JP2005509872A - プロテオーム解析のための微小流体システム - Google Patents
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Abstract
本発明は、多数の化合物または化合物の複雑な混合物、特に細胞のシグナル伝達経路に関与する小量の細胞性タンパク質を迅速に解析するための微小流体システムおよび方法を提供する。一態様においては、統合された微小流体システム(1)は、上流の分離モジュール(2)(好ましくは、多次元分離装置(2a))、上流の分離モジュール(2)から受け取った実質的に分離されたタンパク質のオンデバイスでのタンパク質消化のための微小流体デバイス(5)、上記タンパク質の消化生成物を分離するための下流の分離モジュール(14)、ペプチド解析モジュール(17)および上記タンパク質のアミノ酸配列を決定するためのプロセッサ(18)を含む。好ましくは、統合された微小流体システム(1)は、下流の分離モジュール(14)とペプチド解析モジュール(17)との間に接続微小流体デバイス(5i)を備える。
Description
本発明は、プロテオーム解析のための微小流体システムおよび微小流体デバイスならびにその製造方法および使用方法を提供する。
プロテオミクスの目標は、生物系の複雑さに対処する手段として1つの細胞で発現されるタンパク質を全て同定し、定量することである(Anderson, 1998, Electrophoresis 19:1853-1861)。プロテオーム解析のための現在の方法は一般に、細胞性タンパク質を同定するための二次元電気泳動法(2DE)の使用に基づいている。画像解析技術を用いて2DEゲル上のタンパク質のパターンを解析して、プロテオームマップを作成する。正常細胞と異常細胞のプロテオームマップを比較して、疾患に生理的に反応する間に増加調節または減少調節されたタンパク質を検出する。これらのタンパク質を切り出して、マスフィンガープリンティングおよび質量分析等の方法を用いて同定および特性評価を行う。
しかしながら、現在の2DE法を用いては、最も豊富にあるタンパク質しか同定することができない。したがって、2DE法で同定されるタンパク質のほとんどは、構造タンパク質またはハウスキーピングタンパク質を意味する(例えば、Gygi et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:9390-9395; Gygi et al., 1999, Electrophoresis 20:310-319; Shevchenko, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14440-14445; Boucherie, 1996, Electrophoresis 17(11):1683-1699; Ducret, 1998, Protein Science 7:706-719; Garrels, 1994, Electrophoresis 15: 1466-1486を参照)。異常な細胞シグナルを生じる少量のタンパク質を質的に解析することができないので、これらの問題が癌のマーカーの同定についてプロテオミクスの使用を制約してきた。そのため、疾患状態を引き起こすメカニズムを解明すること、および好適な癌特異的なマーカーを同定することが困難になる。
現在の2DEに基づいた技術の感度の欠如は、主として多量のタンパク質が少量のタンパク質の同定を妨害するために、分離力または解像力が欠如することによって引き起こされる。多量のスポットのガウステイルが少量のタンパク質を汚染するので、ゲル上にさらに多くのタンパク質を負荷しても状況は改善されない。ズームゲル(狭いpH範囲に絞る2Dゲル)の使用は、最低限の進歩を可能にするが(Gygi, 2000, 上記)、あまりに面倒で実用的な有用性はない(Corthals, 2000, Electrophoresis 21:1104-1115)。選択的濃縮法を使用することもできるが、一般に、細胞性タンパク質の発現の包括的な見解を得ることを犠牲にしている。質量分析法(MS)による同定のために必要なタンパク質の量が、2DEゲルにおけるタンパク質スポットの視覚化のための最も感度の高い方法の検出限界に近いので、2DEゲルにおける検出の感度も問題である。さらに、2DEに通常使用されるポリアクリルアミドのマトリクスは、抽出された試料混合物において有意な量のバックグランドを生じ、このことによりその後に続くMSによる解析が困難になる(Kinter, 2000, 「タンデム質量分光分析を用いたタンパク質の配列決定および同定」(Protein Sequencing and Identification Using Tandem Mass Spectrometry)(ニューヨーク、ウイリー(Wiley))における)。さらに、典型的なゲル中消化法に続いてペプチド抽出を行っている間、試料は多数の表面に暴露され、特に、少量のタンパク質については、喪失は相当なものであり得る(Timperman, 2000, Anal. Chem. 72:4115-4121; Kinter、上記)。
多次元カラム分離は、2DEに比べて、より高い分離力ならびに試料の汚染および喪失の低減など、多数の利点を提供する。典型的な大型2DEゲルは、約2,000のピーク容量を達成することが可能であるが、2Dカラム分離は、タンパク質の分離について20,000を超えるピーク容量を達成することができる。さらに、これらカラムの静止相は極めて安定であり、ポリアクリルアミドゲルに比べて非反応性であり、そのため試料の汚染および喪失の低減がもたらされる。サイズ排除、逆相クロマトグラフィ、陽イオン交換クロマトグラフィおよびキャピラリー電気泳動を含めた多数の異なった分離技術が2Dカラム分離に組み合わせられてきた(Wall, 2000, Analytical Chemistry 72:1099-1111; Link, 1999, Nature Biotechnology 17:676-682; Opiteck, 1998, Journal of Microcolumn Separations 10:365-375; Hooker et al., 1998, 「高速キャピラリー電気泳動法」(High-Performance Capillary Electrophoresis)(ニューヨーク、ジョンウイリー&サンズ社(John Wiley & Sons Inc.)、146 pp.581〜612);Opiteck et al., 1998, Analytical Biochemistry 258:349-361; Vissers, 1999, Journal of Microcolumn Separations 11:277-286; Liu et al., 1996, Anal Chem. 68:3928-3933)。三次元カラムを用いてピーク容量のさらなる増加が達成されている(例えば、Moore, 1995、上記を参照)。
微小流体デバイスはDNA解析では多数の応用が見い出されているが、タンパク質解析のためにはこれらのデバイスはほとんど開発されてこなかった。微小流体デバイスの革命は、1992年ハリソン(Harrison, Analytical Chemistry 64:1926-1932)によって始められ、そのようなデバイスにおけるバルブのない電気泳動分離および流体操作が示された。つい最近の研究は、試料注入の基礎、オンデバイスカラムの組み立ておよび質量分析との接続に集中している。
本発明は、多数の化合物または化合物の複合混合物、特に細胞のシグナル伝達経路に関与する少量の細胞性タンパク質を迅速に解析するためのシステムおよび方法を提供する。該システムはまた、天然水に由来する有機物溶解試料中および石炭に由来する有機物中の有機物(これらに限定されない)等の、ペプチド以外の分析物の混合物を解析するのにも使用されてもよい。該システムは、統合した様式で、または別々に、またはその他のシステムと共に用いることができる、多数のモジュール構成成分を含む。
一態様においては、本発明は、実質的に精製されたポリペプチドを受け取るための少なくとも1つの試料保持流路を含む基材(substrate)(例えば、ガラス)を含むオンデバイスでのプロテアーゼ消化のための微小流体デバイス(「プロテアーゼ消化デバイス」)を提供する。少なくとも1つの保持流路は、試料処理試薬を含む。一実施形態においては、試料処理試薬は、流路の一部分に配置された第1の固相に固定化されたプロテアーゼ(例えば、トリプシン)である。好ましくは、流路は、流路の別の部分に配置された第2の固相をさらに含む。さらに、プロテアーゼは固相に固定化されるのではなく、溶液中に残存するのでもよい。電流が第2の固相を通過することができる一方で、実質的に精製されたポリペプチドおよびその消化生成物は通過できない。このことは、ポリペプチドが消化されるにつれてそれらが濃縮されるメカニズムを提供する。好ましい実施形態においては、デバイスは複数の試料保持流路を含む。側面の流路および緩衝液リザーバの形態で追加の流路を提供することもできる。これらは、例えば、試料保持流路中の試料溶液に選択的にイオンを提供してそれら流路中の溶液のpHを変えることによって、デバイス上の試料保持流路における試料溶液を操作するために使用することができる。
一態様においては、第1の固相は、その上にプロテアーゼが固定化された複数の粒子を含む。好ましくは、第2の固相はゾル−ゲル材料またはフィルターを含み、第1の固相に実質的に隣接する。第2の固相は酸化アルミニウムを含んでもよい。
一態様においては、デバイスは、基材上の1つまたは複数の流路で選択的に電圧を印加するための電源に接続可能な1つまたは複数の電極と電気的に連絡している。デバイスにおける種々の流路を介したポリペプチドおよびポリペプチドの消化生成物の輸送を駆動するのに電圧を使用することができる。
別の態様においては、デバイスは、実質的に精製されたポリペプチドを含む試料を上流の分離モジュールから受け取るための少なくとも1つの受入流路をさらに含む。受入流路は好ましくは、消化のために試料を少なくとも1つの試料保持流路に送達する。さらなる態様においては、デバイスは、少なくとも1つの試料保持流路からタンパク質の消化生成物を受け取り、デバイスから離れて消化生成物を輸送するための出力流路を含む。
デバイスは様々な流路の幾何配置を含むことができる。一態様においては、デバイスは、出力流路で再び合流する複数の実質的に平行である試料保持流路に分割する受入流路を含む。試料保持流路で反応が起き、次いで反応生成物は出力流路により試料保持流路を離れる。これらの流路が幾何学的に平行である必要はないが、好ましくは、それらは、共通の入力流路と共通の出力流路とを有する回路の中で平行な一組の抵抗器として構成されるべきである。
別の態様においては、受入流路は交差流路の第1の末端で合流する一方で、出力流路は交差流路の第2の末端で合流する。一連の試料保持流路は交差流路と統合される。試料保持流路は交差流路に実質的に垂直である。デバイスは複数の交差流路を含んでもよい。この構成では、試料または試料の一部は、交差流路との同一の交差点を通って試料保持流路に入り、出て行く。これは、試料が別々の点で試料保持流路に入り、出て行く平行の流路構成とは対照的である。平行の流路構成において試料が試料保持流路を出て行く場合、流路に導入するのに用いた流れの方向とは反対の方向で試料が流れている。
その上、さらなる実施形態においては、実質的に平行である流路が実質的に垂直である流路と交差する。しかしながら、適切な流体の流れ関係が維持されている限り、絶対的な幾何配置は重要ではない。例えば、流路をカーブさせることができ、一態様においては、基材自体が平面ではなく、流路は非同一平面であることが可能である。
好ましくは、少なくとも1つの流路は、タンパク質を消化するための第1の固相を含む試料保持流路である。例えば、試料保持流路は、その上に固定化された1つまたは複数のプロテアーゼを含む粒子またはビーズを含むことが可能である。一態様においては、デバイス上の異なった試料保持流路は、1つまたは複数のプロテアーゼ;誘導体化酵素;化学切断剤;試薬緩衝液;等を含む。別の態様においては、デバイスは、複数の試料保持流路のそれぞれに異なったプロテアーゼを含む(例えば、デノボでのペプチド配列決定を行うために)。好ましくは、試料保持流路の1つはプロテアーゼを含まず、そのため消化されずに流路を通ってポリペプチドが移動し、分子量を決定することを可能にする。
下流のペプチド解析モジュールによる解析に先立ってペプチドを濃縮することが望ましいであろう。したがって、一態様においては、垂直の試料保持流路の構成を含むデバイスにおいて、少なくとも1つの試料保持流路がまた、タンパク質が消化されるにつれてタンパク質が濃縮される第2の相を含む。少なくとも1つの試料保持流路において流れを周期的に反転させ、試料流路における第1の固相から交差流路に、または交差流路から第1の固相に試料を輸送することができる。別の態様においては、例えば、デバイスが平行の流路構成を含む場合、プロテアーゼ消化デバイス内、またはプロテアーゼ消化デバイスから試料を受け取るプロテアーゼ消化デバイスの下流のデバイスのいずれかで集中させることによって(例えば、pH勾配を確立することによって)、試料を濃縮することができる。
上重ね基材(overlying substrate)でデバイスを実質的に覆うことができる。一態様においては、上重ね基材は、デバイスにおける少なくとも1つの流路と連絡するための少なくとも1つの開口部を定める。試薬、流体、またはその他の材料をデバイスに添加するのに開口部を使用することができる。一態様においては、例えば、デバイスの1つまたは複数の他の流路におけるpHを変えるために、1つまたは複数のリザーバウエルが提供され、試薬または流体を保持し、これらをデバイスの1つまたは複数の他の流路に選択的に送達する。
本発明は、実質的に精製されたポリペプチドを含む試料を微小流体デバイスにおける少なくとも1つの試料保持流路に送達し、少なくとも1つの試料保持流路内のプロテアーゼに十分な時間試料を暴露して所望の量の消化されたポリペプチド生成物、すなわちペプチドを得ることを含む、タンパク質を消化する方法も提供する。好ましくは、プロテアーゼは、少なくとも1つの試料保持流路内の第1の固相に固定化される。あるいは、プロテアーゼは溶液中に残存してもよい。少なくとも1つの試料保持流路と連絡する少なくとも1つの電極によって生じる電圧に暴露した際に、ポリペプチド消化生成物すなわちペプチドは、第1の固相を介して輸送され、そして該ペプチドは、流路の別の部分における第2の固相に送達される。一態様においては、第2の固相は第1の固相に隣接する;しかしながら、別の態様においては、第2の固相は、デバイスの上にあり、試料保持流路と連絡する基材においてリザーバウエルに隣接する。電流は第2の固相を通過することができるが、ペプチドは通過できない。このことは、タンパク質が消化されるにつれてペプチドが濃縮されるのを可能にする。プロテアーゼ消化デバイスの異なった試料保持流路における第1の固相に異なった種類のプロテアーゼを固定化することができ、上述のように、一部の流路はプロテアーゼを含まなくてもよい。好ましい態様においては、単一の試料プラグをさらに小さなプラグに分割し、それらは異なった流路に入り、異なったプロテアーゼが並行して同一ポリペプチドの消化を行うことを可能にし、またはプロテアーゼがない流路の場合、消化されない試料をペプチド解析モジュールに通す。
本発明は、上述のようなプロテアーゼ消化デバイスを含む第1の微小流体モジュールおよび複数のポリペプチドまたはタンパク質を分離することが可能である上流の分離モジュールを含むプロテオーム解析用の統合された微小流体システムをさらに提供する。上流の分離モジュールは、実質的に精製されたポリペプチドをプロテアーゼ消化デバイスの少なくとも1つの試料保持流路に送達する。一態様においては、上流の分離モジュールはキャピラリー電気泳動装置を含む。一態様においては、上流の分離モジュールは、第1の基準と第2の基準が異なっている少なくとも第1の基準および第2の基準に従って、複数のポリペプチドを含む試料を分離する。例えば、第1の基準が分子量であってもよく、第2の基準が等電点であってもよい。好ましくは、上流の分離モジュールは、第1の基準に従って複数のポリペプチドを含む試料を分離する第1の分離経路、および第1の基準に従って実質的に分離されたポリペプチドを第2の基準に従って分離する第2の分離経路を含む。
別の態様においては、微小流体モジュールは、デバイスを通過した後に生成された実質的に精製されたポリペプチドの消化生成物を分離するための下流の分離モジュールと連絡する。好ましくは、消化生成物の1つまたは複数のイオン化特性を決定するために、下流の分離モジュールはペプチド解析モジュール(例えば、質量分析計)と連絡する。ペプチド解析モジュールは、例えば、ESI MS/MS装置を含んでもよい。
好ましい実施形態においては、下流の分離モジュールから実質的に精製された消化生成物(すなわち、ペプチド)を受け取り、実質的に精製された消化生成物をペプチド解析モジュールに送達するために、下流の分離モジュールは、接続微小流体モジュールに連結される。接続微小流体モジュールを用いて、集合平均による次のペプチド解析のシグナル対ノイズの比を高め、ペプチド解析モジュールによる長いおよび/または複雑な一連の質量スペクトルの収集を可能にすることができる。消化生成物は、好ましくはエレクトロスプレーによって接続モジュールからペプチド解析モジュールの試料受け取り口の中に送達される。好ましくは、接続微小流体モジュールに連結されたキャピラリーを介してエレクトロスプレーが生成される。
好ましい一態様においては、タンパク分解消化からポリペプチド試料の一部を迂回させ、未処置のポリペプチドの分子量を測定するために、ペプチド解析モジュールに直接送ることができる。あるいは、ペプチド解析モジュールに向かう前に、プロテアーゼのない側面流路で試料の一部を保持することができる。
ペプチド解析モジュールは、消化生成物のアミノ酸配列を決定するためのプロセッサと連絡してもよい。次いで、消化生成物のアミノ酸配列をポリペプチドの配列に組み立てることができる。好ましくは、配列に関係する情報をデータベースに保存する。システムは好ましくは、システムの1つまたは複数のモジュールと光学的に連絡する1つまたは複数の検出器も含む。
特定の部類のポリペプチドのための選択的単離のスキームを提供するように、試料を検出するために使用する検出器を誂えればよい。例えば、ホスホペプチド類のような特定の翻訳後修飾を有するポリペプチドは、蛍光検出器によって検出される蛍光タグで標識すればよい。この処理によって、光学システムによってホスホペプチド類だけが検出され、さらなる解析のために保持流路に方向付けされる。
それぞれのモジュールが互いの機能を補完し合うという意味でシステムが統合されているが、システムの種々のモジュールを省略することができ、または他のシステムと共に使用することができる。分離は全てチップから離れて行えばよいし、または逆に、分離および微小流体試料の処理全てを少なくとも1つのチップに統合すればよい。例えば、一態様においては、プロテアーゼ消化モジュールが、消化した試料をペプチド解析モジュールに直接送達する。別の態様においては、分離モジュールは、代わって試料をペプチド解析モジュールに送達する接続微小流体モジュールに連結される。その上さらなる態様においては、分離の機能性およびプロテアーゼ消化の機能性は、単一の微小流体モジュールにおいて組み合わせられる。本明細書に記載された組み合わせは非限定的であり、その他の組み合わせが本発明の範囲内で包含されることは当業者に明白であるはずである。
本発明は、上述のシステムまたはシステムの1つまたは複数のモジュールを含むプロテオーム解析の方法をさらに提供する。第1の工程において、好ましい実施形態においては、複数の細胞性ポリペプチドを含む試料を上流の分離モジュールに接触させ、試料内部のポリペプチドが分離されて、実質的に精製された複数のポリペプチドが得られる。実質的に精製された、選択されたポリペプチド(例えば、試料のバンド)が、それに固定化されたプロテアーゼを含む微小流体モジュールに送達され、ポリペプチドを実質的に消化するのに十分な時間および条件下でポリペプチドをプロテアーゼに暴露し、それによって消化生成物またはペプチドを産生する。消化生成物は、それらが分離される下流の分離モジュールに輸送され、実質的に分離された消化生成物は、実質的に消化された消化生成物をペプチド解析モジュールに輸送する接続微小流体モジュールに送達される。消化生成物のアミノ酸配列が決定され、そして組み立てられてポリペプチドの配列を作成する。ペプチド解析モジュールへの送達に先立って、接続モジュールは、分離、濃縮および/または集中の1つまたは複数の追加工程を行うことができる。
試料の実質的に全てのポリペプチドに対して、分離工程、消化生成物産生工程およびタンパク質の配列を決定するための消化生成物解析工程を並行しておよび/または反復して行い、ポリペプチドを得た細胞のプロテオームマップを得ることができる。複数の異なった細胞のプロテオームマップを比較して、これらの細胞において差次的に発現されるポリペプチドを同定することができる。特に好ましい実施形態においては、例えば癌細胞のような異常に増殖する細胞において差次的に発現されるポリペプチドが同定される。一層さらに好ましくは、ポリペプチドは細胞のシグナル伝達ポリペプチドである。差次的に発現されるポリペプチドまたはこれらのポリペプチドをコードする核酸を特異的に認識する分子プローブを基材の上に並べて、試料中のこれらのポリペプチドおよび/または核酸の有無をアッセイするための試薬を提供することができる。
添付の図面を参照して本発明をさらに説明するが、その際、幾つかの図を通して、同様の構造は同様の数字で参照する。示される図面は必ずしも一定の比率で拡大されているわけではなく、概して、本発明の原理を説明することに重点が置かれている。
