낸다. 하나의 구현예에서, CH3 도메인은 SEQ ID NO: 2: GQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG 의 아미노산 서열을 갖는다.
용어 항체의 "계열" 은 그의 중쇄가 소유하고 있는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 나타낸다. 5 가지 주요 계열의 항체: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM 이 있고, 이 중 여러 개는 추가로 하위계열 (이소형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2 로 나뉠 수 있다. 상이한 계열의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ 로 불린다.
용어 "인간 기원의 Fc-영역" 은 적어도 힌지 영역 일부, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 함유하는 인간 기원의 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 나타낸다. 하나의 구현예에서, 인간 IgG 중쇄 Fc-영역은 Cys226 으로부터, 또는 Pro230 으로부터, 중쇄의 카르복실-말단까지 확장된다. 하나의 구현예에서, Fc-영역은 SEQ ID NO: 10 의 아미노산 서열을 갖는다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 라이신 (Lys447) 은 존재할수도 존재하지 않을 수도 있다. 본원에서 다르게 구체화되지 않는다면, Fc-영역 또는 불변 영역 내의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌 [Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91 3242] 에 기재된 EU 인덱스라고도 불리는 EU 넘버링 시스템에 따른다.
용어 "FcRn" 은 인간 신생아 Fc-수용체를 나타낸다. FcRn 은 리소좀 분해 경로로부터 IgG 를 구제해내, 소거 감소 및 긴 반감기를 산출하는 기능을 한다. FcRn 은 하기 2 개의 폴리펩티드: 50 kDa 계열 I 주 조직적합성 복합체-유사 단백질 (α-FcRn) 및 15 kDa β2-마이크로글로불린 (β2m) 으로 이루어지는 헤테로이량체성 단백질이다. FcRn 은 IgG 의 Fc 도메인의 CH2-CH3 부분에 높은 친화성으로 결합한다. IgG 와 FcRn 사이의 상호작용은 엄격하게 pH 에 의존적이고, 1 개의 IgG 가 그의 2 개의 중쇄를 통해 2 개의 FcRn 분자에 결합하는 1:2 화학량론으로 발생한다 (Huber, A.H., et al., J. Mol. Biol. 230 (1993) 1077-1083). FcRn 결합은 산성 pH (pH < 6.5) 에서 엔도좀 내에서 발생하고, IgG 가 중성 세포 표면 (pH 약 7.4) 에서 방출된다. 상호작용의 pH-민감성 특성은 엔도좀의 산성 환경 내에서 수용체에 대한 결합에 의해 세포내 분해로부터 세포 내로 세포흡수된 IgG 의 FcRn-매개 보호를 용이하게 한다. 이후 FcRn 은 세포 표면으로의 IgG 의 재순환 및 세포 외부의 중성 pH 환경으로의 FcRn-IgG 복합체의 노출 시 혈류 내로의 후속 방출을 용이하게 한다.
용어 "Fc-영역의 FcRn 결합 부분" 은 대략 EU 위치 243 에서 EU 위치 261 까지, 대략 EU 위치 275 에서 EU 위치 293 까지, 대략 EU 위치 302 에서 EU 위치 319 까지, 대략 EU 위치 336 에서 EU 위치 348 까지, 대략 EU 위치 367 에서 EU 위치 393 까지, EU 위치 408 까지, 대략 EU 위치 424 에서 EU 위치 440 까지 확장되는 항체 중쇄 폴리펩티드의 일부를 나타낸다. 하나의 구현예에서, Kabat 의 EU 넘버링에 따른 하기 아미노산 잔기 중 하나 이상은 변형된 F243, P244, P245 P, K246, P247, K248, D249, T250, L251, M252, I253, S254, R255, T256, P257, E258, V259, T260, C261, F275, N276, W277, Y278, V279, D280, V282, E283, V284, H285, N286, A287, K288, T289, K290, P291, R292, E293, V302, V303, S304, V305, L306, T307, V308, L309, H310, Q311, D312, W313, L314, N315, G316, K317, E318, Y319, I336, S337, K338, A339, K340, G341, Q342, P343, R344, E345, P346, Q347, V348, C367, V369, F372, Y373, P374, S375, D376, I377, A378, V379, E380, W381, E382, S383, N384, G385, Q386, P387, E388, N389, Y391, T393, S408, S424, C425, S426, V427, M428, H429, E430, A431, L432, H433, N434, H435, Y436, T437, Q438, K439, 및 S440 (EU 넘버링) 이다.
용어 "전장 항체" 는 고유의 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 본원에 정의된 Fc-영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 나타낸다.
용어 "힌지 영역" 은 Kabat 의 EU 넘버링 시스템에 따라, 예를 들어 약 위치 216 에서 위치 약 230 까지의 CH1 도메인 및 CH2 도메인을 연결시키는 항체 중쇄 폴리펩티드의 일부를 나타낸다. 힌지 영역은 보통, 동일한 아미노산 서열을 갖는 2 개의 폴리펩티드로 이루어지는 이량체성 분자이다. 힌지 영역은 일반적으로 약 25 개의 아미노산 잔기를 포함하며, 항원 결합 영역이 독립적으로 움직이게 할 수 있도록 유연하다. 힌지 영역은 3 개의 도메인: 상부, 중간부, 및 하부 힌지 도메인으로 세분될 수 있다 (Roux, et al., J. Immunol. 161 (1998) 4083).
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주", 및 "숙주 세포 배양물" 은 상호교환적으로 사용되고, 이러한 세포의 자손을 비롯하여 외생 핵산이 도입되는 세포를 말한다. 숙주 세포에는 일차 형질전환된 세포 및 계대 횟수와 상관없이 그로부터 유래된 자손을 비롯해 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포" 가 포함된다. 자손은 모체 세포와 핵산 함량이 완전히 동일할 수는 없으나, 돌연변이를 가질 수 있다. 고유의 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선별된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 본원에 포함된다.
"인간화" 항체는 비-인간 과가변 영역 (HVR) 으로부터의 아미노산 잔기 및 인간 골격 영역 (FR) 으로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라성 항체를 말한다. 특정 구현예에서, 인간화 항체는 하나 이상의, 전형적으로는 2 개의 가변 도메인의 실질적으로 모두를 포함할 것이고, HVR (예를 들어, CDR) 의 모두 또는 실질적으로 모두는 비-인간 항체의 것에 상응하고, FR 의 모두 또는 실질적으로 모두는 인간 항체의 것에 상응한다. 인간화 항체는 임의로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어, 비-인간 항체의 "인간화 형태" 는 인간화를 겪은 항체를 말한다.
본원에 사용되는 용어 "과가변 영역" 또는 "HVR" 은 서열이 과가변적이고/거나, 구조적으로 정의된 루프 ("과가변 루프") 를 형성하는 항체 가변 도메인의 각각의 영역을 말한다. 일반적으로, 고유의 4 개 사슬 항체가 6 개의 HVR 을 포함한다; VH 에 3 개 (H1, H2, H3), 및 VL 에 3 개 (L1, L2, L3). HVR 은 일반적으로 과가변 루프 및/또는 "상보성 결정 영역" (CDR) 으로부터의 아미노산 잔기를 포함하는데, 상보성 결정 영역은 최고 서열 가변성의 것이고/이거나 항원 인지에 관여한다. 예시적 과가변 루프는 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), 및 96-101 (H3) 에서 발생한다 (Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917). 예시적 CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3) 은 아미노산 잔기 L1 의 24-34, L2 의 50-56, L3 의 89-97, H1 의 31-35B, H2 의 50-65, 및 H3 의 95-102 에서 발생한다 (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242). VH 내의 CDR1 을 제외하고는, CDR 은 일반적으로 과가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. CDR 은 또한 항원과 접촉하는 잔기인 "특이성 결정 잔기", 또는 "SDR" 을 포함한다. SDR 은 약칭-CDR (abbreviated-CDR), 또는 a-CDR 로 불리는 CDR 의 영역 내에 함유된다. 예시적 a-CDR (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2, 및 a-CDR-H3) 은 L1 의 아미노산 잔기 31-34, L2 의 50-55, L3 의 89-96, H1 의 31-35B, H2 의 50-58, 및 H3 의 95-102 에서 발생한다 (Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633 참조). 다르게 표시되지 않는다면, 가변 도메인 중의 HVR 잔기 및 기타 잔기 (예를 들어, FR 잔기) 는 본원에서 Kabat et al., supra 에 따라 넘버링된다.
"개체" 또는 "대상" 은 포유류이다. 포유류에는 가축 (예를 들어, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이), 토끼 및 설치류 (예를 들어, 마우스, 햄스터 및 래트) 가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 특정 구현예에서, 개체 또는 대상은 인간이다.
용어 "단일클론 항체" 는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득되는 항체, 즉, 예를 들어, 자연 발생적 돌연변이를 함유하는 또는 단일클론 항체 제제의 제조 동안 발생하는 가능한 변이체 항체를 제외하고 (이러한 변이체는 일반적으로 소량으로 존재함), 동일한 에피토프에 결합하는 및/또는 동일한 집단을 포함하는 개별 항체를 나타낸다. 전형적으로는 상이한 결정소 (에피토프) 에 대항하는 상이한 항체를 포함하는 폴리클론 항체 제제와는 반대로, 단일클론 항체 제제의 각각의 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정소에 대항한다. 그러므로, 수식어 "단일클론" 은 항체의 특성이 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득되는 것으로 나타내고, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 제조를 요구하는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단일클론 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 면역글로불린 유전자좌의 모두 또는 일부를 함유하는 형질전환 동물의 이용 방법을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있으며, 단일클론 항체의 제조를 위한 상기 방법 및 기타 예시적인 방법은 본원에 기재된다.
"고유의 항체" 는 다양한 구조를 가진 자연 발생적 면역글로불린 분자를 말한다. 예를 들어, 고유의 IgG 항체는 디술피드-결합된 2 개의 동일한 경쇄 및 2 개의 동일한 중쇄로 구성된, 약 150,000 Dalton 의 헤테로사량체 당단백질이다. N- 에서 C-말단까지, 각각의 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인이라고도 불리는 가변 영역 (VH) 과, 후속되는 3 개의 불변 도메인 (CH1, CH2, 및 CH3) 을 갖는다. 유사하게는, N- 에서 C-말단까지, 각각의 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인이라고도 불리는 가변 영역 (VL) 과, 후속되는 불변 경쇄 (CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열에 근거해, 카파 (κ) 및 람다 (λ) 라고 불리는 2 가지 유형 중 하나로 지정될 수 있다.
용어 "비-자연 발생적 아미노산 잔기" 는 폴리펩티드 사슬 내의 인접 아미노산 잔기에 공유 결합될 수 있는, 상기 나열된 바와 같은 자연 발생적 아미노산 잔기 이외의 아미노산 잔기를 나타낸다. 비-자연 발생적 아미노산 잔기의 예는 노르류신, 오르니틴, 노르발린, 호모세린이다. 추가의 예는 문헌 [Ellman, et al., Meth. Enzym. 202 (1991) 301-336] 에 나열된다. 비-자연 발생적 아미노산 잔기의 예시적 합성 방법은 예를 들어, 문헌 [Noren, et al., Science 244 (1989) 182 및 Ellman et al., supra] 에 보고되어 있다.
참조 폴리펩티드 서열과 관련하여 "백분율 (%) 아미노산 서열 일치성" 은 서열의 정렬 및 갭의 도입 후 (필요하다면 최대 백분율 서열 일치성을 달성하기 위해) 서열 일치성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않고, 참조 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 일치하는 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 백분율 아미노산 서열 일치성을 측정하려는 목적을 위한 정렬은 예를 들어, 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하는, 당업계의 기술인 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전장에 대해 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열 정렬을 위한 적합한 파라미터를 측정할 수 있다. 그러나 본원의 목적을 위해, % 아미노산 서열 일치성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2 를 사용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 [Genentech, Inc.] 에 의해 작성되었고, 소스 코드는 [U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559] 에 사용자 문서로 제출되고, 미국 저작권 등록번호 TXU510087 로 등록되었다. ALIGN-2 프로그램은 [Genentech, Inc., South San Francisco, California] 에서 공개적으로 이용가능하고, 또는 소스 코드로부터 편찬될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D 를 포함하는 UNIX 작동 시스템에서 사용하기 위해 편찬되어야만 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고 변하지 않는다.
ALIGN-2 가 아미노산 서열 비교를 위해 사용되는 경우, 제시된 아미노산 서열 B 에 대한, 이것과의 또는 이에 대항하는 제시된 아미노산 서열 A 의 % 아미노산 서열 일치성 (이것은 제시된 아미노산 서열 B 에 대한, 이것과의 또는 이에 대항하는 특정 % 아미노산 서열 일치성을 갖거나 포함하는 제시된 아미노산 서열 A 로서 대안적으로 표현될 수 있음) 은 다음과 같이 계산된다:
100 × 분수 X/Y
(식 중, X 는 A 및 B 의 프로그램의 정렬 내의 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2 에 의한 일치하는 매치로서 점수를 얻은 아미노산 잔기의 수이고, Y 는 B 내의 아미노산 잔기의 총 수임). 아미노산 서열 A 의 길이가 아미노산 서열 B 의 길이와 동일하지 않다면, B 에 대한 A 의 % 아미노산 서열 일치성은 A 에 대한 B 의 % 아미노산 서열 일치성과 동일하지 않을 것임을 인식해야할 것이다. 다르게 구체적으로 언급되지 않는다면, 본원에서 사용되는 모든 % 아미노산 서열 일치성 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 이전 단락에 기재된 바와 같이 수득된다.
용어 "약학 제형" 은 내부에 함유되는 활성 성분의 생물학적 활성은 유효하도록 허용하는 형태이며, 제형을 투여할 대상에게 용납할 수 없는 독성인 부가적인 성분은 함유하지 않는 제제를 말한다.
"약학적으로 허용가능한 담체" 는 대상에게 무독성인 활성 성분 이외의 약학 제형 내의 성분을 말한다. 약학적으로 허용가능한 담체에는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 방부제가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 "양성 선형 pH 구배" 는 낮은 (즉, 더욱 산성) pH 값에서 출발하여 높은 (즉, 덜 산성, 중성 또는 알칼리성) pH 값에서 종료되는 pH 구배를 나타낸다. 하나의 구현예에서, 양성 선형 pH 구배는 약 5.5 의 pH 값에서 출발하여 약 8.8 의 pH 값에서 종료된다.
용어 "음성 선형 pH 구배" 는 높은 (즉, 중성 또는 알칼리성) pH 값에서 출발하여 낮은 (즉, 중성 또는 산성) pH 값에서 종료되는 pH 구배를 나타낸다. 하나의 구현예에서, 음성 선형 pH 구배는 약 7.4 의 pH 값에서 시작하여 약 6.0 의 pH 값에서 종료된다.
본원에 사용되는 바와 같은, "치료" (및 이의 문법적 변형, 예컨대 "치료하다" 또는 "치료하기") 는 치료하고자 하는 개인의 자연적인 과정을 변형하고자 하는 시도로의 임상적 개입을 말하며, 예방을 위해 또는 임상 병리학의 과정 동안 수행될 수 있다. 원하는 치료 효과에는 질환의 발병 또는 재발의 예방, 증상의 경감, 질환의 임의의 직접적인 또는 간접적인 병리학 결과의 해소, 전이 예방, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 경감 또는 완화 및 차도 또는 개선된 예후가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 질환의 발달을 지연시키거나 질환의 진행을 감속시키기 위해 사용된다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인" 은 항원에 대한 항체의 결합에 수반되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 말한다. 고유의 항체의 중쇄 및 경쇄 (VH 및 VL, 각각) 의 가변 도메인은 일반적으로, 각각의 도메인이 4 개의 보존된 골격 영역 (FR) 및 3 개의 과가변 영역 (HVR) 을 포함하는 유사한 구조를 갖는다 (예를 들어, Kindt, T.J., et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), 페이지 91 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 게다가, 특정 항원에 결합하는 항체는 상보적 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 각각 스크리닝하기 위해 항원에 결합하는 항체로부터 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리될 수 있다 (예를 들어, Portolano, S., et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T., et al., Nature 352 (1991) 624-628 참조).
용어 "변이체", "개질 항체", 및 "개질 융합 폴리펩티드" 는 모체 분자의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 갖는 분자를 나타낸다. 전형적으로는 이러한 분자는 변형, 삽입 또는 결실을 하나 이상 갖는다. 하나의 구현예에서, 개질 항체 또는 개질 융합 폴리펩티드는 자연 발생적이 아닌 Fc-영역의 일부를 적어도 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 분자는 모체 항체 또는 모체 융합 폴리펩티드와 100 % 미만의 서열 일치성을 갖는다. 하나의 구현예에서, 변이체 항체 또는 변이체 융합 폴리펩티드는 모체 항체 또는 모체 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열과 약 75 % 내지 100 % 미만의 아미노산 서열 일치성을 갖는, 특히 약 80 % 내지 100 % 미만, 특히 약 85 % 내지 100 % 미만, 특히 약 90 % 내지 100 % 미만, 특히 약 95 % 내지 100 % 미만의 아미노산 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 하나의 구현예에서, 모체 항체 또는 모체 융합 폴리펩티드 및 변이체 항체 또는 변이체 융합 폴리펩티드는 1 개 (단일), 2 개 또는 3 개의 아미노산 잔기(들) 이 상이하다.
II. 조성물 및 방법
인간 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 는 IgG 이화작용에서 중요한 역할을 담당한다. IgG 시험관 내 FcRn 결합 특성/특징은 생체 내 약동학 특성의 지표이다. 이러한 시험관 내 방법은 반복되는 생체 내 연구를 회피할 수 있기 때문에 (동물 실험, 시간 및 비용 감소) 항체 개발 동안 가치가 클 것이다. 지금까지, 이러한 분석은 일반적으로 플라즈몬 표면 공명 (SPR) 어세이를 사용하여 수행되어 왔다 (Wang, W., et al., Drug Metab. Disp. 39 (2011) 1469-1477; Datta-Mannan, A., et al., Drug Metab. Disp. 40 (2012) 1545-1555; Vaughn, D.E. and Bjorkman, P.J., Biochemistry 36 (1997) 9374-9380; Raghavan, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 11200-11204; Martin, W.L. and Bjorkman, P.J., Biochemistry 38 (1999) 12639-12647). 열량측정 및 비대칭 유동장 유동 분획법 (flow field flow fractionation method) 이 또한 FcRn 에 대한 IgG 결합 친화력을 평가하기 위해 기재되어 있다 (Huber, A.H., et al., J. Mol. Biol. 230 (1993) 1077-1083; Pollastrini, J., et al., Anal. Biochem. 414 (2011) 88-98). 복합 어세이 외에도, SPR 에 의해 측정된 시험관 내 FcRn 결합 파라미터와 생체 내 항체의 혈청 반감기 사이의 상관관계를 연구하는 여러 연구에서는 개선된 결합 반응 조건 및 적합한 모델링에도 불구하고 이러한 상관관계를 입증하는데는 지금까지 실패하였다 (Gurbaxani, B., et al., Mol. Immunol. 43 (2006) 1462-1473; Gurbaxani, B.M. and Morrison, S.L., Mol. Immunol. 43 (2006) 1379-1389; Gurbaxani, B., Clin. Immunol. 122 (2007) 121-124). SPR 기술에 의해 측정되는 pH 6 및 중성 pH 에서의 FcRn 에 대한 IgG1 의 친화성을 개선하기 위한 IgG1 의 Fc-영역의 조작은 사이노몰거스 원숭이에서 약동학 개선이라는 결과를 보이지는 않았다 (Yeung, Y.A., et al., J. Immunol. 182 (2009) 7663-7671). 그러나, pH 7.4 에서 FcRn 에 대한 수반되는 유의한 결합 없이 N434A IgG1 변이체에서의 pH 6 FcRn 친화성의 오직 적절한 증가는 영장류에서 개선된 약동학을 산출하였고 pH 7.4 에서의 FcRn 방출의 중요성을 나타낸다 (상기 Yeung, Y.A., 참조).
공지된 방법의 조합으로 FcRn 친화성 크로마토그래피의 결과에 필적할만한 분석 결과를 달성할 수는 있으나 복잡성 및 노력에 대한 비용이 증가된다.
