KR20230156690A - 질량 분광측정법 샘플 가공 방법, 크로마토그래피 장치,및 바이오마커 분석을 위한 데이터 분석 기술 - Google Patents

질량 분광측정법 샘플 가공 방법, 크로마토그래피 장치,및 바이오마커 분석을 위한 데이터 분석 기술 Download PDF

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KR20230156690A
KR20230156690A KR1020237024168A KR20237024168A KR20230156690A KR 20230156690 A KR20230156690 A KR 20230156690A KR 1020237024168 A KR1020237024168 A KR 1020237024168A KR 20237024168 A KR20237024168 A KR 20237024168A KR 20230156690 A KR20230156690 A KR 20230156690A
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microfluidic device
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rplc
channels
sample
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KR1020237024168A
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스피로스 디. 가비스
디미트리오스 일리오포울로스
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프로테아즈 바이오애널리틱스, 인크.
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Abstract

특정 측면에서, 본 개시내용은 질량 분광법을 위해 샘플을 처리하기 위한 방법, 장치, 및 이의 구성요소를 포함하는 플랫폼에 관한 것이다. 다른 측면에서, 본원에는 본원에 기재된 방법 및 장치로부터 수득된 샘플의 질량 분광법 분석으로부터 수득된 것들을 포함하여, 질량 분광법 데이터를 분석하기 위한 분석 플랫폼이 제공된다. 다른 측면에서, 관상 동맥 질환(CAD) 단백체 서명과 같은 개체 내 병태의 식별된 단백체 서명이 제공된다.

Description

질량 분광측정법 샘플 가공 방법, 크로마토그래피 장치, 및 바이오마커 분석을 위한 데이터 분석 기술
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 12월 15일 출원된 미국 가특허 출원 번호 63/125,955에 대한 우선권 및 이익을 주장하며, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
기술 분야
특정 측면에서, 본 개시내용은 질량 분광법을 위한 샘플을 처리하는 방법, 장치, 및 이의 구성요소를 포함하는 플랫폼에 관한 것이다. 다른 측면에서, 본원에는 본원에 기재된 방법 및 장치로부터 수득된 샘플의 질량 분광법 분석으로부터 수득된 것을 포함하여, 질량 분광법 데이터를 분석하기 위한 분석 플랫폼이 제공된다.
질량 분광법은 소분자에서 핵산 내지 폴리펩티드에 이르기까지 다수의 상이한 유형의 구성요소를 함유하는 샘플을 분석하는 데 유용한 도구이다. 생물학적 또는 환경적 기원으로부터의 것과 같은 샘플은 고도로 복잡할 수 있고 상이한 물리적 및 화학적 특성을 갖는 매우 상이한 농도로 구성요소를 함유할 수 있다. 예를 들어, 통상의 샘플은 동적 범위에서 10 자릿수를 초과하는 구성요소를 함유하는 것으로 알려져 있으며, 친수성 및 소수성 펩티드 및 단백질, 1차 및 2차 대사물, 천연 펩티드, 소분자 대사물, 및 microRNA, 원형 및 긴 비코딩 RNA, 및 미토콘드리아 RNA를 포함하는 RNA 및 DNA와 같은 핵산으로 구성된다. 기존 방법은 유체 샘플에서 광범위한 단백질 및 다른 생체분자의 편향되지 않은 포획에서 완전히 만족스럽지 않다. 질환과 같은 생물학적 현상과 연관된 바이오마커로서 생물학적 샘플로부터 생체분자의 발견을 위해 개선된 방법이 요구된다. 개선된 구현예는 이러한 요구를 다룬다.
일부 측면에서, 본원에는 테스트 샘플을 처리하는 방법이 제공되며, 방법은 (a) SEC 미세유체 장치를 사용하여 테스트 샘플을 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 기술에 적용하되, 상기 테스트 샘플은 하나 이상의 생체분자 및 카오트로픽제(chaotropic agent)를 포함하고, 상기 SEC 미세유체 장치는 복수의 상호연결된 채널을 포함하는 것인, 단계; (b) SEC 미세유체 장치로부터 용출된 하나 이상의 분획을 수집하는 단계; (c) SEC 미세유체 장치로부터의 분획 중 하나 이상을 단백질분해 기술에 적용하는 단계; 및 (d) 분획 중 하나 이상의을 역상 액체 크로마토그래피(RPLC) 기술에 적용하여 질량 분광계에 도입하기 위한 분획을 제조하되, 상기 하나 이상의 RPLC-분획은 (i) SEC 미세유체 장치로부터 수득된 0 개 이상의 분획; 및 (ii) 단백질분해 기술에 적용된 0 개 이상의 분획을 포함하는 것인, 단계를 포함한다.
일부 측면에서, 본원에는 질량 분광법 분석을 위한 테스트 샘플을 처리하는 방법이 제공되며, 방법은 (a) SEC 미세유체 장치를 사용하여 테스트 샘플을 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 기술에 적용하되, 상기 테스트 샘플은 하나 이상의 생체분자 및 카오트로픽제를 포함하고, 상기 SEC 미세유체 장치는 복수의 상호연결된 채널을 포함하는 것인, 단계; (b) SEC 미세유체 장치로부터 용출된 복수의 분획을 수집하는 단계; (c) SEC 미세유체 장치로부터의 복수의 분획 중 하나 이상을 단백질분해 기술에 적용하는 단계; 및 (d) 개별적으로 단계 (b) 및 (c) 중 하나 또는 둘 다로부터의 하나 이상의 분획을 질량 분광계에 도입하기 위한 하나 이상의 분획 각각의 구성요소를 제조하는 조건 하에 RPLC 미세유체 장치를 사용하여 역상 액체 크로마토그래피(RPLC) 기술에 적용하되, 상기 RPLC 미세유체 장치 역상 매질을 포함하는 복수의 상호연결된 채널을 포함하고, 상기 RPLC 미세유체 장치는 전기분무 이온화 소스에 결합되는 것인, 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 테스트 샘플 생물학적 샘플. 일부 구현예에서, 테스트 샘플은 개체로부터의 것이다. 일부 구현예에서, 테스트 샘플은 약 5 M 내지 약 8 M의 카오트로픽제의 농도를 갖는다. 일부 구현예에서, 카오트로픽제는 구아니딘 또는 이의 염, 구아니디늄 또는 이의 염, 칼륨 또는 이의 염, 리튬 또는 이의 염, 마그네슘 또는 이의 염, 또는 나트륨 또는 이의 염을 포함한다. 일부 구현예에서, 카오트로픽제는 구아니딘 하이드로클로라이드 또는 구아니디늄 클로라이드이다. 일부 구현예에서, 테스트 샘플 내 카오트로픽제는 액체 고정액으로부터 유래한다.
일부 구현예에서, 테스트 샘플은 약 5% 내지 약 40%의 점도 개질제의 농도를 갖는다. 일부 구현예에서, 점도 개질제는 글리세롤이다. 일부 구현예에서, 테스트 샘플은 적어도 약 6 M 구아니딘 및 약 10% 내지 약 30% 글리세롤을 포함한다.
일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치를 사용하여 SEC 기술에 적용된 테스트 샘플은 약 1 μL 내지 약 200 μL의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, SEC 기술의 이동상 카오트로픽제의 농도 범위는 테스트 샘플의 카오트로픽제의 미리 결정된 농도의 약 +/- 40% 이내이다. 일부 구현예에서, SEC 기술은 테스트 샘플 내 카오트로픽제의 범위 내에서 이동상 카오트로픽제의 농도를 갖는 SEC 이동상의 사용을 포함한다.
일부 구현예에서, SEC 기술의 이동상 카오트로픽제는 테스트 샘플의 카오트로픽제와 동일하다. 일부 구현예에서, SEC 기술의 이동상 카오트로픽제는 테스트 샘플의 카오트로픽제와 상이하다.
일부 구현예에서, SEC 이동상은 약 4 M 내지 약 8 M의 농도의 이동상 카오트로픽제를 포함한다. 일부 구현예에서, SEC 기술의 이동상 카오트로픽제는 구아니딘 또는 이의 염, 구아니디늄 또는 이의 염, 리튬 또는 이의 염, 마그네슘 또는 이의 염, 또는 나트륨 또는 이의 염을 포함한다. 일부 구현예에서, SEC 기술의 이동상 카오트로픽제는 구아니딘 하이드로클로라이드, 구아니디늄 클로라이드, 구아니디늄 티오시난트, 리튬 퍼클로레이트, 리튬 아세테이트, 마그네슘 클로라이드, 칼륨 아세테이트, 및 나트륨 요오다이드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, SEC 이동상은 이동상 점도 개질제를 포함한다. 일부 구현예에서, SEC 기술의 이동상 점도 개질제는 약 5% 내지 약 40%의 농도를 갖는다. 일부 구현예에서, 점도 개질제는 글리세롤이다. 일부 구현예에서, SEC 기술의 이동상 점도 개질제는 액체 고정액의 점도 개질제와 동일하다. 일부 구현예에서, SEC 기술의 이동상 점도 개질제는 액체 고정액의 점도 개질제와 상이하다. 일부 구현예에서, 테스트 샘플은 적어도 약 6 M 구아니딘 및 약 10% 내지 약 30% 글리세롤을 포함한다.
일부 구현예에서, SEC 기술은 등용매 SEC 기술이다. 일부 구현예에서, SEC 기술은 약 1 μL/ 분 내지 약 5 μL/ 분의 이동상 유속의 사용을 포함한다.
일부 구현예에서, SEC 기술은 고온에서 수행된다. 일부 구현예에서, SEC 기술은 약 45℃ 내지 약 60℃의 온도에서 수행된다. 일부 구현예에서, SEC 기술은 실질적으로 일관된 온도에서 수행된다.
일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치는 SEC 매질을 포함한다. 일부 구현예에서, SEC 매질은 약 10 nm 내지 약 500 nm의 평균 기공 크기를 갖는 물질이다. 일부 구현예에서, SEC 매질은 복수의 상호연결된 채널 각각의 내부 표면이다. 일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널의 내부 표면 물질은 약 0.5 μm 내지 약 2 μm의 두께를 갖는다.
일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널은 개방 관형 형식으로 구성된다. 일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널은 8 개 이상의 채널을 포함한다. 일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널은 32 개의 채널을 포함한다. 일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널은 64 개의 채널을 포함한다.
일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각은 연결 채널의 상류 네트워크를 통해 SEC 미세유체 장치의 입력 포트와 유체 연통(fluidic communication)한다. 일부 구현예에서, 연결 채널의 상류 네트워크, 또는 이의 부분은 복수의 상호연결된 채널 각각의 근위 영역(proximal region)에 연결된다. 일부 구현예에서, 연결 채널의 상류 네트워크는 SEC 미세유체 장치의 입력 포트로부터 복수의 상호연결된 채널 각각으로 유체 유동을 분할하도록 구성된 일련의 발산 채널(diverging channel)을 포함한다.
일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각은 연결 채널의 하류 네트워크를 통해 SEC 미세유체 장치의 출력 포트와 유체 연통한다. 일부 구현예에서, 연결 채널의 하류 네트워크, 또는 이의 부분은 복수의 상호연결된 채널 각각의 원위 영역(distal region)에 연결된다. 일부 구현예에서, 연결 채널의 하류 네트워크는 유체 유동을 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널로부터 출력 포트로 조합하도록 구성된 일련의 수렴 채널(converging channel)을 포함한다. 일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널은 연결 채널의 상류 네트워크 또는 연결 채널의 하류 네트워크를 통해서만 연결된다.
일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각은 약 2 cm 내지 약 50 cm의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각은 약 1 μm 내지 약 15 μm의 폭을 갖는다.
일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각은 약 1 μm 내지 약 15 μm의 깊이를 갖는다.
일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널은 기둥 배열을 통해 형성된다. 일부 구현예에서, 기둥 배열은 무정형 기둥 배열이다. 일부 구현예에서, 기둥 배열은 비-무정형 기둥 배열이다. 일부 구현예에서, 기둥 배열은 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각의 내부 표면을 형성한다.
일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치는 석영 기판을 포함한다. 일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치는 복수의 상호연결된 채널을 형성하는 모놀리식(monolithic) 기판을 포함한다. 일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치는 석영 모놀리식 기판을 포함한다.
일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치는 3차원(3D) 인쇄 기판을 포함한다.
일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치로부터 용출된 복수의 분획을 수집하는 것은 분획 수집기를 사용하여 수행된다. 일부 구현예에서, 복수의 분획 각각은 시간에 기반하여 SEC 미세유체 장치로부터 수집된다. 일부 구현예에서, 복수의 분획 각각은 약 30 초 내지 약 5 분의 기간 동안 SEC 미세유체 장치로부터 수집된다. 일부 구현예에서, 복수의 분획 각각은 균일한 시간 동안 SEC 미세유체 장치로부터 수집된다. 일부 구현예에서, 복수의 분획 중 일부는 복수의 분획 중 또 다른 분획과 상이한 시간 동안 SEC 미세유체 장치로부터 수집된다.
일부 구현예에서, 복수의 분획 각각은 SEC 미세유체 장치로부터의 용출액의 부피에 기반하여 SEC 미세유체 장치로부터 수집된다. 일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치로부터 수집된 복수의 분획 각각은 약 1 μL 내지 약 20 μL의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치로부터 수집된 복수의 분획은 균일한 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치로부터 수집된 복수의 분획 중 일부는 복수의 분획 중 또 다른 분획과 상이한 부피를 갖는다.
일부 구현예에서, 복수의 분획은 약 5 내지 약 50 개의 분획이다. 일부 구현예에서, 복수의 분획은 약 12 내지 약 24 개의 분획이다.
일부 구현예에서, 단백질분해 기술은 효소-기반 분해(digestion) 기술을 포함한다. 일부 구현예에서, 효소-기반 분해 기술은 트립신, 키모트립신, 펩신, LysC, LysN, AspN, GluC 및 ArgC, 또는 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 효소의 사용을 포함한다.
일부 구현예에서, 효소-기반 분해 기술은 SEC 미세유체 장치로부터 용출된 분획을 희석하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 희석 단계는 SEC 미세유체 장치로부터 용출된 분획을 물과 혼합하여 카오트로픽제의 농도에 도달하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 효소적 분해를 위한 카오트로픽제 농도의 최종 농도는 약 0.5 M이다.
일부 구현예에서, 효소-기반 분해 기술은 완충액 교환 단계를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 효소-기반 분해 기술은 알킬화 단계를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 효소-기반 분해 기술은 환원 단계를 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 단백질분해 기술은 비-효소-기반 접근법을 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 SEC 미세유체 장치로부터의 복수의 분획 중 하나 이상 및/또는 단백질분해 기술에 적용된 복수의 분획 중 하나 이상을 정량적 표지화 기술에 적용하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 정량적 표지화 기술은 RPLC 미세유체 장치를 사용하여 역상 액체 크로마토그래피(RPLC) 기술 전에 수행된다.
일부 구현예에서, 정량적 표지화 기술은 등압 질량 태그의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 정량적 표지화 기술은 탠덤 질량 태그(TMT)의 사용을 포함한다.
일부 구현예에서, 정량적 표지화 기술은 탈염 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 내부 표준을 SEC 미세유체 장치로부터의 복수의 분획 중 하나 이상 및/또는 단백질분해 기술에 적용된 복수의 분획 중 하나 이상과 혼합하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 내부 표준의 혼합 단게는 RPLC 미세유체 장치를 사용하여 역상 액체 크로마토그래피(RPLC) 기술 전에 수행된다. 일부 구현예에서, 내부 표준은 동위원소 표지된 펩티드이다.
일부 구현예에서, RPLC 기술에 적용된 하나 이상의 분획은 (i) SEC 미세유체 장치로부터 수득된 0 개 이상의 분획; 및 (ii) 단백질분해 기술에 적용된 복수의 분획 중 하나 이상으로부터 수득된 하나 이상의 분획, 또는 이의 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, RPLC 기술에 적용된 하나 이상의 분획 각각은 수용액과 혼합된 기원의 각각의 분획을 포함한다.
일부 구현예에서, RPLC 기술에 적용된 분획은 약 1 μL 내지 약 50 μL의 부피를 갖는다.
일부 구현예에서, RPLC 기술은 RPLC 이동상의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, RPLC 기술은 약 0.05 μL/ 분 내지 약 2 μL/ 분의 RPLC 이동상의 이동상 유속을 포함한다. 일부 구현예에서, RPLC 기술은 구배 RPLC 기술이다.
일부 구현예에서, RPLC 기술은 고온에서 수행된다. 일부 구현예에서, RPLC 기술은 약 30℃ 내지 약 100℃의 온도에서 수행된다. 일부 구현예에서, RPLC 기술은 실질적으로 일관된 온도에서 수행된다.
일부 구현예에서, 역상 매질은 다음 알킬 모이어티 중 2 개 이상을 포함하는 RPLC 모이어티 혼합물을 포함한다: C2, C4, C8, 및 C18. 일부 구현예에서, RPLC 모이어티 혼합물은 다음 알킬 모이어티 중 3 개 이상을 포함한다: C2, C4, C8, 및 C18. 일부 구현예에서, RPLC 모이어티 혼합물은 다음 알킬 모이어티를 포함한다: C2, C4, C8, 및 C18. 일부 구현예에서, RPLC 모이어티 혼합물의 알킬 모이어티는 등몰량으로 존재한다.
일부 구현예에서, RPLC 모이어티 혼합물의 알킬 모이어티는 RPLC 미세유체 장치의 상호연결된 복수의 채널 각각의 표면에 공유적으로 결합된다. 일부 구현예에서, 상호연결된 복수의 채널 각각의 표면은 실리카(SiO2)를 포함한다.
일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널은 8 개 이상의 채널을 포함한다. 일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널은 32 개의 채널을 포함한다. 일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널은 64 개의 채널을 포함한다.
일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각은 연결 채널의 상류 네트워크를 통해 RPLC 미세유체 장치의 입력 포트와 유체 연통한다. 일부 구현예에서, 연결 채널의 상류 네트워크, 또는 이의 부분은 복수의 상호연결된 채널 각각의 근위 영역에 연결된다. 일부 구현예에서, 연결 채널의 상류 네트워크는 RPLC 미세유체 장치의 입력 포트로부터 복수의 상호연결된 채널 각각으로 유체 유동을 분할하도록 구성된 일련의 발산 채널을 포함한다.
일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각은 연결 채널의 하류 네트워크를 통해 RPLC 미세유체 장치의 출력 포트와 유체 연통한다. 일부 구현예에서, 연결 채널의 하류 네트워크, 또는 이의 부분은 복수의 상호연결된 채널 각각의 원위 영역에 연결된다. 일부 구현예에서, 연결 채널의 하류 네트워크는 유체 유동을 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널로부터 출력 포트로 조합하도록 구성된 일련의 수렴 채널을 포함한다. 일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널은 연결 채널의 상류 네트워크 또는 연결 채널의 하류 네트워크를 통해서만 연결된다.
일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각은 약 2 cm 내지 약 50 cm의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각은 약 1 μm 내지 약 15 μm의 폭을 갖는다. 일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각은 약 1 μm 내지 약 15 μm의 깊이를 갖는다.
일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널은 기둥 배열을 통해 형성된다. 일부 구현예에서, 기둥 배열은 무정형 기둥 배열이다. 일부 구현예에서, 기둥 배열은 비-무정형 기둥 배열이다. 일부 구현예에서, 기둥 배열은 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각의 내부 표면을 포함하여 형성된다.
일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치는 온라인 전환 특징부를 포함한다. 일부 구현예에서, 온라인 전환 특징부는 밸브 및/또는 채널이다. 일부 구현예에서, 온라인 전환 특징부는 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널과 전기분무 이온화 장치 사이에 위치한다.
일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치는 석영 기판을 포함한다. 일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치는 복수의 상호연결된 채널을 형성하는 모놀리식 기판을 포함한다. 일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치는 석영 모놀리식 기판을 포함한다.
일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치는 3차원(3D) 인쇄 기판을 포함한다.
일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치는 개방 관형 형식으로 구성된다.
일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치는 온라인 탈염을 위해 구성된다.
일부 구현예에서, 전기분무 이온화 소스는 나노-전기분무 이온화 소스이다. 일부 구현예에서, 전기분무 이온화 소스는 가열된 전기분무 이온화 소스이다.
일부 구현예에서, 샘플은 혈액 샘플, 뇌척수액(CSF) 샘플, 복수 샘플, 정액 샘플, 및 유두 흡입액 샘플로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 샘플은 약 10 μL 내지 약 200 μL의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 샘플은 혈액 샘플이다.
일부 구현예에서, 개체로부터의 샘플이 혈액 샘플일 때, 방법은 혈장 샘플을 제조하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 혈장 샘플을 제조하는 것은 혈액 샘플을 혈장 생성 기술에 적용하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 혈장 생성 기술은 샘플을 폴리술폰 매질에 적용하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리술폰 매질은 비대칭 폴리술폰 물질이다.
일부 구현예에서, 혈장 생성 기술은 모세관 작용 여과 기술이다. 일부 구현예에서, 혈장 생성 기술에 적용된 혈액 샘플의 부피는 약 10 μL 내지 약 200 μL이다.
일부 구현예에서, 방법은 생성된 혈장 샘플을 액체 고정액과 혼합하여 테스트 샘플을 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 테스트 샘플은 테스트 샘플을 SEC 기술에 적용하기 전에 추가로 고갈되지 않는다.
일부 구현예에서, 혈장 생성 기술은 주위 온도에서 수행된다.
일부 구현예에서, 샘플은 혈장 생성 기술 전에 고갈 단계에 적용되지 않았다.
일부 구현예에서, 방법은 RPLC 미세유체 장치로부터 용출된 구성요소, 또는 이의 생성물을 질량 분광계에 적용하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 질량 분광계를 사용하여 샘플의 구성요소, 또는 이의 생성물의 질량 분광법 분석을 수행하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 질량 분광법 분석은 RPLC 미세유체 장치를 사용하여 RPLC 기술에 적용된 각 분획의 분석을 포함한다. 일부 구현예에서, 질량 분광법 분석은 RPLC 미세유체 장치를 사용하여 RPLC 기술에 적용된 각 분획에 대한 질량 분광계로부터 수득된 정보를 포함하는 하나 이상의 데이터 세트를 수득하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 단일 데이터 세트는 RPLC 미세유체 장치를 사용하여 RPLC 기술에 적용된 단일 분획으로부터 질량 분광계로부터 수득된 정보를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 데이터 세트 각각은 질량 분광계에 도입된 구성요소, 또는 이의 생성물의 이온에 대한 질량 대 전하(m/z) 및 존재비 정보를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 방법으로부터 수득된 조성물 집합의 각각의 조성물은 RPLC 미세유체 장치 용출액이다.
일부 측면에서, 본원에는 조성물을 분석하는 방법이 제공되며, 방법은 (a) 조성물을 질량 분광계에 적용하는 단계; 및 (b) 조성물의 질량 분광법 분석을 수행하는 단계를 포함하고, 상기 조성물은 SEC 미세유체 장치의 사용을 포함하는 SEC 기술을 사용하여 샘플의 분획화 후 각 분획, 또는 이의 생성물을 RPLC 기술에 적용하는 것을 포함하는 처리 기술로부터 수득된다.
일부 측면에서, 본원에는 질량 분광법을 사용하여 조성물 집합을 분석하는 방법이 제공되며, 방법은 (a) 조성물 집합의 각 조성물을 질량 분광계에 적용하는 단계; 및 (b) 조성물 집합의 각 조성물의 질량 분광법 분석을 수행하는 단계를 포함하며, 상기 조성물 집합은 SEC 미세유체 장치의 사용을 포함하는 SEC 기술을 사용하여 테스트 샘플의 분획화 후 각 분획, 또는 이의 생성물을 RPLC 미세유체 장치의 사용을 포함하는 RPLC 기술에 적용하는 것을 포함하는 처리 기술로부터 수득된다.
일부 구현예에서, SEC 분획은 단백질분해 기술을 통해 추가로 처리된다.
일부 구현예에서, 방법은 하나 이상의 데이터 세트 중 적어도 하나에 기반하여, 테스트 샘플에서 복수의 하나 이상의 생체분자 각각의 정체성을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 하나 이상의 데이터 세트 중 적어도 하나에 기반하여, 테스트 샘플에서 복수의 하나 이상의 생체분자 각각의 양을 측정하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 결정된 정체성으로부터 하나 이상의 식별된 생체분자를 포함하는 서명을 식별하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 식별 단계는 하나 이상의 식별된 생체분자의 측정량에 기반하여 하나 이상의 식별된 생체분자의 하위집합을 선택하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 식별된 생체분자의 하위집합은 참조 샘플과 비교하여 하나 이상의 식별된 생체분자의 차등 측정량에 기반하여 선택된다.
일부 구현예에서, 방법은 하나 이상의 식별된 생체분자를 포함하는 서명을 식별하는 단계를 추가로 포함하며, 식별 단계는 하나 이상의 데이터 세트 중 적어도 하나에 기반하여, 테스트 샘플에서 복수의 하나 이상의 생체분자 각각의 양을 측정하고; 측정량에 기반하여 샘플에서 복수의 하나 이상의 생체분자의 하위집합을 선택하고; 테스트 샘플에서 복수의 하나 이상의 생체분자의 하위집합 각각의 정체성을 결정하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 테스트 샘플에서 복수의 하나 이상의 생체분자의 하위집합은 참조 샘플과 비교하여 테스트 샘플에서 복수의 하나 이상의 생체분자의 차등 측정량에 기반하여 선택된다. 일부 구현예에서, 테스트 샘플은 병을 앓는 대상체로부터의 샘플이고 참조 샘플은 건강한 대상체 또는 대조군 대상체로부터의 샘플이다. 일부 구현예에서, 테스트 샘플은 질환과 관련된 이전 병태를 가진 대상체로부터의 샘플이고 참조 샘플은 건강한 대상체 또는 대조군 대상체로부터의 샘플이다. 일부 구현예에서, 테스트 샘플은 활성 상태의 질환을 앓는 대상체로부터의 샘플이고 참조 샘플은 비활성 상태의 질환을 앓는 대상체로부터의 샘플이며, 임의적으로 상기 비활성 상태는 관해이다. 일부 구현예에서, 테스트 샘플은 진행된 단계의 질환을 앓고 있는 대상체로부터의 샘플이고 참조 샘플은 초기 단계의 질환을 앓고 있는 대상체로부터의 샘플이다.
일부 구현예에서, 복수의 식별된 생체분자 또는 이의 하위집합을 포함하는 서명은 본원에 기재된 방법에 의해 식별된다. 일부 구현예에서, 식별된 생체분자의 하위집합을 포함하는 서명은 본원에 기재된 방법에 의해 식별된다.
일부 구현예에서, 방법은 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스, 경로 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스, 및/또는 네트워크 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스에 대한 입력물로서 서명의 식별된 생체분자의 전부 또는 하위집합을 제공하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 샘플의 생체분자를 분석하는 방법은 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스, 경로 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스, 및/또는 네트워크 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스에 대한 입력물로서 서명의 식별된 생체분자를 제공하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 서명의 하나 이상의 분자 유형의 식별된 생체분자는 입력물로서 제공된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 분자 유형은 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 분자 유형은 단백질로만 이루어진다.
일부 측면에서, 본원에는 유전자 농축 분석, 경로 분석, 및 네트워크 분석을 임의의 순서로 수행하는 단계를 포함하는, 식별된 구성요소의 서명을 분석하는 방법이 제공되며, 상기 식별된 구성요소의 서명은 단백질 세트, 전사체 세트, 펩티드 세트, 및/또는 대사물 세트를 포함하고; 수행 단계는 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 프로세스; 경로 분석을 수행하도록 구성된 프로세스; 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 프로세스; 및 네트워크 분석을 수행하여 약물 표적을 식별하도록 구성된 프로세스를 포함한다.
일부 구현예에서, 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스는 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 유전자 온톨로지(ontology)를 식별하도록 구성된 프로세스를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스는 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 세포 구성요소 유전자 온톨로지를 식별하도록 구성된 프로세스; 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 분자 경로 유전자 온톨로지를 식별하도록 구성된 프로세스; 및/또는 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 생물학적 프로세스 유전자 온톨로지를 식별하도록 구성된 프로세스를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스는 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나의 하나 이상의 조절자를 식별하도록 구성된 프로세스를 포함한다.
일부 구현예에서, 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스는 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나를 조절하는 하나 이상의 전사 인자를 식별하도록 구성된 프로세스; 및/또는 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나를 조절하는 하나 이상의 키나제를 식별하도록 구성된 프로세스를 포함한다.
일부 구현예에서, 경로 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스는 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 경로를 식별하도록 구성된 프로세스를 포함한다. 일부 구현예에서, 경로 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스는 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 분자 경로를 식별하도록 구성된 프로세스; 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 신호전달 경로를 식별하도록 구성된 프로세스; 및/또는 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 대사 경로를 식별하도록 구성된 프로세스를 포함한다.
일부 구현예에서, 네트워크 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스는 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 네트워크를 식별하도록 구성된 프로세스를 포함한다. 일부 구현예에서, 네트워크 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스는 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 분자 경로를 식별하도록 구성된 프로세스; 및/또는 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 신호전달 경로를 식별하도록 구성된 프로세스를 포함한다.
일부 구현예에서, 네트워크 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스는 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 네트워크의 하나 이상의 허브를 식별하도록 구성된 프로세스를 포함한다. 일부 구현예에서, 네트워크 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스는 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나를 각각 표적하는 하나 이상의 약물을 식별하도록 구성된 프로세스를 포함하며, 임의적으로 상기 프로세스는 입력물로서 제공된 서명의 복수의 식별된 생체분자를 포함하는 네트워크의 적어도 하나의 허브를 각각 표적하는 하나 이상의 약물을 식별하도록 구성된다. 일부 구현예에서, 네트워크 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스는 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나를 각각 표적하는 하나 이상의 약물을 식별하도록 구성된 2 개의 프로세스를 포함하며, 임의적으로 상기 2 개의 프로세스는 입력물로서 제공된 서명의 복수의 식별된 생체분자를 포함하는 네트워크의 적어도 하나의 허브를 각각 표적하는 하나 이상의 약물을 식별하도록 구성된다.
일부 측면에서, 본원에는 유전자 농축 분석, 경로 분석, 또는 네트워크 분석을 수행하도록 각각 구성된 복수의 프로세스 각각에 복수의 식별된 생체분자를 제공하는 단계를 포함하는, 식별된 생체분자의 서명을 분석하는 방법이 제공되며, 상기 제공 단계는 임의의 순서로 수행되고; 복수의 식별된 생체분자는 단백질 세트, 전사체 세트, 펩티드 세트, 및/또는 대사물 세트를 포함하고; 복수의 프로세스는 입력물로서 제공된 복수의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 유전자 온톨로지를 식별하기 위해 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 프로세스; 입력물로서 제공된 복수의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 신호전달 경로를 식별하기 위해 경로 분석을 수행하도록 구성된 프로세스; 입력물로서 제공된 복수의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나를 조절하는 하나 이상의 전사 인자를 식별하기 위해 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 프로세스; 입력물로서 제공된 복수의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나의 유전자 산물을 조절하는 하나 이상의 키나제를 식별하기 위해 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 프로세스; 입력물로서 제공된 복수의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 네트워크를 식별하기 위해 네트워크 분석을 수행하도록 구성된 프로세스; 및 입력물로서 제공된 복수의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나를 각각 표적하는 하나 이상의 약물을 식별하기 위해 네트워크 분석을 수행하도록 구성된 2 개의 프로세스 각각을 포함한다.
일부 측면에서, 본원에는 유전자 농축 분석, 경로 분석, 또는 네트워크 분석을 수행하도록 각각 구성된 복수의 프로세스 각각에 복수의 단백질을 제공하는 단계를 포함하는, 단백질 서명을 분석하는 방법이 제공되며, 상기 제공 단계는 임의의 순서로 수행되고, 복수의 프로세스는 입력물로서 제공된 복수의 단백질 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 유전자 온톨로지를 식별하기 위해 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 프로세스; 입력물로서 제공된 복수의 단백질 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 신호전달 경로를 식별하기 위해 경로 분석을 수행하도록 구성된 프로세스; 입력물로서 제공된 복수의 단백질 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나를 조절하는 하나 이상의 전사 인자를 식별하기 위해 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 프로세스; 입력물로서 제공된 복수의 단백질 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나의 유전자 산물을 조절하는 하나 이상의 키나제를 식별하기 위해 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 프로세스; 입력물로서 제공된 복수의 단백질 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 네트워크를 식별하기 위해 네트워크 분석을 수행하도록 구성된 프로세스; 및 입력물로서 제공된 복수의 단백질 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나를 각각 표적하는 하나 이상의 약물을 식별하기 위해 네트워크 분석을 수행하도록 구성된 2 개의 프로세스 각각을 포함한다.
일부 측면에서, 본원에는 입력 포트; 연결 채널의 상류 네트워크; 및 복수의 상호연결된 채널을 포함하는 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 미세유체 장치가 제공되며, 상기 복수의 상호연결된 채널의 각 채널은 개방 관형 형식이고, 상기 복수의 상호연결된 채널의 각 채널은 SEC 매질을 포함하는 내부 표면을 포함하고, 상기 복수의 상호연결된 채널의 각 채널은 연결 채널의 상류 네트워크를 통해 입력 포트와 유체 연통한다.
일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 SEC 매질을 포함하는 내부 표면은 약 0.5 μm 내지 약 2 μm의 두께를 갖는다. 일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 SEC 매질은 약 10 nm 내지 약 500 nm의 평균 기공 크기를 갖는 물질이다.
일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널은 8 내지 100 개의 상호연결된 채널을 포함한다. 일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널은 8 개 이상의 상호연결된 채널을 포함한다. 일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널은 32 개의 상호연결된 채널을 포함한다. 일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널은 64 개의 상호연결된 채널을 포함한다.
일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 연결 채널의 상류 네트워크, 또는 이의 부분은 복수의 상호연결된 채널 각각의 근위 영역에 연결된다. 일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 연결 채널의 상류 네트워크는 SEC 미세유체 장치의 입력 포트로부터 복수의 상호연결된 채널 각각으로 유체 유동을 분할하도록 구성된 일련의 발산 채널을 포함한다. 일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각은 연결 채널의 하류 네트워크를 통해 SEC 미세유체 장치의 출력 포트와 유체 연통한다. 일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 연결 채널의 하류 네트워크는 유체 유동을 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널로부터 출력 포트로 조합하도록 구성된 일련의 수렴 채널을 포함한다.
일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각은 약 2 cm 내지 약 50 cm의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각은 약 1 μm 내지 약 15 μm의 폭을 갖는다. 일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각은 약 1 μm 내지 약 15 μm의 깊이를 갖는다.
일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널은 기둥 배열을 통해 형성된다. 일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 기둥 배열은 무정형 기둥 배열이다. 일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 기둥 배열은 비-무정형 기둥 배열이다. 일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 기둥 배열은 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각의 내부 표면을 형성한다.
일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치는 석영 기판을 포함한다. 일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치는 복수의 상호연결된 채널을 형성하는 모놀리식 기판을 포함한다. 일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치는 석영 모놀리식 기판을 포함한다.
일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치는 3차원(3D) 인쇄 기판을 포함한다.
일부 측면에서, 본원에는 입력 포트; 연결 채널의 상류 네트워크; 및 복수의 상호연결된 채널을 포함하는 역상 액체 크로마토그래피(RPLC) 미세유체 장치가 제공되며, 상기 복수의 상호연결된 채널의 각 채널은 개방 관형 형식이고, 상기 복수의 상호연결된 채널의 각 채널은 RPLC 매질을 포함하는 내부 표면을 포함하고, 상기 복수의 상호연결된 채널의 각 채널은 연결 채널의 상류 네트워크를 통해 입력 포트와 유체 연통한다.
일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 RPLC 매질은 약 2 내지 약 20 개의 탄소를 갖는 알킬 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 RPLC 매질은 C2, C4, C8, 및 C18 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 RPLC 매질은 다음 알킬 모이어티 중 2 개 이상을 포함하는 RPLC 모이어티 혼합물을 포함한다: C2, C4, C8, 및 C18. 일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 RPLC 모이어티 혼합물은 다음 알킬 모이어티 중 3 개 이상을 포함한다: C2, C4, C8, 및 C18. 일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 RPLC 모이어티 혼합물은 다음 알킬 모이어티를 포함한다: C2, C4, C8, 및 C18. 일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 RPLC 모이어티 혼합물의 알킬 모이어티는 등몰량으로 존재한다.
일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 RPLC 매질은 실리카(SiO2)를 통해 복수의 상호연결된 채널의 각 채널의 내부 표면에 접합된다. 일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널은 8 내지 100 개의 상호연결된 채널을 포함한다. 일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널은 8 개 이상의 상호연결된 채널을 포함한다. 일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널은 32 개의 상호연결된 채널을 포함한다. 일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널은 64 개의 상호연결된 채널을 포함한다.
일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 연결 채널의 상류 네트워크, 또는 이의 부분은 복수의 상호연결된 채널 각각의 근위 영역에 연결된다. 일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 연결 채널의 상류 네트워크는 RPLC 미세유체 장치의 입력 포트로부터 복수의 상호연결된 채널 각각으로 유체 유동을 분할하도록 구성된 일련의 발산 채널을 포함한다.
일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각은 연결 채널의 하류 네트워크를 통해 RPLC 미세유체 장치의 출력 포트와 유체 연통한다. 일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 연결 채널의 하류 네트워크는 유체 유동을 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널로부터 출력 포트로 조합하도록 구성된 일련의 수렴 채널을 포함한다.
일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각은 약 2 cm 내지 약 50 cm의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각은 약 1 μm 내지 약 15 μm의 폭을 갖는다. 일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각은 약 1 μm 내지 약 15 μm의 깊이를 갖는다.
일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널은 기둥 배열을 통해 형성된다. 일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 기둥 배열은 무정형 기둥 배열이다. 일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 기둥 배열은 비-무정형 기둥 배열이다. 일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 기둥 배열은 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각의 내부 표면을 형성한다.
일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치는 석영 기판을 포함한다. 일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치는 복수의 상호연결된 채널을 형성하는 모놀리식 기판을 포함한다. 일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치는 석영 모놀리식 기판을 포함한다.
일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치는 3차원(3D) 인쇄 기판을 포함한다.
다른 측면에서, 본원에는 유전자 농축 분석, 경로 분석, 및 네트워크 분석을 임의의 순서로 수행하는 단계를 포함하는, 식별된 구성요소의 서명을 분석하는 방법이 제공되며, 상기 식별된 구성요소의 서명은 단백질 세트, 전사체 세트, 펩티드 세트, 및/또는 대사물 세트를 포함하고; 수행 단계는 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 프로세스; 경로 분석을 수행하도록 구성된 프로세스; 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 프로세스; 및 네트워크 분석을 수행하여 약물 표적을 식별하도록 구성된 프로세스를 포함한다.
다른 측면에서, 본원에는 개체에게 관상 동맥 질환(CAD) 진단 결정을 내리게 하는 방법이 제공되며, 방법은 (a) 개체로부터 수득된 샘플, 또는 이의 유도체로부터 질량 분광법(MS) 데이터를 수득하는 단계; 및 (b) CAD 단백체 서명에 따라 MS 데이터를 분석하되, 상기 CAD 단백체 서명은 표 1의 하나 이상의 바이오마커를 포함하는 것인, 단계; 및 (c) 개체가 CAD 단백체 서명을 갖는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 개체가 CAD 단백체 서명을 갖는 경우, 개체가 CAD를 앓는 것으로 진단된다.
다른 측면에서, 본원에는 개체가 관상 동맥 질환(CAD)을 앓는 것으로 진단하는 방법이 제공되며, 방법은 (a) 개체로부터 수득된 샘플, 또는 이의 유도체로부터 질량 분광법(MS) 데이터를 수득하는 단계; 및 (b) CAD 단백체 서명에 따라 MS 데이터를 분석하되, 상기 CAD 단백체 서명은 표 1의 하나 이상의 바이오마커를 포함하는 것인, 단계; 및 (c) CAD 단백체 서명의 존재에 기반하여 개체가 CAD를 앓는 것으로 진단하는 단계를 포함한다.
다른 측면에서, 본원에는 관상 동맥 질환(CAD)을 앓는 개체를 치료하는 방법이 제공되며, 방법은 (a) 개체로부터 수득된 샘플, 또는 이의 유도체에서 CAD 단백체 서명의 존재에 따라 개체가 CAD를 앓는 것으로 진단하되, 상기 CAD 단백체 서명은 표 1의 하나 이상의 바이오마커를 포함하는 것인, 단계; 및 (b) 개체에게 CAD 치료를 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, CAD 단백체 서명의 존재는 CAD 단백체 서명에 따라 MS 데이터를 분석함으로써 결정된다.
일부 구현예에서, 방법은 개체로부터 수득된 샘플, 또는 이의 유도체로부터 MS 데이터를 수득하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, CAD 치료는 생활 방식 조정을 포함한다. 일부 구현예에서, CAD 치료는 약제학적 개입을 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 개입은 칼슘 채널 차단제, 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 억제제(예컨대 HDAC6), Ca2+/칼모듈린(CaM)-의존적 단백질 키나제 II(CaMK II) 억제제, 구아닐릴 사이클라제(sGC) 활성제, MMP 억제제, 스타틴, 및 항고혈압제로 이루어진 군으로부터 선택된 약물의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 개입은 암로디핀, 투바스타틴-a, 포르스콜린, 트리코스타틴 A, KN-93, CFM-1571, 일로마스타트, CAY-10603, 및 로수바스타틴, 또는 이의 약제학적 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 약물을 포함한다. 일부 구현예에서, 약물은 BRD-K52306726, BRD-K71361154, 아세타졸아미드, 롤리프람, 룩솔리티닙, BRD-A59808129-001-01-7, BRD-K76876037, ZM336372, 트레할로스, SCHEMBL3092652, BMS-387032, BRD-K01425431, 4-하이드록시-레티노산, CHEMBL585951, CHEMBL1673039, HY-11007, 프리미돈, BRD-K81417919, SPECTRUM_000826, 타목시펜, BRD-K00544996, CID 67066889, CX-5461, BRD-K63944563, SCHEMBL6851809, BRD-A86146706, FR-180204, CHEMBL552425, 헥사클로로펜, Aggc, SUGA1_008424, BRD-K96640811, 아나스트로졸, 워트만닌, 반데타닙, AC1NWALF, OTSSP167, WZ3105, 디하이드로에르고타민, BRD-K99839793, SR 33805 옥살레이트, AT-7519, 술파독신, SPECTRUM_001319, MLS003329219, 트리코스타틴 A, 및 로테논, 또는 이의 약제학적 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 측면에서, 개체의 관상 동맥 질환(CAD) 단백체 서명을 검출하기 위한 방법이 제공되며, (a) 개체로부터 수득된 샘플, 또는 이의 유도체로부터 질량 분광법(MS) 데이터를 수득하는 단계; 및 (b) CAD 단백체 서명에 따라 MS 데이터를 분석하여 CAD 단백체 서명을 검출하되, 상기 CAD 단백체 서명은 표 1의 하나 이상의 바이오마커를 포함하는 것인 단계. 일부 구현예에서, 개체가 CAD를 앓는 것으로 의심된다.