上記図面は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、考察で言及するとおり、本発明のその他の実施形態も企図される。本開示は、限定のためではなく説明のために、本発明の説明的な実施形態を提示している。本発明の趣旨および原理の範囲内に入る多数の他の改変および実施形態が当業者によって考案され得る。
本発明は、多数の化合物または化合物の複合混合物、特に、細胞性のタンパク質およびポリペプチドを迅速に解析するためのシステムおよび方法を提供する。現在好ましい実施形態においては、該システムおよび方法を用いて、細胞のシグナル伝達経路に関与するタンパク質を解析する。
一態様においては、該システムは、上流の分離モジュール(好ましくは、多次元分離装置)、上流の分離モジュールから受け取った実質的に分離されたタンパク質のオンデバイスでのタンパク質消化のための少なくとも1つの微小流体デバイス、タンパク質の消化生成物を分離するための下流の分離モジュール、ペプチド解析モジュールおよび/またはタンパク質のアミノ酸配列を決定するためのプロセッサを含む。好ましくは、システムは、実質的に分離された消化生成物をペプチド解析モジュールに送達するために、下流の分離モジュールとペプチド解析モジュールとの間に接続微小流体デバイスも含む。必要に応じて、接続微小流体デバイスは、ペプチド解析モジュールに送達するのに先立って、タンパク質の消化生成物をさらに分離し、濃縮し、および/または集中させる。
定義
本明細書では、以下の用語および定義を使用する:
本明細書で使用されるとき、「実質的に精製されたポリペプチド」とは、実質的に同一の分子量(例えば、試料中にて約90%より多くの、好ましくは約95%より多くの、約98%より多くの、および約100%までのポリペプチドが実質的に同一の分子量である)のポリペプチドを含むポリペプチド試料を言う。実質的に精製されたポリペプチドは、必ずしも同一のポリペプチド配列を含むとは限らない。
本明細書では、以下の用語および定義を使用する:
本明細書で使用されるとき、「実質的に精製されたポリペプチド」とは、実質的に同一の分子量(例えば、試料中にて約90%より多くの、好ましくは約95%より多くの、約98%より多くの、および約100%までのポリペプチドが実質的に同一の分子量である)のポリペプチドを含むポリペプチド試料を言う。実質的に精製されたポリペプチドは、必ずしも同一のポリペプチド配列を含むとは限らない。
本明細書で使用されるとき、「実質的に同一の分子量」とは、分子量において10キロダルトン未満の差異、好ましくは分子量において5キロダルトン未満の差異、最も好ましくは分子量において1kd未満の差異を有するポリペプチドを言う。
本明細書で使用されるとき、「試料のバンド」または「試料のプラグ」とは、試料(例えば、実質的に精製されたポリペプチドまたは実質的に精製されたペプチド)を含む一定容量の流体を言う。
本明細書で使用されるとき、流路において第2の固相に「実質的に隣接する」第1の固相は、第1の固相の少なくとも一部が第2の固相に接触する第1の固相を表す。
本明細書で使用されるとき、「プロテアーゼ消化デバイス」とは、少なくとも一部がそこに固定化されるプロテアーゼを含む少なくとも1つの流路を含む基材を含む微小流体デバイスを言う。プロテアーゼ消化デバイスは、統合されたプロテオーム解析システムの一部であってもよいし、上流のデバイスまたは下流のデバイスとは独立して(例えば、それらから分離して)使用することもできる。
本明細書で使用されるとき、「流路に固定化されたプロテアーゼ」は、流路に入れられた試料の少なくとも一部の消化を達成するのに必要な時間(例えば、試料の少なくとも1%を消化することができる時間)の、流路とプロテアーゼの安定した結合を言う。固定化が永続的である必要はない。例えば、一態様においては、流路の磁場への暴露をコントロールすることによって流路に選択的に送達し、選択的に流路から除去することができる磁気ビーズ上にプロテアーゼを固定化することができる。プロテアーゼは、流路に残存する限り流路内を移動することができる。
本明細書で使用されるとき、「接続微小流体デバイス」または「接続デバイス」とは、回収、保持、分離および集中の1つまたは複数の機能を行うことができ、かつ一般に少なくとも1つの上流のデバイスおよび少なくとも1つの下流のデバイスに接続されるデバイスを言う。
本明細書で使用されるとき、「連絡して」という用語は、別のシステムまたはシステムの構成成分から入力を受け取り、入力に反応して出力を提供するシステムまたはシステムの構成成分の能力を言う。「入力」または「出力」は、電気的シグナル、光、データ(例えば、スペクトルデータ)、材料の形態であってもよく、あるいはシステムまたはシステムの構成成分によってなされる作用の形態であってもよい。「連絡して」という用語は、1つのシステムと別のシステムとの間の、または1つのシステムの構成成分と別の構成成分との間の直接的であっても、または間接的であってもよい物理的な接続も包含する。
本明細書で使用されるとき、「分子プローブ」とは、生体分子(例えば、ポリペプチドまたは核酸)と反応する際に検出可能な分子、または検出可能な分子を産生する分子である。
本明細書で使用されるとき、「発現」とは、生成物のレベル、形態または局在を言う。例えば、「タンパク質の発現」とは、タンパク質のレベル、形態(例えば、修飾、または切断またはその他の処理された生産物の有無あるいは量)または局在のうち1つまたは複数を言う。
本明細書で使用されるとき、「診断上の特徴」とは、全体として診断上である、1つの同定するための特徴または特徴のセットである。「特徴」という用語は、生物学的特徴および経験(例えば、薬剤への暴露、職業、居住地)の双方を包含する。一態様においては、特徴は、例えば、形質転換した細胞、不死化した細胞、前癌細胞もしくは癌細胞のような特定の細胞種、または状態(例えば、疾患)のためのマーカーであり、特徴の検出は、試料がその細胞種または状態を含むという信頼できる認証を提供する。したがって、特徴に影響する作用剤をスクリーニングすることは、95%の信頼水準の範囲内で統計的に有意であるその特徴において検出可能な変化または反応を起こすことができる作用剤を同定することを言う。
本明細書で使用されるとき、「癌」という用語は、正常な成長コントロールに対する感受性を喪失している細胞の増殖によって生じるまたはそれを特徴とする悪性疾患を言う。「悪性疾患」とは、元々の細胞を侵略する、または元々の細胞から離れた部位に移動する能力を得た細胞により生じる疾患を言う。
本明細書で使用されるとき、「癌特異的マーカー」とは、癌細胞に優先的に発現される生体分子であり、成人個体の非癌細胞には発現されないか、または少量発現される。本明細書で使用するとき、「少量」とは、癌細胞と非癌細胞におけるマーカーの発現の差異が、通常の統計方法を用いた場合に、95%の信頼水準の範囲内までで、統計学的に有意な差異として検出されるのに十分なほど大きいことを意味する。
本明細書で使用されるとき、「発現における差異」または「差次的発現」とは、発現の増減を言う。差異は、定量的測定(例えば、ポリペプチドまたはポリペプチドをコードするRNAの量)における増減であってもよいし、定性的測定の変化(例えば、ポリペプチドの局在の変化)であってもよい。差異が定量的測定で観察される場合、本発明に係る差異は、正常な標準試料におけるレベルよりも少なくとも約10%大きいか、または小さい。差異が増加である場合、増加は、約20%、30%、50%、70%、90%、100%(2倍)以上ほどで、約5倍、10倍、20倍、50倍以下、またはそれ以上の増加であってもよい。差異が低下である場合、低下は、約20%、30%、50%、70%、90%、95%、98%、99%以下であってもよく、100%(特異的なポリペプチドまたはRNAは存在しない)を含めてもよい。必要に応じて、定性的差異でさえ定量的用語で表され得ることに注意すべきである。例えば、ポリペプチドの細胞内局在における変化を元々の局在を示す細胞の比率における変化として表してもよい。
本明細書で使用されるとき、「薬剤の有効性」または「治療剤の有効性」とは、診断上の特徴の発現を正常と有意差のない値(通常の統計方法によって、95%の信頼水準の範囲内までで決定される)に回復させる薬剤または治療剤の能力として定義される。
本明細書で使用されるとき、「試料」とは、ポリペプチドおよび/またはペプチドを言う。試料は、生物学的な液体、懸濁液、緩衝液、細胞の回収、組織、腫瘍、生物体(例えば、細菌や酵母のような微生物)のこすり取り、断片または切片等(これらに限定されない)の種々の供給源から得ることができる。試料はまた、例えば、核またはミトコンドリアのような細胞内小器官を含む細胞成分分画も含む。
本明細書で使用されるとき、「生物学的な液体」には、血液、血漿、血清、唾液、尿、脳脊髄液、洗浄液、および白血球搬出(leukapheresis)試料が挙げられる。
本明細書で使用されるとき、「平行流路の構成」とは、流路間の交差点にて共通の電圧出力を提供するものである。しかしながら、流路の幾何学的配置は、必ずしも平行であるとは限らない。しかしながら、流路は、共通の入力流路および共通の出力流路を有する回路における一組の平行抵抗器として構成されるべきである。
本明細書で使用されるとき、別の流路に対して「実質的に平行である」幾何学構成を有する流路は、他方の流路の長軸に対して5度未満の角度である流路である。別の流路に対して「実質的に垂直」である流路は、別の流路の長軸に対して90°±5°である流路である。
本明細書で使用されるとき、複数の配列から「組み立てられる」アミノ酸配列とは、末端と末端との接続および/または重なり合った領域において重なり合った配列の接続を言う。
本明細書で使用されるとき、「システムプロセッサ」とは、メモリ、複数のプログラムを同時に作動させることができる中央処理ユニット、および、好ましくは、少なくとも1つの非システムの装置から端末に電気信号を送り、受け取ることが可能であるネットワーク接続の端末を含むデバイスを言う。システムプロセッサは、それ自体のプロセッサまたはマイクロプロセッサを有してもよい1つまたは複数のシステムの構成成分(例えば、モジュール、検出器、コンピュータワークステーション等)と連絡する。後者の型のプロセッサまたはマイクロプロセッサは一般に、メモリおよび特定機能専用である保存されたプログラム(例えば、検出器プロセッサの場合、蛍光シグナルの検出、またはペプチド解析モジュールプロセッサの場合、イオン化スペクトルを得ること、または1つまたは複数のデバイスに電力供給を接続した場合、デバイスにおいて選択された流路の電圧および電流の設定をコントロールすること)を含み、一般に直接的にはネットワークに接続可能ではない。それに対して、システムプロセッサは、種々のシステムの構成成分に関係するプロセッサ/マイクロプロセッサの機能を統合して、以下にさらに記載するようにプロテオーム解析を行う。
本明細書で使用されるとき、「データベース」とは、関係を示す表に従ってリンクするファイルを用いて階層的にデータが整理されているかどうかを決定するデータモデルに従って、またはシステム操作者によって決定された幾つかのその他のモデルに従って、組織化された情報または事実の収集である。システム操作者によって確立された定義に基づいた解釈に一致する形式でデータベース内のデータを保存する。
本明細書で使用されるとき、「システム操作者」とは、データベースへのアクセスをコントロールする個人である。
本明細書で使用されるとき、「情報管理システム」とは、データベースを検索し、そのような検索の結果として同定されたデータ間の関係を決定することができる1つのプログラム、または一連のプログラムを言う。
本明細書で使用されるとき、「使用者デバイスの画面上のインターフェース」または「使用者インターフェース」または「図解的な使用者インターフェース」とは、使用者が本発明に係るデータベースおよび情報管理システムと相互交流することを可能にするネットワークに接続可能な使用者デバイスのスクリーンまたはモニタによって表示される画面(文字および/または図解による情報を含む)である。
本明細書で使用されるとき、用語「リンク」とは、情報を参照する1つの画面またはインターフェース(「リンク源」)からさらなる情報が存在するその他のスクリーン画面(「リンク目的地」)に見る人がリンクする(ジャンプする)ことができるネットワークに接続可能な使用者デバイスにおいて実施されるポイント・アンド・クリックのメカニズムを言う。「リンク」という用語は、情報が利用可能であることを示す画面要素、および情報を見い出し(例えば、データベース中で)目的地スクリーンに表示するプログラムの双方を包含する。一態様においては、リンクは文字と関係している;しかしながら、その他の態様においては、リンクは画像またはアイコンに関係している。一部の態様においては、リンクを選択することにより(例えば、マウスを用いて右クリックすることにより)、使用者に幾つかのインターフェースの1つを見るという選択肢を提供するように表示されるドロップダウンメニュを生じる。操作ボタン、ラジオボタン、チェックボタン等の形態でもリンクを提供することができる。
使用されるとき、「データベースの少なくとも一部へのアクセスを提供すること」とは、視覚または聴覚の伝達手段を介してデータベースの情報を使用者(単数または複数)に公開することを言う。
本明細書で使用されるとき、「経路の分子」または「経路の生体分子」とは、同一経路に関与する分子であり、その蓄積および/または活性および/または形態(すなわち、まとめて、分子の「発現」という)は、その他の経路の分子に依存しており、またはその蓄積および/または活性および/または形態は、他の経路の標的分子の蓄積および/または活性または形態に影響を及ぼす。例えば、「GPCR経路の分子」とは、その発現がGPCRと同族のリガンド(GPCRに特異的に結合し、細胞内カルシウムの上昇のようなシグナル伝達反応を誘発するリガンド)との相互作用により影響を受ける分子である。したがって、GPCR自体が、そのリガンドがそうであるように、細胞内カルシウムがそうであるように、GPCR経路の分子である。
本明細書で使用されるとき、「相関」とは、当該技術分野で既知の通常の統計方法を用いて決定される統計的に有意な関係を言う。例えば、一態様においては、統計的有意性は、p<0.05で差異を統計的有意とみなして、スチューデントの対応のないt検定を用いて決定される。
本明細書で使用されるとき、「診断用プローブ」とは、組織試料および/または細胞試料へのその結合が特定の特徴の有無の指標を提供するプローブである。一態様においては、プローブが、異常組織/異常細胞を含む試験試料の少なくとも約80%で異常組織および/または異常細胞(「異常試料」)に結合し、試料の非異常組織/非異常細胞(「非異常」試料)の10%未満に結合すれば、プローブは診断用とみなされる。好ましくは、プローブは、少なくとも約90%または少なくとも約95%で異常試料に結合し、5%または1%未満の非異常試料に結合する。
本明細書で使用されるとき、「ペプチド」とは、20未満の連続したアミノ酸を含む生体分子を言う。
本明細書で使用されるとき、「ポリペプチド」とは、20を超える連続したアミノ酸を含む生体分子を言う。「ポリペプチド」という用語は、タンパク質を包含することを意味するが、20を超える連続したアミノ酸である、タンパク質の断片、またはタンパク質の切断形態、または部分的に消化されたタンパク質も包含する。
統合されたプロテオミクス解析システム
好ましい態様においては(図1Aに示す)、統合されたプロテオミクス解析システム1は、上流の分離モジュール2、好ましくは少なくとも1つの微小流体モジュール4と接続する1つまたは複数の分離カラムまたは流路(例えば、2a、2b等)を含む多次元のクロマトグラフィ装置を含む。微小流体モジュール4は、上流の分離モジュール2から実質的に精製されたポリペプチドを受け取るための1つまたは複数の受入流路8rを含む基材である微小流体デバイス5を含む。好ましくは、微小流体デバイス5は、デバイス5の1つまたは複数の流路8と連絡する開口部であって、それを介して溶液および/または試薬を流路8に導入することができる開口部を含む上重ね基材(例えば、カバーグラス、示さず)によって覆われる。上重ね基材はまた、実質的に含有される環境として微小流体モジュール4を維持し、微小流体デバイス5の流路8を介して流れる溶液の蒸発を最小化する。
好ましい態様においては(図1Aに示す)、統合されたプロテオミクス解析システム1は、上流の分離モジュール2、好ましくは少なくとも1つの微小流体モジュール4と接続する1つまたは複数の分離カラムまたは流路(例えば、2a、2b等)を含む多次元のクロマトグラフィ装置を含む。微小流体モジュール4は、上流の分離モジュール2から実質的に精製されたポリペプチドを受け取るための1つまたは複数の受入流路8rを含む基材である微小流体デバイス5を含む。好ましくは、微小流体デバイス5は、デバイス5の1つまたは複数の流路8と連絡する開口部であって、それを介して溶液および/または試薬を流路8に導入することができる開口部を含む上重ね基材(例えば、カバーグラス、示さず)によって覆われる。上重ね基材はまた、実質的に含有される環境として微小流体モジュール4を維持し、微小流体デバイス5の流路8を介して流れる溶液の蒸発を最小化する。
好ましい態様においては、「オンデバイス」でのタンパク質消化システムを生じるシステム1の少なくとも1つの微小流体モジュール4のプロテアーゼ消化デバイス5の1つまたは複数の流路8にプロテアーゼを固定化する。一層さらに好ましくは、大量輸送によってポリペプチドが微小流体モジュール4の流路8を介して移動しながら、ポリペプチドがプロテアーゼで消化されるにつれて濃縮される。一態様においては、消化されたポリペプチド生成物、すなわちペプチドを回収し、これらペプチドのさらなる分離を実行することができる下流の分離モジュール14(例えば、キャピラリー電気泳動またはCEモジュール)に微小流体モジュール4をその下流末端にて連結する。下流の分離モジュール14は、個々のペプチドの特性に関する情報を収集するのに使用されるペプチド解析モジュール17(例えば、エレクトロスプレータンデム質量分析計またはESI−MS/MS)と連絡する。下流の分離モジュール14をペプチド解析モジュール17に接続するために1つまたは複数の接続微小流体モジュール4iも提供される。
好ましくは、システム1は、実質的に分離されたタンパク質およびペプチドがシステムの異なったモジュールを介して移動しているとき、システム1の異なったモジュールから(および/またはそれら自体に結合しているプロセッサまたはマイクロプロセッサから)得られた電気信号を、実質的に分離されたタンパク質およびペプチドの分離有効性および特性に関する情報に変換することができるシステムプロセッサ18をさらに含む。好ましくは、システムプロセッサ18は、タンパク質/ペプチドがシステムの異なったモジュールを介して移動する速度も監視する。好ましくは、シグナルは、システム1の異なったモジュールおよび/または流路と光学的に連絡する1つまたは複数の検出器23から得られる。一実施形態においては、検出器23は、上流の分離モジュール2と連絡し、消化反応を受けさせるために、それ自体が微小流体モジュールの正しい位置に試料プラグを送達することができる。
システム1は、システム内部で、構成成分/モジュールの配置および数を変化させることが可能である。例えば、検出器23の数および配置は変化することが可能である。一態様においては、プロテアーゼ消化モジュールは、介在する下流分離モジュール14および/または接続モジュール4iと接続しないでペプチド解析モジュール17に直接接続することができ、または接続モジュール4iではなく下流の分離モジュール14に接続することができ、または下流の分離モジュール14ではなく接続モジュール4iに接続することができる。一部の態様においては、プロテアーゼ消化モジュール4が分離を行うこともでき、上流の分離モジュール2の1つまたは複数の分離機能を削除しうる。さらに他の態様においては、微小流体モジュール4に接続しないで、ペプチド解析モジュール17への接続のために接続モジュール4iを分離モジュールに連結することができる。この筋書きでは、システム1に接続していないプロテアーゼ消化デバイス4iから得られた後、またはあまり好ましくないが、ゲル上の消化プロセスから得られた後、消化または部分消化されたポリペプチドを分離モジュールに送達することができる。
さらに、該システムは、異なったモジュールが互いの機能を補完し合うという意味で「統合された」と記載してあるが、システムの種々の構成成分は、別々におよび/または別のシステムと合わせて使用することができる。例えば、上流の分離モジュール2、プロテアーゼ消化モジュール4、下流の分離モジュール14、接続モジュール4i、およびペプチド解析モジュール17、ならびにそれらの組み合わせから成る群から選択される構成成分を別々に使用することがでる。さらに、システム内で一部のモジュールを反復することができ、例えば、複数の上流および/または下流の分離モジュール(2および/または14)、複数のプロテアーゼ消化モジュール4、複数の接続モジュール4i、複数の検出器23、および複数のペプチド解析モジュール17がシステム1内に存在してもよい。多数の順列が可能であり、これら順列の全てが本発明の範囲内に包含されることは当業者に明白であるはずである。
上流の分離モジュール
