KR20130008439A - 슬립칩 장치 및 방법 - Google Patents

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웬빈 두
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케빈 폴 플러드 니콜스
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Abstract

복수의 제1 영역을 가지는 제1 표면 및 복수의 제2 영역을 가지는 제2 표면을 가지는 장치가 설명된다. 상기 제1 표면과 상기 제2 표면은 서로 대향하고, 제1 물질을 가지는 상기 복수의 제1 영역 중 어느 것도 제2 물질을 가지는 복수의 제2 영역에 노출되지 않는 적어도 제1 위치로부터 제2 위치로 서로 상대적으로 이동할 수 있다. 상기 제2 위치에 있을때, 상기 복수의 제1 및 제2 영역은, 이에 따라 상기 제1 및 제2 물질은, 서로에게 노출된다. 본 장치는 복수의 제1 제2 영역과 연통해서, 상기 제1 위치에 있을때 물질을 상기 복수의 제2 영역의 내부 또는 상부에 위치시킬 수 있는 일련의 덕트를 더욱 포함할 수도 있다.

Description

슬립칩 장치 및 방법{SLIP CHIP DEVICE AND METHODS}
본 발명은 미국 국립보건원(NIH)이 수여한 승인 번호 GM074961 및 DP1OD003584 및 미국 국립과학재단이 수여한 승인 번호 CHE-0526693 하에 정부의 지원으로 완성되었다. 정부는 본 발명에 대한 소정의 권리를 갖는다.
본 출원은, Rustem F. Ismagilov가 “Slip Chip Device And Methods”라는 명칭으로 2009년 3월 24에 가출원한 미국 가특허출원번호 제61/162,922호, Rustem F. Ismagilov가 “Slip Chip Device And Methods”라는 명칭으로 2009년 11월 18일에 가출원한 미국 가특허출원번호 제61/262,375호, 및 Rustem F. Ismagilov가 “Slip Chip Device And Methods”라는 명칭으로 2010년 3월 22에 가출원한 미국 가특허출원번호 제61/340,872호(대리인 정리번호 7814-275)인 우선권을 주장하며, 이들 모두는 본 명세서에서 참조로 원용된다.
반응을 수행하기 위한 것으로 알려진 장치 및 방법은 2 이상의 물질이 서로에게 노출될 수 있는 방식에 한정되어 있다. 그러한 장치에서는, 물질이 특정한 처리 단계를 거치도록 구성된 일련의 챔버들을 사용하지만, 각 챔버가 개별적으로 채워지고 그리고/또는 다른 챔버에 노출되어서 그 챔버에서 반응을 수행하도록 요구된다. 이러한 장치는, 교차 오염 또는 외부 요인으로부터의 오염의 가능성을 최소화하도록 설계되어 있지 않다. 게다가, 다수의 물질을 이용해서 다수의 반응을 수행하려면, 이 장치에는 추가 물질들이 다시 로딩되어야 하며, 따라서 추가 시간이 소요되고 오염 가능성이 커지게 된다. 이에 따라, 특정 물질에 대한 반응들의 각각 조합하는 것은 시간 소모적인 공정이다.
본 발명은 반응을 수행하기 위한 장치 및 방법을 포함한다. 일 실시예에서, 상기 장치는 제1 표면을 갖는 기판(base)을 포함하고, 적어도 하나의 제1 영역은 상기 제1 표면의 일부를 따라 위치하고, 상기 적어도 하나의 제1 영역은 적어도 하나의 제1 물질을 유지하도록 구성된다. 제2 표면을 갖는 플레이트(plate)는 상기 제1 표면에 대향하고, 적어도 하나의 제2 영역은 상기 제2 표면의 일부를 따라 위치하고, 상기 적어도 하나의 제2 영역은 적어도 하나의 제2 물질을 유지하도록 구성되고, 상기 기판의 상기 제1 표면 및 상기 플레이트의 상기 제2 표면 중 적어도 하나는 제1 위치 사이에서 다른 것에 대하여 이동하도록 구성되고, 여기서 상기 적어도 하나의 제1 영역 중 하나는 상기 적어도 하나의 제2 영역 중 하나에만 노출되고 폐쇄형 시스템(closed system)을 형성한다.
또 다른 실시예에서, 반응을 수행하기 위한 장치는, 제1 표면 및 상기 제1 표면의 일부를 따라 형성된 복수의 영역을 갖는 기판을 포함하고, 상기 복수의 제1 영역의 각각은 적어도 하나의 제1 물질을 유지하도록 구성된다. 제2 표면을 갖는 플레이트는 상기 제1 표면에 대향하며, 복수의 제2 영역은 상기 제2 표면의 일부를 따라 형성된다. 상기 복수의 제2 영역의 각각은 적어도 하나의 제2 물질을 유지하도록 구성되고, 상기 기판의 상기 제1 표면 및 상기 플레이트의 상기 제2 표면 중 적어도 하나는, 상기 복수의 제1 영역 중 적어도 일부가 상기 복수의 제2 영역 중 어느 것에도 노출되지 않는 제1 위치 및 상기 제1 표면의 법선에 대략 수직하는 방향으로의 제2 위치 사이에서 나머지 하나에 대하여 미끄러지도록 구성되고, 상기 제2 위치에서는, 상기 복수의 제1 영역 중 적어도 하나 및 상기 복수의 제2 영역 중 적어도 하나만이 서로 노출된다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 장치는 제1 표면 및 상기 제1 표면의 일부를 따라 위치하는 제1 영역을 갖는 기판을 포함하고, 상기 제1 영역은 적어도 하나의 제1 물질을 유지하도록 구성된다. 제1 덕트(duct)가 상기 제1 표면의 일부를 따라 형성되고 상기 제1 영역에 노출되지 않는다. 제2 표면을 갖는 플레이트가 상기 제2 표면에 대향하며, 제2 영역은 상기 제2 표면의 일부를 따라 위치하고, 상기 제2 영역은 적어도 하나의 제2 물질을 유지하도록 구성되고, 상기 제1 표면과 상기 제2 표면은 제1 위치와 제2 위치 사이에서 서로에 대하여 미끄러지도록 구성되고, 상기 제1 위치에서는, 상기 제1 덕트가 상기 제2 영역에 노출되고 상기 제1 영역과 상기 제2 영역이 서로 노출되지 않고, 상기 제2 위치에서는, 상기 제1 영역과 상기 제2 영역이 서로에 대해서만 노출된다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 장치는 제1 표면 및 상기 제1 표면의 일부를 따라 위치하는 복수의 제1 영역을 갖는 기판을 포함하고, 상기 복수의 제1 영역은 제1 패턴을 갖고, 적어도 하나의 제1 물질을 유지하도록 구성된다. 제1 세트의 덕트들이 상기 제1 표면의 일부를 따라 형성되고 상기 복수의 제1 영역에 노출되지 않는다. 제2 표면을 갖는 플레이트가 상기 제1 표면에 대향하고, 복수의 제2 영역은 상기 제2 표면의 일부를 따라 위치하고, 상기 복수의 제2 영역은, 적어도 하나의 제2 물질을 유지하도록 구성되는, 상기 복수의 제1 영역의 패턴과 대략 유사한 패턴을 갖고, 상기 제1 표면과 상기 제2 표면은, 상기 제1 세트의 덕트들이 상기 복수의 제2 영역에 노출되는 제1위치 및 상기 복수의 제1 영역 중 적어도 하나와 상기 복수의 제2 영역 중 적어도 하나가 서로에 대해서만 노출되는 제2 위치 사이에서 서로 미끄러지도록 구성된다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 장치는 제1 표면 및 상기 제1 표면의 일부를 따라 위치하는 제1 영역을 갖는 기판을 포함하고, 상기 제1 영역은 적어도 하나의 제1 물질을 유지하도록 구성된다. 상부 플레이트는 상기 제1 표면에 대향하는 제2 표면을 갖고, 상기 제2 표면의 일부를 따라 위치하는 제2 영역을 갖고, 적어도 하나의 제2 물질을 유지하도록 구성된다. 중간 플레이트는 상기 기판의 제1 표면과 상기 상부 플레이트의 제2 표면 사이에 배치되고, 상기 중간 플레이트는 상기 중간 플레이트를 관통하여 형성된 개구부(opening)를 갖고, 상기 기판, 상기 상부 플레이트 및 상기 중간 플레이트는, 상기 개구부를 경유해서 상기 제1 영역이 상기 제2 영역에 노출되지 않는 제1 위치에서부터, 상기 제1 영역이 상기 개구부를 경유해서 상기 제2 영역에 노출되는 제2 위치로 서로에 대하여 미끄러지도록 구성된다.
본 발명의 또 다른 실시예는, 제1 표면 및 적어도 하나의 제1 물질을 유지하도록 구성되며 상기 제1 표면의 일부를 따라 위치하는 제1 영역을 갖는 기판, 및 제2 표면 및 적어도 하나의 제2 물질을 유지하도록 구성되며 상기 제2 표면의 일부를 따라 위치하는 제2 영역을 갖는 플레이트를 포함하는, 반응을 수행하기 위한 키트를 포함하고, 상기 제1 영역의 제1 물질, 상기 제2 영역의 제2 물질 및 기질(substrate) 중 적어도 하나가 상기 제1 표면과 상기 제2 표면 사이에 배치되고, 상기 기판의 제1 표면 및 상기 플레이트의 제2 표면은, 함께 맞춰지는 경우, 서로 대향하고 상기 제1 영역과 상기 제2 영역이 서로 노출되지 않는 제1 위치와, 상기 제1 영역과 상기 제2 영역이 서로에 대해서만 노출되는 제2 위치 사이에서 서로에 대하여 이동하도록 구성된다.
본 발명의 또 다른 실시예는, 제1 표면, 상기 제1 표면의 일부를 따라 위치하고 적어도 하나의 제1 물질을 유지하도록 구성된 제1 영역, 및 상기 제1 표면의 일부를 따라 형성되고 상기 제1 영역에 노출되지 않는 제1 덕트를 갖는 기판, 및 제2 표면 및 상기 제2 표면의 일부를 따라 위치하고 적어도 하나의 제2 물질을 유지하도록 구성된 플레이트를 포함하는, 반응을 수행하기 위한 키트를 포함하고, 상기 제1 영역의 제1 물질, 상기 제2 영역의 제2 물질, 기질 중 적어도 하나가 상기 제1 표면과 상기 제2 표면 사이에 배치되고, 상기 제1 표면과 상기 제2 표면은, 함께 맞춰지는 경우, 제1 위치와 제2 위치 사이에서 서로에 대하여 미끄러지도록 구성되고, 상기 제1 위치에서는, 상기 제1 덕트가 상기 제2 영역에 노출되고, 상기 제1 영역과 상기 제2 영역은 서로 노출되지 않고, 상기 제2 위치에서는, 상기 제1 영역과 상기 제2 영역은 서로에 대해서만 노출된다.
본 발명의 또 다른 실시예는, 제1 표면, 상기 제1 표면의 일부를 따라 위치하며 제1 패턴을 갖고 적어도 하나의 제1 물질을 유지하도록 구성되는 복수의 제1 영역, 및 상기 제1 표면의 일부를 따라 형성되고 상기 복수의 제1 영역에 노출되지 않는 제1 세트의 덕트들을 갖는 기판을 포함하는, 반응을 수행하기 위한 키트를 포함한다. 본 실시예는 제2 표면 및 상기 제2 표면의 일부를 따라 위치하는 복수의 제2 영역을 갖는 플레이트를 더 포함하고, 상기 복수의 제2 영역은 상기 복수의 제1 영역의 패턴과 대략 유사한 패턴을 갖고, 적어도 하나의 제2 물질을 유지하도록 구성되고, 상기 제1 영역의 제1 물질, 상기 제2 영역의 제2 물질, 및 기질 중 적어도 하나가 상기 제1 표면과 상기 제2 표면 사이에 배치되고, 상기 제1 표면과 상기 제2 표면은, 함께 맞춰지는 경우, 상기 제1 세트의 덕트들이 상기 복수의 제2 영역에 노출되는 제1 위치와 상기 복수의 제1 영역 중 적어도 하나와 상기 복수의 제2 영역 중 적어도 하나가 서로에 대해서만 노출되는 제2 위치 사이에서 서로에 대하여 미끄러지도록 구성된다.
본 발명의 또 다른 실시예는, 제1 표면 및 상기 제1 표면의 일부를 따라 위치하며 적어도 하나의 물질을 유지하도록 구성되는 제1 영역을 갖는 기판, 제2 표면 및 적어도 하나의 제2 물질을 유지하도록 구성된 상기 제2 표면의 일부를 따라 위치하는 상부 플레이트, 및 상기 기판의 제1 표면과 상기 상부 플레이트의 제2 표면 사이에 배치되고 개구부가 관통 형성되어 있는 중간 플레이트를 포함하는, 반응을 수행하기 위한 키트를 포함하고, 상기 제1 영역의 제1 물질, 상기 제2 영역의 제2 물질, 및 기질 중 적어도 하나가 상기 제1 표면과 상기 제2 표면 사이에 배치되고, 상기 기판, 상기 상부 플레이트 및 상기 중간 플레이트는, 상기 중간 플레이트가 상기 제1 표면과 상기 제2 표면 사이에 배치될 수 있고 상기 제1 영역이 상기 개구부를 통해 상기 제2 영역에 노출되지 않는 제1 위치로부터 상기 제1 영역이 상기 개구부를 통해 상기 제2 영역에 노출되는 제2 위치로 상기 기판과 상부 플레이트에 대하여 미끄러질 수 있도록 구성된다.
본 발명의 또 다른 실시예는 반응을 수행하기 위한 방법을 포함하고, 상기 방법은, 제1 위치에 장치 - 상기 장치는, 제1 표면의 일부를 따라 위치하며 적어도 하나의 제1 물질을 유지하도록 구성되는 제1 영역을 갖는 기판(base), 상기 제1 영역의 제1 물질, 상기 제1 표면에 대항하는 제2 표면 및 상기 제2 표면의 일부를 따라 위치하고 적어도 하나의 제2 물질을 유지하도록 구성되는 제2 영역을 갖는 플레이트(plate), 및 상기 제2 영역의 제2 물질을 포함하고, 상기 기판의 제1 표면과 상기 플레이트의 제2 표면은 서로에 대하여 이동하도록 구성되고, 상기 제1 영역과 상기 제2 영역은 상기 제1 위치에 있는 경우 서로에 대하여 노출되지 않음 -를 제공하는 단계와, 상기 기판의 제1 표면과 상기 플레이트의 제2 표면을 서로에 대하여 이동시킴으로써 상기 제1 위치로부터 제2 위치로 상기 장치를 이동시키는 단계를 포함하고, 상기 제2 위치에서는, 상기 제1 영역과 상기 제2 영역이 서로에 대해서만 노출되고, 이에 따라 상기 제1 물질과 상기 제2 물질을 반응시킨다.
본 발명의 또 다른 실시예는 반응을 수행하기 위한 방법을 포함하고, 상기 방법은, 제1 위치에 장치 - 상기 장치는, 제1 표면 및 상기 제1 표면의 일부를 따라 형성되며 각각 적어도 하나의 제1 물질을 유지하도록 구성되는 복수의 제1 영역을 갖는 기판, 상기 복수의 제1 영역 중 적어도 하나에 있는 적어도 하나의 제1 물질, 및 상기 제1 표면에 대향하는 제2 표면 및 상기 제2 표면의 일부를 따라 형성되며 적어도 하나의 제2 물질을 유지하도록 각각 구성되는 복수의 제2 영역을 갖는 플레이트, 및 상기 복수의 제2 영역 중 적어도 하나에 있는 적어도 하나의 제2 물질을 포함하고, 상기 기판의 제1 표면과 상기 플레이트의 제2 표면은 상기 제1 표면의 법선에 대략 수직하는 방향으로 서로에 대하여 이동하도록 구성되고, 상기 복수의 제1 영역 중 적어도 일부는 상기 제1 위치에서 상기 복수의 제2 영역 중 어떤 것에도 노출되지 않음 -를 제공하는 단계와, 상기 장치를 상기 제1 위치로부터 제2 위치로 이동시키는 단계를 포함하고, 상기 제2 위치에서는, 상기 복수의 제2 영역 중 적어도 하나 및 상기 복수의 제2 영역 중 적어도 하나가 서로에 대해서만 노출되고, 이에 따라 상기 적어도 하나의 제1 물질 및 적어도 하나의 제2 물질을 반응시킨다.
본 발명의 또 다른 실시예는, 반응을 수행하기 위한 방법을 포함하고, 상기 방법은, 제1 위치에 장치 - 상기 장치는, 제1 표면 및 상기 제1 표면의 일부를 따라 위치하며 적어도 하나의 제1 물질을 유지하도록 구성되는 제1 영역을 갖는 기판, 상기 제1 영역에서 유지되는 적어도 하나의 제1 물질, 상기 제1 표면의 일부를 따라 형성되며 상기 제1 영역에 노출되지 않는 제1 덕트(duct), 상기 제1 표면에 대향하는 제2 표면 및 상기 제2 표면의 일부를 따라 위치하는 제2 영역을 갖는 플레이트 - 상기 제1 표면과 상기 제2 표면은 상기 제1 위치로부터 제2 위치로 서로에 대하여 미끄러지도록 구성되고, 상기 제2 영역은 적어도 하나의 제2 물질을 유지하도록 구성됨 -, 및 상기 제1 영역에서 유지되는 적어도 하나의 제2 물질을 포함하고, 상기 제1 위치에서는, 상기 제1 덕트가 상기 제2 영역에 노출되고, 상기 제1 영역과 상기 제2 영역은 서로에 대하여 노출되지 않음 -를 제공하는 단계와, 상기 장치를 상기 제1 위치로부터 상기 제2 위치로 이동시키는 단계를 포함하고, 상기 제2 위치에서는, 상기 제1 영역과 상기 제2 영역이 서로에 대해서만 노출되고, 이에 따라 상기 적어도 하나의 제1 물질과 상기 적어도 하나의 제2 물질을 반응시킨다.
본 발명의 또 다른 실시예는, 반응을 수행하기 위한 방법을 포함하고, 상기 방법은, 제1 위치에 장치 - 상기 장치는, 제1 표면 및 상기 제1 표면의 일부를 따라 위치하고 제1 패턴을 갖고 적어도 하나의 제1 물질을 유지하도록 구성되는 복수의 제1 영역을 갖는 기판, 상기 적어도 하나의 제1 영역에서 유지되는 적어도 하나의 제1 물질, 상기 제1 표면의 일부를 따라 형성되며 상기 복수의 제1 영역에 노출되지 않는 제1 세트의 덕트들, 상기 제1 표면에 대향하는 제2 표면 및 상기 제2 표면의 일부를 따라 형성되며 상기 복수의 제1 영역의 패턴과 대략 유사한 패턴을 갖고 적어도 하나의 제2 물질을 유지하도록 구성된 복수의 제2 영역을 갖는 플레이트 - 상기 제1 표면과 상기 제2 표면은 서로에 대하여 미끄러지도록 구성됨 -, 및 상기 복수의 제2 영역 중 적어도 하나에서 유지되는 적어도 하나의 제2 물질을 포함하고, 상기 제1 위치에서, 상기 제1 세트의 덕트들은 상기 복수의 제2 영역에 노출됨 - 를 제공하는 단계와, 상기 장치를 상기 제1 위치로부터 제2 위치로 이동시키는 단계를 포함하고, 상기 제2 위치에서, 상기 복수의 제1 영역 중 적어도 하나 및 상기 복수의 제2 영역 중 적어도 하나는 서로에 대하여 노출되고, 이에 따라 상기 적어도 하나의 제1 물질 및 상기 적어도 하나의 제2 물질을 서로 반응시킨다.
본 발명의 또 다른 실시예는 반응을 수행하기 위한 방법을 포함하고, 상기 방법은, 제1 위치에서 장치 - 상기 장치는, 제1 표면 및 상기 제1 표면의 일부를 따라 위치하며 적어도 하나의 제1 물질을 유지하도록 구성되는 제1 영역을 갖는 기판, 상기 제1 영역에서의 적어도 하나의 제1 물질, 상기 제1 표면에 대향하며 적어도 하나의 제2 물질을 유지하도록 구성된 상기 제2 표면의 일부를 따라 위치하는 제2 영역을 갖는 상부 플레이트, 상기 제2 영역에서의 적어도 하나의 제2 물질, 및 상기 기판의 제1 표면 및 개구부가 관통 형성된 상기 상부 플레이트의 제2 표면 사이에 배치된 중간 플레이트를 포함하고, 상기 기판, 상기 상부 플레이트 및 상기 중간 플레이트는 서로에 대하여 미끄러지도록 구성되고, 상기 제1 위치에서, 상기 제1 영역은 상기 개구부를 통해 상기 제2 영역에 노출되지 않음 -를 제공하는 단계와, 상기 장치를 상기 제1 위치로부터 제2 위치로 이동시키는 단계를 포함하고, 상기 제2 위치에서, 상기 제1 영역은 상기 개구부를 통해 상기 제2 영역에 노출되고, 이에 따라 상기 적어도 하나의 제1 물질과 상기 적어도 하나의 제2 물질을 반응시킨다.
본 발명의 또 다른 실시예는, 시약들의 인벤토리를 제시하고, 고객으로부터 소망하는 서브세트의 시약들을 접수하고, 상기 고객에게 키트를 전달하기 위한 키트를 포함하고, 상기 키트는, 제1 표면 및 상기 제1 표면의 일부를 따라 위치하며 적어도 하나의 제1 물질을 유지하도록 구성되는 제1 영역을 갖는 기판, 및 제2 표면 및 상기 제2 표면의 일부를 따라 위치하며 적어도 하나의 제2 물질을 유지하도록 구성되는 제2 영역을 갖는 플레이트, 및 상기 제1 영역에서의 제1 물질 또는 상기 제2 영역에서의 제2 물질을 포함하고, 상기 기판의 제1 표면 및 상기 플레이트의 제2 표면은, 함께 맞춰지는 경우, 서로 대향하고, 상기 제1 영역과 상기 제2 영역이 서로 노출되지 않는 제1 위치와 상기 제1 영역과 상기 제2 영역이 서로 노출되는 제2 위치 사이에서 서로에 대하여 이동하도록 구성되고, 상기 제1 물질과 상기 제2 물질 중 적어도 하나는 상기 소망하는 서브세트의 시약들의 요소이다.
본 발명의 또 다른 실시예는, 시약들의 인벤토리를 제시하고, 고객으로부터 소망하는 서브세트의 시약들을 접수하고, 상기 고객에게 키트를 전달하기 위한 키트를 포함하고, 상기 키트는, 제1 표면 및 상기 제1 표면의 일부를 따라 위치하며 제1 패턴을 갖고 적어도 하나의 제1 물질을 유지하도록 구성되는 복수의 제1 영역을 갖는 기판, 상기 제1 표면의 일부를 따라 형성되며 상기 복수의 제1 영역에 노출되지 않는 제1 세트의 덕트들, 제2 표면 및 상기 제2 표면의 일부를 따라 위치하며 상기 복수의 제1 영역의 패턴과 대략 유사한 패턴을 갖고 적어도 하나의 제2 물질을 유지하도록 구성된 복수의 제2 영역을 갖는 플레이트, 및 상기 제1 영역에서의 제1 물질과 상기 제2 영역에서의 제2 물질 중 적어도 하나를 포함하고, 상기 제1 표면과 상기 제2 표면은, 함께 맞춰지는 경우, 상기 제1 세트의 덕트들이 상기 복수의 제2 영역에 노출되는 제1 위치 및 상기 복수의 제1 영역 중 적어도 하나와 상기 복수의 제2 영역 중 적어도 하나가 서로에 대해서만 노출되는 제2 위치 사이에서 서로에 대하여 미끄러지도록 구성된다.
도 1a는 제1 위치에 있는 본 발명의 일 실시예에 따른 슬립칩 장치의 측면도이다.
도 1b는 제2 위치에 있는 도 1a에 도시한 실시예의 슬립칩 장치의 측면도이다.
도 2는 본 발명의 다른 실시예에 따른 슬립칩 장치의 부분도이다.
도 3a는 제1 위치에 있는 본 발명의 다른 실시예에 따른 슬립칩 장치의 사시도이다.
도 3b는 제2 위치에 있는 도 3a에 도시한 슬립칩 장치의 측면도이다.
도 3c는 제3 위치에 있는 도 3a에 도시한 슬립칩 장치의 측면도이다.
도 3d는 제4 위치에 있는 도 3a에 도시한 슬립칩 장치의 측면도이다.
도 4a는 제1 위치에 있는 본 발명의 다른 실시예에 따른 슬립칩 장치의 측면도이다.
도 4b는 제2 위치에 있는 도 4a에 도시한 슬립칩 장치의 측면도이다.
도 4c는 제3 위치에 있는 도 4a에 도시한 슬립칩 장치의 측면도이다.
도 5a는 제1 위치에 있는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 슬립칩 장치의 측면도이다.
도 5b는 제2 위치에 있는 도 5a에 도시한 슬립칩 장치의 측면도이다.
도 6a는 제1 위치에 있는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 슬립칩 장치의 평면도 및 단면도이다.
도 6b는 제2 위치에 있는 도 6a에 도시한 실시예에 따른 슬립칩 장치의 평면도 및 단면도이다.
도 7a는 제1 위치에 있는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 슬립칩 장치의 부분도이다.
도 7b는 제2 위치에 있는 도 7a에 도시한 슬립칩 장치의 부분도이다.
도 8a는 제1 위치에 있는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 슬립칩 장치의 부분 평면도이다.
도 8b는 제2 위치에 있는 도 8a에 도시한 슬립칩 장치의 부분도이다.
도 8c는 제3 위치에 있는 도 8a에 도시한 슬립칩 장치의 부분도이다.
도 8d는 제4 위치에 있는 도 8a에 도시한 슬립칩 장치의 부분도이다.
도 9a는 제1 위치에 있는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 슬립칩 장치의 평면도이다.
도 9b는 제2 위치에 있는 도 9a에 도시한 슬립칩 장치의 평면도이다.
도 10a는 제1 위치에 있는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 슬립칩 장치의 부분 평면도이다.
도 10b는 제2 위치에 있는 도 10b에 도시한 슬립칩 장치의 부분 평면도이다.
도 11a는 제1 위치에 있는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 슬립칩 장치의 부분 평면도이다.
도 11b는 제2 위치에 있는 도 11a에 도시한 슬립칩 장치의 부분 평면도이다.
도 11c는 제1 위치에 있는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 슬립칩 장치의 부분 평면도이다.
도 11d는 제2 위치에 있는 도 11c에 도시한 슬립칩 장치의 부분 평면도이다.
도 12a는 제1 위치에 있는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 슬립칩 장치의 평면도이다.
도 12b는 제2 위치에 있는 도 12a에 도시한 슬립칩 장치의 부분 평면도이다.
도 13a는 제1 위치에 있는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 슬립칩 장치의 사시도이다.
도 13b는 제2 위치에 있는 도 13a에 도시한 슬립칩 장치의 사시도이다.
도 14a는 제1 위치에 있는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 슬립칩 장치의 부분 평면도이다.
도 14b는 제2 위치에 있는 도 14a에 도시한 슬립칩 장치의 부분 평면도이다.
도 15는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 슬립칩 장치의 부분 측면도이다.
유사한 구성요소들이 유사한 번호들로 참조되는 도면들을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 본 발명의 다양한 구성요소들의 관계 및 기능은 하기의 상세한 설명에 의해 더욱 잘 이해할 수 있다. 그러나, 후술하는 본 발명의 실시예들은 예시일 뿐이며, 본 발명이 도면에 도시한 실시예들로 한정되지 않는다. 본 발명의 발명자들은, 이론에 의해 한정하려는 의도 없이, 후술하는 다수의 예들에서, 본 발명을 실시할 수 있는 것으로 파악되는 이론들을 제시한다. 과학적 이론을 제시하는 어떠한 표현들도 청구 발명을 한정하려는 것이 아니며 청구 발명을 한정하는 것으로서 취급해서도 안된다.
단수 형태인 “한(a)”, “하나(an)”, “그(the)”는, 명세서 및 청구범위에서 사용되는 경우, 명백하게 달리 언급하지 않는 한 복수의 형태도 나타낸다. 따라서, 예를 들어, “하나의 물질(a substance)”에 대한 참조는, 단수 물질 및 복수의 물질을 포함하고, “한 영역(an area)”에 대한 참조는, 단수 영역 및 복수의 영역을 포함하고, “한 덕트(a duct)”에 대한 참조는 단수 덕트 및 복수의 덕트를 포함하며, 다른 표현들도 동일한 방식이다.
본 명세서에서 사용되는 “영역(area)”이라는 용어는 두 개 이상의 물질이 서로에게 노출되는 사이트(site)를 가리킨다. 또한, 상기 “영역”은 표면을 따라서 또는 표면 내에 물질을 유지할 수 있는 표면을 따른 일부를 가리킨다. 상기 “영역”은 홀(hole), 웰(well), 캐비티(cavity), 또는 오목부(indentation) 등의 물리적 구조를 취할 수 있고, 그 길이, 폭 또는 깊이를 따라 직사각형, 원형 또는 삼각형 등의 임의의 단면 형상을 가질 수 있다.
“제1 위치”와 “제2 위치” 사이를 이동한다는 맥락에서 사용될 때의 “사이(between)”라는 용어는, 제1 위치로부터 제2 위치로의 이동하는 경우만, 제2 위치로부터 제1 위치로 이동하는 경우만, 또는 제1 위치로부터 제2 위치로 이동하고 제2 위치로부터 제1 위치로 이동하는 경우를 의미할 수 있다.
“폐쇄형 시스템”(closed system)이라는 용어는 물질이 아닌 열과 에너지를 그 주변과 교환할 수 있는 계를 나타낼 수 있다. 일부 실시예들에서, 상기 폐쇄형 시스템은 액체를 그 주변과는 교환할 수 없지만 수증기나 산소 등의 기체와는 교환할 수 있는 것일 수 있다. 일부 실시예들에서, 상기 폐쇄형 시스템은, 액체 상태의 물을 그 주변과 교환할 수 없지만 수증기나 산소 등의 기체, 또는 윤활층이나 기질을 침투할 수 있는 물질과는 교환할 수 있는 것일 수 있고, 또한 전단 농화 유체 등의 비뉴턴 유체일 수 있다. 상기 폐쇄형 시스템은 하이드로겔을 포함한 겔일 수도 있다. 또한, 상기 폐쇄형 시스템은 지방질 큐빅 상(phase)과 기타 지방질 중간상을 포함한 탄수화물 풍부 상 또는 지방질 풍부 상일 수 있다. 일부 실시예들에서, 기체에 대한 투과성이 바람직할 수도 있으며, 예를 들어, 본 슬립칩 내의 생 세포 및 조직을 이용하는 일부 적용 예에서 바람직하다.
“덕트(duct)”라는 용어는 물질이 이송될 수 있는 3차원 밀폐공간을 가리킬 수도 있다. 대안으로, 상기 덕트는 물질이 이송될 수도 있는 표면 내의 개방된 홈(groove) 또는 트렌치(trench)를 가리킬 수도 있다. 덕트는 관형이나 원통형 등의 임의의 형태 또는 형상을 취할 수 있고, 상기 덕트의 길이를 따라 균일하거나 가변적(예를 들어, 테이퍼형) 직경을 가질 수 있고, 상기 덕트의 길이를 따라 직사각형, 원형 또는 삼각형 등의 하나 이상의 단면 형상을 가질 수 있다. 상기 “덕트”라는 용어는, 여기에서 사용되는 것처럼, 장치에서 사용하는 데 적절한 사이즈로 된 미세덕트를 포함한다. 덕트는 다른 하나의 덕트, 영역, 또는 다른 임의의 형태의 도관을 통해 적어도 하나의 또 다른 덕트에 접속될 수 있다.
소정의 실시예들에서는 영역이 덕트일 수도 있고, 소정의 실시예들에서는 덕트가 영역일 수도 있다.
전술한 바와 같이, 상기 덕트는 임의의 단면 형상(원형, 타원형, 삼각형, 불규칙한 형상, 정사각형 또는 직사각형 등)을 가질 수 있고, 피복되거나 피복되지 않을 수 있다. 상기 덕트가 완전히 덮히는 실시예들에서, 상기 덕트의 적어도 일 부분은 완전히 폐쇄되는 단면을 가질 수 있고, 또는 상기 덕트 전체가 입구(들)와 출구(들)를 제외하면 상기 덕트의 전체 길이를 따라 완전히 피복될 수 있다. 덕트는 일반적으로 물질 수송에 대한 제어를 촉진하는 특성, 예를 들어, 구조적 특성 및/또는 물리적 또는 화학적 특성(소수성 또는 친수성) 또는 유체에 힘을 가할 수 있는 기타 특성을 포함할 것이다. 상기 덕트 내의 물질은 상기 덕트를 부분적으로 또는 완전히 채울 수 있다. 개방형 덕트가 사용되는 일부 경우에, 유체 등의 상기 물질은, 예를 들어, 표면 장력(즉, 오목 또는 볼록 메니스커스)을 이용하여 상기 덕트 내에 보유될 수도 있다.
상기 덕트는, 임의의 크기일 수 있는데, 예를 들어, 약 50 mm 미만, 약 5 mm 미만, 약 2 mm 미만, 약 1 mm 미만, 약 500 마이크로미터 미만, 약 200 마이크로미터 미만, 약 60 마이크로미터 미만, 약 50 마이크로미터 미만, 약 40 마이크로미터 미만, 약 30 마이크로미터 미만, 약 15 마이크로미터 미만, 약 10 마이크로미터 미만, 약 3 마이크로미터 미만, 약 1 마이크로미터 미만, 약 300 nm 미만, 약 100 nm 미만, 약 30 nm 미만, 또는 약 10 nm 미만의, 유체 등의 물질의 흐름 방향에 수직하는 최대 치수를 가질 수 있다. 일부 경우에, 상기 덕트의 치수는 물질이 영역이나 다른 덕트들을 통해서, 또는 상기 영역이나 다른 덕트들 내로 자유롭게 흐를 수 있도록 선택될 수도 있다. 또한, 상기 덕트의 치수는, 예를 들어, 상기 덕트 내에서 유체의 소정의 체적 또는 선형 유속이 가능하도록 선택될 수도 있다. 물론, 덕트의 수와 모양은 당업자에게 알려져 있는 임의의 방법에 의해 가변될 수 있다.
“노출(exposed)”이라는 용어는, 여기에 사용되는 것처럼, 두 개 이상의 구성요소들 사이의 연통하는 형태이다. 이러한 구성요소들은 물질, 영역, 덕트, 통로, 채널, 루멘, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수도 있다. 일부 경우에, “노출”은 두 개 이상의 물질이 서로 유체 연통됨을 의미할 수 있고, 또는 이와 달리, 두 개 이상의 물질이 서로 반응함을 의미할 수도 있다.
“유체 연통(fluidic communication)”이라는 용어는, 여기에서 사용되는 것처럼, 경로가 개방될 때 실질적으로 제한받지 않고 액체, 기체, 또는 고체 등의 물질이 통과할 수 있는 임의의 덕트, 채널, 튜브, 파이프, 또는 경로를 가리킨다. 상기 경로가 폐쇄되면, 상기 물질은 실질적으로 통과를 제한받는다. 물질이 존재하는 실시예들에서, 상기 반응 영역들이 상기 경로를 통한 통로에 비해 상기 기질을 통한 확산을 허용하도록 공간적으로 위치하면, 상기 장치가 폐쇄 위치에 있을 때 물질은 상기 기질을 통해 하나의 반응 영역으로부터 다른 반응 영역으로 이동할 수 있다. 통상적으로, 상기 물질과 재료의 조성에 따라 발생할 수 있거나 발생하지 않을 수도 있는, 플레이트, 기판, 및/또는 기질의 재료를 통한 물질의 제한된 확산은 유체 연통에 해당되지 않는다.
“반응한다(react)” 또는 “반응(reaction)”이라는 용어들은, 예를 들어, 반응물, 시약, 상, 분산매, 또는 플러그 유체 등의 적어도 하나의 물질을 관련시키며 (화학적, 생화학적, 생물학적 전환의 경우에) 일반적으로 공유, 비공유, 반 데르 발스, 수소, 또는 이온 결합들 등의 하나 이상의 결합의 파괴 또는 형성을 관련시키는 물리적, 화학적, 생화학적, 또는 생물학적 전환을 가리킨다. 상기 용어는, 통상적인 광화학적 반응 및 전자화학적 반응, 합성 반응, 중화 반응, 분해 반응, 치환 반응, 환원 산화 반응, 침전, 결정화 반응, 연소 반응 및 폴리머화 반응 등의 통상적인 화학 반응, 및 공유 결합과 비공유 결합, 상 변화, 색 변화, 상 형성, 용해, 광 방출, 광 흡수성 또는 광 방출성의 변화, 온도 변화 또는 열 흡수나 방출, 변화, 입체 구조적 변화, 및 단백질 등의 거대 분자의 접힘과 펴짐도 포함한다.
상기 “물질(substance)”이라는 용어는, 여기에서 사용되는 것처럼, 임의의 화학적, 화합물, 혼합물, 용액, 유제, 분산제, 현탁제, 분자, 이온, 다이머, 폴리머나 단백질 등의 거대 분자, 생체 분자, 침전물, 결정, 화학적 부분이나 그룹, 입자, 나노입자, 시약, 반응 생성물, 용매, 또는 유체를 가리키며, 이들 중 임의의 하나는 고체, 액체, 또는 기체 상태에서 존재할 수 있고, 통상적으로 분석 대상이다.
반응을 수행하기 위한 장치(10)가 도 1a와 도 1b에 도시되어 있다. 도 1a와 도 1b는 길이 방향 축을 따라 취한 상기 장치(10)의 단면도이다. 상기 장치(10)는 기판(base)(12) 및 플레이트(plate)(14)를 포함한다. 제1 표면(surface)(16)은 상기 기판(12)의 일부를 따라서 형성되어 있다. 제1 영역(area)(18)은 상기 제1 표면(16)의 일부를 따라서 위치한다. 제2 표면(20)은 상기 플레이트(14)의 일부를 따라서 형성되어 있으며, 상기 제2 표면(20)의 일부를 따라 위치하는 제2 영역(22)을 갖는다. 상기 제1 및 제2 표면(16, 20)은 서로 고정 대향할 수 있으며, 이들은 실질적으로 평면형일 수 있으며, 또는 대안으로, 상기 제1 및 제2 표면(16, 20) 사이의 상대적 이동을 허용하도록 상보적인 표면 특성을 가져도 된다. 또한, 상기 제2 표면(20)은 상기 제1 표면(16)에 대하여 복합적, 비평면적, 및/또는 비평행적일 수 있다. 상기 제1 및 제2 표면(16, 20)은 서로 가깝게 면할 수 있고, 일부 실시예들에서는, 예를 들어, (클립, 스프링, 공압이나 수압 수단, 또는 클램핑 장치들 등의) 외부 수단을 이용하여 부품들을 함께 가압함으로써 가압 밀봉 기술을 이용할 수 있다. 또한, 상기 제1 및 제2 표면(16, 20)에 균일한 압력이 가해지는 것을 보장하도록, 압력이 상기 장치(10)를 따라서 이산 위치들에 가해질 때 상기 표면들의 형상을 가변시켜 상기 표면들(16, 20)에 걸쳐 균일한 압력이 발생하는 것을 보장할 수 있다. 예를 들어, 상기 두 개의 표면이 원뿔형이면, 압력을 가하여 상기 두 개의 표면이 서로 밀접하게 접하게 할 수 있다. 플레이트들 중 하나 이상은 상기 압력이 가해질 때 변형되어 국소적 압력을 전체 표면에 걸쳐서 균일한 압력으로 재분배하도록 설계될 수 있다.
일부 실시예들에서, 영역들은, 서로에게 노출되면 기체를 소모하거나 압력 감소를 야기하는 시약들로 채워지고, 폐쇄형 시스템을 형성하도록 구성된다. 예를 들어, 적어도 하나의 제1 영역은 수산화나트륨을 함유할 수 있고, 적어도 하나의 제2 영역은 이산화탄소로 채워질 수도 있다. 일단 상기 장치(10)의 부분들을 이동시켜 상기 적어도 하나의 제1 영역을 상기 제2 영역에 노출시키면, 상기 수산화나트륨의 상기 이산화탄소와의 반응이 부분적 진공을 형성할 수 있다. 이러한 부분적 진공은 상기 장치(10)의 상기 플레이트(14)와 상기 기판(12)을 함께 유지하도록 작용하는 힘을 생성한다.
상기 제1 및 제2 표면(16, 20)은 평면형이거나 비평면형일 수 있다. 예를 들어, 상기 표면들은 원통형일 수 있다. 상기 기판(12)과 상기 플레이트(14)의 원통형 장치(10)에서의 상대적 이동은 회전식이다. 상기 기판(12)과 상기 플레이트(14)의 상대적 이동을 수동으로 수행하려면, 핸들을 상기 기판(12), 상기 플레이트(14) 또는 둘 다에 고정시킬 수 있을 것이다. 당업자에게는 상기 표면들(16, 20)이 서로 밀접하게 계면하는 형상들일 수 있음이 명백할 것이다. 상기 제1 표면과 상기 제2 표면은 동심원일 수 있다.
상기 제1 및 제2 표면(16, 20)은 상기 기판(12) 및 상기 플레이트(14)와 각각 동일한 재료로 형성될 수 있다. 이와 달리, 상기 표면들(16, 20)은 마찰 계수가 낮은 다른 임의의 적절한 재료로 형성되어도 되며, 소수성이나 친수성을 가져도 된다. 또한, 상기 제1 및 제2 영역(18, 22)도 상기 제1 및 제2 표면(16, 20) 또는 상기 기판(12)과 상기 플레이트(14)와 각각 서로 다른 재료로 형성될 수 있거나 서로 다른 성질을 가질 수 있다.
상기 제1 영역(18)과 상기 제2 영역(22) 모두는, 도 1a와 도 1b에 도시한 바와 같이, 내부에 물질을 유지하도록 구성된 영역들(23)이다. 그러나, 상기 제1 영역(18)과 상기 제2 영역(22)은 또한 도 2에 도시한 바와 같이 물질의 표면 패턴(25), 또는 도 4에 도시한 바와 같이 관통홀(through hole)일 수 있다. 도 2에 도시한 바와 같이, 상기 제1 영역(18)과 상기 제2 영역(22)은 다른 것과 동일한 구조적 구성을 갖거나, 동일한 물질을 유지할 필요는 없다.
영역들(18, 22)은, 예를 들어, 다공성 유리, 알루미늄 산화물, 또는 종이에서 발견되는 셀룰로오스 매트릭스 등의 다공성 재료들을 함유할 수도 있다. 이러한 영역들은 매트릭스를 상기 영역 내로 증착시킴으로써 될 수 있다. 대안으로, 이러한 영역들은 다공성 층을 패터닝하고 상기 영역들 주위에 상기 다공성 층을 채움으로써 형성될 수 있다. 예를 들어, 종이는, Martinez, A.W., Phillips, S.T., Carrilho, E., Thomas III, S.W., Sindi, H., Whitesides, G.M., Simple telemedicine for developing regions: Camera phones and paper-based microfluidic devices for real-time, off-site diagnosis (2008) Analytical Chemistry, 80 (10), pp. 3699-3707, Martinez, A.W., Phillips, S.T., Butte, M.J., Whitesides, G.M. Patterned paper as a platform for inexpensive, low-volume, portable bioassays (2007) Angewandte Chemie - International Edition, 46 (8), pp. 1318-1320, Martinez, A.W. FLASH: A rapid method for prototyping paper-based microfluidic devices (2008) Lab Chip, and Macek, K., Becvarova, H. Papers, ready-for-use plates, and flexible sheets for chromatography (1971) Chromatographic Reviews, 15 (1), pp. 1-28에서 설명하는 방법들에 의해 패터닝될 수 있고, 다른 재료들은, 상기 영역들 주위에 지역들을 채우고 그리고/또는 피복하도록, Vozzi, G., Flaim, C., Ahluwalia, A., Bhatia, S. Fabrication of PLGA scaffolds using soft lithography and microsyringe deposition (2003) Biomaterials, 24 (14), pp. 2533-2540, Desai, T.A., Hansford, D.J., Leoni, L., Essenpreis, M., Ferrari, M. Nanoporous anti-fouling silicon membranes for biosensor applications (2000) Biosensors and Bioelectronics, 15 (9-10), pp. 453-462, Pichonat, T., Gauthier-Manuel, B. Development of porous silicon-based miniature fuel cells (2005) Journal of Micromechanics and Microengineering, 15 (9), pp. S179-S184, Cohen, M.H., Melnik, K., Boiarski, A.A., Ferrari, M., Martin, F.J. Microfabrication of silicon-based nanoporous particulates for medical applications (2003) Biomedical Microdevices, 5 (3), pp. 253-259, De Jong, J., Ankone, B., Lammertink, R.G.H., Wessling, M. New replication technique for the fabrication of thin polymeric microfluidic devices with tunable porosity (2005) Lab on a Chip - Miniaturisation for Chemistry and Biology, 5 (11), pp. 1240-1247, Ohji, H., Lahteenmaki, S., French, P.J. Macro porous silicon formation for micromachining (1997) Proceedings of SPIE - The International Society for Optical Engineering, 3223, pp. 189-197, Chu, K.-L., Gold, S., Subramanian, V., Lu, C., Shannon, M.A., Masel, R.I. A nanoporous silicon membrane electrode assembly for on-chip micro fuel cell applications (2006) Journal of Microelectromechanical Systems, 15 (3), pp. 671-677, Petronis, S., Gretzer, C., Kasemo, B., Gold, J. Model porous surfaces for systematic studies of material-cell interactions (2003) Journal of Biomedical Materials Research - Part A, 66 (3), pp. 707-721, 및 Wang, M., Feng, Y. Palladium-silver thin film for hydrogen sensing (2007) Sensors and Actuators, B: Chemical, 123 (1), pp. 101-106에서 설명하는 방법들에 의해 패터닝될 수 있으며, 이들 모두는 본 명세서에서 참고로 원용된다.
다시 도 1a와 도 1b에 도시한 실시예를 참조해 보면, 상기 제1 및 제2 표면(16, 20)은 실질적으로 서로 대향하고 있다. 기질(substrate)(24)이 상기 제1 및 제2 표면(16, 20) 사이에 배치되어 각 영역(18, 22) 내의 물질을 유지하는 데 일조할 수도 있고, 또는 각 영역(18, 22)을 교차 오염으로부터 보호하도록 기능할 수도 있다. 상기 기질(24)은, 상기 장치(10)와 접하고 그리고/또는 상기 장치를 통해 이송될 물질에 대하여 실질적으로 불활성인 재료로 이루어지는 것이 통상적이다. 상기 기질(24)은, 또한 상기 장치(10)와 접하고 그리고/또는 상기 장치를 통해 이송될 물질과 실질적으로 혼화되지 않는 재료로 이루어지는 것이 통상적이다.
상기 기질(24)은 탄화수소 또는 플루오르화 물질일 수 있으며, 본 발명에서 사용될 수 있는 상기 플루오르화 물질은, 플루오르화 탄소, 과불화 탄소, 알킬 및 아릴 플루오르화 탄소, 할로플루오르화 탄소, 플루오르화 알코올, 플루오르화 오일, 및 과불화 폴리에테르를 포함한 액체 플루오르폴리머를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 예로는, 과불화 옥틸 브롬화물, 과불화 옥틸에탄, 옥타데카 플루오로 데카히드로나프탈렌, 1-(1, 2, 2, 3, 3, 4, 4, 5, 5, 6, 6-언데카-플루오르화사이클록헥실)에탄올, C6F11C2H4OH, 플루오리너트(Flourinert (3M)), 크라이톡스(Krytox) 오일, 폼블린(Fomblin) 오일, 및 뎀넘(Demnum) 오일이 있지만, 이러한 예로 한정되지 않는다. 탄화수소 물질들로는, 알칸, 또는 알칸의 혼합물 (예를 들어, 헥산, 헥사데칸 및 미네랄 오일 등의 파라핀 오일), 기타 유기 재료와 폴리머를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 다른 유체 재료로는 실리콘 오일 및 다양한 그리스 (예를 들어, 다우 피복(Dow Corning)의 고 진공 그리스, 폼블린(Fomblin)의 진공 그리스, 크라이톡스(Krytox)의 그리스), 및 이온성 유체를 포함한다. 유체는, 또한, 비뉴턴 유체일 수 있으며, 예를 들어, 전단 농화 유체, 하이드로겔을 포함한 겔, 및 지방질 큐빅 상과 기타 지방질 중간상을 포함한 지방질 풍부 상 또는 탄수화물 풍부 상일 수 있다. 일부 실시예들에서는 기체에 대한 투과성이 바람직할 수 있으며, 예를 들어, 슬립칩 내의 생 세포와 조직을 이용하는 일부 적용 예에서 바람직할 수 있다. 예를 들어, 계면 활성제를 상기 기질에 첨가하여 표면 응집을 야기하거나 방지하고 그리고/또는 물질들의 안정성에 영향을 끼칠 수 있다. 윤활 분말 또는 비드를 사용할 수도 있다. 상술한 재료들 중 일부의 변형 또는 버전은 여기서 적용할 수 있으며, PTFE, PFA 또는 FEP 테플론 재료들로 구성될 수 있는 다양한 테플론 비드 또는 분말을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 다른 건식 윤활제로는 그라파이트, 몰리브덴 이황화물 및 텅스텐 이황화물을 포함한다. 상기 기질은 고체 멤브레인일 수도 있다. 예를 들어, 영역에 비드계 시약들을 사용하면, 상기 멤브레인은 비드가 영역(18)으로부터 영역(22)으로 이동하는 것을 방지하면서 다른 물질들을 상기 영역(18)으로부터 상기 영역(22)으로 확산하는 것을 여전히 가능하게 할 수 있다. 이러한 멤브레인은, 예를 들어, 테플론 멤브레인 또는 폴리카보네이트 멤브레인 또는 셀룰로오스 멤브레인 또는 다른 임의의 멤브레인일 수 있다. 일부 실시예들에서, 통상적으로 상기 기질(24)이 액체인 경우, 상기 기질은 상기 장치의 영역들 및/또는 덕트들을 부분적으로 채울 수도 있다. 특히, 일부 실시예들에서, 표면 장력은 상기 기질(24)로 하여금 부피로 존재하는 시료 유체를 기질(24)에 의해 분리되는 별개 플러그(plug)들이나 방울(droplet)들로 분리되게 할 수 있다. 상기 부피가 그 길이를 따라 단면에 있어서 가변한다면, 상기 기질(24)은, 예를 들어, 상기 부피에서 단면적이 더욱 넓은 부분들에 대부분 존재할 수 있고, 예를 들어, 덕트들에 존재할 수 있고, 상기 시료는 상기 부피에서 단면적이 더욱 넓은 부분들에 대부분 존재할 수 있다.
도 1a는 또한 “위치 A”라 칭하는 제1 위치에 있는 상기 장치(10)를 도시하고, 도 1b는 “위치 B”라 칭하는 제2 위치에 있는 상기 장치를 도시한다. 상기 장치(10)는, 상기 제1 위치에 있는 경우, 상기 제1 표면(16)이 상기 제2 표면(20)에 대향하고 상기 제2 표면(20)의 법선에 실질적으로 수직하는 방향으로 이동하여 상기 제1 표면(16)과 상기 제2 표면(20) 사이의 (상기 장치가 도 1a에 도시한 바와 같이 배향되어 있는 경우 정의된 바와 같은) 수직 거리가 대략 일정한 값으로 유지되도록 구성되도록 배향된다. 상기 거리, 즉, 상기 제1 표면(16)과 상기 제2 표면(20) 사이의 갭은 상기 기질의 존재 및 상기 기질의 유형에 따라 가변될 수 있다. 일부 실시예들에서, 상기 거리는 다양한 장치 위치들에 따라 가변될 수 있는데, 예를 들어, 디자인이나 표면 거칠기로 인해 가변될 수 있다. 일반적으로 말하면, 상기 갭은 0.2 나노미터 내지 20 마이크로미터의 범위 내의 어떠한 값을 가져도 된다.
상기 제1 위치에 있는 경우, 상기 제1 영역(18)과 상기 제2 영역(22)은 각자 물질을 함유하지만, 상기 제1 영역(18) 및 상기 제2 영역(22), 따라서 상기 물질들은 서로에게 노출되지 않는다. 상기 제2 위치에 있는 경우, 상기 기판(12)과 상기 플레이트(14) 중 적어도 하나는 상기 기판(12)의 법선에 수직하는 방향으로 나머지 하나에 대하여 이동하여, 상기 제1 및 제2 영역(18, 22)이 서로에게 노출된다. 본 실시예에서, 도 1a와 도 1b에 도시한 바와 같이, 상기 제1 및 제2 영역(18, 22)은 한 영역이 나머지 한 영역과 중첩될 때 서로에 대해서만 노출된다. 그러나, 노출과 중첩되는 정도는 가변될 수 있는데, 도 2에 도시한 바와 같이, 상기 제1 및 제2 영역(18, 22) 중 일부만이 중첩될 때 상기 제2 위치에 도달할 수도 있다. 또한, 본 발명의 다른 실시예들에 대하여 후술하는 바와 같이, 두 개 이상의 영역 중 어느 것도 중첩되지 않으면서 상기 두 개 이상의 영역이 서로 노출될 수 있게 하는 다른 구성도 고려한다. 상기 제1 및 제2 영역(18, 22)이 서로 어떻게 노출되는지에 상관없이, 상기 노출은 상기 제1 및 제2 영역(18, 22)에서의 물질들이 서로 반응하게 할 수 있다.
그러나, 본 명세서에서 설명하는 실시예들의 각각에서는, 상기 장치(10)가 상기 제2 위치에 있을 때, 적어도 하나의 제1 영역(18) 및 대응하는 제2 영역(22)이 중첩되어서 다른 어떠한 물질도 상기 제1 및 제2 영역(18, 22)에 노출되거나 상기 제1 및 제2 영역(18, 22)과 연통하지 않도록 할 수도 있음을 고려한다. 이에 따라, 상기 제1 및 제2 영역(18, 22) 각각은, 어떠한 채널, 덕트, 입구, 출구, 또는 내부에 물질을 제공하도록 구성된 다른 임의의 구조에 노출되거나 이러한 채널, 덕트, 입구, 출구, 또는 다른 임의의 구조와 연통하지 않는다.
상기 기판(12)과 상기 플레이트(14) 중 적어도 하나는 다른 것에 대하여 더 이동하여 상기 제1 및 제2 영역(18, 22)이 서로에게 더 이상 노출되지 않도록 상기 제1 및 제2 영역을 분리할 수도 있다. 상기 기판(12) 및/또는 상기 플레이트(14)는 상기 제1 위치로 다시 이동할 수 있고, 또는 상기 제1 위치와는 다른 제3 위치로 이동하여 상기 제1 및 제2 영역(18, 22)을 분리할 수도 있다. 상기 기판(12)과 상기 플레이트(14) 사이의 상대적 이동은, 상기 기판(12)과 상기 플레이트(14) 간의 상대적 이동 양과 방향을 제한하기 위해 가이드/트랙 (도시하지 않음) 구성 또는 미끄러져 상기 기판(12)과 상기 플레이트(14)를 맞물리게 구성된 볼 베어링에 의해 가이드될 수도 있다. 추가적으로, 상기 기판(12)과 상기 플레이트(14) 사이의 상대적 이동은 자동화될 수도 있다. 본 명세서에서 설명하는 실시예들 중 어느 것에서도, 상기 장치(10)는 상기 장치(10) 내의 반응을 기록 및/또는 측정하는 촬상 또는 센서 부품 등의 검출기를 포함할 수도 있다. 이러한 검출기와 촬상 장치의 예는 미국공개특허 제2009/0010804 및 WO 2008/002267에서 찾을 수 있으며, 이들은 본 명세서에서 참고로 원용된다. 상기 검출기는, 그 내용이 본 명세서에 참고로 원용되는 국제 공개특허 WO 2008/002267에 설명되어 있듯이, 웹 카메라, 디지털 카메라, 모바일 폰의 디지털 카메라 및 비디오 카메라로 이루어지는 그룹 중에서 선택될 수 있는, 검출하는 데 적합한 임의의 검출기일 수 있다. 대안으로, 상기 검출기는 적절한 조명 및 해상도를 갖는 카메라 또는 촬상 장치일 수 있으며, 상기 카메라 또는 촬상 장치는 그 내용이 본 명세서에 참고로 원용되는 미국 공개특허 제2009/0010804에 설명되어 있듯이 상기 장치에 의해 생성되는 개별적인 신호들을 공간적으로 분해하기 위한 것이다. 이러한 점에서, 본 발명의 촬상 장치는 본 장치의 다양한 디자인 및 구성과 호환성 있는 공지의 임의의 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 카메라는 전하 결합 장치(CCD), 전하 주입 장치(CID), 광 다이오드 어레이(PDA), 또는 상보 금속 산화물 반도체(CMOS)를 포함한 임의의 공통 고체 촬상 센서를 사용할 수 있다. 상기 장치는 덕트 및/또는 영역 내에 선, 점 또는 가시적 물질 등의 마커를 포함해서 등록 및/또는 분석이 가능하도록 할 수도 있다. 등록 마크가 상기 장치 상에 포함되어서, 사진이 찍힌 각도 및 배향에 대한 광수차의 자동 정정 또는 이미지의 조절이 가능하도록 할 수도 있다. 형광 결과를 검출하기 위해, 처프 여기/판독(chirped excitation/readout)을 이용할 수 있다. 예를 들어, 수 나노초 동안 상기 장치 상에 청색 여기 광을 조명한 후에, 끄고, 예를 들어, 수 나노초 후에 형광을 검출할 수도 있다. 이어서, 십 나노초 후에, 예를 들어, (초기 여기 플래시 없이) 다른 이미지를 수집하여 삭감을 위한 백그라운드 강도 이미지를 생성한다. 이러한 식으로, 낮에도 형광을 분석할 수 있다. 안전을 위해, 예를 들어, 상기 장치가 인식가능 패턴을 포함하고 있다면, 상기 검출기가 상기 장치를 자동 인식하도록 설계되어서 상기 검출기가 상기 장치에 집중된 여기 광만을 생성하도록 될 수 있다. 본 명세서에 참조로 원용되는 Sia 등의 Angewandte Chemie International Edition, (43), 4, 498-502에서는 펄스 변조를 사용하는 것을 포함하여 다수의 장치에서 신호들을 검출해서 노이즈를 줄이도록 하기 위한 추가 수단을 개시하고 있다. 또한, 당업자에게 알려져 있듯이, 여기/방출 광의 분극을 이용함으로써 검출을 개선할 수 있다.
상기 제1 및/또는 제2 영역(18, 22)의 수, 구성 또는 배향은 적용 예에 따라 달라지며 적용 예마다 가변될 수 있으며 무한 수의 구성을 포함할 수 있음을 인식할 수 있다. 이에 따라, 예를 들면, 도 3a 내지 도 3d는 상기 장치(10)의 또 다른 실시예를 도시한다. 이 도면 및 적절한 다른 도에 있어서, 실선은 상기 플레이트(14) 및 상기 제2 표면(20)에 연관된 특징을 나타내고, 점선은 상기 기판(12) 및 상기 제1 표면(16)에 연관된 특징을 나타낸다. 본 실시예에서, 상기 장치(10)는 하나의 제1 영역(18)을 갖는 기판(12) 및 두 개의 제2 영역(22)을 갖는 플레이트(14)를 포함한다. 상기 두 개의 제2 영역(22)은 상기 제2 표면(20)의 일부를 따라 위치하지만, 분리되어서 서로 직접적으로 노출되지 않는다.
상기 기판(12)과 상기 플레이트(14) 사이의 상대적 이동에 따라, 상기 제1 영역(18)은 상기 두 개의 제2 영역(22) 중 오직 하나, 나머지 제2 영역, 또는 상기 두 개의 제2 영역(22) 모두에 동시에 노출될 수 있다. 예를 들어, 도 3a의 위치 A에 도시한 바와 같이, 상기 제1 영역(18)은 상기 두 개의 제2 영역(22)에 노출되지 않으며, 이 위치에서, 상기 두 개의 제2 영역(22) 또한 서로 노출되지 않는다.
상기 기판(12) 및/또는 상기 플레이트(14)는, 도 3b의 위치 B에 도시한 바와 같이 상기 제1 영역(18)이 상기 두 개의 영역(22) 중 하나에만 노출되거나 도 3c의 위치 C에 도시한 바와 같이 상기 두 개의 제2 영역(22) 중 나머지 하나에만 노출되거나 도 3d의 위치 D에 도시한 바와 같이 상기 두 개의 제2 영역(22) 모두에 동시에 노출되도록 서로에 대하여 도 3a의 위치 A로부터 다른 위치로 이동할 수 있다. 상기 기판(12) 및/또는 상기 플레이트(14)는 상기 제2 위치로부터 다른 구성 및 반응을 허용하는 추가 위치로 더 이동할 수 있다. 물론, 상기 제1 영역(18) 및 상기 두 개의 제2 영역(22) 중 적어도 하나가 나머지 하나에 대하여 노출되는 순서로 인해 반응 대상 물질들과 상기 반응 자체가 제어될 것이다.
도 3a 내지 도 3d의 실시예는 하나의 플레이트(14)만을 포함하지만, 하나보다 많은 플레이트(14)를 사용하는 것을 고려하는 다른 실시예들도 존재한다. 예를 들어, 도 4a 내지 도 4c에 도시한 실시예에서, 상기 플레이트(14)와 상기 기판(12) 사이에는 중간 플레이트(46)가 있다. 상기 플레이트(14) 및 상기 기판(12)과 마찬가지로, 상기 중간 플레이트(46)는 상기 플레이트나 상기 기판 어느 것에 대해서도 미끄러지도록 구성되고, 내부에 개구부(48)를 더 한정하고 있다.
도 4a 내지 도 4c에 도시한 바와 같이, 본 실시예에서의 상기 장치(10)는, 세 가지 서로 다른 물질을 내부에 배치하도록 구성되며, 여기서 하나의 물질은 상기 제1 영역(18) 내부 또는 상기 제1 영역을 따라서 배치되고, 제2 물질은 상기 제2 영역(22) 내부 또는 상기 제2 영역을 따라서 배치되고, 제3 물질은 상기 개구부(48) 내부 또는 상기 개구부를 따라서 배치된다. 상기 제1 표면(16), 상기 제2 표면(20), 및 상기 중간 플레이트(46)는 서로에 대하여 이동하도록 구성된다. 본 실시예에서, 상기 장치(10)는, 상기 제1 영역(18), 상기 제2 영역(22) 및 상기 개구부(48)가 서로 노출되지 않는 도 4a의 위치 A인 제1 위치로부터, 상기 제2 영역(22)이 상기 개구부(48)에 노출되는 도 4b의 위치 B인 제2 위치로, 그리고 상기 제1 영역(18), 상기 제2 영역(22) 및 상기 개구부(48)가 모두 서로 노출되어 상기 세 가지 물질이 반응할 수 있는 도 4c의 위치 C인 제3 위치로 이동하도록 구성된다. 상기 제1 및 제2 영역(18, 22) 및 상기 개구부(48)가 서로 노출되는 순서는, 적어도, 가변될 수 있으며 상기 중간 플레이트(48)의 수가 적용 예에 따라 가변될 수 있음을 인식할 수 있다.
도 5a와 도 5b의 상기 장치(10)의 실시예는 중간 플레이트(46)가 하나보다 많아 적층된 구성의 일례이다. 본 실시예는, 복수의 중간 플레이트(46)를 포함하고, 상기 복수의 중간 플레이트(46)의 각각은 상기 중간 플레이트를 관통하는 개구부(48)를 갖고, 각 개구부는 다른 개구부들(48)과 정렬될 때 연속적 컬럼(50)을 형성한다. 이어서, 상기 개구부들(48) 중 하나를 통해서나 입구 포트 (도시하지 않음)를 통해서 물질을 상기 컬럼(50) 내에 배치할 수도 있다. 상기 중간 플레이트들(46)의 적층은 다수 물질 테스트를 위해 이용할 수 있고, 또는 향후 테스트를 위해 복수의 중간 플레이트(46)를 채우고 저장하는 데 이용할 수 있다. 안정성, 상기 중간 플레이트들(46)의 상대적 이동 제어 및 상기 중간 플레이트들(46)에 의해 함유되는 물질의 증발 제어를 제공하도록 홀더 (도시하지 않음)를 포함할 수도 있다.
전술한 바와 같이, 상기 장치(10)에 대한 본 실시예는 다수 물질 테스트를 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 도 5a의 위치 A인 제1 위치로부터 적어도 제1 방향으로 도 5b의 위치 B인 제2 위치로 하나의 중간 플레이트(46)가 나머지 중간 플레이트들(46)에 대하여 이동될 수 있고, 또는 부분적으로 미끄러질 수 있고, 이때 상기 중간 플레이트(46)의 개구부(48)는 상기 중간 플레이트(46)를 수용하도록 구성된 수용 구조(52)의 형태인 상기 기판(12)의 제1 표면(16)을 따라 상기 제1 영역(18)에 노출될 수 있다.
상기 중간 플레이트들(46)의 적층은 바이어스 메커니즘 또는 시스템을 가져서 상기 컬럼(50)이 온전한 상태로 유지되도록 상기 중간 플레이트들(46) 중 하나가 제거될 때 바이어스력을 인가할 수도 있다. 예를 들어, 상기 중간 플레이트들(46)의 적층은 상부 플레이트(54) 및 하부 플레이트(56)에 의해 한정되어서, 상기 최상단 중간 플레이트(46)가 제거될 때 상기 바이어스 메커니즘이 상기 중간 플레이트들의 나머지 적층을 상향으로 가압하여 다음 중간 플레이트(46)가 이제 상기 상부 플레이트(54)에 인접할 수도 있다.
대안으로, 상기 제1 표면(16)에 노출되는 상기 중간 플레이트(46)는 상기 제1 방향에 대략 수직하는 방향으로 그리고 상기 제1 방향과는 대략 반대 방향으로 미끄러져서, 상기 중간 플레이트(46)가 상기 중간 플레이트들(46)의 적층 내에 배치되지만 상기 개구부(46)가 상기 컬럼(50)과 더 이상 연통하지 않고 상기 컬럼(50)이 더 이상 온전한 상태로 되지 않을 수도 있다. 이어서, 상기 중간 플레이트들(46)의 나머지 개구부들(48)은 순차적으로 미끄러져 서로 노출될 수 있고, 또는 상기 수용 구조(52)의 제1 영역(18)에 노출될 수 있다. 단일 장치(10)를 위해 복수의 중간 플레이트(46)가 사용될 수 있으며 전술한 실시예는 다수를 고려한 구성을 예시하고 있음을 인식할 수 있다. 또한, 상기 중간 플레이트(46) 없이 상기 기판(12)과 상기 플레이트(14)만을 갖는 실시예에 대하여 본 명세서에서 설명하는 특징은 하나 이상의 중간 플레이트(46)를 갖는 실시예들에서 달성될 수도 있다.
일부 실시예들에서, 상기 기판 또는 플레이트들 중 임의의 것은 새로운 다른 기판이나 플레이트로 교체될 수도 있으며, 이때 상기 새로운 기판이나 플레이트는 그 영역들의 다른 물질 및/또는 영역들의 다른 구성을 갖는다. 예를 들어, 장치는 기판 상의 한 영역에서의 온비드(on-bead) 합성 반응 등의 고상 반응을 수행하도록 사용될 수 있다. 이 반응을 위한 시약들은 본 명세서에서 설명하는 기술들 중 임의의 것을 이용하여 하나 이상의 단계에서 첨가될 수 있다. 상기 반응이 완료된 후, 상기 플레이트는 제거되어, 상기 기판의 영역 내에서의 비드들 상에 위치하는 반응 생성물들을 분석하는 데 적합한 덕트들 및/또는 영역들을 갖는 새로운 플레이트로 교체될 수 있다. 선택 사항으로, 상기 플레이트는 분석을 수행하도록 시약들을 사전 로딩(preload)해도 된다. 다른 일 실시예에서, 상기 반응 생성물은 상기 기판의 비드들로부터 떨어져 상기 플레이트 상의 반응 영역 내로 확산될 수 있고, 이어서 상기 기판이 제거되고 향후 반응 및/또는 분석을 위해 덕트 및/또는 영역 및/또는 시약을 포함하는 새로운 기판이 추가된다.
도 6a와 도 6b에 도시한 두 개의 플레이트 실시예를 참조해 보면, 상기 제1 영역(18)의 수와 구성은 하나보다 클 수도 있으며 상기 제2 영역(22)의 수와 일치할 수도 있다. 도 6a와 도 6b는 쇄선으로 도시된 상기 기판(12) 및 복수의 제1 및 제2 영역(18, 22)과 함께 실선으로 도시된 상기 플레이트(14)를 갖는 상기 장치(10)의 일 실시예의 평면 단면도들이다. 일련의 이산(discrete) 덕트들(26)은 상기 제1 표면(16)의 일부를 따라 형성되어 있다. 상기 일련의 이산 덕트들(26)은 서로 독립적이며 연속적 유로를 독립적으로 형성하지 않는다. 상기 이산 덕트들(26)의 수는 하나 내지 하나를 초과할 수 있다. 물리적 특성은 상기 일련의 덕트들(26)의 각 덕트(26)마다 가변될 수 있으며 적용 예에 따른다.
상기 일련의 이산 덕트들(26)은 상기 복수의 제1 영역(18)으로부터 이격되며 상기 복수의 제1 영역과 연통하지 않는다. 하나 이상의 상기 이산 덕트들(26)은 입구 덕트(28)를 포함할 수 있고, 다른 하나의 이산 덕트는 출구 덕트(30)일 수 있다. 상기 입구 덕트(28) 및 상기 출구 덕트(30)는 상기 제1 표면(16) 또는 상기 제2 표면(20)을 따라 형성될 수 있고, 상기 입구 덕트(28) 및 상기 출국 덕트(30)를 동일한 표면(16, 20)을 따라 형성할 필요는 없다. 도 6a와 도 6b에 도시한 실시예에서, 상기 입구 덕트(28) 및 상기 출구 덕트(30)는 상기 제2 표면(18)을 따라서 형성되어 있다. 복수의 제1 및 제2 영역(18, 22)을 갖는 일부 실시예들에서, 입구 덕트(28)의 수는 상기 일부 실시예에 있어서 상기 제1 및 제2 영역(18, 22)의 총 수의 절반보다 작다. 다른 실시예들에서, 출구 덕트(30)의 수는 상기 제1 및 제2 영역(18, 22)의 총 수의 절반보다 작다.
도 6a에서 위치 A로 도시한 바와 같이 상기 제1 위치에 있는 경우, 상기 제1 및 제2 표면(16, 20)은 서로 고정 대향하며, 상기 복수의 제2 영역(22)은 상기 일련의 이산 덕트들(26)에 노출되어, 예를 들어, 상기 일련의 이산 덕트들(26)과 상기 복수의 제2 영역(22) 사이의 유체 연통을 가능하게 하여 제1 물질을 상기 복수의 제2 영역(22)을 따라 또는 상기 복수의 제2 영역 내에 배치한다. 본 실시예에서, 상기 제1 물질은 상기 입구 덕트(28)를 경유해서 상기 일련의 이산 덕트들(26) 및 상기 복수의 제2 영역(22)에 제공된다. 임의의 잉여 물질은 상기 출구 덕트(30)를 통해 배출된다.
일단 상기 복수의 제2 영역(22)을 따라서 또는 상기 복수의 제2 영역 내부에 물질이 형성되면, 상기 기판(12) 및/또는 상기 플레이트(14)는 도 6b에서 위치 B로 도시한 바와 같이 상기 제2 위치를 향하여 서로에 대하여 이동할 수 있다. 상기 위치 B에서는, 상기 일련의 이산 덕트들(26)과 상기 복수의 제2 영역(22) 사이의 유체 연통이 단절되며, 상기 입구 덕트(28)에 의해 제공되는 물질이 상기 복수의 제2 영역(22) 내에 또는 상기 복수의 게2 영역을 따라 추가로 배치될 수 없다. 위치 B라 칭하는 상기 제2 위치는, 사용자에 의해 정의되는 것이며, 본 실시예에서는, 각 제2 영역(22)이 각 제1 영역(18)에 노출될 때 얻게 된다. 각 제1 영역(18)에 대해 각 제2 영역(22)이 노출됨으로써, 상기 제1 물질이, 상기 제1 영역(18) 내부 또는 상기 제1 영역을 따라 배치되는 다른 임의의 물질과 연통할 수 있으며 반응할 수 있게 된다. 그리고 나서, 상기 기판(12) 및/또는 상기 플레이트(14)를 필요하다면 다른 위치로 이동시킬 수도 있다.
장치는, 시료 내로 담궈질 수 있는 기판 내 입구 덕트나 영역을 두도록 구성될 수 있다. 상기 입구 덕트나 영역은 시료를 캡쳐하도록 오목할 수 있고 또는 위킹(wicking) 재료를 함유할 수도 있다. 시료를 캡쳐하도록 설계된 입구 덕트나 영역은 환경에 노출될 수 있으며, 즉, 제1 로딩 위치에서는 대향 플레이트에 의해 덮이지 않을 수 있지만, 상기 기판과 대향 플레이트의 상대적 이동 후 제2 위치에서는 상기 대향 플레이트에 의해 덮일 수 있다.
대안적인 실시예에서, 도 7a와 도 7b에 도시한 바와 같이, 상기 제1 및 제2 영역(18, 22)은 동일한 표면을 따라서나 상기 동일한 표면 내에 형성될 수도 있다. 예를 들어, 본 실시예에서, 상기 제1 및 제2 영역(18, 22)은 상기 기판(12)의 상기 제1 표면(16)을 따라 형성된다. 본 실시예에서 덕트들(26)은 상기 플레이트(14)의 상기 제2 표면(20)을 따라 형성된다.
본 실시예에서, 상기 장치(10)는, 두 개 이상의 제2 영역(22)이 상기 덕트들(26)과 유체 연통하거나 상기 덕트들에 노출되지만 상기 제1 및 제2 영역(18, 22) 중 어느 것도 서로 노출되지 않는 도 7a의 위치 A인 제1 위치로부터 도 7b의 위치 B인 제2 위치로 이동하도록 구성된다. 상기 제2 위치에서는, 대응하는 제1 및 제2 영역(18, 22)이 상기 덕트들(26) 중 하나를 통해 서로 노출된다. 구체적으로, 상기 제1 및 제2 위치 사이의 상대적 이동에 의해, 상기 덕트들(26)이 상기 제1 영역(18)과 상기 제2 영역(22)에 대하여 각 덕트(26)가 두 개의 인접하는 제2 영역(22)에 노출되어 이들 사이의 유체 연통을 가능하게 하는 위치 A인 상기 제1 위치로부터 각 덕트(26)가 이제 하나의 제1 영역(18) 및 대응하는 하나의 제2 영역(22)에 노출되는 도 7b에 도시한 위치 B인 상기 제2 위치로 이동하게 된다. 이에 따라, 본 실시예에서 도시한 바와 같이, 상기 제1 및 제2 영역(18, 22)은 상기 덕트(26)를 통해 서로 노출될 수 있고, 상기 제1 및 제2 영역(18, 22)을 물리적으로 중첩할 필요는 없다. 그러나, 서로 노출되도록 구성된 상기 제1 및 제2 영역(18, 22)의 수와 배향은 적용 예에 따라 달라진다.
전술한 모든 실시예에서, 상기 장치(10)의 상기 기판(12)과 상기 플레이트(14) 및 임의의 중간 플레이트들(46) 사이의 상대적 이동은 방향 및 거리에 있어서 가변될 수 있다. 예를 들어, 도 4a 내지 도 4c에 도시한 이동의 단일 방향과는 달리, 도 8a 내지 도 8d에 도시한 상기 장치(10)의 실시예는 복수의 제1 및 제2 영역(18, 22)을 도시하며, 각 세트의 영역들은 매트릭스 구성으로 된 자신의 고유한 세트의 이산 덕트들(26)을 갖는다. 구체적으로, 본 실시예의 상기 장치(10)는 상기 기판(12)의 상기 제1 표면(16) 상에 복수의 제1 영역(18), 및 상기 제1 영역들(18)과 직접적으로 유체 연통하지 않는, 상기 제1 표면(16) 내에 형성된 일련의 제1 덕트들(40)을 포함한다. 상기 플레이트(14)의 상기 제2 표면(20)은 복수의 제2 영역(22) 및 상기 복수의 제2 영역(22)과 직접적으로 유체 연통하지 않고 내부에 형성된 일련의 제2 덕트들(42)을 포함한다.
도 8a에서 위치 A로서 도시한 바와 같이 상기 제1 위치에 있는 경우, 상기 제1 표면(16)은, 상기 제1 영역들(18)이 상기 제2 세트의 덕트들(42)과 유체 연통하거나 상기 제2 세트의 덕트들(42)에 노출되지만 상기 제2 영역들(22)은 상기 제1 영역들(18) 또는 상기 제1 세트의 덕트들(40)과 유체 연통하지 않거나 상기 제1 영역들 또는 상기 제1 세트의 덕트들에 노출되지 않는 배향으로 상기 제2 표면(20)에 고정 대향한다. 이 위치에서는, 상기 제1 영역들(18)은 물질로 채워질 수 있고, 또는 상기 제1 영역들(18)의 각 열이 다른 물질로 채워질 수 있다. 상기 제1 표면(16)과 상기 제2 표면(20) 사이의 제1 방향으로 도 8b에 도시한 위치 B인 상기 제2 위치로의 상대적 이동은 상기 제1 영역(18) 및 상기 제2 세트의 덕트들(42) 중 대응하는 하나의 각각을 다른 제1 영역들(18) 및 제2 세트의 덕트들(42)로부터 분리시킨다. 상기 제1 방향에 대략 수직하는 도 8c에 도시한 위치 C로의 제2 방향으로의 추가 이동에 의해, 상기 제2 영역들(22)이 상기 제1 세트의 덕트들(40)과 유체 연통하거나 상기 제1 세트의 덕트들에 노출되며, 상기 제2 영역들(22)이 다른 물질로 채워질 수 있으며, 또는 제2 영역들(22)의 각 컬럼이 다른 물질로 채워질 수 있다. 상기 제1 방향의 반대 방향으로 도 8d에 도시한 위치 D로의 추가 이동에 의해, 상기 제1 영역들(18)이 상기 제2 영역들(22)에 적어도 부분적으로 노출된다. 상기 장치(10)가 더 많은 또는 더 적은 수의 열과 컬럼을 가질 수 있고 상기 제1 표면(16)과 상기 제2 표면(20) 사이의 상대적 이동이 특정한 적용 예에 따라 가변될 수 있음을 인식할 수 있다.
전술한 바와 같이, 상기 장치(10)는, 임의의 두 개의 위치 사이에서 이동하는 경우, 상기 제1 표면(16)의 법선에 대략 수직하는 방향으로 이동한다. 이에 따라, 상기 방향은 선형, 회전형, 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 경우에는, 선형 이동 및/또는 회전형 이동의 조합을 통해 2차원 이동 (예를 들어, X-Y 이동)을 달성할 수 있다. 예를 들어, 슬라이딩 및 회전 수단을 사용하여 선형 및 회전 슬라이딩 이동에 영향을 끼칠 수 있다. 또한, 상대적 슬라이딩 이동을 생성하기 위한 이러한 수단은, 예를 들어, 당업자에게 알려져 있는, 모터, 레버, 풀리, 기어, 유압식 기계, 공압식 기계, 이들의 조합, 또는 다른 전자기계적 또는 기계적 수단으로 구성될 수 있다. 하나의 부분에 대한 다른 하나의 부분의 이동을 제어하는 방법들의 다른 예들은, 슬라이딩 가이드, 랙 및 피니언 시스템(미국 특허 등록 제7,136,688호), 회전 플레이트(미국 특허 등록 제7,003,104호), 슬라이더 조립체(미국 공개 특허 제2007/015545호 및 제2008/0058039호), 가이드 홈(미국 특허 등록 제5,805,947호 및 제5,026,113호), 압전 액추에이터(미국 공개 특허 제2005/0009582호), 볼 베어링 및 노치(미국 특허 등록 제2,541,413호) 및 드라이브 케이블(미국 특허 등록 제5,114,208호)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 이러한 특허 문헌들 및 특허 출원들의 전체 내용은 본 명세서에 참고로 원용된다.
또한, 상기 기판(12)과 상기 플레이트(14) 또는 플레이트들의 서로에 대한 이동은, 예를 들어, 통상적으로 전기 커넥터에서 단독으로 사용되거나 조합 사용되는, 노치, 리테이너, 및/또는 홀과 정합 핀의 시스템에 의해 구속될 수 있다. 또한, 상기 기판(12)과 상기 플레이트(14) 또는 플레이트들의 서로에 대한 이동은, 예를 들어, 케이스, 포스트, 홈 및 리지, 기어에 의해, 또는 회전 이동의 경우에는 중심 액슬에 의해 구속될 수 있다. 일부 실시예들에서, 상기 장치(10)는 로봇에 의해 조작되도록 구성된다.
예를 들어, 도 9a와 도 9b에 도시한 실시예에서, 상기 제1 및 제2 표면(16, 20) 사이의 상대적 이동은 사실상 회전식이다. 구체적으로, 도 9a에 도시한 상기 장치는 상기 제2 영역들(22)이 상기 일련의 덕트들(26) 및 입구 덕트(28)와 유체 연통하는 위치 A인 제1 위치로부터 이동한다. 본 실시예에서는, 출구 덕트(30)가 없을 수 있음을 인식할 수 있다. 제1 물질이 상기 제2 영역들(22) 내부 또는 상기 제2 영역들을 따라 배치되는 방식은 가변적일 수 있다. 예를 들어, 외부 펌프가 상기 제1 물질(32)을 상기 제2 영역들(22) 내부 또는 상기 제2 영역들을 따라 배치하는 데 일조하도록 라인 압력을 생성할 수 있다. 다른 방안으로, 그리고 도 9a와 도 9b의 실시예에 도시한 바와 같이, 상기 장치(10) 전체의 회전은 상기 제1 물질(22)을 상기 입구 덕트(28)로부터 상기 제2 영역들(22)로 이동시키는 데 일조하는 원심력을 생성한다.
이어서, 상기 기판(12)과 상기 플레이트(14)는 상대적 회전 이동에 의해 위치 A인 제1 위치로부터 도 9b에 도시한 위치 B인 제2 위치로 이동하게 된다. 이 위치에서, 적어도 하나의 제1 영역(18)은 적어도 하나의 제2 영역(22)에 노출된다. 상기 상대적 회전 이동은, 예를 들어, 자동화 기어 조립체(36) 또는 수동 이동에 의해 부분적으로 야기될 수 있다.
상기 장치(10)의 각 실시예의 패턴 및 형상도 가변적일 수 있으며, 적용 예에 따른다. 예를 들어, 도 10a와 도 10b에 도시한 다른 일 실시예에서, 상기 제1 영역(18)은, 상기 제1 표면(16) 내에 형성된, 물질을 유지하도록 구성된 연속식 채널(21)이다. 일련의 포스트 부재들(38)은, 도 10a의 위치 A인 상기 제1 위치에 있을 때 상기 제1 영역(18)의 연속성을 방해하지 않는 상기 제2 영역들(22)에 인접하여, 상기 제2 표면(20)을 따라 형성된다. 위치 A에 있는 경우, 상기 제1 영역(18)은 상기 제2 영역들(22)에 노출되지 않는다. 그러나, 위치 B인 상기 제2 위치로 이동하게 되면, 상기 일련의 포스트 부재들(38)은, 예를 들어, 상기 제1 영역(18)의 일부와 맞물려 이전의 연속식 채널(21)을 다른 이산된 제1 영역들(18)과 유체 연통하지 않는 복수의 이산된 제1 영역들(18)로 구분한다. 상기 이산된 제1 영역(18)들의 각각은, 도 10b에 도시한 위치 B에 있는 경우, 상기 제2 영역들(22)에 노출된다.
또한, 상기 표면들(16, 18)이 서로에 대하여 이동할 때 상기 제2 표면(18)을 따른 포스트 부재(38) 및 상기 제1 표면(16)을 따른 상기 제1 영역(18)의 조합을 사용하여 압력을 생성할 수 있다. 예를 들어, 양압은 상기 포스트 부재(38)의 방향 앞으로 생성될 수 있고, 음압은 뒤로 생성될 수도 있다. 상기 압력은, 물질을 상기 장치(10) 내에 로딩하거나 물질을 상기 장치(10)로부터 벗어나게 배치하고, 또는 상기 장치(10) 내의 물질을 이동시키고, 또는 여과를 비롯하여 후술하는 바와 같이 분리를 도입하는 데 사용될 수 있다. 이러한 이동에 의해 흐름이 생성될 수도 있다.
실시예들에서의 상기 제1 및 제2 영역(18, 22)의 형상의 변동에 더하여, 상기 각 세트의 제1 및 제2 영역(18, 22)들 사이의 상대적 노출 및 노출의 양도 가변적일 수 있으며, 적용 예에 따라 달라진다. 예를 들어, 도 11a와 도 11b에 도시한 상기 장치(10)의 실시예는 도 10b에 도시한 바와 같이 위치 B인 상기 제2 위치에 있는 경우 상기 각 세트의 제1 및 제2 영역(18, 22)들 사이의 노출의 양을 가변한다. 각 세트의 제1 및 제2 영역(18, 22)들 사이의 노출의 가변량 또는 등급량은, 예를 들어, 상기 제1 세트의 영역들(18)과 상기 제2 세트의 영역들(22)의 패턴을 구성함으로써 달성될 수 있다.
예를 들어, 상기 제1 및 제2 영역(18, 22) 상의 노출 또는 확산의 양은 다양한 방식으로 얻을 수 있다. 예를 들어, 도 11a와 도 11b에 도시한 바와 같이, 상기 제1 및 제2 영역(18, 22)은 실질적으로 정사각형이며, 상기 제1 및 제2 영역(18, 22)의 각 세트의 중첩량은 도 11b에 도시한 바와 같이 상기 제2 위치에 있는 경우 상기 제1 영역들(18)의 등급화된 대각선 패턴에 의해 가변된다. 다른 방안으로, 도 11c와 11D에 도시한 실시예에서, 노출 또는 확산의 양은 도 11d에 도시한 바와 같이 상기 제2 위치에 있는 경우 상기 제1 영역(18)에 노출되는 상기 제2 영역(22)의 입구부(34)의 형상 및/또는 직경을 가변함으로써 제어된다. 본 명세서에서 설명하는 바와 같이, 구배는 상기 장치의 영역들 사이에서의 물질들의 확산을 제어함으로써 생성될 수 있다. 본 발명의 구배 생성 방법의 각 단계에서의 확산의 정도는 상기 장치의 슬라이딩 위치에 따라 제어될 수 있다. 본 발명의 구배는, 세포-표면 상호작용, 세포들의 어레이를 사용한 고속 대량처리 탐색 등의 구배 농도에 의존하는 생물학적 현상을 연구하는 데 그리고 세포 기반 바이오센서에 있어서 유용하다. 특히, 주화성, 접촉 주성, 마이그레이션과 관련된 연구는 본 발명에 의해 달성가능한 비교적 컴팩트하고 안정적인 구배를 활용한다. 주화성 세포들은 상기 세포의 앞과 뒤 사이에서의 2%만큼 작은 농도 차에 민감할 수 있으므로, 단일 세포의 순서별 해상도(약 10 내지 100 μm, 100 μm당 2 내지 20%)를 갖는 구배가 유용할 수 있다. 본 발명은 단백질의 구배, 표면 성질, 성장 인자를 함유하는 유체 스트림, 독소, 효소, 약, 및 생물학적으로 관련된 기타 유형의 분자를 생성하는 기능을 제공한다. 또한, 주화성 또는 화학배척성을 갖는 확산가능 물질들의 구배는 생물학적 패턴 형성에 있어서 중요한 역할을 할 수 있고, 혈관 형성 및 축색돌기 경로찾기는 구배를 이용할 수 있는 프로세스들의 예들을 제공한다. 또한, 본 발명은 고등 유기체를 연구하는 데 있어서 서로 다른 물질들과 (유사한 또는 유사하지 않은) 구배들의 중첩을 제공한다. 또한, 본 발명의 톱니 구배는 생물학적 프로세스들을 조사하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 구배는, 미국 공개특허 제2004/0258571호, 미국 특허 등록 제6,705,357호, 제7,314,070호 및 제6,883,559호에 개시되어 있듯이 추가 적용 예들에 사용될 수 있으며, 이들 모두는 본 명세서에 참고로 원용된다.
상기 제1 및 제2 영역(18, 22)이 연속적 채널이 형성하여 두 개 이상의 물질을 서로 노출시키는 상기 장치(10)의 다른 실시예들도 존재한다. 예를 들어, 도 12a와 도 12b에 도시한 바와 같은 상기 장치(10)의 실시예는, 상기 제2 표면(20)을 따라 가지형으로 형성된 입구 덕트(28)를 포함한다. 또한, 다수의 일련의 제2 영역들(22)은 상기 제2 표면(20) 내에 또는 상기 제2 표면을 따라 형성된다. 그러나, 상기 다수의 일련의 제2 영역들(22) 및 상기 입구 덕트(28)는 도 12a에 도시한 바와 같은 위치 A인 상기 제1 위치에 있는 경우 서로 직접적으로 유체 연통하지 않는다. 다수의 일련의 제1 영역들(18)은 다수의 출구 덕트(30)와 함께 상기 제1 표면(16) 내부 또는 상기 제1 표면을 따라 형성되고, 상기 다수의 출구 덕트의 각각은 위치 A에 있는 경우 각 일련의 제1 영역들(18)과 정렬되지만 서로 직접적으로 유체 연통하지 않거나 노출되지 않는다.
본 실시예에서, 물질 또는 일련의 물질들은 상기 제1 영역들(18)의 각각 내에 또는 상기 제1 영역들의 각각을 따라 배치될 수 있다. 상기 제1 및 제2 표면(16, 20)이 상기 제1 위치로부터 도 12b에 도시한 바와 같은 위치 B인 상기 제2 위치로 서로에 대하여 이동하면, 각 일련의 영역들(18, 22)에 대한 제1 영역(18)과 제2 영역(22)은 중첩되고, 또는 서로 노출되어, 도 12b에 도시한 바와 같이 연속적인 일련의 제1 및 제2 영역(22, 22)을 형성하게 된다. 또한, 도 12b에 도시한 바와 같이 위치 B인 상기 제2 위치에 있는 경우, 상기 제1 영역들(18) 중 적어도 하나는 상기 입구 덕트(28)의 하나의 가지에 노출되거나 상기 입구 덕트의 하나의 브랜치와 유체 연통하게 된다. 또한, 상기 제2 영역들(22) 중 하나는 상기 출구 덕트들(30) 중 하나에 노출되거나 상기 출구 덕트들 중 하나와 유체 연통하여, 상기 입구 덕트(28)와 상기 출구 덕트(30) 사이의 연속 경로를 형성하여 물질이 상기 일련의 제1 영역들(18)에 노출될 수 있게 한다. 상기 입구 덕트(28)와 상기 출구 덕트(30)의 가지의 배향 및 수는 가변적일 수 있으며 적용 예에 따라 달라진다. 그러나, 본 실시예에서 알 수 있듯이, 복수의 물질은 상기 제1 영역들(18)의 각각 내에 또는 상기 제1 영역들의 각각을 따라 배치될 수 있으며, 위치 B인 상기 제2 위치에 있는 경우 상기 입구 덕트(28)에 의해 제공되는 물질과 반응할 수 있다.