현행의 표준 방법은 엔도좀 결합을 위해 산성 pH, 그러나 세포 표면에서의 IgG 방출을 위해 중성 pH 를 필요로 하는 FcRn 결합 특징의 생리학적 pH 의존성을 적합하게 반영할 수 없다. pH 환경은 FcRn 분자의 자가-연합 특성에 영향을 준다. 현행의 방법은 하나의 제시된 pH 에서의 표준 조건 하에 작동하며, 따라서 IgG-FcRn 상호작용의 로부스트 동역학 평가를 방해하는 복합 FcRn-IgG 상호작용의 스냅샷만을 검출한다. 이것은 또한 여러 연구에서 발견되는 (상기 참조) 시험관 내 FcRn 분석과 생체 내 약동학 사이의 FcRn 친화성의 결여된 상관관계에 대한 이유 중 하나일 수 있다.
IgG-FcRn 상호작용의 SPR 분석은 샘플의 예상되는 또는 일탈적 결합 특성을 나타내는 질적 결과는 제공하지만, 일탈적 결합의 이유에 대한 힌트를 주거나 일탈적 결합을 하고 있는 항체의 양에 대한 양적 추정은 제공하지 않는다. 질량 분광 분석은 또한 IgG 분자의 방해된 완전성의 질적 정보를 제공할 뿐이다. 반대로, FcRn 친화성 크로마토그래피는 1:2, 1:1 및 2:2 화학량론을 비롯한 화학량론의 혼합으로의 우세한 2:1 화학량론 및 샘플에서 발견되는 상이한 피크의 분리를 미세하게 조절하기 위해 조정될 수 있는 pH 구배를 가진, 적합한 생리학적 조건 하에서 샘플을 분석하는 것을 가능하게 한다. 상이한 피크는 이들의 각각의 곡선 하 면정에 의해 정량화될 수 있고, 각각의 피크에 상응하는 용리액은 예를 들어, 기능성 결정, 재-크로마토그래피 또는 질량 분광 분석을 위해 이차 분석에 받아들여진다.
부가적으로는, 오늘날 공지된 그리고 또한 미래에 밝혀질 다양한 질환을 치료하기 위한 치료적 섭생을 제공하기 위해, 맞춤 제작된 항체 뿐 아니라 Fc-부분 함유 폴리펩티드에 대한 필요성이 존재한다.
항체 또는 Fc-부분 함유 융합 폴리펩티드의 FcRn 결합 특징의 맞춤 제작을 위해, Fc-부분 매개 효과기 기능에 관여하는 잔기를 개질하고, 산출되는 개질 항체 및 융합 폴리펩티드를 시험해야만 한다. 요구되는 특징이 충족되지 않는다면 동일한 과정을 다시 수행한다.
하나의 구현예에서, Fc-부분은 FcRn 에 대한 결합을 매개하는 Fc-영역의 분획이다.
그러므로, 간단한 크로마토그래피 방법에 근거하여 개질 항체의 특징 변화를 예측하고 개질 항체에서의 특징 변화를 분석하기 위해 생체 내 연구를 필요로 하지 않는 방법을 제공하는 것이 유리할 것이다.
일부 경우에서 연장된 반감기를 갖는 항체가 요구된다. 예를 들어, 치료를 필요로 하는 환자의 순환 내에서 연장된 반감기를 갖는 약물은 투여 감소 또는 투여 간격 증가가 필요해진다. 이러한 항체는 또한 예를 들어 종양과 같은 질환 부위에 대한 노출 증가라는 장점을 갖는다.
본원에 보고되는 하나의 양상은 친화성 크로마토그래피 리간드로서의 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 및 베타-2-마이크로글로불린의 부동화된 비-공유 복합체의 용도이다.
친화성 크로마토그래피 리간드로서 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 및 베타-2-마이크로글로불린의 부동화된 비-공유 복합체를 포함하는 친화성 크로마토그래피 컬럼이 예상치못한 안정성을 갖는다는 것이 발견되었다. 이것은 성능 (선택성 및/또는 결합 능력) 에서의 손실 없이 100 회 이상의 크로마토그래피 사이클 내지 약 200 회 이하의 크로마토그래피 사이클 (평형 - 분리 - 재생) 에 대해 사용될 수 있다.
또한 보고되는 것은 매트릭스 결합 크로마토그래피 작용기가 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 및 베타-2-마이크로글로불린의 비-공유 복합체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 매트릭스 및 매트릭스 결합 크로마토그래피 작용기를 포함하는 친화성 크로마토그래피 컬럼이다.
본원에 보고되는 하나의 양상은 항체 및 참조 항체의 체류 시간 비를 측정함으로써 항체의 생체 내 반감기의 측정을 위한 리간드로서의 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 및 베타-2-마이크로글로불린의 비-공유 복합체를 포함하는 크로마토그래피 물질의 용도이다. 하나의 구현예에서, 참조 항체는 전장 인간 IgG1 항체이다.
또한 본원에는 항체 및 참조 항체의 본원에 보고된 FcRn 친화성 컬럼 상에서 측정된 체류 시간의 비를 측정함으로써 참조 항체와 관련된 항체의 생체 내 반감기를 측정하는 방법이 보고되어 있다.
본원에 보고된 하나의 양상은 Fc-부분을 적어도 포함하는 항체 또는 융합 폴리펩티드의 분리를 위한 리간드로서 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 및 베타-2-마이크로글로불린의 비-공유 복합체를 포함하는 크로마토그래피 물질의 용도이다.
또한 본원에는 Fc-부분을 적어도 포함하는 항체 또는 융합 폴리펩티드의 분리 방법이 보고되어 있다.
하나의 구현예에서, 분리는 정제, 제조 및 분석으로부터 선택된다.
본원에 보고된 하나의 양상은 IgG3 하위계열의 항체로부터 IgG1 하위계열의 항체의 분리를 위한 리간드로서의 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 및 베타-2-마이크로글로불린의 비-공유 복합체를 포함하는 크로마토그래피 물질의 용도이다.
본원에 보고된 하나의 양상은 항체의 메티오닌 산화를 측정하기 위한 리간드로서의 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 및 베타-2-마이크로글로불린의 비-공유 복합체를 포함하는 크로마토그래피 물질의 용도이다.
본원에는 본원에 보고된 친화성 크로마토그래피 방법을 사용하는 항체의 Fc-부분 내의 FcRn 결합 산화된 메티오닌 잔기 상에 대한 영향을 측정하는 방법이 보고되어 있다.
본원에 보고된 하나의 양상은 항체의 올리고머화 수준을 측정하기 위한 리간드로서의 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 및 베타-2-마이크로글로불린의 비-공유 복합체를 포함하는 크로마토그래피 물질의 용도이다.
본원에는 본원에 보고된 친화성 크로마토그래피 방법을 사용하는 항체의 올리고머화 수준을 측정하는 방법이 보고되어 있다.
일반적으로, 본원에 보고된 방법에 대한 출발점은 FcRn 에 대한 결합을 특징으로 하는 모체 항체 또는 모체 융합 폴리펩티드이다.
본원에 보고된 하나의 양상은 모체 항체 또는 모체 융합 폴리펩티드와 비교하여 FcRn 에 대해 변형된 결합 친화력을 갖는 개질 항체 또는 개질 융합 폴리펩티드에 대한 Fc-영역의 FcRn 결합 부분을 적어도 포함하는, 모체 항체 또는 모체 융합 폴리펩티드의 개질 항체 또는 개질 융합 폴리펩티드의 라이브러리를 스크리닝하기 위한 리간드로서의 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 및 베타-2-마이크로글로불린의 비-공유 복합체를 포함하는 크로마토그래피 물질의 용도이다.
본원에는 하기 단계를 포함하는, 모체 항체 또는 모체 융합 폴리펩티드와 비교하여 FcRn 에 대해 변형된 결합 친화력을 갖는 개질 항체 또는 개질 융합 폴리펩티드에 대한 Fc-영역의 FcRn 결합 부분을 적어도 포함하는, 모체 항체 또는 모체 융합 폴리펩티드의 개질 항체 또는 개질 융합 폴리펩티드의 라이브러리를 스크리닝하는 방법이 보고되어 있다:
(a) 본원에 보고된 FcRn 친화성 크로마토그래피 컬럼에 대해 라이브러리의 개별 일원 및 모체 항체 또는 모체 융합 폴리펩티드를 적용하는 단계;
(b) pH 구배로 라이브러리의 개별 일원을 회수하고 개별 체류 시간을 측정하는 단계; 및
(c) 모체 항체 또는 모체 융합 폴리펩티드와 비교하여 FcRn 에 대해 변형된 결합 친화력을 갖는 상기 항체 또는 융합 폴리펩티드를 선택하는 단계.
본원에는 폴리펩티드의 혼합물로부터 Fc-영역의 FcRn-결합 부분을 적어도 포함하는 항체 또는 융합 폴리펩티드를 제조하는 방법이 보고되어 있으며, 상기 방법은 본원에 보고된 FcRn 친화성 컬럼에 혼합물을 적용하고 Fc-영역의 FcRn-결합 부분을 적어도 포함하는 항체 또는 융합 폴리펩티드를 pH 구배로 용리해내어, 항체 또는 융합 폴리펩티드를 정제하는 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서, Fc-영역의 FcRn-부분은 인간 Fc-영역, 또는 마우스 Fc 영역, 또는 사이노몰거스 원숭이 Fc-영역, 또는 토끼 Fc-영역, 또는 햄스터 Fc 영역의 것이다.
단수형 "a" 또는 "an" 은 1 개 또는 2 개 또는 3 개 또는 4 개 또는 5 개 또는 6 개 및 109 개 이하를 나타낸다.
하나의 구현예에서, 반응/생성 혼합물 또는 미정제 또는 부분적으로 정제된 배양 상청액을 제 1 pH 값에서 FcRn 친화성 컬럼에 적용하고, 항체 또는 융합 폴리펩티드를 제 2 pH 값에서 FcRn 친화성 컬럼으로부터 회수한다.
하나의 구현예에서, 제 1 pH 값은 약 pH 3.5 내지 약 pH 7.5 이다. 하나의 구현예에서, 제 1 pH 값은 약 pH 4 내지 약 pH 7 이다. 하나의 구현예에서, 제 1 pH 값은 약 pH 4.5 내지 약 pH 6.5 이다. 하나의 구현예에서, 제 1 pH 값은 약 pH 5 내지 약 pH 6 이다. 하나의 구현예에서, 제 1 pH 값은 약 pH 5 또는 약 pH 5.5 또는 약 pH 6 이다.
하나의 구현예에서, 제 1 pH 값은 약 pH 3.5, 약 pH 3.6, 약 pH 3.7, 약 pH 3.8, 약 pH 3.9, 약 pH 4.0, 약 pH 4.1, 약 pH 4.2, 약 pH 4.3, 약 pH 4.4, 약 pH 4.5, 약 pH 4.6, 약 pH 4.7, 약 pH 4.8, 약 pH 4.9, 약 pH 5.0, 약 pH 5.1, 약 pH 5.2, 약 pH 5.3, 약 pH 5.4, 약 pH 5.5, 약 pH 5.6, 약 pH 5.7, 약 pH 5.8, 약 pH 5.9, 약 pH 6.0, 약 pH 6.1, 약 pH 6.2, 약 pH 6.3, 약 pH 6.4, 약 pH 6.5, 약 pH 6.6, 약 pH 6.7, 약 pH 6.8, 약 pH 6.9, 약 pH 7.0, 약 pH 7.1, 약 pH 7.2, 약 pH 7.3, 약 pH 7.4, 및 약 pH 7.5 로부터 선택된다.
하나의 구현예에서, 제 2 pH 값은 약 pH 8 내지 약 pH 9.5 이다. 하나의 구현예에서, 제 2 pH 값은 약 pH 8.5 내지 약 pH 9 이다. 하나의 구현예에서, 제 2 pH 값은 약 pH 8.8 이다.
하나의 구현예에서, 제 2 pH 값은 약 pH 8.0, 약 pH 8.1, 약 pH 8.2, 약 pH 8.3, 약 pH 8.4, 약 pH 8.5, 약 pH 8.6, 약 pH 8.7, 약 pH 8.8, 약 pH 8.9, 약 pH 9.0, 약 pH 9.1, 약 pH 9.2, 약 pH 9.3, 약 pH 9.4, 및 약 pH 9.5 로부터 선택된다.
하나의 구현예에서, 약 pH 3.5, 약 pH 3.6, 약 pH 3.7, 약 pH 3.8, 약 pH 3.9, 약 pH 4.0, 약 pH 4.1, 약 pH 4.2, 약 pH 4.3, 약 pH 4.4, 약 pH 4.5, 약 pH 4.6, 약 pH 4.7, 약 pH 4.8, 약 pH 4.9, 약 pH 5.0, 약 pH 5.1, 약 pH 5.2, 약 pH 5.3, 약 pH 5.4, 약 pH 5.5, 약 pH 5.6, 약 pH 5.7, 약 pH 5.8, 약 pH 5.9, 약 pH 6.0, 약 pH 6.1, 약 pH 6.2, 약 pH 6.3, 약 pH 6.4, 약 pH 6.5, 약 pH 6.6, 약 pH 6.7, 약 pH 6.8, 약 pH 6.9, 약 pH 7.0, 약 pH 7.1, 약 pH 7.2, 약 pH 7.3, 약 pH 7.4, 및 약 pH 7.5 의 제시된 제 1 pH 값 각각은 약 pH 8.0, 약 pH 8.1, 약 pH 8.2, 약 pH 8.3, 약 pH 8.4, 약 pH 8.5, 약 pH 8.6, 약 pH 8.7, 약 pH 8.8, 약 pH 8.9, 약 pH 9.0, 약 pH 9.1, 약 pH 9.2, 약 pH 9.3, 약 pH 9.4, 및 약 pH 9.5 의 제시된 제 2 pH 값 각각과 조합된다.
본원에 보고된 하나의 양상은 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 에 대한 변경된 결합을 나타내는 Fc-영역의 FcRn-결합 부분을 적어도 포함하는 (예를 들어, IgG1 과 같은 면역글로불린의 불변 도메인) 항체 또는 융합 폴리펩티드를 확인하기 위한 리간드로서의 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 및 베타-2-마이크로글로불린의 비-공유 복합체를 포함하는 크로마토그래피 물질의 용도이다.
본원에는 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 에 대한 변경된 결합을 나타내는 Fc-영역의 FcRn-결합 부분을 적어도 포함하는 (예를 들어, IgG1 과 같은 면역글로불린의 불변 도메인) 항체 또는 융합 폴리펩티드를 확인하는 방법이 제공된다.
이러한 개질 항체 또는 융합 폴리펩티드는 모체 항체 또는 융합 폴리펩티드와 비교하는 경우 또는 참조 항체 또는 참조 융합 단백질과 비교하는 경우 FcRn 에 대한 결합이 증가 또는 감소하므로, 혈청 내 반감기가 각각 증가 또는 감소한다.
FcRn 에 대해 증가된 친화성을 갖는 Fc-영역 변이체 (즉, 모체 항체 또는 참조 항체와 비교해 본원에 보고된 바와 같이 FcRn 컬럼 상에서의 체류 시간이 증가되었으나 여전히 pH 7.4 의 pH 값 이전에 용리됨) 는 FcRn 에 대해 감소된 친화성을 갖는 것에 비해 더 긴 혈청 반감기를 갖는 것으로 예상된다. FcRn 에 대해 증가된 친화성을 갖는 Fc-영역 변이체는 투여된 항체 또는 융합 폴리펩티드의 긴 반감기가 요구되는 포유류, 특히 인간의 치료 방법, 예컨대 만성 질환 또는 장애의 치료에 적용된다. FcRn 에 대해 감소된 친화성을 갖는 Fc-영역 변이체는 투여된 항체 또는 융합 폴리펩티드의 짧은 반감기가 요구되는 포유류, 특히 인간의 치료 방법, 예컨대 생체 내 진단 이미지화에 적용된다.
FcRn 결합 친화력이 감소된 Fc-영역 변이체는 태반을 통과할 수 있을 것이므로, 임산부 특히 복중 태아에서의 질환 또는 장애의 치료에 사용될 수 있다. 게다가, 감소된 FcRn 결합 친화력은 뇌, 신장 및/또는 간에 대한 적용/수송을 위해 의도되는 약물에 대해 바람직할 수 있다.
본원에 보고된 하나의 양상은 맥관구조로부터 신장 사구체의 상피를 가로질러 수송 감소를 나타내는 항체 또는 융합 폴리펩티드를 확인하기 위한, 리간드로서의 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 및 베타-2-마이크로글로불린의 비-공유 복합체를 포함하는 크로마토그래피 물질의 용도이다.
하나의 구현예에서, 본원에 보고된 바와 같은 개질 Fc 영역을 포함하는 항체 또는 융합 폴리펩티드는 맥관구조로부터 신장 사구체의 상피를 가로질러 수송 감소를 나타낸다.
본원에 보고된 하나의 양상은 뇌로부터 관 공간 내로 혈액 뇌 관문을 가로질러 수송 감소를 나타내는 항체 또는 융합 폴리펩티드를 확인하기 위한, 리간드로서의 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 및 베타-2-마이크로글로불린의 비-공유 복합체를 포함하는 크로마토그래피 물질의 용도이다.
하나의 구현예에서, 본원에 보고된 바와 같은 인간 기원의 개질 Fc 영역을 포함하는 항체 또는 융합 폴리펩티드는 뇌로부터 관 공간 내로 혈액 뇌 관문 (BBB) 을 가로질러 수송 감소를 나타낸다.
본원에는 Fc-영역의 FcRn 결합 부분을 적어도 포함하는 이러한 개질 항체 및 융합 폴리펩티드의 제조 방법 및 이러한 개질 항체 및 융합 폴리펩티드의 사용 방법이 보고되어 있다.
하나의 구현예에서, 본원에 보고된 바와 같은 항체 또는 융합 폴리펩티드는 하나 이상의 결합 부위 (예를 들어, 하나 이상의 항원 결합 부위, 또는 하나 이상의 수용체 결합 부위, 또는 하나 이상의 리간드 결합 부위) 를 포함한다. 하나의 구현예에서, 본원에 보고된 바와 같은 항체 또는 융합 폴리펩티드는 2 개 이상의 결합 부위 (예를 들어, 2 개 이상의 항원 결합 부위, 또는 2 개 이상의 수용체 결합 부위, 또는 2 개 이상의 리간드 결합 부위, 또는 하나 이상의 항원 결합 부위 및 하나 이상의 수용체 결합 부위, 또는 하나 이상의 항원 결합 부위 및 하나 이상의 리간드 결합 부위, 또는 하나 이상의 수용체 결합 부위 및 하나 이상의 리간드 결합 부위) 를 포함한다. 하나의 구현예에서, 본원에 보고된 바와 같은 항체 또는 융합 폴리펩티드는 3 개의 결합 부위 (예를 들어, 3 개 이상의 항원 결합 부위, 또는 3 개 이상의 수용체 결합 부위, 또는 3 개 이상의 리간드 결합 부위, 또는 상기의 3 개 이상의 결합 부위의 임의의 혼합물) 를 포함한다. 하나의 구현예에서, 본원에 보고된 바와 같은 항체 또는 융합 폴리펩티드는 4 개의 결합 부위를 포함한다.
본원에 보고된 모든 양상 중 하나의 양상에서, Fc-영역의 적어도 일부는 인간 기원의 Fc-영역의 적어도 일부이다. 본원에 보고된 모든 양상 중 하나의 양상에서, FcRn 은 인간 FcRn, 사이노몰거스 원숭이 FcRn, 마우스 FcRn, 래트 FcRn, 양 FcRn, 개 FcRn 및 토끼 FcRn 로부터 선택된다.
본원에 보고된 모든 양상 중 하나의 양상에서, 베타-2-마이크로글로불린은 FcRn 과 동일한 종으로부터 유래된다.
본원에 보고된 모든 양상 중 하나의 양상에서, 베타-2-마이크로글로불린은 FcRn 과 상이한 종으로부터 유래된다.
