JP2018039735A - 補体依存性細胞傷害活性が異なる抗体の分離方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(A)CDC活性が異なる抗体を含有する試料を、
Fc結合性タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる吸着剤に接触させ、
当該吸着材に抗体を吸着させ、
次いで、抗体とFc結合性タンパク質との相互作用を弱めることにより、CDC活性の異なる抗体を順次溶出させる、
ことを特徴とする、CDC活性が異なる抗体の分離方法。
(B)Fc結合性タンパク質がヒトFcγRIIIaである、(A)に記載の方法。
(C)ヒトFcγRIIIaが、
配列番号1に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも17番目のグリシンから192番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、かつ前記アミノ酸残基に一つ以上の他のアミノ酸残基が挿入されたポリペプチド、又は
配列番号1に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも17番目のグリシンから192番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、但し前記アミノ酸残基のうちの一つ以上が他のアミノ酸残基に置換または欠失したポリペプチド
である、(B)に記載の方法。
(D)ヒトFcγRIIIaが、配列番号2(FcR2)、配列番号3(FcR3)、配列番号4(FcR4)、配列番号5(FcR5a)、配列番号6(FcR5b)、配列番号7(FcR6a)、配列番号8(FcR6b)、配列番号9(FcR7)、配列番号10(FcR7a)、配列番号11(FcR8)、配列番号12(FcR9)、配列番号13(FcR10)、配列番号14(FcR11)のいずれかに記載のアミノ酸配列の少なくとも33番目のグリシンから208番目のグルタミンまでのアミノ酸配列を含むポリペプチドである、(C)に記載の方法。
(E)ヒトFcγRIIIaが、配列番号1に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも17番目のグリシンから192番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含むポリペプチドである、(B)に記載の方法。
(F)ヒトFcγRIIIaが糖鎖を有していないヒトFcγRIIIaである、(B)から(E)のいずれかに記載の方法。
(i)配列番号1に記載の野生型Fc結合性タンパク質のアミノ酸配列のうち少なくとも17番目から192番目までのアミノ酸残基を含むポリペプチドや、
(ii)配列番号1に記載の野生型Fc結合性タンパク質のアミノ酸配列のうち少なくとも17番目から192番目までのアミノ酸残基を含み、かつ前記アミノ酸酸基に一つ以上の他のアミノ酸残基が挿入されたポリペプチド、又は、配列番号1に記載の野生型Fc結合性タンパク質のアミノ酸配列のうち少なくとも17番目から192番目までのアミノ酸残基を含み、但し前記アミノ酸残基のうちの一つ以上が他のアミノ酸残基に置換または欠失したポリペプチドがあげられる。
(1)2mLの分離剤用親水性ビニルポリマー(東ソー社製:NPRゲル)の表面の水酸基をヨードアセチル基で活性化後、特開2016−023152号に記載の方法で調製したFc結合性タンパク質FcR9Cys(配列番号15)を4mg反応させることにより、Fc結合性タンパク質固定化ゲル(以下、FcR9ゲル)を得た。なおFcR9Cys(配列番号15)は、配列番号12(FcR9)に記載のアミノ酸配列のうち33番目のグリシンから208番目のグルタミンまでのアミノ酸配列(配列番号15では24番目から199番目までのアミノ酸配列に相当)からなるポリペプチドのN末端側にPelBシグナルペプチド(配列番号15の1番目のメチオニンから22番目のアラニンまでの領域)およびメチオニン(配列番号15の23番目のメチオニン)を、C末端側にシステインタグ(配列番号15の200番目のグリシンから207番目のグリシンまでの領域)を、それぞれ付加したポリペプチドである。
(3)(2)で作製したFcR9カラムを高速液体クロマトグラフィー装置に接続し、20mMの酢酸緩衝液(pH5.0)で平衡化した。
(4)PBS(Phosphate Buffered Saline)(pH7.4)で4.0mg/mLに希釈したモノクローナル抗体(リツキサン、全薬工業社製)を流速0.5mL/minにて0.15mLアプライした。
(5)流速0.5mL/minのまま平衡化緩衝液で4分洗浄後、10mMのグリシン塩酸緩衝液(pH3.0)によるpHグラジエント(18分で10mMのグリシン塩酸緩衝液(pH3.0)が100%となるグラジエント)で吸着したモノクローナル抗体を溶出した。
(1)実施例1に記載の方法でモノクローナル抗体を分離し、図2に示す溶出パターン(クロマトグラム)中のピーク1、ピーク2、およびピーク3の画分を分取した。これら3つのピークに含まれるモノクローナル抗体および分離前のモノクローナル抗体の濃度を280nmの吸光度で測定した。
(2−1)ピーク1、ピーク2およびピーク3に含まれるモノクローナル抗体および分離前のモノクローナル抗体を、PBSを用いて10μg/mLから1/2希釈で7段階の希釈系列を調製した。
(2−2)モノクローナル抗体(リツキサン、全薬工業社製)の抗原であるCD20を発現しているDaudi細胞をAssay Buffer(10mLのOptiMem培地と5mLの16%Human Serumとを混合して調製したBuffer)を用いて約1.1×104cells/mLに調製し、96ウェルプレート(3917:コーニング社製)に90μL/wellで加えた。
(2−4)測定抗体サンプルを添加した96ウェルプレートをCO2インキュベーター(5%CO2、37℃)に2時間静置した。
(2−5)Cytotox−Glo Assay(プロメガ社製)の手順に従って、基質を溶解したAssay Reagentを50μL/wellで加えた。
(2−6)Assay Reagentを添加した96ウェルプレートをプレート振とう機で数十秒撹拌し、室温で15分反応させた後、プレートリーダーEnsight(Perkin Elmer社製)で発光を測定した。
Claims (6)
- 補体依存性細胞傷害活性が異なる抗体を含有する試料を、
Fc結合性タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる吸着剤に接触させ、
当該吸着剤に抗体を吸着させ、
次いで、抗体とFc結合性タンパク質との相互作用を弱めることにより、補体依存性細胞傷害活性が異なる抗体を順次溶出させる、
ことを特徴とする、補体依存性細胞傷害活性の異なる抗体の分離方法。 - Fc結合性タンパク質がヒトFcγRIIIaである、請求項1に記載の方法。
- ヒトFcγRIIIaが、
配列番号1に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも17番目のグリシンから192番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、かつ前記アミノ酸残基に一つ以上の他のアミノ酸残基が挿入されたポリペプチド、又は
配列番号1に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも17番目のグリシンから192番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、但し前記アミノ酸残基のうちの一つ以上が他のアミノ酸残基に置換または欠失したポリペプチド
である、請求項2に記載の方法。 - ヒトFcγRIIIaが、配列番号2(FcR2)、配列番号3(FcR3)、配列番号4(FcR4)、配列番号5(FcR5a)、配列番号6(FcR5b)、配列番号7(FcR6a)、配列番号8(FcR6b)、配列番号9(FcR7)、配列番号10(FcR7a)、配列番号11(FcR8)、配列番号12(FcR9)、配列番号13(FcR10)、配列番号14(FcR11)のいずれかに記載のアミノ酸配列の少なくとも33番目のグリシンから208番目のグルタミンまでのアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項3に記載の方法。
- ヒトFcγRIIIaが、配列番号1に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも17番目のグリシンから192番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含むポリペプチドである、請求項2に記載の方法。
- ヒトFcγRIIIaが糖鎖を有していないヒトFcγRIIIaである、請求項2から5のいずれかに記載の方法。
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