또한, 연속적 채널들을 사용하여 다른 반응 영역들을 사전 로딩할 수 있다. 예를 들어, 도 13a와 도 13b에 도시한 바와 같은 상기 장치(10)의 다른 일 실시예에서, 상기 장치(10)는 다수의 제2 영역(22)을 물질로 채우거나 사전 로딩하도록 구성될 수 있다. 본 실시예에서, 상기 기판(12)은 제1 물질을 전달하도록 구성된 연속식 채널(44)을 갖는다. 상기 플레이트(14)의 제2 영역(22) 및 상기 기판(12)의 연속식 채널(44)은, 상기 제2 영역(22) 또는 제2 영역들(22)이 상기 연속식 채널(44)과 유체 연통하지 않거나 상기 연속적 채널에 노출되지 않는 도 13a에 도시한 위치 A인 제1 위치로부터 상기 제2 영역(22) 또는 제2 영역들(22) 중 적어도 일부가 상기 연속식 채널(44)에 노출되거나 상기 연속적 채널과 유체 연통하여 물질을 상기 제2 영역(22) 내에 채우거나 상기 제2 영역을 따라 배치하는 도 13b에 도시한 바와 같은 위치 B인 제2 위치로 이동하도록 구성된다. 이어서, 상기 기판(12) 및/또는 상기 플레이트(14)는 상기 제2 영역(22) 또는 제2 영역들(22)이 이제 상기 물질로 채워지도록 제3 위치(도시하지 않음)로 서로에 이동하도록 구성된다. 이어서, 채워진 상기 물질이 사전 로딩된 상기 플레이트(14)는 후속 용도를 위해 사용될 수 있으며, 그 중 일부를 본 명세서에서 설명한다. 상기 기판(12)은 대신에 이산된 제1 영역들(18)을 가질 수 있고 상기 연속식 채널(44)은 상기 플레이트(14) 내에 형성될 수 있음을 인식할 수 있다(동 도에는 도시하지 않음). 또한, 상기 영역들을 사전 로딩하는 것 대신에, 본 실시예에서는 상기 제2 영역(22) 내의 제2 물질을, 상기 제1 표면(16) 내의 또는 상기 제1 표면을 따라 상기 제1 물질로 채워진 연속식 채널(44)에 노출시킬 수 있고, 그 반대의 경우도 가능하다.
다른 일 실시예에서, 도 14a와 도 14b에 도시한 부분도에서는, 상기 제1 및 제2 표면(16, 20) 사이의 상대적 이동은 사실상 회전식이다. 상기 제1 및 제2 영역(18, 22)은 동일한 표면을 따라 또는 상기 동일한 표면 내에 형성될 수 있다. 본 실시예의 상기 입구 덕트(28) 및 일련의 덕트들(26)는 상기 제2 표면(20)을 따라 형성된다. 본 실시예에서, 상기 장치는, 한 세트의 두 개 이상의 제1 영역(18), 한 세트의 두 개 이상의 제2 영역(22) 등이 각각 대응하는 세트의 덕트들(26)과 유체 연통하거나 상기 대응하는 세트의 덕트들에 노출되지만 상기 제1 및 제2 영역(18, 22) 중 어느 것도 서로 노출되지 않는 도 14a에 도시한 바와 같은 위치 A인 제1 위치로부터 회전하도록 구성된다. 예를 들어, 도 14a와 도 14b에 도시한 바와 같이, 도 14a에 도시한 바와 같이 위치 A에 있는 경우, 7개의 제1 영역(18)은 일련의 방사상 접속된 덕트들(26)을 통해 서로 노출되지만 상기 제2 영역들(22) 중 어느 것에도 노출되지 않는다.
도 14b에 도시한 바와 같이 위치 B인 제2 위치에서, 이어서, 상기 제1 및 제2 표면(16, 20)은 상대적 회전 이동에 의해 위치 A인 상기 제1 위치로부터 위치 B인 상기 제2 위치로 이동하게 된다. 이 위치에서는, 적어도 하나의 제1 영역(18)이 적어도 하나의 제2 영역(22) 등에 노출된다. 위치 B에서는, 대응하는 제1 및 제2 영역(18, 22)이 일련의 나선형 접속 덕트들(26)을 통해 서로 노출된다. 예를 들어, 도 14a와 도 14b에 도시한 바와 같이, 상기 제1 및 제2 위치 사이의 상대적 이동에 의해, 상기 덕트들이 상기 제1 및 제2 영역 (18, 22) 등등에 대하여 각 덕트가 인접하는 제1 영역들(18)에 노출되어 상기 제1 영역들(18)의 열 사이의 유체 연통이 가능해지는 위치 A인 상기 제1 위치로부터 일련의 나선형 접속 덕트들(26)을 통해 각 덕트가 이제 하나의 제1 영역(18), 대응하는 하나의 제2 영역(22) 등에 노출되는 위치 B로 이동하게 된다. 이어서, 상기 제1 및 제2 표면(16, 20)은 위치 A로부터 위치 B로의 이동과 동일한 방향으로의 상대적 회전 이동에 의해 위치 B인 상기 제2 위치로부터 위치 C인 제3 위치(도 14a 또는 도 14b에는 도시하지 않음)로 이동할 수 있다. 위치 A에서와 같은 위치에서는, 두 개 이상의 제1 영역(18), 두 개 이상의 제2 영역(22) 등이 상기 덕트들(26)과 유체 연통하거나 상기 덕트들에 노출되지만 상기 제1 및 제2 영역(18, 22) 중 어느 것도 서로 노출되지 않는다. 위치 C인 이러한 제3 위치에서는, 두 개 이상의 제1 영역(18)이, 방사상으로 접속된 일련의 덕트들(26)을 통해 서로 노출되지만 상기 제2 영역들(22) 등에는 노출되지 않는다.
이어서, 상기 제1 및 제2 표면(16, 20)은, 추가 상대적 회전 이동에 의해 위치 C인 상기 제3 위치로부터 위치 D인 제4 위치(도 14a 또는 도 14b에는 도시하지 않음)로 이동할 수 있다. 위치 B에서와 같은 이러한 위치에서는, 적어도 하나의 제1 영역(18)이, 일련의 나선형 덕트들 (26)을 통해 적어도 하나의 제2 영역(22) 등등에 노출된다.
*각 순차적 슬라이딩 위치에서, 입구 덕트(28)로부터 시작되는 각 덕트는 인접하는 다음의 제1 또는 제2 영역(18, 22) 등으로 미끄러진다. 각 순차적 슬라이딩 위치에 대하여, 상기 덕트들(26)은 상기 제1 영역들(18)의 행들을 상기 제2 영역들(22)의 열들에 접속하는 것과 상기 제1 영역(18)을 상기 제2 영역(22)에 접속하는 것을 일련의 나선형 덕트들(26)을 통해 교번한다.
본 발명의 일부 실시예들에서, 상기 영역들은 그들이 노출되어 있는 물질들의 양을 유지한다. 이는 영역의 표면의 기능화, 영역 상의 재료의 퇴적, (펩타이드 또는 DNA 합성) 폴리머화 반응에서의 영역으로의 모노머 부착 등에 의해 행해질 수 있다. 이 장치를 조립하기 전에, 상기 영역들에는 포획된 비드 또는 겔이 로딩될 수 있으며, 이에 따라 어떠한 흡수이든지, 이러한 비드나 겔과의 흡수 또는 반응도 포획된다. 이 장치는 또한 출구 덕트 또는 기체 투과가능 요소인 다른 덕트를 포함한다. 위 설명은 하나의 기판과 하나의 플레이트를 갖는 장치에 관한 것이지만, 다른 실시예들은 도 5a와 도 5b에 대하서 전술한 바와 같이 복수의 중간 플레이트를 포함해도 된다.
이 장치를 위한 잠재적 용도는, 효소 활성, 세포 생존성, 세포 부착성, 세포 결합 등의 분석 수행, 촉매 활성이나 선택성에 대한 선별, (기체 흡수 또는 독소 화합물의 포획 등의) 저장 능력이나 격리에 대한 선별, 및 전기적, 자기적, 광학적 성질 등의 다양한 성질의 테스트를 포함한다.
여기에서 설명하는 발명은 또한 방사성 동위원소들의 합성을 위해 사용될 수 있다. 방사성 동위원소들을 만들기 위한 통상적인 방법들은 미국특허번호 제7,235,216호, 제6,567,492호 및 제5,169,942호에 개시되어 있으며, 이들 모두는 본 명세서에 참고로 원용된다. 이러한 다단계 방법들은 상기 장치의 각각의 후속 슬라이딩 위치에서 조건들을 제어함으로써 수행될 수 있다.
전술한 바와 같이 본 발명의 상기 장치(10) 및 상기 기질을 형성하는 데 사용되는 재료는, 상기 장치(10)의 적절한 기능에 바람직한 물리적 특성과 화학적 특성에 관하여 선택된다. 미세 유체의 적용 예에서, 상기 제1 및 제2 표면(16, 20), 상기 제1 및 제2 영역(18, 22) 및 상기 덕트들(26, 28, 30)은 통상적으로 고화질(또는 고 "해상도") 특징, 예를 들어, 밀리미터, 마이크로미터 또는 서브마이크로미터 치수인, 미세 채널, 챔버, 혼합 특징 등의 형성을 가능하게 하는 재료로 제조된다. 즉, 상기 재료는, 소망하는 소형 표면 특징을 갖도록, 예를 들어, 건식 에칭, 습식 에칭, 레이저 에칭, 레이저 어블레이션, 몰딩, 엠보싱 등을 이용하여 미세 제조될 수 있어야 하며, 바람직하게는, 예를 들어, 상기 기질 내에, 상에 및/또는 통해 특징을 형성하는 방식으로 상기 기질가 미세 제조될 수 있어야 한다. 또한, 기질의 표면 상에 재료를 추가함으로써 상기 표면 상에 미세 구조를 형성할 수 있고, 예를 들어, 광 촬상가능 폴리이미드를 사용하여 폴리머 채널을 유리 기질의 표면 상에 형성할 수 있다. 또한, 사용되는 모든 장치 재료들은 바람직하게는 유체를 도입하도록 사용될 때 접하게 되는 임의의 물질에 대하여 화학적으로 비활성이며 물리적으로 안정적이다(예를 들어, pH, 전계 등이 있음). 본 발명의 장치를 형성하기 위한 적절한 재료로는, 폴리머 재료, (알루미늄 산화물, 실리콘 산화물, 지르코늄 산화물 등을 포함한) 세라믹, (실리콘, 갈륨 비화물 등을 포함한) 반도체, 유리, 금속, 복합체, 및 이들의 라미네이트를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
슬립칩의 유리 에칭 제조:
상기 장치(10)는 표준 포토리소그래피 및 습식 화학적 에칭 기술들을 이용하여 형성된 상보적 패턴을 갖는 두 개의 유리 슬라이드로 구성될 수 있다 (예를 들어, He, 등, Sens Actuators B Chem. 2008 February 22; 129(2): 811-817 참조). Telic Company (Valencia, CA)로부터 크롬과 포토레지스트가 피복된 소다 석회의 플레이트를 획득하였다. Karl Suss, MJBB3 컨택트 얼라이너를 사용하여 포토레지스트가 피복된 유리 플레이트를 마이크로덕트 및 영역의 설계를 포함한 포토마스크와 정렬하였다. 상기 포토마스크는 상기 마스크를 상기 플레이트와 정렬하기 위한 마크를 포함할 수도 있다. 이어서, 1분 동안 상기 유리 플레이트와 상기 포토마스크를 UV 광에 노출시켰다. 상기 포토마스크를 제거하고, 상기 유리 플레이트를 0.1 mol/L NaOH 용액에 2분 동안 침지하여 현상하였다. 상기 포토레지스트 중 상기 UV 광에 노출된 영역들만이 상기 용액에서 용해되었다. 크롬 에칭제(0..365 M HClO4 / (NH4)2Ce(NO3)6 용액)를 사용하여, 노출된 하지 크롬층을 제거하였다. 상기 플레이트를 밀리포어 수(Millipore water)로 세척하고 질소 기체로 건조시키고, 상기 유리 플레이트의 후면을 PVC 밀봉 테이프 (McMaster-Carr)로 붙여 유리의 후면을 보호하였다. 이어서, 테이프가 부착된 유리 플레이트를, 40°C에서 소다 석회 유리를 에칭하도록 ..75 mol/L HF/NH4F/HNO3로 조성된 완충 에칭액이 있는 플라스틱 용기 내에 조심스럽게 침지하였다. 에칭 온도에 의해 에칭 속도를 제어하였고, 에칭 시간에 의해 영역 및 덕트 깊이를 제어하였다. 에칭 후에, 상기 테이프를 상기 플레이트에서 제거하였다. 이어서, 상기 플레이트를 밀리포어 수로 철저히 세척하고 질소 기체로 건조시켰다. 남아 있는 포토레지스트를 에탄올로 세척해서 제거하고, 상기 플레이트를 크롬 에칭제 내에 침지함으로써, 남아 있는 크롬 피복을 제거하였다. 트리데카플루오로-1,1,2,2-테트라히드로옥틸-1-트리클로로실란(United Chemical Technologies, Inc.)을 이용한 실린화에 의해 상기 유리 플레이트의 표면이 소수성으로 되었다. 0.76 mm 직경의 다이아몬드 드릴 비트로 액세스 홀(access hole)을 천공하였다.
상기 슬립칩의 두 개 이상의 영역 사이에 유체 연통을 설치하는 한 방법은, 나노미터 범위의 적어도 하나의 단면 치수를 갖는 채널, 즉, 상기 슬립칩에 임베딩될 수 있는 나노채널을 사용하는 단계를 포함한다. 상기 나노채널은 다층 슬립칩 내에 임베딩될 수 있다. 상기 나노채널의 높이는 나노미터 스케일 해상도로 가변될 수 있으며, 예를 들어, 이는 웰들 사이의 마이크로미터 크기의 세포들의 전달을 방지하지만, 단백질, 소낭, 미셀, 유전자 물질, 소분자, 이온, 및 세포 배양 배지 및 분비물을 비롯한 기타 분자와 거대 분자의 전달을 가능하게 한다. 웰들 사이의 이송 역학을 제어하기 위해 상기 나노채널의 폭, 길이 및 비틀림도 조작될 수 있다. 상기 나노채널은, Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes, Juan E. Keymer, Peter Galajda, Cecilia Muldoon, Sungsu Park, 및 Robert H. Austin, PNAS November 14, 2006 vol. 103 no. 46 17290-17295에서 설명하는 바와 같이, 또는 제1 유리에서 나노채널을 에칭하여 제2 유리와 접하게 한 후 선택 사항으로 결합 단계를 수행함으로써, 제조될 수 있다. 적용 예로는, 여과, 세포와 입자의 캡쳐, 장기간 세포 배양, 세포, 세포 군체 및 조직 간의 상호 작용의 제어가 있다.
PDMS/유리형의 장치(10)는, 소프트 리소그래피를 이용하여 제조될 수 있으며 (McDonald, J. C.; Whitesides, G. M. Accounts Chem. Res. 2002, 35, 491-499.), 전술한 바(Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 2508-2511)와 마찬가지이다. 사용된 장치는, 두 개의 층을 포함하고, 각 층은 덕트와 영역이 있는 PDMS의 얇은 멤브레인, 및 75 mm x 25 mm인 1 mm 두께의 현미경 유리 슬라이드로 구성되었다. 상기 장치를 제조하기 위해, 상기 유리 슬라이드를 세척하고 산소 플라즈마 처리를 받게 하였다. Dow-Corning Sylgard 184 A 및 B 성분들을 의 질량비로 혼합하고, 슬립칩의 몰드 상에 흘렸다. 경화 전에 유리 슬라이드를 PDMS 상에 위치시켰다. 철 비드가 있는 유리 하면을 상기 유리 슬라이드 상에 놓아 상기 PDMS 멤브레인을 더욱 얇게 하였다. 상기 장치를 7시간 동안 실온에서 미리 경화한 후, 60 °C 오븐으로 옮겨 밤새 경화하였다. 경화 후, 상기 장치에서 상기 몰드를 박리하고 트리데카플루오로-1,1,2,2-테트라히드로옥틸-1-1트리클로로실란으로 실란화하였다. 액세스 홀들을 0.76mm 직경의 다이아몬드 드릴 비트로 천공하였다.
본 발명에서 사용하는 데 적절한 폴리머 재료들은 유기 폴리머일 수 있다. 이러한 폴리머는, 자연발생 또는 합성의 것이고, 가교결합되거나 비가교결합된, 호모폴리머 또는 코폴리머일 수 있다. 구체적인 관심 폴리머로는, 폴리이미드, 폴리카르보네이트, 폴리에스테르, 폴리아미드, 폴리에테르, 폴리우레탄, 폴리플루오르화 탄소, 폴리스티렌, 폴리(아클리로니트릴-부타디엔-스티렌(ABS), 폴리메틸 메타아클레이트 등의 아크릴레이트 및 아크릴산 폴리머, 및 기타 치환 및 미치환 폴리올레핀, 및 이들의 코폴리머를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일반적으로, 상기 기질 또는 상기 장치(10)의 일부 중 적어도 하나는 마이크로장치를 사용하여 생물학적 유체를 이송하는 경우 생물부착 내성 폴리머를 포함한다. 폴리이미드는 구체적으로 주목하고 있는 것으로서, 여러 가지 면에서 매우 바람직한 기질로 증명되었다. 폴리이미드는, 예를 들어, 상표명 Kapton?, (DuPont, Wilmington, Del.) 및 Upilex? (Ube Industries, Ltd., Japan)에 의해 상업적으로 이용가능하다. 폴리에테르에테르케톤(PEEK)도 바람직한 생물부착 내성을 나타낸다. 본 발명에서 사용하는 데 적절한 폴리머 재료는 폴리디메틸실록산 등의 실리콘 폴리머, 및 에폭시 폴리머를 포함한다.
또한, 본 발명의 장치(10)는 "복합체(composite)", 즉, 서로 다른 재료들로 이루어진 조성물로 제조될 수 있다. 상기 복합체는 블록 복합체일 수 있으며, 예를 들어, A-B-A 블록 복합체, A-B-C 블록 복합체 등일 수 있다. 다른 방안으로, 상기 복합체는, 상(phase)이 개별적으로 서로 다른 재료들의 이종 조합, 또는 재료들이 서로 다른 동종 조합일 수 있다. 상기 “복합체”라는 용어는, 본 명세서에서 사용되는 경우, “라미네이트” 복합체를 포함하도록 사용된다. 상기 “라미네이트”는 동일하거나 서로 다른 재료의 서로 다른 여러 결합층들로 형성된 복합체 재료를 가리킨다. 다른 바람직한 복합체 기질은, 폴리머 라미네이트, 폴리머 금속 라미네이트, 예를 들어, 구리로 피복된 폴리머, 세라믹 인 금속(ceramic-in-metal) 또는 폴리머 인 금속(polymer-in-metal) 복합체를 포함한다. 한 가지 바람직한 복합체 재료는, DuPont (Wilmington, Del.)에 의해 이용가능한 KJ?로 알려져 있는 폴리이미드로 형성된 열 접착제의 제2 박층과 함께 공압출된 Kapton?등의 폴리이미드의 제1 층으로 형성된 폴리이미드 라미네이트이다.
상기 장치는, 압축 성형, 사출 성형 또는 진공 성형을 단독으로 또는 조합하는 기술들을 이용하여 제조될 수 있다. 성형 후 충분히 소수성있는 재료를 직접 사용할 수 있다. 친수성 재료를 사용할 수도 있지만, 추가 표면 변형을 필요로 할 수 있다. 또한, 상기 장치는, 플라스틱, 금속 및 유리를 포함한 다양한 재료들로부터 CNC 기계 가공을 사용하여 직접 밀링될 수 있지만, 이러한 재료들의 예로 한정되지는 않는다. 미세 제조 기술들을 이용하여 서브마이크로미터 크기의 최소 배선폭을 갖는 상기 장치를 제조할 수 있다. 이러한 기술들은, 실리콘의 딥 반응 이온 에칭, 실리콘의 KOH 에칭, 유리의 HF 에칭을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 또한, 기계 가공된 네거티브 이미지 스탬프를 이용하여 폴리디메틸실록산 장치를 제조할 수 있다. 강성 기질 외에도, 형상이나 치수가 변경될 수 있는 유연성있으며, 신장가능하며, 압축가능한 다른 유형의 기질을 상기 슬립칩의 일부 실시예들을 위한 재료로서 사용할 수 있다. 일부 실시예들에서, 이러한 성질들은, 예를 들어, 슬라이딩을 제어하거나 유도하도록 사용될 수 있다.
일부의 경우에, 상기 기판(12), 상기 플레이트(14) 및 상기 기질이 동일한 재료로 형성될 수 있다. 다른 방안으로, 서로 다른 재료들을 사용해도 된다. 예를 들어, 일부 실시예들에서, 상기 기판(12)과 상기 플레이트(14)는 세라믹 재료로 이루어질 수 있고 상기 기질은 폴리머 재료로 이루어질 수 있다.
상기 장치는 어느 표면(16, 20) 상에도 전기적으로 전도성있는 재료를 함유할 수 있다. 상기 재료는 전극을 형성하도록 임의의 형상의 적어도 하나의 영역 또는 패치로 형성될 수 있다. 적어도 하나의 전극은 하나의 표면(16) 상에 위치할 수 있고, 제1 위치에서, 상기 적어도 하나의 전극은 반대측 표면(20) 상의 적어도 하나의 제1 영역에 노출되지 않지만, 상기 장치의 두 부분(12, 14)이 서로에 대하여 제2 위치로 이동하면, 상기 적어도 하나의 전극이 상기 적어도 하나의 영역(18)과 중첩된다. 상기 적어도 하나의 전극은 외부 회로에 전기적으로 접속될 수 있다. 상기 적어도 하나의 전극을 사용하여 검출 및/또는 합성을 위한 전기화학 반응을 수행할 수 있다. 하나의 영역 또는 유체 연통하는 복수의 영역 또는 유체 연통하는 영역들과 덕트들의 조합에서의 물질에 노출되는 적어도 두 개의 전극에 전압이 인가되면, 그 결과 시스템을 이용하여 전기 영동 분리 및/또는 전기 화학 반응 및/또는 이송을 수행할 수 있다. 선택 사항으로, 적어도 하나의 덕트 및/또는 적어도 하나의 영역은 상기 적어도 하나의 전극과 동일한 표면 상에 존재할 수 있고 위치할 수 있어서, 제1 위치에서는, 상기 적어도 하나의 덕트와 상기 적어도 하나의 전극 중 어느 것도 반대측 표면 상의 영역(18)에 노출되지 않지만, 상기 장치의 두 부분(12, 14)이 서로에 대하여 제2 위치로 이동하면, 상기 적어도 하나의 덕트 및/또는 상기 적어도 하나의 영역 및 상기 적어도 하나의 전극은 상기 적어도 하나의 영역(18)과 중첩된다.
본 발명의 여러 실시예들은, 물질이 적어도 하나의 덕트 및/또는 영역을 통해 상기 덕트 및/또는 영역 내로 및/또는 상기 덕트 및/또는 영역을 가로질러 이동할 것을 필요로 한다. 예를 들어, 물질의 이동은, 면역검정, 생성물 또는 부산물의 제거, 시약의 도입, 또는 희석물의 세척 단계들을 위해 이용될 수 있다.
물질의 로딩은 본 명세서에서 설명하는 바와 같이 다수의 방법에 의해 수행될 수 있다. 로딩은, 예를 들어, 상기 물질이 출구에 도달할 때 흐름 저항을 증가시키도록 상기 출구를 설계함으로써, 상기 장치의 덕트와 영역을 채우도록 수행될 수 있다. 이러한 방안은, 선택 사항으로 상기 물질로부터 검체(analyte)를 캡쳐하는 동안, 체적이 제한된 시료에 있어서 또는 상기 출구를 통해 과도한 체적을 흐르게 하는 데 있어서 유용하다. 검체는 본질적으로 마이크로규모 시스템을 통해 흐를 수 있는 임의의 이산 재료일 수 있다. 검체 캡쳐는, 예를 들어, 상기 장치의 영역들에, 상기 영역들에 포획된 캡쳐 요소들(자기력을 통해 또는 기하학에 의해 또는 비드와 덕트의 상대적 크기 또는 멤브레인을 이용하여 상기 영역 내에 유지되는 입자, 비드 또는 겔 등)을 사전 로딩함으로써, 달성될 수 있으며, 이에 따라 어떠한 흡수이든지, 이러한 비드나 겔과의 흡수 또는 반응도 포획된다. 이어서, 이러한 영역들은 노출되어 있는 상기 물질들의 양 또는 성분 또는 검체를 유지한다. 이는, 또한, 한 영역의 표면의 기능화, 한 영역 상의 재료 퇴적, (펩타이드 또는 DNA 합성 등의) 폴리머화 반응에서의 모노머를 한 영역에 부착함으로써, 행해질 수 있다.
요소를 캡쳐하는 다른 예는, 항체, 친화성-단백질, 앱타머, 비드, 입자 및 생물학적 세포를 포함한다. 비드로는, 예를 들어, 폴리머 비드, 실리카 비드, 세라믹 비드, 클레이 비드, 유리 비드, 자기 비드, 금속 비드, 무기 비드 및 유기 비드를 사용할 수 있다. 상기 비드 또는 입자는, 본질적으로 임의의 형상, 예를 들어, 구형, 나선형, 불규칙형, 회전 타원체, 막대형, 원뿔형, 디스크형, 큐빅, 다면체, 또는 이들의 조합을 가질 수 있다. 캡쳐 요소들은, 선택 사항으로, 시약, 친화성 매트릭스 재료 등에 결합되며, 예를 들어, 핵산 합성 시약, 펩타이드 합성 시약, 폴리머 합성 시약, 핵산, 뉴클레오티드, 뉴클레오베이스, 뉴클레오시드, 펩타이드, 아미노산, 모노머, 세포, 생물학적 시료, 합성 분자, 또는 이들의 조합에 결합된다. 캡쳐 요소들은, 선택 사항으로, 상기 장치 내에서, 저 농도에서 시료를 캡쳐하도록 블랭크 입자, 더미 입자, 캘리브레이션 입자, 시료 입자, 시약 입자, 테스트 입자, 분자 캡쳐 입자 등으로서 기능하는 것을 포함한 많은 용도를 갖는다. 또한, 상기 캡쳐 요소들은 입자 유지 요소를 제공하도록 사용될 수 있다. 캡쳐 요소들은 선택된 덕트 또는 멤브레인(또는 다른 마이크로규모의 요소)을 통과하거나 통과하지 않는 크기를 갖는다. 이에 따라, 입자 또는 비드의 크기는 적용 예에 따른다.
물질을 도입하여 대부분의 반응 영역과 덕트를 채울 수 있다. 채우는 것을 더 계속하여 영역과 덕트의 체적보다 큰 과도한 시료를 제공할 수 있다. 영역과 덕트의 체적보다 큰 물질의 체적을 도입함으로써, 캡쳐물 내에서 캡쳐될 수 있는 검체량을 증가시킨다. 물질의 도입 후 세척 유체를 도입하여 상기 캡쳐 요소들과 상기 캡쳐 요소들에 결합되어 있는 검체들을 세척할 수 있다. 후속하는 추가 슬라이딩을 수행하여 검체들의 반응 및 분석을 수행할 수 있다.
전술한 방안은, 검체의 농도가 낮은 시료, 예를 들어, 희귀한 핵산이나 단백질, 유전적 또는 전염성 질병, 환경적 오염물 등의 마커 및 바이오마커를 분석할 때 유익하다 (예를 들어, 본 명세서에서 참고로 원용되는 USSN 10/823,503 참조). 다른 예는, 태아기 진단을 위해 모체 혈액 내의 태아 세포 또는 순환 암세포 등의 희귀한 세포들의 분석을 포함한다. 이러한 방안은, 혈액, 가래, 뼈, 골수 흡인물, 및 오줌 및 척수액 등의 기타 신체 내 유체의 미생물 균체를 캡쳐하고 추가 분석함으로써, 감염의 급속 조기 진단에 유익할 수 있다. 확률론적 한정(stochastic confinement)에 있어서 비드와 세포 모두를 분석하는 것은 유익할 수 있다 (예를 들어, 본 명세서에 참고로 원용되는 PCT/US08/71374 참조).
일부 실시예들에서, 상기 장치(10)는, 전배양 없이 복합적인 생물학적 매트릭스를 포함한 시료의 급속 검출 및 박테리아의 약 민감성 선별에 사용될 수 있다. 박테리아의 농도를 검출가능한 정도로 증가시키도록 시료의 배양에 의존하는 종래의 박테리아 배양 및 검출 방법들과는 달리, 본 발명의 방법은 개별적인 박테리아를 나노리터 체적의 영역들 내로 한정하도록 사용될 수 있다. 단세포들이 작은 체적의 영역들 내로 한정되어 영역당 하나의 박테리아보다 적게 로딩이 이루어지면, 검출 시간은 영역 체적에 비례한다. 한정은, 세포 밀도를 증가시키고, 분리된 분자들이 세포 주위에 축적되게 할 수 있게 하여, 전배향 단계를 제거하며 박테리아를 검출하는 데 요구되는 시간을 줄인다. 이 접근법을 '확률론적 한정(stochastic confinement)'이라 칭할 수 있다. 상기 장치는, 예를 들어, 단일 실험에서 많은 항생물질들에 대한 메티실린내성황색포도상구균 등의 박테리아의 내성기록(antibiogram) - 항생물질 민감도의 차트 -를 판정하고 이러한 스트레인에 저항하는 약의 최소 증식억제 농도(MIC)를 측정하는 데 사용될 수 있다. 또한, 상기 장치는 인간 혈장의 시료들의 황색포도상구균의 민감성 균주와 저항성 균주를 구별하는 데 사용될 수 있다. 또한, 상기 장치는 박테리아를 함유하는 단일 시료에 대하여 다수의 테스트를 동시에 수행하게 할 수 있다. 상기 장치는, 박테리아 감염에 대한 빠르면서 효과적인 환자 맞춤형 처리 방법을 제공하며, 줄어든 시간척도로 박테리아 시료의 다수의 기능 테스트를 필요로 하는 다양한 적용 예들로 확장될 수 있다.
확률론적 한정은 다른 시스템들에서 사용되어 왔다. 예를 들어, 다음의 문헌을 참조할 수 있다. 2008년 8월 공개된 미국 공개특허 제60/962,426호의, “Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics”, ., ., ., . Lab on a chip 8(8):1265, M. Y. He, J. S. Edgar, G. D. M. Jeffries, R. M. Lorenz, J. P. Shelby and D. T. Chiu, Anal. Chem., 2005, 77, 1539-1544; Y. Marcy, T. Ishoey, R. S. Lasken, T. B. Stockwell, B. P. Walenz, A. L. Halpern, K. Y. Beeson, S. M. D. Goldberg and S. R. Quake, PLoS Genet., 2007, 3, 1702-1708; A. Huebner, M. Srisa- Art, D. Holt, C. Abell, F. Hollfelder, A. J. Demello and J. B. Edel, Chem. Commun., 2007, 1218-1220; S. Takeuchi, W. R. DiLuzio, D. B. Weibel and G. M. Whitesides, Nano Lett., 2005, 5, 1819-1823; P. Boccazzi, A. Zanzotto, N. Szita, S. Bhattacharya, K. F. Jensen and A. J. Sinskey, App. Microbio. Biotech., 2005, 68, 518-532; V. V. Abhyankar and D. J. Beebe, Anal. Chem., 2007, 79, 4066-4073. 유사한 기술들은 단일 분자 및 단일 효소 연구를 위해 사용되어 왔으며 (H. H. Gorris, D. M. Rissin and D. R. Walt, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2007, 104, 17680-17685; A. Aharoni, G. Amitai, K. Bernath, S. Magdassi and D. S. Tawfik, Chem. Biol., 2005, 12, 1281-1289; O. J. Miller, K. Bernath, J. J. Agresti, G. Amitai, B. T. Kelly, E. Mastrobattista, V. Taly, S. Magdassi, D. S. Tawfik and A. D. Griffiths, Nat. Methods, 2006, 3, 561-570; J. Huang and S. L. Schreiber, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1997, 94, 13396-13401; D. T. Chiu, C. F. Wilson, F. Ryttsen, A. Stromberg, C. Farre, A. Karlsson, S. Nordholm, A. Gaggar, B. P. Modi, A. Moscho, R. A. Garza-Lopez, O. Orwar and R. N. Zare, Science, 1999, 283, 1892-1895; J. Yu, J. Xiao, X. J. Ren, K. Q. Lao and X. S. Xie, Science, 2006, 311, 1600-1603), 이들 모두는 본 명세서에 참고로 원용된다. 또한, 상기 장치는, 급속 항생물질 민감도 조사에 특히 유용한, 시료 실험에서 단일 박테리아 시료로부터 박테리아 기능의 다양한 분석의 동시 수행을 가능하게 한다. 종래에는, 민감도 조사를 위해 겔 미적들을 사용해 왔다. (Y. Akselband, C. Cabral, D. S. Shapiro and P. McGrath, J. Microbiol. Methods, 2005, 62, 181-197; C. Ryan, B. T. Nguyen and S. J. Sullivan, J. Clin. Microbiol., 1995, 33, 1720-1726 참조.)
상기 장치는 유기체를 검출하는 데 사용될 수 있다. 상기 “유기체”라는 용어는, 박테리아, 이스트, 균류, 바이러스, 원생 생물(원생 동물, 미세 조류), 고세균, 진핵 생물을 포함한, 임의의 유기체나 미세 유기체를 가리킨다. 상기 “유기체”라는 용어는, 본 발명의 방법들에 의해 검출되고 식별될 수 있는 핵산을 포함한 생체 및 바이러스를 가리킨다. 유기체는, 박테리아, 고세균, 원핵 생물, 진핵 생물, 바이러스, 원생 동물, 마이코플라즈마, 균류, 선충을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 다른 유기체들은 다른 균주, 다른 변종, 다른 종, 다른 속, 다른 군, 다른 목, 다른 강, 족, 및/또는 다른 계일 수 있다. 유기체들은, 수성 환경으로부터의 미립자들에 부착된, 토양 침출액, 해양 퇴적물, 담수 퇴적물, 온천, 붕빙(ice shelves), 외계 시료, 바위 틈, 구름을 포함한 환경적 근원들로부터 격리될 수 있고, 다세포 유기체들과의 공생 관계에 관련될 수 있다. 이러한 유기체들의 예들은, 자연원으로부터 알려져 있지 않은/특징화되지 않은 종 및 스트렙토미세스 종을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
유기체는 유전적으로 조작된 유기체를 포함하였다. 유기체의 추가 예는, 에어로모나스 하이드로필라 등의 박테리아 병원균 및 기타 종들(spp.)을 포함하며, 예를 들어, 탄저균, 세레우스균, 클로스트리듐의 보툴리누스균 신경독 생성 종, 소유산균, 말타열균, 브루셀라균, 비저균(Burkholderia mallei; 이전에는Pseudomonas mallei), 유비저균(Burkholderia pseudomallei; 이전에는 Pseudomonas pseudomallei), 캄필로박터 제주니, 앵무병 클라미디아, 클로스트리듐 보툴리늄, 클로스트리듐 페르프린젠스, 콕시디오이데스 임미티스, 콕시디오이데스 포사다시, 카우드리아 루미난튬(심수), 콕시엘라 부르네티, 장관독생산성(ETEC) 대장균인 대장균, 장 병원군(EPEC), 대장균-O157:H7 장출혈성(EHEC), 장관조직침입성 대장균(EIEC) 등의 장병원성 대장균//군(EEC 군), 에를리키아 차펜시스 등의 에를리키아 spp, 야토병균, 레지오넬라 뉴모필리아, 리베로박터 아프리카누스, 리베로박터 아시아티쿠스, 리스테리아 모노사이토제니스, 클렙시엘라, 엔테로박터, 프로테우스, 사이트로박터, 에어로박터, 프로비덴시아 및 세라티아 등의 다양한 장균, 소결핵균, 결핵균, 마이코플라즈마 카프리컬럼, 마이코플라즈마 마이코이데스 s네 마이코데스, 페레노스클레로스포라 필리피네시스, 파코프소라 파치리지(Phakopsora pachyrhizi), 플레시오모나스 시겔로이데스, 랄스토니아 솔라나시아룸 레이스 3, 생물변이형 2, 발진티푸스 리케치아, 로키산홍반열 리케치아, 살모넬라 spp, 실레로프토라 레이시에 바지제아(Schlerophthora rayssiae varzeae), 시겔라 spp, 황색포도상구균, 연쇄구균, 신치트륨 엔도바이오티쿰, 비브리오 콜레라 넌-O1, 비보리오 콜레라 O1, 장염 비브리오균 및 기타 비브리오, 비브리오 패혈증, 산토모나스 오리자, 자이렐라 파스티디오사(시트러스 얼룩덜룩한 위황병 스트레인), 여시니아 엔테로콜리티카 및 여시니아 가성결핵, 여시니아 페스트가 있다. 유기체의 추가 예로는 다음과 같은 바이러스들이 있다: 즉, 아프리카 말병 바이러스, 아프리카 돼지 열병 바이러스, 아까바네 바이러스, 조류 독감 바이러스(고 발병균), 반자 바이러스, 청설 바이러스(외래), 낙타 두 바이러스, 세르코피테신 헤르페스 바리어스 1, 치쿤구니야 바이러스, 클래시컬 돼지 열병 바이러스, 코로나 바이러스(SARS), 크림 반도-콩고 출혈 열병 바이러스, 뎅기 바이러스, 덕비(Dugbe) 바이러스, 에볼라 바이러스, 동부형마 뇌막염 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 머리 밸리 뇌염 바이러스, 베네스웰라 마뇌염 바이러스 등의 뇌염 바이러스, 말 모르빌리 바이러스, 플렉설 바이러스, 구제역 바이러스, 저미스턴 바이러스, 산양 두 바이러스, 한탄 또는 기타 한타 바이러스, 헨드라 바이러스, 이식쿨 바이러스, 코탱고 바이러스, 라사 열병 바이러스, 조약병 바이러스, 괴피병 바이러스, 림프구성 맥낙 뇌막염 바이러스, 악성 카타르 열병 바이러스(외래), 마르부르그 바이러스, 마야로 바이러스, 맨앵글 바이러스, 원두 바이러스, 무캄보 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스(WND), 니파 바이러스, 노르워크 바이러스 군, 오로퓨스 바이러스, 가성우역 바이러스, 피리 바이러스, 자두 두 포티바이러스, 폴리오 바이러스, 감자 바이러스, 포와산 바이러스, 리프트 밸리열 바이러스, 우역 바이러스, 로타 바이러스, 셈리키 삼림 열 바이러스, 양두 바이러스, 플렉설, 구아나리토, 쥬닌, 마츄포 및 사비아 등의 남아메리카 출혈 열병 바이러스, 스폰드웨니(Spondweni) 바이러스, 돼지 수포 병 바이러스, 중부 유럽 진드기 뇌염, 극동 진드기 뇌염 러시아 봄여름 뇌염, 키야사나 삼림 병 및 옴스크 출혈 열병 등의 진드기 뇌염 콤플렉스(flavi) 바이러스, 대마마 바이러스(천연두 바이러스), 소마마 바이러스(알라스트림), 수포성 구내염 바이러스(외래), 베셀브론(Wesselbron) 바이러스, 서부 나일강 바이러스, 황열병 바이러스, 및 쥬닌, 마츄포, 사비아, 플렉설 및 구아나리토 등의 남아메리카 출혈 열병 바이러스가 있다.
유기체의 추가 예로는, 아칸트아메바 및 기타 독립 생활 아메바 등의 기생 원생 동물 및 벌레, 아니사키스 sp 및 기타 관련된 벌레, 회충 및 편충, 크립토스포르디움 파르범(Cryptosporidium parvum), 원포자충, 열두조충 spp, 이질아메바, 유스트롱리데스(Eustrongylides) sp, 람블편모충, 나노피에투스 spp, 시스토소마 spp, 톡소플라즈마 곤디, 필라리알 선충 및 트리치넬라가 있다. 검체의 추가 예로는, 식물 꽃가루 및 밀 글루텐 등의 알레르겐이 있다.
유기체의 추가 예로는, 아스페르질루스 spp, 블라스토미세스 더마티티디스, 칸디다, 콕시디오이데스 임미티스, 콕시디오이데스 포사다실, 크립토콕쿠스 네오포르만스, 히스토플라즈마 캡슐라툼, 메이즈 러스트(Maize rust), 도열병, 라이스 브라운 스폿 병(Rice brown spot disease), 호밀 블라스트, 스포로트릭스 쉔키, 및 밀 균류가 있다. 유기체의 추가 예로는, C. 엘레건스 등의 벌레 및 병원균 벌레나 선충이 있다.
*시료는, 환자 또는 사람으로부터 얻을 수 있고, 혈액, 배설물, 오줌, 타액 또는 기타 신체의 유체를 포함한다. 또한, 식품 시료를 분석할 수 있다. 시료들은 유기체를 잠재적으로 포함하는 임의의 시료일 수 있다. 유기체를 찾기 위한 환경은, 지열 및 열수 지역, 산성 토양, 술포타라(sulfotara) 및 보일링 머드 폿, 풀, 효소들이 알칼리에 대하여 중성인 온천 및 간헐천, 해양 방선균, 후생 동물, 내외 공생물, 열대 토양, 온대 토양, 편건성 토양, 퇴비 더미, 두엄 더미, 해양 퇴적물, 담수 퇴적물, 수 농축물, 고염 및 과냉 해빙, 북극 툰드라, 조해, 공해 원양, 바다눈, (고래 시체, 샘, 및 열수 분출공 등의) 미생물 매트, 벌레 및 선충 미생물 군락, 북극곰 콧구멍, 내부 기생 식물, 착생 수 시료, 공업 용지, 및 현장외 환경이 있지만, 이러한 예들로 한정되지는 않는다. 또한, 시료는, 진핵 생물, 원핵 생물, 믹소박테리아(에포틸온), 공기, 물, 퇴적물, 토양이나 바위, 식물 시료, 음식 시료, 내장 시료, 타액 시료, 혈액 시료, 땀 시료, 오줌 시료, 척수액 시료, 조직 시료, 질 면봉, 대변 시료, 양수 시료, 기침에 의해 생성되는 에어로졸을 포함한 지문 에어로졸, 피부 시료, 생체 검사로부터의 조직을 포함한 조직, 및/또는 구강 청결제 시료로부터 격리될 수 있다.
상기 장치에서의 신진 대사적으로 활성인 박테리아 및 그 존재를 감시하기 위해, 형광 생존 활성 지시자인 alamarBlue?를 배양물에 첨가할 수 있다. alamarBlue?의 활성 성분은 형광 산화 환원 반응 지시자 레자주린(resazurin)이다. (J. O’Brien and F. Pognan, Toxicology, 2001, 164, 132-132.) 레자주린은, 형광 분자 레자주린을 생성하도록, NADH 및 FADH와 같이 세포 신진대사 활동에서 사용되는 전자 리셉터에 의해 환원된다. 따라서, 영역에서의 형광 강도는 세포의 존재 및 신진대사 활동과 상관되며, 이 경우에는, 박테리아이다. 레자주린은 세포 생존 활성을 나타내기 때문에, 종래에는 항생 테스트에서 레자주린 기반 분석을 사용해 왔다 (S. G. Franzblau, R. S. Witzig, J. C. McLaughlin, P. Torres, G. Madico, A. Hernandez, M. T. Degnan, M. B. Cook, V. K. Quenzer, R. M. Ferguson and R. H. Gilman, J. Clin. Microbiol., 1998, 36, 362-366; A. Martin, M. Camacho, F. Portaels and J. C. Palomino, Antimicrob. Agents Chemother., 2003, 47, 3616-3619; K. T. Mountzouros 및 A. P. Howell, J. Clin. Microbiol., 2000, 38, 2878-2884; C. N. Baker and F. C. Tenover, J. Clin. Microbiol., 1996, 34, 2654-2659.) 레자주린은 살아있는 박테리아의 존재 및 항생물질 등의 약에 대한 박테리아의 응답 모두를 검출하는 데 사용될 수 있다. 확률론적 한정은, 상기 영역에 박테리아가 있기 때문에 검출 시간을 감소시키며, 상기 박테리아는 개시 용액에서보다 효과적으로 고 농도로 존재하고, 레자주린의 환원 생성물이 상기 영역에 더욱 빠르게 축적되므로 검출에 요구되는 신호대 잡음에 더욱 일찍 도달하게 된다.
(단일 분자 및 단일 박테리아까지의) 종들의 저 농도를 검출하는 것은 음식, 의료 및 보안 산업에 있어서의 도전 과제이다. 상기 장치는 당업자가 이러한 시료들을 모아 분석을 수행하게 할 수 있다. 예를 들어, 과도한 다른 DNA가 존재하는 가운데 주목하고 있는 소량의 DNA를 함유하는 시료를 증폭시킬 수 있다. 영역들이 충분히 작게 형성되어 일부 영역들이 주목되고 있는 단일 DNA 분자들을 함유하고 다른 영역들이 주목되고 있는 DNA 분자를 함유하지 않으면 증폭을 검출할 수 있다. 이러한 영역 분리는 원래의 시료에서보다 주목되고 있는 더욱 높은 DNA농도를 갖는 영역들을 효과적으로 생성한다. 예를 들어, PCR에 의한 그러한 영역들에서의 DNA 증폭에 따라 상기 원래의 시료의 증폭보다 높은 신호가 발생하게 된다. 또한, 마찬가지의 방법에 의한 영역들에서의 박테리아의 국소화는 박테리아의 높은 국소 농도(매우 작은 영역당 1)를 생성할 수 있어서, 이러한 박테리아를 더욱 쉽게 검출할 수 있다. 쿼럼 센싱(quorum sensing)을 이용하는 일부 박테리아에 대해서는, 이는 박테리아를 활성화하고 검출하는 방법일 수 있다. 이러한 박테리아는 비활성/비-병원균일 수 있으며, 활성 부족으로 인해 저 농도에서 검출이 어려울 수 있지만, 박테리아의 고 농도에서는, 시그널링 분자의 농도가 증가하여, 박테리아를 활성화한다. 단일 박테리아가 영역에 국소 위치하면, 박테리아에 의해 생성되는 상기 시그널링 분자는 널리 확산될 수 없으며, 그 농도는 급속히 증가하고, 상기 박테리아의 활성화를 개시하여, 검출을 가능하게 한다. 또한, 상기 장치는 영역들 내에 겔 또는 매트릭스를 생성함으로써 세포 및 박테리아를 국소화하는 데 사용될 수 있다. 박테리아 및 기타 종(입자 및 분자)은 물 등의 유체를 통해 공기를 흐르게 한 후 상기 유체를 사용하여 복수의 영역을 채움으로써 수집되고 플러그 내로 집중될 수 있다. 그 결과, 상기 영역들 중 일부가 어떠한 검체도 함유하지 않기 때문에 시료 함유 영역들이 집중된다.
PCR 기술들은 다음에 따르는 미국 공개특허출원 및 국제 특허출원에 개시되어 있다: US 2008/0166793, WO 08/069884, US 2005/0019792, WO 07/081386, WO 07/081387, WO 07/133710, WO 07/081385, WO 08/063227, US 2007/0195127, WO 07/089541, WO 07030501, US 2007/0052781, WO 06096571, US 2006/0078893, US 2006/0078888, US 2007/0184489, US 2007/0092914, US 2005/0221339, US 2007/0003442, US 2006/0163385, US 2005/0172476, US 2008/0003142, and US 2008/0014589이며, 이들 모두는 본 명세서에 참고로 원용된다.
적은 개수의 물품을 갖거나 물품이 없는 작은 체적의 영역들을 영역들 내에 포함시킴으로써 세포 및/또는 화학물을 집중하기 위한 방법들을 설명하는 다음에 따르는 문헌들은, PCR과 관련된 특정한 적용 예들과 함께, 본 명세서에 참고로 원용된다. 상기 문헌들은 다음과 같다. Anal Chem. 2003 Sep 1 ;75(17):4591-8. Integrating polymerase chain reaction, valving, and electrophoresis in a plastic device for bacterial detection. Koh CG, Tan W, Zhao MQ, Ricco A J, Fan ZH; Lab Chip. 2005 Apr;5(4):416-20. Epub 2005 Jan 28. Parallel nanoliter detection of cancer markers using polymer microchips. Gulliksen A, Solli LA, Drese KS, Sorensen O, Karlsen F, Rogne H, Hovig E, Sirevag R.; Ann N Y Acad Sci. 2007 Mar;1098:375-88. Development of a microfluidic device for detection of pathogens in oral samples using upconverting phosphor technology (UPT). Abrams WR, Barber CA, McCann K, Tong G, Chen Z, Mauk MG, Wang J, Volkov A, Bourdelle P, Corstjens PL, Zuiderwijk M, Kardos K, Li S, Tanke H J, Sam Niedbala R, Malamud D, Bau H; Sensors, 2004. Proceedings of IEEE 24-27 Oct. 2004 Page(s):1191 - 1194 vol.3. A microchip-based DNA purification and real-time PCR biosensor for bacterial detection. Cady, N.C.; Stelick, S.; Kunnavakkam, M.V.; Yuxin Liu; ; Science. 2006 Dec 1 ;314(5804):1464-7. Microfluidic Digital PCR Enables Multigene Analysis of Individual Environmental Bacteria. Elizabeth A. Ottesen, Jong Wook Hong, Stephen R. Quake, Jared R. Leadbetter; Electrophoresis 2006, 27, 3753-3763. Automated screening using microfluidic chip-based PCR and product detection to assess risk of BK virus associated nephropathy in renal transplant recipients. Govind V. Kaigala, I, Ryan J. Huskins, Jutta Preiksaitis, Xiao-Li Pang, Linda M. Pilarski, Christopher J. Backhouse; Journal of Microbiological Methods 62 (2005) 317- 326. An insulator-based (electrodeless) dielectrophoretic concentrator for microbes in water. Blanca H. Lapizco-Encinas, Rafael V. Davalos, Blake A. Simmons, Eric B. Cummings, Yolanda Fintschenko; Anal. Chem. 2004, 76, 6908-6914. Electrokinetic Bioprocessor for Concentrating Cells and Molecules. Pak Kin Wong, Che-Yang Chen, Tza-Huei Wang, and Chih-Ming Ho; Lab Chip, 2002, 2, 179-187. High sensitivity PCR assay in plastic micro reactors. Jianing Yang, Yingjie Liu, Cory B. Rauch, Randall L. Stevens, Robin H. Liu, Ralf Lenigk and Piotr Grodzinski; Anal. Chem. 2005, 77, 1330-1337. High-Throughput Nanoliter Sample Introduction Microfluidic Chip-Based Flow Injection Analysis System with Gravity-Driven Flows. Wen-Bin Du, Qun Fang, Qiao-Hong He, and Zhao-Lun Fang; Science Vol 315 5 January 2007, 81-84. Counting Low-Copy Number Proteins in a Single Cell. Bo Huang, Hongkai Wu, Devaki Bhaya, Arthur Grossman, Sebastien Granier, Brian K. Kobilka, I, Richard N. Zare; Nature Biotechnology Vol 22 (4), April 2004. A nanoliterscale nucleic acid processor with parallel architecture. Hong JW, Studer V, Hang G, Anderson WF, and Quake SR; Electrophoresis 2002, 23, 1531- 1536. A nanoliter rotary device for polymerase chain reaction. Jian Liu, Markus Enzelberger, and Stephen Quake; Biosensors and Bioelectronics 20 (2005) 1482-1490. Microchamber array based DNA quantification and specific sequence detection from a single copy via PCR in nanoliter volumes. Yasutaka Matsubara, Kagan Kerman, Masaaki Kobayashi, Shouhei Yamamura, Yasutaka Morita, Eiichi Tamiya; US Patent Application 2005/0019792, "Microfluidic device and methods of using same"; and Nature Methods 3, 541 - 543 (2006) "Overview: methods and applications for droplet compartmentalization of biology" John H Leamon, Darren R Link, Michael Egholm ＆ Jonathan M Rothberg.
또한, 특정 박테리아의 존재하는 경우 색을 변경하는 플루오르생성 배지(Flourogenic media)를 사용하여 세포들을 검출할 수 있다. 유색 배지는, 예를 들어, Difco mEI agar, Merck/EMD ChromocultTM Coliform Agars, ChromocultTM Enterococci Agar/Broth, or Fluorocult? LMX Broth, BL agar, IDEXX Colilert, CPI ColiTag and Merck/EMD ReadyCult?를 포함한다. 색소원 또는 발광원에 결합된 통상적인 효소 기질은 ONPG, CPRG, 및 MUG를 포함한다. 이들은 또한 바로 사용할 수 있는 형태로 이용가능하며, 예를 들어, BBL ml 세균 배양액 및 IDEXX Colilert, CPI ColiTag and Merck/EMD ReadyCuIt? 등의 ‘컨비니언스’ 팩일 수 있다.
항생물질 선별을 수행하기 위해, 영역들은 항생물질들을 함유할 수 있고, 시료로 채워진 상기 영역들은 미생물의 성장이 가능하도록 배양될 수 있다. 항생물질은 인식되며, 미생물을 죽이거나 미생물의 성장을 억제하는 물질이다. 항생물질의 예는, 클로로테트라시클린, 바시트라신, 나이스타틴, 스트렙토마이신, 폴리미신(polymicin), 그라미시딘, 옥시테트라사이클린, 클로람페니콜, 리팜피신, 세프술로딘, 세포티암, 메폭신, 페니실린, 테트라사이클린, 미노사이클린, 독시사이클린, 반코마이신, 카나마이신, 네오마이신, 젠타마이신, 에리트로마이신, 세팔로스포린, 겔다나마이신, 및 이들의 유사물질들을 포함하지만, 이러한 예로 한정되지 않는다. 세팔로스포린의 예는, 세팔로틴, 세파피린, 세파졸린, 세파렉신, 세프라딘, 세파드록실, 세파만돌, 세폭시틴, 세파클로, 세푸록심, 세포니시드, 세포라니드, 세포탁심, 목사락탐, 세프티족심, 세프트리악손 및 세포페라존을 포함한다. 사용될 수 있는 항생물질의 추가 예들은, 미국 공개특허 제2007/0093894 A1에 개시되어 있으며, 그 내용은 본 명세서에 참고로 원용된다. 각 항생물질의 존재 및 부재에 있어서 성장 및 미생물군의 차를 검출함으로써, 항생물질 민감성에 관한 정보를 제공하게 된다. 우선, 상기 시료의 박테리아를 카운팅한다. 이어서, 상기 박테리아 시료를, “블랭크(blank)” 배지 및 “블랭크” 항생물질 영역들과 함께 서로 다른 성장 배지 및 서로 다른 항체들을 함유하는 영역들에 노출시키고, 박테리아 성장에 대하여 영역들을 분석한다.
다른 적용 예들은 먹이 사슬과 물의 국내 안전 및 보안에서의 적용 예를 위해 박테리아를 검출하는 것을 포함한다. 또한, 이러한 검출 방법들을 패혈증, 바이오에너지, 단백질, 효소 공학, 혈액 응고, 바이오디펜스, 음식 안전, 급수 안전 및 환경 복원 분야들에 적용하는 것도 가능하다. 다음의 특허 및 특허 출원은 본 명세서에 참고로 원용된다. WO 2005-010169 A2, US 6,500,617, WO 2007-009082 A1.
물질을 이동시키는 수단의 예는, 유체 연통하는 영역들의 어레이를 포함하는 장치가 사용되는 경우의 원심력, 삼투압, 모세관 압력, 예를 들어, 펌프나 흡입기를 사용하여 외부에서 생성된 양 또는 음의 압력, 예를 들어, 유체를 함유하는 영역을 압축하거나 확장함으로 인한 슬라이딩, 전기력, 전기삼투력, 자기력, 및 외부에서 개시될 수 있거나 슬라이딩에 의해 개시될 수 있는 화학 반응이나 처리를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
예를 들어, 기체 생성물을 함께 생성하는 영역에 복수의 액체 또는 고체 물질을 배치할 수 있고, 이에 따라 압력을 생성할 수 있다. 예를 들어, 황산 용액 및 탄산 염을 사용할 수 있다. 다른 방안으로, 촉매가 없는 경우에는 반응하지 않거나 느리게 반응하지만 상기 촉매가 있는 경우에는 더욱 빠르게 반응하는 물질들을 함유하는 영역에 상기 촉매를 첨가할 수 있다. 일례는, 예를 들어, 촉매로서 기능하는, 물 첨가에 의해 활성화되는 타르타르산인 고체산과 탄산수소나트륨의 혼합물이다. 촉매에 의해 활성화될 수 있는 이러한 다수의 혼합물을 베이킹 분말로서 사용한다. 다른 방안으로, 기체 물질이 소모되도록 물질들을 접촉시켜, 음의 압력을 생성하고 장치에서의 물질의 이동을 유도한다. 예를 들어, 수산화나트륨 및 이산화탄소는 이러한 식으로 반응한다. 또한, 상 전이를 이용하여 장치에서의 물질의 이동을 유도할 수 있다. 또한, 위킹을 이용할 수 있다. 예를 들어, 제1 영역은, 이동을 유도하기 위해 물질을 흡수하는 재료를 함유할 수 있거나 상기 재료로 구성될 수 있다. 물질의 이동을 유도하는 다른 일례로서, 외부 압력을 가하지 않고도, 표면 장력 및 흐름 저항으로 인한 차분 압력을 이용하여 슬라이딩 후 흐름을 유도할 수 있다. 일례로, 장치는 바람직한 흐름이 통하는 하나 이상의 메인 채널, 및 상기 메인 채널보다 작고 이에 따라 상기 메인 채널보다 높은 모세관 압력을 갖는 하나 이상의 모세 채널들의 어레이를 포함할 수 있다. 상기 장치는, 미끄러져 상기 메인 채널(들)이 상기 모세 채널들의 어레이와 유체 연통하게 할 수 있고, 이에 따라 상기 메인 채널에서보다 상기 모세 채널들에서 높은 압력을 갖는 유체 경로를 생성할 수 있으며, 이는 상기 메인 채널로의 흐름을 유도한다. 상기 장치 및 상기 슬라이딩 이동은 흐름의 속도와 지속 시간을 제어하도록 조절될 수 있다. 예를 들어, 대기에 개방되어 있는 유체의 저장소는, 흐름 저항에 의해 압력을 제어하도록, 제한된 거리, 상기 모세 채널 및/또는 메인 채널에 위치할 수 있다. 이러한 저장소는, 선택 사항으로, 덕트를 통해 상기 모세 채널 및/또는 상기 메인 채널에 접속되어, 상기 흐름 저항을 더욱 감소시킬 수 있고 이에 따라 상기 흐름 속도를 증가시킬 수 있다. 이는, 예를 들어, 세척 채널을 통한 흐름을 유도하여 면역분석 동안 세척을 행하도록 또는 세포들의 관류 배양 또는 비드들의 현탁액에 대한 느린 흐름을 유도하도록 이용될 수 있다.
본 발명의 장치를 사용하여 다수의 영역들에 동일한 물질을 쉽고 경제적으로 로딩할 수 있다. 예를 들어, 도 12a와 도 12b를 참조해 볼 때, 상기 장치는 다수의 영역들(22) 및 영역들(18)을 포함하도록 제조될 수 있다. 개방 위치에서, 각 영역은 서로 접속되며 입구(28)에 접속되어, 쉬운 로딩을 가능하게 한다. 폐쇄 위치에서, 상기 영역들(18, 22)의 각각은 서로 분리되어, 예를 들어, (예를 들어, 단일 분자, 비드, 세포 및 박테리아의 확률론적 한정을 통해) 개별적인 영역들에서의 소량의 물질들을 검출할 수 있게 한다. 개개의 영역들에서 소량의 물질들을 검출하기 위한 방법들은, 예를 들어, PCT/US08/071374, PCT/US07/02532, 및 PCT/US08/71370개시되어 있으며, 이들 모두는 본 명세서에서 참고로 원용된다.
또한, 본 발명의 장치를 사용하여, 다양한 제2 물질이 사전 로딩되어 있는 다수의 영역 내로 제1 물질을 쉽게 로딩할 수 있다. 예를 들어, 도 12a와 도 12b를 참조해 보면, 각 영역(18, 22)은 상기 영역들의 표면에 부착될 수 있는 서로 다른 제1 물질(예를 들어, 서로 다른 항생물질들)을 함유할 수 있다. 제2 물질(예를 들어, 박테리아를 함유하는 시료)을 상기 입구(28)를 통해 상기 개방 위치에서 상기 장치에 로딩하면, 상기 제2 물질은 각 영역 내로 로딩된다. 상기 장치가 상기 폐쇄 위치로 미끄러진 후, 상기 제2 물질에 끼치는 상기 제1 물질의 영향에 대하여 개별적인 영역들을 감시할 수 있다. 항생물질들에 대한 박테리아의 민감성을 측정하기 위한 방법들은 PCT/US08/71374에 개시되어 있으며, 이는 본 명세서에 참고로 원용된다.
본 명세서에서 설명하는 본 발명의 실시예들은 미생물 배양을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 혐기성 미생물이 산소 없이 로딩되어 있는 유리로 된 장치에서 상기 혐기성 미생물을 배양할 수 있다. 이어서, 유기체를 산소에 노출시키지 않고 상기 혐기성 미생물에 대하여 조작, 성장, 분석 등을 행할 수 있다. 이러한 장치는, 호기성 또는 혐기성 미생물 분석, 장내 생물군 분석, 진단, 혐기성 감염증의 항생물질 민감성 등의 적용 예들에서 사용될 수 있다. 이러한 미생물 배양 장치의 적용 예들은 국제 특허 출원 PCT/US08/71374 및 PCT/US08/71370에 개시되어 있다. 미생물 종들을 상기 장치의 영역들에 한정시킨 후, 각 후속 슬라이딩 위치에서 조건(즉, 혐기성, 화학적 등) 을 제어하도록 다단계 프로세스들을 통해 조작할 수 있다. 예를 들어, 미생물은 초기 슬라이딩 위치에 한정될 수 있고, 이어서, 다음 슬라이딩 위치에서 자극되어 발병 인자를 생성할 수 있고, 이어서 최종 슬라이딩 위치에서 상기 발병 인자가 검출 시약과 접할 수 있다.
또한, 본 명세서에서 설명하는 본 발명의 실시예들은 선충 등의 다세포 생물을 비롯한 원핵 생물 세포 및 진핵 생물 세포를 배양하고 조작하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 유기체들은, 제1 슬라이딩 위치에서 세포 및 유기체에 영양소를 공급하고, 제2 슬라이딩 위치에서 자극을 가하고, 제3 슬라이딩 위치에서 폐기물을 제거하도록 설계된 장치에서 배양될 수 있다. 특허출원 PCT/US08/71374 및 PCT/US08/71370에 개시되어 있는 바와 같이, 선택 사항인 추가 슬라이딩 위치를 이용하여 상기 장치 내에서 상기 유기체에 의해 분비되는 생성물을 캡쳐할 수 있다. 상기 장치는 한정된 유기체의 고 해상도 촬상과 호환되도록 설계될 수 있다.
마찬가지로, 본 발명의 장치는 다수의 영역에 서로 다른 물질들을 쉽고 경제적으로 로딩하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 도 8a 내지 도 8d에서, 상기 장치는 하나의 표면 상에 다수의 영역(18) 및 대향 표면 상에 다수의 영역(22)을 포함하도록 제조된다. 위치 A에서, 상기 영역들(22)의 평행한 열들에는 서로 다른 제1 물질들이 로딩될 수 있다. 위치 C로 미끄러진 후, 상기 영역들(18)의 평행한 컬럼들에는 서로 다른 제2 물질들이 로딩될 수 있다. 위치 D에서, 다양한 상기 제1 및 제2 물질들은 결합되어, 서로 다른 반응들의 어레이를 형성할 수 있다. 본 실시예에서, 예를 들어, 10개 열의 각각에서의 10개의 영역 및 10개 컬럼의 각각에서의 10개의 영역을 포함하는 장치를 사용하여 100개의 반응을 준비할 수 있다. 다른 실시예들에서, 상기 장치는, 예를 들어, 6, 24, 96, 384, 1536, 3456, 또는 9600 개의 시료 웰을 포함할 수 있는 표준 다중웰 플레이트와 동일한 위치에 구성된 영역들을 포함할 수 있다. 다른 실시예들에서, 상기 장치는, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 24, 30, 40, 48, 50, 60, 70, 80, 90, 96, 100, 200, 300, 384, 400, 500, 512, 1000, 1500, 1536, 2000, 2500, 3000, 3456, 3500, 4000, 4500, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 9600, 10000, 1500, 2000, 2500, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000,9000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200000, 200000, 400000, 500000, 600000, 700000, 800000, 900000, 1000000개 이상의 영역을 포함할 수 있다. 표준 다중웰 구성은 미국공개특허 US 20070015289에 개시되어 있으며, 그 전체 내용은 본 명세서에 참고로 원용된다. 예를 들어, 장치는 100,000개 영역의 어레이를 포함할 수 있고, 각 영역은 한 변이 약 200 마이크로미터인 정육면체이며, 10 nL당 1 밀리미터의 시료가 100,000개의 용량으로 분리될 수 있다. 이러한 장치는, 예를 들어, 매우 낮은 농도에서 존재하는 검체를 검출하도록 사용될 수 있다.
일부 실시예들에서, 본 발명의 장치에는 물질들이 사전 로딩될 수 있고 사용 전 저장될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 물질이 상기 영역들 내로 건조되면, 상기 개방 위치에서 상기 장치에 용액을 첨가하여 상기 물질들을 다시 수화/용해시킬 수 있다. 저장을 위해 물질들을 건조시키는 방법들은 미국 공개특허 US 2008/0213215, US2009/0057149 및 US 7,135,180에 개시되어 있으며, 그 전체 내용은 본 명세서에 참고로 원용된다.
본 발명은, 미국특허 7,129,091 및 미국 공개특허 US 2007/0172954, US 2006/0003439, US 2005/0087122 및 국제 특허 출원 PCT/US08/71374, PCT/US08/71370, PCT/US07/26028에 개시되어 있는 바와 같은 플러그 기술과 함께 사용될 수 있으며, 이들 모두는 본 명세서에 참고로 원용된다. 예를 들어, 영역은 플러그들의 어레이로 채워질 수 있는 기판 상에 채널을 포함할 수 있다. 상기 장치는 제1 위치에서 한 세트의 적어도 하나의 영역을 포함하는 대향 플레이트를 포함할 수 있고, 각 영역은 상기 플러그들의 어레이 내의 적어도 하나의 플러그와 중첩되고, 제2 위치에서는, 상기 플러그들의 어레이 중 어떠한 플러그와도 중첩되지 않는다.
이러한 장치(10)의 일 실시예는 도 12a와 도 12b에 도시되어 있다. 도 12a와 도 12b에 도시한 상기 장치(10)를 제조하는 한 방식은 유리를 이용하는 것이다. 전술한 바와 같이 에칭에 의해 영역 또는 채널을 갖는 유리 슬라이드를 제조하였다. 영역의 크기는 약 130 x 50 μm 이고 깊이는 약 15 μm 이다. 상기 장치의 각 층에는 2048개의 영역이 존재하며, 이는 64개 영역의 32개 열로 구성되었다. 모든 32개 열 영역들은 Y 형상 트리 분산 스타일에 의해 단일 입구에 접속되었다. 슬라이딩 후에, 상기 장치는 4096개의 개별적인 구역들을 생성하였다. 상기 장치의 크기는 1 cm x 2 cm였다.
상보적 패턴을 갖는 두 개의 유리 슬라이드를 현미경에 정렬시켜 관통채널을 형성하고 페이퍼 클립으로 고정하였다. 상기 영역들이 정렬될 때, 상기 영역들은 입구에 접속된 연속적 채널을 형성하였다. 그리고, 상기 채널의 타단은 더욱 큰 채널에 접속되었으며, 이는 상기 장치의 가장자리까지 계속되었다.
우선 상기 입구를 통해 FC-40을 주입하여 모든 채널들을 채웠다. 상기 유리는 실란화되었고 FC-40은 상기 유리를 적셨으므로, 오일은 상기 모든 채널들을 채웠을 뿐만 아니라, 두 개의 유리 층 사이의 모든 컨택트 영역들로 채웠다. 상기 입구를 통해 공기를 주입하여 FC-40을 대체하는 한편, 상기 두 개의 유리 층의 컨택트 영역들은 여전히 FC-40에 의해 적신 상태에 있었다. 또한, FC-40 박층에는 소량의 FC-40 잔여물이 존재하거나 FC-40 박층은 상기 채널의 표면을 여전히 피복한다. 상기 입구를 통해 10 mM Tris pH 7.8의 0.5 μm 플루오로스세인 용액을 상기 채널들 내로 주입하였다.
일부 실시예들에서, 상기 장치 내로 로딩된 시료는 물질 또는 자기 비드를 고정시킬 수 있는 비드들을 가질 수 있다. 비드들은 상기 개방 위치에서 상기 영역들을 접속하는 덕트들을 상기 비드들보다 작게 형성함으로써 상기 장치의 서로 다른 영역들 내로 한정될 수 있다. 자기 비드들은 포커싱된 자기장을 상기 영역에 인가함으로써 특정한 영역들로 향하거나 상기 특정한 영역들 내에 추가로 포획될 수 있다. 일부 실시예들에서, 상기 영역들에는 제1 물질(예를 들어, 제1 아미노산)을 함유하는 비드들이 로딩될 수 있다. 개방 위치와 폐쇄 위치 사이에서 (서로 다른 여러 개방 및 폐쇄 위치들을 통해) 상기 장치를 미끄러지게 함으로써, 상기 비드들에는, 세척, 보호 해제, 제2 물질(예를 들어, 제2 아미노산)과의 반응, 세척 등이 행해질 수 있다. 이러한 식으로, 새로운 분자들의 어레이들(예를 들어, 폴리펩타이드)을 형성할 수 있다. 결국, 상기 새로운 분자는 상기 비드로부터 분리되어 분석되거나 심지어 수집될 수도 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 비드들의 유형의 예들은 미국 공개특허 2009/0035847, 국제 특허 출원 WO 2009/018348, WO 2009/013683, WO 2009/002849 및 WO 2009/012420에 열거되어 있으며, 이들 모두는 본 명세서에 참고로 원용된다.
일부 실시예들에서, 상기 제1 및 제2 물질들을 혼합하는 속도는 상기 개방 및 폐쇄 위치들 사이에서 상기 장치를 여러 번 미끄러지게 함으로써 증가할 수 있다.
일부 실시예들에서, 다수의 영역들은 한번보다 많게 상기 폐쇄 위치로 슬라이딩으로써 물질들의 연속 첨가가 가능하도록 (그리고 추가 반응도 가능하도록) 정렬된다. 본 실시예에서, 슬라이딩은 도 14a와 도 14b를 참조하여 전술한 바와 동일하거나 다를 수 있다.
일부 실시예들에서, 상기 영역들의 용량은, 두 개의 영역의 혼합이 상기 물질들의 농도를 감시할 수 있는 정량적으로 제어된다. 일부 실시예들에서, 다수의 영역들은 상기 장치가 폐쇄 위치로 더 미끄러질 때 물질의 계열 희석이 가능하도록 정렬된다. 예를 들어, 기판 상의 제1 세트의 적어도 하나의 제1 영역은, 제1 위치에서, 예를 들어, 덕트들을 통해 물질로 채워질 수 있고, 이어서, 상기 영역은 다른 위치들로 이동될 수 있으며, 상기 다른 위치들의 각 위치에서, 상기 적어도 하나의 제1 영역은, 예를 들어, 완충액인 희석액을 함유하는, 대향 플레이트 상의 제2 세트의 미리 채워진 영역들 중 하나에 노출된다. 각 위치에서의 노출은 상기 물질이 상기 희석액과 완전히 희석되도록 충분한 시간 동안 유지된다. 연속되는 각 위치에서, 상기 물질은 희석액의 용량에 의해 희석된다. 예를 들어, 제1 영역이 1 나노리터의 물질을 함유하고 한 세트의 5개의 제2 영역의 각각이 9 나노리터의 용량을 갖는다면, 상기 제1 영역이 상기 제2 영역들의 각각에 차례로 노출된 후, 상기 제2 영역들은 약 10배, 100배, 1000배, 10,000배, 100,000배로 희석된 물질들로 채워진다. 이어서, 상기 제2 세트의 영역들은 추가 영역들 및 물질들에 노출되어 추가 반응을 수행할 수 있다.
다른 일 실시예에서, 기판 상에 복수의 제1 영역을 포함하는 열은, 예를 들어, 제1 위치에서, 덕트들을 통해 물질로 채워질 수 있고, 이어서 순차적으로 상기 복수의 제1 영역은 서로 다른 위치들로 이동될 수 있으며, 상기 서로 다른 위치의 각 위치에서, 상기 복수의 제1 영역의 각각은, 예를 들어, 각각이 희석액을 함유하는, 대향 플레이트 상의 대응하는 제2 세트의 미리 채워진 영역들에 노출되며, 상기 복수의 제1 영역의 각각은 상기 제2 세트의 미리 채워진 영역들에서의 서로 다른 수의 영역들에 노출된다. 예를 들어, 4개의 제1 영역은 제1 위치에서 채워질 수 있고, 이어서 제2 위치에서, 첫 번째 제1 영역이 희석 영역에 노출되지만, 나머지 3개의 제1 영역은 상기 희석 영역에 노출되지 않는다. 제3 위치에서, 상기 제1 및 제2 영역들은 희석 영역들에 노출되지만, 나머지 두 개는 상기 희석 영역들에 노출되지 않는다. 제4 위치에서, 상기 제1, 제2 및 제3 영역들은 희석 영역들에 노출되지만, 나머지 하나는 상기 희석 영역들에 노출되지 않는다. 이러한 동작의 결과는 농도가 다른 일련의 4개의 제1 영역을 채우는 것이며, 이러한 제1 영역들은 이어서, 예를 들어, 단백질 결합이나 억제 활동을 분석하기 위한 시약들에 노출될 수 있는 적어도 하나의 추가 위치로 이동될 수 있다. 당업자에게는, 본 예에서의 상기 제1 및 제2 영역의 수를 임의의 소망 값으로 쉽게 가변할 수 있고, 상기 장치 상에서 이용가능 영역에 의해 영향을 받고, 이용가능한 물질의 양에 의해 영향을 받을 수 있다는 점이 명백할 것이다.
이러한 기술들을 이용함으로써, 예를 들어, 정확한 데이터를 얻기 위해 단백질 및/또는 억제제 농도의 넓은 범위가 필요한, 단백질 활동 분석 및/또는 단백질 결합 분석을 위한 용액을, 소량의 재료를 사용하여 빨리 준비할 수 있다.
일부 실시예들에서, 제1 표면 상의 영역들은 대향하는 제2 표면 상의 영역들에 정렬되어 상기 제2 표면 상의 영역이 상기 폐쇄 위치에서 상기 제1 위치 상의 두 개 이상의 영역을 연결(bridge)하게 된다. 본 실시예에서, 형성된 브릿지는 상기 제1 표면 상의 한 영역으로부터 상기 제2 표면 상의 브릿지 영역을 통해 상기 제1 표면 상의 다른 하나의 영역으로의 확산을 제어할 수 있게 한다. 본 실시예는 단백질 결정화에 특히 유용하다.
단백질 결정화에 대한 본 발명의 장치의 유용성을 예시하도록 몇 개의 예시적인 실험을 수행하였다. “Crystallization of RC on SlipChip (L16L025-26)”이라 칭하는 한 실험에서는 도 6a와 도 6b에 도시한 상기 장치(10)를 사용하였다. 구체적으로, 정렬된 PMDS/유리 슬립칩(도 6a와 도 6b에 도시한 바와 같이 25 mm x 75 mm 크기로 패터닝됨)에 대하여 실험을 수행하였다. 두 개의 층 사이의 간격을 사용 전에 FC-40으로 채웠다. 상기 장치는 단백질을 위한 160개의 영역 및 두 개의 층 상의 침전제를 위한 160개의 영역을 포함하며, 이러한 영역들은 슬라이딩을 위해 상보적이다. 상기 영역들 모두는 100 μm 의 깊이 및 300 μm 의 폭을 갖고, 길이를 변경하여 8.8 내지 14.2 nL의 범위에서의 용량을 제어하였다. 16개의 침전제 및 반응 중심 시료를 피펫 조작에 의해 상기 슬립칩 상에 로딩하였다. 각 침전제는 (이웃하는 영역들 사이에 0.6 nL로 계속 증분하는) 8.8 nL 내지 14.2 nL 범위의 용량으로 10개 영역의 어레이를 채우고, 단백질은 침전제 영역에 대향하는160개의 영역 모두를 14.2 내지 8.8 nL의 용량으로 채운다. 16개의 침전제는 No. 1 내지 No. 14인 CrystalScreen 키트(Hampton Research), 및 2개의 동일한 제어 용액 (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH 6.0의 4 M (NH4)2SO4)을 포함하였다. 각 침전제를 로딩할 때, 100 μL 피펫터를 사용하였다. 40 μL 용액을 상기 피펫터 내에 로딩하였다. 상기 용액을 상기 슬립칩 내로 로딩하기 위해, 상기 피펫터 팁의 단부를 대응하는 입구 구멍 내로 밀어넣었다. 이어서, 상기 용액을 밀어 내고 전체 채널이 채워졌을 때 상기 피펫터 팁을 분리하였다. 일단 모든 침전제가 상기 칩 내로 로딩되었으므로, 상기 반응 중심 시료는 ~ 24 mg/mL in 4.5% TEAP, 7% 1,2,3-헵타네트리올, 0.08% LDAO 및 20 mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH 6.0로 되었다. 10 μL 피펫터를 사용하였고 ~ 6 μL의 RC 시료를 상기 칩 내로 로딩하였다. 손으로 슬라이딩을 행하였고, RC가 상관 침전제와 접하게 되었다. 하루 동안의 배양 후, 상기 제어 침전제만이 결정을 생성하였다. 나머지 14개의 조건은 1주일 후에도 결정을 생성하지 않았다.
“Crystallization of lysozyme in hybrid device (notebook page L16L032)”라 칭하는 다른 실험을, 도 6a와 도6B 및 도 7a와 도 7b에 도시한 정렬된 PDMS/유리 슬립칩 실시예에 대하여 행하였다. FID(도 7a와 도 7b)와 마이크로배치 스타일(도 6a와 도 6b)로 이루어진, 정렬된 PDMS/유리 슬립칩(25 mm x 75 mm 크기) 상에는, 하나의 침전제(30% PEG 5000 MME, 0.1 M NaOAc pH 4.8의 1 M NaCl)가 16개의 입구를 통해 16개의 서로 다른 포트 내에 로딩되었다. 침전제는 각 입구에 접속된 12개의 영역을 채웠다. 이러한 12개의 영역은 혼합비의 마이크로배치 최적화를 위한 6개의 영역 및 자유 계면 확산의 최적화를 위한 6개의 영역으로 구성되었다. 마이크로배치 실험을 위해, 침전제 대 단백질의 혼합 용량은 7.8 nL: 15.8 nL; 9.4 nL : 14.2 nL; 11.0 nL : 12.6 nL; 12.6 nL : 11.0 nL; 14.2 nL : 9.4 nL; 15.8 nL :7.8 nL였다. FID를 위해, 사용된 단백질 용량 및 침전제는 모두 16 nL였다. 160 μm, 220 μm, 280 μm, 320 μm, 360 μm, 400 μm 거리를 두고 단백질 및 침전제 영역들을 접속한, 단면이 50 μm x 50 μm 인 브릿지 덕트가 존재하였다. 전술한 바와 같이 침전제를 피펫 조작하기 위한 동일한 피펫 조작 절차를 수행하였다. 전술한 바와 같이 단백질을 로딩하는 동일한 절차를 이용하여, 리소자임 시료(0.1 M NaOAc pH 4.8의 ~ 120 mg/mL)을 상기 칩 내로 로딩하였다. 30분의 배양 동안, 결정들이 먼저 마이크로배치 스타일에서 그리고 이어서 FID 스타일에서 나타나기 시작했다.
PDMS/glass SlipChip with FID style 이라 칭하는 도 7a와 도 7b에 도시한 실시예에 대하여 “Crystallization of lysozyme, thaumatin in FID (L16L24, L16L095)”라 칭하는 또 다른 실험을 수행하였다. 우선, 단백질 시료와 침전제의 영역들을 포함하는 하부층을 페트리 접시 내에 함유된 FC-40에 침지하였다. double concentrated wizard I (Emerald BioSystems) 및 Crystal Screen (Hampton research)으로부터의 침전제의 7.5nL 용액을 상기 침전제 영역들 내로 퇴적시켰다. 7.5 nL 용액을 침적하기 위해, 우선, 상기 용액을 10 μL 흡입기에 접속된 하나의 테플론 튜빙(100 μm I.D. 및 250 μm O.D.) 내로 다른 하나의 테플론 튜빙(~ 360 μm I.D.)에 의해 흡입시켰다. 이러한 두 개의 테플론 튜빙을 왁스로 밀봉하였다. 흡입기를 흡입기 펌프에 의해 구동하였다. 상기 펌프는 300 μL/min의 주입 속도에서 10 mL 흡입기를 사용하도록 설정되었다. 이것은 용량 모드에서 설정되었으며, 매번 7.5 μL를 사용하도록 지정되었다. 흡입기의 크기의 오프셋을 고려할 때, 실제로 사용된 용량은 7.5 nL이다.
또한, 본 발명의 장치(10)는, 미국 특허 6,409,832; 6,994,749; 7,306,672; 7,015,041; 및 6,797,056에 개시된 기술들을 비롯한 다른 미세 유체 결정화 기술들과 결합될 수 있음을 인식할 수 있으며, 이러한 특허 문헌들 모두는 본 명세서에 참고로 원용된다.
또한, 본 발명의 장치는 기상 확산 결정화 실험을 수행하는 데 사용될 수 있다. 기상 확산 실험은 국제 특허 출원 WO/2006/101851, 미국 공개특허 2005/0087122, 및 미국 특허 6,808,934 및 4,755,363에 개시되어 있으며, 이들 모두는 본 명세서에 참고로 원용된다. 기상 확산 결정화 실험에 유용한 일부 실시예들에서, 적어도 하나의 제1 영역은 적어도 하나의 덕트 또는 제3 영역을 통해 적어도 하나의 제1 영역에 접속될 수 있고, 여기서 상기 덕트 또는 제3 영역은 제1 물질을 함유한다. 일부 실시예들에서, 상기 적어도 하나의 제1 영역은 용매에서 용해되는 결정화될 제2 물질을 함유하고, 상기 적어도 하나의 제2 영역은 동일한 용매에서 용해되는 적어도 하나의 제3 물질을 함유하고, 상기 적어도 하나의 제1 영역과 상기 적어도 하나의 제2 영역에서의 상기 용매의 삼투압은, 예를 들어, 염의 농도를 달리 함으로써, 서로 다르다. 통상적으로, 상기 제2 영역의 용액은 상기 제1 영역의 용액보다 높은 염 농도를 갖는다. 상기 제1 물질은 공기나 오일 등의 기체일 수 있지만, 상기 용매가 상기 제1 및 제2 영역들 사이에서 평형화될 수 있는 임의의 물질이어도 된다. 통상적으로, 예를 들어, 물인 상기 용매 중 일부는, 결정화될 상기 제2 물질을 함유하는 염 농도가 낮은 용액으로부터 상기 염 농도가 높은 용액으로 확산한다. 이러한 확산은 결정화될 상기 제2 물질을 농축시키고, 이에 따라 상기 제2 물질이 더욱 더 결정화될 수 있게 한다. 예를 들어, 적절한 영역들 및/또는 덕트들을 포함하는 적절한 기판과 적절한 플레이트를 서로에 대하여 이동시키는, 본 명세서에서 설명하는 모든 기술들을 이용하여 이러한 실험을 위해 필요한 용액을 준비할 수 있다는 것은 명백할 것이다.
침적 후, 연결하는 “넥”(neck)들을 포함하는 상부층을 상기 하부층 상에 정렬하여 단백질 시료들을 위한 상관 영역들을 연결하였다. 정렬 후, 4개의 페이퍼 클립을 사용하여 상기 두 개의 층을 고정시켰다. 타우마틴 용액(물에서 ~ 80 mg/mL) 및 리소자임 용액(22 mg/mL)을 상기 입구들을 통해 상기 영역들 내로 각각 주입하였다. 모든 시료 영역들을 상기 두 개의 시료 중 하나에 의해 모두 채운 후, 슬라이딩을 수동으로 수행하였다. 이전 침적은, Crystal Screen으로부터의 침전제가 “넥”에 의해 상기 타우마인 시료에 연결되는 한편 double concentrated Wizard I으로부터의 침전제는 리소자임 시료에 연결되는 방식으로 수행되었다. 5일 내에, Crystal Screen의 조건 29 (0.1 M HEPES pH 7.5의 0.8 M 주석산칼륨 나트륨)로 타우마인이 결정화되었고, 리소자임은 double concentrated Wizard I으로부터의 조건 16 (0.1 M 인 칼륨 나트륨 완충액 pH 6.2의 3.75 M NaCl)으로 결정화되었다.
일부 실시예들에서, 물질은 영역에 고정된다. 예를 들어, 촉매, 검체 및 생체 분자(즉, 탄수화물, 펩타이드, 단백질, DNA, 항체 등)는 미국특허 4,071,409, 5,478,893, 7,319,003, 6,203,989, 5,744,305 및 6,855,490에 개시되어 있는 바와 같이 알려져 있는 방법들을 이용하여 고정될 수 있으며, 이러한 특허 문헌들 모두는 본 명세서에 참고로 원용된다.
알려져 있는 다양한 검출 방법들(광학, X-레이, MALDI, FP/FCS, FCS, 형광 분석, 비색 분석, 화학 발광, 생체 발광, 산란, 표면 플라즈몬 공명, 전기화학, 전기 영동, 레이저, 질량 분광 분석, 라만 분광 분석, FLIPRTM (Molecular Devices) 등)을 이용하여 본 발명의 장치를 분석할 수 있다. 적절한 재료를 사용하는 경우(즉, 광학 검출 방법을 위해 광학적으로 투명한 물질을 사용하는 경우) 상기 장치를 직접 분석할 수 있다. 신호가 경로길이의 함수인 광 흡수 등의 그러한 검출 방법을 위해, 상기 장치 상에 다수의 영역들을 형성하여 상기 다수의 영역들이 동일하지만 경로길이만 다른 내용물들을 함유할 수 있다. 이러한 식으로, 상기 영역들 중 적어도 하나로부터 얻는 신호가 상기 검출기의 동적 범위 내에 있을 가능성이 증가한다. 서로 다른 경로길이들을 고려하도록 구성된 컴퓨터 시스템을 사용하여 소망하는 최종 결과를 얻을 수 있으며, 예를 들어, 검체 농도를 얻을 수 있다. 다른 방안으로는, (예를 들어, 액세스 홀을 통해) 개별적인 영역들에 대한 접근을 허용하는 추가 위치 내로의 슬라이딩이 가능하도록 상기 장치를 개방하고 개별적인 영역들을 분석하거나 설계할 수 있다. 일부 실시예들에서는, 반응 영역들의 증폭(예를 들어, 은 기반 증폭, 소식세포 증폭 등 )을 수행할 수 있다.
일부 실시예들에서, 일단 덕트 내로 로딩되면, 전계를 이용하여 시료의 구성 성분들을 분리할 수 있다(전기 영동).
본 발명의 장치는, 응고/응혈, 단백질 응집, (지방질 큐빅 상의 사용을 포함한) 단백질 결정화, 소 분자, 거대 분자 및 입자의 결정화 및 분석, 동소체의 결정화 및 분석, 조제물, 약 및 약 후보의 결정화, 바이오 미네랄화, 나노입자 형성, (수분 및 대기 샘플링을 통한) 환경, 배양 조건(예를 들어, 확률론적 한정, 세포 용해 등), 약 민감성, 약 상호작용 등을 연구하고 수행하는 데 사용될 수 있다. 결정화를 위한 기술들은 미국 특허 7,129,091및 미국 공개특허 2007/0172954, US 2006/0003439, 및 US 2005/0087122에 개시되어 있으며, 이들 모두는 본 명세서에 참고로 원용된다. 혈액 응집/응혈을 분석하기 위한 방법들은 본 명세서에 참고로 원용되는 국제 특허 출원 PCT/US07/02532에 개시되어 있으며, 이하 더 설명한다. 이러한 방법들은, 개별적인 테스트들 또는 이들의 조합들로서, PT, aPTT, ACT, INR, 개별적인 응집 인자에 대한 분석, 피브리노겐 농도 측정, 혈소판 기능 측정, 트롬보엘라스토그래피 및 이 방법의 다양한 수정형, 및 점성도법을 포함한다. 이러한 방법들은 슬립칩에 적용될 수 있으며, 상기 슬립칩의 층들의 이동을 이용함으로써 향상될 수 있다. 단백질 응집 분석은, 미국 특허 6,949,575, 5,688,651, 7,329,485, 및 7,375,190 및 미국 공개 특허 2003/0022243에 개시되어 있으며, 이들 모두는 본 명세서에서 참고로 원용된다. 배양 조건의 연구는 국제 특허 출원 PCT/US08/71370에 개시되어 있으며, 이는 본 명세서에서 참고로 원용된다. 본 발명의 장치는, 고 처리량 선별(예를 들어, 하나의 제1 물질과 서로 다른 많은 제2 물질들, 서로 다른 많은 제1 물질과 서로 다른 많은 제2 물질), 복합 분석(예를 들어, PCR, 태그만, 면역 분석(예를 들어, ELISA 등)), 샌드위치 면역 분석, 주화성, 가지형성(ramification) 증폭(RAM) 등을 포함한 다양한 분석들을 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 장치는, 촉매, 다단계 반응, 고정된 다단계 합성(예를 들어, 소 분자, 펩타이드 및 핵산 합성), 고체 합성, 방사성 동위 원소 합성 등을 포함한 다양한 합성들을 위해 사용될 수 있다. 마지막으로, 본 발명의 장치는 시료들의 정제 및 증균을 위해 사용될 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 명세서에서 설명하는 본 발명의 실시예들은 혈액 시료의 응집 및 혈소판 기능을 분석하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 혈액 응고를 분석하는 데 사용될 수 있는 장치 및 방법을 제공한다. 상기 방법은 피험자로부터의 혈액 유체를 적어도 두 개의 패치와 접하게 하는 단계를 포함하고, 상기 패치들의 각각은 피험자로부터의 혈액 유체와 접하게 될 때 응집 경로를 개시할 수 있는 자극 재료를 포함한다. 하나의 패치의 상기 자극 재료는 다른 하나의 패치의 자극 재료와는 다르며, 또는, 상기 하나의 패치의 상기 자극 재료의 농도는 상기 제2 패치와는 다르며, 또는 하나의 패치는 다른 하나의 패치와는 다른 표면 영역을 갖고, 또는 하나의 패치는 다른 하나의 패치와는 다른 형상을 갖고, 하나의 패치는 다른 하나의 패치와는 다른 크기를 갖는다. 상기 방법은 어느 패치가 상기 피험자로부터의 혈액 유체의 응집을 개시하는지를 결정하는 단계를 포함한다. 본 발명은 모든 표준 응집 및 혈소판 기능 분석을 위해 사용될 수 있다. 미세 유체 장치에서의 응집 및 혈소판 기능을 분석하기 위한 기술들은 국제 특허 출원 PCT/US07/02532 (국제 공개 번호WO 2007/089777)에 개시되어 있으며, 이는 본 명세서에 참고로 원용된다.
일부 실시예들에서, 상기 장치는 양 또는 음의 제어로서 사용되는 영역들을 포함할 수 있다. 양의 제어를 행하기 위해, 상기 장치 상의 다른 영역들에서 테스트 받을 검체를 상기 제어 영역들에 사전 로딩할 수 있고, 상기 장치가 전술한 바와 같이 이동할 때, 측정할 시료와 동일한 방법을 이용하여, 사전 로딩된 상기 검체는 반응에 노출되고 검출된다. 양의 제어가 예상 결과를 제공하지 못하면, 이는 상기 장치의 부적절한 저장이나 사용을 의미할 수 있다. 마찬가지로, 검체를 포함하지 않는 음의 제어 영역들을 준비할 수 있으며, 이는 분석을 위한 시약에 노출되는 경우 어떠한 신호도 제공하지 않을 것으로 예상된다. 또한, 추가 검증 제어를 이용하여 분석의 무결성을 결정할 수 있다. 본 발명의 기술들을 이용함으로써, 검체의 알려져 있는 양 X를 상기 검체의 미지의 양을 함유하는 시료에 첨가할 수 있고, 이어서, 추가 재료를 함유하는 시료 및 상기 미지의 양을 함유하는 원래의 시료 모두를, 동일한 방법을 이용하여, 검체 농도에 대하여, 바람직하게는 동일한 장치에 대하여 분석하여, 상기 미지의 시료에 대한 Y 및 상기 검체의 첨가량을 갖는 미지의 시료에 대한 Z 결과를 제공할 수 있다. Z와 Y 사이의 차는 X이며, X로부터의 임의의 편차는 분석 시약들의 열화 등의 문제가 분석에 있음을 나타낸다.