하나의 구현예에서, Fc-영역 또는 Fc-영역의 FcRn 결합 부위는 임의의 이소형의 중쇄로부터 유래된다.
하나의 구현예에서, Fc-영역의 적어도 일부는 인간 기원의 CH2 도메인의 아미노산 잔기 282-340 (SEQ ID NO: 01, Kabat 에 따른 넘버링) 을 적어도 포함한다. 하나의 구현예에서, Fc-영역의 적어도 일부는 완전한 CH2 도메인 (Kabat 에 따른 EU 넘버링에 따른 인간 기원의 항체 중쇄 폴리펩티드 Fc-영역의 약 아미노산 잔기 231-340) 을 포함한다. 하나의 구현예에서, Fc-영역의 적어도 일부는 적어도 CH2 도메인, 및 힌지 영역 (EU 넘버링에 따른 인간 기원의 항체 중쇄 폴리펩티드 Fc 영역의 약 아미노산 잔기 216-230) 또는 CH3 도메인 (EU 넘버링에 따른 인간 기원의 항체 중쇄 폴리펩티드 Fc-영역의 약 아미노산 잔기 341-446) 중 하나 이상을 포함한다. 하나의 구현예에서, Fc-영역의 적어도 일부는 인간 기원의 항체 중쇄의 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 하나의 구현예에서, Fc-영역의 적어도 일부는 인간 기원의 항체 중쇄 Fc-영역의 힌지, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함한다. 인간 기원의 Fc-영역 또는 인간 기원 부분의 Fc-영역의 FcRn 결합 부분은 예컨대 IgG1 (SEQ ID NO: 03), IgG2 (SEQ ID NO: 04), IgG3 (SEQ ID NO: 05), 및 IgG4 (SEQ ID NO: 06) 와 같은 임의의 이소형의 중쇄로부터 유래될 수 있다. 하나의 구현예에서, 인간 이소형은 IgG1 이다.
모체 항체의 Fc-영역 또는 모체 융합 폴리펩티드에 포함된 Fc-영역은 상이한 면역글로불린 분자 및/또는 상이한 면역글로불린 이소형으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 모체 항체 또는 모체 융합 폴리펩티드는 IgG1 이소형 면역글로불린 유래의 CH2 도메인 및 IgG3 이소형 면역글로불린 유래의 힌지 영역을 포함할 수 있다. 또한 예를 들어, 모체 항체 또는 모체 융합 폴리펩티드는 이들이 인간 기원의 것이라면, 일부분은 IgG1 면역글로불린 하위형으로부터 유래되고 일부분은 IgG3 면역글로불린 하위형으로부터 유래되는 힌지 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 모체 항체 또는 모체 융합 폴리펩티드는 일부분은 IgG1 면역글로불린 이소형으로부터 유래되고, 일부분은 IgG4 면역글로불린 이소형으로부터 유래되는 키메라성 힌지 영역을 포함할 수 있다.
본원에 보고되는 모체 항체 또는 모체 융합 폴리펩티드는 하나 이상의 Fc-영역 또는 이의 하나의 FcRn-결합 부분을 포함한다. 하나의 구현예에서, 모체 항체 또는 모체 폴리펩티드는 하나 이상의 결합 도메인 (하나의 구현예에서 항원 결합 도메인, 수용체 결합 도메인, 또는 리간드 결합 도메인으로부터 선택됨) 을 부가적으로 포함한다. 하나의 구현예에서, 모체 항체 또는 모체 융합 폴리펩티드는 하나 이상의 결합 도메인 및 하나 이상의 Fc-영역 또는 이의 하나의 FcRn-결합 부분을 포함한다. 하나의 구현예에서, 모체 항체 또는 모체 융합 폴리펩티드는 2 개의 결합 도메인 및 2 개의 Fc-영역 또는 이의 2 개의 FcRn-결합 부분을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본원에 보고되는 모체 항체 또는 모체 융합 폴리펩티드는 생물학적 효과를 매개하는 표적에 특이적으로 결합하고 (하나의 구현예에서, 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 리간드 또는 리간드에 결합할 수 있는 세포 표면 수용체), 하나 이상의 Fc-영역 또는 이의 FcRn 결합 부분과 함께 세포로의 음성 또는 양성 신호의 전달을 매개하는 하나 이상의 결합 도메인을 포함한다. 하나의 구현예에서, 생물학적 효과의 매개는 약 pH 7.4 의 pH 값에서 일어난다. 하나의 구현예에서, 모체 항체 또는 모체 융합 폴리펩티드는 감소 또는 제거를 위해 표적된 항원 (하나의 구현예에서, 세포 표면 항원 또는 가용성 항원) 에 특이적인 하나 이상의 결합 도메인 및 하나 이상의 Fc-영역 또는 이의 하나의 FcRn 결합 부분을 포함한다.
표적에 특이적으로 결합하는 항체는 관련 항원 (예를 들어, 정제된 항원, 상기 항원을 포함하는 세포 또는 세포 추출물, 또는 이러한 항원을 코딩하는 DNA) 및 임의로 아쥬반트의 복합적 피하 또는 복강내 주사에 의해 포유류에서 상승될 수 있다.
하나의 구현예에서, 항체는 단일클론 항체이다.
하나의 구현예에서, 본원에 보고되는 융합 폴리펩티드는 FcRn 결합 부분에 작동가능하게 연결된 항체 단편 (예를 들어, scFv 분자, 미니체, 4원자가 미니체, 또는 디아바디(diabody)) 을 포함한다. 하나의 구현예에서, FcRn 결합 부분은 완전 항체 중쇄 Fc-영역이다.
하나의 구현예에서, 모체 항체는 2-특이적 항체이고 또는 모체 융합 폴리펩티드는 2-특이적 항체 또는 2-특이적 항체 단편을 포함한다.
하나의 구현예에서, 모체 항체는 키메라성 항체이다.
하나의 구현예에서, 모체 융합 폴리펩티드는 Fc-영역의 FcRn-결합 부분을 적어도 포함한다. 하나의 구현예에서, 본원에 보고된 바와 같은 모체 융합 폴리펩티드는 각각 하나의 결합 부위를 포함하는 하나 이상의 결합 도메인(들) 을 포함한다. 모체 융합 폴리펩티드는 2-특이적 (첫번째 표적에 특이적으로 결합하는 하나의 결합 부위 및 두번째 표적에 특이적으로 결합하는 두번째 결합 부위를 가짐) 또는 다가 (동일한 표적에 특이적으로 결합하는 2 개의 결합 부위를 가짐) 일 수 있다.
모든 이전 양상의 하나의 구현예에서, pH 는 약 pH 5.5 에서 약 pH 8.8 까지의 구배이다.
하나의 구현예에서, pH 는 약 pH 5 에서 pH 6, 또는 약 pH 6 에서 약 pH 7, 또는 약 pH 7 에서 약 pH 8 까지의 구배이다.
일반적으로, 결합 도메인은 Fc-영역의 적어도 FcRn 결합 부분의 C-말단 또는 N-말단에 융합된다.
본원에 보고된 하나의 양상은 생체 내 (공동)-표적화에 대해 pH 7.4 의 pH 값에서 FcRn 에 대한 결합을 가진 항체를 선별하기 위한 리간드로서의 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 및 베타-2-마이크로글로불린의 비-공유 복합체를 포함하는 크로마토그래피 물질의 용도이다. 하나의 구현예에서, 공동-표적화는 내재화이다.
그러므로, 하나의 구현예에서, 첫번째 pH 는 약 pH 7.4 이다. 하나의 구현예에서, 두번째 pH 는 약 pH 6.0 이다.
일반적으로, C-말단 His-Avi Tag (SEQ ID NO: 08) 를 가진 FcRn (인간 FcRn 에 대해 SEQ ID NO: 07) 의 가용성 세포외 도메인은 포유류 세포에서 β2-마이크로글로불린 (인간 베타-2-마이크로글로불린에 대해 SEQ ID NO: 09) 과 함께 공동-발현되었다. 비-공유 FcRn-마이크로글로불린 복합체는 비오티닐화되었고 스트렙타비딘 유도된 세파로오스 상에 로딩되었다.
본원에 보고된 모든 양상 중 하나의 양상에서, 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 및 베타-2-마이크로글로불린의 비-공유 복합체는 고체상에 결합된다.
"고체상" 은 비-유체 성분을 나타내고, 중합체, 금속 (상자성, 강자성 입자) 과 같은 물질로 제조된 입자 (마이크로입자 및 비이드 포함), 유리 및 세라믹; 겔 성분, 예컨대 실리카, 알루미나 및 중합체 겔; 중합체, 금속, 유리 및/또는 세라믹으로 제조될 수 있는 모세관; 제올라이트 및 기타 다공성 성분; 전극; 마이크로티터 플레이트; 고체 스트립; 및 큐벳, 튜브 또는 기타 분광계 샘플 용기가 포함된다. 어세이의 고체상 구성성분은 "고체 지지체" 가 분자와 화학적으로 상호작용하기로 의도되는, 그의 표면 상에 하나 이상의 잔기를 함유한다는 점에서 비활성 고체 표면과 구별된다. 고체상은 정지 구성성분, 예컨대 칩, 튜브, 스트립, 큐벳 또는 마이크로티터 플레이트일 수 있고, 또는 비-정지 구성성분, 예컨대 비이드 및 마이크로입자일 수 있다. 마이크로입자는 또한 균질 어세이 포맷을 위한 고체 지지체로서 사용될 수 있다. 단백질의 비-공유 또는 공유 부착 모두를 가능하게 하는 다양한 마이크로입자 및 기타 성분이 사용될 수 있다. 이러한 입자에는 중합체 입자, 예컨대 폴리스티렌 및 폴리 (메틸메타크릴레이트); 금 입자, 예컨대 금 나노입자 및 금 콜로이드; 및 세라믹 입자, 예컨대 실리카, 유리 및 금속 산화물 입자가 포함된다. 예를 들어 본원에 참조로서 인용된 문헌 [Martin, C.R., et al., Analytical Chemistry-News & Features, May 1 (1998) 322A-327A] 를 참조한다. 하나의 구현예에서, 고체 지지체는 세파로오스이다.
하나의 구현예에서, 고체상에 대한 비-공유 복합체의 공액은 N-말단 및/또는 ε-아미노기 (라이신: lysine), 상이한 리신 (lysin) 의 ε-아미노기, 항체의 아미노산 골격의 카르복시-, 술프히드릴-, 히드록실-, 및/또는 페놀 작용기, 및/또는 항체의 탄수화물 구조의 당 알코올 기를 통한 화학적 결합에 의해 수행된다.
하나의 구현예에서, 비-공유 복합체는 특이적 결합 쌍을 통해 고체상에 공액된다. 하나의 구현예에서, 비-공유 복합체는 비오틴에 공액되고, 고체 지지체에 대한 부동화는 고체 지지체 부동화된 아비딘 또는 스트렙타비딘을 통해 수행된다.
특이적 결합 쌍 (첫번째 구성성분/두번째 구성성분) 은 하나의 구현예에서 스트렙타비딘 또는 아비딘/비오틴, 항체/항원 (예를 들어 문헌 [Hermanson, G.T., et al., Bioconjugate Techniques, Academic Press (1996)] 참조), 렉틴/다당류, 스테로이드/스테로이드 결합 단백질, 호르몬/호르몬 수용체, 효소/기질, IgG/Protein A 및/또는 G 등으로부터 선택된다.
본원에 보고된 용도 및 방법에서의 본원에 보고된 FcRn 친화성 컬럼에 결합된 항체의 회수는 선형 구배 용리에 의해 수행된다. 하나의 구현예에서, 선형 구배는 pH 구배 또는 전기전도 구배이다.
원칙적으로는 임의의 완충제 성분이 본원에 보고된 방법에서 사용될 수 있다.
마우스 Fc-마우스 FcRn 상호작용에 결정적인 Fc 잔기는 부위-지정 돌연변이화에 의해 확인되었다 (예를 들어, Dall'Acqua, W.F., et al. J. Immunol 169 (2002) 5171-5180 참조). 잔기 I253, H310, H433, N434, 및 H435 (Kabat 에 따른 EU 넘버링) 가 상호작용에 관여된다 (Medesan, C., et al., Eur. J. Immunol. 26 (1996) 2533; Firan, M., et al., Int. Immunol. 13 (2001) 993; Kim, J.K., et al., Eur. J. Immunol. 24 (1994) 542). 잔기 I253, H310, 및 H435 는 인간 Fc 와 쥣과 FcRn 과의 상호작용에 중요한 것으로 밝혀졌다 (Kim, J.K., et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2819). 잔기 M252Y, S254T, T256E 는 [Dall'Acqua et al.] 에 의해 단백질-단백질 상호작용 연구에 의해 FcRn 결합을 향상시킨다고 기술되어 있다 (Dall'Acqua, W.F., et al. J. Biol. Chem. 281 (2006) 23514-23524). 인간 Fc-인간 FcRn 복합체의 연구는 잔기 I253, S254, H435, 및 Y436 이 상호작용에 중요한 것임을 보여주었다 (Firan, M., et al., Int. Immunol. 13 (2001) 993; Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604). 문헌 [Yeung, Y.A., et al. (J. Immunol. 182 (2009) 7667-7671)] 에서, 잔기 248 내지 259 및 301 내지 317 및 376 내지 382 및 424 내지 437 의 다양한 돌연변이체가 보고되고 시험되었다.
상이한 용리 완충액으로 수득된 상이한 항체의 체류 시간은 하기 표에 제시된다.
용리 완충액 체류 시간 [분]
항-Her2 항체 (I253H-돌연변이체) 항-Ox40L 항체 항-Abeta 항체
(야생형)		 항-Abeta 항체
(YTE-돌연변이체)
피크 1 피크 2
pH 8.8 로 조정된, 150 mM NaCl 를 함유하는 20 mM Tris/HCl 결합하지 않음 45 45.5 52.5 66
pH 8.8 로 조정된, 300 mM NaCl 를 함유하는 20 mM Tris/HCl 측정되지 않음 42.5 43 48.5 51.5
pH 8.8 로 조정된, 50 mM NaCl 를 함유하는 20 mM Tris/HCl 측정되지 않음 43 44 51 -
pH 8.6 으로 조정된, 150 mM NaCl 를 함유하는 20 mM HEPES 측정되지 않음 48 48.5 63 76
용어 YTE-돌연변이체는 삼중 돌연변이체 M252Y/S254T/T256E 를 나타낸다.
하나의 구현예에서, 약학적으로 허용가능한 완충제 성분, 예컨대 인산 또는 이의 염, 아세트산 또는 이의 염, 시트르산 또는 이의 염, 모르폴린, 2-(N-모르폴리노) 에탄술폰산 (MES) 또는 이의 염, 히스티딘 또는 이의 염, 글리신 또는 이의 염, 트리스 (히드록시메틸) 아미노메탄 (TRIS) 또는 이의 염, (4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산 (HEPES) 또는 이의 염이 사용된다.
하나의 구현예에서, 완충제 성분은 인산 또는 이의 염, 또는 아세트산 또는 이의 염, 또는 시트르산 또는 이의 염, 또는 히스티딘 또는 이의 염으로부터 선택된다.
하나의 구현예에서, 완충제 성분은 10 mM 내지 500 mM 의 농도를 갖는다. 하나의 구현예에서, 완충제 성분은 10 mM 내지 300 mM 의 농도를 갖는다. 하나의 구현예에서, 완충제 성분은 10 mM 내지 250 mM 의 농도를 갖는다. 하나의 구현예에서, 완충제 성분은 10 mM 내지 100 mM 의 농도를 갖는다. 하나의 구현예에서, 완충제 성분은 15 mM 내지 50 mM 의 농도를 갖는다. 하나의 구현예에서, 완충제 성분은 약 20 mM 의 농도를 갖는다.
하나의 구현예에서, 제 1 용액 중의 완충제 성분 및 제 2 용액 중의 완충제 성분은 동일한 완충제 성분이다.
하나의 구현예에서, 제 1 용액 중의 완충제 성분 및 제 2 용액 중의 완충제 성분은 상이한 완충제 성분이다.
하나의 구현예에서, 제 1 용액은 약 pH 3.5 내지 약 pH 7.5 의 pH 값을 갖는다. 하나의 구현예에서, 제 1 용액은 약 pH 5 내지 약 pH 6 의 pH 값을 갖는다. 하나의 구현예에서, 제 1 용액은 약 pH 5.5 의 pH 값을 갖는다.
하나의 구현예에서, 제 2 용액은 약 pH 7.0 내지 약 pH 9.5 의 pH 값을 갖는다. 하나의 구현예에서, 제 2 용액은 약 pH 8 내지 약 pH 9 의 pH 값을 갖는다. 하나의 구현예에서, 제 2 용액은 약 pH 8.2 내지 약 pH 8.8 의 pH 값을 갖는다.
예시적인 제 1 용액은 pH 5.5 로 조정된, 20 mM MES 및 150 mM NaCl 을 포함한다.
예시적인 제 2 용액은 pH 8.8 로 조정된, 20 mM TRIS 및 150 mM NaCl 을 포함한다.
예시적인 제 2 용액은 pH 8.6 로 조정된, 20 mM HEPES 를 포함한다.
예시적인 제 2 용액은 pH 8.2 로 조정된, 20 mM TRIS 를 포함한다.
하나의 구현예에서, 완충액은 부가적인 염을 포함한다. 하나의 구현예에서, 부가적인 염은 염화나트륨, 황산나트륨, 염화칼륨, 황산칼륨, 구연산나트륨, 또는 구연산칼륨으로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 50 mM 내지 1000 mM 의 부가적인 염의 완충액을 포함한다. 하나의 구현예에서, 50 mM 내지 750 mM 의 부가적인 염의 완충액을 포함한다. 하나의 구현예에서, 50 mM 내지 500 mM 의 부가적인 염의 완충액을 포함한다. 하나의 구현예에서, 50 mM 내지 750 mM 의 부가적인 염의 완충액을 포함한다. 하나의 구현예에서, 약 50 mM 내지 약 300 mM 의 부가적인 염의 완충액을 포함한다.
하나의 구현예에서, 제 1 및/또는 제 2 용액은 염화나트륨을 포함한다. 하나의 구현예에서, 제 1 및/또는 제 2 용액은 약 50 mM 내지 약 300 mM 염화나트륨을 포함한다.
염 및 완충제 성분의 종류가 체류 시간 및 분해능에 영향을 준다는 것이 발견되었다. FcRn 에 대한 항체의 결합을 위한 최적의 염 농도가 측정될 수 있다 (150 mM NaCl). 염 농도가 높을수록 (300 mM) FcRn 에 대한 결합은 감소하고/짧은 체류 시간이 수득된다. 낮은 염 농도 (50 mM) 에 대해서도 이것은 사실이다. 20 mM HEPES pH 8.6 은 모든 시험된 항체에 대해 체류 시간을 연장시켰다.
도 1 로부터 볼 수 있듯이, 적용된 항체의 양은 용리된 피크의 곡선 하 면적에 대한 선형 연관성을 보여준다.
8 개의 항체를 완전한 항체로서 및 효소 IDES 로의 분할 후 분석하였다. 분할은 SDS 페이지 및 분석용 SEC 에 의해 조절되었다. 항체의 Fc 부분 및 Fab 부분을 분취용 SEC 에 의해 분리하였다. 하기 표에, 완전한 항체, Fab 부분 및 Fc 부분의 체류 시간을 제시한다.
항체
 체류 시간 [분]
완전한 항체 Fc 부분 Fab 부분
항-Her2 항체
(I253H 돌연변이체)		 결합하지 않음 측정되지 않음 측정되지 않음
항-IGF-1R 항체 44.5 45 결합하지 않음
항-IL13Rα 항체 44.5 45 결합하지 않음
항-Her2 항체 45 45 결합하지 않음
항-IL 6R 항체 45 45 결합하지 않음
항-Ox40L 항체 45 45 결합하지 않음
항-Abeta 항체 (야생형) 45 45 결합하지 않음
항-Abeta 항체
(YTE 돌연변이체)		 피크 1: 52.5
피크 2: 66		 52 결합하지 않음
용어 YTE-돌연변이체는 삼중 돌연변이체 M252Y/S254T/T256E 를 나타낸다.