일부 구현예에서, CAD 단백체 서명은 참조와 비교하여, 표 1에 따른 하나 이상의 바이오마커의 발현 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, CAD 단백체 서명은 참조와 비교하여, 표 1에 따른 하나 이상의 바이오마커의 발현 감소를 포함한다.
일부 구현예에서, CAD 단백체 서명은 칼슘 신호전달 경로, 히스톤 조절, HIF-1 신호전달 경로, cAMP 신호전달 경로, 베타-아드레날린성 신호전달 경로, PI3K-Akt 신호전달 경로, 보체 및/또는 응고 캐스케이드, 스핑고지질 신호전달 경로, 자연 살해 세포 매개 세포독성, 아디포사이토카인 신호전달 경로, DNA 손상, 칼슘 에너지, 대사체학, 세포 부착, 염증, 저산소증, 및 히스톤 메틸화와 연관된 하나 이상의 바이오마커를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 바이오마커는 전사 인자와 연관된 하나 이상의 바이오마커를 포함하는 이의 하위집합을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 바이오마커는 키나제와 연관된 하나 이상의 바이오마커를 포함하는 이의 하위집합을 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 바이오마커는 표 1의 적어도 10 개 바이오마커를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 바이오마커는 표 1의 적어도 25 개 바이오마커를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 바이오마커는 표 1의 적어도 50 개 바이오마커를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 바이오마커는 표 1의 모든 바이오마커를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 개체로부터 샘플을 수득하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 샘플, 또는 이의 유도체는 혈액 샘플 또는 이의 유도체이다. 일부 구현예에서, 샘플, 또는 이의 유도체는 혈장 샘플이다. 일부 구현예에서, 샘플, 또는 이의 유도체는 액체 고정액을 포함한다.
일부 구현예에서, 샘플, 또는 이의 유도체로부터 MS 데이터를 수득하는 단계는 질량 분광계를 사용하여 샘플, 또는 이의 유도체의 질량 분광법 분석을 수행하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 질량 분광법 분석은 질량 분광법 분석을 수행하기 위해 본원에 제공된 방법 중 임의의 것에 따라 수행된다. 일부 구현예에서, 질량 분광법 분석은 구현예 140-143의 방법에 따라 수행된다. 일부 구현예에서, CAD 단백체 서명에 따라 MS 데이터를 분석하는 단계는 구현예 161-177 중 임의의 하나의 방법에 MS 데이터를 적용하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, CAD 단백체 서명에 따라 MS 데이터를 분석하는 것은 MS 데이터에서 CAD 단백체 서명의 하나 이상의 바이오마커 각각의 존재 또는 부재 또는 수준을 평가하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 개체의 다음 인자 평가 중 하나 이상을 수행하는 단계를 추가로 포함한다: 성별, 연령, 신체질량지수(BMI), 수축기 혈압, 확장기 혈압, 총 콜레스테롤, HDL, LDL, 트리글리세리드, 고지질혈증, 고혈압, 진성 당뇨병, 인슐린 저항, 신장 질환, 흡연 상태, 신체 활동 수준, 수면 수준, 또는 영양의 질.
일부 구현예에서, 방법은 CAD의 존재를 평가하기 위해 개체에 대한 의료 절차를 수행하는 단계를 추가로 포함한다.
도 1은 샘플을 수득하고 질량 분광법을 사용하여 내부의 구성요소를 분석하기 위한 예시적인 작업 흐름(100)을 도시한다. 도 1에 도시된 바와 같이, 예시적인 작업 흐름(100)은 샘플 획득(105), 예비 샘플 처리(110), 액체 크로마토그래피 및, 임의적으로, 단백질분해(115), 질량 분광법을 위한 이온화(120), 질량 분광법 데이터 획득(125), 및 질량 분광법 데이터 분석(130)을 포함한다.
도 2는 샘플을 수득하고 질량 분광법을 사용하여 내부의 구성요소를 분석하는 예시적인 작업 흐름(200)을 도시한다. 도 2에 도시된 바와 같이, 예시적인 작업 흐름(200)은 혈액 샘플 획득(205), 혈장 생성(210), 크기 배제 크로마토그래피(215), 효소적 분해를 사용한 단백질분해(220), 질량 분광법을 위한 온라인 이온화와 결합된 역상 액체 크로마토그래피(RPLC)(225), 질량 분광법 데이터 획득(230), 및 질량 분광법 데이터 분석(235)을 포함한다.
도 3은 샘플 구성요소의 분리를 위해 구성된 예시적인 미세유체 장치(300)의 개략도를 도시한다.
도 4는 고갈되지 않은 인간 혈장의 대표적인 크기 배제 추적을 도시한다. 분획 크기는 파선을 사용하여 예시된다.
도 5는 예시적인 크기 배제 크로마토그래피 미세유체 장치의 개략도를 도시한다.
도 6은 ToppGene 소프트웨어를 사용한 292-단백질 CAD 서명의 예시적인 세포 구성요소 분석을 도시한다.
도 7은 ToppGene 소프트웨어를 사용한 292-단백질 CAD 서명의 예시적인 분자 경로 분석을 도시한다.
도 8은 292-단백질 CAD 서명의 예시적인 전사 인자 농축 분석(TFEA) 알고리즘을 도시한다.
도 9는 292-단백질 CAD 서명의 예시적인 키나제 농축 분석(KEA)을 도시한다.
도 10은 292-단백질 CAD 서명으로부터 GeneMANIA 알고리즘을 사용하여 생성된 예시적인 292-단백질 CAD 서명 상호작용 네트워크를 도시한다.
도 11은 292-단백질 CAD 서명으로부터 GeneMANIA 알고리즘을 사용하여 생성된 예시적인 CAD 보체 경로 단백질 상호작용 하위네트워크를 도시한다.
도 12는 292-단백질 CAD 서명으로부터 GeneMANIA 알고리즘을 사용하여 생성된 예시적인 CAD 히스톤 조절 단백질 상호작용 하위네트워크를 도시한다.
도 13은 292-단백질 CAD 서명으로부터 GeneMANIA 알고리즘을 사용하여 생성된 예시적인 CAD DNA 손상 단백질 상호작용 하위네트워크를 도시한다.
도 14는 292-단백질 CAD 서명으로부터 GeneMANIA 알고리즘을 사용하여 생성된 예시적인 CAD 칼슘 에너지 단백질 상호작용 하위네트워크를 도시한다.
도 15는 292-단백질 CAD 서명으로부터 GeneMANIA 알고리즘을 사용하여 생성된 예시적인 CAD 대사체학 단백질 상호작용 하위네트워크를 도시한다.
도 16은 292-단백질 CAD 서명으로부터 GeneMANIA 알고리즘을 사용하여 생성된 예시적인 CAD 세포 부착 단백질 상호작용 하위네트워크를 도시한다.
도 17은 292-단백질 CAD 서명으로부터 GeneMANIA 알고리즘을 사용하여 생성된 예시적인 CAD 염증 단백질 상호작용 하위네트워크를 도시한다.
도 18은 292-단백질 CAD 서명으로부터 GeneMANIA 알고리즘을 사용하여 생성된 예시적인 CAD 저산소증 단백질 상호작용 하위네트워크를 도시한다.
도 19는 292-단백질 CAD 서명으로부터 GeneMANIA 알고리즘을 사용하여 생성된 예시적인 CAD 히스톤 메틸화 단백질 상호작용 하위네트워크를 도시한다.
도 20a-20b는 292-단백질 CAD 서명(도 20a)에 나타낸 단백질 네트워크의 허브(도 20b)를 표적하는 FDA-승인된 약물을 식별하는 예시적인 L1000 FWD 알고리즘 분석을 도시한다.
도 21은 292-단백질 CAD 서명에 나타낸 단백질 네트워크의 허브를 표적하는 신규 약물을 식별하는 예시적인 ILINC 화학적 혼란 알고리즘 분석을 도시한다.
일부 측면에서, 본원에는 질량 분광법 분석을 위한 테스트 샘플을 처리하는 방법이 제공된다. 다른 측면에서, 본원에는 크기 배제 크로마토그래피 미세유체 장치 또는 역상 액체 크로마토그래피 미세유체 장치와 같은 구성요소의 분리에 유용한 미세유체 장치가 제공된다. 다른 측면에서, 본원에는 본원에 기재된 방법 및/또는 장치를 사용하여 수득된 조성물의 집합이 제공된다. 다른 측면에서, 본원에는 질량 분광법 기술을 사용하여 조성물 집합을 분석하는 방법이 제공된다. 다른 측면에서, 본원에는 하나 이상의 식별된 생체분자를 포함하는 서명을 식별하는 방법이 제공된다. 다른 측면에서, 본원에는 본원에 개시된 방법 및/또는 장치를 사용하여 식별된 서명이 제공된다. 다른 측면에서, 본원에는 기능, 활성, 및/또는 속성에 대해 서명의 구성요소를 분석하는 방법이 제공된다.
제공된 구현예는 분비된, 내인성 절단 생성물, 가용성 단백질, 및 엑소솜 또는 지질 미세소포-풍부 단백질과 같은 다양한 단백질 세트, 뿐만 아니라 샘플의 다른 비-단백질 구성요소의 포획을 포함하는 높은 프로테옴 적용범위를 달성하기 위해 질량 분광법을 사용하는 비선험적 불가지론 방법에 관한 것이다. 이들 생체분자는 큰 선형 동적 범위(예를 들어, 전형적으로 12-자릿수 이상)에 걸칠 수 있다. 제공된 방법 및/또는 장치에 의해 달성된 이러한 분석 전략은 다양한 물리-화학적 및 생물학적 특성을 갖는 단백질 뿐만 아니라 샘플의 다른 비-단백질 구성요소의 광범위한 편향되지 않은 포획 및 분석을 허용한다. 제공된 방법은 또한 낮은 존재비 수준에서 자연 발생 단백질을 포함하는 프로테옴과 같은, 샘플의 관찰가능한 구성요소의 대부분을 재현가능하게 분석하기 위해 사전 분석 변수를 최소화한다.
일부 구현예에서, 제공된 방법 및/또는 장치는 단자 검사(prick-test)로 조달된 혈액 표본만을 포함하는, 작은 생물학적 샘플로부터 단백질 생체서명(예를 들어, 질환 특이적 단백질 생체서명)을 포함한 특이적 분자 서명의 편향되지 않은 발견 및 후속 표적 분석에 사용될 수 있다. 단일 혈액 방울로부터 혈장 추출은 상업적으로 이용가능한 물질을 통한 모세관 작용 여과로 달성될 수 있고 카오트로픽 액체 고정액과 직접 혼합될 수 있다. 일부 구현예에서, 액체 고정액은 1차 및 2차 대사물, 천연 펩티드, 및 microRNA를 포함하는 혈액 샘플로부터 단백질 및 다른 생물학적 분석물을 가용화하고 보존한다. 강력한 카오트로픽 활성으로 인해, 이 액체 고정액은 프로테아제 활성을 제거하고, 대사물의 화학적 무결성을 최대한 보존하고, 단백질-단백질 결합을 제거하고, 효율적인 크기 배제 크로마토그래픽(SEC) 분리를 위해 최대 유체역학적 반경 및 액체 점도를 제공한다. 추가로, 표본 조달 및 보존 장치는 최소한의 화학적 또는 독성학적 위험으로 모든 인간 병원체(예를 들어, 바이러스, 박테리아, 진균 등)를 철저히 중화한다. 이 구성은 혈장 또는 혈청, 및 단백질, 천연 펩티드, 대사물 함량, 및 핵산, 예를 들어, RNA, 함량의 조달 및 화학적 고정을 위한 현장 진료(point-of-care) 장치에 적합하다.
일부 구현예에서, 방법 및/또는 장치는 효율적인 유동 역학(최소 난류), 낮은 작동 배압, 최적 표면 대 부피 비율을 달성하고, 단백질, 내인성 펩티드, 대사물, 및 핵산, 예를 들어, RNA를 포함하는 전체 고갈되지 않은 혈장/혈청과 같은 샘플에서 발견된 다양한 생체분자 종 세트에서 관찰된 광범위한 유체역학적 반경 또는 분자량의 탁월한 샘플링을 수득하는 미세유체 크기 배제 크로마토그래피를 제공한다. 중요하게, 이러한 미세유체 기반 분할은 고도로 통합되고 직교하는 파이프라인을 생성하기 위해 샘플 조달로부터 액체 고정액을 활용한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 바이오마커 발견 방법은 추가적으로 화학량론적으로 정규화된 동중 안정 동위원소 태깅을 통해, 분획화된 샘플의 상대적 정량적 분석을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 또한 무표지(label-free) 접근법으로 수정가능하다. 프로테아제를 사용한 표준 단백질 분해와 달리, 환원 단계 및/또는 알킬화 단계는 단백질분해에 적용되는 샘플, 또는 이의 분획에 존재하는 액체 고정액 특성으로 인해 필요하지 않다. 원래 샘플로부터 생성된 분획은 본원에 제공된 바와 같은 개방 관형 구성을 갖는 변형된 역상 액체 크로마토그래피 장치를 사용하여 추가로 분리될 수 있다. 본원에 기재된 장치는 예를 들어, 단백질로부터 유래된 단백질분해 펩티드, 천연 펩티드(예를 들어, MHC 클래스 I 및 II, 인슐린, 글루카곤, 트로포닌 등), 및 1차(예를 들어, 효소 보조인자, 당, 아미노산, 핵산, 지질 등) 또는 2차 대사물(예를 들어, 약물 또는 다른 생체이물 작용제 등으로부터 유래) 및 핵산, 예를 들어, RNA 종의 분리에 유용할 수 있다. 예를 들어 혈장 또는 혈청과 같은 생물학적 유체에서 자연 발생 엑소솜 또는 다른 지질 미세소포에 발생할 때 천연 펩티드, 대사물 및 RNA 종을 공동 분석하는 능력은 효소 또는 키나제 보조인자로 구성할 수 있으며 따라서 그들의 기능적 상태를 판독 및 검증하는 것을 돕고 이의 대리 마커로서 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 개방 관형 역상 액체 크로마토그래피는 랩 칩 장치 상에서 구성될 수 있고 수행된다.
본 개시내용에 기재된 바와 같이, 일부 구현예에서, 개방 관형 역상 액체 크로마토그래피 미세유체 장치는 조합된 긴 컬럼 길이를 포함하고, 석영 물질로부터 구성될 수 있고, C2, C4, C8, 및 C18 알킬 기 중 임의의 하나 이상을 갖는 화학적으로 변형된 표면을 포함한다. 본원에 기재된 개방 관형 역상 액체 크로마토그래피 미세유체 장치는 이론적 플레이트 수의 증가 및 이에 따른 더 높은 결합 용량에서 분리 효율, 뿐만 아니라 광범위한 소수성, 양친매성 및 소수성 펩티드에 대한 분리 능력을 제공하여, 이에 따른 하류 분석(예를 들어, 전기분무 이온화 및 질량 분광 분석)을 용이하게 한다.
일부 구현예에서, 본원에는 생물학적 현상의 평가, 모니터링 또는 예측을 가능하게 하는 데 중요한 특정 약물에 대한 반응성인 특정 생물학적 현상, 예컨대 질환, 질환 상태 또는 중증도와 연관된 바이오마커의 강력하고 포괄적인 발견을 위한 방법이 제공된다. 특히, 바이오마커는 진단 마커, 예후 마커 또는 계층화 마커로서 제공될 수 있다. 예를 들면, 바이오마커는 질환 위험 및 진행을 평가하고, 치료에 대한 환자의 반응을 모니터링하거나 심지어 예측하는 데 중요하다. 예를 들어 혈장 또는 혈청과 같은 생물학적 유체에서 자연 발생 엑소솜 또는 다른 지질 미세소포에 발생할 때, 천연 펩티드, 대사물 및 RNA 종을 공동 분석하는 능력은 효소 또는 키나제 보조인자를 구성할 수 있고 따라서 그들의 기능적 상태를 판독 및 검증하는 것을 돕고 이의 대리 마커로서 제공될 수 있다. 단백질은 인체에서 생화학적 반응을 조절하고 환경, 연령, 동반이환, 행동, 및 약물과 연관된 후생적 인자에 따른 유전자의 효과를 통합할 수 있다. 이와 같이, 단백질은 큰 내적표현형(endophenotypic) 바이오마커 잠재력을 나타낸다.
그럼에도 불구하고, 바이오마커로서 임상에서 사용되는 단백질은 순환 프로테옴의 매우 작은 분획만을 나타낸다. 추가로, 혈액과 같은 유체 샘플의 특정 대사물과 같은 다른 생체분자가 또한 질환과 같은 생물학적 현상의 관련 바이오마커일 수 있다. 따라서, 기존 방법은 일반적으로 관련 바이오마커의 적용범위 정도를 포획하지 못한다. 게다가, 다차원 데이터 통합 알고리즘 및 다른 컴퓨터 기반 기계 학습 도구 개발 발달의 진전에도 불구하고, 바이오마커에 대한 기계적 통찰력을 추출하기 위한 데이터 통합의 유연성, 유효성 및 견고성은 제한적으로 남아있다. 이와 같이, 많은 기존 방법은 특정 질환과 같은 특정 생물학적 현상에 대한 병태생리학적 관련성이 있는 생물학적 샘플에 존재하는 단백질을 포획하지 못한다. 따라서, 바이오마커 발견 및 기계적 분석에 대해 이용가능한 접근법은 완전히 만족스럽지 않다.
추가로, 기존 질량 분광법 방법의 유용성은 샘플의 구성요소 종(예컨대 샘플로부터의 단일 유형 펩티드의 낮은 존재비 집단)을 구성요소 종이 질량 분광계의 검출기에 도달하여 분석되는 이러한 농축된 형태로 질량 분광계에 도입하는 능력을 포함하여, 다수의 측면에 의해 제한된다. 이 문제는 인간 혈액 샘플, 및 예를 들어, 상대적으로 높은 농도의 알부민, IgG, 항트립신, IgA, 트랜스페린, 합토글로빈, 및 피브로겐의 경우와 같이, 매우 풍부한 구성요소 종의 존재로 혼동된다. 샘플의 구성요소를 효율적으로 분리하고 농축하는 문제 외에도, 질량 분광법 분석 전에 샘플을 제조하는 동안 많은 구성요소가 손실될 수 있다.
제공된 구현예는 이들 문제 중 하나 이상을 다룬다. 예를 들어, 일부 측면에서, 본원에는 친화도 고갈 및 친화도 강화 단계와 완전히 독립적이고 고갈되지 않은 혈액 혈청 및/또는 혈장에서 다양한 범위의 생화학적 적용에 대한 정량적 적용을 나타내는 포괄적인 혈장 발견 및 검증 파이프라인이 기재된다. 추가로, 식별된 구성요소는 예를 들어, 진단 및/또는 예후 값을 갖는 신규하고 고도로 정확한 도구로서 질환 특이적 생체서명을 식별하고/하거나 사용하기 위해 본원에 기재된 방법에 따라 분석될 수 있다.
또한, 본원에 제공된 방법 및 장치는 자동화 및 확장을 가능하게 하는 기술적 플랫폼을 포함한다. 이러한 전제는 수백 개 또는 심지어 수천 개 샘플의 포괄적인 분석을 통해 통계적 검증력을 달성하는 데 필수적이게 된다. 제공된 구현예에 의해 달성된 혈장 프로테옴과 같은 샘플의 대량 및 재생산가능한 분석은 초기, 개시 단계 및 후속적인 안전하고 효과적인 치료에서 고위험 환자의 임상 제시의 큰 이질성에도 불구하고 예를 들어, 단백질 및 유도체 대사물 수준(예를 들어, 본원에 기재된 통합된 단백질대사 프로파일)에서 기능적 및 임상적으로 관련된 내적표현형 증거를 판독할 수 있는 다양한 인공 지능, 기계 학습 알고리즘의 최대 활용을 허용한다.
일부 측면에서, 제공된 방법에 의해 구현된 플랫폼에 대한 추가의 이점은 기술적 구성요소가 높은 정도의 상호보완적 작동 원리를 고려할 때 단일 수직으로 통합된 파이프라인을 구성한다는 점이다. 또한, 파이프라인은 자동화에 매우 적합하기 때문에 최소의 인간 개입으로 분석 용량을 증가시키기 위해 확장될 수 있다. 이러한 특징은 일괄하여 임의의 질환으로부터 유래된 혈장에서 단백질 생체서명의 효과적이고 포괄적인 분석을 용이하게 한다. 중요하게, 플랫폼은 질환 특이적 방식으로, 또는 대안적으로 발견 분석으로부터 식별된 구성요소의 고처리량 병렬 조사를 위한 표적된 절대 정량적 분석 모드로 차등적으로 발현되고/존재하기 때문에, 단백질과 같은 구성요소의 광범위한 스펙트럼의 편향되지 않거나 불가지론적 정량화를 위한 발견 모두 모두에서 작동할 수 있다. 플랫폼 분석의 발견 및 유도체 표적화 모드는 둘 다 측정 전에 값비싸고 신뢰할 수 없는 항체 및/또는 단백질의 압타머-기반 고갈 또는 농축을 사용하지 않게 한다.
개시된 방법 및/또는 장치의 결과는 엑소솜과 같이 어려운 것을 포함하는 단백질과 같은 샘플로부터의 구성요소를 식별하고/하거나 정량화할 수 있는 민감하고, 강력하고 재현가능한 결과를 제공하는 플랫폼이다. 또한, 방법 및/또는 장치는 단일 랩 칩 장치에 필요한 경우를 포함하여, 소형화 및 통합에 적합하다.
따라서, 일부 측면에서, 본원에는 질량 분광법 분석을 위한 테스트 샘플을 처리하는 방법이 제공되며, 방법은 (a) SEC 미세유체 장치를 사용하여 테스트 샘플을 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 기술에 적용하되, 상기 테스트 샘플은 하나 이상의 생체분자 및 카오트로픽제를 포함하고, 상기 SEC 미세유체 장치는 복수의 상호연결된 채널을 포함하는 것인, 단계; (b) SEC 미세유체 장치로부터 용출된 복수의 분획을 수집하는 단계; (c) SEC 미세유체 장치로부터의 복수의 분획 중 하나 이상을 단백질분해 기술에 적용하는 단계; 및 (d) 단계 (b) 및 (c) 중 하나 또는 둘 다로부터의 하나 이상의 분획을 질량 분광계에 도입하기 위한 하나 이상의 분획 각각의 구성요소를 제조하기 위한 조건 하에 RPLC 미세유체 장치를 사용하여 역상 액체 크로마토그래피(RPLC) 기술에 개별적으로 적용하되, 상기 RPLC 미세유체 장치는 역상 매질을 포함하는 복수의 상호연결된 채널을 포함하고, 상기 RPLC 미세유체 장치는 전기분무 이온화 소스에 결합되는 것인, 단계를 포함한다.
일부 측면에서, 본원에는 질량 분광법 분석을 위한 생물학적 샘플과 같은 샘플의 구성요소, 또는 이의 생성물을 처리하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 방법은 (a) 테스트 샘플을 SEC 미세유체 장치를 사용하여 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 기술에 적용하는 단계; (b) SEC 미세유체 장치로부터 용출된 복수의 분획을 수집하는 단계; (c) SEC 미세유체 장치로부터의 복수의 분획 중 하나 이상을 단백질분해 기술에 적용하는 단계; 및 (d) RPLC-호환성 분획 세트 각각을 RPLC 미세유체 장치를 사용하여 역상 액체 크로마토그래피(RPLC) 기술에 적용하여 질량 분광계에 도입하기 위한 샘플의 구성요소, 또는 이의 생성물을 제조하는 단계를 포함한다.
다른 측면에서, 본원에는 질량 분광법 분석을 위한 생물학적 샘플의 구성요소, 또는 이의 생성물을 처리하는 방법이 제공되며, 방법은 (a) 테스트 샘플을 SEC 미세유체 장치를 사용하여 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 기술에 적용하되, 상기 테스트 샘플은 액체 고정액과 혼합된 샘플을 포함하고, 상기 테스트 샘플은 액체 고정액으로부터 유래하는 미리 결정된 농도의 카오트로픽제를 갖고, 상기 SEC 기술은 테스트 샘플 내 카오트로픽제의 미리 결정된 농도의 범위 내에서 이동상 카오트로픽제의 농도를 갖는 SEC 이동상의 사용을 포함하고, 상기 SEC 미세유체 장치는 복수의 상호연결된 채널을 포함하며, 각 채널은 약 10 nm 내지 약 500 nm의 평균 기공 크기를 갖는 내부 표면 물질을 갖는 개방 관형 형식으로 구성되는 것인, 단계; (b) SEC 미세유체 장치로부터 용출된 복수의 분획을 수집하는 단계; (c) SEC 미세유체 장치로부터의 복수의 분획 중 하나 이상을 단백질분해 기술에 적용하는 단계; 및 (d) RPLC-호환성 분획 세트 각각을 RPLC 미세유체 장치를 사용하여 역상 액체 크로마토그래피(RPLC) 기술에 적용하여 질량 분광계에 도입하기 위한 샘플의 구성요소, 또는 이의 생성물을 제조하되, 상기 RPLC-호환성 분획 세트는 (i) SEC 미세유체 장치로부터 복수의 분획 중 0 개 이상; 및 (ii) 단백질분해 기술에 적용된 복수의 분획 중 하나 이상으로부터 수득된 분획을 포함하는 것인, 단계를 포함하며, 상기 RPLC 기술 및 RPLC 미세유체 장치는 온라인 탈염을 위해 구성되고, 상기 RPLC 미세유체 장치는 복수의 상호연결된 채널을 포함하며, 각 채널은 역상 매질을 포함하는 내부 표면 물질을 갖는 개방 관형 형식으로 구성되고, 상기 RPLC 미세유체 장치는 전기분무 이온화 소스에 결합된다.
다른 측면에서, 본원에는 본원에 기재된 방법 중 임의의 하나로부터 수득된 조성물 집합이 제공된다. 일부 구현예에서, 조성물 집합의 각 조성물은 RPLC 미세유체 장치 용출액이다.
다른 측면에서, 본원에는 질량 분광법을 사용하여 조성물 집합을 분석하는 방법이 제공되며, 방법은 (a) 조성물 집합의 각 조성물을 질량 분광계에 적용하는 단계; 및 (b) 조성물 집합의 각 조성물의 질량 분광법 분석을 수행하는 단계를 포함하며, 상기 조성물 집합은 SEC 미세유체 장치의 사용을 포함하는 SEC 기술을 사용하여 테스트 샘플의 분획화 후 각 분획, 또는 이의 생성물을 RPLC 미세유체 장치의 사용을 포함하는 RPLC 기술에 적용하는 것을 포함하는 처리 기술로부터 수득된다.
다른 측면에서, 본원에는 입력 포트; 연결 채널의 상류 네트워크; 및 복수의 상호연결된 채널을 포함하는 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 미세유체 장치가 제공되며, 상기 복수의 상호연결된 채널의 각 채널은 개방 관형 형식이고, 상기 복수의 상호연결된 채널의 각 채널은 SEC 매질을 포함하는 내부 표면을 포함하고, 상기 복수의 상호연결된 채널의 각 채널은 연결 채널의 상류 네트워크를 통해 입력 포트와 유체 연통한다.
다른 측면에서, 본원에는 입력 포트; 연결 채널의 상류 네트워크; 및 복수의 상호연결된 채널을 포함하는 역상 액체 크로마토그래피(RPLC) 미세유체 장치가 제공되며, 상기 복수의 상호연결된 채널의 각 채널은 개방 관형 형식이고, 상기 복수의 상호연결된 채널의 각 채널은 RPLC 매질을 포함하는 내부 표면을 포함하고, 상기 복수의 상호연결된 채널의 각 채널은 연결 채널의 상류 네트워크를 통해 입력 포트와 유체 연통한다.
본 출원에 언급된 특허 문서, 과학 기사 및 데이터베이스를 포함한 모든 간행물은 각 개별 간행물이 참조에 의해 개별적으로 포함된 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전문이 참조로 포함된다. 본원에 제시된 정의가 참조에 의해 본원에 포함된 특허, 출원, 공개된 출원 및 다른 간행물에 제시된 정의와 반대되거나 달리 일치하지 않는 경우, 본원에 제시된 정의는 참조에 의해 본원에 포함된 정의보다 우선한다.
본원에 사용된 섹션 제목은 구조적 목적만을 위한 것이며 기재된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
I. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술 용어, 표기법 및 다른 기술적 및 과학적 용어 또는 전문 용어는 청구된 주제가 속하는 기술 분야의 숙련자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는 것으로 의도된다. 일부 경우에, 통상적으로 이해되는 의미를 갖는 용어는 명료성 및/또는 용이한 참조를 위해 본원에 정의되고, 본원에서 이러한 정의를 포함하는 것은 당업계에서 일반적으로 이해되는 것 이상의 실질적인 차이를 나타내는 것으로 반드시 해석되지 않아야 한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기를 포함하는 중합체를 지칭하기 위해 상호교환가능하게 사용될 수 있고, 최소 길이에 제한되지 않는다. 이러한 중합체는 천연 또는 비천연 아미노산 잔기, 또는 이의 조합을 함유할 수 있고, 펩티드, 폴리펩티드, 올리고펩티드, 아미노산 잔기의 이량체, 삼량체, 및 다량체를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 전장 폴리펩티드 또는 단백질, 및 이의 단편이 이 정의에 포함된다. 용어는 또한 이의 변형된 종, 예를 들어, 하나 이상의 잔기의 번역 후 변형, 예를 들어, 메틸화, 인산화 글리코실화, 시알릴화, 또는 아세틸화를 포함한다.
본 개시내용 전반에 걸쳐, 청구된 주제의 다양한 측면이 범위 형식으로 제시된다. 범위 형식의 설명은 단지 편의성 및 간결성을 위한 것이고 청구된 주제의 범위에 대한 융통성 없는 제한으로 해석되어서는 안 된다는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 범위의 설명은 모든 가능한 하위범위 뿐만 아니라 해당 범위 내의 개별 수치 값을 구체적으로 개시하는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들면, 값의 범위가 제공되는 경우, 문맥상 명백하게 달리 지시되지 않는 한, 해당 범위의 상한치 및 하한치와 언급된 해당 범위에서 임의의 다른 언급되거나 개입된 값 사이의 하한 단위의 10분의 1까지 각 개입 값은 언급된 범위에서 임의의 구체적으로 제외된 제한에 적용하여 본 개시내용 내에 포함되는 것으로 이해된다. 언급된 범위가 제한 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우, 포함된 제한 중 어느 하나 또는 둘 다를 제외한 범위가 또한 본 개시내용에 포함된다. 일부 구현예에서, 특징에 대해 2 개의 반대되고 개방형의 범위가 제공되고, 이러한 설명에서 2 개 범위의 조합이 본원에 제공되는 것으로 생각된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 특징은 약 10 단위 초과인 것으로 기재되고, 특징은 약 20 단위 미만이며, 따라서, 약 10 단위 내지 약 20 단위의 범위가 본원에 기재되는 것으로 (또 다른 문장에서와 같이) 기재된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "약"은 이 기술 분야에서 용이하게 알려진 각각의 값에 대한 일반적인 오차 범위를 지칭한다. 본원에서 "약" 값 또는 매개변수에 대한 언급은 해당 값 또는 매개변수 자체에 관한 변경을 포함(및 설명)한다. 예를 들어, "약 X"를 언급하는 설명은 "X"의 설명을 포함한다.
첨부된 청구범위를 포함하여 본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 예를 들어, 단수형은 "적어도 하나" 또는 "하나 이상"을 의미한다. 본원에 기재된 측면 및 변경은 이러한 측면 및 변경으로 "이루어진" 및/또는 "본질적으로 이루어진" 구현예를 포함하는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 바와 같이, 상호교환가능하게 사용되는 용어인 "대상체" 또는 "개체"는 포유동물이다. 일부 구현예에서, "포유동물"은 인간, 비인간 영장류, 가축 및 농장 동물, 및 동물원, 스포츠, 또는 애완 동물, 예컨대 개, 말, 토끼, 소, 돼지, 햄스터, 게르빌루스쥐, 마우스, 흰족제비, 래트, 고양이, 원숭이 등을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체 또는 개체는 인간이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료하는" 및 "치료"는 대상체에게 유효량의 제제를 투여하거나 본원에 기재된 금연과 같은 생활 방식 조정을 처방하여 대상체가 질환의 적어도 하나 증상의 감소 또는 질환의 개선, 예를 들어, 유익하거나 바람직한 임상 결과를 갖도록 하는 것을 포함한다. 이 기술의 목적을 위해, 유익하거나 바람직한 임상 결과는 검출가능하든 검출가능하지 않든 하나 이상의 증상 완화, 질환 정도 감소, 안정화된(즉, 악화되지 않은) 질환 상태, 질환 진행 지연 또는 둔화, 질환 상태 개선 또는 완화, 및 관해(부분적이든 전체적이든)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 치료하는 것은 치료를 받지 않은 경우 예상되는 생존과 비교하여 생존을 연장하는 것을 지칭할 수 있다. 따라서, 당업자는 치료가 질환 상태를 개선할 수 있지만, 질환에 대한 완전한 치유가 아닐 수 있음을 인식한다. 일부 구현예에서,　질환 또는 장애의 하나 이상의 증상은 질환 치료 시 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50%까지 완화된다.
당업자는 여러 구현예가 본 개시내용의 범위 및 취지 내에서 가능하다는 것을 인식할 것이다. 다음 설명은 개시내용을 예시하며, 물론, 본원에 기재된 발명의 범위를 어떤 방식으로든 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
II. 샘플의 구성요소, 또는 이의 생성물을 처리하는 방법
일부 측면에서, 본원에는 하류 적용을 위해 샘플의 구성요소, 또는 이의 생성물을 서로 적어도 어느 정도 분리하기 위해 샘플의 구성요소, 또는 이의 생성물을 처리하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 처리 방법은 질량 분광법 분석을 위해 구성요소, 또는 이의 생성물을 효율적으로 및 효과적으로 분리하고 농축하는 데 유용하다.
일부 구현예에서, 질량 분광법 분석을 위한 샘플의 구성요소, 또는 이의 생성물을 처리하는 방법은 포괄적으로 샘플 획득부터 구성요소, 또는 이의 생성물을 질량 분광계에 도입하는 것까지 모든 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 하나 이상의 액체 크로마토그래피 단계 및/또는 예비 처리 단계와 같은, 질량 분광법 분석을 위한 구성요소, 또는 이의 생성물의 전반적인 처리에 연루된 특정 측면을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 처리 방법은 질량 분광법 분석을 포함하는 하류 적용 바로 직전에 접속하도록 구성된다. 본원에 개시된 방법의 측면은 모듈 방식으로 아래에 보다 상세하게 기재된다. 이러한 제시는 샘플의 구성요소, 또는 이의 생성물을 처리하는 방법을 형성하기 위해 본 출원의 개시내용에 의해 포함된 다양한 측면의 조합 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
A. 샘플, 이의 구성요소, 샘플 획득, 및 예비 샘플 처리
본원에 기재된 방법은 구성요소의 다수의 상이한 조합을 함유하는 다양한 소스 어레이로부터 다양한 샘플의 구성요소, 또는 이의 생성물을 처리하는 데 유용하다.
일부 구현예에서, 샘플은 유기체 또는 이의 일부 또는 생성물을 포함하는 샘플과 같은 생물학적 샘플이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 인간과 같은 개체로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 개체는 인간, 소, 말, 고양이, 개, 설치류, 또는 영장류와 같은 포유동물이다. 일부 구현예에서, 샘플은 인간 샘플이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 진정세균(Eubacteria) 계, 고세균(Archaebacterial) 계, 원생생물(Protista) 계, 식물(Plantae) 계, 진균(Fungi) 계, 또는 동물(Animalia) 계로 분류된 유기체로부터의 물질을 포함한다. 일부 구현예에서, 샘플은 환경 샘플이다.
일부 구현예에서, 샘플은 개체의 유체 및/또는 고체(예를 들어, 세포)를 포함한다. 일부 구현예에서, 샘플은 액체 생검이다. 일부 구현예에서, 샘플은 혈액 샘플, 혈청 샘플, 회복기 혈장 샘플, 구강인두 면봉으로부터 수득된 것을 포함하는 구강인두 샘플, 비인두 면봉으로부터 수득된 것을 포함하는 비인두 샘플, 협측 샘플, 기관내 흡인기로부터 수득된 것을 포함하는 기관지폐포 세척 샘플, 땀 샘플, 가래 샘플, 타액 샘플, 눈물 샘플, 신체 분비 샘플, 또는 뇌척수액 샘플을 포함하는 샘플과 같은 체액을 포함한다. 일부 구현예에서, 샘플은 대변 샘플을 포함하는 샘플과 같은 고체를 포함한다. 일부 구현예에서, 샘플은 혈액 샘플, 뇌척수액(CSF) 샘플, 금욕액(ascetic fluid) 샘플(기관에 인접한 근위 유체), 정액 샘플, 및 유두 흡입액 샘플로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 샘플은 복합 생물학적 샘플과 같은 복합 샘플이다. 일부 구현예에서, 샘플은 적어도 약 2 자릿수, 예컨대 적어도 약 3 자릿수, 4 자릿수, 5 자릿수, 6 자릿수, 7 자릿수, 8 자릿수, 9 자릿수, 10 자릿수 중 임의의 것에 걸친 농도를 갖는 구성요소를 포함한다.
일부 구현예에서, 샘플은 생체분자 또는 이의 유도체와 같은 구성요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질, 펩티드, 핵산, 대사물, 또는 이의 유도체(예컨대 이의 처리 및/또는 표지된 형태)와 같은 본원에 기재된 샘플 및/또는 임의의 분획(예컨대 본원에 기재된 방법 단계 및/또는 장치로부터 수득된 유체의 일부)의 특징은 구성요소로서 기재될 수 있다.
일부 구현예에서, 구성요소는 폴리펩티드(예컨대 단백질, 자연 발생 펩티드, 또는 내인성 단백질 절단 산물), 폴리뉴클레오티드(예컨대 DNA 또는 RNA), 또는 대사물이다. 일부 구현예에서, 샘플은 단백질, 자연 발생 펩티드, 및 대사물을 포함한다. 일부 구현예에서, 구성요소는 번역후 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, 샘플의 구성요소의 생성물은 샘플 획득 시 또는 후에 생성된 구성요소의 임의의 유도체이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 샘플의 단백질 구성요소의 생성물은 변경된 물리적 구조 또는 조성을 갖는(예를 들어, 번역후 변형을 갖는) 단백질 구성요소, 단백질 구성요소의 단백질분해로부터 생성된 폴리펩티드 또는 펩티드, 및 조성물의 변경된 물리적 구조를 갖는(예를 들어, 번역후 변형 및/또는 정량적 표지를 갖는) 폴리펩티드 또는 펩티드를 포함하는, 샘플 처리 동안 및/또는 결과로서 발생하는 단백질 구성요소, 또는 생성된 부분에 대한 임의의 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, 샘플은 고갈되지 않은 샘플, 예를 들어, 매우 풍부한 단백질과 같은 이의 특정 구성요소를 제거하도록 처리되지 않은 샘플이다.
일부 구현예에서, 샘플은 혈액 샘플 또는 그로부터 유래된 샘플, 예를 들어, 혈장 샘플이다. 일부 구현예에서, 샘플은 혈액 샘플을 포함한다. 일부 구현예에서, 혈액 샘플은 전혈 샘플이다. 일부 구현예에서, 혈액 샘플은 고갈되지 않은 혈액 샘플, 예를 들어, 매우 풍부한 단백질과 같은 이의 특정 구성요소를 제거하도록 처리되지 않은 혈액 샘플이다. 일부 구현예에서, 혈액 샘플은 혈장 샘플을 포함한다. 일부 구현예에서, 혈장 샘플은 고갈되지 않은 혈장 샘플, 예를 들어, 매우 풍부한 단백질과 같은 이의 특정 구성요소를 제거하도록 처리되지 않았지만, 전혈 샘플로부터 혈장 샘플을 생성할 때 일반적으로 제거되는 다른 것을 제거하도록 처리된 혈장 샘플이다. 일부 구현예에서, 혈액 샘플은 혈청 샘플을 포함한다. 일부 구현예에서, 혈청 샘플은 고갈되지 않은 혈청 샘플, 예를 들어, 매우 풍부한 단백질과 같은 이의 특정 구성요소를 제거하도록 처리되지 않은 혈청 샘플이다. 일부 구현예에서, 혈장 샘플 또는 그로부터 수득된 혈청 샘플을 포함하는 혈액 샘플은 7 개의 통상의 매우 풍부한 혈액 단백질(알부민, IgG, 항트립신, IgA, 트랜스페린, 합토글로빈, 피브리노겐) 중 임의의 하나 이상을 제거하도록 처리되지 않았다. 일부 구현예에서, 혈장 샘플 또는 그로부터 수득된 혈청 샘플을 포함하는 혈액 샘플은 14 개의 통상의 매우 풍부한 혈액 단백질(알부민, IgG, 항트립신, IgA, 트랜스페린, 합토글로빈, 피브리노겐, 알파2-매크로글로불린, 알파1-산 당단백질, IgM, 아포지질단백질 AI, 아포지질단백질 AII, 보체 C3, 트랜스티레틴) 중 임의의 하나 이상을 제거하도록 처리되지 않았다.