本発明の好ましい態様においては、上流の分離モジュール2は少なくとも一次元の分離を含む。一実施形態においては、上流の分離モジュール2はキャピラリー電気泳動装置を含む。しかしながら、好ましいバージョンとしては、多次元のカラム分離装置を使用するであろう。種々の様式のクロマトグラフィ、電気泳動法、および拡散に基づいた分離が挙げられるが、これらに限定されず、相互に互換性のあるいかなる組み合わせの化学的分離システムも結びつけ得る。多次元分離では、試料は、異なった基準に従って少なくとも二次元で分離される。例えば、一次元目では、等電点電気泳動を用いて試料中の構成成分を分離して、目的の構成成分の等電点に関係する情報を提供し、二次元目では、同一等電点を有する構成成分をさらに分子量に従って分離することができる。
本発明の好ましい態様においては、上流の分離モジュール2は少なくとも一次元の分離を含む。一実施形態においては、上流の分離モジュール2はキャピラリー電気泳動装置を含む。しかしながら、好ましいバージョンとしては、多次元のカラム分離装置を使用するであろう。種々の様式のクロマトグラフィ、電気泳動法、および拡散に基づいた分離が挙げられるが、これらに限定されず、相互に互換性のあるいかなる組み合わせの化学的分離システムも結びつけ得る。多次元分離では、試料は、異なった基準に従って少なくとも二次元で分離される。例えば、一次元目では、等電点電気泳動を用いて試料中の構成成分を分離して、目的の構成成分の等電点に関係する情報を提供し、二次元目では、同一等電点を有する構成成分をさらに分子量に従って分離することができる。
一態様においては、図1Aに示されるように、上流の分離モジュール2は、少なくとも第1と第2の分離経路(それぞれ、2aと2b)を含む。一態様においては、少なくとも1つの分離経路はキャピラリーである。別の態様においては、双方の分離経路がキャピラリーである。第1および第2の分離経路は、第1および第2の分離媒体を含む。
一態様においては、第1の分離経路は、第1の分離媒体の中に分離されるべきポリペプチドの混合物を含む試料を注入するまたは送達する注入装置(例えば、マイクロピペット、示さず)に連結されたキャピラリーである。好ましい態様においては、試料は、細胞(単数または複数)、組織(単数または複数)、生物体(単数または複数)(例えば、細菌または酵母のような微生物)等の溶解物を含む。特に好ましい態様においては、試料は、異常に増殖する細胞(例えば、腫瘍に由来する癌様細胞)の溶解物を含む。試料はまた、特定の細胞内小器官(例えば核またはミトコンドリア)が濃縮されたものなど、細胞成分分画を含むこともできる。一態様においては、分離に先立ってタンパク質を濃縮する。好ましくは、注入される試料は、マイクログラムのポリペプチドを含む。
第1の分離経路2aの少なくとも第1および第2の末端に連結された1つまたは複数の電極(示さず)を用いて、分離経路に沿って電場を作成する。一態様においては、第2の分離経路2bが第1の分離経路に接続し、第1の基準に従って実質的に分離された第1の分離経路2aから試料を受け取る。分離された試料が第2の分離経路2bを通って通過することにより、これらの試料が第2の基準に従って実質的に分離される。試料を並行して分離するために、多数の平行の分離経路2bも提供することができる。分離経路において試料の流れをコントロールするシステムおよび方法は、米国特許第5,942,093号に記載されている。
第1および第2の分離経路(それぞれ、2aおよび2b)の交差領域は、各々図1Aにおいて矢印で示され、第1の基準に従って実質的に分離された試料を第2の分離媒体に注入するための注入装置を形成する。分離2bのためにキャピラリー電気泳動が使用されるならば、第2の分離経路2bに沿って電場を適用し、それにより第1の基準に従って実質的に分離された試料を第2の基準に従って実質的に分離する。一態様においては、1つまたは複数の廃棄物経路(示さず)が提供されて、望ましくないキャリア媒体を引き出す(例えば、米国特許第5,599,432号を参照)。
追加の分離経路を、第1の分離経路2aの下流に提供することができ、例えば、第2の分離経路に接続して、または第1および第2の分離経路の間に提供することができる。これら追加経路はそれぞれ、上流の分離経路と同一の、または異なった基準を用いて分離を行うことができる。
一態様においては、少なくとも1つの分離経路における少なくとも1つの分離媒体を用いて経路にpH勾配を確立する。例えば、第1の分離媒体として両性電解質を使用することができる。一方の末端にてリザーバ部(示さず)に、そして他方の末端にて、第1と第2の経路の間の交差点に近い回収経路(示さず)に第1の経路を接続することができる。電極を用いて、両性電解質を含むリザーバおよび回収経路に電場を生じさせることができる。両性電解質の分子の酸性基および塩基性基が、電場に従って自ら並び、移動し、そのようにして両性電解質において一時的なまたは安定的なpH勾配を生じる。
流体を経路に放出するため、経路から流体を除去するため、または流体が経路に入るの防ぐため、そのいずれかのために異なった構成で作動するバルブを用いて、上流の分離モジュール2においてその他の経路から、異なる分離経路、リザーバ、回収経路および廃棄物経路を隔離することができる(例えば、米国特許第5,240,577号の記載を参照。その全体を本明細書に参照により援用する)。モジュール2の種々の部分における電圧の差異をコントロールすることにより、同じ効果を達成することができる。好ましくは、モジュール2内の異なる経路における構成成分の分離を監視する1つまたは複数の検出器23とさらに連絡するプロセッサ18によって、バルブの開閉または電位の変化をコントロールする(例えば、米国特許第5,240,577号の記載を参照)。
このようにして、第1の分離経路2aを用いて等電点電気泳動を行うことができる一方で、第2の分離経路2bを用いて質量のような別の基準によって構成成分を分離することができる。しかしながら、リザーバおよび回収経路の構成を変えることにより、等電点電気泳動を第2の分離経路2bで行う一方で、質量による分離を第1の経路で行うことができることが当業者に明白であろう。その上さらなる態様においては、上流の分離モジュール2において、複数の異なった分離経路に複数の異なったpH勾配を確立することができる。
分離された試料のプロテアーゼ消化を行うことができる微小流体モジュール4のようなそれが接続する下流のシステムに適合するように、上流の分離モジュール2における緩衝液および試薬の選択が最適化されるだろう(以下でさらに記載する)。好ましくは、ポリペプチド/ペプチドの溶解性を維持する一方で下流のシステム(例えば、プロテアーゼ消化、および最終的には、タンパク質の解析)で起こる反応に実質的に影響を与えない緩衝液を選択する。例えば、トリプシン消化(例えば、下流の微小流体モジュール4で起こる)またはイオン化(例えば、下流のペプチド解析モジュール17で起こる)のような解析に影響を与えない場合に、アセトニトリル(ACN)ならびに例えば尿素およびグアニジンのような溶解剤を使用することができる。必要とされるわけではないが、上流の分離モジュールとしてCEカラムを使用する場合、CEカラムの上流に、SPEビーズを組み込んだ固相抽出(SPE)CEシステムを提供することができ、CE分離に先立って、緩衝液を変えること、試料を濃縮することが可能になる。市販のクロマトグラフィビーズは、界面活性剤を含有する溶液からタンパク質を抽出するのに特異的に設計されている(カリフォルニア州、オーバーン(Auburn)ミクロンバイオリソース(Michron Bioresources))。SPEからの溶出もACNで達成することができる。
現在好ましい態様においては、サイズ排除、例えば、サイズ排除クロマトグラフィ(SEC)等を基にする少なくとも1つの分離を行う(例えば、Guillaume, et al., 2001, Anal. Chem. 73(13):3059-64を参照)。イオン交換も採用することができ、勾配技術であるという利点を有する。これら分離の双方は、タンパク質の溶解性を維持するのに使用される界面活性剤および変性剤に適合する。別の態様においては、少なくとも1つの分離が等電点クロマトグラフィ(CF)分離である。CF分離は、等電点(pI)に基づいて分離し、ミリグラム量のタンパク質を調製するのに使用することができる(例えば、Burness et al., 1983, J. Chromatogr. 259(3):423-32; Gerard et al., 1982, J. Immunol. Methods 55(2):243-51を参照)。好ましくは、第1の分離経路2aでSECが行われ、第2の分離経路2bでCFが行われ、2DEと同程度のレベルと質の分離が達成される。
約96までの流路、またはそれ以上の流路を含む微小流体デバイスが製造されているので(例えば、Simpson et al., 1998, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95:2256-2261; Liu et al., 1999, Analytical Chemistry 71:566-573等の記載を参照)、本発明に係る統合された微小流体デバイスシステムに、並行分離を容易に組み込むことができる。
しかしながら、マイクログラムの試料を含む大容量を濃縮するために(すなわち、マイクロリットル対ナノリットル)好ましくは上流の分離モジュール2が用いられるので、上流の分離モジュールの少なくとも1つの構成成分が大容量の試料を濃縮し、そのような試料の中でポリペプチドを分離することができることが好ましい。したがって、特に好ましい態様においては、上流の分離モジュール2は、1つまたは複数のクロマトグラフィカラムを含み、好ましくは少なくとも1つのキャピラリー電気クロマトグラフィカラムを含む。
例えば、分離経路は、密に詰めたビーズ、ゲルまたはその他の適切な粒状材料を含む分離媒体を含んでおり、試料構成成分を含む流体がその上を流れることができる大きな表面積を提供することができる。大きな表面積は、流体の粒状材料との相互作用を促進し、密に詰まった無作為に空間のある粒状材料によって流体が分離経路の実際の長さよりもはるかに長い有効な経路にわたって移動させられる。分離経路を通過する試料の構成成分は、流体中の各構成成分の分配係数に基づいて移動相(分離経路を通って流れる液体溶出液)と同様に静止相(分離経路中の粒子)とも相互作用する。分配係数は、静止相における構成成分の濃度と移動相における構成成分(例えば、ポリペプチドまたはペプチド)の濃度の比として定義される。したがって、大きな分配係数を有する構成成分は、よりゆっくり移動し、遅く溶出する。
好ましい態様においては、上流の分離モジュール2におけるクロマトグラフによる分離が電気泳動によって促進される。好ましくは、キャピラリー電気クロマトグラフィ(CEC)で使用されるようなチューブにおいて分離が起こる。
より小さな粒径が一般に使用されるが、CECは、電気泳動分離の電気的に駆動される流れの特徴を、液体クロマトグラフィに典型的な固体の静止相の使用と組み合わせている。それは、逆相液体クロマトグラフィの分離力を高効率のキャピラリー電気泳動と結びつけている。キャピラリー電気クロマトグラフィ分離では液体クロマトグラフィよりも高い効率を得ることが可能である。電気泳動とは対照的に、液体クロマトグラフィの分離メカニズムを用いて、カラム粒子の静止相と移動相との間で分析物の分配を行うことによって、キャピラリー電気クロマトグラフィは中性の分子を分離することが可能である。
CECでは、静止相は、キャピラリーチューブに詰められた粒子(詰められたCEC)であることも、またはキャピラリー(開放チューブまたはOTEC)の壁に結合される(すなわち、修飾または被覆される)ことも可能である。静止相の材料は、マイクロHPLCで使用されるものと同様である。しかしながら、移動相は、高圧機械ポンプを使用するのではなく、CZEの場合と同様に、印加された電場を用いて電気−浸透圧の流れを生成することにより、キャピラリーカラムを介してポンピングされる。これによって、高い分離効率を提供する均一な流れ特性が生じる。したがって、現在好ましい実施形態においては、上流の分離モジュール2の少なくとも1つの構成成分が1つまたは複数のCECカラムを含む。
マイクロチップの一部としてCECシステムを提供することもできる。例えば、Jacobson et al., 1994, Anal. Chem. 66:2369-2373に記載のとおり参照されたい。
プロテアーゼ消化のための微小流体モジュール
微小流体デバイスは、多数の試料を迅速に解析するために開発された。従来の分離装置に比べて、微小デバイスに基づいた分離装置は、高い試料処理能力を有し、試料および試薬の消費を低減し、化学的な廃棄物も低減する。微小デバイスに基づいた分離装置の液体の流速は、ほとんどの適用で、1分当たりおよそ1〜300ナノリットル(nL)の範囲である。
微小流体デバイスは、多数の試料を迅速に解析するために開発された。従来の分離装置に比べて、微小デバイスに基づいた分離装置は、高い試料処理能力を有し、試料および試薬の消費を低減し、化学的な廃棄物も低減する。微小デバイスに基づいた分離装置の液体の流速は、ほとんどの適用で、1分当たりおよそ1〜300ナノリットル(nL)の範囲である。
微小流体デバイスは、希釈することなくnL容積の溶液を取り扱う新しい方法を提供する。そのコンパクトな形態によって、プロテオーム解析に必要な大量の並行処理が可能になる。高処理能力のDNA配列決定のためにデバイス上に96までのキャピラリーのアレイが組み立てられている(Simpson et al., 1998, 上記;Liu et al., 1999, 上記)。さらに、電極のアレイによって、デバイスの異なった流路を介した試料のオンデバイス電気浸透圧ポンピングが容易に達成され得る。高圧のラインとバルブのアレイをコントロールするよりも電極のアレイをコントロールする方がはるかに容易である。さらに、閉鎖システムの構造によって汚染、および蒸発により生じる困難さが低減される。
一態様においては、システム1は、上流の分離モジュール2の下流において、そして上流の分離モジュール2の1つまたは複数の分離経路に接続するための1つまたは複数の受入流路8rを含むことができる受入流路インターフェース15を介して上流の分離モジュールと連絡して、オンデバイス消化微小流体モジュール4を含む。
好ましくは、微小流体デバイス5は、シリコンまたはガラスまたはポリマーのような生体適合性の基材を含み、1つまたは複数の流路8を含む。好ましくは、該デバイスは、少なくとも約2、少なくとも約4、少なくとも約8、少なくとも約16、少なくとも約32、少なくとも約48、または少なくとも約96の試料保持流路を含む。流路8は、サイズを変化させることができ、一般に、幅約50μm〜200μm(好ましくは、幅約80μm〜100μm)であり、深さ約5μm〜40μm(好ましくは、深さ約10μm〜30μm)である。基材は必ずしも平面であるとは限らず、三次元の流路ネットワークで表されてもよい。
一態様においては、デバイス5は、パターン化されたシリコンの原盤に対する迅速な複製成形によって形成される。シリコンの原盤は、フォトレジストを用いた写真平板技術によって形成することができる。例えば、標準的な写真平板手順は、Crによるシリカのデバイスのスパッタ被覆、フォトレジスト(例えば、nSU8陰性フォトレジスト等)によるスピン被覆、フォトレジストへの暴露、およびHF/NH4Fによる流路のエッチングから成る。流路のエッチング方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Fan et al., 1994, Anal. Chem. 66:177-184およびJacobson et al., 1994, Anal. Chem. 66:1107-1113に記載されている。デバイス5を製造するのに、反応性イオンエッチング、熱酸化、写真平板技術、イオン移植、金属蒸着、およびその他の標準的な半導体加工技術も使用することができる。
実質的に閉鎖したシステム(例えば、蒸発および試料の汚染に耐性)(示さず)を維持するために、上重ね基材によってデバイスを実質的に覆うことができる。上重ね基材は、デバイス5と実質的に同じサイズであり得るが、少なくとも、デバイス5の流路8を覆うのに十分なくらい実質的に大きい。一態様においては、上重ね基材は、デバイス5における少なくとも1つの流路と連絡するための少なくとも1つの開口部を含む。開口部を使用してデバイス5に試薬または流体を添加することができる。別の態様においては、図1Bに示されるように、開口部を使用して、開口部と連絡する異なった流路に電圧を印加することができる。
上重ね基材を形成するのに適切な材料は、シリコン、ガラス、プラスチックまたは別のポリマーを含む。一態様においては、上重ね基材6は、実質的に光を透過する材料を含む。例えば、当該技術分野で既知のように、陽極結合、珪酸ナトリウム結合、融合結合によって、またはデバイスの基材5と上重ね基材6の双方がガラスを含む場合はガラス結合によって、上重ね基材6をデバイス5に結合または固定することができる(例えば、Chiem et al., Sensors and Actuators B 63:147-152に記載のとおり参照)。
微小流体モジュール4は、好ましくは、受入流路8rにおいて、上流の分離モジュール2から実質的に分離されたタンパク質を回収し、そして微小流体モジュール4は、試料を1つまたは複数のプロテアーゼと反応させるための少なくとも1つの試料保持流路をさらに含む。
デバイスは、様々な流路の幾何構造を含むことができる。一態様においては、デバイスは、出力流路にて再び合流する複数の実質的に平行の試料保持流路に分割する1つの受入流路を含む(図2A参照)。しかしながら、別の態様においては、受入流路は複数の交差流路25に分割される。交差流路25は複数の試料保持流路と統合される。第1の末端と第2の末端を含む交差流路が試料保持流路を横切る(図1A参照)。受入流路が交差流路の第1の末端と合流する一方で、出力流路が交差流路の第2の末端と合流する。試料保持流路は交差流路に実質的に垂直である。適切な流体の流れの関係が維持されている限り、絶対的な流路の幾何配置は重要ではない。例えば、流路をカーブさせることができ、一態様においては、基材自体が平面ではなく、流路は非同一平面であることが可能である(例えば、中心ハブからのスポークのように中央の交差流路から放射される)。
流路のレイアウトの幾何配置に対して多数の改良を行い、デバイスの性能を高めることができ、そのような改良は本発明の範囲内に包含される。例えば、より短い流路は試料バンドが輸送されるべき距離を減らすが、一般に、流路は、試料バンドを保持するために、また電流のフィードバックを防ぐように流路と接する電極間に適切な分離を与えるために十分長いことが必要である(以下でさらに考察する)。
図2Aは、プロテアーゼ消化デバイスが、注入交差点において少なくとも2つの平行な流路または試料保持流路8に分れる受入流路8rを含むという実施形態を示す。本発明の好ましい実施形態においては、1つまたは複数のリザーバ流路8resが受入流路8rおよび/または試料保持流路8と交差する。より好ましくは、少なくとも1つのリザーバが、上重ね基材6における開口部11と接続するリザーバウエルで終結し、そのため開口部11を介して微小流体デバイス5のリザーバに溶液または試薬を添加することができる。平行の流路8は、出力流路9で再び合流する。
現在好ましい実施形態においては、図1Aに示されるように、そのようなデバイスは、交差流路25が横切る少なくとも1つの試料保持流路8を含むことができ、その際、その交差流路は第1の末端25aおよび第2の末端25bを含む。好ましくは、交差流路25は、少なくとも1つの試料保持流路8に対して垂直である。実質的に精製されたポリペプチドを受け取るための受入流路8r(単数または複数)は、交差流路25の第1の末端25aと合流する一方で、出力流路9は交差流路25の第2の末端と合流する。好ましくは、交差流路に対して実質的に垂直である複数の試料保持流路8は、デバイスの一方の端の領域からデバイスの他方の端の領域まで延びる。交差流路の第2の末端25bは、ペプチド解析モジュール17に直接連結することができるが、好ましくは、さらなる試料の保持、分離、集中および/または濃縮のために、下流の分離モジュール14および/または接続モジュール4iに連結される。
さらに別の実施形態においては、微小流体デバイス5は複数の交差流路25を含み、その際、各交差流路は、図2Bに示されるように一連の試料保持流路8を含んでおり、したがって微小流体モジュール4がデバイス5または交差流路25の全体の長さを増やさずに処理できる試料の量が増大する。一実施形態では、試料保持流路は補助流路77と統合される。補助流路77を使用して、補給の流れを提供し(provide make-up flow)、緩衝液を提供し、または試薬を提供することができる。
プロテアーゼ消化のための試料保持流路に加えて、追加の流路を提供することができる。例えば、一態様においては、実質的に精製されたポリペプチドを含む試料を直接ペプチド解析モジュール17に移動させてその質量を決定するため(例えば、ポリペプチドの消化形態と比較するため)の、プロテアーゼ耐性である1つまたは複数の流路が提供される(例えば、流路が1つまたは複数のプロテアーゼ阻害剤を含むことができる)。別の態様においては、ポリペプチドまたはそれらの消化生成物を化学的に修飾するための誘導体化酵素および/または化学薬品を含み、ペプチド解析プロセスを促進する1つまたは複数の流路が提供される。一実施形態においては、補助流路77を介してこれらの酵素が提供される。さらなる態様においては、システムのその他の異なった流路に選択的に添加することが可能な緩衝液および/またはその他の試薬を含む1つまたは複数の流路を提供することができる。例えば、そのような流路を介して好適なイオンを提供し、システムの1つまたは複数のその他の流路のpHを変えることができる。