일반적으로, 야생형 Fc 부분 (IgG1 또는 IgG2 또는 IgG4) 을 갖는 항체의 체류 시간은 45 내지 49 분 (36 개의 항원에 대항하는 35 개의 치료 항체로 시험됨, 데이터는 제시되지 않음) 으로 상이하다.
하기 표에, 컬럼 물질 그램 당 부동화된 FcRn 수용체의 양과 관련된 체류 시간이 제시된다.
용리 완충액: pH 8.8 로 조정된, 150 mM NaCl 을 함유하는 20 mM Tris/HCl 체류 시간 [분]
항-Her2 항체 (I253H-돌연변이체) 항-Ox40L 항체 항-Abeta 항체
(야생형)		 항-Abeta 항체 (YTE-돌연변이체)
피크 1 피크 2
1.2 mg FcRn/g 고체상 측정되지 않음 42.5 42.5 48.5 54
3 mg FcRn/g 고체상 결합하지 않음 45 45.5 52.5 66
6 mg FcRn/g 고체상 측정되지 않음 48.5 49 53 74
12 mg FcRn/g 고체상 측정되지 않음 48.5 49 58 75
용어 YTE-돌연변이체는 삼중 돌연변이체 M252Y/S254T/T256E 를 나타낸다.
항-Abeta 항체 FAB-단편은 당화 부위를 포함한다.
그러므로, 본원에 보고된 하나의 양상은 FAB 개질을 검출하기 위한 리간드로서의 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 및 베타-2-마이크로글로불린의 비-공유 복합체를 포함하는 크로마토그래피 물질의 용도이다. 하나의 구현예에서, 개질은 당화, 또는 전하 분포이다.
일반적으로, 본원에 보고된 방법 및 용도에서의 체류 시간은 pH 구배 및 사용된 염 농도의 기울기에 따라 다르다. 야생형 항체가 참조로서 사용되고 약한 결합은 짧은 체류 시간 (= 초기 용리) 에 의해 나타내지는 반면, 강한 결합은 긴 체류 시간 (= 후기 용리) 에 의해 나타내지나, 여전히 pH 7.4 의 pH 값 전이다.
IgG 의 Fc 부분의 상이한 돌연변이체가 FcRn 컬럼 상에서 상이하게 행동하는 것이, 변경된 체류 시간을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
예를 들어, 항-Abeta 항체 돌연변이체 YTE 는 증가된 체류 시간을 보인다. 항-Abeta 항체 YTE-돌연변이체의 두번째 피크는 Fab 부분 내에 도입된 부가적인 당화 부위 때문이다.
예를 들어, 항-IGF-1R 항체 돌연변이체 YTE 는 증가된 체류 시간을 보인다 (참조, 도 2).
항체 체류 시간 [분]
항-IGF-1R 항체 (야생형) 44.5
항-IGF-1R 항체 (YTE-돌연변이체) 57.5
항-Abeta 항체 (야생형) 45
항-Abeta 항체 (YTE 돌연변이체) 피크 1: 52.5
피크 2: 66
YTE-돌연변이체는 삼중 돌연변이체 M252Y/S254T/T256E 를 나타낸다.
본원에 보고된 FcRn 컬럼으로, FcRn 결합 관련 아미노산을 확인하고 비-개질된 야생형 항체와 비교하여 돌연변이체를 평가하는 것이 가능하다는 것을 발견하였다.
본원에 보고되는 양상은 FcRn 결합 관련 아미노산을 확인하고 비-개질된 야생형 항체와 비교하여 돌연변이체를 평가하기 위한, 리간드로서의 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 및 베타-2-마이크로글로불린의 비-공유 복합체를 포함하는 크로마토그래피 물질의 용도이다.
항-Her2 항체로 수득된 결과는 하기 표에 제시된다 (예를 들어, 예시적 참조로서 WO 2006/031370 을 참조함).
돌연변이 체류 시간 [분] 체류 시간 [야생형의 %]
I253H 결합하지 않음 -
M252D 결합하지 않음 -
S254D 결합하지 않음 -
R255D 41.4 89
M252H 43.6 94
K288E 45.2 98
L309H 45.5 98
E258H 45.6 99
T256H 46.0 99
K290H 46.2 100
D98E 46.2 100
야생형 46.3 100
K317H 46.3 100
Q311H 46.3 100
E430H 46.4 100
T307H 47.0 102
N434H 52.0 112
FcRn 컬럼으로부터 후기 용리를 보인 항체, 즉, FcRn 컬럼 상에서 긴 체류 시간을 갖는 항체가 생체 내에서 더 긴 반감기를 갖는다는 것이 발견되었다. 생체 내 데이터는 하기 표에 제시된다.
항체 체류 시간[분] 생체 내 반감기[h]
항-Abeta 항체 (야생형) 45.5 103 +/- 51
항-Abeta 항체 (YTE-돌연변이) 52.5/66 197 +/- 53
항-IGF-1R 항체 (야생형) 45.5 97 +/- 9
항-IGF-1R 항체 (YTE-돌연변이체) 58 211 +/- 41
용어 YTE-돌연변이체는 삼중 돌연변이체 M252Y/S254T/T256E 를 나타낸다.
본원에 보고된 하나의 양상은 항체의 생체 내 반감기를 측정하기 위한 리간드로서의 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 및 베타-2-마이크로글로불린의 비-공유 복합체를 포함하는 크로마토그래피 물질의 용도이다.
야생형 IgG 및 Fc 부분 내에 YTE-돌연변이를 가진 IgG 변이체로 수행된 시험관 내 및 생체 내 실험 세트는 FcRn 친화성 크로마토그래피에서의 발견과 인간 FcRn 에 대해 형질전환된 마우스로의 생체 내 약동학 연구에서의 결과의 반-정량적 연관성을 보여주는 것을 가능하게 하였다 (Spiekerman, G.M., et al. J. Exp. Med. 196 (2002) 303-310; Dall'Acqua, W.F., et al., J. Biol. Chem. 281 (2006) 23514-23524). YTE-돌연변이는 유의하게 연장된 반감기 및 느려진 혈장 소거를 야기한다. 더 긴 생체 내 반감기는 FcRn 크로마토그래피에서의 더 긴 체류 시간에 상응한다. Fc-조작된 트라스투주맙 변이체의 연장된 반감기는 최근 유세포 분석에 의해 측정된 바와 같이 FcRn 에 대한 시험관 내 결합이 향상되었음을 보여주었다 (Petkova, S.B., et al., Int. Immunol. 18 (2006) 1759-1769). 11 배 개선된 FcRn 친화성을 갖는 항-VEGF IgG1 항체 베바시주맙의 변이체는 인간 FcRn 형질전환 마우스에서 5 배 연장된 반감기 및 사이노몰거스 원숭이에서 3 배 긴 반감기를 갖는 것으로 제시되었다 (Zalevsky, J., et al., Nat. Biotechnol. 28 (2010) 157-159).
IgG 제제 중의 반 항체의 분석 및 제거가 본원에 보고된 바와 같이 FcRn 컬럼을 사용하여 달성될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 예시적인 FcRn 컬럼 크로마토그래피는 도 3 에 제시된다.
본원에 보고된 하나의 양상은 IgG 제제로부터 반 항체의 제거를 위한 리간드로서의 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 및 베타-2-마이크로글로불린의 비-공유 복합체를 포함하는 크로마토그래피 물질의 용도이다.
올리고머 및 응집체가 본원에 보고된 바와 같이 FcRn 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있다는 것이 밝혀졌다 (도 4 참조).
본원에 보고된 하나의 양상은 IgG 제제로부터 항체 응집체 및 항체 올리고머의 제거를 위한 리간드로서의 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 및 베타-2-마이크로글로불린의 비-공유 복합체를 포함하는 크로마토그래피 물질의 용도이다.
체류 시간이 분석물 분자에 포함된 Fc 부분의 수에 의해 영향을 받는다는 것으로 밝혀졌다. 이것은 1 개 또는 2 개의 Fc 부분을 함유하는 구축물을 사용하여 제시되었다 (참조, 도 5).
산화가 FcRn 결합에 영향을 주고 FcRn 컬럼 상에서 제시될 수 있다는 것이 밝혀졌다 (참조, 도 6).
항체 포맷이 FcRn 컬럼에 대한 결합에 영향을 주지 않는 것으로 제시되었다. 이것은 놉-인투-홀 (knob-into-hole) 포맷 및 여러 2-특이적 항체 포맷에 대해 제시되었다. 그러므로, FcRn 컬럼은 신규한 항체 포맷의 평가를 위해 사용될 수 있다.
하나의 구현예에서, 복합체는 모노-비오틴화된다.
하나의 구현예에서, 리간드로서 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 및 베타-2-마이크로글로불린의 비-공유 복합체를 포함하는 크로마토그래피 물질은 본원에 보고된 방법 및 용도에서 100 회 이상의 사이클의 안정성을 갖는다. 사이클은 각각의 방법 또는 용도의 제 1 pH 값에서 제 2 pH 값까지의 pH 구배이고 이에 의해 물질의 재생을 위해, 방법 또는 용도의 최종 조건 이상으로 추가의 조건 변화가 필요하지 않다. 그러므로, 하나의 구현예에서 사이클은 약 pH 값 pH 5.5 에서 약 pH 값 pH 8.8 까지의 pH 구배이다.
위치 428 에서의 M 에서 E 로의 아미노산 교환과 조합된 위치 252 에서의 M 에서 H 로의 아미노산 교환이 체류 시간을 줄인다는 것이 밝혀졌다 (참조, 도 7).
산화 생성물 Met252 및 Met428 을 함유하는 항체 샘플은 SPR 기법과 FcRn 친화성 크로마토그래피 사이의 차이를 설명한다. 샘플의 SPR 분석으로 참조 표준과 비교하여 샘플의 결합에서 약 20% 의 상대적 차이가 검출된 반면, 상기 샘플의 이질성에 대한 통찰력을 제공하지는 않았다. 반대로, 동일한 샘플의 FcRn 친화성 크로마토그래피는 2 개의 구별되는 피크를 나타내었는데, 참조 표준의 체류 시간에서 1 개 및 스트레스 받은 샘플 중의 항체와 낮은 pH 에서 FcRn 컬럼 물질과의 약한 상호작용을 나타내는 오른쪽으로 현저하게 이동된 2 번째 피크이다.
본원에 보고된 리간드로서 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 및 베타-2-마이크로글로불린의 비-공유 복합체를 포함하는 크로마토그래피 물질은 항체 단편의 단리/분리를 위해 사용될 수 있고, 그러므로, 통상의 Protein A 친화성 크로마토그래피에 대한 대안을 제공한다. 본원에 보고된 크로마토그래피 물질을 사용하는 것 외에도, 분리는 통상의 Protein A 친화성 크로마토그래피와 비교하여, 예컨대 pH 값과 같은 더욱 좀더 생리학적 조건에서 발휘될 수 있다.
리간드로서 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 및 베타-2-마이크로글로불린의 비-공유 복합체를 포함하는 크로마토그래피 물질은 예를 들어, 산화, 전하 변이체, 당화, 및 탈아미드화와 같은 개질을 포함하는 항체 종의 측정/분리/풍부를 위해 사용될 수 있다. 리간드로서 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 및 베타-2-마이크로글로불린의 비-공유 복합체를 포함하는 크로마토그래피 물질은 특정 항체 종의 풍부를 위해 선택된 pH 구배 (출발/종결 pH 값) 에 따라 달리 사용될 수 있다.
리간드로서 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 및 베타-2-마이크로글로불린의 비-공유 복합체를 포함하는 크로마토그래피 물질은 분자량 변이/차이에 의해 항체 종의 단리/풍부를 위해 사용될 수 있다.
리간드로서 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 및 베타-2-마이크로글로불린의 비-공유 복합체를 포함하는 크로마토그래피 물질은 분자 내 FcRn 결합 부위의 수에 의한 항체의 단리/풍부를 위해 사용될 수 있다.
리간드로서 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 및 베타-2-마이크로글로불린의 비-공유 복합체를 포함하는 크로마토그래피 물질은 아미노산 개질의 단리를 위해 사용될 수 있다. 리간드로서 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 및 베타-2-마이크로글로불린의 비-공유 복합체를 포함하는 크로마토그래피 물질은 홀-홀 이량체 및 반 항체와 같은 2-특이적 항체 미스페어링 (mispairing) 의 단리/분리를 위해 사용될 수 있다.
특정 구현예
1. 양성 선형 pH 구배를 가진 친화성 크로마토그래피에서 친화성 크로마토그래피 리간드로서의 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 및 베타-2-마이크로글로불린 (b2m) 의 부동화된 비-공유 복합체의 용도.
2. 제 1 항에 있어서, Fc-영역을 적어도 포함하는 항체 또는 융합 폴리펩티드를 분리하기 위한 양성 선형 pH 구배를 가진 친화성 크로마토그래피에서의 것임을 특징으로 하는 용도.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 신생아 Fc 수용체 및 베타-2-마이크로글로불린이 서로 독립적으로 인간 기원, 또는 마우스 기원, 또는 사이노몰거스 원숭이 기원, 또는 래트 기원, 또는 토끼 기원의 것임을 특징으로 하는 용도.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 베타-2-마이크로글로불린이 신생아 Fc 수용체와 동일한 종으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 용도.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 신생아 Fc 수용체 및 베타-2-마이크로글로불린이 각각 서로 독립적으로 0 내지 10 개의 아미노산 잔기 개질을 갖는, 인간 야생형 신생아 Fc 수용체 및 인간 야생형 베타-2-마이크로글로불린인 것을 특징으로 하는 용도.
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 및 베타-2-마이크로글로불린 (b2m) 의 비-공유 복합체가 고체상에 결합되는 것을 특징으로 하는 용도.
7. 제 6 항에 있어서, 고체상이 크로마토그래피 물질인 것을 특징으로 하는 용도.
8. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서, 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 및 베타-2-마이크로글로불린 (b2m) 의 비-공유 복합체가 비오틴화되고, 고체상이 스트렙타비딘으로 유도되는 것을 특징으로 하는 용도.
9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, pH 구배가 제 1 pH 값에서 제 2 pH 값까지이며, 제 1 pH 값이 약 pH 3.5 에서 약 pH 7.5 까지이고 제 2 pH 값이 약 pH 6.0 에서 약 pH 9.5 까지인 것을 특징으로 하는 용도.
10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 pH 값이 약 pH 5.5 이고 제 2 pH 값이 약 pH 8.8 인 것을 특징으로 하는 용도.
11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 및 참조 항체의 체류 시간의 비를 측정함으로써 항체의 생체 내 반감기의 측정을 위한 것임을 특징으로 하는 용도.
12. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 메티오닌 산화를 측정하기 위한 것임을 특징으로 하는 용도.
13. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 올리고머화 수준을 측정하기 위한 것임을 특징으로 하는 용도.
14. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 모체 항체 또는 모체 융합 폴리펩티드와 비교하여 FcRn 에 대해 변형된 결합 친화력을 갖는 개질 항체 또는 개질 융합 폴리펩티드에 대한 Fc-영역의 FcRn 결합 부분을 적어도 포함하는, 모체 항체 또는 모체 융합 폴리펩티드의 개질 항체 또는 개질 융합 폴리펩티드의 라이브러리를 스크리닝하기 위한 것임을 특징으로 하는 용도.
15. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 신생아 Fc 수용체에 대해 변형된 결합을 나타내는 Fc-영역의 FcRn-결합 부분을 적어도 포함하는 항체 또는 융합 폴리펩티드를 확인하기 위한 것임을 특징으로 하는 용도.
16. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, IgG 제제로부터 반 항체의 제거를 위한 것임을 특징으로 하는 용도.
17. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, IgG 제제로부터 항체 응집체 및 항체 올리고머의 제거를 위한 것임을 특징으로 하는 용도.
18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 융합 폴리펩티드의 1-특이적 항체 또는 항체 단편, 또는 융합 폴리펩티드의 2-특이적 항체 또는 항체 단편, 또는 융합 폴리펩티드의 3-특이적 항체 또는 항체 단편, 또는 융합 폴리펩티드의 4-특이적 항체 또는 항체 단편인 것을 특징으로 하는 용도.
19. 음성 선형 pH 구배를 가진 친화성 크로마토그래피에서 친화성 크로마토그래피 리간드로서의 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 및 베타-2-마이크로글로불린 (b2m) 의 부동화된 비-공유 복합체의 용도.
20. 제 19 항에 있어서, Fc-영역을 적어도 포함하는 항체 또는 융합 폴리펩티드를 분리하기 위한 음성 선형 pH 구배를 가진 친화성 크로마토그래피에서의 것임을 특징으로 하는 용도.
21. 제 19 항 또는 제 20 항에 있어서, 신생아 Fc 수용체 및 베타-2-마이크로글로불린이 서로 독립적으로 인간 기원, 또는 마우스 기원, 또는 사이노몰거스 원숭이 기원, 또는 래트 기원, 또는 토끼 기원의 것임을 특징으로 하는 용도.
22. 제 19 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 베타-2-마이크로글로불린이 신생아 Fc 수용체와 동일한 종으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 용도.
23. 제 19 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 신생아 Fc 수용체 및 베타-2-마이크로글로불린이 각각 서로 독립적으로 0 내지 10 개의 아미노산 잔기 개질을 갖는, 인간 야생형 신생아 Fc 수용체 및 인간 야생형 베타-2-마이크로글로불린인 것을 특징으로 하는 용도.
24. 제 19 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 및 베타-2-마이크로글로불린 (b2m) 의 비-공유 복합체가 고체상에 결합되는 것을 특징으로 하는 용도.
25. 제 24 항에 있어서, 고체상이 크로마토그래피 물질인 것을 특징으로 하는 용도.
26. 제 24 항 또는 제 25 항에 있어서, 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 및 베타-2-마이크로글로불린 (b2m) 의 비-공유 복합체가 비오틴화되고, 고체상이 스트렙타비딘으로 유도되는 것을 특징으로 하는 용도.
27. 제 19 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, pH 구배가 제 1 pH 값에서 제 2 pH 값까지이며, 제 1 pH 값이 약 pH 7.0 에서 약 pH 8.5 까지이고 제 2 pH 값이 약 pH 5.5 에서 약 pH 6.9 까지인 것을 특징으로 하는 용도.
28. 제 19 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 pH 값이 약 pH 7.4 이고 제 2 pH 값이 약 pH 6.0 인 것을 특징으로 하는 용도.
29. 제 19 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 및 참조 항체의 체류 시간의 비를 측정함으로써 항체의 생체 내 반감기의 측정을 위한 것임을 특징으로 하는 용도.
30. 제 19 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 메티오닌 산화를 측정하기 위한 것임을 특징으로 하는 용도.
31. 제 19 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 올리고머화 수준을 측정하기 위한 것임을 특징으로 하는 용도.
32. 제 19 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 모체 항체 또는 모체 융합 폴리펩티드와 비교하여 FcRn 에 대해 변형된 결합 친화력을 갖는 개질 항체 또는 개질 융합 폴리펩티드에 대한 Fc-영역의 FcRn 결합 부분을 적어도 포함하는, 모체 항체 또는 모체 융합 폴리펩티드의 개질 항체 또는 개질 융합 폴리펩티드의 라이브러리를 스크리닝하기 위한 것임을 특징으로 하는 용도.
33. 제 19 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 신생아 Fc 수용체에 대해 변형된 결합을 나타내는 Fc-영역의 FcRn-결합 부분을 적어도 포함하는 항체 또는 융합 폴리펩티드를 확인하기 위한 것임을 특징으로 하는 용도.
34. 제 19 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, IgG 제제로부터 반 항체의 제거를 위한 것임을 특징으로 하는 용도.
35. 제 19 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, IgG 제제로부터 항체 응집체 및 항체 올리고머의 제거를 위한 것임을 특징으로 하는 용도.
36. 제 19 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 융합 폴리펩티드의 1-특이적 항체 또는 항체 단편, 또는 융합 폴리펩티드의 2-특이적 항체 또는 항체 단편, 또는 융합 폴리펩티드의 3-특이적 항체 또는 항체 단편, 또는 융합 폴리펩티드의 4-특이적 항체 또는 항체 단편인 것을 특징으로 하는 용도.