선택 사항으로, 채색 등으로 검출가능한 물질, 예를 들어, 블랙 잉크, 또는 염료는, 상기 장치의 특정한 제어 영역들에 배치될 수 있고, 상기 장치의 다른 영역들에서의 소망하는 반응을 수행하는 데 필요한 방식으로의 상기 장치의 부분들의 이동이 상기 채색 물질을 상기 장치의 동일한 부분 또는 다른 부분 상의 다른 영역들에 노출시켜 알려져 있는 특정한 검출가능 패턴이 생성되도록 위치할 수 있다. 예상 패턴이 생성되지 않으면, 이는, 상기 장치의 부적절한 저장, 상기 장치의 누출, 또는 이동의 소망 시퀀스를 통한 상기 장치의 부분들의 불완전한 이동을 의미할 수 있다. 일부 실시예들에서, 상기 예상 패턴은 바코드이다. 상기 패턴은 인간이나 기계에 의해 판독될 수 있다.
다른 실시예들에서, 사용자는 상기 장치에 시료를 첨가하고, 하나 이상의 단계를 통해 슬라이딩을 수행하고, 검체의 존재 및 검체의 농도에 관한 정보를 전달하는 영역들의 패턴으로서 판독을 얻는다.
농도를 측정하는 한 방법은 많은 분석들을 서로 다른 응답 특성들로 멀티플렉싱한 후 통계를 이용하여 예상 값과 신뢰도 구간을 계산하는 것을 이용한다. 이는 디스크에 대한 RAID로 행해지는 바와 같이 컴퓨터 산업에서 사용되는 방안 및 잠재적으로 결함있는 많은 칩들을 사용하여 수퍼컴퓨터를 구축하는 HP 방안과 유사하다.
다른 방안으로, 각 영역이 다른 임계 응답을 나타내도록 서로 다른 영역들에서의 반응을 설정할 수 있다. 즉, 각 영역은 상기 검체에 대한 다른 민감성을 갖는다. 예를 들어, 소정의 검체에 있어서, 영역들의 세트들을 설정하여, 예를 들어, 농도가 4개 영역의 세트들로 나누어지는 16개 영역의 어레이를 초과할 때에만 응답을 제시할 수 있고, 예를 들어, 4개의 영역이 형성될 수 있고, 각 세트는 예를 들어 20, 25, 30, 또는 35개의 농도 단위가 존재하는 경우에만 응답을 제시한다. 시료를 16개 영역 내로 도입한 후, 예를 들어, 상기 시료가 실제로 27개의 농도 단위에서 상기 물질을 함유하는 경우, 20 및 25개의 농도 단위의 임계값을 갖는 모든 영역들이 응답하고 30 및 35개의 농도 단위의 임계값을 갖는 영역들은 응답하지 않는다면, 상기 농도는 25 내지 30개의 농도 단위 범위에 있는 것으로서 높은 신뢰도로 보고될 수 있다. 이러한 응답 패턴으로부터 연속적으로 더욱 멀리 벗어나게 되면, 보고 결과에서는 신뢰도가 연속적으로 낮아지게 된다.
임계 응답을 생성하기 위한 메커니즘은 국제 특허 출원 PCT US2008/071374, PCT /US07/02532, 및 PCT/US08/71370에 개시되어 있으며, 이들 모두는 본 명세서에 참고로 원용된다. 상기 장치의 일 실시예에서, 상기 장치의 플레이트의 제1 영역은 분석할 시료를 포함한다. 상기 장치의 기판의 제2 영역은 캡쳐 영역을 포함한다. 상기 캡쳐 영역은 상기 임계 레벨 바로 아래의 상기 검체의 양을 캡쳐할 수 있는 물질을 함유한다. 검출 임계는 상기 캡쳐 영역에서 검체를 캡쳐할 수 있는 물질의 양에 의해 설정된다. 예를 들어, 상기 캡쳐 물질은 표면 또는 비드 결합 항체, 앱타머, 또는 상기 검체를 위해 선택가능한 기타 분자일 수 있다. 상기 장치는 분석할 상기 시료를 상기 캡쳐 영역에 노출하도록 미끄러진다. 비드들이 사용된다면, 멤브레인을 상기 기판과 상기 플레이트 사이에 배치하여 상기 기판과 상기 플레이트가 상기 캡쳐 영역 밖으로 이동하는 것을 방지할 수 있다. 교환이 가능한 충분한 시간이 경과한 후에, 상기 장치는 다시 미끄러져 분석할 상기 시료가 상기 기판 상에 배치된 교환 영역에 노출된다. 상기 교환 영역은 상기 검체에 의해 배치될 수 있는 결합된 촉매를 함유한다. 상기 촉매는, 예를 들어, 비드 또는 표면 결합 항체 또는 앱타머에 의해 결합될 수 있는 기능화된 금 나노입자일 수 있다. 촉매는 상기 캡쳐 영역의 용량이 초과하면 상기 교환 영역에만 배치되어, 상기 검체가 상기 교환 영역 위로 전달된다. 이어서, 상기 장치는 상기 제1 영역에서 노출되어 배치된 촉매에 다시 미끄러져 상기 기판 상에 위치하는 검출 영역으로 미끄러진다. 상기 검출 영역은 검출가능 신호를 생성하도록 상기 촉매가 존재하는 경우에 반응하는 물질을 함유한다. 예를 들어, 상기 촉매가 기능화된 금 나노입자이면, 상기 검출 영역은 두 개의 영역으로 구성될 수 있고, 하나의 영역은 예를 들어 은(I)을 함유하고 나머지 하나의 영역은 히드로퀴논 등의 환원제를 함유한다. 이러한 두 개의 영역은 촉매를 함유하는 상기 제1 영역이 상기 두 개의 영역 위로 미끄러질 때까지 서로 노출되지 않도록 위치할 수 있다. 일단 상기 두 개의 영역이 모두 촉매에 노출되면, 상기 금 나노입자는 은의 환원을 촉매화하여 검출가능 은 금속을 형성하게 된다. 당업자에게는, 상기 프로세스의 각 단계에서, 반응이 발생하기 위한 충분한 시간 동안 상기 장치를 제 위치에 두어야 하며, 예를 들어, 이러한 시간이 더 길어지거나 짧아지지 않도록 확산을 고려하여 상기 장치의 치수와 기타 특성을 최적화할 수 있다는 점이 명백할 것이다.
일부 실시형태에서, 농도의 측정은 강도 또는 강도에 도달하기 까지의 시간을 측정함으로써 이루어질 수 있다. 시간 분해능은 자동 또는 수동으로 가능하다. 가시적 검출 또는 광도 검출에 대하여, 장치는 임의의 시점 또는 시간에서 획득하여야 하는 이미지 또는 검사되는 테스트 영역을 제어하기 위한 또는 신호를 제공하기 위한 타이머를 구비하는 컴퓨터를 포함한다.
장치는 타이머 구역을 선택적으로 포함할 수 있다. 타이머 구역은 장치가 하나의 위치에서 다른 위치로 이동하여야 하는 경우를 나타내는 표준 반응을 포함할 수 있다. 급격한 시각 천이가 발생하는 반응이 사용될 수 있다. 타이머 구역 반응은 개별 영역에서 수행되며, 반응이 적절하게 개시하는 동일 이동에 의해 개시되는 것이 바람직하다.
대안으로, 용량을 포획 지점으로 채우고, 용량의 한쪽, 한면 또는 한변에 검체를 도입하고, 검체가 분자의 확산 속도 및 검체를 갖는 물질이 용량을 통해 흘러서 검체가 용량 전체에 확산 및/또는 흐르는 것처럼 포획을 포화시키는 속도에 대하여 신속하게 결합하는 조건을 선택함으로써 농도가 기하학적으로 판정될 수 있다. 검체가 포획 지점에 결합되는 경우에 색 변화 또는 다른 검출가능한 변화가 생기면, 포획 영역의 길이 또는 크기를 측정함으로써 검체의 양의 측정값을 직접 구할 수 있다. 대안으로서, 본 명세서에 개시되고 당업자에게 명백한 바와 같이, 포획 분자의 복합체와 표지된 검체를 용량 내에 미리 형성하고, 추가된 검체를 표지된 검체로 바꾸면, 결국에는 표지된 검체가 검출된다.
본 발명은 US 2009/0069194에 개시된 것과 같은, 증폭에 기초한 기술; US 2008/0129736 및 WO 2008/063227에 개시된 PCR 반응; US 2008/0108063, US 2007/0134739, WO 2008/063227, WO 2008/043041 및 US 7,413,712에 개시된 핵산 및 단백질 표적의 분석; US 2007/0202525에 개시된 비침습성 태아 유전자 스크리닝; US 7,501,245 및 WO 06/088876에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열분석; US 2008/0107565, US 2007/0077547, US 7,122,301, US 2009/0062134 및 WO 2008/063227에 개시된 세포 기반 분석; US 2009/0068760에 개시된 바이오센서; WO 2007/081387(상기 문헌들의 전체 내용을 본원에 참조에 의해 포함함)에 개시된 고효율 스크리닝을 포함하는 대상의 게놈의 표적 폴리뉴클레오티드의 복제 횟수 변형을 판정하는 데에 사용될 수 있다. 슬립칩은 인간, 마우스, 랫, 소 및 다른 배아를 포함하는 포유동물 배아로부터 획득한 몇 개의 세포를 분석하는 데에 사용된다. 테스트는 특정 유전자 또는 유전자 돌연변이의 존재 또는 부존재를 확립하기 위한, 역전 및 결실을 포함하는 염색체 이상의 검출을 포함하는 유전자 테스트를 포함할 수 있다. PCR, FISH, 전체 게놈 증폭 및 비교 게놈 교잡법(comparative genomic hybridization) 및 다른 기술을 슬립칩에 사용할 수 있다. 테스트는 유전자 치료, 시험관내 수정 및 다른 적용 예가 가능하도록 배아 선택, 배아 스크리닝, 착상전 유전자 진단에 적용될 수 있다. 테스트가 이루어질 수 있는 조건은, 낭포성 섬유증, 베타-탈라세미아, 겸상 적혈구병 및 1형 척추 근육 위축증(spinal muscular atrophy type 1), 근긴장성 이영양증(myotonic dystrophy), 헌팅턴 질환(Huntington's disease) 및 샤르코-마리-투스병(Charcot-Marie-Tooth disease); 취약 X 증후군(fragile X syndrome), 혈우병 A(haemophilia A) 및 뒤시엔니형 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy)을 포함한다. 핵산의 분석 및 증폭을 위한 PCR, FISH 및 다른 기술은 본 적용 예에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다. 슬립칩은 신생아 혈액의 빌리루빈(bilirubin) 또는 빌리루빈-알부민 복합체를 분석하는 데에 사용될 수 있다.
본 명세서에 개시된 본 발명의 실시형태는 식물 및 동물 진단법, 음식 및 수질 안전성 테스트, 생태 보전, 농업 유전학 및 인간 질환 연구 등과 같은 적용 예에서 실시간 PCR에 의해 유전자 발현의 PCR 기반 단일뉴클레오티드 다형성(SNP) 유전형 또는 정량적 측정에 사용될 수 있다. 예를 들어, 쇠고기, 저온살균되지 않은 우유, 병에 든 쥬스 및 오염된 하수, 및 병원체의 개별 병독성 유전자에서 발견된 병원체 E. 콜리 O157:H7이 본 발명의 장치에서의 병렬 PCR을 수행함으로써 신속하게 스크린되고 식별될 수 있다.
또한, 본 발명은 글리코시다제(glycosidases), 펩티다제(peptidases), 에스터라제(esterases), 포스파타제(phosphatases), 퍼옥시다제(peroxidases), 설파타제(sulfatases), 포스포리파제(phospholipases), 루시퍼라제(luciferases), 시토크롬 P450, 키나제(kinases), 리파제(lipases), 포스포리파제, 옥시다제(oxidases), 세크리타제(secretases), 프로테아제(protease) 및 펩티다제 등을 포함하는 효소의 활성 및/또는 효소 농도를 검증하고, 스위치 비오신쓰 및/또는 캘리포니아 칼스바드에 소재한 Life Technologies에 의해 시판되고 있는 시약 등을 사용하여 면역학적 검증을 수행하는 데에 사용될 수 있다.
상기 장치는 세척 단계 없이 면역 분석을 수행하는 데에 사용될 수 있다. 예를 들어, 도 15에 부분도로서 나타낸 일 실시형태에서, 장치(10)의 플레이트(14)는 영역 A와 선택적으로 영역 B, C, D 및 E를 포함하는데, 이들 모두는 적절한 시약 또는 비드(bead)로 사전 로딩된다. 제1 위치에서, 검체를 포함하는 시료는 하나 이상의 영역 A에 로딩된다. 항-검체 포획 항체는 반대쪽 베이스상의 영역 F에 로딩된다. 포획 항체는 고정화, 예를 들어 비드 또는 영역 F의 표면 상에 고정될 수 있다. 기판과 플레이트가 서로에 대하여 제2 위치로 이동하면, 영역 F 는 영역 A에 노출되고, 검체 분자는 포획 항체에 결합한다. 선택적인 제3 위치에서, 영역 F는 영역 B에 노출된다. 영역 B는 잠재적인 간섭 분자를 제거하는 데에 도움이 되는 완충액 및/또는 다른 시약을 포함한다. 제4 위치에서, 영역 F는 검출 항체를 포함하는 영역 C에 노출된다. 검출 항체는 검체에 강하게 결합하도록 선택된다. 검출 항체는 효소로 표지될 수 있다. 대안으로서, 특정의 면역 분석 구성에 따라, 형광 태그 또는 그외 다른 태그로 표지화될 수 있거나, 표지화되지 않을 수 있다. 제5 위치에서, 영역 F는 영역 D에 노출된다. 영역 D는 검출 항체에 결합하는 항체를 포함하지만, 검출용 항체-항원 상호작용보다 약한 친화도를 갖는다. 영역 D에서의 항체는 비드 또는 영역 D의 표면에 고정될 수 있다. 영역 D의 항체는 용액으로부터 잉여의 검출 항체를 제거한다. 제6 위치에서, 영역 F는 영역 E에 노출된다. 영역 E는 검출 항체에 링크된 효소가 존재하는 경우에 생성물로 변환될 수 있는 기질 용액을 포함한다. 이 단계는 몇몇 면역 분석 구성에 대해 임의 선택적이다. 전형적으로, 각각의 위치에서, 영역 F는 영역 A, B, C, D 및 E 중 하나의 영역에만 노출된다. 장치는 하나의 시료 또는 다수의 시료에 대해 이러한 면역 분석을 수행하도록 또는 하나의 시료 또는 다수의 시료에 대하여 이러한 여러 많은 면역 분석을 수행하도록 구성될 수 있다.
장치는 시료 제조 및 시료 저장을 수행하는 데에 사용될 수 있다. 예를 들어, 장치는 여과를 사용하여 혈액으로부터 세포를 제거하고, 혈액 시료를 보존하기 위해 시약을 첨가하는 데에 사용될 수 있다. 혈장은 하나 이상의 제1 영역 및/또는 덕트로 이루어진 장치 내의 입력 용량에 혈액을 도입함으로써 장치를 사용하여 혈액으로부터 여과될 수 있다. 입력 용량은 멤브레인에 의해 입력 용량으로부터 분리된 하나 이상의 제2 영역에 노출됨으로써, 혈장 중의 몇몇 또는 모두가 멤브레인을 통해 하나 이상의 제2 영역으로 통과한다. 잉여의 혈장은 하나 이상의 제2 영역에 노출되지만 입력 용량에는 직접 노출되지 않은 하나 이상의 제3 영역에 수집될 수 있다. 선택적으로, 동일한 장치에서, 하나 이상의 제2 영역은 앞서 설명한 바와 같이 혈장으로 충전될 수 있으며, 다른 하나 이상의 제4 영역은, 예를 들어 방해가 되는 멤브레인을 통해 또는 멤브레인 없이 노출에 의해 전체 혈액으로 채워질 수 있다.
영역을 혈장으로 채운 후에, 영역은 다양한 반응 및 조작에 사용될 수 있다. 예를 들어, 장치의 일부분의 상대적 이동을 사용하여, 하나 이상의 제2 영역을 추가의 영역에 노출시킬 수 있으며, 혈장은 시트르산염(citrate) 또는 EDTA의 첨가에 의해 보전되어 응고를 방지할 수 있다. 다른 보존제 또는 시약을 마찬가지로 첨가해도 된다. 전체 장치는 분석을 위해 저장되고 수송된다. 분석을 위해, 혈장의 일부 또는 모두는 영역으로부터 제거될 수 있으며, 장치 외의 다른 분석에 사용될 수 있다. 또한, 혈장을 포함하는 하나 이상의 영역이 추가의 위치로 이동해서 추가의 분석을 수행할 수 있다. 이러한 분석은 장치의 추가의 영역에 사전 로딩된 시약을 사용하여 이루어질 수 있다. 이러한 분석은 사용자가 첨가한 시약을 사용해서도 수행될 수 있으며, 이러한 방법은 분석에 앞서 즉각적으로 첨가하는 것이 용이하고 사전 로딩이 어려운 시약을 포함하는 분석의 경우에 유리하다. 선택적으로, 분석은 시료 수집의 시간에서 또는 나중에, 예를 들어 외부 온도가 더 용이하게 제어되거나 외부 검출기를 이용할 수 있는 설정 시점에서 장치 상에서 수행될 수 있다.
장치는 샘플링을 위한 화학 전극 (chemistrode)과 함께 및/또는 이를 포함해서 사용될 수 있다(참조: Chen, 등, PNAS, November 4, 2008, vol. 105, no. 44 16843-16848; Keats, J., “Jargon Watch,” Wired Magazine 17.03, 2/23/09; Armstrong, G., Nature Chemistry (14 Nov 2008), doi: 10.1038/nchem.89, Research Highlights.).
하나의 장치를 사용해서, 한 명의 환자로부터 얻은 시료에 대하여 단일의 분석 또는 다수의 분석을 저장 및/또는 수행하거나, 또는 다수의 환자로부터의 시료에 대해 하나의 분석 또는 다수의 분석을 저장 및/또는 수행할 수 있다. 다른 유형의 시료 제조 및 저장을 수행할 수 있는데, 예를 들면 다른 체액 또는 환경 시료를 제조 및 저장하는 데에 사용될 수 있다. 추가로, 장치(10)의 일실시형태에 의한 영역(18, 22), 덕트(26) 또는 영역(18, 22) 및 덕트(26)의 조합은 분리 경로 또는분리 영역을 구성할 수 있다. 분리는 겔 및 모세관 전기영동, 유체 역학적 분리, 여과, 원심분리에 의한 분리, 자기적 및 광학적 힘에 기초한 분리를 포함하는 전위, 크로마토그래피를 사용하여, 본 기술분야에 주지된 방법으로 실행될 수 있다. 단백질 및 핵산, 거대 분자, 입자 및 세포를 포함하는 분자를 포함하는 다양한 종이 분리될 수 있다. 이러한 분리 경로 또는 영역에 대해 언급하고 있는 특허 문헌 및 공개 문헌의 예로는 미국특허 5,707,850; 5,772,889; 5,948,624; 5,993,631; 6,013,166; 6,274,726; 6,436,292; 6,638,408; 6,716,642; 6,858,439; 6,949,355; 및 미국공개특허 제 2002/0076825가 있다. 이들 특허 문헌 및 출원의 내용을 본원에 참조에 의해 포함한다.
슬립칩에 멤브레인이 포함될 수 있다. 예를 들어, 칩상에 거대 분자를 집중시키기 위해, 예를 들어 거대 분자 및 단백질 결정을 위해 투석 멤브레인이 사용될 수 있다. 멤브레인은 다른 분리, 예를 들어, 혈액 세포를 포함하는 개별 세포를 분리하는 데에 사용될 수 있으며, 혈액 및 다른 생용량 유체의 성분을 분리시키는 데에 사용될 수 있다.
2개의 플레이트를 서로에 대하여 미끄러지도록 하는 것은 분리 경로 또는 영역의 분리, 분리된 생성물의 포획, 분리 경로 또는 영역에 시약을 투입하여 검출하는 것, 가시화 또는 분석 등의 변환을 수행하는 데에 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 슬립칩은 2개의 단계 반응에 사용될 수 있다. 예를 들어, 제1, 제2 및 제3 위치 사이에서 이동할 수 있는 슬립칩은 하나 이상의 제1 영역이 제2 위치에서 하나 이상의 제2 영역 에 중첩되고, 제1 영역이 제3 위치에서 중첩되는 하나 이상의 제3 영역보다 제2 영역이 더 작도록(예를 들어, 10분의 1 또는 20분의 1의 크기) 된 영역을 갖도록 구성될 수 있다. 이러한 장치는 2-단계 단백질 결정화 실험에 사용될 수 있다. 하나 이상의 제1 영역은 결정화할 단백질로 채워진다. 하나 이상의 제2 영역은 핵 형성, 예를 들어 더 높은 농도의 침전제, 또는 메틸-β-사이클로덱스트린 용액 또는 세정제를 제거할 수 있는 다른 물질의 용액을 유도할 것으로 예상되는 물질로 미리 채워지거나 사용자가 채운다. 하나 이상의 제3 영역은, 예를 들어 낮은 농도의 침전제를 포함할 수 있다. 칩을 사용하기 위하여, 먼저 영역들이 채워질 것이다. 이후, 장치를 핵형성을 위해 제1 위치로 이동시키고, 그 위치에서 핵형성을 유도하기에 충분한 시간 동안 유지하거나 제1 위치를 가로질러 연속해서 이동되도록 해서, 제1 영역 및 하나 이상의 제2 영역이 핵형성을 유도하기에 충분한 시간 동안 접촉하도록 한다. 이 시간은, 예를 들어 1초, 30초, 또는 5분이 될 수 있다. 이후, 장치는 제3 위치로 이동하게 될 것이다. 작은 크기의 하나 이상의 제2 영역은 시료가 대량으로 희석되는 것을 방지한다.
일부 실시형태에서, 사용자가 로딩한 슬립칩은 다수의 혼합 비율로 시료를 상이한 다수의 시약과 혼합함으로써 다중화된 나노리터 규모의 실험을 수행하는 데에 사용될 수 있다. 혼합 비율은 형광 염료를 희석함으로써 정해지는데, 혼합된 영역의 각각의 용량에 의해 조절될 수 있다. 이러한 슬립칩 설계는 48개의 상이한 시약에 대하여 유비저균( Burkholderia pseudomallei )으로부터 가용성 단백질, 글루타릴-CoA 디하이드로게나제의 결정화 조건을 스크린하는 데에 사용되었으며, 각각의 시약은 12 nL 이하의 스케일에서 총 528번의 결정화 실험 동안 11개의 상이한 혼합 비율로 테스트하였다. 이러한 실험은 3개의 동일한 슬립칩 장치를 사용하여 행해졌으며, 각각 16개의 상이한 시약을 스크리닝하였다. 총 단백질 시료의 사용은 10 μL 이하였다. 결정화 조건이 성공적으로 확인되었다. 결정화 실험은 슬립칩에서 확인된 조건을 사용하여 플레이트에서 성공적으로 규모를 증가시켰다. 결정은 X선 회절에 의해 특징이 결정되며, 상이한 스페이스 그룹과 종래의 방법에서 취득한 구조보다 높은 용해도에서 단백질 구조가 제공되었다. 사용자가 로딩한 슬립칩은 점도 및 표면 장력 등의 다양한 물리 화학적 특성의 유체를 취급한다. 형광 강도의 정량적 측정 및 높은 용해도의 이미징은 이러한 유리 슬립칩에서 수행하도록 간단하게 하였다. 플러그에 기초한 결정화에서 사용된 플루오르화된 윤활 유체와 유사한 플루오르화된 윤활 유체를 사용하여 조절하였다. 이러한 방식은 단백질 결정화를 넘는 다수의 영역, 특히 효소 동역학 및 혈액 응고, 세포 기반 분석, 및 화학 반응을 포함하는 액적에 기초한 미세 유체 체계가 성공했다고 증명된 영역에서 사용될 수 있다.
특정 실시예에서, 슬립칩은 시료를 많은 여러 상이한 시약과 많은 상이한 혼합 비율로 혼합하여, 다중화된 나노리터 규모의 실험을 사용자가 로딩하는 형태로 수행하는 데에 사용될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 이것은 특별한 유체 처리 장비 등의 슬립칩 외부 장비를 필요로 하지 않고도 행해질 수 있다. 다중화된 실험은 생물학적 분석, 화학적 합성, 단백질 합성의 영역과 화학적 공간이 널리 사용되는 임의의 영역에서 공통이다. 본원에 참조에 의해 포함되는 미국특허 61/162,922는 슬립칩의 추가의 특징과 실시형태를 설명하고 있다. 화학적 공간의 광범위한 조사는 이러한 처리를 더 생산적으로 하며 또한 화학적 폐기물의 양을 줄이기 위해, 시료의 사용량을 줄이고 실험을 더 신속히 할 수 있다는 장점을 가진다. 미세 유체 기술은 고 처리량(high throughput) 스크리닝에 대한 능력과 나노리터 및 더 작은 규모에서 유체를 조작할 수 있는 능력을 갖는다. 이러한 용도를 위해 다양한 미세 유체 체계가 개발되었지만, 이들 체계는 펌프, 밸브 또는 원심 분리기를 필요로 하는 경우가 있다. 슬립칩에 대한 특정 실시예는 펌프 또는 밸브가 없는 다중화된 미세 유체 반응 및 그 동작을 수행하는 데에 사용될 수 있으며, 특정 실시예에서는 시료를 칩에 피펫팅하고, 사전 로딩된 시약과 시료를 혼합하며 반응을 개시하도록 칩의 하나의 부분을 서로에 대해 미끄러지도록 하면 된다 (슬립칩을 미끄러지도록 구성하는 추가의 예시적인 수단에 대해서는, Chung 등의 Lab Chip, 2009년 9월, 페이지 2845 - 2850에 설명되어 있으며, 이는 그 전체 내용을 본원에 참조에 의해 포함한다). 슬립칩의 특정 실시예에서, 시료를 사전 로딩된 시약과 혼합한다. 특정 실시예에서, 중앙 집중식 설비에서 시약을 칩에 사전 로딩하고 칩을 연구자에게 배분하는 것은 사용자의 실험을 매우 단순하게 한다는 점에서 장점이 있다. 특정 실시예에서, 슬립칩은 시약으로 사전 로딩되어서는 안 된다. 본 발명자들은 슬립칩이 많은 상이한 시약으로 많은 상이한 혼합 비율로 다중화된 나노 규모의 실험을 수행하는 데에 사용하여, 구역적 규모의 화학적 공간의 검사가 가능하게 될 수 있다는 것을 증명하였다.
본 발명자들은 이 방식을 가용성 단백질의 결정화를 위한 조건을 스크리닝하는 데에 사용했다. 단백질의 결정화를 얻는 것은 분자 레벨에서 이들의 구조를 해결하고 이들의 기능을 해명하는 것에 대한 병목 중의 하나가 남는다. “회절-품질” 결정을 얻기 위해서는 다양한 농도에서 다수의 침전제의 높은 처리율의 스크리닝을 필요로 하는데, 예를 들어 수백 또는 수천번의 결정화 실험을 수행하는 것이다. 나노리터 및 피코리터 용량을 정확하게 처리하기 위해 밸브 또는 액적을 이용하는 미세 유체 기술이 개시되어 있으며, 단백질의 결정화에 적용되어 왔다. 이들 2가지 방식은 단백질을 성공적으로 결정화하지만, 대부분의 개별 실험실에서는 마이크로리터의 용액을 96개의 웰 플레이트에 피펫팅함으로써 결정화 실험을 설정하고 있으며, 여전히 단순하고, 저렴하며, 신속하고, 조절가능한, 단백질의 결정화를 위한 시스템이 필요하다고 제안하고 있다. 여기에서는 이러한 기준을 만족시키는 사용자가 로딩한 슬립칩의 실시형태를 설명한다.
사용자가 로딩한 슬립칩의 일부 실시형태에서, 슬립칩의 2개의 플레이트가 정렬되는데, 시료 영역과 시료 덕트가 연속하는 유체 경로를 형성하도록 정렬되며, 시약 영역과 시약 덕트가 오프셋되도록 정렬된다. 시료는 시료 영역(상부 플레이트)을 시료 덕트(바닥 플레이트)에 중첩함으로써 형성된 연속하는 유체 경로를 통해 로딩될 수 있다. 장치는 시약 영역(바닥 플레이트)와 시약 덕트(상부 플레이트)가 정렬되도록 슬립될 수 있다. 시약은 시약 영역과 시료 영역을 중첩함으로써 형성된 개별의 유체 경로에 로딩될 수 있다. 장치는 초 단위로 슬립될 수 있으며, 상부 플레이트의 시료 영역은 바닥 플레이트의 시약 영역에 노출된다. 로딩되는 시약 및 시료의 순서는 사용자가 정해도 된다.
본 발명의 일 실시형태에서, 슬립칩은 12 nL 이하의 규모에서 총 176번의 실험에서 11개의 혼합 비율로 16개의 상이한 침전제에 대하여 단백질 시료를 스크리닝하는 데에 사용되었으며, 모든 실험에서 단백질 시료의 3.5 μL만을 필요로 한다. 슬립칩은 시약에 대한 16개의 분리 유체 경로를 포함하며, 각 경로는 11개의 영역이 있고, 단백질 시료에 대한 단일의 연속하는 유체 경로는 176개의 영역을 가진다. 슬립칩의 몇몇 실시형태에서, 시약의 유체 경로에 대한 입구는 다중채널 피펫터 내의 팁의 간격과 96개의 웰 플레이트의 영역의 간격을 부합하도록 하는 방식으로 간격을 형성하였다. 이러한 슬립칩은 2개의 플레이트를 포함한다. 상부 플레이트는 시약에 대해 별개의 입구를 포함하고, 시료에 대해서는 덕트를 포함하며, 시약에 대해서는 영역을 포함한다. 바닥 플레이트는 상부 플레이트상의 입구, 시료를 위한 영역 및 출구에 접속된 시약을 위한 덕트를 포함한다. 2개의 플레이트는 윤활 유체로 된 층에 의해 분리되었다. 이를 위해, 발명자들은 플루오르화 탄소, 퍼플루오로-트리-n-부틸아민 및 퍼플루오로-디-n-부틸메틸아민 (FC-40)의 혼합물을 사용하였다. 먼저 2개의 플레이트를 조립하면, 상부 플레이트의 시약을 위한 입구 및 영역은 바닥 플레이트의 시약을 위한 덕트의 상부에 정렬되었다. 이러한 방향에서, 각각의 시약은 입구로 피펫되었으며, 덕트를 통해 흐르고, 영역을 채웠다. 시약을 로딩한 이후, 칩의 상부 플레이트를 새로운 방향으로 “슬립”하였고, 이 상부 플레이에 있는 시료의 덕트는 바닥 플레이트에 있는 시료를 위한 영역의 상부에 정렬되었다. 이러한 배향에서, 시료는 입구로 피펫되었으며, 덕트를 통해 흐르고, 영역을 채웠다. 시료와 시약을 모두 로딩한 이후, 칩의 상부 플레이트는 다시 시약을 위한 영역이 시료를 위한 영역의 상부가 되는 위치로 슬립되며, 시약과 시료 사이의 상호작용을 확산에 의해 개시하였다.
사용자가 로딩한 슬립칩의 일 실시형태에서, 상부 플레이트는 출구 덕트, 시약 입구, 시료 덕트에 위치한 시료 입구, 및 시약 영역을 포함하고 있다. 바닥 플레이트는 시약 덕트와 정렬된 출구와 시료 영역을 포함하고 있다. 상부 플레이트와 바닥 플레이트를 조립하고, 플루오르화 탄소로 채워서, 사용 준비가 된 슬립칩을 만들었다. 이러한 방향에서, 연속하는 유체 경로는 시약 입구, 시약 영역 및 출구에 의해 형성되었다. 시약은 피펫팅에 의해 도입되었다. 시약은 연속하는 유체 경로를 통해 흐르고 시약 영역을 채웠다. 칩은 제2 위치로 슬립될 수 있다. 이러한 제2 위치에서, 연속하는 유체 경로는 시료 입구, 시료 덕트 및 시료 영역으로 형성되었다. 시료는 피펫팅에 의해 도입될 수 있다. 시료는 연속하는 유체 경로를 통해 흐르고 시료 영역을 채웠다. 칩은 다시 제3 위치로 미끄러질 수 있으며, 이 위치에서 시약 영역은 시료 영역의 상부에 정렬되었으며, 정렬된 영역에 있는 시료와 시약이 확산에 의해 혼합되었다.
특정 실시예에서, 미끄러지는 단계 동안, 시약 용액의 바람직하지 않은 박막이 슬립칩의 2개의 플레이트 사이에 형성될 수 있다. 이러한 박막은, 특정 실시예에서, 시약을 위한 덕트와 시약을 위한 영역이 분리된채로 유지하는 것이 아니라, 이들을 연결한다. 상기 미끄러지는 단계 이후의 교차 오염은 윤활 유체에 의해 측정된, 슬립칩의 플레이트와 용액(시료 또는 시약) 사이의 접촉각(contact angle)을 제어함으로써 최소로 할 수 있다. 발명자들은 특정 실시예에서 사용된 윤활 유체, 즉 플루오르화 탄소(FC)에 의해 접촉각을 측정하였으며, 특정 실시예에서 ~ 130°를 넘는 접촉각이 교차 오염을 최소로 하는 데에 바람직하다고 판정했다. 이를 확인하기 위하여, 발명자들이 계면 활성제를 포함하지 않고 접촉각이 139°인 시약의 용액을 로딩한 경우, 시약은 상기 제1 슬라이딩 단계 이후에 슬립칩의 플레이트 사이에서 트랩되지 않았다. 바람직한 접촉각은 제2 슬라이딩 단계에 대해서도 동일한 것을 알게 되었으며, 발명자들이 시료 용액에 계면 활성제를 첨가한 경우, 접촉각은 110°까지 감소했으며, 계면 활성제 용액의 박막이 슬립칩의 2개의 플레이트 사이에 트랩되었다. 특정 실시예에서 이 문제를 최소화하기 위해, 발명자들은 접촉각을 154°까지 증가시키는 플루오르화된 에틸렌 프로필렌(FEP)으로 이루어진 얇은 층으로 플레이트를 스핀 피복하였다. 스핀 피복 이후에, 슬립 단계는 교차 오염 없이 수행되었다.
이러한 슬립칩의 실시형태를 사용하여, 발명자들은 용량을 조절하였으며, 이에 따라 각각의 실험에서 혼합된 시료와 시약의 혼합 비율을 조절하였다. 발명자들은 2개의 영역을 결합하기 위해 슬립에 의해 생성된, 실험의 총 용량이 항상 12 nL 이하가 되도록 하고, 각 실험에서의 시약과 시료가 혼합 비율은 용량이 0.67:0.33 에서 0.33:0.76까지, 이들 사이의 비율이 균일한 간격을 갖도록 변화되었다.
시료로서 형광 염료 용액을 사용하고 시약으로서 완충액 용액을 사용하는 실험 결과는, 이러한 설계가 11개 영역의 각각에서의 조절된 혼합 비율이 되었다는 것을 확인해 주고 있다. 실험으로부터의 시료의 상대적인 농도와 예측된 농도 사이의 관계는 양호한 부합을 나타낸 설계에 기초했으며, 실험과 예측된 농도 사이의 불일치는 하나의 영역을 제외한 모든 영역에서 10% 이하였다.
본 발명의 일 실시형태에서, 슬립칩은 형광 염료 용액을 함유하는 바닥 플레이트에 시료를 위한 영역을 가지며, 완충 용액을 함유하는 상부 플레이트에 시약을 위한 영역을 구비하였다. 각각의 영역은 서로 다른 크기이며, 상이한 용액 용량을 유지하였다. 영역은 8 nL(0.67의 상대적 용량) 내지 4 nL(0.33의 상대적 용량)까지의 범위로 하였다. 시약과 시료를 혼합하도록 칩을 미끄러지면, 실험의 총 용량은 항상 12 nL이었다. 실험으로부터 희석된 시료의 상대적 농도의 그래프는 실험 및 예측된 농도 사이의 양호한 일치(경사도 = 0.98; R2 = 0.9938)를 나타낸 계획된 용량에 기초하여 예측한 상대적 농도와 관련시켜 작성하였다. 농도는 형광 세기의 측정으로부터 추론되었다. 상이한 불일치 값을 가진 영역의 수의 히스토그램을 작성하였다. 이 불일치는 실험 결과와 예측된 농도 사이의 농도 퍼센트 차로서 계산되었으며, 영역의 제조시의 오차 및 편차, 영역의 충전, 슬립, 및 강도의 측정을 고려하였다.
발명자들은 블라스토클로리스 비리디스(Blastochloris viridis)로부터 광합성 반응 중심(RC)인 모델 멤브레인 단백질의 결정화로 이러한 방식을 사용하여 시약 농도의 가변성을 확인하였다. 7번 실험을 반복했으며, 침전제(40 mM NaH2PO4/Na2HPO4에서의 3.2 M (NH4)2SO4, pH 6.0) 및 RC의 11개의 상이한 혼합 비율 슬립칩에 대해 수행하였으며, 증식하였다. 상이한 혼합 비율은 슬립칩의 열에 랜덤하게 배치하였다. 즉, 혼합 비율의 간격이 균일하게, 0.67 단백질에 대해 0.33 침전제의 혼합 비율로 시작하고 0.33 단백질에 대해 0.67 침전제의 혼합 비율로 종료하는 대신에, 영역은 상대적인 침전제 농도와 관련해서, 왼쪽에서 오른쪽으로 다음의 순서로 배치하였다: 0.33, 0.63, 0.4, 0.57, 0.47, 0.5, 0.53, 0.43, 0.6, 0.37, 및 0.67. 이러한 배열은 시스템적으로 한쪽에서 다른 쪽으로 왜곡시킬 수 있는 제조 또는 증발에서의 임의의 아티팩트가 혼합 비율의 효과로부터 용이하게 구분될 수 있도록 선택하였다. 이러한 배열은 또한 인접한 2개의 영역 사이의 거리를 유사하도록 유지하고, 덕트 길이를 영역 크기와 유사하도록 유지하며, 슬립칩의 제조를 더 단순하게 한다. 취득한 결과는 상이한 혼합 비율이 슬립칩의 열을 가로질러 순차적으로 배열되었을 때와 동일하였다. 이것은 제조 또는 증발에 의한 어떠한 효과도 최소가 되는 것을 나타낸다.
결정화의 작용에 대한 이해를 돕기 위하여, 발명자들은 침전제의 증가하는 농도의 순서로 영역의 현미경 사진을 디지털로 재구성하였다. 0.33: 0.67에서 0.43:0.57까지의 단백질에 대한 침전제의 혼합 비율에서, 7번의 실험 중 어느 것도 단백질 결정을 형성하지 못했다. 0.47: 0.53의 혼합 비율에서, 하나의 실험이 단백질 결정을 형성했으며, 에서는 4번의 실험이 단백질 결정을 형성하였다. 0.53:0.47, 0.57:0.43 및 0..4의 혼합 비율에서, 총 7번의 실험이 단백질 결정을 형성했다. 0.63:0.37의 혼합 비율에서, 총 7번의 실험이 침전물을 형성했다. 0.67:0.33에서는, 2번의 실험이 단백질 결정을 형성했으며, 남은 5번의 실험에서는 침전물이 형성되었다. RC의 결정화는 침전제 농도에 민감하게 영향을 받는 것을 알게 되었다. 침전제의 상대적 농도를 증가시킴에 따라, 결정화에 대한 용액에 남아 있는 단백질로부터 침전으로 천이되는 것을 관찰하였다. 단백질 농도를 감소시키면, 핵 형성이 어느 정도까지 감소하는 것으로 관찰되었다. 결정화 결과는 혼합 비율과 단조적이지 않으며, 더 큰 단일의 결정의 구역이 미세 결정의 구역에 의해 분리되었다. 본 명세서에 개시된 7번의 실험에 대해 7개의 행이 사용된 것에 추가로, 이러한 칩에 대하여, 2개의 열이 의도적으로 왼쪽으로 블랭크되었으며, 추가의 7번의 실험이 더 높은 침전제 농도에서 수행되었다.
발명자들은 단일의 사용자가 로딩한 슬립칩에 대하여 많은 상이한 혼합 비율에서 많은 상이한 시약을 사용하여 단백질 시료의 결정화를 위한 조건을 스크리닝하였다. 발명자들은 유비저균(Burkholderia pseudomallei)으로부터 표적: 글루타릴-CoA 디하이드로게나제(glutaryl-CoA dehydrogenase)로서 가용성 단백질을 선택하였다. 단백질 시료는 Seattle Structural Genomics Center for Infectious (SSGCID) 로부터 구입했다. 20% (w/v) PEG-3000, 0.1M HEPES pH 7.5, 0.2M NaCl (PDBid 3D6B)를 사용하는 조건에서의 증기 확산 조건하에서 결정을 산출하기 위해 슬립칩을 사용하지 않고 병렬로 스크리닝하였다. 이들 결정은 2.2
Figure pct00001
해상도 및 스페이스 그룹 P212121 (PDBid 3D6B)의 구조를 산출하였다. 이들 결정화 조건에 대한 어떠한 지식도 없이, 단백질은 위자드(Wizard) 스크린에 기초한 홈메이드 스크리닝 키트로부터 48개의 상이한 시약에 대한 슬립칩의 실시형태에 대하여 단백질을 스크리닝하였다. 각각의 시약에 대하여, 단백질 시료 및 시약의 11개의 상이한 혼합 비율을 상기 설명한 바와 같이 0.33:0.67 내지 0.67:0.33 의 범위로 하여 스크리닝하였다. 스크린은 단백질의 결정화를 위한 2가지 조건을 성공적으로 확인하였다. 이들 결과로부터, 45% (w/v) PEG-400, 0.2 M MgCl2 및 0.1 M Tris, pH 7.8를 가진 0.57:0.43의 혼합 비율 및 30% (w/v) PEG-8000 및 0.1 M Hepes, pH 7.8를 가진 0.67:0.33 혼합 비율의 최적의 조건을 선택하였다. 후자의 조건은 SSGCID에서 통상적인 기술을 사용함으로써 식별된 것과 유사하지만 동일하지는 않다. 이들 조건은 영역 플레이트에서 복제되며, 2가지 경우에서 결정을 얻었다. 영역 플레이트로부터의 결정은 스페이스 그룹 P21의 1.6
Figure pct00002
의 해상도와 스페이스 그룹 P212121의 2.9
Figure pct00003
의 해상도에서 각각 X선으로 회절되었다. 따라서, 발명자들은 1.73
Figure pct00004
의 해상도에서 단백질의 구조를 판정했으며, X선이 회전된 결정으로부터 더 높은 해상도 1.6
Figure pct00005
까지 수집되었으며, 발명자들은 2.2
Figure pct00006
P212121 구조에 없어지는 루프를 할당할 수 있다.
일 실시형태에서, 슬립칩은 동작을 위한 외부 장비를 필요로 하지 않는다. 예를 들어, 특정 실시예에서, 슬라이딩은 수동으로 행해질 수 있다. 특정 실시예에서, 내부 가이드는 플레이트의 서로에 대한 이동을 제한하는 데에 사용될 수 있다. 몇몇 실시예에서, 장치에서 수행되는 하나 또는 둘 이상의 반응의 결과는 특정의 장비, 셀폰의 카메라와 같이 널리 사용될 수 있는 장비를 사용해서, 또는 나안으로, 또는 바코드 스캐너를 사용하는 것과 같이 특정의 장비 없이도 판독해낼 수 있다. 특정 실시예에서, 판독은 디지털 디스플레이의 픽셀로서 작용하는 장치의 각각의 영역을 가짐으로써 가능하게 되며, 상이한 결과는 인간 및/또는 기계에 의해 인지가능한 및/또는 변역가능한 전체적으로 상이한 패턴을 만들어낸다.
본 발명의 특정 실시예에서, 사용자가 로딩한 슬립칩은 많은 상이한 시약을 기질에 대하여 상이한 혼합률로 그리고 정확한 나노리터 용량으로 스크리닝함으로써 다중화된 반응을 수행하는 데에 사용될 수 있다. 본 발명의 특정 실시예들은 특정 용도의 요건에 따라, 다수의 혼합 비율로 시약으로 사전 로딩된 또는 사용 지점에 사용자가 로딩한 연구자에게 전달될 수 있다. 유체 경로는 유체 저항을 증가시키고 모든 영역의 적절한 충전을 제공하기 위해 특별한 덕트를 포함하도록 설계될 수 있다. 이러한 방법은 많은 상이한 조건이 액적에 기초한 어레이에서 스크리닝되는 액적에 기초한 하이브리드 방법과 기능적으로 유사하다. 발명자들은 가용성 단백질을 위한 결정화의 조건을 스크리닝에서 슬립칩의 사용을 증명하였다. 단백질의 X선 회절 데이터는 결정화 조건을 웰 플레이트에 복제하고, 슬립칩에서 식별된 결정화 조건이 슬립칩의 외부에서 신뢰성있게 규모를 증가시킬 수 있는 것을 증명함으로써 취득했다. 슬립칩의 상이한 실시형태에 대한 자유 계면 확산에 의한 결정화가 수행될 수 있으며, 또 다른 실시형태에서 미세 배치와 자유 계면 확산 결정화를 병렬로 수행하기 위해 복합 슬립칩이 사용될 수 있다.
결정화에 추가로, 사용자가 로딩한 슬립칩 실시형태는 상이한 시약과 이들의 농도를 모두 테스트하는 것이 바람직한 다수의 다른 다중화된 반응 및 분석에 적용가능하다. 플루오르화된 윤활 유체는, 예를 들어 슬립칩의 특정 실시예로 표면 화학의 제어를 위해 확립된 방식을 직접 전달하는 데에 사용될 수 있다. 효소를 이용하는 것 등의 플러그 기반 시스템에서 수행되는 것과 유사한 분석 및 세포는 슬립칩의 특정 실시예에서 수행될 수 있다. 발명자들은 슬립칩의 특정 실시예를 모든 영역의 위치가 정의되는 것으로 용이하게 달성될 수 있는 이미징을 발견하였다. 사용자가 로딩한 슬립칩의 특정 실시예는 액적 기반의 방식, 특히 바이브리드 방식이 증명된 적용 예에 사용될 수 있다. 일반적으로, 사용자가 로딩한 슬립칩의 흥미를 끄는 적용예에는, 진단법, 약제 발견, 조합적 화학, 생화학, 분자 생물학 및 재료과학 등이 있다.
실시예
칩 설계 및 제조 . 슬립칩은 본 출원에서 설명된 바와 같은, 다만 이 과정에서는 45분 이하의 에칭이 60 μm 이하의 깊이를 제공하는 데에 사용된 변화를 제외하고는, 슬립칩의 유리 에칭 제조법을 사용하여 제조하였다. 액세스 홀은 0.030 인치의 직경을 다이아몬드 드릴 비트로 천공하였다. 에칭된 유리 플레이트의 표면을 밀리포아 수(Millipore water)로 세정한 다음 에탄올로 세정하고, 실란화 또는 플루오르화된 에틸렌 프로필렌 (FEP) 피복 이전에 산소 플라즈마 처리를 행하였다.
스핀 피복 FEP . FEP (TE-9568, Dupont)의 수용성 에멀전을 사용 전에 밀리포아 수로 4번 희석하였다. 슬립칩 장치를 플라즈마 세정한 다음, 용액을 플라스틱 피펫을 사용하여 장치 상에 균일하게 확산시켰다. 스핀 피복의 경우, 스핀의 속도를 1500 rpm으로 설정했으며, 공정은 30초 동안 행하였다. 또는 스핀의 속도를 2000 rpm으로 설정하고 공정을 30초 동안 행하였다. 피복이 완료되면, 슬립칩을 120 °C 오븐으로 전달하여 10분 동안 배양하였다. 배양 후에, 슬립칩을 250 °C의 온도로 핫 플레이트에서 10분 소성하였고, 다시 10분 동안 온도를 265 °C까지 올려서 소성하였다. 소정 이후에, 스립 칩은 340 °C의 온도로 핫 프레이트에서 1분 동안 소결하였다. 소결된 칩을 실온으로 냉각시켰다.
슬립칩 조립 . 슬립칩을 FC-40 이하에서 조립하였다. 바닥 플레이트를 페트리 접시의 FC-40에 패턴이 위쪽으로 오도록 해서 침지하였다. 이후, 상부 플레이트를 바닥 플레이트의 상부에, 패턴이 아래쪽이 되도록 해서 배치했다. 2개의 플레이트는 서로에 대해 상대적으로 이동시켜서 위치에 정렬시키고 4개의 미세 바인더 클립을 사용해서 고정시켰다. 슬립칩은 표면에서의 추가의 FC-40을 제거한 후에 사용할 준비가 되도록 했다.
접촉각의 측정 . 슬립칩의 플레이트를 탱크 내의 플루오르화 탄소에 침지하였다. 아래 쪽을 향하는 플레이트를 2개의 미세 바인더 클립에 의해 각각의 끝에서 클램핑해서, 탱크의 바닥와 플레이트 사이에 갭을 형성하였다. 측정된 수용성 용액의 5 μL를 갭에 피펫하였으며, 수용성 액적을 주변의 플루오르화 탄소의 부력 때문에 플레이트와 접촉하도록 했다. 기질 상의 액적의 접촉각은 광학적 접촉각 측정법(Rame-Hart Instrument Co., Model 500)을 사용하여 측정하였다.
식품 염료 분석 . 식품 염료 분석에 사용된 모든 용액을 사용전에 0.45 μm의 PVDF 시린지 필터를 사용하여 여과하였다. 4개의 식품 염료(갈색, 핑크색, 적색 및 청색; 미국 뉴욕주에 소재한 Ateco)를 이들의 축적된 용액으로부터 10번 이하로 희석하였으며, 16개의 시약 덕트에 피펫 로딩하였다. 각각의 덕트를 로딩하기 위해, 4 μL의 염료를 염료 용액이 출구로부터 나올 때까지 피펫을 사용하여 입구를 통해 집어 넣었다. 시약을 로딩한 후에, 슬립칩을 슬라이딩시켜서 시료를 위한 연속하는 유체 경로를 형성하였다. 녹색 염료를 20번 희석하고, 시료 입구를 통해 로딩하였다. 피펫을 사용하여, 모든 시료 덕트가 완전히 충전될 때까지, 4 μL의 염료를 칩에 로딩하였다. 시료가 로딩되면, 슬립칩을 다시 슬라이딩시켜서 용액을 확산에 의해 혼합되도록 하였다.
혼합 비율의 정량화 . 로딩 과정은 식용 염료 분석에 대한 로딩 과정과 유사하게 하였다. 2개의 용액, 즉 형광 용액 (10 mM Tris 내 44.8 μM Alexa-488 , pH 7.8) 및 완충액 (10 mM Tris, pH 7.8)을 사용하였다. 11개의 영역을 갖는 가장 바깥쪽에 있는 4개의 유체 경로는 형광 용액으로 로딩하였으며, 남은 12개의 유체 경로는 완충액으로 로딩하였다. 형광 용액은 또한 시료로서도 사용하였다. 시약에 대한 영역과 시료에 대한 영역을 혼합한 후에, 슬립칩을 4시간 동안 암실에 두어 완전히 혼합되도록 했다. 이후, 슬립칩을 두 번째로 슬립해서 시약을 위한 영역을 시료를 위한 영역과 분리시켰다. 형광 용액을 함유하는 가장 바깥쪽에 있는 4개의 유체 경로는 희석하지 않았으며, 강도 측정을 보정하기 위해 조절하였다.
혼합 비율의 정량화: 형광 측정 . Alexa-488의 형광 강도가 형광 현미경의 작업 범위 내에서 농도와 선형으로 상관되는지를 확인하기 위하여, 발명자들은 슬립칩에 희석 곡선(dilution curve)을 만들었다. 먼저, 하나의 완충액(10 mM Tris, pH 7.8) 및 3개의 용액을 포함하는 4개의 용액을 최초의 Alexa-488 용액(0 mM Tris에서 44.8 마이크로몰, pH 7.8)의 농도의 1/4, 1/2, 및 1 배 농도에서 미리 조립한 사용자가 로딩한 슬립칩 내의 4개의 분리된 유체 경로에 로딩하였다. 상부 플레이트가 바닥 플레이트에 대해서 미끄러져서 전체 영역이 분리되었다. 바닥 플레이트의 로딩된 영역의 형광 강도를, 10×0.4NA Leica 대물렌즈와 Hamamatsu ORCAER 카메라를 가진 Leica DMI6000 현미경(Leica Microsystems)을 사용하여 측정했다. Alexa-488 형광 물질을 수집하기 위해 GFP 필터를 사용하였다. 노출 시간을 4 분으로 하였다. 메타모프(Metamorph) 이미징 시스템 버전 6.3r1 (Universal Imaging)을 사용하여 이미지를 취득 및 분석했다. 형광 신호의 강도를 추출하기 위해, 관심 영역의 중간에 100 픽셀 x 100 픽셀의 구역을 선택했다. 동일한 Alexa-488 농도를 갖는 영역(각 농도에 대해 5개의 영역)에 속하는 구역의 평균 통합 강도를 보정 곡선을 취득하기 위한 대응하는 농도에 대하여 작성하였다.
이후, 시료 영역을 사용하여 형광 측정을 수행하였다. 본 발명자들은 바닥 플레이트의 영역의 형광 강도를 측정하였다. 이에 의하면, 형강 강도를 측정하기 위한 작업 파라미터가 일치한다는 것이 보장되었다. 희석 곡선을 작성하는 데에 사용된 것처럼 이 실험에서도 형광 현미경을 위한 동일한 구성을 사용하였다. 측정값으로부터의 강도를 희석 곡선에 기초한 농도로 변환하였다. 현미경을 보정하기 위해, GFP를 위한 형광 기준 슬라이드의 형광 강도를 기록하고, 배경 보정을 위해 사용하였다. 메타모프 이미징 시스템 버전 6.3r1 (Universal Imaging)을 사용하여 이미지를 취득하여 분석했다.
혼합 비율의 정량화: 영역 크기의 특징화. 유리의 습식 에칭을 등방성이라고 가정하고, 에칭의 속도를 모든 방향에서 동일하게 한다. 에칭 이후의 영역의 크기를, 미세 측정자에 의해 보정된 Leica MZ 16 스테레오스코프를 사용하여 측정하였으며, 영역의 용량도 이에 따라 산출하였다.
혼합 비율 정량화: 데이터 분석 . 강도 측정을 보정하기 위해, 배경 강도를 모든 형광 이미지로부터 제거했다. 각 영역의 강도를 각 영역의 중심에 위치한 100 픽셀 x 100 픽셀의 집중된 강도로부터 추출했다. 각 영역에 대한 희석 비율은 해당 영역의 강도를 희석되지 않은 동일한 크기의 영역의 강도로 제산함으로써 구했다.
RC 결정화. 블라스토클로리스 비리디스(Blastochloris viridis)로부터 광합성 반응 중심(RC)의 시료를 취득했다. 로딩 과정은 식품 염료 분석의 로딩 과정과 유사했다. 침전제(40 mM NaH2PO4/Na2HPO4의 3.2 M (NH4)2SO4, pH 6.0)를 7개의 시약 덕트에 로딩하였고, 단백질 시료(0.07% (w/v) LDAO, 7% (w/v) 1,2,3-헵탄트리올, 4.5% (w/v) 트리에틸아민 포스페이트 (TEAP), 17 mM Na2HPO4/NaH2PO4 내 36 mg/mL RC, pH 6.0)을 시료 덕트에 로딩하였다. 이 실험을 포함하는 슬립칩을, 암실에서 실온으로 페트리(Petri) 접시의 FC-70에 보존하였다. 이러한 실험을 10일 동안 계속 모니터링해서 결정을 형성를 체크하였다.
슬립칩에 유비저균( Burkholderia pseudomallei )으로부터 글루타릴 - CoA 디하 이드로게나제를 결정화함. 단백질 시료를 Seattle Structural Genomics Center for Infectious(SSGCID)으로부터 입수했다. 위자드 스크린에 기초한 홈 메이드 스크리닝 키드로부터의 48개의 침전제를 3개의 슬립칩에 로딩하였으며, 즉 각 칩에 16개의 침전제를 로딩하였다. 동일한 로딩 과정은 식용 염료 실험과 동일하였다. 이후, 각각의 슬립칩을 별도의 페트리(Petri) 접시의 FC-70에 침지하였다. 페트리 접시를 실온에서 배양한 다음, 그 결과를 2주일 동안 모니터링하였다. 결정을 포함한 영역의 이미지를 Leica MZ 16 스테레오스코프에 연결된 SPOT 인지점 카메라(미국 미시간주 스털링 하이트에 있는 Diagnostic Instruments, Inc의 제품)로 사진촬영했다.
슬립칩을 사용하지 않고, 웰 플레이트에, 유비저균( Burkholderia pseudomallei)으부터 글루타릴-CoA 디하이드로게나제의 결정화. 글루타릴-CoA 디하이드로게나제에 대한 결정화 조건이 확인되었으면, 미세 배치 방법을 사용해서 시팅 드롭 웰 플레이트(Hampton 리서치)에서 실험을 확대했다. 슬립칩에 대한 스크리닝 실험에 의해 확인된 동일한 혼합 비율로, 단백질 시료를 침전제와 혼합해서, 최종적으로 웰 플레이트에 3 μL의 용량을 얻었다. 저장부(reservoir)에서, 밀리포아 수를 침전제와 혼합하여 웰 플레이트와 동일한 침전제 농도를 얻었으며, 최종 용량은 600 μL이었다. 각각의 조건은 하나의 복제물을 갖는다. 이후, 플레이트를 밀봉 테이프 (Hampton 리서치)로 밀봉하고, 실온에서 배양하였다. 결정의 이미지는 Leica MZ 16 스테레오스코프에 연결된 SPOT 인지점 카메라(미국 미시간주 스털링 하이트에 소재한 Diagnostic Instruments, Inc의 제품)로 사진 촬영했다.
X선 회절 및 데이터 처리. X선 회절을 위한 결정을 웰 플레이트 실험으로부터 구했다. PEG-400을 함유한 침전제에 대하여, 모액(mother liquor)을 냉동 보호제(cryo-protectant)로서 사용했으며, PEG-400의 농도를 25% (w/v)로 변화시켰다. 다른 침전제로는, 모액 플러스 20% (v/v) 글리세롤을 냉동 보호제로서 사용했다. 먼저, 결정을 최초의 웰 플레이트에서 냉동 보호제 를 함유하는 웰 플레이트로 나일론 루프를 사용해서 이동시켰다. 이후, 결정을 액체 질소에서 동결시켰다. X선 회절 분석을 Advanced Photon Source (Argonne National Laboratory)의 GM/CA Cat station 23 ID-D에서 수행했다. X선 데이터를 1.0332
Figure pct00007
의 파장을 사용하여 100 K에서 수집했다.
데이터를 HKL-2000을 사용해서 처리 및 분석했다.
글루타릴 - CoA 디하이드로게나제 의 X선 구조 결정. 글루타릴-CoA 디하이드로게나제의 구조를PDBid 3D6B 구조를 개시 모델로 하고 CCP4 세트 내의 MOLREP 프로그램을 사용하여 분자 치환에 의해 용해시켰다. PEG-400을 함유하는 조건에서 성장시킨 결정으로부터 수집한 데이터를 사용하였다. 프로그램 REFMAC5를 가진 최대 공산 표적을 사용하여 강체, 위치 및 온도 인자 정제를 수행하였다. CCP4를 사용하여 시그마A-가중화된 2Fobs-Fcalc 및 Fobs-Fcalc 퓨리에 맵을 산출하였다. 퓨리에 맵을 표시하고 COOT로 검사하였다. 새로운 용매 분자에 대한 검사를, COOT를 사용하여 수행하였다. 좌표 및 구조 인자를 엔트리 코드 3119 (펜딩)를 사용하여 단백질 데이터 뱅크에 축적하였다.
슬립칩의 특정 실시예에서, 자유 계면 확산과 미세 배치 방법을 조합한 나노리터 단백질 결정화를 위해 다수 파라미터 스크리닝을 수행할 수 있다. 본 발명의 특정 실시예들에서, 하나의 장치에서 미세 배치 방법과 FID 결정화 방법을 동시에 수행하는 슬립칩 기반의 자유 계면 확산(FID) 방법과 슬립칩 기반의 복합 방법을 수행할 수 있다.
특정 실시예에서, 다수의 확산 평형 시간에서 다수의 시약을 스크리닝하도록 FID 슬립칩을 설계하였으며, 이 FID 슬립칩은 2개의 단백질, 즉 마이코박테리움 투버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)로부터의 에노일-CoA 수화효소(hydratase)와 바베시아 보비스(Babesia bovis)로부터의 디하이드로폴레이트 환원효소(dihydrofolate reductase)/티미딜레이트 합성효소(thymidylate synthase)를, 5번의 상이한 평형 시간에서 48개의 상이한 시약에 대해 결정화를 위한 조건을 스크리닝하는 데에 사용하였다. 3개의 슬립칩을 사용하여 총 480번의 실험에 대해 각 단백질을 12 μL 사용하였다. 다수의 혼합 비율과 다수의 평형 시간에서, 다수의 시약을 스크리닝하기 위해 복합의 슬립칩이 설계되었으며, 이 슬립칩은 2개의 단백질, 즉 마이코박테리움 투버쿨로시스로부터의 에노일-CoA 수화효소와 바베시아 보비스(Babesia bovis)로부터의 디하이드로폴레이트 환원효소/티미딜레이트 합성효소에 대한 결정화를 위한 조건을 스크리닝하는 데에 사용하였다. 용액을 FID 안정화를 위한 넥 덕트(neck duct) 내에 용액을 유지하면서, 교차 오염을 방지하기 위하여, 슬립칩의 플레이트를 나노 규모의 영역의 패턴으로 에칭하였다. 이러한 나노 패턴은 실란으로 처리된 유리의 표면 상에 수용성 용액의 접촉각을 증가시키는 데에 사용하였다. 나노패터닝은 Z. Burton 및 B. Bhushan, Nano letters, 2005, vol. 5, no8, pp. 1607-1613(그 전체 내용을 본 명세서에 참조에 의해 포함함)에 개략적으로 개시되어 있다. 복합의 슬립칩은 성공적인 결정화 조건의 수를 증가시켰으며 별개의 FID 및 미세 배치 스크리닝에 비해 결정화를 위한 조건을 더 많이 식별하였다. 결정화 실험은 슬립칩 스크리닝 중에 식별된 조건을 사용하여 웰 플레이트에서 규모를 증대시켰으며, X선 회절 데이터를 취득하여, 1.95
Figure pct00008
해상도에서 디하이드로폴레이트 환원효소/티미딜레이트 합성효소의 단백질 구조를 생성했다. 이러한 자유 계면 확산 방법은 미세 유체 장치에서의 구배를 설정하는 편리하고 높은 처리율의 방법을 제공하며, 세포 기반의 분석에도 사용될 수 있다.
슬립칩 기반의 방식은 단일의 미세 유체 장치에서 단백질 결정화를 위한 2가지 방법, 즉 미세 배치 방법과 자유 계면 확산(FID)을 동시에 수행하는 데에 사용될 수 있다. 현재, 단백질 결정화에는 문제가 있다. 단백질을 결정화하기 위하여, 요구되는 조건을 정하기 위해 큰 규모의 화학적 공간을 찾아야 한다. 이러한 바람직한 침전제 및 바람직한 단백질 및 침전제의 농도에 대한 검사는 더 빠른 분석 및 더 작용 시료 크기에 의해 촉진되며, 단순하고 신속하며 제어가능한 시스템은 새로운 단백질 구조의 발견을 앞서간다. 단백질을 결정화하기 위한 특히 흥미를 끄는 방법은 나노규모 FID인데, 이는 단백질의 농도와 침전제의 농도가 확산에 의해 점진적으로 변화함에 따라 결정화를 위한 위상 다이아그램을 사용하며, 결정 핵 형성을 위한 더 높은 일시 과포화를 제공하고, 신속한 혼합에 의해 유도된 침전제를 제거하기 때문이다. 결국, 나노리터 규모의 FID는 결정화에 효과적이지만, 현재는 밸브를 기반으로 하는 시스템으로만 구현할 수 있다. FID는 칩 기반의 방식과 침술 기반의 방식을 포함하여, 통상 마이크로 리터 규모에서 구현되는 바람직하게 확립된 카운터 확산 방법과 기계적으로 매우 유사하다. FID에서의 밸브의 사용은 외부 제어 장비를 필요로 하며, 밸브는 종종 PDMS로 이루어진다. PDMS 장치는 대기 및 증발의 제어를 필요로 하는 추가의 문제가 있다. FID를 구현하기 위한 밸브가 없는 방식은 본 방법을 단순하게 하며 더 광범위하게 사용될 수 있도록 한다. 결정화의 여러 방법은 단백질 결정이 형성되고 여러 결정화 결과를 산출하는 평형 조건으로 여러 경로를 사용한다. 이들 방법은 결정화의 동력을 변경하고 이에 따라 단백질의 결정을 형성하도록 수정될 수 있지만, 여러 방법은 단백질 용액과 침전제 용액을 혼합하기 위해 여러 기술을 필요로 한다. 한가지 이상의 결정화 방법을 사용하는 것이 바람직하지만, 하나의 실험에 2개의 기술을 사용하는 것이 기술적으로 문제이다.
본 발명의 슬립칩 기술은 이러한 문제들을 해결한다. 사전 로딩된 그리고 사용자가 로딩한 형태로 증명하였다. 일부 실시형태에서, 사용자가 로딩하는 형태는 슬립칩에 기초한 FID 기술을 증명하는 데에 사용될 수 있으며, FID와 미세 배치를 조합한 기술은 하나의 “복합” 슬립칩에 사용될 수 있다.
발명자들은 FID 방법을 포함하도록 슬립칩의 실시형태를 설계하였다. 이러한 슬립칩은 5개의 상이한 평향 시간에서 16개의 상이한 침전제에 대하여 시료를 스크리닝하도록 설계되었다. 각각의 평형 시간은 단일의 슬립칩에서 총 160번의 평가를 위해 한번 더 조사하였다. 슬립칩은 10개의 영역을 포함하는 침전제에 대해 16개의 개별의 유체 경로를 형성하도록 구성될 수 있으며, 단백질 시료를 위한 단일의 유체 경로가 160개의 영역을 포함한다. FID 방법을 포함하기 위하여, 슬립칩을 “미끄러져서” 단백질 영역과 침전제 영역을 연결하는 경우에, 단백질 시료를 위한 연속하는 유체 경로를 형성한 미세 덕트(깊이가 21 μm인 덕트)는 단백질 영역을 침전제 영역에 연결하는 넥 덕트가 되었다. 단백질 영역과 침전제 영역 사이의 거리를 점진적으로 증가시킴으로써, 넥 덕트의 길이가 91 μm에서 491 μm로 증가하였으며, 덕트의 폭을 감소시킴으로써, 넥 덕트의 폭이 104 μm에서 58 μm로 감소되었다. 덕트의 횡단면 면적으로 나눈 넥 덕트의 길이로서 규정한 넥의 형상은. 변경이 가능하다.
슬립칩을, FID 결정화 방법을 사용하여 16개의 상이한 침전제에 대하여 단백질을 스크리닝하도록 설계하였다. 다수의 침전제와 단백질을 침전제와 혼합하기 위한 다수의 평형 시간은 동일한 슬립칩에서 스크리닝될 수 있다. 상부 플레이트는 단백질을 위한 덕트와 침전제를 위한 덕트를 포함한다. 단백질을 위한 덕트는 단백질 영역과 침전제 영역을 연결하는 넥 덕트가 될 것이며, 이들 덕트는 왼쪽에서 오른쪽으로 폭이 점진적으로 감소하며, 평형 시간을 점진적으로 변경한다. 바닥 플레이트는 단백질을 위한 영역과 침전제를 위한 영역을 갖는다. 단백질을 위한 영역과 침전제를 위한 영역 사이의 거리는 왼쪽에서 오른쪽으로 갈수록 점진적으로 증가하며, 평형 시간을 점진적으로 변경시킨다. 2개의 플레이트를 조립한 경우, 단백질을 위한 유체 경로와 침전제를 위한 유체 경로가 형성된다. “슬라이딩” 후에, 바닥 플레이트로부터의 단백질과 침전제는 상부 플레이트의 좁은 덕트에 의해 가교된다.
넥의 형상은 평형 시간을 조절하며, 발명자들은 네트 형상에 따라 선형으로 증가하는 평형 시간이 수치적 시뮬레이션과 일치한다는 것을 알게 되었다. 완전히 발전된 확산 프로파일을 가진 안정 상태에서 생기는 평형 시간은 이들 프로파일을 확립하기 위한 시간과 다르다. 후자의 시간은 거리의 제곱과 비례한다. FID 분석을 슬립칩에 용이하게 설정하였다. 이 경우, 밸브를 필요로 하지 않으며, 피펫팅과 슬립만 포함하면 된다. 이러한 방식에서, 단백질 시료를 위한 덕트는 FID 분석을 설정하기 위해 사용되었기 때문에, 사용되는 시료가 매우 적다. 상기 넥은 침전제 또는 단백질을 함유하는 영역에 비해 얇게 되도록 설계되기 때문에, 넥 형상의 변화에 의해 생기는 용량 변화는 결정화 분석의 총 용량에 비해 무시할 수 있을 정도이다. 넥의 용량은 결정화 실험의 총 용량의 4-8%만으로 구성했다. 본 발명자들은 평형 시간의 변경이 단백질 결정화에 어떻게 영향을 미치는지를 증명하였다.
덕트 형상의 변경은 슬립칩에서 평형 시간에 변화를 준다. 각각의 조건은 서로 다른 평형 시간을 나타내며, 동일하게 행해졌다. 모델 형광 염료, DTPA를 사용함으로써 다양한 넥 형상을 위한 확산 프로파일을 구했다. 단백질을 위한 영역의 평균 강도는 영역을 통한 라인 스캔에 의해 측정하였다. 확산 프로파일은 넥 형상에 따라 달라진다. 50%의 평형 시간과 넥 형상은 선형 관계를 가진다. 50% 평형 시간은 단백질 영역에서의 평균 강도가 최대 평형 강도의 절반에 도달하는 데에 걸리는 시간으로서 규정하였다. 네트 형상은 네트의 횡단면 면적으로 나눈 넥의 길이로 규정하였다. 가장 짧은 평형 시간에서는, 침전제만 획득했다. 평형 시간이 증가함에 따라, 더 큰 결정을 획득했다.
본 발명자들은 FID 슬립칩을 이용하여 블라스토클로리스 비리디스로부터 광합성 반응 중심을 결정화함으로써 결정화 동역학에 대한 평형 시간의 효과를 증명하였다. 본 발명자들은 평형 시간이 증가함에 따라 단백질은 침전물에서 다수의 작은 결정 내지 보다 적은 수의 보다 큰 결정으로 진행된다는 것을 증명하였다. 이어 본 발명자들은 FID 슬립칩을 이용하여 마이코박테리움 투버쿨로시스로부터의 에노일-CoA 수화효소 및 바베시아 보비스로부터의 디하이드로폴레이트 환원효소/티미딜레이트 합성효소와 같은 2개의 단백질에 대한 결정화 조건을 스크리닝하였다. 약 12 μL의 각 단백질은 총 480회의 실험을 위해 48개의 침전제를 함유하는 스크리닝 키트에 대해 스크리닝하기 위해 소모되었다. 이는 슬립칩 상에서 수행되었으며, 각 슬립칩은 침전제당 16개의 침전제 및 5개의 조건이 구비되며, 칩당 총 160회의 실험이 수행되며, 칩당 4 μL의 단백질이 소모되었다. 또한 본 발명자들은 동일한 침전제에 대해 미세 배치 방법을 이용하는 사용자-로딩된 슬립칩의 특정 실시예를 이용하여 단백질 둘 모두를 스크리닝하였으며, FID 결과와 미세 배치 결과를 비교하였다.
분석된 2개의 단백질은 서로 다른 핵 형성 동역학을 나타낸다. 즉, 에노일-CoA 수화효소는 신속하게 핵 형성되지만, 디하이드로폴레이트 환원효소/티미딜레이트 합성효소는 느리게 핵 형성된다. 에노일-CoA 수화효소에 있어서, FID는 핵 형성을 최소화하고, 미세 배치에서 침전만이 관측되는 조건에서 결정을 수득한다. FID 슬립칩을 이용하여 본 발명자들은 몇몇 조건 하에서 에노일-CoA 수화효소의 결정을 생산하였다. 블라스토클로리스 비리디스로부터의 광합성 반응 중심에 대해서와 같이 상기 방법 둘 모두에서 결정을 생산하는 조건 하에, FID는 보다 적은 수의 보다 큰 결정을 생산하는 반면, 미세 배치는 다수의 작은 결정을 생산한다. 결정이 형성되어 있는 디하이드로폴레이트 환원효소/티미딜레이트 합성효소 분석에 있어서, 각 실험에서 결정이 거의 수득되지 않았으며, 이는 디하이드로폴레이트 환원효소/티미딜레이트 합성효소의 결정화가 핵 형성을 제한한다는 것을 나타낸다. 오직 하나의 침전제 조건은 FID 방법을 이용하여 결정을 생성하였지만, 3개의 침전제 조건은 미세 배치 방법으로 결정을 생성하였다. 이것은 서로 다른 핵 형성 동역학을 갖는 단백질은 서로 다른 결정화 기술을 요구할 것이고, 다수의 기술을 병행하여 이용하는 것은 단백질 결정을 생성하기에 적합한 조건을 확인할 가능성을 증가시킨다는 것을 의미한다.
슬립칩의 다른 실시형태에서, 침전제, 및 이의 결정화 농도를 확인하는 것 이외에 2개의 방법(FID 및 미세 배치)이 동시에 스크리닝되었다. 특정 실시예에서, 단백질 시료용 연속적인 유체 경로 및 16개의 서로 다른 침전제용 개별 유체 경로가 구성될 수 있다. 이러한 실시형태에서, 미세 배치 실험을 위해 설계된 영역 및 FID 실험을 위해 설계된 영역은 각각의 유체 경로 내에 존재하며, 이는 단일 단백질이 다수의 혼합 비율 및 평형 시간에서 16개의 침전제에 대해 각각 스크리닝되도록 하였다. 이러한 실시형태에서, FID 영역은 16개의 침전제 각각에 대해 칩당 총 176회의 실험, 5회의 미세 배치 실험 및 6회의 FID 실험에 대해 다수의 혼합 비율(, , 및 )을 갖는다.
복합체 슬립칩에서, 상기 단백질을 혼합하기 위한 다수의 침전제 및 다수의 체적 및 평형 시간은 미세 배치 및 FID 방법 모두를 이용하여 동일한 슬립칩 상에서 스크리닝될 수 있다. 상부 플레이트는 상기 단백질용 영역, 상기 침전제(미세 배치)용 덕트, 및 상기 단백질 및 침전제(FID)용 덕트를 함유한다. 하부 플레이트는 상기 단백질용 덕트, 상기 침전제(미세 배치)용 영역, 및 상기 단백질 및 침전제(FID)용 영역을 구비한다. 2개의 플레이트가 조립되는 경우, 상기 단백질용 유체 경로 및 상기 침전제용 유체 경로가 형성되어 미세 배치 및 FID 방법 둘 모두를 위한 영역을 채운다. 미세 배치에서, 2개의 영역은 서로에 대해 정렬되며, FID에서는 2개의 영역이 좁은 덕트에 의해 연결된다.
특정 실시예들에서, 불필요한 교차 오염이 슬라이딩 단계 도중에 잠재적으로 발생할 수 있다. 즉, 용액의 박막은 슬립칩의 2개의플레이트 사이에 형성될 수 있으며, 이는 서로 분리되어 있어야 하는 덕트와 영역을 연결한다. 불필요한 교차 오염을 최소화하기 위해, 윤활제인 플루오르화 탄소 중에서 상기 용액과 슬립칩의 플레이트 사이에는 130°를 초과하는 접촉각이 바람직하며, 다른 실험에서 플루오르화된 에틸렌 프로필렌의 박층으로 상기 플레이트를 스핀 피복하는 것이 바람직하다. FID 방법의 특정 실시예에서, 상기 넥 덕트 내 용액은 이 같이 높은 접촉각에서 안정하지 않으며, 표면 에너지를 최소화하기 위해 분해되는 경향이 있다. 본 발명자들은 상기 영역 및 넥 덕트 내부의 표면보다 더 소수성이 되도록 슬립칩의 표면을 패턴화함으로써 이러한 문제를 해결하였다. 이를 위해, 본 발명자들은 이전 에칭 단계에서 남아있는 피복물을 세척 제거하기 전에 미세 에칭이라는 추가의 단계를 도입하였다. 이는 깊이가 250 nm이고 10 μm의 직경을 갖는 영역의 패턴을 생성하였다. 나노 패턴화 없이, 0.1% N,N-디메틸도데실아민 N-옥사이드 (LDAO) 시료 용액의 평균 접촉각은 단지 112.2°이고, 나노 패턴화가 존재하는 경우 동일한 LDAO 시료 용액의 평균 접촉각은 134.2°이었다. 또한 나노 패턴화는 슬라이딩 단계 도중에 용액 가장자리에 직접 노출되었던 유리의 표면적을 증가시켰다. 상기 작은 영역은 윤활 유체를 트랩핑하고, 용액 누수를 방지하기 위해 격벽을 생성하였다.
나노 패턴화의 성능은 나노 규모의 영역 크기, 간격 및 에칭된 깊이를 포함한 나노 패턴의 외형에 의해 영향을 받았다. 이들 파라메터는 가변될 수 있으며, 나노 패턴화 각각의 접촉각은 측정 가능하다. 나노 규모의 영역의 깊이 및 표면적 모두는 상기 접촉각에 영향을 미쳐야 한다. 나노 패턴화를 갖는 실란화된 유리는 통상적으로 나노 패턴화가 없는 유리보다 높은 접촉각을 가졌으며, 상기 접촉각은 에칭 깊이와 함께 증가하였다. 나노 패턴화 깊이가 196 nm 내지 3.81 μm 범위인 이들 유리 플레이트에 있어서 상기 접촉각은 130°를 초과했다. 깊이가 3.81 μm인 나노 패턴에 있어서, 최대 접촉각은 153.62°이었다(RSD=1.01%, n=5, 방울 배치 5분 이후에 측정됨). 5분 이후에 접촉각을 측정함으로써 관측된 바와 같이, 상기 접촉각은 시간이 지남에 따라 감소하였다. 상기 감소량은 나노 패턴 깊이에 의해 영향을 받았다. 깊이가 200 nm 미만인 나노 패턴은 깊이가 200 nm 이상인 이들 나노 패턴보다 빠르게 접촉각이 감소하였다. 또한 복합체 슬립칩은 개별 FID 및 미세 배치 실험을 이용하여 연구된 동일한 2개의 단백질, 즉 마이코박테리움 투버쿨로시스로부터의 에노일-CoA 수화효소 및 바베시아 보비스로부터의 디하이드로폴레이트 환원효소/티미딜레이트 합성효소의 결정화 조건을 스크리닝하기 위해 사용되었다. 상기 복합체 접근법은, 핵 형성 및 결정 성장에 대한 2개의 경로가 조사됨에 따라 관련 결정화 조건에 대한 조사를 보다 효율적으로 만드는 반면, 동일한 소량의 단백질(약 12 μL)이 동일한 스크리닝 키트에 대해 각 단백질을 스크리닝하기 위해 소모되었다. 복합체 슬립칩의 미세 배치 및 유리 계면 확산 성분 모두가 작용을 하며, 단백질 둘 모두에 대한 결정화 조건을 확인하였다. 상기 복합체 슬립칩에서, 개별 미세 배치 및 FID 스크리닝에 의해 확인된 다수의 조건들이 또한 확인되었다. 에노일-CoA 수화효소에 있어서, 개별 스크린 중 하나에 의해 확인되지 않은 새로운 2개의 조건은 하이브리드 스크린에 의해 선별되었다.
상기 복합체 슬립칩을 이용한 단백질의 결정화 조건의 스크리닝은 미세 배치 및 FID 방법에 의해 결과와 일치하였다. 모든 영역은 시약 41 (45% (W/V) PEG-3000, 0.1 M CHES, pH 9.5)을 함유하였다. 미세 배치 방법을 이용함으로써 결정이 의 혼합 비율(단백질:침전물)로 형성되었다. 상기 FID 방법을 이용함으로써 결정이 의 혼합 비율로 형성되었다. 상기 복합체 방법에 의해 에노일-CoA 수화효소 및 디하이드로폴레이트 환원효소/티미딜레이트 합성효소 모두에 대해 미세 배치 또는 FID 단독에서 보다 많은 결정화 성공이 이루어졌다.
본 발명자들은 상기 미세 배치 슬립칩에서 확인된 디하이드로폴레이트 환원효소/티미딜레이트 합성효소의 결정화를 위한 3가지 조건 중 하나를 비율에 따라 확대하였다. 상기 선택된 조건은, 단백질 시료가 20 % (w/v) PEG-8000, 0.2 M NaCl 및 0.1 M CHES의 혼합 비율(pH 9.5)이 0.33:0.57이라는 것이다. 본 발명자들은 인지된 보다 낮은 성공율로 나타낸 바와 같이 디하이드로폴레이트 환원효소/티미딜레이트 합성효소가 결정화되기 더 어렵기 때문에 에노일-CoA 수화효소 대신에 디하이드로폴레이트 환원효소/티미딜레이트 합성효소를 비율에 따라 확대하였다. 침전제인20 % (w/v) PEG-8000, 0.2 M NaCl 및 0.1 M CHES(pH 9.5)는 선택된 혼합 비율에서 가장 명확한 형태를 갖는 결정을 생성하였다. 미세 배치 방법의 결정화 실험을 슬립칩에서 웰 플레이트로 옮기는 것은 용이하며, 본 발명자들은 비율에 따라 성공적으로 확대된 접근법으로부터 결정을 수득하였다. 본 발명자들은 완전한 X선 회절 데이터 세트를 수집하였고, 1.95
Figure pct00009
의 해상도에서 구조를 결정하였다(스페이스 그룹 P212121). 상기 구조는 단백질 데이터 은행에 PBDid: 3KJR로 기탁되었다. 동일한 단백질은 Seattle Structural Genomics Center for Infectous Disease(SSGCID) 및 Accelerated Technologies Center for Gene to 3D Structure(ATCG3D) 시설을 이용하여 병행하여 스크리닝되어, 20% (w/v) PEG-8000 및 0.1M CHES(pH 9.5)를 이용하는 조건에서 결정 카드에서 미세 유체 미세 배치를 이용하여 결정을 수득하였다. 이들 결정은 2.35
Figure pct00010
구조를 생성하였다(스페이스 그룹 P1 (PDBid 3D6B)). 스크린이 완료되고 결정이 수득된 이후에 슬립칩 상에서 디하이드로폴레이트 환원효소/티미딜레이트 합성효소의 결정화의 스크리닝 및 부수적인 평가 분석이 상기 SSGCID 및 ATCG3D 시설에서 스크리닝에 의해 수득된 조건에 대한 임의의 지식없이 수행될 때까지 결정화 조건에 대한 임의의 정보가 공유되지 않은 채 이중 맹검으로 수행되었다. 동일한 PEG 및 완충액을 공유하고 슬립칩 스크린에서 NaCl의 존재에 의해서만 서로 상이한 유사 조건들이 구조를 수득하기 위해 독립적으로 발견되었다. 본 발명자들은 스페이스 그룹이 서로 다른 해상도가 보다 높은 구조를 수득하였다.
본 발명자들은 단백질을 결정화하기 위한 슬립칩 기반 FID 접근법을 증명하였고, 또한 미세 배치 및 FID 결정화 기술을 이용하기 위해 복합체 슬립칩 기반 접근법을 증명하였다. 상기 슬립칩의 특정 실시예는 유리 계면 확산법에서 160개 이상의 실험을 설정하고 미세 배치 및 유리 계면 확산법에서 176회의 실험을 설정하기 위한 간단하면서도 사용하기 용이한 방법을 제공하며, 모든 분석은 단일 미끄럼에 의해 동시에 설정될 수 있다. 각 실험이 반드시 개별적으로 제어될 필요가 없는 단백질 결정화과 같은 적용 예에 있어서, 밸브의 부재는 분석 실행 및 장치의 제조 모두를 매우 간소화시킨다. 장치의 제조는 슬립칩 플랫폼을 이용하여 추가로 간소화되며, 이는 상기 슬립칩이 저렴한 몰딩 기술 및 일반적인 성형법과 양립할 수 있다. 플러그 기반 결정화 기술에서 이미 증명된 더욱 진보된 기술들은 슬립칩 설계와 양립할 수 있다. 다수의 침전제, 혼합 비율 및 평형 시간을 스크리닝하는 것 이외에, 상기 복합체 슬립칩은 2개의 서로 다른 단백질 결정화 기술을 동일한 장치에서 나노리터 규모로 비교하는 것을 가능케 한다. 단일 장치를 이용함으로써, 표면 화학 성질 및 사용된 용액은 동일하며, 하나의 방법이 다른 방법에 대한 임의의 이점이 확인 및 구현될 수 있다. 미세 배치는 보다 큰 계면을 통한 신속한 혼합에 상응하며, 이는 보다 신속한 핵 형성을 야기한다. 유리 계면 확산법은 보다 작은 계면을 통한 보다 느린 혼합에 상응하며, 이는 보다 느린 핵 형성과 일치한다. 넥 외형의 제어는 미세 배치 및 FID 방법을 브리징하는 방법의 연속체(continuum)를 가능케 한다. 역확산 접근법에 기초한 결정화는 기계적으로는 FID 방법과 유사하다. 결정화를 위한 역확산법은 보다 작은 규모로 슬립칩 상에서 수행될 수 있으며, 통상의 방법에서보다 다중화된 포맷으로 수행될 수 있다. 복합체 슬립칩은 많은 단백질을 분석하기 위한 플랫폼, 및 중요한 단백질 결정화 특정에 관해 더욱 많은 것을 학습할 기회를 제공한다.
결정화 조건들이 확인된 이후, X선 회절에 적합한 고품질의 결정은 상기 결정을 특성화하고 단백질 구조를 결정하는데 바람직하다. X선 회절을 위한 충분히 큰 결정을 생성하기 위해, 통상적으로는 약 10 nl의 최소 실험 체적이 요구되며, 훨씬 더 작은 결정이, 예를 들어 싱크로트론 x선 분야에서의 최근 발전을 이용하여 분석될 수 있어, 상기 슬립칩에서 수득된 결정은 구조적 특성화를 위해 충분히 클 수 있다. 상기 결정의 추출 및 원위치 회절을 포함한, 슬립칩에서 성장한 결정으로부터 X선 회절 데이터를 수득하기 위한 몇몇 선택안이 존재한다. 특정 실시예에서, 상기 슬립칩은 밀봉되지 않으며, 따라서 2개의 플레이트는 분리될 수 있으며, 결정은 웰 기반 칩에 대해 수행된 바와 같이 추출될 수 있다. 원위치 회절법은 결정화 이후 조작 동안에 결정에 대한 손상을 방지할 수 있으며, 처리량을 증가시킬 수 있다. 원위치 X선 회절법은 상기 슬립칩이 PDMS, PMMA 및 사이클러올레핀-코폴리머와 같이 원위치 회절법과 양립할 수 있는 재료로 구성될 수 있기 때문에 상기 슬립칩에서 수행될 수 있거나, 필요한 경우에 유리를 에칭하여 충분히 얇은 벽이 구비된 영역을 생성할 수 있다.
슬립칩에서 성장한 특정 결정이 고품질의 X선 회절 데이터를 생성하지 못하면, 결정화 실험은 슬립칩 스크리닝에 의해 확인된 조건을 이용하여 비율에 따라 확대될 수 있다. 미세 배치 실험은 웰 플레이트에서 비율에 따라 용이하게 확대된다. 다른 성공 사례는 상기 동일한 전략을 이용하여 버크홀데리아 슈도말레이로부터의 리보스-포스페이트 파이로포스포키나제에 의해 달성되었다. 통상적인 증기 확산 방법에 의해 밝혀진 조건(20% (w/v) PEG-3350, 0.2M 포름산 마그네슘, pH 5.9)은 I222의 스페이스 그룹에서 결정을 생성하였다. 결정 구조는 2.3
Figure pct00011
해상도 (PDBid: 3DAH)에서 결정되었다. 상기 슬립칩의 실시형태와 병행 이용함으로써 본 발명자들은 P43212의 스페이스 그룹에서 결정을 생성하는 서로 다른 조건(11% (w/v) PEG-8000, 37 mM 시트르산 나트륨, pH 5.5)을 발견하였다. 본 발명자들은 비율에 따른 확대에 의해 생성된 결정에 대한 1.83
Figure pct00012
에서의 데이터를 수득하였다. 다른 기술을 이용함으로써, 상기 FID 접근법은 확산 프로파일 및 동역학을 모사하여 보다 큰 규모로 철저히 제어할 필요가 있기 때문에 비율에 따라 확대하는데 있어서 덜 진부할 수 있다. 본 발명자들이 상기 FID 슬립칩에 대해 결정하였던 예상가능한 확산 프로파일은 비율에 따른 확대가능한 슬립칩이 예를 들어 피코리터 규모까지 작게, 그리고 예를 들어 마이크로리터 규모까지 크게 합리적으로 설계하는 것을 가능케 한다.
본원에서 상술한 기술은 단백질 결정화를 넘어선 다수의 적용 예를 갖는다. 예를 들어, 초소수성 표면을 생성하기 위해 사용된 나노미터 규모의 에칭은 표면 패턴화 기술에 영향을 미칠 것이다. FID 방법에 사용된 기술은 다른 실험에서 용액을 조합하는 경우에 평형 시간을 제어하기 위해 확장될 수 있다. 이러한 평형 제어는, 예를 들어 주화성을 연구하는 경우에 적용 예 범위에서 농도 구배를 설정하는데 유용하며, 다른 세포 기반 분석에 유용하다.
실시예
나노 패턴화를 갖는 슬립칩의 제조
본 발명자들은 하기와 같이 변형된 적용 예에서 다른 경우에 개시된 유리 에칭 제조 과정을 따라 수행하였다. 먼저, 블랭크 유리 플레이트(소다 석회유리, 두께: 0.7 mm; 크롬 피복: 1025
Figure pct00013
; AZ 포토레지스트: 1 μm)를 단계 1에서 3 × 1인치가 되도록 절단하였다. 단계 1: 유리 에칭 제조 과정은 유리 플레이트의 이면이 PVC 테이프로 밀봉되는 시점까지 수행되었다. 이어, 본 발명자들은 유리 플레이트의 가장자리에 제 2 포토마스크를 배열하기 위한 십자형 표시를 하였으며; 이들 표시는 에칭을 방지하기 위해 테이핑(tape)되었다. 본 실시예에서, 에칭 시간은 유리 플레이트 내로 40 μm 깊이까지의 영역을 에칭하기 위해 약30분이 필요하였다. 상기 플레이트는 밀리포어 수로 철저히 세정하고, 질소 가스로 건조하였다. 단계 2: 덕트에 대한 설계 및 약 15 내지 20분의 에칭 시간을 포함하는 다른 포토마스크를 이용하여, 20 μm 깊이의 덕트를 단계 1에서와 동일한 과정을 이용하여 유리 플레이트 상에서 에칭하였다. 포토마스크로 유리 플레이트를 배열하기 위해 조심하였다. 이러한 단계 도중에, 40 μm 깊이의 영역은 60 μm 깊이가 될 때까지 추가로 에칭되었다. 상기 플레이트를 밀리포어 수로 철저히 세정하고, 질소 가스로 건조하였다. 단계 3: 덕트 및 영역이 플레이트에 에칭된 이후, 상기 플레이트는 나노 패턴화 포토마스크를 이용하여 배열한 후, 단계 1에서와 동일한 과정을 수행하였다. 크롬 피복을 제거한 후, 유리 플레이트를 50:25:37.5 mmol/L의 HF/NH4F/HNO3 에칭 용액에 침지하고, 실온(~ 23 °C)에서 에칭하여 약 250 nm 깊이의 패턴을 표면상에 생성하였다. 최종적으로, 상기 유리 플레이트를 에탄올로 세정하여 현상되지 않은 포토레지스트를 제거하였으며, 크롬 에칭제에 침지시켜 상기 크롬 피복을 제거하였다. 이어 유리를 에탄올 및 밀리포어 수로 세정하고, 질소 가스로 건조하였다. 본원에 개시된 방법에 의해 하나의 유리 기질 상에 나노미터 깊이의 설계 및 다양한 마이크로미터 깊이의 설계가 통합된다. 또한 다른 나노유체/미세 유체 적용 예를 위한 나노미터/마이크로미터 하이브리드 덕트를 제조하기 위해 사용될 수도 있다. 상기 에칭된 패턴들은 Veeco Dektak 150 형상 측정기(profilometer)를 이용하여 측정되었다(도 S2). 유리 플레이트를 세척하고, 산소 플라즈마 처리에 적용한 후, 그 표면을 상술한 바와 같이 트리데카플루오로-1,1,2,2-테트라하이드로옥틸-1-트리클로로실란으로 3시간 동안 진공 건조기에서 실란화하여 소수성으로 만들었다. 실란화 이후, 상기 유리 플레이트를 120 °C 오븐에서 30분 동안 베이킹(bake)하고, FC-3283 탱크에 침지시킴으로써 세정하였으며, 60 °C 오븐에서 하룻밤 동안 건조하였다.