好ましくは、微小流体モジュール4は、実質的に分離されたタンパク質のオンラインでのタンパク質消化のためにシステム1において区画を提供する。一態様においては、デバイス5は、そのデバイスの1つまたは複数の試料保持流路8に固定化されたプロテアーゼを含む。約6〜約24時間を必要とし得る、例えばトリプシンのようなプロテアーゼによるゲル中消化とは対照的に、本発明に係る微小流体デバイス5を用いる「オンデバイス」での消化は、化学的なバックグランドがほとんどなく、分の時間単位で行うことができる。固定化されたプロテアーゼによって、自己溶解生成物は無視できるほどしか生じずに、高濃度の酵素を使用できる。対照的に、ゲル中消化では、酵素がゲルに浸透しなければならず、酵素の固定化は除外され、結果的に有意な自己溶解ピークを生じる。
好ましい態様においては、プロテアーゼは、デバイス5の1つまたは複数の試料保持流路8の中に含有される。好適なプロテアーゼとしては、例えば、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、およびエンドペプチダーゼ(例えば、トリプシン、キモトリプシン、サーモリシン、エンドプロテイナーゼLysC、エンドプロテイナーゼGluC、エンドプロテイナーゼArgC、エンドプロテイナーゼAspN)のようなペプチダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。アミノペプチダーゼおよびカルボキシペプチダーゼは、翻訳後修飾およびプロセッシング事象の性状分析に有用である。プロテアーゼの組み合わせも使用することができる。システムが複数の試料保持流路を含んでいる場合、少なくとも1つの流路はプロテアーゼなし、および/またはプロテアーゼ消化耐性であり得る(例えば、上述のように1つまたは複数のプロテアーゼ阻害剤を含むことができる)。さらに、異なった流路が異なった種類または量のプロテアーゼまたはその他の酵素または誘導体化化学薬品を含み、実質的に同一の試料(例えば、単一の試料プラグから得られた)の複数の反応を並行して行うことができる。例えば、配列特異的な切断のための作用剤等を提供することができる。
さらに、試料がプロテアーゼに暴露される時間量を正確にコントロールすることにより消化の程度をコントロールして、より大きなペプチドまたは重複する配列を含むペプチドを産生してもよい。さらに、未処理のポリペプチドの分子量を測定するために、ポリペプチド試料の一部をタンパク分解の消化から除外することができる。
一態様においては、1つまたは複数の試料保持流路8内で粒子20のような第1の固相にプロテアーゼを固定化する。本発明で有用な粒子の材料としては、シリカ、ガラス、ポリスチレン、または例えばアガロースもしくはセファロースのようなその他のポリマー組成物が挙げられるが、これらに限定されない。クロマトグラフ用ビーズ(例えば、英国のFlintshire、Phase Separationsから入手可能なSpherisorb ODS1ビーズ)および多孔性C−18ビーズも使用することができる。固定化トリプシンビーズは市販されている。粒子は、デバイスの流路の直径によってサイズを変えることができ、一態様においては、直径1.5〜4.0μmの範囲であり得る。好ましくは、粒子20自体が流路8に実質的に固定化される。
好ましくは、当該技術分野で既知であるように、ビーズ注入技術を用いて粒子20を添加または交換する(例えば、Ruzicka & Scampavia, 1999, Anal. Chem. 71(7):257A-263A;Oleschuk et al., 2000, Anal. Chem. 72(3):585-590参照)。
タンパク分解の消化を行うためのキャピラリーシステム(例えば、Licklinder et al., 1995, Analytical Chemistry 67:4170-4177; Licklinder et al., 1998, Analytical Chemistry 70:1902-1908参照)およびプロテアーゼ消化のための微小流体デバイス(例えば、Tremblay et al., 2001, Proteomics 1(18):975-986; Li et al., 2001, Eur. J. Mass Spectrom. 7(2):143-155; Li et al., 1999, Anal. Chem. 71:3036-3045; Khandurina et al., Anal. Chem. 71:1815-1819参照)が記載されているが、これらの装置は、消化している間に試料を濃縮せず、上流の分離モジュールから試料を選択的に回収する形式では使用されてこなかった。従来技術のシステムとは対照的に、本システムによって消化動態が希釈試料にとってさらに有利になる。
さらなる態様においては、デバイス5の流路8の少なくとも一部は、タンパク質もしくはペプチドに化学的部分を付加することができる、またはタンパク質もしくはペプチドから化学的部分を除去することができる1つまたは複数の酵素を含み、さらに下流の分離または解析を促進する。
吸着法または共有結合法を用いて、プロテアーゼおよび/またはその他の酵素を粒子に固定化する。酵素がより長時間固定化されたままであり、多種多様な条件下でより安定なので、共有結合で固定化された酵素が一般に好ましい。共有結合による固定化の一般例としては、グルタルアルデヒド、イソチオシアネートおよび臭化シアンのようなリガンドによるアルキルアミン活性化粒子へのプロテアーゼの直接的な共有結合が挙げられる。しかしながら、プロテアーゼと特異的に反応する結合相手、または自身がプロテアーゼに(例えば共有結合で)連結される分子に結合もしくは反応する結合相手を用いて、プロテアーゼを固相に固定化することもできる。結合相手は、好ましくは約108より大きい親和定数または約10-8の解離定数を有する。好適なリガンド結合対の代表例としては、サイトスタチン/パパイン、バルホスホネート/カルボキシペプチダーゼA、ビオチン/ストレプトアビジン、リボフラビン/リボフラビン結合タンパク質、および抗原/抗体結合対が挙げられる。
好ましくは、結合対または結合対に結合する分子は、プロテアーゼおよび/またはその他の酵素の触媒部位から離れて位置する。
選択された流路にて電圧を印加し、粒子20を所望の流路に駆動することによって、プロテアーゼおよび/またはその他の酵素を含む粒子20をデバイスの試料保持流路に詰めることができる。好ましくは、粒子20は、荷電した表面分子(例えば、遊離のシロノール基)を含んでこのプロセスを促進する。例えば、流路8の壁により駆動される電気浸透圧の流れおよび粒子20上の遊離のシロノール基を用いて詰め込みを行うことができる。一態様においては、残りの選択されない流路はアースするが、選択された流路8における約5分間の約200〜800Vの電圧は、選択された流路8に粒子20を駆動するのに十分である。米国特許第5,942,093号に記載されているように粒子の詰め込みを電気運動的に行ってもよい。
しかしながら、別の態様においては、粒子は、磁性、常磁性、または超常磁性であり、デバイス5の選択的領域に印加される磁場を用いることによってデバイス5の流路8に添加すること、またはそれから除去することができる。
最初に、(アセトニトリル)ACNのような溶媒中で流路8の中に粒子20を送達することができる。トリプシンはACNに高い許容性を有し、約10%のACNで実際に効率的であり、約40%までのACNでの報告があり(例えば、Figeys et al., 1998, Electrophoresis 19:2338-1347参照)、そして80%で有効に使用された。上で考察されたように、これらの条件も、例えばCEC装置のような上流の分離モジュールで使用される緩衝液と適合しうる。
現在好ましい態様においては、図1Bに示されるように、交差流路25と交差する1つまたは複数の試料保持流路が提供される場合、試料保持流路8の少なくとも一部は、それを介して電流は移動することができるが、ポリペプチドまたはポリペプチドの消化生成物は移動することができない第2の固相(例えば、ゾル−ゲル膜、フィルター、膜、またはフリット)21を含む。ポリペプチドは消化されるにつれて濃縮されるので、より少ない自己溶解生成物で、濃度の低い試料をより迅速に消化することができる。好ましくは、第2の固相は、緩衝液や電流は通過できるが、ペプチドを保持するのに十分小さな孔を含む膜である。例えば、一態様においては、膜は、約2Å〜数ミクロンの範囲にある直径を有する孔を含む。好ましくは、膜は、一価および二価のイオンの排斥は低いが、200〜500の分子量範囲またはそれ以上(すなわち、例えば、ペプチド)での分子量のカットオフにより有機化合物を優先的に排斥するナノろ過膜である。ナノろ過膜は当該技術分野で既知であり、例えば、オスモミニス(Osmonics)(登録商標)から(www.osmonics.comにて)入手可能である。しかしながら、第2の固相の位置は一般に、デバイス5上で変化し得る。例えば、第2の固相は、試料保持流路8と連絡するリザーバ流路8resにおけるような、上重ね基材の開口部の近傍であり得る。電場の存在下では、分子量のカットオフは、流体力学の流れにより駆動される典型的な限外ろ過における分子量のカットオフとは異なる。一実施形態では、微小流体デバイスは固相を含まない。一実施形態では、プロテアーゼは液相に残存する。図1Bでは、変数「P」は、圧力の変化を表し、圧力の変化によって実質的に精製されたポリペプチドを所望の方向に移動させる。
図2Aで示される実質的に平行の流路構成を有するデバイスでは、流路に試料を保持し、そして例えば、以下にさらに記載するように流路におけるpH勾配を生成することによってそれらを集中させることにより濃縮を好ましく達成する。
適切な消化時間(すなわち、約0〜10分、好ましくは約30秒〜約3分)の後、試料保持流路8における流れを反転し、消化されたタンパク質生成物(すなわち、ペプチド)を交差流路25に戻し、そこで、次いで出力流路9を介してそれらを下流の分離モジュール14に送達する。さらに反応溶液、温度を変えることにより、またはデバイスを振動させることにより、消化速度を最適化することができる。
好ましくは、微小流体デバイス5は、微小流体デバイス5における1つまたは複数の流路と連絡する少なくとも1つの電極を含んで、デバイス5の種々の流路を介してポリペプチドの大量輸送を駆動する。好ましい態様においては、電極(単数または複数)を介して電圧をコントロールすることにより、ポリペプチドを含む溶液の流れを電気浸透圧的に且つ電気泳動的にコントロールする。一態様においては、デバイスの表面に酸化ケイ素の層を提供することによって、その上に導電性電極を形成することができる表面が提供される(例えば、化学蒸着、写真平板技術等によって)。酸化の温度および時間を介して層の厚さをコントロールすることができ、所望の程度の電気的隔離を得るように最終的な厚さを選択することができる。好ましい態様においては、上重ね基材から電極(単数または複数)を隔離するのに十分厚い酸化ケイ素の層が提供され、それによって、デバイス5の異なった流路における空間的に離れた位置間で電位差を選択的に適用でき、その結果、異なった流路を介する流体の流れのをコントロールする。上重ね基材がガラスではない態様では、上重ね基材の上で1つまたは複数の電極を形成することもできる。
さらに別の態様においては、図1Bに示されるように、1つまたは複数の電極が、試料保持流路8の終末末端でリザーバウエル11にて提供される緩衝液溶液と電気的に連絡することができる。
しかしながら、さらに別の態様においては、デバイスの1つまたは複数の選択された流路を通る流れは流体力学的であり、当該技術分野で既知であるように、適切な流路の接合部に置かれたバルブが機械的に介在する。例えば、米国特許第6,136,212号、同第6,008,893号およびSmits, Sensors and Actuators A21-A23:203(1990)を参照されたい。試料の取り扱いを改善し、システムの検出限界を最終的に改善するには、流れの正確なコントロールが必要である。したがって、一態様においては、デバイス5の流路8のそれぞれにおける試薬の流れが独立してコントロールされる。好ましくは、輸送は、圧力により駆動されるのではなく、電圧により駆動される。流路8間におけるフィードバックまたはクロストークを防止または低減するには、望ましくない別の経路に沿った電極および緩衝液リザーバを用いて、電流および電気浸透圧の流れのドレーンとして作用することによってフィードバックを阻止することができる。これらの作業を達成することができる電圧コントロールのスキームを図3に示す。
接続された流路を介してフィードバックを防ぐには、電気浸透圧の流れの供給源またはドレーンのいずれかとして作用する、一連の電極を使用することができる。高電流がドレーンを通過すると、緩衝液のジュール加熱または速い消費から問題が生じる。緩衝液の消費は、適切な工学技術(例えば、それを介して緩衝液を添加することができるリザーバ11を提供すること)によって解決することができる技術的問題である。高いレベルのジュール熱発生で起こり得る緩衝液からのガス発生(buffer out-gassing)は、使用前に緩衝液を脱気することによって回避し得る。使用される最大電圧は、システムで使用される緩衝液溶液からのガス発生に大きく支配される。電流は電圧に比例するので、高い電圧では、ジュール加熱はさらに大きくなり、ガス発生が起こる傾向が大きくなる。試料輸送についての電圧コントロールの現在のスキームでは(図3で示されるように)、最大電流が、電位および電気浸透圧の流れのシンク(sink)として作用している電極の間を流れ、そこはガス発生が最も起こりうる領域である。しかしながら、超高速分離が53kV/cmで行われたように(例えば、Figeys et al., 1997, J. Chromatogr. 763:295-306参照)、極めて高い電場強度が、微小デバイスにおいて使用可能であり、本発明は、迅速な試料輸送のために高い電圧の使用を企図するが、電場強度は53kV/cmより低い。
プロセスの各段階の間で各電極(黒点で表される)が維持する電圧を数値(絶対値は重要ではないが、相対値は重要である)によって示す。リザーバ11はデバイス5の上にあり、上重ね基材に小さな穴を開けて流路5とリザーバ11を接続する。隣接する電極の距離は同等であるので、各接合部における電圧を容易に概算することができる。デバイスが被覆されていない融合シリカでできている場合、電気浸透圧の流れの方向は常に高い電圧から低い電圧であり、平行の流路が存在する場合、平行の流路を横切る電圧の低下はない。
図1Aに示されるように、微小流体モジュール4は、実質的に精製されたポリペプチドを含む試料バンドが上流の分離モジュール2から溶出されると、それを回収する。好ましくは、受入流路インターフェース15の近くに位置する光学検出器23が分離された試料バンドを検出する。バンドがこの光学検出器23に到達する速度を用いて、バンドの移動度および試料の流れを方向付けるように電極の電圧を微小流体デバイス上で変調すべき時間を計算する。そのような様式で、検出器23は、微小流体デバイス4における適切な試料保持流路8に試料プラグを方向付けうる。上流の分離モジュール2がCEC装置を含む場合、速度ではなく、上流の分離モジュール2からの電気浸透圧の流れを測定することができる。
流体は、必要に応じてデバイス上の1つまたは複数のリザーバ11に方向付けられるので、ポリペプチドのバンドだけが保持流路8に送られる。好ましくは、試料を含有していない、試料ピーク間の上流の分離モジュール2からの流動用緩衝液は排除されるので、それは微小流体モジュール4内ではいかなる空間も占めない。緩衝液を排除することによって、下流のペプチド解析モジュールがペプチドを含有しない試料を解析するのに費やす時間量が減少し、それによってシステム1の効率が高められる。
アレイにおける適切な電極で電位を変調することにより、適切な流路に試料バンドを方向付ける。タンパク質試料バンドがいったん平行の緩衝液流路の1つに保持されると、流路内で固定化された酵素によって消化され得る。
電極で泡が生じることは問題になり得る。電極がデバイス上の緩衝液リザーバに保持される場合(例えば、図1Bに示されるとおり参照)、およびリザーバ中の溶液が上重ね基材6における穴を介して流路と直接接続されている場合、泡は物理的に流路から分離されるだろう。電極が流路上に直接統合されていれば、以前にエレクトロスプレーMSインターフェースについて報告されたように(例えば、Moini et al., 1999, Analytical Chemistry 71:1658-1661参照)、緩衝液添加剤を使用して泡の形成を抑制することができる。
試料保持流路が図2Aに示されるように実質的に平行の構成である場合、例えば、試料保持流路8において隣接する流路8との交差を介して誘導される電気浸透圧の圧力により、ゆっくりと試料バンドが外に強制的に出され、プロテアーゼ消化プロセスの効率が下がりうる。1つまたは複数の流路8と光学的に連絡するオンデバイスの画像検出器23(以下でさらに考察する)を提供することによって、使用者は、ポリペプチドおよび/またはその消化生成物を含む試料バンドが実際に定常的であるかどうかを決定することができる。それらが定常的でなければ、多数の異なった方法を用いてこの圧力の効果に打ち消すことができる。例えば、Lee et al., 1990, Anal. Chem. 62:1550-1552; Wu et al., 1992, Anal. Chem. 64:886-891; Hayes et al., 1993, Anal. Chem. 65:27-31; Hayes et al., 1993, Anal. Chem. 65:2010-2013; およびHayes et al., 1992, Anal. Chem. 64:512-516に記載されるように、二重層電位をコントロールすることによって電気浸透圧の流れを積極的にコントロールすることができる。そのようなコントロールを有する微細加工された装置の製造がSchasfoort et al., 1999, Science 286:942-945によって最近明らかにされた。
流路における電気的接触を一時的に遮断することによって、実質的に平行の流路構成を有する流路における電気浸透圧の圧力を止めることもできる。ここでは、泡は望ましく、泡を低い圧力によって流路8(単数または複数)に導入して、デバイス5における流れを操作する。試料プラグを物理的に分離することによって、または流路(単数または複数)における導電性を遮断することによって泡を導入することができる。泡には透過性であるが、液体に透過性ではない膜(例えば、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリウレタン、ポリメチルペンテン、ポリテトラフルオロエチレン等からできた疎水性の膜)を戦略的に配置して泡を除去することができる。気体は通すが、溶液は通さないようにすることによって、そのような膜を用いて溶液の流れを方向付けることができる。気体透過性の膜は当該技術分野で既知であり、例えば、米国特許第6,267,926号に記載されている。同様の様式で、流路の交差の後に戦略的に疎水性の被覆を配置することによって、オンデバイスの受動バルブを作ることができる。例えば、McNeely et al., 1999, SPIE: Bellingham 3877:210-220に記載のとおり参照されたい。
微小流体モジュール4を最適化して、例えば、電極の幾つかを一緒に結束することによって、デバイス5当たり最小数の電極コントロールを提供することができる。デバイス5の一部である回路に分圧器を組み込むことを用いて、一対の電極を常に同一の相対電位に保持することができるが、それらの絶対電位は変動する。そのようなスキームによって、高電圧電源の数を減らし、デバイス5に連絡するプロセッサに必要な流路をコントロールする。
図6は、第1の電極91が試料保持流路8の第1の末端と結合し、第2の電極92が試料保持流路8の第2の末端と統合する本発明の実施形態を示す。本発明の実施形態は、複数のビーズ93上に固定化された酵素を含む。本発明の実施形態は、第1の電極91および第2の電極92に隣接する被覆95層を提供する。図6に示される本発明の実施形態では、少なくとも1つの固相(上述したような)の必要性が除かれる。図6において、変数「P」は圧力の変化を表し、圧力の変化は、実質的に精製されたポリペプチドを所望の方向に移動させる。
下流の分離デバイス
現在好ましい態様においては、微小流体モジュール4は、試料保持流路8を介して移動するタンパク質のタンパク分解消化の生成物であるペプチドを、タンパク質解析に先立って、下流の分離モジュール14に送達する。下流の分離モジュール14は、上流の分離デバイス2について記載された分離カラムを1つまたは複数含むことができる;しかしながら、好ましくは、下流の分離モジュール14は、実質的に分離された消化生成物の供給源を提供するために、微小流体モジュール4と連絡した少なくとも1つの分離経路を含むキャピラリー電気泳動装置を含む。
現在好ましい態様においては、微小流体モジュール4は、試料保持流路8を介して移動するタンパク質のタンパク分解消化の生成物であるペプチドを、タンパク質解析に先立って、下流の分離モジュール14に送達する。下流の分離モジュール14は、上流の分離デバイス2について記載された分離カラムを1つまたは複数含むことができる;しかしながら、好ましくは、下流の分離モジュール14は、実質的に分離された消化生成物の供給源を提供するために、微小流体モジュール4と連絡した少なくとも1つの分離経路を含むキャピラリー電気泳動装置を含む。