37. 제 1 항 내지 제 10 항, 제 18 항, 제 19 항 내지 제 28 항 또는 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서, IgG3 하위계열의 항체로부터 IgG1 하위계열의 항체의 분리를 위한 것임을 특징으로 하는 용도.
38. 위치 252 에서의 아미노산이 메티오닌에서 히스티딘으로 변형되고 위치 428 에서의 아미노산이 메티오닌에서 글루탐산으로 변형된 인간 IgG1 이소형의 Fc-영역 변이체.
1. 항체 단편
특정 구현예에서, 본원에 제공되는 융합 폴리펩티드는 항체 단편을 포함한다. 항체 단편에는 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, 및 scFv 단편, 및 하기 기재되는 기타 단편이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 특정 항체 단편에 대한 리뷰를 위해서는 문헌 [Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134] 를 참조한다. scFv 단편에 대한 리뷰를 위해서는, 예를 들어 문헌 [Plueckthun, A., In: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994), pp. 269-315]; 및 또한 WO 93/16185; 및 US 5,571,894 및 US 5,587,458 을 참조한다. 구조 (salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 생체 내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab')2 단편의 논의를 위해서는, US 5,869,046 을 참조한다.
디아바디는 2-원자가 또는 2-특이적일 수 있는 2 개의 항원-결합 부위를 가진 항체 단편이다. 예를 들어, EP 0 404 097; WO 1993/01161; Hudson, P.J., et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134; 및 Holliger, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448 을 참조한다. 트리아바디 (Triabody) 및 테트라바디 (tetrabody) 가 또한 문헌 [Hudson, P.J., et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134)] 에 기재된다.
단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인 모두 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인 모두 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 구현예에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다 (Domantis, Inc., Waltham, MA; 예를 들어, 미국 특허 번호 6,248,516 B1 참조).
항체 단편은 본원에 기재된 바와 같은 미손상 항체의 단백질 가수분해 소화 뿐 아니라 재조합 숙주 세포 (예를 들어, E. coli 또는 파지) 에 의한 제조를 비롯한, 그러나 이에 제한되지 않는 다양한 기법에 의해 제조될 수 있다.
2. 키메라성 및 인간화 항체
특정 구현예에서, 본원에 제공되는 항체는 키메라성 항체이다. 예를 들어, US 4,816,567; 및 Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855) 에 특정 키메라성 항체가 기재되어 있다. 하나의 예에서, 키메라성 항체는 비-인간 가변 영역 (예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 또는 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이 유래의 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가의 예에서, 키메라성 항체는 계열 또는 하위계열이 모체 항체의 것으로부터 변화된 "계열이 변경된" 항체이다. 키메라성 항체에는 이의 항원-결합 단편이 포함된다.
특정 구현예에서, 키메라성 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로는, 비-인간 항체는 모체 비-인간 항체의 특이성과 친화성을 유지하면서, 인간에 대한 면역원성을 감소시키기 위해 인간화된다. 일반적으로, 인간화 항체는 HVR, 예를 들어, CDR (또는 이의 일부) 이 비-인간 항체로부터 유래되고, FR (또는 이의 일부) 이 인간 항체 서열로부터 유래되는 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 임의로 또한 인간 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 인간화 항체 내의 일부 FR 잔기는, 예를 들어, 항체 특이성 또는 친화성을 회복 또는 향상시키기 위해, 비-인간 항체로부터의 (예를 들어, HVR 잔기가 유래되는 항체) 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화 항체 및 이의 제조 방법은 예를 들어, 문헌 [Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633] 에서 리뷰되고, 예를 들어, 하기 문헌에서 추가로 기재된다 [Riechmann, I., et al., Nature 332 (1988) 323-329; Queen, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033; US 5,821,337, US 7,527,791, US 6,982,321, 및 US 7,087,409; Kashmiri, S.V., et al., Methods 36 (2005) 25-34 (SDR (a-CDR) 그래프팅 (grafting) 을 기재함); Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498 ("재표면처리 (resurfacing)" 를 기재함); Dall'Acqua, W.F., et al., Methods 36 (2005) 43-60 ("FR 셔플링 (shuffling)" 을 기재함); 및 Osbourn, J., et al., Methods 36 (2005) 61-68 및 Klimka, A., et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260 (FR 셔플링에 대한 "지침 선택" 접근법을 기재함)].
인간화를 위해 사용될 수 있는 인간 골격 영역에는 "최적의" 방법을 사용하여 선택된 골격 영역 (예를 들어, Sims, M.J., et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308 참조); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 하위그룹의 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 골격 영역 (예를 들어, Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; 및 Presta, L.G., et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632 참조); 인간 성숙 (체세포 돌연변이) 골격 영역 또는 인간 생식세포 골격 영역 (예를 들어, Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633 참조); 및 FR 라이브러리의 스크리닝으로부터 유래된 골격 영역 (예를 들어, Baca, M., et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684 및 Rosok, M.J., et al., J. Biol. Chem. 271 (1996) 22611-22618 참조) 이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
3. 인간 항체
특정 구현예에서, 본원에 제공되는 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 당업계에 공지된 다양한 기법을 사용하여 제조될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 문헌 [van Dijk, M.A. and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374 및 Lonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459] 에 기재되어 있다.
인간 항체는 항원 접종에 반응하여 미손상 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 가진 미손상 항체를 생성하도록 개질된 형질전환 동물에 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 이러한 동물은 전형적으로는 내인성 면역글로불린 유전자좌로 대체되거나, 또는 염색체 외부에 존재하거나 동물의 염색체 내로 무작위로 통합되는 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유한다. 이러한 형질전환 마우스에서, 내인성 면역글로불린 유전자좌는 일반적으로 비활성화된다. 형질전환 동물로부터 인간 항체를 수득하기 위한 방법에 대한 리뷰는 문헌 [Lonberg, N., Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125] 를 참조한다. 또한 예를 들어, XENOMOUSE™ 기술을 기재하고 있는 US 6,075,181 및 US 6,150,584; HUMAB® 기술을 기재하고 있는 US 5,770,429; K-M MOUSE® 기술을 기재하고 있는 US 7,041,870, 및 VELOCIMOUSE® 기술을 기재하고 있는 US 2007/0061900 을 참조한다. 이러한 동물로부터 생성된 미손상 항체 유래의 인간 가변 영역은 예를 들어, 상이한 인간 불변 영역과 조합됨으로써 추가로 개질될 수 있다.
인간 항체는 또한 하이브리도마-기반 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 단일클론 항체의 제조를 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주가 기재되어 있다 (예를 들어, Kozbor, D., J. Immunol. 133 (1984) 3001-3005; Brodeur, B.R., et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987), pp. 51-63; 및 Boerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95 참조). 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성되는 인간 항체는 또한 문헌 [Li, J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 3557-3562] 에 기재되어 있다. 부가적인 방법에는 예를 들어, US 7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터의 단일클론 인간 IgM 항체의 제조를 기재함) 및 Ni, J., Xiandai Mianyixue 26 (2006) 265-268 (인간-인간 하이브리도마를 기재함) 에 기재된 방법이 포함된다. 인간 하이브리도마 기술 (Trioma 기술) 은 또한 문헌 [Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Histology and Histopathology 20 (2005) 927-937 및 Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27 (2005) 185-191] 에 기재되어 있다.
인간 항체는 또한 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리함으로써 생성될 수 있다. 이러한 가변 도메인 서열은 이후 요망되는 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하기 위한 기법은 하기에 기재된다.
4. 라이브러리-유래 항체
본 발명의 항체는 원하는 활성(들) 을 갖는 항체에 대해 조합적인 라이브러리를 스크리닝하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성시키고 원하는 결합 특징을 소유하고 있는 항체에 대해 이러한 라이브러리를 스크리닝하기 위해 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 이러한 방법은 예를 들어, 문헌 [Hoogenboom, H.R., et al., Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37] 에 리뷰되어 있고 예를 들어 문헌 [McCafferty, J., et al., Nature 348 (1990) 552-554; Clackson, T., et al., Nature 352 (1991) 624-628; Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597; Marks, J.D. and Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175; Sidhu, S.S., et al., J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310; Lee, C.V., et al., J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093; Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472; 및 Lee, C.V., et al., J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132] 에 추가로 기재되어 있다.
특정 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 에 의해 개별적으로 클로닝되고 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합되는데, 이후 이것은 문헌 [Winter, G., et al., Ann. Rev. Immunol. 12 (1994) 433-455] 에 기재된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 스크리닝될 수 있다. 파지는 전형적으로는 단일-사슬 Fv (scFv) 단편 또는 Fab 단편으로서 항체 단편을 나타낸다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 제작할 필요 없이 면역원에 대해 고-친화성 항체를 제공한다. 대안적으로는, 본래의 레퍼토리가 클로닝되어 (예를 들어, 인간으로부터), 문헌 [Griffiths, A.D., et al., EMBO J. 12 (1993) 725-734] 에 의해 기재되는 바와 같이 임의의 면역화 없이, 다양한 범위의 비-자가 및 또한 자가-항원에 대한 항체의 단일 공급원을 제공할 수 있다. 최종적으로, 본래의 라이브러리는 또한 줄기 세포로부터 비-재정렬된 V-유전자 절편을 클로닝하고 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용하여, 문헌 [Hoogenboom, H.R. and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388] 에 기재되는 바와 같이, 고도로 가변적인 CDR3 영역을 코딩하고 시험관 내 재정렬을 달성함으로써 합성적으로 제조될 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기재하고 있는 특허 출원에는 예를 들어: US 5,750,373, US 2005/0079574, US 2005/0119455, US 2005/0266000, US 2007/0117126, US 2007/0160598, US 2007/0237764, US 2007/0292936, 및 US 2009/0002360 가 포함된다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 고려된다.
5. 다중특이적 항체
특정 구현예에서, 본원에 제공되는 항체는 다중특이적 항체, 예를 들어, 2-특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 2 개 이상의 상이한 부위에 대한 결합 특이성을 갖는 단일클론 항체이다. 특정 구현예에서, 2-특이적 항체는 동일한 항원의 2 개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 2-특이적 항체는 또한 항원을 발현하는 세포에 세포독성제를 국소화시키는데 사용될 수 있다. 2-특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.
다중특이적 항체의 제조 기법에는 상이한 특이성을 갖는 2 개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공동-발현 (Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540, WO 93/08829, 및 Traunecker, A., et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659 참조), 및 "놉-인-홀 (knob-in-hole)" 조작 (예를 들어, US 5,731,168 참조) 이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 다중특이적 항체는 또한 항체 Fc-헤테로이량체 분자의 제조를 위한 정전기 스티어링 (steering) 효과 조작 (WO 2009/089004); 2 개 이상의 항체 또는 단편의 가교 (예를 들어, US 4,676,980, 및 Brennan, M., et al., Science 229 (1985) 81-83 참조); 2-특이적 항체의 제조를 위한 류신 지퍼의 사용 (예를 들어, Kostelny, S.A., et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553 참조); 2-특이적 항체 단편의 제조를 위한 "디아바디" 기술의 사용 (예를 들어, Holliger, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448 참조); 및 단일-사슬 Fv (sFv) 이량체의 사용 (예를 들어, Gruber, M., et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374 참조); 및 예를 들어, 문헌 [Tutt, A., et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69] 에 기재된 바와 같은 3-특이적 항체의 제조에 의해 제조될 수 있다.
"문어다리 (Octopus) 항체" 를 비롯하여 3 개 이상의 작용 항원 결합 부위를 가진 조작된 항체가 또한 본원에 포함된다 (예를 들어, US 2006/0025576 참조).
본원의 항체 또는 단편에는 또한 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용 Fab (Dual Acting Fab)" 또는 "DAF" 가 포함된다 (예를 들어, US 2008/0069820 참조).
본원의 항체 또는 단편에는 또한 WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792, 및 WO 2010/145793 에 기재된 다중특이적 항체가 포함된다.
6. 항체 변이체
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 이것은 항체의 결합 친화력 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선하는데 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 내로의 적합한 개질의 도입에 의해, 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 개질에는 항체의 아미노산 서열 내의 예를 들어, 잔기의 결실, 및/또는 삽입 및/또는 치환이 포함된다. 결실, 삽입, 및 치환의 임의의 조합은 최종 구축물이 원하는 특징 (예를 들어, 항원-결합) 을 갖도록 최종 구축물에 도달하기 위해 제조될 수 있다.
a) 치환, 삽입, 및 결실 변이체
특정 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환적 돌연변이생성을 위한 관심의 부위에는 HVR 및 FR 이 포함된다. 예시적 변화는 "예시적 치환" 이라는 제목 하에, 아미노산 측쇄 계열을 참조로 하여 추가로 하기에 추가로 기재되는 바와 같이 표 1 에 제공된다. 보존적 치환은 "바람직한 치환" 의 제목으로 표 1 에 제시된다. 아미노산 치환은 관심의 항체 내로 도입될 수 있고, 생성물을 원하는 활성, 예를 들어, 유보된/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 증가된 ADCC 또는 CDC 에 대해 스크리닝한다.
본래 잔기 예시적 치환 바람직한 치환
Ala (A) Val; Leu; Ile Val
Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys
Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln
Asp (D) Glu; Asn Glu
Cys (C) Ser; Ala Ser
Gln (Q) Asn; Glu Asn
Glu (E) Asp; Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg
Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucine Leu
Leu (L) Norleucine; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile
Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg
Met (M) Leu; Phe; Ile Leu
Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val; Ser Ser
Trp (W) Tyr; Phe Tyr
Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucine Leu
아미노산은 공통의 측쇄 특성에 따라 그룹지어질 수 있다:
(1) 소수성: Norleucine, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 방향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 또다른 계열에 대한 상기 계열 중 하나의 일원의 교환을 수반할 것이다.
하나의 유형의 치환 변이체에는 모체 항체 (예를 들어, 인간화 또는 인간 항체) 의 하나 이상의 과가변 영역 (HVR) 잔기의 치환이 수반된다. 일반적으로, 추가 연구에 대해 선택된 산출 변이체(들) 은 모체 항체와 비교해 특정 생물학적 특성에 있어서의 개질 (예를 들어, 개선) (예를 들어, 증가된 친화성, 감소된 면역원성) 을 가질 것이고/거나 모체 항체의 실질적으로 유보된 특정 생물학적 특성을 가질 것이다. 예시적 치환 변이체는, 예컨대 본원에 기재된 것과 같은 기법, 예를 들어, 파지 디스플레이-기반 친화성 돌연변이 기법을 사용하여 편리하게 생성될 수 있는 친화성 성숙된 항체이다. 간략하게는, 하나 이상의 HVR 잔기를 돌연변이시키고 변이체 항체를 파지 상에 디스플레이 하고, 특정 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화력) 에 대해 스크리닝한다.
변경 (예를 들어, 치환) 은 예를 들어, 항체 친화성을 개선하기 위해, HVR 내에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟 (hotspot)", 즉, 체세포 성숙 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이를 겪은 코돈에 의해 코딩되는 잔기 (예를 들어, Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196 참조), 및/또는 결합 친화력에 대해 시험되는 산출 변이체 VH 또는 VL 을 가진 SDR (a-CDR) 에서 제조될 수 있다. 2 차 라이브러리로부터의 구축 및 재선별에 의한 친화성 성숙이 예를 들어, 문헌 [Hoogenboom, H.R., et al., Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37] 에 기재되어 있다. 친화성 성숙의 일부 구현예에서, 다양한 방법 (예를 들어, 오류-유발 PCR, 연쇄 셔플링 (shuffling), 또는 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이생성) 중 임의의 것에 의해 성숙에 대해 선택된 다양한 유전자 내로 다양성이 도입된다. 이후 2 차 라이브러리가 제작된다. 라이브러리는 그 다음 원하는 친화성을 가진 임의의 항체 변이체를 확인하기 위해 스크리닝된다. 다양성을 도입하기 위한 또다른 방법은 여러 개의 HVR 잔기 (예를 들어, 한번에 4-6 잔기) 가 무작위화되는 HVR-지정 접근법을 수반한다. 항원 결합에 관여하는 HVR 잔기는 예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이생성 또는 모델링을 사용하여 구체적으로 확인될 수 있다. CDR-H3 및 CDR-L3 이 특히 종종 표적화된다.
특정 구현예에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 이러한 변형이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않기만 한다면 하나 이상의 HVR 내에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 결합 친화력을 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변형 (예를 들어, 본원에 제공된 바와 같은 보존적 치환) 이 HVR 에서 제조될 수 있다. 이러한 변형은 HVR "핫스팟" 또는 SDR 의 외부에 있을 수 있다. 상기 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 구현예에서, 각각의 HVR 은 변형되지 않거나, 1 개, 2 개 또는 3 개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
돌연변이생성의 표적이 될 수 있는 항체의 영역 또는 잔기의 유용한 확인 방법은 문헌 [Cunningham, B.C. and Wells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085] 에 의해 기재되는 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이생성" 이라고 불린다. 본 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기의 그룹 (예를 들어, 전하를 띠는 잔기, 예컨대 arg, asp, his, lys, 및 glu) 이 확인되고 중성 또는 음성 전하의 아미노산 (예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌) 으로 치환되어 항체와 항원의 상호작용이 영향을 받는지의 여부를 측정한다. 추가의 치환은 초기 치환에 대해 기능적 민감성을 나타내는 아미노산 위치에 도입될 수 있다. 대안적으로는, 또는 부가적으로는, 항원-항체 복합체의 결정 구조는 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃 잔기는 치환에 대한 후보자로서 표적이 되거나 제거될 수 있다. 변이체는 이들이 원하는 특성을 가지고 있는지의 여부를 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입에는 하나의 잔기에서 100 개 이상의 잔기 뿐 아니라, 단일 또는 복합 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 함유하는 폴리펩티드에 이르는 길이 범위의 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합이 포함된다. 말단 삽입의 예에는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체가 포함된다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체에는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드 또는 효소 (예를 들어, ADEPT) 에 대한 항체의 N- 또는 C-말단의 융합이 포함된다.
b) 당화 변이체
특정 구현예에서, 본원에 제공되는 항체는 항체가 당화되는 범위를 증가 또는 감소시키기 위해 변경된다. 항체에 대한 당화 부위의 부가 또는 결실은 하나 이상의 당화 부위가 생성되거나 제거되는 식으로 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성될 수 있다.
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 이곳에 부착된 탄수화물이 변경될 수 있다. 포유류 세포에 의해 생성되는 본래의 항체는 전형적으로는 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297 에 대한 N-연결에 의해 일반적으로 부착된 분지형, 바이안테너리 (biantennary) 올리고당을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Wright, A. and Morrison, S.L., TIBTECH 15 (1997) 26-32] 를 참조한다. 올리고당에는 다양한 탄수화물, 예를 들어, 만노오스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토오스, 및 시알산 뿐 아니라, 바이안테너리 올리고당 구조의 "줄기" 내의 GlcNAc 에 부착된 푸코오스가 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체 중의 올리고당의 개질은 특정의 향상된 특성을 갖는 항체 변이체를 제조하기 위해 이루어질 수 있다.
하나의 구현예에서, Fc 영역에 (직접적으로 또는 간접적으로) 부착된 푸코오스가 결핍된 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 이러한 항체 중의 푸코오스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40% 일 수 있다. 푸코오스의 양은 예를 들어, WO 2008/077546 에 기재된 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분광 분석에 의해 측정된 Asn 297 에 부착된 모든 당구조의 합 (예를 들어, 복합체, 혼성 및 고차 만노오스 구조) 에 대한, Asn297 에 당 사슬을 가진 푸코오스의 평균 양을 계산함으로써 측정된다. Asn297 은 Fc 영역 내의 약 위치 297 (Fc 영역 잔기의 EU 넘버링) 에 위치하는 아스파라긴 잔기를 말한다; 그러나, Asn297 은 또한 항체 내의 미미한 서열 변형으로 인해, 위치 297 의 업스트림 또는 다운스트림 약 ± 3 개 아미노산, 즉, 위치 294 내지 300 에 위치할 수 있다. 이러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, US 2003/0157108; US 2004/0093621 을 참조한다. "탈-푸코실화" 또는 "푸코오스-결핍" 항체 변이체와 관련된 공개문헌의 예에는 US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; Okazaki, A., et al., J. Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249; Yamane-Ohnuki, N., et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622 가 포함된다. 탈-푸코실화 항체의 제조가 가능한 세포주의 예에는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 (Ripka, J., et al., Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986) 533-545; US 2003/0157108; 및 WO 2004/056312, 특히 실시예 11), 및 녹아웃 (knockout) 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실트랜스페라아제 유전자인 FUT8, 녹아웃 CHO 세포 (예를 들어, Yamane-Ohnuki, N., et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622; Kanda, Y., et al., Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680-688; 및 WO 2003/085107 참조) 가 포함된다.