일부 구현예에서, 샘플은 약 10 μL 내지 약 200 μL, 예컨대 약 10 μL 내지 약 100 μL, 약 10 μL 내지 약 75 μL, 약 25 μL 내지 약 75 μL, 또는 약 30 μL 내지 약 60 μL 중 임의의 부피(예컨대 개체로부터 수득된 샘플의 부피)를 갖는다. 일부 구현예에서, 샘플은 적어도 약 10 μL,예컨대 적어도 약 15 μL, 20 μL, 25 μL, 30 μL, 35 μL, 40 μL, 45 μL, 50 μL, 55 μL, 60 μL, 65 μL, 70 μL, 75 μL, 80 μL, 85 μL, 90 μL, 95 μL, 100 μL, 105 μL, 110 μL, 115 μL, 120 μL, 125 μL, 130 μL, 135 μL, 140 μL, 145 μL, 150 μL, 155 μL, 160 μL, 165 μL, 170 μL, 175 μL, 180 μL, 185 μL, 190 μL, 195 μL, 또는 200 μL 중 임의의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 샘플은 약 200 μL 미만, 예컨대 약 195 μL, 190 μL, 185 μL, 180 μL, 175 μL, 170 μL, 165 μL, 160 μL, 155 μL, 150 μL, 145 μL, 140 μL, 135 μL, 130 μL, 125 μL, 120 μL, 115 μL, 110 μL, 105 μL, 100 μL, 95 μL, 90 μL, 85 μL, 80 μL, 75 μL, 70 μL, 65 μL, 60 μL, 55 μL, 50 μL, 45 μL, 40 μL, 35 μL, 30 μL, 25 μL, 20 μL, 15 μL, 또는 10 μL 미만 중 임의의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 샘플은 약 10 μL, 15 μL, 20 μL, 25 μL, 30 μL, 35 μL, 40 μL, 45 μL, 50 μL, 55 μL, 60 μL, 65 μL, 70 μL, 75 μL, 80 μL, 85 μL, 90 μL, 95 μL, 100 μL, 105 μL, 110 μL, 115 μL, 120 μL, 125 μL, 130 μL, 135 μL, 140 μL, 145 μL, 150 μL, 155 μL, 160 μL, 165 μL, 170 μL, 175 μL, 180 μL, 185 μL, 190 μL, 195 μL, 또는 200 μL 중 임의의 부피를 갖는다.
일부 구현예에서, 방법은 개체로부터 샘플을 수득하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 하나 이상의 예비 샘플 처리 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 예비 샘플 처리 단계는 샘플을 나중 분석을 위한 상태로 샘플을 보존하는 제제와 혼합하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 예비 샘플 처리 단계는 샘플(예컨대 혈액 샘플)을 항응고제와 혼합하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 예비 샘플 처리 단계는 샘플(예컨대 혈액 샘플)을 효소 억제제, 예를 들어, 프로테아제 억제제와 혼합하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 예비 샘플 처리 단계는 샘플을 나중 분석을 위한 상태로 샘플을 보존하는 조건에 적용하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 예비 샘플 처리 단계는 샘플을 약 10℃ 이하, 4℃ 이하, 0℃ 이하, -20℃ 이하, 또는 -80℃ 이하 중 임의의 온도와 같은 감소된 온도에 적용하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 샘플은 현장 진료 시 수득된다.
일부 구현예에서, 예비 샘플 처리 단계는 샘플을 액체 고정액과 혼합하여 테스트 샘플을 생성하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 액체 고정액 구성요소 및/또는 이의 농도 및/또는 샘플 부피 대 액체 고정액 부피의 비율은 테스트 샘플에서 액체 고정액의 하나 이상의 구성요소의 미리 결정된 농도를 달성하는 것과 같은 본원에 기재된 방법의 요구를 충족하도록 조정될 수 있다.
일부 구현예에서, 액체 고정액은 카오트로픽제를 포함한다. 일부 구현예에서, 카오트로픽제는 구아니딘 또는 이의 염, 구아니디늄 또는 이의 염, 칼륨 또는 이의 염, 리튬 또는 이의 염, 마그네슘 또는 이의 염, 또는 나트륨 또는 이의 염을 포함한다. 일부 구현예에서, 카오트로픽제는 구아니딘 하이드로클로라이드, 구아니디늄 클로라이드, 구아니디늄 티오시난트, 리튬 퍼클로레이트, 리튬 아세테이트, 마그네슘 클로라이드, 칼륨 아세테이트, 및 나트륨 요오다이드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 카오트로픽제는 구아니딘 염이다. 일부 구현예에서, 카오트로픽제는 구아니딘 하이드로클로라이드이다.
일부 구현예에서, 테스트 샘플은 약 5 M 내지 약 8 M, 예컨대 약 5.5 M 내지 약 8 M, 약 5.5 M 내지 약 7 M, 또는 약 5.5 M 내지 약 6.5 M 중 임의의 액체 고정액으로부터 유래하는 카오트로픽제의 농도를 포함한다. 일부 구현예에서, 테스트 샘플은 적어도 약 5.5 M, 예컨대 적어도 약 6 M, 6.5 M, 7 M, 7.5 M, 또는 8 M 중 임의의 액체 고정액으로부터 유래하는 카오트로픽제의 농도를 포함한다. 일부 구현예에서, 테스트 샘플은 약 8 M 이하, 예컨대 약 7.5 M 이하, 6.5 M 이하, 또는 6 M 이하 중 임의의 액체 고정액으로부터 유래하는 카오트로픽제의 농도를 포함한다. 일부 구현예에서, 테스트 샘플은 약 5.5 M, 6 M, 6.5 M, 7 M, 7.5 M, 또는 8 M 중 임의의 액체 고정액으로부터 유래하는 카오트로픽제의 농도를 포함한다.
일부 구현예에서, 액체 고정액은 점도 조절제를 포함한다. 일부 구현예에서, 점도 조절제는 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 소르비톨, 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 점도 조절제는 글리세롤이다.
일부 구현예에서, 테스트 샘플은 약 5% 내지 약 40%, 예컨대 약 5% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 30%, 또는 약 20% 내지 약 40% 중 임의의 액체 고정액으로부터 유래하는 점도 조절제의 농도를 포함하다. 일부 구현예에서, 테스트 샘플은 적어도 약 5%, 예컨대 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 또는 40% 중 임의의 액체 고정액으로부터 유래하는 점도 조절제의 농도를 포함한다. 일부 구현예에서, 테스트 샘플은 약 40% 이하, 예컨대 약 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 또는 5% 이하 중 임의의 액체 고정액으로부터 유래하는 점도 조절제의 농도를 포함한다. 일부 구현예에서, 테스트 샘플은 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% 중 임의의 액체 고정액으로부터 유래하는 점도 조절제의 농도를 포함한다. 일부 구현예에서, 테스트 샘플에서 점도 조절제의 양은 (예컨대 SEC 미세유체 장치를 포함하여, 본원에 기재된 방법의 측면을 통해 처리하기 위한) 테스트 샘플의 원하는 점도에 기반한다.
일부 구현예에서, 테스트 샘플은 약 5 M 내지 약 8 M, 예컨대 약 5.5 M 내지 약 7.5 M, 약 5.5 M 내지 약 7 M, 또는 약 5.5 M 내지 약 6.5 M 중 임의의 액체 고정액으로부터 유래하는 카오트로픽제(이러한 구아니딘 하이드로클로라이드)의 농도, 및 약 5% 내지 약 40%, 예컨대 약 5% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 30% , 또는 약 20% 내지 약 40% 중 임의의 액체 고정액으로부터 유래하는 점도 조절제(예컨대 글리세롤)의 농도를 포함한다. 일부 구현예에서, 테스트 샘플은 적어도 약 5 M, 예컨대 적어도 약 5.5 M, 6 M, 6.5 M, 7 M, 7.5 M, 또는 8 M 중 임의의 액체 고정액으로부터 유래하는 카오트로픽제(이러한 구아니딘 하이드로클로라이드)의 농도, 및 적어도 약 5%, 예컨대 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 또는 40% 중 임의의 액체 고정액으로부터 유래하는 점도 조절제(예컨대 글리세롤)의 농도를 포함한다. 일부 구현예에서, 테스트 샘플은 약 8 M 이하, 예컨대 약 7.5 M 이하, 6.5 M 이하, 또는 6 M 이하 중 임의의 액체 고정액으로부터 유래하는 카오트로픽제(이러한 구아니딘 하이드로클로라이드)의 농도, 및 약 40% 이하, 예컨대 약 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 또는 5% 이하의 액체 고정액으로부터 유래하는 점도 조절제(예컨대 글리세롤)의 농도를 포함한다. 일부 구현예에서, 테스트 샘플은 약 5 M, 5.5 M, 6 M, 6.5 M, 7 M, 7.5 M, 또는 8 M 중 임의의 액체 고정액으로부터 유래하는 카오트로픽제(이러한 구아니딘 하이드로클로라이드)의 농도, 및 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% 중 임의의 액체 고정액으로부터 유래하는 점도 조절제(예컨대 글리세롤)의 농도를 포함한다.
일부 구현예에서, 테스트 샘플은 약 5.5 M 내지 약 8 M, 예컨대 약 6 M 이상의 액체 고정액으로부터 유래하는 카오트로픽제(예를 들어, 구아니딘 하이드로클로라이드)의 농도, 및 약 5% 내지 약 40%, 이러한 약 10% 내지 약 30%의 액체 고정액으로부터 유래하는 점도 개질제(예를 들어, 글리세롤)의 농도를 포함한다.
일부 구현예에서, 테스트 샘플은 고갈되지 않은 샘플, 예를 들어, 매우 풍부한 단백질과 같은 이의 특정 구성요소를 제거하도록 처리되지 않은 테스트 샘플이다. 일부 구현예에서, 혈액 샘플, 혈장 샘플, 또는 혈청 샘플로부터 수득된 테스트 샘플을 포함하는 테스트 샘플은 7 개의 통상의 매우 풍부한 혈액 단백질(알부민, IgG, 항트립신, IgA, 트랜스페린, 합토글로빈, 피브리노겐) 중 임의의 하나 이상을 제거하도록 처리되지 않았다. 일부 구현예에서, 혈액 샘플, 혈장 샘플, 또는 혈청 샘플로부터 수득된 테스트 샘플을 포함하는 테스트 샘플은 14 개의 통상의 매우 풍부한 혈액 단백질(알부민, IgG, 항트립신, IgA, 트랜스페린, 합토글로빈, 피브리노겐, 알파2-매크로글로불린, 알파1-산 당단백질, IgM, 아포지질단백질 AI, 아포지질단백질 AII, 보체 C3, 트랜스티레틴) 중 임의의 하나 이상을 제거하도록 처리되지 않았다.
일부 구현예에서, 액체 고정액은 예를 들어, 스톡 제형(습식 또는 건식)으로부터 제조될 때와 같이, 원하는 농도에 도달하기 위해 물과 같은 용액으로 희석될 수 있다. 일부 구현예에서, 액체 고정액의 점도 개질제는 액체 고정액의 원하는 농도를 달성하기 위해 물과 혼합된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 액체 고정액은 10% 점도 개질제/ 90% 물 용액에 혼합한 7 M의 카오트로픽제를 포함한다.
본원에서 논의된 바와 같이, 액체 고정액의 하나 이상의 구성요소의 농도는 테스트 샘플에서 액체 고정액으로부터의 원하는 구성요소 농도 및/또는 샘플 부피 대 액체 고정액 부피의 비율에 기반할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 액체 고정액은 카오트로픽제의 농도 및/또는 점도 개질제의 농도를 포함하며 테스트 샘플을 생성하기 위해 샘플과 혼합될 때, 액체 고정액으로부터 유래하는 카오트로픽제 및/또는 점도 개질제가 본원에 기재된 바와 같은 농도에 있도록 한다.
일부 측면에서, 본원에는 개체의 혈액 샘플로부터 혈장의 테스트 샘플을 제조하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 혈장의 테스트 샘플을 제조하는 방법은 본원에 기재된 다른 방법과 통합된다. 일부 구현예에서, 개체로부터의 샘플이 혈액 샘플일 때, 방법은 혈장 샘플을 제조하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 혈장 샘플을 제조하는 단계는 혈액 샘플을 혈장 생성 기술에 적용하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 혈장 생성 기술은 샘플을 폴리술폰 매질에 적용하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리술폰 매질은 비대칭 폴리술폰 물질이다. 일부 구현예에서, 혈장 생성 기술은 모세관 작용 여과 기술이다. 일부 구현예에서, 혈장 생성 기술은 폴리술폰(예컨대 비대칭 폴리술폰) 모세관 작용 여과 기술이다.
혈장 샘플을 생성하기 위한 추가의 기술이 당업계에 알려져 있으며, 이러한 기술은 본원에 기재된 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 혈장 생성 기술은 개체로부터의 혈액 샘플을 원심분리에 적용하는 것을 포함하며, 상기 혈액 샘플의 원심분리는 전혈로부터 혈장을 분리하도록 항응고제(예를 들어, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 헤파린, 및 시트레이트 중 임의의 하나 이상)의 존재 하에 수행된다. 일부 구현예에서, 혈장 생성 기술은 개체로부터의 혈액 샘플을 응집시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 혈장 생성 기술은 개체로부터의 혈액 샘플을 수동 또는 능동 미세유체-기반 분리에 적용하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 혈장 생성 기술은 개체로부터의 혈액 샘플을 폴리술폰, 폴리에테르술폰, 및 셀룰로스 아세테이트 중 임의의 하나 이상을 포함하는 매질에 적용하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 혈장 생성 기술에 적용된 혈액 샘플의 부피는 약 10 μL 내지 약 200 μL, 예컨대 10 μL 내지 약 100 μL, 예컨대 약 25 μL 내지 약 75 μL 중 임의의 것이다. 일부 구현예에서, 혈장 생성 기술에 적용된 혈액 샘플의 부피는 적어도 약 10 μL, 예컨대 적어도 약 20 μL, 30 μL, 40 μL, 50 μL, 60 μL, 70 μL, 80 μL, 90 μL, 100 μL, 110 μL, 120 μL, 130 μL, 140 μL, 150 μL, 160 μL, 170 μL, 180 μL, 190 μL, 또는 200 μL 중 임의의 것이다. 일부 구현예에서, 혈장 생성 기술에 적용된 혈액 샘플의 부피는 적어도 약 10 μL, 예컨대 적어도 약 20 μL, 30 μL, 40 μL, 50 μL, 60 μL, 70 μL, 80 μL, 90 μL, 100 μL, 110 μL, 120 μL, 130 μL, 140 μL, 150 μL, 160 μL, 170 μL, 180 μL, 190 μL, 또는 200 μL 중 임의의 것, 및 약 500 μL 미만이다. 일부 구현예에서, 혈장 생성 기술에 적용된 혈액 샘플의 부피는 약 200 μL 미만, 예컨대 190 μL, 180 μL, 170 μL, 160 μL, 150 μL, 140 μL, 130 μL, 120 μL, 110 μL, 100 μL, 90 μL, 80 μL, 70 μL, 60 μL, 50 μL, 40 μL, 30 μL, 20 μL, 또는 10 μL 미만 중 임의의 것이다. 일부 구현예에서, 혈장 생성 기술에 적용된 혈액 샘플의 부피는 약 10 μL, 20 μL, 30 μL, 40 μL, 50 μL, 60 μL, 70 μL, 80 μL, 90 μL, 100 μL, 110 μL, 120 μL, 130 μL, 140 μL, 150 μL, 160 μL, 170 μL, 180 μL, 190 μL, 또는 200 μL 중 임의의 것이다.
일부 구현예에서, 생성된 혈장의 부피는 약 1 μL 내지 약 100 μL이다. 일부 구현예에서, 생성된 혈장의 부피는 적어도 약 1 μL, 예컨대 적어도 약 2 μL, 3 μL, 4 μL, 5 μL, 6 μL, 7 μL, 8 μL, 9 μL, 10 μL, 15 μL, 20 μL, 25 μL, 30 μL, 35 μL, 40 μL, 45 μL, 50 μL, 55 μL, 60 μL, 65 μL, 70 μL, 75 μL, 80 μL, 85 μL, 90 μL, 95 μL, 또는 100 μL 중 임의의 것이다. 일부 구현예에서, 생성된 혈장의 부피는 약 1 μL, 2 μL, 3 μL, 4 μL, 5 μL, 6 μL, 7 μL, 8 μL, 9 μL, 10 μL, 15 μL, 20 μL, 25 μL, 30 μL, 35 μL, 40 μL, 45 μL, 50 μL, 55 μL, 60 μL, 65 μL, 70 μL, 75 μL, 80 μL, 85 μL, 90 μL, 95 μL, 또는 100 μL 중 임의의 것이다.
일부 구현예에서, 생성된 혈장 샘플과 같은 혈장 샘플은 액체 고정액과 혼합되어 테스트 샘플(테스트 혈장 샘플)을 생성한다. 일부 구현예에서, 혈장 샘플은 혈장 샘플의 제조 후(예컨대 즉시) 직접 액체 고정액과 혼합된다. 일부 구현예에서, 방법은 혈장 샘플(예컨대 생성된 혈장 샘플)을 액체 고정액과 혼합하여 테스트 샘플(테스트 혈장 샘플)을 생성하는 것을 포함한다. 본원에서 논의된 바와 같이, 액체 고정액의 구성요소의 농도는 적어도 부분적으로, 액체 고정액으로부터 유래하는 테스트 샘플 내 구성요소(예컨대 카오트로픽제 및/또는 점도 개질제)의 원하는 농도에 기반하여 조정될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법으로 혼합된 액체 고정액에 대한 샘플(예컨대 혈장 샘플)의 부피는 적어도 부분적으로, 액체 고정액으로부터 유래하는 테스트 샘플 내 구성요소(예컨대 카오트로픽제 및/또는 점도 개질제)의 원하는 농도, 테스트 샘플의 원하는 최종 부피, 및/또는 액체 고정액 내 특정 구성요소의 농도 제한에 기반할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법을 사용하여 생성된 테스트 혈장 샘플과 같은 테스트 샘플은 테스트 샘플을 SEC 미세유체 장치를 사용하는 SEC 기술과 같은 본원에 기재된 분리 기술에 적용하기 전에 추가로 고갈되지 않는다. 일부 구현예에서, 이러한 고갈 방법은 항체, 압타머, 다른 친화성 시약, 및 분자 막 한외여과 중 임의의 하나의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법을 사용하여 생성된 테스트 혈장 샘플과 같은 테스트 샘플은 SEC 미세유체 장치를 사용하는 SEC 기술과 같은, 본원에 기재된 분리 기술에 테스트 샘플을 적용하기 전에 7 개의 통상의 매우 풍부한 혈액 단백질(알부민, IgG, 항트립신, IgA, 트랜스페린, 합토글로빈, 피브리노겐) 중 임의의 하나 이상을 제거하기 위해 추가로 고갈되지 않는다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법을 사용하여 생성된 테스트 혈장 샘플과 같은 테스트 샘플은 SEC 미세유체 장치를 사용하는 SEC 기술과 같은, 본원에 기재된 분리 기술에 테스트 샘플을 적용하기 전에 14 개의 통상의 매우 풍부한 혈액 단백질(알부민, IgG, 항트립신, IgA, 트랜스페린, 합토글로빈, 피브리노겐, 알파2-매크로글로불린, 알파1-산 당단백질, IgM, 아포지질단백질 AI, 아포지질단백질 AII, 보체 C3, 트랜스티레틴) 중 임의의 하나 이상을 제거하도록 추가로 고갈되지 않는다.
일부 구현예에서, 혈장 생성 기술은 주위 온도에서, 예컨대 실온 또는 부근에서 수행된다. 일부 구현예에서, 혈장 생성 기술은 약 20℃ 내지 약 40℃의 온도에서 수행된다. 일부 구현예에서, 혈장 생성 기술은 약 20℃, 21℃, 22℃, 23℃, 24℃, 25℃, 26℃, 27℃, 28℃, 29℃, 30℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃, 37℃, 38℃, 39℃, 또는 40℃ 중 임의의 온도에서 수행된다.
B. 액체 크로마토그래피
특정 측면에서, 본원에 기재된 방법은 샘플의 구성요소, 또는 이의 생성물을 분리하고/하거나 농축하도록 설계된 액체 크로마토그래피 방법(예컨대 액체 크로마토그래피 단계)을 포함한다. 일부 구현예에서, 질량 분광법 분석을 위한 개체로부터의 샘플과 같은 생물학적 샘플의 구성요소, 또는 이의 생성물을 처리하는 방법은 2, 3, 및 4차원의 크로마토그래피를 포함하는 하나 이상의 차원의 크로마토그래피를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 초과 차원의 크로마토그래피를 포함하는 방법의 경우, 크로마토그래피 차원은 오프라인으로 수행되고, 임의적으로 이전, 이후, 또는 사이에 하나 이상의 처리 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 보다 많은 차원의 크로마토그래피를 포함하는 방법의 경우, 크로마토그래피 차원은 온라인으로 수행된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법의 크로마토그래피의 차원은 직교이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 액체 크로마토그래피 방법은 본원에 기재된 바와 같은 복수의 상호연결된 채널을 갖는 미세유체 장치를 사용하여 완료된다.
일부 구현예에서, 2 개 이상의 크로마토그래피 단계(예컨대 크기 배제 크로마토그래피 단계 후 역상 크로마토그래피 단계)는 중간 단백질분해 단계를 필요로 하지 않는 적용을 위해(예를 들어, 단백질 경로 및 네트워크의 대리 마커로서 제공될 수 있는 천연 펩티드 또는 대사물의 분석을 위해), 예를 들어 동일한 칩 상에서 순차적으로 완료된다. 일부 구현예에서, 이러한 통합된 2차원 μSEC-RP 랩-칩은 질량 분광계를 위한 대기압 이온화 소스에 직접 접속될 수 있다.
i. 크기 배제 크로마토그래피(SEC)
특정 측면에서, 본원에는 본원에 기재된 SEC 미세유체 장치를 사용하여 완료된 SEC 기술과 같은 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 기술을 포함하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, SEC 기술은 SEC 미세유체 장치에 유체 입력물을 도입하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 유체 입력물은 일부 추가 처리 단계의 생성물과 같은 테스트 샘플 또는 이의 유도체이다.
일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치를 사용하여 SEC 기술에 적용된 테스트 샘플과 같은 유체 입력물은 약 1 μL 내지 약 200 μL의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치를 사용하여 SEC 기술에 적용된 테스트 샘플과 같은 유체 입력물은 적어도 약 1 μL, 예컨대 적어도 약 5 μL, 10 μL, 15 μL, 20 μL, 25 μL, 30 μL, 35 μL, 40 μL, 45 μL, 50 μL, 55 μL, 60 μL, 65 μL, 70 μL, 75 μL, 80 μL, 85 μL, 90 μL, 95 μL, 100 μL, 110 μL, 120 μL, 130 μL, 140 μL, 150 μL, 160 μL, 170 μL, 180 μL, 또는 190 μL 중 임의의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치를 사용하여 SEC 기술에 적용된 테스트 샘플과 같은 유체 입력물은 약 200 μL 미만, 예컨대 약 190 μL, 180 μL, 170 μL, 160 μL, 150 μL, 140 μL, 130 μL, 120 μL, 110 μL, 100 μL, 95 μL, 90 μL, 85 μL, 80 μL, 75 μL, 70 μL, 65 μL, 60 μL, 55 μL, 50 μL, 45 μL, 40 μL, 35 μL, 30 μL, 20 μL, 10 μL, 또는 5 μL 미만 중 임의의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치를 사용하여 SEC 기술에 적용된 테스트 샘플과 같은 유체 입력물은 약 1 μL, 5 μL, 10 μL, 15 μL, 20 μL, 25 μL, 30 μL, 35 μL, 40 μL, 45 μL, 50 μL, 55 μL, 60 μL, 65 μL, 70 μL, 75 μL, 80 μL, 85 μL, 90 μL, 95 μL, 100 μL, 110 μL, 120 μL, 130 μL, 140 μL, 150 μL, 160 μL, 170 μL, 180 μL, 190 μL, 또는 200 μL 중 임의의 부피를 갖는다.
일부 구현예에서, SEC 기술은 테스트 샘플에서 카오트로픽제의 미리 결정된 농도 범위에서 이동상 카오트로픽제의 농도를 갖는 SEC 이동상의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, SEC 기술의 이동상 카오트로픽제의 농도 범위는 테스트 샘플의 카오트로픽제의 미리 결정된 농도의 약 +/- 40%, 예컨대 임의의 약 +/- 35%, +/- 30%, +/- 25%, +/- 20%, +/- 15%, +/- 10%, +/- 8%, +/- 6%, +/- 5%, +/- 4%, +/- 3%, +/- 2%, +/- 1% 이내 중 임의의 것이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드를 포함하는 테스트 샘플의 경우, SEC 이동상은 6 M을 포함하여, 6 M의 +/- 10%로 구아니딘을 포함한다.
일부 구현예에서, SEC 기술의 이동상 카오트로픽제는 액체 고정액의 카오트로픽제와 동일하다. 일부 구현예에서, SEC 기술의 이동상 카오트로픽제는 액체 고정액의 카오트로픽제와 상이하다. 일부 구현예에서, 이동상 카오트로픽제는 구아니딘 또는 이의 염, 구아니디늄 또는 이의 염, 칼륨 또는 이의 염, 리튬 또는 이의 염, 마그네슘 또는 이의 염, 또는 나트륨 또는 이의 염을 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 카오트로픽제는 구아니딘 하이드로클로라이드, 구아니디늄 클로라이드, 구아니디늄 티오시난트, 리튬 퍼클로레이트, 리튬 아세테이트, 마그네슘 클로라이드, 칼륨 아세테이트, 및 나트륨 요오다이드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 이동상 카오트로픽제는 구아니딘 염이다. 일부 구현예에서, 이동상 카오트로픽제는 구아니딘 하이드로클로라이드이다.
일부 구현예에서, SEC 이동상은 이동상 약 5 M 내지 약 8 M, 예컨대 약 5.5 M 내지 약 8 M, 약 5.5 M 내지 약 7 M, 또는 약 5.5 M 내지 약 6.5 M 중 임의의 이동상 카오트로픽제의 농도를 포함한다. 일부 구현예에서, SEC 이동상은 적어도 약 5.5 M, 예컨대 적어도 약 6 M, 6.5 M, 7 M, 7.5 M, 또는 8 M 중 임의의 이동상 카오트로픽제의 농도를 포함한다. 일부 구현예에서, SEC 이동상은 약 8 M 이하, 예컨대 약 7.5 M 이하, 6.5 M 이하, 또는 6 M 이하 중 임의의 이동상 카오트로픽제의 농도를 포함한다. 일부 구현예에서, SEC 이동상은 5.5 M, 6 M, 6.5 M, 7 M, 7.5 M, 또는 8 M의 이동상 카오트로픽제의 농도를 포함한다.
일부 구현예에서, SEC 이동상은 이동상 점도 조절제를 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 점도 조절제는 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 소르비톨, 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 이동상 점도 조절제는 글리세롤이다.
일부 구현예에서, SEC 이동상은 약 5% 내지 약 40%, 예컨대 약 5% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 30%, 또는 약 20% 내지 약 40% 중 임의의 이동상 점도 조절제의 농도를 포함한다. 일부 구현예에서, SEC 이동상은 적어도 약 5%, 예컨대 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 또는 40% 중 임의의 이동상 점도 조절제의 농도를 포함한다. 일부 구현예에서, SEC 이동상은 약 40% 이하, 예컨대 약 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 또는 5% 이하 중 임의의 이동상 점도 조절제의 농도를 포함한다. 일부 구현예에서, SEC 이동상은 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50%의 이동상 점도 조절제의 농도를 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상에서 점도 조절제의 양은 (예컨대 SEC 미세유체 장치를 포함하여, 본원에 기재된 방법의 측면을 통해 처리하기 위해) 이동상의 원하는 점도에 기반한다.
일부 구현예에서, SEC 이동상은 약 5 M 내지 약 8 M, 예컨대 약 5.5 M 내지 약 7.5 M, 약 5.5 M 내지 약 7 M, 또는 약 5.5 M 내지 약 6.5 M 중 임의의 이동상 카오트로픽제(이러한 구아니딘 하이드로클로라이드)의 농도, 및 약 5% 내지 약 40%, 예컨대 약 5% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 30%, 또는 약 20% 내지 약 40% 중 임의의 이동상 점도 조절제(예컨대 글리세롤)의 농도를 포함한다. 일부 구현예에서, SEC 이동상은 적어도 약 5 M, 예컨대 적어도 약 5.5 M, 6 M, 6.5 M, 7 M, 7.5 M, 또는 8 M 중 임의의 이동상 카오트로픽제(이러한 구아니딘 하이드로클로라이드)의 농도, 및 적어도 약 5%, 예컨대 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 또는 40% 중 임의의 이동상 점도 조절제(예컨대 글리세롤)의 농도를 포함한다. 일부 구현예에서, SEC 이동상은 약 8 M 이하, 예컨대 약 7.5 M 이하, 6.5 M 이하, 또는 6 M 이하 중 임의의 이동상 카오트로픽제(이러한 구아니딘 하이드로클로라이드)의 농도, 및 약 40% 이하, 예컨대 약 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 또는 5% 이하 중 임의의 이동상 점도 조절제(예컨대 글리세롤)의 농도를 포함한다. 일부 구현예에서, SEC 이동상은 약 5 M, 5.5 M, 6 M, 6.5 M, 7 M, 7.5 M, 또는 8 M 중 임의의 이동상 카오트로픽제(이러한 구아니딘 하이드로클로라이드)의 농도, 및 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% 중 임의의 이동상 점도 조절제(예컨대 글리세롤)의 농도를 포함한다.
일부 구현예에서, SEC 이동상은 약 5.5 M 내지 약 8 M, 예컨대 약 6 M 이상의 이동상 카오트로픽제(예를 들어, 구아니딘 하이드로클로라이드)의 농도, 및 약 5% 내지 약 40%, 이러한 약 10% 내지 약 30%의 이동상 점도 개질제(예를 들어, 글리세롤)의 농도를 포함한다.
일부 구현예에서, SEC 기술의 이동상 점도 개질제는 액체 고정액의 점도 개질제와 동일하다. 일부 구현예에서, SEC 기술의 이동상 점도 개질제는 액체 고정액의 점도 개질제와 상이하다.
일부 구현예에서, SEC 기술은 등용매 SEC 기술이다(즉, 단일 SEC 이동상이 사용되고 구성요소 농도의 구배는 수행되지 않는다).
일부 구현예에서, SEC 기술은 약 1 μL/ 분 내지 약 5 μL/ 분, 예컨대 약 1 μL/ 분, 1.5 μL/ 분, 2 μL/ 분, 2.5 μL/ 분, 3 μL/ 분, 3.5 μL/ 분, 4 μL/ 분, 4.5 μL/ 분, 또는 5 μL/ 분 중 임의의 이동상 유속의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상이 도입될 수 있고 유속은 주사기 펌프 또는 초고성능 액체 크로마토그래피 펌프와 같은 당업계에 알려진 시스템에 의해 제어될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 SEC 기술은 주위 온도(예컨대 컬럼 온도에 기반), 예컨대 실온 또는 부근에서 수행된다. 일부 구현예에서, SEC 기술은 고온에서 수행된다. 일부 구현예에서, SEC 기술은 약 15℃ 내지 약 60℃, 예컨대 약 15℃ 내지 약 45℃, 약 23℃ 내지 약 45℃, 약 30℃ 내지 약 50℃, 또는 약 45℃ 내지 약 60℃ 중 임의의 온도에서 수행된다. 일부 구현예에서, SEC 기술은 적어도 약 15℃, 예컨대 적어도 약 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 40℃, 45℃, 50℃, 55℃, 또는 60℃ 중 임의의 온도에서 수행된다. 일부 구현예에서, SEC 기술은 약 60℃ 미만, 예컨대 약 55℃, 50℃, 45℃, 40℃, 35℃, 30℃, 25℃, 20℃, 또는 15℃ 미만 중 임의의 온도에서 수행된다. 일부 구현예에서, SEC 기술은 약 15℃, 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 40℃, 45℃, 50℃, 55℃, 또는 60℃ 중 임의의 것에서 수행된다.
일부 구현예에서, SEC 기술은 실질적으로 일관된 온도에서 수행된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, SEC 기술은 원하는 온도 범위로 수행된다. 일부 구현예에서, 범위는 원하는 농도의 약 +/- 8℃, +/- 6℃, +/- 5℃, +/- 4℃, +/- 3℃, +/- 2℃, 또는 +/- 1℃ 중 임의의 것이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, SEC 기술은 21℃의 +/- 5℃ 범위로 수행된다.
일부 구현예에서, SEC 기술은 원하는 분리에 기반하여 선택된 SEC 매질의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, SEC 기술은 SEC 미세유체 장치의 구성요소와의 호환성 및/또는 기공 크기와 같은, 이의 특성에 기반하여 SEC 매질을 선택하는 것을 포함한다.
ii. 역상 액체 크로마토그래피
본원에는 본원에 기재된 RPLC 미세유체 장치를 사용하여 완료된 RPLC 기술과 같은 역상 액체 크로마토그래피(RPLC) 기술을 포함하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, RPLC 기술은 RPLC 미세유체 장치에 유체 입력물을 도입하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 유체 입력물은 RPLC-호환성 분획과 같은 RPLC-호환성 유체이고, 본원에 기재된 방법, 예를 들어, 본원에 기재된 SEC 미세유체 장치를 사용하여 완료된 SEC 기술로부터 수득된 것들을 포함하고, 임의적으로 단백질분해 기술에 적용된다.
일부 구현예에서, RPLC 기술에 적용된 분획은 그의 공급원으로부터 조절된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, RPLC 기술에 적용된 분획은 SEC 분획의 적어도 일부를 포함하며, 상기 SEC 분획은 RPLC 기술에 적용되기 전에 추가로 처리된다. 일부 구현예에서, RPLC 기술에 적용된 분획은 단백질분해 기술에 적용된 분획의 적어도 일부를 포함하며, 상기 단백질분해 기술에 적용된 분획은 RPLC 기술에 적용되기 전에 추가로 처리된다. 일부 구현예에서, RPLC 기술에 적용된 분획은 정량적 표지화 기술에 적용된 분획의 적어도 일부를 포함하며, 상기 정량적 표지화 기술에 적용된 분획은 RPLC 기술에 적용되기 전에 추가로 처리된다. 일부 구현예에서, RPLC 기술에 적용된 분획은 탈염 단계를 거쳤다. 일부 구현예에서, RPLC 기술에 적용된 분획은 RPLC 호환성 용액으로 희석하는 것과 같은 희석 단계를 거쳤다.
일부 구현예에서, 분획 세트, 또는 이의 부분은 각각 RPLC 미세유체 장치를 사용하여 완료된 RPLC 크로마토그래피 기술을 포함하여 본원에 기재된 RPLC 기술에 적용된다. 일부 구현예에서, 분획 세트는 SEC 기술에 따라 SEC 미세유체 장치로부터 수득된 분획, 또는 이의 처리된 유도체를 포함한다. 일부 구현예에서, 분획 세트는 단백질분해 기술로부터 수득된 분획, 또는 이의 처리된 유도체를 포함한다. 일부 구현예에서, 분획 세트는 SEC 미세유체 장치로부터의 분획의 일부, 및 단백질분해 기술에 적용된 SEC 미세유체 장치로부터의 분획의 또 다른 부분을 포함한다.
일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치에 대한 분획과 같은 유체 입력물은 약 1 μL 내지 약 50 μL, 예컨대 약 1 μL 내지 약 25 μL, 또는 약 5 μL 내지 약 20 μL의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치에 대한 분획과 같은 유체 입력물은 적어도 약 1 μL, 예컨대 적어도 약 2 μL, 3 μL, 4 μL, 5 μL, 6 μL, 7 μL, 8 μL, 9 μL, 10 μL, 15 μL, 20 μL, 25 μL, 30 μL, 35 μL, 40 μL, 45 μL, 또는 50 μL 중 임의의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치에 대한 분획과 같은 유체 입력물은 약 50 μL 미만, 예컨대 약 45 μL, 40 μL, 35 μL, 30 μL, 25 μL, 20 μL, 15 μL, 10 μL, 9 μL, 8 μL, 7 μL, 6 μL, 5 μL, 4 μL, 3 μL, 2 μL, 또는 1 μL 미만 중 임의의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치에 대한 분획과 같은 유체 입력물은 약 1 μL, 2 μL, 3 μL, 4 μL, 5 μL, 6 μL, 7 μL, 8 μL, 9 μL, 10 μL, 15 μL, 20 μL, 25 μL, 30 μL, 35 μL, 40 μL, 45 μL, 또는 50 μL 중 임의의 부피를 갖는다.
일부 구현예에서, RPLC 기술은 RPLC 이동상의 사용을 포함한다. RPLC 이동상은 당업계에 잘 알려져 있고 본원에 기재된 방법 및 장치와 호환성다. 일부 구현예에서, RPLC 이동상은 샘플의 구성요소, 또는 이의 생성물의 용출을 용이하게 하기 위해서와 같이, RPLC 기술과정에 걸쳐 조정되는 동적 이동상이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, RPLC 이동상은 수용액의 농도 및 유기 용액의 농도를 포함한다. 일부 구현예에서, 수용액은 초순수와 같은 물을 포함한다. 일부 구현예에서, 유기 용액은 아세토니트릴을 포함한다. 일부 구현예에서, RPLC 이동상은 RPLC 기술 및/또는 질량 분광법에 유용한 추가의 구성요소를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, RPLC 이동상은 산성 pH를 갖도록 약산으로 조정된다. 일부 구현예에서, RPLC 이동상은 포름산, 트리플루오로아세트산, 또는 아세트산과 같은 약산을 포함한다. 일부 구현예에서, RPLC 이동상에서 약산의 농도는 약 0.5% 미만, 예컨대 약 0.4%, 0.3%, 0.2%, 또는 0.1% 중 임의의 것이다.
일부 구현예에서, RPLC 기술은 구배 RPLC 기술이다(즉, 이동상의 유기 상의 양을 증가시키는 것과 같은 이동상 구성요소의 구배가 용출에 사용된다).
일부 구현예에서, RPLC 기술은 약 0.05 μL/ 분 내지 약 2 μL/ 분, 예컨대 약 0.1 μL/ 분, 0.2 μL/ 분, 0.3 μL/ 분, 0.4 μL/ 분, 0.5 μL/ 분, 0.6 μL/ 분, 0.7 μL/ 분, 0.8 μL/ 분, 0.9 μL/ 분, 1 μL/ 분, 1.1 μL/ 분, 1.2 μL/ 분, 1.3 μL/ 분, 1.4 μL/ 분, 1.5 μL/ 분, 1.6 μL/ 분, 1.7 μL/ 분, 1.8 μL/ 분, 1.9 μL/ 분, 또는 2 μL/ 분 중 임의의 이동상 유속의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상이 도입될 수 있고 유속은 주사기 펌프 또는 초고성능 액체 크로마토그래피 펌프와 같은, 당업계에 알려진 시스템에 의해 제어될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 RPLC 기술은 주위 온도, 예컨대 실온 또는 부근에서 수행(예컨대 컬럼 온도에 의해 평가)된다. 일부 구현예에서, RPLC 기술은 고온에서 수행된다. 일부 구현예에서, SEC 기술은 약 15℃ 내지 약 100℃, 예컨대 약 15℃ 내지 약 45℃, 약 23℃ 내지 약 45℃, 약 30℃ 내지 약 50℃, 또는 약 45℃ 내지 약 60℃ 중 임의의 온도에서 수행된다. 일부 구현예에서, RPLC 기술은 적어도 약 15℃, 예컨대 적어도 약 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 40℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃, 70℃, 75℃, 80℃, 85℃, 90℃, 95℃, 또는 100℃ 중 임의의 온도에서 수행된다. 일부 구현예에서, SEC 기술은 약 100℃ 미만, 예컨대 약 95℃, 90℃, 85℃, 80℃, 75℃, 70℃, 65℃, 60℃, 55℃, 50℃, 45℃, 40℃, 35℃, 30℃, 25℃, 20℃, 또는 15℃ 미만 중 임의의 온도에서 수행된다. 일부 구현예에서, RPLC 기술은 약 15℃, 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 40℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃, 70℃, 75℃, 80℃, 85℃, 90℃, 95℃, 또는 100℃ 중 임의의 것에서 수행된다.
일부 구현예에서, RPLC 기술은 실질적으로 일관된 온도에서 수행된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, RPLC 기술은 원하는 농도 범위로 수행된다. 일부 구현예에서, 범위는 원하는 온도의 약 +/- 8℃, +/- 6℃, +/- 5℃, +/- 4℃, +/- 3℃, +/- 2℃, 또는 +/- 1℃ 중 임의의 것이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, RPLC 기술은 21℃의 +/- 5℃ 범위로 수행된다.
C. 분획 수집
일부 측면에서, 본원에는 본원에 기재된 크로마토그래피 기술을 사용하여 어느 정도 분리 후에 샘플의 분획(예를 들어, 개별 분절)을 포획하는 데 유용한 분획 수집 기술 및 분획 수집 장치가 제공된다.
일부 구현예에서, 분획 특성(예컨대 수집 크기 또는 기간)은 적어도 부분적으로, 본원에 기재된 액체 크로마토그래피 기술에 의해 수행된 분리의 원하는 분할에 기반한다. 일부 구현예에서, 방법은 용출 시간에 기반하여 분획을 선택하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 분획은 본원에 기재된 SEC 미세유체 장치를 사용하는 SEC 기술과 같은 액체 크로마토그래피 기술로부터 약 30 초 내지 약 5 분, 예컨대 약 30 초 내지 약 3 분, 약 1 분 내지 약 2 분, 약 1 분 내지 약 4 분, 또는 약 2 분 내지 약 5 분 중 임의의 기간 동안 수집된다. 일부 구현예에서, 분획은 본원에 기재된 SEC 미세유체 장치를 사용하는 SEC 기술과 같은 액체 크로마토그래피 기술로부터 적어도 약 30 초, 예컨대 적어도 약 1 분, 1.5 분, 2 분, 2.5 분, 3 분, 3.5 분, 4 분, 4.5 분, 또는 5 분 중 임의의 기간 동안 수집된다. 일부 구현예에서, 분획은 본원에 기재된 SEC 미세유체 장치를 사용하는 SEC 기술과 같은 액체 크로마토그래피 기술로부터 약 5 분 이하의 기간, 예컨대 약 4.5 분 이하, 4 분 이하, 3.5 분 이하, 3 분, 2.5 분, 2 분, 1.5 분, 1 분, 또는 30 초 미만 중 임의의 기간 동안 수집된다. 일부 구현예에서, 분획은 본원에 기재된 SEC 미세유체 장치를 사용하는 SEC 기술과 같은 액체 크로마토그래피 기술로부터 약 30 초, 1 분, 1.5 분, 2 분, 2.5 분, 3 분, 3.5 분, 4 분, 4.5 분, 또는 5 분 중 임의의 기간 동안 수집된다. 일부 구현예에서, 복수의 분획 각각은 SEC 미세유체 장치로부터 약 1 분 내지 약 2 분의 기간 동안 수집된다.