FEP 스핀 피복
스핀 피복 FEP는 이러한 적용 예에서 다른 경우에 개시된 바와 같이 수행되었다.
나노 패턴화의 접촉각의 측정
나노 패턴화에 의해 슬립칩을 제조하는 단계 3에서 개시된 나노 패턴화 포토마스크를 이용함으로써 나노 패턴을 갖도록 유리 플레이트를 에칭하고, 에칭 시간을 제어함으로써 서로 다른 나노 규모의 영역 깊이를 얻었다. 모든 유리는 접촉각을 측정하기 이전에 실란화되고 세정되었다. 상기 유리 플레이트는 유리 탱크 중의 플루오르화 탄소 내에 침지하였다. 패턴화된 표면이 하부로 향하고 있는 상기 플레이트를2개의 미세 바인더 클립을 이용하여 각 말단에 고정하여, 상기 플레이트와 탱크의 바닥부 사이에 간극을 형성하였다. 5 μL의 측정된 수성 용액을 간극 내로 피펫팅하고, 0.1% LDAO를 갖는 수성 방울은 주변 플루오르화 탄소(FC-40)에서 이의 부력으로 인해 상기 플레이트와 접촉하였다. 이어, 상기 기질 상의 방울의 접촉각은 광학적 접촉각 측정장치(Rame-Hart Instrument Co., Model 500)를 이용함으로써 측정되었다. 상기 방울이 유리 플레이트에 접촉한 직후에 접촉각을 측정하고, 상기 접촉 5분 후에 다시 접촉각을 측정하였다.
FID 장치에서의 식품 염료 분석
나노 패턴화 또는 FEP 피복 없이 상술한 방법에 의해 FID 장치를 제조하였다. 상기 장치의 2개의 플레이트를 FC-40 하에서 조립하였다. 얻어진 배향에서, 16개 시약 모두 및 하나의 시료를 위한 유체 덕트가 형성되었다. 식품 염료 실험에 사용된 모든 용액은 사용 이전에 0.45 μm PVDF 주사기 필터로 여과하였다. 4개의 식품 염료(황색, 핑크색, 적색 및 청색)를 이의 스톡 용액으로부터 10배 희석하고, 16개의 시약 덕트에 피펫-로딩하였다. 각 덕트에 로딩하기 위해, 먼저 염료 용액이 출구에 나타날 때까지 4 μL의 염료를 피펫을 이용하여 입구를 통해 밀어 넣었다. 녹색 염료를 20배 희석하고, 0.04% (w/v) LDAO와 혼합하여, 단백질 시료를 모방하였다. 이어 녹색 염료를 시료 입구를 통해 로딩하였다. 피펫을 이용하여 10 μL의 염료를 상기 시료 덕트가 완전히 채워질 때까지 칩 내에 로딩하였다. 일단 시료가 로딩되면, 인접한 영역 사이의 연결부가 분리되고 수직 덕트가 상기 시료 영역 및 상기 시료 영역 하의 상대적 시약 영역을 위한 브리징 확산 덕트를 형성하도록 상기 슬립칩을 미끄러지게 하였다. 연속적인 이미지(시간 간격: 3분)를 Plan APO 0.63× 대물렌즈가 구비된 Leica MZ 16 Stereoscope를 이용하여 촬영하였다.
FID 장치에서의 형광 염료 확산 분석
나노 패턴화를 이용한 상술한 방법으로 FID 장치를 제조하였다. 슬립칩을 조립하고, 용액을 식품 염료 실험에 대해 상술한 바와 같이 로딩하였다. PBS 완충액 (1×, pH 7.4) 중의 250 μm MPTS를 피펫팅에 의해 2개의 시약 덕트에 로딩하였다. 0.01% (w/v) LDAO 용액을 시료 덕트에 로딩하여 모든 시료 영역을 채웠다. 슬립칩을 Leica MZ 16 Stereoscope 하에서 미끄러지게 하여 5개의 서로 다른 덕트 외형을 갖는 20개의 유리 계면 확산 실험을 형성하였다. FID의 출발 시점을 타이머로 기록하였다. 상기 장치를 5 ×0.4 Leica 대물렌즈 및 Hamamatsu ORCAER 카메라가 구비된 Leica DMI6000 현미경(Leica Microsystems)에 신속하게 전달하였다. 20 ms의 노출 시간을 갖는 DAPI 필터를 사용하여 MPTS 형광을 수집하였다. 현미경을 조정하기 위해, DAPI 필터에 대한 형광 참조 슬라이드의 형광 강도를 기록하고, 백그라운드 교정용으로 사용하였다. 다중 치수 획득 기능이 구비된 메타모프 촬상 시스템 버전 6.3r1(Universal Imaging)을 이용하여 이미지를 획득하고 분석하였다. 이미지는 매 10분마다 촬영하였다. 시료 영역에서 평균 강도를 얻기 위해, 본 발명자들은 각 시료 영역 상에서 라인 스캔을 수득하였다. 상기 라인 스캔에 따른 강도의 평균을 수득하고, 평균 강도를 시간에 따라 플로팅하였다. 시간은 FID 실험의 설정과 촬영 시작 사이의 지연을 설명함으로서 교정되었다.
하이브리드 장치에서의 식품 염료 분석
상술한 나노 패턴화 방법을 이용함으로써 하이브리드 슬립칩을 제조하였다. 이는 FC-40 하에서 조립되었다. 얻어진 배향에서, 16개의 시약 및 하나의 시료를 위한 유체 덕트가 형성되었다. 식품 염료 실험에 사용된 모든 용액은 사용하기 전에 0.45 μm PVDF 주사기 필터로 여과하였다. 4종류의 식품 염료(황색, 핑크색, 적색 및 청색, Ateco, Glen Cove, NY)를 이의 스톡 용액으로부터 10배 희석하고, 16개의 시약 덕트에 피펫-로딩하였다. 각 덕트를 로딩하기 위해, 염료 용액이 출구에 나타날 때까지 4 μL의 염료를 피펫을 이용하여 입구를 통해 밀어 넣었다. 녹색 염료를 20배 희석하고, 0.04% (w/v) LDAO와 혼합하여, 단백질 시료를 모방하였다. 이어 녹색 염료를 시료 입구를 통해 로딩하였다. 피펫을 이용하여 10 μL의 염료를 상기 시료 덕트가 완전히 채워질 때까지 칩 내에 로딩하였다. 일단 시료가 로딩되면, 시약 영역이 미세 배치 부분중에서 상기 시료 영역과 중복되고, 시약 영역이 FID 부분 중에서 넥(슬라이딩 이전에 시료의 유체 경로를 연결하는 덕트)에 의해 시료 영역에 연결되도록 상기 슬립칩이 미끄러지게 된다.
미세 배치 슬립칩에 의한 마이코박테리움 투버쿨로시스로부터의 에노일 - CoA 수화효소의 결정화
Seattle Structural Genomics Center for Infectous Disease(SSGCID)로부터 단백질 시료를 수득하였다. 미세 배치 슬립칩은 유리 에칭에 의해 제조되고, 플루오르화된 에틸렌 프로필렌 (FEP)에 의해 표면 피복되며, 퍼플루오로-트리-n-부틸아민과 퍼플루오로-디-n-부틸메틸아민 (FC-40)의 혼합물인 윤활제 플루오르화 탄소 하에서 조립되었다. 국산 스크리닝 키트로부터의 48개의 침전제를 3개의 조립된 슬립칩 내에 로딩하였으며, 이때 각 칩 내에는 16개의 침전제가 존재하였다. 침전제를 슬라이딩에 의해 단백질 시료와 조합하였다. 각 슬립칩을 개별 페트리 접시에 있는 FC-70 내로 침지시켰다. 페트리 접시를 23 °C 배양기에서 저장하고, 결과를 2주 동안 모니터링하였다. Leica MZ 16 Stereoscope에 연결된 SPOT Insight 카메라 (Diagnostic Instruments, Inc., Sterling Heights, MI)를 이용하여 결정화 실험을 포함하는 영역의 이미지를 2주 동안 촬영하였다.
FID 칩에 의한 에노일 - CoA 수화효소의 결정화
상술한 나노 패턴화 방법을 이용하여 단백질 결정화를 위한 FID 슬립칩을 제조하였다. 국산 스크리닝 키트로부터의 48개의 침전제를 3개의 슬립칩 내에 로딩하였으며, 각 칩 내에는 16개의 침전제가 존재하였다. 즉 상기 로딩 과정은 FID 칩의 식품 염료 실험에서와 동일하였다. 슬라이딩 이후에 침전제 영역 및 단백질 영역을 단백질 넥에 의해 연결시켜 FID 실험을 개시하였다. 각 슬립칩은 개별 페트리 접시 내 FC-70에서 침지시켰다. 페트리 접시를 23 °C 배양기에 저장하고, 그 결과는 2주 동안 모니터링하였다. 결정을 포함하는 영역의 이미지를 2주 동안 촬영하였다.
하이브리드 슬립칩에 의한 에노일 - CoA 수화효소의 결정화
상술한 나노 패턴화 방법을 이용하여 단백질 결정화를 위한 하이브리드 슬립칩을 제조하였다. 국산 스크리닝 키트로부터의 48개의 침전제를 3개의 슬립칩 내에 로딩하였으며, 각 칩 내에는 16개의 침전제가 존재하였다. 즉 상기 로딩 과정은 하이브리드 칩의 식품 염료 실험에서와 동일하였다. 1단계의 슬라이딩 이후에 미세 배치 및 FID 실험 모두를 설정하였다. 각 슬립칩은 개별 페트리 접시 내 FC-70에서 침지시켰다. 페트리 접시를 23 °C 배양기에 저장하고, 그 결과는 2주 동안 모니터링하였다. 결정을 포함하는 영역의 이미지를 2주 동안 촬영하였다.
미세 배치 슬립칩에 의한 바베시아 보비스로부터의 디하이드로폴레이트 환원 효소/티미딜레이트 합성효소의 결정화
SSGCID로부터 단백질 시료를 수득하였다. 미세 배치 슬립칩을 이용한 스크리닝 분석을 에노일-CoA 수화효소에 대해 상술한 동일한 방식으로 수행하였다.
FID 칩에 의한 디하이드로폴레이트 환원효소/ 티미딜레이트 합성효소의 결정 화
SSGCID로부터 단백질 시료를 수득하였다. FID 슬립칩을 이용한 스크리닝 분석을 에노일-CoA 수화효소에 대해 상술한 동일한 방식으로 수행하였다.
하이브리드 슬립칩에 의한 디하이드로폴레이트 환원효소/ 티미딜레이트 합성 효소의 결정화
SSGCID로부터 단백질 시료를 수득하였다. 하이브리드 슬립칩을 이용한 스크리닝 분석을 에노일-CoA 수화효소에 대해 상술한 동일한 방식으로 수행하였다.
UV -현미경을 이용한 단백질 결정의 시각화
슬립칩 상에서의 모든 결정화 분석에서 수득된 결정이 실재 단백질 결정인지를 확인하기 위해, 본 발명자들은 UV-현미경(PRS-1000, Korima Inc., Carson, CA)을 이용하였다. 명시야 이미지 및 UV광 하의 이미지를 촬영하였다. 상기 결정으로부터의 UV 신호가 검출되고 상응하는 결정화 조건이 성공적으로 확인되는 경우에 상기 결정을 단백질 결정으로 확인하였다.
웰 플레이트 중의 디하이드로폴레이트 환원효소/ 티미딜레이트 합성효소의 결 정화
디하이드로폴레이트 환원효소/티미딜레이트 합성효소의 결정화는 버크홀데리아 슈도말레이로부터의 글루타릴-CoA 디하이드로게나제에 대해 상술한 바와 같이 웰 플레이트 상에서 수행되었다.
X선 회절 및 데이터 처리
X선 회절 및 데이터 처리는 본 적용 예에서 다른 경우에 개시된 바와 같이 수행되었다.
디하이드로폴레이트 환원효소/ 티미딜레이트 합성효소의 X선 구조 결정
디하이드로폴레이트 환원효소/티미딜레이트 합성효소의 구조는 출발 모델로서 PDBid 3I3R 구조를 이용하고 CCP4 슈트(suite)에서의 MOLREP 프로그램을 이용하여 분자 치환에 의해 해석되었다. PEG-400을 함유하는 조건에서 성장된 결정으로부터 수집된 데이터가 사용되었다. 강체, 위치 및 온도 인자 정련(refinement)은 프로그램 REFMAC5에 의해 최대 가능성 표적물질을 이용하여 수행되었다. SigmaA-가중치 2Fobs-Fcalc 및 Fobs-Fcalc 푸리에 맵(Fourier map)은 CCP4를 이용하여 산정하였다. 푸리에 맵을 표시하고, COOT에서 검토하였다. 새로운 용매 분자에 대한 조사는 COOT의 도움으로 수행되었다. 상기 구조는 단백질 데이터 은행에 PBDid: 3KJR로 기탁되었다.
혼합 비율의 정량화: 영역 크기의 특성화
초기 영역(에칭 이전)은 제 1 측면과 제 2 측면, 그리고 제 4 측면과 제 5 측면 사이의 2개의 마주보는 직각을 갖는 육각형이다 상기 영역의 체적은 수학식 1로 표시되며, 여기서 W1는 상기 영역의 초기 폭(제 3 측면과 제 6 측면 사이의 거리)이고, L 은 상기 영역의 초기 길이(제 3 측면과 제 6 측면의 길이)이고, r은 팽창 거리이고, d는 에칭 이후의 상기 영역의 깊이다.
수학식 1
Figure pct00014
에칭 이후의 상기 영역의 크기는 마이크로 자(micro-ruler)로 산정된 Leica MZ 16 Stereoscope를 이용함으로써 측정되었다. 팽창 거리(r)은 수학식 2를 이용하여 산정되며, 여기서 W2는 에칭 이후의 상기 영역의 폭(W1과 동일한 축에 따른 폭)이다.
수학식 2
Figure pct00015
본 발명자들은 상기 에칭 속도가 모든 방향에서 동일하여, 상기 영역의 초기 패턴이 모든 방향에서 동일한 거리로 팽창한다고 추정하였다. 패창 거리(r)은 깊이(d)와 동일한 것으로 추정된다. 따라서, 상기 영역의 체적은 수학식 1과 2를 조합함으로써 산정될 수 있다.
수학식 3
Figure pct00016
상기 슬립칩의 영역은 W1는 항상 236 μm이고 L 0, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180 및 200 μm로 가변되도록 설계될 수 있다. 육각형의 각도는 90 또는 135도이다. 상기 영역을 60 μm의 깊이가 되도록 에칭함으로써, 상기 영역은 각각 4.0, 4.4, 4.8, 5.2, 5.6, 6.0, 6.4, 6.8, 7.2, 7.6 및 8.0 nl의 체적을 갖도록 설계될 수 있다.
본 발명의 특정 실시예들에서, 상기 슬립칩은 비드 기반 면역 분석과 같은 비드 기반 분석을 수행하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시예들에서, 비드 기반 슬립칩 방법은 다단계 슬라이딩, 비드의 칩 내로의 로딩, 역역에서의 비드 취급, 하나의 층에서 다른 층으로의 비드의 전달, 및 이후의 미끄럼에 의한 하나의 영역에서 다른 영역으로의 비드의 전달을 포함할 수 있다. 세척 비드는 전후 슬라이딩, 전방향 슬라이딩 및 일련의 희석을 포함하는 다수의 메커니즘에 의해 실시될 수 있다. 친수성 영역은 하나의 영역 내 유체의 박층을 유지하기 위해 사용될 수 있으며, 보다 많은 체적으로 세척될 수 있는 작은 체적을 생성함으로써 일련의 효과적인 희석을 위해 사용될 수 있으며, 상기 박층 내외로의 확산을 가속화하기 위해 사용될 수 있다. 매우 얇은 나노 규모의 영역(예를 들어, 약 100 nm, 1 um와 10 um 사이)은 매우 신속한 면역 분석을 위해 공정화된 항체를 포함할 수 있다. 이 같은 면역 분석은, 예를 들어 파라티오리드 호르몬(Parathyroid Hormone)을 검출하기 위해 신속한 분석용으로 유용할 수 있다. 또한, 이 같은 영역 상의 미끄럼에 의한 과량의 재료의 제거는, 예를 들어 Maerkl SJ, Quake SR. "A Systems Approach to Measuring the Binding Energy Landscapes of Transcription Factors" Science, 2007, 315:233-237에 개시된 적용 예에서 보다 약한 결합을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 슬립칩 면역 분석을 위해, 비드가 아래로 유지되거나, 캡쳐 항체가 표면 상에 고정화되어 있는 경우, 유체를 배열된 영역 및 덕트를 통해 흐르게 함으로써 직접 세척을 수행할 수 있다(교차 오염을 감소시키기 위해 모든 영역을 순차적으로 세척하는 것이 아니라 병행하여 세척하는 것이 바람직함).
상기 영역에서 세포 배양을 성장시키고, 유지하고, 분석할 수 있다. 하나의 영역에서 적어도 하나의 세포가 존재할 수 있으며, 분석은, 예를 들어 면역 분석에 의해 수행될 수 있다. 이는 세포의 분비, 세포의 용리(lysing), 세포의 자극, 및 예를 들어 면역 분석을 포함하는 임의의 방법에 의한 상기 결과의 분석, 또는 시약을 첨가하기 위한 미끄럼에 의한 자극, 및 면역 분석을 포함한 임의의 방법에 의한 분석을 포함할 수 있다.
상기 슬립칩은, 예를 들어 화학 전극을 포함하는 다른 장치로부터 수득될 수 있는 다수의 시료를 분석하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 다수의 작은 체적의 시료는 슬립칩 내에서의 비드 기반 ELISA 분석법을 이용하여 병행하여 분석될 수 있다. 작은 체적의 시료를 분석하는 것이 중요한 상황으로는 화학 전극으로부터 시료를 분석하는 것을 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 생체 시스템에 대한 이해는 일시적인 해상도를 갖는 분자적 신호를 전달하고, 캡쳐하고 해석하기 위한 도구를 포함할 수 있다. 새로 개발된 화학 전극은, 다수의 독립적인 기술에 의해 후속적으로 병행하여 분석되는 수백개의 나노리터-체적 플러그의 어레이에서 분자적 신호를 기록함으로써 충족되지 않은 이러한 요구를 제기한다. 상기 화학 전극은 높은 민감도, 특이성, 및 대량 처리량으로 나노리터 체적의 기록 플러그를 분석하는 방법으로 이익을 얻을 수 있다. 면역검정은 생체적 연구에서 높은 특이성 및 민감도를 갖는 분자적 마커를 검출하기 위해 가장 빈번히 사용되는 기술들 중 하나이다. 이들 nL-플러그에 대해 면역검정법을 개발하면, 상기 화학 전극의 분석 능력이 향상된다. 작은 체적의 시료를 분석하는 것이 중요한 다른 상황으로는 진단법 및 임상 연구를 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 시간에 대한 종양의 일련의 모니터링은 작은 시료의 샘플링 및 이들의 분석을 반복하는 것을 요구한다. 또한, 혈액 은해에 기탁된 혈액 시료의 불필요한 방혈(depletion)을 피하기 위해, 테스트는 작은 체적의 분석을 요구한다. 작은 체적의 시료를 분석하는 것이 중요한 다른 상황으로는 단일 세포 분석, 살아있는 세포, 예를 들어 망막(Lu, Miao-Jen, 등 Exp Diabetes Res. 2007; 2007: 39765), 및 작은 시료 (예를 들어, 배아로부터의 재료)의 나노 유동 샘플링을 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 특정 상황에서 가장 큰 병목현상은 다수의 작은 체적을 병행하여 처리(예를 들어 비드와 시료의 조합, 및 시약의 첨가)하는 것이다. 나노리터 방울을 조작하기 위한 전형적인 방법은 플러그를 하나씩 직렬로 처리하는 것이다. 특정 실시예들에 있어서, 이는 플러그의 인덱싱(indexing)이 중요한 경우에는 덜 바람직한데, 이는 오차가 축적될 수 있기 때문이다. 어레이에서 나노리터 방울을 배열하기 위한 현재의 장치의 다수의 예가 방출의 조작(시약의 첨가 및 비드의 취급)을 허용하지 않는다. 디지털 미세 유체공정은 마이크로리터 체적으로 수행된다. 다수의 미세 유체 장치는 시료를 도입하기 위해 층류에 의존한다. 이들은 큰 사멸 체적 및/또는 흡착 문제를 가질 수 있다. 상기 슬립칩의 특정 실시예는 복합체의 사용 없이 다수의 다단계 반응을 병행하여 강력하게 취급할 수 있다. 본 발명자들은 슬립칩을 이용하여 다수의 작은 시료를 병행하여 분석하기 위해 비드 기반 ELISA를 수행하는 간단한 접근법을 개발하였다. 본 발명자들은 다단계 슬라이딩을 혼입하기 위해 특정 실시예의 슬립칩을 설계하고, 비드의 로딩 및 세척을 증명하기 위해 실험을 수행하였다. 다단계 슬라이딩은 본 발명자가 하나의 층에서 다른 층으로 비드를 전달한 후, 하나의 영역에서 다른 영역을 상기 비드를 전달하도록 한다. 이들 실시형태에서, 일련의 희석에 의한 전방향 슬라이딩 및 전후 슬라이딩과 같은 2개의 메커니즘에 의해 비드는 세척될 수 있다. 친수성 영역은 이러한 슬립칩의 영역에서 유체의 박층을 유지한다. 상기 친수성 영역은 또한 보다 큰 체적으로 세척될 수 있는 작은 체적을 생성함으로써 효과적인 일련의 희석을 가능케 한다. 상기 슬립칩의 실시형태에 의해 본 발명자들이 달성한 검출 한계는 다수의 분자 마커의 생리학적 농도 범위 이내인 pM 범위까지 낮추었다.
상기 슬립칩의 실시예는 48회의 면역 분석을 병행하여 수행할 수 있도록 설계되었다. 이는 2개의 부분, 부분 A 및 부분 B를 포함한다. 부분 A는 다수의 작은 시료를 로딩하기 위해 사용된다. 즉, 이러한 부분의 설계는 서로 다른 시료 공급원의 서로 다른 요건을 수용하기 위해 가변성이다. 비드 기반 ELISA를 수행하는 것을 증명하기 위해, 각각 7개의 영역(1 nl, 10 μm의 깊이)으로 이루어진 6개 그룹을 갖도록 장치를 제작하였다. 상기 시료(하부 플레이트)을 위한 영역, 및 상기 시료 (상부 플레이트)을 위한 덕트가 배열되는 경우, 6개의 개별 유체 경로가 형성되며, 각 유체 경로는 개별 입구로의 피펫팅에 의해 채워진다. 각 유체 경로는 또한 상기 용액을 위한 개별 출구를 포함한다. 이들 실험에서, 6개의 표준 구경 측정기는 상기 시료를 위한 6개의 유체 경로 내로 로딩되었다. 부분 B는 비드 기반 ELISA를 수행하기 위해 사용된다. 즉, 이는 상기 장치의 코어 부분이다. 이는 48개의 영역(9 nL, 80 μm의 깊이)의 6개의 열을 포함한다. 제 1 열에서의 영역은 캡쳐 항체와 결합된 자기적 비드를 포함하는 혼합 용액을 로딩하기 위해 사용된다. 제 2, 제 3, 제 4 및 제 5 열에서의 영역은 세척 완충액을 로딩하기 위해 사용된다. 제 6 열에서의 영역은 기질을 포함하는 용액을 로딩하기 위해 사용된다. 슬립칩의 실시예에서 상부층은 시료를 로딩하기 위해 입구, 출구 및 덕트를 포함하며, 다양한 시약을 위한 입구, 출구 및 영역을 포함할 수 있다. 상기 슬립칩의 실시예에서 하부층은 시료를 위한 영역, 및 시약을 로딩하기 위한 영역을 포함할 수 있다.
특정 실시예들에서, 슬립칩은 미세 제조된 2개의 유리 층으로 구성되어 있다. 상부층은 입구, 출구, 시료를 위한 덕트, 및 시약을 위한 영역을 포함할 수 있다. 하부층은 시료를 위한 영역 및 시약을 위한 덕트를 포함할 수 있다. 상기 영역의 향상된 충전을 위해, 상기 장치의 표면은 상기 영역을 친수성으로 유지하면서 소수성이 되도록 실란화될 수 있다. 상기 영역은 친수성 표면을 유지하기 위해 실란화 도중에 보호될 수 있다. 교차 오염의 잠재적인 공급원은 슬라이딩 이후에 분리되어야 하는 영역을 연결시키는 상기 슬립칩의 특정 실시예의 2개의 플레이트 사이에 용액의 박막을 형성하는 것이다. 이는 상기 용액이 슬립칩의 표면을 적시는 경우에 야기된다. 상기 영역 및 덕트 내부를 제외한 상기 슬립칩의 특정 실시예의 표면 상에서 BSA 함유 용액의 습윤화(wetting)를 최소화하기 위해, 상기 영역 및 덕트 외부의 표면 상에 나노 패턴을 형성할 수 있다. 나노 패턴화는 용액과 표면 사이의 접촉각을 증가시키며, 따라서 표면의 습윤화가 방지된다.
특정 실시예에서, 슬립칩을 이용하여 면역 분석을 수행하는 것은, 3개의 일반적인 단계, 즉 (a) 시약을 사전 로딩하는 단계, (b) 시료를 로딩하는 단계, 및 (c) 분석을 수행하는 단계를 포함한다. 특정 실시예에서, 시약은 8개의 단계로 사전 로딩될 수 있다. 즉, (1) 시약 덕트에 의해 제 1 열의 상기 영역이 연결되도록 슬립칩이 조립된다. (2) 예를 들어, 캡쳐-항체 피복된 초상자성 비드 및 효소-표지된 검출용 항체를 함유하는 시약 용액을 슬립칩에 주입하고, 제 1 열에서의 영역이 채워진다. (3) 상기 칩은 덕트에 의해 제 2 열의 영역을 연결시키기 위해 미끄러지게 된다. (4) 플루오르화 탄소는 덕트 내 임의의 잔류 용액을 제거하기 위해 상기 덕트를 통해 주입된다. (5) 세척 완충액은 슬립칩 중의 이 같은 열에 있는 영역을 채우기 위해 주입된다. (6) 상기 칩은 덕트에 의해 다음 열의 영역을 연결시키기 위해 미끄러지게 된다. (7) 단계 (4), 단계 (5) 및 단계 (6)을 3회 반복하여 제 3 및 제 4 열을 완충액으로 채운다. (8) 플루오르화 탄소는 임의의 잔류 용액을 제거하기 위해 상기 덕트를 통해 주입되고, 효소적 기질은 제 6 열을 채우기 위해 주입된다.
일 실시예에서, 시료는 2개의 단계에 의해 로딩된다. 즉, (1) 슬립칩은 덕트에 의해 영역을 연결시키기 위해 미끄러지게 되고(이는 사용자가 사용하기 용이한 상태가 됨), (2) 검체의 용액은 입구를 통해 피펫팅함으로써 주입된다.
특정 실시예들에서, 분석은 5개의 단계로 수행될 수 있다. 즉, (1) 슬립칩은, 검체 및 예를 들어 항체 및 비드의 시약 용액을 조합하기 위해 미끄러지게 되며, 상기 용액은 항체 샌드위치가 형성되도록 하기 위해 배양되고, (2) 자석은 하부 플레이트의 영역 내로 비드를 끌러 내리기 위해 하부층의 배면 에 대해 들어 올려지고, 분석 용액 및 세척 완충액은 슬립칩을 천천히 미끄러지게 함으로써 조합되어, 상기 자석이 제거될 지라도 상기 비드는 하부 플레이트의 영역에 잔류하게 되고, (3) 단계 (2)를 3회 반복하고, (4) 자석을 사용하여 하부 플레이트의 영역 내로 비드를 끌러 내리고, 슬립칩은 항체 샌드위치 및 기질을 조합하기 위해 미끄러지게 하며, (5) 형광 현미경을 이용하여 형광도의 증가를 모니터링한다. 형광도는 당업자에게 공지된 기술을 이용하여 검체의 농도와 상호 관련이 있게 한다.
부분 A 및 부분B의 2개의 부분을 포함하는 일 실시형태에서, 8개의 단계가 사용되어 시약을 상기 슬립칩에 사전 로딩할 수 있다. 부분 B의 제1 열의 영역은 시약 덕트에 의해 연결될 수 있다. 캡쳐-항체-피복된 초상자성 비드 및 효소-표지된 검출용 항체를 포함하는 시약 용액은 상기 슬립칩 내로 주입되어, 부분 B의 제1 열 중의 영역을 채울 수 있다. 슬립칩은 덕트에 의해 부분 B의 제2 열의 영역을 연결시키기 위해 미끄러지게 될 수 있다. 플루오르화 탄소는 덕트 중의 임의의 잔류 용액을 제거하기 위해 상기 덕트를 통해 주입될 수 있다. 세척 완충액은 상기 슬립칩에서 이 같을 열 중의 영역을 채우기 위해 주입될 수 있다. 상기 슬립칩은 덕트에 의해 다음 열의 영역을 연결시키기 위해 미끄러지게 될 수 있다. 이들 단계는 완충액으로 제 3, 제 4 및 제 5 열을 채우기 위해 3회 반복될 수 있다. 플루오르화 탄소는 임의의 잔류 용액을 제거하기 위해 상기 덕트를 통해 주입될 수 있으며, 효소적 기질은 부분 B의 제 6 열을 채우기 위해 주입될 수 있다. 2개의 단계를 이용하여 상기 슬립칩의 이러한 실시형태 내로 시료를 로딩할 수 있다. 슬립칩은 상기 시료용 덕트에 의해 부분 A 중의 영역을 연결시키기 위해 미끄러지게 될 수 있다. 상기 검체의 용액은 입구를 통해 피펫팅함으로써 주입될 수 있다. 5개 단계가 면역 분석을 수행하기 위해 사용될 수 있다. 슬립칩은 검체 및 항체와 비드의 시약 용액을 조합하고 항체 샌드위치가 형성되도록 하기 위해 용액을 배양하기 위해 미끄러지게 될 수 있다. 자석은 하부 플레이트의 영역 내로 비드를 끌어 내리기 위해 사용될 수 있고, 슬립칩은 분석 용액 및 세척 완충액을 조합하기 위해 미끄러지게 될 수 있다. 필요한 경우, 단계를 반복할 수 있다. 자석은 하부 플레이트의 영역 내로 비드를 끌어 내리기 위해 사용될 수 있으며, 슬립칩은 항체 샌드위치 및 기질을 조합하기 위해 미끄러지게 될 수 있다. 형광도의 증가는 형광 현미경을 이용하여 모니터링될 수 있다.
예를 들어, 제 1 내지 제 6열을 포함하는 상술한 실시형태와 유사한 실시형태는 복수의 분석이 병행하여 수행되도록 복수의 세트, 예를 들어 6개의 열 부분이 단일 슬립칩 상에 제작될 수 있도록 이루어질 수 있다는 것이 당업자에게 자명할 것이다.
다른 실시형태에서, 슬립칩을 이용하여 다수의 시료, 예를 들어 나노리터 시료를 분석하는 것은 인슐린 비드 기반 ELISA를 이용함으로써 수행될 수 있다. 이를 증명하기 위해, 본 발명자들은 캡쳐 항체, 알칼라인 포스파타제-표지된 항-인슐린 단클론성 항체, 및 차단 완충액으로 피복된 초상자성 비드를 함유하는 용액을 제 1 부분에서 제 1 열의 영역에 주입하여 샌드위치 복합체를 형성하였다. 효소-표지된 검출용 항체를 검출하기 위해, 본 발명자들은 효소인 알칼라인 포스파타제 (ALP)에 의한 가수분해시 형광성으로 되는 효소인 플루오레신 디포스페이트 (FDP)용으로 형광 기질을 이용하였다. 본 발명자들은 6개의 인슐린의 표준 구경 측정기 용액(0 pM, 7 pM, 70 pM, 350 pM, 1050 pM, 및 2100 pM)을 동일한 칩의 부분에 주입하였다. 각 영역에서의 형광 강도는 시간에 대해 측정되었다. 본 발명자들은 배경 신호의 편차의 3배로서 한정된 검출 한계는 약 9 pM임을 발견하였다.
인슐린 면역 분석은 다수의 작은 시료를 이용하여 슬립칩 상에서 병행하여 수행될 수 있다. 인슐린 면역 분석의 서로 다른 영역에서의 동일한 슬립칩 상의 다수의 시료, 예를 들어, 나노리터 시료의 형광 강도는 시간에 대해 측정될 수 있다.
슬립칩의 특정 실시예에서, 초상자성 비드 기반 분석이 수행될 수 있다. 본 발명자들은 슬라이딩 동안에 이들 비드가 영역 내에 머물고 있다는 것을 증명하였다. 즉 상기 비드는 2개의 플레이트 사이에 트랩핑되지 않았으며, 3% 미만의 손실이 존재하였다. 특정 실시예에 있어서, 비드의 보유는 결과의 정확성을 향상시키는 것이 바람직하다. 상기 비드는 용액의 혼합을 조장하기 위해 움직이는 자석을 이용하여 이동할 수 있다. 특정 실시예에서, 이는 비드의 세척 및 하나의 영역에서 다른 영역으로의 전달 둘 모두를 위해 바람직하다. 자석으로 비드를 이동시키는 것은 혼합을 증가시켜, 세척 효율성을 증가시킬 것이다. 또한 자석은 슬라이딩 이전에 하부 영역으로 비드를 끌어 내리기 위해 사용되어, 상기 슬립칩에서 열에서 열로 전달된 비드의 수를 증가시킬 수 있다. 잔류 효소-표지된 검출용 항체는 세척 완충액 내로 확산될 것이고, 지수적으로 희석되어 결과적으로 무시가능한 수준에 도달할 수 있으며, 그 결과 비드를 세척할 수 있다. 특정 실시예에서, 4회의 세척 주기 이후에, 잔류 시약을 104의 계수로 희석되며, 이는 모든 세척 주기에서 완전한 혼합을 나타낸다. 특정 실시예에서, 본 발명자들은 효소-표지된 검출용 항체의 수준이 상기 슬립칩에서의 세척 이후에 검출 한계 미만으로 존재한다는 것을 증명하였다.
친수성 영역을 갖는 슬립칩의 제조. 본 발명자들은 하기와 같이 변형을 갖는 이러한 적용 예에서 다른 경우에 개시된 슬립 과정의 유리 에칭 제조를 이용하였다. 블랭크 유리 플레이트(소다 석회유리, 두께: 0.7 mm; 크롬 피복: 1025
Figure pct00017
; AZ 포토레지스트: 1 μm)를 2인치 × 1인치가 되도록 먼저 절단하였다. 포토마스크가 유리 플레이트로부터 제거된 이후, 상기 유리 플레이트는 0.5% NaOH 용액에 1분 동안 침지시킴으로써 현상되었다. 본 실시예에서, 상기 유리 플레이트의 전방 상부의 특정 영역은 또한 보다 얇은 영역을 형성하기 위해 PVC 테이프로 테이핑되었다. 유리 플레이트가 PVC 테이프로 테이핑된 이후, 이를 에칭 용액에 침지시키고, 25 °C 항온 수조 교반기를 이용하여 에칭 속도를 제어하였다. 에칭 시간(약 50분)을 제어함으로써, 70 μm의 깊이를 갖는 영역 및 덕트는 유리 플레이트 내로 에칭되었다. 상기 플레이트는 밀리포어 수로 완전히 세정되고, 질소 가스로 건조되었다.
이어서, 보다 얇은 영역을 보호하기 위한 테이프를 제거하고, 상기 플레이트를 약 7분 동안 에칭 용액에 침지하였다. 10 μm 깊이의 영역 영역은 테이프가 제거된 유리 플레이트 상에서 에칭되었다. 이러한 단계 도중에, 70 μm 깊이의 영역 및 덕트는 80 μm의 깊이가 되도록 추가로 에칭되었다. 상기 플레이트는 밀리포어 수로 철저히 세정하고, 질소 가스로 건조하였다.
상기 덕트 및 영역이 상기 플레이트 내로 에칭된 이후, 유리 플레이트를 에탄올로 세척하여 현상되지 않은 포토레지스트를 제거하였다. 이어 상기 플레이트를 OmniCoat로 피복하고, 200 °C에서 1분 동안 베이킹하였다. 다음으로, 상기 플레이트를 SU8 2010의 10 μm 두께의 층으로 피복되고, 상기 플레이트는 소수성이 되어야 하는 상기 플레이트의 영역을 보호하는 포토마스크로 커버되었다. UV 광을 상기 유리 플레이트의 배면으로부터 조사하였다. 포토마스크에 의해 노출된 영역에서, UV 광은 크롬 피복이 제거된 플레이트만을 통과하여, 상기 영역 내 SU8은 현상 이후에 잔류하였다. 상기 영역 중의 SU8은 상기 영역을 보호하여, 이들이 소수성이 되는 것을 방지한다. 노출된 표면 상의 OmniCoat는 4분 동안 CD-26에 침지함으로써 현상되었다.
이어서, S1813 양성 포토레지스트의 층은 상기 플레이트의 상부에 피복되고, 95 °C에서 1분 동안 베이킹되었다. 이어 상기 플레이트는 나노 패턴화 포토마스크에 의해 배열되고, 상기 영역 및 덕트를 에칭하기 위해 상술한 바와 같이 동일한 과정이 수행되었다. 크롬 피복을 제거한 이후, 유리 플레이트를 10배로 희석된 상술한 유리 에칭 용액에 침지시키고, 실온(약 20 °C)에서 10분 동안 에칭하여 표면 상에 약 300 nm 깊이의 패턴을 생성하였다. 최종적으로, 유리 플레이트를 에탄올로 세정하여 현상되지 않은 포토레지스트를 제거하고, 크롬 에칭제에 침지시켜 크롬 피복액을 제거하였다. 이어 유리는 에탄올 및 밀리포어 수로 세척하고, 질소 가스로 건조하였다.
에칭된 패턴은 Veeco Dektak 150 형상 측정기를 이용하여 측정하였다. 유리 플레이트는 세척하고, 산소 플라즈마 처리에 적용한 후, 그 표면을 앞서 상술한 바와 같이 트리데카플루오로-1,1,2,2-테트라하이드로옥틸-1-트리클로로실란으로 3시간 동안 진공 건조기에서 실란화에 의해 소수성이 되게 하였다. 실란화 이후, 상기 유리 플레이트를 120 °C 오븐에서 30분 동안 베이킹하고, FC-3283 탱크에 침지시킴으로써 세정하였으며, 60 °C 오븐에서 하룻밤 동안 건조하였다. 최종적으로, 상기 영역 중의 SU8은 80 ℃에서 30분 동안 유리 플레이트를 Remover PG에 침지시킴으로써 제거되었다.
슬립칩의 조립. 슬립칩을 FC-40 하에서 조립하였다. 먼저, 하부 플레이트를 페트리 접시에서 FC-40에 침지시켜, 패턴이 상부로 향하게 하였다. 이어, 상부 플레이트를 하부 플레이트의 상부에 위치시켜, 상기 패턴이 하부로 향하게 하였다. 상기 2개의 플레이트를 서로 대해 이동시킴으로써 도 3a에 도시된 위치 내로 배열되었으며, 이어 2개의 미세 바인더 클립을 이용하여 고정되었다. 슬립칩은 표면 상의 여분의 FC-40이 제거된 이후에 사용 준비가 되었다.
식품 염료의 실례. 모든 식품 염료 용액은 사용 전에 0.45 μm PVDF 시린지 필터로 여과되었다. 상자성 입자에 결합된 마우스 단클론성 항-인슐린의 용액을 원심분리에 의해 6배 농축하였다. 얻어진 비드 현탁액 및 2개의 식품 염료(오렌지색 및 청색, Ateco, Glen Cove, NY, 이의 스톡 용액으로부터 10배 희석됨)를 시약 덕트 내로 피펫-로딩하였다. 각 덕트를 로딩하기 위해, 먼저 2.5 μL의 염료는 염료 용액이 출구를 통해 나타날 때까지 피펫을 이용하여 입구를 통해 밀어 넣었다. 시약을 로딩한 이후, 슬립칩은 시료를 위한 연속적인 유체 경로를 형성하기 위해 미끄러지게 되었다. 적색 염료를 10배로 희석한 후, 시료 입구를 통해 로딩하였다. 피펫을 이용하여 2.5 μL의 염료를 상기 칩의 6개의 유체 시료 경로 각각에 로딩하였다.
인슐린 비드 기반 ELISA. 로딩 과정은 식품 염료 실례의 경우와 유사하였다. 시약 영역을 로딩하고, 6개의 시료 경로를 6개의 표준 인슐린 용액으로 로딩하였다. 상기 항체를 위한 영역, 및 상기 시료를 위한 영역을 조합한 이후, 슬립칩을 37 °C에서 1시간 동안 배양하여 완전한 반응을 가능케 하였다. 이어 슬립칩은 분석을 수행하기 위해 미끄러지게 되었다.
영역의 이미지는 Leica MZ 16 Stereoscope에 연결된 SPOT Insight 카메라(Diagnostic Instruments, Inc., Sterling Heights, MI)를 이용하여 촬영하였다. 상기 영역의 형광 강도는 20 × 0.4NA Leica 대물렌즈 및 Hamamatsu ORCAER 카메라가 구비된 Leica DMI6000 현미경(Leica Microsystems)을 이용하여 측정되었다. GFP 필터를 이용하여 플루오레신 형광을 수집하였다. 메타모프 촬상 시스템 버전 6.3r1(Universal Imaging)을 이용하여 이미지를 획득하고 분석하였다. 먼저, 상기 이미지의 최대 강도를 시간에 대해 플로팅하였으며, 이어 초기 증가 속도를 추출하고, 음성 대조군(어떠한 검출용 항체가 첨가되지 않았다는 것을 제외하고는 상기 분석과 동일함)의 속도로 빼고, 초기 속도를 상응하는 농도에 대해 플로팅하여 보정 곡선을 수득하였다.
슬립칩의 특정 실시예에서, 면역 분석은 7개의 단계로 수행될 수 있다: (A) 나노리터-체적의 검체 용액을 플루오르화 탄소 아래로 침지된 슬립칩의 하부층에서의 영역 상에 침적되었다. (B) 슬립칩을 조립하고, 캡쳐-항체로 피복된 초상자성 비드 및 효소-표지된 검출용 항체를 포함하는 시약 용액을 하부 플레이트의 덕트 및 상부 플레이트의 영역에 의해 형성된 유체 경로 내로 주입된다. (C) 슬립칩은 검체 및 시약 용액을 조합하기 위해 미끄러지게 되고, 자석은 하부 플레이트의 영역 내로 비드를 가라앉히기 위해 사용된다. 샌드위치가 형성되도록 하기 위해 배양된다. (D) 슬립칩은 단계 (B)에서의 구성으로 다시 미끄러지게 되고, 세척 완충액은 하부 플레이트의 덕트 및 상부 플레이트의 영역에 의해 형성된 유체 경로 내로 주입된다. (E) 슬립칩은 세척 완충액 및 분석 용액을 조합하기 위해 미끄러지게 된다. 단계(D) 및 (E)를 반복하여 느슨하게 결합되어 있는 효소-표지된 검출용 항체를 제거한다. (F) 슬립칩을 미끄러지게 하고, 효소 기질을 하부 플레이트의 덕트 및 상부 플레이트의 영역에 의해 형성된 유체 경로 내로 주입한다. (G) 슬립칩은 기질 및 항체-샌드위치를 조합하기 위해 마지막으로 미끄러지게 된다. 검체의 농도는 형광도의 증가를 측정함으로써 모니터링된다. 형광도의 증가는 검체의 농도와 상호 관련이 있다. 상기 슬립칩의 실시형태에서 로딩, 전달 및 세척된 비드의 일례로서, 비드는 피펫팅에 의해 슬립칩의 영역 내로 균일하게 로딩되고, 비드는 자석 및 슬라이딩을 이용함으로써 하나의 층에서 다른 층으로 전달된다. 상기 비드는 슬라이딩 도중에 상기 영역에 머무를 것이다. 비드를 용액의 혼합을 촉진하기 위해 움직이는 자석을 이용하여 이동할 수 있다. 특정 실시예에서, 이는 효율적인 세척을 위해 바람직하다. 특정 실시예에서, 특정 효소적 반응과 같이 혼합은 반응 혼합물의 균일성을 개선하는데 있어 바람직하다.
일 실시예에서, 슬립칩에서 초상자성 비드를 취급하는 것은 하기 단계를 포함하였다: 나노리터-체적 용액은 하부 플레이트에 침적되고, 슬립칩은 조립되고, 용액에 현탁된 비드는 슬립칩 내로 주입되고, 슬라이딩 및 자력을 이용하여 하부 플레이트의 영역 내로 비를 가라앉게 하고, 슬립칩은 초기 구성으로 다시 미끄러지게 되고, 완충액은 유체 경로의 임의의 잔류 용액을 제거하기 위해 슬립칩 내로 주입되었다.
이어, 슬립칩에서 느슨하게 결합된 검출용 항체 거의 모두를 제거하기 위해 초상자성 비드를 세척하기 위한 일례가 개시되어 있다. 먼저, 본 발명자들은 하부 플레이트의 13-24 영역 및 37-48 영역에서 효소-표지된 검출용 항체(알칼라인 포스파타제 표지된 항-인슐린 단클론성 항체)의 용액을 침적시켰다. 대조군으로서, 본 발명자들은 또한 1-12 웰 및, 25-36 웰에 완충액 용액을 침적시켰다. 이어 본 발명자들은 차단 완충액에 현탁된 캡쳐-항체 피복된 초상자성 비드를 슬립칩내로 주입하였다. 본 발명자들은 상기 장치를 미끄러지게 하고, 상기 비드를 검출용 항체와 조합하였다. 세척 완충액을 도입하기 위해, 본 발명자들은 자력을 이용하여 하부 플레이트의 영역 내로 비드를 가라앉혔고, 상기 장치를 미끄러지게 하였다. 세척 완충액을 주입하였다. 이어, 본 발명자들은 상기 비드와 세척 완충액을 조합하기 위해 상기 장치를 미끄러지게 하였다. 느슨하게 결합된 검출용 항체는 비드가 하부 플레이트의 영역에 잔류하는 동안에 세척 완충액 내로 확산될 것이다. 세척단계를 반복함으로써, 잔류 효소-표지된 검출용 항체를 지수적으로 희석하고, 결과적으로 무시가능한 수준에 도달하였다. 이 시점에 비드가 세척되는 것을 간주된다. 일례로, 세척 단계를 12회 반복하고, 잔류 검출용 항체의 양은 출발 농도의 ~0.2%가 되었으며, 이는 모든 세척 주기 에서 완전한 혼합을 의미한다. 잔류 효소-표지된 검출용 항체를 검출하기 위해, 본 발명자들은 효소인 알칼라인 포스파타제 (ALP)에 의한 가수분해시 형광성이 되는 효소인 플루오레신 디포스페이트(FDP)에 위해 형광 기질을 사용하였다. 본 발명자들은 상기 장치를 미끄러지게 하고, FDP를 주입하였다. 최종적으로, 본 발명자들은 상기 영역에서 기질 및 임의의 잔류 효소-표지된 검출용 항체를 조합하기 위해 상기 장치를 미끄러지게 하였다. 각 영역에서의 형광 강도를 측정하였다. 본 발명자들은 ALP-항체에 의해 침적된 영역, 및 완충액에 의해 침적된 영역에 대해 형광 강도도 매우 약하고 동일하다는 것을 발견하였다. 또한 형광 강도는 완충액과 혼합된 기질 용액의 형광도와 동일하였다. 이러한 결과에 따르면, 효소-표지된 검출용 항체의 수준은 세척 이후에 검출 한계 미만인 것으로 나타났다. 양성 대조군으로서, 본 발명자들은 세척 단계를 방치함으로써 세척이 없는 영역에 FDP를 첨가하였다. ALP-항체로 침적된 영역은 강한 형광성을 나타냈으며, 이는 상기 시약 및 방법이 잔류 ALP-항체를 검출하는데 효과적이라는 것을 보여준다. 계속해서, 이들 실험에 따르면, 잔류 검출용 항체는 슬립칩에서 전후 슬라이딩과 함께 세척에 의해 비드로부터 실질적으로 제거될 수 있는 것으로 나타났다.
슬립칩에서의 전방향-슬라이딩 방법은 칩 상의 단일세포의 분석을 인용하고 플러그 내에 수집된 시료를 분석하도록 변경될 수 있다. 본 발명자들은 칩 상에 로딩된 단일 β-세포로부터의 인슐린 분비를 측정하는데 전방향-슬라이딩 방법을 사용하였다(화학 전극에 의해 샘플링된 마우스 섬으로부터의 인슐린 분리). 우선, 본 발명자들은 칩 상에 로딩된 단일세포의 분석을 허용하도록 부분 A의 설계를 변경시켰다. 이 설계에서, 부분 A는 영역의 2개의 열을 갖고(하나는 하부 플레이트 내 및 하나는 상부 플레이트 내에 존재함), 부분 B는 전술한 바와 같이 서로 동일하다. 본 발명자들은 상부층 - 이는 부분 A에서 영역의 제 2 열 - 상에서 영역의 제 1 열에 단일 β-세포를 로딩 및 배양하였다.본 발명자들은 로딩 하부층 상의 영역의 열에 - 부분 A에서 영역의 제 1 열 - 글루코스 용액을 로딩하였다. 이 설계에는 β-세포 및 글루코스 용액을 합치는 하나의 추가 슬라이딩 단계를 포함하였다. β-세포 및 글루코스 용액을 합친 후, 본 발명자들은 전술한 바와 같이 시료를 부분 B를 통해 미끄러지게 하여서 인슐린 비드 기반 ELISA를 수행하였다. 이 설계는 단일세포로부터 시작되는 영역에서 세포의 순수한 배양을 성장시키는데 사용될 수 있다. 이 설계는 또한 단일세포를 자극 및 분석하는데 사용될 수 있다. 상기 세포는 특정 시약과 접촉하도록 미끄러지게 함으로써 자극될 수 있으며, 세포의 분비 또는 세포 용해질 모두는 (전술한 바와 같은) 면역검정 또는 다른 방법에 의해 분석될 수 있다.
본 발명자들은 또한 화학 전극에 의해 샘플링된 단일 섬으로부터의 인슐린 분비의 분석을 허용하도록 부분 A의 설계를 변경하였다. 이 설계에서, 부분 A는 상부 플레이트 내에 영역의 2개의 열을 갖는다. 제 1 열은 화학 전극을 사용하여 캡쳐된 플러그로 로딩되고, 제 2 열은 완충액으로 사전 로딩된다. 부분 B의 6개의 열은 전술한 바와 같이 사전 로딩된다. 본 발명자들은 글루코스에 의해 단일 섬을 자극하고, 화학 전극을 사용하여 플러그 내의 인슐린 방출을 샘플링하였다. 이 경우, 화학 전극은 플러그의 어레이를 생성시키며, 인슐린 방출의 일시적 용해를 나타낸다. 슬립칩은 플루오르화 탄소 하에서 조립하였다. 본 발명자들은 우선 2개의 층을 조립하기 전에 상부층 상의 영역의 제 1 열 내에 시료 플러그를 직접 침적시킨 후, 상부층 상의 영역의 제 1 열이 하부층 내의 웰들의 열과 정렬되도록 조심스럽게 2개의 층을 배열시켰다. 이 슬립칩 설계의 상부 열은 입구 또는 출구를 포함하지 않는데, 이는 플러그가 슬립칩의 영역 상에 직접 침적되기 때문이다. 본 발명자들은 우선 시료를 완충액 중에 미끄러지게 함으로써 이를 희석시켰다. 그 다음, 본 발명자들은 희석된 시료를 부분 B 를 통해 미끄러지게 하여서 전술한 바와 같은 인슐린 비드 기반 ELISA를 수행하였다.
슬립칩은 또한 매우 신속한 면역검정을 위해 고정화된 항체를 함유하는 매우 얇은 영역(예를 들어, 약 100 nm, 1 μm, 또는 10 μm)으로 설계될 수 있다. 세척은 또한 활성 방법에 의해 실시될 수 있다: 비드가 자장에 의해 고정화되거나 또는 캡쳐 항체가 영역들의 표면에 고정화되면, 비드는 배열된 영역 및 덕트를 통해 유체를 진행시킴으로써 직접 세척될 수 있다. 활성 세척에서 교차 오염을 방지하기 위해, 영역들을 순차적으로 세척하는 대신 평행하게 세척한다. 특정 실시예에서, 입구 덕트 및 출구 덕트에 따른 압력 강하가 세척되는 개별 유체 경로에 따른 압력 강하보다 적도록(예를 들어, 10배) 상기 장치를 설계하는 것이 바람직하다. 나노 규모의 영역을 세척하는 경우, 유체 저항은 높아지기 쉬우며, 이 조건은 희생되기 쉽다. 세척 유체를 위한 입구 덕트 및 출구 덕트는 사멸될 수 있으며, 좁은 덕트는 다른 덕트를 향한다. 고정화된 항체를 함유하는 영역들이 미끄러지고 배열되어서 입구 덕트 및 출구 덕트를 연결하는 경우, 세척 유체를 상기 영역들을 통과시켜 세척할 수 있다.
비드를 사용하여 시료를 제조하는데 슬립칩의 특정 실시예를 사용할 수 있다: 슬립칩에서 영역-영역으로 비드를 전달하고 이들을 서로 다른 시약에 노출시킴으로써, 시료 정제 및 제조는 킹피셔 시스템(Kingfisher system)에서 진행된 바와 같이 달성될 수 있다. 세척 및 농축은 다수의 전계 및 효과에 의해 강화될 수 있다. 예를 들어, 전기 농도는 전계를 사용하여 나노구멍 또는 덕트 부근의 분자를 농축시킨다.
슬립칩의 특정 실시예는 자성 면역검정, 예를 들어 필립스 코포레이션(Philips Corporation)에 의해 개발된 것과 혼화 가능하다. 슬립칩의 특정 실시예는 후생 유전학적(epigenetic) 정보를 수득하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 히스티딘의 , , , 및 는 분석될 수 있으며, 슬립칩의 특정 실시예는 크로마틴 면역 침전법 (ChIP)을 단일 세포 수준까지 수행 및 분석하는데 사용될 수 있다.
슬립칩의 특정 실시예는 PCR 실험을 수행하는데 사용될 수 있다. 적어도 3개의 서로 다른 슬립칩 기반 PCR 예는 다음과 같다: 다중화된 PCR 실험을 수행하기 위한 사전 로딩된 슬립칩, 디지털 PCR 실험을 위해 설계된 슬립칩, 및 PCR을 위해 비드 상에 박테리아를 트래핑하고 상기 비드를 슬립칩 내에 로딩하는 과정.
슬립칩의 특정 실시예는, 오일 영역의 상부의 슬라이딩, 유리 상의 비-불소화된 오일 / 미네랄 오일; 및/또는 비-불소화된 실란화의 사용, 상부에 오일을 갖는 건조한 시약(예를 들어, 프라이머)의 사용, 및 PCR 혼합물 드롭이 프라이머와 접촉하도록 PCR 혼합물을 갖는 영역보다 좁은 영역을 포함할 수 있다. 시약을 선택 사항으로 갖는 오일이 함유된 영역에 걸쳐 수성 용액이 함유된 영역을 미끄러지게 하는 경우, 상부 영역의 내용물은 오일과 교체된 후, 바닥부에 침적된 시약과 반응할 수 있다. 일부 오일이 상기 영역에 남아있어서 열적 팽창의 제어를 제공하며, 일부 경우에는 오일의 총 체적은 수성 용액의 체적보다 클 수 있다. 다중화된 PCR 장치의 특정 실시예는 또한 더욱 큰 사각형 및 더욱 작은 원형을 중첩시키는 것을 포함할 수 있다. 이 외형은 2개의 목표를 달성한다: 이는 열적 팽창으로 인해 오차를 줄여서 일부 오일이 더욱 큰 사각형을 트래핑하며, 이는 하부 영역에서 건조한 프라이머와의 접촉으로 인해 오차를 줄인다.
슬립칩의 특정 실시예에서, 중첩되는 타원형 영역들이 존재한다. 특정 실시예에서, 타원형 영역(충전하는 방향으로 연장되는 영역)은 강한 중첩 및 로딩을 위한 저압 강하를 제공하며, 이들 사이의 중첩을 붕괴시키고 오일 영역과의 중첩을 형성시키도록 짧은 거리로 미끄러질 수 있다. 특정 실시예에서, 타원형 영역이 방울의 더욱 우수한 이미지화를 위해 방울을 중심으로 모으는데 사용될 수 있다.
슬립칩의 특정 실시예는 자기적 비드를 사용하여 박테리아를 트래핑하는데 사용될 수 있다. 플라즈마로부터의 박테리아는 비드 상에 트래핑되고 슬립칩의 특정 실시예 내로 로딩된 후, 예를 들어 PCR 반응을 사용하여 분석할 수 있다.
본원에서 전술한 상기 장치 및 방법은 다수의 적용 예에 사용될 수 있다. 특히, 온도에서의 변화가 요구되는 적용 예에서는 이들 장치를 사용하여 실시될 수 있다. 적용 예에는 PCR에 의한 DNA 의 분석 및 RT-PCR에 의한 RNA의 분석, 이를테면 mRNA의 분석이 포함된다. 다른 적용 예에는 효소 및 다른 분자의 열적변성이 요구되는 프로세스, 성분 및 반응의 열적활성화 또는 비활성화가 요구되는 프로세스, 및 비주위 온도가 요구되는 프로세스(예를 들어, 여러 촉매 반응)가 포함된다.
슬립칩의 특정 실시예는 혈액, 소변, CSF, 대변, 눈, 귀, 생식관, 하부 기도, 코, 및 목구멍으로부터의 시료를 포함하지만 이에 국한되지 않은 인간, 동물 및 환경 시료를 포함하는 다수의 적용 예에 사용될 수 있다. 이들 적용 예에는 바이러스 감염, 예를 들어HIV 및 간염을 위한 바이러스 로딩의 측정, 바이러스 및 박테리아 및 곰팡이의 돌연변이 및 약물 저항성의 분석, 바이러스 및 박테리아의 동정을 위한 패널, 암 세포 및 이들의 돌연변이, 유전자 가변성, 클론 진화, 및 약물 저항성의 분석이 포함된다. 해당 미생물에는 스타필로코쿠스 아우레우스( Staphylococcus aureus ), 베타-헤모리틱 스트렙토코쿠스(streptococci), 스트렙토코쿠스 뉴모니아(Streptococcus pneumonia), 엔테로코쿠스(Enterococcus), 에리시펠로트릭스( Erysipelothrix ), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 해모필루스인플루엔자 ( Haemophilus influenza ), 슈도모나스 아에루기노사( Pseudomonas aeruginosa ), 곰팡이, 악티노미세스 종(Actinomyces sp.), 레시티나제(lecithinase) 또는 리파제 포지티브 혐기성 그람-양성 유기체 및 박테로이데스 프라길리스 ( Bacteroides fragilis ) 군이 포함되지만 이에 국한되지 않는다.
바이러스 검출은, 바이러스 표적 RNA 또는 DNA 서열을 증폭 및 검출하는 핵산 테스트(NAT) 기술을 비제한적으로 포함하는 서로 다른 여러 분석을 사용하여 슬립칩 상에서 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, HIV 검출은 HIV 표적 서열을 증폭 및 검출하는 NAT 기술을 사용하여 슬립칩 상에서 수행될 수 있다.
본 슬립칩의 특정 실시예의 비드 상 또는 영역 표면의 세포 캡쳐는, 암 진단법, 태아 진단법 및 감염성 질환을 비제한적으로 포함하는 적용 예와 비교하여 세포의 분석 및 조작, 예를 들어 다중화된 PCR 분석에 바람직하다.
특정 실시예에서, 슬립칩 장치는, 하기 변화를 제외하고서, 이 적용 예에서 전술된 바와 같이 슬라이딩 슬립칩의 유리 에칭 제조를 사용함으로써 제조하였다: 이 예에서, 에칭의 약 45분은 약 60 마이크론의 깊이를 만들었다. 액세스 홀은 직경 0.030 인치의 다이아몬드 드릴 비트로 드릴링하였다. 에칭된 유리 플레이트의 표면은 밀리포어 수 및 에탄올로 세정하고, 실란화 전에 산소 플라즈마 처리에 가했다. 유리는 1시간 동안 증기 상에서 디클로로디메틸실란(비-불소화된 실란)를 사용하여 실란화시켰다. 그 다음, 유리 슬라이드를 클로로포름, 아세톤 및 에탄올로 세정하고, 최종적으로 질소 가스로 건조시켰다.
하기 부분은 사전 로딩된 다중화된 PCR 슬립칩 중 하나의 실시형태를 기술한다. PCR 슬립칩의 상부 플레이트는 640 μm 길이 및 70 μm 깊이의 사각형 시료 영역을 포함하고, 하부 플레이트는 시료의 덕트를 포함하고, 프리로딩된 원형 영역은 서로 다른 PCR 프라이머 세트를 포함한다. 원형 영역은 560 μm 직경 및 30 μm 깊이이다. 하부 플레이트 내의 영역은 우선 프라이머 용액(1 μm) 0.5 μL로 로딩하고, 실온에서 건조시켰다. 그 다음, 하부 플레이트를 미네랄 오일이 함유된 페트리 접시 내에 위치시켰다. 불소화된 또는 비-불소화된 미네랄 오일은 PCR 슬립칩 실험에 사용될 수 있다. 하부 플레이트를 오일이 함유된 페트리 접시 내에 위치시킴으로써, 오일 층이 사전 로딩된 건조한 프라이머의 상부에 형성되었다. 프라이머가 함유된 영역은 깊이 및 폭 둘다가 PCR 마스터 믹스가 함유된 상부 영역보다 작도록 설계하였다. 이로 인해, 상부 영역에 로딩된 PCR 마스터 믹스가 함유된 방울은 프라이머의 상부 상에 오일의 층을 통해 하부 영역 내의 프라이머에 효율적으로 도달한다. 그 다음, PCR 슬립칩의 상부 플레이트는 시료 영역 및 시료 덕트가 정렬되어 연속적인 유체 경로를 형성하도록 하부 플레이트의 상부에 배열하였다. 에바그린 수퍼믹스(EvaGreen supermix)(바이오-라드(Bio-rad)), 1 mg/mL BSA (로슈(Roche)) 및 DNA 주형 또는 물(대조 세트를 위한 것)이 함유된 PCR 혼합물을 유체 경로를 통해 유동시켜서 시료 영역을 로딩시켰다. PCR 슬립칩을 미끄러지게 하여서 사각형 시료 영역을 원형 프라이머 영역과 배열시켰다. 상기 2개의 영역들 사이에 오일 층이 존재하기 때문에, 수성 PCR 혼합물은 영역 내에 방울을 형성하여서 표면 장력을 감소시켰다. PCR 혼합물이 프라이머 영역의 바닥에서 프라이머와 접촉하는 경우, PCR 프라이머는 반응 혼합물 중에 용해되었다. 슬립칩을 미끄러지게 한 후, 열적 변환은 원위치 어댑터(in-situ adapter)를 갖는 에펜도르프 마스터사이클러(Eppendorf mastercycler)를 사용하여 수행하였다. PCR 판독은 시료 영역의 형광 측정 및 겔 전기영동을 사용함으로써 수행하였다.
열적 변환 도중, 영역 내의 수성 용액은 온도에서의 증가로 인해 체적이 팽창한다. 특정 실시예에서, 사각형 영역만을 갖는 슬립칩을 사용하는 경우, 수성 용액은 사각형 영역을 채울 수 있는데, 이는 온도에서의 상승 후 영역 밖으로 수성 용액이 누출될 위험이 있고, 재료의 소실 및 농도에서의 모니터링 불가능한 변화를 초래한다. 오일이 함유된 더 작은 원형 영역이 수성 용액이 함유된 사각형 영역과 접촉하는 경우, 수성 용액은 영역 내에서 방울을 형성하는데, 이는 열적 변환 도중 팽창 공간을 제공한다. 하부 영역의 특정 형태 및 크기는 2개의 영역의 중심에서 일정 크기의 단일방울을 형성하기에 바람직하다. 일정하게 크기가 조정된 방울은 방울 내의 시약의 농도에서의 변화를 최소화한다.
본 발명자들은, 주형은 갖지 않는 대조 영역의 2개의 열 및 5 pg/μL 스트렙토코쿠스 아우레우스 gDNA를 갖는 영역의 2개의 열을 갖도록 PCR 슬립칩의 이 실시형태의 실험을 세팅하였다. 본 발명자들은, 주형이 포함된 영역만이 증폭을 나타남에 따라 슬립칩 내에 오염이 발생되지 않음을 밝혀냈다. 주형이 포함된 모든 영역은 증폭을 나타냈는데, 이는 PCR 슬립칩의 견고성을 입증하는 것이다. 형광 강도 측정 및 겔 전기영동에서는 주형이 없는 영역은 열적 변환 후 DNA를 갖지 않으며, 주형을 갖는 영역은 단지 하나의 DNA 시료를 포함하는 것으로 나타난다.
정량적 데이터 분석에서는 PCR 슬립칩에서 오염이 없는 것으로 확인되었다. 슬립칩에서의 오염 또는 교차 오염이 존재하지 않음을 입증하기 위해서, 본 발명자들은 nuc 유전자(스타필로코쿠스 아우레우스-유래) 및 mecA 유전자(MRSA-유래)에 대해 프라이머 세트를 교호적으로 배열하는 2개의 서로 다른 프라이머 세트로 바닥 칩을 사전 로딩시켰다. 5 pg/ μL S. 아우레우스 게놈 DNA를 전술한 바와 같이 칩 내에 주입하였다. nuc 유전자가 S. 아우레우스 게놈 DNA에서만 존재하는 반면, mecA 유전자는 MRSA에서만 존재하기 때문에, 오직 nuc 유전자에 대해 프라이머로 로딩된 영역에서만 형광에서의 증가를 나타내고, mecA 유전자가 함유된 다른 영역에서는 형광을 나타내지 않았다. 형광 강도의 A 라인스캔에서는 주형이 없는 영역이 유의적 형광을 나타내지 않음을 정량적으로 나타냈다.
특정 실시예에서, 열적 변환은 상기 장치 주위의 주변 온도를 상승 및 저하시키는 전체 PCR 슬립칩을 열적 변환기내에 위치시킴으로써 수행한다. PCR 슬립칩의 서로 다른 실시형태에서, 열적 변환이 상기 장치 내에서 발생한다. 여기서, 열적 변환기는 상기 장치 내에서 일정한 온도 분포에 의해 교체되고, 영역은 하나의 온도로부터 다음의 온도로 물리적으로 이동한다. 수성 방울은 우선 전술한 바와 같이 수성 용액이 함유된 영역을 오일이 함유된 영역과 합치도록 슬라이딩에 의해 형성된다. 슬립칩의 특정 실시예는 형성되는 수성 방울이 용액의 소실 없이 슬라이딩에 의해 이동될 수 있도록 설계된다. 그 다음, 이들 방울은 특정한 기간 동안 특정 온도에서 유지되는 슬립칩의 구역까지 미끄러진다. 슬립칩의 특정 실시예 내의 온도 분포는 예를 들어 P2i 피복 하에 IR 가열기 또는 열전기 장치를 사용함으로써 생성될 수 있다. 이들 “핫스팟(hotspot)” 및 “콜드스팟(coldspot)”의 크기는 개별 영역에 순응하기에 충분하게 작을 수 있거나, 또는 영역의 열 또는 어레이에 순응하기에 충분하게 클 수 있다. 예를 들어, 회전 장치는 상기 장치의 차가운 반쪽으로부터 상기 장치의 뜨거운 반쪽까지 이동할 수 있다. 상기 장치 내의 다수의 온도 스팟의 존재는 다른 치수(dimension)를 PCR 슬립칩 장치: 어닐링(annealing) 온도의 특정 실시예에 첨가하는데 사용될 수 있다. 서로 다른 프라이머가 서로 다른 어닐링 온도를 가짐에 따라, 더 넓은 범위의 프라이머가 장치 상에서 스크리닝될 수 있다.
이후, 디지털 PCR 슬립칩의 하나의 실시예를 기술한다. 슬립칩의 하나의 실시예는 1,280 영역을 포함하고, 각 영역은 약 5 nL 체적이고, 전술된 포토리쏘그래피 및 습식 화학적 에칭 기술을 사용하여 제조하였다. 이 실시형태는 타원형 덕트 또는 영역을 포함하며; 2개의 플레이트는 치수 400 μm x 200 μm 및 50 μm 깊이의 오버래핑 타원형 영역으로 패턴화하였다. 2개의 플레이트는 또한 치수 200 μm 직경 및 50 μm 깊이의 원형 영역으로 패턴화하였다. 중첩하는 타원형 영역을 사용함으로써, 상기 장치에서의 압력 강하가 작은데, 이로 인해 간단한 피펫팅에 의해 충전된다. 슬립칩을 짧은 거리로 슬라이딩으로써, 타원형 영역들을 분리하고, 오일 층이 포함된 원형 영역의 상부에 중첩시켰다. 디지털 PCR을 위해, 프라이머는 원형 영역 내로 사전 로딩하는 대신에 PCR 혼합물에 첨가하였다. 타원형 영역은 타원형 영역의 폭이 원형 영역의 직경과 서로 동일하도록 설계하였다. 설계는 방울을 영역 내의 중심으로 모으며, 이로 인해 더욱 우수한 이미지화가 허용된다. 설계는 또한 일정 크기의 방울을 생성시키며, 따라서 시약의 일정 농도를 갖는 방울을 생성시킨다. 설계는 PCR 슬립칩에 대해 전술한 바와 같이, 영역 내의 오일에 의해 둘러싸인 수성 방울을 생성시키며, 이로 인해 열적 변환 동안 열적 팽창에 대한 여지를 허용한다.
디지털 PCR 슬립칩의 특정 실시예는 100 fg/10 μL만큼 낮은 농도에서 주형 DNA를 검출할 수 있었다.
디지털 PCR의 동적 범위는 예를 들어 큰 영역과 작은 영역의 조합을 사용함으로써 증가될 수 있다. 예를 들어, 2,000 영역이 포함된 장치에서, 하나는 통계에서 1,000 영역이 1 nL 용액을 포함하고 1,000 영역이 10 nL 용액을 포함한다는 더욱 큰 동적 범위 및 더 높은 신뢰도를 갖는다. 가장 우수한 동적 범위 및 가장 높은 신뢰도 간격을 제공하는 영역 크기의 분포가 예측될 수 있다.
디지털 PCR 슬립칩의 특정 실시예에서, 다수의 영역 크기는 회전 설계를 사용함으로써 설계될 수 있다. 큰 영역은 더 낮은 밀도에서 외부에 위치할 수 있고, 작은 영역은 더 높은 밀도에서 내부에 위치할 수 있다. 슬립칩의 이 실시형태가 회전하여 슬라이딩에 따라, 큰 영역은 작은 영역보다 더 이동할 것이며, 모든 영역은 각각 하부 플레이트 상의 이들의 상응하는 영역과 동시에 접촉할 것이다.
슬립칩의 특정 실시예에서, 자기적 비드를 사용하여 박테리아를 트래핑할 수 있다. 본 발명자들은 자기적 비드(버그 트랩 버전 C(Bug Trap version C))를 사용하여서 MRSA 를 인간 풀드 플라즈마(human pooled plasma; HPP)로부터 캡쳐하였다. HPP는 최종 농도 1x 107 cfu/ mL MRSA에 대해 MRSA를 스파이킹하였다(spike). 그 다음, 100 μL의 이 용액을 실온에서 20분 동안 버드 트랩(Bug Trap) 비드로 인큐베이션하였다. 비드를 자석으로 아래로 당기고, 1x PBS 완충액으로 5회 세척하였다. 그 다음, 비드를 에바그린 PCR 수퍼믹스, 1 mg/mL BSA, 프라이머와 혼합하고, 열 순환 동안 슬립칩 내에 주입하였다. 본원에 사용된 슬립칩 설계는 다수의 PCR 실험에 대해 서로 동일하였다.
본 명세서에 기재된 상기 기술들은 다수의 세포들, 바이러스들, 입자들, 분자들, 및 다른 목적물들의 대비 분석을 위해 사용될 수도 있다. 예를 들면, 슬립칩에 대한 특정 실시예는 유전자 구조의 가변성 및 이질성, 표현형, 전위적 치료들 및 상기 치료들의 조합에 대한 반응들을 포함하는, 반응의 동역학이 판단될 수 있도록, 암 세포 집단에 대한 측정을 수행하는데 사용될 수도 있다. 슬립칩은 방사선 치료, 산업 재해 또는 전쟁 또는 테러에 의한 방사선 장애의 마커로서 세포 및 조직, 예를 들면, 혈액 세포를 평가하기 위해 사용될 수 있다. 상기 분석법은 인간에 의해 수여되는 방사선의 양을 추정하기 위해 사용될 수도 있으며, 그러한 정보는 예를 들면, 방사선 치료의 투여량, 킬레이션 요법의 투여 또는 비-방사성 동위원소의 섭취 또는 부가적인 방법들을 조절하는 것에 의해 적절한 대응책을 도모하기 위해 사용될 수도 있다. 이러한 마커들은 이중-가닥 DNA 절단(double-stranded DNA breaks)의 마커들일 수 있다. 단백질, mRNA, miRNA 마커 및 작은 분자들은 일반적인 마커로서 뿐만 아니라 기관-특이 마커로서 사용될 수도 있다. 그러한 마커의 일예로서 히스톤 H2AX의 인산화를 들 수 있다. 상기 마커들은 슬립칩 상에서, 예를 들면, 효소 분석법을 통해, 면역검정, 전기영동, 웨스턴 블럿 분석을 통해, RNA 수준의 분석을 포함하는 핵산 증폭 기술, 및 상기 방법들의 조합을 통해 분석될 수 있다. 단일-세포 수준에서 수행되는 측정들은 국소적으로 수여되는 투여로부터, 심지어 순환 세포들로부터, 광범위하게 수여되는 방사선 투여를 구별하기 위하여 더욱 유용한 정보를 제공할 것이다. 예를 들면, 광범위한 손상은 손상된 세포들 또는 손상에 대한 단일-피브 분포에 의해 나타나는 손상과 유사한 정도의 수준을 야기할 수 있는 반면, 국소적인 손상은 세포들에 의해 나타내는 손상 수준의 변형을 야기하거나, 손상의 2중 모드 이상의 복잡한 분포를 야기할 수 있다. 바이러스들의 저항 패턴을 결정하기 위하여, 바이러스들의 유전자형을 분석한 다음 각각의 바이러스들로부터 유전 물질을 증폭하는 것은, 예를 들면, HIV 및 간염 감염의 치료에 적합한, 저항성 표현형의 조기 검출을 가능하게 한다.
본 명세서에 기재된 상기 기술들은 플러그-기반 및/또는 액적-기반 미세유체 시스템을 포함하는 다상 유동 기술 및 다른 기술들과 통합될 수도 있다. 슬립칩에 대한 특정 실시예들은 화학전극(chemistrode) 등에 의해 발생된 플러그와 같이, 슬립칩 상에 직접 발생되거나 또는 외부적으로 발생되어 슬립칩에 도입된 체적들을 포함하는, 비혼화 유체에 의해 둘러쌓인 액적, 플러그 및 다른 유체 체적의 어레이를 분석하기에 적합하다.
본 출원은 다양한 분리 기술 및 시료 종류와 통합될 수 있는 분리용 슬립칩 장치를 기술한다. 본 출원은 US 가출원61/162,922 (예를 들면, 식별번호 00102, 00104, 00122, 및 00188 참고)에 기술된 성능을 더욱 상세히 설명할 것이다. 상기 슬립칩은 전술한 FID 단백질 결정화용 슬립칩에서 기술한 바와 같이 구성되어 있다.
특정 실시예에서, 상기 슬립칩은 확산-기반 분리를 위해 사용될 수도 있다. 많은 의학적 진단들은 질병을 진단하기 위하여 혈장과 같이 분리된 깨끗한 체액에 의존하지만, 깨끗한 체액을 분리하는 것은 고가의 원심기, 시간 및 노동을 필요로 한다. 상기 슬립칩은 전혈 내의 저분자량 단백질들, 핵산들, 및 바이러스들의 경우 버퍼를 포함하는 영역으로 확산되도록 하는 반면, 적혈구 세포의 경우 원래의 영역내에서 유지될 수 있도록 설계될 수 있다. 이러한 분리법은 확산 계수의 차이를 기반으로 한다. 예를 들면, 5분 이내에, B형 간염 바이러스는 600 μm 확산할 수 있지만, 적혈구 세포는 4 μm만 확산할 수 있다. 예를 들면, 본 발명자들은 전혈을 5 μmol/L 8-메톡시피렌-1,3,6 트리설폰산 (MPTS)과 혼합하고, 10 μL 혈액 시료를 피펫하는 것에 의해, 상기 혼합물을 왼쪽 영역으로 로딩할 수 있는 슬립칩을 설계하였다. 1× PBS 버퍼를 오른쪽 영역으로 로딩하였다. 상기 장치를 혈액 영역을 버퍼 영역과 연결하기 위해 미끄러지도록 하였다. MPTS는 30분 이내에 버퍼 영역으로 확산되는 반면, 혈액 세포는 이동하지 않았다.
이러한 슬립칩 설계는 덕트 또는 영역내에 분리 매체를 이용하는 것에 의해 분리를 유도할 수 있다. 하나 이상의 영역/덕트가 분리 매체를 포함할 수 있다. 영역에 통합될 수 있는 분리 매체들의 예로는 겔 (예를 들면, 실리카 겔 또는 폴리아크릴아마이드 겔), 버퍼, 폴리머 필터 및 막, 결합제, 크로마토그래피 배지, 살아있는 세포의 표면, 단백질이 존재하거나 존재하지 않는 생물 막 (즉, 지질 이중층), 입자들의 어레이, 및 나노입자들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 선택적으로, 상기 분리 매체는 장치의 표면에 존재할 수 있다. 예를 들면, 박막 크로마토그래피(TLC), 겔 전기영동, 및 등전 초점법이 슬립칩에서 수행될 수 있다. 또한, 분리법은 확산 및 외부장(external field) 및 환경에 의해 유도될 수 있다. 분리를 유도하기 위한 장 및 환경의 예로는 자기장, 전기장, 광학장, 중력장, 화학 구배, 온도 구배, 능동 수송, 및 전단력을 포함한다. 장은 칩 상에 또는 외부적으로 통합되어 있는 전극들에 의해 생산될 수도 있다. 예를 들면, 전극들은 슬립칩의 영역 및/또는 덕트 또는 다른 영역에 통합되거나, 슬립칩의 입구 및 출구를 통해 외부적으로 적용될 수 있다. 전극들을 슬립칩에 통합하면, 전기영동하기 위하여 덕트 내로 겔을 배치하는 것에 의해, 시료를 전처리 함이 없이 전기영동에 사용할 수 있다. 장은 한 위치로부터 다른 위치로 슬립칩을 미끄러지게 하는 것에 의해 스위치 온/오프 되거나 힘이 조절될 수 있다. 또한, 인가된 장과 관련된 대상물들의 특성을 변경하는 태그들에 의해 분기가 가능하게 된다. 예를 들면, 자화율, 전기영동성, 및 확산계수는 목적 대상물을 다른 대상물과 결합하는 것에 의해 변경될 수 있다. 표면 개질된 자성 비드는 특이적 박테리아에 결합한 다음, 자기장에 의한 분리를 위해 사용될 수 있다. 상기 슬립칩은 또한 약물들 및 그것들의 대사산물 및 복합체, 호르몬, 환경 오염물질, 항생제, 니코틴 및 그것의 대사산물, 약물 남용, 스트레스성 호르몬, 만성 및 급성 스트레스와 관련된 다른 분자들과 같은 소분자들을 분리하고 검출하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 분리법은 또한 세포를 분리하고 생물 유체로부터 세포들을 단리하기 위해 사용될 수 있다. 그러한 목적 세포들은 순환 암 세포, 혈액내의 태아 세포, 줄기 세포, 박테리아 및 균 세포, T-세포 및 B-세포, 및 다른 특이적 마커들을 발현하는 세포들의 소집단을 포함한다. 이러한 세포들은 혈액, 소변, 뇌척수액, 간질액, 눈물, 양수, 골수, 및 조직 생검으로부터 단리될 수 있다. 예를 들면, 분리법은 신경퇴행성 질병에 관여하는 단백질 및 펩티드의 응집 상태 및 후-전사 변형을 판단하기에 유용할 수도 있다.
상기 슬립칩은 또한 세포 및 기관과 같이, 독립적으로 이동할 수 있는 대상물들을 연구하는데 사용될 수 있다. 주화성 (능동 수송), 주역성, 및 주자성이 슬립칩 내부에 화학적, 열적, 및 자기적 구배를 생성하는 것에 의해 연구될 수 있다. 예를 들면, 혈액 내의 박테리아 또는 백혈구를 단리하기 위해 주화성이 사용될 수 있다.
분리법은 슬립칩의 모든 다른 성능들과 통합될 수 있다. 예를 들면, 혼합물이 다양한 단편들로 분리되도록 미끄러진 이후에, 상기 슬립칩은 웨스턴 블롯을 위한 항체의 전달에서와 같이, 검출을 시각화하기 위한 시약을 도입하기 위하여 2회 미끄러질 수 있다. 또한, 세포내의 인산화 및 당화 수준의 검출은 진단과 약물 발견에 중요하다. 분리법과 면역염색법을 결합하는 것은 인산화 및 당화의 검출에 매우 매력적인 것으로, 상기 슬립칩은 단일-세포 수준까지의 인산화 및 당화의 측정을 수행하기 위하여 사용될 수도 있다. 일련의 슬립들은 단일 세포를 단리하고, 그것을 용해하고, 그리고 분리를 수행하고, 항체를 갖는 분리된 단편을 염색하고, 그리고 측정 분석법을 수행하기 위해 사용될 수 있다. 초기 분리 이후에, 다수의 장들이 1-차원, 2-차원, 또는 그 이상의 차원 분리를 수행하기 위해 단일 단계 또는 다중 단계에 결합될 수 있다. 예를 들면, 분리법은 단백질 결정법과 결합될 수도 있다. 결정 동안에 분리를 계속하는 것에 의해, 결정 동안의 다양한 응집 상태의 단백질이 분리될 수 있다. 이러한 분리법은 고품질 및 고순도를 갖는 결정체를 생산할 수 있다.
슬립칩에 대한 특정 실시예에서, 강한 내부 혼합은 볼텍스 자기장에 의해 발생될 수 있다. Martin, Shea-Rohwer, Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 2009 Jul;80(1 Pt 2):016312 참고 (상기 문헌은 본 명세서에서 참로로 원용됨). “볼텍스(vortex)” 자기장은 유체 체적 전체를 강하고, 균일하게 혼합하는, 구형의 자기 입자들을 갖는 부유물에 인가될 수 있다. 미세채널 내부의 층 흐름(laminar flow)을 교반하는 것은 교번 자기장을 채널 내부의 페리자성 비드에 인가하는 것에 의해 달성될 수 있다. Rida and Gijs Anal Chem. 2004 Nov 1;76(21):6239-46 참고 (상기 문헌은 본 명세서에서 참고로 원용됨). 공간적으로 균일하게 회전하는 자기장에 노출된 미세크기의 자성바를 사용하는 교반-바 전략이 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 영구적인 구조물은 표준 자성 교반기에 의해 구동되는 제작된 자성 막대를 포함한다. 마이크로체인에 결합된 비드가 또한 교반을 위해 사용될 수 있다. 혼합은 비드를 단순한 회전장에 노출시키는 것에 의해 달성될 수 있다. 비드들은 유체 내부에 적당한 수준의 혼합을 제공할 수 있다. 볼텍스 자기장을 생성하기 위하여, 설치의 간편성으로 인해 영구 자석 (및 자성 교반기)이 특정 실시예에서 바람직하다. 초음파 혼합, “버블 혼합기”, 및 혼합 및 전기장에 의한 흐름을 포함하고, 교번 교류 이중전기영동을 포함하는, 미세유체 장치에서 흔히 사용되는 다른 혼합 방식이 슬립칩에서 사용될 수 있다.
자성 교반기 및 강한 영구 자석의 사용의 일 예.
1 마이크론 자성 비드를 함유하는 미세유체 장치를 회전 강 자석으로부터 1-1.5 cm 떨어진 곳에 두고, 4개의 강 자석들을 대략 비슷한 거리의 상단부에 추가하였다. 강한 혼합을 ~6 nL 영역 내부에서 발생시켰다. 상단부 자석, 또는 아래의 회전 자석 없이, 강한 혼합을 중단하였다. 이론에 구애됨이 없이, 볼텍스 자기장이 발생하였던 것으로 간주하였다.
버퍼링 챔버가 본 명세서에 기재된 장치 중 어느 하나에 사용될 수 있다. 이것들은 입구, 영역 및 덕트 세트의 업스트림에 가까운 것이 바람직하다. 그것들은 시료의 일부를 포획할 수 있는바, 예를 들면, 소량의 시료가 슬립칩 쪽으로 너무 밀리게 되는 경우, 오버슈트(overshoot)되는 것을 막을 수 있다. 버퍼링 챔버는 용적식(positive displacement) 장치 (피펫, 등)으로 로딩되는 경우가 바람직하다.
FID 결정화를 수행하기 위해 사용되는 슬립칩에서, 동일한 다바이스의 영역들을 연결하는 다른 크기(예를 들면, 길이, 넓이 및 깊이 중 하나 이상이 다른)의 덕트가 다른 영역을 가로지르는 복수개의 확산 프로파일을 만들어내기 위하여 사용될 수 있다.
슬립칩에 대한 특성 실시예의 경우, 영역 및/또는 덕트가 중첩되는 세트 내부에서 영역 및/또는 덕트 사이의 중첩 정도가 다양한 것이 바람직하다.
FID 결정화을 포함하는, 특정 반응을 수행하기 위해 사용되는 슬립칩에서, 복수개의 덕트가 단일 영역에 연결되는 것에 의해 동일한 영역에 연결된 다수의 농도 구배를 만들어낼 수 있다.
슬립칩은 한 종류 이상의 반응을 수행하기 위해 설계될 수 있다. 예를 들면, 장치는 동일 장치 상에서 FID 결정화뿐만 아니라 마이크로배치 결정화를 수행할 수 있도록 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 다른 반응을 위해 사용되는 장치의 영역 사이에 있는 시료를 위해 분기(branching) 공급 덕트가 사용되었다.
FID 결정화를 수행하기 위한 상술한 장치와 유사한 슬립칩이 다른 종류의 실험을 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 세포-이동 또는 세포 편광 분석법이 그러한 장치에서 수행될 수 있다. 그것은 상하로 이동할 수 있는 세포들에 따른 구배를 생성하거나, 세포가 분극화할 수도 있는 곳에 반응하는, 2 이상의 영역들을 연결하기 위한 장치들을 미끄러지게 하였다. 그것은 복잡한 구배 및 역구배를 형성하기 위한 다수의 영역들을 연결할 수 있다. 게다가, 그러한 장치들은 공동-배양하고 세포-세포 상호작용을 관찰하기 위해 사용될 수 있다.
많은 장 및 힘들이 한 영역으로부터 다른 영역으로 체적을 전달하기 위해 사용될 수 있다. 영역들 사이의 체적을 전달가능하게 하는 장의 예로는 표면 장력, 자기장, 전기장, 중력장, 온도 구배, 및 전단 응력을 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 슬립칩은 다양한 체적을 갖는 액체를 단일한 체적으로 계량하고 전달하기 위해 사용될 수 있다. 상기 슬립칩은 다른 체적을 갖는 시료들을 단일 체적으로 전달하고 혼합하기 위하여, 체적이 변화하는 영역을 갖도록 설계될 수 있다. 다른 체적의 시료를 단일 체적으로 전달하고 혼합하는 능력은 건조 시약을 다시 수화시키는 일반적 방법으로 사용될 수 있고, 관련 분석법들에 의해 후속으로 수행될 수 있다. 그것은 단백질 결정화 실험, 혈액 응집, 분석 및 반응에서, 열적 팽창을 필요로하는 PCR 및 다른 적용을 위한 분석에서 시약을 일방향으로 전달하기 위하여, 액적 스팟 어레이(drop spot array)” 에서와 같이 다른, 예를 들면, 하기에 기술된 어레이에서와 같이 시약을 포획된 액적으로 추가하기 위하여 사용될 수 있다: Schmitz, C. H. J.; Rowat, A. C.; Koster, S.; Weitz, D. A., Lab Chip 2009, 9, 44-49; Shim, J. U.; Olguin, L. F.; Whyte, G.; Scott, D.; Babtie, A.; Abell, C.; Huck, W. T. S.; Hollfelder, F., J. Am . Chem. Soc. 2009, 131, 15251-15256 (상기 문헌들은 모두 본 명세서에서 참고로 원용됨). 슬립칩의 영역 및 플레이트의 다른 기하학적 배열, 크기, 및 표면 변형이 영역들 내의 액적들은 전달하고 분류하기 위해 사용될 수 있다. 액적 형상 및 체적은 영역 형상 및 영역 체적에 의해 제한되기 때문에, 영역들은 다른 범위로 채워질 수 있는바, 영역들은 더 큰 영역 내부에 포획된 작은 액적들로, 그리고 액적 보다 조금 더 큰 영역 내부에 포함된 액적들로 충분히 채워질 수 있다. 슬립칩의 특정 실시예에서 체적들을 전달하고 조합하기 위해서 다양한 크기와 다양한 채움의 정도가 사용될 수 있다.
슬립칩에서 체적을 전달하기 위한 영역 및 액적 크기들의 이러한 조합의 일 사용예는 하기를 포함한다: 그것은 제1 물질로 가득 채워진 한 영역을 제2 물질로 구성된 액적을 포함하는 더 큰 영역으로 미끄러지게 하여 겹쳐지도록할 수 있다. 이러한 두 영역들이 접촉될 때, 제1 영역내의 액체는 더 크게 액적과 융합되어, 큰 영역에 남아있게 되므로 표면 장력은 최소화된다.
다른 기하학적 배열들이 영역 보다 작은 액적들을 포획하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 경사진 영역들이 액적을 가두기 위해 사용되거나 3-층 슬립칩이 중간층에 액적을 가두기 위해 사용될 수 있다. 이러한 설계는 액적들을 정교하게 위치시키기 위하여 사용될 수 있고 미끄러지는 동안 액적들의 탈출을 막기 위하여 사용될 수 있다. 게다가, 그것들은 또한 오프-칩(off-chip) 분석용 액적을 추출하기 위해 개방되어야 하는 장치에 매우 유용하다.
슬립칩은 또한 액적들 내부에서 혼합을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시예에서, 영역이 완전히 채워지지 않은 경우, 윤활유를 포함하는 추가적인 층이 영역내의 액체 사이에 그리고 슬립칩의 두 플레이트 사이의 존재한다. 슬립칩이 미끄러지기 때문에, 두 플레이트의 움직임은 윤활유의 움직임에 의해 전달되는, 액적내의 혼합을 유도할 수 있다. 비선형 또는 비가역적 슬라이딩 패턴이 혼합을 강화하기 위하여 사용될 수 있다.
특정 실시예에서, 완전히 채워지지 않은 영역들에서, 용액과 슬립칩의 다른 플레이트 표면 사이에 윤활유를 갖는 추가적인 층이 존재는 교차-오염을 예방할 수 있다. 용액과 슬립칩의 전면 플레이트 사이의 추가적인 장벽은 슬립칩의 표면 상의 잔류물의 가능성을 감소시킬 뿐만 아니라, 표면 개질에 의한 용액의 접촉각을 조절하는 대안일 수 있다.