항체 변이체는 예를 들어, 항체의 Fc 영역에 부착된 바이안테너리 올리고당이 GlcNAc 에 의해 이등분되는 이등분된 올리고당으로 추가로 제공된다. 이러한 항체 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체의 예는 예를 들어, WO 2003/011878; US 6,602,684; 및 US 2005/0123546 에 기재된다. Fc 영역에 부착된 올리고당 내에 하나 이상의 갈락토오스 잔기를 갖는 항체 변이체가 또한 제공된다. 이러한 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체는 예를 들어, WO 1997/30087; WO 1998/58964; 및 WO 1999/22764 에 기재되어 있다.
c) Fc 영역 변이체
특정 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 개질이 본원에 제공된 항체의 Fc 영역 내로 도입될 수 있어, Fc 영역 변이체를 생성한다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 개질 (예를 들어, 치환) 을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역) 을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 일부 그러나 전부는 아닌 효과기 기능을 가진 항체 변이체를 고려하며, 이것은 생체 내 항체의 반감기가 중요하지만, 특정 효과기 기능 (예컨대, 보체 및 ADCC) 은 불필요하거나 유해한 적용에 대해 바람직한 후보자가 될 수 있게 한다. 시험관 내 및/또는 생체 내 세포독성 어세이는 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체 (FcR) 결합 어세이는 항체가 FcγR 결합은 결여되지만 (그러므로 ADCC 활성이 결여된 것 같음), FcRn 결합 활성을 보유하고 있음을 확인하기 위해 수행될 수 있다. ADCC 를 매개하기 위한 주된 세포인 NK 세포는 FcγRIII 만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 을 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492] 의 페이지 464 에 있는 표 3 에 요약되어 있다. 관심의 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관 내 어세이의 비-제한적인 예가 US 5,500,362 (예를 들어, Hellstrom, I., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063; 및 Hellstrom, I., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502 참조); US 5,821,337 (Bruggemann, M., et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361 참조) 에 기재되어 있다. 대안적으로는, 비-방사성 어세이 방법이 사용될 수 있다 (예를 들어, 유세포 분석을 위한 ACTI™ 비-방사성 세포독성 어세이 (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); 및 CytoTox 96® 비-방사성 세포독성 어세이 (Promega, Madison, WI) 참조). 이러한 어세이를 위한 유용한 효과기 세포에는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 살해 (NK) 세포가 포함된다. 대안적으로는, 또는 부가적으로는, 관심의 분자의 ADCC 활성은 문헌 [Clynes, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656] 에 기재된 바와 같은 생체 내에서, 예를 들어 동물 모델에서 평가될 수 있다. C1q 결합 어세이는 또한 항체가 C1q 에 결합할 수 없고 그러므로 CDC 활성이 결여된다는 것을 확인하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402 에서의 C1q 및 C3c 결합 ELISA 를 참조한다. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 어세이가 수행될 수 있다 (예를 들어, Gazzano-Santoro, H., et al., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171; Cragg, M.S., et al., Blood 101 (2003) 1045-1052; 및 Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743 참조). FcRn 결합 및 생체 내 소거/반감기 측정은 또한 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다 (예를 들어, Petkova, S.B., et al., Int. Immunol. 18 (2006) 1759-1769 참조).
효과기 기능이 감소된 항체에는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 (US 6,737,056) 중 하나 이상의 치환을 가진 것이 포함된다. 이러한 Fc 돌연변이체에는 잔기 265 및 297 의 알라닌으로의 치환을 가진 소위 "DANA" Fc 돌연변이체를 포함하여 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 (US 7,332,581) 중 2 개 이상에서의 치환을 가진 Fc 돌연변이체가 포함된다.
FcR 에 대한 결합이 개선된 또는 소멸된 특정 항체 변이체가 기재된다 (예를 들어, US 6,737,056; WO 2004/056312, 및 Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604 참조).
특정 구현예에서, 항체 변이체는 ADCC 를 개선하는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어, Fc 영역의 위치 298, 333, 및/또는 334 (잔기의 EU 넘버링) 에서의 치환을 가진 Fc 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 예를 들어, US 6,194,551, WO 99/51642, 및 [Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184] 에 기재되는 바와 같이, 변형된 (즉, 개선된 또는 소멸된) C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성 (Complement Dependent Cytotoxicity: CDC) 을 산출하는 Fc 영역에서의 변형이 이루어진다.
모체 IgG 의 태아로의 전달을 담당하고 있는 신생아 Fc 수용체 (FcRn) (Guyer, R.L., et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593, 및 Kim, J.K., et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434) 에 대한 결합이 개선되고 반감기가 증가된 항체는 US 2005/0014934 에 기재되어 있다. 상기 항체는 FcRn 에 대한 Fc 영역의 결합을 개선하는 하나 이상의 치환을 가진 Fc 영역을 포함한다. 이러한 Fc 변이체에는 Fc 영역 잔기: 238, 252, 253, 254, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 하나 이상에서의 치환, 예를 들어, Fc 영역 잔기 434 의 치환 (US 7,371,826) 을 가진 것들이 포함된다.
또한 Fc 영역 변이체의 다른 예와 관련된 Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740; US 5,648,260; US 5,624,821; 및 WO 94/29351 을 참조한다.
d) 시스테인 조작된 항체 변이체
특정 구현예에서, 시스테인 조작된 항체, 예를 들어, 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된 "thioMAb" 를 제작하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 구현예에서, 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에서 일어난다. 상기 잔기를 시스테인으로 치환함으로써, 반응성 티올 기가 항체의 접근가능한 부위에 위치하고, 본원에 추가로 기재되는 바와 같이 면역공액체를 제작하기 위해 항체를 다른 부분, 예컨대 약물 부분 또는 링커-약물 부분에 공액시키기 위해 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 하기 잔기 중 임의의 하나 이상이 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (Kabat 넘버링); 중쇄의 A118 (EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 넘버링). 시스테인 조작된 항체는 예를 들어, US 7,521,541 에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다.
e) 항체 유도체
특정 구현예에서, 본원에 제공되는 항체는 당업계에 공지되고 쉽게 이용가능한 부가적인 비-단백질성 부분을 함유하도록 추가로 개질될 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 부분에는 수용성 중합체가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 수용성 중합체의 비-제한적인 예에는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (동종중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 동종중합체, 프롤릴프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸렌화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알코올, 및 이의 혼합물이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드가 이의 수 중 안정성으로 인해 제조시 유리할 수 있다. 중합체는 임의의 분자량의 것일 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 수는 가변적일 수 있고, 1 개 초과의 중합체가 부착되는 경우, 이들은 동일 또는 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은, 항체 유도체가 정의된 조건 하의 요법에서 사용될 것인지 등의, 개선시키고자 하는 항체의 특정한 특성 또는 기능을 포함하나 이에 제한되지 않고 고려하여 결정될 수 있다.
또다른 구현예에서, 방사선에 대한 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 항체와 비-단백질성 부분의 공액체가 제공된다. 하나의 구현예에서, 비-단백질성 부분은 탄소 나노튜브이다 (Kam, N.W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605). 방사선은 임의의 파장일 수 있고, 보통의 세포에는 해가 없으나, 항체-비-단백질성 부분에 근접한 세포를 치사시키는 온도로 비-단백질성 부분을 가열하는 파장이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
III. 재조합 방법 및 조성물
단일클론 항체의 제조 방법은 Kohler and Milstein (Nature 256 (1975) 495-497) 에 의해 처음으로 보고되었다. 그러므로 항체-코딩 핵산 (DNA) 을 안정하게 도입함으로써 골수종 세포와 함께 재조합 항체를 제조하는 것이 보고되어 있다 (Oi, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983) 6351-6355 참조).
항체의 코딩 핵산 (완전한 항체에 대해 또는 가변 도메인에 대해) 은 항체 생성 세포로부터 통상의 절차를 사용하여 단리되고 서열분석될 수 있다. 단리 후 코딩 핵산은 하나 이상의 발현 벡터 내에 위치할 수 있다. 가변 도메인의 코딩 핵산 만이 단리되는 경우, 발현 벡터는 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 각각 코딩하는 핵산을 포함한다 (예를 들어, US 5,658,570 참조). 발현 벡터는 다르게는 항체를 분비하지 않는 원핵 (E. coli) 또는 진핵 숙주 세포 (CHO, HEK, BHK, SP2/0) 내로 트랜스펙션될 수 있다.
코딩 핵산이 예컨대 파지 디스플레이 라이브러리, 효모 디스플레이 라이브러리, 또는 일반적으로 세포 표면 디스플레이 라이브러리와 같은 디스플레이 라이브러리로부터 유래되는 경우, 이것은 발현 벡터 내로 직접 클로닝될 수 있다.
항체는 예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 에 기재된 바와 같이 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 제조될 수 있다. 하나의 구현예에서, 본원에 기재된 항체를 코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 이러한 핵산은 항체의 VL 을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH 를 포함하는 아미노산 서열 (예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄) 을 코딩할 수 있다. 추가의 구현예에서, 이러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터 (예를 들어, 발현 벡터) 가 제공된다. 추가의 구현예에서, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 하나의 이러한 구현예에서, 숙주 세포는: (1) 항체의 VL 을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH 를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL 을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제 1 벡터 및 항체의 VH 를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제 2 벡터를 포함한다 (예를 들어, 이것으로 형질전환되었다). 하나의 구현예에서, 숙주 세포는 진핵세포, 예를 들어, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프계 세포 (예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포) 이다. 하나의 구현예에서, 항체의 발현에 적합한 조건 하에서 상기 제공된 바와 같이 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하고, 임의로 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지) 로부터 항체를 회수하는 것을 포함하는, 본원에 보고된 항체의 제조 방법이 제공된다.
본원에 보고된 항체의 재조합 제조를 위해, 항체를 코딩하는 핵산을, 예를 들어 상기 기재된 바와 같이 단리하고 숙주 세포 내에서의 추가의 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터 내로 삽입한다. 이러한 핵산은 통상의 절차를 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 쉽게 단리되고 서열분석될 수 있다.
항체-코딩 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포에는 본원에 기재된 원핵 또는 진핵 세포가 포함된다. 예를 들어, 항체는 특히 당화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않은 경우, 박테리아에서 생성될 수 있다. 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현을 위해, 예를 들어, US 5,648,237, US 5,789,199, 및 US 5,840,523 을 참조한다. (또한, E. coli 에서의 항체 단편의 발현을 기재하고 있는, Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254 를 참조한다). 발현 후, 가용성 분획 내의 박테리아 세포 페이스트로부터 항체를 단리할 수 있고, 추가로 정제할 수 있다.
원핵생물 외에도, 진핵 미생물, 예컨대 사상 진균 또는 효모는 부분적인 또는 완전한 인간 당화 패턴을 가진 항체의 생성을 야기하는, 당화 경로가 "인간화된" 진균 및 효모 균주를 비롯하여 항체-코딩 벡터에 대한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 문헌 [Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414; 및 Li, H., et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215] 를 참조한다.
당화 항체의 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물) 로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예에는 식물 및 곤충 세포가 포함된다. 곤충 세포와 함께, 특히 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포의 트랜스펙션을 위해 사용될 수 있는 수많은 배큘로바이러스 균주가 확인되었다.
식물 세포 배양물도 또한 숙주로서 이용될 수 있다. 예를 들어, US 5,959,177, US 6,040,498, US 6,420,548, US 7,125,978, 및 US 6,417,429 (형질전환 식물에서 항체를 제조하는 PLANTIBODIES™ 기술을 기재하고 있음) 를 참조한다.
척추동물 세포가 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액에서 성장하도록 적응된 포유류 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 다른 예는 SV40 에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7); 인간 배아 신장 세포주 (예를 들어, Graham, F.L., et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74 에 기재된 293 또는 293 세포); 아기 햄스터 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들어, Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252 에 기재된 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 자궁경부암 세포 (HELA); 개 신장 세포 (MDCK; 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐세포 (W138); 인간 간세포 (Hep G2); 마우스 유방종양 (MMT 060562); 예를 들어, 문헌 [Mather, J.P., et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68] 에 기재된 바와 같은, TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포가 포함된다. 다른 유용한 포유류 숙주 세포주에는 DHFR- CHO 세포를 비롯한 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 (Urlaub, G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220); 및 골수종 세포 주, 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0 이 포함된다. 항체 생성에 적합한 특정 포유류 숙주 세포주의 리뷰를 위해서는, 예를 들어 문헌 [Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268] 을 참조한다.
III. 면역공액체
본 발명은 또한 하나 이상의 세포독성제, 예컨대 화학치료제 또는 약물, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소, 또는 이의 단편), 또는 방사성 동위원소에 공액된 본원에 보고된 항체를 포함하는 면역공액체를 제공한다.
하나의 구현예에서, 면역공액체는 항체가 마이탄시노이드 (US 5,208,020, US 5,416,064 및 EP 0 425 235 B1 참조); 아우리스타틴, 예컨대 모노메틸 아우리스타틴 약물 부분 DE 및 DF (MMAE 및 MMAF) (US 5,635,483, US 5,780,588, 및 US 7,498,298 참조); 돌라스타틴; 칼리케아미신 또는 이의 유도체 (US 5,712,374, US 5,714,586, US 5,739,116, US 5,767,285, US 5,770,701, US 5,770,710, US 5,773,001, 및 US 5,877,296; Hinman, L.M., et al., Cancer Res. 53 (1993) 3336-3342; 및 Lode, H.N., et al., Cancer Res. 58 (1998) 2925-2928 참조); 안트라사이클린, 예컨대 다우노마이신 또는 독소루비신 (Kratz, F., et al., Curr. Med. Chem. 13 (2006) 477-523; Jeffrey, S.C., et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 16 (2006) 358-362; Torgov, M.Y., et al., Bioconjug. Chem. 16 (2005) 717-721; Nagy, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 829-834; Dubowchik, G.M., et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12 (2002) 1529-1532; King, H.D., et al., J. Med. Chem. 45 (2002) 4336-4343; 및 미국 특허 번호 6,630,579 참조); 메토트렉세이트; 빈데신; 탁산, 예컨대 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀 및 오르타탁셀; 트리코테센; 및 CC1065 를 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 약물에 공약되는, 항체-약물 공액체 (Antibody-Drug Conjugate: ADC) 이다.
또다른 구현예에서, 면역공액체는 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬 (슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa) 유래의 것), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모덱신 A 사슬, 알파-사르신, 알류리테스 포르디이 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 (dianthin) 단백질, 파이토라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 (momordica charantia) 억제제, 큐르신 (curcin), 크로틴 (crotin), 사포나리아 오피시날리스 (Saponaria officinalis) 억제제, 겔로닌 (gelonin), 미토겔린 (mitogellin), 레스트릭토신 (restrictocin), 페노마이신 (phenomycin), 에노마이신 (enomycin), 및 트리코테센 (tricothecene) 을 포함하나 이에 제한되지 않는 효소적으로 활성인 독소 또는 이의 단편에 공액되는 본원에 기재된 항체를 포함한다.
또다른 구현예에서, 면역공액체는 방사능공액체를 형성하기 위해 방사성 원자에 공액된 본원에 기재된 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소가 방사능공액체의 제조에 이용가능하다. 예에는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu 의 방사성 동위원소가 포함된다. 검출을 위해 방사능공액체가 사용되는 경우, 이것은 신티그래피 연구를 위해, 예를 들어, TC99m 또는 I123, 또는 핵 자기 공명 (NMR) 영상 (또한 자기 공명 영상, MRI 으로 공지됨) 을 위한 스핀 라벨, 예컨대 다시 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철 등의 방사성 원자를 포함할 수 있다.
항체 및 세포독성제의 공액체가 다양한 이작용성 단백질 커플링제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이작용성 유도체 (예컨대, 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대, 글루타알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대, 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠) 을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta, E.S., et al., Science 238 (1987) 1098-1104] 에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민 펜타아세트산 (MX-DTPA) 은 항체에 대한 방사능뉴클레오티드의 공액을 위한 예시적 킬레이트제이다. WO 94/11026 을 참조한다. 연결기는 세포 내에 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "분할가능 연결기" 일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정성 연결기, 펩티다아제-민감성 연결기, 광불안정성 연결기, 디메틸 연결기 또는 디술피드-함유 연결기 (Chari, R.V., et al., Cancer Res. 52 (1992) 127-131; US 5,208,020) 가 사용될 수 있다.
본원의 면역공액체 또는 ADC 는 시판되는 (예를 들어, Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A 로부터) BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC, 및 술포-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트) 를 포함하나 이에 제한되지 않는 가교-연결기 시약으로 제조된 공액체가 고려되나 이에 제한되는 것은 아니다.
IV. 진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
특정 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 항체는 생물학적 샘플 중의 이의 항원의 존재를 검출하기 위해 유용하다. 본원에 사용되는 용어 "검출" 은 정량적 또는 정성적 검출을 망라한다. 특정 구현예에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직을 포함한다.
하나의 구현예에서, 진단 또는 검출 방법에 사용하기 위한 본원에 보고된 항체가 제공된다. 추가의 양상에서, 생물학적 샘플 중의 항원의 존재를 검출하기 위한 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 본 방법은 항체의 그의 항원에 대한 결합을 허용하는 조건 하에서 생물학적 샘플을 본원에 기재된 항체와 접촉시키고, 항체와 항원 사이에 복합체가 형성되는지를 검출하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 시험관 내 또는 생체 내 방법일 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에 보고된 표지된 항체가 제공된다. 표지에는 직접 검출되는 표지 또는 부분 (예컨대 형광, 발색단, 전자-밀집, 화학발광 및 방사성 표지) 뿐 아니라, 예를 들어, 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해 간접적으로 검출되는 효소 또는 리간드와 같은 부분이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 예시적 표지에는 방사능동위원소 32P, 14C, 125I, 3H, 및 131I, 형광단, 예컨대 귀금속 킬레이트 또는 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실, 엄벨리페론 (umbelliferone), 루시퍼라아제, 예를 들어, 반딧불 루시퍼라아제 및 박테리아 루시퍼라아제 (US 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 호스래디시 페록시다아제 (HRP), 알칼리 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 라이소자임, 당류 옥시다아제, 예를 들어, 글루코오스 옥시다아제, 갈락토오스 옥시다아제, 및 글루코오스-6-포스페이트 디하이드로게나제, HRP 와 같은 염료 전구체를 산화시키기 위해 과산화수소를 사용하는 효소와 커플링된 헤테로시클릭 옥시다아제, 예컨대 유리카아제 (uricase) 및 잔틴 옥시다아제, 락토퍼옥시다아제, 또는 마이크로퍼옥시다아제, 비오틴/아비딘, 스핀 라벨, 박테리오파지 라벨, 안정한 유리 라디칼 등이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
V. 약학 제형
본원에 기재된 항체의 약학 제형은 원하는 정도의 순도를 가진 이러한 항체와 하나 이상의 임의의 약학적으로 허용가능한 담체 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)) 를, 동결건조 제형 또는 수용액 형태로 혼합함으로써 제조된다. 약학적으로 허용가능한 담체는 사용되는 투여량 및 농도에서 수여자에게 일반적으로 무독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 비롯한 산화방지제; 방부제 (예컨대 옥타데실 디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 염화헥사메토늄; 염화벤잘코늄; 염화벤제토늄; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레솔); 저 분자량 (약 10 개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리(비닐피롤리돈); 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 단당류, 이당류 및 글루코오스, 만노오스, 또는 덱스트린을 비롯한 기타 탄수화물; 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로오스, 만니톨, 트레할로오스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 본원의 예시적 약학적으로 허용가능한 담체에는 침입형 (interstitial) 약물 분산제, 예컨대 가용성 중성-활성 히알루로니다아제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어, 인간 가용성 PH-20 히알루로니다아제 당단백질, 예컨대 rhuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.) 이 추가로 포함된다. rhuPH20 을 비롯한 특정의 예시적 sHASEGP 및 사용 방법은 미국 특허 공개 번호 2005/0260186 및 2006/0104968 에 기재되어 있다. 하나의 양상에서, sHASEGP 는 하나 이상의 부가적인 글리코사미노글리카나아제, 예컨대 콘드로이티나아제와 조합된다.