일부 구현예에서, 복수의 분획 각각은 본원에 기재된 SEC 미세유체 장치를 사용하는 SEC 기술과 같은 액체 크로마토그래피 기술로부터 균일한 시간 동안 수집된다. 일부 구현예에서, 복수의 분획 중 하나의 분획은 본원에 기재된 SEC 미세유체 장치를 사용하는 SEC 기술과 같은 액체 크로마토그래피 기술로부터 복수의 분획 중 또 다른 분획과 상이한 시간 동안 수집된다.
일부 구현예에서, 분획은 본원에 기재된 SEC 미세유체 장치를 사용하는 SEC 기술과 같은 액체 크로마토그래피 기술로부터 그로부터의 용출액의 부피에 기반하여 수집된다. 일부 구현예에서, 분획은 약 1 μL 내지 약 20 μL, 예컨대 약 1 μL 내지 약 8 μL, 약 5 μL 내지 약 15 μL, 또는 약 10 μL 내지 약 20 μL 중 임의의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 분획은 최소 약 1 μL, 예컨대 적어도 약 2 μL, 3 μL, 4 μL, 5 μL, 6 μL, 7 μL, 8 μL, 9 μL, 10 μL, 11 μL, 12 μL, 13 μL, 14 μL, 15 μL, 16 μL, 17 μL, 18 μL, 19 μL, 또는 20 μL 중 임의의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 분획은 약 20 μL 이하, 예컨대 약 19 μL 이하, 18 μL 이하, 17 μL 이하, 16 μL 이하, 15 μL 이하, 14 μL 이하, 13 μL 이하, 12 μL 이하, 11 μL 이하, 10 μL 이하, 9 μL 이하, 8 μL 이하, 7 μL 이하, 6 μL 이하, 5 μL 이하, 4 μL 이하, 3 μL 이하, 2 μL 이하, 또는 1 μL 이하 중 임의의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 분획은 약 1 μL, 2 μL, 3 μL, 4 μL, 5 μL, 6 μL, 7 μL, 8 μL, 9 μL, 10 μL, 11 μL, 12 μL, 13 μL, 14 μL, 15 μL, 16 μL, 17 μL, 18 μL, 19 μL, 또는 20 μL 중 임의의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 SEC 미세유체 장치를 사용하는 SEC 기술과 같은 액체 크로마토그래피 기술로부터 수집된 복수의 분획 각각은 균일한 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 SEC 미세유체 장치를 사용하는 SEC 기술과 같은 액체 크로마토그래피 기술로부터 수집된 복수의 분획 중 하나의 분획은 복수의 분획 중 또 다른 분획과 상이한 부피를 갖는다.
일부 구현예에서, 방법은 본원에 기재된 SEC 미세유체 장치를 사용하는 SEC 기술과 같은 액체 크로마토그래피 기술로부터 복수의 분획을 수집하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 분획은 약 5 개의 분획 내지 약 50 개의 분획, 예컨대 약 5 개의 분획 내지 약 30 개의 분획, 약 12 개의 분획 내지 약 24 개의 분획, 또는 약 30 개의 분획 내지 약 50 개의 분획이다. 일부 구현예에서, 복수의 분획은 적어도 약 5 개의 분획, 예컨대 적어도 약 10 개의 분획, 11 개의 분획, 12 개의 분획, 13 개의 분획, 14 개의 분획, 15 개의 분획, 16 개의 분획, 17 개의 분획, 18 개의 분획, 19 개의 분획, 20 개의 분획, 21 개의 분획, 22 개의 분획, 23 개의 분획, 24 개의 분획, 25 개의 분획, 30 개의 분획, 35 개의 분획, 40 개의 분획, 45 개의 분획, 또는 50 개의 분획 중 임의의 것이다. 일부 구현예에서, 복수의 분획은 약 50 개 이하의 분획, 예컨대 약 45 개 이하의 분획, 40 개 이하의 분획, 35 개 이하의 분획, 30 개 이하의 분획, 25 개 이하의 분획, 24 개 이하의 분획, 23 개 이하의 분획, 22 개 이하의 분획, 21 개 이하의 분획, 20 개 이하의 분획, 19 개 이하의 분획, 18 개 이하의 분획, 17 개 이하의 분획, 16 개 이하의 분획, 15 개 이하의 분획, 14 개 이하의 분획, 13 개 이하의 분획, 12 개 이하의 분획, 11 개 이하의 분획, 10 개 이하의 분획, 또는 5 개 이하의 분획 중 임의의 것이다. 일부 구현예에서, 복수의 분획은 약 5 개의 분획, 10 개의 분획, 11 개의 분획, 12 개의 분획, 13 개의 분획, 14 개의 분획, 15 개의 분획, 16 개의 분획, 17 개의 분획, 18 개의 분획, 19 개의 분획, 20 개의 분획, 21 개의 분획, 22 개의 분획, 23 개의 분획, 24 개의 분획, 25 개의 분획, 30 개의 분획, 35 개의 분획, 40 개의 분획, 45 개의 분획, 또는 50 개의 분획 중 임의의 것이다. 일부 구현예에서, 복수의 분획은 약 12 개의 분획을 포함하여 약 12 개의 분획 내지 약 24 개의 분획이다.
일부 구현예에서, 분획은 분획 수집기를 사용하여 수집된다. 일부 구현예에서, 분획 수집기는 SEC 미세유체 장치와 같은 본원에 기재된 액체 크로마토그래피 장치에 연결된다. 일부 구현예에서, 분획은 미세유체 장치(예를 들어, 랩-온-칩 장치)의 구획과 같은 미세유체 또는 칩-기반 특징을 통해 수집된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 SEC 미세유체 장치로부터 용출된 복수의 분획은 칩-기반 분획 수집기(예를 들어, 랩-칩 장치)를 사용하여 수집된다.
D. 용해 기술
일부 구현예에서, 방법은 단백질분해 기술과 같은 용해 기술을 포함한다. 일부 구현예에서, 용해 기술은 샘플의 구성요소, 또는 이의 생성물의 일부의 분리를 초래한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 용해 기술은 폴리펩티드를 2 개 이상의 생성된 생성물로 분해하는 단백질분해 기술이다. 일부 구현예에서, 용해 기술은 폴리펩티드로부터 대사물(예컨대 번역후 변형)을 분리한다. 일부 구현예에서, 용해 기술은 대사물을 2 개 이상의 생성물로 분리한다.
질량 분광법 기술을 통한 분석을 위한 샘플의 모체 폴리펩티드의 생성물인 펩티드와 같은 폴리펩티드를 생산하기 위한 단백질분해 기술은 당업계에 알려져 있다. 일부 구현예에서, 모체 폴리펩티드의 생성물인 펩티드와 같은 폴리펩티드는 폴리펩티드 생성물을 질량 분광계에 적용하기 전에 단백질분해(예를 들어, 샘플 분해)를 통해 수득된다. 일부 구현예에서, 모체 폴리펩티드의 생성물인 펩티드와 같은 폴리펩티드는 질량 분광계 내에서 수득된다. 일부 구현예에서, 단백질분해 기술은 본원에 기재된 방법으로부터 수득된 복수의 분획 중 하나 이상, 예컨대 전부에 대해 수행된다. 일부 구현예에서, 단백질분해 기술은 본원에 기재된 방법으로부터 수득된 샘플 또는 분획의 일부에 대해 수행된다.
일부 구현예에서, 단백질분해 기술은 효소-기반 분해 기술을 포함한다. 일부 구현예에서, 효소-기반 분해 기술은 프로테아제와 같은 단백질분해 효소의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질분해 효소는 트립신, 키모트립신, 써모리신, 펩신, 엘라스타제, Lys-C, Lys-N, Asp-N, Glu-C, Arg-C, TEV, IdeS, IdeZ, PNGase F, 및 Factor Xa, 또는 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 단백질분해 기술은 화학-기반 단백질분해 기술이다. 일부 구현예에서, 화학-기반 단백질분해 기술은 강산과 같은 산의 사용을 포함한다.
일부 구현예에서, 단백질분해 기술은 용액상 단백질분해 기술이다. 일부 구현예에서, 단백질분해 기술은 고체상 또는 고체상태 단백질분해 기술이다. 일부 구현예에서, 단백질분해 기술은 겔상 단백질분해 기술이다.
본 출원의 개시내용에 포함된 용해 기술, 또는 이의 부분을 수행하기 위한 기술은 당업계에 잘 알려져 있다. 일부 구현예에서, 이러한 기술의 고려사항은 용액 및 이의 구성요소, 온도, 기간, 샘플의 구성요소에 대한 프로테아제와 같은 소화 구성요소의 비율과 같은 반응의 환경을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 용액상 트립신 단백질분해 기술은 트립신을 희석된 분획과 약 1:30 비율로 혼합하고, 약 37℃에서 약 8 시간 동안 인큐베이션하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 단백질분해 기술과 같은 용해 기술은 본원에 기재된 방법으로부터 수득된 분획과 같은 기술에 대한 입력물을 희석하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 희석은 물, 유기 용매, 약한 완충액, 호환성 완충액, 또는 이의 조합을 사용하여 수행된다. 일부 구현예에서, 희석은 생성된 희석 물질과 용해 기술의 호환성을 보장하기 위해 수행된다. 일부 구현예에서, 희석 단계는 약 0.1 내지 약 2 M, 예컨대 약 0.1 M 내지 약 0.5 M, 약 0.5 M 내지 약 1.5 M, 또는 약 1 M 내지 약 2 M 중 임의의 카오트로픽제(예컨대 구아니딘 하이드로클로라이드)의 최종 농도를 수득하는 것에 기반한다. 일부 구현예에서, 희석 단계는 약 1 M 미만, 예컨대 약 0.9 M, 0.8 M, 0.7 M, 0.6 M, 0.5 M, 0.4 M, 0.3 M, 0.2 M, 0.1 M, 또는 0.05 M 미만 중 임의의 카오트로픽제의 최종 농도를 수득하는 것에 기반한다.
일부 구현예에서, 효소-기반 분해 기술은 완충액 교환 단계를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 효소-기반 분해 기술은 알킬화 단계를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 효소-기반 분해 기술은 환원 단계를 포함하지 않는다.
E. 정량화 기술
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 정량화 기술을 포함한다. 일부 구현예에서, 정량화 방법은 샘플에서 구성요소, 또는 이의 생성물의 존재비 척도를 제공한다. 일부 구현예에서, 정량화 방법은 상대적 정량화 방법이다. 일부 구현예에서, 정량화 방법은 준-상대적 정량화 방법이다. 일부 구현예에서, 정량화 방법은 절대 정량화 방법이다. 일부 구현예에서, 정량화 방법은 무표지 정량화 방법이다. 일부 구현예에서, 정량화 방법은 등압 태그, 예를 들어, 탠덤 질량 태그의 사용을 포함하는 것과 같은 표지 기반 정량화 방법이다. 일부 구현예에서, 정량화 방법은 예를 들어, 동위원소 표지된 펩티드로서 하나 이상의 표준의 사용을 수반하는 것과 같은 스파이크-인(spike-in) 방법이다. 일부 구현예에서, 정량화 방법은 정량화 방법의 임의의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 정량화 방법은 방법의 하류 단계를 시작하기 전에 정화(clean-up) 단계를 포함한다 예를 들어, 일부 구현예에서, 정량화 방법은 샘플의 구성요소, 또는 이의 생성물에 접합되지 않은 과도한 표지를 제거하는 것과 같은 탈염 단계를 포함한다.
질량 분광법 정량화 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, Bantscheff 등, Anal Bioanal Chem, 389, 2007을 참조하며, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
F. 샘플의 구성요소, 또는 이의 생성물을 질량 분광계에 도입
본원에는 샘플의 구성요소, 또는 이의 생성물을 질량 분광계에 도입하기 위한 기술 및 장치(예컨대 방출계)가 제공된다. 도입 기술, 및 이의 장치는 당업계에 잘 알려져 있고 본원에 기재된 방법과 호환된다. 일부 구현예에서, 도입 기술은 이온화 기술을 포함한다. 일부 구현예에서, 이온화 기술은 전기분무 이온화 기술이다. 일부 구현예에서, 전기분무 이온화 기술은 기술과 함께 유속 사용에 기반한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 전기분무 이온화 기술은 나노-전기분무 이온화 기술이다. 일부 구현예에서, 전기분무 이온화 기술은 나노-전기분무 이온화 소스와 같은 전기분무 이온화 소스의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 이온화 기술은 대기압 화학적 이온화 기술이다. 일부 구현예에서, 이온화 기술은 대기압 광 이온화 기술이다. 일부 구현예에서, 이온화 기술은 오프라인 탈착 전기분무 이온화(DESI) 기술이다. 일부 구현예에서, 이온화 기술은 오프라인 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화(MALDI) 기술이다.
일부 구현예에서, 전기분무 이온화 소스는 가열된 전기분무 이온화 소스이다. 일부 구현예에서, 전기분무 이온화 소스는 질소 스트림 또는 커튼과 같은 가스 건조 특징과 결합된다.
일부 구현예에서, 온라인 이온화 기술과 같은 이온화 기술은 질량 분광계로 보강된 대기압 고자기장 비대칭 파형 이온 이동성 분광법(FAIMS)과 결합된다.
G. 질량 분광법 및 데이터 획득 기술
본 출원은 질량 분광법 프로파일을 결정하는 것을 포함하여, 본원에 개시된 방법 및 방법 단계와 함께 사용하기에 적합한 질량 분광법 기술의 다양한 배열을 고려한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 하나 이상의 질량 분광법 기술을 사용하여 샘플을 분석하는 것을 포함한다. 본원에 논의된 바와 같이, 일부 구현예에서, 질량 분광법 기술은 MS 이온 정보(m/z 및 존재비), 식별/서열 정보, 예컨대 펩티드 및/또는 단백질 식별/서열 정보, 번역 후 변형 정보, 대사물 정체성, 및 정량화 정보의 임의의 조합을 포함하는 샘플, 구성요소, 또는 이의 생성물에 대한 막대한 양의 정보를 제공하기 위한 데이터를 획득하는 데 사용되고/되거나 이를 수득하는데 유용하다.
일부 구현예에서, 질량 분광법 기술은 질량 분광법 기술의 사용을 포함한다. 본 발명에 의해 고려되는 질량 분광계는 고해상도 질량 분광계 및 저해상도 질량 분광계를 포함한다. 일부 구현예에서, 질량 분광계는 비행시간형(time-of-flight: TOF) 질량 분광계이다. 일부 구현예에서, 질량 분광계는 사중극자 비행시간형(Q-TOF) 질량 분광계이다. 일부 구현예에서, 질량 분광계는 단일 사중극자이다. 일부 구현예에서, 질량 분광계는 삼중 사중극자(QQQ)이다. 일부 구현예에서, 질량 분광계는 사중극자 이온 트랩 비행시간형(QIT-TOF) 질량 분광계이다. 일부 구현예에서, 질량 분광계는 사중극자 - 선형 이온 트랩(Q-LIT)이다. 일부 구현예에서, 질량 분광계는 하이브리드 사중극자-오비트랩(Orbitrap), 선형 이온 트랩 - 오비트랩, 또는 트리브리드 사중극자-선형 이온 트랩 - 오비트랩 변종과 같은, 구성성분 이온 광학 구성요소 중 하나로서 푸리에 변환(Fourier Transform) - 오비트랩에 의존한다. 일부 구현예에서, 질량 분광계는 FT-이온 사이클로트론 공명(FT) 질량 분광계이다. 일부 구현예에서, 질량 분광계는 사중극자 FT- 이온 사이클로트론 공명(Q-FT) 질량 분광계이다. 일부 구현예에서, 질량 분광계 자기 섹터 질량 분광계.
일부 구현예에서, 질량 분광법 기술은 양이온 모드의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 질량 분광법 기술은 음이온 모드의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 질량 분광법 기술은 이온 이동성 질량 분광법 기술을 포함한다.
일부 구현예에서, 질량 분광법 기술은 하향식(top-down) 질량 분광법 기술을 포함한다. 일부 구현예에서, 질량 분광법 기술은 중간-하향식(middle-down) 질량 분광법 기술을 포함한다. 일부 구현예에서, 질량 분광법 기술은 상향식(bottom-up) 질량 분광법 기술을 포함한다. 일부 구현예에서, 질량 분광법 기술은 탠덤 질량 분광법 기술이다. 일부 구현예에서, 탠덤 질량 분광법 기술은 단편화 기술을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법 이의 임의의 조합을 포함한다.
다양한 질량 분광법 데이터 획득 기술은 본원에 기재된 방법과 함께 처리할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 질량 분광법 데이터 획득 기술은 데이터-의존적 데이터 획득, 데이터 독립적 데이터 획득, 표적 데이터 획득, 또는 이의 조합을 포함한다.
일부 측면에서, 본원에는 질량 분광법을 사용하여 조성물 집합을 분석하는 방법이 제공되며, 방법은 (a) 조성물 집합의 각 조성물을 질량 분광계에 적용하는 단계; 및 (b) 조성물 집합의 각 조성물의 질량 분광법 분석을 수행하는 단계를 포함하며, 상기 조성물 집합은 SEC 미세유체 장치의 사용을 포함하는 SEC 기술을 사용하여 테스트 샘플의 분획화 후 각 분획, 또는 이의 생성물을 RPLC 미세유체 장치의 사용을 포함하는 RPLC 기술에 적용하는 것을 포함하는 처리 기술로부터 수득된다. 일부 구현예에서, SEC 분획은 단백질분해 기술을 통해 추가로 처리된다.
H. 본원에 기재된 방법의 발견 및 표적-기반 모드
발견-모드 방법, 준표적-모드 방법, 표적-모드 방법, 및 이의 조합이 본원에 기재된 방법에 포함된다. 모드 유형의 사용, 및 이의 선택은 샘플에서 평가할 원하는 정보에 기반할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 예를 들어, 샘플의 무가설 평가에서 샘플의 다수의 구성요소를 연구하는 것이 바람직하다(예컨대 발견-모드 또는 준표적 모드로 더 많이 처리할 수 있음). 일부 구현예에서, 샘플의 구성요소의 작은 선택을 연구하는 것이 바람직하다(예컨대 표적-모드로 더 많이 처리할 수 있음). 목적 및/또는 원하는 정보에 기반하여, 당업자는 본원에 제공된 교시에 기반하여, 어떻게 본원에 기재된 방법을 설계하고 실행하는지를 용이하게 이해할 것이다. 예를 들어, 목적 및/또는 원하는 정보는 얼마나 많은 분획이 SEC 기술로부터 생산되고 수득되는지, 어떻게 많은 SEC 분획이 추가로 분석되는지, 경우에 따라, 어떤 추가 처리가 수행되는지(예컨대 단백질분해 기술), 및 어떤 질량 분광계 및 질량 분광법 분석 기술이 사용되는지를 설계하는 데 사용될 수 있다.
I. 샘플 구성요소의 분석을 위한 예시적인 방법
일부 구현예에서, 질량 분광법 분석을 위한 생물학적 샘플의 구성요소, 또는 이의 생성물을 처리하는 방법이 제공되며, 방법은 (a) 테스트 샘플을 SEC 미세유체 장치를 사용하여 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 기술에 적용하되, 상기 테스트 샘플은 액체 고정액과 혼합된 샘플을 포함하고, 상기 테스트 샘플은 액체 고정액으로부터 유래하는 미리 결정된 농도의 카오트로픽제를 갖고, 상기 SEC 기술은 테스트 샘플 내 카오트로픽제의 미리 결정된 농도 범위 내에서 이동상 카오트로픽제의 농도를 갖는 SEC 이동상의 사용을 포함하고, 상기 SEC 미세유체 장치는 복수의 상호연결된 채널을 포함하며, 각 채널은 약 10 nm 내지 약 500 nm의 평균 기공 크기를 갖는 내부 표면 물질을 갖는 개방 관형 형식으로 구성되는 것인, 단계; (b) SEC 미세유체 장치로부터 용출된 복수의 분획을 수집하는 단계; (c) SEC 미세유체 장치로부터의 복수의 분획 중 하나 이상을 단백질분해 기술에 적용하는 단계; 및 (d) RPLC 미세유체 장치를 사용하여 역상 액체 크로마토그래피(RPLC) 기술에 RPLC-호환성 분획 세트 각각을 적용하여 질량 분광계에 도입하기 위한 샘플의 구성요소, 또는 이의 생성물을 제조하되, 상기 RPLC-호환성 분획 세트는 (i) SEC 미세유체 장치로부터 복수의 분획 중 0 개 이상; 및 (ii) 단백질분해 기술에 적용된 복수의 분획 중 하나 이상으로부터 수득된 분획을 포함하는 것인, 단계를 포함하며, 상기 RPLC 기술 및 RPLC 미세유체 장치는 온라인 탈염을 위해 구성되고, 상기 RPLC 미세유체 장치는 복수의 상호연결된 채널을 포함하며, 각 채널은 역상 매질을 포함하는 내부 표면 물질을 갖는 개방 관형 형식으로 구성되고, 상기 RPLC 미세유체 장치는 전기분무 이온화 소스에 결합된다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 인간과 같은 개체로부터의 혈장 샘플이다. 일부 구현예에서, 액체 고정액 및 SEC 이동상에서 발견되는 것과 같은 카오트로픽제는 구아니딘 하이드로클로라이드이다. 일부 구현예에서, 방법은 RPLC 미세유체 장치로부터의 용출액을 질량 분광계에 적용하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 개체는 인간이다.
일부 구현예에서, 질량 분광법 분석을 위해 인간으로부터의 혈장 샘플의 구성요소, 또는 이의 생성물을 처리하는 방법이 제공되며, 방법은 (a) SEC 미세유체 장치를 사용하여 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 기술에 테스트 혈장 샘플을 적용하되, 상기 테스트 샘플은 액체 고정액과 혼합된 샘플을 포함하고, 상기 테스트 샘플은 액체 고정액으로부터 유래하는 적어도 약 5.5 M, 예컨대 적어도 약 6 M, 구아니딘(예를 들어, 구아니딘 하이드로클로라이드로부터)을 갖고, 상기 SEC 기술은 적어도 약 5.5 M, 예컨대 적어도 약 6 M, 구아니딘(예를 들어, 구아니딘 하이드로클로라이드로부터)을 갖는 SEC 이동상의 사용을 포함하고, 상기 SEC 미세유체 장치는 복수의 상호연결된 채널을 포함하며, 각 채널은 약 10 nm 내지 약 500 nm의 평균 기공 크기를 갖는 내부 표면 물질을 갖는 개방 관형 형식으로 구성되는 것인, 단계; (b) SEC 미세유체 장치로부터 용출된 복수의 분획을 수집하는 단계; (c) 트립신과 같은 단백질분해 효소를 사용하여 SEC 미세유체 장치로부터의 복수의 분획 중 하나 이상을 단백질분해 기술에 적용하는 단계; 및 (d) RPLC 미세유체 장치를 사용하여 역상 액체 크로마토그래피(RPLC) 기술에 RPLC-호환성 분획 세트 각각을 적용하여 질량 분광계에 도입하기 위한 샘플의 구성요소, 또는 이의 생성물을 제조하되, 상기 RPLC-호환성 분획 세트는 (i) SEC 미세유체 장치로부터 복수의 분획 중 0 개 이상; 및 (ii) 단백질분해 기술에 적용된 복수의 분획 중 하나 이상으로부터 수득된 분획을 포함하는 것인, 단계를 포함하며, 상기 RPLC 기술 및 RPLC 미세유체 장치는 온라인 탈염을 위해 구성되고, 상기 RPLC 미세유체 장치는 복수의 상호연결된 채널을 포함하며, 각 채널은 역상 매질을 포함하는 내부 표면 물질을 갖는 개방 관형 형식으로 구성되고, 상기 역상 매질은 C2, C4, C8, 또는 C18 중 하나 이상을 포함하고, 상기 RPLC 미세유체 장치는 전기분무 이온화 소스에 결합된다. 일부 구현예에서, 방법은 혈장 샘플을 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 RPLC 미세유체 장치로부터의 용출액을 질량 분광계에 적용하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 질량 분광법 분석을 위해 인간으로부터의 혈액 샘플의 구성요소, 또는 이의 생성물을 처리하는 방법이 제공되며, 방법은 (a) 혈액 샘플로부터 테스트 혈장 샘플을 생성하되, 상기 테스트 혈장 샘플은 액체 고정액과 혼합된 혈액 샘플로부터의 혈장 샘플을 포함하고, 상기 혈장 샘플은 액체 고정액으로부터 유래하는 적어도 약 5.5 M, 예컨대 적어도 약 6 M, 구아니딘(예를 들어, 구아니딘 하이드로클로라이드로부터)을 갖는 것인, 단계; (b) SEC 미세유체 장치를 사용하여 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 기술에 테스트 혈장 샘플을 적용하되, 상기 SEC 기술은 적어도 약 5.5 M, 예컨대 적어도 약 6 M, 구아니딘(예를 들어, 구아니딘 하이드로클로라이드로부터)을 갖는 SEC 이동상의 사용을 포함하고, 상기 SEC 미세유체 장치는 복수의 상호연결된 채널을 포함하며, 각 채널은 약 10 nm 내지 약 500 nm의 평균 기공 크기를 갖는 내부 표면 물질을 갖는 개방 관형 형식으로 구성되는 것인, 단계; (c) SEC 미세유체 장치로부터 용출된 복수의 분획을 수집하는 단계; (d) 트립신과 같은 단백질분해 효소를 사용하여 SEC 미세유체 장치로부터의 복수의 분획 중 하나 이상을 단백질분해 기술에 적용하는 단계; 및 (e) RPLC 미세유체 장치를 사용하여 역상 액체 크로마토그래피(RPLC) 기술에 RPLC-호환성 분획 세트 각각을 적용하여 질량 분광계에 도입하기 위한 샘플의 구성요소, 또는 이의 생성물을 제조하되, 상기 RPLC-호환성 분획 세트는 (i) SEC 미세유체 장치로부터 복수의 분획 중 0 개 이상; 및 (ii) 단백질분해 기술에 적용된 복수의 분획 중 하나 이상으로부터 수득된 분획을 포함하는 것인, 단계를 포함하며, 상기 RPLC 기술 및 RPLC 미세유체 장치는 온라인 탈염을 위해 구성되고, 상기 RPLC 미세유체 장치는 복수의 상호연결된 채널을 포함하며, 각 채널은 역상 매질을 포함하는 내부 표면 물질을 갖는 개방 관형 형식으로 구성되고, 상기 역상 매질은 C2, C4, C8, 또는 C18 중 하나 이상을 포함하고, 상기 RPLC 미세유체 장치는 전기분무 이온화 소스에 결합된다. 일부 구현예에서, 방법은 RPLC 미세유체 장치로부터의 용출액을 질량 분광계에 적용하는 단계를 추가로 포함한다.
III. 관상 동맥 질환(CAD) 서명 및 이의 사용 방법
특정 측면에서, 본원에는 건강한 개체와 비교하여 관상 동맥 질환(CAD)을 앓는 개체로부터의 샘플의 평가에 기반하여 본원에 기재된 방법 및 장치를 사용하여 식별된 복수의 바이오마커를 포함하는 CAD 서명이 제공된다. 심혈관 질환(CVD)의 주요 질환 하위유형은 관상 동맥 질환(CAD)이며, 아테롬성동맥경화증(atherosclerosis)으로 알려진 심장 동맥의 협착 및 경직을 특징으로 한다. 아테롬성동맥경화증은 내피 손상 및 내피하 apoB-지단백질 체류, 인슐린 저항, 산화 스트레스, DNA 손상 및 노화, 자가포식, 지질 대사 조절 장애, 염증, 및 혈전증을 포함하는 다중 병리학적 기전에 의해 유발되고, 이의 서명을 식별하는 것은 어렵다.
CAD 서명의 발견은 예를 들어, 개체에서 CAD 단백체 서명을 검출하기 위한 분석 방법, 진단 방법, 및 치료 방법에서 이의 하나 이상의 바이오마커의 사용을 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 CAD 서명의 하나 이상의 바이오마커와 같은 식별된 CAD 서명의 바이오마커의 하위집합만을 활용한다. 일부 구현예에서, 표 1(아래에 제공)에 제공된 CAD 서명의 하나 이상의 바이오마커를 포함하는 CAD 단백체 서명이 제공된다. 일부 구현예에서, CAD 단백체 서명은 질량 분광법 기술을 사용하는 것과 같이, 샘플에서 폴리펩티드를 통해 평가된다. 일부 구현예에서, CAD 단백체 서명은 ELISA와 같은 비-질량 분광법 기반 기술을 통해 평가된다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 CAD 단백체 서명에 따라 질량 분광법(MS) 데이터를 분석하는 단계를 포함하며, 상기 CAD 단백체 서명은 표 1의 하나 이상의 바이오마커를 포함한다. 일부 구현예에서, CAD 단백체 서명의 각 바이오마커는 참조(하나 이상의 건강한 개체, 예를 들어, CAD를 앓지 않은 개체에서 단백질 수준)와 비교하여 단백질 정체성 및 단백질 발현의 증가 또는 감소 상태(표 1의 CAD 서명 열에 언급된 바와 같이)를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, CAD 단백체 서명을 평가하기 위해 본원에 제공된 방법은 CAD 단백체 서명의 하나 이상의 바이오마커의 존재에 대해 개체로부터 수득된 샘플, 또는 이의 유도체를 평가하고 CAD 단백체 서명의 하나 이상의 바이오마커가 표 1의 발현 증가 또는 발현 감소 분류와 실질적으로 일치하는지(예컨대 하나 이상의 바이오마커의 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것을 포함하여, 적어도 약 70%) 여부를 평가한다. 일부 구현예에서, CAD 단백체 서명을 평가하기 위해 본원에 제공된 방법은 CAD 단백체 서명의 하나 이상의 바이오마커의 존재에 대해 개체로부터 수득된 샘플, 또는 이의 유도체를 평가하고 CAD 단백체 서명의 하나 이상의 바이오마커가 표 1의 발현 증가 또는 발현 감소 분류와 일치하는지 여부를 평가한다.
일부 구현예에서, CAD 단백체 서명의 각 바이오마커는 참조(하나 이상의 건강한 개체, 예를 들어, CAD를 앓지 않은 개체의 단백질 수준)와 비교하여 단백질 정체성 및 단백질의 발현 증가 또는 감소 수준(예컨대 발현 증가 또는 감소에 대해 정의된 설정 역치를 초과하는 수준)을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질의 발현 증가는 참조와 비교하여 개체에서 측정될 때, 적어도 약 0.2, 예컨대 적어도 약 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 또는 2.0 중 임의의 것의 평균 log2 비율이다. 일부 구현예에서, 단백질의 발현 감소는 참조와 비교하여 개체에서 측정될 때, 약 -0.2 이하, 예컨대 약 -0.3, -0.4, -0.5, -0.6, -0.7, -0.8, -0.9, -1.0, -1.1, -1.2, -1.3, -1.4, -1.5, -1.6, -1.7, -1.8, -1.9, 또는 -2.0 이하 중 임의의 것의 평균 log2 비율이다. 일부 구현예에서, CAD 단백체 서명의 하나 이상의 바이오마커의 발현 증가 또는 감소는 표 1의 평균 log2 비율의 약 0.1 이하의 표준 편차 내에 있다. 일부 구현예에서, CAD 단백체 서명의 하나 이상의 바이오마커의 발현 증가 또는 감소는 표 1의 평균 log2 비율의 약 0.05 이하의 표준 편차 내에 있다.
일부 구현예에서, 발현 증가 또는 감소의 상태 및/또는 정도는 참조, 예를 들어, 건강한 개체, 예를 들어, CAD를 앓지 않은 개체와의 비교에 기반한다. 일부 구현예에서, 참조는 과학 참고문헌에 공개된 것과 같은 문헌 값이다. 일부 구현예에서, 참조는 건강한 개체, 예를 들어, CAD를 앓지 않은 개체의 집단에 기반한다. 일부 구현예에서, 참조는 건강한 개체, 예를 들어, CAD를 앓지 않은 개체의 집단으로부터 측정될 때 평균 발현 수준이다.
일부 구현예에서, 방법은 개체로부터 수득된 하나 이상의 샘플, 또는 이의 유도체로부터의 하나 이상의 측정에 기반한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 측정이 바이오마커를 평가하기 위해 수행될 때, 방법은 상기 바이오마커의 평균 측정에 기반할 수 있다.
일부 구현예에서, CAD 단백체 서명은 칼슘 신호전달 경로, 히스톤 조절, HIF-1 신호전달 경로, cAMP 신호전달 경로, 베타-아드레날린성 신호전달 경로, PI3K-Akt 신호전달 경로, 보체 및/ 또는 응고 캐스케이드, 스핑고지질 신호전달 경로, 자연 살해 세포 매개 세포독성, 아디포사이토카인 신호전달 경로, DNA 손상, 칼슘 에너지, 대사체학, 세포 부착, 염증, 저산소증, 및 히스톤 메틸화와 연관된 하나 이상의 바이오마커를 포함한다.
일부 구현예에서, CAD 단백체 서명의 하나 이상의 바이오마커는 전사 인자와 연관된 하나 이상의 바이오마커를 포함하는 이의 하위집합을 포함한다. 일부 구현예에서, 전사 인자와 연관된 하나 이상의 바이오마커는 각각 NF4A, FOXA2, LMO2, RUNX1, FLI1, EGR1, VDR, RCF21, GATA2, TP63, ELK3, FLI1, GATA1, CTNNB1, SIN3B, STAT3, TAP1, AHR, MTF2, 및 SRY로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, CAD 단백체 서명의 하나 이상의 바이오마커는 키나제와 연관된 하나 이상의 바이오마커를 포함하는 이의 하위집합을 포함한다. 일부 구현예에서, 키나제와 연관된 하나 이상의 바이오마커는 각각 HIPK2, MAPK1, MAPK3, GSK3B, MAPK8, TAF1, AKT1, CDK1, MAPK14, CDK9, CSNK2A1, CHUK, NLK, ABL1, CDK6, CDK2, CDK7, CDK4, TRIM24, 및 PRKCZ로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, CAD 단백체 서명은 표 1의 적어도 5 개의 바이오마커, 예컨대 적어도 10 개의 바이오마커, 15 개의 바이오마커, 20 개의 바이오마커, 25 개의 바이오마커, 30 개의 바이오마커, 35 개의 바이오마커, 40 개의 바이오마커, 45 개의 바이오마커, 50 개의 바이오마커, 55 개의 바이오마커, 60 개의 바이오마커, 65 개의 바이오마커, 70 개의 바이오마커, 75 개의 바이오마커, 80 개의 바이오마커, 85 개의 바이오마커, 90 개의 바이오마커, 95 개의 바이오마커, 100 개의 바이오마커, 110 개의 바이오마커, 120 개의 바이오마커, 130 개의 바이오마커, 140 개의 바이오마커, 150 개의 바이오마커, 160 개의 바이오마커, 170 개의 바이오마커, 180 개의 바이오마커, 190 개의 바이오마커, 200 개의 바이오마커, 210 개의 바이오마커, 220 개의 바이오마커, 230 개의 바이오마커, 240 개의 바이오마커, 250 개의 바이오마커, 260 개의 바이오마커, 270 개의 바이오마커, 280 개의 바이오마커, 또는 290 개의 바이오마커 중 임의의 것을 포함한다. 일부 구현예에서, CAD 단백체 서명은 표 1의 모든 바이오마커를 포함한다. 일부 구현예에서, CAD 단백체 서명은 표 1에 따른 내부의 바이오마커의 발현 증가 또는 감소 상태에 기반하여 분석된다. 일부 구현예에서, CAD 단백체 서명은 표 1에 따른 내부의 바이오마커의 발현 증가 또는 감소 수준에 기반하여 분석된다.
일부 구현예에서, CAD 단백체 서명은 Q969E1(LEAP2), Q8NF37(LPCAT1), Q01082(SPTBN1), Q7Z333(SETX), 및 P30481(HLA-B)을 포함한다.
일부 구현예에서, CAD 단백체 서명은 Q969E1(LEAP2), Q8NF37(LPCAT1), Q01082(SPTBN1), Q7Z333(SETX), P30481(HLA-B), Q5T8A7(PPP1R26), Q9NX02(NLRP2), P02144(MB), Q9BQS2(SYT15), 및 P62805(HIST1H4A)를 포함한다.
일부 구현예에서, CAD 단백체 서명은 Q969E1(LEAP2), Q8NF37(LPCAT1), Q01082(SPTBN1), Q7Z333(SETX), P30481(HLA-B), Q5T8A7(PPP1R26), Q9NX02(NLRP2), P02144(MB), Q9BQS2(SYT15), P62805(HIST1H4A), P80370(DLK1), P68366(TUBA4A), P27797(CALR), P05164(MPO), 및 Q99439(CNN2)를 포함한다.
일부 구현예에서, CAD 단백체 서명은 Q86YI8(PHF13), Q9Y4D8(HECTD4), Q9UIW2(PLXNA1), Q6ZS81(WDFY4), 및 Q9H329(EPB41L4B)를 포함한다.
일부 구현예에서, CAD 단백체 서명은 Q86YI8(PHF13), Q9Y4D8(HECTD4), Q9UIW2(PLXNA1), Q6ZS81(WDFY4), Q9H329(EPB41L4B), A2RUB1(C17orf104), O15031(PLXNB2), Q9NYF3(FAM53C), O75146(HIP1R), 및 P80362(Ig 카파 쇄 V-I 영역 WAT)를 포함한다.
일부 구현예에서, CAD 단백체 서명은 Q86YI8(PHF13), Q9Y4D8(HECTD4), Q9UIW2(PLXNA1), Q6ZS81(WDFY4), Q9H329(EPB41L4B), A2RUB1(C17orf104), O15031(PLXNB2), Q9NYF3(FAM53C), O75146(HIP1R), P80362(Ig 카파 쇄 V-I 영역 WAT), P01880(IGHD), Q9C0K0(BCL11B), A0AVI2(FER1L5), Q86XJ1(GAS2L3), 및 Q00688(FKBP3)을 포함한다.
일부 구현예에서, CAD 단백체 서명은 Q969E1(LEAP2), Q8NF37(LPCAT1), Q01082(SPTBN1), Q7Z333(SETX), P30481(HLA-B), Q86YI8(PHF13), Q9Y4D8(HECTD4), Q9UIW2(PLXNA1), Q6ZS81(WDFY4), 및 Q9H329(EPB41L4B)를 포함한다.
일부 구현예에서, CAD 단백체 서명은 Q969E1(LEAP2), Q8NF37(LPCAT1), Q01082(SPTBN1), Q7Z333(SETX), P30481(HLA-B), Q5T8A7(PPP1R26), Q9NX02(NLRP2), P02144(MB), Q9BQS2(SYT15), P62805(HIST1H4A), Q86YI8(PHF13), Q9Y4D8(HECTD4), Q9UIW2(PLXNA1), Q6ZS81(WDFY4), Q9H329(EPB41L4B), A2RUB1(C17orf104), O15031(PLXNB2), Q9NYF3(FAM53C), O75146(HIP1R), 및 P80362(Ig 카파 쇄 V-I 영역 WAT)를 포함한다.
일부 구현예에서, CAD 단백체 서명은 Q969E1(LEAP2), Q8NF37(LPCAT1), Q01082(SPTBN1), Q7Z333(SETX), P30481(HLA-B), Q5T8A7(PPP1R26), Q9NX02(NLRP2), P02144(MB), Q9BQS2(SYT15), P62805(HIST1H4A), P80370(DLK1), P68366(TUBA4A), P27797(CALR), P05164(MPO), Q99439(CNN2), Q969E1(LEAP2), Q8NF37(LPCAT1), Q01082(SPTBN1), Q7Z333(SETX), P30481(HLA-B), Q5T8A7(PPP1R26), Q9NX02(NLRP2), P02144(MB), Q9BQS2(SYT15), P62805(HIST1H4A), Q86YI8(PHF13), Q9Y4D8(HECTD4), Q9UIW2(PLXNA1), Q6ZS81(WDFY4), Q9H329(EPB41L4B), A2RUB1(C17orf104), O15031(PLXNB2), Q9NYF3(FAM53C), O75146(HIP1R), 및 P80362(Ig 카파 쇄 V-I 영역 WAT)를 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 바이오마커는 안전성, 효능, 진단, 예후, 질환 진행, 요법에 대한 반응, 또는 이의 임의의 조합을 나타낸다.
일부 측면에서, 본원에는 개체에게 관상 동맥 질환(CAD) 진단 결정을 내리게 하는 방법이 제공되며, 방법은 (a) 개체로부터 수득된 샘플, 또는 이의 유도체로부터 질량 분광법(MS) 데이터를 수득하는 단계; 및 (b) CAD 단백체 서명에 따라 MS 데이터를 분석하되, 상기 CAD 단백체 서명은 표 1의 하나 이상의 바이오마커를 포함하는 것인, 단계; 및 (c) 개체가 CAD 단백체 서명을 갖는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 개체가 CAD 단백체 서명을 갖는 경우 개체가 CAD를 앓는 것으로 진단된다.
일부 측면에서, 본원에는 개체가 관상 동맥 질환(CAD)을 앓는 것으로 진단하는 방법이 제공되며, 방법은 (a) 개체로부터 수득된 샘플, 또는 이의 유도체로부터 질량 분광법(MS) 데이터를 수득하는 단계; 및 (b) CAD 단백체 서명에 따라 MS 데이터를 분석하되, 상기 CAD 단백체 서명은 표 1의 하나 이상의 바이오마커를 포함하는 것인, 단계; 및 (c) CAD 단백체 서명의 존재에 기반하여 개체가 CAD를 앓는 것으로 진단하는 단계를 포함한다.
일부 측면에서, 본원에는 관상 동맥 질환(CAD)을 앓는 개체를 치료하는 방법이 제공되며, 방법은 (a) 개체로부터 수득된 샘플, 또는 이의 유도체에서 CAD 단백체 서명의 존재에 따라 개체가 CAD를 앓는 것으로 진단하되, 상기 CAD 단백체 서명은 표 1의 하나 이상의 바이오마커를 포함하는 것인, 단계; 및 (b) 개체에게 CAD 치료를 투여하는 단계를 포함한다.