영역의 표면 개질은 영역 내의 위치를 조절하고 매스를 전달하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 그것은 영역의 바닥이 수용액에 의해 우선적으로 젖게되므로, 바닥으로 액적을 포획하는 친수성 바닥 표면을 갖는 영역을 만들어낼 수 있다. 다른 예에서, 전체 영역은 수용액에 의해 영역이 젖을 수 있도록, 친수성으로 만들어질 수 있다. 다른 용액들은 동일한 크기의 영역에서 다른 형상 및 표면 곡률 (표면 에너지)를 가질 수 있다. 표면 개질은 또한 한 영역으로부터 다른 영역으로 용액들은 전달하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 두 영역들은 충분히 채워지지 않은 영역을 충분히 채워진 다른 영역에 연결하는, 친수성 브릿지로 연결될 수 있다. 표면 장력 및 확산을 사용하는 것에 의해, 기질은 한 영역으로부터 다른 영역으로 운반될 수 있다.
제1 영역(예를 들면, 계량 영역)으로부터 제2 영역(예를 들면, 반응기 영역)으로 유체의 체적을 전달하는 매커니즘은 제1 영역 내부의 유체의 체적이 제2 영역 내부의 유체의 체적 보다 더 큰 표면 장력을 갖도록, 제1 영역과 제2 영역을 기하학적으로 배열하는 경우에 존재하게 된다. 예를 들면, 이러한 조건은 제1 영역이 제2 영역 보다 얕거나 작은 경우에 충족될 수 있다. 사용자는 덕트를 사용하여 제1 영역을 로딩한 다음, 제1 영역과 제2 영역이 겹쳐지도록 미끄러지게할 수 있다. 제1 영역의 액적은 표면 장력으로 인해 더 큰 영역으로 움직이려는 경향이 있다. 이러한 접근법은 예를 들면 이미 로딩된 건조 시약을 다시 수화하기 위해여 적용될 수 있다. 이러한 접근법은 또한 동일 체적에 있는 다수의 시약들을 합치기 위하여 사용될 수 있다; 예를 들면, 2, 3, 4, 5 이상의 시약들이 이미 첨가된 시약들의 손실 없이, 동일한 체적으로 순차적으로 첨가될 수 있다.
표면 장력을 사용하여 액적을 전달하는 다른 실시예에서, 반응기 영역의 표면은 친수성이 되도록 개질되고, 슬립칩 장치의 나머지 영역은 소수성이 되도록 개질될 수 있다. 친수성 반응기 영역 및 소수성 계량 영역을 사용하는 경우, 계량 영역에 의해 전달되는 수용액이 반응기 영역의 친수성 표면을 우선적으로 젖게 하므로, 영역들의 상대적인 크기는 중요하지 않다. 예를 들면, 크고 작은 충분히 채워진 소수성 영역뿐만 아니라 부분적으로 채워진 소수성 영역들이 반응기 영역을 채우기 위해 사용될 수 있다.
많은 조합들을 갖는 고 효율의 스크리닝을 위한 다중화 슬립칩이 복수-단계 전달 전략을 기반으로 개발되었다. 상기 장치는 반응 매트리스, 각 영역을 다른 조합의 용액으로 채우기 위하여 사용될 수 있다. 더 많은 단계들이 수직 방향뿐만 아니라 수평 방향으로 3번째 및 4번째 시약을 도입하기 위하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 그러한 NxN 설계가 건조 시약을 재수화하고, 시료를 첨가하고, (예를 들면, 수직 방향으로) 시약을 첨가한 다음, 다른 세트로 (예를 들면, 수평 방향으로) 시약을 첨가하기 위해 사용될 수 있다. 상기 장치는 또한 다중화 스트리닝에 부가적인 치수를 첨가하는 것에 의해, 다른 체적의 영역들을 갖도록 설계될 수 있다. 상기 장치는 상술한 표면 장력을 기반으로 하는 체적 전달 메카니즘을 이용할 수 있다.
제1 영역으로부터 제2 영역으로 용액을 전달하기 위해 사용될 수 있는 다른 메카니즘이 기술된다. 액체의 밀도 차이가 액적을 떠오르게 하거나 액적을 더 큰 영역으로 집어 넣기 위하여 사용될 수 있다. 자성 비드가 제1 영역내의 액적에 첨가되는 경우, 액적을 제2 영역으로 이동시키기 위하여 자석이 사용될 수 있다. 또한, 하전된 용액들 또는 입자들을 포함하는 액적을 이동시키기 위하여, 슬립칩의 특정 실시예에 전극을 통합할 수 있다. 제2 영역을 제1 용액으로 채운 이후에, 뒤로 미끄러지게 하고, 제2 영역을 다른 용액으로 충전한 다음, 두 영역들이 다시 겹쳐지도록 미끄러지게 하여 다른 용액들의 계량된 체적들이 합쳐질 수 있다. 상기 용액들은 또한 채우는 동안 배양될 수 있다. 사용자는 반응기 영역으로 채워지는 용액들의 수와 각 용액들의 체적을 조절할 수 있다. 예를 들면, 다른 체적을 갖는 작은 영역의 어레이가 반응기 영역으로 다른 용액들의 정확한 체적을 계량하기 위해 사용될 수 있다.
반응기 영역의 체적이 그것으로 계량된 액적들의 체적에 비해 큰 경우, 열팽창을 위한 공간이 존재한다. 이것은 열 팽창이 발생할 때 용액이 누설되지 않기 때문에, (예를 들면, PCR의 열순환에서와 같이) 온도가 증가되는 어플리케이션에 유용하다. 계량 영역이 반응기 영역과 접촉할 때, 반응기 영역이 충분히 채워지면, 계량 영역내의 용액은 반응기 영역내의 용액과 혼합될 것이다. 계량 영역이 미끄러지게 되면, 그것은 혼합된 용액의 계량된 체적을 전달할 것이다. 혼합 기술은 두 용액들이 잘 혼합될 수 있도록, 슬립칩과 통합될 수 있다.
혼합을 위해 용액이 계량되고 큰 영역으로 전달되도록 작은 영역들을 사용하는 슬립칩의 실시예가 기술된다. 이 장치는 10 개의 열과 덕트를 포함하는바, 각 열들은 20개의 큰 영역들과, 20개의 작은 영역들을 포함하고, 각 열들은 다른 용액으로 채워질 수 있다. 큰 영역 (620 μm × 240 μm 크기, 60 μm 깊이, 6.8 nL 체적) 및 덕트 (300 μm 폭, 60 μm 갚이)는 하부 플레이트 내에 존재하고, 그리고 작은 영역(620 μm × 120 μm 폭, 35 μm 깊이, 2 nL 체적)은 상부 플레이트 내에 존재한다. 상기 슬립칩 장치는 플루오르화 탄소 하에 조립된다. 플루오르화 탄소 오일은 영역들, 덕트들, 및 두 플레이트 사이의 갭을 채운다. 레드 푸드(red food) 건조 용액은 작은 영역과 덕트에 의해 형성된 유로를 채운다. 상기 장치는 작은 영역을 큰 영역과 정력하기 위하여 미끄러진다. 수용액의 표면 장력으로 인해, 상기 용액은 작은 영역으로부터 큰 영역으로 전달된다. 상기 장치는 작은 영역과 덕트를 통과하는 연속 유로를 형성하기 위하여 그것의 원래 위치로 다시 미끄러지고, 그리고 블루 푸드 건조 용액이 작은 영역에 채워진다. 상기 장치는 작은 영역을 큰 영역과 정렬하기 위하여 다시 미끄러지고, 그리고 레드 및 블루 푸드 건조물이 큰 영역에서 합쳐지고 혼합된다. 다른 푸드 건조 용액이 채워지는 사이에, 상기 유로는 오염물질을 감소시키기 위하여 물 및 FC40으로 세척된다.
일부 실시예에서, 상기 슬리칩은 대사 프로파이링을 위해 사용될 수 있다. 모든 사람들은 약물을 다르게 대사한다. 개인의 대사를 결정하는 것은 유전학적으로 가능하지만 비용이 많이 들고, 조합적인 상호작용을 다루기 위한 노력시 많은 과제에 직면하게 된다. 간 효소는 유도될 수도 있고, 또한 제한될 수도 있기 때문에, 추가적인 과제가 존재한다. 따라서, 기능 테스트가 유용하다. 대사 프로파일링을 위한 슬립칩 기반 장치는 사무실에서 또는 집에서 사용될 수 있다. 또한, 금연을 최적화하기 위해 니코틴 대사를 특징화하는 것에 대한 요구가 존재한다. 상기 슬립칩은 실험실 이외의 곳에서 사용될 수 있기 때문에, 슬립칩은 이에 유용하다. 그것은 예를 들면, 다른 투여량을 갖는 니코틴 패치들 중에서의 선택을 돕기 위하여, 박막 크로마토그래피 성능이 구비된 슬립칩으로 약국에서 사용될 수 있다. 전단응력-구동 크로마토그래피가 슬립칩 상의 박막 크로마토그래피를 향샹시키기 위해 사용될 수 있다. 검출 및 정량화는 예를 들면, 핸드폰 또는 시각화 검출 장치와 같은 장치 상에서 수행될 수 있다.
물질 대사를 측정하기 위한 슬립칩은, 예를 들면, 단순한 장치가 약물의 농도 또는 약물과 약물의 하나 이상의 그것의 대사산물 사이의 비율을 측정할 것을 필요로 하는 경우, 또는 투여량을 결정하는 것이 중요한 경우에 유용하다. 타액 내의 물질의 농도를 측정하는 것은 바람직하다. 타액의 출처에 관계 없이 타액으로 분배되는 물질의 농도를 측정하는 것은 바람직하다. 그러한 장치는 또한 진단하는 것 보다는 관찰하는 것이 중요한 경우, 예를 들면, 장기간 동안 환자가 이미 하나 이상의 약물을 섭취하고 있어서, 일부 대사 효소들이 억제될 수 있는 상황에 유용할 수 있다. 그러한 경우, 약물의 과다 투여를 피하기 위해 오랜 시간 동안 하나 이상의 약물들의 대사를 관찰하는 것이 유용하다. 이러한 종류의 장치는 또한 단계 I, II 또는 III 임상 시험 동안 부작용을 최소화하고 결과를 향상시키기에 유용하다. 박막 크로마토그래피 또는 다른 기술들에 의한 2-차원 분리법이 농도 및 분리(예를 들면, 일 차원에서 시료를 농축시킨 후, 다른 용매 상을 사용하여, 다른 차원에서 분리할 수 있음)를 향상시키기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시예들에서, 대사 프로파일을 위한 슬립칩은 온-칩 연속 희석으로, 교차-오염 없이 다중-단계 슬라이딩, 및 친수성 영역을 생성하기 위한 장치의 패터닝을 가능하게 하는 불연속 브릿지 덕트를 포함할 수 있다.
슬립칩은 개인 맞춤형 의학이 가능하도록 다수의 접근법 및 기술에 적용될 수 있다. 상기 적용은 진단 및 약물 개발 및 치료를 위해 환자들의 시료들을 테스트하고 관찰하는 것을 포함한다.
슬립칩은 혈액, 소변, 타액 및 다른 시료들을 분석하는 것에 의해, 환자들의 간 기능을 평가하기 위해 사용될 수도 있다. 그것은 크레아티닌의 분석 및 호중구 겔라티나제 결합 리포칼린(Neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL), 시스타틴 C(Cystatin C) 및 다른 마커들과 같은 마커들의 분석을 포함한다. 마커들은 면역분석법, 효소분석법, 및 본 명세서에서 기술된 다른 분석법을 사용하여 분석될 수 있다.
슬립칩은 간 기능을 평가하기 위해 사용될 수 있으며, 이 경우 효소적 분석법 테스트 및 면역분석법 테스트를 포함한다. 표적물질은 알라닌 트랜스아미나제(Alanine transaminase, ALT), 아스팔테이트 트랜스아미나제(Aspartate transaminase, AST), 알칼린 포스파타제(Alkaline phosphatase, ALP), 감마 글루타밀 트랜스펩티다제(Gamma glutamyl transpeptidase, GGT), 베타-헥소스아미다제(Beta-Hexosaminidase, β-HEX), 락테이트 데하이드로게나제(Lactate dehydrogenase, LDH), 5’ 뉴틀레오티다제(5' Nucleotidase, 5'NTD)를 포함한다. 혈청 글루코스, 전체 및 직접 빌리루빈(BIL), 혈청 알부민의 응집 테스트 (예를 들면, INR)와 같은 부가적인 테스트가본 명세서에 기술된 상기 방법들을 사용하여 슬립칩 상에서 수행될 수 있다.
상기로부터, 본 발명의 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형 및 변이가 가능함은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명한 사실이다. 본 명세서에 기술된 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. 또한, 모든 형태의 변형 및 변이는 본 발명의 정신에 위배되지 않는 범위 내에서 본 발명의 특허청구범위에 속한다고 볼 것이다.
특정 실시예들에서, 상기 슬립칩은 연속 희석에 의한 농도 프로파일을 생성하기 위하여 사용될 수 있다. 연속 희석은 가장 흔하고 기초적인 실험 기술 중 하나이고, 면역분석법, 세포 배양 분석법에 적용될 수 있으며, 효소 분석법의 동역학을 측정할 수 있다. 일부 미세유체 방법들은 희석을 만들어내기 위해 존재하는바, 이는 층 흐름의 시료 확산적 혼합, 복수의 스트림을 쪼개고 다시 합치게 하는 다중-단계 유체-분배기를 포함하고, 그리고 원하는 최종 농도에 비례하는 유량 비율로 복수의 스트림을 혼합하는 것을 포함한다. 그러나, 많은 미세유체 장치는 연속 흐름에 의존하므로, 큰 무용 체적, 흡착, 압력 하강 제한, 및 다른 제한들에 의한 한계가 존재한다. 특정 실시예들에서, 상기 슬립칩은 복잡한 기구를 사용 함이 없이 다중화 다중-단계 반응을 견고하게 처리할 수 있다. 본 발명자들은 연속 희석을 수행하기 위하여 슬립칩을 사용하는 단순한 접근법을 개발하였다. 본 발명자들은 영역 크기를 조절하는 것에 의해 조절되는, 다단계 슬라이딩 및 다중 혼합 비율을 통합하기 위한 슬립칩을 설계하였다. 이러한 방법은 동시에 많은 시료들을 처리할 수 있고, 특성 실시예에서, 소량의 시료(각 영역용 나노리터)를 필요로 할 수 있으며, 그리고 정량적인 다중화 분석법에 유용하다. 일 실시예에서, 연속 희석 슬립칩은 동시에 8개의 연속 희석 단계들을 수행할 수 있도록 설계되었다. 그것은 2개의 부분: 시료를 포함하는 얕은 영역의 열들과 희석용 버퍼 용액들로 채워지는 깊은 영역의 어레이들을 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 슬립칩을 사용하는 것에 의해, 연속 희석을 수행하는 것은, 3개의 일반적인 단계: (a) 버퍼 로딩, (b) 시료 로딩, 및 (c) 희석을 위한 다단계 슬라이딩을 포함한다. 슬립칩을 채운 이후에, 예를 들면, 피펫팅 이후에, 칩의 두 플레이트는 영역으로부터 덕트를 분리하기 위해 미끄러진다. 덕트가 영역으로부터 분리되기 때문에, 그것들은 또한 슬라이딩 경로 밖으로 이동된다. 시료를 포함하는 영역들은 버퍼를 포함하는 영역들과 접촉하게 되므로, 시료들은 희석된다. 혼합비, 또는 희석 인자는 영역 체적의 비에 의해 결정된다. 슬라이딩의 추가 단계들이 동일한 원리에 의해 작동되므로, 연속 희석이 수행된다. 일 실시예에서, 연속 희석 슬립칩은 2 층의 미세가공된 유리로 구성되어 있다: 상부층은 모든 주입부 및 배출부, 시료를 위한 덕트, 및 버퍼 용액을 위한 영역를 포함한다. 모든 영역들의 깊이는 76 μm이고, 모든 덕트들의 깊이는 30 μm이다. 하부층은 시료를 위한 10 μm 깊이의 영역 및 버퍼 용액을 위한 30 μm 깊이의 덕트를 포함한다. 상기 장치의 표면은 10 μm 깊이 영역이 친수성을 유지하는 동안, 소수성이 되도록 실란화되었다. 본 발명자들은 영역의 내부와 외부의 확산을 감소시키기 위하여 상대적으로 얇은 10 μm 깊이의 영역을 사용하였다. 본 발명자들은 친수성 영역 내부의 물 액적의 형상 (및 체적)을 조절하고, 그리고 또한 얕은 영역으로부터 비-젖음(de-wetting)을 예방하기 위하여, 영역을 친수성으로 제조하였다. 10 μm 깊이의 영역들은 친수성 표면을 유지하기 위하여 실란화되는 동안 일시적으로 마스크로 덮어졌다. 형광 염료를 사용하여 상기 슬립칩을 사용하는 희석을 정량화하였다. 4개의 슬라이딩 단계 이후에, ~104-배 희석이 관찰되었다.
친수성 영역으로 슬립칩을 제작하기 위하여, 본 발명자들은 그 다음 하기의 변형들로 본 명세서에 기술된 슬립칩 과정 중 유리 에칭 가공을 수행하였다. 우선, 블랭크 유리 플레이트(소다-석회 유리, 두께: 0.7 mm; 크롬 피복: 1025
Figure pct00018
; AZ 1500 포토레지스트: 1 μm) 를 절단하여 3 in × 1 in가 되도록 하였다.
포토마스크를 유리 플레이트로부터 제거한 후, 유리 플레이트를 2분 동안 0.5% NaOH 용액에서 침지하는 것에 의해 현상하였다. 유리 플레이트에 테이프를 붙이고 에칭 용액에서 침지한 다음, 25 °C의 일정-온도 수조 교반기를 사용하여 에칭 속도를 조절하였다. 에칭 시간(~30 분)을 조절하는 것에 의해, 46 μm 깊이의 영역들을 유리 플레이트로 에칭하였다. 영역들의 깊이는, 특정 에칭 깊이를 통과시키는 것에 의해, 확대되지 않았음을 나타내는 특별히 설계된 구조물을 사용하는 것이 의해 확인하였다. 상기 구조물은 에칭된 거리의 두배와 동일한 넓이를 갖는 정사각형의 어레이로 이루어진다. 정사각형은 기본적으로 크롬으로 커버되어 있다. 원하는 에칭 깊이에 도달한 이후에, 크롬을 제거하면, 육안으로 관찰할 수 있는 명확한 명암 차이가 생성된다. 상기 플레이트를 꺼내어 밀리포어 수로 철저히 헹군 다음 질소 가스로 건조시킨다. 덕트를 위한 설계를 포함하는 다른 포토마스크를 사용하는 것에 의해, ~20 분 동안 에칭한 다음, 30 μm 깊이의 덕트를 유리 플레이트로 에칭하였다. 상기 플레이트를 밀리포어 수로 완전히 헹군 다음, 질소 가스로 건조시켰다. 본 발명자들은 하부 플레이트 내에 10 μm 깊이의 영역 및 30 μm 깊이의 덕트를 만들기 위하여 동일한 프로토콜을 사용하였다.
유리 플레이트를 에탄올로 헹구고 비현상된 포토레지스트를 벗겨낸 이후에, 유리 플레이트를 피라냐(piranha) 세정(30% 과산화수소 및 황산 )하고, 밀리포어 수로 2회 세척한 다음, 2시간 이상 동안 220°C의 핫 플레이트에서 탈수화하였다. 상기 플레이트를 실온까지 냉각시키고, OmniCoat (MicroChem, USA)로 스핀-피복한 다음, 1분 동안 베이크하였다. 상기 플레이트를 실온까지 냉각시킨 후 OmniCoat (MicroChem, USA)으로 스핀-피복 한 다음, 1분 동안 200°C에서 베이크하였다. 상기 플레이트를 실온까지 냉각시킨 후 20 μm 두께의 SU8 2025으로 스핀-피복하였다. 그 다음, 상기 플레이트를 소수성이 될 프레이트 상의 영역을 보호하는 포로마스크로 덮었다. 이미 존재하는 크롬 마스크의 이점을 갖기 위하여, UV 광을 유리 플레이트의 뒷 부분에 비추어 주었다. 포토마스크에 의해 노출된 영역에서, UV 광은 크롬 피복이 제거된 경우에만 플레이트를 통과하므로, 영역내 SU8만이 현상 이후에 존재하게 되었다. 영역내 SU8은 영역을 보호하고 그것들이 소수성으로 만들어지지 않도록 하였다. 노출된 표면 상의 OmniCoat를 30초 동안 MF-319에서 침지하는 것에 의해 현상한 다음, 2분 동안 밀리포어 수로 헹구었다.
마지막으로, 유리 플레이트를 크롬 에칭제에서 침지하는 것에 의해 크롬 피복을 제거하였다. 그 다음, 유리를 에탄올 및 밀리포어 수로 헹군 후, 하룻 밤 동안 120°C 에서 베이크하는 것에 의해 건조시켰다.
유리 플레이트를 세정하고 100초 동안 300 mTorr에서 공기 플라즈마 처리한 후, 표면을 상술한 트리데카플루오로-1,1,2,2-테트라히드로옥틸-1-트리클로로실란을 사용하여 5시간 동안 진공 건조기에서 실란화하는 것에 의해 소수성을 부여하였다. 실란화 이후에, 상기 유리 플레이트를 (하기의 순서에 따라) 3 × 20 ml 무수 톨루엔, 3 x 30 ml 무수 에탄올, 3 × 30 ml 에탄올/ H2O (50%:50%, v:v), 및 3 × 30 ml 밀리포어 수로 헹구었다. 상기 플레이트를 15분 동안 120°C의 오븐에서 베이크하였다. 최종적으로, 30분 동안 80°C 에서 리무버 PG에서 유리 플레이트를 침지하는 것에 의해 영역내 SU8를 벗겨내였다. 그 다음, 상기 플레이트를 클로로폼, 아세톤, 및 에탄올을 사용하여 헹군 후, 질소로 건조시켰다.
상기 슬립칩을 FC-40 하에 조립하였다. 우선, 하부 플레이트는 패턴이 위를 향하도록 하여, 페트리 접시내의 FC-40으로 침지하였다. 그 다음, 상부 플레이트는 패턴이 아래를 향하도록 하여, 하부 플레이트의 상단 부에 올려놓았다. 그로부터 ~ 3분이 경과한 후, 슬립칩을 조립할 때, 공기 버블이 포획되지 않도록 상부 플레이트를 조심스럽게 뒤집었다. 필요한 경우, 공기 버블은 진공 건조기에 칩을 재빨리 두는 것에 의해 제거할 수 있다. 두 플레이트를 서로에 대하여 움직이게 하여 정렬하고 4개의 마이크로 바인더 칩을 사용하여 것에 의해 고정하였다. 상기 슬립칩을 로딩하는 동안 FC-40에서 보관하였다.
모든 형광염료 용액들은 사용 전에 0.22 μm PVDF 시린지 필터(Millipore)로 여과하였다. PBS 버퍼 (1×, pH 7.4)내 Alexa Fluor 488 히드라진 (1.6 mM, Invitrogen)을 시료 덕트로 피펫팅하는 것에 의해 로딩하였다. 1 × PBS 버퍼 용액을 버퍼 덕트로 로딩하였다. 상기 슬립칩을 Leica MZ 16 스테레오스코프 하에 미끄러지게 하는 것에 의해, 단리된 액적을 형성하였다. 그 다음, 시료 영역들을 버퍼 영역들과 순차적으로 결합하였다. 각 슬라이딩 단계 이후에, 본 발명자들은 형광 안료가 확산될 수 있도록 3분 동안 기다렸다. 4단계의 슬라이딩 이후에, 상기 장치를 20X 0.7NA Leica 대물렌즈와Hamamatsu ORCAER 카메라가 구비된 Leica DMI6000 마이크로스코프 (Leica Microsystems)로 신속하게 전달하였다. 30ms의 노출 시간을 갖는 L5 필터를 사용하는 것에 의해 Alexa Fluor 488 형광을 수집하였다. 얻어진 이미지들을 Metamorph 이미징 시스템 버전 6.3r1 (Universal Imaging)을 사용하여 분석하였다. 마이크로스코프를 보정하기 위하여, L5 필터에 대한 형광 대조 슬라이드의 형광 강도를 기록하여 바탕값 보정을 위해 사용하였다. PBS 버퍼내에 80 nM, 160 nM, 400 nM 및 800 nM Alexa Fluor 488 히드라진 용액들을 사용하여 보정 곡선을 얻고, 4개의 슬라이딩 단계 이후의 형광 안료의 농도를 측정하였다. 영역 깊이는 Veeco Dektak 150 프로파일로미터를 사용하여 측정하고, 영역의 체적은 에칭이 등방성이라는 가정 하에 계산하였다.
슬립칩의 특정 실시예는 또한 다른 다단계 반응을 수행하기 위하여 사용될 수 있는바, 이는 IC50, EC50와 다른 농도 곡선 (예를 들면, CP450 등)을 측정하는 것을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. IC50 분석법은 100% DMSO 또는 DMSO / 물 혼합물 내의 2x107 희석이 얻어질 수 잇도록 DMSO 화합물 라이브러리의 연속 희석법을 통해 수행될 수 있고, 그리고 분석법들은 목적 화합물의 IC50가 확인될 수 있도록 각 희석법으로 수행될 수 있다. 상기 슬립칩은 라이브러리 희석하고 다중화 방법으로 발생된 희석 라이브러리상에 연속 스크리닝을 수행하게 할 수 있는 이상적인 플랫폼이다. 슬립칩 상에서 수행될 수 있는 다른 다단계 반응으로는 효소 동역학을 측정하고 연속 희석에 의한 (실시간 PCR과 결합하거나 종말점 PCR을 사용하는) PCR에 의해 농도를 정량화하는 것을 포함한다. 예를 들면, 사용자는 PCR에 의해 HIV 바이러스 로딩 테스트(HIV viral load test)을 수행할 수 있다. 사용자는 넓은 동적 범위에 걸쳐 미지의 시료들을 연속적으로 희석하고, HIV 바이러스가 포아송 분포(Poisson distribution)를 따른다는 가정 하에 PCR 결과로부터 농도를 추출할 수 있다. 슬립칩 상에서 수행될 수 있는 다른 다중-단계는 약물 및 독성물질 모두에 대한 민감성을 테스트하는 것을 포함하는바, 이는 (온-칩 또는 오프-칩) 이후에 투여될 목적 물질의 연속 희석 및, 테스트 유기체 또는 인간 환자, 및 희귀 세포 또는 분자의, 특히 미지의 초기 농도를 갖는 시료로부터의 단리를 사용한다: 조밀한 세포 집단 / 고농도 혼합물에서, 희귀 세포 또는 분자를 발견하는 것은 어려울 것이다. 연속 희석은 초기 농도를 모를 경우, 확률론적 한정(stochastic confinement) (또는 디지탈 PCR 등) 에 요구되는 농도를 얻을 수 있는 통상적인 방법을 제공한다. 슬립칩 상에서 수행될 수 있는 다중-단계 반응은 연속 희석 및 역-계산법을 통해 신속하게 측정될 수 있는 박테리아 배양 밀도(또는 용액내의 입자들의 농도)를 포함한다. 항체 역가 및 연속 희석은 비-특이적 결합을 제거하거나 위-양성(false-positive)으로서 그것을 동정하는 방법에 의해 측정될 수 있다.
본 발명의 특정 실시예들에서, 고효율 나노리터 디지털 PCR이 슬립칩 상에서 수행될 수 있다. 상기 슬립칩은 교차 오염을 나타내지 않았는바, 이는 단백질 결정화 및 면역분석법을 수행하는 것에 의해 이미 확인되었다. 본 발명자들은 또한 상기 슬립칩이 고처리량 다중 PCR에 적용될 수 있음을 입증하였다. 본 발명자들은 디지털 PCR을 수행하기 위하여 상기 슬립칩 플랫폼을 사용하였다. 특정 실시예들에서, 피펫팅을 통해 시료들을 도입한 이후에, 천개 이상의 나노리터 구획들은 한번의 하나의 슬라이딩 단계에 의해 동시에 형성될 수 있다. 낮은 농도의 핵산이 상기 장치로 로딩될 때, 구획 마다 한개 미만의 카피를 갖는 핵산이 존재할 수 있다. 이 경우, 종말점 형광의 “예스-또는-노” 디지탈 판독기가 각 구획내의 핵산의 존재를 측정하기 위하여 사용될 수 있으며, 원래 시료내의 핵산의 농도가 계산될 수 있다. 그러한 디지털 PCR 슬립칩은 스타피로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 게놈 DNA를 증폭하기 위하여 사용되어 왔다. 또한, RT-PCR을 통해 HIV로부터 RNA를 증폭하기 위하여 사용되어 왔다. 디지털 PCR 슬립칩은 핵산의 정량화를 위한 새로운 전략, 세포 이질성에 대한 연구, 태아기 질환의 진단, 및 현장 진료(point-of-care) 장치의 개선을 제공한다. 등온 반응기 및 비주얼 판독기와 결합될 때, PCR 슬립칩 플랫폼은 자원이 한정된 상황에서 진단시 강력한 도구가 될 수 있다.
유체의 체적을 다루는 것은 현대의 실험실 실습의 기초를 이룬다. 그것은 바이오마커 및 약물에서부터 새로운 물질 및 공정에 이르기까지의 연구 및 개발에 매우 중요하다. 그것은 진단, 식품과 물의 안전, 및 바이오디펜스(biodefense)에서의 분석 과학의 중요한 부분을 차지한다. 이러한 분야에서, 슬립칩 기술이 유용할 수 있다. 슬립칩은 많은 유체 체적의 동시 처리를 위한 복잡한 프로그램을 암호화하도록 설계될 수 있다. 상기 슬립칩은, 특정 실시예에서, 서로에 대하여 움직일 수 있는 두개의 플레이트를 포함한다. 상기 프로그램은 영역들의 패턴들이 플레이트에 인쇄되는 것처럼 각 슬립칩으로 암호화된다. 각 영역들은 그것이 반대 플레이트 상의 영역과 겹쳐질 때까지 격리된 상태로 남아있는다. 암호화된 프로그램은 두 플레이트가 서로에 대하여 움직이는 것에 의해-또는 슬라이딩에 의해-실행된다. 플레이트가 움직이기 때문에, 두 플레이트내의 영역들은 정확하게 한정된 순서로 접촉을 반복하는 것에 의해, 일시적인 유로를 생성하고 분해하며, 그리고 접촉을 반복하는 것에 의해 시약을 제공한다. 하나 이상의 시료들은 그러한 유로를 통해 도입될 수 있다. 상기 프로그램은 시료를 사용자에 의해 일시적인 유로로 로딩하거나 미리- 슬립칩 상에 로딩된 시약과 접촉하는 것에 의해 실행된다. 매우 복잡한 프로그램들이 사용자에게 용이하게 수천개의 영역 상에서 실행될 수 있다. 더 작은 체적의 시료 및 시약을 사용하는 것이 중요하고, 시료와 시약의 더 많은 상호 작용, 및 더 복잡한 조작이 슬립칩에는 유익하다. 상기 슬립칩은 새로운 유체 기술 개발의 틀을 이루는, 7개의 미충족 요구들을 만족시킨다: 그것은 소형화를 가능하게 하고, 피코리터에서부터 나노리터를 거쳐 마이크로리터 체적까지 원활하고 정교하게 측정할 수 있다. 상기 슬립칩은 큰 규모로는 단순하게 할 수 없었던 실험들, 예를 들면, 인간 세포뿐만 아니라 미생물 세포에서 각 세포에게 신호를 전달하거나, 분자들의 수를 계산하는 것을 가능하게 한다. 상기 슬립칩은 시약과 시료의 소비를 최소화하고, 낭비, 특히 비싼 시약, 희귀한 시료(생검 시료, 희귀 세포, 기탁 시료), 독성 물질, 방사능 물질, 및 감염성 폐기물을 감소시킨다. 슬립칩에 대한 특정 실시예들은 수천개의 실험들로 이루어진 다중화 실험을 최소화된 포맷으로 동시에 용이하게 수행하는 것을 가능하게 한다. 슬립칩은 각각의 세포들의 특성 및 유전형에서의 가변성을 검출하기 위해 요구되는, “하나의 시료, 하나의 분석법, 많은 시간”을 가능하게 한다. 예로서 생검 및 순환 종양 세포들을 분석하는 것에 의해 암을 진단하고, HIV에서의 희귀성 및 약물 저항성 유전형을 분석하고, 그리고 뇌졸중을 진단 위한 방법들을 판명하는 것을 포함한다. 슬립칩에 대한 특정 실시예는 Quest Diagnostics와 같은 중앙 실험실에서 수행되는, “하나의 분석법, 많은 시료들”을 매우 간소화할 수 있다. 스립칩에 대한 특정 실시예는 복잡한 조건을 갖는 진단에 요구되는 다중파라미터 진단학에서와 같이, “하나의 시료, 많은 분석법”을 가능하게 한다. 슬립칩에 대한 특정 실시예는 바이오마커의 발견 및 입증에 요구되는 “많은 시료, 많은 분석법” 실험들을 가능하게 한다. 상기 슬립칩은 테스트에서부터 결과가 나올때까지의 시간을 줄이는 것에 의해 신속성을 만족시킨다. 단일-세포 수준에서 분석을 수행하여 세포 배양을 없애는 것에 의해, 슬립칩에 대한 특정 실시예는 폐혈증의 진단 및 식품, 물, 및 환경 안전성에 중요한 미생물학적 실험을 가속화시킨다. 단순화된 플랫폼을 제공하는 것에 의해, 슬립칩에 대한 특정 실시예는 (급성 심장 발작과 같은) 급성 상태의 진단에 중요한 휴대용 사용 시점(point-of-use) 장치를 가능하게 한다. 슬립칩에 대한 특정 실시예는 “디지털” 포맷으로 단일-분자 수준까지 떨어진 민감도를 만족시킨다. 한번에 분자를 검출하는 것은 핵산 및 단백질의, 민감도 검사 및 정량화에 매력적이다. 상기 슬립칩은 (각 분자를 매우 충분한 농도를 얻어 검출 화학이 가능하도록) 작은 체적으로 (정확한 계산을 위하여) (예를 들면, 이종 면역분석을 위한)수천개의 실험 및 다단계 조작을 요구하는 “디지털” 포맷에 이상적인 플랫폼이다. 이러한 성능은 각각의 암 세포에서의 유전자 카피 수를 계산하는 것에서부터 심장 발작 및 뇌의 외상(traumatic brain injury, TBI)에 이르기까지, 넓은-범위의 관련성을 가진다. 상기 슬립칩은 설비시설이 잘 구비된 실험실, 현장 진료, 및 자원-부족 상황에 요구되는, 수작업을 최소화하고, 오류를 줄이며, 재생능력을 증가시키고, 효율성을 증가시킨다. 그것은 마이크로크기로 복잡한 선-프로그램화된 다중단계 과정들을 가능하게 하는바, 이는 유전학 테스트를 위한, 시료 준비 및 가공을 포함한다. 그것은 사용자에 의해 로딩되거나, 공장에서 사전 로딩되어 보드에 저장된 시약들을 제공하고, 처리를 최소화시킨다. 사전 로딩된 시약을 포함하는 슬립칩은 DNA 혼성화 분석법에 혁명을 불러 일으킨, 유전자-칩과 같이 다중화 용액-상 분석법에 혁명을 불러일으킬 수 있는 가능성을 가진 “액체-상 마이크로분석법”으로 기능을 한다. 그것은 벤치-탑(bench-top) 발견 작업, 현장 진료 및 자가 진단, 자원 부족 상황에 요구되는 바와 같이, 실험실 밖에서 수행되는 복잡한 과정을 가능하게 한다. 상기 슬립칩 플랫폼은 모든 공통의 실험 방법을 제공한다. 예를 들면, 그것은 넓은 범위의 적용 예에 요구되는, PCR 및 다른 핵산 테스트, 면역분석법 및 비드 핸들링, 효소 분석법 및 세포-기반 분석법을 제공한다. 그것을 통상적으로 사용되는 (광학적, 자성 및 전기적) 판독 매카니즘을 제공한다. 그것은 유일하게 화학물질, 예를 들면 시료 테프론 (Teflon), 및 유리 장치에 적합하다. 슬립칩에 대한 특정 실시예는 비용을 감소시킨다. 특정 실시예는 밸브를 필요로하지 않으므로, 표준 성형 기술에 의해 제조될 시료가 존재한다. 상기 플랫폼은 필요로하는 최소한의 장비의 유무에 관계없이 작동하기에 단순할 수 있다. 저렴한 가격 및 단순성의 조합은 상기 슬립칩을 칩 기술 중에서, 칩을 작동시키기 위해 복잡한 기구의 사용이 요구되고(로보트, 펌프, 작동기), 복잡한 칩이 통합된 밸브를 필요로 하는 다른 미세유체 실험에 비해 우수하게 만든다. 상기 슬립칩은 자본-집중적이고 증발 및 정밀함에 대한 문제로 인해, 저-체적 범위에서 슬립칩의 수행력에 필적할 수 없는 로보트 워크스테이션에 비해 우수하다.
슬립칩에 대한 특정 실시예는 많은 단일 세포 / 단일 입자 / 단일 시료 / 단일 분자들 상에서 동시에 사용될 수 있다. 그것들은 또한 유지, 교란(perturbing), 및 분석을 위한 유체와 관련된, 3D 조직 모델용으로 사용될 수 있다.
상기 슬립칩은 시약 및 기구를 제공하는, 학문적, 약제학적, 진단적 세그먼트로 사용될 수 있다. 상기 슬립칩에 대한 특성 실시예는 소형화 및 표준 실험 프로토콜, 핵산 DNA/RNA의 농도 측정 (“디지털 PCR”), 단백질 결정화의 간소화를 가능하게 하고, 단일-세포 분석에서의 유일한 성능을 제공한다. 상기 슬립칩은 또한 슬립칩 내에 그것들을 포장해두는 것에 의해 화합물 라이브러리를 판매하는 회사들에 가치를 제공한다. 현재, 이러한 라이브러리는 스크리닝 센터에 의해서 판매되고 있으며, 테스트는 고가이다. 각 화합물은 예를 들면, 10,000 배 미만이 슬립칩상에 로딩되어 테스트될 수 있다. 상기 슬립칩은 시약을 테스트하는 사용자에게 장벽을 줄일 수 있으며, 시약 제형을 갖는 패널로 사전 로딩된 슬립칩은 그것들의 적용 예에 적합한 제형에 대한 신속하고 효율적인 테스트를 원하고, 다량으로 제형을 주문하는 사용자에게 기여할 수 있다. 슬립칩에 대한 특정 실시예는 또한 매우 단순화된 접근접을 요구하는 법정에서 유전자 테스트를 위해 사용될 수 있다.
슬립칩이 유용한 다른 영역은 식품, 물 및 환경 안정을 포함한다. 현재 박테리아 검출 방법은 테스트하기 전에 하룻밤 동안 배양될 것을 요구한다. 슬립칩에 대한 특정 실시예는 이러한 낭비적인 시간 지연을 극복하는 것에 의해, 배양 없이 ~1 시간 내에 결과를 제공한다. 슬립칩에 대한 특정 실시예는 먼 거리(예를 들면, 우주 탐험, 시골 지역)에 중요한, 현장 테스트를 가능하게 한다. 그것은 또한 가축 진단 / 농업 테스트에 사용될 수 있다. 슬립칩에 대한 특정 실시예는 가정에서의 현존하는 진단 테스트, 현장 검사 및 임상 테스트를 최소화하고 가속화시킨다. 기술의 단순화는 현장 진료, 가정 및 군대에서의 사용을 매력적으로 만들고, 높은 수행력은 임상 실험실을 위해 현재 다른 플랫폼을 승인받기 위해 요구되는 FDA 비용에서의 돈을 절약되게 하고 현장 진료 기술에 매우 유용하다. 슬립칩에 대한 특정 실시예는 미국에서만 100,000 명 이상의 사망자를 야기하는, 폐혈증에서 미생물적 테스트를 가속화하기 위하여 사용될 수 있다. 이러한 사망의 대다수는 더 빠른 진단에 의해 예방가능하다. 진단법은 안전성과 효율성을 보장하기 위하여, MRSA 및 약물-저항성 HIV 유전형에서와 같이, 유전자 테스트 및 약물 저항 스크리닝, 약물 저항성을 위한 표현형 테스트, 응고장애 테스트 및 관련 테스트 및 혈액 응고 모니터링, 세포-기반 면역진단 / 알레르기 프로파일링, 개발 도상국을 위한 진단(예를 들면, HIV, 말라리아, TB 등), 기관 기능 및 치료 특히, 고가의 생물제제를 모니터링하기 위한 가정 및 현장 진료, 약물 치료 및 약물 대사를 모니터링하기 위한 일반적인 대사 테스트를 포함한다. 상기는 소비자 뿐만 아니라, 잠재적으로, 임상 실험을 관찰하기 위한, 약물 개발자에게도 중요하다. 와파린(Warfarin)은 가장 잘 알려져 있는 것이긴 하지만, 더 많은 것이 존재한다. 슬립칩은 또한 새로운 진단 법에 사용될 수 있는바, 이는 암, 태아세포, 뇌종중 진단에서와 같이 단일-세포 분석을 통한 새로운 바이오마커를 발견하고; (펄스 채스(pulse-chase) 진단을 위한 화학전극과 관련된) 알츠하이머 및 암에서와 같이 다중화 분석법을 사용하는 바이오마커의 새로운 패널을 발견하는 것을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 그것은 이러한 바이오 마커의 임상 연구 및 유요성 입증을 가능하게 하고, 현장 진료 및 임상 포맷에서 진단시 그러한 바이오 마크의 사용을 가능하게 한다. 그것은 또한 정신건강 장애를 가진 환자들에게 적당한 정신 상태를 유지시키기 위해 사용될 수 있는바, 이는 예를 들면, 가정 테스트, 장거리 관찰, 환자 네트워크, 및 다른 비-전통적인 접근법을 포함한다. 상기 슬립칩은 또한 새로운 치료 접근법에 사용될 수 있는바, 이는 바이오마커 발견 및 약물 발견과 관련된 유효성 입증 및 진단법 및 통합된 분석법으로 복잡한 조직 매양 모델을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 슬립칩은 또한 약물 치료를 제공하는 것 보다는, 행동을 교정하거나 사람들에게 많은 선택을 가능하게 하는 테스트로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 니코틴 패취 및 다른 금연 생산물은 처방전 없이 이용가능하다. 그것은 니코틴의 대사율이 금연의 성공률에 강하게 영향을 미치므로, 구매하는 사람들에게 패취의 종류를 설명해야 하는 것은 잘 알려져 있다. 그러한 테스트는 슬립칩 상에서 이행될 수 있고, 사람들을 3가지 종류의 저-매개-고-니코틴 대사자로 분류하고 적당한 금연 상품을 제안하는 것에 의해, 담배를 끊고있는 사람에게 팔릴 것이다. 매일 섭취하는 적당한 중단 경험을 제공하기 위한 패취의 투여량을 제안한다. 키트는 금연 상품으로 그러한 테스트를 포함할 수 있다. 슬립칩 테스트는 또한 수행: 수화 및 탈수화 수준, 다이어트, 카페인 및 다른 합법적 물질들의 수준을 최적화할 수 있고, 연습 수준은 적당한 테스트 지도로 최상의 수행력을 달성하기 위해 모두 관찰되고 그리고/또는 변경될 수 있다. 그러한 테스트는 시간에서: 경쟁적 운동, 군대, 학생, 스포츠 팬들의 수행에 의해, 그리고 낮잠으로 낭비된 있는 시간을 갖는 사람들에 의해 사용될 수 있다. “스트레스 칩(Stress chip)”은 일반적인 집단에서 급성 및 만성 스트레스 마커를 분석하기 위해 사용될 수 있다. 스트레스를 관리하는 것은 아마도 삶의 만족도를 증가시키는 가장 중요한 방법 중 하나이다. 그러한 테스트는 스트레스-관련 건강 질환의 가능성을 감소시키기 위하여 그들의 라이프 스타일에서 각개인의 더욱 즉각적인 피드백을 제공할 것이다. 이것은 만성 감염 또는 심혈관계 질환의 진행을 기다린 후 개입하는 것 보다 꽤 덜 비용이 든다. 고용주들, 군인 및 법 집항자, 및 보험업자에게, 그것은 인간 자원을 평가하고 관리하기에 가치가 있다. “중독 슬립칩(addiction SlipChip)”은 패널, 또는 패널의 조합을 수행하기 위해 사용될 수 있는바, 이는 알코올 소비와 관련된 간 손상, 니코틴 및 담배와 관련된 그것의 대사산물 수준, 혈중 글루코스 및 대사산물과 관련된 글리코실화 헤모글로빈의 수준, 섭식 장애, 카페인 및 그것의 대사산물 수준, 및 약물 남용 수준을 테스트한다. “베이비 칩(baby chip)”, “기관 칩(organic chip)” 및 “만성 칩(chronic chip)”은 1세대 부모, 건강 광신자, 또는 정보를 원하고 관찰하여 미리 대책을 광구해야 하는 만성 질환의 고위험에 있는 사람들에게 필요한 정보를 만족시키기 위한 추가적인 어플리케이션이다. 휴대폰 패독기, 예를 들면, 구글 또는 마이크로소프트와 제휴된 단순한 슬립칩의 경우, 그들의 테스크의 결과를 정리하고 다이어트, 운동 및 행동을 반영하는 블로그로 그것들을 선택적으로 링크하는 사람들을 위한 방법으로서, 매력적이다. 건강한 사람은 정보에 대한 믿기 어려운 가치를 위해 그들의 구글 건강 서비스를 사용할 수 있고, 테스트를 개선시키고 그리고 광고 및 새로운 제품을 제공하기 위하여 사용될 수 있다. 상기 슬립칩에 대한 특정 실시예는 건강을 유지하고, 질병을 테스트 하기 위하여 사용될 수 있다. (건강 상태에서와 같이 단기간 뿐만 아니라 장기간) 수행과 관련되고 단순한 테스트 플랫폼을 통해 각 개인을 개별화하는 테스트가능한 타액분비성 마커를 분석하는 것은 삶의 질과 사회 생산성을 향상시킬 수 있다.
특정 실시예에서, 상기 슬립칩은 모델 시스템과 같은 산소 분자에 의한 메탄 산화를 사용하여 새로운 동질의 촉매를 발견할 수 있도록, 유전 알고리즘 (genetic algorithms, GA)을 위해 사용될 수 있다. 본 발명자에 의해 증명된 일 실시예에서, GA 파라미터로는 촉매, 종결 산화제로서 분자 산소를 사용할 수 있는 조촉매, 및 촉매 시스템을 조율할 수 있는 리간드가 존재하였다. GA는 최적의 촉매 시스템을 발견하기 위하여 수백개의 반응을 요구하고, 그리고 미세유체는 동시에 실행하는 다수의 반응을 가능하게 하였다. 작은 규모 및 체적의 미세유체는 상당히 안전한 이점을 제공한다. 미세유체 시스템은 촉매를 포함하는 다양한 플러그 어레이를 형성하고, 고압에서 가스상 시약을 도입하고, 동시에 반응을 수행하고, 그리고 인 시튜 반응기 시스템을 사용하여 촉매 활성을 분석하는 방법들을 포함한다. 플래티넘(II)가 활성 탄소로 확인되었고, 철 (II) 및 폴리옥소메탈레이트 H5PMo10V2O40 (POM-V2)가 활성 조촉매로 확인되었다. 상기 Pt/Fe 시스템은 NMR 실험을 사용하여 더욱 최적화될 수 있도록 특징화될 수 있다. 최적화 후 약 50 정도의 산출율 수가 거의 동량의 메탄올 및 포름산 생산과 함께 달성되었다. Pt/Fe 시스템은 전체 촉매 사이클을 갖는 철의 호환성으로 증명되었다. GA-가이드 진화는 촉매 및 화학적 공간의 탐사가 바람직한 영역의 발견을 상당히 가속화할 수 있는 가능성을 가진다. Kreutz, 외, J Am Chem Soc. 2010 Mar 10;132(9):3128-32 참고(상기 참고문헌은 본 명세서에서 참고로 원용됨).
특정 실시예에서, 상기 슬립칩 플랫폼은 시료 로딩 없는 기구 및 소량의 시료를 사용하는 디지털 PCR을 수행하기 위해 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 상기 PCR 마스터 혼합물은 피펫팅에 의해 상기 슬립칩으로 도입될 수 있다. 연장된 영역이 겹쳐지는 것에 의해 유로가 형성되고, 단순히 미끄러지는 것에 의해 분해되어, 1280개의 반응 구획(각 (2.6 nL)들이 동시에 형성된다. 열 순환 이후에, 종결-점 형광 강도가 사용되어 핵산의 존재를 측정하였다. 상기 슬립칩상의 디지털 PCR은 스타피로코커스 아우레우스 게놈 DNA을 사용하여 확인하였다. PCR 마스터 혼합액내의 템플레이트가 희석될 때, 양성 영역의 프랙션은 통계적인 분배에 의해 예측된 바와 같이, 정비례적으로 감소하게 되었다. 어느 교차 오염도 실험 동안 관찰되지 않았다. 디지털 역 전사 PCR (RT-PCR)은 또한 HIV로부터 RNA를 증폭하는 것에 의해 슬립칩상에서 증명된다. 상기 슬립칩은 PCR 및 RT-PCR을 사용하는 것에 의해 핵산의 수를 셀 수 있고, 단일 세포 분석, 태아 진단 및 현장 진료 진단을 수행할 수 있는, 용이하고 이용가능한 전략을 제공한다. 등온 PCR 및 시각적 판독기의 경우, 상기 슬립칩상의 디지털 PCR은 기구가 없도록 설계될 수 있고, 이는 자원이 한정된 영역내의 조사 및 진단에 광범위하게 적용될 수 있다.
디지털 PCR에 대한 일반적인 생각은 하나 이하의 분자를 구획 안으로 넣는 것에 의해 핵산 분자를 분리하기 위한 것이다. 구획들의 수는 증가하고 구획들의 크기는 감소하기 때문에, 단일 분자를 각각의 구획 내로 포획할 수 있는 가능성을 증가하게 된다. 단일 분자 수준에서, 상기 분자를 작은 체적으로 가두는 것은 또한 농도를 증가시키므로 민감도가 향상될 수 있다. 양성 영역의 수는 셀 수 있고, 시료내 전체 타겟 분자의 수는 계산될 수 있다.
디지털 PCR은 이미 다중웰 플레이트에서 증명되어 왔으며, 많은 연구진들이 미세유체 포맷에서 이러한 방법을 수행하는 방법을 알 고 있다. 밸브-제한된 미세유체 칩은, 예를 들면 세포 분석 및 태아 진단과 같은 다양한 적용을 위하여 디지털 PCR에 채택되었으나; 이러한 방법들은 밸브의 “열림/닫힘” 상태를 정확히 제어하기 위하여, 복잡한 다중층 소프트 인쇄 제작 프로세스 및 전기적 공기 시스템을 필요로 한다. 디지털 PCR을 위한 다른 시스템은 단일-카피 PCR 및 RT-PCR을 위한 미세유체 장치내의 피토리터 액적을 사용한다. 비록 많은 수의 피코리터 액적이 미세유체 T-연결에 의해 발생될 수 있더라도, 이 방법은 단일한 크기의 액적을 형성하기 위해 유량을 정확하게 조절하기 위한 매우-정밀한 펌프를 필요로 한다. 에털젼 PCR, 마이크로액적, 및 가공된 나노리터 액적이 디지털 PCR에서 잠재적으로 사용될 수 있으나, 이러한 시스템은 기계적 교반 또는 작은 체적의 액적을 생성하기 위한 펌프를 필요로 한다. 고처리량 나노리터 체적 qPCR 을 위한 미세유체 챔버가 디지털 PCR에 채택될 수 있으나, 그것은 여전히 기계적 로팅 및 수작업인 밀봉 작업을 필요로 한다. 현재까지, 디지털 PCR은 여전히 고 성능 사용자에게 제한적이다. 단순하고, 저렴한 플랫폼이 여전이 디지털 PCR을 실험실 또는 자원이 한정된 상황에서 기계적인 과정으로 할 수 있기에 미충족 요구이다. 본 발명자들은 슬립칩 플랫폼을 기반으로 하는 그러한 시스템을 증명하였다. 상기 슬립칩은 그것의 고유의 간편성으로 인해 디지털 PCR에 유리한 플랫폼이다. 모든 시료들은 단순한 피펫팅에 의해 로딩될 수 있다. 상기 슬립칩은 단백질 결정화 및 면역분석법의 관점에서 많은 적은 체적으로 다중단계 과정을 처리할 수 있다. 다중화 PCR은 슬립칩에서 성공적으로 증명되었다: 어느 교차-오염도 다른 미이-로딩된 프라이머가 병원균의 존재를 동정하기 위한 시료를 스크리닝하는데 사용되는 경우에도 관찰되지 않았으며, 상기 슬립칩의 설계는 열순환 동안 액상 PCR 용액의 열 팽장을 위한 공간을 허용하도록 변경되었다. 상기 슬립칩은 또한 시료를 수천개의 나노리터 영역으로 나누는 것에 의해 디지털 PCR을 수행할 수 있다는 것이 관찰되었다.
실시예. 상업적 제조업자로부터 구입한 모든 용매 및 염들은 다른 언급이 없는한 제공받은 바와 같이 사용하였다. SsoFast EvaGreen Supermix (2X)는 Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA)에서 구입하였다. 소혈청 알부민 (BSA)은 Roche Diagnostics (Indianapolis, IN)에서 구입하였다. 모든 프라이머들은 DNA Technologies (Coralville, IA)에서 주문하였다. 미네랄 오일 (DNase, RNase, Protease 비함유) 및 DEPC-처리된 뉴클리아제-비함유 물은 Fisher Scientific (Hanover Park, IL)에서 구입하였다. 디클로로디메틸실란은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)에서구입하였다. 스타피로코커스 아우레우스 게놈 DNA (ATCC number 6538D-5)는American Type Culture Collection (Manassas, VA)에서 구입하였다. 크롬 및 포토레지스트로 피복된 소다-석회 유리 플레이트는 Telic Company (Valencia, CA)에서구입하였다. 스펙트럼 식품 색채(레드 식품 염료)는 August Thomsen Corp (Glen Cove, NY)에서 구입하였다. PCR튜브 및 막 피펫 팁은Molecular BioProducts (San Diego, CA)에서 구입하였다. 작은 바인더 클립은(클립 사이즈 ¾”)은 Officemax (Itasca, IL)에서 구입하였다. 마스터사이클러(mastercycler) 및 인시튜 어답터(in situ adapter)는 Eppendorf (Hamburg, Germany)에서 구입하였다. 테프론 튜빙(O.D. 250 μm, I.D. 200 μm)은 Zeus (Orangeburg, SC)에서 구입하였다. 테프론 튜빙 (I.D. 370 μm)은 Weico Wire ＆ Cable (Edgewood, NY)에서 구입하였다. 포토마스트는 CAD/Art Services, Inc. (Bandon, OR)에서 입수하였다. 드릴 비트로 피복된 무정형 다이아몬드는 Harvey Tool (절단 직영 0.030 인치, Rowley, MA)에서 입수하였다.
슬립칩의 제작 과정은 본 명세서에 기술된 슬립칩 제조 과정 중 유리 에칭 제작 방법 및 그것의 변형을 기초로 한다. 크롬 및 포토레지스트로 피복된 소다-석회 유리 플레이트를 슬립칩의 (구형의 연장된) 영역을 위한 설계을 포함하는 포토마스트와 결합시킨 후, 40초 동안 UV 광에 노출시켰다. 노출된 포토레지스트 및 크롬 막을 제거한 후, 유리 플레이트를 40℃에서 35분 동안 유리 에칭 용액에 함침시키는 것에 의해 깊이가 50 μm인 영역을 제조하였다.
영역에 에칭된 패턴을 갖는 유리 플레이트를 밀리포어 수와 에탄올로 완전히 세정하고 질소 가스로 건조시켰다. 유리 플레이트를 100초 동안 플라즈마 클리너에서 산화시킨 후, 바로 디클로로디메틸실란 50 μL을 사용하여 건조기에 두었다. 그 다음, 한 시간 동안 진공하에 두어 가스-상 실란화를 하였다. 실란화된 유리 플레이트를 클로로포름, 아세톤, 및 에탄올로 헹군 후, 질소 가스를 사용하여 건조시켰다. 상기 유리 플레이트는 피라냐 산( 황산:과산화수소)로 세척하고 상기 기술된 바와 같이 실란화하는 것에 의해여, 재사용될 수 있다.
미네랄 오일을 여과하고, 사용 전에 가스를 제거하였다. 상기 슬립칩을 미네랄 오일 하에 조립하였다. 하부 플레이트를 우선 패턴화된 면이 위를 향하도록, 페트리 접시에 있는 오일로 침지하였다. 그 다음, 상부 플레이트를 패턴화된 면이 아래를 향하도록 하여 하부 플레이트 위에 올려놓았다. 두개의 플레이트를 정렬하고 바인더 클립을 사용하여 고정하였다.
S. 아우레우스에서 발견된 nuc 유전자를 위한 두개의 프라이머 서열은 종래 간행물로부터 선택하였다: 5’-GCGATTGATGGTGATACGGTT-3’ (프라이머 1) 및 5’-AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3’ (프라이머 2). 반응 마스터 혼합물은 10 μL의 2X SsoFast EvaGreen Supermix, 0.5 μL의 프라이머 1 (10 μmol/L), 0.5 μL 의 프라이머 2 (10 μmol/L), 2 μL의 10 mg/mL BSA 용액, 5 μL의 RNase 비함유 물 및 2 μL의 S. 아우레우스 gDNA 용액으로 이루어져있다. 10 ng/μL, 1 ng/μL, 100 pg/μL, 10 pg/μL, 1 pg/μL 및 100 fg/μL의 최종 견본 농도 범위를 주기 위하여 S. 아우레우스 gDNA 용액을 1 x BSA 용액(0.01 mg/mL)을 사용하여 순차적으로 희석하였다. PCR열순환기(Eppendorf)를 사용하여 증폭을 수행하였다. DNA를 증폭하기 위하여, 94 °C에서 2분 동안 초기화 단계를 수행하여 효소를 활성화하였다. 그 다음, 총 35 사이클의 증폭을 하기와 같이 수행하였다: 94 °C에서 1분 동안의 DNA 열변성 단계, 55 °C에서 30초 동안의 프라이머 풀림 단계, 및 72 °C에서 30초 동안의 DNA 연장 단계. 마지막 사이클 이후에, 최종 신장 단계를 72 °C에서 5분 동안 수행하였다. 그 다음, PCR 산물을 이미징 전에 4 °C의 사이클러(cycler)에서 저장하였다.
S. 아우레우스 gDNA (GenBank accession number NC_009632)에는 2.9 밀리온의 총 염기 쌍들이 존재한다. 각 염기 쌍의 평균 분자량은 약 660이었다. 따라서, 1 ng의 S. 아우레우스 gDNA는 3.15
Figure pct00019
105의 카피를 가진다. 각 구획에서의 반응 용액의 체적은 2.6 nL이므로, 장치내 총 영역의 수는 1280이었다. 따라서, 각 영역은 S. 아우레우스 gDNA의 출발 농도가 1 ng/ μL인 경우에 평균적으로 944개의 카피들을 포함하게 된다
Leica 스테레오스코프에 의해 명시야 이미지(Bright field image)를 획득하였다. 모든 형광 이미지들은 실온에서 5X / 0.15 NA 대물렌즈 및 L5 필터를 갖는 Leica DMI 6000 B epi-형광 이미지가 증착된 디지털 카메라 (C4742, Hamamatsu Photonics, Japan)를 사용하여 획득하였다. 모든 형광 이미지들을 표준 형광 슬라이드로 얻어진 배경 이미지들에 의해 수거한 다음, MetaMorph 소프트웨어 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 사용하여 함께 스티칭하였다. 모든 이미지의 강도 수준을 동일한 수준으로 조정하였다.
장치의 설계는 영역의 밀도를 증가시키기 위하여 대칭적이다. 오일로 채워진 구형 영역의 어레이는 상단 및 하부 플레이트에 설계되어, 상단 및 하부 플레이트 모두에 겹쳐지는 신장된 영역이 시료를 도입하기 위해 사용된다. 미끄러지는 동안, 격리되는 구획들이 생성되고, 그리고 동일한 크기를 갖는 액상 액적들이 각각의 구획 내에서 생성된다. 상기 슬립칩은 덕트를 포함하지 않으나; 대신, 각 플레이트는 총 1,280 반응 구획을 위한 신장된 영역과 구형 영역들로 이루어진 열들을 포함한다. 신장된 영역은400 μm의 길이, 200 μm의 너비, 및 50 μm의 깊이를 갖고, 그리고 구형 영역은 200 μm의 직경과50 μm의 깊이를 가진다. 초기 구성에서, 상단 및 하부 플레이트에 있는 신장된 영역들이 겹쳐지게 되는 것에 의해 연속 유로가 형성된다. 덕트에 의해 연결되는 영역 대신, 겹쳐지는 신장된 영역을 사용하는 것에 의해, 장치내 압력 강하가 작아지므로, 많은 영역들이 단순한 피펫팅에 의해서도 채워질 수 있으며, 3.4 μL의 시료들이 전체 장치를 채우게 된다. 하부 플레이트레 대하여 상부 플레이트를 짧은 거리 미끄러지게 하는 것에 의해, 신장된 영역은 분리되고 각각들은 윤활액(미네랄 오일) 층을 포함하는 구형 영역의 상단 부에 모이게 된다. 디지털 PCR의 경우, 프라이머는 구형 영역에 사전 로딩되는 대신에, PCR 혼합물에 첨가된다. 신장된 영역은 신장된 영역의 폭이 구형 영역의 직경과 동일하게 되도록 설계되었다. 이러한 설계의 이점은: (1) 액적들이 영역 내로 모일 수 있게 하여, 더 나은 이미징을 가능하기 한다. (2) 이러한 설계는 또한 일정한 체적(~2.6 nL)의 액적을 생산할 수 있게 한다. (3) 이러한 설계는 상술한 다중화 PCR 슬립칩에서와 같이, 영역 내부에 오일에 의해 둘러쌓이는 수성 액적들을 생겨나게 하여 열 순환 동안 공간의 열 팽창을 가능하게 한다.
열 순환 동안, 윤활액 및 수성 PCR 혼합물은 세 물질의 다른 열 팽창 계수로 인해 슬립칩의 유리 물질 보다 더 팽창한다. 동일한 크기와 기하학적 배열의 겹쳐지는 영역을 갖는 슬립칩에 대한 특정 실시예를 사용하는 경우, 수용액은 완전히 상기 영역들을 채울 것이다. 온도가 열 순환에 요구되는 온도까지 증가하는 동안, 수용액은 팽창하여 영역을 빠져나가게 되므로, 물질의 손실 및 시약의 농도에서의 변화를 초래하게 된다. 다중화 PCR 슬립칩의 경우, 오일을 함유하는 구형 영역을 갖는 수성 PCR 혼합물을 포함하는 정사각형 영역을 겹치게 하여, 오일에 부유되고 정사각형 영역 내에 모이는 액적을 생성하는 것에 의해 상기 문제점이 해결되었다. 다중화 PCR 슬립칩의 경우, 오일을 함유하는 구형 영역을 갖는 수성 PCR 혼합물을 포함하는 정사각형 영역을 겹치게 하여, 오일에 부유되고 정사각형 영역 내에 모이는 액적을 생성하는 것에 의해 상기 문제점이 해결되었다.
본 발명자들은 10 fg/μL의 S. 아우레우스 gDNA를 사용하여 슬립칩 상에 다지털 PCR을 증명하였다. 이 농도에서, 평균 100 영역 마다 1개 미만의 gDNA 카피가 존재하였고, 단일한 gDNA 카피의 PCR 증폭을 수행하였다. 열 순환 전후의 디지털 PCR 슬립칩의 라인스캔은 단일 DNA 주형을 포함하는영역에서의 형광 강도는 유의적으로 증가하였으나, DNA 주형이 없는 영역에서의 형광 강도는 증가하지 않았음을 나타낸다. 이러한 라인스캔은 또한 DNA 주형을 포함하는 영역에 인접한 빈 영역에서의 형광 강도는 변화를 나타내지 않았으므로, 슬립칩내의 교차-오염이 없음을 입증하였다.
본 발명자들은 S. 아우레우스로부터 게놈 DNA의 5개의 농도를 사용하여 상기 장치의 수행을 정량화하였다. 디지털 PCR 슬립칩은 1 fg/ μL 만큼 낮은 농도에서 주형 DNA의 검출을 가능하게 한다. 본 발명자들은 단일 카피 타겟 DNA 증폭이 전체 영역의 3분의 1 미만에서 증폭 시그널을 나타내는 경우에 달성되었다는 것을 확인하였다. DNA 주형의 예상 농도를 영역(cpw) 마다 카피의 수만큼 제공하고, 그리고 원래의 DNA 전구체 용액(stock solution)의 농도를 NanoDrop (Thermo Scientific)에 의해 스펙트로포토메트리컬하게 측정하엿다. cpw를 계산하는 구체적인 방법은 상술한 바와 같다. PCR 마스터 혼합물 내의 DNA 주형이 희석되기 때문에, 양성 영역의 프랙션은 비례적으로 감소하게 된다. 본 발명자들은 주형 DNA를 포함하지 않는 대조 시료가 어떤 양성 결과도 나타내지 않았기 때문에 오염에 대한 어느 단서도 관찰하지 못하였다.
본 발명자들은 각 농도(n ≥ 3)에 대하여 상기 실험을 반복하였고, 그리고 양성 PCR 결과를 나타내는 영역의 프랙션과 영역당 주형의 예상 카피수에 대한 보정 곡선을 생성하였다. 포이송 분포를 가정하여 양성 영역의 예상 프랙션을 계산하였다. 양성 영역의 프랙션은 포이송 분포로부터 예상되는 수치보다 조금 낮았다; 이는 시료 준비 동안 비-특이적 흡수에 의해 야기된 것일 수 있다. 본 발명자들은 HIV로부터 단리된 RNA가 로딩된 바이러스를 정량화하기 위하여 디지털 PCR 슬립칩을 사용하여 역-전사 PCR(RT-PCR)을 수행하였다. 그것들은 슬립칩이 표준 열 순환 PCR 기술을 사용하여 시료내에 존재하는 핵산의 양을 정량화할 수 있다는 것을 입증하였다. 1,280 영역을 포함하는 슬립칩은 3.4 μL 시료를 각각 ~2.6 nL의 1,280 액적으로 분리되도록 설계되었으므로, 단일 카피 수준에서 주형 DNA를 검출할 수 있다. 상기 장치를 사용하여 검출할 수 있는 농도의 상한은 슬립칩 상의 영역의 수를 증가시키는 것에 의해 증가시될 수 있으며, 그리고 상기 장치의 민감도는 영역의 체적을 감소시키는 것에 의해 향상시킬 수 있다. 본 발명자들은 단일 슬립칩 상에 피코리터 체적을 갖는 16,384 영역을 1.5 인치 대 1 인치 치수로 통합하였다. 디지털 PCR 슬립칩은 또한 단백질 결정화 실험 및 다중 PCR을 위해 설계된 슬립칩에서와 같이 동일한 칩 상에서 다중 시료를 스크리닝하기 위하여 제조될 수 있다. 다중 디지털 PCR 슬립칩은 영역의 수를 증가시키고 구형 영역내 미리-로딩된 다른 건조 프라이머 세트에 대한 마이크로어레이 기술을 사용하는 것에 의한 방해 없이, 한번의 실험으로 다중 타겟을 셀 수 있도록 제조될 수 있다. 디지털 PCR 슬립칩 설계에서 다른 개선점은 LAMP 또는 NASBA와 같은 비-열적 순환 방법을 통합하고, 크고 작은 영역들의 조합을 사용하여 디지털 PCR 슬립칩의 동적 범위를 증가시키는 것을 포함한다. 예를 들면, 2,000개의 영역을 포함하는 장치에서, 1,000개의 영역들이 1 nL의 용액을 함유하고, 1,000개의 영역들이 10 nL의 용액을 함유하면, 더 큰 동적 범위 및 통계적으로 더 높은 신뢰도를 얻을 것이다. 최상의 동적 범위 및 최고의 신뢰도를 주는 영역 크기의 분배는 예측될 수 있다. 추가적인 개선점은 (종래 알려진 적장한 이미징 장치를 사용하는) Taqman 시스템 및 분자 신호와 같은 실-시간 PCR 및 다중-칼라 프로브를 통합하는 것을 포함한다. 다중-칼라 프로브는 을 연구하기 위한 단일 세포 내부의 다중 유전자 검출용 다지털 PCR을 적용하고 또한 내부의 양성 대조군을 통합하기 위한 방법을 제공하기 위하여 사용될 수 있다. 상기 슬립칩은 “시료 주입, 결과 산출” 어플리키에션을 위한 디지털 PCR 사용 전에 동일한 칩 상에서 핵산(DNA/RNA) 추출 및 결정화를 수해하기 위해여 제조될 수 있다.
슬립칩 상의 디지털 PCR의 다른 적용은 돌연변이와 야생-형 주형 DNA를 구별하는 것처럼, 다량의 보통 세포의 존재 하에 희귀 세포를 검출하는 것이다. 전통적인 기술로, 큰 집단의 보통 세포의 방해로 인해 돌연변이의 프랙션을 정량화하는 것은 어렵다. 슬립칩 상의 디지털 PCR은 적은 체적의 영역에 그것들을 가두는 것에 의해 희귀 세포들의 구획을 증가시키는 견고하고 용이한 방법이다.
상기 플랫폼은 다지털 PCR이 광범위하게 이용될 수 있게 하며, 매우 단순한 실험실-기반의 핵산 정량화를 제공한다. 상기 슬립칩은 태아 진단을 수행하기 위한 용이하고 이용가능한 방법을 제공한다. 상기 장치는 또한 돌연변이의 검출, 유전자 발현의 관찰, 이질성의 분석과 같은 단일 세포 분석을 위해, 특히 자원이-한정된 환경에서 저렴한 진단을 위해 사용될 수 있다. 비-열적 순환 방법, 핵산 단리 방법, 및 단순한 해독 방법이 다지털 PCR 슬립칩에 통합될 수 있다.
특정 실시예에서, 나노리터 다중화 PCR 어레이가 슬립칩 상에서 수행될 수 있다. 일 실시예에서, 슬립칩 플랫폼은 고처리량 나노리터 다중화 PCR을 수행하기 위해 사용되었다. 다중화 PCR을 위한 슬립칩 플랫폼의 사용 이점은 건조 프라이머 어레이의 건조 프라이머 어레이를 사전 로딩하는 능력, 기구-없이 시료 로딩, 소량의 시료 체적, 및 고효율 용량을 포함한다. 슬립칩은 반응 구획 마다 한개의 프라이머 쌍을 사전 로딩하여 반응 구획 마다 30 나노리터 미만의 시료로 384개의 다른 프라이머 쌍을 스크리닝할 수 있도록 설계되어 있다. 본 발명자들은 다중화 PCR을 위해 40-영역 뿐만 아니라384-영역으로 설계된 슬립칩을 모두 사용하였다. 두 플랫폼은 교차-오염되지 않는 것으로 관찰되었고, 종말점 형광 검출이 판독을 위해 사용되었다. 다중 시료은 또한 동일한 슬립칩 상에서 동시에 스크리닝될 수 있다. 다중 PCR은 혈액 감염에 통상적으로 존재하는 16개의 박테리아와 균주를 동정하기 위해 20개의 다른 프라이머 세트를 사용하여 384-영역 슬립칩상에서 수행되었다. 상기 슬립칩은 분리된 실험으로 5개의 다른 박테리아와 균류를 정확하게 동정할 수 있다.
그것의 도입하는 것에 인해, 다중 PCR은 암 세포의 유전자 분석을 포함하고, 유전적 가변성 및 클론성 진화, 및 바이러스, 박테리아, 균류, 및 해충에 의해 야기되는 감염성 질환의 동정을 포함하는, 많은 분야에서 성공적으로 적용되어 왔다. 다중화 PCR을 수행하기 위한 통상적인 방법은 하나의 반응 구획에서 다수의 타겟 주형이 증폭될 수 있도록 다수의 프라이머들을 로딩하는 것이다. 이러한 접근법의 효율은 열악한 민감성 또는 특이성 및 다른 타겟의 일정하지 않는 증폭비뿐만 아니라, 다른 프라이머에 의한 방해 및 검출에 요구되는 형광 프로브의 수에 의한, 일반적으로 구획 마다 10개 미만의 타겟들로 제한된다. 다중화 PCR은 또한 PCR 미아크로어레이로 수행될 수 있으나, 이 방법은 항상 많은 양의 시약과 시료를 요구한다. 다른 통상적인 전략이 다른 타겟을 위한 프라이머 세트로 많이 소형화된 구획을 사용하기 위한 것이나, 이것은 소량의 액체 처리에서의 제한 및 실험기구의 비용에 의해 방해받게 된다.
미세유체 기술은 전통적인 PCR 플랫폼에 비해 더 많은 이점을 갖는 것으로 증명되어 왔는바, 이는 소량의 반응 체적, 고-효율 능력, 및 휴대성을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 많은 그룹들은 PCR용 “랩-온-어-칩” 미세유체 플랫폼을 개발하였고, 마이크로-액적 기반 PCR이 단일 카피의 핵산 검출을 입증하였다. 그러나, 대부분의 미세유체 PCR 시스템은 복잡한 제작방법을 요구하며, 유체 흐름을 컨트롤하기 위해여 펌프 또는 정교한 밸브에 의존한다. 펌프의-사용 없이 용이하게 로딩할 수 있고, 소량의 시약 체적으로, 고-효율의 능력을 나타내는 미세유체 플랫폼이 여전히 다중 PCR에서 미충족된 요구이다.
슬립칩은 마이크로리터의 용액이 펌프 및 기계에 의한 로딩 없이 매우 정교하게 수백개의 나노리터 구획들로 효과적으로 분배될 수 있게 한다. 슬립칩의 중요한 특징은 교차 오염 없이 다수의 시약의 사전 로딩 및 저장을 가능하게 한다는 것이다. 본 발명자들은 고-처리량 다중 PCR을 수행하기 위하여 슬립칩을 제조하였다. 프라이머 세트의 어레이를 수작업으로 슬립칩의 영역 내로 바로 집어넣었고 실온에서 건조시켰다. 잉크젯, 마이크로젯 충전 및 스포팅 기술과 같은 마이크로어레이 제조 방법들이 또한 슬립칩 상의 프라이머 어레이의 제조에 적용될 수 있다. 이하, 본 발명자들은 종말-점 형광 검출법으로 단일의 10 μL 시료에 있는 384개의 다른 주형이 동정될 수 있도록, 384 동시 PCR을 수행할 수 있는 슬립칩을 기술한다. 상기 슬립칩은 단일 피펫팅을 사용하는 것에 의해 사용자에 의해 용이하게 설정될 수 있고 PCR 반응은 펌프 또는 다른 기구에 의존함이 없이 슬라이딩에 의해 개시될 수 있다.
실시예. 상업적 제조업자로부터 구입한 모든 용매들 및 염들은 다른 언급이 없으한 제공받은 바와 동일하게 사용하였다. 모든 프라이머들은 DNA Technologies (Coralville, IA)에서 주문하였다. 프라이머 염기서열을 하기에 열거한 바와 같다. 소혈청 알부민(BSA)은 Roche Diagnostics (Indianapolis, IN)에서 구입하였다. SsoFast EvaGreen Supermix (2X)는 Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA)에서 구입하였다. 미네랄 오일(DNase, RNase, Protease free), Agar, 100 bp PCR DNA 래더, 및 DEPC-처리 뉴클리아제 비함유 물은 Fisher Scientific (Hanover Park, IL)에서 입수하였다. 디클로로디메틸실란은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)에서 구입하였다. 스타피로코커스 아우레우스 유전자 DNA (ATCC number 6538D-5), 칸디다 알비칸 (ATCC 10231), 스타피로코커스 아우레우스 (ATCC 25923), 메타실린 저항성 스타피로코커스 아우레우스 (MRSA, ATCC 43300), 에스테리치아 콜리 (ATCC 39391), 및 슈도모나스 애루기노사 (ATCC 27853)는 American Type Culture Collection (Manassas, VA)에서 구입하였다. YM Broth 및 LB Broth는 Becton, Dickinson 및 Company (Sparks, MD)에서 구입하였다. 크롬 및 포토레지스트로 피복된 소다-석회 유리 플레이트는 Telic Company (Valencia, CA)에서 구입하였다. 스펙트럼 식품 칼라(그린, 레드, 및 블루 식품 염료) 는 August Thomsen Corp (Glen Cove, NY)에서 구입하엿다. 막 피펫 팁 및 PCR 튜브는 Molecular BioProducts (San Diego, CA)에서 구입하였다. 작은 바인터 클립 (클립 크기 ¾”)는 Officemax (Itasca, IL)에서 입수하였다. 마스터사이슬러 및 인 시튜 어답터는 Eppendorf (Hamburg, Germany)에서 구입하였다. 테프론 튜빙(I.D. 370 μm)은 Weico Wire ＆ Cable (Edgewood, NY)에서 입수하였고, 테프론 튜빙 (O.D. 250 μm, I.D. 200 μm)은 Zeus (Orangeburg, SC)에서 입수하였다. 포토마스크는 CAD/Art Services, Inc. (Bandon, OR)에서 입수하였다. 레드 양자점 도트(QDs), Qdot 655 ITK, 및 pBad His B 플라스미드와 관련된 것은 Invitrogen (Carlsbad, CA)에서 입수하였다. 그린 QDs는 Ocean Nanotech (Springdale, AR)에서구입하였다. MinElute PCR 정제 키트는 Qiagen (Valencia, CA)에서 구입하였다.
유리로부터 슬립칩을 제작하는 과정은 본 명세서에서 달리 기술되어 있지 않은한 상기 슬립칩 과정에서의 유리 에칭 방법 및 그의 변형을 기초로 한다. 유리 플레이트를 영역과 덕트를 위한 설계를 포함하는 포토마스트로 결합시키고, 40초 동안 UV 광에 노출시켰다. 40-영역 설계 및 384-영역 설계 모두를 위한 상단 슬라이드는 70 μm 깊이로 에칭될 정사각형 영역을 포함한다. 40-영역 설계 및 384-영역 설계 모두를 위한 다한 슬라이드는 30 μm 깊이로 에칭될 구형 영역을 포함한다. 관통홀을 용액을 위한 입구처럼 상부 플레이트내에 드릴하였다. 40-영역 설계를 위한 (정사각형 및 원형 영역을 겹치는 한 쌍의) 단일 구획의 최종 체적은 약 25.9 nL이었고, 384-영역의 경우 약 7.1 nL이었다.
에칭된 영역을 갖는 유리 슬라이드를 밀리포어 수 및 에탄올로 완전히 헹군 후, 질소 가스로 건조시켰다. 유리 슬라이드를 100초 동안 플라스마 클리너에서 산화시킨 후, 즉시 건조기로 옮겼다. 50 μL의 디클로로디메틸실란을 상기 건조기에 주입하고, 그 다음 진공하에 한 시간 동안 가스 상 실란화를 수행하였다. 실란화된 유리 슬라이드를 클로로포름, 아세톤, 및 에탄올로 세정한 후, 질소 가스로 건조시켰다. 실란화된 유리 슬라이드를 하루 내에 PCR 실험을 위해 사용하였다. 패턴화된 유리 슬라이드는 피라냐 용액( 황산:과산화수소)로 세성하고, 상기 기술한 바와 같이 다시 실란화 한 이후에 재사용될 수 있다.
40-영역 슬립칩 설계의 경우, 각 프라이머의 농도는 0.05 μm이었다. 프라이머 용액을 50 μL Hamilton 유리 실린저에 연결된 테프론 튜빙(200 μm ID)에 흘러주었다. 0.1 μL 체적의 프라이머 용액은 Harvard 실린저 펌프에 의해 조절 하였으며, 구형 영역으로 집어 넣었다. 상기 용액을 실온에서 건조시킨 후, 사전 로딩된 슬립칩을 하루 이내에 실험을 위해 사용하였다.
384-영역 슬립칩 설계의 경우, 각 프라이머의 농도는 0.1 μm이었다. 모든 프라이머 서열을 표 1에 나타내었다. 0.02 μL 체적의 프라이머 용액을 하부 플레이트 상의 원형 영역으로 집어넣었다. 상기 용액을 실온에서 건조시킨 후, 사전 로딩된 슬립칩은 하루 이내에 사용하였다.
384-웰 슬립칩에 넣은 프라이머 세트의 이름 및 서열. 40-웰 슬립칩에 사용된 프라이머 세트는 별표로 표시하였다.
프라이머 세트 명 타겟DNA/병원균
pBad GCGTCA CACTTT GCT ATG C
GCT TCT GCGTTC TGA TTT AAT CTG
E coli nlp ATA ATC CTC GTC ATT TGC AG {Palka-Santini, 2009 #20
GACTTC GGGTGA TTG ATA AG
S pyogene fah TTA AAT ACG CTA AAG CCC TCT {Palka-Santini, 2009 #20}
AGG GTG CTT AAT TTG ACA AG
S pyogene OppA CCC AGT TCA ATT AGA TTA CCC {Palka-Santini, 2009 #20}
TTG ACT TAG CCT TTG CTT TC
S pneumoniae cinASP GGCTGT AGG AGA CAATGA AG {Palka-Santini, 2009 #20}
CTT TGT TGA CAG ACGTAG AGT G
S pneumoniae plySP ATT TCG AGT GTT GCT TAT GG{Palka-Santini, 2009 #20}
GTA AAGTGA GCC GTC AAATC
E faecium bglB TCT TCA TTT GTT GAA TAT GCT G{Palka-Santini, 2009 #20}
TGG AAT CGA ACC TGT TTATC
E faecalis ace TAG TTG GAA TGA CCG AGA AC{Palka-Santini, 2009 #20}
AGT GTA ACG GAC GAT AAA GG
P aerugino vic TTC CCT CGC AGA GAA AAC ATC {Qin, 2003 #17}
CCT GGT TGA TCA GGT CGA TCT
S agalactia cpsY CGA CGA TAA TTC CTT AAT TGC{Palka-Santini, 2009 #20}
TCA GGA CTG TTT ATT TTT ATG ATT
Pseu general 16S GAC GGG TGA GTA ATG CCT A {Qin, 2003 #17}
CAC TGG TGT TCC TTC CTA TA
S aureus nuc ** GCGATTGATGGTGATACGGTT {Brakstad, 1992 #18}
AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC
S epid agrC GAT GAT ATT AAT CTA TTT CCG TTT G{Palka-Santini, 2009 #20}
TCA GGA CTG TTT ATT TTT ATG ATT
S mutans dltA AGATAT GAT TGC AAC AAT TGA A{Palka-Santini, 2009 #20}
CGC ATG ATT GAT TTG ATA AG
P mirabil aad CGCTAT TAA CCT TGC TGA AC{Palka-Santini, 2009 #20}
CCT TTC TCA CTC ACC ACATC
MRSA mecA ** CAAGATATGAAGTGGTAAATGGT {Shrestha, 2002 #19}
TTTACGACTTGTTGCATACCATC
C troplicalis ctr CAA TCC TAC CGC CAG AGG TTA T {Luo, 2002 #16}
TGG CCA CTA GCA AAA TAA GCG T
C glabrata cgc {Luo, 2002 #16}
CCC ACA TAC TGA TAT GGC CTA CAA
C albicans calb TTT ATC AAC TTG TCA CAC CAG A {Luo, 2002 #16}
ATC CCG CCT TAC CAC TAC CG
K pneumonia cim AAT TTA ACC TGG TTT GAT AAG AA{Palka-Santini, 2009 #20
CAA AAT ATG AAC TAT CAG AAA GAT TG
K pneumonia acoA TAA CGG CAA AGA CGC TAA{Palka-Santini, 2009 #20}
TGA CCA GGG CTT CTA CTT C
스타피로코커스 아우레우스, 메티실린 저항성 스타피로코커스아우레우스, 에스체리치아콜리, 및 슈도모나스애루기노사를 6-8시간 동안 지수 성장 단계(exponential phase)까지LB broth에서 배양하였다. 칸디다 알비칸을 8시간 동안 YM broth에서 배양하였다. 상기 세포들을 수거하고 1X PBS 버퍼로 세척하였다. 세포들의 수는 마이크로소프트 하에 계산하고, 농도는 약 1 x 107 cfu/mL이 되도록 표준화하였다. 병원균의 최종 농도는 PCR 마스터 혼합으로 혼합한 후, 1 x 106 cfu/mL이었다.
상기 슬립칩을 실험 전에 여과하고 가스를 제거한, 미네랄 오일 하에 조립하였다. 하부 플레이트를 우선 페트리 접시에 있는 오일을 사용하여 패턴화된 면이 위를 향하도록, 침지하였다. 그 다음, 상부 플레이트를 패턴화된 면이 아래를 향하도록 하부 플레이트 위에 올려놓았다. 두 플레이트를 정렬시키고 바인더 클립을 사용하여 고정하였다.
GFP 필터 세트 및 11.2 Color Mosaic 카메라 (Diagnostic Instruments Inc., MI)가 설치된, 형광 스테레오마이크로스코프, MZ FLIII (Leica, Germany)를 사용하여 열적 팽창을 연구하였다. 이 스테레오마이크로스코프는 블루 빛에 의해 여기하는, 레드 및 그린 양자점의 동시에 관찰 가능하게 한다. 슬립칩의 두 플레이트 사이의 갭을 그린 형광 양자점(QDs)에 의해 염색된 미네랄 오일로 채웠다. 오일을 염색하기 위하여, 톨루엔 내 원래의 1% QDs 용액을 0.22 마이크론 마이크로원심기 Amicon filters (Millipore, MA)를 통해 여과하고 10분 동안 초음파 수조(Fisher Scientific, NJ)에서 초음파 분해 하였다. 미네랄 오일내 QDs의 10% 용액으로 완전히 볼텍스하고, 장치내로 채우기 전에 진공 하에 10분 이상 보관하였다.
염색된 미네랄 오일을 슬립칩의 슬라이드 사이에 집어 넣고, 넘치는 오일은 클로로폼, 아세톤, 및 에탄올 순서에 의해 조립된 장치를 헹구는 것에 의해 제거하였다. 슬립칩 영역을 영역 및 덕트에 의해 만들어진 유로를 통과하는 레드 QDs 수용액을 로딩하는 것에 의해 채웠다. 레드 QDs 655 ITK를 1 mM EDTA 및 50 mM NaCl를 함유하는, pH 8.0, 10 mM Tris-HCl 버퍼에서 으로 희석하였다. 슬립칩을 마스터사이클러상의 스테레오스코프 아래에 두고, 다중 열적 순환을 수행하여 수성 열적 팽창을 관찰하였다.
40-영역 슬립칩에서의 반응의 경우, 반응 마스터 혼합물은 10 μL 의 2X SsoFast EvaGreen SuperMix, 2 μL 의 10 mg/mL BSA 용액, 6 μL 의 RNase 미함유 물, 및 2 μL 의 1 ng/μL S 아우레우스 gDNA (대조군의 경우 RNase 비함유 물을 2 μL 사용함)으로 이루어져 있다. gDNA 주형의 최종 농도는 100 pg/uL이었다. 384-영역 슬립칩에서의 반응의 경우, His B 플라스미드 (pBad 주형)로부터 증폭된 dsDNA의 331-bp 길이 조각을 PCR 대조 반응의 주형으로 사용하였다.(프라이머 1: GCG TCA CAC TTT GCT ATG CC; 프라이머 2: GCT TCT GCG TTC TGA TTT AAT CTG). pBad 주형을 MinElute PCR 정제 키트(Qiagen)를 사용하여 정제하였다. 384-영역 슬립칩을 위한 반응 마스터 혼합물은 10 μL의2X SsoFast EvaGreen SuperMix, 2 μL의10 mg/mL BSA 용액, 1 μL의 100 pg/μL pBad 주형, 2 μL 의 세포 부유물, 및 5 μL의 RNase 비함유 물로 이루어져 있다. 상기 PCR 마스터 혼합물을 피펫팅 하여 스립칩으로 주입하였다. 상부 플레이트 상의 정사각형 영역이 하부 플레이트 상의 원형 영역을 덮도록 움직였다. 그 다음, 상기 슬립칩을 마스터사이틀러(Eppendorf)내의 원위치 어답터상에 두는 것에 의해 열적 순환하게 하였다. 94℃에서 15분 동안 초기화 단계를 수행하여 세포를 용혈시키고 효소를 활성화하였다. 그 다음, 총 35 사이클의 증폭을 하기와 같이 수행하였다: 94°C에서 1분 동안의 DNA 열변성 단계, 55°C에서 30초 동안의 프라이머 풀림 단계, 및 72°C에서 30초 동안의 DNA 연장 단계. 마지막 사이클 이후에, 최종 신장 단계를 72°C에서 5분 동안 수행하였다. 그 다음, PCR 산물을 이미징 전에 4°C의 사이클러(cycler)에서 저장하였다.
Leica 스테레오스코프에 의해 명시야 이미지(Bright field image)를 획득하였다. 모든 형광 이미지들은 실온에서 5X / 0.15 NA 대물렌즈 및 L5 필터를 갖는 Leica DMI 6000 B epi-형광 현미경을 사용하여 얻었다. 형광 이미지의 강도 수치를 모든 이미지들에서 동일한 값으로 조정하였다. 모든 형광 이미지들을 표준 형광 슬라이드로 얻어진 배경 이미지들에 의해 수거한 다음, MetaMorph 소프트웨어 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 사용하여 함께 스티칭하였다.
본 발명자들은 2개의 다른 시료를 위한 40개의 영역과 2개의 입구를 포함하도록 설계된 슬립칩 상에 PCR을 수행하였다. 이 장치는 두개의 다른 시료를 각 시료를 위한 20개의 다른 프라이머 세트로 동시에 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다. 상부 플레이트는 유체 주입구, 정사각형 영역(측면 길이640 μm, 깊이 70 μm) 및 직사각형 영역(길이570 μm, 너비230 μm, 깊이70 μm)를 포함하였다. . 하부 플레이트는 원형 영역(직경560 μm, 깊이 30 μm) 및 시료의 도입을 위한 덕트(너비 150 μm, 깊이30 μm)를 포함하였다. 다른 프라이머 세트들을 하단 원형 영역으로 사전 로딩하고 실온 하에 건조시켰다. 상단 및 하부 플레이트들을 그 다음 미네랄 오일 하에 침지키시고 가공하여 연속 유로를 형성하였다. PCR 마스터 혼합물, SsoFast EvaGreen Supermix, 1 mg/mL BSA를 포함하는 용액, 및 주형(또는 대조 실험을 위한 물)을 피펫팅하여 슬립칩에 도입하였다. 이러한 기하학적 배열에서, 시료 유체는 슬라이딩 하기 전에도 불연속 체적으로 자발적으로 분해되었다. 연속 스트림의 불연속 체적으로의 분해는 확률론적 한정 및 디지털 PCR와 같은, 구획화를 요구하는 어플리케이션에 사용될 수 있다. 시료를 로딩한 직후, 상부 플레이트를 아래로 미끄러지게 하여 정사각형 영역이 하부 플레이트상의 원형 영역과 겹쳐지게 하고, 원형 영역에 사전 로딩된 건조 프라이머들을 정사각형 영역으로부터 도입된 시료 내에서 용해하였다. 또한, 상부 플레이트 상의 직사각형 영역들을 하부 플레이트 상의 덕트 중간에 정렬시켰다. 수용액은 표면 장력으로 인해 영역 내에서 원형 액적을 형성하였고, 그리고 각 구획내의 용액의 체적은 AutoCAD 소프트웨어에 의해 25.9 nL로 측정되었다.