キャピラリー電気泳動は、小さなキャピラリーチューブ内で、分子の電気泳動的性質および/または試料の電気浸透圧の流れを利用して試料の構成成分を分離する技術である。通常、内径100μm以下の石英ガラスのキャピラリーに電解質を含有する緩衝液溶液を充填する。キャピラリーの各末端を緩衝液電解質を含有する別個の流体リザーバに入れる。電位電圧を一方の緩衝液リザーバに設置し、第2の電位電圧を他方の緩衝液リザーバに設置する。緩衝液リザーバに適用された2つの電位電圧により確立された電場の影響下、正および負に荷電した種がキャピラリー中を反対方向に移動する。流体中の各構成成分の電気浸透圧の流れおよび電気泳動の移動度が各流体の構成成分についての全体的な移動を決定する。電気浸透圧の流れから生じる流体の流れは、分離流路の壁に沿った摩擦抵抗が低下するので均一である。観察される移動度は、電気浸透圧的移動度と電気泳動的移動度の合計であり、観察される速度は、電気浸透圧的速度と電気泳動的速度の合計である。
一態様においては、以下でさらに記載されるプロテアーゼ消化デバイス5または接続デバイス5iの一部である、またはそれから離れたデバイス上に、キャピラリー電気泳動システムが微細加工される。デバイス上にキャピラリー電気泳動システムを微細加工する方法は当該技術分野で既知であり、米国特許第6,274,089号;同第6,271,021号;Effenhauser et al., 1993, Anal. Chem. 65:2637-2642; Harrison et al., 1993, Science 261:895-897; Jacobson et al., 1994, Anal. Chem. 66:1107-1113;およびJacobson et al., 1994, Anal. Chem. 66:1114-1118に記載されている。
試料の喪失を最小化するために、試料の抽出が可能であるCE分離を使用することができる。1秒未満の迅速CE分離が達成されているが、それらには、極めて小さな注入容積と短いカラムが必要である。CE分離のピーク容量および速度を最適化するには、所定の注入プラグの長さ(例えば、試料プラグ)に対する最小限のカラムの長さを決定することが必要である。しかしながら、全体の試料の分離のピーク容量を最大化するには、1つのピークを含む注入プラグを、それより前の分離のピーク(単数または複数)と混合すべきではない。最適化されたCEがあまりに長すぎるカラムを必要とし、あまりに遅すぎるためにピークの再結合を回避できなければ、そのときは、複数のCE分離を並行して行うことができる。
CEキャピラリーの寸法は、サイズにおいて微小流体デバイスの流路と良好に一致する。CE分離は、MALDI−MSおよびESI−MS/MSに基づいたタンパク質解析の双方にとって十分以上の試料量を提供する(例えば、Feng et al., 2000, Journal of the American Society For Mass Spectrometry 11:94-99; Koziel, New Orleans, LA 2000; Khandurina et al., 1999, Analytical Chemistry 71:1815-1819参照)。したがって、一態様においては、下流の微小流体デバイス5iにおける複数の受入流路に接続する複数の平行の分離経路が提供される。
好ましくは、電気泳動的濃縮を用いて、ポリペプチド消化後のバンドの広がりおよび拡散の影響に対抗する。
その他の下流の分離装置としては、微小高速液体クロマトグラフィカラム、例えば、逆相、イオン交換およびアフィニティカラムが挙げられるが、これらに限定されない;しかしながら、これらはそれほど好ましくない。
下流の分離モジュール14の正確な構成は変化し得ることは、当業者には明白であるはずである。一態様においては、下流の分離モジュールは、電場が印加される末端の間で分離媒体およびキャピラリーを含む。キャピラリーシステムにおける分離媒体の輸送および調べるべき試料(例えば、ペプチドおよび/または部分的に消化されたポリペプチドを含む試料バンド)の分離媒体への注入は、ポンプおよびバルブの助けを借りて行うことができるが、好ましくは、キャピラリーの種々の点に好適に印加される電場を用いることによる。電圧を最適化することによって解析時間を最適化することができ、一般に分離経路の末端間における高電圧により速度が上昇する。好ましい態様においては、約10〜1000kV/cmの電圧を通常用いて、これにより約数分未満の分離時間となる。
好ましくは、以下でさらに記載される接続微小流体モジュール4iおよびペプチド解析モジュール17などに接続する下流のシステムに適合するように、下流の分離モジュール14における緩衝液および試薬の選択を最適化する。例えば、上流の分離モジュールの場合と同様に、ACN、ならびに例えば、尿素およびグアニジンのような溶解剤は、MSのようなタンパク質解析に影響を与えないので、緩衝液システムとして使用することができる。同様に、上流の分離モジュールの場合と同様に、CEを固相抽出(SPE)CEシステムと組み合わせることができる。
接続微小流体モジュール
一態様においては、接続微小流体モジュール4iを用いて2つのデバイスを連結することにより下流の分離モジュール14をペプチド解析モジュール17に連絡する。これは、下流の分離モジュール14が上述したようなキャピラリー電気泳動(CE)のような迅速な分離を採用する場合、特に好ましい。その高い分離効率のために、CEはタンパク質消化の解析に良好に適しているが、分離されたペプチドまたは部分的に消化されたポリペプチドを表す狭いピーク幅のために、高品質のMS/MSスペクトルを達成するのに必要な、続いてのタンデムMS実験の実行が困難になる。
一態様においては、接続微小流体モジュール4iを用いて2つのデバイスを連結することにより下流の分離モジュール14をペプチド解析モジュール17に連絡する。これは、下流の分離モジュール14が上述したようなキャピラリー電気泳動(CE)のような迅速な分離を採用する場合、特に好ましい。その高い分離効率のために、CEはタンパク質消化の解析に良好に適しているが、分離されたペプチドまたは部分的に消化されたポリペプチドを表す狭いピーク幅のために、高品質のMS/MSスペクトルを達成するのに必要な、続いてのタンデムMS実験の実行が困難になる。
さらに、CEのような迅速な分離では、ペプチド解析モジュール17への注入の流速は分離の流速によって決定されるので、カラムから溶出するイオン全てに関する衝突誘発性の解離(collision-induced dissociation)(CID)を得るのに十分な時間が通常ない。例えば、現在、標準的なキャピラリーLC−MSでは、活性なペプチドを溶出している間、全体のLC−MS操作時間の約10%のみがMSによるペプチドの検出および捕捉に費やされる一方で、ほとんどの時間は、LCカラムに装填し、それを再平衡化するのに費やされる。ペプチドのCE分離については、試料の装填およびカラムのすすぎに費やされる時間量は激減しているが、それでも相当なものである。
流れを変調する技術は、CE(例えば、Figeys et al., 1999, Anal. Chem. 71:2279-228参照)およびLC(例えば、Davis et al., 1995, Anal. Chem. 67:4549-4556; Davis et al., 1997, J. American Society for Mass Spectrometry 8:1059-1069参照)のために開発されたが、分離の質を悪化させ、小さな範囲にわたってしか流れを変調することはできない。流れを変調できる範囲の小ささは、i)進行中の分離の悪化、およびii)通常の流速および低下した流速の双方を収容するのに十分大きい内径を有するMS装置に送達するためにエレクトロスプレーキャピラリーおよびチップを使用する必要性のためである。
これらの困難さを回避するために、好ましい態様においては、接続微小流体モジュール4i(図1Aに示される)を用いて、MS/MS装置のようなペプチド解析モジュール17に試料バンドを注入する。試料バンドは、微小流体モジュール4におけるタンパク質の消化、および下流の分離モジュール14によるこれらの生成物の確実な分離の後に得られた実質的に精製されたペプチドおよび/または部分消化されたポリペプチドを含む分画を表す。接続微小流体モジュール4iは、第1の固相を有さないオンデバイス消化モジュール4に類似の構造を有することができる。
本発明に係る接続微小流体モジュール4iは、以下の機能:(1)解析まで試料保持流路8に実質的に精製されたペプチドまたは部分消化されたポリペプチドを保存すること;(2)解析に先立って、ペプチド/部分消化されたポリペプチドを電気泳動的に濃縮すること;および(3)エレクトロスプレー供給源のような送達要素22によってペプチド解析モジュール17(例えば、MSシステム)にペプチド/部分消化されたポリペプチドを注入する一方で、ペプチド/部分消化されたポリペプチドを含有しない溶出液を保持または排除すること、のうち1つまたは複数を行うことによって、検出の下限を達成するために、適時のタンパク質解析プロセスから、下流の分離モジュール17における分離プロセスを切り離す。検出および解析から分離を切り離すことによって、全体の解析時間を増やすことなく、下流の分離モジュール17から溶出されるイオン全てのCIDスペクトルを得るためのさらなる時間が提供される。
オンデバイス消化微小流体モジュール4を生成するのに使用したものと類似の方法を用いて接続微小流体モジュール4iを製造することができる。好ましくは、1つまたは複数の電極を上重ね基材から遮断して、デバイス内で流体の流れを電気的に隔離する。しかしながら、上重ね基材6iがガラスではない態様においては、デバイス5iの近傍の上重ね基材の表面上に、任意の電極または全ての電極が代替的にまたは追加的に形成される。
接続微小流体デバイス5iは、複数の流路8iを含むことができ、一態様においては、プロテアーゼ消化デバイス5に関して図1Aで示されるものに類似した流路の幾何配置が採用される。流路の幾何配置における制約は、プロテアーゼ消化デバイス5について上述したものに類似する。しかしながら、接続デバイス5iの流路の数および幾何配置は、それが連結される下流のペプチド解析モジュール17の操作パラメータによっても影響を受ける。例えば、複数の流路8iはペプチド解析モジュール17による並行解析を促進するので、非修飾ペプチドが高濃度であり、修飾ペプチド(単数または複数)が低濃度で存在する試料では、低い化学量論比で存在する翻訳後修飾を評価するのに多数の流路8i(例えば、約32〜64)が有用である。
次に続く分離(すなわち、デバイス5iの流路(単数または複数)への次の試料バンドの溶出)の終了まで処理のために下流の分離モジュール14からの試料バンドを保持することができれば、下流の分離モジュール14からの試料バンドをデバイス5iの異なった流路8iに方向づけることは単純な作業である。しかしながら、次に続く分離が終了する前に試料の解析を開始しなければならない場合、そのときは作業はさらに複雑になる。ここで提案される方法は、下流の分離モジュール14によって分離された消化され、精製されたペプチドを表す試料バンドまたはピークのいくつかの間の物理的分離によるものである。デバイス5iの異なった流路の中に、回収されたバンドを移動させ始めるために、バンドまたはピークの間に幾つかのギャップが存在しなければならない。一態様においては、バンド/ピークを隔離することができる電極を通過してバンド/ピークを移動させることによって、バンドまたはピークの間の空間的分離が達成される。この点で、バンド/ピークは、下流の分離モジュールからの溶出液から独立して操作され得る(例えば、ペプチドまたは部分消化されたポリペプチドを含有していない溶出液をデバイス内のリザーバに方向付けることによる)。しかしながら、分離でピークが多すぎてギャップがなければ、そのときは、十分な試料があるのでピークの全てを解析する必要はない。
下流の分離モジュール14からの試料の溶出速度を計算し、それを用いて接続デバイス5iの流路8i(単数または複数)を介する流体の流れの速度を予測することができる。デバイス5iを介する試料の流れをコントロールするために、デバイス5iと連絡する電極を介する電流を適宜タイミングよくコントロールするには、速度の正確な評価が必要とされる。図4に示されるように、アークランプ96およびCCDカメラ97を用いて、デバイスの種々の流路への試料バンドの輸送の精度および再現性を監視する。幅広い流路で分離を画像化するために類似の蛍光検出器が設計されている(Liu et al., 1996, Anal. Chem. 68:3928-3933; Hietpas et al., 1981, Anal. Chem. 69:2292-2298)。最適な試料の流れが決定された後、CCDカメラを用いずに、例えば、システム1のプロセッサ18に入れた事前にプログラムした適切な電流/電圧のパラメータおよび一時的な順序によって、デバイスの種々の電極を通る電流のコントロールを実施してもよい。類似の配置を用いて、プロテアーゼ消化デバイス5における流れを監視し、最適化することができる。
別の態様においては、デバイスへの検出器23の光学的連結を用いて、いつ試料が流路に到達するのかを決定する。一態様においては、接続微小デバイス5iの電極と電気的に連絡する電圧コントロールシステムが、デバイス5iの入口での光学検出器23からの入力を用いて、試料のピークがどこにあるかを決定し、そしてこのデータを、流れのコントロールのために基準として使用する。例えば、一態様においては、電圧コントロールシステムと連絡するシステムプロセッサ18が電圧コントロールプログラムを実施し、リアルタイムのピーク認識を行い、デバイス5iにおける各試料バンドの最初と最後および試料バンドの位置を決定する。
試料バンドを輸送することに加えて、ペプチド解析モジュール17に注入する前に、接続デバイス5iを用いて、ペプチドおよび/または部分消化されたポリペプチドを保持するおよび/または濃縮するおよび/または集中させることができる。第2の固相は、一般にこの実施形態では試料を濃縮するのに使用することができないので、これは、プロテアーゼ消化デバイス5における試料流路8が実質的に平行の構成(例えば、図2Aにおけるような構成)である場合、特に望ましい。
一態様においては、デバイス5iの1つまたは複数の流路8i内で2つの異なった導電性緩衝液の間のインターフェースにて試料の濃縮を行い、約10倍以上の濃縮を達成する。好ましくは、バックグランドを高め、検出限界を高める(すなわち、低い検出感度)傾向があるキャリア両性電解質を用いないで、一時的な等電点電気泳動(IEF)のようなその他の方法を使用することができる(例えば、Koziel et al., New Orleans, LA 2000参照)。例えば、横断面領域に温度勾配を有する流路8iにおける溶液に電流を通すことによって温度勾配を形成することができる。温度勾配は、効率的な等電点電気泳動を可能にするpH勾配を形成する。緩衝液の交換をデバイス上で行うことができるので、微小流体システムは、そのような電気泳動的濃縮方法に極めて良く適している。
下流の分離モジュール14でIEFが使用された場合、試料の過剰装填がpH勾配を乱し得るが、接続デバイス5i内にたった1本のバンドが集中させられるので、このことは接続モジュール4iでは大きな懸念ではない。接続モジュール4iに集中させることによって、下流の分離モジュール14における一次元目によって分離されなかった試料バンドをさらに分解するために二次元目の分離を提供することができる。一次元目からのバンドは接続モジュール4iで再結合されないので、これは真の二次元目の分離を提供し、下流の分離モジュール14から共溶出するピークを分解することができる。
微小透析膜(Liu et al., 1998, Analytical Chemistry 70:1797-1801; Xiang et al., 1999, Analytical Chemistry 71:1485-1490; Xu et al., 1998, Analytical Chemistry 70:3553-3556)およびふるいフリッツ(sieving fits)(Khandurina et al., 1999, Analytical Chemistry 71:1815-1819)をデバイス5i上に組み込むこともでき、それにより試料を希釈しないで緩衝液の交換を行うことが可能になる。シグナル対ノイズの比が試料の濃度に直接比例するので、有効なオンデバイス濃縮は、検出限界を改善するのに極めて有益であり得る。オンデバイス濃縮は、集合平均のような機械的操作よりもシグナル対ノイズ比をより増加させるだけでなく、試料バンドの長さを圧縮することによって解析に必要な時間も短縮する。上で考察されたように、接続微小流体モジュール4iは、試みた全ての濃縮の効果を打ち消すであろうデッドボリュームまたは溶出液からの試料の希釈を導入することがない。
一態様においては、拡散の影響を最小化するためにタンパク質解析直前のオンデバイス濃縮を使用し、デバイス5iの1つまたは複数の流路8iにおけるpHを変えることによってそれを達成する。例えば、20分間流路8iにて試料を保持することによって試料プラグはちょうど1mm広がる(拡散係数を1×10-6cm2/sと仮定する)。デバイス5iとその上重ね基材6iとの間に挟まれた透析膜またはフリットを介したイオンの輸送によって静止した不連続な緩衝液の先端が形成される。流路におけるpHの低下と共に、流路8iにおけるペプチド分析物の電気泳動速度が低下し、濃縮効果または堆積効果を生じる。1つまたは複数の流路8iを介して低いpHで緩衝液を流すことによって、ペプチド解析モジュール17に送達される(例えば、MS装置内にスプレーされる)前に試料蒸気のpHを直接低下させ得る(例えば、Liu et al., 1998 Analytical Chemistry 70:1797-1801; Xiang et al., 1999, Analytical Chemistry 71:1485-1490; Xu et al., 1998, Analytical Chemistry 70:3553-3556; Yang etal., 1998, Analytical Chemistry 70:4945-4950; およびJacobson et al., Anal. Chem. 66:1107-1113; Timperman et al., 1995, Anal. Chem. 67:139-44の記載どおり参照)。
試料の電気泳動的濃縮によってペプチド解析モジュール17の検出限界を改善することに加えて、緩衝液の交換を用いて、接続モジュール4iからペプチド解析モジュール17への試料の送達に最適のpHを提供することができる。
好ましくは、接続モジュール4iは、下流の分離モジュール14のようなシステム1の上流の構成成分に最適であるpHから、使用される特定のペプチド解析モジュール17に最適であるpHに切り替えるメカニズムを提供する。例えば、CEでは分離に最適のpHは中性のpHの近くであり(Nice, 1996, Biopolymers (Peptide Science) 40:319-341)、ESI−MSで最良の感度はpH2と3の間で得られる。したがって、一態様においては、図6に示されるように、適切な高いpH条件および低いpH条件をオンおよびオフで切り替えて、接続モジュール4iを負荷モードから保持および集中モードに、ならびに保持および集中モードから、試料をペプチド解析モジュール17に方向付けする輸送モードに変える。
好ましくは、接続モジュール4iは、下流の分離モジュール14のようなシステム1の上流の構成成分に最適であるpHから、使用される特定のペプチド解析モジュール17に最適であるpHに切り替えるメカニズムを提供する。例えば、CEでは分離に最適のpHは中性のpHの近くであり(Nice, 1996, Biopolymers (Peptide Science) 40:319-341)、ESI−MSで最良の感度はpH2と3の間で得られる。したがって、一態様においては、図6に示されるように、適切な高いpH条件および低いpH条件をオンおよびオフで切り替えて、接続モジュール4iを負荷モードから保持および集中モードに、ならびに保持および集中モードから、試料をペプチド解析モジュール17に方向付けする輸送モードに変える。
一態様においては、pHを調節するためのイオンを含むpH変更溶液を提供する側面流路を提供することができる(示さず)。好ましくは、側面流路は、デバイスのその他の流路8から電気的に隔離され、pH変更溶液は、側面流路で電圧を選択的に印加することによりデバイスの1つまたは複数のその他の流路に、および所望の時間にて1つまたは複数のその他の流路に、選択的に導入される。
一態様においては、接続微小流体デバイス5は、ペプチド解析モジュール17に連結される。最も好ましいバージョンにおいては、キャピラリーで形成されるエレクトロスプレーシステムは、ペプチド解析モジュール17の試料採取口の近傍にある微小デバイス5i(示さず)における出口流路に連結される。キャピラリーの先端または末端から発する、電界の向きの線(electric field lines)の濃縮をもたらすように、キャピラリー口および電極から出て行く導電性または部分的に導電性の流体(例えば、下流の分離モジュール14から受け取った実質的に精製されたペプチドを含有する流体)の間に十分な電位差を印加した場合、エレクトロスプレーが生じる。ペプチド解析モジュール17の試料採取口(例えば、質量分析計のイオン試料採取口)で正の電圧を印加した場合、その電場は、流体中で正に荷電したイオンをキャピラリーの先端で流体の表面に移動させる。同様に、負の電圧を印加した場合、電場は流体中で負に荷電したイオンをキャピラリーの先端で流体の表面に移動させる。