일부 측면에서, 본원에는 개체의 관상 동맥 질환(CAD) 단백체 서명을 검출하는 방법, (a) 개체로부터 수득된 샘플, 또는 이의 유도체로부터 질량 분광법(MS) 데이터를 수득하는 단계; 및 (b) CAD 단백체 서명에 따라 MS 데이터를 분석하여 CAD 단백체 서명을 검출하되, 상기 CAD 단백체 서명은 표 1의 하나 이상의 바이오마커를 포함하는 것인, 단계가 제공된다. 일부 구현예에서, 개체가 CAD를 앓는 것으로 의심된다.
일부 구현예에서, CAD 단백체 서명의 존재는 CAD 단백체 서명에 따라 MS 데이터를 분석함으로써 결정된다.
일부 구현예에서, 방법은 본원에 기재된 질량 분광법 기술을 수행하는 것과 같이, 개체로부터 수득된 샘플, 또는 이의 유도체로부터의 MS 데이터를 수득하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, CAD 치료는 생활 방식 조정을 포함한다. 일부 구현예에서, 생활 방식 조정은 식이요법, 운동 일정의 구현, 금연, 및/또는 알코올 섭취 중단이다.
일부 구현예에서, CAD 치료는 약제학적 개입을 포함한다. CAD를 치료하기 위한 약제학적 약물 및 제제는 알려져 있다. 대상체의 치료를 위한 적절한 약물을 선택하는 것은 숙련자의 수준 내에 있다. 일부 구현예에서, 약제학적 개입은 칼슘 채널 차단제, 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 억제제(예컨대 HDAC6), Ca2+/칼모듈린(CaM)-의존적 단백질 키나제 II(CaMK II) 억제제, 구아닐릴 사이클라제(sGC) 활성제, MMP 억제제, 스타틴, 및 항고혈압제로 이루어진 군으로부터 선택된 약물의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 개입은 암로디핀, 투바스타틴-a, 포르스콜린, 트리코스타틴 A, KN-93, CFM-1571, 일로마스타트, CAY-10603, 및 로수바스타틴, 또는 이의 약제학적 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 약물을 포함한다. 일부 구현예에서, 약물은 BRD-K52306726, BRD-K71361154, 아세타졸아미드, 롤리프람, 룩솔리티닙, BRD-A59808129-001-01-7, BRD-K76876037, ZM336372, 트레할로스, SCHEMBL3092652, BMS-387032, BRD-K01425431, 4-하이드록시-레티노산, CHEMBL585951, CHEMBL1673039, HY-11007, 프리미돈, BRD-K81417919, SPECTRUM_000826, 타목시펜, BRD-K00544996, CID 67066889, CX-5461, BRD-K63944563, SCHEMBL6851809, BRD-A86146706, FR-180204, CHEMBL552425, 헥사클로로펜, Aggc, SUGA1_008424, BRD-K96640811, 아나스트로졸, 워트만닌, 반데타닙, AC1NWALF, OTSSP167, WZ3105, 디하이드로에르고타민, BRD-K99839793, SR 33805 옥살레이트, AT-7519, 술파독신, SPECTRUM_001319, MLS003329219, 트리코스타틴 A, 및 로테논, 또는 이의 약제학적 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 약물은 6-메르캅토퓨린, 빈크리스틴, 베바시주맙, 프레드니손, 탈리도미드, 졸레드론산, 파클리탁셀, 페메트렉세드, 토포테칸, 카바지탁셀, 프레드니솔론, 카페시타빈, 카페시타빈, 젬시타빈, 카페시타빈, 도세탁셀, 옥살리플라틴, 세비파불린, 콜히친, 프로베네시드, 사이클로포스파미드, 다우노루비신, 이마티닙, 5-플루오로우라실, 에피루비신, 트라스투주맙, 비노렐빈, 리툭시맙, 에토포시드, 에토포시드, 젬시타빈, 미토잔트론, 미토잔트론, 토포테칸, 비노렐빈, 다부네티드, 덱사메타손, 젬시타빈, 젬시타빈, 젬시타빈, 비노렐빈, 하이드로코르티손, 이리노테칸, 파미드론산, 비노렐빈, 에포틸론 B, 에리불린, 젬시타빈, 젬시타빈, 젬시타빈, 비노렐빈, 이리노테칸, 테모졸로미드, 이리노테칸, 사이타라빈, L-아스파라기나제, 프레드니손, 라로탁셀, 밀라탁셀, 토포테칸, 플리나불린, 포도필로톡신, 비노렐빈, 빈블라스틴, 빈플루닌, 비노렐빈, 빈타폴리드, AZD4831, GCS-1, GR-MD-2, BI 76563, CC-95251, 에쿨리주맙, IFX-1, IgG, 라불리주맙, 페그세타코플란, CNGRC 펩티드-TNF 알파 접합체, 스타물루맙, BI 836845, MEDI-573, MORAb-4, 라벤두스틴 C, 알리로쿠맙, BMS-844421, 에비나쿠맙, PCSK9 억제제, CALAA-1, CX-229, 에미시주맙, 모로크토코그 알파, L19-IL2 모노클로날 항체-사이토카인 융합 단백질, L19TNF알파, 오크리플라스민, 카로툭시맙, APO1, ASP8232, 하이드랄라진, 하이드로클로로티아지드, 하이드랄라진, 레세르핀, 이소소르비드 디니트레이트, 암리논, 아나글렐리드, 실로스타졸, 디피리다몰, 디필린, 에녹시몬, 메도리논, 밀리논, 니트로글리세린, 펜톡시필린, 테오필린, 톨부타미드, 알베스피마이신, 시스플라틴, 루미네스핍, 레타스피마이신, TAS-116, 바피뉴주맙, 플로르베타벤 F, 플로르베타피르 F18, 콜라게나제 클로스트리듐 히스톨리티쿰, 트릴로스탄, 활성화 재조합 인간 인자 VII, 아픽사반, 클로피도그렐, 리바록사반, 에녹사파린, 아스피린, 리바록사반, 리바록사반, 티클로피딘, 베트릭사반, 달테파린, 델리고파린, DPC 423, 에독사반, 에미시주맙, 에녹사파린, F8, F9, 폰다파리눅스, 와파린, 헤파린, 이드라파리눅스, 네마토드 항응고제 단백질 c2, 리바록사반, RPR 12844, RPR 28566, 티파코긴, AGN 2194, AR-H4718, 클라리트로마이신, 덱스란소프라졸, 디클로페낙, 에소메프라졸 마그네슘, 에소메프라졸, 나프록센, 일라프라졸, 란소프라졸, 수산화마그네슘, 중탄산나트륨, 오메프라졸, 중탄산나트륨, 판토프라졸, 라베프라졸, 테나토프라졸, AZD425, 바리시티닙, 메토트렉세이트, 브레포시티닙, 에를로티닙, 룩솔리티닙, 필고티닙, INCB52793, 이타시티닙, JAK1 억제제, 자크티닙, 메토트렉세이트, 토파시티닙, 모멜로티닙, 토파시티닙, 우파다시티닙, 세다주리딘, 사이티딘 데아미나제 억제제, 및 로십토르, 또는 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 치료 방법은 CAD 치료를 모니터링하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 치료 후 CAD 단백체 서명 분석을 수행하는 단계 및 건강한 상태로의 복귀와 같은, CAD의 개선을 나타내는 변화를 평가하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 CAD의 하나 이상의 증상을 모니터링하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 개체로부터 샘플을 수득하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 샘플, 또는 이의 유도체는 혈액 샘플 또는 이의 유도체이다. 일부 구현예에서, 샘플, 또는 이의 유도체는 혈장 샘플이다. 일부 구현예에서, 샘플, 또는 이의 유도체는 액체 고정액을 포함한다. 일부 구현예에서, 샘플은 본 출원의 다른 섹션에 기재된 바와 같이 수득되고 처리된다.
일부 구현예에서, 샘플, 또는 이의 유도체로부터 MS 데이터를 수득하는 단계는 질량 분광계를 사용하여 샘플, 또는 이의 유도체의 질량 분광법 분석을 수행하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 질량 분광법 분석은 본원에 제공된 설명에 따라 수행된다.
일부 구현예에서, CAD 단백체 서명에 따라 MS 데이터를 분석하는 단계는 본원에 기재된 방법에 MS 데이터를 적용하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, CAD 단백체 서명에 따라 MS 데이터를 분석하는 단계는 MS 데이터에서 CAD 단백체 서명의 하나 이상의 바이오마커 각각의 존재 또는 부재 또는 수준을 평가하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, CAD 단백체 서명과의 일치는 CAD 단백체 서명의 하나 이상의 바이오마커가 표 1의 발현 증가 또는 발현 감소 분류와 실질적으로 일치하는지(예컨대 하나 이상의 바이오마커의 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 중 임의의 것을 포함하여, 적어도 약 70%) 여부에 기반한다.
일부 구현예에서, 방법은 개체의 다음 인자 평가 중 하나 이상을 수행하는 단계를 추가로 포함한다: 성별, 연령, 신체질량지수(BMI), 수축기 혈압, 확장기 혈압, 총 콜레스테롤, HDL, LDL, 트리글리세리드, 고지질혈증, 고혈압, 진성 당뇨병, 인슐린 저항, 신장 질환, 흡연 상태, 신체 활동 수준, 수면 수준, 또는 영양의 질.
일부 구현예에서, 방법은 심장 카테터법 또는 관상 동맥 CT 혈관조영술과 같은 CAD의 존재를 평가하기 위해 개체에 대한 의료 절차를 수행하는 단계를 추가로 포함한다.
표 1. CAD 서명의 식별된 바이오마커.
IV. 장치 및 시스템
본원에는 본원에 기재된 방법에 유용한 장치 및 시스템이 제공된다. 일부 구현예에서, 샘플의 구성요소, 또는 이의 생성물의 분리를 위한 미세유체 장치, 예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피 미세유체 장치 또는 역상 액체 크로마토그래피 미세유체 장치가 제공된다. 일부 구현예에서, 본원에는 본원에 기재된 방법의 단계가 통합된 시스템이 제공된다. 일부 구현예에서, 시스템은 샘플의 구성요소, 또는 이의 생성물의 분리를 위한 미세유체 장치, 및 본원에 기재된 방법의 단계를 완료 및/또는 통합하는 데 유용한 다른 특징을 포함한다. 일부 구현예에서, 시스템은 로봇 공학과 같은 자동화를 위한 특징을 포함한다.
A. 샘플의 구성요소를 분리하기 위한 미세유체 장치
일부 측면에서, 본원에는 샘플의 구성요소를 분리하도록 구성된 미세유체 장치가 제공된다. 일부 구현예에서, 미세유체 장치는 분리에 유용한 매질(예컨대 다공성 매질 또는 역상 매질)을 포함하는 복수의 상호연결된 채널을 포함한다. 복수의 상호연결된 채널을 포함하는 미세유체 장치는 샘플 구성요소의 다양한 배열을 효율적이고 효과적으로 분리하는 데 유용하여, 예를 들어, 복합 생물학적 샘플의 동시 단백체학, 펩티드체학, 및 대사체학 분석을 가능하게 한다.
예시적인 미세유체 장치(300)의 개략도가 도 3에 제공된다. 미세유체 장치(300)는 입력 포트(305)를 복수의 상호연결된 채널(315)과 연결하는 연결 채널의 상류 네트워크(310)와 유체 연통하는 입력 포트(305)를 포함한다. 미세유체 장치(300)는 입력 포트(305)를 통해 유체를 수신하고, 유체의 부분을 연결 채널의 상류 네트워크(310)를 통해 상호연결된 채널(315) 각각으로 지시하도록 구성된다. 상호연결된 채널(315)은 또한 연결 채널의 하류 네트워크(320)와 유체 연통하며, 출력 포트(325)에서 종료한다. 미세유체 장치는 연결 채널의 하류 네트워크(320)를 통해 용출액을 복수의 상호연결된 채널 각각으로부터 단일 출력 포트(325)와 같은 출력 특징부로 지시하도록 구성된다. 일부 구현예에서, 입력 포트는 샘플 주입기 및/또는 이동상 공급원(예컨대 펌프)과 접촉하도록 구성된다. 일부 구현예에서, 출력 포트는 본원에 기재된 방법에 유용한 하류 도구 또는 특징부와 접속하도록 구성된다. 일부 구현예에서, 출력 포트는 분획 수집기와 같은 수집 장치와 접속하도록 구성된다. 일부 구현예에서, 출력 포트는 전기분무 이온화 소스와 접속하도록 구성된다.
일부 구현예에서, 미세유체 장치는 복수의 상호연결된 채널을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상호연결된 채널은 복수의 상호연결된 병렬 채널로서 구성된다. 이러한 구현예에서, 용어 "병렬"은 유체 입력 미세유체 장치로의 유체 입력물이 분할되고 유체의 부분이 상호연결된 채널의 상이한 채널, 또는 이의 상이한 섹션을 통해 동시에 이동하는 것을 나타내고, 상호연결된 채널의 모양에 관한 제한으로 해석되는 것으로 의도되지 않는다(예를 들어, 해당 상호연결된 병렬 채널은 기하학적 병렬 방식으로 구성된 직선일 수만 있다). 일부 구현예에서, 복수의 상호연결된 채널은 채널의 실질적으로 선형 특징을 포함하는 하나 이상의 채널을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상호연결된 채널은 발산형, 엇갈림형, 또는 파형 기하학적 구조를 포함하는 것과 같은, 채널의 비선형 특징을 포함하는 하나 이상의 채널을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 미세유체 장치는 임의의 수의 상호연결된 채널을 포함할 수 있어서, 상호연결된 채널이 미세유체 장치의 입력 포트(들)와 유체 연통하도록 하고, 상호연결된 채널이 입력 포트(들)를 통해 미세유체 장치로 도입된 유체의 일부를 수신하도록 구성된다. 일부 구현예에서, 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널은 8 개 이상의 상호연결된 채널을 포함한다. 일부 구현예에서, 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100 개 중 임의의 상호연결된 채널을 갖는다. 일부 구현예에서, 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널은 32 개의 상호연결된 채널을 포함한다. 일부 구현예에서, 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널은 64 개의 상호연결된 채널을 포함한다.
일부 구현예에서, 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각은 미세유체 장치의 입력 포트와 유체 연통한다. 일부 구현예에서, 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각은 연결 채널의 상류 네트워크를 통해 미세유체 장치의 입력 포트와 유체 연통한다. 일부 구현예에서, 연결 채널의 상류 네트워크는 유체의 일부가 각 상호연결된 채널로 전달되도록 미세유체 장치의 입력 포트를 통해 도입된 유체의 유동을 지시하고 분할하도록 구성된다. 일부 구현예에서, 연결 채널의 상류 네트워크, 또는 이의 부분은 복수의 상호연결된 채널 각각의 근위 영역에 연결된다. 일부 구현예에서, 상호연결된 채널의 근위 영역은 미세유체 장치의 입력 포트를 통해 도입된 유체에 처음 적용된 상호연결된 채널의 영역이다. 연결 채널의 상류 네트워크는 수많은 방식으로 구성될 수 있고 유체를 상호연결된 채널에 지시하는 것 외에도 하나 이상의 기능, 예를 들어, 혼합 기능 및/또는 필터링 기능 및/또는 희석 기능을 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 연결 채널의 상류 네트워크는 유체 유동을 미세유체 장치의 입력 포트로부터 복수의 상호연결된 채널 각각으로 분할하도록 구성된 일련의 발산 채널을 포함한다. 일부 구현예에서, 연결 채널의 상류 네트워크의 일련의 발산 채널은 1 대 2 분할(예를 들어, 의도된 유체 유동에 기반하여 상류에서 하류 방향으로, 1 개의 채널을 2 개의 채널로 분할함)을 사용하여 구조화된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 단일 입력 포트 및 32 개의 상호연결된 채널를 갖는 미세유체 장치의 경우, 연결 채널의 상류 네트워크는 2 개의 채널로 분할되는 단일 채널을 포함하며, 상기 2 개의 채널 각각은 2 개의 채널로 분할되고(이제 총 4 개의 채널), 상기 4 개의 채널 각각은 2 개의 채널로 분할되고(이제 총 8 개의 채널), 상기 8 개의 채널 각각은 2 개의 채널로 분할되고(이제 16 개의 채널), 상기 16 개의 채널 각각은 2 개의 채널로 분할되고(이제 32 개의 채널), 상기 32 개의 채널 각각은 32 개의 상호연결된 채널 중 하나에 연결된다. 일부 구현예에서, 연결 채널의 상류 네트워크는 1 대 2 분할, 1 대 3 분할, 1 대 4 분할, 1 대 5 분할, 1 대 6 분할, 1 대 7 분할, 1 대 8 분할, 1 대 9 분할, 1 대 10 분할, 1 대 11 분할, 1 대 12 분할, 또는 이의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 분할 후 연결 채널의 상류 네트워크의 채널(즉, 분할 채널)은 원래 채널과 비교하여 더 작은 단면 치수(예컨대 높이 및/또는 폭)를 갖는다.
일부 구현예에서, 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각은 미세유체 장치의 출력 포트와 유체 연통한다. 일부 구현예에서, 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각은 연결 채널의 하류 네트워크를 통해 미세유체 장치의 출력 포트와 유체 연통한다. 일부 구현예에서, 연결 채널의 하류 네트워크는 유체 유동을 복수의 상호연결된 채널 각각으로부터 미세유체 장치의 출력 포트(예를 들어, 미세유체 장치의 하나 초과의 출력 포트 포함)로 지시하고 조합하도록 구성된다. 일부 구현예에서, 연결 채널의 하류 네트워크, 또는 이의 부분은 복수의 상호연결된 채널 각각의 원위 영역에 연결된다. 일부 구현예에서, 상호연결된 채널의 원위 영역은 유체가 상호연결된 채널에서 하류 특징부로 빠져나가는 상호연결된 채널의 영역이다. 연결 채널의 하류 네트워크는 수많은 방식으로 구성될 수 있고 유체를 출력 포트로 지시하는 것 외에도 하나 이상의 기능, 예를 들어, 혼합 기능 및/또는 필터링 기능 및/또는 희석 기능을 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 연결 채널의 하류 네트워크는 유체 유동을 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널로부터 출력 포트로 조합하도록 구성된 일련의 수렴 채널을 포함한다. 일부 구현예에서, 연결 채널의 하류 네트워크의 일련의 수렴 채널은 2 대 1 분할(예를 들어, 의도된 유체 유동에 기반하여 상류에서 하류 방향으로, 2 개의 채널을 1 개의 채널로 수렴함)을 사용하여 구조화된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 단일 출력 포트 및 32 개의 상호연결된 채널을 갖는 미세유체 장치의 경우, 연결 채널의 하류 네트워크는 32 개의 채널을 포함하며, 연결 채널의 하류 네트워크의 32 개의 채널 각각은 32 개의 상호연결된 채널의 채널에 연결되며, 상기 연결 채널의 하류 네트워크의 32 개 채널의 쌍은 단일 채널로 수렴되고(이제 16 개 채널), 상기 연결 채널의 하류 네트워크의 16 개 채널 쌍은 단일 채널로 수렴되고(이제 8 개의 채널), 상기 연결 채널의 하류 네트워크의 8 개 채널의 쌍은 단일 채널로 수렴되고(이제 4 개의 채널), 상기 연결 채널의 하류 네트워크의 4 개의 채널 쌍은 단일 채널로 수렴되고(이제 2 개의 채널), 상기 연결 채널의 하류 네트워크의 2 개의 채널은 출력 포트와 유체 연통하는 단일 채널로 수렴된다. 일부 구현예에서, 연결 채널의 하류 네트워크는 2 대 1 수렴, 3 대 1 수렴, 4 대 1 수렴, 5 대 1 수렴, 6 대 1 수렴, 7 대 1 수렴, 8 대 1 수렴, 9 대 1 수렴, 10 대 1 수렴, 11 대 1 수렴, 12 대 1 수렴, 또는 이의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 수렴 후 연결 채널의 하류 네트워크의 채널(즉, 수렴 채널)은 원래 채널과 비교하여 더 큰 단면 치수(예컨대 높이 및/또는 폭)를 갖는다.
일부 구현예에서, 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널은 연결 채널의 상류 네트워크 및/또는 연결 채널의 하류 네트워크를 통해서만 연결된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 하나의 상호연결된 채널은 연결 채널의 상류 네트워크 및/또는 연결 채널의 하류 네트워크를 통한 것을 제외하고, 또 다른 상호연결된 채널에 연결되지 않는다.
일부 구현예에서, 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각은 약 2 cm 내지 약 50 cm, 예컨대 약 5 cm 내지 약 20 cm의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 상호연결된 채널의 길이는 적어도 약 5 cm, 예컨대 적어도 약 6 cm, 7 cm, 8 cm, 9 cm, 10 cm, 11 cm, 12 cm, 13 cm, 14 cm, 15 cm, 16 cm, 17 cm, 18 cm, 19 cm, 20 cm, 21 cm, 22 cm, 23 cm, 24 cm, 25 cm, 26 cm, 27 cm, 28 cm, 29 cm, 30 cm, 31 cm, 32 cm, 33 cm, 34 cm, 35 cm, 36 cm, 37 cm, 38 cm, 39 cm, 40 cm, 41 cm, 42 cm, 43 cm, 44 cm, 45 cm, 46 cm, 47 cm, 48 cm, 49 cm, 또는 50 cm 중 임의의 것이다. 일부 구현예에서, 상호연결된 채널의 길이는 약 50 cm 미만, 예컨대 약 49 cm, 48 cm, 47 cm, 46 cm, 45 cm, 44 cm, 43 cm, 42 cm, 41 cm, 40 cm, 39 cm, 38 cm, 37 cm, 36 cm, 35 cm, 34 cm, 33 cm, 32 cm, 31 cm, 30 cm, 29 cm, 28 cm, 27 cm, 26 cm, 25 cm, 24 cm, 23 cm, 22 cm, 21 cm, 20 cm, 19 cm, 18 cm, 17 cm, 16 cm, 15 cm, 14 cm, 13 cm, 12 cm, 11 cm, 10 cm, 9 cm, 8 cm, 7 cm, 6 cm, 5 cm, 4 cm, 3 cm, 또는 2 cm 미만 중 임의의 것이다. 일부 구현예에서, 상호연결된 채널의 길이는 약 5 cm, 6 cm, 7 cm, 8 cm, 9 cm, 10 cm, 11 cm, 12 cm, 13 cm, 14 cm, 15 cm, 16 cm, 17 cm, 18 cm, 19 cm, 20 cm, 21 cm, 22 cm, 23 cm, 24 cm, 25 cm, 26 cm, 27 cm, 28 cm, 29 cm, 30 cm, 31 cm, 32 cm, 33 cm, 34 cm, 35 cm, 36 cm, 37 cm, 38 cm, 39 cm, 40 cm, 41 cm, 42 cm, 43 cm, 44 cm, 45 cm, 46 cm, 47 cm, 48 cm, 49 cm, 또는 50 cm 중 임의의 것이다.
일부 구현예에서, 복수의 상호연결된 채널의 총 길이는 약 20 cm 내지 약 3,200 cm이다. 일부 구현예에서, 복수의 상호연결된 채널의 총 길이는 약 20 cm 초과, 예컨대 약 50 cm, 75 cm, 100 cm, 150 cm, 200 cm, 250 cm, 300 cm, 350 cm, 400 cm, 450 cm, 500 cm, 600 cm, 700 cm, 800 cm, 900 cm, 1,000 cm, 1,250 cm, 1,500 cm, 1,750 cm, 2,000 cm, 2,250 cm, 2,500 cm, 2,750 cm, 또는 3,000 cm 초과 중 임의의 것이다.
본원에 기재된 상호연결된 채널, 연결 채널의 상류 네트워크, 및 연결 채널의 하류 네트워크의 채널은 다양한 단면 모양 및 크기를 갖도록 형성될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 채널의 단면 모양 및 크기는 채널의 상이한 지점에서 변할 수 있다. 일부 구현예에서, 채널은 직사각형, 정사각형, 또는 원형을 포함하는 단면 모양을 갖는다.
일부 구현예에서, 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 1 μm 내지 약 15 μm, 예컨대 약 3 μm 내지 약 10 μm의 단면 치수를 갖는다. 일부 구현예에서, 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 15 μm 이하, 예컨대 약 14 μm 이하, 13 μm 이하, 12 μm 이하, 11 μm 이하, 10 μm 이하, 9 μm 이하, 8 μm 이하, 7 μm 이하, 6 μm 이하, 5 μm 이하, 4 μm 이하, 3 μm 이하, 2 μm 이하, 또는 1 μm 이하 중 임의의 단면 치수를 갖는다. 일부 구현예에서, 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 1 μm, 2 μm, 3 μm, 4 μm, 5 μm, 6 μm, 7 μm, 8 μm, 9 μm, 10 μm, 11 μm, 12 μm, 14 μm, 또는 15 μm 중 임의의 단면 치수를 갖는다.
일부 구현예에서, 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 1 μm 내지 약 15 μm, 예컨대 약 3 μm 내지 약 10 μm의 최대 단면 치수를 갖는다. 일부 구현예에서, 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 15 μm 이하, 예컨대 약 14 μm 이하, 13 μm 이하, 12 μm 이하, 11 μm 이하, 10 μm 이하, 9 μm 이하, 8 μm 이하, 7 μm 이하, 6 μm 이하, 5 μm 이하, 4 μm 이하, 3 μm 이하, 2 μm 이하, 또는 1 μm 이하 중 임의의 최대 단면 치수를 갖는다. 일부 구현예에서, 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 1 μm, 2 μm, 3 μm, 4 μm, 5 μm, 6 μm, 7 μm, 8 μm, 9 μm, 10 μm, 11 μm, 12 μm, 14 μm, 또는 15 μm 중 임의의 최대 단면 치수를 갖는다. 일부 구현예에서, 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 1 μm 이상, 예컨대 약 2 μm 이상, 3 μm 이상, 4 μm 이상, 5 μm 이상, 6 μm 이상, 7 μm 이상, 8 μm 이상, 9 μm 이상, 또는 10 μm 이상 중 임의의 최소 단면 치수를 갖는다. 일부 구현예에서, 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 1 μm, 2 μm, 3 μm, 4 μm, 5 μm, 6 μm, 7 μm, 8 μm, 9 μm, 10 μm, 11 μm, 12 μm, 14 μm, 또는 15 μm 중 임의의 최소 단면 치수를 갖는다.
일부 구현예에서, 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 1 μm 내지 약 15 μm, 예컨대 약 3 μm 내지 약 10 μm의 최대 단면 치수에 수직인 단면 치수를 갖는다. 일부 구현예에서, 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 15 μm 이하, 예컨대 약 14 μm 이하, 13 μm 이하, 12 μm 이하, 11 μm 이하, 10 μm 이하, 9 μm 이하, 8 μm 이하, 7 μm 이하, 6 μm 이하, 5 μm 이하, 4 μm 이하, 3 μm 이하, 2 μm 이하, 또는 1 μm 이하 중 임의의 최대 단면 치수에 수직인 단면 치수를 갖는다. 일부 구현예에서, 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 1 μm, 2 μm, 3 μm, 4 μm, 5 μm, 6 μm, 7 μm, 8 μm, 9 μm, 10 μm, 11 μm, 12 μm, 14 μm, 또는 15 μm 중 임의의 최대 단면 치수에 수직인 단면 치수를 갖는다. 일부 구현예에서, 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 1 μm, 2 μm, 3 μm, 4 μm, 5 μm, 6 μm, 7 μm, 8 μm, 9 μm, 10 μm, 11 μm, 12 μm, 14 μm, 또는 15 μm의 최대 단면 치수, 및 임의의 약 1 μm, 2 μm, 3 μm, 4 μm, 5 μm, 6 μm, 7 μm, 8 μm, 9 μm, 10 μm, 11 μm, 12 μm, 14 μm, 또는 15 μm 중 임의의 최대 단면 치수에 수직인 단면 치수를 갖는다.
일부 구현예에서, 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 1 μm 내지 약 15 μm, 예컨대 약 1 μm 내지 약 6 μm, 약 3 μm 내지 약 10 μm, 또는 약 6 μm 내지 약 12 μm 중 임의의 폭(예컨대 단면 치수에 걸쳐 측정됨)을 갖는다. 일부 구현예에서, 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 15 μm 이하, 예컨대 약 14 μm 이하, 13 μm 이하, 12 μm 이하, 11 μm 이하, 10 μm 이하, 9 μm 이하, 8 μm 이하, 7 μm 이하, 6 μm 이하, 5 μm 이하, 4 μm 이하, 3 μm 이하, 2 μm 이하, 또는 1 μm 이하 중 임의의 폭(예컨대 단면 치수에 걸쳐 측정됨)을 갖는다. 일부 구현예에서, 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 1 μm, 2 μm, 3 μm, 4 μm, 5 μm, 6 μm, 7 μm, 8 μm, 9 μm, 10 μm, 11 μm, 12 μm, 14 μm, 또는 15 μm 중 임의의 폭(예컨대 단면 치수에 걸쳐 측정됨)을 갖는다.
일부 구현예에서, 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 1 μm 내지 약 15 μm, 예컨대 약 1 μm 내지 약 6 μm, 약 3 μm 내지 약 10 μm, 또는 약 6 μm 내지 약 12 μm 중 임의의 높이(예컨대 단면 치수에 걸쳐 측정됨)를 갖는다. 일부 구현예에서, 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 15 μm 이하, 예컨대 약 14 μm 이하, 13 μm 이하, 12 μm 이하, 11 μm 이하, 10 μm 이하, 9 μm 이하, 8 μm 이하, 7 μm 이하, 6 μm 이하, 5 μm 이하, 4 μm 이하, 3 μm 이하, 2 μm 이하, 또는 1 μm 이하 중 임의의 높이(예컨대 단면 치수에 걸쳐 측정됨)를 갖는다. 일부 구현예에서, 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 1 μm, 2 μm, 3 μm, 4 μm, 5 μm, 6 μm, 7 μm, 8 μm, 9 μm, 10 μm, 11 μm, 12 μm, 14 μm, 또는 15 μm 중 임의의 높이(예컨대 단면 치수에 걸쳐 측정됨)를 갖는다.
일부 구현예에서, 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널은 기둥 배열을 통해 형성된다. 일부 구현예에서, 기둥 배열은 무정형 기둥 배열이다. 일부 구현예에서, 기둥 배열은 비-무정형 기둥 배열이다. 일부 구현예에서, 기둥 배열은 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각의 내부 표면을 포함하여 형성된다.
일부 구현예에서, 미세유체 장치는 석영 기판을 포함한다. 일부 구현예에서, 미세유체 장치는 복수의 상호연결된 채널을 형성하는 모놀리식 기판을 포함한다. 일부 구현예에서, 미세유체 장치는 석영 모놀리식 기판을 포함한다. 일부 구현예에서, 미세유체 장치는 3차원(3D) 인쇄 기판을 포함한다.
일부 구현예에서, 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 개방 관형 형식이다. 일부 구현예에서, 미세유체 장치의 채널은 내부 표면 물질을 포함한다. 일부 구현예에서, 내부 표면 물질은 크기 배제 크로마토그래피 매질과 같은 분리 매질로서 구성된다. 일부 구현예에서, 내부 표면 물질은 원하는 분리에 기반하여, 두께와 같은 치수를 갖는다.
일부 측면에서, 본원에는 본원에 기재된 미세유체 장치를 제조하는 방법이 제공된다. 미세유체 장치의 제조 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, Gale 등, MDPI Inventions, 3, 2018을 참조하며, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, 방법은 마스킹 기술을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 에칭 기술을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 3차원(3D) 인쇄 기술을 포함한다.
i. 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 미세유체 장치
일부 구현예에서, 샘플의 구성요소를 분리하도록 구성된 미세유체 장치는 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 미세유체 장치이다. 이러한 구현예에서, SEC 미세유체 장치는 채널의 내부 표면에 접합된 것과 같은, 적어도 SEC 크로마토그래피 장치의 복수의 상호연결된 채널에 위치된 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 매질을 포함한다. 일부 구현예에서, SEC 매질은 연결 채널의 상류 네트워크에 추가로 위치한다. 일부 구현예에서, SEC 매질은 연결 채널의 하류 네트워크에 추가로 위치한다.
일부 구현예에서, SEC 매질은 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널의 내부 표면 물질이다. 일부 구현예에서, 내부 표면은 약 10 nm 내지 약 500 nm의 평균 기공 크기를 포함한다. 일부 구현예에서, 내부 표면은 적어도 약 10 nm, 예컨대 적어도 약 20 nm, 30 nm, 40 nm, 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm, 100 nm, 125 nm, 150 nm, 175 nm, 200 nm, 225 nm, 250 nm, 275 nm, 300 nm, 325 nm, 350 nm, 375 nm, 400 nm, 425 nm, 450 nm, 475 nm, 또는 500 nm 중 임의의 평균 기공 크기를 포함한다. 일부 구현예에서, 내부 표면은 약 500 nm 미만, 예컨대 약 475 nm, 450 nm, 425 nm, 400 nm, 375 nm, 350 nm, 325 nm, 300 nm, 275 nm, 250 nm, 225 nm, 200 nm, 175 nm, 150 nm, 125 nm, 100 nm, 90 nm, 80 nm, 70 nm, 60 nm, 50 nm, 40 nm, 30 nm, 20 nm, 또는 10 nm 미만 중 임의의 평균 기공 크기를 포함한다. 일부 구현예에서, 내부 표면은 약 10 nm, 20 nm, 30 nm, 40 nm, 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm, 100 nm, 125 nm, 150 nm, 175 nm, 200 nm, 225 nm, 250 nm, 275 nm, 300 nm, 325 nm, 350 nm, 375 nm, 400 nm, 425 nm, 450 nm, 475 nm, 또는 500 nm 중 임의의 평균 기공 크기를 포함한다.
일부 구현예에서, 내부 표면 물질은 개방 관형 형식으로 발견된 것과 같은, 복수의 상호연결된 채널의 각 채널에 개방 공간을 남기도록 구성된다. 일부 구현예에서, 내부 표면 물질은 약 0.5 μm 내지 약 2 μm의 두께를 갖는다. 일부 구현예에서, 내부 표면 물질은 적어도 약 0.5 μm, 예컨대 적어도 약 0.6 μm, 0.7 μm, 0.8 μm, 0.9 μm, 1 μm, 1.1 μm, 1.2 μm, 1.3 μm, 1.4 μm, 1.5 μm, 1.6 μm, 1.7 μm, 1.8 μm, 1.9 μm, 또는 2 μm 중 임의의 두께를 갖는다. 일부 구현예에서, 내부 표면 물질은 약 2 μm 미만, 예컨대 약 1.9 μm, 1.8 μm, 1.7 μm, 1.6 μm, 1.5 μm, 1.4 μm, 1.3 μm, 1.2 μm, 1.1 μm, 1 μm, 0.9 μm, 0.8 μm, 0.7 μm, 0.6 μm, 또는 0.5 μm 미만 중 임의의 두께를 갖는다. 일부 구현예에서, 내부 표면 물질은 약 0.5 μm, 0.6 μm, 0.7 μm, 0.8 μm, 0.9 μm, 1 μm, 1.1 μm, 1.2 μm, 1.3 μm, 1.4 μm, 1.5 μm, 1.6 μm, 1.7 μm, 1.8 μm, 1.9 μm, 또는 2 μm 중 임의의 두께를 갖는다.
일부 구현예에서, 내부 표면 물질은 플라즈마 에칭 기술 및/또는 3차원(3D) 인쇄 기술을 사용하여 제조된다.
일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치는 복수의 상호연결된 채널을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 SEC 미세유체 장치는 임의의 수의 상호연결된 채널을 포함할 수 있어서, 상호연결된 채널이 SEC 미세유체 장치의 입력 포트와 유체 연통하도록 하고, 상호연결된 채널은 입력 포트를 통해 SEC 미세유체 장치에 도입된 유체의 일부를 수신하도록 구성된다. 일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널은 8 개 이상의 상호연결된 채널을 포함한다. 일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100 개 중 임의의 상호연결된 채널을 갖는다. 일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널은 32 개의 상호연결된 채널을 포함한다. 일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널은 64 개의 상호연결된 채널을 포함한다.
일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각은 SEC 미세유체 장치의 입력 포트와 유체 연통한다. 일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각은 연결 채널의 상류 네트워크를 통해 SEC 미세유체 장치의 입력 포트와 유체 연통한다. 일부 구현예에서, 연결 채널의 상류 네트워크는 유체의 일부가 각 상호연결된 채널로 전달되도록 SEC 미세유체 장치의 입력 포트를 통해 도입된 유체의 유동을 지시하거나 분할하도록 구성된다. 일부 구현예에서, 연결 채널의 상류 네트워크, 또는 이의 부분은 복수의 상호연결된 채널 각각의 근위 영역에 연결된다. 일부 구현예에서, 상호연결된 채널의 근위 영역은 SEC 미세유체 장치의 입력 포트를 통해 도입된 유체에 처음 적용된 상호연결된 채널의 영역이다. 연결 채널의 상류 네트워크는 수많은 방식으로 구성될 수 있고 유체를 상호연결된 채널에 지시하는 것 외에도 하나 이상의 기능, 예를 들어, 혼합 기능 및/또는 필터링 기능 및/또는 희석 기능을 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 연결 채널의 상류 네트워크는 유체 유동을 SEC 미세유체 장치의 입력 포트로부터 복수의 상호연결된 채널 각각으로 분할하도록 구성된 일련의 발산 채널을 포함한다. 일부 구현예에서, 연결 채널의 상류 네트워크의 일련의 발산 채널은 1 대 2 분할(예를 들어, 의도된 유체 유동에 기반하여 상류에서 하류 방향으로, 1 개의 채널을 2 개의 채널로 분할함)을 사용하여 구조화된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 단일 입력 포트 및 32 개의 상호연결된 채널을 갖는 SEC 미세유체 장치의 경우, 연결 채널의 상류 네트워크는 2 개의 채널로 분할된 단일 채널을 포함하며, 상기 2 개의 채널 각각은 2 개의 채널로 분할되고(이제 총 4 개의 채널), 상기 4 개의 채널 각각은 2 개의 채널로 분할되고(이제 총 8 개의 채널), 상기 8 개의 채널 각각은 2 개의 채널로 분할되고(이제 16 개의 채널), 상기 16 개의 채널 각각은 2 개의 채널로 분할되고(이제 32 개의 채널), 상기 32 개의 채널 각각은 32 개의 상호연결된 채널 중 하나에 연결된다. 일부 구현예에서, 연결 채널의 상류 네트워크는 1 대 2 분할, 1 대 3 분할, 1 대 4 분할, 1 대 5 분할, 1 대 6 분할, 1 대 7 분할, 1 대 8 대 분할, 1 대 9 분할, 1 대 10 대 분할, 1 대 11 대 분할, 1 대 12 대 분할, 또는 이의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 분할 후 연결 채널의 상류 네트워크의 채널(즉, 분할 채널)은 원래 채널과 비교하여 더 작은 단면 치수(예컨대 높이 및/또는 폭)를 갖는다.
일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각은 SEC 미세유체 장치의 출력 포트와 유체 연통한다. 일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각은 연결 채널의 하류 네트워크를 통해 SEC 미세유체 장치의 출력 포트와 유체 연통한다. 일부 구현예에서, 연결 채널의 하류 네트워크는 유체 유동을 복수의 상호연결된 채널 각각으로부터 SEC 미세유체 장치의 출력 포트(예를 들어, 미세유체 장치의 하나 초과의 출력 포트 포함)로 지시하고 조합하도록 구성된다. 일부 구현예에서, 연결 채널의 하류 네트워크, 또는 이의 부분은 복수의 상호연결된 채널 각각의 원위 영역에 연결된다. 일부 구현예에서, 상호연결된 채널의 원위 영역은 유체가 상호연결된 채널에서 하류 특징부로 빠져나가는 상호연결된 채널의 영역이다. 연결 채널의 하류 네트워크는 수많은 방식으로 구성될 수 있고 유체를 출력 포트로 지시하는 것 외에도 하나 이상의 기능, 예를 들어, 혼합 기능 및/또는 필터링 기능 및/또는 희석 기능을 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 연결 채널의 하류 네트워크는 유체 유동을 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널로부터 출력 포트로 조합하도록 구성된 일련의 수렴 채널을 포함한다. 일부 구현예에서, 연결 채널의 하류 네트워크의 일련의 수렴 채널은 2 대 1 분할(예를 들어, 의도된 유체 유동에 기반하여 상류에서 하류 방향으로, 2 개의 채널을 1 개의 채널로 수렴함)을 사용하여 구조화된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 단일 출력 포트 및 32 개의 상호연결된 채널을 갖는 SEC 미세유체 장치의 경우, 연결 채널의 하류 네트워크는 32 개의 채널을 포함하며, 연결 채널의 하류 네트워크의 32 개의 채널 각각은 32 개의 상호연결된 채널의 채널에 연결되고, 상기 연결 채널의 하류 네트워크의 32 개의 채널 쌍은 단일 채널로 수렴되고(이제 16 개의 채널), 상기 연결 채널의 하류 네트워크의 16 개의 채널 쌍은 단일 채널로 수렴되고(이제 8 개의 채널), 상기 연결 채널의 하류 네트워크의 8 개의 채널 쌍은 단일 채널로 수렴되고(이제 4 개의 채널), 상기 연결 채널의 하류 네트워크의 4 개의 채널 쌍은 단일 채널로 수렴되고(이제 2 개의 채널), 상기 연결 채널의 하류 네트워크의 2 개의 채널은 출력 포트와 유체 연통하는 단일 채널로 수렴된다. 일부 구현예에서, 연결 채널의 하류 네트워크는 2 대 1 수렴, 3 대 1 수렴, 4 대 1 수렴, 5 대 1 수렴, 6 대 1 수렴, 7 대 1 수렴, 8 대 1 수렴, 9 대 1 수렴, 10 대 1 수렴, 11 대 1 수렴, 12 대 1 수렴, 또는 이의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 수렴 후 연결 채널의 하류 네트워크의 채널(즉, 수렴 채널)은 원래 채널과 비교하여 더 큰 단면 치수(예컨대 높이 및/또는 폭)를 갖는다.
일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널은 연결 채널의 상류 네트워크 및/또는 연결 채널의 하류 네트워크를 통해서만 연결된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 하나의 상호연결된 채널은 연결 채널의 상류 네트워크 및/또는 연결 채널의 하류 네트워크를 통한 것을 제외하고, 또 다른 상호연결된 채널에 연결되지 않는다.