본 발명자들은 슬립칩의 신중한 설계에 의해 열적 순환 동안 열 팽창의 문제를 해결하였다. 슬립칩(유리)의 재료, 윤활액(미네랄 오일), 및 시료(수성 PCR 혼합물)은 다른 열 팽창 계수를 가진다. 미네랄 오일과 수성 혼합물을 슬립칩의 온도가 풀림 온도(55°C) 에서부터 용해 온도(95°C)까지 증가하는 경우 유리 보다 더 팽창한다는 것은 알려져 있다. 슬립칩의 독특한 설계는 영역 기하학적 배열을 사용하는 것에 의해 영역 내부에 수용액을 담아두었다. 디클로로메틸실란을 사용하여 슬립칩 표면이 소수성이 되도록 하였다. 본 발명자들은 레드 양자점을 함유하는 수용액 및 그린 양자점을 함유하는 미네랄 오일을 사용하는 것에 의해, 열적 순환 동안 유체의 움직임을 연구하였다. 정사각형 영역으로만 이루어진 슬립칩을 사용할 때, 수용액을 정사각형 영역에 채웠다. 온도를 증가시킨 이후에, 수용액이 영역 밖으로 새어 나가서 물질의 손실과 농도의 불예측 변화를 초래하였다. 본 발명자들은 하부 플레이트 내에 오일을 포함하는, 작고, 구형의 영역을 상부 플레이트 내에 수용액을 함유하는 정사각형 영역과 접촉시키는 경우, 수용액이 열 순환 동안 팽창을 위한 공간을 제공하는, 표면 장력에 의한 수소성 영역 내의 미네랄 오일에 의해 둘러싸이는 액적을 형성한다는 것을 발견하였다. 온도가 증가할 때, 수용액이 팽창하여 반응 구획을 채우게 되고, 미네랄이 팽창하여 슬립칩 내의 상단 및 하부 플레이트 사이의 갭을 통과하는 것에 의해, 버퍼 물질로서 역할을 하였다. 이러한 설계 없이, 특정 실시예에서는 열적 순환 동안 누설이 발견되었다. 본 발명자들은 하단 영역의 형상 및 크기가 두 영역의 중앙내의 일정한 크기의 단일 액적을 형성하기 위해 사용될 수 있다는 것을 관찰하였다. 일정한 크기의 액적 형성은 액적 내부의 시약의 농도를 모든 액적 내에서 동일하게 한다. 상부 플레이트 상의 직사각형 영역을 하부 플레이트 상의 덕트와 겹치게 하는 것에 의해 덕트 내에 잔존하는 용액의 열적 팽창에 대한 문제를 해결하였다.
본 발명자들은 S. 아우레우스 게놈 DNA 내의 nuc 유전자를 증폭시키는 것에 의해 슬립칩의 일 실시예에서 PCR을 수행하였다. S. 아우레우스 nuc 유전자를 위한 프라이머를 슬립칩의 하부 플레이트의 구형 영역으로 사전 로딩한 후 실온 하에 건조시켰다. EvaGreen supermix, 100 pg/μL S. 아우레우스 게놈 DNA (gDNA), 및 1 mg/mL BSA PCR 혼합물을 포함하는, PCR 마스터 혼합물을 덕트에 주입하여 영역의 두 열을 채웠다. 두개의 다른 영역의 열은 gDNA을 RNase 비함유 물로 바꾸는 것을 제외하고는 동일한 수성 PCR 혼합물로 채웠다. 상기 상부 플레이트내의 정사각형 영역과 하부 플레이트내의 구형 영역을 서로에 대하여 슬립칩의 두 플레이트를 미끄러지게 하는 것에 의해 겹치게 하였다. 상기 슬립칩을 PCR 증폭기를 위한 원 위치 어답터 내의 플레이트 상의 열적 사이클러로 넣었다. 본 발명자들은 주형을 포함하는 영역에서만 증폭이 관찰될 수 있는 것처럼, 슬립칩내의 다른 열 사이에서 교차 오염이 발생되지 않는 다는 것을 발견하였다. 형광 강도는 gDNA를 함유하는 영역에서만 열적 순환 이후에 유의적으로 증가하였고, 그리고 주형을 포함하는 모든 20개의 영역이 증폭을 나타내므로, PCR 슬립칩의 강건함을 확인하였다. 열 순환 이후에, 슬립칩 내의 용액을 따라서 수거하고, 그리고 겔 전기영동 실험을 수행하였다. 겔의 이미지는 성공적인 온-칩 증폭 및 증폭 생성물의 정확한 크기(~ 270 bp)를 나타내었다.
그 다음, 본 발명자들은 동일한 열에 교대로, 칩 상에 S. 아우레우스 내의 nuc 유전자와 메티실린-저항성 스타피로코커스 아우레우스(MRSA) 내의 mecA의 프라이머 세트를 사전 로딩하고, 100 pg/μL의 S. 아우레우스 게놈 DNA를 함유하는 PCR 마스터 혼합물을 슬립칩(프라이머 세트는 표 1로부터 알 수 있음)에 삽입하는 것에 의해 인접한 영역 사이에서의 교차 오염을 테스트하였다. nuc 유전자는 통상적으로 S. 아우레우스내에 존재하지만, mecA 유전자는 존재하지 않기 때문에, nuc 유전자용 프라이머 세트가 사전 로딩된 10개의 모든 영역들은 열 순환 이후에 형광 강도가 상당히 증가하였고, mecA 유전자용 프라이머가 로딩된 영역은 형광 강도가 전혀 증가하지 않았음이 나타났다. 상기 결과들을 종합하는 것에 의해, 본 발명자들은 각 영역은 격리된 반응 상태이고, 그리고 각 영역간의 교차 연동이 발생하지 않았다는 증명하였다.
게다가, 본 발명자들은 384개의 다른 프라이머 세트까지 사전 로딩될 수 있는, 384 영역을 포함하는 슬립칩이, 고-처리량 다중 PCR에 적용될 수 있음을 증명하였다. 본 발명자들은 슬립칩 상에 사전 로딩된 20개의 다른 프라이머를 사용하는 것에 의해 혈액 감염 내에 통상적으로 존재하는 16개의 다른 병원체를 위한 본 플랫폼을 설계하였다. 프라이머 염기서열은 종래 간행물로부터 선택하였고, 그리고 PCR 마스터 혼합물은 약 106 cfu/mL의 최종 농도로 세포와 합쳤다. 이로 인해 각 개별 영역 내의 표적화된 세포들의 존재가 확인되었다. 본 발명자들은 슬립칩 상의 PCR이 단일 분자를 검출할 수 있음을 증명하였다. 슬립칩은 28개의 독립된 영역으로 만들어졌고, 각 병원체를 위한 프라이머 세트를 이미징의 편의를 위해 2개의 매트릭스에 사전 로딩하였다. pBad 주형을 위한 프라이머를 양성 내부 대조로서 슬립칩의 모서리에 있는 영역의 2 컬럼에 사전 로딩하였다. 정제된 pBad 331bp 주형 (최종 농도 1 pg/uL)을 로딩하기 전에 PCR 마스터 혼합물에 첨가하였다. pBad을 위한 프라이머를 포함하는 영역 옆의 2 컬럼을 누설을 위한 음성 대조로서 빈 상태로 두었다.
적당한 프라이머가 사전 로딩된 영역에서만 형광 시그날에서의 상당한 증가를 나타내기 때문에, 상기 슬립칩은 세포를 강건하게 동정할 수 있었다. 양성 대조를 위한 영역은 형광 시그날에서의 증가를 나타내었고, 음성 대조를 위한 영역을 그렇지 않았다. 상기 슬립칩은 S. 아우레우스, MRSA, 칸디다 알비칸, P. 애루기노사, 및 E. 콜리를 정확하게 동정할 수 있었다. 본 발명자들은 슬립칩 상의 고-처리량 다중 PCR을 증명하였다. 특정 실시예에서, 상기 슬립칩은 미리 제조된 프라이머 세트의 어레이로 다중 PCR을 위한 384 나노리터-크기 반응을 수행할 수 있다. PCR 슬립칩은 피펫팅에 의해 단순히 로딩될 수 있는바, 이는 복잡한 로딩 방법을 위한 어느 필요사항도 요구되지 않는다. 본 발명자들은 PCR 슬립칩의 실시예가 동일한 슬립칩 상의 16개의 다른 병원균을 위한 하나의 시료를 스크리닝할 수 있으며, 거기에는 교차 오염이 검출되지 않음을 관찰하였다. 본 발명자들은 또한 두개의 다른 시료들이 단일의 사전 로딩 슬립칩 상에 도입될 수 있고 동시에 테스트될 수 있음을 입증하였다. 다중화 PCR 슬립칩은 AMP, RPA 또는 NASBA와 같은 비-열적 순환 핵산 증폭 방법으로 및/또는 더 많은 조건들이 단일 실험에서 스크리닝되도록 많은 영역으로 사용하기 위한, 다중 시료의 동시 스크리닝을 위한 많은 주입부를 갖도록 설계될 수 있다. PCR 슬립칩은 현재 PCR 마이크로어레이 기술에 의해 확립되었지만, 꽤 작은 크기 및 반응 체적을 갖는 프라이머 세트를 사용하기 위하여 제조될 수 있다. 또한, 프라이머를 사전 로딩하고 슬립칩을 제작하기 위한 현재 마이크로어레이 프린팅 기술에 적용할 수 있다.
하나의 실험으로 많은 다른 종류들을 구별하는것 이외에, 슬립칩의 특정 실시예는, 예를 들면, 다중 실-시간 PCR을 위한 실-시간 이미지 기술을 통합하거나, 또는 다중 디지털 PCR을 수행하기 위한 하나의 실험에서 모든 증폭산물의 수를 계산하는 것이 가능하도록, 각 프라이머 세트를 위한 많은 영역들을 사용하는 것에 의해, 정량적인 결과를 제공할 수 있다.
특이 유전자의 스크리닝을 위한 다중 PCR을 위해 사용하는 것 이외에, 슬립칩의 특정 실시예는 추가적인 적용 예에 사용될 수 있다. 다중화 PCR 및 슬립칩 상의 다른 핵산 증폭 화학물질이 시퀀싱 전에 고-효율 DNA 증폭 예를 들면, 웰 플레이트에서 액적-기반 방법에 의해 현재 수행될 수 있는, 타겟화 시퀀싱을 위한 보강 방법(예를 들면, 대-규모 타겟화 시퀀싱을 위한 마이크로액적-기반 PCR에 이미 기술되어 있는, R.외, Nat . Biotechnol. 2009, 27, 1025-1031)에 사용될 수 있다. 슬립칩 상의 PCR은 게놈 질병, 유전적 돌연변이, 및 식품 또는 물 오염의 검출을 위해 사용될 수 있다. 현재 플랫폼은 또한 예를 들면, RNA 바이러스 검출과 같은 RNA 증폭을 위한 역 전사 PCR, 유전자 발현의 연구, 및 세포 이질성의 조사를 수행하기에 적합할 수 있다.
슬립칩은 유리 또는 플라스틱과 같은 저렴한 재료로 제작될 수 있으며, 특정 실시예에서 어느 복잡한 장비 또는 작동하기 위한 전문화된 지식도 요구하지 않는다. 건조된 시약이 슬립칩으로 사전 로딩될 때, 그것은 또한 전달되고 저장되기에 용이하다. 그것은 등온 증폭 방법 및 간단한 판독기와 통합될 수 있다.
상기 슬립칩은 또한 다중 및 고 효율 성능을 갖도록 미리제작된 시약 어레이를 필요로하는 예를 들면, 단백질 결정화, 면역어레이, DNA 혼성화, DNA-단백질 상호작용, 및 크로마틴 면역-침전(ChIP)과 같은 다른 어플리케이션에 사용될 수 있다.
특정 실시예에서, 조합 바이오촉매반응(combinatorial biocatalysis)이 슬립칩상에서 수행될 수 있다. 조합 바이오촉매반응은 유리 화학에서의 조합 합성의 개념과 유사하다. 조합 바이오촉매는 촉매를 통해 바이오촉매 반응을 순차적으로 결합하는 것에 의해 단일 선도물질로부터 다양한 유도체 라이브러리를 제공할 수 있다. 조합 바이오촉매반응은 다른 기질이나 다른 효소의 동일한 염기서열로 수많은 효소 생산물의 발생을 가능하게 한다. 다-기능기(예를 들면, 카복실기, 히드록시기, 아실기, 아민 기 등) 를 갖는 선도물질들이 적용될 수 있는 잠재 분자이다. 조합 바이오촉매반응은 연속 혼합 및 작용과 관련된 많은 단계를 필요로한다. 선도물질의 양이 매우 작거나 비싼 경우, 96, 384 또는 심지어1,536개의 웰 플레이트가 필요한 수천개의 반응을 위해 많은 체적을 요구할 수 있다. 게다가, 제한된 양의 이용으로 인해 합성된 유도체들을 테스트하기에 제한될 수 있다. 표면 다중웰 플레이트 상의 생성물의 분석은 농도 및 부피의 관점에서 볼때 어려울 수 있다. 슬립칩의 특성 실시예는 적당히 한정된 체적과 복잡한 장비 없이 충분한 수의 반응 중심을 제공할 수 있다. 슬립칩은 고 처리량 약물 발견/약물 스크리닝에 매력적인 용액이다. 조합 바이오촉매반응의 가능한 적용은 바이오촉매반응 (효소 스크리닝, 효소 진화, 반응 조건의 최적화), 바이오엔지니어링 (시스템 개발, 로보트, 산업화), 바이오프로세스 엔지니어링(반응 시스템 최적화, 다운스트림 프로세스, 대규모 상업화), 의학 화학( 약물 후보, 유도체화, ADME 독성 테스트), 식품 화학 및 엔지니어링(천연 착색제, 항산화제, 식품 첨가제), 농업 화학(기능성 식품, 유화제) 및 환경 화학(천연 살충제)를 포함한다.
본 발명의 특정 실시예에서, 고 처리량 효소 스크리닝이 상기 슬립칩에서 수행될 수 있다. 스크리닝 효소는 전 세계적으로 많이 연구되는 산업 분야이다. 연구원은 통상적으로 그들의 효소 후보군을 공인된 화학 라이브러리에 적용한다. 통상적으로 로봇 및 수작업이 사용될 수 있으나, 통상적으로 많은 양의 시료에 의해 제한받는다. 시료 문제는 조합 바이오촉매반응(상기 참고)에서와 같이 발생한다. 다양한 화학 라이브러리가 다른 기질을 사용하여 슬립칩에 제공될 수 있다. 타겟 기질로서 화학 라이브러리들은 테스트될 특정 효소에 집중된 타겟-특이성 뿐만 아나리 기능기의 큰 스펙트럼을 포함하는 것이 바람직하다. 슬립칩은 적당한 양의 반응물로 화학 라이브러리의 다른 범위를 포함할 수 있다. 그 다음, 사용자는 다바이스로 효소 수용액의 적은 양을 흐르게 하고 슬립칩 내의 각 영역을 분석한다. 예를 들면, 누군가 추정 리파아제/에스테라제 시료를 갖고 있으면, 슬립칩은 가수분해(예를 들면, C2 에스테르, C3 에스테르, C4 에스테르, … C14 에스테르, C16 에스테르….. 등)를 위한 다양한 화학 라이브러리 테스트를 포함할 수 있다. 고 처리량 효소 스크리닝의 가능한 적용은 스테레오-특이성, 레지오-특이성, 소수성, 가수분해 및/또는 역-가수분해 반응성, pH 범위, 초-내열성 효소의 온도 범위, 초-내압성 효소의 압력 범위, 이온성 강도 범위, 및 고-내염성을 측정하는 것을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
특정 실시예에서, 슬립칩은 효소의 스크리닝을 위한 효소 테스트에 사용될 수 있다. 일단 잠재적 효소가 미생물로부터 단리되면, 전형적으로 기질 특이성, 반응성, 선택성 및 안정성을 평가하기 위하여 96-웰 플레이트에서 효소 반응을 수행하게 된다. 이 분석의 경우, 전형적으로 화학 라이브러리에 대한 효소를 테스트한다. 효소 시료를 단순한 테스트 스크리닝 키트로 사용하기 위한 다중 기질을 포함하는 미리-로딩된 칩이 제공된다.
본 발명의 특정 실시예에서, 슬립칩은 증폭, 검출, 및 해독 컴포넌트의 넓은 범위와 호환될 수 있는 방법으로, 시료 수집, 농축, 및 준비(sample collection, concentration, and preparation, SCCP)의 복잡성을 줄이며; 소변에서부터 객담(sputum)까지의 점도를 갖는 진단학적으로 관련된 시료들을 처리하고; 그리고 낮은 농도의 분석체를 포획하기 위하여 많은 양의, 밀리미터-크기 시료들을 처리할 수 있으며, 용이한 검출을 위해, 적은 양의, 나노리터-크기 체적까지 농축시킬 수 있는 플랫폼으로 사용될 수 있다.
슬립칩 플랫폼은 자원-한정 환경에서 헬스 케어 및 진단 기술로 향하는 몇몇 중요한 도전을 극복한다. 진단 분석법은 시료 준비에서부터 증폭까지, 검출 및 해독까지의 복잡한 여러 단계들을 필요로 한다. 이러한 단계들은 그들이 숙련된 기술자 또는 복잡한 오토메이션을 요구하기 때문에, 자원-한정 환경에서 수행하기가 어렵다. 또한, 상기 분석법은 높은 반응성(에러 및 오염이 적은 공간), 정량법(복잡한 프로토콜 및 장비), 및 다중화(상기 공정은 다중 분석체를 수회 반복되어야 함)을 요구하므로 어려움은 더욱 증가한다. 슬립칩 플랫폼은 시료의 수거, 농축 및 준비로부터, 증폭, 검출, 및 해독까지, 완전한 진단 장치에 요구되는 모든 단계들을 암호화할 수 있다.
상기 슬립칩 플랫폼은 시료 준비를 편하게 할 수 있으며, 현장 진단(POC) 어플리케이션에 새로운 기술을 열 수 있다. 예를 들면, 그것은 (i) 혈액, 객담, 소변 또는 대변과 같은 진단학적으로 관련된 시료의 (고민감성을 가능하게 하는) 작은 양 또는 큰 체적을 수용할 수 있으며; (ii) 목적 분자를 단리하기 위하여 많은 시료 준비 단계를 거쳐 그들을 조작할 수 있으며, 그리고 (iii) 증폭 및 측정 컴포넌트에 의해 바로 사용될 수 있는 작은 부피로 그들을 농축할 수 있다.
특정 실시예에서, 슬립칩은 원료 시료 주입부로부터 진학적으로 관련된 바이오마커의 신속하고, 단순한 추출에 사용될 수 있다. 슬립칩의 특정 실시예는 현재 중요한 미충족된 요구들의 많은 영역을 해결하는데 사용될 수 있는바, 이는 (1) HIV 바이러스 로딩양을 정량화하기 위하여 (예를 들면, 항레트로바이러스 치료를 관찰하고 태아를 진단하기 위한) 바이러스 RNA의 단리를 위한 전혈 및 플라즈마를 갖는 시료 준비; (2) 폐렴을 야기하는 병원균으로부터 RNA 뿐만 아니라 DNA의 단리를 위한 (예를 들면, 항생제 치료가 투여되어야 하는 경우에 측정하기 위한) 객담을 포함하는 시료의 준비를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
널리 보급된 약물내성을 막기 위하여 자원-한정된 환경에서 치료하는 동인 HIV 바이럴 로드의 정량적인 모니터링이 전 세계적으로 HIV/AIDS 진료에 중요한 장벽으로서 확인되고 있다. 몇주된 태아에서의 HIV 감염의 진단은 바이러스 로딩양을 정량화하는 것에 의해 수행될 수 있고, HIV 감염의 조기 진단 및 HIV 항레트로바이러스 약물 치료의 투여는 태아 사망률을 급진적으로 감소시키기 때문에, 자원-한정 환경에서 바람직하다.
현재, 자원-한정 환경에서 사용될 수 있는, 이용가능한 HIV 바이러스 로딩양 정량화 플랫폼이 존재하지 않기 때문에, 바이러스 로딩과 관련된 공인된 테스트는 일반적으로 적합하지 않다. 현존하는 공인된 바이러스 로딩 분석법은 상당한 기술자 및 실험기구를 요구한다. 자원-한정된 환경에서 복잡한 기구를 설치하는 것은 일반적으로 실패하였고, 그리고 시료를 공인된 실험실로 이송하는 것은 많은 문제를 발생하는 것으로 확인되었다. 건조된 혈액 스팟(DBS, 필터 페이퍼 상에 건조된 전혈의 스팟)은 이러한 환경에서 시료를 이송하기 위한 유일한 대안이다. DBS로부터 바이러스 RNA를 정량적으로 단리하는 기술 문제 이외에, 이것의 결과가 지체 없이 나오면, 테스트 결과로서 소송에 사용될 수 있기 때문에, 진료소를 옮기는 경우 적합하지 않는다. 더욱이, DBS의 사용은 정교한 장비 및 기술자라는 가정 하에 정량적인 RNA 테스트를 요구하고 있다.
특정 실시예에서, 슬립칩은 자체-완결 포맷으로 다중단계 시료 가공을 수행하는 것에 의해 자원-한정된 환경에서 HIV 바이러스 로드양의 정량적이고 민감한 측정을 위하여 사용될 수 있다. 슬립칩의 특정 실시예는 예를 들면, 100-200 μL의 전혈 또는 플라즈마를 수용할 수 있고, 디지털 슬립칩 또는 다른 증폭 컴포넌트 상에서 수행되는 후속 등온 증폭에 충분한 품질을 갖는 20-50 μL에서 >30% 수율로 정제된 바이러스 RNA를 생산할 수 있다.
폐렴과 같은 급성 저 호흡 감염 (acute lower respiratory infections, ALRIs)의 원인의 정확한 진단은 매년 수천 수만명의 생명을 구할 수 있고, 박테리아 바이러스의 동시 다중화 검출, 및 (박테리아 감염에 대응하는) 높은 수준으로부터 (박테리아 군집화에 대응하는)낮은 수준을 구별하기 위한 정량화를 포함하는 것이 바람직하다. 개발도상국에서, ALRIs, 특히 폐렴은 정확성, 낮은 비용, 쉽게 이용가능한 진단 툴의 부족으로 야기되는 부적절한 치료로 인해, 5세 이하의 어린이들 사망(>2 million/year) 의 주요 원인이 되고 있다. 열악한 진단 능력은 또한 항생제의 남용을 야기하는 것에 의해 내약물성 균주의 출원을 촉진시킨다. 박테리아 감염, 특히 스트렙토코커스 뉴모니아 및 해모필러스 인플루엔자 b형은 항생제로 쉽게 치료될 수 있는 것이므로, 바이러스 또는 다른 원인과 구별되어야 한다. 상부 호흡기의 군집화로부터 박테리아 감염을 구별하는 것이 가장 중요한 도전이고, 단순한 정량적인 예스/노 테스트는 효과적이지 않다. 진단은 객담, 예를 들면 16개의 통상의 박테리아 및 바이러스 병원균의 객담을 정량적인 다중화 테스트를 수행하는 것에 의해 급진적으로 개선될 수 있다. 예를 들면, 상당한 수준의 다른 병원균의 부재시, 보통 수준의 S. 뉴모니아 박테리아는 S. 뉴모니아 감염을 나타내는 경향이 있는 반면, 높은 수준의 호흡기 신시치아 바이러스(respiratory syncytial virus, RSV)의 부재시 보통 수준의 S. 뉴모니아 박테리아는 더 높은 원인으로서 RSV 감염을 나타낸다.
특정 실시예에서, 슬립칩은 디지털 슬립칩 또는 다른 컴포넌트상의 다운스트림 정량화 및 민감도 검출을 위한 >5-10배 증가된 농도로 >30% 수율로 객담으로부터 폐렴을 야기하는 병원균의 RNA 및 DNA를 단리하기 위하여 사용될 수 있다.
슬립칩의 특정 실시예는 mL 에서부터 nL까지의 체적으로의 복잡한 조작을 수행하기 위하여 프로그램화될 수 있다. 그것들은 시료를 예를 들면, 두개의 플레이트를 미끄러지게 하는 것에 의해 동시에 수천 수백만 나노리터의 체적을 쉽게 처리하도록 사용될 수 있다. 본 발명자들은 큰 체적(예를 들면,, 200 μL의 전혈) 이 상기 플랫폼에 통합될 수 있음을 증명하였다. 이 다중-크기 성능은 유용하다. 예를 들면, 500/mL HIV 바이러스 로딩양으로 50 HIV 바이러스를 포획하기 위하여, 최소한 100 μL의 플라즈마를 처리하는 것이 필요하고, 시료를 더 작은 체적으로 농축시키는 것은 가공 동안 손실을 줄이고 (예를 들면,, 디지털 PCR 슬립칩을 사용하여) 증폭 및 정량화에 더욱 적합한 생산물을 제공한다. 105-배까지의 연속 희석 및 희석에 의한 세정은 슬립칩 상에서 증명되어 왔다. 비드의 정량적인 처리는 수천개의 단백질 분자를 처리하고 검출하는, pM 범위의 nL-체적 면역분석법로 증명되어 왔다. 국소 가열 및 냉각은 필요한 단계에서 결합하기 위한 가열- 또는 냉각-발생 시약을 프로그램하는 것에 의해, 시료 화학을 거쳐 슬립칩으로 프로그램될 수 있다. 온도 컨트롤은 또한 전기 및 열적 가열 및 냉각을 포함하는, 외부 또는 내부 온-칩 수단에 의해 달성될 수 있고, 많은 접근법이 PCR 반응을 수행하기 위하여 사용될 수 있다. 이러한 특징들은 최소항 30%의 수율로, 10-배 농도를 갖는 타겟 핵산의 신뢰성있는 단리를 위해 사용될 수 있고, 그리고 수율과 농도 사이의 관계를 최적화할 수 있다.
특정 실시예에서, 상기 슬립칩은 다운스트림 HIV 바이러스 로딩 분석을 위하여 전혈 또는 플라즈마로부터 HIV RNA 바이러스를 추출하기 위하여 암호화될 수 있다. 본 슬립칩은 500 내지 106/mL HIV 바이러스 로딩양으로 (온칩 또는 오프칩으로 제조된) 100 내지 200 μL 의 플라즈마를 사용할 수 있으며 >30% 수율로 바이러스 RNA를 10-30 μL 용액을 사용하여 단리할 수 있다. 이러한 산출양은 mL당 500 내지 106 카피의 동적 범위, 95%의 신뢰도로 3배 이하의 에러율을 갖는 바이러스 로딩양을 측정하기 위한 디지털 슬립칩에 충분하다. 단리된 HIV RNA의 품질 및 양은 실시간 RT-PCR에 의핸 정량화될 수 있다.
특정 실시예에서, 슬립칩은 폐렴을 야기하는 병원균의 동정 및 정량화를 위한 객담으로부터 RNA 및 DNA를 추출하기 위하여 암호화될 수 있다. 그것들은, 예를 들면, > 30%의 수율로, RNA 및 DNA 단리를 위한 200-500 μL에 담을 예를 들면, 그것을 20-50 μL 의 증폭-준비 용액에 농축시키는 것에 의해, 처리될 수 있다. 슬립칩 상에서의 높은 동시 처리는 (i) 동일한 시료로부터 동시에 DNA 및 RNA의 동시 정제, 및 (ii) 단일 환자로부터 적어도 하나의 높은-품질 시료에서 보증하기 위한, 또는 다중 환자르부터 효율을 증가시키기 위한 동일한 장치 상에서 처리된 다중 객담 시료를 포함하는 선택들을 가능하게 한다. 증폭, 해독, 및 통합을 위한 슬립칩 컴포넌트와 결합된, 이러한 특징들은 HIV 바이러스의 정량화 및 폐렴 병원균의 다중화 정량적 분석을 포함하는 긴급한 세계적인 진단 문제에 대한 해결책을 제공한다. 객담 시료 처리 프로토콜은 TB의 분자 진단을 위한 미코박테리아 투베르쿨로시스로부터의 DNA 단리 및 내약물성 균주의 동정에 용이하게 채용될 수 있으며, 배설물로부터 핵산의 단리로까지 확장시킬 수 있다. HIV 프로토콜은 말라리아 진단을 위한 혈액으로부터 플라스모디움 DNA의 단리에 사용될 수 있다.
특정 실시예에서, 슬립칩은 현존하는 모든 증폭 화학 컴포넌트와 호환가능한 방법으로, 신호 증폭을 제공하고 검출을 개선하기 위하여 사용될 수 있다.
특정 실시예에서, 상기 슬립칩은 “확률론적 한정”의 원리를 이행하기 위한 슬립칩 플랫폼의 이점을 이용하는 것에 의해 시그날 증폭 및 검출 화학을 급진적으로 향상시키기 위하여 사용될 수 있다. 슬립칩은 예를 들면, (i) 단일-분자 또는 단일-세포 수준까지 현존하는 기술들의 민감도를 증가시키고; (ii) 특이도 및 감소된 방해 및 배경 반응을 증가시키고 (iii) 큰 동적 범위로 강건하게 정량화하고; (iv) 다중화 실험을 수행하기 위하여 사용될 수 있다.
특정 실시예에서, 상기 슬립칩은 자원이-제한된 환경에서 진단 어플리케이션을 위한 증폭 화학 컴포넌트의 강건성, 정량화, 민감도, 및 특이성을 향상키기시 위하여 사용될 수 있다. 상기 슬립칩은 현재 상당히 총족되지 않은 요구들을 갖는 많은 분야를 해결하기 위하여 사용될 수 있는바, 이는 (1) (예를 들면, 항레트로바이러스 치료를 관찰하고 태아를 진단하기 위한) HIV 바이러스의 정량화, 및 (예를 들면, 항생제 치료를 투여받아야 한다고 결정하기 위한) 폐렴을 야기하는 박테리아 및 바이러스 병원균의 다중 정량적 검출을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
특정 실시예에서, 슬립칩은 HIV 바이럴 로드의 정량화, 예를 들면, 항레트로바이러스 치료를 관찰하고 태아를 진단하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시예에서, 상기 슬립칩은 종말-점 판독으로 “디지털” 포맷”(이하, “디지털 슬립칩”이라고도 함) 까지 단순한 정량적 증폭 화학을 전환하는 것에 의해 HIV 바이러스의 높은 정량적이고 민감한 측정을 위해 사용될 수있 다.
특정 실시예에서 상기 슬립칩은 폐렴의 원인을 진단하기 위한 다중화 병원균 검출을 위해 사용될 수 있다. 현재, 폐렴 병원균의 정량적인 다중화 검출은 자원-제한된 환경 하에 미충족된 요구로 존재한다. 단일-분석체 테스트는 등온 기술에 의해 수행될 수 있으나, 그것들의 가치는 정량화 및 다중화의 부재시 제한적이다. 다중화 정량적 검출은 실 시간 PCR에 의해 달성될 수 있으나, 현장 진료, 자원 제한된 환경에는 유용하지는 않았다. 특정 실시예에서, 슬립칩은 증폭 화학의 다중화 및 전환을 종말-점 해독을 갖는 “디지털” 포맷에 결합하는 것에 의해 패렴 병원균의 정량적 및 민감한 검출을 위해 사용될 수 있다.
특정 실시예에서, 슬립칩은 (i) 단일-분자 또는 단일-세포 수준으로 현존하는 기술의 민감도를 증가시키고; (ii) 간섭과 배경 반응을 감소시키고; (iii) 넓은 동적 범위에 걸쳐 강건하게 정량화하고; (iv) 다중화 어플리케이션을 실질적으로 제한하지 않기 위하여 사용될 수 있다. 본 슬립칩에 대한 특정 실시예에서는 상기 두 개의 플레이트의 영역들의 시퀀스로서 반드시 임의의 프로그램을 암호화해서 유체 체적을 조작할 수 있다.
특정 실시예에서, 상기 슬립칩은 다체적 확률론적 한정을 위해 사용될 수 있다. 상기 슬립칩은 시료를 예를 들면 증폭 이전에 “디지털” 포맷으로 다양한 크기를 갖는 수천 수만개의 작은 체적(영역당 0 에서 하나 이상의 분석체 분자)로 나눌 수 있다. 작은 영역으로 분자를 한정하는 것은 (i) 분자의 농도를 증가시키고, (ii) 이러한 분자를 분자들의 간섭으로부터 격리시키고, (iii) 동일한 칩에서 동시에 사용되는 다중 체적에 의해 제공된 넓은 동적 범위로, 최대 우도 추정(maximum likelihood estimation)에 의해 종말점 해독으로부터의 정량화를 가능하게 한다.
슬립칩은 상업적으로 이용가능한 스톡 시약들을 이용하는 디지털 PCR 뿐만 아니라 디지털 등의 리콤비나제-폴리머라제 증폭 (ecombinase-polymerase amplification, RPA) 증폭 기술과 호환가능하다. 많은 다른 등온 기술은 (간섭이 존재하지 않는 경우에도)이 수행될 수 있는바, 이는 분석체를 정량화하기 위하여, 예를 들면, 루프-매개 등온 증폭 (loop-mediated isothermal amplification, LAMP) 및 핵산 염기서열-기반 증폭(nucleic acid sequence-based amplification, NASBA)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
특정 실시예에서, 슬립칩은 다중 확률론적 한정을 사용하여 HIV 바이러스 로딩양를 분석하기 위하여 500-106/mL의 동적 범위를 가질 수 있다. 특정 실시예에서, 상기 슬립칩은 회전 다중체적 디지털 슬립칩으로 설계될 수 있다. 이러한 설계는 예를 들면, 0.37 내지 250 nL 범위의 체적들을 갖는 수백개의 영역들을 가질 수 있고, 95%의 신뢰도에서 3-배 변화로 500-106 copies/mL의 동적 범위를 갖는 HIV 바이러스 RNA를 정량화할 수 있다. 본 발명자들을 HIV RNA가 디지털 슬립칩 플랫폼상에서 측정될 수 있음을 확인하였다.
특정 실시예에서, 상기 슬립칩은 폐렴과 관련된 16개의 병원균의 객담 시료들을 검출하고 정량화하기 위하여 사용될 수 있다. 특정 실시예에서, 상기 슬립칩은 (RNA 바이러스의 검출을 위해 선택적이고 부가적인 역 전사 단계를 사용하는) 16개의 병원균의 등온 증폭 화학을 위한 사전 로딩횐 시약을 함유할 수 있다. 본 발명자들은 384-플렉스 단일-영역 슬립칩 플렛폼상이 사전 로딩된 시약들을 사용하여 병원균의 다중화 검출을 증명하였다. 제안된 칩의 다른 영역은 장치의 동적 범위를 적당한 범위, 예를 들면, 외부 영역은 102-105/mL 범위에서, CMV, HRV, 및 다른 병원균의 민감한 검출을 위해 큰 영역으로, 그리고 내부 영역은 S. 뉴모니아 및 H. 인플루엔자 b형과 같은 병원균의 군집화를 102-106/mL의 범위로 하여 검출하고 정량화하기 위한 작은 영역으로 조절하기 위하여 사용될 수 있다. 시료 준비, 시각적 해독, 및 통합을 갖는 슬립칩의 능력은 긴급한 세계적인 진단 요구되는 두 영역- HIV 바이러스 로딩의 정량화 및 폐렴 병원균의 다중 정량적인 분석에 대한 해결책을 제공하기 위한 가능성을 가진다. 결핵의 진단은 미코박테리움 투베르쿨로시스의 생리학적 반응을 증폭시키는 슬립칩 상의 확률론적 한정에 의해 수행될 수 있고, 내약물성의 빠른 검출 및 표현형 테스트를 가능하게 한다. AIDS 환자에서 CD4 수의 정량화는 다중체적 확률론적 한정을 효과적으로 사용하는 것에 의해 수행될 수 있다.
특정 실시예에서, 상기 슬립칩은 해독 및 시그날 전환을 위해 사용될 수 있다. 특정 실시예에서, 상기 슬립칩은 다중화 증폭 및 검출 컴포넌트의 산물, 예를 들면 병원균의 검출 동안 생성되는 1000여개의 분리된 증폭 핵산 산물을 수용할 수 있으며, 그리고 그것들을 육안에 의해 또는 단일 휴대폰 카메라를 사용하는 것에 의해, 분석 및 해석을 위한 해독정보로 전환할 수 있다. 상기 슬립칩은 다중 단계 및 다중화 프로세싱을 실행하기 위하여 슬립칩 플랫폼의 이점을 이용하는 것에 의해, 어느 진단 테스트를 위한 시각적인 해독을 발생시키는 것에 의해, 시그널 프로세싱 및 해독을 향상시킬 수 있다. 특정 실시예에서, 상기 슬립칩은 (i) 사용자의 전문성에 의존 함이 없이 기술적으로 복잡한 프로세싱에 사용될 수 있고 (ii) 현재 POC 에서 이용가능한 것 보다 더 다양한 증폭, 프로세싱 및 검출 화학에 접근하여 진단 툴 박스를 확대시킬 수 있고; (iii) 그리고 인프라구조 없이 시작적인 해독정보를 정량화할 수 있다.
특정 실시예에서, 상기 슬립칩은 자원-제한된 환경에서 현재 상당히 미충족된 요구의 두 영역: 1) (예를 들면, 항레트로바이러스 치료를 위하여 태아를 진단하기 위하여) HIV 바이러스 로딩의 정량화, 및 2) (예를 들면, 항생제 치료를 투여해야 한다고 결정된) 폐렴을 야기하는 박테리아 및 바이러스 병원균의 다중 정량적인 검출에서 진단하기 위한 빠른 시각적 분석을 위해 사용될 수 있다.
*특정 실시예에서, 상기 슬립칩은 기반 시설이 없는 지역에서 HIV 바이러스 로딩양의 측정을 위한 다중화 시각화 해독을 위해 사용될 수 있다. 특정 실시예에서, 상기 슬립칩은 자체 완결 포맷으로 다중단계 프로세싱을 수행하고 시각적 해독정도로 쉽게 생성하는 것에 의해 적합한, 기반시설 없는 지역에서 HIV 바이러스 로딩의 정량적이고 민감한 측정에 사용될 수 있다. 그것은 슬립칩 또는 다른 증폭 컴포넌트상에서 수행되는 핵산 증폭 기술(NAT)의 생산물을 수용할 수 있고, 그것을 더 즉각적인 치료 계획에 유효하게 하는 시각적 해독정보로 전환할 수 있다.
특정 실시예에서, 상기 슬립칩은 폐렴의 원인을 검출하기 위하여 다중화된 시각화 검출법 및 분석법에 사용될 수 있다.
특정 실시예에서, 상기 슬립칩은 (i) 디지털 슬립칩 또는 다른 컴포넌트로부터의, 증폭된 핵산을 함유하는 수천개의 혼합물을 수용하고, 그리고 (ii) 각각으로부터의 정량적인 시각화 해독정보를 생산하기 위한 이러한 혼합물의 다중단계 프로세싱을 수행하기 위하여 사용될 수 있다. 다른 기술들은 이러한 요구들을 아직 만족시키지 못했는바, 이는 디지털 슬립칩에 의해 제공된 HIV 바이러스 로딩 테스트 또는 폐렴 패널과 같은, 정량적이고, 높은 다중화 “디지털” 테스트의 시각적인 해독으로의 전환에 바람직하다. 슬립칩의 특정 실시예는, 2개의 플레이트 내의 영역의 시퀀스로서, 유체 체적을 조작하기 위한 필수적인 어느 프로그램을 암호화할 수 있다. 슬립칩의 특정 실시예는 검출, 증폭, 및 시각적 해독를 포함하는 다중 단계를 기초로, 다중 체적을 프로세스할 수 있다.
특정 실시예에서, 상기 슬립칩은 예를 들면, 수천개의 영역들을, 예를 들면 각 영역내에 등온적으로 증폭된 핵산을 갖는 0.3-300 nL의 체적을 수용할 수 있으며, 다중단계 프로세스에 의해 각 영역으로부터 시각적인 해독정보를 생산할 수 있다. 특정 실시예에서, 1 이상의 흡광도를 갖는 250 μm × 250 μm 이상의 영역은 슬립칩상에서 용이하게 관찰가능하다. 고농도의 핵산을 갖는 큰 영역의 경우, 금 또는 셀리늄 입자들의 혼성화 포획에 의한 직접 검출이 사용될 수 있다. 저농도를 갖는 작은 영역들의 경우, 사용자는 큰 영역으로 시료들을 전달하고 추가적인 증폭 화학을 수행할 수 있다. 증폭 화학은 시각적인 검출을 제공하도록 변형될 수 있으며, 그러한 변형은 측방 유동 해독을 위해 잘 설립되어 있다. 슬립칩의 특정 실시예는 사용자의 기술적인 전문성을 요구함이 없이, 슬라이딩에 의해 사전 로딩된 시약을 사용하는 것에 의해 모든 바람직하게 포함된 단계들(예를 들면, 비드 및 표면 상의 분자의 포획, 자성 조작, 희석에 의한 부가적 세정)을 제공할 수 있다. 특정 실시예에서, 상기 슬립칩은 LAMP 및 RPA 및 다른 등온 증폭 기술을 위해 사용될 수 있다.
실시예. RPA 실험을 위한, TwistAmp Basic 키트는TwistDx. (Cambridge, United Kingdom)로부터 구입하였다. RPA 슈퍼믹스는RPA 효소 및 시약(냉동-건조된 기초 반응 펠렛)을 포함하는 단일 튜브로부터 20 μL 재수화 버퍼 및8 μL 대조 1X 프라이므/프로브 혼합으로 이루어진 혼합물을 첨가하는 것에 의해 제조하였다. 양성 대조 용액은 5 μL의 양성 대조 주형(10 카피/μL)을 14 μL of RPA 슈퍼믹스로 혼합하는 것에 의해 제조하였고, 음성 대조 용액은 14 μL of RPA 슈퍼 믹스에 5 μL 물을 첨가하였다.
50 nl의 마그네슘 아세테이트 수용액 (9.3 mM)을 Harvard 실린저 펌프에 의해 조절된 50 μL의 Hamilton 유리 실린저에 연결된 테프론 튜빙(200 μm ID)을 통해 40-영역 슬립칩의 하부 플레이트 상의 각 원형 영역에 집어 넣었다. 상기 용액을 10분 동안 실온에서 건조시켰다.
상기 슬립칩을 가스가 제거된 미네랄 오일 하에 조립하였다. 하부 플레이트를 우선 페트리 접시에 패턴화된 면이 뒤를 향하도록 침지하였다. 상부 플레이트를 그 다음 패턴화된 면이 아래를 향하도록 하부 플레이트 위에 올려두었다. 두 플레이트를 정렬시키고 바인터 클립으로 고정하였다.
음성 대조 용액(5 μL)을 피펫팅하여 하나의 주입구를 통해 위의 두개의 열에 주입하고, 양성 대조 용액(5 μL)을 분리된 입구를 통해 아래의 두 열에 로딩하였다. 유로는 슬리핑에 의해 분쇄되었고, 상부 플레이트를 움직여서 하부 플레이트 상에, 사전 로딩된 건조 마그네슘 아세테이트를 포함하는, 구형 영역에 붙였다. 각 영역에서의 반응 혼합물의 부피는 예상된 Mg 아세테이트 농도 17 mM로 27 nL이었다. 슬립칩을 즉시 39 ºC의 인큐베이터에 넣은 후, Leica DMI 6000 B epi-형광 마이크로스코프를 사용하여 형광 강도를 획득하였다. 형광 이미지는 슬리핑한 바로 직후와39 ºC에서 인큐베이팅한 후로부터 20분이 경과한 이후에 5X / 0.15 NA 대물렌즈 및 L5 필터를 사용하여 획득하였다.
실시예 1. 건조 마그네슘 아세테이르를 사용하여, 전술한 실험을 수행하였다. 그러나, 마그네슘 아세테이트 용액은 이후의 수성 상으로 슬립칩에 교대로 로딩될 수 있으며, 그 다음 RPA 슈퍼믹스로 혼합하기 위해 슬라이딩 하여 반응을 시작할 수 있다. 실험 2. RPA 슈퍼믹스로 마그네슘 아세테이트 용액을 미리 혼합하였다. 1 μL의 마그네슘 아세테이트 용액 280 mM를 19 μL의 음성 대조 용액에 첨가하고, 상기 용액을 40-영역 슬립칩의 위 두 열에 로딩하였다. 1 μL 의 다른 마그네슘 아세테이트 수용액 280 mM 을 19 μL의 양성 대조 용액에 첨가하고, 상기 용액을 다른 주입구를 통해 아래 두 열에 로딩하였다. 유로를 미끄러지게 하는 것에 의해 분해하고 상부 플레이트를 움직여서 미네랄 오일을 포함하는 구형 영역으로 덮었다. 슬립칩을 즉시 39 ºC의 인큐베이터에 넣고, Leica DMI 6000 B epi-형솽 마이크로스코프를 사용하는 것에 의해 형광 강도를 획득하였다. 형광 이미지는 슬리핑 이후에 즉시 및 39 ºC에서 인큐베이터 한 20분 이후에 5X / 0.15 NA 대물렌즈 및 L5 필터를 사용하는 것에 의해 획득하였다. 실험 1에서, 양성 대조 용액에 해당하는, 40개의 영역 중 오직 2개의 영역에서만 발광하였다. 실험 2에서, 양성 대조 용액에 해당하는, 40개의 영역 중 3곳 에서, 발광하였다. 두 실험에서, 음성 영역 용엑에 해당하는 영역들은 모드 어두운 상태로 남아있었다.
상기 슬립칩은 넓은 범위의 시각화 검출 화학과 호환가능하다. 슬립칩의 특정 실시예에서 다중 단계 프로세싱은 “딥 스틱” 측방 유동 장치에서 이미 정립된 표준 시각화 화학물질들을 이용하거나(예를 들면, 미국특허출원 12/425121 참고, 상기 특허출원은 본 명세서에서 참고로 원용됨) 또는 화학물질을 가능하게 한다. 금 나노입자(AuNPs)의 표면 상에서 시작되는, 은 (I) 이온의 자동촉매 환원은 매우 높은 정도의 증폭을 제공하여 신속하게 시각적으로 관찰가능한 은 증착물을 생산한다. 5 pM 검체(~165,000 분자)에서 55 nL 체적에서 슬립칩 상의 실험은, 이러한 화학 물질을 배경으로부터 완벽히 구별가능한 시각적 시그날을 생산하였다. 상기 시그날은 10분 이내에 발생되었다. 슬립칩 상에서 수행될 수 있는 다른 화학물질들은 직접 라벨 포획, NBT 및 BCIP로부터의 시각적 생산물을 발생시키기 위한 알칼리 포스파타제(Alkaline Phosphatase, AP), 및 중합-기반 증폭을 포함하나, 이제 한정되는 것은 아니다.
특정 실시예에서, 상기 슬립칩은 슬립칩 상의 HIV 바이러스 로딩의 시각적 정량화를, 예를 들면, 500-106의 동적 범위로 사용하기 위하여 사용될 수 있다. 슬립칩 또는 다른 증폭 컴포넌트로부터의 HIV RNA의 RPA 생산물은, 예를 들면, 혼성화, 정제 및 HIV 바이러스 로딩의 직접적인 시각적 분석을 위한 시각적 시그날 발생을 수행하기 위하여 슬립칩상에서의 추가적인 단계를 통하여 처리될 수 있다.
특정 실시예에서, 상기 슬립칩은 검출 및 정량화 예를 들면, 폐렴과 관련된 16개의 병원균을 시각화 하기 위하여 사용될 수 있다. 혼성화 및 시각적 증폭을 위한 추가적인 영역이 2-층 장치의 내부에 또는 다중층 장치의 내부에 밀도를 증가시키기 위하여 통합될 수 있다. 상기 슬립칩은 다중화된, 다중 단계 해독이 요구되는 다른 영역에서 사용될 수 있다. 이것은 (예를 들면, 말라리라 기생충 또는 STDs의 동정 및 진단에서) 핵산의 증폭에 의지하는 다른 진단 요구, (예를 들면, 지속성 설사 또는 STDs에 관여하는 병원균의 동정에서) 다중화 면역분석법, 및미코박테리엄 투벨쿠로시스 박테리아의 신속한 시각적 검출 및 정량화를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
특정 실시예에서, ExaVir Load (Cavidi AB)와 같은, 바이러스 로딩을 측정하는 ELISA-기반 방법이 슬립칩 상에서 수행될 수 있다. ExaVir Load는 역전사 효소 활성의 정량화를 기반으로 바이러스 로딩양을 측정하고, O 및 N-기를 포함하는, 어느 HIV형 또는 아형(subtype)을 측정할 수 있다. 불행하게도, Exavir Load 및 유사한 분석법은 느리고 정량적이지 않다. 그러한 분석법은 낮은 바이러스 로딩양에서 검출하능한 DNA의 양을 얻기 위하여 DNA 분석을 위한 긴 배양 시간을 필요로 한다. 그러나, 그러한 분석법이 확률론적 한정 및 디지털 해독기를 사용하는 슬립칩의 특정 실시예에서 수행되면, 높은 국소적 농도로 인해 배양시간을 줄일 수 있을 것이다. 예를 들면, ExaVir Load 측정 범위는 600,000/mL까지 이다. 이것은 배양 시간(통상적으로, 1일)에서 웰의 바닥에 연결되는 모든 주형을 포화시키는 합성된 DNA에 의해 측정된다. 예를 들면, 10nL의 체적과100 μm의 깊이를 갖는 슬립칩 영역에서, 웰내의 바이론은 100,000/mL이나, 영역은 96-웰 플레이트내의 웰에 비해, 겨우 약 ~1/300이다. 주형의 소모 속도가 바이론의 농도에 의존한다고 가정하면, 하나의 바이론은 슬립칩 내의 주형을 포화시키기 위하여, ~1/50의 시간, 즉, 통상적으로 약 1시간을 필요로 한다.
다른 방법이 증폭을 증가시키기 위하여 라디칼 개시 / 중합 증폭과 같은 ExaVir Load와 함께 수행될 수 있다. 그것은 임계치를 설정하기 위하여, 억제자로서 적은 양의 라디칼 사슬 터미네이터를 첨가하는 것에 의해 증폭을 더욱 향상시킬 수 있다. 이것은 요구되는 세척 단계의 수를 줄인다.
특정 실시예에서, 슬립칩은 적재가능하다. 적재가능한 슬립칩은 현재 중요한 미충족 요구의 많은 영역에서 사용될 수 있는바, 이는 (1) (예를 들면, 항레트로바이러스 치료를 관찰하고 태아를 진단하기 위한) HIV 바이러스 로딩양의 정량화, 및 (2)(예를 들면, 항생제 치료가 투여되어야 한다고 결정되는) 예를 들면, 폐렴을 야기하는 박테리아 및 바이러스 병원균이 다중 정량적 측정을 포함하나, 이에 한정되니 않는다. 적재가능한 슬립칩은 HIV 바이러스 로딩양의 정량화를 위한 완성된 혈액-대-응답 진단 용액을 용이해 사용될 수 있다. 특정 실시예에서, 적재가능한 슬립칩은 다른 슬립칩 기술, 예를 들면 (i) 혈액으로부터 HIV 바이러스 RNA를 단리하기 위한 시료 준비 및 농축을 위한 슬립칩, (ii) RNA 분자의 등온 증폭 및 카운팅에 의한 바이러스 로딩양의 정량화를 위한 디지털 슬립칩, 및 (iii) 증폭된 핵산을 육안으로 또는 예를 들면 휴대폰 카메라로 검출가능한 해독정보로 전환하기 위한 슬립칩을 통합하는 것에 의한 HIV 바이러스 로딩양의 정량적이고 민감한 측정을 위해 사용될 수 있다.
특정 실시예에서, 적재가능한 슬립칩은 예를 들면, 폐렴의 원인을 진단하기 위한 다중 병원균 검출에 사용될 수 있다. 특정 실시예에서, 적재가능한 슬립칩은 다른 슬립칩 기술, 예를 들면 (i) 폐렴을 야기하는 객담 RNA 및 DNA 병원균으로부터 단리하기 위한 시료 준비 및 농축을 위한 슬립칩, (ii) 패널, 예를 들면, 폐렴을 야기하는 16개의 병원균으로부터의 핵산의 다중 동정 및 정량화를 위한 디지털 슬립칩, (iii) 증폭된 핵산을 육안 또는, 예를 들면, 휴대폰 카메라에 의해 검출가능한 시각적 해독정보로 전환하기 위한 슬립칩을 포함하는, 다른 슬립칩 기술을 통합하는 것에 의해 현장 진료시 폐렴 병원균의 정량적이고 민감한 검출에 사용될 수 있다.
특정 실시예에서, 적재가능한 슬립칩은 그것들 사이에 있는 또는 다른 화학물질을 갖는 다중 슬립칩 컴포넌트 및 하드웨어 컴포넌트의 통합을 위해 사용될 수 있다. 슬립칩의 특정 실시예는 두 플레이트내의 영역의 시퀀스로서, 유체 체적을 조작하기 위한 필수적인 어느 프로그램을 암호화할 수 있다. 그것들은 시료의 농축 및 준비, 핵산의 동정 및 정량화를 위한 다중화 증폭, 및 핵산의 시각적 도는 예를 들면, 휴대폰 독 정보로의 전환을 위해 사용될 수 있다. 적재가능한 슬립칩은 이러한 컴포넌트를 하나의 다른 컴포넌트와 또는 다른 연구진에 의해 개발된 다른 컴포넌트들과 통합하는 것이 의해 진료 테스트를 완료하기 위해 사용될 수 있다. 적재가능한 슬립칩을 통합하는 많은 방법이 존재하는바, 입력/출력의 제한된 수를 교환하기 위한 미리-제조된 컴포넌트 칩의 제작, 및 수백 수천개의 입력/출력을 교환하기 위한 완성된 슬립칩 컴포넌트를 생성하기 위한 다중 적재 층의 제작을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 적재가능한 슬립칩은 슬라이딩, 비드의 포획, 및 적재를 통한 유체 움직임의 조절을 제한할 수 있는바, 이는 모세관 및 압력-유도 흐름을 포함한다. 슬립칩은 스택을 통한 유로를 생성하고 분해할 수 있고, 심지어 단순한 윅(wick) 또는 압력 원천은 스택을 통한 유체의 재구성가능한 움직임을 야기할 수 있다.
특정 실시예에서, 적재가능한 슬립칩은 소수의 입력-출력으로 미리-제조된 컴포넌트 슬립칩을 통합하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시예에서, 적재가능한 슬립칩은 디지털 슬립칩으로 농축하는 스립칩의 통합을 위해 사용될 수 있다. 스택의 컴포넌트 사이의 단일 연결은 HIV 바이러스 로딩양 측정에 충분할 수 있고, 소수의 연결(예를 들면 RNA 및 DNA 준비 모듈로부터 용액을 다르게 처리하기 위한)은 예를 들면, 폐렴 병원균으로부터 핵산을 동정하고 정량화하기에 충분할 수 있다. 이러한 접근법은 입력-출력 구성 기준이 설정되어 있는한, 컴포넌트들은 각각 최적화된 후, 용이하게 통합되기 때문에 매력적이다.
특정 실시예에서, 적재가능한 슬립칩은 슬립칩 층의 직접 통합을 위해 사용될 수 있다. 이러한 접근은 컴포넌트 슬립칩의 구성를 가지고, 그리고 그것을 한 층에 있는 영역으로부터 다른 층에 있는 영역으로 직접 시료를 전달하는 단계로 통합한다. 이러한 접근은 수백 수천개의 시료 체적을 처리하는 예를 들면, 핵산을 증폭하기 위한 디지털 슬립칩 및 시각적 해독정보를 생성하기 위해 각 체적의 다중 프로세싱을 수행하기 위한 해독 슬립칩 컴포넌트의 통합에 중요하다. 그것은 또한 전체 장치의 상당한 단순화를 제공하고, 단일 디지털 슬립칩 층은 진단 장치의 요구에 의존하는, 각각 다른 종류의 해독 슬립칩 중 하나로 통합될 수 있다. 특정 실시예에서, 적재가능한 슬립칩은 500-106/mL 동적 범위의 HIV 바이러스 로드량을 측정하기 위한 완전한 테스트를 가능하게 한다. 특정 실시예에서, 적재가능한 슬립칩은 예를 들면 16개의 폐렴 병원균의 객담 시료에서 검출 및 정량화를 위해 채용될 수 있다.
특정 실시예에서, 슬립칩은 뇌의 외상(TBI) 바이오마커의 분자를 세기 위한 캐스캐이드의 증폭을 위해 사용될 수 있다. TBI는 군대에서 중요한 건강 문제이다. Mild TBI (mTBI)은 그것이 많은 경우에 포함되기 때문에 특별한 중요성을 가지며, 진단을 어렵게 만들며, 장-기간 무능력을 초래할 수 있다. 현재 진단 기술, 자기 공명 영상 및 컴퓨터 단층촬영은, 전쟁이 일어나는 곳에서 비실용적이고, 비용 및 낮은 민감도로 인해 제한적이다. 미충족된 요구는 현장 진료(POC)에서 TBI의 적당한 치료를 진단하고 개시하기 위한 것이다.
바이오마커는 TBI를 진단하기 위하여 사용될 수 있으나, (1) 혈액내 바이오마커의 낮은(pM) 패널 수치의 검출, 특히 정량화(정량화는 절대적인 수치뿐만 아니라 바이오마커내에서 시간-의존적으로 변화하는 수치가 TBI의 적절한 평가에 요구되기 때문에 중요하다)가 개선될 필요가 있으며, 그리고 (2) 추가적인 장비 없이 분석을 수행하거나 해독하기 위한 휴대가능한 경량 장치와 같은 기능을 가질 필요가 있다. 정성적인 결과는 공지의 딥-스틱형 장치로부터 얻어질 수 있으나, 정량화를 위해서는 다른 판독기가 요구되기 때문에 신뢰받지 못할 수 있다. 낮은 농도에서의 정량화는 혈액 또는 소변 및 잠재적으로 심지어 타액내의 바이오마커의 검출을 가능하게 하므로, 현재 “골드 표준” 뇌척수액 보다 현장에서 수거하기에 단순하고 안전하다.
분석법의 발전은 두가지의 다른: 증폭 및 정량화에 대한 요건을 가진다. 낮은 출발 농도 및 강하고, 쉽게 검출가능한 시그날에 대한 요구는 매우 정확한 정도의 증폭을 필요로 한다. 그러나, 그러한 증폭은 일반적으로 정량화하기에 너무 어렵고, 증폭 캐스케이드를 유발하고 에러 및 긍정 오류를 야기하는, 심지어 아주 적은 양의 방해물질이 존재하는 경우에도 매우 민감하다. 이러한 도전은 “확률론적 한정”와 화학적 증폭을 겹합하는 것에 의해, 수천개의, 예를 들면, 나노리터, 피코리터, 또는 펨토리터 체적의 영역에서, 단일-분자 검출법으로 해결될 수 있다. 단일 분자의 개수를 계산하기 위한 “디지털” 접근법은 PCR(디지털 PCR)에 의한 핵산에 일반적으로 사용되는 것으로, 효소를 증명하여 왔다. 이러한 접근법은 “확률론적 한정’를 사용하는바: 시료를 예를 들면, 수백 수천개의 작은 체적, 또는 영역으로 분리하는 것에 의해 추계적으로 각 영역은 0 또는 하나의 타겟 북석체의 분자를 포함한다. 확률론적 한정은 하기와 같은 여러 이점을 가진다: (1) 정확하고, 정성적인 예스/노 증폭 화학은 양성 영역의 개수를 계산하는 것에 의해 정량적인 결과를 산출하고; (2) 인공물, 예를 들면 증폭의 거짓 개시 또는 억제는 각각의 영역들을 제한하게 되고; (3) 분석의 민감도 및 특이도는 단일 분자의 유효 농도가 (시그날을 증가시키는 것에 의해) 작은 체적에서 더 높고 방해 분자는 (노이즈를 감소시키는 것에 의해) 추계적으로 배제되기 때문에 증가하게 된다. 증폭이 (예를 들면, PCR에서의 열적 순환에 의해) 개시되면, 포아송 추계에 의해 수정된, 양성 영역의 수는 시료내 분자의 수와 일치한다. “확률론적 한정” 및 화학 증폭법 디지털 바이오마커 검출을 위한 단일 분자 면역분석법에서 사용될 수 있다.
확률론적 한정 및 증폭은 즉각적인 측정, 해석, 및 치료 방안을 제공하기 위하여, “바코드화된” 시각적 판독기에 사용될 수 있다. 시각적 판독기는 예를 들면, 병원 및 실험실에서 사용하는 정교한 촬영 기구가 멀리 떨어져 있는 군대와 같은 환경에서 중요하다. 다중화 분석 체적의 시각화 판독기는 패턴이 시각적으로 또는 휴대폰 카메라를 사용하는 것에 의해 해독될 수 있도록, 바코드와 같은 도트를 가진 디지털 패턴으로 구성될 수 있다. 이미지를 캡쳐하는 것은 시간의 경과에 따른 측정을 가능하게 하고, 의사 결정을 자동화하거나 대표화하기에 유용하다. 상기 패턴은 가장 최선의 조치를 지시할 수 있도록, 온-보드 소프트웨어 또는 중심 설비를 통해 즉각적으로 분석하고 해석될 수 있다. TBI 바이오마커의 “디지털” 계산은, 예를 들면, 멀리 떨어져 있는 군대와 같은 환경에서의 진단을 가능하게 한다. 연속 증폭 단계 이후에, 시각적 시그날이 발생되어, 예를 들면, 휴대폰 카메라를 사용하여 신속하게 이미지화되거나 분석될 수 있으므로, 즉각적인 지시를 제공할 수 있다.
예를 들면, 나노리터, 피코리터 또는 펨토리터 체적의 다수의, 예를 들면, 수천개의 다중처리 단계가 상기 슬립칩을 사용하는 것에 의해 달성될 수 있다. 슬립칩에서의 정교한 유체 조작이 다중-단계 면역분석법 및 단일-분자 수준에서 TBI 바이오마커의 검출에 적합한 다른 화학방법을 수행하기 위하여 사용될 수 있다. 상기 슬립칩은 수천개의 작은 체척이 동시에 조작될 수 있도록 복잡한 프로그램을 암호화하는 것에 의해 사용될 수 있는 마이크로유체 플랫폼이다. 면역분석법은 상기 슬립칩에 대한 특정 실시예에서 증폭법을 사용하는 것에 의해 정량적으로 수행될 수 있다. TBI 내의 낮은 수준의 단백질 바이오마커를 검출하기 위해서는, 초과량의 포획 항체가 결합을 유도하기 위하여 사용될 수 있기 때문에, 면역분석법이 유용하다. 이러한 분석법의 경우, 다중-단계 처리과정이 바람직한바, 이는 세척 단계 및 시그날 증폭을 위한 시약의 첨가 단계를 포함한다. 본 발명자들은 비드-기반 면역분석법이 스립칩에서 나노리터 체적을 사용하는 것에 의해, 대사 마커 인슐린에 대하여 pM-수준 민감도를 가진다는 것을 증명하였다. 상기 슬립칩상에서의 확률론적 한정은 디지털 PCR에 의한 증폭 이후에 단일 DNA 분자의 수를 계산하기 위하여 사용될 수 있다. 본 발명자들은 DNA의 단일 분자가 각각의 체적이 2.6 nL인 전체 영역 1,280 중에서 양성 영역의 수를 계산하는 것에 의해 정량화될 수 있다는 것을 증명하였다.
특정 실시예에서, 상기 슬립칩은 (1) 매우 높은 정도의 증폭 이후에 단일 분자의 수를 계산하는 것에 의해 달성될 수 있는 높은 민감도를 갖는 TBI 바이오마커의 정량적 검출 (2) 시각적 판독기에서 목적 TBI 바이오마커의 단일 분자를 검출하고 계산하기 위해 요구되는 민감도를 제공할 수 있는 다중단계 증폭 캐스케이트 (3) 분자 인식을 위한 표준 면역분석법 화학에 사용될 수 있는 작은 (예를 들면, 펨토리터 내지 피코리터) 체적의 TBI 바이오마커 분자의 확률론적 한정에 사용될 수 있다.
유비퀴틴 C-말단 하이드로라제-L1(UCH-L1)은 신경 세포체 손상의 마커이고, SBDP 150는 칼패인에 의한 αII-스펙트린 분해의 생산물로서 축삭 손상과 관련된 마커이다. 이들은 TBI 동안 혈액내에, 각각 4 내지 130 pM 및 7 내지 70 pM 존재한다. 이러한 분석법에서 사용될 수 있는 상기 물질들에 대한 상업적 모노클로날 항제들이 존재한다. 상기 슬립칩에 대한 특정 실시예는 동시 검출로 ~0.02-200 pM 농도 또는 0.001 pM 이하의 범위를 정량화하기 위하여 사용될 수 있다.
단일-분자 현미경이 증폭 및 시각적 판독을 위한 영역에서 목적 단일 분자의 존재를 확인하기 위하여 사용될 수 있다. 시료들은 Alba 현미경 시스템(ISS, Champaign, IL)으로 이미지화될 수 있다. 타겟 바이오마커, 항체, DNA 프로브 및 심지어 금 나노입자들(AuNPs)이 양자점(QDs, 점멸에 의해 강화됨)으로 라벨링될 수 있다. 긴 라이프타임을 갖는 란탄계 염료가 플라즈마를 포함하는 강한 형광성 인간 시료에서의 타임-게이트 모드에서 사용될 수 있다.
특정 실시예에서, 상기 슬립칩은 작은 체적내의 시료들을 구획하고 조작하기 위하여 사용될 수 있다. 상기 슬립칩은 넓은, 예를 들면, 나노리터(예를 들면, 영역의 치수, 500 x 500 x 50 μm3)에서부터 열배 이상의 피코리터(50 x 50 x 5 μm3)까지 열배 이상의 펨터리터 (5 x 5 x 0.5 μm3)까지의 범위를 갖는 체적의 형성 및 조작을 가능하게 한다. 예를 들면, 마이크로리터 크기에서의 적절한 대조 반응은 시약 및 분석이 예상대로 수행되는지를 확인하기 위하여 수행될 수 있다. 확률론적 한정은 단일 분자를 단리하기 위하여 사용될 수 있다: 예를 들면, 9 pM 농도에서, 0.2 pL 부피의 영역들은 평균 하나의 분자를 포함한다. 펨토리터 영역의 증가된 제작 복잡성에 대한 급속히 빠른 전송과 같은, 각 영역 크기의 이점 및 제한은 제공된 어플리케이션에 의해 결정될 수 있다. 작은 체적은 제공된 어플리케이션에 덜 적합한 경우, 짧은 평형 시간이 큰 체적으로부터 단일 바이오마커 분자들을 포획하기 위하여 사용될 수 있다. 단일-분자 현미경에 의한 특징화는 실제 농도의 개선된 대표화를 보증하기 위하여 사용될 수 있다.
단일-분자 분석법을 분석하기 위하여, 포아송 통계가 관찰되는 양성 및 음성 영역의 수로부터 분석체의 초기 농도를 계산하기 위하여 사용될 수 있다. 시각적 판독기를 사용하여 정확하고 정밀한 단일-분자 분석법을 수행하기 위하여, 사용자는 버퍼, 인공 플라스마, 로그-크기 농도 단계(농도당 시료 n ≥ 5 )에서 0.02 pM - 200 pM의 바이오마커가 결합되고 비결합된 것인 저장된 보통의 인간 플라스마 내에 있는 바이오마커의 농도를 분석할 수 있다. TBI 하에 분석을 수행하기 위하여, 12개의 각각의 TBI 환자로부터 저장된 인간 플라즈마 (Banyan)는 분석을 정확하게 평가하구 mTBI 환자의 바이오마커 수준을 측정하기 위하여≥ 3회 분석될 수 있다.
특정 실시예에서, 상기 슬립칩은 다중화 포맷에서 시각적 판독기를 사용하여 단일 분자의 다중단계 임계치 증폭을 수행하기 위하여 사용될 수 있다. 육안 또는 휴대폰 카메라에 의한 단순한 시각화를 위하여, 양성 영역의 광학적 특징(흡수 또는 반사) 은 200 μm x 200 μm 영역에서 0.5 내지 1의 흡광도와 상당할 수 있다.
금 나노입자(AuNP) 표면에서 개시되는, 은(I) 이온의 자기촉매 환원은 시각적으로 관찰가능한 은 증착을 생성하는 매우 높은 정도의 증폭을 제공한다. 면역분석법에서 사용하는 경우, AuNP는 검출 항체에 컨쥬게이트된다. 상기 슬립칩에서, 이러한 화학물질은 5 pM AuNP (영역당165,000 AuNP)를 포함하는 55 nL 체적에서 배경으로부터 분명하게 식별가능한 시각적 시그날을 생산할 수 있다. 증폭 조건은 낮은 검출 제한을 달성하기 위하여 변경될 수 있고, 출발 체적은 5 pM 농도가 영역당 평균 0.6개의 분자를 생성할 수 있도록 200 fL까지 감소될 수 있다. 최소한 200개의 영역을 포함하는 장치상에서, <1%의 긍정 오류를 갖고 >95%의 입자들로부터 시각적 시그날을 발생시키기 위하여, 단일 분자로부터 강건한 증폭이 수행되 수 있다.
암시야 현미경은 단일 분자 수준에서 150 nm AuN Ps 컨쥬게이트된 항- UCH-L1 항체를 추적하기 위하여 사용될 수 있다. 선택적으로, 형광 현미경 시스템(예를 들면, Alba 시스템)이 형광 라벨된 AuNPs를 추적하기 위하여 사용될 수 있다.
특정 어플리케이션에서, 서브-피코리터 영역으로부터의 시그날은 시각적으로 검출하기에 충분한 강도를 가지고 있지 않기 때문에, 두-단계 증폭이 시그날을 시각화하기에 바람직하다. AuNP-촉매화 증폭의 제1단계로부터의 출력은 시각적으로 관찰되기에 충분히 큰 제2 세트 영역에서의 증폭을 개시할 수 있다. 은 증착은 자기촉매로서, AuNPs (배경)의 부재하에 잠재석 시그날 생성의 우려가 존재한다. 증폭의 제1단계 동안, 긍정 진실은 강한 시그날을 생성하고, 배경 노이즈는 약한 시그날을 생성한다. 임계치는 임계 치수 보다 강한 입력 시그날만 더욱 증폭되도록 도입될 수 있다. 고 친화력 티올의 첨가하여 금 표면을 피복하는 것은 배경뿐만 아니라 1시간 이상 동안 AuNPs의 서브-임계치 농도를 억제할 수 있다. 임계치의 사용은 AuNP가 처음 함유된 영역으로부터 증폭의 제2단계 이후에 시각적 시그날이 나타나는 것을 보장한다.
PCR은 증폭 화학으로부터 시그날-대-노이즈의 비율을 증가시키기 위한 추가적인 증폭 단계로서 사용될 수 있는바, 표준 PCR에 의한 핵산의 단일-분자 증폭이 잘 알려져 있다. 확률론적 한정와 결합된 단일-분자 면역-PCR이 수행될 수 있다. 사용자는 항-UCH-L1 검출 항체를 DNA 염기서열에 컨쥬게이트할 수 있다. 상기 DNA는 염기서열의 많은 카피를 생성하는, PCR 증폭을 위한 주형으로서 작용한다. PCR 산물의 각 카피는 두개의 프로브: 영역 또는 비드의 표면에 그것을 부동화시키는 프로브, 및 시그날 분자에 그것을 연결하는 프로브가 혼성화되도록 설계될 수 있다. NBT/BCIP 및 AuNP-촉매화 은 증착을 갖는 알칼라인 포스파타제(AP)는 PCR 산물로부터 시각적 시그날을 발생시키기 위하여 둘 다 사용될 수 있다.
특정 실시예에서, 상기 슬립칩은 단일-분자 PCR 및 등온 DNA 증폭을 위해 사용될 수 있다. 표준 PCR이 그것이 강건하고 잘-특징화될 수 있기 때문에 상기 슬립칩 상에서 수행될 수 있으나, 필요한 온도순환이 예를 들면, 현장에서 사용하기에 항상 적합한 것은 아니다. 등온 기술은 특정 현장 어플리케이션에 적합하다. 본 발명자들은 슬립칩 플랫폼 상에서 등온 리콤비나아제 폴리머라제 증폭(RPA)을 사용하여 단일-분자 검출을 증명하였다.
확률론적 한정와 결합된 증폭을 위한 다른 화학이 상기 슬립칩 상에서 사용될 수 있다. 광개시 시스템이 매우 민감한 것으로 밝혀 졌고, 단일 분자 수준에서 기능을 할 수 있다. 중합화는 시각적 시그날을 발생시킬 수 있고, 그리고 항체에 다중 라디칼 광개시제를 첨가하는 것은 시각적 판독기에 가능성을 나타낸다. 자기촉매 산 발생에 결합된 광산 개시제가 극한 민감도를 필요로하는 포토레지스트에서 광범위하게 사용된다.
단일 샌드위치-복합체가 슬립칩 상에서 명확하게 관찰가능한 시그날을 제공할 수 있고, 예를 들면, TBI 바이오마커 (즉, UCH-L1)을 위한 면역분석법이 단일 분자 수준까지 검출하기 위하여 사용될 수 있다.
확률론적 한정은 포획 항체를 포함하는 슬립칩 영역에서 분석체의 단일 분자를 단리하: 예를 들면, 0.5 pL 체적의 1000 영역을 갖는 장치는 0.2-200 pM 범위에서 단일 분자의 검출이 가능하게 한다. 포획 효능은 세정 전후에, 예를 들면, 형광 현미경 시스템을 사용하여 바이오마커-함유 영역을 추적하는 것에 의해, 예를 들면, 형광 양자점(QD)으로 라벨된 타겟 바이오마커를 사용하여, 결과를 계산된 예측값과 비교하는 것에 의해, 평가될 수 있다. 예를 들면, 하나의 바이오마커 분자 및 0.1 μm 포획 항체 (Kd = 1 nM)를 포함하는 1 pL 영역은 99%의 효능으로 바이오마커를 포획할 것으로 예측된다. 사용자는 다른 QD로 측정 항체를 라벨할 수 있고, 그리고 즉시 결합을 시각화할 수 있다. 사용자는 면역-샌드위치 복합체의 형성을 정량화하고 검출 항체의 배경 오프-타겟 결합을 정량화하기 위하여 두 라벨의 공동국소화(colocalization)를 측정할 수 있다. 이것은 낮은 배경으로 단일-분자 결합을 최적화되도록 분석 조건(농도, 버퍼, 표면 화학물질 등)을 변경하는 것에 의해 정량화를 가능하게 한다.
단일 분자 측정은 종종 높은 배경 및 단일 분석체 분자로부터의 약한 시그날의 문제점을 갖는다. 확률론적 한정은 양성 영역에서의 시그날 강도를 증가시킬 수 있으나, 검출 항체(배경 결합)의 비-특이절 결합으로 인해 긍정 오류의 수를 반드시 감소시키는 것은 아니고, 상술한 바와 같은 통상적인 방법을 사용하여도 완화될 수 있는 것이 아니다. 배경 결합을 감소시키기 위한 용액은 자성 비드에 검출 항체를 부착하기 위한 것으로, 이는 비결합 항체가 영역으로부터 더욱 쉽게 제거될 수 있도록 하고, 제거가 음파 기술을 사용하여 더욱 강화될 수 있도록 한다. 높은 배경 시그날을 갖는 어플리케이션의 경우, 두개의 검출 항체들의 공동국소화를 사용하는 것에 의한 동시 검출이 배경 시그날을 바로 측정하고 교정하기 위하여 사용될 수 있다.
분석체의 단일 분자로 영역을 로딩하고 예상된 항체 결합을 얻은 이후에, 증폭 화학이 수행될 수 있으며, 그 다음 사용자는 버퍼에서 및 인공 플라스마에서 전체 면역분석법을 평가할 수 있다. 사용자는 면역-샌드위치 복합체로부터 시그날 분자를 단리하고, 선택된 증폭 화학을 사용하여 증폭하고, 그리고 양성 영역의 수를 계산하기 위한 이미지를 위하여 시료를 확률론적으로 한정할 수 있다. 사용자는 농도의 범위를 통해 예상된 결과로부터 민감도, 특이도, 선형성 (또는 일반적인 투여량-반응 관계)를 평가할 수 있다.
사용자는 단일 분자의 존재 및 위치를 확인하기 위하여, 선-증폭 시각화를 적용하는 라벨된 바이오마커를 사용할 수 있다. 얼마나 많은 항체 함유 영역들이 시각적 시그날을 초래하고, 얼마나 많은 빈 영역들이 시각적 시그날을 초래하는 여부에 대한 추적으로 시스템의 수행능력을 정량화할 수 있다.
상기 슬립칩 단일-분자 접근법은 배경 결합으로 인해 시그날을 감소시키고 온-타겟 결합, 배경 결합 정량화로부터 배경 결합을 바로 구별하기 위한 일치된 관측을 위하여 사용될 수 있다. 사용자는 타겟 바이오마커(예를 들면, 3개의 항체가 UCH-L1 (Banyan Biomarkers))의 세개의 다른 에피토프를 위해 이용될 수 있다)의 두개의 다른 에피토프에 대한 다른 형광물질로 라벨된, 두개의 검출 항체를 사용할 수 있고, 두개의-색채 관측을 사용할 수 있다. 사용자는 적절한 형광 현미경을 사용한 직후, 두개의 색채 시각화 판독정보 또는 통상적인 (예를 들면, PCR 이후에 색채를 발생시키기 위하여 고추냉이 퍼옥시다아제 및 글루토스 옥시다아제의 포획을 필요로 하는) 판독정보를 제공하기 위하여 증폭하는 것에 의해 동시 검출을 할 수 있다. 배경 결합은 포아숑 분배에 의해 예측되는, 낮은 일치도를 갖는 시그날을 제공한다. 온-타겟 결합은 상기-랜덤한 일치(예를 들면, 25-영역 칩에서도 >98%의 침화도)를 쉽게 구별가능하다. 단일-분자 일치 검출 없이도, 이러한 시그날은 검출 항체를 위한 5 단위의 결합을 갖는 경우에는, 구별불가능한 것으로 보일 수 있다. 필요한 경우, 배경 시그날은 근접한 태그에서만 시그날을 생산하는 것에 의해 낮아질 수 있다. 예를 들면, 형광 공명 에너지 전달 또는 형광 교차-상관 분광학은 검출체에 결합될 때, 두개의 압타머가 인접한 경우에만, 롤링 원형 증폭(RCA)을 초기화하는 한쌍의 검출 암타머를 특징화하기 위하여 사용될 수 있다.
인간 시료는 플라즈마 내의 많은 다른 물질, 및 다른 인간 시료내에서의 다양한 배경 농도로 인해 비특이적 결합 보다 더 높은 배경 시그날을 가질 수 있다. 사용자는 단일-분자 형광 현미경 측정으로 사용하여 결합이 특이적으로 발생한다는 것을 확인한 후, 시각적 판독결과를 얻기 위하여 증폭 화학을 적용하는 것에 의해, 플라즈마 시료내의 바이오마커를 위한 단일-분자 면역분석을 수행할 수 있다.
사용자는 예를 들면, 서브-나노미터 체적에서, 다중 단계 증폭 이후에 단일 분자들의 수를 계산하는 것에 의해 인간 시료내의 바이오마커를 정량적으로 측정할 수 있고, 시각적 판독정보로 분석할 수 있다. 사용자는 항체 대신에 압타머를 사용할 수 있고, PCR 대신에 등온 증폭을 사용할 수 있으며, 현장 상태 하에 분석하기 위한 기술 장치, 및 분석 결과를 해석하고 조치를 제안하기 위한 커뮤니케이션 장치용 디자인 소프트웨어를 사용할 수 있다. 상기 슬립칩은 또한 약물 발견, 예를 들면, TBI, 및 바이오마커의 발견 및 테스트를 가속화시킬 수 있다. 그것의 높은 민감도는 침, 소변 또는 눈물과 같은 더 접근가능한 유체에서의 바이오마커의 개발에 사용될 수 있다. 이것은 또한 mRNA 또는 miRNA와 같은 비-단백질 바이오마커의 검출을 가능하게 한다.
상기 슬립칩에 대한 특정 실시예에서, 추계적인 컨파인먼트는 비-특이적 바탕 보정으로 비특이 결합의 높은 수준을 갖는 시료를 정량화할 수 있도록 동시 검출과 결합될 수 있다. 노이즈의 증폭을 제거하기 위하여, 사용자는 오직 임계치 수치 보다 큰 입력 시그날만 더욱 증폭하기 위하여 임계치를 도입할 수 있다.
특정 실시예에서, 상기 슬립칩은 다른 미생물을 사용하여 조합적 바이오촉매를 위해 사용될 수 있고, 이는 극한 미생물을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 많은 연구원들은 일반적인 친열성 미생물(약 45 °C 내지 약 80 °C)을 관찰하기 위하여 플레이트 분석을 사용하는 반면, 초호열성 미생물(약 80 내지 약122 °C)의 경우, 아가 배지의 증발 및 융해으로 인해 표준 플레이트 실험을 수행하기가 어렵다. 가장 널리 알려진 초호열성 미생물은 혐기성, 황 요구 및 낮은 성장율을 가지는 유기체이다. 상기 슬립칩은 친열성미생물 및 초호열성 미생물을 포함하는 많은 유기체를 배양하기 위하여 사용될 수 있다. 초호열성미생물에 의해 수행되는 많은 바이오촉매 반응으로는 바이오매스 분해(예를 들면, 셀룰라아제 생성 및 반응을 할 수 있는) 반응이 있다. 상기 슬립칩은 군집-기재 배지를 관찰하거나 배양하는 효소를 위해 사용될 수 있다.
하기의 특허 및 출원은 본 명세서에서 참고로서 원용된다: US 12/257495 “Automated analyzer for clinical laboratory”, US 12/411,020 “Integrated microfluidic assay devices and methods”, US 3,996,345 “Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays”, 5,686,315 “Assay device for one step detection of analyte” 및PCT/US2007/20810 “Integrated microfluidic assay devices and methods”.
특정 실시예에서, 상기 슬립칩은 세포-세포 통신 장치로 사용될 수 있는바, 여기서 표면은 윤활액 대신에 반응 유체에 의해 젖을 수 있다. 표면을 따라, 나노패턴화될 수 있는, 매우 얇은 덕트에 의해 연결된 영역은 접촉 없이 세포-세포 통신을 관찰하거나, 또는 예를 들면, 시료 준비 및 비드-기재 화학을 위한 용액(하나의 영역으로부터 다른 영역으로 흐름이 유도되는 경우)을 여과하기 위하여 사용될 수 있다. 일 예에서, 두 표면은 친수성일 것이나, 다른 예에서, 한 표면만 친수성일 수 있다. 친수성 나노패턴이 사용될 수 있다.
슬립칩에 대한 특정 실시예는 예를 들면, 화학 전극을 포함하는, 어느 플러그 제조 시스템 또는 장치로부터의 플러그를 분석하기 위하여 사용될 수 있다. 상기 슬립칩에 대한 특정 실시예에서 시약은 윤활제 또는 캐리어 유체에 담궈질 수 있다. 상기 슬립칩에 대한 특정 실시예에서 단백질 흡착은 예를 들면, 형광 수용성 계면활성제를 사용하여 표면 화학을 조절하는 것에 의해 경계면에서 컨트롤될 수 있다. 상기 슬립칩에 대한 특정 실시예는 오염의 위험 없이 시약을 저장하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 슬립칩은 개방 및 폐쇄 장치일 수 있다. 이것은 희귀 세포, 입자 및/또는 비드 전달 세포 또는 목적 분자를 큰 체적 없이, 단리하고 분석하기 위하여 사용될 수 있다. 이것은 많은 종류의 세포와 관련된 것으로, 순환 제포, 체액 내의 미생물 세포, 다른 세포들의 정제물을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 이것은 많은 다른 접근법을 사용하여 수행될 수 있고, 표준 정량 및 포획, 포획하기 위해 사용되는 개방 슬립칩, 및 이후의 가공을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 슬립칩의 일 플레이트는 몇몇의 목적 세포만으로 큰 체적을 분석해야하는 문제를 해결하기 위하여, 필터로서 또는 포획 표면으로서 작용할 수 있다. 그러한 장치는 예를 들면, 재채기 동안 발생되는 박테리아 및 바이러스의 에어로졸, 또는 종양 및 생검에서와 같이, 세포들 사이의 공간적 관계의 트랙 손실 없이 시료를 분석하고자 하는 소비자로부터의 조직 슬라이드를 로딩하기에 어려울 수 있는 시료의 분석을 위해 사용될 수 있다. 게다가, 사용자는 (예를 들면, DESI 및 MALDI 기술에 의한 슬립칩의 영역의 분석을 포함하는, 질량-분석) 직접 평가로부터의 이익을 얻을 수 있는 방법에 의해 분석을 위해 칩을 개방할 수 있다. 스립칩은 관통할 수 있는 물질 (PDMS, 폴리우레탄, 다른 엘라스토머, 및 3M에 의해 제조된 밀봉 테잎)을 사용하여 제작될 수 있고, 영역의 내용물은 바늘로 물질을 찌르는 것에 의해 직접 평가될 수 있다.
본 발명의 특정 실시예에서, 표면 장력이 누출을 예방(“표면 장력 밀봉”)하기 위하여 사용될 수 있다. 장치의 두개의 할브예를 들면, 플라즈마 처리를 위해 사용하는 매우 소수성으로 만들어진 플라스틱으로 제조될 수 있다. 칩을 둘러싸는 폐쇄로는 친수성으로 만들어질 수 있다. 소수성 영역은 소수성 액체로 젖을 수 있다. 증발을 예방하기 위하여, 적당한 영역과 접촉하는 액제 저장소가 존재할 수 있다. 슬립칩의 두 할브는 서로 조여질 수 있고, 칩에 첨가되는 수용액은 모세압으로 인해 플레이트 사이에서 누출되지 않을 것이다. 이와 마찬가지로, 소수성 수용액은 친수성 층에 의해 멈추게된다. 장치가 견딜 수 있는 최고 압력은 모세압에 의해 조절될 것이다.
슬립칩의 두 측면이 서로 조여질 때, 층이 얇은 경우에는, 표면 전체에 불균일한 압력이 적용되는 것이 바람직하다. 미리-염색된 홀딩 장치의 경우, 상기 슬립칩은 매우 얇게 만들어지고, 공장에서 서로 미리-조여질 수 있고, 그리고 벗겨질 수 있다. 선택적으로, 두개의 단단한 유리 슬라이드가 홀더로서 사용될 수 있고, 필요한 경우 이미지화가 그것 전체에서 수행될 수 있다. 유리 슬라이드는 x-ray 회절이 수행될 경우 제거될 수 있다. 그러나, 특정 실시예에서, 조이는 것은 불필요하다. 예를 들면, 두 유리 슬리이드가 만약 젖는 경우, 서로 매우 단단하게 붙게 되고, 이와 마찬가지의 원리가 슬립칩의 층이 서로 유지될 수 있도록 사용될 수 있다. 대향하는 표면이 단단하고 평평한 경우, 매우 높은 모세압이 생성되고, 그리고 슬라이드가 분리될 때, 접촉은 큰 힘을 필요로하며, 동시에 큰 영역 전체가 분해되어야 한다. 적용은 예를 들면, 막 단백질 결정화를 위한 단백질 결정화를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
시료의 정확한 측정이 바람직한 특정 슬립칩 어플리테이션에서, 웰은 넘치게 채워질 수 있고, 초과량은 인접 층에 의해 밀릴 수 있다. 선택적으로, 상기 장치는 많은 통로 세트를 가질 수있고, 여기서 정제 및/또는 분석을 위한 각각의 통로는 예를 들면, 5 μL를 흡수할 수 있고, 사용자가 시료를 장치로 로딩할 때, 우선 5 μL가 채워지고, 그 다음 또 채워진다. 그러한 장치는 예를 들면, 플라즈마의 10 μL 및 50 μL 상의 정량적인 분석을 하기에 강건한 시스템을 갖는다.
본 발명의 특정 실시예에서, 상기 슬립칩은 원심분리 튜브 내에 있을 수 있다. 이러한 종류의 장치는 슬립칩을 원심분리 튜브의 하단부에 결합시키는 것에 의해 세포/입자의 재농축을 위해 사용될 수 있다.
화학 전극, 2-상 층 흐름에 의지하는 마이크로유체 장치는 반복된 시료를 요구하고 분석을 위해 그것들을 유지할 수 있다. 화학 전극은 전극(시그날 전달 및 기록) 처름 수행하지만 전기적 신호 대신에 화학적 신호를 사용하는 마이크로프로브일 수 있다. 단리된 영역내의 조직으로부터의 분비를 샘플링하기 위한 화학 전극, 및 흙 부유물을 샘플링하기 위한 바늘-형 화학전극이 증명되었다.
화학 전극은 단일-분자 방법 수준에서 동시 칩-기반 나노리터 분석과 호환가능하고, 많은 작은 체적들을 샘플링하고 단일 동물로부터 분석할 수 있다. 대사 마커 인슐린의 단일-분자 검출은 경쟁적 면역분석법 및 형광 상관 분광학(FCS)을 사용하여 달성될 수 있다. 화학적극에 의해 얻어진 액적들은 또한 슬립칩 상에서 분석될 수 있다. 분석을 위해 FCS 또는 SlipChip과 결합된, 화학 전극은 정량적인 분석을 위해 생존 동물로부터의 바이오유체를 연속적으로 샘플링할 수 있다.
상기 슬립칩에 대한 특정 실시예는 바이오마커의 검출(예를 들면, TBI 바이오마커)에 요구되는 피코모랄 수준에서 다중-단계 면역분석법을 수행하기 위하여 화학전극으로부터 많은 나노리터 체적을 가공할 수 있다.
상기 슬립칩의 특정 실시예는 현장 진료(POC)에서 저렴하고 단순한 HIV 바이럴 로드를 측정하기 위하여 사용될 수 있다. 그러한 테스트는 자원이-한정된 상황에서 항레트로바이러스 치료중인 환자를 적절히 진료하고, 그리고 HIV의 내약물성 균주의 세계적인 확산을 조절하기 위하여 긴급하게 요구된다. 정량적인 예스/노 진단 툴의 수가 개발되어 있으나, 여전히 자원-한정된 상황에서 정량적인 바이러스 로딩량 측정에 대한 미충족 요구가 존재한다. 실-시간 판독기를 갖는 PCR-기반 분석법은 정량적이지만, 이러한 분석법은 자원-제한된 상황에서 POC를 위해 매우 복잡한 기구 및 환경을 요구한다. 또한, 플라즈마로부터 바이러스 RNA를 단리하고 농축하는 것은 대부분의 POC 접근에의 도전에 직면하고 있다. 슬립칩에 대한 특정 실시예는 동시에 많은 유체 체적을 조작하기 위한 복잡한 프로그램(알고리즘)을 암호화한다. 슬립칩에 대한 특정 실시예는 서로에 대하여 움직이거나-또는 “미끄러지는”- 시료 유체와 불혼화성인 휘발성 유체에 의해 윤활되는- 두개의 플레이트으로 이루어지고 또한 표면 화학 컨트롤을 제공하고 교차-오염을 예방한다. 상기 프로그램은 시약을 포함하는 영역의 패턴으로 플레이트로 암호화되고, 그리고 미끄러지는 것에 의해 실행된다. 슬라이딩은 진단 분석을 수행하기 위한 접촉을 반복하는 두개의 플레이트로 영역(또는 웰)을 제공한다. 다수의 크기, 예를 들면, 100 pL 내지 100 μL의 조작이 동일한 칩에서 수행될 수 있다. 그러한 슬립칩은 바이러스 RNA를 단리하고 농축하기 위한 업스트림 시료 준비의 통합을 용이하게 하고, 예를 들면, 휴대폰 카메라로 찍히는 이미지로 시료를 해독가능하게 하는 다운스트림 시그날 증폭으로 “디지털”(단일 분자) 검출을 사용하여 핵산 증폭을 통해 바이러스 입자들의 정량화를 가능하게 한다.
인도와 나이지리아에서 주로 발견되는 A, C, 및 G 아형을 포함하는 다양한 HIV-1 아형을 목표로 할 수 있다.
현재 이용 가능한 정성적 POC 진단 테스트들은 필요한 정량적 모니터링에는 적합하지 않다. 상기 HIV 항체 테스트를 자원 한정 세팅에서 쉽게 사용 가능한 딥스틱(dipstick) 포맷에 합체해 왔다. 하지만, 이 테스트는 환자의 혈청상태에 대한 정보만을 제공하므로, HIV 항레트로바이러스 치료 (ART)의 효과를 반영하지 않는다. 상기 p24 항원 테스트는 낮은 민감성을 가지며 매우 높은 수준의 HIV 바이러스혈증에서만 (>105 입자 /ml) 기능함에 따라, ART를 모니터하는 데에 사용할 수 없다. CD4 세포 계수법들은 현재 널리 이용가능하지 않으며, 상기 계수가 수많은 질병에서 낮을 수 있고, HIV 감염을 반영하지 못할 수도 있다. 또한, HIV 바이러스 역학 및 치료 내성이 추론될 수도 있는데, 이는 CD4 계수가 느려서 더 신속한 시간스케일에서 벌어지는 바이러스 로드 변화를 반영하기 때문이다. Cavidi AB로부터의 ExaVirLoad가 자원 한정 세팅에서 가능성이 있지만, 테스트에 약 3일이 걸리고, 비싸고, 이를 확립된 임상 실무에 연계시키기 위해서 추가적인 입증 부담이 있다.