溶媒和イオンの斥力がエレクトロスプレーされた流体試料の表面張力を超えた場合、一定量の流体試料は、キャピラリーの先端から延びるテイラーコーンとして知られる円錐形状に引っ張られる(例えば、Dole et al., 1968, Chem. Phys. 49:2240およびYamashita & Fenn, 1984, J. Phys. Chem. 88:4451参照)。エレクトロスプレーを開始するのに必要な電位電圧は、溶液の表面張力に依存する(例えば、Smith, 1986, IEEE, Trans. Ind Appl. IA-22:527-535参照)。キャピラリーの物理的サイズが、エレクトロスプレーを誘導するのに必要な電界の向きの線の密度を決定する。1分間当たりナノリットルの桁における流速でのエレクトロスプレーのイオン化のプロセスを、「ナノエレクトロスプレー」と言う。しかしながら、「エレクトロスプレー」という用語は、本明細書ではナノスプレーを包含して用いられる。
ペプチド解析モジュールのイオン−試料採取口へのエレクトロスプレーは、キャピラリーから流れる液体中に存在する分析物分子(例えば、実質的に精製されたペプチド)の存在のために、ペプチド解析モジュールの検出器の構成成分において定量可能な反応をもたらすことができる。エレクトロスプレー装置は既知であり、当該技術分野で説明されている(例えば、Wilm & Mann, 1996, Anal. Chem. 68:1-8; Ramsey et al., 1997, Anal. Chem. 69:1174-1178; Xue et al., 1997, Anal. Chem. 69:426-430参照)。
エレクトロスプレーシステムを形成するのにノズルを使用することもできる。例えば、Desai et al., Jun. 16-19, 1997, International Conference on Solid-State Sensors and Actuators, Chicago, 927-930には、シリコンのマイクロデバイスの端でのノズルの作成およびマイクロデバイス全体への電圧の印加が記載されている。一態様においては、内径と外径を有し、突出表面からくぼんだ環状部分により定義されるノズルを使用する。環状のくぼみは外径から放射状に延びる。ノズルの先端は、突出表面と同一平面または水平であり、それを越えて延びないので、ノズルは偶発的な破損から保護されている。反応性イオンエッチングおよびその他の半導体加工技術によってノズルにエッチングを施すことができる(例えば、米国特許第6,245,227号の記載どおり参照)。
しかしながら、好ましくはエレクトロスプレーシステムはキャピラリーを含む。一態様においては、キャピラリーは、接続デバイス5iにおける出口流路に接続する上重ね基材6iの開口部を介して接続微小流体モジュール4iの上重ね基材6iに連結される。好ましくは、キャピラリーは、接続微小流体デバイス5iの表面に対して一定の角度である(例えば、45℃〜90℃の角度)。エレクトロスプレーシステムは、ペプチド解析モジュール17の試料採取口から約0〜10mm、好ましくは約0〜2mmに設置される。
図5は、接続微小流体デバイス5i(大きなID)上の輸送流路とエレクトロスプレーのキャピラリー(小さなID)である送達要素22との間の接続を示す概略図である。黒い形状は、キャピラリーに移動しているときの試料バンドを表す。デバイス5iと連絡する2つの電極間の電圧は、試料溶液をナノスプレーキャピラリー22に通過させる電気浸透圧の流れを生成する。キャピラリー22を横切る電圧の低下は無視できるので、この領域には電気泳動の流れはない。流れを遅らせる物質または流路の構成を制約するまたはバランスさせるフリット(frit)または流れ(斜線の箱)は、8resへの溶液の流れを遅らせ、溶液をエレクトロスプレーキャピラリー22を通過させるのを助ける。詳細な挿入図によって、エレクトロスプレーキャピラリー22の内径(ID)「C」とエレクトロスプレーの先端(ID)「T」との間の差異が明らかにされる。現在好ましい態様においては、エレクトロスプレーキャピラリーのIDは約10μmである。
しかしながら、現在好ましい実施形態においては、逆集中または希釈効果を回避するために、電気浸透圧ポンプ作用(pumping)により試料バンドをスプレーキャピラリー22上に押し進める。電気浸透圧流ポンプ(EOFポンプ)は、1つの流路または領域における流体の電気浸透圧ポンプ作用を利用して、接続された流路で圧力ベースの物質の流れを生じる(例えば、米国特許第6,171,067号参照)。電気浸透圧ポンプ作用について、スプレーキャピラリー22を横切る電圧低下はなく、キャピラリー22の直前の流路8iにおいて溶液をスプレーキャピラリーに強制するようにEOFを生じることができる。EOFポンプ領域およびデバイス5iでの電場のない領域において試料の長さおよび容積を調整することによって、ナノスプレーインターフェース(例えば、図5に示されるような)の設計を最適化することができる。EOFポンプを用いて低い流速を得ることができ、デバイス5iの異なった領域/流路8iで印加された電圧をコントロールすることにより、流速をコントロールすることができる。さらなる非EOFポンプシステムが、Feng et al., 2000, Journal of the American Society For Mass Spectrometry 11:94-99に記載されている。例えば、上で考察されたように、流体力学的な流れのシステムを使用することができる。
過度のバンドの広がり量を提供することなく試料をエレクトロスプレーの先端に移動させることが重要である。しかしながら、スプレーキャピラリー22の内径に対して試料プラグの長さが非常に長いので、本発明に係るシステム1では解析用分離よりも大量のバンドの広がりを容認することができる。例えば、スプレー電圧をキャピラリー22の先端に直接印加して流路8iとキャピラリー22の双方を横切る電位の低下を生成することによって、デバイス5iの流路8iからキャピラリー22に試料バンドを電気泳動的に移すことができる。
特に、ペプチド解析モジュールがデータを迅速に得て、解析する場合、接続デバイス5からペプチド解析モジュール17へ直接にペプチド混合物を迅速に送達するには、電気浸透圧ポンプが好ましい。例えば、迅速ESI−TOFマシーンは、4Hzの速度でスペクトルを収集することができる(Liu et al., 1998, 上記)。ペプチド質量フィンガープリンティングは、ESI機器を伴ってさらに複雑化されているが、正常に機能することが実証されている(例えば、Xiang et al., 1999, Analytical Chemistry 71:1485-1490; Xu et al., 1998, Analytical Chemistry 70:3553-3556参照)。この途切れのないアプローチにより、MALDIのようなペプチド解析に必要なスポッティング(spotting)および風感(dry-down)が除外され、観察可能なペプチドの数を制約する、MALDIで遭遇する競合イオン化の問題が回避される。
MALDI装置との接続は、キャピラリーとMALDI標的とを接続する自動スポッタ(spotter)が開発されているので(例えば、Figeys et al., 1998, Electrophoresis 19:2338-2347参照)やはり簡単である。特に好ましい態様においては、例えば、翻訳後修飾を評価する場合、タンパク質が消化されずにプロテアーゼ消化モジュール4を通過し、そしてペプチド試料が続いてペプチド解析モジュール17に送達されると、正確なペプチド質量地図と共に正確なタンパク質の分子量を記録することができるように、少量のタンパク質溶液を迅速にシステム1の種々のモジュールに通過させる。
幾つかの例では、MS装置のようなペプチド解析モジュール17への流速を下げることによってタンパク質の解析時間を延長し、検出限界を改善することができる。上で考察されたように、エレクトロスプレーは濃度感受性であり(Kebarle et al., 1997, 上記)、普通、MSへの流速は、上流の分離システムによって決定され、したがって、MSの検出に関して最適化されない。例えば、通常、キャピラリーHPLC−MSは、約200nL/分の流速にて操作され(例えば、Gatlin et al., 1998, Analytical Chemistry 263:93-101参照)、CE−MSは、約25nL/分の流速にて操作される。流速で20倍の低下を得るには、キャピラリーHPLC−MSの場合10nL/分で、CE−MSの場合約1nL/分の流速で、エレクトロスプレーが作動することができなければならない。そのような流速は低いが、安定したエレクトロスプレーは0.5nL/分までの低い流速で得られている(例えば、Valaskovic et al., Analytical Chemistry 67:3802-3805参照)。接続モジュール4iは、ペプチド解析モジュール17の解析時間を1つの分離終了と次の分離開始との間の「待ち時間(dead-time)」(例えば、下流の分離モジュール14の再平衡化と試料注入との間の時間の間)に延長するので、低容積の流れと共にエレクトロスプレー供給源を使用することができる。エレクトロスプレーは濃度依存性(例えば、Banks et al., 1996, 上記、Karger, 1996, 上記、Kebarle, 1997, 上記参照)なので、シグナルでの喪失は観察されない。
ナノスプレー供給源で極めて低い流速(約0.5nL/分)を得ることは、スプレー先端の内径よりもキャピラリー22の内径に大きく依存する(Valaskovic, 1995, 上記)。したがって、好ましい態様においては、小さな内径(5〜10μm)のキャピラリー22を用いて、接続マイクロデバイス5iをMSシステムと接続する(図6を参照)。好ましくは、キャピラリー22の直径は、試料をキャピラリー22に送達する接続デバイス5iの流路8iの直径よりも少なくとも小さい。一態様においては、キャピラリー22は、デバイス5iの約50μmの流路8iに直接接続される。
さらなる態様においては、微細加工されたキャピラリーアレイを装填するために開発されたもの(例えば、Scherer et al., 1999, Electrophoresis 20:1508-1517参照)と類似の回転システムを用いて、操作者のコントロール(直接またはプロセッサを介して)下に溶液を移動するために配列させることができる複数のナノスプレーの針から、接続微小流体モジュールを物理的に分離する。最近、シリコンのデバイス上にエレクトロスプレー針のアレイが組み立てられた(例えば、Zubritsky et al., 2000, Anal. Chem. 72:22A;Licklinder et al., Anal. Chem. 72:367-375参照)。
流路に保存され、ペプチド解析モジュール17に送達される各試料バンドは、必ずしも純粋であるとは限らない。しかしながら、キャピラリーLC−MS/MSのようなシステムでは、成分に分解されないピークは一般的であり、全て短時間で解析されなければならない。本発明に係るシステム1の大きな利点の1つは、ナノスプレーインターフェースによって、分解されないペプチドを解析する適切な時間があるということである。試料の抽出および濃縮を介して桁違いに試料濃度が高まり得るので、下流の分離モジュール14および/または接続モジュール4iによる分離および/または集中は、重要な工程である。システム1の抽出および濃縮の能力によって、MS装置のようなペプチド解析モジュール17がはるかに高い濃度のペプチド溶液を解析することができるようになる。
ペプチド解析モジュール
ペプチド解析モジュールとは、試料の化学的または物理的な解析を提供する装置を言い、さらに一般的には、構造解析モジュールと呼ばれ得る。具体的には、ペプチドは最も好ましい分析物なので、ペプチド分解モジュールは最も好ましい構造解析モジュールであった。しかしながら、微小流体システムはポリペプチド以外の分析物に適用され得るので、より一般的には、ペプチド解析モジュールは構造解析モジュールである。ペプチド解析モジュール17は、好ましくは、イオナイザ、イオンアナライザおよび検出器を含む質量分析計(MS)装置のいくつかの形態である。例えば、アニオンスプレー質量分析計(Bruins et al., 1987, Anal. Chem. 59:2642-2647)、エレクトロスプレー質量分析計(Fenn et al., Science 246:64-71)、およびレーザ脱離装置(マトリクス支援脱離イオン化装置および表面(surfaced)増強脱離イオン化装置を含む)のような、気相でイオン化したペプチドを生じることが可能であるいかなるイオナイザを使用することもできる。4重極型質量フィルター、イオントラップ型、磁場型、飛行時間型、およびフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴(FTICR)型を含むが、これらに限定されないいかなる適切なイオンアナライザも同様に使用することができる。好ましい態様においては、例えば、3連4重極型、イオントラップ型、4重極飛行時間型、イオントラップ飛行時間型、またはFTICR型のようなタンデムMS機器を用いて、イオンスペクトルを提供する。
ペプチド解析モジュールとは、試料の化学的または物理的な解析を提供する装置を言い、さらに一般的には、構造解析モジュールと呼ばれ得る。具体的には、ペプチドは最も好ましい分析物なので、ペプチド分解モジュールは最も好ましい構造解析モジュールであった。しかしながら、微小流体システムはポリペプチド以外の分析物に適用され得るので、より一般的には、ペプチド解析モジュールは構造解析モジュールである。ペプチド解析モジュール17は、好ましくは、イオナイザ、イオンアナライザおよび検出器を含む質量分析計(MS)装置のいくつかの形態である。例えば、アニオンスプレー質量分析計(Bruins et al., 1987, Anal. Chem. 59:2642-2647)、エレクトロスプレー質量分析計(Fenn et al., Science 246:64-71)、およびレーザ脱離装置(マトリクス支援脱離イオン化装置および表面(surfaced)増強脱離イオン化装置を含む)のような、気相でイオン化したペプチドを生じることが可能であるいかなるイオナイザを使用することもできる。4重極型質量フィルター、イオントラップ型、磁場型、飛行時間型、およびフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴(FTICR)型を含むが、これらに限定されないいかなる適切なイオンアナライザも同様に使用することができる。好ましい態様においては、例えば、3連4重極型、イオントラップ型、4重極飛行時間型、イオントラップ飛行時間型、またはFTICR型のようなタンデムMS機器を用いて、イオンスペクトルを提供する。
一態様においては、接続モジュール22(例えば、エレクトロスプレー)の送達要素からペプチドのイオン化によって生じる分子イオン(例えば、娘イオン)を、荷電していない分子および断片を除去しながら、ペプチド解析モジュール17のイオンアナライザを介して加速する。好ましくは、イオンアナライザは、ペプチド解析モジュールの検出器構成成分へのイオンの移動を変調するための1つまたは複数の電圧源(例えば、電極または電極格子)を含む。娘イオンは、その質量対荷電比(m/z)に基づいて検出器に移動する(一般にイオンの荷電は同一であるが)。好ましい態様においては、検出器は、イオンによって打撃されると電気信号を生じる。
イオンアナライザの走査電圧における当該信号を統合するタイミング機構によって、イオンが検出器を打撃すると、ペプチド解析モジュール17がプロセッサ18に報告することができる。プロセッサは、そのm/zに従ってイオンを分類し、検出器は特定のm/zを有する各事象の頻度を記録する。標準物質をモジュールに導入し、標準分子イオンと断片イオンが正確に報告されるまで、システム構成成分を調整することにより、ペプチド解析モジュール17の較正を行うことができる。好ましくは、プロセッサ18と併せたペプチド解析モジュール17は、生じたイオンの相対量と質量対荷電比とのプロットに相当する生成物イオンのスペクトルをプロットする。ペプチド解析モジュール(例えば、質量分析計)において親イオン(通常、ペプチド分子の分子量)を単離し、そして断片化することによって、検出される生成物イオンが形成される。
一般に、ペプチドは、アミノ酸残基間のアミド結合のところで断片化し、ピークは特定のアミノ酸またはアミノ酸の組み合わせに相当する。生成物イオンのスペクトルに追加のピーク(イオン)が存在してもよいが、これらその他のピークの多数は予測することができ、それらの存在は、既知の化合物(例えば、標準物質)のスペクトルデータと比較することにより説明することができる。親イオンを断片化して生成物イオンを形成するには多数の異なったプロセスを使用することができ、それには、衝突誘起解離(CID)、電子捕捉解離、およびポストソース分解が挙げられるが、これらに限定されない。
生成物イオンのスペクトルの解析は、使用されるペプチド解析モジュール17の特定の種類によって異なる。
ポリペプチドの高速大量同定のために、マトリクス支援レーザ脱離イオン化質量分析(MS)ペプチドフィンガープリンティングが好適な方法である。この方法は迅速ではあるが、タンパク質のデータベースとの一致を必要とし、最少の詳細情報しか提供しない。さらなる詳細が必要な場合、イオン化タンデム質量分光分析(ESI−MS/MS)が好適な方法である(例えば、Karger et al., 1993, Anal. Chem. 65:900-906参照)。MS/MSは、アミノ酸レベルの配列情報を提供することができ、デ・ノボ配列決定および翻訳後修飾の解析に必要とされる。MS/MSのスペクトルをタンパク質および核酸のデータベース内の配列に直接相関させる自動データベース検索プログラムの開発は処理能力を大いに高めた。解析の速度をアミノ酸配列の情報と組み合わせるために、MALDIをMS/MSと組み合わせる新しいハイブリッド機器が開発されつつある。当業者には明らかであるが、MSツールが発展するにつれて、本発明に係る微小流体デバイスをMALDIまたはHISの供給源のいずれかと連結するために新しいインターフェースを開発することができる。
一態様においては、ペプチドが由来するポリペプチドを同定するために、タンパク質のデータベースに対してペプチド解析モジュール17によって得られたスペクトルを直接検索する。しかしながら、好ましくは、ペプチド解析モジュール17は、タンパク質またはゲノムのデータベースを使用しないで、ペプチド解析モジュール17によって得られたスペクトルから配列情報を直接得る。これは、同定されるべきタンパク質がタンパク質のデータベースにない場合、特に望ましい。したがって、一態様においては、ペプチド配列をタンパク質のデータベースと比較する検索機能を実行するのではなく、プロセッサ18は、ペプチド解析モジュール17から得られたスペクトルの自動データ解析のためのアルゴリズムを実施する。
好ましくは、モジュールにスプレーされた(例えば、エレクトロスプレーによって)親イオンから得られる娘イオン(MS2イオン)を単離し、さらに、孫娘イオン(MS3イオン)を得るためにこれらを単離して断片化し、それによってMS3スペクトル得ることにより、ペプチド解析モジュール17はこの相互作用を促進する。この種の解析については、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分光分析計およびイオントラップ質量分光分析計のようなイオントラップ型の機器が好ましい。
MS3スペクトルは一般に、2つの部類のイオン:娘イオン(MS2イオン)と同一の末端を有するイオンおよびペプチドの内部断片に由来するイオン(この後者の部類の一部はC末端残基を含む)を含む。MS2とMS3の双方のスペクトル(例えば、交差スペクトルと共に含有される)に共通するピークを同定することにより、主な残存イオンの質量の差異に基づいた交差スペクトルから、ペプチドの部分配列を直接読み取ることができる。ペプチドの多数の娘イオンのMS3スペクトルを得ることによって多数の交差スペクトルを生じ、続いてこれからペプチドの異なった領域の多数の部分配列を生じる。実験的に獲得されたスペクトルをデータベースにおける全ての配列について予測される理論的スペクトルと相関させることによって、部分配列を組み合わせてペプチドの完全配列を得ることができる。迅速フーリエ変換を用いて一致の質を決定することができる。好ましい態様においては、多数のスペクトルの集合平均によって検出限界がさらに改善される(Wilm, 1996, Analytical Chemistry 68:1-8)。
タンパク質解析の速度は、主として、試料を移動させるのに使用される電圧、接続微小流体デバイス5iにおける流路の幾何配置、および試料バンドに関係するデータを獲得するためのタンパク質解析システムにより使用される走査の数に依存する。当該技術分野で日常的な方法を用いて、走査数を最適化することができる。例えば、集合平均では、シグナル対ノイズの比の増加は、平均化した走査数の平方根と等しいので、さらに大きな走査数では、収穫逓減がある。走査数の増加は解析時間も増やすので、平均化に最適な走査数がある。この数は、システムが試料をエレクトロスプレー/ナノスプレーのキャピラリーに装填することができる効率および試料の複雑さによって決定される。
試料の濃度が高ければ高いほど検出可能なピークが多く、あまり平均化する必要はない。試料の濃度が低ければ低いほど含有されるピークは少ないので、走査を獲得する時間がさらに多い。上述したもののような光学検出システムを用いて、MSに到達する前に試料の複雑さを測定することができ、この情報を用いて最適な走査数を決定することができる。
ペプチド解析モジュール17は好ましくは、システム1を介した複数回の試料の運転の結果を比較する。したがって、一態様においては、一つの運転の結果が、同一タンパク質またはペプチドの試料を利用したもう一つの運転の結果と比較される。もう1つの好ましい態様においては、タンパク質解析により、プロテアーゼ消化モジュール4内で種々の時間プロテアーゼに暴露した試料の複数回の運転を比較し、これにより試料中の未消化の、部分的に消化された、および完全に消化されたタンパク質またはポリペプチドの解析が可能となる。