일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각은 약 2 cm 내지 약 30 cm, 예컨대 약 5 cm 내지 약 20 cm의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 상호연결된 채널의 길이는 적어도 약 5 cm, 예컨대 적어도 약 6 cm, 7 cm, 8 cm, 9 cm, 10 cm, 11 cm, 12 cm, 13 cm, 14 cm, 15 cm, 16 cm, 17 cm, 18 cm, 19 cm, 20 cm, 21 cm, 22 cm, 23 cm, 24 cm, 25 cm, 26 cm, 27 cm, 28 cm, 29 cm, 또는 30 cm 중 임의의 것이다. 일부 구현예에서, 상호연결된 채널의 길이는 약 30 cm 미만, 예컨대 약 29 cm, 28 cm, 27 cm, 26 cm, 25 cm, 24 cm, 23 cm, 22 cm, 21 cm, 20 cm, 19 cm, 18 cm, 17 cm, 16 cm, 15 cm, 14 cm, 13 cm, 12 cm, 11 cm, 10 cm, 9 cm, 8 cm, 7 cm, 6 cm, 5 cm, 4 cm, 3 cm, 또는 2 cm 미만 중 임의의 것이다. 일부 구현예에서, 상호연결된 채널의 길이는 약 5 cm, 6 cm, 7 cm, 8 cm, 9 cm, 10 cm, 11 cm, 12 cm, 13 cm, 14 cm, 15 cm, 16 cm, 17 cm, 18 cm, 19 cm, 20 cm, 21 cm, 22 cm, 23 cm, 24 cm, 25 cm, 26 cm, 27 cm, 28 cm, 29 cm, 또는 30 cm 중 임의의 것이다.
일부 구현예에서, 복수의 상호연결된 채널의 총 길이는 약 20 cm 내지 약 3,200 cm이다. 일부 구현예에서, 복수의 상호연결된 채널의 총 길이는 약 20 cm 초과, 예컨대 약 50 cm, 75 cm, 100 cm, 150 cm, 200 cm, 250 cm, 300 cm, 350 cm, 400 cm, 450 cm, 500 cm, 600 cm, 700 cm, 800 cm, 900 cm, 1,000 cm, 1,250 cm, 1,500 cm, 1,750 cm, 2,000 cm, 2,250 cm, 2,500 cm, 2,750 cm, 또는 3,000 cm 초과 중 임의의 것이다.
복수의 상호연결된 채널 본원에 기재된 상호연결된 채널, 연결 채널의 상류 네트워크, 및 연결 채널의 하류 네트워크의 채널은 다양한 단면 모양 및 크기를 갖도록 형성될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 채널의 단면 모양 및 크기는 채널의 상이한 지점에서 변할 수 있다. 일부 구현예에서, 채널은 직사각형, 정사각형, 또는 원형을 포함하는 단면 모양을 갖는다.
일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 1 μm 내지 약 15 μm, 예컨대 약 3 μm 내지 약 10 μm의 단면 치수를 갖는다. 일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 15 μm 이하, 예컨대 약 14 μm 이하, 13 μm 이하, 12 μm 이하, 11 μm 이하, 10 μm 이하, 9 μm 이하, 8 μm 이하, 7 μm 이하, 6 μm 이하, 5 μm 이하, 4 μm 이하, 3 μm 이하, 2 μm 이하, 또는 1 μm 이하 중 임의의 단면 치수를 갖는다. 일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 1 μm, 2 μm, 3 μm, 4 μm, 5 μm, 6 μm, 7 μm, 8 μm, 9 μm, 10 μm, 11 μm, 12 μm, 14 μm, 또는 15 μm 중 임의의 단면 치수를 갖는다.
일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 1 μm 내지 약 15 μm, 예컨대 약 3 μm 내지 약 10 μm의 최대 단면 치수를 갖는다. 일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 15 μm 이하, 예컨대 약 14 μm 이하, 13 μm 이하, 12 μm 이하, 11 μm 이하, 10 μm 이하, 9 μm 이하, 8 μm 이하, 7 μm 이하, 6 μm 이하, 5 μm 이하, 4 μm 이하, 3 μm 이하, 2 μm 이하, 또는 1 μm 이하 중 임의의 최대 단면 치수를 갖는다. 일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 1 μm, 2 μm, 3 μm, 4 μm, 5 μm, 6 μm, 7 μm, 8 μm, 9 μm, 10 μm, 11 μm, 12 μm, 14 μm, 또는 15 μm 중 임의의 최대 단면 치수를 갖는다. 일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 1 μm 이상, 예컨대 약 2 μm 이상, 3 μm 이상, 4 μm 이상, 5 μm 이상, 6 μm 이상, 7 μm 이상, 8 μm 이상, 9 μm 이상, 또는 10 μm 이상 중 임의의 최소 단면 치수를 갖는다. 일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 1 μm, 2 μm, 3 μm, 4 μm, 5 μm, 6 μm, 7 μm, 8 μm, 9 μm, 10 μm, 11 μm, 12 μm, 14 μm, 또는 15 μm 중 임의의 최소 단면 치수를 갖는다.
일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 1 μm 내지 약 15 μm, 예컨대 약 3 μm 내지 약 10 μm의 최대 단면 치수에 수직인 단면 치수를 갖는다. 일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 15 μm 이하, 예컨대 약 14 μm 이하, 13 μm 이하, 12 μm 이하, 11 μm 이하, 10 μm 이하, 9 μm 이하, 8 μm 이하, 7 μm 이하, 6 μm 이하, 5 μm 이하, 4 μm 이하, 3 μm 이하, 2 μm 이하, 또는 1 μm 이하 중 임의의 최대 단면 치수에 수직인 단면 치수를 갖는다. 일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 1 μm, 2 μm, 3 μm, 4 μm, 5 μm, 6 μm, 7 μm, 8 μm, 9 μm, 10 μm, 11 μm, 12 μm, 14 μm, 또는 15 μm 중 임의의 최대 단면 치수에 수직인 단면 치수를 갖는다. 일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 1 μm, 2 μm, 3 μm, 4 μm, 5 μm, 6 μm, 7 μm, 8 μm, 9 μm, 10 μm, 11 μm, 12 μm, 14 μm, 또는 15 μm 중 임의의 최대 단면 치수, 및 약 1 μm, 2 μm, 3 μm, 4 μm, 5 μm, 6 μm, 7 μm, 8 μm, 9 μm, 10 μm, 11 μm, 12 μm, 14 μm, 또는 15 μm 중 임의의 최대 단면 치수에 수직인 단면 치수를 갖는다.
일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 1 μm 내지 약 15 μm, 예컨대 약 1 μm 내지 약 6 μm, 약 3 μm 내지 약 10 μm, 또는 약 6 μm 내지 약 12 μm 중 임의의 폭(예컨대 단면 치수에 걸쳐 측정됨)을 갖는다. 일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 15 μm 이하, 예컨대 약 14 μm 이하, 13 μm 이하, 12 μm 이하, 11 μm 이하, 10 μm 이하, 9 μm 이하, 8 μm 이하, 7 μm 이하, 6 μm 이하, 5 μm 이하, 4 μm 이하, 3 μm 이하, 2 μm 이하, 또는 1 μm 이하 중 임의의 폭(예컨대 단면 치수에 걸쳐 측정됨)을 갖는다. 일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 1 μm, 2 μm, 3 μm, 4 μm, 5 μm, 6 μm, 7 μm, 8 μm, 9 μm, 10 μm, 11 μm, 12 μm, 14 μm, 또는 15 μm 중 임의의 폭(예컨대 단면 치수에 걸쳐 측정됨)을 갖는다.
일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 1 μm 내지 약 15 μm, 예컨대 약 1 μm 내지 약 6 μm, 약 3 μm 내지 약 10 μm, 또는 약 6 μm 내지 약 12 μm 중 임의의 높이(예컨대 단면 치수에 걸쳐 측정됨)를 갖는다. 일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 15 μm 이하, 예컨대 약 14 μm 이하, 13 μm 이하, 12 μm 이하, 11 μm 이하, 10 μm 이하, 9 μm 이하, 8 μm 이하, 7 μm 이하, 6 μm 이하, 5 μm 이하, 4 μm 이하, 3 μm 이하, 2 μm 이하, 또는 1 μm 이하 중 임의의 높이(예컨대 단면 치수에 걸쳐 측정됨)를 갖는다. 일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 1 μm, 2 μm, 3 μm, 4 μm, 5 μm, 6 μm, 7 μm, 8 μm, 9 μm, 10 μm, 11 μm, 12 μm, 14 μm, 또는 15 μm 중 임의의 높이(예컨대 단면 치수에 걸쳐 측정됨)를 갖는다.
일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널은 기둥 배열을 통해 형성된다. 일부 구현예에서, 기둥 배열은 무정형 기둥 배열이다. 일부 구현예에서, 기둥 배열은 비-무정형 기둥 배열이다. 일부 구현예에서, 기둥 배열은 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각의 내부 표면을 포함하여 형성된다.
일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치는 석영 기판을 포함한다. 일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치는 복수의 상호연결된 채널을 형성하는 모놀리식 기판을 포함한다. 일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치는 석영 모놀리식 기판을 포함한다. 일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치는 3차원(3D) 인쇄 기판을 포함한다.
일부 구현예에서, SEC 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 개방 관형 형식이다.
ii. 역상 액체 크로마토그래피(RPLC) 미세유체 장치
일부 구현예에서, 샘플의 구성요소를 분리하도록 구성된 미세유체 장치는 역상 크로마토그래피(RPLC) 미세유체 장치이다. 이러한 구현예에서, RPLC 미세유체 장치는 RPLC 크로마토그래피 장치의 적어도 복수의 상호연결된 채널에 위치된 크기 배제 크로마토그래피(RPLC) 매질을 포함한다. 일부 구현예에서, RPLC 매질은 연결 채널의 상류 네트워크에 추가로 위치한다. 일부 구현예에서, RPLC 매질은 연결 채널의 하류 네트워크에 추가로 위치한다.
일부 구현예에서, 역상 매질은 임의의 탄소 쇄 길이의 알킬 모이어티와 같은 알킬 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 역상 매질은 C2 내지 C20의 탄소 쇄 길이를 갖는 알킬 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 역상 매질은 C2, C4, C8, 또는 C18 중 임의의 것의 탄소 쇄 길이를 갖는 알킬 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 역상 매질은 C2 내지 C20의 탄소 쇄 길이를 갖는 알킬 모이어티 중 2 개 이상을 포함하는 RPLC 모이어티 혼합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 역상 매질은 다음 알킬 모이어티 중 2 개 이상을 포함하는 RPLC 모이어티 혼합물을 포함한다: C2, C4, C8, 및 C18. 일부 구현예에서, 역상 매질은 C2 내지 C20의 탄소 쇄 길이를 갖는 알킬 모이어티 중 3 개 이상을 포함하는 RPLC 모이어티 혼합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 역상 매질은 다음 알킬 모이어티 중 3 개 이상을 포함하는 RPLC 모이어티 혼합물을 포함한다: C2, C4, C8, 및 C18. 일부 구현예에서, RPLC 모이어티 혼합물은 다음 알킬 모이어티를 포함한다: C2, C4, C8, 및 C18.
역상 매질의 알킬 모이어티는 원하는 분리에 기반할 수 있다. 일부 구현예에서, RPLC 모이어티 혼합물의 알킬 모이어티는 등몰량으로 존재한다.
일부 구현예에서, RPLC 모이어티 혼합물과 같은 역상 매질의 알킬 모이어티는 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각의 표면에 공유적으로 결합된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 상호연결된 복수의 병렬 채널의 내부 표면은 실리카(SiO2)를 포함한다.
일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치는 복수의 상호연결된 채널을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 RPLC 미세유체 장치는 임의의 수의 상호연결된 채널을 포함할 수 있어서, 상호연결된 채널이 RPLC 미세유체 장치의 입력 포트와 유체 연통하도록 하고, 상호연결된 채널은 입력 포트를 통해 RPLC 미세유체 장치에 도입된 유체의 일부를 수신하도록 구성된다. 일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널은 8 개 이상의 상호연결된 채널을 포함한다. 일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100 개 중 임의의 상호연결된 채널을 갖는다. 일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널은 32 개의 상호연결된 채널을 포함한다. 일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널은 64 개의 상호연결된 채널을 포함한다.
일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각은 RPLC 미세유체 장치의 입력 포트와 유체 연통한다. 일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각은 연결 채널의 상류 네트워크를 통해 RPLC 미세유체 장치의 입력 포트와 유체 연통한다. 일부 구현예에서, 연결 채널의 상류 네트워크는 유체의 일부가 각 상호연결된 채널로 전달되도록 RPLC 미세유체 장치의 입력 포트를 통해 도입된 유체의 유동을 지시하고 분할하도록 구성된다. 일부 구현예에서, 연결 채널의 상류 네트워크, 또는 이의 부분은 복수의 상호연결된 채널 각각의 근위 영역에 연결된다. 일부 구현예에서, 상호연결된 병렬 채널의 근위 영역은 RPLC 미세유체 장치의 입력 포트를 통해 도입된 유체에 처음 적용된 상호연결된 채널의 영역이다. 연결 채널의 상류 네트워크는 수많은 방식으로 구성될 수 있고 유체를 상호연결된 채널로 지시하는 것 외에도 하나 이상의 기능, 예를 들어, 혼합 기능 및/또는 필터링 기능 및/또는 희석 기능을 제공한다. 일부 구현예에서, 연결 채널의 상류 네트워크는 유체 유동을 RPLC 미세유체 장치의 입력 포트로부터 복수의 상호연결된 채널 각각으로 분할하도록 구성된 일련의 발산 채널을 포함한다. 일부 구현예에서, 연결 채널의 상류 네트워크의 일련의 발산 채널은 1 대 2 분할(예를 들어, 의도된 유체 유동에 기반하여 상류에서 하류 방향으로, 1 개의 채널을 2 개의 채널로 분할함)을 사용하여 구조화된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 단일 입력 포트 및 32 개의 상호연결된 채널을 갖는 RPLC 미세유체 장치의 경우, 연결 채널의 상류 네트워크는 2 개의 채널로 분할된 단일 채널을 포함하며, 상기 2 개의 채널 각각은 2 개의 채널로 분할되고(이제 총 4 개의 채널), 상기 4 개의 채널 각각은 2 개의 채널로 분할되고(이제 총 8 개의 채널), 상기 8 개의 채널 각각은 2 개의 채널로 분할되고(이제 16 개의 채널), 상기 16 개의 채널 각각은 2 개의 채널로 분할되고(이제 32 개의 채널), 상기 32 개의 채널 각각은 32 개의 상호연결된 채널 중 하나에 연결된다. 일부 구현예에서, 연결 채널의 상류 네트워크는 1 대 2 분할, 1 대 3 분할, 1 대 4 분할, 1 대 5 분할, 1 대 6 분할, 1 대 7 분할, 1 대 8 분할, 1 대 9 분할, 1 대 10 분할, 1 대 11 분할, 1 대 12 의 분할, 또는 이의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 분할 후 연결 채널의 상류 네트워크의 채널(즉, 분할 채널)은 원래 채널과 비교하여 더 작은 단면 치수(예컨대 높이 및/또는 폭)를 갖는다.
일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각은 RPLC 미세유체 장치의 출력 포트와 유체 연통한다. 일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각은 연결 채널의 하류 네트워크를 통해 RPLC 미세유체 장치의 출력 포트와 유체 연통한다. 일부 구현예에서, 연결 채널의 하류 네트워크는 유체 유동을 복수의 상호연결된 채널의 각각으로부터 RPLC 미세유체 장치(예를 들어, 미세유체 장치의 하나 초과의 출력 포트 포함)로 지시하고 조합하도록 구성된다. 일부 구현예에서, 연결 채널의 하류 네트워크, 또는 이의 부분은 복수의 상호연결된 채널 각각의 원위 영역에 연결된다. 일부 구현예에서, 상호연결된 채널의 원위 영역은 유체가 상호연결된 채널로부터 하류 특징부로 빠져나오는 상호연결된 채널의 영역이다. 연결 채널의 하류 네트워크는 수많은 방식으로 구성될 수 있고 유체를 출력 포트로 지시하는 것 외에도 하나 이상의 기능, 예를 들어, 혼합 기능 및/또는 필터링 기능 및/또는 희석 기능을 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 연결 채널의 하류 네트워크는 유체 유동을 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널로부터 출력 포트로 조합하도록 구성된 일련의 수렴 채널을 포함한다. 일부 구현예에서, 연결 채널의 하류 네트워크의 일련의 수렴 채널은 2 대 1 분할(예를 들어, 의도된 유체 유동에 기반하여 상류에서 하류 방향으로, 2 개의 채널을 1 개의 채널로 수렴함)을 사용하여 구조화된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 단일 출력 포트 및 32 개의 상호연결된 채널을 갖는 RPLC 미세유체 장치의 경우, 연결 채널의 하류 네트워크는 32 개의 채널을 포함하며, 연결 채널의 하류 네트워크의 32 개의 채널 각각은 32 개의 상호연결된 채널의 채널에 연결되고, 상기 연결 채널의 하류 네트워크의 32 개의 채널 쌍은 단일 채널로 수렴되고(이제 16 개의 채널), 상기 연결 채널의 하류 네트워크의 16 개의 채널 쌍은 단일 채널로 수렴되고(이제 8 개의 채널), 상기 연결 채널의 하류 네트워크의 8 개 채널의 쌍은 단일 채널로 수렴되고(이제 4 개의 채널), 상기 연결 채널의 하류 네트워크의 4 개의 채널 쌍은 단일 채널로 수렴되고(이제 2 개의 채널), 상기 연결 채널의 하류 네트워크의 2 개의 채널은 출력 포트와 유체 연통하는 단일 채널로 수렴된다. 일부 구현예에서, 연결 채널의 하류 네트워크는 2 대 1 수렴, 3 대 1 수렴, 4 대 1 수렴, 5 대 1 수렴, 6 대 1 수렴, 7 대 1 수렴, 8 대 1 수렴, 9 대 1 수렴, 10 대 1 수렴, 11 대 1 수렴, 12 대 1 수렴, 또는 이의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 수렴 후 연결 채널의 하류 네트워크의 채널(즉, 수렴 채널)은 원래 채널과 비교하여 더 큰 단면 치수(예컨대 높이 및/또는 폭)를 갖는다.
일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널은 연결 채널의 상류 네트워크 및/또는 연결 채널의 하류 네트워크를 통해서만 연결된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 하나의 상호연결된 채널은 연결 채널의 상류 네트워크 및/또는 연결 채널의 하류 네트워크를 통한 것을 제외하고, 또 다른 상호연결된 채널에 연결되지 않는다.
일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각은 약 2 cm 내지 약 30 cm, 예컨대 약 5 cm 내지 약 20 cm의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 상호연결된 채널의 길이는 적어도 약 5 cm, 예컨대 적어도 약 6 cm, 7 cm, 8 cm, 9 cm, 10 cm, 11 cm, 12 cm, 13 cm, 14 cm, 15 cm, 16 cm, 17 cm, 18 cm, 19 cm, 20 cm, 21 cm, 22 cm, 23 cm, 24 cm, 25 cm, 26 cm, 27 cm, 28 cm, 29 cm, 또는 30 cm 중 임의의 것이다. 일부 구현예에서, 상호연결된 채널의 길이는 약 30 cm 미만, 예컨대 약 29 cm, 28 cm, 27 cm, 26 cm, 25 cm, 24 cm, 23 cm, 22 cm, 21 cm, 20 cm, 19 cm, 18 cm, 17 cm, 16 cm, 15 cm, 14 cm, 13 cm, 12 cm, 11 cm, 10 cm, 9 cm, 8 cm, 7 cm, 6 cm, 5 cm, 4 cm, 3 cm, 또는 2 cm 미만 중 임의의 것이다. 일부 구현예에서, 상호연결된 채널의 길이는 약 5 cm, 6 cm, 7 cm, 8 cm, 9 cm, 10 cm, 11 cm, 12 cm, 13 cm, 14 cm, 15 cm, 16 cm, 17 cm, 18 cm, 19 cm, 20 cm, 21 cm, 22 cm, 23 cm, 24 cm, 25 cm, 26 cm, 27 cm, 28 cm, 29 cm, 또는 30 cm 중 임의의 것이다.
일부 구현예에서, 복수의 상호연결된 채널의 총 길이는 약 20 cm 내지 약 3,200 cm이다. 일부 구현예에서, 복수의 상호연결된 채널의 총 길이는 약 20 cm 초과, 예컨대 약 50 cm, 75 cm, 100 cm, 150 cm, 200 cm, 250 cm, 300 cm, 350 cm, 400 cm, 450 cm, 500 cm, 600 cm, 700 cm, 800 cm, 900 cm, 1,000 cm, 1,250 cm, 1,500 cm, 1,750 cm, 2,000 cm, 2,250 cm, 2,500 cm, 2,750 cm, 또는 3,000 cm 초과 중 임의의 것이다.
본원에 기재된 상호연결된 채널, 연결 채널의 상류 네트워크, 및 연결 채널의 하류 네트워크의 채널은 다양한 단면 모양 및 크기를 갖도록 형성될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 채널의 단면 모양 및 크기는 채널의 상이한 지점에서 변할 수 있다. 일부 구현예에서, 채널은 직사각형, 정사각형, 또는 원형을 포함하는 단면 모양을 갖는다.
일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 1 μm 내지 약 15 μm, 예컨대 약 3 μm 내지 약 10 μm의 단면 치수를 갖는다. 일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 15 μm 이하, 예컨대 약 14 μm 이하, 13 μm 이하, 12 μm 이하, 11 μm 이하, 10 μm 이하, 9 μm 이하, 8 μm 이하, 7 μm 이하, 6 μm 이하, 5 μm 이하, 4 μm 이하, 3 μm 이하, 2 μm 이하, 또는 1 μm 이하 중 임의의 단면 치수를 갖는다. 일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 1 μm, 2 μm, 3 μm, 4 μm, 5 μm, 6 μm, 7 μm, 8 μm, 9 μm, 10 μm, 11 μm, 12 μm, 14 μm, 또는 15 μm 중 임의의 단면 치수를 갖는다.
일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 1 μm 내지 약 15 μm, 예컨대 약 3 μm 내지 약 10 μm의 최대 단면 치수를 갖는다. 일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 15 μm 이하, 예컨대 약 14 μm 이하, 13 μm 이하, 12 μm 이하, 11 μm 이하, 10 μm 이하, 9 μm 이하, 8 μm 이하, 7 μm 이하, 6 μm 이하, 5 μm 이하, 4 μm 이하, 3 μm 이하, 2 μm 이하, 또는 1 μm 이하 중 임의의 최대 단면 치수를 갖는다. 일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 1 μm, 2 μm, 3 μm, 4 μm, 5 μm, 6 μm, 7 μm, 8 μm, 9 μm, 10 μm, 11 μm, 12 μm, 14 μm, 또는 15 μm 중 임의의 최대 단면 치수를 갖는다. 일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 1 μm 이상, 예컨대 약 2 μm 이상, 3 μm 이상, 4 μm 이상, 5 μm 이상, 6 μm 이상, 7 μm 이상, 8 μm 이상, 9 μm 이상, 또는 10 μm 이상 중 임의의 최소 단면 치수를 갖는다. 일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 1 μm, 2 μm, 3 μm, 4 μm, 5 μm, 6 μm, 7 μm, 8 μm, 9 μm, 10 μm, 11 μm, 12 μm, 14 μm, 또는 15 μm 중 임의의 최소 단면 치수를 갖는다.
일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 1 μm 내지 약 15 μm, 예컨대 약 3 μm 내지 약 10 μm의 최대 단면 치수에 수직인 단면 치수를 갖는다. 일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 15 μm 이하, 예컨대 약 14 μm 이하, 13 μm 이하, 12 μm 이하, 11 μm 이하, 10 μm 이하, 9 μm 이하, 8 μm 이하, 7 μm 이하, 6 μm 이하, 5 μm 이하, 4 μm 이하, 3 μm 이하, 2 μm 이하, 또는 1 μm 이하 중 임의의 최대 단면 치수에 수직인 단면 치수를 갖는다. 일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 1 μm, 2 μm, 3 μm, 4 μm, 5 μm, 6 μm, 7 μm, 8 μm, 9 μm, 10 μm, 11 μm, 12 μm, 14 μm, 또는 15 μm 중 임의의 최대 단면 치수에 수직인 단면 치수를 갖는다. 일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 1 μm, 2 μm, 3 μm, 4 μm, 5 μm, 6 μm, 7 μm, 8 μm, 9 μm, 10 μm, 11 μm, 12 μm, 14 μm, 또는 15 μm 중 임의의 최대 단면 치수, 및 약 1 μm, 2 μm, 3 μm, 4 μm, 5 μm, 6 μm, 7 μm, 8 μm, 9 μm, 10 μm, 11 μm, 12 μm, 14 μm, 또는 15 μm 중 임의의 최대 단면 치수에 수직인 단면 치수를 갖는다.
일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 1 μm 내지 약 15 μm, 예컨대 약 1 μm 내지 약 6 μm, 약 3 μm 내지 약 10 μm, 또는 약 6 μm 내지 약 12 μm 중 임의의 폭(예컨대 단면 치수에 걸쳐 측정됨)을 갖는다. 일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 15 μm 이하, 예컨대 약 14 μm 이하, 13 μm 이하, 12 μm 이하, 11 μm 이하, 10 μm 이하, 9 μm 이하, 8 μm 이하, 7 μm 이하, 6 μm 이하, 5 μm 이하, 4 μm 이하, 3 μm 이하, 2 μm 이하, 또는 1 μm 이하 중 임의의 폭(예컨대 단면 치수에 걸쳐 측정됨)을 갖는다. 일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 1 μm, 2 μm, 3 μm, 4 μm, 5 μm, 6 μm, 7 μm, 8 μm, 9 μm, 10 μm, 11 μm, 12 μm, 14 μm, 또는 15 μm 중 임의의 폭(예컨대 단면 치수에 걸쳐 측정됨)을 갖는다.
일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 1 μm 내지 약 15 μm, 예컨대 약 1 μm 내지 약 6 μm, 약 3 μm 내지 약 10 μm, 또는 약 6 μm 내지 약 12 μm 중 임의의 높이(예컨대 단면 치수에 걸쳐 측정됨)를 갖는다. 일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 15 μm 이하, 예컨대 약 14 μm 이하, 13 μm 이하, 12 μm 이하, 11 μm 이하, 10 μm 이하, 9 μm 이하, 8 μm 이하, 7 μm 이하, 6 μm 이하, 5 μm 이하, 4 μm 이하, 3 μm 이하, 2 μm 이하, 또는 1 μm 이하 중 임의의 높이(예컨대 단면 치수에 걸쳐 측정됨)를 갖는다. 일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 약 1 μm, 2 μm, 3 μm, 4 μm, 5 μm, 6 μm, 7 μm, 8 μm, 9 μm, 10 μm, 11 μm, 12 μm, 14 μm, 또는 15 μm 중 임의의 높이(예컨대 단면 치수에 걸쳐 측정됨)를 갖는다.
일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널은 기둥 배열을 통해 형성된다. 일부 구현예에서, 기둥 배열은 무정형 기둥 배열이다. 일부 구현예에서, 기둥 배열은 비-무정형 기둥 배열이다. 일부 구현예에서, 기둥 배열은 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각의 내부 표면을 포함하여 형성된다.
일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치는 석영 기판을 포함한다. 일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치는 복수의 상호연결된 채널을 형성하는 모놀리식 기판을 포함한다. 일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치는 석영 모놀리식 기판을 포함한다. 일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치는 3차원(3D) 인쇄 기판을 포함한다.
일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치의 상호연결된 채널은 개방 관형 형식이다.
일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치는 온라인 전환 특징부를 포함한다. 일부 구현예에서, 온라인 전환 특징부는 밸브 및/또는 채널, 예컨대 이를 통해 유체 유동에 적용되는 채널이다. 일부 구현예에서, 온라인 전환 특징부는 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널과 전기분무 이온화 장치 사이에 위치한다. 일부 구현예에서, 온라인 전환 특징부는 예를 들어, RPLC 용출액의 특정 부분 또는 부분들이 질량 분광계 접속으로부터 전환될 수 있도록 폐기물과 유체 연통한다.
V. 본원에 기재된 방법 및/또는 장치로부터 수득된 조성물
특정 측면에서, 본원에는 본원에 기재된 방법 및/또는 장치 중 임의의 것으로부터 수득된 조성물 집합이 제공된다. 일부 구현예에서, 조성물 집합의 각 조성물은 RPLC 미세유체 장치 용출액이다.
일부 구현예에서, 본원에 사용된 바와 같이, 조성물은 단백질, 펩티드, 핵산, 대사물, 다른 생체분자, 및 이의 유도체를 포함하는, 2 개 이상의 생성물, 물질, 액체, 및/또는 구성요소의 임의의 혼합물을 지칭한다. 일부 구현예에서, 조성물은 용액, 현탁액, 액체, 분말, 페이스트, 수성, 비수성, 또는 이의 임의의 조합일 수 있다.
VI. 키트, 구성요소, 및 조성물(예컨대 소모품)
일부 측면에서, 본원에는 본원에 기재된 방법, 장치, 및 시스템의 키트, 구성요소, 및 조성물(예컨대 소모품)이 제공된다. 일부 구현예에서, 키트는 SEC 미세유체 장치 및/또는 RPLC 미세유체 장치와 같은 미세유체 액체 크로마토그래피 장치를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 시약, 예를 들어, 액체 고정액과 같은, 본원에 기재된 방법, 장치, 및 시스템에 유용한 조성물 및/또는 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 본 개시내용에 따라 사용하기 위한 설명서를 포함한다.
VII. 분석 방법
일부 구현예에서, 질량 분광법 기술은 구성요소, 또는 이의 하위 집단과 연관된 신호의 평가, 예를 들어, 피크 검출을 포함한다. 질량 분광계에 의해 측정된 신호를 평가하기에 적합한 많은 기술이 당업계에 알려져 있다. 일부 구현예에서, 질량 분광법 기술은 구성요소, 또는 이의 하위 집단과 연관된 이온화 강도를 결정하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 질량 분광법 기술은 구성요소, 또는 이의 하위 집단과 연관된 피크 높이를 결정하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 질량 분광법 기술은 구성요소, 또는 이의 하위 집단과 연관된 피크 면적을 결정하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 질량 분광법 기술은 구성요소, 또는 이의 하위 집단과 연관된 피크 부피를 결정하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 질량 분광법 기술은 아미노산 서열에 의해 펩티드 생성물을 식별하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 질량 분광법 기술은 펩티드 생성물 아미노산 서열 할당을 수동으로 해석하고 검증하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 질량 분광법 기술은 단백질 식별자에 의해 제1 폴리펩티드를 식별하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 질량 분광법 기술은 단백질 식별자에 의해 복수의 폴리펩티드 중 하나 이상을 식별하는 것을 포함하며, 이는 상업적으로 이용가능하거나 사내 생성된 데이터베이스(재조합 단백질 또는 펩티드 또는 대사물의 다른 합성 표준으로부터) 검색 또는 도서관 검색으로 식별될 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드 생성물의 식별은 스펙트럼 라이브러리를 사용하여 달성된다. 스펙트럼 라이브러리의 사용은 폴리펩티드 시스템에 관해 얻은 지식을 전가할 수 있고 데이터 분석 속도가 증가하고 오류가 감소한다.
기재된 질량 분광법 기술 중 임의의 하나가 본원에 기재된 방법에 적용될 수 있다. 일부 구현예에서, RPLC 미세유체 장치로부터 용출된 하나 이상의 생체분자 및/또는 구성요소는 질량 분광계에 적용된다. 일부 구현예에서, 질량 분광법 분석은 질량 분광계를 사용하여 테스트 샘플의 하나 이상의 생체분자 및/또는 구성요소에 대해 수행된다. 일부 구현예에서, 질량 분광법 분석은 RPLC 미세유체 장치를 사용하여 RPLC 기술에 적용된 분획의 분석을 포함한다. 일부 구현예에서, 질량 분광법 분석은 RPLC 미세유체 장치를 사용하여 RPLC 기술에 적용된 각 분획에 대해 질량 분광계로부터 수득된 정보를 포함하는 하나 이상의 데이터 세트를 수득하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 데이터 세트는 RPLC 미세유체 장치를 사용하여, 본원에 기재된 RPLC 기술과 같은 RPLC 기술에 적용된 단일 분획으로부터 질량 분광계로부터 수득된 정보를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 데이터 세트 각각은 질량 분광계에 도입된 하나 이상의 생체분자 및/또는 구성요소의 이온에 대한 질량 대 전하(m/z) 및 존재비 정보를 포함한다.
일부 측면에서, 본원에 제공된 방법은 질량 분광법 기술의 하나 이상의 출력물을 분석하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 방법은 질량 분광계로부터 수득된 정보를 포함하는 하나 이상의 데이터 세트 중 적어도 하나를 분석하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 데이터 세트 중 적어도 하나는 테스트 샘플에서 복수의 하나 이상의 생체분자 각각의 정체성을 결정하는 데 사용된다. 본원에서 "정체성"에 대한 언급은 테스트 샘플에서 생체분자의 이름을 지칭한다. 예를 들면, 일부 구현예에서 하나 이상의 데이터 세트 중 적어도 하나는 질량 분광계에 도입된 테스트 샘플, 또는 이의 생성물로부터의 임의의 단백질의 단백질 이름을 결정하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 데이터 세트 중 적어도 하나의 m/z 정보는 테스트 샘플에서 복수의 하나 이상의 생체분자 각각의 정체성을 결정하는 데 사용된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 데이터 세트 중 적어도 하나는 테스트 샘플에서 복수의 하나 이상의 생체분자 각각의 양을 결정하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 식별된 생체분자의 양이 결정된다. 본원에서 "식별된 생체분자"에 대한 언급은 정체성이 결정된 테스트 샘플의 생체분자를 지칭한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 데이터 세트 중 적어도 하나에서 존재비 정보는 테스트 샘플에서 복수의 하나 이상의 생체분자 각각의 양을 결정하는 데 사용된다. 후속 질량 분광법 기술의 출력물, 예를 들어, m/z 또는 존재비 정보에 기반하여 질량 분광계에 도입된 테스트 샘플 또는 이의 생성물로부터의 생체분자를 식별하거나 정량화하기 위한 적절한 기술을 결정하는 것은 숙련자의 수준 내에 있다.
일부 구현예에서, 적어도 하나 데이터 세트는 테스트 샘플의 하나 이상의 생체분자를 식별하거나 정량화하는 데 사용된다. 예를 들면, 단일 데이터 세트는 단일 분획(예를 들어, 섹션 II-C에 기재된 분획 중 임의의 것)과 연관된 데이터를 포함할 수 있고, 단일 데이터 세트는 해당 분획에 존재하는 생체분자 또는 이의 생성물을 식별하고 정량화하는 데 사용될 수 있고 질량 분광계에 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 데이터 세트는 예를 들면 질량 분광계에 도입된 복수의 분획에 존재하는 생체분자 또는 이의 생성물을 식별하거나 정량화하기 위해, 테스트 샘플의 하나 이상의 생체 분자를 식별하거나 정량화하는 데 사용된다. 질량 분광계에 도입된 임의의 수의 분획과 연관된 임의의 수의 데이터 세트는 연관된 생체분자 또는 이의 생성물을 식별하거나 정량화하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 결정된 정체성으로부터 하나 이상의 식별된 생체분자를 포함하는 서명을 식별하는 단계를 추가로 포함한다. 본원에서 "서명"에 대한 언급은 식별된 생체분자 세트를 지칭한다. 서명은 테스트 샘플에서 식별된 생체분자의 전부 또는 하위집합을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 서명을 식별하는 것은 서명에서 원래 하나 이상의 식별된 생체분자의 하위집합을 선택하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 식별된 생체분자의 하위집합은 하나 이상의 식별된 생체분자의 측정량에 기반하여 선택된다. 예를 들면, 하나 이상의 식별된 생체분자의 하위집합은 높은-존재비 생체분자를 포함하도록 선택될 수 있다.
다른 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 하나 이상의 데이터 세트 중 적어도 하나에 기반하여, 테스트 샘플에서 복수의 하나 이상의 생체분자 각각의 양을 측정하고; 측정량에 기반하여 테스트 샘플에서 복수의 하나 이상의 생체분자의 하위집합을 선택하고; 테스트 샘플에서 복수의 하나 이상의 생체분자의 하위집합 각각의 정체성을 결정함으로써 서명을 식별하는 단계를 추가로 포함한다. 즉, 테스트 샘플에서 복수의 생체분자의 양은 먼저 복수의 생체분자를 식별하지 않고 결정될 수 있고, 복수의 생체분자의 하위집합은 측정량에 기반하여 선택될 수 있다. 그런 다음, 복수의 생체분자의 하위집합에 대한 정체성이 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 식별된 생체분자의 하위집합은 참조 샘플과 비교하여 하나 이상의 식별된 생체분자의 차등 측정량에 기반하여 선택된다. 일부 구현예에서, 테스트 샘플에서 복수의 하나 이상의 생체분자의 하위집합은 참조 샘플과 비교하여 테스트 샘플에서 복수의 하나 이상의 생체분자의 차등 측정량에 기반하여 선택된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 식별된 생체분자의 하위집합(또는 복수의 하나 이상의 생체분자의 하위집합)은 복수의 참조 샘플과 비교하여 차등 측정량에 기반하여 선택된다. 일부 구현예에서, 식별된 생체분자 및 연관된 측정량은 복수의 테스트 샘플에 대해 결정되고, 서명에 포함되는 하나 이상의 식별된 생체분자의 하위집합(또는 복수의 생체분자 또는 이의 생성물의 하위집합)은 복수의 테스트 샘플과 복수의 참조 샘플 사이의 차등 측정량에 기반하여 선택된다. 일부 구현예에서, 서명은 참조 샘플 또는 복수의 참조 샘플에 비해, 더 높은 양을 갖는 식별된 생체 분자, 더 낮은 양을 갖는 식별된 생체분자, 또는 둘 다를 포함한다.
일부 구현예에서, 테스트 샘플 및 참조 샘플은 상이한 건강 또는 질환 상태를 갖는 대상체 또는 대상체 그룹 사이에서 차등적으로 발현되거나 차등량을 갖는 식별된 생체분자의 서명을 식별하기 위해 선택된다. 일부 구현예에서, 참조 샘플은 건강한 대상체 또는 대조군 대상체로부터의 샘플이다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 테스트 샘플은 병을 앓는 대상체로부터의 샘플이고, 참조 샘플은 건강한 대상체 또는 대조군 대상체로부터의 샘플이다. 일부 구현예에서, 테스트 샘플은 질환과 관련된 이전 병태를 갖는 대상체로부터의 샘플이고, 참조 샘플은 건강한 대상체 또는 대조군 대상체로부터의 샘플이다. 본원에서 "대조군 대상체"에 대한 언급은 건강하거나 테스트 샘플을 제공하는 대상체와 무관한 질환 또는 이전 병태를 가진 대상체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 테스트 샘플 및 참조 샘플은 둘 다 병을 앓는 대상체로부터의 샘플이지만, 병을 앓는 대상체는 상이한 상태의 질환을 갖는다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 테스트 샘플은 활성 상태의 질환을 앓는 대상체로부터의 샘플이고, 참조 샘플은 비활성 상태의 질환을 앓는 대상체로부터의 샘플이다. 일부 구현예에서, 비활성 상태는 관해이다. 관해는 질환의 징후 및 증상이 감소하거나 사라지는 것이다. 용어는 또한 이러한 감소가 발생하는 동안의 기간을 지칭하는 데 사용될 수 있다. 관해는 부분 관해 또는 완전 관해로 간주될 수 있다. 일부 구현예에서, 테스트 샘플 및 참조 샘플은 둘 다 병을 앓는 대상체로부터의 샘플이지만, 병을 앓는 대상체는 상이한 단계의 질환을 갖는다. 환자는 병인학, 병태생리학, 및 중증도에 기반하여 특정 질환 단계를 갖는 것으로 분류될 수 있고, 동일한 단계의 질환을 갖는 환자는 유사한 치료가 필요할 수 있고 유사한 예상 결과를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 테스트 샘플은 진행된 단계의 질환을 앓고 있는 대상체로부터의 샘플이고, 참조 샘플은 초기 단계의 질환을 앓고 있는 대상체로부터의 샘플이다. 다른 예시적인 질환 단계는 1기(예를 들어, 합병증이 없는 질환), 2기(예를 들어, 국소 합병증이 있는 질환), 및 3기(예를 들어, 질환은 다중 시스템에 연루되거나 전신 합병증이 있음)를 포함한다.
따라서, 일부 구현예에서 본원에는 본원에 제공된 방법 중 임의의 것을 사용하여 식별된 복수의 식별된 분자, 또는 이의 하위집합을 포함하는 서명이 제공된다. 일부 구현예에서, 본원에는 본원에 제공된 임의의 방법을 사용하여 식별된 식별된 생체분자의 하위집합을 포함하는 서명이 제공된다.
일부 구현예에서, 제공된 방법은 서명의 식별된 생체분자의 전부 또는 하위집합을 추가 분석에 적용하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제공된 방법은 제공되는 데이터의 유형을 분석하도록 각각 구성된 하나 이상의 프로세스에 입력물로서 서명의 식별된 생체분자의 전부 또는 하위집합을 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들면, 식별된 생체분자는 단백질 이름을 포함할 수 있고, 단백질 이름은 제공된 단백질 또는 이의 생성물 중에서 관계 또는 측면을 분석하도록(예를 들어, 단백질-단백질 네트워크 분석을 수행하도록) 구성된 프로세스에 대한 입력물로서 제공될 수 있다.
일부 구현예에서, 제공된 방법은 유전자 농축 분석을 수행하도록 각각 구성된 하나 이상의 프로세스; 경로 분석을 수행하도록 각각 구성된 하나 이상의 프로세스; 및/또는 네트워크 분석을 수행하도록 각각 구성된 하나 이상의 프로세스에 입력물로서 서명의 식별된 생체분자의 전부 또는 하위집합을 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 또한 일부 구현예에서 본원에는 샘플의 생체분자를 분석하는 방법이 제공되며, 방법은 유전자 농축 분석을 수행하도록 각각 구성된 하나 이상의 프로세스; 경로 분석을 수행하도록 각각 구성된 하나 이상의 프로세스; 및/또는 네트워크 분석을 수행하도록 각각 구성된 하나 이상의 프로세스에 입력물로서 본원에 제공된 임의의 서명의 식별된 생체분자를 제공하는 단계를 포함한다. 이러한 프로세스는 입력물로서 제공된 식별된 생체분자 내에서 쌍 또는 그룹에 걸친 패턴 및 관계를 식별하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 서명의 식별된 생체분자는 유전자 농축 분석을 수행하도록 각각 구성된 하나 이상의 프로세스; 경로 분석을 수행하도록 각각 구성된 하나 이상의 프로세스; 및 네트워크 분석을 수행하도록 각각 구성된 하나 이상의 프로세스에 대한 입력물로서 제공된다.