핵산 테스팅에 의해서 HIV 바이럴 로드를 정량적으로 특정하는 데에는 자원 한정 세팅이 긴급하게 요구된다. ART의 주된 목적은 가능한한 오랫동안 가능한 많이 혈장 내 HIV RNA 수치를 떨어뜨리도록 제형화되는 것이다. 여기에는 정량화, 즉 현재 중앙 실험실들에서의 자동화 기계 상에서 실시간 역전사효소-폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR)에 의한 직접 핵산 테스팅 (NAT), 핵산 서열 기반 증폭 (NASBA), 및 전사-매개 증폭 (TMA)을 기반으로 하는 것이 필요하다. HIV 바이럴 로드의 정량화는 언제 HIV 항레트로바이러스 약물 치료를 시작할지 가이드하고, 달성된 초기 항레트로바이러스 효과의 정도에 대한 정보를 제공하고, 질병 진행의 위험을 수집하고, 언제 다른 ART 요법으로 바꿔야 할지를 결정하는 데 도움을 주기 위해서 사용된다.
현재, 본 명세서의 다른 부분에서 설명된 것과 같이 자원 한정 세팅에서 사용 가능한 아무런 HIV 바이럴 로드 정량화 플랫폼이 없다. 바람직한 장치는 수많은 바람직한 특성을 가진다: 바이럴 로드를 측정하기 위한 넓은 동적 범위, 예를 들면 혈장 내 500 내지 1,000,000 입자/mL; 예를 들면 전혈 또는 혈장의 100-200 μL 사용; 예를 들면 90-95% 가능성을 가지면서 바이럴 로드의 예를 들어 3-5 배 변화를 구분하기에 충분히 정량적임; 사용이 간편함; 예를 들면 2-4 시간 (1회 방문 이내) 미만 만에 결과 제공; 매우 간단하고 강건한 장치 요구; 및 단순한 판독 보유.
디지털 직접 핵산 테스팅 (NAT)은 기술적 진보로, DNA 또는 RNA 수치를 더욱 높은 민감도로 정량화할 수 있게 하며, 실시간 판독을 필요로 하지 않는다. 특정 적용 예들의 경우, 실시간 RT-PCR은 정확한 바이럴 로드를 제공하며, 사용 가능하지만, 다른 예들의 경우에는, 요구되는 숙련도와 장치 측면에서 너무 복잡하다. 실시간 측정 요건 없이 정량적 결과를 얻기 위해서는, 단일 분자 검출은 바람직한 것으로 나타났다. 디지털 NAT는 단일 카피의 핵산을 일련의 적은 체적에 한정하고 가시화하는 개념에 기초하는 것이다. 핵산 산물을 생성하는 적은 체적의 개수는 원래 시료에 존재하는 분자의 개수와 직접 연관되며, 결과를 더욱 정량적으로 만들어준다. 높은 배경을 가지는 시료의 검출 민감도는 디지털 플랫폼들에서 증가되는데, 오염원들을 막는 것과 별개로, 검출 중인 각각의 분자가 개개의 소형 체적으로 나눠 들어가기 (또는 확률론적으로 한정되기) 때문이다.
본 슬립칩의 특정 실시예들에서는 소형 (예를 들면 피코리터 내지 나노리터) 유체 체적들의 많은 수를 외부 장치화 없이 평행하게 구획화하는 단순한 방법을 제공한다. 본 슬립칩은 자원 한정 세팅에서 HIV 치료 및 진단을 위한 디지털 NAT를 수행하는 데에 사용될 수 있다. 본 슬립칩의 특정 실시예들은 수천 나노리터 반응기 챔버를 형성하면서, 값비싼 펌프-기반으로 채우는 시스템을 요구하지 않으며 - 일련의 연결 웰(well)들은 단일 피펫팅 단계에 의해 간단하게 채워질 수 있고, 웰들은 이어서 하나의 플레이트에서 옆에 있는 다른 것으로 미끄러지면서 개개의 나노리터 반응기들로 분리된다. 본 슬립칩은 매우 다중화될 수 있지만 밸브가 필요하지 않다.
본 슬립칩의 특정 실시예들에서는 민감한 분석 및 열적 사이클링 동안 필요한 엄중 조건 하에서조차 모든 반응들의 구획화를 유지한다. 웰들의 기하학적 구조를 변경함으로써, 액적을 윤활유에 에워싸진 채로 웰 속에 부유시킬 수 있다. 특정 실시예들에서, 열적 사이클링과 연관된 온도 변화 중에, 유체가 팽창하지만 PCR 반응을 함유하는 액적은 웰에서 누수되지 않는다.
본 슬립칩의 특정 실시예들은 분리된 단계들에서 다중 시약들을 모든 구획화된 반응 체적들에 외부 장비나 교차 오염 없이 이웃하는 반응 체적들 사이에 평행하게 첨가하는 것을 촉진하며, 그것은 디지털 등온 NAT 및 NAT 판독의 이어진 증폭 모두에 바람직하다. 등온 NAT는 자원 한정 세팅에서 바람직한데, 그것이 열적 사이클링을 필요로 하지 않으면서, 주된 장비 요소에 대한 필요성을 제거하기 때문이다. 하지만, 현재로는 POC로서 상업적으로 이용되고 있지 않은데, 증폭 반응 개시를 제어하기가 기술적으로 곤란하기 때문이며, 반응은 상기 POC 혼합물을 주형 RNA와 혼합하자마자 즉시 개시된다. 증폭이 디지털 플랫폼으로의 시료 로딩 전에 시작하기 때문에, 디지털 판독은 RNA의 본래 표적 농도를 반드시 정확하게 반영하는 것은 아니다. 주형 핵산이 확률론적 한정 이전에 증폭될 때, 위-양성(fals positive)이 생긴다. 본 슬립칩의 특정 실시예들은 이 문제를 해결한다. 먼저, 시료를 함유한 웰들을 시약을 담은 웰들과 접촉하도록 슬라이딩시킴으로써 상기 RNA 주형을 로딩한 후에 시약을 사용자가 특정한 시작 시간에 즉시 첨가할 수 있다 둘째, 디지털 PCR은 종말점(end-point) 판독을 활용할 수 있어서 반응시간이 중요하지 않다. 추가로, 이웃하는 반응 체적들 간에 교차 오염이 없다. 본 슬립칩은 반응 체적들을 다양하게 하는 조작을 촉진하는바, RNA 동정에 바람직하다. 본 슬립칩은 웰 직경을 다양하게 하고 깊이를 다양하게 하면서 어떤 기하학적 구조로도 제조될 수 있는데, 예를 들면 수 마이크론부터 밀리미터에 이르는 깊이로 가능하다. 단일 핵산을 함유하는 각각의 반응 체적은 진정으로 디지털하게 해석될 수 있다. 형광 판독을 사용하는 것의 대안으로서, 비색 효소 증폭 반응을 사용하여 NAT 산물을 검출할 수 있다. 또한 본 슬립칩은 복수 시약을 전체 반응 체적들에 동시에 첨가하는 것을 가능하게 할 수 있다.
본 슬립칩의 특정 실시예들에서, 분자 또는 바이러스 입자는 자성 비드에 의해 포획되고, 큰 체적에서 작은 체적으로 자석을 이용해서 당겨져서, 온-칩 농도를 실현할 수 있다. 유사하게, 작은 체적들은 큰 체적들로 첨가되어서, 온-칩 희석을 실현할 수 있다.
본 슬립칩의 특정 실시예들에서 계면 화학은 상기 윤활유와 상기 반응 유체의 계면에서 제어되어서, 제조를 단순화시킬 수 있다. 두 가지 혼화성 액체 간의 계면 화학은 예를 들면 계면활성제의 첨가에 의해 제어 가능하다. 일부 슬립칩에 사용된 윤활유는 이전의 액적-기반 작업에서 사용된 담체 유체와 동일하기 때문에 (예를 들면, US 7,129,091, 및 PCT/US2009/046255 참고, 둘다 여기에 참조문헌으로 원용됨) 상기 계면 화학은 유사한 방식으로 제어 가능하다. 비-불화 윤활유 (미네랄 오일 등)의 경우, 계면활성제를 수용성 반응 유체에 첨가할 수 있으며; 불화 윤활유의 경우, 불화 오일-용해성 계면활성제를 상기 윤활유에 첨가할 수 있다. 본 슬립칩에 사용된 다양한 윤활유의 예시에는 단일 분자 PCR 슬립칩용 미네랄 오일과, pM 검출 한계를 수행하는 면역검정용 슬립칩용 불화 오일이 있다.
슬립칩 용으로 가능한 표면 처리에는, 디클로로디메틸실란 (유리 장치에 적합함)과 기체상 실란화가 있지만, 이에만 한정하는 것은 아니다.
균일한 웰 체적을 가진 유리 슬립칩은 예를 들면 5,000 내지 100,000 HIV 입자/mL 검출의 동적 범위를 가질 수 있다. 이러한 설계의 장점은 같은 용액으로 로딩될 때 모든 웰이 동일한 복제품이라는 것인데, 체적 대비 표면 비율이 일정하게 유지되기 때문이다. 하나의 실험에서, 균일한 웰 체적을 갖는 슬립칩에 로딩된 염료는 3.2%의 변동 계수를 가졌다. 균일한 웰 장치는 예를 들면 본 슬립칩의 상부 요소에 640개의 기다란 웰과 하부 요소에 640개의 기다란 웰로 이루어진 1280개의 반응 체적을 가져서, 공간을 보존할 수 있다. 상기 기다란 웰들은 초기에 겹쳐서 채울 수 있다. 채운 후에, 상기 기다란 웰들은 예를 들면 미네랄 오일을 함유하는 원형 웰들 위로 미끄러질 수 있다. 이 설계는 미끄러질 때 미네랄 오일의 체적에 의해 에워싸여진 액적의 형성을 촉진한다. 상기 액적은 가열시 팽창해서, 본 슬립칩의 두 개의 플레이트들 사이에 미네랄 오일을 배치하고, 수용액 상이 웰 밖으로 누수하지 못하게 하고, 열적 팽창에 의한 교차 오염을 막을 수 있다. 각각의 원형 웰은 예를 들면 50 μm 직경과 깊이일 수 있다.
본 장치는 표준 포토리소그래피 및 습식 화학 에칭 기술을 이용해서 유리로 만들어질 수 있다. 표면 화학은 실란화, 예를 들면 PCR에 친밀한 디클로로디메틸실록산에 의해서 본 슬립칩의 표면에 소수성을 부여함으로써 제어 가능하다. 미네랄 오일은 본 슬립칩의 두 개의 플레이트들 사이의 윤활유로서 사용 가능하고, 반응 혼합물을 담은 수용성 상을 에워싸는 습윤층으로서 사용 가능하다.
상업적으로 구득 가능한 HIV 표준 (HIV-1의 8E5 LAV 삭제 돌연변이 균주)와 생성물 검출용 EvaGreen 염료와 함께 상업적으로 구득 가능한 Promega사의 Access RT-PCR 키트를 사용 가능하다. HIV-1 장-말단 반복 (LTR) 영역의 증폭을 위한 프라이머를 사용할 수 있는데, 이것은 모든 HIV-1 아형들 사이에서 M, N, O 그룹으로 보존되는 서열을 포함하고 있다. 이들 프라이머은 인도와 나이지리아에서 발견된 모든 HIV-1 아형 (A, C, G) 뿐만 아니라 미국에서 우세한 아형 (B)을 증폭시키기에 적합하다. 상기 프라이머들은 다음과 같다: A1352 센스, Los Alamos HIV 서열 데이터베이스의 공개된 서열 배열에서 607번 위치, GRAACCCACTGCTTAASSCTCAA; A1355 안티센스, 708번 위치, GAGGGATCTCTAGNYACCAGAGT.
하나의 실험에서, 1280개 웰들을 신뢰성 있게 채우는 것은 초기 시료 6.5 μL를 사용해서 달성했고, 재생 가능한 디지털 판독이 PCR과 RT-PCR 모두에 제공되었다. 1280-웰 슬립칩은 스타필로코커스 아우레우스 지노믹 DNA를 사용하는 디지털 PCR에 맞게 특성화되었다. 결과는 재생 가능하고 정량적이었다. 추가로, 하나의 실험에서는 HIV-1의 8E5 LAV 삭제 돌연변이 균주와 A1352 및 A1355 센스 및 안티센스 프라이머를 사용하는 RT-PCR의 생화학이 디지털 슬립칩 플랫폼과 상용 가능하다는 점을 언급하였다.
내부 제어가 본 슬립칩 속에 형성되어서, 상기 계(field)에서 얻어지는 결과를 평가할 수 있다. 예를 들면, 100개 웰을 플라이머와 함께 사전 로딩해서 시료에 첨가될 수 있는 컨트롤 RNA를 검출할 수 있다. 상기 프라이머들은 본 슬립칩의 두 개의 플레이트를 조립하기 전에 수작업이나 단순 로보틱스로 처리될 수 있다.
하나의 칩 상에 복수 반응 체적을 생성하는 원형 슬립칩의 하나의 실시예가 설명되었다. 이 디자인의 장점은 동적 범위가 예를 들면 500 내지 1,000,000 HIV 입자/mL의 검출 범위를 덮을 수 있다. 특정 실시예들에서, 웰들은 초기에 덕트들을 겹쳐서 채워질 수 있게 하고, 그런 다음 장치를 회전시켜서 개별적인 반응 체적들로 미끄러진다. 이 슬립칩에 대한 예시적 크기는 200 nL 체적의 128개 웰 (39 - 1667 RNA 분자/mL), 20 nL 체적의 128개 웰 (391 - 16667 RNA 분자/mL), 2 nL 체적의 256개 웰 (1953-166,667 RNA 분자/mL), 및 0.5 nL 체적의 512개 웰 (7813 - 1,333,333 RNA 분자/mL)이다. 이러한 웰 사이즈들은 더욱 크고 더욱 작은 체적들의 동적 범위에서 중첩으로 인한 본 슬립칩의 내적 동질성을 확인할 수 있게 한다. 본 장치는 내적 제어수단들을 통합할 수 있다.
이러한 장치는 대안으로서, 수용성 시료 용액 내 계면활성제를 사용하거나, 미네랄 오일 대신 불화 오일을 사용할 수 있다.
특정 실시예들에서, 온-칩 시리얼 희석에 의해서 균등하게 큰 동적 범위를 달성하는 것이 바람직할 수 있는바, 이것은 특정 실시예들에서는 더욱 큰 웰들을 포함하고 있다. 이 디자인에 대한 예시적인 크기는 각 열에 100개 웰을 포함하는 5개의 열이고, 20 nL의 시료를 담지하는 얕은 웰이 180 nL 희석 버퍼를 담은 사전 로딩된 웰 위로 미끄러져서, 각 슬립마다 10배 희석을 달성한다.
슬립칩은 많은 재료로 만들어질 수 있는데, 예를 들면 유리, 폴리카보네이트, 폴리프로필렌 및 기타 플라스틱류가 포함된다. 폴리프로필렌과 폴리카보네이트는 PCR과 상용 가능하다고 알려져 있다. 플라스틱 장치들은 다양한 표면 피복, 계면활성제 및 오일로 피복될 수 있다.
본 슬립칩의 특정 실시예들은 역전사효소 (RT)에 의해 cDNA로의 HIV RNA 전사의 개시 및 후속 증폭 반응들을 제어하기 위해 이용 가능하다. cDNA 합성 및 증폭의 개시는 본 슬립칩의 상부 요소에 반응 혼합물과 주형 RNA를 함유하는 웰들을, 본 슬립칩의 하부 요소에 사전 로딩된 마른 프라이머들 위로 슬립시켜서 제어된다. 상기 프라이머들은 예를 들어 I.D. 50 μm의 Teflon 튜브를 사용해서 초기 테스팅을 위해서 예를 들면 수작업으로든지 단순한 로보틱스로 로딩될 수 있다.
다양한 박테리아 종을 검출하기 위해 프라이머들이 사전 로딩된 384-웰 슬립칩인 메티실린-저항성 스타필로코커스 아우레우스 (MRSA)를 메티실린-민감성 S. 아우레우스 (MSSA)로부터 구별해냈다. 본 슬립칩의 양 단의 두 개 컬럼에 pBad 프라이머를 사전 로딩하고, pBad 주형 DNA를 모든 웰에 양성 대조구로 로딩시켰다.
NASBA, 및 RT-RPA를 포함하여 등온 증폭 기술이 사용 가능하다. 이 증폭 기술들은 40 °C에서 동작 가능하다 (일부 POC 장치들에서는 더 낮은 온도가 바람직함): NASBA (생성물: RNA), RT-RPA (생성물: DNA), LAMP HIV-RNA 6-프라이머 세트 중 하나를 사용하는 RT-LAMP, 전사-매개 증폭 (TMA, 41 °C), 헬리카제-의존성 증폭 (HAD, 65 °C), 가닥-변위 증폭 (SDA, 37 °C),
POC에 바람직한 증폭 방법들은 주변과의 큰 온도 차이를 요하지 않는 것들이며, 하나의 혼합 단계에서 개시될 수 있지만, NASBA 및 RPA는 열에 불안정한 효소를 포함한다. 따라서, 표준 프로토콜에서 변성 단계를 제외시키고, 프라이머 어닐링 온도를 40 °C로 맞출 수 있다. 만약 특정 실시예들의 경우 40 °C에서의 어닐링이 보다 낮은 민감도를 제공한다면, 40 °C에서 효율적인 프라이머 어닐링을 보장하는 약한 이차 구조를 갖는 다양한 HIV-1 아형들에서 보존적인 지노믹 RNA에서 100-120개 뉴클레오티드 길이 증폭 표적을 선택할 수 있다.
하나의 실험에서, Mg2 + 용액을 슬립칩의 모든 웰에 사전 로딩시켰으며, 용액 내 RPA를 위한 모든 기타 시약들을 사용해서 남아있는 웰을 채웠다. 상기 키트에 제공되는 컨트롤 주형의 본래 농도는 2 몰/μL이었다. 약 500 μL이 분석되었다.
여러가지 진단 NAT 테스트가 내적 제어부를 관심대상 RNA와 동일한 튜브 또는 웰 속에 병합하고, 증폭된 표적 RNA를 인식하는 프로브의 것이 아닌, 다른 플루오로포어에 결합된 특정한 프로브를 사용해서 상기 내적 제어부를 정량한다. 예를 들면 HIV RNA와 혼합된 컨트롤 주형 RNA (예, 3,569 nt-길이 박테리오파지 MS2 지노믹 RNA)을 사용하는 내적 제어부와 전체 증폭 시약을 본 슬립칩 내로 병합할 수 있다. HIV 프라이머를 담지한 건조한 반응 혼합물을 갖는 칩 상의 웰의 4분의 3, 및 내부 컨트롤을 갖는 나머지 4분의 1을 사전 로딩하고, 예를 들면 SYBR Green 검출을 사용해서 HIV와 상기 내부 컨트롤을 정량함으로써 독립적으로 그리고 동시에 HIV RNA와 내부 컨트롤 주형을 분석할 수 있다.
가시적 판독이 특정 자원 한정 POC 세팅에서 바람직하다. 본 슬립칩을 변형해서 가시적 판독에 유용한 추가 단계들과 슬립들을 합체할 수 있다. 가시적 판독을 얻는 것은 핵산 생성물을 효소로 잡종화하는 것, 잉여 효소를 제거하기 위해 세척하는 것, 효소가 변환할 기질을 가시적 시그널에 첨가하는 것, 및 상기 가시적 시그널을 증폭하기 위해 인큐베이팅하는 것을 포함할 수 있다. 가시화를 더욱 쉽게 하기 위해서는, 웰 사이즈를 증가시켜서 더 많은 가시적 시그널이 생성될 수 있게 할 수 있다. 핸드폰 카메라는, 예를 들면 결과의 기록, 분석, 및 문서화를 보조할 수 있다.
단일 가닥 RNA (NASBA에 의해 생성됨)의 잡종화는 표면 부동화, 자성 비드 및 얕은 웰을 사용하는 하나의 단계로 이루어질 수 있다.
알칼라인 포스파타아제가 효소 기반 검출에 사용 가능하다. 알칼라인 포스파타아제는 가시화를 위해서 적절하게 설치된 BCIP/NBT ((5-브로모-4-클로로-3-인도일 포스페이트, 디소듐 염)/(니트로 블루 테트타졸륨 클로라이드)) 기질을 가진다. 이 기질은 효소 활성 부위에 매우 강한 청색 침전물을 형성한다. 특정 적용 예들의 경우, 예상되는 100 nM의 생성물 R/DNA은 상기 BCIP 기질을 용이하고 신속하게 소모할 수 있는 효소를 결합해서, 어둡고 쉽게 식별 가능한 시그널을 생산하기에 바람직한 대략 1 mM의 생성물을 생성한다.
더욱 큰 웰에서 작은 스팟으로 농축될 수 있거나, 은 증폭 (금 나노입자의 경우)을 사용하여 증폭될 수 있는 금 나노입자 또는 유색 자성 비드들도 강한 가시적 시그널을 생성하기 위해 사용 가능하다.
핸드폰 카메라는 간단한 소프트웨어를 이용해서 쉽게 데이터를 기록하고 신속한 분석을 제공해서, 원하는 정보를 계수하고 산출할 수 있다. 상기 카메라는 바람직하게는 스팟을 해상하고 식별할 수 있다. 예를 들면 1280 웰 레이아웃 상의 1 메가픽셀 카메라를 촛점을 맞추는 것에 의해서, 각각의 웰 이미지는 대략 80개 픽셀을 담고 있다. 2 메가픽셀 카메라를 사용하게 되면, 각 웰 이미지는 대략 200개 픽셀을 담는다. 픽셀 수는 신뢰할 만한 계수에 충분하다. 두 해상도 모두 많은 카메라에서 일반적인 수준이며, 자원 한정 세팅에서조차 쉽게 구할 수 있다. 가시적 시그널 현상 과정에서 상기 시료들이 더욱 큰 웰들에 전달되어서 검출을 촉진할 수 있다.
특정 적용 예들의 경우, 환자 혈액에 존재하는 적어도 40%의 초기 HIV 바이럴 로드, 또는 동정된 200 내지 400,000 몰 / mL에 상응하는 정제된 RNA의 최종 농도를 얻는 것이 바람직하다. 포아송 통계에 기반한 계산에 의하면, 환자로부터 초기 바이럴 로드를 500 내지 1,000,000 몰 / mL에서 신뢰할 만하게 정량하기에 40% 회수가 적절하다는 것을 암시한다.
예시적인 동정 프로토콜은 다음을 포함한다:
프로토콜 1: Modified Boom에 의해서 변성 염으로 바이러스 입자를 용리시켜서 혈장으로부터 RNA를 동정하고, 실리카 자성 비드 상에서 RNA를 트래핑하기 (MagPrep? beads, Merck KGaA).
프로토콜 2: Modified Boom에 의해서 변성 염으로 바이러스 입자를 용리시켜서 혈장으로부터 RNA를 동정하고, 철-산화물 비드 상에서 RNA를 트래핑하기.
프로토콜 3: 항체-피복 자성 비드 상에서 바이러스 입자를 포획해서 전혈로부터 RNA를 동정하고 (Viro-Adembeads, Ademtech, France), 연성 용리 공정 수행 (95°C에서 가열하거나 약 알칼리로 처리).
각 프로토콜의 경우, 슬립칩 상에서 세척 단계의 수를 둘로 줄일 수 있다.
실시예: 1280-웰 디지털 슬립칩에 사용된 HIV RNA를 얻기 위해서, 완전 용리, 담체 RNA, 실리카 미니컬럼을 포함하는, Qiagen QiaAmp 바이러스 정제 키트를 사용해서 Acrometrix OptiQual HIV-1 High Positive Control (1.7 x 106 돌연변이 HIV-1 입자 / mL; 18 pg HIV RNA / mL, 1OD260 = 37 μg / mL)로부터 HIV-1를 정제하였다.
원형 슬립칩 플랫폼에 대한 일실시예에서는 자성 캡쳐 비드를 사용하는 RNA 동정 프로세스의 모든 단계를 수용할 수 있다.
본 슬립칩의 특정 실시예들은 전혈 또는 혈장을 샘플링하고 HIV 바이럴 러드를 의미하는 측정 가능한 판독을 낳을 수 있다.
나노리터의 용액을 플라스틱 슬립칩 속의 플루오르화 탄소에 6개월 이상 보관할 수 있다. 블리스터 팩에 슬립칩을 보관할 수 있다. 예를 들면 Drierite-타입 코발트계 고체 건조제를 사용해서 물 흐름을 예측하고, 그리고/또는 슬립칩 영역들 사이의 건조한 경계를 생성할 수 있다.
슬립칩에 대한 특정 실시예들에서 시료는 커다란 웰에 미리 보관될 수 있다. 특정 실시예들에서, 상기 시료는 윤활 오일, 예를 들면 플루오르화 탄소 (FC) 또는 파라핀 오일에 의해 둘러싸이기 때문에, 증발이 억제된다. 입구를 통해서 압력이 인가될때, 시료는 막다른끝에 도달할 때까지 유로를 경유해서 웰 속으로 흘러간다. 상기 시료가 자동적으로 멈추게 되면, 상기 시료 웰들이 시약 웰들로 슬립해서 반응을 개시한다. 다양한 체적을 가진 수백개의 웰들을 로딩할 때, 모든 웰들이 채워지는지 확인하는 것이 바람직하다. 상기 막다른끝을 채우는 것이 그것을 촉진한다. 상기 막다른끝의 상류측 전체 웰은 완전히 채워지고, 사용자는 언제 중지할 것인지 결정할 필요가 없는데, 상기 시료가 상기 막다른끝에 도달하면 로딩 단계가 자동으로 멈추기 때문이다.
적층 가능한, 회전형 슬립칩 실시예에서는 모듈방식을 통해서 추가적인 가능성을 제시한다. 습식 및 건식 시약 등 다양한 시약 유형이 상기 회전형 장치의 다양한 층 상에 보관될 수 있다. 더욱이, 표준 구성이 사용된다면, 다른 회전 층을 시스템에 도입함으로써 다양한 검출 시스템들이 쉽게 혼합되고 간단하게 매치될 수 있다. 하기에 설명한 RNA 정제 횟수 또한 다른 분석 종류들에서 이용 가능하다.
채우는 방법들로는, 압력 구동 양호한 채움, 원심력, 및 막다른끝 충전이 있으나, 이에만 한정하는 것은 아니다.
특정 실시예들에서, 더욱 큰 웰에 첫번째 수집된 시료는 바람직하게는 가공을 위해서 두번째 단계로 전달된다. 막다른끝 충전에 의해 구동력과 정지 메카니즘 모두를 제공해서, 상기 시료를 전달하게 된다. 즉, 시료를 조절된 압력원에 연결함으로써 제1 층에서 제2 층으로 그것을 원하는 채널이나 웰로 구동시키고 나서, 끝단에 도달하게 되면 누수없이 자동으로 멈추게 된다. 제3 층에 있는 개구부에 연결될 때 재시작한다. 상기 압력원은 공기가 로딩된 시린지처럼 단순한 것일 수 있다. 이 방법은 회전형 시스템의 한 층 내를 채우는 것에만 한정하는 것은 아니다. 그것은 압력을 조절해서 구멍들을 통해서 다양한 층을 채울 수 있다.
본 슬립칩에 대한 특정 실시예들에 의하면 POC 진단용 용액 및 건조한 시약을 저장하기 위한 플랫폼을 제공한다.
실험들에서는 나노리터의 용액이 플라스틱 슬립칩에서 플루오르화 탄소에서 6개월 이상 동안 보관될 수 있다는 것을 보여준다.
수분 흡수는 외부 건조제를 첨가하거나, 건조 트랩을 습식 영역들과 건식 영역들 사이 칩 내에 첨가해서 플루오르화 탄소들을 통한 교류를 최소화시켜서 줄어들 수 있다. 대안으로서, 본 디자인을 변형해서 시약들이 건조하게 로딩되고, 상기 장치가 용매의 후속 첨가를 허용하는 구조가 되게 할 수 있다.
증폭 분석에 사용된 시약과 효소는 동결건조될 수 있는데, 선택사항으로 안정화제 존재 (예, 단백질:트레할로스:마니톨 비율을 1:20:100로 한 시점) 하에서 공지된 동결건조 방법을 사용할 수 있다. 시약들은 예를 들면, 건식으로, 미네랄이나 플루오르화 탄소 오일 하에서, 공기 상태나 진공 하 밀봉 상태에서 보관될 수 있다.
슬립칩의 가능한 설계: 4 적층 구조 (1 내지 4, 상부에서부터 표시함), 3 및 4층이 그런 것처럼 1 및 2층이 함께 슬립칩을 형성한다. 3 층으로 시료를 전달하기 위해서 2 층은 바닥에 구멍을 가진다. 상기 관통 구멍 입구 / 출구의 표준 위치들을 사용해서, 어떠한 두 개의 슬립칩이라도 서로 합체될 수 있게 할 수 있다.
특정 실시예들에서, 시료는 큰 웰 온-칩으로 미리 보관될 수 있다. 상기 웰을 윤활 오일 (예를 들면 FC 또는 파라핀 오일)로 에워싸는 것이 증발을 막을 수 있다. 입구를 통해서 압력이 인가될때, 시료는 막다른끝에 도달할 때까지 유로를 경유해서 웰 속으로 흘러간다. 상기 시료가 자동적으로 멈추게 되면, 상기 시료 웰들이 시약 웰들로 슬립해서 반응을 개시한다. 예를 들면 다양한 체적을 가진 수백개의 웰들을 로딩할 때, 모든 웰들이 채워지는지 확인하는 것이 바람직하다. 상기 막다른끝을 채우는 것이 그것을 촉진한다. 이 디자인에서는, 전체 웰이 완전히 채워지고, 사용자는 언제 중지할 것인지 결정할 필요가 없는데, 상기 시료가 상기 막다른끝에 도달하면 로딩 단계가 자동으로 멈추기 때문이다.
방울들을 슬립칩 내의 웰들 속으로 배치할 수 있는데, 수작업으로든지 로보틱스로 수행될 수도 있다. 화학전극, 또는 기타 플러그 소스로부터 (예를 들면 여기에 그 전문이 참조문헌으로 원용되는 US 7,129,091에서 설명한 기술들을 사용하여 형성된 것들) 방울들이 상기 칩 내로 흘러 들어가고, 공지된 방울 트래핑 메카니즘에 의해 동시에 트래핑되는 대체적인 자가-배치 디자인을 사용할 수 있다. Wu, L.; Li, G. P.; Xu, W.; Bachman, M., Appl . Phys. Lett. 2006, 89, Boukellal, H.; Selimovic, S.; Jia, Y. W.; Cristobal, G.; Fraden, S., Simple , robust storage of drops and fluids in a microfluidic device. Lab on a Chip, 2009. 9(2): p. 331-338 and Hong Shen, Qun Fang and Zhao-Lun Fang, A microfluidic chip based sequential injection system with trapped droplet liquid-liquid extraction and chemiluminescence detection, Lab Chip, 2006, 6, 1387-1389,에서 방울 트래핑을 위한 방법에 대해 설명하고 있으며, 이들 모두가 여기에서 참조문헌으로 원용된다. WO2008097559A2로 공개된 PCT/US2008/001544, 및 US 7,556,776 또한 여기에 참조문헌으로 원용된다. 본 슬립칩의 특정 실시예들은 이들 기술과 조합해서 사용될 수 있는데, 예를 들면 이들 기술을 이용해서 개별적인 체적들을 생성하고 나서 그 상부에 시약을 슬립시키는 것에 의해서이다.
슬립칩의 가능한 적용 예들로는 다음이 있지만, 이들에만 한정하는 것은 아니다: 바이러스 폐렴 검출; 비한정적인 예시로, GPBB, 미오글로빈, CK-MB 및 트로포닌 T를 포함하는 심장 마커 검출 위한 ELISA 이용; 우유, 와인, 아기 이유식, 보리, 콩, 말린 과일, 과일 쥬스, 곡식, 옥수수(maize), 우유, 유제품, 너트, 쌀, 곡물, 밀, 쇠고리, 육류, 해산물, 치킨, 개 사료 등을 포함하는 식품 테스트; 항생제 (예를 들면, 클로람페니콜), 살충제 (예를 들면, 오르가노포스페이트 살충제 포함 (콜린에스테라제 억제의 의해 분석됨), 엔드린(endrin), 페르탄(perthane), 카바릴(carbaryl), 테트라디폰(tetradifon), 디테닐아민, 알드린(aldrin), 디엘드린(dieldrin), 벤젠 헥사클로라이드, 클로르단(chlordane), 클로르데콘(chlordecone), DDT, DDE, TDE, 디코폴(dicofol), 에틸렌 디브로마이드, 헵타클로르(heptachlor), 린단(lindane), 및/또는 마이렉스(mirex)), 천연 독소 (예를 들면, 아플라톡신, 오크라톡신 및/또는 미코톡신 포함), 잔기, 및 알레르기원 (예를 들면, 아몬드, 달걀, 글리아딘(gliadin), 헤이즐넛, 우유, 머스타드, 해산물, 땅콩 또는 콩 잔류물 포함) 존재 여부에 대한 식품 테스트; 새우의 설파이트 테스트; 살모넬라, 리스테리아, 및/또는 대장균 테스트; 디옥시니발레놀 (DON), 푸모니신(fumonisin), T-2/HT-2 톡신, 제아라레논(zearalenone), 히스타민, 파튤린(patulin) 테스트; 혈액형 검사; 인플루엔자 A 아형검사 (H1N1 포함) HAI 스크린 (MRSA 및/또는 VRE 포함) 용 PCR 사용, 낭포성 섬유종 검사, 신생아 스크리닝, 암 예후, 유전자 발현 클러스터링, ADME/Tox 약물 R＆D 스크리닝, 패혈증 검출, HBV/HCV/HIV 혈액 기증 스크리닝, HCV 정량화, HIV 아형검사, HIV 정량화, HIV 약물 내성, HPV 아형검사, Ashkenazi 패널 가동, 임신 염색체 스크리닝, 예, 염색체 13, 18, 21, X 및 Y, 조류 독감 균주 아형검사, 암 진단, 암 재발 검출, 기관 이식 유형결정, 기관 이식 모니터링, 고처리량 스크리닝; 감염성 질환용 혈액의 몰 검사; 유전자형/바이럴 로드 테스트; 감염된 환자에서 바이럴 로드의 정량적 측정 (HIV,HCV); 클라미디아/고노헤아/HPV을 포함한 성적 전달 질병 및 약물 내성 테스트; 예진 (예, 약물 효능); 게놈약학 및 치료진단학 (약학/진단 쌍); 예를 들면, 클라미디아 및/또는 고노헤아 용 테스트, 미코박테리아 투베르쿨로시스, HCV 정량화, HIV 약물 내성 테스트, 혈액 기증에서 HBV, 혈액 기증에서 HCV/HIV, 약물 대사 효소, 인자 II (프로트롬빈), 인자 V 레이덴, HPV 게놈검사, 가르드네렐라(gardnerella), 트리코노모나스, 바기나리스 및 칸디다 spp., 레지오넬라 뉴모필리아, MRSA, 스타필로코커스 아우레우스, B 그룹 스트렙토코커스 용 PCR 이용; A 그룹 스트렙토코커스, B 그룹 스트렙토코커스, 웨스트 나일 (WNV), 시토메갈로바이러스 용 테스트 위한 면역검정 이용, 낭포성 섬유종 스크리닝; B-세포 만성 림프구 백혈병 염색체 8 계수 (예를 들면, CML, AML, MPD, MDS), HER-2 상태, 방광암의 초기 진단 및 재발 모니터링, 성 불일치 공수 이식 테스트, 약물 내성과 연관된 HIV-1 바이러스 돌연변이 검출; 감염성 질환에 대한 실시간 테스트 및 자궁경부암, 식도암 및 흑색종 포함, 특정 암 유형 FISH 테스트; MRSA로 콜로니화된 환자들을 식별하기 위한 활성 스크리닝; 유방암 및 난소암 포함, 유전적 질환, 유전적 흑색종 용 유전자 테스트; 선종성용종증후군(adenomatous polyposis syndromes) 테스트; 유전성 대장암 (HNPCC) 테스트; 활성 성분 존재 및/또는 양 및/또는 오염원 테스트 포함, 화학적 Q＆A 테스트; 살충제 테스트; 비료 테스트; 석유 테스트; 산업적 발효 과정 제어; 물, 과일, 채소류, 식품, 비누 오일류, 우유, 유제품, 음료, 달걀 테스트; 비정기 단백질 또는 아미노산, 자유 지방산, 락트산, 퍼옥사이드류, 암모니아, 클로라이드, 글루코오스, 페놀류, 요소 스크리닝 및/또는 분석; 캄필로박터 테스트; 해조류 분석; 도축장 및 농장 내 테스트; 직장암 모니터링용 혈액 테스트; 직업 운전사용 스킨 패치 코카인 테스트; 미코플라즈마 뉴모니아, 클라미디아, 뉴모니아 및 레지오넬라 뉴모니아 용 폐렴 패널 테스트 (예를 들면, RT-PCR 사용); 예를 들면, 일반 페닐케톤뇨증, 겸상적혈구 질환, 및 갑상선 기능저하증 용 신생아 스크리닝; 및 BNP/Pro, hs-CRP, 또는 호모시스테인 용 테스트. 추가적으로, 슬립칩 상에서 C-반응성 단백질 용 현장 진료 테스트가 치료 도중 및 임상 실험 도중의 통증을 모니터링하는 데에 사용될 수도 있다.
당업자들에게 알려진 예를 들면 PCR 및/또는 면역검정 방법들을 이용하여 본 슬립칩의 특정 실시예들에서 검출 가능한 유기체들은 다음과 같지만, 이들에만 제한되는 것은 아니다: 스트렙토코커스 뉴모니아, 해모필루스 인플루엔자 b형, 스트렙토코커스 아우레우스, 에스케리치아 콜리, 슈도모나스 애루기노사, 클라미도필라 뉴모니아, 미코플라즈마 뉴모니아, 레지오넬라 뉴모필라, 스트렙토코커스 아가락티아, 미코박테리움 투베르쿨로시스, 크렙시엘라 뉴모니아, 모락셀라 카타할리스, 클라미도필라 시타치, 스트렙토코커스 비리단스, 콕시엘라 버르네티, 크립토코커스 네오포르만스, 엔테로박터, 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV), 인플루엔자 바이러스 (A 및 B), 인간 파라인플루엔자 바이러스, 시토메갈로바이러스 (CMV), 인간 리노바이러스 (HRV), 코로나바이러스 (예, SARS), 아데노바이러스, 메탑뉴모바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 인간 보카바이러스, 기아르디아 람블리아, 크립토스포리디움 파르붐, 엔테로어그레티브 에스케리치아 콜리 (EAggEC),, 비브리오 콜레라, 시겔라 이질균 1형 (Sd1), 엔테로톡시겐 E. coli (ETEC), 엔타아메바 히스톨리티카, 캄필로박터, 살모넬라, 클로스트리듐 디피실리, 로타바이러스, 노로바이러스, 아데노바이러스, 및 아스트로바이러스.
관심대상 세포를 담지하는 예를 들면 희귀세포 또는 비드 등의 표적을 체액 등의 시료로부터 분리하거나 포획하기 위한 본 슬립칩의 특정 실시예들을 이용하는 장치 및 방법이 설명된다. 이런 장치와 방법은 포획한 표적과 이를 운반하는 시료를 하방 분석하는 데에 바람직하다. 예를 들면, 희귀세포, 비드나 응집체 등의 입자, 또는 분자가 예를 들면 혈액, 타액, 호흡 기체, 눈물, CSF, 또는 소변 등의 체액으로부터나, 토양 현탁액, 주변 물 시료, 조직 균질액, 가스, 액체, 고체 또는 겔을 포함하는 기타 시료로부터 포획 가능하다. 예를 들면 유기체, 세포소기관, 분자, 거대분자, DNA, 단백질, 및 탄수화물 등의 저농도의 검체를 가진 시료, 희귀 핵산 또는 단백질, 유전적 또는 감염성 질환의 마커 및 바이오마커, 환경 오염물질, 상피세포, 순환 종양세포, 면역조직 세포, 적혈구, 혈소판, 엑소좀, 미세소낭을 포함하는 숙주 세포, 태아세포 및 정자를 포함하는 비-숙주세포를 포함하는 세포 또는 소낭을 분석할때 이 접근방식은 유익하다 (예를 들면 USSN 10/823,503 참조하며, 이는 여기에 참고문헌으로 원용됨). 또 다른 예시로는 순환 암 세포 또는 임신 진단 목적의 모체 혈액 내 태아 세포 등의 희귀세포의 분석이 포함된다. 이 접근방식은 혈액, 담, 골수 흡인물 및 소변 및 뇌 척수액 등 기타 체액 내 세균 세포를 포획하고 추가 분석함으로써 감염을 신속하게 조기 진단하는 데에 유익할 수도 있다. 비드와 세포 모두 분석하는 것이 확률론적 한정으로부터 유익할 수도 있다 (예, PCT/US08/71374 참조하며, 여기에 참고문헌으로 원용함).
표적의 동정 또는 포획은 광범위한 시스템의 특성화 또는 분석을 위해서 중요하다. 하나의 예는 체액 속의 희귀 세포들을 분석하는 것이다 - 암 (순환 종양 세포 (CTCs), 유출 림프절 내의 침투성 종양 세포들), 면역성 (CD4 카운트, 항원 특이성 세포, 기타), 감염 (미생물 세포), 임신 진단 (모체 혈액 내 태아 세포 또는 유핵 적혈구) 및 졸도 (전사적 변형된 말초혈액 단핵세포 (PBMC))을 포함하는 적용 예들에서 중요한 예임. "희귀 세포"는 다른 유형의 세포들 (예, 간엽 세포, 림프구)이 풍부한 혼합물 속의 하나의 유형의 세포 (예, CTCs)이거나, 동일한 유형 (예, PBMCs)의 정상 세포들의 혼합물 속의 특이한 표현형 또는 유전자형 (예, 상방조절된 전사)을 갖는 세포일 수 있다.
CTC의 동정 또는 포획은 암 진단 및 모니터링을 위해서 중요할 수 있다. 전이는 암으로부터 사망의 주된 원인인데, 이들이 종종 기존의 치료법들에 내성을 가지기 때문이다 (전이 속의 암 세포들에는 많은 이질성이 있다). CTCs는 주요 종양에서 떨어진 세포들이며, 혈류 속을 순환한다. 다른 조직들에 접할 때, 침투된 조직 내에서 그 주위로 미세환경을 형성함으로써 이들은 추가적인 종양 성장에 씨드 작용을 할 수 있다. CTCs는 혈액에서 매우 낮은 농도로 관찰된다 (한 세포에서 106 내지 109 사이). CTCs의 양은 다양한 암 종류별로 매우 다양한데, 일부 암들은 대부분의 경우 (난소암) CTC를 갖지 않고, 다른 것들은 거의 모든 경우 (유방암) CTCs를 갖는다. 대부분의 최근 연구는 이런 세포들의 검출을 향상시키기 위한 방법들에 초점을 맞추었으며, 많은 개선이 있었다 (하기 현존 방법 부분 참고). 하지만, 이 방법들 중 대부분은 CTCs의 계수 만을 제공하는 한편, 소수가 PCR이나 염색에 의한 분석을 제공할 수 있다. 본 발명에서 광범위한 하방조절 분석 및 조작을 위한 CTCs 포획에 사용 가능한 방법 및 장치가 설명된다.
CTC가 혈류로부터 정보를 제공할 수 있는 반면, 고상 종양 시료 분석 또는 림프절 생검은 일차 종양에 대한 정보를 제공할 수 있다. 하지만, 고상 종양 생검 시료는 종종 세침 흡인 생검 또는 세침 생검으로부터의 시료에 종종 제한되는데, 환자에 위험이나 주된 불편함 없이 내적으로 위치한 종양에 접근하기 어렵기 때문이다. 이 시료들은 200개 세포 정도 밖에 안되는 것을 제공할 수도 있는데, 종양 세포 및 간엽 또는 림프 (비-종양) 세포의 혼합물을 포함한다. 소수의 표적 세포에도 불루가혹, 이 시료들로부터 종양 세포들을 포획하거나 동정하고, 복합화된 분석을 제공할 필요가 있다. 유사하게, 수술중 시간계획 (<40 분) 상에서 신속하게 포획하고 분석해서, 감시 림프절 등의 시료 생검이 전이성인지를 결정하고, 따라서 양성 케이스들에서 이차 수술의 필요성을 없앨 필요성이 있다. 본 발명은 다수의 간엽 또는 림프 세포들이 존재함에도 불구하고 이 시료들로부터 종양 세포를 포획하고 분리하는 방법 및 장치를 제공하며, kRAS2 (고상 종양에서 일반적임) 등에서의 돌연변이에 대한 PCR 등, 또는 유방암을 위한 MUC1을 포함하는 특이한 mRNAs에 대한 RT-PCR의 신속한 분석 및 조작을 가능하게 한다.
포획과 분리의 또 다른 중요한 적용 예는 면역 시스템의 분석이다. 인간 혈류는 mL 당 108 이 넘는 혈소판에 더하여, T- 및 B-림프구, 단핵세포, 수지상세포, 호중구, 및 적혈구를 포함해서 mL당 수백만 세포를 함유하고 있다. 자가면역, 알레르기, 및 감염 뿐만 아니라 암 같은 환경에서, 특정 항원에 대해 특이적인 T-세포의 빈도 (각각, 종양 항원, 자가-항원, 알레르겐, 또는 병원균 유래 항원)는 종종 질환 경과에 대한 예측 물질이다. 하지만, 이 세포들은 매우 희귀하고, 1,000 내지 100,000 세포에서 0.002% 내지 0.2% 빈도로 나타난다. 현존하는 분석 방법들은 계수화에 초점을 맞추며 (유세포분석기, ELISPOT) 거의 추가 분석을 제시하지 않는다. 본 발명은 그런 세포들을 포획하고 분리하는 장치들과 방법들을 제공하며 (예, MHC-항원 복합체와 친화도 포획에 의하거나, 항원-자극 시토카인 분비 스크리닝에 의하거나 기타 등등) PCR, 추가 자극-반응 분석, 및 배양을 포함하지만, 이에만 제한되지 않는 하방 분석을 제공한다. 이 방법들은 종양의 분자적 메카니즘, 자가면역 및 기타 환경들에 대한 통찰을 제공할 수 있다. 예를 들면, 자가-항원에 특이적인 T-세포들이 시토카인에 의한 자극에도 더욱 민감한지를 결정해서, 자가면역 반응을 없애는 데 사용될 수 있다. 슬립칩은 ELISPOT 기술이 사용 가능한 모든 적용 예들에 대한 분석을 수행하는 데에 사용될 수도 있다. 슬립칩에 대한 확률론적 한정으로 더욱 빠르고 민감한 분석이 제공될 것이다.
일부 현존 방법들은 표적의 포획을 제공하지만 하방 분석이나 가공을 거의 제공하지 않거나 아예 하지 않았다. 현존하는 포획 방법들에는, 사이즈 또는 형태에 의한 여과, 항체-도포 자성 비드 또는 로드 등으로 친화성 포획 (예, 셀 서치 , MagSweeper , or RoboSCell technologies), 미세유체 포스트 (예, CTC-칩 또는 엑소솜 포획), 또는 미세유체 채널 벽, 콜라겐 부착 매트릭스의 전이성 침습을 포함한 특이 행동에 의한 기능성 포획, 모든 다른 표적 제거에 의한 음성 선별, 자성, 광학적, 기타 특성에 의한 포획 (예, 유전영동 장-흐름 분획법 또는 광음향분광학에 의함), 및 가시적으로 전체 표적 스크리닝 및 유세포분석기, 섬유 광학 어레이, 또는 레이저 스캐닝에 의한 것을 포함한 관심대상 수집 (레이저-작동 분석 및 프로세싱, LEAP™, by Cytellect)이 포함된다.
상기 나열한 방법들과 대조적으로, 본 슬립칩의 일부 실시예들은 다수의 상방 또는 하방 적용 예들을 가능하게 하는데, 상방 시료 제조를 포획 및 하방 복수- 또는 단수-세포 분석 및 조작과 조합하는 것을 포함한다. 실시 가능한 분석 유형의 예시로는 PCR 및 기타 핵산 기반 테스트, 면역검정, 면역염색, 조직염색을 포함하는 염색, 및 중량-분석이 포함되지만, 이들에만 한정되는 것은 아니다. 분리 후에 수행 가능한 공정들로는, 단일 세포의 배양, 순수 배양 (단일 세포 유형), 혼합 공동배양, 또는 공간적으로-조직화된 공동배양을 포함하지만 이에만 한정되지 않는 배양, 항원, 병원균을 포함하지만 이에만 한정되지 않는 자극제-반응 분석, 또는 시토카인 위험, 수용체 결합 및 주화성 분석이 포함된다.
표적들은 사이즈나 형태에 의해서 선별, 예를 들면 여과에 의해서 선별될 수 있다. 예를 들면, 시료들은 흡입 또는 흐름 같은 프로세스에 의해서 여과 장치를 통과할 수 있다. 체 또는 다공성 멤브레인 같은 여과 장치가 포획 영역에서 여과보다 더 큰 표적을 보유한다. 이들은 더 큰 표적을 분리하기 위해서나, 관심대상인 더 작은 표적으로부터 물질을 제거하기 위해 사용 가능하다. 포획된 표적들은 그리고 나서 추가 조작을 위해서 분석 영역으로 슬립될 수 있다. 관심대상 표적의 검출을 위한 시약들은 다양한 단계에서 포함될 수 있는데, 하기에 보여진 것처럼 여과 전에 시료와 혼합되거나, 상기 장치 상에 사전 로딩된다. 필터 (예를 들면 서브마이크론 사이즈의 공을 갖는 하나)가 채널에 놓일 수 있으며, 시료가 상기 필터를 통해 흐를 수 있고, 그리고 나서 바람직하게는 원래 시료보다 부피 측면에서 더 작게, 세척이 상기 필터가 수집한 것을 재부유시키기 위한 역 방향으로 흐를 수 있다.
수력학에 의한 포획은 예를 들면 시료 중 다른 성분들과 별개로 수력 특성을 지닌 표적들을 함유하는 시료에 대해 사용 가능하다. 예를 들면, 나노기둥들의 어레이가 그들의 수력학 및 확산 특성에 따라서 물체를 분리하기 위해 사용되어 왔다. 경계면 옆으로 이동하는 물체의 수력학 상의 차이 또한 잘 정립되어 있다. 작은 세포들이 좁은 측면 채널들로 들어갈 수 있고, 큰 세포들이 들어갈 수 없었던 (세포에서 혈장을 분리하는 데에도 유용함) 스키밍 방법이 설명되었다. 세포를 방울로 캡슐화하고 수력학적으로 정렬시켜서 빈 방울들을 제거하고 원하는 크기의 세포들을 수집하는 것이 설명되었다. 표적들은 밀도 변화를 활용하는 것에 의해서 정렬될 수 있다. 예를 들면, 종(species)은 검출 시약과 함께 방울로 캡슐화되어서, 방울 속의 표적들이 방울을 밀도가 작게 하는 분자를 생산하고, 방울이 본 슬립칩의 상부 부위로 부유하게끔 할 수 있었다. 이 방법들은 슬립칩 상에서 활용 가능하며, 그리고 나서 포획된 표적들은 분석 및 조작을 위해서 다른 영역으로 슬립될 수 있다.
전기적, 광학적, 자기적및 기타 성능에 의한 포획이 사용 가능한데, 예를 들면 표적 자체들이 본래 특이한 전기적, 광학적, 자기적 성능을 가질 때, 또는 그 성능들이 유도될 수 있을 때 그러하다. 예를 들면, 자성 입자들을 미생물에 선별적으로 결합하는 것은 유기체들의 자기적 특성을 변화시키고, 그 유기체들을 자기장을 이용해서 시료의 나머지로부터 분리하는 데에 사용할 수도 있다.
관심 있는 표적들은 포획 보조제에 대한 친화도에 의해 포획될 수 있는데, 이는 관심대상 표적에 특이적이거나 비특이적일 수 있다. 특정 실시예들에서, 시료의 벌크가 본 장치에 의해 포획되지 않는 반면, 원하는 표적, 그런 미생물, 세포, 또는 분자가 우선적으로 결합되고 풍부해진다.
포획 보조제 (또는 포획 요소)는 친화성 치약을 포함할 수 있는데, 항체, 앱타머, 비특이적 포획 보조제를 포함하며, 예를 들면 방울이나 세포가 부착할 수 있는 친수성 패치 및 여기에 설명된 다른 것들을 포함한다. 여러가지 포획 요소들이 동일한 플레이트 상에 패터닝될 수 있다. 예를 들면, 하나의 열이 박테리아에 대항해서 포획 보조제로, 다른 열은 균류에 대항해서 포획 보조제로 패터닝될 수 있다. 플레이트들을 조립한 후, 박테리아 및 균류에 대한 검출 시약을 대응하는 영역들에 첨가해서, 동일한 시료로부터 박테리아와 균류를 검출할 수 있다.
관심대상 표적들은 특이한 행동에 의해 포획될 수도 있다. 예를 들면, 세포들을 콜라겐 부착 매트릭스 같은 물질이 도포된 슬립칩 웰들 속으로 로딩할 수 있다. 전이성 세포들이 겔 속으로 이동하는 한편, 다른 세포들은 그렇지 않을 것이다. 다른 세포들이 세척해서 없어질 수 있고, 겔은 용해되고, 다른 분석용 영역으로 슬립될 수 있는 웰에 분리된 전이성 세포들을 남겨둔다.
본 슬립칩은 또한 칩의 상이한 영역들을 가로질러서 종 (세포, 비드, 등)을 어레이하고, 그리고 나서 검출 시약을 이 모두에 적용해서 원하는 표적의 위치를 식별할 수 있다 이들은 추가 분석 및 조작 용 다른 영역으로 슬립됨으로써 분리될 수 있다. 예를 들면, 시료 내의 모든 세포들은 웰 속으로 로딩될 수 있고, 그리고 나서 표지된 친화도 시약 (관심대상 마커용 형광 표지된 항체, CD4 또는 EpCAM 등 )으로 식별할 수 있다. 표지된 세포들을 담은 이 웰들은 그리고 나서 예를 들면 PCR, 세포배양 및/또는 면역검정에 의한 추가 분석 또는 조작을 위해서, 분석 영역으로 슬립될 수 있다.
슬립칩 상에서 담지체의 후속 포획에 의해서 담지체로의 오프(off)-슬립칩 결합을 수행할 수 있다. 담지체들은 예를 들면 자성 입자, DNA 도포 입자, 항체, 및/또는 기타 표적화 분자일 수 있다. 특정 실시예들에서, 관심대상 표적은 상기 담지체에 결합하고, 상기 담지체는 포획 영역에 의해 슬립칩 상에서 포획된다. 결합은 친화도, 전기적, 광학적, 자기적, 또는 기타 물성을 이용하는 방법들을 포함하지만 이에만 한정되지 않는 방법들에 의해 수행된다. 상기 담지체의 포획은 표적 포획용으로 상술한 방법들 등에 의해 수행 가능하다. 예를 들면, 세포 용액 내 희귀 세포가 항체가 도포된 자성 비드에 결합하고, 상기 자성 비드가 그리고 나서 자석에 인접한 슬립칩 웰들에서 포획된다.
포획은 폐쇄형 장치 (2 이상의 플레이트가 함께) 또는 개방형 장치 (1 또는 복수 플레이트가 별개로 시료에 노출됨)에서 이루어질 수 있다. 폐쇄형 장치의 경우, 시료가 여러 수단에 의해 로딩될 수 있는데, 예를 들면, 열린 구멍을 통해서, 유도된 흐름을 통해서나 채널로의 흡인을 통해서 가능하다. 개방형 장치의 경우, 본 슬립칩의 하나의 플레이트가 필터 역할을 하거나 포획 표면 역할을 할 수도 있다. 개방형 장치의 장점은 시료의 큰 체적들이 신속하게 처리되고 희귀한 표적들이 신속하게 포획될 수 있다는 것이다. CTCs 같은 표적들에 유용한데, 이는 혈액 mL 당 0.5-50개 세포만큼 낮은 비율로 존재할 수도 있다. 추가로, 개방형 장치는 이와 반대로는 로딩하기 곤란할 수도 있는 시료, 예를 들면 기침 중에 생성된 박테리아나 바이러스의 에어로졸의 분석, 또는 조직 슬라이딩 상의 시료의 분석에 유용할 수 있으며, 세포들 간의 공간적 관계를 추적하는 것은 예를 들면 종양 생검의 경우에와 같이 바람직하다. 추가적으로 직접 접속 (예를 들면, 중량 분석법)으로부터 이점이 있는 방법들에 의한 분석을 위해 본 칩을 개방하는 것이 바람직하다. 개방형 슬립칩 상의 물질을 수거하는 예시적인 방법은, 슬립칩의 적어도 하나의 플레이트를 시료에 노출시키는 단계, 적어도 하나의 표적을 상기 플레이트로 전달할 수 있게 하는 단계 (예를 들면, 친화도 포획이나 여과 포획에 의함), 선택적으로 상기 슬립칩을 환경에서 제거하는 단계, 상기 슬립칩의 제2 플레이트를 제1 플레이트와 접하게 하는 단계, 및 상기 플레이트들을 미끄러지게 해서 각 플레이트 상의 적어도 하나의 영역이 서로 접하게 해서 분석 또는 조작을 위한 상기 표적과의 반응 / 상호작용을 유도하는 단계를 포함한다.
포획 방법들은 확률론적 한정, 검출 시그널의 다단계 증폭, 및 가시적 판독을 포함한 기타 기술들과 조합 가능하다. 예를 들면, 상기 시료로부터의 세포와 같은 표적은, 검출을 가속화하고 그리고/또는 더욱 민감하게 만드는 확률론적으로 구분된 작은 체적들로 한정될 수 있다. 하나의 적용 예에는 혈액 시료로부터의 면역 세포들을 예를 들면, 나노리터 체적들로 확률론적으로 한정시키고 나서, 상기 장치를 미끄러지게 해서 CD4를 위한 면역검정을 수행하게 해서, CD4+ 세포들을 식별하는 것을 포함한다. 이는 CD4 개수를 제공한다. 식별한 CD4-양성 세포들은 그리고 나서 분리되고 추가 분석, 예를 들면 PCR를 위해서 다른 영역으로 미끄러질 수 있다.
포획 방법들은 하방 분석 및 조작과 조합될 수 있는데, 예를 들면 자극제-반응 분석 및 유도된 크롤링(directed crawling) 분석법들이 포함된다. 자극-반응 분석법은 표현형이 휴지기 조건 하에서 분명하지 않은 세포의 검출과 특성화, 예를 들면 액체 종양의 검출에 유용하다. 포획한 세포는 시토카인 등으로 자극될 수 있으며, 그들의 반응은 일단의 병렬 분석과, 시토카인과 프로테아제를 포함하여 배출된 시그널에 대한 ELISA를 포함한 조작, 시그널 경로 확인을 위한 인산화 상태용 염색, PCR, RT-PCR, 및 배양에 의해 검정되었다. 유도성 크롤링 분석법(Directional crawling assay)이 표현형을 다양하게 하면서 세포를 구분하기 위해 사용될 수도 있다. 예를 들면, 전이성 세포는 기계적으로 한정될때 신속하고 방향성있게 포복하고; 포획된 CTCs는 길게 뻗은 덕트 같은 채널 속으로 미끄러져서 이 행동을 모을 수 있다.
비슷하게도, 주화성 구배가 정립될 수 있는데, 예를 들면 슬립칩의 특정 실시예들 중 하나의 웰들 주화성 제제로 로딩하고, 미끄러지게 해서 그것이 다른 웰이나 덕트에 연결되고, 확산에 의한 구배를 정립시키는 것에 의해서이다 (FID 장치 및 브릿지 장치에서와 같음). 또한 흐름은 구배를 정립하는 데에도 이용될 수 있다. 이 구배들은 포획된 세포의 주화성을 분석하는 데에 사용 가능한데, 이는 염증, 종양 퇴행 및 전이, 자가면역, 및 감염과 연관된다.
개별적으로 분리되는 포획한 표적들은 시간 경과하면서 모니터될 수 있는데, 처리나 자극이 있거나 없이, 벌크 배양에서는 얻어질 수 없는 시간이 해결한 단일 표적 정보를 제공한다. 예를 들면, 단일 세포들이 확장, 리포터의 발현 (예를 들면, 형광에 의해 모니터됨) 및/또는 시그널 배출을 모니터할 수 있다.
포획한 세포를 함유하는 웰들은 세포의 행동을 분석하기 위해 조작될 수 있다. 예를 들면, 웰들은 세포외 기질의 퇴적을 분석할 수 있다. 상기 칩의 표면은 마이크로- 또는 나노-규모 위상에 의해 변형되거나, 화학적 표면처리 등의 변형으로 세포외 기질 형성의 역학과 산물을 변경할 수 있다. 또 다른 예시에서, 화학적 또는 세포 자극제를 포함하지만 이에만 한정하지 않는 자극제를 가해서 확장이나 분화 같은 행동을 유도할 수 있으며; 이는 림프구, 단핵구, 및 줄기세포 등의 많은 세포 유형 연구에서 유용하다. 다양한 유형의 포획된 세포들은 혼합되거나 공간적으로 제한되어서 공동배양으로 함께 보내져서, 세포-세포 상호작용을 분석하도록 할 수 있다. 하나의 예에서, 항원-제공 세포들이 T-세포와 배양되어서, 항원 인식에 대한 상기 T-세포 반응의 역학을 분석할 수 있다. 또 다른 예에서는, 항원-활성화 기억 T-세포들은 세포가 통과하기에는 너무 작은 덕트를 경유해서 유체흐름적으로 다른 웰에 연결된 웰 속에서 배양될 수 있다. 다른 세포들, 예를 들면 미경험 T-세포(naive T-cell) 또는 B-세포, 또는 상피 세포가 다른 웰에서 배양되어서, 시토카인 등의 용해성 시그널의 영향을 분석할 수 있다.
친수성 브릿지들이 슬립칩의 특정 실시예들에서 사용되어서, 웰 연결에 의해서 세포-세포 상호작용을 가능하게 할 수도 있다. 항생제 내성을 스크리닝하기 위한 하나의 실험이 설명된다. 여기에 설명된 장치와 방법은 예를 들면 항생제 내성 스크리닝, 세포들을 물리적으로 접촉시키지 않는 세포-세포 상호소통 연구, 공간 제한된 미생물 커뮤니티 구축, 마이크로생태 시스템의 다양성 및 진화 이해, 및 사이즈, 운동성 및/또는 주화성에 기반한 바이러스, 박테리아, 및/또는 세포 추출 또는 분리에 유용할 수 있다.
실험 부분
화학물질 및 재료
달리 언급하지 않는한 상업적 출처에서 구입한 용매와 염 모두를 수취된 대로 사용했다. FC-40 (퍼플루오로-트리-n-부틸메틸아민과 퍼플루오로-디-n-부틸메틸아민의 혼합물)를 3M (St. Paul, MN)로부터 얻었다. 식품 염료들을 Ateco (Glen Cove, NY)로부터 구입했다. 트리데카플루오로-1, 1, 2, 2-테트라하이드로옥틸-1-트리클루오로실란을 United Chemical Technologies, Inc. (Bristol, PA)로부터 구입했다. Alexa Fluor ? 488 dye (Alexa-488)를 Invitrogen (Eugene, OR) 로부터 구입했다. Telic Company (Valencia, CA)로부터 크롬과 포토레지스트가 피복된 소다 석회의 플레이트를 구하였다. Harvey Tool (0.035 인치 커터 다이아몬드, Rowley, MA)로부터 무정형 다이아몬드 피복 드릴 비트를 구했다. Microscopy/Microscopy Education (McKinney, TX) 로부터 형광 참조 슬라이드를 구입했다. Officemax (Itasca, IL) 로부터 바인더클립(Binderclips) (5/32’ 인치 용량, 1/2’ 인치 크기)를 구입했다. Eppendorf Inc. (Westbury, NY)로부터 피펫터를 구입했다. Fisher Scientific (Hanover Park, IL)로부터 Fisherbrand 피펫터 팁을 구입했다.
칩 설계 및 제조. 본 출원에서 다른 부분에서 설명되는 것처럼 슬립칩(SlipChip)은 슬립칩의 유리 에칭 제조를 이용해서 제조되는데, 다음의 변형들을 가진다. 약 25 분간의 에칭으로 약 30 μm 깊이를 형성하였다. 에칭 후에, 플레이트들에서 테이프를 제거하였다. 그런 다음 상기 플레이트들을 밀리포어(Millipore) 수로 철저하게 헹구고 질소 가스로 건조시켰다. 검정색 패턴을 가지는 친수성 브릿지 부위들을 포함하는 포토마스크를 하단 플레이트에만 배치시키고 나서, 다른 부분에서 설명된 상기 유리 에칭 제조 공정에 의해서 친수성 브릿지 표면을 형성하였다. 액세스 홀들을 다이아몬드 드릴 비트 직경 0.035 인치로 드릴하였다. 상기 에칭된 유리 플레이트들의 표면을 밀리포어 수와, 에탄올로 세척하고, 실란화 전에 산소 플라즈마 처리시켰다. 상기 친수성 브릿지 패턴의 유리 표면은 실란화되지 않았기 때문에, 상기 친수성 브릿지 패턴 상의 크롬층을 제거한 후에도 친수성으로 남았다. 그런 다음 플레이트를 밀리포어 수와 에탄올로 헹구고 질소 가스로 철저하게 건조시켰다.
슬립칩 조립. 본 슬립칩은 FC-40 및 0.4 mg/ml RfOEG의 혼합물 하에서 조립되었다. FC-40 및 0.4 mg/ml RfOEG의 50 μL 혼합물을 패턴들을 위로 향하게 하면서 페트리 접시의 하부 플레이트 상에 펼쳤다. 그리고 나서 상기 패턴들이 아래로 향하게 하면서 상부 플레이트를 상기 하부 플레이트의 상단에 놓이게 하였다. 상기 두 플레이트들을 서로에 대하여 이동하게 해서 위치 정렬시키고 나서, 두 개의 마이크로 바인더 칩을 사용해서 고정시켰다. 본 슬립칩은 상기 표면에 남은 FC-40가 제거된 후에 사용 준비가 되었다.
식품 염료 실험. 식품 염료 실험용으로 사용되는 모든 용액을 사용 전에 0.45 μm PVDF 시린지 필터로 여과시켰다. 두 가지 식품 염료 (청색 및 황색, Ateco, Glen Cove, NY)를 피펫으로 20개 시약 채널들에 로딩하였다. 각 채널을 로딩하기 위해서, 상기 염료 용액이 공기 공급 채널에서 나올 때까지, 10 μL의 염료를 피펫을 사용해서 유입구들을 통해서 밀어넣었다. 시약을 로딩한 후에, 본 칩은 미끄러져서 두 개의 시약 웰(well)을 상기 친수성 부분 위에 배치되게 하였다. 상기 웰들을 좌우로 약간 미끄러지게 해서 상기 친수성 브릿지가 완전히 젖게 했다. 그리고 나서 상기 시약들에 의해 형성된 습윤층(wetting layer)을 상기 친수성 표면에 잔류하게 해서 두 개의 웰들을 연결시켰다.
형광 염료를 이용한 확산 테스트 로딩 공정은 상기 식품 염료 실험에서와 유사했다. Alexa488 (44 μm) 및 MPTS (400 μm)을 10 mM TRIS 버퍼에 용해시켰다. 상기 Alexa488 용액과 MPTS 용액을 장치에 로딩시켰다. 장치의 2분의 1에 있는 10개의 유입구를 Alexa488로 로딩시켰는데, 각 통로가 10개 웰을 갖게 하였다. 장치의 다른 2분의 1에 있는 10개의 유입구는 MPTS를 로딩시켰다. 형광 염료를 가진 웰들을 친수성 브릿지로 연결한 후에, 확산 프로세스를 10 × 0.4NA 라이카(Leica) 렌즈를 갖는 Leica DMI6000 형광 현미경과, Hamamatsu ORCAER 카메라를 사용해서 암실에서 3 시간 동안 촬영했다. GFP 및 DAPI 필터를 이용해서 Alexa 488 및 MPTS 형광을 수집하였다. Alexa488 및 MPTS 모두에 대해 30분의 노출 시간이 사용되었다.
형광 측정. 메타모프(Metamorph) 영상 시스템 6.3r1 버젼을 이용해서 이미지를 획득하고 분석하였다 (유니버설 이미징). 형광 신호의 세기를 추출하기 위해서 100 픽셀 x 100 픽셀 영역을 모든 관심대상 웰의 중간에 선택하였다. 상기 현미경을 보정하기 위해서, GFP와 DAPI를 위한 형광 참조 슬라이드의 형광 세기를 기록하고 배경 보정으로 사용했다.
데이터 분석. 상기 세기 측정을 보정하기 위해서, 먼저 배경 세기를 전체 형광 이미지에서 제거하였다. 그리고 나서 각 웰의 세기를각 웰의 중심에 위치한 100 픽셀 x 100 픽셀의 통합 세기로부터 추출하였다.
에스케리치아 콜리(Escherichia coli)를 이용한 항생제 스크리닝 실험. pDsRed 플라스미드를 갖는 에스케리치아 콜리가 벤자민 S. 글릭 교수에 의해 제공되었다(시카고 대학). 세포 스톡을 -80oC에 보관하였다. 각 실험 전에, 스톡을 100 μg/ml 암피실린을 갖는 LB 한천 플레이트들 위에 묻혔다 (Difco LB 브로쓰, Miller, 2% (wt/vol) Alfa Aesar 한천 분말 함유). 플레이트들을 30 oC에서 밤새 인큐베이팅시켰다. 암피실린(100 μg/ml)을 갖는 LB 3 mL를 함유하는 배양 튜브에 콜로니를 접종하고 30 oC에서, 160 rpm으로 밤새 2차 배양시켰다. 장치로 로딩시킨 세균 배양을 하룻밤 배양으로부터 재접종하고 대수 증식기(log phase)로 배양시켰다. 2.5×107 세포 / ml의 세균 세포 밀도를 상기 친수성 브릿지 장치의 유입구들의 반을 통해서 로딩시켰다. 다양한 농도의 클로람페니콜 및 카나마이신 (각 항생제 당 0.01 μg/ml, 0.1 μg/ml, 1 μg/ml, 10 μg/ml 및100 μg/ml)을 장치의 다른 반에 로딩시켰다. 공기 공급 채널들을 건조 흡입해서, E. 콜리 생장을 위한 공기 수송이 가능하게 했다. 세균과 항생제를 갖는 웰들을 친수성 브릿지로 연결한 다음, E. 콜리의 생장을 10 × 0.4NA 라이카(Leica) 렌즈를 갖는 Leica DMI6000 형광 현미경과, Hamamatsu ORCAER 카메라를 사용해서 암실에서 16 시간 동안 화상처리했다. Texas red 필터를 이용해서 DsRed 형광을 수집하였다. 40분의 노출 시간이 사용되었다. 메타모프(Metamorph) 영상 시스템 6.3r1 버젼을 이용해서 이미지를 획득하고 분석하였다 (유니버설 이미징). 세균 생장을 비교하고 정량화하기 위해서, 임계 영역 분율(threshold area percentage)를 모든 웰 쌍에 대해 측정하였다. 이것은 ‘적색’ 픽셀 수를 임계화하고 측정함으로써 이미지의 특성들을 선택하는 것으로 이루어졌다. 임계 영역 분율은 측정 영역 내의 총 픽셀 수에 대한 적색 픽셀 수의 백분율을 가리킨다. 여기서, 모든 이미지마다 전체 측정 영역은 동일했다.
결과
동시에 10회의 독립적인 상호작용 실험을 수행하기 위한 슬립칩을 준비하였다. 각 실험에는 9회 중복 시도가 포함되었다. 한 차례 시도에서 2개 웰 (각각 1.5 nL)을 300 μm x 40 μm 사이즈인 써브마이크론 두께 친수성 브릿지로 분리한다. 쌍을 이룬 웰들을 가지는 상부 플레이트를 미세채널들과 친수성 정사각형 무늬들을 가지는 하부 플레이트와 정렬시켰다. 쌍을 이룬 웰들로 된 두 개의 열에 A 세포를 함유한 파랑색 용액과 B 세포를 함유한 노랑색 용액을 나눠서 로딩시켰다. 로딩 후에, 상기 상부 플레이트 웰들이 상기 하부 플레이트에 대하여 미끄러져서, 구획들로의 연속적인 흐름을 깨고, 쌍을 이룬 웰들이 친수성 브릿지들을 통해 연결되어서 확산하기 시작한다. 작은 분자들은 상기 써브마이크론 두께 친수성 브릿지들을 통해 확산한다. 평형 상태에서, 웰들은 모두 녹색이었다. A 세포와 B 세포는 상기 친수성 브릿지를 넘지 못하지만, 이들이 배출하는 화학물질들은 상기 친수성 브릿지를 통해서 교환 가능하다.
친수성 브릿지 장치를 식품 염료로 테스트하였다. 청색 및 황색 염료들을 20개 로딩 채널들에 나눠서 로딩시켰다. 슬라이딩 후에, 두개의 웰이 상기 친수성 브릿지에 의해 연결되었다. 두 가지 식품 염료가 상기 연통 친수성 브릿지를 통해서 두 개의 웰들 사이에서 양방향으로 확산하는 것이 웰들의 컬럼 모두에서 일정한 녹색으로 입증되었다.
또 다른 실험에서, 한 세트의 웰에 MPTS를 초기 로딩시켰으며, 이들은 Alexa488 (녹색)이 채워진 웰들과 쌍을 이루었다. 두 가지 염료가 연결된 브릿지의 친수성 표면을 통해서 서로를 향하여 확산하였다. 덧씌워진 명시야(brightfield) 및 형광 이미지들이 형광 염료들이 한 세트의 웰들로부터 다른 것들로 확산하는 것을 보여준다. 완전한 혼합은 Alexa488의 경우에는 ~55 분 후에, MPTS의 경우에는 ~45 분 후에 이루어졌다.
항생제 스크리닝이 친수성 브릿지 장치에서 실시되었다. 명시야 및 형광 이미지들은 E. 콜리가 상기 친수성 브릿지의 한 면 위의 웰들에서 자라는 것을 보여주었다. 클로람페니콜 (CLR) 및 카나마이신 (Kana)을 다른 면 위의 웰들에 로딩시켰다. 각 항생제에 대한 농도는 0.01 μg/ml, 0.1 μg/ml, 1 μg/ml, 10 μg/ml 및 100 μg/ml이었다. E. 콜리 세포 (밀도 2.5×107 cells/ml)를 컬럼 쌍들의 첫번째 웰 세트로 로딩시켰다. E. 콜리가 다양한 농도의 항생제들에 처음 노출되었을 때부터 16 시간 후에 데이터를 분석하였다. 성장한 E. 콜리 DsRed에 대한 임계 영역을 선택하고, 상기 임계 영역 백분율을 각 웰 쌍에 대해 측정하였다. 상기 임계 영역 백분율은 다양한 항생제 농도 하에서의 생장 차이를 간접적으로 나타낸다.
특정 실시예들에서, 본 슬립칩의 제조와 작동에는 윤활유가 필요하지 않다. 본 슬립칩은 상기 플레이트들 사이에서 배출된 윤활유가 필요하지 않고 작동 가능하다. 이러한 “건식” 작동의 경우, 반응 유체는 장치 표면 상에서 높은 접촉각 (예를 들면, 130도 초과 각도)을 갖는 것이 바람직하다. 이러한 높은 접촉각은, 나노크기 다공성 및 마이크로크기 다공성 중합체의 사용, 블록 공중합체의 상 분리, 표면 피복, 표면 거칠기 및 많은 다른 접근법들을 포함하여 다수의 접근법들과 그들의 혼합형태들을 통해서 달성될 수 있는데, 수용액의 경우에는 소수성 및 극소수성 표면을 생성하기 위한 접근법들로 알려져 있다. 다공성 중합체가 극소수성 표면을 생성하기 위해 사용될 수도 있는데, 예를 들면 Levkin PA, Svec F, Frechet JMJ, Advanced Functional Materials, 2009 19 (12):1993-1998에 설명된 바와 같다. 윤활유 없이 슬립칩을 작동시키는 예가 설명되어 있다.
슬립칩은 유리 주형(glass mold)을 이용한 핫 엠보싱(hot embossing)에 의해 플라스틱으로 만들어졌다. 유리 주형 제조 - 유리 에칭에 의해서 유리 주형을 준비했다. 크롬 및 포토레지스트 피복이 있는 유리 플레이트 (3 mm 두께) (Telic Company, Valencia, CA)를 본 슬립칩 디자인을 가지는 포토마스크로 덮고 (패턴들은 투명 배경 위에 그림자 처리되었다) UV 광에 1 분간 노출시켰다. 노출 직후, 상기 유리 플레이트를 0.1 mol/L NaOH 용액에 2 분간 담가서 현상시켰다. 상기 UV 광에 노출된 포토레지스트 영역만 상기 용액에 용해되었다. 노출된 하부 크롬층을 크롬 에칭액 (0..365 mol/L HClO4 / (NH4)2Ce(NO3)6 용액)을 사용해서 제거했다. 그 결과 상기 디자인 내 패턴들은 여전히 크롬 및 포토레지스트 피복에 의해 덮여 있었다. 상기 플레이트를 밀리포어 물로 세심하게 헹구고 질소 가스로 건조시키고, 상기 유리 플레이트의 후면을 PVC 밀봉 테이프 (McMaster-Carr)로 붙여서 유리 후면을 보호하였다. 그리고 나서 상기 붙여진 유리 플레이트를 조심스럽게 유리 에칭 용액(..75 mol/L HF/NH4F/HNO3) 이 들어있는 플라스틱 용기에 담가서 플레이트의 노출된 유리 표면(포토레지스트와 크롬 피복이 제거된 플레이트 위의 영역)을 에칭시켰다. 40 °C 항온수조(constant-temperature water bath shaker)를 사용해서 에칭 속도를 조절하였다. 에칭 시간을 조절해서 (~55 min), 에칭 깊이가 60 μm가 되었다. 그리고 나서 에탄올과 크롬 에칭액을 사용해서 패턴들을 덮은 포토레지스트 및 크롬 피복을 제거했다. 결과적으로, 에칭되지 않은 패턴들은 60 μm-높이 기둥 형태를 가졌다. 그리고 나서 양각 패턴들이 있는 유리 플레이트를 또 다른 크롬층으로 덮었다. 193 nm에서 작동하는 Resonetics RapidX 250 엑시머 레이저로 상기 크롬층을 제거해서 홀들의 어레이 (5 μm x 5 μm)가 형성되었다. 그 결과를 조정해서 150 nm 크롬 층을 단일 펄스에서 제거하였으며, 유리에는 영향을 주지 않았다. 유리는 에칭 마스크로서 상기 크롬을 사용하는 HF로 후속 에칭되었다. 만들어진 구멍들은 용융 엠보스 플라스틱 부재에서 포스트(post)가 되며, 접촉각을 상당히 증가시킨다. 플라스틱 슬립칩 제조- 유리 주형을 사용해서 상기 칩 패턴을 1/16" 불화 에틸렌 프로필렌 (FEP, McMaster-Carr)으로 엠보스처리하였다. 상기 칩들을 260 °C, 400 lbs / in2에서 20 분 동안 Carver 3889 용융 프레스에서 엠보스처리하였다. 압력이 제거되기 전에 상기 칩들을 신속하게 실온으로 냉각시켰다.
특정 실시예들에서, 플라스틱 슬립칩 작동이 윤활유 없이 수행 가능하다. 막다른 끝 충전방법(dead-end filling method)을 이용해서 was adopted to load a dry 건조한 FEP 슬립칩에 수용액을 로딩시켰다. 어떠한 윤활유가 없는 상태에서 상기 FEP 슬립칩을 조립한 후에, 슬립칩을 두 개의 유리 슬라이드들 사이에 샌드위치시켰다. 상부 유리 슬라이드는 슬립칩 입구에 정렬되는 액세스 홀을 가졌다. 상기 “샌드위치”를 종이 클립으로 고정시켰다. 용액들은 직접 1 μL 부피를 피펫으로 상기 입구들로 전부 로딩시켰다. 상기 상부 유리 슬라이드 내의 액세스 홀들을 통해서 상기 피펫 단부들이 상기 입구들에 대해 밀어졌다. 상기 로딩 과정은 상기 용액이 막다른 끝에 도달하였을 때 동시에 중지되었다. 0.1 M Fe (NO3)3을 시약으로 사용하였고 0.3 M KSCN을 시료로 사용했다. 로딩 후에, 슬립칩의 상부 플레이트가 하부 플레이트에 대하여 미끄러졌고, 전체 공정을 통해서 칩이 상기 두 유리 플레이트들 사이에서 샌드위치 상태로 남아 있는 동안 용액은 혼합되었다. Fe (NO3)3 용액과 KSCN 용액 간의 반응으로 Fe(SCN)3을 포함한 다양한 혼합물들의 붉은 용액이 만들어졌다. 교차 오염이나 슬라이딩 후에 잔류하는 액체 잔류물에 대한 어떠한 증거도 발견되지 않았으며, 상기 붉은 혼합물이 덕트들에서는 형성하지 않았다.
건조한 FEP 장치에서의 단순한 화학 반응에 대한 하나의 예에서, 본 슬립칩의 두 개의 플레이트들은 윤활유가 없는 상태에서 정렬해서 시약과 시료에 대한 유체 통로를 형성하였다. 상기 시약과 시료 용액들은 피펫을 이용해서 본 슬립칩 내로 로딩되었다. 본 슬립칩이 미끄러져서 상기 시약을 시료와 혼합되었다. 본 반응 공정은 투명한 색에서 붉은 색으로의 색 변화를 관찰하는 것으로 모니터되었다.
특정 실시예들에서, PCR과 기타 기술들에 의한 디지털 검출을 위해서 본 슬립칩에서 다체적 확률론적 한정을 수행할 수 있다. 본 발명자들은 높은 동적 범위에 걸친 타겟 종들 또는 분자들을 디지털 검출로 정량화하기 위해서 본 슬립칩에서 다체적 확률론적 한정 방법을 개발했다. 검출은 다양한 방법들을 이용해서 달성 가능한데, PCR, 세포 배양, 효소 및 등온 증폭법을 포함한다. 확률론적 한정의 원리는 특허출원 PCT/US/2008/071374, Stochastic Confinement to Detect, Manipulate, and Utilize Molecules and Organisms에 개시되어 있다. 다체적 확률론적 한정의 잠재적인 용도로는 질병 바이오마커 진단, 모니터링 또는 검출, 환경 또는 식품 시료 테스트, 및 배양 또는 생물학적 시료 분리, 특성화, 및 분석이 포함되나, 이들에만 제한되는 것은 아니다.
디지털 PCR은 일반적으로 동일한 부피의 마이크로웰(microwell)이나 유화제을 사용하므로, 높은 정밀도와 높은 동적 범위를 달성하기 위해서는 매우 많은 구획 (수천개 내지 수백만개)이 요구된다. 슬립칩은 다중 부피의 웰들 내에서 디지털 측정을 수행하도록 고안될 수 있다. 이 방법이 단일 부피 방법에 대해서 갖는 몇 가지 이점은 더 적은 웰들로 높은 동적 범위를 갖는 점과, 다른 크기의 웰들에 범위를 중복시켜서 얻어지는 정밀도 증가가 있다. 다중의 반응 부피를 갖는 웰들의 어레이가 하나의 칩 상에 디자인되어서 전체적으로 소망하는 범위의 검출을 달성할 수 있다. 접근 방식은 일련의 희석 방법들과 유사하며, 동일한 수학 계산법에 의해서 통계 분석이 이루어질 수 있다. 다중 부피 접근법은 마이크로생물학에서 사용되어 왔는데, 예를 들면 IDEXX Quanti-Tray?/2000가 미생물의 검출과 계산에 사용되었다. 이들과 또 다른 용도들 또한 슬립칩 상에 구현될 수 있다. 다중 부피 접근법은 슬립칩 상에서의 디지털 PCR에 적용 가능하다. 세 가지 가능성 있는 작동 모드에는 다음이 포함된다: (1) PCR 시약들과 사전 혼합된 시료를 칩 속에 주입한 후, 슬라이딩을 통해 구획화하여 디지털 PCR 수행. (2) 선택적으로 다중화된 포맷으로, 프라이머 등 시약의 개별적 사전 로딩 또는 사용자 로딩 후, 슬라이딩을 통해 시료와 혼합하여 반응 개시. (3) 상기 모드들의 혼합.
표준 PCR 기술들에 추가해서, 슬립칩은 루프 매개 증폭(loop-mediated amplification, LAMP), 재조합효소 중합효소 증폭(recombinase polymerase amplification, RPA), 핵산 서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification, NASBA), 전사-매개 증폭(transcription-mediated amplification, TMA), 헬리카제 의존 증폭(helicase-dependent amplification, HAD), 회전환 증폭(rolling-circle amplification, RCA), 및 가닥치환 증폭(strand-displacement amplification, SDA) 등의 등온 증폭법들과 호환 가능하다. 상기 다중 부피 슬립칩은 이러한 플랫폼들을 디지털화하기 위해 사용될 수 있다. 상기 다중 부피 슬립칩은 세포 분석이나 검출을 포함하여, 확률론적 한정 (특허출원 PCT/US/2008/071374, Stochastic Confinement to Detect, Manipulate, and Utilize Molecules and Organisms)과 혼화 가능한 다른 시스템들에 적용 가능하다.
상기 다중 부피 슬립칩의 적용 예에 대한 하나의 예에는 HIV 바이럴 로드(viral load) 측정이 있다. 현장에서 HIV 바이럴 로드 측정하는 경우, 한 가지 바람직한 목표는 총 범위의 적어도 3 배의 농도변화 구별능력과 함께, 500 내지 1,000,000 HIV 입자/mL의 혈장 동적 범위이다. 이를 만족시키는 시스템의 하나의 예를 본 발명자들이 설명하였다. 이 예시는 50 nL 부피의 128개 웰, 10 nL 부피의 128개 웰, 2 nL 부피의 256개 웰 및 0.4 nL 부피의 512개 웰로 구성된다. 좀더 적은 부피 웰들이 좀더 많이 있는 것은 해상도를 높이는데 사용하거나 그렇지 않으면 내부 기준과 함께 시스템을 보정하는데 사용한다. HIV 바이러스 입자 당 RNA의 두 개의 사본의 경우, 디자인은 200 HIV 입자/mL의 검출 하한과, 3배 해상도가 600-3,500,000 HIV 입자/mL으로 달성되는 동적 범위를 가지며, 대부분의 범위에서 그 해상도를 상당히 초과할 것이다. 이 계산은 시료 손실 및 시료 준비 중 농도의 영향이 조정될 필요가 있으며, 이것은 예를 들면 다른 색을 가진 탐침, 또는 특정 웰들에 사전 로딩된 다른 프라이머들을 사용하는 동일 장치 상에서 검출된 내부 기준을 사용하여 이루어질 수 있다.
이 디자인은 현장 테스팅(point of care testing)에 적용 가능하다. 또는, 40-10,000,000 입자/mL 범위가 요구될 수도 있다. 장치는 이 범위를 달성하도록 설계될 수 있다. 그러한 장치의 하나의 예는 검출 하한을 위해서 75 μL의 총 시료 부피 및 0.25 nL의 순서가 되도록 최소 웰 부피를 사용한다. 시료를 사전 농축하는 능력으로 인해 더욱 적은 부피가 사용될 수 있을 것이다.
디지털 측정을 위한 본 다체적 슬립칩 방법은 B형 간염 바이럴 로드 같은 것에서 감염 로드에 대한 정확한 정보가 유용한 기타 질환들에도 적용 가능하다.
상술한 바와 유사한 구성이 폐렴 원인 진단과 같이 다른 적용 예들에 사용 가능하다. 폐렴은 많은 상이한 종에 의해서 발병될 수 있기 때문에 정확한 진단에는 주된 악성 병원균들을 검출하기 위한 고도로 복합화된 테스트가 요구된다. 또한 더 상위 수준 (하부 호흡기관의 박테리아 감염에 상당하는) 으로부터 더 하위 수준 (상부 호흡기관의 일반 박테리아 콜로니화에 상당하는)을 분화시키기 위한 정량화가 요구된다. 디자인을 16개의 동일 섹션으로 나눔으로써, 16개의 상이한 박테리아 및 바이러스 종들을 대략 1000배 농도 범위에서 검출할 수 있다. 폐렴 검출을 위한 또 다른 디자인에 의하면 악성 바이러스 종들에 대한 검출 하한과, 악성 박테리아 원인 탐지 및 감염 대비 콜로니화의 분화를 위한 충분히 큰 동적 범위를 가능하게 할 것이다. 설계에는 바이러스 검출을 위한 8 세트의 12x 200 nL 웰 및 12x 50 nL 웰이 포함될 것이다. 이 세트들은 약 1000 입자/mL 내지 약 30,000 입자/mL의 검출 범위를 가질 것이다. 또한 이 설계에는 박테리아 검출과 더욱 정교한 정량화를 위한 8 세트의 24x 25 nL 웰 및 24 x 2.5 nL 웰이 포함될 것이다. 이 세트들은 이 범위의 대부분에 걸쳐 3배 해상도를 가지면서, 약 4000 박테리아/mL 내지 최고 약 800,000 박테리아/mL 의 검출 범위를 가질 것이다. 본 검출 범위와 디자인은 테스트의 요구사항에 맞추기 위해서 필요에 따라 조정 가능한데, 웰 사이즈나 개수 변경이나 테스트 중인 시료 사전농축이 포함된다. 현존 디지털 PCR 문헌에서 언급된 것처럼, 이 접근방식은 실시간 PCR이 적용된 어떠한 용도에도 사용될 수 있다. 이 접근방식은 디지털 분석을 단일 장치 상에서 복수화시키는 것과 조합할 수 있는데, 예를 들면 복수의 시료를 첨가하거나 동일 시료에 대해 복수 테스트를 실시하거나, 또는 이들의 혼합형태에 의해서이다.
본 장치를 설계하고 결과를 분석하기 위해, 여러가지 방법이나 그들의 조합이 사용 가능하다. 장치 설계는 소망하는 검출 범위와 그 범위에서 달성 가능한 해상도 모두에 따라 달라진다. 하나의 방법은 포아송 또는 이항 분포에 기초한 통계적 접근을 사용해서, 하기 등식에서 제시된 것처럼 “최확수(Most Probable Number, MPN)” 형태로 농도를 산출하는 것이다:
Figure pct00020
여기서 n i 은 i번째 희석/웰 사이즈에서의 총 웰 개수이고, s i 는 그 레벨에서의 멸균/비어있는/미반응 웰 개수이고, v i 는 그 레벨에서 함유된 최초 시료 용액의 부분 (따라서 10 배 희석 또는 10의 인자로서 웰 부피 감소는 v i 값에 0.1을 부여할 것임)이고, d는 최초 농도이고, 따라서 본 등식에서는 d를 구해야 한다.
상기 검출 하한은 전체 웰에 함유된 총 시료 부피에 따라 달라진다. 상기 검출 상한은 시료 부피와 최소 부피에서의 웰 개수에 의해 정해진다. 여러가지 방법이나 그들의 조합을 사용해서 주어진 결과에 대한 신뢰구간(confidence interval, CI)을 설정하고, 시스템의 해상도를 결정할 수 있다. 등식 기반 근사값들은 CI 값들이 신속하게 얻어질 수 있기 때문에 유용하지만, 그들은 단지 평균 근사값들이어서 주어진 결과에는 정확하지 않을 수도 있다. 그들은 시스템/장치 디자인을 설계함에 있어서, 바람직한 성능이 합리적으로 예측 가능한지 확인하는 데에 유용하다. 일반적으로 사용되는 또 다른 세트의 방법들은 “정밀(exact)”법으로 알려져 있는데, 그것들이 모든 잠재적 결과에 대한 실제 가능성들을 활용하기 때문이다. 이 방법은 창시자들의 이름을 따서 일반적으로 클로퍼-피어슨 (CP) 및 스테른 법으로 부르는 단일 희석/부피 시스템에 가해진 현존하는 작업을 대부분 기초로 한다. CI를 사용해서 주어진 시스템의 해상도를 결정하는데, 이것이 웰의 개수와 희석 인자에 의존하는 것처럼, 원하는 해상도 또한 웰 사이즈와 개수를 좌우할 것이다. 하기 부등호를 사용해서 해상도의 인자/배수를 결정한다:
d1 의 경우 d1 + 95% CI ≤ d2 의 경우 d2 - 95% CI
두 면이 동일할 때 d1 / d2 =X이며, 이것은 해상도의 인자/배수이고, 일반적으로 전체적으로 설명된 예시들에서 최대한 3배로 세팅된다.