예시적 동결건조 항체 제형은 US 6,267,958 에 기재되어 있다. 수성 항체 제형에는 US 6,171,586 및 WO 2006/044908 에 기재된 것들이 포함되고, 수성 항체 제형은 히스티딘-아세테이트 완충액을 포함한다.
본원의 제형은 또한 특정 증상을 치료하는데 필수적인 하나 초과의 활성 성분, 바람직하게는 서로에 대해 악영향을 주지는 않는 상보적 활성을 가진 성분을 함유할 수 있다. 이러한 활성 성분은 의도되는 목적에 유효한 양으로 조합으로 적합하게 존재한다.
활성 성분은 콜로이드 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼 중에 각각, 예를 들어, 코아세르베이션 (coacervation) 기법에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸 메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 포획될 수 있다. 이러한 기법은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)] 에 기재되어 있다.
서방성 제제가 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예에는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반-침투성 매트리스가 포함되고, 상기 매트리스는 성형품, 예를 들어, 필름, 또는 마이크로캡슐의 형태이다.
생체 내 투여를 위해 사용하고자 하는 제형은 일반적으로 멸균된다. 멸균은 예를 들어, 멸균 여과 멤브레인을 통한 여과에 의해 쉽게 달성될 수 있다.
VI. 제조품
본 발명의 또다른 양상에서, 상기 기재된 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조품이 제공된다. 제조품은 용기 및 용기와 함께 또는 용기 상에 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기에는 예를 들어, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 백 등이 포함된다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 용기는 조성물을 그 자체로 또는 상태의 치료, 예방 및/또는 진단에 유효한 또다른 조성물과 조합으로 담고 있고 멸균 접근 포트 (예를 들어, 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘에 의해 관통가능한 마개를 가진 바이알일 수 있다) 를 가질 수 있다. 조성물 중의 하나 이상의 활성제는 본 발명의 항체이다. 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물이 선택된 상태의 치료에 사용된다는 것을 표시한다. 게다가, 제조품은 (a) 본 발명의 항체를 포함하는 조성물을, 그 안에 함유하고 있는 제 1 용기; 및 (b) 추가의 세포독성제 또는 다른 치료제를 포함하는 조성물을, 그 안에 함유하고 있는 제 2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 본 구현예에서 제조품은 조성물이 특정 상태를 치료하기 위해 사용될 수 있다는 것을 나타내는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로는, 또는 부가적으로는, 제조품은 약학적으로-허용가능한 완충제, 예컨대 주사용 정균수 (Bacteriostatic Water For Injection: BWFI), 포스페이트-완충 식염수, 링거액 및 덱스트로오스 용액을 포함하는 제 2 (제 3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이것은 다른 완충제, 희석제, 충전제, 바늘 및 주사기를 포함하여, 광고 및 사용자 관점으로부터 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
상기 제조품 중 임의의 것이 본원에 보고된 항체 대신에 또는 그에 더해 본 발명의 면역공액체를 포함할 수 있다고 이해된다.
하기 실시예, 도 및 서열은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되며, 이의 참 범주는 특허청구범위에서 언급된다. 본 발명의 취지로부터 벗어남 없이 언급된 절차에 대한 변형이 이루어질 수 있는 것으로 이해된다.
실시예
방법
전기분무 이온화질량 분광 분석 (ESI-MS)
단백질 분취액 (50 ㎍) 에 0.5 ㎕ N-Glycanase plus (Roche) 및 인산나트륨 완충액을 (0.1 M, pH 7.1) 첨가하여 탈글리코실화시켜, 최종 샘플 부피 115 ㎕ 을 수득하였다. 혼합물을 37℃ 에서 18 시간 동안 인큐베이션하였다. 이후 환원 및 변성을 위해, 4 M 구아니딘 * HCl (Pierce) 중의 60 ㎕ 0.5 M TCEP (Pierce) 및 50 ㎕ 8 M 구아니딘 * HCl 을 첨가하였다. 혼합물을 37℃ 에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 크기 배제 크로마토그래피 (세파로오스 G-25, 등용매, 40% 아세토니트릴 + 2% 포름산) 에 의해 탈염시켰다. ESI 질량 스펙트럼 (+ve) 을 나노 ESI 공급원 (TriVersa NanoMate, Advion) 이 장착된 Q-TOF 기계 (maXis, Bruker) 로 기록하였다. MS 파라미터 설정은 다음과 같았다: 전송: 퓨넬 (Funnel) RF, 400 Vpp; ISCID 에너지, 0 eV; 멀티폴 (Multipole) RF, 400 Vpp; 사중극: 이온 에너지, 4.0 eV; 저 질량, 600 m/z; 공급원: 건조 기체, 8 L/분; 건조 기체 온도, 160℃; 충돌 셀 (Collision Cell): 충돌 에너지, 10 eV; 충돌 RF: 2000 Vpp; 이온 냉각기: 이온 냉각기 RF, 300 Vpp; 전송 시간: 120 ㎲; 프리 펄스 스토리지 (Pre Puls Storage), 10 ㎲; 스캔 범위 m/z 600 내지 2000. 데이터 평가를 위해, 사내에서 개발된 소프트웨어 (MassAnalyzer) 를 사용하였다.
FcRn 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 분석
FcRn 에 대한 야생형 항체 및 돌연변이체의 결합 특성을 BIAcore T100 기계 (BIAcore AB, Uppsala, Sweden) 를 사용하는 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 기술에 의해 분석하였다. 상기 시스템은 분자 상호작용 연구에 대해 잘 정립된다. 이것은 리간드/분석물 결합의 지속적인 실시간 모니터링을 가능하게 하고 그러므로 다양한 어세이 설정에서 동적 파라미터의 측정이 가능하다. SPR-기술은 금이 코팅된 바이오센서 칩의 표면과 근접한 굴절률의 측정에 기반한다. 굴절률의 변화는 부동화된 리간드와 용액 내로 주입된 분석물과의 상호작용에 의해 야기되는 표면 상의 질량 변화를 나타낸다. 분자가 표면 상의 부동화된 리간드에 결합하는 경우에는 질량이 증가하고, 해리의 경우에는 질량이 감소한다. 현행 어세이에서, FcRn 수용체는 400 반응 유닛 (Response unit: RU) 의 수준까지의 아민 커플링을 통해 BIAcore CM5-바이오센서 칩 (GE Healthcare Bioscience, Uppsala, Sweden) 상에 부동화되었다. 어세이는 실온에서 영동 완충액 및 희석 완충액으로서 PBS, 0.05% Tween20 pH 6.0 (GE Healthcare Bioscience) 로 실시되었다. 200 nM 의 본래의 또는 산화된 항체 샘플을 50 ㎕/분의 유속으로 실온에서 주입하였다. 회합 시간은 180 초였고, 해리 상은 360 초 걸렸다. 칩 표면의 재생은 HBS-P, pH 8.0 의 짧은 주입에 의해 도달하였다. SPR-데이터의 평가는 주입 후 180 초 및 주입 후 300 초에 생물학적 반응 신호 높이의 비교에 의해 수행되었다. 상응하는 파라미터는 RU 최대 수준 (주입 후 180 초) 및 후기 안정성 (주입 종료 300 초 후) 이다.
실시예 1
FcRn 친화성 컬럼의 제조
HEK293 세포에서의 FcRn 의 발현
FcRn 을 FcRn 및 베타-2-마이크로글로불린의 코딩 서열을 함유하는 2 개의 플라스미드를 이용하여 HEK293 세포의 트랜스펙션에 의해 일시적으로 발현시켰다. 트랜스펙션된 세포를 36.5℃, 120 rpm (진탕기 진폭 5 cm), 80% 습도 및 7% CO2 의, 진탕기 플라스크에서 배양하였다. 세포를 3 내지 4*105 세포/ml 의 밀도로 2 내지 3 일 마다 희석하였다.
일시적 발현을 위해, 14 ℓ 스테인레스 스틸 생물반응기를 36.5℃, pH 7.0 ± 0.2, pO2 35 % (N2 및 공기로 탈기, 총 기체 흐름 200 ml 분-1) 및 100 - 400 rpm 의 교반기 속도에서 8 ℓ 의 배양 부피로 시작하였다. 세포 밀도가 20*105 세포/ml 에 도달하였을 때, 10 mg 플라스미드 DNA (등몰량의 두 플라스미드) 를 400 ml Opti-MEM (Invitrogen) 에 희석하였다. 상기 혼합물에 20 ml 의 293fectin (Invitrogen) 을 첨가하고, 이후 이것을 15 분 동안 실온에서 인큐베이션하고 이어서 발효조로 옮겼다. 다음날부터, 세포에 영양분을 지속적인 방식으로 공급하였다: 공급 용액을 500 ml/일의 비율로 첨가하고, 2 g/ℓ 초과의 수준을 유지하는데 필요한 글루코오스를 첨가하였다. 1 ℓ 버킷 (bucket): 4000 rpm 으로의 스윙 헤드 (swing head) 원심분리를 90 분 동안 사용하여 트랜스펙션 7 일 후에 상청액을 수확하였다. 상청액 (13 L) 을 Sartobran P 필터 (0.45 ㎛ + 0.2 ㎛, Sartorius) 에 의해 맑게하고, 그로부터 FcRn 베타-2-마이크로글로불린 복합체를 정제하였다.
신생아 Fc 수용체의 비오틴화
HEK293 세포에서 β2-마이크로글로불린과 동시 발현된 His-Avi Tag 가 있는 FcRn 의 가용성 세포외 도메인을 하기와 같이 정제 후에 비오틴화하였다:
150 mM KCl, 250 ㎕ PBS 및 1 개의 정제 Complete 프로테아제 억제제 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) 를 함유하는 5 ml 20 mM 구연산나트륨 완충액, pH 5.5 중의 1.2 mg 내지 12 mg FcRn/β2-마이크로글로불린을 제조사의 지침 (Bulk BIRA) 에 따라 Avidity 사의 비오틴화 키트를 사용하여 비오틴화하였다. 비오틴화 반응을 실온에서 밤새 수행하였다. 개질된 단백질을 150 mM NaCl, pH 7.5 를 함유하는 20 mM 인산나트륨 완충액에 대해 4℃ 에서 밤새 투석하여 과량의 비오틴을 제거하였다.
스트렙타비딘 세파로오스에 대한 커플링
1 그램 스트렙타비딘 세파로오스 (GE Healthcare) 를 비오틴화되고 투석된 수용체 (1.2 내지 12 mg FcRn/β2-마이크로글로불린, 표준 분석 적용을 위해 3 mg 가 선택되었음) 에 첨가하고 진탕하면서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 수용체 유도체화 세파로오스를 1 ml XK 컬럼 (GE Healthcare) 에 채웠다.
실시예 2
FcRn 친화성 컬럼을 사용하는 크로마토그래피
수용체 유도체화 세파로오스를 1 ml XK 컬럼 (GE Healthcare) 에 채우고 이후 FcRn 컬럼을 150 mM NaCl, pH 5.5 를 함유하는 20 mM 2-(N-모르폴린)-에탄술폰산 (MES) 완충액으로 평형시켰다.
조건:
컬럼 면적: 50 mm x 5 mm
층 높이: 5 cm
로딩량: 50 ㎍ 샘플
평형 완충액: pH 5.5 로 조정된 150 mM NaCl 를 함유하는 20 mM MES
용리 완충액: pH 8.8 로 조정된 150 mM NaCl 를 함유하는 20 mM Tris/HCl
용리: 7.5 CV 평형 완충액, 30 CV 중에서 100% 용리 완충액으로, 10 CV 용리 완충액
50 내지 100 ㎍ 의 단백질을 함유하는 항체 또는 융합 단백질 샘플을 pH 5.5 로 조정하고, AKTA explorer 10 XT 또는 Dionex Summit (Dionex, Idstein, Germany) 를 사용하는 FcRn 컬럼에 적용하였다. 이후 5 cm 층 높이의 컬럼을 평형 완충액 20 mM MES, 150 mM NaCl, pH 5.5 의 5-10 컬럼 부피로 세정하였다. 친화성-결합된 Fc-함유 단백질을 30 컬럼 부피 중의 20 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, pH 8.8 까지 pH 구배로 용리하였다. 개질 항체의 완전한 용리를 위해, pH 를 pH 8.8 까지 구배로 증가시켰다. 실험을 실온에서 수행하였다. 280 nm 에서의 흡광도의 지속적인 측정에 의해 용리 프로파일을 수득하였다. 샘플 주입 후 검출기에 도달하기 위해 분석물 피크에 대해 걸리는 시간, X 를 체류 시간으로 불렀다.
실시예 3
FcRn 컬럼 상의 체류 시간과 생체 내 반감기와의 연관성
10 mg/kg (n=8) 의 단일 i.v. 투여 후 인간 FcRn 형질전환 C57BL/6J 마우스에서 생체 내 반감기를 측정하고, FcRn 컬럼 상의 체류 시간과 비교하였다 (하기 표 참조). FcRn 컬럼으로부터 후기 용리를 나타낸 항체가 FcRn 형질전환 마우스에서 더 긴 반감기를 갖는다는 것을 발견하였다.
항체 체류 시간
[분]		 생체 내 반감기
[h]
항-Abeta 항체 (야생형) 45.5 103 +/- 51
항-Abeta 항체 (YTE-돌연변이) 52.5/ 66 197 +/- 53
항-IGF-1R 항체 (야생형) 45.5 97 +/- 9
항-IGF-1R 항체 (YTE-돌연변이체) 58 211 +/- 41
실시예 4
인간 FcRn, 마우스 FcRn 및 사이노몰거스 원숭이 FcRn 의 정제
헥사히스-태그된 (hexahis-tagged) 단백질을 함유하는 정화된 상청액을 Ni NTA 친화성 크로마토그래피 수지 (Qiagen, Hanbrechtikon, Switzerland) 상에 4℃ 에서 로딩하였다. 500 mM NaCl (pH 7.4) 을 포함하고 20 mM 각각 100 mM 이미다졸을 함유하는 20 mM 인산나트륨 완충액으로의 세정 단계 후, 단백질을 2 ml/분의 유속에서 AKTA Prime 크로마토그래피 시스템 (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) 상에 300 mM 이미다졸을 함유하는 동일한 완충액으로의 배치 용리를 사용하여 용리하였다. 분획을 수집하고, 크기 배제 크로마토그래피 (SuperdexTM 200, GE Healthcare, Zurich, Switzerland) 상에서 500 mM NaCl 을 함유하는 인산나트륨 완충액에서 추가로 정제하였다. 정제된 단백질을 Nanodrop 분광 광도계 (Nanodrop Technologies, Wilmington, DE) 를 사용하여 정량하고, 변성 및 환원 조건 하에서 MES 완충액 중의 NuPAGE 4-12% Bis-Tris 젤 상에 SDS PAGE 에 의해 분석하였다.
실시예 5
마우스 및 사이노몰거스 원숭이 FcRn 친화성 컬럼 크로마토그래피
하기 표에는, 사이노몰거스 원숭이 유래의 FcRn 을 포함하는 친화성 컬럼 상에서의 예시적 인간 항체의 체류 시간이 제시된다. 데이터는 하기 조건을 사용하여 수득되었다: 용리 완충액: 20 mM TRIS/HCl, 150 mM NaCl, pH 8.5. 추가의 설명을 위해서는 실시예 2 를 참조한다. 용어 YTE-돌연변이체는 삼중 돌연변이체 M252Y/S254T/T256E 를 나타낸다.
항체 체류 시간 [분]
항-Abeta 항체 (야생형) 48.8
항-Abeta 항체 (YTE-돌연변이체) 57.4
항-IGF-1R 항체 (야생형) 51.2
항-IGF-1R 항체 (YTE-돌연변이체) 63.0
하기 표에는, 쥣과 FcRn 상의 예시적 인간 항체의 체류 시간이 제시된다. 데이터는 하기 조건을 사용하여 수득되었다: 1 ml 세파로오스 상에 커플링된 1.2 mg 수용체. 용리 완충액: 20 mM TRIS/HCl, 150 mM NaCl, pH 8.5. 추가의 설명을 위해서는 실시예 2 를 참조한다. 용어 YTE-돌연변이체는 용리 완충액의 pH 가 9.5 로 조정되지 않는다면 이들이 용리되지 못하기 때문에 본 표에는 포함시키지 않았다.
항체 체류 시간 [분]
항-Abeta 항체 (야생형) 54.7
항-IGF-1R 항체 (야생형) 48.8
사이노몰거스 원숭이 FcRn 친화성 컬럼은 인간화 항체의 결합에 관해 인간 FcRn 친화성 컬럼과 유사하게 반응을 보였다. 한편 쥣과 FcRn 컬럼에 대한 인간화 항체의 결합은 후기 체류에서 볼 수 있듯이, 인간 FcRn 친화성 컬럼보다 강하다.
실시예 6
항체 단편의 생성
F(ab')2 단편 및 Fc-영역 단편은 50 ㎍ 항체 당 1 ㎍ IdeS 시스테인 프로테아제를 첨가함으로써, 100 mM Tris, pH 8.0 로 1:1 희석된 전장 항체의 분할 및 37℃ 에서 2 시간 동안의 인큐베이션에 의해 제조되었다. 산출된 분할 생성물 F(ab')2 및 Fc 는 AKTA Explorer 크로마토그래피 시스템 (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) 을 사용하는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 컬럼 (Superdex 200, GE Healthcare, Zurich, Switzerland) 상에서 분리되었고, 피크 분획을 모집하였다. 동일한 컬럼 상의 분자량 표준은 이들의 체류 시간에 근거해 2 개의 분할 생성물을 확인하는 역할을 하였다.
전장 항체의 체류 시간은 현저히 다양하였다. 반면, 모든 시험된 항체의 각각의 Fc 부분의 체류 시간은 사실상 서로 상이하지 않았다 (<1%).
플라스민이 전장 항체의 분할을 위해 사용되는 경우, 동일한 발견이 수득되었다 (데이터는 제시되지 않음).
실시예 7
FcRn 컬럼 상의 체류 시간과 산화 상태와의 연관성
FcRn 친화성 크로마토그래피에서의 체류 시간에 대한 항체의 산화 영향을 연구하였다. IgG1 항체 (1 mg/ml) 의 산화는 항체를 40℃ 에서 2 개월 동안 저장함으로써 관찰하였다. 비개질되고 산화된 항체 샘플을 FcRn 친화성 크로마토그래피 및 FcRn 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 기술에 의해 분석하였다. 항체의 산화는 펩티드 맵핑 (mapping) - 및 전기분사 이온화 질량 분광 분석 (ESI-MS) 에 의해 특징지어졌다.
ESI-MS 데이터는 IgG1 항체의 중쇄의 대략 50 % 가 2 개월 동안 40℃ 가속 조건 하에 완충액 (20 mM His/His*HCl, 240 mM 트레할로오스, 0.02% 폴리소르베이트 20) 중에서 저장 시 용매 노출된 Met252 및 Met428 잔기에서 산화되었다는 것을 밝혀냈다. 산화된 항체를 함유하는 40℃ 에서 스트레스받은 샘플 및 -80℃ 및 25℃ 에서 저장된 샘플을 FcRn 이 미리 부동화된 친화성 컬럼 상에 적용하였던 경우, 2 개의 주요 피크가 분리될 수 있었다 (도 8). 더 긴 체류 시간으로 2 개의 사실상 중복되는 곡선으로 이루어지는 도 8 의 두번째 피크는 25℃ 및 -80℃ 에서 저장된 샘플 중의 비개질된 항체의 용리 시간에 상응했던 반면, 초기 용리 피크는 Met252 및 Met428 산화된 항체를 나타내었다. 산화된 Met252 및 Met428 의 존재는 ESI-MS 에 의해 스트레스 받은 샘플에서 검출된 16 Da 질량 이동에 의해 지지되었다. BIAcore 로 SPR 에 의한 스트레스 받은 (40℃) 항체 샘플의 분석은 2 개의 상이한 항체 종, 즉, 야생형 항체 및 Met252- 및 Met428-산화된 항체를 사용한 FcRn 크로마토그래피에서와 같이 센서그램에서 동일한 반응 패턴을 보였다 (도 9).