일부 구현예에서, 서명의 하나 이상의 분자 유형의 식별된 생체분자는 입력물로서 제공된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 분자 유형은 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 분자 유형은 코딩 및/또는 비코딩 RNA를 포함하는 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 분자 유형은 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 분자 유형은 대사물을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 분자 유형은 단백질, RNA(코딩 및/또는 비코딩 RNA), 펩티드, 및 대사물의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 분자 유형은 단백질로만 이루어진다.
일부 구현예에서, 서명의 식별된 생체분자는 유전자 농축 분석을 수행하도록 각각 구성된 하나 이상의 프로세스에 대한 입력물로서 제공된다. 유전자 농축 분석(유전자 세트 농축 분석 또는 기능 강화 분석으로도 알려짐)은 제공된 생체분자 세트에 과도하게 제시된 생체분자 그룹(예를 들어, 유전자 또는 단백질 그룹)을 식별하는 데 사용될 수 있는 방법을 포함한다. 이들 방법은 또한 입력물로서 제공된 임의의 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성에 영향을 미치는 활성을 갖는 제공된 생체분자, 예를 들면 전사 인자 또는 키나제의 조절자를 식별하는 데 사용될 수 있다. 이들 방법은 입력물로서 제공된 생체분자 중에서 유의하게 풍부하거나 고갈된 생체분자 그룹을 식별하기 위한 통계적 접근법에 의존한다. 일부 경우에, 생체분자는 동일한 생물학적 경로의 개선에 기반하여 그룹화된다. 이들 방법은 또한 생체분자를 그룹화하기 위해 유전자 온톨로지(GO)에 의존한다. GO는 당업계에 알려져 있고 다양한 생체분자 중에서 관계에 대한 인간이 선별한 표현을 포함한다. GO는 세포 구성요소, 분자 기능, 또는 생물학적 프로세스를 설명하는 것들을 포함한다. 본원에서 특정 GO, 예를 들면 세포 구성요소 GO에 대한 언급은 또한 더 큰 온톨로지 내에 함유된 모든 하위 온톨로지를 지칭한다(예를 들어, 세포 구성요소 GO에 대한 언급은 세포 구성요소 GO 내의 하위 온톨로지에 대한 언급을 포함한다).
일부 구현예에서, 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스는 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나(즉, 입력물로서 제공된 식별된 생체분자의 생성물 중 적어도 하나)와 연관된 하나 이상의 GO를 식별하도록 구성된 프로세스를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스는 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 연관된 하나 이상의 세포 구성요소 GO를 식별하도록 구성된 프로세스; 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 연관된 하나 이상의 분자 경로 GO를 식별하도를 구성된 프로세스; 및/또는 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 연관된 하나 이상의 생물학적 프로세스 GO를 식별하도록 구성된 프로세스를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스는 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 연관된 하나 이상의 세포 구성요소 GO를 식별하도록 구성된 프로세스; 및 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 연관된 하나 이상의 분자 경로 GO를 식별하도록 구성된 프로세스를 포함한다.
임의의 선행 구현예에서, 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스는 입력물로서 제공된 식별된 생체분자, 또는 이의 생성물에 풍부하거나 높게 나타나는 GO를 식별한다. 일부 구현예에서, 식별된 GO는 입력물로서 제공된 복수의 또는 대부분의 식별된 생체분자, 또는 이의 생성물과 연관된다. 일부 구현예에서, 식별된 GO와 연관된 식별된 생체분자, 또는 이의 생성물의 수는 우연히 예상되는 것보다 더 많다(예를 들어, 무작위로 선택된 GO와 평균적으로 연관되는 수보다 더 많다).
일부 구현예에서, 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스는 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나의 하나 이상의 조절자를 식별하도록 구성된 프로세스를 포함한다. 조절자는 전사 인자, 소분자, 작은 조절 RNA(예를 들어, microRNA 또는 siRNA), 키나제, 및 포스파타제를 포함하여, 테스트 샘플에서 임의의 생체분자의 존재비 또는 활성에 영향을 미칠 수 있는 임의의 생체분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스는 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나를 조절하는 하나 이상의 전사 인자를 식별하도록 구성된 프로세스를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스는 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나를 조절하는 하나 이상의 키나제를 식별하도록 구성된 프로세스를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스는 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나를 조절하는 하나 이상의 전사 인자를 식별하도록 구성된 프로세스; 및 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나를 조절하는 하나 이상의 키나제를 식별하도록 구성된 프로세스를 포함한다.
임의의 선행 구현예에서, 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스는 입력물로서 제공된 복수의 또는 대부분의 식별된 생체분자, 또는 이의 생성물을 조절하는 조절자(예를 들어, 전사 인자 또는 키나제)를 식별한다. 일부 구현예에서, 식별된 조절자에 의해 조절되는 식별된 생체분자, 또는 이의 생성물의 수는 우연히 예상되는 것보다 더 많다(예를 들어, 무작위로 선택된 조절자에 의해 평균적으로 조절되는 수보다 더 많다).
유전자 농축 분석을 수행하기 위한 예시적인 방법은 표준 유전자 세트 농축 분석(GSEA) 알고리즘, 단순 농축 분석(SEA) 알고리즘, 및 스펙트럼 유전자 세트 농축(SGSE) 알고리즘을 포함한다. 유전자 농축 분석을 수행하기 위한 예시적인 도구는 핵산 서열 분석 리소스(NASQAR), PlantRegMap, 분자 서명 데이터베이스(MSigDB), Broad Institute, WebGestalt(예를 들면 과-제시 분석(ORA), GSEA, 또는 네트워크 토폴로지-기반 분석(NSA) 알고리즘 사용), Enrichr, GeneSCF, DAVID, Metascape, AmiGO2, 주석 도구의 게놈 영역 강화(GREAT), 기능 강화 분석(FunRich), FuncAssociate, InterMine, ToppGene, 유전자 발현에 대한 정량적 세트 분석(QuSAGE), Blast2GO, 및 g:Profiler)을 포함하거나 이에 의해 제공된다. 유전자 농축 분석을 수행하기 위한 예시적인 도구는 또한 각각 전사 인자 농축 분석(TFEA) 및 키나제 농축 분석(KEA)을 포함하여, 입력물로서 제공된 단백질을 조절하는 전사 인자 또는 키나제를 식별할 수 있는 것들을 포함한다.
일부 구현예에서, 서명의 식별된 생체분자는 경로 분석을 수행하도록 각각 구성된 하나 이상의 프로세스에 대한 입력물로서 제공된다. 경로 분석은 생체분자의 목록이 입력물로서 주어지면, 제공된 생체분자 중에서 제시되거나 풍부한 임의의 생물학적 경로를 식별하는 데 사용될 수 있는 방법을 포함한다. 생물학적 경로는 대사 경로 및 신호전달 경로를 포함한다. 이들 방법은 GO 뿐만 아니라 인간이 선별한 경로 수집 및 상호작용 네트워크, 예를 들면 리소스 KEGG, WikiPathways, Reactome, Pathway Studio, 및 독창성 경로 분석으로부터의 것들에 의존할 수 있다. 이들 경로 수집 및 상호작용 네트워크는 공개된 자료로부터 편집될 수 있고, 특이적 유기체와 연관된 유전자, 단백질, 대사 경로, 분자 상호작용, 및 생화학적 반응에 대한 정보를 포함할 수 있다. 이들은 또한 어떻게 이러한 다양한 생체분자 및 경로가 세포 구조 또는 더 큰 반응 경로에서 조직화되는지 맵핑할 수 있다. 경로 분석은 또한 경로-기반 모델링 방법을 포함한다. 경로-기반 모델 유형 및 이러한 모델을 개발하는 데 이용가능한 도구는 편미분 방정식/Boolean 모델(이용가능한 도구는 CellNetAnalyzer를 포함함); 네트워크 흐름 모델(이용가능한 도구는 NetPhorest 및 NetworKIN을 포함함); 전사 조절 네트워크-기반 재구성 방법(이용가능한 도구는 ARACNe를 포함함); 및 확률론적 그래프 모델(PGM, 이용가능한 도구는 PARADIGM을 포함함)을 포함한다.
일부 구현예에서, 경로 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스는 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 연관된 하나 이상의 경로, 예를 들어, 분자, 신호전달, 또는 대사 경로를 식별하도록 구성된 프로세스를 포함한다. 일부 구현예에서, 경로 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스는 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 연관된 하나 이상의 분자 경로를 식별하도록 구성된 프로세스; 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 연관된 하나 이상의 신호전달 경로를 식별하도록 구성된 프로세스; 및/또는 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 연관된 하나 이상의 대사 경로를 식별하도록 구성된 프로세스를 포함한다. 일부 구현예에서, 경로 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스는 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 연관된 하나 이상의 신호전달 경로를 식별하도록 구성된 프로세스를 포함한다.
임의의 선행 구현예에서, 경로 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스는 입력물로서 제공된 식별된 생체분자, 또는 이의 생성물에 풍부하거나 또는 고도로 제시되는 하나 이상의 경로를 식별한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 식별된 경로(예를 들어, 신호전달 경로) 각각은 입력물로서 제공된 복수의 또는 대부분의 식별된 생체분자, 또는 이의 생성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 식별된 경로 각각에 포함된 식별된 생체분자 또는 이의 생성물의 수는 우연히 예상되는 것보다 더 많다(예를 들어, 평균적으로 무작위로 선택된 경로에 포함되는 수보다 더 많다).
경로 분석을 수행하기 위한 예시적인 방법은 과-제시 분석(ORA); 기능 분류 점수화(FCS); 신호전달 경로 영향 분석(SPIA), EnrichNet, 유전자 그래프 농축 분석(GGEA), 및 TopoGSA를 포함하는 경로 토폴로지 분석(PTA); 및 네트워크 강화 분석(NEA)을 포함한다. 경로 분석을 수행하기 위한 예시적인 도구는 STRING, Cytoscape, Ingenuity, Pathways Studio, Pathways Studio Viewer, PTA: PathwayGuide, MetaCore, Wiki Pathways, CellNetAnalyzer, NetPhorest/ NetworKIN, ARACNe, 및 Paradigm을 통해 제공된 것들을 포함한다.
일부 구현예에서, 서명의 식별된 생체분자는 네트워크 분석을 수행하도록 각각 구성된 하나 이상의 프로세스에 대한 입력물로서 제공된다. 네트워크 분석은 생체분자의 목록이 입력물로서 주어지면, 입력물로서 제공된 생체분자 중에서 관계를 식별하는 데 사용될 수 있는 방법을 포함한다. 관계는 물리적 또는 기능적 상호작용을 포함한다. 이들 네트워크는 예를 들면, 예측된 공발현, 공국소화, 유전적 상호작용, 물리적 상호작용, 및 예측되고 공유된 단백질 도메인 데이터에 기반하여 구성될 수 있다. 노드(node) 또는 꼭짓점(vertice)은 입력물로서 제공된 식별된 생체분자를 나타내는 데 사용될 수 있고, 2 개의 노드(또는 노드 자체)를 각각 연결하는 엣지(edge)는 연결된 노드 사이의 예측되거나 식별된 관계를 나타내는 데 사용될 수 있다. 네트워크 유형은 전사 조절 네트워크, 바이러스-숙주 네트워크, 대사 네트워크, 단백질-단백질 상호작용 네트워크, 질환 네트워크, 및 약물 효과 네트워크(예를 들어, 발현 또는 활성이 특정 약물에 의해 영향을 받는 생체분자의 네트워크)를 포함한다. 네트워크는 자동적으로 또는 인간 선별을 통해 구축될 수 있는 상호작용 데이터베이스를 사용하는 생체분자의 제공된 목록에서 식별될 수 있다. 인간이 선별한 상호작용 데이터베이스는 BioGRID 및 IntAct를 포함한다. 네트워크 분석은 밀접하게 연결된 그룹, 예를 들면 서로 연결하는 많은 수의 엣지가 있는 노드 그룹과 유사하거나 이의 부분인 노드 클러스터(즉, 식별된 생체분자)를 검출하는 것을 포함하여, 제공된 식별된 생체분자의 상호연계성(즉, 사이의 관계)을 분석하는 데 사용될 수 있다. 네트워크 분석은 또한 네트워크의 허브를 식별하는 데 사용될 수 있다. 네트워크의 허브는 네트워크에서 다른 노드에 연결하는 엣지의 평균 수보다 높거나 더 높은 노드이다. 생물학적 네트워크에서, 이러한 허브는 연관된 경로의 중앙 조절자일 수 있다. 따라서, 일부 측면에서, 이러한 허브를 표적하는 약물의 식별은 질환에 의해 영향을 받았던 경로 또는 프로세스에 광범위하게 영향을 미칠 수 있다.
일부 구현예에서, 네트워크 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스는 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 네트워크를 식별하도록 구성된 프로세스를 포함한다. 일부 구현예에서, 네트워크 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스는 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 네트워크의 하나 이상의 허브를 식별하도록 구성된 프로세스를 포함한다.
일부 구현예에서, 네트워크 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스는 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 분자 경로를 식별하도록 구성된 프로세스; 및/또는 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 신호전달 경로를 식별하도록 구성된 프로세스를 포함한다. 일부 구현예에서, 네트워크 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스는 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 분자 경로를 식별하도록 구성된 프로세스; 및 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 신호전달 경로를 식별하도록 구성된 프로세스를 포함한다.
일부 구현예에서, 네트워크 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스는 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 단백질-단백질 상호작용 네트워크를 식별하도록 구성된 프로세스를 포함한다. 일부 구현예에서, 프로세스는 하나 이상의 식별된 단백질-단백질 상호작용 네트워크와 연관된 하나 이상의 허브를 식별하도록 추가로 구성된다.
일부 구현예에서, 네트워크 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스는 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나를 각각 표적하는 하나 이상의 약물을 식별하도록 구성된 프로세스를 포함한다. 일부 구현예에서, 네트워크 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스는 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나를 각각 표적하는 하나 이상의 약물을 식별하도록 구성된 2 개의 프로세스를 포함한다. 일부 구현예에서, 프로세스 또는 2 개의 프로세스 각각은 입력물로서 제공된 서명의 복수의 식별된 생체분자를 포함하는 네트워크의 적어도 하나의 허브를 각각 표적하는 하나 이상의 약물을 식별하도록 구성된다. 일부 구현예에서, 프로세스 또는 2 개의 프로세스 각각은 (1) 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나와 연관된 하나 이상의 네트워크를 식별하고, (2) 하나 이상의 식별된 네트워크의 하나 이상의 허브를 식별하고, (3) 식별된 허브 중 적어도 하나를 각각 표적하는 하나 이상의 약물을 식별하도록 구성된다. 임의의 선행 구현예에서, 네트워크 또는 하나 이상의 네트워크는 단백질-단백질 상호작용 네트워크이다.
임의의 선행 구현예에서, 프로세스는 입력물로서 제공된 서명의 복수의 식별된 생체분자, 또는 이의 복수의 생성물과 각각 연관된 하나 이상의 네트워크 또는 이의 허브를 식별하도록 구성된다. 일부 구현예에서, 식별된 하나 이상의 네트워크와 연관된 식별된 생체분자 또는 이의 생성물의 수는 우연히 예상되는 것보다 더 많다.
예시적인 네트워크 클러스터링 알고리즘은 Girvin-Newman 방법, Markov Cluster 알고리즘, HotNet 알고리즘, HyperModules Cytoscape App, 및 Reactome FI Network 및 ReactomeFIViz를 포함하거나 이를 통해 이용가능하다. 네트워크 분석을 수행하기 위한 예시적인 도구는 GeneMANIA(예를 들면, 단백질-단백질 상호작용 네트워크를 식별하기 위해 사용될 수 있음), HotNet, HyperModules, 및 Reactome Cytoscape FI App를 포함할 뿐만 아니라 L1000 불꽃 디스플레이(L1000 FWD) 및 iLINCS 화학적 혼란(piNET) 알고리즘을 포함하며, 둘 다 입력물로서 제공된 유전자 또는 단백질을 표적하는 약물을 식별하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 서명의 식별된 생체분자는 유전자 농축 분석을 수행하도록 각각 구성된 하나 이상의 프로세스(예를 들어, 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 상기 기재된 임의의 프로세스); 경로 분석을 수행하도록 각각 구성된 하나 이상의 프로세스(예를 들어, 경로 분석을 수행하도록 구성된 상기 기재된 임의의 프로세스); 및 네트워크 분석을 수행하도록 각각 구성된 하나 이상의 프로세스(예를 들어, 네트워크 분석을 수행하도록 구성된 상기 기재된 임의의 프로세스)에 대한 입렵으로서 제공된다. 일부 구현예에서, 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스는 입력물로서 제공된 식별된 구성요소 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 세포 구성요소 유전자 온톨로지를 식별하도록 구성된 프로세스를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스는 입력물로서 제공된 식별된 구성요소 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 분자 경로 유전자 온톨로지를 식별하도록 구성된 프로세스를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스는 입력물로서 제공된 식별된 구성요소 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나를 조절하는 하나 이상의 전사 인자를 식별하도록 구성된 프로세스를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스는 입력물로서 제공된 식별된 구성요소 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나를 조절하는 하나 이상의 키나제를 식별하도록 구성된 프로세스를 포함한다. 일부 구현예에서, 경로 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스는 입력물로서 제공된 식별된 구성요소 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 신호전달 경로를 식별하도록 구성된 프로세스를 포함한다. 일부 구현예에서, 네트워크 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스는 입력물로서 제공된 식별된 구성요소 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 네트워크를 식별하도록 구성된 프로세스를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 네트워크는 단백질-단백질 상호작용 네트워크이다. 일부 구현예에서, 네트워크 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스는 입력물로서 제공된 식별된 구성요소 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나를 각각 표적하는 하나 이상의 약물을 식별하도록 구성된 하나 이상의 프로세스를 포함한다. 일부 구현예에서, 입력물로서 제공된 식별된 구성요소 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나를 각각 표적하는 하나 이상의 약물을 식별하도록 구성된 하나 이상의 프로세스는 입력물로서 제공된 복수의 식별된 구성요소, 또는 이의 복수의 생성물을 포함하는 단백질-단백질 상호작용 네트워크의 허브를 각각 표적하는 하나 이상의 약물을 식별하도록 구성된다.
또한 일부 구현예에서 본원에는 식별된 생체분자의 서명을 분석하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 유전자 농축 분석, 경로 분석, 또는 네트워크 분석을 수행하도록 각각 구성된 복수의 프로세스 각각에 복수의 식별된 생체분자를 제공하는 단계를 포함하되, 상기 제공 단계는 임의의 순서로 수행되고; 복수의 식별된 생체분자는 단백질 세트, 전사체 세트, 펩티드 세트, 및/또는 대사물 세트를 포함하고; 복수의 프로세스는 입력물로서 제공된 복수의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 유전자 온톨로지를 식별하기 위해 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 프로세스; 입력물로서 제공된 복수의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 신호전달 경로를 식별하기 위해 경로 분석을 수행하도록 구성된 프로세스; 입력물로서 제공된 복수의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나를 조절하는 하나 이상의 전사 인자를 식별하기 위해 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 프로세스; 입력물로서 제공된 복수의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나의 유전자 산물을 조절하는 하나 이상의 키나제를 식별하기 위해 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 프로세스; 입력물로서 제공된 복수의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 네트워크를 식별하기 위해 네트워크 분석을 수행하도록 구성된 프로세스; 및 입력물로서 제공된 복수의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나를 각각 표적하는 하나 이상의 약물을 식별하기 위해 네트워크 분석을 수행하도록 구성된 2 개의 프로세스 각각을 포함한다.
일부 구현예에서, 복수의 식별된 생체분자는 단백질 세트를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 식별된 생체분자는 단백질만 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 네트워크는 단백질-단백질 상호작용 네트워크이다. 일부 구현예에서, 입력물로서 제공된 복수의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나를 각각 표적하는 하나 이상의 약물을 식별하기 위해 네트워크 분석을 수행하도록 구성된 2 개의 프로세스 각각은 입력물로서 제공된 복수의 식별된 생체분자, 또는 이의 복수의 생성물을 포함하는 단백질-단백질 상호작용 네트워크의 허브를 각각 표적하는 하나 이상의 약물을 식별하도록 구성된다.
또한 일부 구현예에서 본원에는 단백질 서명을 분석하는 방법이 제공되며, 방법은 유전자 농축 분석, 경로 분석, 또는 네트워크 분석를 수해하도록 각각 구성된 복수의 프로세스 각각에 복수의 단백질을 제공하는 단계를 포함하되, 상기 제공 단계는 임의의 순서로 수행되고, 복수의 프로세스는 입력물로서 제공된 복수의 단백질 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 유전자 온톨로지를 식별하기 위해 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 프로세스; 입력물로서 제공된 복수의 단백질 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 신호전달 경로를 식별하기 위해 경로 분석을 수행하도록 구성된 프로세스; 입력물로서 제공된 복수의 단백질 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나를 조절하는 하나 이상의 전사 인자를 식별하기 위해 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 프로세스; 입력물로서 제공된 복수의 단백질 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나의 유전자 산물을 조절하는 하나 이상의 키나제를 식별하기 위해 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 프로세스; 입력물로서 제공된 복수의 단백질 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 네트워크를 식별하기 위해 네트워크 분석을 수행하도록 구성된 프로세스; 및 입력물로서 제공된 복수의 단백질 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나를 각각 표적하는 하나 이상의 약물을 식별하기 위해 네트워크 분석을 수행하도록 구성된 2 개의 프로세스 각각을 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 네트워크는 단백질-단백질 상호작용 네트워크이다. 일부 구현예에서, 입력물로서 제공된 복수의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나를 각각 표적하는 하나 이상의 약물을 식별하기 위해 네트워크 분석을 수행하도록 구성된 2 개의 프로세스 각각은 입력물로서 제공된 복수의 식별된 생체분자, 또는 이의 복수의 생성물을 포함하는 단백질-단백질 상호작용 네트워크의 허브를 각각 표적하는 하나 이상의 약물을 식별하도록 구성된다.
VIII. 예시적인 구현예
본원에는 본 출원의 주제에 대한 구현예가 제공된다.
구현예 1. 질량 분광법 분석을 위한 테스트 샘플을 처리하는 방법으로서, (a) SEC 미세유체 장치를 사용하여 테스트 샘플을 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 기술에 적용하되, 상기 테스트 샘플은 하나 이상의 생체분자 및 카오트로픽제를 포함하고, 상기 SEC 미세유체 장치는 복수의 상호연결된 채널을 포함하는 것인, 단계; (b) SEC 미세유체 장치로부터 용출된 복수의 분획을 수집하는 단계; (c) SEC 미세유체 장치로부터의 복수의 분획 중 하나 이상을 단백질분해 기술에 적용하는 단계; 및 (d) 단계 (b) 및 (c) 중 하나 또는 둘 다로부터의 하나 이상의 분획을 질량 분광계에 도입하기 위한 하나 이상의 분획 각각의 구성요소를 제조하기 위한 조건 하에 RPLC 미세유체 장치를 사용하여 역상 액체 크로마토그래피(RPLC) 기술에 개별적으로 적용하되, 상기 RPLC 미세유체 장치는 역상 매질을 포함하는 복수의 상호연결된 채널을 포함하고, 상기 RPLC 미세유체 장치는 전기분무 이온화 소스에 결합되는 것인 단계를 포함하는, 방법.
구현예 2. 구현예 1에 있어서, 상기 테스트 샘플이 생물학적 샘플인, 방법.
구현예 3. 구현예 1 또는 2에 있어서, 상기 테스트 샘플이 개체로부터 유래되는 것인, 방법.
구현예 4. 구현예 1-3 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 테스트 샘플이 약 5 M 내지 약 8 M의 카오트로픽제의 농도를 갖는 것인, 방법.
구현예 5. 구현예 1-4 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 카오트로픽제가 구아니딘 또는 이의 염, 구아니디늄 또는 이의 염, 칼륨 또는 이의 염, 리튬 또는 이의 염, 마그네슘 또는 이의 염, 또는 나트륨 또는 이의 염을 포함하는 것인, 방법.
구현예 6. 구현예 1-3 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 카오트로픽제가 구아니딘 하이드로클로라이드 또는 구아니디늄 클로라이드인, 방법.
구현예 7. 구현예 1-6 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 테스트 샘플 내 카오트로픽제가 액체 고정액으로부터 유래되는 것인, 방법.
구현예 8. 구현예 1-7 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 테스트 샘플이 약 5% 내지 약 40%의 점도 개질제의 농도를 갖는 것인, 방법.
구현예 9. 구현예 8에 있어서, 상기 점도 개질제가 글리세롤인, 방법.
구현예 10. 구현예 8 또는 9에 있어서, 상기 테스트 샘플이 적어도 약 6 M 구아니딘 및 약 10% 내지 약 30% 글리세롤을 포함하는 것인, 방법.
구현예 11. 구현예 1-10 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치를 사용하여 SEC 기술에 적용된 테스트 샘플이 약 1 μL 내지 약 200 μL의 부피를 갖는 것인, 방법.
구현예 12. 구현예 1-11 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 SEC 기술의 이동상 카오트로픽제의 농도 범위가 테스트 샘플의 카오트로픽제의 미리 결정된 농도의 약 +/- 40% 이내인, 방법.
구현예 13. 구현예 1-12 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 SEC 기술이 테스트 샘플 내 카오트로픽제 범위 내에서 이동상 카오트로픽제의 농도를 갖는 SEC 이동상의 사용을 포함하는 것인, 방법.
구현예 14. 구현예 1-13 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 SEC 기술의 이동상 카오트로픽제가 테스트 샘플의 카오트로픽제와 동일한 것인, 방법.
구현예 15. 구현예 1-13 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 SEC 기술의 이동상 카오트로픽제가 테스트 샘플의 카오트로픽제와 상이한 것인, 방법.
구현예 16. 구현예 1-15 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 SEC 이동상이 약 4 M 내지 약 8 M의 농도에서 이동상 카오트로픽제를 포함하는 것인, 방법.
구현예 17. 구현예 1-16 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 SEC 기술의 이동상 카오트로픽제가 구아니딘 또는 이의 염, 구아니디늄 또는 이의 염, 리튬 또는 이의 염, 마그네슘 또는 이의 염, 또는 나트륨 또는 이의 염을 포함하는 것인, 방법.
구현예 18. 구현예 1-17 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 SEC 기술의 이동상 카오트로픽제가 구아니딘 하이드로클로라이드, 구아니디늄 클로라이드, 구아니디늄 티오시난트, 리튬 퍼클로레이트, 리튬 아세테이트, 마그네슘 클로라이드, 칼륨 아세테이트, 및 나트륨 요오다이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
구현예 19. 구현예 1-18 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 SEC 이동상이 이동상 점도 개질제를 포함하는 것인, 방법.
구현예 20. 구현예 20에 있어서, 상기 SEC 기술의 이동상 점도 개질제가 약 5% 내지 약 40%의 농도를 갖는 것인, 방법.
구현예 21. 구현예 19 또는 20에 있어서, 상기 점도 개질제가 글리세롤인, 방법.
구현예 22. 구현예 19-21 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 SEC 기술의 이동상 점도 개질제가 액체 고정액의 점도 개질제와 동일한 것인, 방법.
구현예 23. 구현예 19-21 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 SEC 기술의 이동상 점도 개질제가 액체 고정액의 점도 개질제와 상이한 것인, 방법.
구현예 24. 구현예 19-21 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 테스트 샘플이 적어도 약 6 M 구아니딘 및 약 10% 내지 약 30% 글리세롤을 포함하는 것인, 방법.
구현예 25. 구현예 1-24 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 SEC 기술이 등용매 SEC 기술인, 방법.
구현예 26. 구현예 1-25 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 SEC 기술이 약 1 μL/ 분 내지 약 5 μL/ 분의 이동상 유속의 사용을 포함하는 것인, 방법.
구현예 27. 구현예 1-26 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 SEC 기술이 고온에서 수행되는 것인, 방법.
구현예 28. 구현예 1-27 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 SEC 기술이 약 45℃ 내지 약 60℃의 온도에서 수행되는 것인, 방법.
구현예 29. 구현예 27 또는 28에 있어서, 상기 SEC 기술이 실질적으로 일관된 온도에서 수행되는 것인, 방법.
구현예 30. 구현예 1-29 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치가 SEC 매질을 포함하는 것인, 방법.
구현예 31. 구현예 30에 있어서, 상기 SEC 매질이 약 10 nm 내지 약 500 nm의 평균 기공 크기를 갖는 물질인, 방법.
구현예 32. 구현예 30 또는 31에 있어서, 상기 SEC 매질이 복수의 상호연결된 채널 각각의 내부 표면인, 방법.
구현예 33. 구현예 1-32 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널의 내부 표면 물질이 약 0.5 μm 내지 약 2 μm의 두께를 갖는 것인, 방법.
구현예 34. 구현예 1-33 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널이 개방 관형 형식으로 구성되는 것인, 방법.
구현예 35. 구현예 1-34 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널이 8 개 이상의 상호연결된 채널을 포함하는 것인, 방법.
구현예 36. 구현예 35에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널이 32 개의 상호연결된 채널을 포함하는 것인, 방법.
구현예 37. 구현예 35에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널이 64 개의 상호연결된 채널을 포함하는 것인, 방법.
구현예 38. 구현예 1-37 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각이 연결 채널의 상류 네트워크를 통해 SEC 미세유체 장치의 입력 포트와 유체 연통하는 것인, 방법.
구현예 39. 구현예 38에 있어서, 상기 연결 채널의 상류 네트워크, 또는 이의 부분이 복수의 상호연결된 채널 각각의 근위 영역에 연결되는 것인, 방법.
구현예 40. 구현예 38 또는 39에 있어서, 상기 연결 채널의 상류 네트워크가 유체 유동을 SEC 미세유체 장치의 입력 포트로부터 복수의 상호연결된 채널 각각으로 분할하도록 구성된 일련의 발산 채널을 포함하는 것인, 방법.
구현예 41. 구현예 1-40 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각이 연결 채널의 하류 네트워크를 통해 SEC 미세유체 장치의 출력 포트와 유체 연통하는 것인, 방법.
구현예 42. 구현예 41에 있어서, 상기 연결 채널의 하류 네트워크, 또는 이의 부분이 복수의 상호연결된 채널 각각의 원위 영역에 연결되는 것인, 방법.
구현예 43. 구현예 41 또는 42에 있어서, 상기 연결 채널의 하류 네트워크가 유체 유동을 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널로부터 출력 포트에 조합하도록 구성된 일련의 수렴 채널을 포함하는 것인, 방법.
구현예 44. 구현예 41-43 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널이 연결 채널의 상류 네트워크 또는 연결 채널의 하류 네트워크를 통해서만 연결되는 것인, 방법.
구현예 45. 구현예 1-44 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각이 약 2 cm 내지 약 50 cm의 길이를 갖는 것인, 방법.
구현예 46. 구현예 1-45 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각이 약 1 μm 내지 약 15 μm의 폭을 갖는 것인, 방법.
구현예 47. 구현예 1-46 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각이 약 1 μm 내지 약 15 μm의 깊이를 갖는 것인, 방법.
구현예 48. 구현예 1-47 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널이 기둥 배열을 통해 형성되는 것인, 방법.
구현예 49. 구현예 48에 있어서, 상기 기둥 배열이 무정형 기둥 배열인, 방법.
구현예 50. 구현예 48에 있어서, 상기 기둥 배열이 비-무정형 기둥 배열인, 방법.
구현예 51. 구현예 32-50 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 기둥 배열이 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각의 내부 표면을 형성하는 것인, 방법.
구현예 52. 구현예 1-51 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치가 석영 기판을 포함하는 것인, 방법.
구현예 53. 구현예 1-42 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치가 복수의 상호연결된 채널을 형성하는 모놀리식 기판을 포함하는 것인, 방법.
구현예 54. 구현예 1-53 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치가 석영 모놀리식 기판을 포함하는 것인, 방법.
구현예 55. 구현예 1-44 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치가 3차원(3D) 인쇄 기판을 포함하는 것인, 방법.
구현예 56. 구현예 1-55 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치로부터 용출된 복수의 분획을 수집하는 것이 분획 수집기를 사용하여 수행되는 것인, 방법.
구현예 57. 구현예 1-56 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 복수의 분획 각각이 시간에 기반하여 SEC 미세유체 장치로부터 수집되는 것인, 방법.
구현예 58. 구현예 57에 있어서, 상기 복수의 분획 각각이 약 30 초 내지 약 5 분의 기간 동안 SEC 미세유체 장치로부터 수집되는 것인, 방법.
구현예 59. 구현예 57 또는 58에 있어서, 상기 복수의 분획 각각이 균일한 시간 동안 SEC 미세유체 장치로부터 수집되는 것인, 방법.
구현예 60. 구현예 47 또는 58에 있어서, 상기 복수의 분획 중 일부가 복수의 분획 중 또 다른 분획과 상이한 시간 동안 SEC 미세유체 장치로부터 수집되는 것인, 방법.
구현예 61. 구현예 1-56 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 복수의 분획 각각이 SEC 미세유체 장치로부터의 용출액의 부피에 기반하여 SEC 미세유체 장치로부터 수집되는 것인, 방법.
구현예 62. 구현예 61에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치로부터 수집된 복수의 분획 각각이 약 1 μL 내지 약 20 μL의 부피를 갖는 것인, 방법.
구현예 63. 구현예 61 또는 62에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치로부터 수집된 복수의 분획 각각이 균일한 부피를 갖는 것인, 방법.
구현예 64. 구현예 62 또는 63에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치로부터 수집된 복수의 분획 중 일부가 복수의 분획 중 또 다른 분획과 상이한 부피를 갖는 것인, 방법.
구현예 65. 구현예 1-64 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 복수의 분획이 약 5 내지 약 50 개의 분획인, 방법.
구현예 66. 구현예 65에 있어서, 상기 복수의 분획이 약 12 내지 약 24 개의 분획인, 방법.
구현예 67. 구현예 1-66 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 단백질분해 기술이 효소-기반 분해 기술을 포함하는 것인, 방법.
구현예 68. 구현예 67에 있어서, 상기 효소-기반 분해 기술이 트립신, 키모트립신, 펩신, LysC, LysN, AspN, GluC 및 ArgC, 또는 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 효소의 사용을 포함하는 것인, 방법.
구현예 69. 구현예 67 또는 68에 있어서, 상기 효소-기반 분해 기술이 SEC 미세유체 장치로부터 용출된 분획을 희석하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
구현예 70. 구현예 69에 있어서, 상기 희석 단계가 SEC 미세유체 장치로부터 용출된 분획을 물과 혼합하여 카오트로픽제의 농도에 도달하는 것을 포함하는 것인, 방법.
구현예 71. 구현예 70에 있어서, 상기 효소적 분해를 위한 카오트로픽제 농도의 최종 농도가 약 0.5 M인, 방법.
구현예 72. 구현예 67-71 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 효소-기반 분해 기술이 완충액 교환 단계를 포함하지 않는 것인, 방법.
구현예 73. 구현예 67-72 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 효소-기반 분해 기술이 알킬화 단계를 포함하지 않는 것인, 방법.
구현예 74. 구현예 67-72 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 효소-기반 분해 기술이 환원 단계를 포함하지 않는 것인, 방법.
구현예 75. 구현예 1-66 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 단백질분해 기술이 비-효소-기반 접근법을 포함하는 것인, 방법.
구현예 76. 구현예 1-75 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 방법이 SEC 미세유체 장치로부터의 복수의 분획 중 하나 이상 및/또는 단백질분해 기술에 적용된 복수의 분획 중 하나 이상을 정량적 표지화 기술에 적용하는 단계를 추가로 포함하되, 상기 정량적 표지화 기술은 RPLC 미세유체 장치를 사용하여 역상 액체 크로마토그래피(RPLC) 기술 전에 수행되는 것인, 방법.
구현예 77. 구현예 76에 있어서, 상기 정량적 표지화 기술이 등압 질량 태그의 사용을 포함하는 것인, 방법.
구현예 78. 구현예 76 또는 77에 있어서, 상기 정량적 표지화 기술이 탠덤 질량 태그(TMT)의 사용을 포함하는 것인, 방법.
구현예 79. 구현예 76-78 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 정량적 표지화 기술이 탈염 단계를 포함하는 것인, 방법.
구현예 80. 구현예 1-79 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 방법이 내부 표준을 SEC 미세유체 장치로부터의 복수의 분획 중 하나 이상 및/또는 단백질분해 기술에 적용된 복수의 분획 중 하나 이상과 혼합하는 단계를 추가로 포함하되, 상기 내부 표준의 혼합은 RPLC 미세유체 장치를 사용하여 역상 액체 크로마토그래피(RPLC) 기술 전에 수행되는 것인, 방법.
구현예 81. 구현예 79에 있어서, 상기 내부 표준이 동위원소 표지된 펩티드인, 방법.
구현예 82. 구현예 1-81 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 RPLC 기술에 적용된 하나 이상의 분획이 (i) SEC 미세유체 장치로부터 수득된 0 개 이상의 분획; 및 (ii) 단백질분해 기술에 적용된 복수의 분획 중 하나 이상으로부터 수득된 하나 이상의 분획, 또는 이의 부분을 포함하는 것인, 방법.
구현예 83. 구현예 1-82 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 RPLC 기술에 적용된 하나 이상의 분획 각각이 수용액과 혼합된 각각의 기원 분획을 포함하는 것인, 방법.
구현예 84. 구현예 1-83 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 RPLC 기술에 적용된 분획이 약 1 μL 내지 약 50 μL의 부피를 갖는 것인, 방법.
구현예 85. 구현예 1-84 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 RPLC 기술이 RPLC 이동상의 사용을 포함하는 것인, 방법.
구현예 86. 구현예 85에 있어서, 상기 RPLC 기술이 약 0.05 μL/ 분 내지 약 2 μL/ 분의 RPLC 이동상의 이동상 유속을 포함하는 것인, 방법.
구현예 87. 구현예 1-86 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 RPLC 기술이 구배 RPLC 기술인, 방법.
구현예 88. 구현예 1-87 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 RPLC 기술이 고온에서 수행되는 것인, 방법.
구현예 89. 구현예 1-37 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 RPLC 기술이 약 30℃ 내지 약 100℃의 온도에서 수행되는 것인, 방법.
구현예 90. 구현예 88 또는 89에 있어서, 상기 RPLC 기술이 실질적으로 일관된 온도에서 수행되는 것인, 방법.
구현예 91. 구현예 1-90 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 역상 매질이 다음 알킬 모이어티: C2, C4, C8, 및 C18 중 2 개 이상을 포함하는 RPLC 모이어티 혼합물을 포함하는 것인, 방법
구현예 92. 구현예 91에 있어서, 상기 RPLC 모이어티 혼합물이 다음 알킬 모이어티: C2, C4, C8, 및 C18 중 3 개 이상을 포함하는 것인, 방법.
구현예 93. 구현예 91에 있어서, 상기 RPLC 모이어티 혼합물이 다음 알킬 모이어티: C2, C4, C8, 및 C18을 포함하는 것인, 방법.
구현예 94. 구현예 91-93 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 RPLC 모이어티 혼합물의 알킬 모이어티가 등몰량으로 존재하는 것인, 방법.
구현예 95. 구현예 91-94 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 RPLC 모이어티 혼합물의 알킬 모이어티가 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각의 표면에 공유적으로 결합되는 것인, 방법.
구현예 96. 구현예 95에 있어서, 상기 복수의 상호연결된 채널 각각의 표면이 실리카(SiO2)를 포함하는 것인, 방법.
구현예 97. 구현예 1-96 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널이 8 개 이상의 상호연결된 채널을 포함하는 것인, 방법.
구현예 98. 구현예 97에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널이 32 개의 상호연결된 채널을 포함하는 것인, 방법.
구현예 99. 구현예 97에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널이 64 개의 상호연결된 채널을 포함하는 것인, 방법.
구현예 100. 구현예 1-85 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각이 연결 채널의 상류 네트워크를 통해 RPLC 미세유체 장치의 입력 포트와 유체 연통하는 것인, 방법.
구현예 101. 구현예 100에 있어서, 상기 연결 채널의 상류 네트워크, 또는 이의 부분이 복수의 상호연결된 채널 각각의 근위 영역에 연결되는 것인, 방법.
구현예 102. 구현예 100 또는 101에 있어서, 상기 연결 채널의 상류 네트워크가 유체 유동을 RPLC 미세유체 장치의 입력 포트로부터 복수의 상호연결된 채널 각각으로 분할하도록 구성된 일련의 발산 채널을 포함하는 것인, 방법.
구현예 103. 구현예 1-102 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각이 연결 채널의 하류 네트워크를 통해 RPLC 미세유체 장치의 출력 포트와 유체 연통하는 것인, 방법.
구현예 104. 구현예 103에 있어서, 상기 연결 채널의 하류 네트워크, 또는 이의 부분이 복수의 상호연결된 채널 각각의 원위 영역에 연결되는 것인, 방법.
구현예 105. 구현예 103 및 104에 있어서, 상기 연결 채널의 하류 네트워크가 유체 유동을 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널로부터 출력 포트로 조합하도록 구성된 일련의 수렴 채널을 포함하는 것인, 방법.
구현예 106. 구현예 103-105 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널이 연결 채널의 상류 네트워크 또는 연결 채널의 하류 네트워크를 통해서만 연결되는 것인, 방법.
구현예 107. 구현예 1-106 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각이 약 2 cm 내지 약 50 cm의 길이를 갖는 것인, 방법.
구현예 108. 구현예 1-107 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각이 약 1 μm 내지 약 15 μm의 폭을 갖는 것인, 방법.
구현예 109. 구현예 1-108 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각이 약 1 μm 내지 약 15 μm의 깊이를 갖는 것인, 방법.
구현예 110. 구현예 1-109 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널이 기둥 배열을 통해 형성되는 것인, 방법.
구현예 111. 구현예 110에 있어서, 상기 기둥 배열이 무정형 기둥 배열인, 방법.
구현예 112. 구현예 110에 있어서, 상기 기둥 배열이 비-무정형 기둥 배열인, 방법.