好ましい態様においては、ペプチド解析モジュール17は、細胞性タンパク質の翻訳後修飾を同定する。一般に、翻訳後修飾は、タンパク質の化学修飾の部位によって4つのグループに分類されうる。例えば、タンパク質の修飾は、カルボキシ末端のアミノ酸残基のカルボン酸基、アミノ末端のアミノ酸残基のアミノ基、ポリペプチド鎖における個々のアミノ酸残基の側鎖、および/またはポリペプチド鎖におけるペプチド結合が関与する。修飾は、化学修飾の別個のタイプにしたがって、例えば、リン酸化、グリコシル化、アシル化、アミド化およびカルボキシル化等のサブグループ化してもよい。MSを用いて、ペプチドイオンをペプチド断片イオンに断片化し、それを選択し、さらに断片化して修飾の性質および部位に関係する情報が得られる。
構造的解析モデルにその他の方法が使用され得る。分析物に関する化学的または物理的な情報を提供する別のシステムの例は、核磁気共鳴(NMR)である。
検出器
一態様においては、図1Aに示されるように、システム1の種々の流れの地点に検出器23を設置して、使用者が分離効率を監視することを可能にする。例えば、1つまたは複数の分光学的検出器23をシステム1の種々の流路、出力および/またはモジュールと連絡して配置することができる。分光学的検出器は、屈折率、紫外線および/または可視光の吸収、または好適な波長の光で試料(例えば、タンパク質を含む溶液)を励起した後の蛍光の変化によるものである。
一態様においては、図1Aに示されるように、システム1の種々の流れの地点に検出器23を設置して、使用者が分離効率を監視することを可能にする。例えば、1つまたは複数の分光学的検出器23をシステム1の種々の流路、出力および/またはモジュールと連絡して配置することができる。分光学的検出器は、屈折率、紫外線および/または可視光の吸収、または好適な波長の光で試料(例えば、タンパク質を含む溶液)を励起した後の蛍光の変化によるものである。
好ましい態様においては、試料バンドと反応する光源光(例えば、紫外線源)の変化を認識する光学検出器によって、実質的に分離されたタンパク質(例えば、上流の分離モジュール2を通過した後得られた)または実質的に精製されたペプチド(例えば、微小流体モジュール4および下流の分離モジュール14を通過した後得られた)を含む試料バンドを積極的に感知する。そのような変化に反応して、検出器は1つまたは複数の電気信号を生じ、検出器に電気的に連絡したプロセッサ18がそれを受け取り、処理する。
一態様においては、検出器23は、システム1の種々のモジュールを通過するポリペプチドおよびペプチドの天然の蛍光を検出する。そのような蛍光は、これら分子におけるトリプトファン残基、チロシン残基およびフェニルアラニン残基の存在から生じる。好ましくは、検出器23は、試料バンドがシステム内で検出光学素子の範囲を通過するときに試料バンドを励起するためのレーザ(例えば、210〜290nmのレーザ)を含み、この励起に反応して試料バンド内でポリペプチド、部分的に消化されたポリペプチド、またはペプチドから放射されたスペクトルを回収する。検出器23は、レーザから伝達された光またはポリペプチド/ペプチドから受け取った光をさらに絞るためのレンズまたは対物レンズを含む。
好ましくは、検出器23は、検出された放射スペクトルに相当するシグナルを、システム1のプロセッサ18に伝達し、プロセッサは、シグナルが得られた時間および場所(例えば、システム内のモジュール)を記録する。ポリペプチドおよびペプチドの天然の蛍光を検出するための、少なくともトリプトファンとチロシンをスペクトル的に識別することができる検出器は、当該技術分野で既知であり、例えば、Timperman et al., 1995, Analytical Chemistry 67(19):3421-3426に記載されており、その全体を本明細書に参照して援用する。上で考察されたように、検出器23を用いてシステム1を介する試料の流れを監視し、コントロールすることができる。
特に好ましい態様においては、検出器はシステム内のモジュールの中に統合されている。例えば、UV検出器または熱レンズ検出器を用い、タンパク質消化モジュール4または接続モジュール4iのいずれかまたは双方に統合することができる。双方の検出システムは最近進歩しており、これらシステムの検出限界は、低いナノモル範囲である(例えば、Culbertson et al., 1999, Journal of Microcolumn Separations 11:652-662を参照)。一態様においては、複数の反射セルを有するUV検出システムがシステム内のデバイスに統合されている(例えば、Salimi-Moosavi et al., 2000, Electrophoresis 21:1291-1299の記載を参照)。熱レンズ検出器によってオンデバイスで極めて低いヨクトモルの検出限界が達成されている(例えば、Sato et al., 1999, Analytical Science 15:525-529を参照)。
本発明の好ましい態様においては、図1Aに示されるように、上流の分離モジュール2と微小流体デバイス5の受入流路との間の分離流路と光学的に連絡して検出器23が設置される。検出器は上流の分離モジュールによってデバイス5に送達される試料バンドを検出し、そしてプロセッサ18は、検出器23から受け取ったシグナルに反応して、試料バンドがデバイス5における試料保持流路8の1つに方向付けられたときに、バックグランドの電解質シグナルを除外するバックグランド控除を行う。試料バンドを「切断すること」によって、ペプチド解析モジュール17は試料の解析にさらに時間を費やすことができ、バックグランドの電解質解析の時間は少ない。低濃度のタンパク質試料については、試料の解析に極めて小さな時間割合(<2%)が実際に費やされる。
好ましくは、タンパク質解析システム17は、システム17によって解析されているペプチドから得られるスペクトル情報を検出する自体の検出器(示さず)を含む。例えば、タンパク質解析検出器は、ペプチドイオンがESI MS/MSシステムのようなペプチド解析モジュール1を通過するとき、ペプチドイオンの種々の荷電形態を検出することができる。
上で考察されたように、一態様においては、1つまたは複数の検出器23(タンパク質解析検出器を含む)が電気的にプロセッサ18に連結されている。本明細書で使用するとき、「連結される」という用語は、直接的な連結(例えば、伝導ケーブル、赤外線連絡デバイス等を介した永続的な接続または間欠的な接続)、またはデータが中間保存デバイス(例えば、サーバまたはフロッピーディスク)を介して転送されるような間接的な連結のいずれかを含む。検出器の出力は、プロセッサ18が受け入れることができる形式であるべきことが容易に十分理解されるだろう。
解析される試料の種類に従って様々な検出器23を選択できることは当業者には明白であるはずである。検出器23をさらに、カメラ、適切なフィルターシステムおよび光電子増倍管に連結することができる。検出器23は光学検出器に限定される必要はないが、電気化学的、屈折率、導電性、FT−IRおよび光散乱の検出器等を含めた、液体クロマトグラフィおよびキャピラリー電気泳動における検出に使用されるいかなる検出器も含めることができる。
プロセッサ
好ましい態様においては、システムプロセッサ18を用いて、例えば、システムの種々の位置に設置された検出器から得られるデータに基づいて、システム1を通るタンパク質/ペプチドの流れをコントロールする。好ましい態様においては、システム1の接続モジュール4iがこのコントロールを用いて、ペプチド解析モジュール17が実際に試料を解析し、配列情報を得るのに費やす時間量を増加させる。
好ましい態様においては、システムプロセッサ18を用いて、例えば、システムの種々の位置に設置された検出器から得られるデータに基づいて、システム1を通るタンパク質/ペプチドの流れをコントロールする。好ましい態様においては、システム1の接続モジュール4iがこのコントロールを用いて、ペプチド解析モジュール17が実際に試料を解析し、配列情報を得るのに費やす時間量を増加させる。
本明細書で使用するとき、「システムプロセッサ」とは、メモリ、複数のプログラムを同時に作動させることができる中央処理ユニット、および好ましくは、少なくとも1つの非システムの装置から端末に電気信号を送り、受け取ることが可能であるネットワーク接続の端末を含むデバイスを言う。
システムプロセッサ18は、自体のプロセッサまたはマイクロプロセッサを有しうる1つまたは複数のシステム構成成分(例えば、モジュール(2、14、4、4i、17)、検出器23、コンピュータワークステーション等)と連絡する。後者の型のプロセッサ/マイクロプロセッサは一般に、メモリおよび特定の機能専用である、保存されたプログラム(例えば、検出器23プロセッサの場合、蛍光シグナルの検出、またはペプチド解析モジュール17プロセッサの場合、イオン化スペクトルを得ること、または1つまたは複数のデバイスに接続された電源の場合、デバイス上の選択された流路の電圧および電流の設定をコントロールすること)を含み、一般に直接的にはネットワークに接続可能ではない。
好ましい態様においては、システムプロセッサ18は、使用者がシステム1と接続する(すなわち、データを見る、システム1のパラメータを設定するもしくは修正する、および/またはデータを入力する)ために使用することができる使用者用インターフェースを表示する画面を含む少なくとも1つの使用者用デバイスと連絡する。少なくとも1つの使用者用デバイスはキーボードのような入力用デバイス、およびマウス、光ペン、トラックボール、ジョイスティックまたはその他の位置決めデバイスを含むが、これらに限定されない1つまたは複数の操縦ツールに接続することができる。
システムプロセッサ18は、種々のシステムの構成成分と関係するプロセッサ/マイクロプロセッサの機能を統合し、データの解釈(例えば、その他のプロセッサ/マイクロプロセッサからのシグナルを解釈すること)、データの作成(例えば、得られたシグナルにおいて1つまたは複数の統計操作を行うこと)、データの保存(例えば、関連するデータベースの創製)、データの解析(例えば、検索およびデータの回収、ならびに関係の決定)、データの通信(例えば、サーバ等のようなシステムの外のプロセッサまたはシステム内のプロセッサへの通信)、表示(例えば、図解および/または文字の形態での画像またはデータの表示)、および作業シグナルの作成(例えば、その他のシステムの構成成分から得られたデータに反応して種々のシステム構成成分に指示を発信し特定の作業を行うこと)のうち1つまたは複数の機能を実行することができる。
一態様においては、システムプロセッサ18を用いて、システム1の種々のモジュールおよび流路における電圧の差異をコントロールする。好ましい態様においては、このコントロールを用いて、ペプチド解析モジュール17が実際に試料を解析し、配列情報を得るのに費やす時間量を増加させる。
好ましくは、システムプロセッサ18は、システム1のモジュールおよび流路と連絡する1つまたは複数のセンサー(例えば、pHセンサー、温度センサー)および/または検出器23と連絡することができる。さらにより好ましくは、システムプロセッサ18は、この連絡に反応して種々のシステムのパラメータ(例えば、試薬の流れ、電圧)を修正することができる。例えば、1つまたは複数の編集機能を実行することができるシステムプロセッサ18が、検出器23の出力(例えば、1つまたは複数の電気信号)を処理することができる。編集機能としては、バックグランドを除去すること、シグナルを画像として表すこと、二回一組のまたは異なった運転のシグナルおよび/または画像を比較すること、統計操作を行うこと(例えば、Wilm, 1996, 上記で記載されるような集合平均)等が挙げられるが、これらに限定されない。これらの機能のいかなるものも操作者が決定した基準に従って自動的に行うことができ、または双方向性に行うことができ、すなわち、人間の操作者に画像ファイルを表示する際、操作者が種々の編集メニュを適宜修正することができる。好ましくは、編集メニュは、例えば、ドロップダウンメニュ形式のものは、ネットワークに接続可能であり、システム18プロセッサと連絡している使用者用デバイスのインターフェース上に表示される。あるいは、またはさらには、使用者用デバイスのインターフェース上に表示される1つまたは複数のアイコン、ラジオボタンおよび/またはハイパーリンクを選択することにより編集メニュにアクセスすることができる。
好ましい態様においては、プロセッサ18は、複数のタンパク質消化生成物または特有のペプチドからタンパク質の配列を推測するプログラムを実施することが可能である。そのようなプログラムは当該技術分野で既知であり、Yates et al., 1991, in Techniques in Protein Chemistry II, Academic Press, Inc. pp477-485; Zhou et al., The 40th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, pp635-636; およびZhou et al., The 40th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, pp1396-1397に記載されており、それら全体を本願に引用し、援用する。
例えば、システムプロセッサ18を用いて、例えば、ペプチド結合の形成における水の喪失、プロトン化、アミノ酸の測定質量を変化させるその他の因子、およびアミノ酸の可能な組み合わせを制約する実験的検討事項のような種々の因子を調整した後、合計すると解析された(例えば、ESIMS/MSによって)未知ペプチドの測定質量になるアミノ酸のあらゆる可能な組み合わせを決定することができる。次いで、システムプロセッサ18は、可能な組み合わせにおけるアミノ酸の線形の順列を決定することができる。次いで、各順列について理論的断片化スペクトルを計算し、これらを、未知ペプチドについて得られた実験的断片化スペクトルと比較して未知ペプチドのアミノ酸配列を決定する。SEQUEST(サーモフィニンガン(Thermo Finnigan))およびマスコット(Mascot)(マトリクスサイエンス(Matrix Science))のように多数のコンピュータプログラムが、質量スペクトルのデータ(生成物イオンのスペクトル)をタンパク質およびヌクレオチドの配列のデータベースと直接相関させるために市販されている。
いったん、単離されたタンパク質またはそのポリペプチド断片の実験的に決定されたアミノ酸配列が得られると、システムプロセッサ18を用いて、利用可能なタンパク質データベースまたは核酸配列データベースを検索し、システム1により同定されたタンパク質とデータベースの配列との間の同一性の程度を決定することができる。そのような解析によりタンパク質の機能の評価が支援されうる。例えば、一態様においては、新しく同定されたタンパク質における保存されたドメインを用いて、タンパク質がシグナル伝達タンパク質かどうかを同定することができる(例えば、7回膜貫通疎水性領域、細胞外N末端、および細胞質内C末端の存在はGタンパク質結合型受容体すなわちGPCRの顕著な特徴である)。
データベースが、システム1により同定されたタンパク質の少なくとも一部をコードする1つまたは複数の部分的なヌクレオチド配列を含有する場合、そのような部分的ヌクレオチド配列(またはそれらの相補型)が、該タンパク質をコードする核酸分子をクローニングするためのプローブとして役立つことができる。核酸配列データベースの中に、システム1により同定されたタンパク質について一致するヌクレオチド配列を見つけることができなければ、実験的に決定されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の縮重セットを作成し、ハイブリッド形成プローブとしてそれらを用いて、タンパク質をコードする遺伝子のクローニングを促進することができる。それによって得られたクローンを用いてタンパク質を発現させることができる。
好ましくは、システムプロセッサ18を用いて細胞に関するプロテオームマップを作成する。さらに好ましくは、プロセッサ18は、異なった疾患状態における同一種類の細胞、1つまたは複数の病原体または毒素に暴露された同一種類の細胞、異なった発生段階にある同一種類の細胞に関するプロテオームマップも作成し、または異なった種類の細胞(例えば、異なった種類の組織)を比較するために用いられる。特定の疾患状態における細胞について得られた地図を、薬剤または作用剤で治療した細胞から得た地図と比較することができ、また異なった段階の疾患(例えば、癌の異なった段階または等級)における細胞について作成することができる。
好ましくは、システムプロセッサ18を用いて、上述した細胞において差次的に発現されたポリペプチドを同定するために得られた別々の地図を比較する。好ましい態様においては、プロセッサ18は使用者用デバイスの画面上にそのような解析の結果を表示し、ポリペプチドの名称(わかる場合)、相当するアミノ酸配列および/または遺伝子配列、および発現データ(例えば、ゲノムの解析からのもの)、または既知の機能性データのような情報を表示する。好ましくは、細胞が得られた患者に関する利用可能な臨床データと共に、プロテオーム解析に関するデータをデータベースに保存する。
一態様においては、画面は、使用者がデータベースの種々の部分にアクセスするために選択することができる1つまたは複数のハイパーリンクを表示する使用者インターフェースを含む。別の態様においては、プロセッサ18は、当該データベースを、その他のプロテオミクスデータベースまたはゲノムデータベース(例えば、タンパク質配列およびヌクレオチド配列のデータベース等)とリンクすることができる情報管理システムを含むか、またはそれに接続可能である。
好ましい態様においては、プロテオームマップは、細胞のシグナル伝達経路の壊された遺伝子を含む細胞について得られ、このマップを用いて、細胞で差次的に発現された(細胞のシグナル伝達経路の機能的な遺伝子を含む細胞と比べた場合)その他のポリペプチドを同定する。差次的に発現されたタンパク質は、同一シグナル伝達経路の候補メンバーとして同定される。
一態様においては、シグナル伝達経路の候補遺伝子が、ノックアウト動物(例えば、マウス)のようなモデル系で破壊されており、シグナル伝達経路の候補遺伝子に加えて、破壊により影響を受け、従って同一経路にある可能性のあるその他の遺伝子を同定する。その他のモデル系には、候補ポリペプチドをコードするmRNAの翻訳を妨害するアンチセンス分子またはリボザイムを含む細胞(単数または複数)または組織(単数または複数)が挙げられるが、これらに限定されない。そのようなモデル系を作成する方法は当該技術分野で既知である。複数の破壊されたシグナル伝達ポリペプチドの候補についてプロテオームマップを得ることによって、(例えば、ポリペプチドがその他の経路ポリペプチドの上流にあるかまたは下流にあるかを同定するために)経路におけるポリペプチドの位置を決定することができる。
細胞のシグナル伝達ポリペプチドの使用
複数の生体試料において、シグナル伝達経路の候補ペプチドの発現および/または形態(例えば、修飾および/または切断生成物またはその他の処理された形態の有無)を評価して、これらのポリペプチドの診断用分子としての使用を評価することができる。ポリペプチドをコードする核酸分子の発現および/または形態(例えば、配列)を複数の生体試料で評価することができ、これらもまた診断用となりうる。好ましい態様においては、生体試料は、疾患(または疾患の特定の段階)を有する患者、または疾患を発生するリスクがある患者からのものである。好ましくは、疾患は、異常な細胞増殖または細胞死(例えば、癌等)を含む病態である。
複数の生体試料において、シグナル伝達経路の候補ペプチドの発現および/または形態(例えば、修飾および/または切断生成物またはその他の処理された形態の有無)を評価して、これらのポリペプチドの診断用分子としての使用を評価することができる。ポリペプチドをコードする核酸分子の発現および/または形態(例えば、配列)を複数の生体試料で評価することができ、これらもまた診断用となりうる。好ましい態様においては、生体試料は、疾患(または疾患の特定の段階)を有する患者、または疾患を発生するリスクがある患者からのものである。好ましくは、疾患は、異常な細胞増殖または細胞死(例えば、癌等)を含む病態である。
シグナル伝達経路の候補ポリペプチドの破壊(例えば、発現の喪失、発現の低下、過剰発現、ポリペプチドの異所性発現、またはポリペプチドの異常形態の存在)が特定の疾患または特徴の診断として同定された場合、破壊されたポリペプチドと反応性がある分子プローブを疾患または特徴を有することが疑われる患者からの試験試料に接触させることができ、疾患または特徴を有するリスクの有無を決定する手段として、分子プローブと破壊されたポリペプチドとの反応性を測定することができる。
一態様においては、分子プローブは、破壊されたポリペプチドおよび破壊されていないポリペプチドの双方に反応性があり、破壊されたポリペプチドと破壊されていないポリペプチドとの間の分子量または配列の差異を検出することによって、または単一種のポリペプチドの量的レベルの変化を検出することによって(すなわち、その破壊が、破壊されていないポリペプチドの構造ではなく、発現を変える場合)、破壊されたポリペプチドの存在を決定することができる。別の態様においては、分子プローブは、ポリペプチドの破壊された形態に特異的に反応し、ポリペプチドの破壊されていない形態とは反応しない(例えば、プローブは、ポリペプチドのリン酸化された形態とは反応するが、リン酸化されていない形態とは反応しない)。