실시예 8
FcRn 컬럼 상의 체류 시간과 응집체 형성과의 연관성
친화성 크로마토그래피 중의 FcRn 상호작용에 대한 항체 응집체 형성의 영향을 항-IL13R알파 항체에 대해 평가하였다. 항체 단량체 및 응집체 분획을 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 및 각각의 피크의 모집 (pooling) 에 의해 단리하였다. 분획의 FcRn 상호작용을 친화성 크로마토그래피 및 SPR 기술에 의해 분석하였다.
FcRn 컬럼 크로마토그래피에 대해 항-IL13R알파 항체 단량체 및 다량체 응집체를 함유하는 3 개의 항-IL13R알파 항체 분획을 단리하기 위해 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 를 사용하였다. 크로마토그램의 피크 면적에 근거해, FcRn 친화성 크로마토그래피를 위해 사용되는 항-IL13R알파 항체의 샘플은 항-IL13R알파 항체의 57% 단량체 및 43% 응집체를 함유하였다. FcRn 친화성 크로마토그래피 중의 미분획화된 샘플의 분석은 상이한 체류 시간을 가진 2 개의 주요 피크를 밝혀냈다 (도 10). 더 긴 체류 시간을 가진 작은 피크는 응집체 분획에 사응하는 반면, 빠른 용리 피크의 주요 부분은 단량체 분획에 상응하였다.
표면 플라즈몬 공명 (SPR) 분석에서, 항-IL13R알파 항체 참조 표준을 응집체 (모집물 1) 및 단량체 (모집물 2) 가 풍부한 2 개의 상이한 모집된 분획 및 본래 모집물과 비교하였다. 본래 배치 및 모집된 분획의 정확한 조성은 하기 표에 기재된다.
항-IL13R알파 항체의 본래의 및 풍부한 모집된 분획의 조성.
단량체 [%] Fc-이량체 [%] 응집체 [%]
출발 모집물 91.0 8.6 0.4
모집물 1 27.7 26.9 45.4
모집물 2 98.3 1.4 0.4
단량체-풍부 모집물 2 샘플의 센서그램은 항-IL13R알파 항체 참조 표준 뒤에 응집체-부족 샘플의 센서그램과 밀접하였다. 반대로, 응집체-풍부 모집물 1 은 SPR 분석에서 FcRn 에 대한 결합에 거의 2 배 높은 것으로 특징지어 졌다 (도 11).
실시예 9
인간 FcRn 마우스에서의 약동학 연구
모든 절차는 실험실 동물 관리의 평가 및 관리 연합의 가이드라인 (www.aaalac.org) 을 따라 수행하였다. 연구는 독일 오버바이에른 주의회에 의해 승인을 받았다.
수컷 및 암컷 C57BL/6J 마우스 (백그라운드); 마우스 FcRn 결핍이나, 인간 FcRn 에 대해 반접합성 형질전환된 (huFcRn (276) -/tg (30, 31) 마우스를 약동학 연구 전반에 걸쳐 사용하였다.
투여 시, 동물의 체중은 17 내지 25 g 였다. 각각의 항체를 꼬리 정맥을 통해 단일 정맥 일시 주사로서 세공하였다. 마우스의 제한된 혈액 부피로 인해, 각각 4 마리 수컷 및 4 마리 암컷 동물로 이루어진 3 개 그룹이 9 회의 샘플링 시점, 즉, 동물당 3 회의 샘플링 시점을 커버하기 위해 필요하였다. 투여 후 혈액 샘플을 그룹 1 에서는 5 분, 24 시간 및 336 시간에, 그룹 2 에서는 2 시간, 168 시간 및 504 시간에, 그룹 3 에서는 8 시간, 48 시간 및 672 시간에 취하였다. 약 100 ㎕ 의 혈액 샘플을 후안 천자에 의해 수득하고 응고되도록 실온에서 60 분 동안 저장하였다. 40 ㎕ 이상의 혈청 샘플을 4℃, 9,300 x g 에서 3 분 동안의 원심분리에 의해 수득하고, 즉시 동결시켜 어세이 전까지 -20℃ 에 보관하였다.
쥣과 혈청 중의 인간 치료 항체의 혈청 농도를 투여된 항체 및 이의 변이체의 항원 결합 영역 (Fab) 에 특이적인 항원-포획 효소 연결 면역흡착 어세이 (ELISA) 에 의해 측정하였다. 모든 시약 또는 샘플을 실온, 400 rpm 에서의 진탕기 상에서 인큐베이션하였다. 각각의 세정 단계는 3 회의 사이클을 포함하였다. 간략하게는, 스트렙타비딘-코팅 마이크로티터 플레이트를 어세이 완충액에 희석된 비오틴화 항체로 코팅하였다. 포스페이트-완충 식염수-폴리소르베이트 20 (Tween20) 으로의 세정 후, 다양한 희석물 중에 혈청 샘플을 첨가하고, 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 세정 후, 결합된 인간 치료 항체를, 마우스 IgG 와 교차반응하지 않는 디곡시게닌과 공액된 인간 Fcγ-특이적 단일클론 항체 Fab 단편과의 후속 인큐베이션에 의해 검출하였다. 세정 후, 호스래디시 페록시다아제 (HRP) 와 공액된 항-디곡시게닌 항체를 첨가하고 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 세정 후, ABTS (2,2'아지노-디[3-에틸벤즈티아졸린 술포네이트; Roche Diagnostics, Germany) 를 HRP 기질로서 첨가하여 착색된 반응 생성물을 형성하였다. 산출된 반응 생성물의 흡광도를 490 nm 에서의 참조 파장과 함께 405 nm 에서 판독하였다. 모든 혈청 샘플 및 양성 또는 음성 대조군 샘플을 반복하여 분석하고 참조 표준에 대해 교정하였다.
약동학 파라미터를 약동학 평가 프로그램 WinNonlin™ (Pharsight, St. Louis, MO, USA), 버전 5.2.1 을 사용하는 비-구획 분석에 의해 계산하였다. 간략하게는, 농도/시간 곡선 하 면적 AUC(0-672) 을 시간 0 에서 무한대까지 선형 사다리꼴 법칙 (선형 보간법) 에 의해 계산하였다. 명백한 종결 반감기 (T1/2) 를 방정식: T1/2 = ln2 / λz 로부터 유도하였다. 총 신체 소거율 (CL) 을 투여량/AUC 로서 계산하였다. 야생형 항체와 그의 변이체 사이의 약동학 파라미터에서 통계적으로 유의한 차이가 ANOVA 분석에 의해 측정되었다.
마우스 FcRn 결핍이나, 인간 FcRn 에 대해 반접합성 형질전환된 C57BL/6J (huFcRn (276) -/tg) 마우스에서의 약동학 연구는 YTE 돌연변이가 항체의 약동학을 향상시켰음을 보여주었다 (도 12). 통계학적 유의성 수준에서, YTE 돌연변이체는 야생형 항체와 비교하여 1.74 배 높은 AUC(0-672), 1.95 배 느린 소거율 및 2.2 배 더 긴 종결 반감기를 보였다 (하기 표).
인간 FcRn 형질전환 마우스에 10 mg/kg 의 단일 i.v. 일시 주사 후 ELISA 에 의해 측정된 혈청 농도의 비-구획 분석에 의해 수득된 야생형 항체 및 이의 삼중 돌연변이체 YTE 에 대한 약동학 파라미터. 평균 ± SD, 그룹 당 n=8, 야생형 항체와 비교하여 유의성 ANOVA 분석 (+++, p<0.001). 0 에서 672 시간 까지 혈청 농도-시간 곡선 하 면적 AUC(0-672).
항체 AUC(0-672)
[h*㎍/ml]		 소거율
[ml/분/kg]		 종결 반감기
[h]
야생형 항체 15.693 ± 1.879 0.0107 ± 0.0013 96.8 ± 8.9
YTE-돌연변이체 27.359 ± 2.731 0.0055 ± 0.0006 211.4 ± 40.6
<110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Fc-receptor based affinity chromatography <130> 30801 WO <150> EP12155630 <151> 2012-02-15 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Trp Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 35 40 45 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 50 55 60 Glu Ser Thr Tyr Arg Trp Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 65 70 75 80 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 85 90 95 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 105 <210> 2 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 1 5 10 15 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 100 105 <210> 3 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 4 <211> 326 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 130 135 140 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 165 170 175 Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp 180 185 190 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 195 200 205 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu 210 215 220 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 225 230 235 240 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 245 250 255 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270 Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 275 280 285 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 290 295 300 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 305 310 315 320 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 5 <211> 377 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro 100 105 110 Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg 115 120 125 Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys 130 135 140 Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 145 150 155 160 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 165 170 175 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 180 185 190 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr 195 200 205 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 210 215 220 Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 225 230 235 240 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 245 250 255 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln 260 265 270 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 275 280 285 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 290 295 300 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn 305 310 315 320 Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 325 330 335 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile 340 345 350 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln 355 360 365 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 370 375 <210> 6 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 330 <210> 7 <211> 274 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Ala Glu Ser His Leu Ser Leu Leu Tyr His Leu Thr Ala Val Ser Ser 1 5 10 15 Pro Ala Pro Gly Thr Pro Ala Phe Trp Val Ser Gly Trp Leu Gly Pro 20 25 30 Gln Gln Tyr Leu Ser Tyr Asn Ser Leu Arg Gly Glu Ala Glu Pro Cys 35 40 45 Gly Ala Trp Val Trp Glu Asn Gln Val Ser Trp Tyr Trp Glu Lys Glu 50 55 60 Thr Thr Asp Leu Arg Ile Lys Glu Lys Leu Phe Leu Glu Ala Phe Lys 65 70 75 80 Ala Leu Gly Gly Lys Gly Pro Tyr Thr Leu Gln Gly Leu Leu Gly Cys 85 90 95 Glu Leu Gly Pro Asp Asn Thr Ser Val Pro Thr Ala Lys Phe Ala Leu 100 105 110 Asn Gly Glu Glu Phe Met Asn Phe Asp Leu Lys Gln Gly Thr Trp Gly 115 120 125 Gly Asp Trp Pro Glu Ala Leu Ala Ile Ser Gln Arg Trp Gln Gln Gln 130 135 140 Asp Lys Ala Ala Asn Lys Glu Leu Thr Phe Leu Leu Phe Ser Cys Pro 145 150 155 160 His Arg Leu Arg Glu His Leu Glu Arg Gly Arg Gly Asn Leu Glu Trp 165 170 175 Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg Leu Lys Ala Arg Pro Ser Ser Pro Gly 180 185 190 Phe Ser Val Leu Thr Cys Ser Ala Phe Ser Phe Tyr Pro Pro Glu Leu 195 200 205 Gln Leu Arg Phe Leu Arg Asn Gly Leu Ala Ala Gly Thr Gly Gln Gly 210 215 220 Asp Phe Gly Pro Asn Ser Asp Gly Ser Phe His Ala Ser Ser Ser Leu 225 230 235 240 Thr Val Lys Ser Gly Asp Glu His His Tyr Cys Cys Ile Val Gln His 245 250 255 Ala Gly Leu Ala Gln Pro Leu Arg Val Glu Leu Glu Ser Pro Ala Lys 260 265 270 Ser Ser <210> 8 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HIS-AVITAG <400> 8 His His His His His His Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys 1 5 10 15 Ile Glu Trp His Glu 20 <210> 9 <211> 99 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu 1 5 10 15 Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro 20 25 30 Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys 35 40 45 Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu 50 55 60 Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys 65 70 75 80 Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp 85 90 95 Arg Asp Met <210> 10 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-Region <400> 10 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225

Claims (37)

  1. 양성 선형 pH 구배를 가진 친화성 크로마토그래피에서 친화성 크로마토그래피 리간드로서의 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 및 베타-2-마이크로글로불린 (b2m) 의 부동화된 비-공유 복합체의 용도.
  2. 제 1 항에 있어서, Fc-영역을 적어도 포함하는 항체 또는 융합 폴리펩티드를 분리하기 위한 양성 선형 pH 구배를 가진 친화성 크로마토그래피에서의 것임을 특징으로 하는 용도.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 신생아 Fc 수용체 및 베타-2-마이크로글로불린이 서로 독립적으로 인간 기원, 또는 마우스 기원, 또는 사이노몰거스 원숭이 기원, 또는 래트 기원, 또는 토끼 기원의 것임을 특징으로 하는 용도.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 베타-2-마이크로글로불린이 신생아 Fc 수용체와 동일한 종으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 용도.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 신생아 Fc 수용체 및 베타-2-마이크로글로불린이 각각 서로 독립적으로 0 내지 10 개의 아미노산 잔기 개질을 갖는, 인간 야생형 신생아 Fc 수용체 및 인간 야생형 베타-2-마이크로글로불린인 것을 특징으로 하는 용도.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 및 베타-2-마이크로글로불린 (b2m) 의 비-공유 복합체가 고체상에 결합되는 것을 특징으로 하는 용도.
  7. 제 6 항에 있어서, 고체상이 크로마토그래피 물질인 것을 특징으로 하는 용도.
  8. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서, 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 및 베타-2-마이크로글로불린 (b2m) 의 비-공유 복합체가 비오틴화되고, 고체상이 스트렙타비딘으로 유도되는 것을 특징으로 하는 용도.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, pH 구배가 제 1 pH 값에서 제 2 pH 값까지이며, 제 1 pH 값이 약 pH 3.5 에서 약 pH 7.5 까지이고 제 2 pH 값이 약 pH 6.0 에서 약 pH 9.5 까지인 것을 특징으로 하는 용도.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 pH 값이 약 pH 5.5 이고 제 2 pH 값이 약 pH 8.8 인 것을 특징으로 하는 용도.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 및 참조 항체의 체류 시간의 비를 측정함으로써 항체의 생체 내 반감기의 측정을 위한 것임을 특징으로 하는 용도.
  12. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 메티오닌 산화를 측정하기 위한 것임을 특징으로 하는 용도.
  13. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 올리고머화 수준을 측정하기 위한 것임을 특징으로 하는 용도.
  14. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 모체 항체 또는 모체 융합 폴리펩티드와 비교하여 FcRn 에 대해 변형된 결합 친화력을 갖는 개질 항체 또는 개질 융합 폴리펩티드에 대한 Fc-영역의 FcRn 결합 부분을 적어도 포함하는, 모체 항체 또는 모체 융합 폴리펩티드의 개질 항체 또는 개질 융합 폴리펩티드의 라이브러리를 스크리닝하기 위한 것임을 특징으로 하는 용도.
  15. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 신생아 Fc 수용체에 대해 변형된 결합을 나타내는 Fc-영역의 FcRn-결합 부분을 적어도 포함하는 항체 또는 융합 폴리펩티드를 확인하기 위한 것임을 특징으로 하는 용도.
  16. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, IgG 제제로부터 반 항체의 제거를 위한 것임을 특징으로 하는 용도.
  17. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, IgG 제제로부터 항체 응집체 및 항체 올리고머의 제거를 위한 것임을 특징으로 하는 용도.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 융합 폴리펩티드의 1-특이적 항체 또는 항체 단편, 또는 융합 폴리펩티드의 2-특이적 항체 또는 항체 단편, 또는 융합 폴리펩티드의 3-특이적 항체 또는 항체 단편, 또는 융합 폴리펩티드의 4-특이적 항체 또는 항체 단편인 것을 특징으로 하는 용도.
  19. 음성 선형 pH 구배를 가진 친화성 크로마토그래피에서 친화성 크로마토그래피 리간드로서의 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 및 베타-2-마이크로글로불린 (b2m) 의 부동화된 비-공유 복합체의 용도.
  20. 제 19 항에 있어서, Fc-영역을 적어도 포함하는 항체 또는 융합 폴리펩티드를 분리하기 위한 음성 선형 pH 구배를 가진 친화성 크로마토그래피에서의 것임을 특징으로 하는 용도.
  21. 제 19 항 또는 제 20 항에 있어서, 신생아 Fc 수용체 및 베타-2-마이크로글로불린이 서로 독립적으로 인간 기원, 또는 마우스 기원, 또는 사이노몰거스 원숭이 기원, 또는 래트 기원, 또는 토끼 기원의 것임을 특징으로 하는 용도.
  22. 제 19 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 베타-2-마이크로글로불린이 신생아 Fc 수용체와 동일한 종으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 용도.
  23. 제 19 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 신생아 Fc 수용체 및 베타-2-마이크로글로불린이 각각 서로 독립적으로 0 내지 10 개의 아미노산 잔기 개질을 갖는, 인간 야생형 신생아 Fc 수용체 및 인간 야생형 베타-2-마이크로글로불린인 것을 특징으로 하는 용도.
  24. 제 19 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 및 베타-2-마이크로글로불린 (b2m) 의 비-공유 복합체가 고체상에 결합되는 것을 특징으로 하는 용도.
  25. 제 24 항에 있어서, 고체상이 크로마토그래피 물질인 것을 특징으로 하는 용도.
  26. 제 24 항 또는 제 25 항에 있어서, 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 및 베타-2-마이크로글로불린 (b2m) 의 비-공유 복합체가 비오틴화되고, 고체상이 스트렙타비딘으로 유도되는 것을 특징으로 하는 용도.
  27. 제 19 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, pH 구배가 제 1 pH 값에서 제 2 pH 값까지이며, 제 1 pH 값이 약 pH 7.0 에서 약 pH 8.5 까지이고 제 2 pH 값이 약 pH 5.5 에서 약 pH 6.9 까지인 것을 특징으로 하는 용도.
  28. 제 19 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 pH 값이 약 pH 7.4 이고 제 2 pH 값이 약 pH 6.0 인 것을 특징으로 하는 용도.
  29. 제 19 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 및 참조 항체의 체류 시간의 비를 측정함으로써 항체의 생체 내 반감기의 측정을 위한 것임을 특징으로 하는 용도.
  30. 제 19 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 메티오닌 산화를 측정하기 위한 것임을 특징으로 하는 용도.
  31. 제 19 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 올리고머화 수준을 측정하기 위한 것임을 특징으로 하는 용도.
  32. 제 19 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 모체 항체 또는 모체 융합 폴리펩티드와 비교하여 FcRn 에 대해 변형된 결합 친화력을 갖는 개질 항체 또는 개질 융합 폴리펩티드에 대한 Fc-영역의 FcRn 결합 부분을 적어도 포함하는, 모체 항체 또는 모체 융합 폴리펩티드의 개질 항체 또는 개질 융합 폴리펩티드의 라이브러리를 스크리닝하기 위한 것임을 특징으로 하는 용도.
  33. 제 19 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 신생아 Fc 수용체에 대해 변형된 결합을 나타내는 Fc-영역의 FcRn-결합 부분을 적어도 포함하는 항체 또는 융합 폴리펩티드를 확인하기 위한 것임을 특징으로 하는 용도.
  34. 제 19 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, IgG 제제로부터 반 항체의 제거를 위한 것임을 특징으로 하는 용도.
  35. 제 19 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, IgG 제제로부터 항체 응집체 및 항체 올리고머의 제거를 위한 것임을 특징으로 하는 용도.
  36. 제 19 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 융합 폴리펩티드의 1-특이적 항체 또는 항체 단편, 또는 융합 폴리펩티드의 2-특이적 항체 또는 항체 단편, 또는 융합 폴리펩티드의 3-특이적 항체 또는 항체 단편, 또는 융합 폴리펩티드의 4-특이적 항체 또는 항체 단편인 것을 특징으로 하는 용도.
  37. 위치 252 에서의 아미노산이 메티오닌에서 히스티딘으로 변형되고 위치 428 에서의 아미노산이 메티오닌에서 글루탐산으로 변형된 인간 IgG1 이소형의 Fc-영역 변이체.
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