여러가지 슬립칩 디자인이 다체적 확률론적 한정을 구현하는 데에 사용 가능한데, 회전 슬립칩 장치, 적층형 다중층 슬립칩 장치, 및 하나 또는 두 방향으로 슬라이딩이 요구되는 장치가 해당된다. 다양한 부피의 웰들은 동일한 층에 만들어지거나 웰들을 조합하고 다중층들에 있는 홀을 통해서 만들어질 수 있다. 추가적으로, 다양한 부피의 웰들은 깊이는 같지만 측면 크기가 다른 웰들을 생성하거나, 웰들의 깊이를 다양하게 해서 만들어질 수 있다. 부피는 일정하게 유지하지만 웰들의 깊이를 늘리는 것으로 그들의 측면 크기를 줄이고, 웰들의 밀도를 증가시키는 데에 유용하다. 열적 팽창이 요구되는 적용 예에서는, 최근의 논문들에서 설명된 바와 같이 선택적으로 웰들이 윤활유나 다른 유체를 담은 저장소들과 접촉하도록 장치가 디자인될 수도 있다.
하나의 예에서, 본 장치는 50 nL 부피의 웰 128개, 10 nL 부피의 웰 128개, 2 nL 부피의 웰 256개 및 0.4 nL 부피의 웰512개를 포함하고 있다. 더 적은 부피 웰들이 더 큰 수인 것은 해상도를 높이는 데에 사용하거나, 대안으로 시스템 보정을 위한 내부 기준으로 사용할 수 있다. 정제된 HIV RNA를 함유하는 용액, 검출 목적 핵산 증폭 기술의 이용을 고려하고, HIV 바이러스 입자당 두 개의 RNA 사본을 감안할 때, 이 디자인은 200 HIV 입자/mL의 검출 하한과 600-3,500,000 HIV 입자/mL에 대해 3배 해상도가 달성될 수 있는 동적 범위를 가진다. 이 디자인은 상기 범위의 대부분에서 해상도를 상당히 초과할 것이다. 이 계산에는 시료 소모의 영향과 시료 준비 중 농도가 감안될 필요가 있으며, 예를 들면 다른 색을 갖는 프로브를 사용하거나, 특정 웰들에 사전 로딩된 다른 프라이머들을 사용하는 동일한 장치 상에서 검출된 내부 기준을 사용해서 할 수 있다. PCR 적용 예들에 있어서, 본 디자인은 선택적으로, 수용액을 함유하는 더 큰 웰들과 접촉하게 되는 오일을 함유하는 더 작은 웰들을 포함한다. 상기 더 작은 웰들이 상기 더 큰 웰들과 접촉하게 되면, 상기 수용액이 동시에 상기 구역 내 오일 주위로 액적을 형성해서, 열적 순환 중에 열적 팽창을 가능하게 한다. 상기 웰들과 덕트들은 개별적으로 상기 상부 및 하부 플레이트들 상에 패터닝될 수 있다. 상기 웰들은 본 출원 내 다른 부분들에서 설명한 기술들을 이용해서 제조 가능하다. 몇몇 디자인에서, 상기 웰들은 먼저 덕트들과 중첩되어서 연속적인 유체 통로를 형성해서 채워질 수 있게 한다. 피펫이나 기타 기계적 또는 화학적 구동 압력으로 채우는 것을 가능하게 할 수 있다. 막다른곳-충전(Dead-filling) 또는 출구로서 관통공을 전체 칩을 균일하게 채우기 위해서 이용할 수 있다. 본 슬립칩은 개별적인 반응 체적들로 미끄러질 수 있는데, 예를 들면 장치의 회전 운동에 의해서 미끄러질 수 있고, 다양한 체적의 구역들이 동시에 생성된다.
유리로 제조된 다중 체적 장치의 하나의 실시예에서, 상기 장치는 각 체적당 15개의 웰을 포함하여 총 웰 수는 135개이되, 상기 체적은 0.25nl, 0.72nl, 1.95nl, 5.24nl, 14.1nl, 38.1nl, 103nl, 278nl 및 511nl이다. 이는 약 800 내지 2,400,000 입자/ml에 대해 적어도 3배의 해상도의 동적 범위를 갖는 약 200개의 입자/ml의 검출 한계를 제공한다. 이러한 슬립칩을 제조하기 위한 과정은 이전 연구에서 개시된 과정에 기반을 두고 있다. 일반적으로, 구조는 포토리쏘그래피를 이용하여 패턴화된 후, 유리 에칭 용액(..75mol/L HF/NH4F/HNO3)을 이용함으로써 에칭되었다. 상기 장치는 디클로로디메틸실란에 의해 실란화되어 소수성 표면을 제공한다. 오렌지색 식품 염료의 용액은 상기 장치 내로 주입하고, 서로 다른 체적을 갖는 웰은 슬라이딩 이후에 생성되었다.
다른 설계에서, 상기 장치는 88개의 대형 웰, 272개의 배지 웰 및 216개의 소형 웰을 갖는다. 상기 설계는 HIV 바이럴 로드의 정량화에 적용될 수 있다. HIV 입자 당 2카피의 RNA, 및 50, 5 및 0.5nl 각각의 웰 체적을 고려하면, 이러한 설계는 약 250개의 HIV 입자/ml의 검출 한계, 및 약 800 내지 3,300,000개의 HIV 입자/ml로부터 적어도 3배의 해상도를 갖는 동적 범위를 제공하되, 상기 범위를 훨씬 넘어선 경우에 보다 양호한 해상도를 갖는다. 개개의 웰 크기에 대한 전체 범위는 검출 범위의 오버랩으로 인해 보다 높은 정밀도를 갖는다.
디지털 측정을 수행하기 위한 원형 슬립칩의 2개의 실시예가 개시되어 있다. 제1 실시예에서, HIV 바이럴 로드를 측정하기 위해 설계된 슬립칩은 각 웰당 50nl(동적 범위: 950 내지 2.5 × 104개의 입자/ml)를 갖는 88개의 웰, 각 웰당 5nl(동적 범위: 3.0 × 103 내지 3.5 × 105/ml)를 갖는 272개의 웰, 및 각 웰당 0.5nl(동적 범위: 3.8 × 104 내지 3.3 × 106/ml)를 갖는 216개의 웰을 포함하여, 적어도 3배의 해상도를 갖는 800 내지3,300,000개의 입자/ml의 총 동적 범위(4배의 농축 이후)를 제공한다. 제2 실시예에서, 폐렴 병원체를 정량화 및 정성화하고 박테리아 콜로니 형성과 감염 사이를 구별하기 위해 설계된 슬립칩은 16개의 지역을 포함하며, 여기서 8개의 지역은 바이러스 검출 및 비콜로니성 박테리아 검출을 위해 약 800 내지 4x105개의 입자/ml의 검출 범위에 대해 6 x 400nl 웰 및 26 x 50nl 웰을 포함하며, 8개의 지역은 박테리아 검출을 위해 약 103 내지 4*106입자/ml의 검출 범위를 갖는 5 x 400nl 웰, 8 x 50nl 웰 및 27 x 5nl 웰을 포함한다. 이는 콜로니 형성으로부터 감염을 구별하기 위해 상기 범위의 적어도 중간 부분에 대해 3배의 해상도를 달성할 수 있다.
다중화된 검출을 위해, 상기 장치는 다중 지역으로 분리될 수 있다. 서로 다른 시료에 대해 서로 다른 입구가 사용되어 각 지역을 채울 수 있다. 또한, 서로 다른 프라이머 및 화학성질은 서로 다른 지역으로 프리로딩될 수 있다. 상기 지역은 동일한 민감성 및 동적 범위를 가질 수 있거나, 서로 다른 민감성 및 동적 범위를 가질 수 있다. 서로 다른 민감성은, 예를 들어 폐렴에서 병원체의 멀티플렉싱된 검출을 위해 필요하되, 800 내지 105/ml 범위는 낮은 수준의 검출 및 적절한 정량화를 위해 필요하며, 102 내지 106/ml 범위에서의 검출은 감염으로부터 콜로니 형성을 구별하기 위한 개선된 정량화를 위해 S. pneumonia 및 B형 H. influenzae와 같은 병원체에 대해 필요하다. 예를 들어, 하나의 설계에서는 16개의 지역이 존재하며, 여기서 8개의 지역은 바이러스를 검출하기 위해 수 백 내지 약 40,000개의 입자/ml의 검출 범위에 대해 6 x 400nl 웰 및 26 x 50nl 웰을 포함하며, 8개의 지역은 박테리아들 검출하고 콜로니 형성과 감염 사이를 구별하기 위해 약 1000 내지 400,000개의 입자/ml의 검출 범위에 대해 5 x 400nl 웰, 8 x 50nl 웰 및 27 x 5nl 웰을 포함한다. 상기 설계는 폐렴 발병 병원체의 검출 및 정량화에 적용될 수 있다. 슬립칩은 열량 측정 또는 형광도 판독을 포함한 다양한 판독 기술과 양립 가능하다.
이들 판독 방법은 실시간 또는 종료점에서 적용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 사용자는 PCR, 등온선 증폭 및 면역 분석과 같은 추가의 분석을 위해 시료를 부유화하고 밀리리터 규모의 시료로부터 시료 제조를 수행하기 위해 슬립칩 플랫폼을 이용할 수 있다. 이러한 방법은 질병 바이오마커를 모니터링하거나 검출하고 환경적 시료 또는 음식 시료를 시험하는 진단분석용 수단을 제공하기 위해 다른 슬립칩 적용 예와 함께 적용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 슬립칩은 고 처리량 또는 조합적 방식으로 복합체 입자를 합성하기 위해 사용될 수 있다. 슬립칩은 표면 장식 및 보호, 음식 첨가제, 서방형 캡슐, 크로마토그래피, 유동 세포 분석, 약제 전달 및 조작용 세포의 캡슐화를 포함한 다수의 적용 예와 더불어 서로 다른 폴리머 및 하이드로겔로 제조된 고체 또는 하이드로겔 입자를 포함한 입자를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 정확한 크기, 형태 및 조성을 갖는 입자는 마이크로기전시스템(MEMS), 포토닉스, 진단법, 및 조직 공학에서의 적용 예를 발견하였다. 그러나, 시드 중합과 같은 현존하는 기법을 이용한 이 같은 입자의 합성은 시간 소비적이고, 비용이 많이 든다. 미세 유체 역학은 구형 입자 또는 비구형 입자, 또는 심지어 야뉴스 입자를 제조하기 위한 강력한 도구인 것으로 증명되었다. 그러나, 이들 방법을 이용하여 임의의 형태를 형성하거나 복합체 입자를 형성하는 것이 어렵다. 일반적으로, 슬립칩은 몰드로서 슬립칩을 이용함으로써 오히려 임의의 입자를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 방법은 몰드를 채우고 상기 몰드의 영역을 채우기 위해 사용된 덕트를 미끄러져 나가도록 슬립칩을 이용하는 단계, 및 입자를 형성하는 단계를 포함한다. 입자 형성을 유도하는 방법은 열적 에너지, 광학, 자외선광, 화학적 결합제 등을 이용한 경화를 포함할 수 있다. 입자를 형성하는 방법, 및 슬립칩 몰드를 제조하거나 피복하기 위한 재료는 Liquidia Technologies에 의해 사용된 것들로부터 변형될 수 있다. 입사 형성 도중에 슬립칩에서 윤활 유체, 예를 들어 불소화된 윤활 유체의 사용은 실질적으로 입자의 형성 이후에 입자의 방출을 조장할 수 있다. 입자와 접촉하고 있는 입자 재료의 전구체로 채워진 후 입자 형성을 유도하는 슬립칩의 몇몇 영역의 슬라이딩은 복합 형태 및 조성을 갖는 복합체 입자를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 입자는 슬라이딩에 의해 방출될 수 있거나, 슬립칩을 단순히 분해함으로써 방출될 수 있다. 구배 특성을 갖는 입자는 서로 다른 특성을 갖는 전구체를 접합함으로써 생성될 수 있다.
특정 실시형태에서, 매트릭스 슬립칩으로도 지칭되는 슬립칩 플랫폼은 n + m 로딩 단계를 이용하여 n × m 반응을 수행하기 위해 사용될 수 있다. 2, 3 및 4개의 성분을 혼합하기 위한 슬립칩 설계가 개시되어 있다. 박테리아 세포를 이용한 2회의 실험이 개시되어 있으며, 상기 실험은 매트릭스 슬립칩 상에서 박테리아 세포를 배양하는 단계, 매트릭스 슬립칩 상에서 박테리아-박테리아 상호작용을 스크리닝하는 단계를 포함한다. 강조될 특징으로는 고 처리량을 들 수 있다. 즉 4cm × 4cm 초과의 공간에서1024회의 평형 실험이 수행되고; 고가의 시약 및 시료가 절약되고; 정확한 시간 및 체적 제어와 다중 시간을 혼합하고; 상기 장치가 재사용 및 재구성 가능하며: 각각의 사용 이후에 상기 장치는 차후의 사용을 위해 개방 및 세척될 수 있다. 8개의 입구가 구비된 상부 플레이트는 필요에 따라 서로 다른 개수의 입구, 예를 들어 중심 설계가 동일하기 때문에 8개의 입구, 16개의 입구 및 32개의 입구를 포함하는 서로 다른 하부 플레이트와 함께 사용될 수 있고, 상기 장치를 개방하여 비례 증가된 배양, 검출 등을 위한 나노리터 방울의 함량을 추출하고, 테이프 밀봉된 층과 같은 투과성 층을 이용하여 실험의 결과, 즉 충분한 공기 공급이 있지만 증발이 없는 나노리터 호기성 세포 배양 또는 호기성 배양; 공기 공급 채널; 산소 수송을 위한 나노포스트 패턴에 접촉하고; 데이터를 재생하고 데이터 품질을 향상시키기 위한 복제를 용이하게 생성하고; 다수의 복제 웰은 추가의 사용 및 분석, 즉 중력 또는 자력에 의한 하나의 플레이트 상의 웰로부터 다른 플레이트 상의 웰로 비드 및 세포의 전달을 위해 상기 장치로부터 추가의 생성물을 추출할 수 있게 하고; 본원에서 개시된 장치 및 방법은 다수의 적용 예를 위해 사용될 수 있다. 특히, 슬립칩은 특히 단백질 결정화, 멀티플렉스 게놈 서열 분석, 세포-세포 상호작용, 단백질-단백질 상호작용, 및 약제 스크리닝 등의 고 처리량 스크리닝을 수행하기 위한 플랫폼으로써 사용될 수 있다.
매트릭스 슬립칩은 다수의 부가의 적용 예를 갖는다. 단백질 안정성(예를 들어 1-아닐로나프탈렌-8-설폰산(ANS)과 유사한 소수성 염료의 형광도를 모니터링함으로써)을 반영하는 ThermoFluor Assays 및 기타 분석은 온도의 함수 또는 화학적 조건의 변화로서 단백질 분자의 안정성을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 이들 분석은 약제 발견에서의 리간드 결합, 및 결정학을 위한 리간드 및 완충액 조건의 최적화를 모니터링하는데 유용하다. 슬립칩 및 매트릭스 슬립칩은 Measurements of Copy Number Variation, Gene Expression, Protein Crystallization, Sample Quantification for Next Gen Sequencing, Single Cell Gene Expression, SNP Genotyping을 포함하여 Fluidigm에 의해 시장화된 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다수의 부가적인 적용 예를 가능케 할 수 있다는 것이 당업자에게 자명할 것이다.
매트릭스 슬립칩은 상부 플레이트 및 상보적인 패턴을 갖는 하부 플레이트로 구성되어 있다. 이는 크롬 및 포토레지스트 피복(Telic Company, Valencia, CA)과 함께 소다 석회 유리 플레이트를 사용함으로써 제조되었다. 유리 플레이트 상의 미세 채널 및 웰은 표준 포토리쏘그래피 및 습식 화학적 에칭 기법을 이용함으로써 제조되었다. 간단하게는, 포토레지스트 피복을 갖는 유리 플레이트는 미세 채널 및 웰의 설계를 포함하는 포토마스크와 함께 배열되고, 1분 동안 UV광에 노출된다. 포토마스크를 제거하고, 0.1mol/L NaOH 용액에서 2분 동안 침지시킴으로써 유리 플레이트를 현상하였다. 노출된 하부 크롬층은 크롬 에칭제(0..365M HClO4/(NH4)2Ce(NO3)6의 용액)를 이용하여 제거되었다. 플레이트를 밀리포어 수로 세척하고, 질소 가스로 건조하였으며, 유리 플레이트의 배면은 PVC 밀봉 테이프(McMaster-Carr)로 테이핑하여 유리의 배면을 보호하였다. 이어 테이핑된 유리 플레이트를 유리 에칭 용액(..75M HF/NH4F/HNO3)이 들어있는 플라스틱 용기에서 조심스럽게 침지시켜, 크롬 피복이 제거된 이후에 노출된 유리 표면을 에칭하였다. 40℃ 항온 수욕 교반기를 이용하여 에칭 속도를 제어하였다. 약 25분 동안의 에칭은 약 30 μm 깊이가 수득되었다. 에칭 이후, 상기 플레이트로부터 테이프를 제거하였다. 이어 플레이트를 밀리포어 수로 완전히 세정하고, 질소 가스로 건조하였다. 다이아몬드 드릴 비트를 이용하여 액세스 홀을 0.030인치의 직경으로 드릴링하였다. 에칭된 유리 플레이트의 표면을 밀리포어 수로 세척한 후, 에탄올로 세척하고, 실란화 이전에 산소 플라즈마 처리에 적용하였다.
슬립칩 중의 호기성 세포를 배양하기 위해, 상부 플레이트 상에 나노포스트 패턴을 제조하여 산소 공급을 향상시켰다. 나노포스트 패턴을 형성하기 위해, 30 μm 패턴을 에칭한 이후에 상부 플레이트를 물로 세척하고, 질소 가스로 건조하였다. 본 발명자들은 초기 포토레지스트 및 크롬 피복이 에칭되지 않은 이들 영역을 여전히 커버하고 있다는 것을 이용하였다. 플레이트는 나노포스트 포토마스크와 함께 배열되었고, 동일한 과정은 노출된 하부 크롬을 제거하는 단계를 통해 후술된 바와 같이 이루어졌다. 크롬 피복을 제거한 후, 상부 플레이트를 ..75M HF/NH4F/HNO3mol/L HF/NH4F/HNO3 에칭 용액에 침지시키고, 30 내지 90초 동안 실온(약 23℃)에서 에칭하여 표면 위에 목적하는 나노포스트 높이를 형성하였다. 최종적으로 상부 플레이트 및 하부 플레이트(나노포스트를 갖지 않음)를 에탄올로 세정하여 현상되지 않는 포토레지스트를 제거하고, 크롬 에칭제에 침지시켜 크롬 피복을 제거하였다. 이어 유리를 에탄올 및 밀리포어 수로 세정하고, 질소 가스로 건조하였다.
유리 플레이트를 세척하고, 산소 플라즈마 처리에 적용한 후, 상술한 바와 같이 트리데카플루오로-1,1,2,2-테트라하이드로옥틸-1-트리클로로실란에 의해 진공 건조기에서 실란화에 의해 소수성을 부여하였다. 실란화 이후, 유리 플레이트를 30분 동안 120℃에서 베이킹하고, FC-3283의 탱크에 침지시킴으로써 세정하고, 60℃ 오븐에서 하룻밤 동안 건조하였다.
사용 이전에, 매트릭스 슬립칩의 하부 플레이트 및 상부 플레이트를 비누, 밀리포어 수 및 100% 에탄올로 차례로 제척하고, 질소로 건조한 후, 서로 대향하고 있는 에칭된 패턴을 갖는 깨끗한 페트리 접시에 놓았다. 0.4mg/ml RfOEG3을 함유한 50μL FC-40(3M) 불소화된 오일을 하부 플레이트의 표면 상에 도말하고, 이어 상부 플레이트를 하부 플레이트 상에 놓았다(하측이 패턴화됨). FC-40은 실란화된 표면을 완전히 적시고, 2개의 플레이트 사이에 도말되었다. 2개의 플레이트를 이들을 서로에 대해 미끄러지게 함으로써 정렬시킨 후, 2개의 미세 바인더 클립을 이용하여 고정하였다. 슬립칩은 표면 상의 여분의 FC-40이 제거된 이후에 사용 준비가 되었다. 매트릭스 슬립칩의 플레이트 둘 모두는 타원형 웰을 포함하였다. 상기 웰은 너비가 200 μm이고, 길이가 400 μm이며, 30 μm의 깊이로 에칭되어, 체적이 약 2nl이었다. 연결용 미세 채널은 길이가 860 μm이고, 너비가 80 μm이고, 깊이가 30 μm이었다. 용액을 로딩하기 이전에 상기 장치의 입구에 진공을 가함으로써 채널 및 웰 중의 오일을 흡입하였다. 4개의 식품 염료(적색, 오렌지색, 녹색 및 청색, Ateco, Glen Cove, NY)는 사용 이전에 이들의 스톡 용액으로부터 약 20배 희석하고, 0.45 μm PVDF 주사기 필터로 여과하였다. 용액은 32개의 칼럼 중의 웰 내로 8개의 입구로부터 피펫 로딩하였다. 각 채널을 로딩하기 위해, 먼저 염료 용액이 출구로부터 나올 때까지 8μL의 염료를 피펫을 이용하여 입구를 통해 밀어 넣었다. 시약을 로딩한 이후, 먼저 상부 플레이트를 아래로 미끄러지게 한 후, 좌측으로 미끄러지게 하여 열에서 연속 유체 경로를 형성하였다. 동일한 4개의 식품 염료 용액을 8개의 입구를 통해 좌측으로부터 로딩하여 웰의 32개의 열을 채웠다. 피펫을 이용하여 모든 채널이 완전히 채워질 때까지 8 μL의 염료를 칩 내로 로딩하였다. 일단 열이 로딩되면, 다시 상부 플레이트를 미끄러지게 하여 칼럼 중의 1024개의 웰을 상부 플레이트 상에서 혼합하고, 열 중의 1024개의 웰을 하부 플레이트 상에서 혼합하였다.
본 발명자들은 하기 3성분 및 4성분 매트릭스 슬립칩을 설계하여 하나의 구역에서 2개 이상의 성분의 혼합을 혼입하였다. 여분의 세척 단계는 동일한 연결 채널을 이용하는 2세트의 인접한 웰을 로딩하기 위해 필요하다는 것을 제외하고는 2성분 매트릭스 슬립칩에 대해 개시된 유사한 과정을 이용하여 식품 염료 실험을 수행하였다.
3성분 혼합 매트릭스 슬립칩의 단계적 작동에서, 하부 플레이트 중의 제1 세트의 웰이 채워진다. 선택적으로, 칩은 미끄러지게 되고, 동일한 덕트가 시용되어 하부 플레이트 중의 제2 세트의 웰을 채운다. 슬립칩이 미끄러지게 되어(예를 들어, X 및 Y 방향), 수평 열이 정렬되고, 상부 플레이트 중의 웰이 채워지며, 슬립칩이 미끄러지게 되어 웰이 서로 오버래핑되어, 상부 웰 중의 용액과 2개의 인접한 하부 웰 중의 용액을 조합한다.
4성분 혼합 매트릭스 슬립칩의 단계적 작동에서, 하부 플레이트 중의 제1 세트의 웰이 채워진다. 선택적으로, 칩이 미끄러지게 되고, 제2 세트의 웰이 채워지게 된다. 슬립칩이 미끄러지게 되어 수평 열이 정렬되고, 및 상부 플레이트 중의 제1 세트의 웰이 채워진다. 슬립칩이 미끄러지게 되어 상부 플레이트 중의 제2 세트의 수평 웰이 채워진다. 연결 채널이 먼저 완충액으로 세척되었다. 슬립칩이 미끄러지게 되어 웰이 서로 오버래핑되어, 2개의 인접한 상부 웰 중의 용액과 2개의 인접한 하부 웰 중의 용액을 조합한다.
식품 염료를 이용한 4성분 매트릭스 슬립칩의 단계적 작동에서, 제1 단계에서는 제1 세트의 수직 웰이 로딩되었다. 제2 단계에서는 슬라이딩이 일어나 제2 세트의 수직 웰을 채운 후, 슬라이딩에 의해 수평 웰 및 덕트를 정렬하였다. 이어 제1 세트의 수평 웰을 채운 후, 슬라이딩 및 제2 세트의 수평 웰의 충전을 수행하고, 최종적으로 슬라이딩에 의해 4개의 웰 중의 용액을 조합하였다.
서로 다른 박테리아 세포(호기성 또는 호기성 균주를 포함함)를 슬립칩 상에서 배양 성공은 세포 대 약제 스크리닝, 박테리아 항생제 내성, 박테리아 정량 센싱, 다중 종 군집 상호작용 등의 추가적인 연구에 필수적이다. 통상적인 방법에 비해, 매트릭스 슬립칩은 나노리터 체적을 이용하여 단일 세포 또는 작은 그룹의 세포를 관측할 수 있으며, 이는 처리량을 증가시키고, 시간 및 시약을 절약할 수 있다.
매트릭스 슬립칩 중의 나노리터 웰에서 호기성 박테리아를 배양하고 성장시킬 수 있도록 하기 위해, 사용자는 이들 웰에 연속적으로 산소를 공급할 필요가 있다. 이는 하기 특징에 의해 슬립칩 상에서 달성되었다. 분리된 웰에서 세포를 배양하기 위해, 본 발명자들은 수직 웰 및 채널을 연결시켰고, 얻어진 유체 경로를 공기로 로딩하여 브리딩 채널(breathing channel)을 형성하였다. 각 분리된 웰은 2개의 근접한 브리딩 채널로부터 산소를 공급할 수 있다. 웰과 브리딩 채널 사이의 거리는 240 μm였다. 매트릭스 슬립칩은 FC-40을 윤활 오일로 사용하였으며, 이는 매우 낮은 산소 용해도 및 양호한 산소 투과성을 갖는다. 나노미터 내지 마이크로미터 두께의 FC-40 막은 산소의 전달을 지지할 수 있다. 브리딩 채널의 산소 공급 효율은 2개의 플레이트 사이의 FC-40 막의 두께에 의해 제한되기 때문에 본 발명자들은 상부 플레이트 상에 나노포스트 패턴을 제작하였다. 이는 FC-40 막의 두께를 500nm의 예상 두께에서 1.5 μm까지 증가시켰다. D 내지 도 F에 도시된 바와 같이, 이러한 증가는 슬립칩 중의 대장균(Escherichia coli) DS 적혈구의 성장을 효과적으로 증가시켰다.
슬립칩에서의 배양 동질성이 하기에 개시된 바와 같이 테스트되었다.
플라스미드 pDsred를 갖는 대장균을 수득하였다. 세포의 스톡 용액을 --80℃에 저장하였다. 각각의 실험 이전에 스톡 용액을 100μg/ml 암피실린을 함유하는 LB 아가 플레이트(Difco LB Broth, Miller, 2%(wt/vol) 아가 분말을 함유함, Alfa Aesar) 상에 스트리킹(streak)하였다. 플레이트를 30℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 콜로니를 암피실린(100μg/ml)이 들어있는 3ml의 LB 배지가 들어 있는 시험관 내에서 배양하고, 30℃에서 160rpm으로 하룻밤 동안 계대 배양하였다. 상기 장치에 로딩된 박테리아 배양액은 하룻밤 동안 배양한 배양액으로부터 재접종하여, 대수기까지 배양하였다. 상기 장치에 세포를 로딩하는 경우, 박테리아 세포 밀도는 웰당 약 22 세포를 수득하도록 1.1 ×107 세포/ml로 조절하였다.
32×32 매트릭스 슬립칩은 앞서 개시된 바와 같이 제조하였다. 상부 플레이트 중의 8개의 입구로부터 피펫 로딩 이전에 세포 현탁액을 교반하였다. 8μL의 세포 현탁액을 각 입구에 로딩하였다. 로딩 이후에, 상기 장치를 미끄러지게 하여 채널로부터 칼럼 중의 웰을 분리하고, 공기 공급 채널로 작용하도록 열 중의 채널 및 웰을 연결시켰다. 공기 공급 채널 중의 오일은 진공 하에 제거되어 대장균 성장을 위한 공기 수송을 가능케 하였다.
미세 바인더 클립을 제거하고, 32x32 매트릭스 슬립칩을 페트리 접시 내에 조심스럽게 놓았다. 50μL의FC-40를 함유한 2개의 작은 캡 및 100μL의 H2O를 함유한 하나의 캡은 슬립칩과 나란하게 페트리 접시에 유지하여, 상기 페트리 접시에 수분을 공급하였다. 파라핀으로 페트리 접시를 감싸서 수분 방출을 방지하였다.
대장균의 성장은 10×0.4 NA Leica 대물렌즈 및 Hamamatsu ORCAER 카메라가 구비된 Leica DMI6000 형광 현미경을 이용하여 암실에서 16시간 동안 2시간 마다 촬상하였다. Texas 적색 필터를 이용하여 Dsred 형광도를 수집하였다. 40ms의 노출 시간이 이용되었다. 현미경을 보정하기 위해, Texas 적색 필터용 형광 기준 슬라이드의 형광 강도를 기록하고, 배경 교정을 위해 사용하였다. 다중 치수 획득 기능이 구비된 메타모프 이미징 시스템 버전 6.3r1(Universal Imaging)을 사용하여 이미지를 취득하여 분석했다. 박테리아 성장을 비교하고 정량화하기 위해, 측정원(measure circle)을 그려 웰을 커버하고, 배경 기질을 갖는 통합된 형광 강도를 모든 웰에 대해 측정하였다. 웰의 32x32 매트릭스는 16x16 유니트로서 그룹핑되었고, 각 유니트의 평균 강도는 3개의 서로 다른 장치(나노포스트 없음, 426nm 나노포스트, 및 940nm 나노포스트 각각)에 대해 수집되었다. 그 결과는 나노포스트 패턴이 매트릭스 슬립칩 상에서의 대장균의 성장을 향상시킬 수 있다는 것을 한정하였다.
브리딩 채널이 구비된 장치 상에서의 세포 배양을 위해, 박테리아 배양액으로 로딩된 수직 분리 웰, 및 연결되어 박테리아 웰에 산소를 공급하기 위해 공기로 로딩된 수평 웰 및 채널이 존재하였다. 상부 플레이트 상의 나노포스트는 산소 교환을 가속화하였다. 나노포스트는 그 크기가 20 μm x 20 μm이고, 높이가 900nm이었으며, 나노포스트 사이의 간격은 80 μm이었다. 나노포스트는 장치 내부에 FC-40로 채워진 간극을 1 μm 초과로 유지할 것이다. 이러한 오일은 공기 투과성이고, 브리딩 채널 및 박테리아 웰로부터 산소의 교환을 가속화한다. 서로 다른 나노 패턴 높이는 대장균 DS red를 배양하기 위해 사용되었다: 나노포스트 없음; 426nm 나노포스트; 940nm 나노포스트. 나노포스트의 높이가 증가함에 따라 상기 장치에서의 성장이 더욱 양호하고 더욱 균일하다.
16개의 입구(각 입구는 2개의 칼럼에 용액을 분배함)가 구비된 32×32 매트릭스 슬립칩을 앞서 개시된 바와 같이 제조하였다. 상기 장치는 유체 경로가 칼럼 방향으로 형성되도록 정렬되었다. 3개의 항생제인 클로람페니콜, 카나마이신 및 스트렙토마이신을 서로 다른 농도(각 항생제에 대해 0.01μg/ml, 0.1μg/ml, 1μg/ml, 10μg/ml 및100μg/ml)를 갖는 LB 액체 배지에 용해하고, 칼럼 중의 웰 내에 로딩하였다. 이어 상기 장치를 미끄러지게 하여 열 중의 웰을 연결하여, 대장균을 플라스미드 pDsred로 로딩하였다. 대장균을 이전 단락에서 개시된 바와 같이 배양하였다. 박테리아 세포 밀도를 계수하고, 약2.4×107 세포/ml로 조절하여 각 웰당 약 48 마리의 대장균 세포를 수득하였다. 이어, 상기 장치를 미끄러지게 하여 대장균이 들어 있는 하부 플레이트 상의 웰을 항생제 용액이 들어 있는 상부 플레이트 상의 웰과 접촉하게 하였다. 상기 장치를 상부 플레이트가 하부로 향하고 있는 상태에서 30분 동안 방치하여, 다수의 대장균 세포가 중력에 의해 상부 플레이트 중의 웰에 가라앉도록 하였다. 이어 상기 장치를 천천히 미끄러지게 하여 연속 유체 경로가 다시 열 방향으로 형성하여 공기 공급 채널로서 작용하도록 하였다. 공기 공급 채널 중의 용액은 진공 하에 제거되어 E. 콜리 성장을 위한 공기 수송을 가능케 하였다.
매트릭스 슬립칩을 페트리 접시에 넣고, 앞서 개시된 바와 같이 E. 콜리의 성장을 16시간 동안 촬상하였다. 16시간의 시점에 동일한 데이터 분석을 모든 웰에 대해 수행하였으며, E. 콜리 세포로부터의 통합된 형광 강도는 회색 축척 지도로서 작도(plot)되었다. 각 항생제 농도, 및 항생제가 없는 대조군에 있어서, 2개의 평형 컬럼에서 64개의 웰이 존재하였다. 이들 64개의 웰의 평균 강도를 작도하였다.
96-웰 플레이트 상의 대조군 실험은 동일한 세포 시료 및 항생제 농도에 대해서 수행되었다. 기본적으로, 100μL 분취량의 세포 현탁액을 웰 내로 첨가한 후, 서로 다른 농도를 갖는 100μL의 항생제를 첨가하였다. OD 유니트는 미세 플레이트 판독기에서 0시간 및 16시간 이후의 시점에 측정되었다. 매트릭스 슬립칩을 이용하여 수득된 것과 유사한 E. 콜리 성장 억제 정지점(breakpoint)은 3개의 항생제 모두에 대해 관측되었다.
32x32 매트릭스 슬립칩에서 항생제 스크리닝을 위해, 16시간 이후에 통합 강도는 대조군(LB 액체 배지) 및 서로 다른 농도의 3개의 항생제(클로람페니콜, 카나마이신 및 스트렙토마이신)와 혼합 이후에 32x32 슬립칩 상의 대장균의 성장을 나타낸다. 각 항생제에 대한 농도는 0.01μg/ml, 0.1μg/ml, 1μg/mL, 10μg/ml, 및 100μg/ml이었다. 초기 E. 콜리 세포 밀도는 2.4×107 세포/mL이었다. 배양 16 시간 이후에 데이터를 분석하였다. 평균 형광 강도는 서로 다른 항생제 농도에서 16시간 동안 배양한 이후에 E. 콜리으로부터 수득되었다 정지점은 서로 다른 항생제 농도 하에서의 성장의 차이를 나타낸다.
특정 실시형태에서, 시각적 판독 또는 휴대전화 판독에 의한 농도의 아날로그 대 디지털 변환을 슬립칩 상에서 수행할 수 있다. 역치값을 갖는 화학성질을 이용하여 아날로그 판독에서 디지털 판독으로 변환할 수 있다. 역치값의 정의는 “Stochastic Confinement to Detect, Manipulate, and Utilizemolecules and Organisms” 라는 표제의 특허 출원서(공개 공보 제 WO/2009/048673 호, 국제 출원 제 PCT/US2008/071374 호)에서 찾아볼 수 있다. 상기 분석의 경우, 아날로그 판독은 특정 물질의 양에 상응하는 신호이고, 연속 규모로 표현되며, 따라서 판독할 장비를 필요로 한다. 디지털 판독은 숫자로 표시되며, 이러한 경우에 이는 예/아니오 값이다(“예”는 역치값 초과이고, “아니오”는 역치값 미만임). 이 같은 아날로그 대 디지털 변환은 시각적 판독을 허용하는 분석과 결합되는 경우에 특별한 장비 없이도 슬립칩에서 수행될 수 있다. 역치값 기반 아날로그 대 디지털 변환은 상기 결과가 구현되게 하고, 육안으로 반 정량화되게 하거나, 추가의 분석 및 저장을 위해 사진을 전송할 수 있는 휴대전하 카메라와 같은 간단한 카메라에 의해 캡쳐된다. 이러한 접근법은 다양한 분석, 및 다양한 역치값 화학성질을 이용하여 이루어진다. 특히, 본 발명자들은 효소 및 금 나노 입자(Au NP)를 이용하여 2가지 유형의 역치값 화학성질을 증명하였다. 효소: 억제제가 효소에 견고하게 결합하여, 촉매가 촉매 기능을 수행하지 못하도록 억제하는 경우에 역치값이 존재한다. 소량의 효소가 존재하는 경우, 모든 효소 분자가 촉매 기능을 수행하지 못하도록 억제하기에 충분한 억제제가 존재할 것이다. 다량의 효소가 존재하는 경우, 효소 반응을 억제하기에 충분한 억제제가 존재하지 않을 것이다. 그 결과, 특정 량의 억제제에 있어서, 역치값이 존재할 것이고, 이는 효소 농도가 역치값을 초과하는 경우에만 발명자들은 신호를 관측할 수 있다는 것을 의미한다. 따라서 역치값 위치는 억제제의 양에 의존한다. 여기서 본 발명자들은 의 비율로 아세틸콜린에스터라제(acetylcholinesterase, AChE)에 견고하게 결합하는 억제제인 syn -(S)-TZ2PIQ-A51을 이용하였다. AChE의 역치값 양은 억제제의 양에 의해 설정된다. AChE는 아세틸티오콜린을 가수분해하여 티오콜린을 생성한다. 티오콜린은 stach/I2 복합체와 반응한다. 상기 반응은 짙은 파랑에서 투명하게 색 변화를 야기한다. 금 나노 입자(Au NP): Au NP는 (하이드로퀴논의 존재 하에) 검은색 침전물인 은(0) 입자로의 은 (I) 이온(무색임)의 환원을 촉매할 수 있다. 견고한 Au-S 결합을 통해 티올은 Au NP의 표면 상에 층을 형성한다. 상기 층은 용액 중에서 Au NP 표면과 반응물 사이의 상호작용을 차단할 것이다. Au NP가 소량 존재하는 경우, 모든 Au NP의 표면을 피복하기에 충분한 티올이 존재할 것이고, 이는 Au와 은 사이의 접촉을 억제하고 은 증강 반응(silver enhancement reaction)을 억제한다. Au가 다량으로 존재하는 경우, Au의 전체 표면을 피복하기에 충분한 티올이 존재하지 못할 것이고, 은 증강은 신속하게 일어날 것이다. Au NP가 티올의 양에 비해 과량으로 존재하는 경우에만 은에 노출된 표면이 존재할 수 있으며, 따라서 역치값 위치는 티올의 양에 의존하였다.
역치값의 화학성질은 분석과 결합될 수 있다. 예를 들어, 역치값은 면역 분석의 리포터(reporter) 분자에 결합될 수 있다. 본 발명자들은 슬립칩에서 시스타틴 C(cystatin C)에 대한 면역 분석이 리포터 분자인 AChE의 역치값을 이용함으로써 시각적 디지털 판독을 제공하였다는 실험적 결과를 본원에서 보고하였다. 또한 본 발명자들은 Au NP에 대한 역치값을 슬립칩에서 작용하여 시각적 디지털 판독을 제공하였으며, 따라서 이는 면역 분석과 같은 분석에 이러한 역치값을 적용할 가능성을 증명한다는 것을 보여주었다.
인슐린에 대한 샌드위치 면역 분석이 슬립칩에서 성공적으로 증명되었다. 그러나, 상기 분석에 대한 판독은 여전히 형광 현미경을 요구하였다. 여기서, 본 발명자들은 리포터 효소로서 AChE를 이용하여 시스타틴 C에 대한 분석을 변형하였다. 상기 분석은 서로 다른 양의 억제제인 syn-(S)-TZ2PIQ-A5에 의해 설정된 역치값으로 인해 디지털 판독을 제공하였으며, 짙은 청색 전분/I2 복합체와 티오콜린(효소 반응의 생성물)의 변색 반응을 수행하여 혼합물을 무색으로 제조함으로써 시각적 판독을 제공하였다. 시스타틴 C의 양은 AChE의 양과 일차적으로 상호연관이 있다. 서로 다른 양의 억제제를 이용함으로써 본 발명자들은 AChE에 대해 서로 다른 역치값을 설정할 수 있다. AChE의 농도는 특정의 역치값에서 반응이 진행하도록 할 것이고, 다른 역치값에서 상기 반응이 억제된다. 이 같은 결과는 AChE의 농도 범위를 나타낼 것이고, 그 결과로서 시스타틴 C의 농도 범위를 나타낼 것이다.
이러한 슬립칩은 보다 큰 치수의 변경, 각 열에서의 웰의 수의 변화, 상부 플레이트에서의 시약에 대한 부가적인 열, 이 같은 열에서의 변경된 깊이를 포함하는 비드 기반 면역 분석을 수행하기 위해 사용된 것과 유사하며, 이는 다중 역치값 농도가 단일 슬립칩 상에서 평가되도록 하였다.
역치값을 이용한 면역 분석용 슬립칩에 있어서, 다이아몬드 웰의 치수는 780 μm x 780 μm이었다. 덕트는 너비가 380 μm이고, 깊이가 90 μm이었다. 열과 칼럼 사이의 간격은 각각 2.5 및 1.5 mm이었다. 슬립칩의 하부 플레이트는 시약을 유지하기 위한 웰, 및 시약을 로딩하기 위한 덕트를 포함하였다. 상부 플레이트에서, 덕트는 시료를 로딩하기 위해 사용되었다. 상부 플레이트 상의 제1열 중의 웰은 캡쳐용 혼합물(capturing mixture)로 로딩되었다. 제2 내지 제5 열은 세척용 완충액으로 채워지고, 제6 열은 억제제로 로딩되며, 제7 열은 기질로 로딩되었다. 제6 열 중의 웰은 [16, 21, 28, 51, 90] μm 각각의 깊이를 갖는 5개의 세트의 [5, 6, 6, 6, 6] 웰로 분류되었다. 상기 상부 플레이트 사의 다른 웰들은 90 μm 깊이었다. 하부 플레이트의 다른 웰은 깊이가 7 μm이었다. 면역 분석에 있어서, 상기 플레이트는 캡쳐용 혼합물을 로딩하기 위해 정렬되었다. 상기 플레이트는 시약을 로딩하기 위해 다수 회 미끄러지고 정렬되었으며, 이어 검체를 로딩하기 위해 미끄러지고 정렬되었다. 상기 플레이트는 하부 플레이트 중의 웰의 열이 상부 플레이트 중의 웰의 각 열과 차례로 접촉하도록 미끄러지게 된 후, 최종 결과를 나타내기 위해 미끄러지게 되었다.
슬립칩에서의 효소적 면역 분석 전체를 수행하기 전에, 본 발명자들은 슬립칩에서 단지 AChE의 단순 역치값 및 syn-(S)-TZ2PIQ-A5 억제제를 나타냄으로써 AChE 역치값의 이용을 검증하였다. 실제로, 5nM의 최종 억제제 농도에서 AChE는 예상된 바와 같이 5nM(최종 농도)에서의 역치값을 나타냈다. 5nM 초과의 AChE 농도에 의한 반응은 거의 투명한 용액을 제공하는 반면, 5nM 이하의 AChE 농도에 의한 반응은 짙은 청색으로 유지되었다.
슬립칩에서의 효소 역치값에 대한 화학성질에 있어서, 상부 플레이트는 동일한 입구에 연결된 웰의 4개의 열을 구비하였다. 하부 플레이트는 개개의 입구 및 출구를 갖는 웰의 4개의 열을 구비하였다. 상부 플레이트 상의 웰의 깊이는 80 μm이고, 하부 플레이트 상의 웰의 깊이는 60 μm이었다. 억제제의 용액은 상부 플레이트 상의 웰 내로 로딩되었다. 서로 다른 농도를 갖는 4개의 서로 다른 AChE 용액은 하부 플레이트 상의 웰 내로 로딩되었다. 하부 플레이트는 상부 플레이트에 대해 미끄러지게 되어 상기 플레이트 둘 모두 상의 웰이 오버래핑되도록 하였다. 30분 동안의 배양 이후, 2개의 플레이트를 초기 위치로 다시 미끄러지게 하였다. 기질 혼합물은 상부 플레이트 상의 웰 내로 로딩되었다. 슬립칩은 다시 미끄러지게 되어 상부 및 하부 플레이트의 웰이 서로 접촉하게 하였으며, 상기 반응은 현미경으로 모니터링하였다.
또한 본 발명자들은 Au NP를 이용하여 다른 유형의 역치값 발생 반응인 은 환원에 대한 예비 결과를 수득하였다. 본 발명자들은 웰 플레이트 상의 Au NP에서 역치값을 나타냈다. 여기서, 본 발명자들은 이러한 역치값이 슬립칩에서 수행될 수 있다는 것을 증명하였다. 이러한 실험에서, 본 발명자들은 티올 억제제의 양을 변경하면서 일정한 농도의 Au NP를 이용하였다. 2-메르캅토에탄올의 농도가 110 μm 미만인 경우, 티올은 Au NP의 표면을 완전히 커버하지 못하여, 짙은 색으로 표시된 바와 같이 Ag (I)의 환원이 진행되었다. 그러나 2-메르캅토에탄올의 농도가 330 μm을 초과하는 경우, 반응이 억제되고, 어떠한 신호도 관측되지 않았다. Au NP는 생물학적 적용 예에서 일반적으로 사용되는 태그이며, 이는 이러한 방법을 광범위한 검출 반응에 결합시키는 것을 가능케 한다.
AChE의 역치값 및 슬립칩 생체접합에서 면역 분석에 있어서, 제조사의 지침서를 이용하여 비드-Ab:시스타틴 C 항체 클론 24(Genway, cat#20-511-242278)는 토실화(tosylation)된 상자성 비드(Invitrogen, cat#65501)에 접합되었다. Ab-비오틴:시스타틴 C 항체 클론 10(Genway, cat#20-511-242277)은 제조사의 지침서를 이용하여 Lightning Link 키트(Innova Biosciences, cat# 704-0010)를 이용하여 비오틴에 접합되었다.
용액은 하기와 같이 제조되었다: 포스페이트 완충액: 1mg/mL의 BAB: 플루로닉(pluronic) F127(BASF)을 함유한 0.1M 인산나트륨(pH 7). 1xDPBS(Gibco, pH 7) 중의1mg/mL의 WB: BAB 플루로닉 F127. 여분의 0.2M NaCl(총 0.337mM NaCl)을 함유한 전분 용액: 포스페이트 완충액 중의 옥수수 가루 현탁액을 10분 동안 끓이고, 실온까지 냉각시켰다. 이어 상층액을 5- μm 멤브레인이 구비된 주사기 필터를 통해 여과하여 전분 용액을 얻었다. 기질 혼합물 1: 45 μL의 전분 용액, 5 μL의 아세틸티오콜린 용액(포스페이트 완충액 중 0.4M), 및 1 μL의 620 μL의 NaI 용액(18.64 mg) 및 I2(1.55 mg)를 볼텍싱(vortexing)에 의해600-μL 미세 원심분리관에서 물에 혼합하였다. 기질 혼합물 2: 98μL의 전분 용액, 1μL의 아세틸티오콜린 용액(포스페이트 완충액중의 0.4M), 및 1μL의 4.016 mL NaI 용액(798.07mg) 및 I2(101.93M)를 볼텍싱에 의해 600-μL 미세 원심분리관에서 포스페이트 완충액에 혼합하였다. 캡쳐용 혼합물: BAB 중의 2.5mg/mL의 비드-Ab, 0.025mg/mL의 Ab-비오틴 및 25mg/mL의 AChE-아비딘(Cayman Chemicals, cat#400045).
슬립칩 상의 특징부의 제조는 하기와 같이 수행되었다: 단순 역치값을 위한 슬립칩은 앞서 개시된 바와 같이 제조되었다. 웰의 치수는 상부 플레이트 상에서 1960 μm x 400 μm x 80 μm이고, 하부 플레이트 상에서 1920 μm x 360 μm x 60 μm이었다. 역치값에 의한 면역 분석용 슬립칩 상에는 상부 플레이트의 제6 열의 웰, 및 하부 플레이트의 웰을 제외한 모든 특징부가 앞서 개시된 바와 같이 제조되었다. 부 플레이트의 제6 열의 웰 및 하부 플레이트 중의 웰은 레이저 드릴링(7의 반확대 배율(demagnification), 130mJ의 일정 에너지 모드, 75-mm 렌즈 및 2.5J/cm2의 플루언스(fluence)를 갖는 Resonetics RapidX250 시스템)을 이용하여 형성되었다.
슬립칩의 피복은 하기와 같이 수행되었다: 단순 역치값을 위한 슬립칩의 표면 처리는 앞서 개시된 바와 같이 수행되었다. 역치값을 이용한 면역 분석용 슬립칩은 FEP로 피복되어 수용액에 의해 임의의 특징부(웰 또는 덕트)를 함유하지 않는 영역의 습윤화를 방지하기 위한 강력한 피복을 갖는다. 노출된 유리 칩은 H2SO4 98%: H2O2 30%( v/v)에서 1시간 동안 세척되었다. 이어 이들은 용액 내로 들어갔다가 이로부터 나오는 각각 10.8 및 1.8cm/min의 속도로 밀리포어 수로 3배 희석된 FEP 유제(Fuel Cell Earth LLC, cat#TE9568-250)로 딥-피복되었다. 피복된 칩을 실온(21 내지 23℃) 에서 250℃로 고온 플레이트 상에서 베이킹하고, 250℃에서 5분 동안 베이킹한 후, 실온에서 대기 중에서 냉각시켰다. 상부 플레이트의 제6 열 중의 웰 및 하부 플레이트 중의 웰에 있는 FEP 층을 층 드릴링(50% 감쇄기(attenuator)에 의한 70mJ: 다른 파라미터는 웰을 드릴링하는 경우와 동일함)에 의해 제거하고, 후속적으로 현미경 하에서 니들(needle) (Beckton-Dickinson, cat#305109)을 수동으로 적용하였다.
슬립칩의 작동은 하기와 같이 수행되었다. 슬립칩은 하부 플레이트 상에 0.5 mL의 FC-40(3M)을 적하하고, 하부 플레이트의 상부에 상부 플레이트를 놓고, 집게(clothespin)를 이용하여 2개의 플레이트를 고정함으로써 조립되었다. 슬립칩의 각 열은 입구 구멍에 10μL의 용액을 함유하는 10-μL 피펫을 찔러 넣고, 피펫 외부로 상기 용액을 밀어냄으로써 로딩되었다.
슬립칩 내로의 시약 및 시료의 로딩은 하기와 같이 수행되었다: 단순 역치값을 위한 슬립칩: 먼저, 억제제 용액을 4개의 열에 연결된 입구를 통해 병렬로 4개의 열에 로딩하고; 포스페이트 완충액 중의 AChE(SigmaAldrich, cat#C2888) 용액을 4개의 개별적인 입구로부터 4개의 열에 하나씩 로딩하였다. 상기 칩을 미끄러지게 하여 AChE 용액의 각 열이 억제제 용액의 열과 오버래핑되도록 하였다. 이어 상기 칩을 초기 위치로 미끄러져 되돌아가기 전에 30분 동안 배양하였다. 과량(약100μL)의 기질 혼합물 1을 4개의 평형 열에 있는 웰 내로 로딩하였다. 상기 칩을 다시 미끄러지게 하여 기질 혼합물이 이전 단계에서 형성된 AChE와 억제제의 혼합물과 접촉하도록 하였다. AChE의 최종 농도는 약 4, 5, 6 및 7nM이고, 억제제의 최종 농도는 약 5nM이었다. 상기 반응은 Plan APO 0.63x 대물렌즈가 구비된 Leica MZ 16 입체 현미경(Leica Microsystems)을 이용하여 모니터링하였다. 역치값을 이용한 면역 분석용 슬립칩: 2개의 플레이트의 조립 이후, 이들을 정렬시켜 상부 플레이트의 제1 열 중 웰을 하부 플레이트 중의 덕트에 의해 연결하였다. 이어 캡쳐용 혼합물을 웰의 제1 열 내로 로딩하였다. 이어 상기 플레이트를 서로에 대해 미끄러지게 하여 상부 플레이트의 제2 열 중의 웰이 하부 플레이트 중의 덕트에 의해 연결되도록 하고, WB가 제2 열 내로 로딩되게 하였다. 유사하게, 제3 내지 제7 열 중의 웰을 WB, 포스페이트 완충액, 포스페이트 완충액, 억제제 용액 및 기질 혼합물 2로 각각 로딩하였다. 이어 상기 플레이트를 정렬하여 하부 플레이트 중의 웰이 상부 플레이트 중의 덕트에 의해 연결되도록 하고, 시스타틴 C 시료(BAB 중의 시료)가 하부 플레이트 중 웰에 로딩되게 하였다.
상기 슬립칩을 미끄러지게 하여 하부 플레이트의 웰이 상부 플레이트 중의 웰의 제1 열과 오버래핑되게 하였다. 시료와 캡쳐용 혼합물의 혼합물을 실온(21 내지 23℃)에서 30분 동안 배양하였다. 자석을 이용하여 하부 플레이트 중의 웰의 바닥까지 비드를 끌어내렸다. 상기 칩을 미끄러지게 하여 하부 플레이트 중의 웰이 상부 플레이트 중의 웰의 제2 열과 오버래핑되게 하고, 2분 동안 배양하였다. 하부 플레이트 중의 웰을 상부 플레이트의 제3 내지 제7 열 중의 웰과 2, 2, 2, 30 및 120분의 배양 시간에 연속하여 접촉하도록 하였다. 최종적으로, 비드를 하부 플레이트 중의 웰의 바닥까지 끌어 내리고, 웰을 상부 플레이트의 제7 열 중의 웰로부터 분리시켰다. 그 결과는 상부 플레이트의 제7 열 중의 웰에서 판독되었고, 비드를 포함한 하부 플레이트 중의 웰은 반응이 웰에서 진행되는 경우에 상부 플레이트의 제7 열 중의 웰의 위치 마커로서 사용되었다. 상기 결과의 사진은 저렴한 휴대전화 카메라(Nokia 3555b)를 이용하여 촬영하였다.
슬립칩의 제조는 하기와 같이 수행되었다: 본 발명자들은 하기 변형 예를 이용하여 앞서 개시된 제조 과정을 수행하였다. 포토레지스트 피복을 갖는 유리 플레이트는 포토마스크에 의해 정렬되고, 1분 동안 UV광에 노출되었다. 웰의 크기는 1920 μm(길이) x 360 μm(너비)인 것으로 결정되었다. Au NP 역치값을 위해 사용된 칩은 각 열 중에 5개의 웰을 가지며, 총 20개의 웰을 갖는다. 노출 직후에 유리 플레이트로부터 포토마스크를 제거하고, 0.1mol/L NaOH 용액 및 크롬 에칭제(0..365mol/L HClO4/(NH4)2Ce(NO3)6의 용액)에서 독립적으로 유리 플레이트를 현상하였다. 이어 테이핑된 유리 플레이트를 유리 에칭 용액(..75mol/L HF/NH4F/HNO3)이 들어 있는 플라스틱 용기에서 조심스럽게 침지시켜, 크롬 피복이 제거된 이후에 노출된 유리 표면을 에칭하였다. 깊이가 80 μm인 웰 및 덕트를 유리 플레이트 내로 에칭하였다. 최종적으로, 유리 플레이트를 에탄올로 세정하여 현상되지 않은 포토레지스트를 제거하고, 크롬 에칭제에 침지시켜 크롬 피복을 제거하였다. 에칭된 패턴은 Veeco Dektak 150 형상 측정기를 이용하여 확인되었다. 산소 플라즈마 처리에 적용한 이후에 표면은 진공 건조기에서 3시간 동안 트리데카플루오로-1,1,2,2-테트라하이드로옥틸-1-트리클로로실란에 의한 실란화에 의해 소수성을 갖게 되었다.
슬립칩 상에서의 혼합 이전에 은 증강 용액의 제조는 하기와 같이 수행되었다: 용액 A: 3μL의 200mM 시트레이트 완충액을 15μL의 100mM AgNO3 용액 및 82μL의 밀리포어 수와 함께 혼합하였다. 용액 B(B1-B4): 4μL의 0.15mM Au NP를 30μL의 100mM 하이드로퀴논 용액 및 서로 다른 체적의 1mM 메르캅토에탄올 용액(0, 10, 30, 50μL)과 혼합하고, 총 체적을 밀리포어 수로 보충함으로써 90μL로 고정하였다.
슬립칩 상의 Au NP 기반 역치값의 실험은 하기와 같이 수행되었다. 슬립칩은 앞서 개시된 바와 같이 조립하고, 로딩하고, 미끄러지게 하였다. 먼저, 용액 A를 4개의 열에 연결된 입구를 통해 직렬로 4개의 열 내로 피펫팅하고; 용액 B1 내지 B2를 4개의 개별적인 입구로부터 4개의 열 내로 하나씩 피펫팅하였다. 이어 하나의 유리 플레이트는 서로 다른 플레이트 중의 웰에 대해 서로 미끄러지게 되어 서로 오버래핑되었다. 전체 칩을 혼합 이전에 암실에 넣고, Plan APO 0.63x 대물렌즈가 구비된 Leica MZ 16 입체 현미경(Leica Microsystems)을 이용하여 현미경 사진을 촬영함으로써 5분 마다 결과를 검토하였다.
농도에 대한 아날로그 대 디지털 변환을 수행하기 위해 역치값을 이용한다는 생각은 (본원에 개시된 바와 같은 면역 분석 이외에) 다른 분석에 적용될 수도 있으며, 이는 다수의 진단 필요성에 상응하게 만들 수 있다. 예를 들어, 핵산에서의 역치값은 핵산에 결합하고 결합된 분자를 물리적으로 제거함으로써 설정된 양의 고정된 상보적 단편을 이용하여 설정될 수 있다. 이 같은 역치값은 HIV, HBV, HCV 및 다른 감염에서 관련이 있는 핵산 정량화에서의 디지털 판독을 제공하기 위해 적용될 수 있다. 아날로그 대 디지털 변환과 조합되는 경우에 슬립칩은 상품화될 수 있으며, 광범위하게 이용될 수 있는 장비가 없으며 현장 자가 진단(point-of-care)용 장치를 위한 매력적인 플랫폼을 나타낸다.
특정 실시형태에서, 슬립칩의 막다른끝 충전(dead-end filling)은 표면 화학성질 및 윤활 슬립칩 및 건조 슬립칩을 위한 플레이트 사이의 간극 크기의 제어를 포함하도록 수행될 수 있다.
이는 막다른끝 충전을 통해 슬립칩을 로딩하기 위해 현재의 연구 일부를 개시하고 있다. 본 발명자들이 “막다른끝 충전”이라고 지칭하는 공정에서, 조립 이후에 슬립칩을 채우는 유체(윤활 유체 또는 공기)는 상기 슬립칩의 2개의 플레이트 사이의 간극을 통해 분산된다. 이러한 슬립칩의 설계에는 막다른끝 충전에 의해 채워진 유체 경로에 어떠한 출구도 구비되어 있지 않다(통상적인 측면).
이러한 방법은 표준 SBS 포맷, 예를 들어 96 또는 384 또는 1536 웰 플레이트와 양립할 수 있는 입구를 갖는 슬립칩을 제조하기 위해 사용될 수 있지만, 표준 장비는 플레이트 내로 용액을 분산시키기 위해 사용될 수 있으며, 가압 이후에 목적하는 체적인 슬립칩 내부에 형성될 수 있으며, 슬라이딩은 상기 공정을 구동하기 위해 사용될 수 있다. 적절한 개구가 구비된 표준 SBS 플레이트는 슬립칩의 층들 중 하나로서 사용될 수 있지만, 웰들 중 하나를 통해 용액을 주입하고 다른 웰 등을 통해 관측하도록 설계될 수 있다.
장치의 제조는 하기와 같이 수행되었다: 크롬 및 포토레지스트 피복(Telic Company, Valencia, CA)을 갖는 소다 석회 유리 플레이트는 장치를 제조하기 위해 사용되었다. 유리 슬립칩을 제조하기 위한 표준 방법이 사용되었다. 간단하게는, 포토레지스트 피복 유리 플레이트를 웰 및 덕트의 설계에 의해 포토마스크에 의해 커버된 자외선에 노출하였다. 0.1M NaOH 용액을 이용한 포토레지스트의 제거 이후, 노출된 크롬 피복을 크롬-에칭 용액으로 제거하였다. 이어 패턴을 40℃ 교반기에서 유리 에칭 용액으로 에칭하였다. 유리 에칭 이후, 잔류하는 포토레지스트 및 크롬 피복을 에탄올 및 크롬-에칭 용액으로 각각 제거하였다. 에칭된 유리 플레이트의 표면을 세척하고, 산소 플라즈마 처리에 적용한 후, 앞서 개시된 바와 같이 진공 건조기 내에서 실란화에 의해 표면에 소수성을 부여하였다. 다이아몬드 드릴 비트를 이용하여 입구 구멍을 0.035인치의 직경으로 드릴링하였다.
표면 장력은 하기와 같이 측정되었다: 플루오르화 탄소 중의 수용액의 표면 장력은 일부 변형예로 앞서 보고된 바와 같이 측정되었다. 간단하게는, 원하는 수용액의 방울을 1회용 방울 압출 팁의 단부에서 형성하였다. . 상기 팁은 하나의 1회용 10μL 피펫 팁에 폴리이미드 피복 유리관에 접착하기 위해 급속 경화성 에폭시(quick-set epoxy)를 이용함으로써 조립되었다 이어 상기 팁은 1 mL 폴리스티렌 큐베트(cuvette)의 드릴링된 구멍을 통해 거꾸로 삽입되었으며, 에폭시 접착제에 의해 고정되었다. 폴리이미드 관은 30게이지 Teflon 관을 이용함으로써 50μL Hamilton Gastight 주사기에 연결되었다. 이어 상기 주사기는 수용액으로 채워지고, 1 mL 큐베트는 플루오르화 탄소로 채워졌다. 형성된 방울은 Model 250 Standard Digital Goniometer ＆ DROPimage Advanced 소프트웨어(Rame-Hart Instrument Co)를 이용하여 촬상되었다.
점도는 Cannon Instrument Company(State College, PA)에 의해 제조된 Cannon-Fenske 보정된 점도계를 이용함으로써 측정되었다. 제품과 함께 동봉된 지침서에 따라 상기 측정을 수행하였다.
접촉각은 앞서 보고된 동일한 프로토콜 3,4에 따라 측정되었다. 간단하게는, 측정된 4μL의 용액을 원하는 기질 상에 피펫팅하였다. 이어 기질 상의 방울의 접촉각은 광학 접촉각 측정기(Rame-Hart Instrument Co., Model 500)를 이용하여 측정되었다.
슬립칩의 2개의 플레이트 사이의 간극을 측정하고 제어하는 것은 하기와 같이 수행되었다: 간극 측정은 Hamamatsu 디지털 냉각형 CCD 카메라(Japan)가 장착된, Leica(Germany)에 의해 제조된 DMI6000 에피-형광 현미경 상에서 수행되었다. 이러한 냉각형 카메라는 정확한 강도 측정을 가능케 하는 광 강도에 대한 일차적 반응을 갖는다. 슬라이드 사이의 간극은 녹색 형광 양자점(quantum dot, QD)(Ocean Nanotech, AR)으로 염색된 미네랄 오일(Fisher Scientific, NJ)을 이용하여 측정되었다. 톨루엔 중의 초기 1% QD 용액을 0.22μ 미세 원심분리기 Amicon 필터(Millipore, MA)를 통해 여과하고, 초음파 수조(Fisher Scientific, NJ)에서 10분 동안 초음파 처리하였다. 미네랄 오일 중의 10% QD 용액을 철저히 볼텍싱하고, 상기 장치를 채우기 전에 적어도 10분 동안 진공 하에 방치하였다.
염색된 미네랄 오일을 상기 슬립칩의 2개의 플레이트 사이에 침착시키고, 과량의 오일은 클로로포름, 아세톤 및 에탄올로 조립된 장치를 연속적으로 세정함으로써 제거되었다. 2개의 플레이트는 8개의 페이퍼 클립으로 고정되었으며, 측정 이전에 압력 하에 적어도 1시간 동안 방치되었다. 이미지 수득, 이미지 가공 및 측정은 메타모프 소프트웨어(Universal Imaging Corporation)를 이용함으로써 수행되었다. 이미지는 비교적 어두운 주위 영역에 대한 참조 영역으로서 사용된 훨씬 밝은 특징부로부터 형광의 누수를 방지하기 위해 감소된 조사 영역에서 수득되었다. 형광 이미지는 배경 카메라 노이즈를 추출하는 단계 및 조사 영역의 균일성을 보상하는 단계를 포함하는 표준 과정에 따라 처리되었다. 슬립칩은 공지된 깊이를 갖는 특징부를 가지며, 이는 이들 특징부로부터 형광 강도를 단순히 비교함으로써 슬라이드 사이의 간극을 포함한 공지되지 않은 특징부의 깊이의 측정을 허용한다. 슬라이드 사이의 정확한 거리를 측정하기 위해, 본 발명자들은 하기 수학식에 따른 자기회귀성 과정을 적용하였다:
Figure pct00021
여기서, w는 공지된 특징부(웰)의 깊이이고, d0 = 0; di - 간극 크기, Is 및 Iw는 주위 표면 및 웰로부터 수득된 강도이다. 통상적으로, 본 발명자들은 i =1-2를 반복하여 신뢰 가능한 거리를 수득하였다.
이러한 과정을 확인하고, 충실도(linearity)를 체크하기 위해, 본 발명자들은 공지된 깊이를 갖는 일련의 웰로부터 형광도 측정을 수행하였다. 이들 참고용 웰은 Laser Ablation System(Resonetics, NH) 상에서 제조되었다. 모든 특징부의 깊이는 형상 측정기(Dektak 150, Veeco, CA)를 이용하여 측정되었다. 웰로부터 수득된 형광 강도는 웰의 깊이에 대해 일차적인 것으로 밝혀졌다. 상기 기법 둘 모두에 의해 수득된 거리 차이는 약 5% 이내이다. 따라서, 당업자는 형광 강도를 이용하여 슬립칩 플레이트 사이의 간극을 측정할 수 있다.
슬라이드 사이의 간극을 제어하기 위해, 본 발명자들은 2개의 서로 다른 크기를 갖는 형광 실리카 비드를 이용한다. 특히, 본 발명자들은 Corpuscular Inc.(NY)로부터 각각 수득된 1.5 μm 및 3.86 μm의 직경을 갖는 비드를 이용하였다. 이들 비드는 사용 이전에 실란화되어, 이들이 탄화수소 오일과 양립할 수 있도록 하였다. 실란화는 하기와 같이 수행되었다: 비드를 세정하고, 아세톤과 함께 3회 초음파 처리하였으며5% 디클로로디메틸실란을 아세톤 중의 비드에 첨가하고, 실온에서 30분 동안 노출시켰다. 비드를 아세톤으로 1회 세정하고, 클로로포름으로 2회 세정하였다. 적절한 비드 양을 형광 염색된 하이드로카본 오일에 첨가해서 상대적으로 균일한 비드 분포를 얻었다. 슬립칩 플레이트 사이의 간극은 각각의 경우에 대해 상술한 바와 같이 측정되었다.
각각의 장치는 2개의 플레이트로 구성되어 있다. 약 300μL의 윤활제 FC는 하부 플레이트 상에 피펫팅되었으며, 상부 플레이트는 하부 플레이트의 상부에 천천히 놓아서 채널 중에 기포가 트래핑(trapping)되는 것을 방지하였다. 이어 서로 밀접하게 접하고 있는 플레이트는 현미경 하에서 정렬시키고, 페이퍼 클립으로 고정시켰다.
물리적 모델을 시험하는 것(압력의 변화(홈 소스 및 기압계) 및 누수 용액의 관측)은 하기와 같이 수행되었다: 압력 제어. 압력은 조정 가능한 N2 공급원에 의해 제공되었다. N2 공급원은 2개의 말단에서 두 갈래로 갈라졌으며, 그 중 하나는 상기 시스템에서 출력 압력을 나타내는 기압계에 연결되어 있고, 다른 하나는 슬립칩에 연결되어 있다. 로딩 용액. 4μL의 녹색 염료를 조립된 장치의 입구의 상부에 피펫팅하였다. 이어, PDMS로 제조되고 높이가 약 5mm인 O-링을 조립된 장치와 유리 플레이트 사이에 위치시키고, 페이퍼 클립으로 고정시켰다. 유리 플레이트는 나노포트 조립체(Upchurch Scientific)를 구비하고 있다. 이어 상기 조립체는 압력 공급원에 연결되어 있고, 용액은 슬립칩 중의 채널 내로 로딩되었다. 임의의 용액 누수가 FC 수용 채널에서 관측되었다. 로딩 속도의 특성화. 2개의 원 사이의 채널 부위는 로딩 속도를 특성화하기 위해 사용되었다. 상기 속도는 평균 체적 유속으로, Qave = V/t로서 한정된다. V(m3)는 용액으로 채워질 채널 부위의 체적이고, t (초)는 채널 부위를 채우기 위해 기록된 시간이다.
5개의 용액이 FC 윤활 장치를 로딩하기 위해 사용되었다: 녹색 염료 용액은 시료를 위한 유체 경로를 로딩하기 위해 사용되었고; 적색, 청색, 오렌지색 및 황색 염료는 시약을 위한 16개의 유체 경로를 로딩하기 위해 사용되었다. 상기 플레이트의 표면은 약 8 μm의 간격을 갖는 웰(길이: 약 12 μm, 너비: 12 μm 및 깊이: 2 μm)로 패턴화되었다. 이 같은 웰은 윤활 FC의 분산을 조장한다. 모든 용액이 유체 경로 앞에 위치한 큰 용기 웰에 먼저 로딩된다는 것을 제외하고, 물리적 모델을 시험하기 위해 사용되었던 동일한 시료 로딩 과정을 이용하여 시료 및 다중 시약 용액을 동시에 로딩하였다. 로딩 이후, 상부 플레이트를 이의 하부에 대해 미끄러지게 하여 시약 웰을 시료 웰과 접촉시키고 내부에서 용액을 혼합하였다.
충진 공정을 보다 상세하게 개시하기 위해, 본 발명자들은 압력 균형을 위한 수학식을 이용한다. 입구에 제공된 압력은 제1 상과 제2 상 사이의 계면에서의 모세관 압력을 압도해야만 한다.
수학식 1:
Figure pct00022
ΔPflow는 유체 유동 저항에 의해 생성된 제1 수성 상으로 채워진 채널의 마주보는 단부 사이의 압력 차이이고, P0는 제1 상을 유체 경로 내로 구동하기 위해 입구에 적용된 압력이고; 및 ΔPcap은 충전 채널 내부의 제1 상과 제2 상의 계면에서 발생한 모세관 압력이다. 일반적으로, 특히 이러한 경우에서와 같이, 이러한 계면은 고체 표면에 의해 부분적으로 형성되고 액체 계면에 의해 부분적으로 형성되는 경우에 직사각형 채널 5,6에서도 계면의 정확한 형태를 결정하기 어렵다. Young-Laplace 수학식에 따라, 직사각형 채널에서 제1 상과 제2 상 사이의 계면에서의 대략적인 압력 차이는
Figure pct00023
. 7 여기서, σ는 표면 장력이고, R w (
Figure pct00024
) 및 R h (
Figure pct00025
)는 수평 방향(너비 w) 및 수직 방향(높이 h)에서 대략적인 계면 곡률이고; θ는 접촉각이다.
P0가 Pcap보다 큰 경우, Pflow는 양의 값이고, 채널은 제1 상으로 채워진다. 이들 압력 사이의 차이가 커질수록 충전이 빨라진다. 점성 항력(viscous drag force)은 채널이 동시에 채워지는 것을 방지할 것이다. 고체 직사각형 채널을 통한 유동 도중에 점성 항력에 대한 상세한 분석은 앞서 토의되어 있다. 채널은 수용성 상을 둘러싸고 있는 플루오르화 탄소 오일에 의해 (적어도 부분적으로) 형성된다. 밀봉 압력인 Pseal(Pa)(수학식 2)는 제1 상이 채널 외부로 누수되는 것을 방지한다.
수학식 2:
Figure pct00026
여기서, γ(N/m)는 수용액(제1 상)과 FC(제2 상) 사이의 표면 장력이고; θ는 제1 상과 제2 상 중의 슬립칩의 표면 사이의 접촉각이고 제1 상의 모세관 현상을 방지하기 위해 90°보다 큰 값이 요구되며; d(m)는 슬립칩의 2개의 플레이트 사이의 간극 거리이다. 최대 압력인 P seal , max (Pa)는
Figure pct00027
=180°의 가정하에 존재한다. 입구 압력은 간극 내로의 누수를 피하기 위해 밀봉 압력보다 작아야 하며(수학식 3), 압력이 높은 경우에 수용액은 플레이트 사이에 유동할 것이고, 이는 누수를 야기한다.
수학식 3: P 0 < Pseal , max
FC 의 분산은 충전 속도를 제한한다. 본 발명자들은 수학식을 이용하여 예측하였으며, 관련된 파라미터를 변경하는 것이 로딩 속도에 영향을 주는 반면, 관련이 없는 파라미터를 변경하는 것은 로딩 속도에 영향을 주지 않는다는 것을 발견하였다. 시험용 슬립칩에서, ΔP flow 는 3가지 용어를 포함한다(수학식 5) : ΔP 1 ,는 로딩 채널에서 수성 상의 유동 저항으로 인한 압력 차이이고; ΔP 2 는 로딩 채널에서 제2 상의 유동 저항으로 인한 압력 차이이고; ΔP 3 은 슬립칩의 2개의 플레이트 사이의 FC의 유동 저항으로 인한 압력 차이이다. 수학식 1과 수학식 5를 조합함으로써 수득된 수학식 6은 상기 시스템에 따른 압력 차이를 나타낸다. 유동 저항으로 인한 압력 차이는 수학식 7로 나타낼 수 있다.7 μi는 상응하는 유체의 점도이며, 따라서 여기서 μ 1 (Pa.S)는 수성 상의 점도이고, μ2 및 μ3은 서로 동일하며, 윤활 상의 점도와 동일하고; L i (m)는 유체 경로의 평균 길이이다. 본 발명자들은 L1 및 L2가 서로 동일하며, 전체 로딩 채널의 길이의 절반과 동일하다고 가정한다. L3은 로딩 채널과 대향 수용 채널 사이의 거리와 동일하고; Q i (m3/s)는 유속 방전량이다. 질량 보존으로 인해, Q 1 , Q 2 및 Q 3 은 서로 동일하고; h i 는 유체 경로의 높이이며, 따라서 h1 및 h2는 서로 동일하며, 상기 채널의 높이와 동일하다. h3은 슬립칩의 간극과 동일하고; wi는 유체 경로의 너비이다. w 1 및 w 2 는 서로 동일하며, 로딩 채널의 너비와 동일하다. 본 발명자들은 w 3 이 2개의 플레이트 사이의 로딩 채널을 따라 윤활 플루오르화 탄소의 유동 프로파일을 결정하기 어렵기 때문에 로딩 채널의 길이의 절반인 것으로 가정한다.
수학식 5:
Figure pct00028
수학식 6:
Figure pct00029
수학식 7:
Figure pct00030
쌍곡선 탄젠트는 채널 영상비(channel aspect ratio)가 증가하는 경우(채널의 높이가 감소하고/하거나 채널의 너비가 증가하는 경우), 점근적으로 1에 가까워지게 될 것이다. 이때, 채널 내의 압력 강하(ΔP)는 영상비(w/h)가 점근적으로 무한대에 가까워지는 경우에 비례적으로 1/h3w로 변할 것이다. ΔP 3 은 h 3 <<h 1and2 < w i 로 인해 Δ P 1 또는 ΔP 2 보다 훨씬 크다(수학식 8). 본 발명자들은 ΔP inlet 가 PΔcap 보다 훨씬 크다는 것을 확인하기 위해 시험용 칩을 설계하였다 . 따라서, ΔP inlet 는 ΔP 3 과 대략적으로 동일하다. 수학식 7 및 수학식 10을 h 3 <<w 3 에서의 근사치와 조합함으로써, 본 발명자들은 수학식 10을 얻었으며, 이는 고정된 입구 압력에서 수용액의 로딩율(loading rate)은 윤활 플루오르화 탄소의 점도 및 분산 치수를 포함하여 윤활 플루오르화 탄소의 분산에 의해 결정되었음을 나타낸다.
수학식 8:
Figure pct00031
수학식 9:
Figure pct00032
수학식 10:
Figure pct00033
본 발명자들은 w 3 , L 3 및 Δ P inlet 상수를 각각 1×104 μm, 2×103 μm 및 5.3 ×103Pa로 유지하면서 h 3 및 μ 3 을 변경함으로써 실험적으로 예상을 시험하였다. 대략적으로, 로딩율은 h3 3 및 μ 3에 의해 독립적으로 증가하였다. 또한, 본 발명자들은 ΔP 1 , ΔP 2 및 Δ P cap 과 관련된 다른 파라미터의 변경이 로딩율에 큰 영향을 미치지 않는다는 것을 확인하였다.
슬립칩은 막다른끝 충전에 의해 로딩될 수 있다. 본 발명자들은 물리적 모델을 이용하였으며, 다중의 용액을 슬립칩에 동시에 로딩하기 위해 막다른끝 충전을 이용하는 시스템을 설계하였다. 본 발명자들은 앞서 보고된 설계를 이용하였으며, 상기 설계는 16개의 서로 다른 침전물 및 상기 침전물 각각에 대한 11개의 혼합 비율을 포함한 단백질 결정화를 위한 사용자 로딩된 슬립칩 스크리닝 조건과 관련이 있다. 본 발명자들은 상기 설계를 간소화하기 위해 하기 변형예를 만들었다: 덕트는 로딩을 위한 최적의 회전 없이 직전으로 제조되며; 어떠한 좁은 채널도 압력의 균형을 맞추기 위해 사용되지 않았다. 또한 본 발명자들은 각각의 로딩 용액을 위한 입구 용기를 부가하였다. 이는 시험용 슬립칩에서 개시된 바와 같이 유동을 완충하기 위해서만 설계되었지만, 또한 저장 및 증발 방지를 위해 설계되었다. 또한 본 발명자들은 바람직하지 못한 역류를 방지하기 위해 보다 작은 출구 용기를 설계하였다. 동일한 밀봉 압력을 유지하면서 플레이트 사이의 윤활 유체의 분산에 의해 생성된 유동 압력을 최소화하기 위해, 수용 채널을 유체 경로 부근에 설계하여 LF의 유동 거리를 최소화하였다. 본 발명자들은 플레이트 사이의 유동 압력을 추가로 낮추기 위해 슬립칩의 접촉 표면 상에 작은 패턴(깊이: 약 2 μm)을 형성하였다.
다른 용액이 여전히 로딩되어 있을지라도 상기 용액이 유체 경로의 단부에 도달했을 때 자발적인 충전이 중단되었다. 그 결과, 모든 용액은 단일 압력 공급원을 이용하여 로딩될 수 있다.
슬립칩 내로의 용액의 피펫팅을 간소화하고 용액의 안정한 저장을 허용하기 위해, 상기 설계는 입구 바로 옆에 있는 용기가 다수의 액세스 홀을 구비하도록 변경될 수 있다. 이러한 설계에서, 윤활 유체는 액세스 홀 중 하나를 통해 용기에서 빠져 나갈 수 있으며, 따라서 압력 저항을 감소시켜 로딩을 용이하게 한다. 용액은 윤활 유체에 둘러싸인 채 유지되어, 안정한 저장을 가능케 하여 증발을 감소시킨다. 용액을 분산시키기 위해, 모든 액세스 홀에 압력을 가하여 로딩될 채널 내로 용액을 밀어 넣는다. 용기의 형태는 수성 방출이 동시에 액세스 홀로부터 멀어지게 이동하거나 로딩 채널에 인접하게 이동하도록 설계될 수 있다.
본 발명의 사상 및 범주를 벗어나지 않는 한, 다양한 변형 및 변경이 이루어질 수 있다는 것이 상기로부터 관측될 것이다. 본원에 개시된 특정 실시형태에 대해 어떠한 제한도 의도되지 않으며 추론되어서는 안 되는 것으로 이해되어야 한다. 물론, 이 같은 모든 변경이 특허청구범위의 범주 이내에 있는 것으로 첨부된 특허청구범위에 의해 커버되는 것으로 의도된다.

Claims (28)

  1. 제1 표면을 가지는 제1 부위;
    상기 제1 표면의 일부분을 따라서 위치하며, 적어도 하나의 제1 물질을 유지하는, 적어도 하나의 제1 영역;
    상기 제1 표면에 대향하는 제2 표면을 가지는 제2 부위; 및
    상기 제2 표면의 일부분을 따라서 위치하며, 적어도 하나의 제2 물질을 유지하는, 적어도 하나의 제2 영역을 포함하고, 상기 제1 부위의 상기 제1 표면과 상기 제2 부위의 상기 제2 표면 중 적어도 하나는 상기 적어도 하나의 제1 영역이 상기 적어도 하나의 제2 영역에 노출되지 않는 제1 위치와 상기 적어도 하나의 제1 영역 중 하나가 상기 적어도 하나의 제2 영역 중 하나에만 노출되는 제2 위치 사이에서 나머지에 대하여 이동하고, 폐쇄형 시스템을 형성하는, 반응을 수행하기 위한 장치.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 장치는 상기 제1 위치에 있으며, 상기 적어도 하나의 제1 영역들 중 적어도 하나는 유체 시료를 함유하는, 장치.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 장치는 상기 제1 위치에 있으며, 상기 적어도 하나의 제2 영역들 중 적어도 하나는 유체 시료를 함유하는, 장치.
  4. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 유체 시료는 핵산, 효소, 중합효소, 항체, 박테리아, 결정화제, 단백질, 펩타이드, 및 포유동물 세포 중 적어도 하나를 포함하는, 장치.
  5. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 제1 유체 시료와 혼합되지 않는 제2 유체 시료를 더 포함하는, 장치.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 제1 부위의 제1 표면과 상기 제2 부위의 상기 제2 표면 중 적어도 하나는 상기 제1 위치로부터 상기 제2 위치로 나머지에 대하여 이동하는, 장치.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 제1 부위의 제1 표면과 상기 제2 부위의 상기 제2 표면 중 적어도 하나는 상기 제2 위치로부터 상기 제1 위치로 나머지에 대하여 이동하는, 장치.
  8. 제 1 항에 있어서,
    제3 표면을 가지는 제3 부위,
    상기 제2 부위 상의 제4 표면, 및
    상기 제3 표면의 일부분을 따라서 위치하고 적어도 하나의 제3 물질을 유지하는 적어도 하나의 제3 영역을 더 포함하고,
    상기 적어도 하나의 제2 영역 중 일부분은 상기 제4 표면을 따라서 위치하고, 상기 제3 표면은 상기 제4 표면에 대향하고, 상기 제3 부위의 상기 제3 표면과 상기 제2 부위의 상기 제4 표면 중 적어도 하나는 상기 적어도 하나의 제3 영역이 상기 적어도 하나의 제2 영역에 노출되지 않는 제3 위치와 상기 적어도 하나의 제3 영역 중 하나가 상기 적어도 하나의 제2 영역 중 하나에만 노출되는 제4 위치 사이에서 나머지에 대하여 이동하고, 폐쇄형 시스템을 형성하는, 장치.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 제1 부위의 상기 제1 표면과 상기 제2 부위의 상기 제2 표면 중 적어도 하나는 상기 제1 위치로부터 상기 제2 위치로 이동할 때 상기 제1 부위의 상기 제1 표면의 법선에 실질적으로 수직하는 방향으로 이동하는, 장치.
  10. 제 1 항에 있어서, 적어도 두 개의 제1 영역 및 적어도 두 개의 제2 영역을 포함하고, 상기 제2 위치에 있을 때, 상기 적어도 두 개의 제2 영역 중 하나는 상기 적어도 두 개의 제1 영역에 동시에 노출되는, 장치.
  11. 제 1 항에 있어서, 제1 패턴으로 배치된 제1 복수의 제1 영역 및 상보적인 패턴으로 배치된 복수의 제2 영역을 포함하고, 상기 제1 위치로부터 상기 제2 위치로 이동으로 인해 상기 제1 복수의 제1 영역 중 적어도 하나가 각각의 제2 영역에 노출될 수 있는, 장치.
  12. 제 11 항에 있어서, 제1 영역의 수는 제2 영역의 수와 같거나, 제1 영역의 수는 제2 영역의 수보다 크거나 제1 영역의 수는 제2 영역의 수보다 작은, 장치.
  13. 제 1 항에 있어서, 상기 영역들 중 적어도 둘은 부피가 상이한, 장치.
  14. 제 1 항에 있어서, 상기 제1 표면 및 상기 제2 표면 사이에 위치하는 기질을 더 포함하는, 장치.
  15. 제 1 항에 있어서, 상기 제1 영역은 내부에 형성된 관통홀을 포함하는, 장치.
  16. 제 8 항에 있어서, 제2 패턴으로 배치된 제2 복수의 제1 영역을 더 포함하고, 상기 제2 위치로부터 제3 위치로의 상대적 이동으로 인해 상기 제2 복수의 제1 영역 중 적어도 하나가 적어도 하나의 제2 영역에 노출될 수 있는, 장치.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 위치와 제2 및 제3 위치 사이에서의 상대적 이동의 방향은 상이한, 장치.
  18. 제 1 항에 있어서, 상기 영역들 중 적어도 하나는 웰을 포함하는, 장치.
  19. 제 1 항에 있어서, 상기 영역들 중 적어도 하나는 표면 패턴을 포함하는, 장치.
  20. 반응을 수행하기 위한 장치이며,
    제1 표면을 가지는 제1 부위;
    상기 제1 표면의 일부분을 따라서 형성되고, 각각 적어도 하나의 제1 물질을 유지하는, 복수의 제1 영역;
    상기 제1 표면에 대향하는 제2 표면을 가지는 제2 부위; 및
    상기 제2 표면의 일부분을 따라서 형성되고, 각각 적어도 하나의 제2 물질을 유지하는, 복수의 제2 영역을 포함하고,
    상기 제1 부위의 상기 제1 표면과 상기 제2 부위의 상기 제2 표면 중 적어도 하나는 상기 복수의 제1 영역 중 적어도 일부가 상기 복수의 제2 영역 중 어느 것에도 노출되지 않는 제1 위치와 상기 제1 표면의 법선에 실질적으로 수직하는 방향으로 상기 복수의 제1 영역 중 적어도 하나와 상기 복수의 제2 영역 중 적어도 하나가 서로에게만 노출되는 제2위치 사이에서 나머지에 대하여 미끄러지는, 장치.
  21. 제 20 항에 있어서, 상기 영역들 중 적어도 둘은 부피가 상이한, 장치.
  22. 제 20 항에 있어서, 동일한 표면들 상의 적어도 두 영역은 깊이가 상이한, 장치.
  23. 제 20 항에 있어서, 상기 제1 부위의 제1 표면과 상기 제2 부위의 상기 제2 표면 중 적어도 하나는 상기 제1 위치로부터 상기 제2 위치로, 또는 상기 제2 위치로부터 상기 제1 위치로, 또는 상기 제1 및 제2 위치들 사이에서 전후로 나머지에 대해 상대적으로 미끄러지는, 장치.
  24. 반응을 실행하기 위한 장치이며,
    제1 표면을 가지는 제1 부위;
    상기 제1 표면의 일부분을 따라서 위치하고, 적어도 하나의 제1 물질을 유지하는, 제1 영역;
    상기 제1 표면에 면하는 제2 표면을 가지는 상부 제2 부위;
    상기 제2 표면의 일부분을 따라서 위치하고, 적어도 하나의 제2 물질을 유지하는, 제2 영역; 및
    상기 제1 부위의 상기 제1 표면과 상기 상부 제2 부위의 상기 제2 표면 사이에 형성되고, 관통하도록 형성된 개구부를 가지는, 중간 제3 부위를 포함하되;
    상기 제1 부위, 상기 상부 제2 부위 및 상기 중간 제3 부위는, 상기 제1 영역이 상기 개구부를 경유해서 상기 제2 영역에 노출되지 않는 제1 위치로부터 상기 제1 영역이 상기 개구부를 경유해서 상기 제2 영역에 노출되는 제2 위치로 서로에 대해 미끄러지는, 장치.
  25. 반응을 수행하기 위한 키트이며,
    (a) (i) 제1 표면 및 (ii) 상기 제1 표면의 일부분을 따라서 형성된 복수의 제1 영역을 가지되, 상기 복수의 제1 영역 각각은 적어도 하나의 제1 물질을 유지하는, 제1 부위;
    (b) (i) 제2 표면 및 (ii) 상기 제2 표면의 일부분을 따라서 형성된 복수의 제2 영역을 가지되, 상기 복수의 제2 영역 각각은 적어도 하나의 제2 물질을 유지하는, 제2 부위; 및
    (c) 상기 적어도 하나의 제1 영역 내의 상기 적어도 하나의 제1 물질, 상기 적어도 하나의 제2 영역 내의 상기 적어도 하나의 제2 물질, 및 상기 제1 표면과 상기 제2 표면 사이에 형성된 기질 중 적어도 하나를 포함하고;
    상기 제1 부위의 상기 제1 표면과 상기 제2 부위의 상기 제2 표면은, 함께 맞춰질 때 서로 대향하고 상기 복수의 제1 영역 중 적어도 일부가 상기 복수의 제2 영역 중 어느 것에도 노출되지 않는 제1 위치와, 상기 제1 표면의 법선에 실질적으로 수직하는 방향으로 상기 복수의 제1 영역 중 적어도 하나와 상기 복수의 제2 영역 중 적어도 하나가 서로에게만 노출되는 제2 위치 사이에서 나머지에 대해 미끄러지는, 반응을 수행하기 위한 키트.
  26. 기판 플레이트;
    상기 기판 플레이트와 근접하게 접하고 제1 위치로부터 제2 위치로 상기 플레이트들의 평면을 가로지르는 방향으로 이동 가능한, 상부 플레이트를 포함하고; 상기 기판 플레이트는 유체를 포함하기 위한 복수의 웰 및 유체 채널을 포함하고, 상기 상부 플레이트는 복수의 웰을 포함하고; 여기서 상기 상부 플레이트가 상기 제1 위치에 있을 때, 상기 기판 플레이트 내의 상기 채널은 상기 상부 플레이트 내의 상기 웰과 유체 접촉하고, 상기 상부 플레이트가 상기 제2 위치에 있을 때, 상기 기판 플레이트 내의 상기 웰은 상기 상부 플레이트의 사전 선택된 웰과 유체 접촉해서, 혼합 챔버를 형성하는, 미세유체 혼합 장치.
  27. 기판 플레이트;
    상기 기판 플레이트와 근접하게 접하고 제1 위치로부터 제2 위치로 상기 기판 플레이트에 대해 이동 가능한, 상부 플레이트를 포함하고; 상기 기판 플레이트는 유체를 포함하기 위한 복수의 웰 및 유체 채널을 포함하고, 상기 상부 플레이트는 복수의 웰을 포함하고; 상기 상부 플레이트가 상기 제1 위치에 있을 때, 상기 기판 플레이트 내의 상기 채널은 상기 상부 플레이트 내의 상기 웰과 유체 접촉하고, 상기 상부 플레이트가 상기 제2 위치에 있을 때, 상기 하부 플레이트의 상기 웰은 상기 상부 플레이트의 사전 선택된 웰과 유체 접촉해서, 혼합 챔버를 형성하는, 미세유체 혼합 장치.
  28. 제 27 항에 있어서, 상기 상부 플레이트는 상기 플레이트들의 평면을 가로지르는 방향으로 이동 가능하거나, 또는 상기 플레이트들의 평면에 수직하는 축에 대한 회전 방향으로 이동 가능한, 미세유체 혼합 장치.
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