好ましくは、プローブは抗体である。当該技術分野で既知の方法を用いてポリクローナル抗血清またはモノクローナル抗体を作ることができる。マウス、ハムスターまたはウサギのような哺乳類をシグナル伝達ポリペプチド、その断片、その修飾型またはその変異型の免疫原性形態で免疫することができる。そのような分子に免疫原性を与える技術には、キャリアとの共役および当該技術分野で既知のその他の技術が挙げられる。例えば、アジュバントの存在下で免疫原性分子を投与することができる。血漿または血清中の抗体力価の検出によって免疫をモニターすることができる。抗原としての免疫原と共に標準的な免疫アッセイ法を用いて抗体のレベルおよび特異性を評価することができる。免疫に続いて、抗血清を得ることができ、所望であれば、血清からポリクローナル抗体を単離することができる。
モノクローナル抗体を得るには、抗体産生細胞(リンパ球)を免疫した動物から回収し、標準的な体細胞融合法によって骨髄腫細胞と融合することができ、こうして、これらの細胞を不死化し、ハイブリドーマ細胞を得る。そのような技術は当該技術分野で既知である(例えば、Kohler & Milstein, 1975, Nature 256:495-497; Kozbor et al., 1983, Immunol. Today 4:72, Cole et al., 1985, In Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy, Allen R. Bliss, Inc., pp77-96を参照)。さらに、単鎖抗体の産生に関して記載された技術(米国特許第4,946,778号)を本発明に係る抗体を産生するように適合させることができる。
細胞のシグナル伝達ポリペプチド、その修飾型、およびその変異型を含有し、それらに特異的に結合する抗体断片も既知の技術によって作成してよい。例えば、そのような断片には、抗体分子のペプシン消化で作出することができるF(ab’)2断片およびF(ab’)2断片のジスルフィド架橋を還元することによって作出することができるFab断片が挙げられるが、これらに限定されない。ファージ発現ライブラリを用いて細菌でVH領域およびFV領域を発現させることができる(例えば、Ward et al., 1989, Nature 341:544-546; Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281; McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-554)。
キメラ抗体、すなわち、非ヒト動物の可変領域とヒトの定常領域を組み合わせた抗体分子も本発明の範囲内である。キメラ抗体分子は、例えば、ヒトの定常領域と共に、マウス、ラット、またはその他の種の抗体に由来する抗原結合ドメインを含む。標準的な方法を用いて、細胞のシグナル伝達ポリペプチドの遺伝子産物を認識する免疫グロブリンの可変領域を含有するキメラ抗体を作ってもよい(例えば、Morrison et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851; Takeda et al., Nature 314:452; 米国特許第4,816,567号;米国特許第4,816,397号を参照)。異常な細胞のシグナル伝達経路に対する生理的応答に関係する症状を治療するために治療上プローブを使用すべき場合、キメラ抗体が好ましい。
可変領域の一部、特に抗原結合ドメインの保存されたフレームワーク領域がヒト由来であり、超可変領域のみが非ヒト由来であるヒト定常領域のキメラを作出することによって、モノクローナル抗体またはキメラ抗体をさらにヒト化することができる。当該技術分野で既知の技術によってそのような免疫グロブリン分子を作ってよい(例えば、Teng et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:7308-7312; Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:7279; Olsson et al., 1982, Meth. Enzymol. 92:3-16;WO92/06193;EP0239400を参照)。
特に好ましい態様においては、細胞のシグナル伝達ポリペプチドの修飾型および/または変異型を認識するが、細胞のシグナル伝達ポリペプチドの非修飾型および/または非変異型を認識しない抗体が提供される。例えば、変異ポリペプチドの変異領域を含むペプチドを抗原として用いて、これらの変異体に特異的な抗体をスクリーニングすることができる。同様に修飾されたペプチドまたはタンパク質を免疫原として用いて、タンパク質の修飾型のみに結合するが非修飾型には結合しない抗体を選択することができる。変異特異的抗体および修飾特異的抗体の作製方法は当該技術分野で既知であり、例えば、米国特許第6,054,273号、米国特許第6,054,273号、米国特許第6,037,135号、米国特許第6,022,683号、米国特許第5,702,890号、米国特許第5,702,890号、およびSutton et al., 1987, Immunogenet. 14(1):43-57に記載されており、それら全体を本願に引用し、援用する。
一態様においては、標識した抗体またはその抗原結合部分が提供される。フルオレセイン、アミノクマリン酢酸、テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)。テキサスレッド、Cy3.0およびCy5.0のような蛍光化合物によって抗体を標識することができる。GFPも蛍光標識に有用であり、融合タンパク質として発現することにより、抗体またはその抗原結合部分を標識するのに使用することができる。融合タンパク質の創製用に設計されたGFPをコードしたベクターが市販されている。その他の標識には、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼ;ルミノールのような発光材料;放射性材料;フェリチンまたはコロイド状の金のような電子密度の高い物質;およびビオチンのようなその他の分子が挙げられるが、これらに限定されない。
上述の抗体を用いた標準的な免疫アッセイを用いてポリペプチドおよび/またはその修飾型および/またはその変異型を検出することができる。免疫アッセイには、ラジオイムノアッセイ、酵素免疫アッセイ(例えば、ELISA)、免疫蛍光(例えば、免疫組織化学的解析)、免疫沈降、ラテックス凝集、血球凝集および組織化学的検査が挙げられるが、これらに限定されない。そのようなアッセイは当該技術分野では日常的である。
本発明の特に好ましい態様においては、複数の異なったプローブが、固体の支持体上の既知の種々の位置に安定して結合される。好ましくは、異なったプローブは、同一シグナル伝達経路における異なったシグナル伝達ポリペプチドを表す。一態様においては、少なくとも1つの初期経路のプローブ(すなわち、約5個未満の経路ポリペプチドほど下流で、少なくとも1つの初期経路ポリペプチドと反応するもの)および少なくとも1つの後期経路のプローブ(すなわち、約10個超の経路ポリペプチドほど下流で、少なくとも1つの後期経路ポリペプチドと反応するもの)が提供される。別の態様においては、少なくとも約1つの中期経路のプローブ(すなわち、約5個超かつ約10個未満の経路ポリペプチドほど下流で、少なくとも1つの中期経路ポリペプチドと反応するもの)が提供される。好ましくは、構成的に発現されているポリペプチド(例えば、アクチン)と反応する1つまたは複数の反応コントロールポリペプチドが提供される。1つまたは複数のバックグランドコントロールプローブ(例えば、ヒトの試料が評価される場合、植物のポリペプチドと反応するプローブのような、特定の試料では存在が予測されないポリペプチドと反応性があるもの)も提供される。支持体およびプローブを患者の細胞(単数または複数)または組織(単数または複数)由来のポリペプチドを含む生体試料と反応させ(それらは好ましくは標識される)、それらを用いて、支持体上のどのプローブが試料中の細胞性ポリペプチドと反応するかを決定することにより、試料で発現されている細胞のシグナル伝達ポリペプチドまたはその修飾型または変異型を同定することができる。
本発明に係る細胞シグナル伝達ポリペプチドをコードする核酸と反応する分子プローブによって並行アッセイを実行できることが当業者に明白であろう。サザン(例えば、欠損したまたはその他の突然変異した細胞シグナル伝達遺伝子を検出するため)、ノーザン、RT−PCR、アレイ系のアッセイ等(例えば、本発明の方法に従って同定される細胞シグナル伝達遺伝子に相当する転写物の発現変化または異常転写物の発現を検出するため)のようなハイブリッド形成を基にしたアッセイ。そのようなアッセイは当該技術分野では日常的である。
本発明に係る、細胞シグナル伝達ポリペプチドの組換え体を発現するように遺伝子操作した細胞をスクリーニングプログラムに用いて、組換えタンパク質と特異的に相互作用するその他の細胞性の生体分子または薬剤を同定することができ、または、例えば、治療用投与のために大量の組換えタンパク質を製造することができる。本発明に係る細胞シグナル伝達ポリペプチドをコードするクローニングされた遺伝子を所有することにより、ポリペプチドの異常発現または発現低下が疾患に関係する場合、そのようなポリペプチドを置き換えるかまたは補完する遺伝子治療が可能である。
次に、以下の実施例を参照して本発明をさらに説明する。以下は単に例示目的であって、細部に対する改変を行いうるが、依然として本発明の範囲内に入ることは十分理解されよう。
特に好ましい実施形態においては、システム1を用いてPI3−キナーゼによって刺激されるタンパク質のプロファイルを同定する。前立腺癌患者の組織から、および同一または異なった患者の正常前立腺組織から細胞溶解物を得る。システム1を用いて溶解物の部分標本を並行して評価し、差次的に発現されるタンパク質を同定する一方で、核酸アレイ(例えば、ジーンデバイス(GeneDevice)アレイまたはcDNAアレイ)を用いて他の部分標本を評価して差次的に発現される核酸を同定する。好ましくは、システム1のプロセッサ18を用いてこれらの解析のそれぞれから得られたデータを評価する。
PI3経路における種々のタンパク質が異常に活性化されていることが分かっている細胞を調べることによってこの解析を補完することができる。例えば、ウイルス型のPI3−キナーゼ(v−P3k)を構成的に活性化し、培養細胞を形質転換することが可能であり、複製欠損レトロウイルスを介して導入した場合、有胚鶏の絨毛尿膜に脈管形成および血管腫肉腫を誘発する。したがって、一態様においては、インビトロでv−P3kによって形質転換した細胞(例えば、ニワトリまたはマウス)におけるv−P3kにより誘導されたタンパク質の発現を評価して、形質転換されていない細胞と比べた場合にこれらの細胞で差次的に発現されているタンパク質を同定する。そのように同定された差次的に発現されているポリペプチドを、ヒトから得た細胞で差次的に発現されているものと比較する。好ましくは、これらのポリペプチドをコードする遺伝子のmRNAの発現も測定する。上記のように、好ましくは、タンパク質の発現データを核酸の発現データと共に評価する。特に好ましい態様においては、形質転換後の種々の時点を評価し、タンパク質発現の特定のプロファイルが特定の生理的反応と相関し得るかどうかを決定する。例えば、形質転換された有胚鶏を評価する場合、タンパク質の発現を、これらの有胚鶏の絨毛尿膜(chorioallantonic)組織中での腫瘍形成または脈管形成に相関付けうる。
v−Srcは組織培養細胞において形態的な形質転換を誘導し、PI3−キナーゼを含むいくつかの下流のシグナル伝達タンパク質を活性化するので、システム1を用いてv−Src形質転換細胞(例えば、マウスの線維芽細胞)もまた解析する。v−Srcにより誘導され、十分に特性分析されたタンパク質は、システム1の感度に対する陽性対照を提供する。
本明細書に引用した参考文献、特許、特許出願および特許公開の全ては、その全体を本願に引用し、援用する。特許請求される、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載されているものの変形物、改変およびその他の実施が当業者に明白であろう。したがって、本発明は、上記の説明的な記載によって定義されるのではなく、添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲によって定義される。
Claims (51)
- 実質的に精製されたポリペプチドを受け取るための少なくとも1つの試料保持流路を有する基材(substrate)を含む微小流体デバイスであって、化学的処理または物理的処理が起きるのを可能にするために、前記少なくとも1つの試料保持流路が前記実質的に精製されたポリペプチドを回収する微小流体デバイス。
- 前記少なくとも1つの保持流路が、前記流路の一部分に配置された第1の固相に固定化された試料処理試薬を有し、前記保持流路が、前記保持流路の別の部分に配置された第2の相をさらに含み、電流は第2の固相を通過してもよいが、前記実質的に精製されたポリペプチドおよびその消化生成物は通過してはならない、請求項1に記載のデバイス。
- 前記試料処理試薬がプロテアーゼである、請求項2に記載のデバイス。
- 前記第1の固相が、その上に固定化された前記試料処理試薬を含む複数の粒子を含む、請求項2に記載のデバイス。
- 前記第2の固相がフィルターを含む、請求項2に記載のデバイス。
- 前記第2の固相がゾル−ゲル材料を含む、請求項2に記載のデバイス。
- 前記第2の固相が酸化アルミニウムを含む、請求項2に記載のデバイス。
- 前記第1の固相が前記第2の固相に実質的に隣接する、請求項2に記載のデバイス。
- 1つまたは複数の電極と電気的に連絡する、請求項1に記載のデバイス。
- 複数の実質的に平行である試料保持流路を含む、請求項1に記載のデバイス。
- 複数の試料を解析し得るように複数の試料保持流路をさらに含む、請求項1に記載のデバイス。
- 前記基材がガラスを含む、請求項1に記載のデバイス。
- 前記基材がポリマーを含む、請求項1に記載のデバイス。
- 試料を受け取るための試料受入流路をさらに含み、前記試料受入流路が少なくとも1つの交差流路と合流する、請求項1に記載のデバイス。
- 前記少なくとも1つの交差流路が前記少なくとも1つの試料保持流路と統合される、請求項14に記載のデバイス。
- 前記複数の試料保持流路の少なくとも1つがリザーバウエルで終了する、請求項15に記載のデバイス。
- 前記デバイスが上重ね基材(overlying substrate)によって実質的に覆われる、請求項1に記載のデバイス。
- 前記上重ね基材が少なくとも1つのリザーバウエルと連絡する開口部を有する、請求項17に記載のデバイス。
- 少なくとも1つの前記複数の試料保持流路が補助流路と統合される、請求項11に記載のデバイス。
- タンパク質を消化する方法であって、
(a)微小流体デバイスの少なくとも1つの試料保持流路に試料を送達すること;および
(b)所望の量の消化生成物を得るのに十分な時間、試料をプロテアーゼに暴露することを含む、タンパク質を消化する方法。 - 前記微小流体デバイスが、1つまたは複数の電極と連絡し、前記試料が、前記少なくとも1つの電極により生じる電圧の存在下に、前記微小流体デバイスの第1の固相を通って輸送される、請求項20に記載の方法。
- 前記試料が、消化反応を受けるにつれて濃縮される、請求項20に記載の方法。
- 前記試料が実質的に精製されたポリペプチドである、請求項20に記載の方法。
- 微小流体デバイスを有する微小流体モジュールを含むプロテオーム解析のための統合された微小流体システムであって、前記微小流体モジュールが、前記微小流体デバイスの少なくとも1つの試料保持流路に実質的に精製されたポリペプチドを提供するための上流の分離モジュールと連絡する、統合された微小流体システム。
- 前記上流の分離モジュールが、少なくとも第1の基準に従って前記実質的に精製されたポリペプチドを分離する、請求項24に記載のシステム。
- 前記上流の分離モジュールがキャピラリー電気泳動装置を含む、請求項24に記載のシステム。
- 前記上流の分離モジュールが、少なくとも第1の基準および第2の基準に従って、複数のポリペプチドを含む試料を分離し、前記第1の基準と第2の基準が異なっている、請求項24に記載のシステム。
- 前記第1の基準が分子量である、請求項27に記載のシステム。
- 前記第2の基準が等電点である、請求項28に記載のシステム。
- 前記第1の基準に従って試料を分離するための第1の分離経路と、前記第1の基準に従って実質的に分離されているポリペプチドを前記第2の基準に従って分離するための第2の分離経路とを含む、請求項27に記載のシステム。
- 前記実質的に精製されたポリペプチドが前記上流の分離モジュールからペプチド解析モジュールに移動し、前記実質的に精製されたポリペプチドが前記微小流体デバイスにおいて化学的処理を受ける前に、前記ペプチド解析モジュールが前記実質的に精製されたポリペプチドの一連の化学的データまたは物理的データを測定することができる、請求項24に記載の統合された微小流体システム。
- 微小流体デバイスを有する微小流体モジュールを含むプロテオーム解析のための統合された微小流体システムであって、前記微小流体モジュールが複数の消化生成物を分離するための下流の分離モジュールと連絡し、前記消化生成物が前記微小流体デバイス上で起きる消化反応の結果生じる、統合された微小流体システム。
- 前記下流の分離モジュールが、前記消化生成物を電気泳動するためのキャピラリーである、請求項32に記載のシステム。
- 前記下流の分離モジュールが、前記実質的に精製されたポリペプチドの複数の化学的情報または物理的情報を測定するためのペプチド解析モジュールと連絡する、請求項32に記載のシステム。
- 前記ペプチド解析モジュールが質量分析計を含む、請求項34に記載のシステム。
- 前記ペプチド解析モジュールがESI MS/MS装置を含む、請求項34に記載のシステム。
- 前記下流の分離モジュールが、前記下流の分離モジュールから複数の消化生成物を受け取り、前記ペプチド解析モジュールに複数の前記消化生成物を送達するための接続微小流体モジュールに連結される、請求項34に記載のシステム。
- エレクトロスプレー装置が、前記消化生成物を前記接続微小流体モジュールから前記ペプチド解析モジュールの試料受け取り口に送達する、請求項37に記載のシステム。
- 前記エレクトロスプレー装置が、前記接続微小流体モジュールから前記ペプチド解析モジュールに延びる多孔性の先端を含む、請求項38に記載のシステム。
- 前記ペプチド解析モジュールが、前記消化生成物の複数のアミノ酸配列を決定するプロセッサと連絡する、請求項34に記載のシステム。
- 前記消化生成物の前記アミノ酸配列が、前記実質的に精製されたポリペプチドの配列に組み立てられる、請求項40に記載のシステム。
- 前記実質的に精製されたポリペプチドの前記配列に関する複数の情報がデータベースに保存される、請求項40に記載のシステム。
- 前記システムと連絡する1つまたは複数の検出器を含む、請求項32に記載のシステム。
- 上流の分離モジュールをさらに含む、請求項43に記載のシステム。
- 前記検出器が、前記上流の分離モジュールから受け取った前記実質的に精製されたポリペプチドを検出し、前記微小流体デバイスの試料保持流路へと前記実質的に精製されたポリペプチドを方向付けする、請求項44に記載のシステム。
- 前記ペプチド解析モジュールがMALDI−MS装置を含む、請求項34に記載のシステム。
- プロテオーム解析消化の方法であって、
(a)プロテオーム解析のための統合された微小流体システムを提供すること;
(b)複数の細胞性ポリペプチドを含む試料を前記統合された微小流体システムの上流の分離モジュールに送達し、実質的に精製されたポリペプチドを得ること;
(c)前記実質的に精製されたポリペプチドを前記統合された微小流体システムの微小流体モジュールに送達し、前記微小流体モジュールはプロテアーゼを含み、前記ポリペプチドを実質的に消化するのに十分な時間および一連の条件下にて前記ポリペプチドを前記プロテアーゼに暴露し、それによって少なくとも1つの消化生成物を産生すること;
(d)前記消化生成物を前記システムの下流の分離モジュールに輸送し、実質的に分離された消化生成物を得ること;および
(e)前記消化生成物のアミノ酸配列を決定し、前記配列を組み立てて前記実質的に精製されたポリペプチドの配列を作成すること、を含むプロテオーム解析の消化方法。 - 前記細胞性ポリペプチドの実質的に全てについて工程(a)〜(e)を実行し、前記細胞性ポリペプチドが得られた細胞のプロテオームマップを得ることを含む、請求項47に記載の方法。
- 前記プロテオームマップを第2のプロテオームマップと比較することをさらに含む、請求項48に記載の方法。
- 前記統合された微小流体システムの前記微小流体モジュールから得られた前記実質的に分離された消化生成物を前記システムの接続微小流体モジュールに送達し、前記統合された微小流体システムの前記接続微小流体モジュールから得られた前記実質的に分離された消化生成物を前記統合された微小流体システムのペプチド解析モジュールに輸送することをさらに含む、請求項47に記載の方法。
- 前記実質的に精製されたポリペプチドを前記上流の分離モジュールからペプチド解析モジュールに送達することをさらに含み、前記実質的に精製されたポリペプチドが前記微小流体デバイスにおいて化学的処理を受ける前に、前記ペプチド解析モジュールが前記実質的に精製されたポリペプチドの一連の化学的情報および物理的情報を測定し得る、請求項47に記載の方法。
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