구현예 113. 구현예 110-112 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 기둥 배열이 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각의 내부 표면을 포함하여 형성되는 것인, 방법.
구현예 114. 구현예 1-113 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치가 온라인 전환 특징부를 포함하는 것인, 방법.
구현예 115. 구현예 114에 있어서, 상기 온라인 전환 특징부가 밸브 및/또는 채널인, 방법.
구현예 116. 구현예 114 또는 115에 있어서, 상기 온라인 전환 특징부가 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널과 전기분무 이온화 장치 사이에 위치하는 것인, 방법.
구현예 117. 구현예 1-116 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치가 석영 기판을 포함하는 것인, 방법.
구현예 118. 구현예 1-117 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치가 복수의 상호연결된 채널을 형성하는 모놀리식 기판을 포함하는 것인, 방법.
구현예 119. 구현예 1-118 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치가 석영 모놀리식 기판을 포함하는 것인, 방법.
구현예 120. 구현예 1-119 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치가 3차원(3D) 인쇄 기판을 포함하는 것인, 방법.
구현예 121. 구현예 1-120 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치가 개방 관형 형식으로 구성되는 것인, 방법.
구현예 122. 구현예 1-121 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치가 온라인 탈염을 위해 구성되는 것인, 방법.
구현예 123. 구현예 1-122 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 전기분무 이온화 소스가 나노-전기분무 이온화 소스인, 방법.
구현예 124. 구현예 1-1231 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 전기분무 이온화 소스가 가열된 전기분무 이온화 소스인, 방법.
구현예 125. 구현예 1-124 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 샘플이 혈액 샘플, 뇌척수액(CSF) 샘플, 복수 샘플, 정액 샘플, 및 유두 흡입액 샘플로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
구현예 126. 구현예 1-125 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 샘플이 약 10 μL 내지 약 200 μL의 부피를 갖는 것인, 방법.
구현예 127. 구현예 1-126 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 샘플이 혈액 샘플인, 방법.
구현예 128. 구현예 1-107 중 어느 한 구현예에 있어서, 개체로부터의 샘플이 혈액 샘플일 때, 방법이 혈장 샘플을 제조하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
구현예 129. 구현예 128에 있어서, 상기 혈장 샘플을 제조하는 단계가 혈액 샘플을 혈장 생성 기술에 적용하는 것을 포함하는 것인, 방법.
구현예 130. 구현예 129에 있어서, 상기 혈장 생성 기술이 샘플을 폴리술폰 매질에 적용하는 것을 포함하는 것인, 방법.
구현예 131. 구현예 130에 있어서, 상기 폴리술폰 매질이 비대칭 폴리술폰 물질인, 방법.
구현예 132. 구현예 129-131 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 혈장 생성 기술이 모세관 작용 여과 기술인, 방법.
구현예 133. 구현예 129-132 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 혈장 생성 기술에 적용된 혈액 샘플의 부피가 약 10 μL 내지 약 200 μL인, 방법.
구현예 134. 구현예 129-133 중 어느 한 구현예에 있어서, 생성된 혈장 샘플을 액체 고정액과 혼합하여 테스트 샘플을 생성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
구현예 135. 구현예 134에 있어서, 상기 테스트 샘플이 SEC 기술에 테스트 샘플을 적용하기 전에 추가로 고갈되지 않는 것인, 방법.
구현예 136. 구현예 129-135 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 혈장 생성 기술이 주위 온도에서 수행되는 것인, 방법.
구현예 137. 구현예 129-136 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 샘플이 혈장 생성 기술 전에 고갈 단계에 적용되지 않았던 것인, 방법.
구현예 138. 구현예 1-137 중 어느 한 구현예에 있어서, RPLC 미세유체 장치로부터 용출된 구성요소, 또는 이의 생성물을 질량 분광계에 적용하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
구현예 139. 구현예 138에 있어서, 질량 분광계를 사용하여 샘플의 구성요소, 또는 이의 생성물의 질량 분광법 분석을 수행하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
구현예 140. 구현예 139에 있어서, 상기 질량 분광법 분석이 RPLC 미세유체 장치를 사용하여 RPLC 기술에 적용된 각각의 분획의 분석을 포함하는 것인, 방법.
구현예 141. 구현예 139 또는 140에 있어서, 상기 질량 분광법 분석이 RPLC 미세유체 장치를 사용하여 RPLC 기술에 적용된 각각의 분획에 대해 질량 분광계로부터 수득된 정보를 포함하는 하나 이상의 데이터 세트를 수득하는 것을 포함하는 것인, 방법.
구현예 142. 구현예 141에 있어서, 상기 단일 데이터 세트가 RPLC 미세유체 장치를 사용하여 RPLC 기술에 적용된 단일 분획으로부터 질량 분광계로부터 수득된 정보를 포함하는 것인, 방법.
구현예 143. 구현예 141 또는 142에 있어서, 상기 하나 이상의 데이터 세트 각각이 질량 분광계에 도입된 구성요소, 또는 이의 생성물의 이온에 대한 질량 대 전하(m/z) 및 존재비 정보를 포함하는 것인, 방법.
구현예 144. 구현예 1-143의 방법 중 어느 하나로부터 수득된 조성물 집합으로서, 상기 조성물 집합의 각 조성물이 RPLC 미세유체 장치 용출액인, 조성물 집합.
구현예 145. 질량 분광법을 사용하여 조성물 집합을 분석하는 방법으로서, (a) 조성물 집합의 각 조성물을 질량 분광계에 적용하는 단계; 및 (b) 조성물 집합의 각 조성물의 질량 분광법 분석을 수행하는 단계를 포함하며, 상기 조성물 집합은 SEC 미세유체 장치의 사용을 포함하는 SEC 기술을 사용하여 테스트 샘플의 분획화 후 각 분획, 또는 이의 생성물을 RPLC 미세유체 장치의 사용을 포함하는 RPLC 기술에 적용하는 것을 포함하는 처리 기술로부터 수득되는 것인, 방법.
구현예 146. 구현예 145에 있어서, 상기 SEC 분획이 단백질분해 기술을 통해 추가로 처리되는 것인, 방법.
구현예 147. 구현예 141-143 중 어느 한 구현예에 있어서, 하나 이상의 데이터 세트 중 적어도 하나에 기반하여, 테스트 샘플에서 복수의 하나 이상의 생체분자 각각의 정체성을 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
구현예 148. 구현예 141-143 및 147 중 어느 한 구현예에 있어서, 하나 이상의 데이터 세트 중 적어도 하나에 기반하여, 테스트 샘플에서 복수의 하나 이상의 생체분자 각각의 양을 측정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
구현예 149. 구현예 147 또는 148에 있어서, 결정된 정체성으로부터 하나 이상의 식별된 생체분자를 포함하는 서명을 식별하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
구현예 150. 구현예 149에 있어서, 상기 식별 단계가 하나 이상의 식별된 생체분자의 측정량에 기반하여 하나 이상의 식별된 생체분자의 하위집합을 선택하는 것을 추가로 포함하는 것인, 방법.
구현예 151. 구현예 148-150 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 하나 이상의 식별된 생체분자의 하위집합이 참조 샘플과 비교하여 하나 이상의 식별된 생체분자의 차등 측정량에 기반하여 선택되는 것인, 방법.
구현예 152. 구현예 141-143 중 어느 한 구현예에 있어서, 하나 이상의 식별된 생체분자를 포함하는 서명을 식별하는 단계를 추가로 포함하되, 식별 단계가 하나 이상의 데이터 세트 중 적어도 하나에 기반하여, 테스트 샘플에서 복수의 하나 이상의 생체분자 각각의 양을 측정하는 단계; 측정량에 기반하여 샘플에서 복수의 하나 이상의 생체분자의 하위집합을 선택하는 단계; 및 테스트 샘플에서 복수의 하나 이상의 생체분자의 하위집합 각각의 정체성을 결정하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
구현예 153. 구현예 152에 있어서, 상기 테스트 샘플에서 복수의 하나 이상의 생체분자의 하위집합이 참조 샘플과 비교하여 테스트 샘플에서 복수의 하나 이상의 생체분자의 차등 측정량에 기반하여 선택되는 것인, 방법.
구현예 154. 구현예 151 또는 153에 있어서, 상기 테스트 샘플이 병을 앓는 대상체로부터의 샘플이고 참조 샘플이 건강한 대상체 또는 대조군 대상체로부터의 샘플인, 방법.
구현예 155. 구현예 151 또는 153에 있어서, 상기 테스트 샘플이 질환과 관련된 이전 병태를 앓는 대상체로부터의 샘플이고 참조 샘플이 건강한 대상체 또는 대조군 대상체로부터의 샘플인, 방법.
구현예 156. 구현예 151 또는 153에 있어서, 상기 테스트 샘플이 활성 상태의 질환을 앓는 대상체로부터의 샘플이고 참조 샘플이 비활성 상태의 질환을 앓는 대상체로부터의 샘플이되, 임의적으로 상기 비활성 상태는 관해인, 방법.
구현예 157. 구현예 151 또는 153에 있어서, 상기 테스트 샘플이 진행된 단계의 질환을 앓고 있는 대상체로부터의 샘플이고 참조 샘플이 초기 단계의 질환을 앓고 있는 대상체로부터의 샘플인, 방법.
구현예 158. 구현예 149-157 중 어느 한 구현예의 방법에 의해 식별된 복수의 식별된 생체분자 또는 이의 하위집합을 포함하는 서명.
구현예 159. 구현예 150-158 중 어느 한 구현예의 방법에 의해 식별된 식별된 생체분자의 하위집합을 포함하는 서명.
구현예 160. 구현예 147-157 중 어느 한 구현예에 있어서, 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스, 경로 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스, 및/또는 네트워크 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스에 입력물로서 서명의 식별된 생체분자의 전부 또는 하위집합을 제공하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
구현예 161. 샘플의 생체분자를 분석하는 방법으로서, 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스, 경로 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스, 및/또는 네트워크 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스에 입력물로서 구현예 158 또는 159의 서명의 식별된 생체분자를 제공하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
구현예 162. 구현예 160 또는 161에 있어서, 상기 서명의 하나 이상의 분자 유형의 식별된 생체분자가 입력물로서 제공되는 것인, 방법.
구현예 163. 구현예 162에 있어서, 상기 하나 이상의 분자 유형이 단백질을 포함하는 것인, 방법.
구현예 164. 구현예 163에 있어서, 상기 하나 이상의 분자 유형이 단백질로만 이루어지는 것인, 방법.
구현예 165. 구현예 160-164 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스가 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 유전자 온톨로지를 식별하도록 구성된 프로세스를 포함하는 것인, 방법.
구현예 166. 구현예 160-165 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스가 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 세포 구성요소 유전자 온톨로지를 식별하도록 구성된 프로세스; 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 분자 경로 유전자 온톨로지를 식별하도록 구성된 프로세스; 및/또는 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 생물학적 프로세스 유전자 온톨로지를 식별하도록 구성된 프로세스를 포함하는 것인, 방법.
구현예 167. 구현예 160-166 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스가 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나의 하나 이상의 조절자를 식별하도록 구성된 프로세스를 포함하는 것인, 방법.
구현예 168. 구현예 160-167 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스가 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나를 조절하는 하나 이상의 전사 인자를 식별하도록 구성된 프로세스; 및/또는 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나를 조절하는 하나 이상의 키나제를 식별하도록 구성된 프로세스를 포함하는 것인, 방법.
구현예 169. 구현예 160-168 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 경로 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스가 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 경로를 식별하도록 구성된 프로세스를 포함하는 것인, 방법.
구현예 170. 구현예 160-169 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 경로 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스가 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 분자 경로를 식별하도록 구성된 프로세스; 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 신호전달 경로를 식별하도록 구성된 프로세스; 및/또는 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 대사 경로를 식별하도록 구성된 프로세스를 포함하는 것인, 방법.
구현예 171. 구현예 160-170 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 네트워크 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스가 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 네트워크를 식별하도록 구성된 프로세스를 포함하는 것인, 방법.
구현예 172. 구현예 160-171 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 네트워크 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스가 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 분자 경로를 식별하도록 구성된 프로세스; 및/또는 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 신호전달 경로를 식별하도록 구성된 프로세스를 포함하는 것인, 방법.
구현예 173. 구현예 160-172 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 네트워크 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스가 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 네트워크의 하나 이상의 허브를 식별하도록 구성된 프로세스를 포함하는 것인, 방법.
구현예 174. 구현예 160-173 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 네트워크 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스가 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나를 각각 표적하는 하나 이상의 약물을 식별하도록 구성된 프로세스를 포함하되, 임의적으로 상기 프로세스는 입력물로서 제공된 서명의 복수의 식별된 생체분자를 포함하는 네트워크의 적어도 하나의 허브를 각각 표적하는 하나 이상의 약물을 식별하도록 구성되는 것인, 방법.
구현예 175. 구현예 160-174 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 네트워크 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스가 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나를 각각 표적하는 하나 이상의 약물을 식별하도록 구성된 2 개의 프로세스를 포함하되, 임의적으로 상기 2 개의 프로세스는 입력물로서 제공된 서명의 복수의 식별된 생체분자를 포함하는 네트워크의 적어도 하나의 허브를 각각 표적하는 하나 이상의 약물을 식별하도록 구성되는 것인, 방법.
구현예 176. 유전자 농축 분석, 경로 분석, 또는 네트워크 분석을 수행하도록 각각 구성된 복수의 프로세스 각각에 복수의 식별된 생체분자를 제공하는 단계를 포함하는, 식별된 생체분자의 서명을 분석하는 방법으로서, 상기 제공 단계가 임의의 순서로 제공되고; 복수의 식별된 생체분자가 단백질 세트, 전사체 세트, 펩티드 세트, 및/또는 대사물 세트를 포함하고; 복수의 프로세스가 입력물로서 제공된 복수의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 유전자 온톨로지를 식별하기 위해 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 프로세스; 입력물로서 제공된 복수의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 신호전달 경로를 식별하기 위해 경로 분석을 수행하도록 구성된 프로세스; 입력물로서 제공된 복수의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나를 조절하는 하나 이상의 전사 인자를 식별하기 위해 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 프로세스; 입력물로서 제공된 복수의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나의 유전자 산물을 조절하는 하나 이상의 키나제를 식별하기 위해 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 프로세스; 입력물로서 제공된 복수의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 네트워크를 식별하기 위해 네트워크 분석을 수행하도록 구성된 프로세스; 및 입력물로서 제공된 복수의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나를 각각 표적하는 하나 이상의 약물을 식별하기 위해 네트워크 분석을 수행하도록 구성된 2 개의 프로세스 각각을 포함하는 것인, 방법.
구현예 177. 유전자 농축 분석, 경로 분석, 또는 네트워크 분석을 수행하도록 각각 구성된 복수의 프로세스 각각에 복수의 단백질을 제공하는 단계를 포함하는, 단백질 서명을 분석하는 방법으로서, 상기 제공 단계가 임의의 순서로 수행되고, 복수의 프로세스가 입력물로서 제공된 복수의 단백질 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 유전자 온톨로지를 식별하기 위해 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 프로세스; 입력물로서 제공된 복수의 단백질 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 신호전달 경로를 식별하기 위해 경로 분석을 수행하도록 구성된 프로세스; 입력물로서 제공된 복수의 단백질 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나를 조절하는 하나 이상의 전사 인자를 식별하기 위해 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 프로세스; 입력물로서 제공된 복수의 단백질 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나의 유전자 산물을 조절하는 하나 이상의 키나제를 식별하기 위해 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 프로세스; 입력물로서 제공된 복수의 단백질 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 네트워크를 식별하기 위해 네트워크 분석을 수행하도록 구성된 프로세스; 및 입력물로서 제공된 복수의 단백질 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나를 각각 표적하는 하나 이상의 약물을 식별하기 위해 네트워크 분석을 수행하도록 구성된 2 개의 프로세스 각각을 포함하는 것인, 방법.
구현예 178. 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 미세유체 장치로서, 입력 포트; 연결 채널의 상류 네트워크; 및 복수의 상호연결된 채널을 포함하되, 상기 복수의 상호연결된 채널의 각 채널은 개방 관형 형식이고, 상기 복수의 상호연결된 채널의 각 채널은 SEC 매질을 포함하는 내부 표면을 포함하고, 상기 복수의 상호연결된 채널의 각 채널은 연결 채널의 상류 네트워크를 통해 입력 포트와 유체 연통하는 것인, SEC 미세유체 장치.
구현예 179. 구현예 178에 있어서, 상기 SEC 매질을 포함하는 내부 표면이 약 0.5 μm 내지 약 2 μm의 두께를 갖는 것인, SEC 미세유체 장치.
구현예 180. 구현예 178 또는 179에 있어서, 상기 SEC 매질이 약 10 nm 내지 약 500 nm의 평균 기공 크기를 갖는 물질인, SEC 미세유체 장치.
구현예 181. 구현예 178-180 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널이 8 내지 100 개의 상호연결된 채널을 포함하는 것인, SEC 미세유체 장치.
구현예 182. 구현예 178-181 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널이 8 개 이상의 상호연결된 채널을 포함하는 것인, SEC 미세유체 장치.
구현예 183. 구현예 178-182 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널이 32 개의 상호연결된 채널을 포함하는 것인, SEC 미세유체 장치.
구현예 184. 구현예 178-182 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널이 64 개의 상호연결된 채널을 포함하는 것인, SEC 미세유체 장치.
구현예 185. 구현예 178-184 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 연결 채널의 상류 네트워크, 또는 이의 부분이 복수의 상호연결된 채널 각각의 근위 영역에 연결되는 것인, SEC 미세유체 장치.
구현예 186. 구현예 178-185 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 연결 채널의 상류 네트워크가 유체 유동을 SEC 미세유체 장치의 입력 포트로부터 복수의 상호연결된 채널 각각으로 분할하도록 구성된 일련의 발산 채널을 포함하는 것인, SEC 미세유체 장치.
구현예 187. 구현예 178-186 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각이 연결 채널의 하류 네트워크를 통해 SEC 미세유체 장치의 출력 포트와 유체 연통하는 것인, SEC 미세유체 장치.
구현예 188. 구현예 187에 있어서, 상기 연결 채널의 하류 네트워크가 유체 유동을 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널로부터 출력 포트로 조합하도록 구성된 일련의 수렴 채널을 포함하는 것인, SEC 미세유체 장치.
구현예 189. 구현예 178-188 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각이 약 2 cm 내지 약 30 cm의 길이를 갖는 것인, SEC 미세유체 장치.
구현예 190. 구현예 178-189 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각이 약 1 μm 내지 약 15 μm의 폭을 갖는 것인, SEC 미세유체 장치.
구현예 191. 구현예 178-190 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각이 약 1 μm 내지 약 15 μm의 깊이를 갖는 것인, SEC 미세유체 장치.
구현예 192. 구현예 178-191 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널이 기둥 배열을 통해 형성되는 것인, SEC 미세유체 장치.
구현예 193. 구현예 192에 있어서, 상기 기둥 배열이 무정형 기둥 배열인, SEC 미세유체 장치.
구현예 194. 구현예 192에 있어서, 상기 기둥 배열이 비-무정형 기둥 배열인, SEC 미세유체 장치.
구현예 195. 구현예 192-194 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 기둥 배열이 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각의 내부 표면을 형성하는 것인, SEC 미세유체 장치.
구현예 196. 구현예 178-195 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치가 석영 기판을 포함하는 것인, SEC 미세유체 장치.
구현예 197. 구현예 178-196 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치가 복수의 상호연결된 채널을 형성하는 모놀리식 기판을 포함하는 것인, SEC 미세유체 장치.
구현예 198. 구현예 178-197 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치가 석영 모놀리식 기판을 포함하는 것인, SEC 미세유체 장치.
구현예 199. 구현예 178-198 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치가 3차원(3D) 인쇄 기판을 포함하는 것인, SEC 미세유체 장치.
구현예 200. 역상 액체 크로마토그래피(RPLC) 미세유체 장치로서, 입력 포트; 연결 채널의 상류 네트워크; 및 복수의 상호연결된 채널을 포함하되, 상기 복수의 상호연결된 채널의 각 채널은 개방 관형 형식이고, 상기 복수의 상호연결된 채널의 각 채널은 RPLC 매질을 포함하는 내부 표면을 포함하고, 상기 복수의 상호연결된 채널의 각 채널은 연결 채널의 상류 네트워크를 통해 입력 포트와 유체 연통하는 것인, RPLC 미세유체 장치.
구현예 201. 구현예 200에 있어서, 상기 RPLC 매질이 약 2 내지 약 20 개의 탄소를 갖는 알킬 모이어티를 포함하는 것인, RPLC 미세유체 장치.
구현예 202. 구현예 200 또는 201에 있어서, 상기 RPLC 매질이 C2, C4, C8, 및 C18 중 하나 이상을 포함하는 것인, RPLC 미세유체 장치.
구현예 203. 구현예 200-202 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 RPLC 매질이 다음 알킬 모이어티: C2, C4, C8, 및 C18 중 2 개 이상을 포함하는 RPLC 모이어티 혼합물을 포함하는 것인, RPLC 미세유체 장치.
구현예 204. 구현예 203에 있어서, 상기 RPLC 모이어티 혼합물이 다음 알킬 모이어티: C2, C4, C8, 및 C18 중 3 개 이상을 포함하는 것인, RPLC 미세유체 장치
구현예 205. 구현예 203 또는 204에 있어서, 상기 RPLC 모이어티 혼합물이 다음 알킬 모이어티: C2, C4, C8, 및 C18을 포함하는 것인, RPLC 미세유체 장치.
구현예 206. 구현예 203-205 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 RPLC 모이어티 혼합물의 알킬 모이어티가 등몰량으로 존재하는 것인, RPLC 미세유체 장치.
구현예 207. 구현예 200-206 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 RPLC 매질이 실리카(SiO2)를 통해 상호연결된 복수의 병렬 채널의 각 채널의 내부 표면에 접합되는 것인, RPLC 미세유체 장치.
구현예 208. 구현예 200-207 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널이 8 내지 100 개의 상호연결된 채널을 포함하는 것인, RPLC 미세유체 장치.
구현예 209. 구현예 200-208 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널이 8 개 이상의 상호연결된 채널을 포함하는 것인, RPLC 미세유체 장치.
구현예 210. 구현예 200-209 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널이 32 개의 상호연결된 채널을 포함하는 것인, RPLC 미세유체 장치.
구현예 211. 구현예 200-209 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널이 64 개의 상호연결된 채널을 포함하는 것인, RPLC 미세유체 장치.
구현예 212. 구현예 200-211 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 연결 채널의 상류 네트워크, 또는 이의 부분이 복수의 상호연결된 채널 각각의 근위 영역에 연결되는 것인, RPLC 미세유체 장치.
구현예 213. 구현예 200-212 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 연결 채널의 상류 네트워크가 유체 유동을 RPLC 미세유체 장치의 입력 포트로부터 복수의 상호연결된 채널 각각으로 분할하도록 구성된 일련의 발산 채널을 포함하는 것인, RPLC 미세유체 장치.
구현예 214. 구현예 200-213 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각이 연결 채널의 하류 네트워크를 통해 RPLC 미세유체 장치의 출력 포트와 유체 연통하는 것인, RPLC 미세유체 장치.
구현예 215. 구현예 214에 있어서, 상기 연결 채널의 하류 네트워크가 유체 유동을 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널로부터 출력 포트로 조합하도록 구성된 일련의 수렴 채널을 포함하는 것인, RPLC 미세유체 장치.
구현예 216. 구현예 200-215 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각이 약 2 cm 내지 약 30 cm의 길이를 갖는 것인, RPLC 미세유체 장치.
구현예 217. 구현예 200-216 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각이 약 1 μm 내지 약 15 μm의 폭을 갖는 것인, RPLC 미세유체 장치.
구현예 218. 구현예 200-217 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각이 약 1 μm 내지 약 15 μm의 깊이를 갖는 것인, RPLC 미세유체 장치.
구현예 219. 구현예 200-218 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널이 기둥 배열을 통해 형성되는 것인, RPLC 미세유체 장치.
구현예 220. 구현예 219에 있어서, 상기 기둥 배열이 무정형 기둥 배열인, RPLC 미세유체 장치.
구현예 221. 구현예 219에 있어서, 상기 기둥 배열이 비-무정형 기둥 배열인, RPLC 미세유체 장치.
구현예 222. 구현예 219-221 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 기둥 배열이 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각의 내부 표면을 형성하는 것인, RPLC 미세유체 장치.
구현예 223. 구현예 219-221 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치가 석영 기판을 포함하는 것인, RPLC 미세유체 장치.
구현예 224. 구현예 219-223 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치가 복수의 상호연결된 채널을 형성하는 모놀리식 기판을 포함하는 것인, RPLC 미세유체 장치.
구현예 225. 구현예 219-224 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치가 석영 모놀리식 기판을 포함하는 것인, RPLC 미세유체 장치.
구현예 226. 구현예 219-225 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치가 3차원(3D) 인쇄 기판을 포함하는 것인, RPLC 미세유체 장치.
구현예 227. 테스트 샘플을 처리하는 방법으로서, (a) SEC 미세유체 장치를 사용하여 테스트 샘플을 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 기술에 적용하되, 상기 테스트 샘플은 하나 이상의 생체분자 및 카오트로픽제를 포함하고, 상기 SEC 미세유체 장치는 복수의 상호연결된 채널을 포함하는 것인, 단계; (b) SEC 미세유체 장치로부터 용출된 하나 이상의 분획을 수집하는 단계; (c) SEC 미세유체 장치로부터 수집된 분획 중 하나 이상을 단백질분해 기술에 적용하는 단계; 및 (d) 분획 중 하나 이상을 역상 액체 크로마토그래피(RPLC) 기술에 적용하여 질량 분광계에 도입하기 위한 분획을 제조하는 단계를 포함하되, 상기 하나 이상의 RPLC-분획은 (i) SEC 미세유체 장치로부터 수득된 0 개 이상의 분획; 및 (ii) 단백질분해 기술에 적용된 0 개 이상의 분획을 포함하는 것인, 방법.
구현예 228. 조성물을 분석하는 방법으로서, (a) 조성물을 질량 분광계에 적용하는 단계; 및 (b) 조성물의 질량 분광법 분석을 수행하는 단계를 포함하되, 상기 조성물은 SEC 미세유체 장치의 사용을 포함하는 SEC 기술을 사용하여 샘플의 분획화 후 SEC 미세유체 기술로부터의 하나 이상의 분획, 또는 이의 생성물을 RPLC 기술에 적용하는 것을 포함하는 처리 기술로부터 수득되는 것인, 방법.
구현예 229. 유전자 농축 분석, 경로 분석, 및 네트워크 분석을 임의의 순서로 수행하는 단계를 포함하는, 식별된 구성요소의 서명을 분석하는 방법으로서, 상기 식별된 구성요소의 서명이 단백질 세트, 전사체 세트, 펩티드 세트, 및/또는 대사물 세트를 포함하고; 수행 단계가 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 프로세스; 경로 분석을 수행하도록 구성된 프로세스; 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 프로세스; 및 네트워크 분석을 수행하여 약물 표적을 식별하도록 구성된 프로세스를 포함하는 것인, 방법.
구현예 230. 개체에게 관상 동맥 질환(CAD) 진단 결정을 내리게 하는 방법으로서, (a) 개체로부터 수득된 샘플, 또는 이의 유도체로부터 질량 분광법(MS) 데이터를 수득하는 단계; 및 (b) CAD 단백체 서명에 따라 MS 데이터를 분석하되, 상기 CAD 단백체 서명은 표 1의 하나 이상의 바이오마커를 포함하는 것인, 단계; 및 (c) 개체가 CAD 단백체 서명을 갖는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
구현예 231. 구현예 230에 있어서, 상기 개체가 CAD 단백체 서명을 갖는 경우, 개체가 CAD를 앓는 것으로 진단되는 것인, 방법.
구현예 232. 개체가 관상 동맥 질환(CAD)을 앓는 것으로 진단하는 방법으로서, (a) 개체로부터 수득된 샘플, 또는 이의 유도체로부터 질량 분광법(MS) 데이터를 수득하는 단계; 및 (b) CAD 단백체 서명에 따라 MS 데이터를 분석하되, 상기 CAD 단백체 서명은 표 1의 하나 이상의 바이오마커를 포함하는 것인, 단계; 및 (c) CAD 단백체 서명의 존재에 기반하여 개체가 CAD를 앓는 것으로 진단하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
구현예 233. 관상 동맥 질환(CAD)을 앓는 개체를 치료하는 방법으로서, (a) 개체로부터 수득된 샘플, 또는 이의 유도체에서 CAD 단백체 서명의 존재에 따라 개체가 CAD를 앓는 것으로 진단하되, 상기 CAD 단백체 서명은 표 1의 하나 이상의 바이오마커를 포함하는 것인, 단계; 및 (b) 개체에게 CAD 치료를 투여하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
구현예 234. 구현예 233에 있어서, 상기 CAD 단백체 서명의 존재가 CAD 단백체 서명에 따른 MS 데이터를 분석함으로써 결정되는 것인, 방법.
구현예 235. 구현예 234에 있어서, 개체로부터 수득된 샘플, 또는 이의 유도체로부터 MS 데이터를 수득하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
구현예 236. 구현예 233-235 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 CAD 치료가 생활 방식 조정을 포함하는 것인, 방법.
구현예 237. 구현예 233-236 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 CAD 치료가 약제학적 개입을 포함하는 것인, 방법.
구현예 238. 구현예 237에 있어서, 상기 약제학적 개입이 칼슘 채널 차단제, 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 억제제(예컨대 HDAC6), Ca2+/칼모듈린(CaM)-의존적 단백질 키나제 II(CaMK II) 억제제, 구아닐릴 사이클라제(sGC) 활성제, MMP 억제제, 스타틴, 및 항고혈압제로 이루어진 군으로부터 선택된 약물의 투여를 포함하는 것인, 방법.
구현예 239. 구현예 237 또는 238에 있어서, 상기 약제학적 개입이 암로디핀, 투바스타틴-a, 포르스콜린, 트리코스타틴 A, KN-93, CFM-1571, 일로마스타트, CAY-10603, 및 로수바스타틴, 또는 이의 약제학적 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 약물을 포함하는 것인, 방법.
구현예 240. 구현예 237 또는 238에 있어서, 상기 약물이 BRD-K52306726, BRD-K71361154, 아세타졸아미드, 롤리프람, 룩솔리티닙, BRD-A59808129-001-01-7, BRD-K76876037, ZM336372, 트레할로스, SCHEMBL3092652, BMS-387032, BRD-K01425431, 4-하이드록시-레티노산, CHEMBL585951, CHEMBL1673039, HY-11007, 프리미돈, BRD-K81417919, SPECTRUM_000826, 타목시펜, BRD-K00544996, CID 67066889, CX-5461, BRD-K63944563, SCHEMBL6851809, BRD-A86146706, FR-180204, CHEMBL552425, 헥사클로로펜, Aggc, SUGA1_008424, BRD-K96640811, 아나스트로졸, 워트만닌, 반데타닙, AC1NWALF, OTSSP167, WZ3105, 디하이드로에르고타민, BRD-K99839793, SR 33805 옥살레이트, AT-7519, 술파독신, SPECTRUM_001319, MLS003329219, 트리코스타틴 A, 및 로테논, 또는 이의 약제학적 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
구현예 241. 개체의 관상 동맥 질환(CAD) 단백체 서명을 검출하는 방법, (a) 개체로부터 수득된 샘플, 또는 이의 유도체로부터 질량 분광법(MS) 데이터를 수득하는 단계; 및 (b) CAD 단백체 서명에 따라 MS 데이터를 분석하여 CAD 단백체 서명을 검출하되, 상기 CAD 단백체 서명은 표 1의 하나 이상의 바이오마커를 포함하는 것인, 방법.
구현예 242. 구현예 241에 있어서, 상기 개체가 CAD를 앓는 것으로 의심되는 것인, 방법.
구현예 243. 구현예 230-242 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 CAD 단백체 서명이 참조와 비교하여 표 1에 따른 하나 이상의 바이오마커의 발현 증가를 포함하는 것인, 방법.
구현예 244. 구현예 230-243 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 CAD 단백체 서명이 참조와 비교하여 표 1에 따른 하나 이상의 바이오마커의 발현 감소를 포함하는 것인, 방법.
구현예 245. 구현예 230-244 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 CAD 단백체 서명이 칼슘 신호전달 경로, 히스톤 조절, HIF-1 신호전달 경로, cAMP 신호전달 경로, 베타-아드레날린성 신호전달 경로, PI3K-Akt 신호전달 경로, 보체 및/ 또는 응고 캐스케이드, 스핑고지질 신호전달 경로, 자연 살해 세포 매개 세포독성, 아디포사이토카인 신호전달 경로, DNA 손상, 칼슘 에너지, 대사체학, 세포 부착, 염증, 저산소증, 및 히스톤 메틸화와 연관된 하나 이상의 바이오마커를 포함하는 것인, 방법.
구현예 246. 구현예 230-245 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 하나 이상의 바이오마커가 전사 인자와 연관된 하나 이상의 바이오마커를 포함하는 이의 하위집합을 포함하는 것인, 방법.
구현예 247. 구현예 230-246 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 하나 이상의 바이오마커가 키나제와 연관된 하나 이상의 바이오마커를 포함하는 이의 하위집합을 포함하는 것인, 방법.
구현예 248. 구현예 230-247 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 하나 이상의 바이오마커가 표 1의 적어도 10 개의 바이오마커를 포함하는 것인, 방법.
구현예 249. 구현예 230-248 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 하나 이상의 바이오마커가 표 1의 적어도 25 개의 바이오마커를 포함하는 것인, 방법.
구현예 250. 구현예 230-249 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 하나 이상의 바이오마커가 표 1의 적어도 50 개의 바이오마커를 포함하는 것인, 방법.
구현예 251. 구현예 230-250 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 하나 이상의 바이오마커가 표 1의 모든 바이오마커를 포함하는 것인, 방법.
구현예 252. 구현예 230-251 중 어느 한 구현예에 있어서, 개체로부터 샘플을 수득하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
구현예 253. 구현예 230-252 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 샘플, 또는 이의 유도체가 혈액 샘플 또는 이의 유도체인, 방법.
구현예 254. 구현예 253에 있어서, 상기 샘플, 또는 이의 유도체가 혈장 샘플인, 방법.
구현예 255. 구현예 254에 있어서, 상기 샘플, 또는 이의 유도체가 액체 고정액을 포함하는 것인, 방법.
구현예 256. 구현예 230-255 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 샘플, 또는 이의 유도체로부터 MS 데이터를 수득하는 단계가 질량 분광계를 사용하여 샘플, 또는 이의 유도체의 질량 분광법 분석을 수행하는 것을 포함하는 것인, 방법.
구현예 257. 구현예 256에 있어서, 상기 질량 분광법 분석이 구현예 140-143의 방법에 따라 수행되는 것인, 방법.
구현예 258. 구현예 230-257 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 CAD 단백체 서명에 따라 MS 데이터를 분석하는 단계가 구현예 161-177 중 어느 한 구현예의 방법에 MS 데이터를 적용하는 것을 포함하는 것인, 방법.
구현예 259. 구현예 230-258 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 CAD 단백체 서명에 따라 MS 데이터를 분석하는 단계가 MS 데이터에서 CAD 단백체 서명의 하나 이상의 바이오마커 각각의 존재 또는 부재 또는 수준을 평가하는 것을 포함하는 것인, 방법.
구현예 260. 구현예 230-259 중 어느 한 구현예에 있어서, 개체의 다음 인자 평가: 성별, 연령, 신체질량지수(BMI), 수축기 혈압, 확장기 혈압, 총 콜레스테롤, HDL, LDL, 트리글리세리드, 고지질혈증, 고혈압, 진성 당뇨병, 인슐린 저항, 신장 질환, 흡연 상태, 신체 활동 수준, 수면 수준, 또는 영양의 질 중 하나 이상을 수행하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
구현예 261. 구현예 230-260 중 어느 한 구현예에 있어서, CAD의 존재를 평가하기 위해 개체에 대한 의료 절차를 수행하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
IX. 실시예
하기 실시예는 예시적 목적을 위해서만 포함되며 본 발명의 범위를 제한하려는 것으로 의도되지 않는다
실시예 1: 혈장 단백체 발견 방법
이 실시예는 단자 검사 조달된 혈액 표본으로부터 질환 특이적 단백질 생체서명의 편향되지 않은 발견, 및 후속 표적화 분석을 위한 포괄적인 정량적 혈장 단백체학 방법을 입증한다. 이 실시예는 제시되지 않은 수준의 분석 정확도, 정밀도, 민감도, 및 특이성을 달성하기 위해 함께 합심하여 작동하는 다중 혁신적 기술을 통합하는 방법을 입증한다.
혈액 한 방울(약 10-15 μL)에 함유된 신선하게 조달된 고갈되지 않은 인간 혈장의 부피 등가물을 실온(RT)에서 액체 고정액과 즉시 혼합하여 단백질 및 1차 및 2차 대사물, 천연 펩티드, microRNA, 원형 및 긴 비코딩 RNA, 및 미토콘드리아 RNA를 포함하는 다른 생물학적 분석물을 가용화하고 보존하였다. 단일 혈액 방울로부터 혈장 추출은 상업적으로 이용가능한 비대칭 polysulphoneTM 물질을 통한 모세관 작용 여과로 달성하고, 90% 물 / 10% 글리세롤에 7 M 구아니딘 HCl의 액체 고정액 40 μL와 직접 혼합하였다. 이 용액은 강한 카오트로픽 활성으로 인해 액체 고정액으로서 기능하므로 효율적인 크기 배제 크로마토그래픽(SEC) 분리를 위해 프로테아제 활성을 제거하고, 대사물의 화학적 무결성의 최대한 보존을 달성하고, 단백질-단백질 결합을 제거하고, 구성성분 분석물에 최대 유체역학적 반경을 부여하고, 액체 점도를 향상시킨다. 추가로, 액체 고정액은 화학적 또는 독성학적 위험이 있는 모든 인간 병원체(예를 들어, 바이러스, 박테리아 등)를 효과적으로 중화시킨다. 이 구성은 혈장 및 그의 단백질 및 대사물 함량의 조달 및 화학적 고정을 위한 현장 진료 장치에 적합하다.
그런 다음 보존된 혈장 표본 대략 5 μL를 미세유체 초고성능 SEC(μUHSEC)를 사용하여 직접 다중-분절된 분별화에 적용하였다. 이 분별화는 개방 관형 장치, (Bioinspired Arterial architecture(BioArteryTM)로 달성하였다(도 5). 본원에 사용된 BioArteryTM μUHSEC 장치의 개방 관형 기하학적 구조는 길이 10 cm, 폭 5 μm, 및 깊이 5 μm의 32 개의 상호연결된 채널을 갖는 석영으로 구성되었다. 이들 채널 각각의 내부 표면은 표준 O2 플라즈마 에칭 절차를 사용하여 생성된 평균 기공 크기가 50-80 nm인 무정형 서브네트워크로 구성되었다. 치수는 전반적인 발견 및 표적화된 단백체학 방법의 필요한 민감도, 특이성, 및 재현성을 달성하는 데 필요한 만큼, 다양한 크로마토그래픽 용량, 분석물 분리 효율, 및 분석 피크 밀도의 수용을 허용하였다. 또한, 12 BioArteryTM μUHSEC 장치의 미세유체 치수는 낮은 표본 시작 부피에서 분석 민감도를 증가시켰다. 12 BioArteryTM μUHSEC 장치는 온전한 친수성 및 소수성 단백질, 천연 펩티드, 및 대사물을 포함한 광범위한 생물학적 분석물의 분할 및 화학적 보존을 허용하였으며, 고해상도 질량 분광법 검출을 사용한 하류 발견 분석에 적합하다.
SEC 이동상은 액체 고정액의 동일한 구성요소로 구성되었으므로, 정화 단계와 같은 사전 분석 단계에 대한 필요성을 제거하였다. 이와 같이, 본원에서 입증된 방법은 사전 분석 변수를 최소화하므로, 측정 표준 편차를 감소시킨다. 각 분절에 대한 단백질 함량은 280 nm에서 UV 흡광도, 또는 290 nm에서 형광 여기 및 320-400 nm에서 방출로 측정하였다. 대표적인 μUHSEC 자취가 도 4에 도시되어 있다.
12 BioArteryTM μUHSEC 장치의 향상된 성능은 상업적으로 이용가능한 포장된 μSEC 컬럼 TSKgel Super SW3000 1 mm x 30 cm x 4 μm 입자에 대해 벤치마킹하였다. 내부의 총 단백질 양이 정의된 동일한 분절, 및 아래에 기재된 동일한 하류 분석 절차를 이 분석에 사용하였다. 더욱이, 분석은 또한 정의된 농도 수준에서 정의된 분자량의 단백질, 펩티드, 및 대사물 혼합물을 함유하는 상업적으로 이용가능한 시스템 적합성 표준을 포함하였다. 민감도 및 후속 프로테옴 적용범위의 최소한의 증가는 μSEC 컬럼 TSKgel Super SW3000과 비교하여 12 BioArteryTM μUHSEC 장치를 사용하여 20-30 배였다. 향상된 성능은 후속적으로 방법 민감도 및 재현성을 보장하기 위해 시스템 적합성 표준으로 12 BioArteryTM μUHSEC 성능을 모니터링하는 데 활용하였다.
12 BioArteryTM μUHSEC 분획 각각으로부터의 분취량을 정제수에 1:10으로 희석하고, 용액상 트립신 단백질분해(Promega)에 적용하였다. 분취량을 1:30 단백질 함량으로 화학량론적으로 보정하고 37℃에서 8 시간 동안 트립신과 함께 인큐베이션하였다. 즉, 분절 당 단백질 양은 0.1 mg 내지 10 ng 범위였고, 트립신 양은 각 분취량의 단백질보다 30 배 적도록 조정하였다. 용액상 단백질분해에 사용된 액체 고정액 특성으로 인해 환원 및 알킬화 단계는 필요하지 않았다. 각 분획의 나머지는 후속 표적화된 단백질 분해 목적을 위해 보존하였다(실시예 2 참조). 그런 다음 발견 상대적 정량적 분석을 위해, 각 분절을 1:3 시약 - 단백질 비율에서 화학량론적으로 정규화된 동중 안정 동위원소 태깅 시약으로 표지하였다. BioArteryTM μUHSEC 분획은 또한 표준 데이터-독립적 획득(DDA) 또는 데이터-독립적 획득(DIA) 접근법을 사용하는 무표지 상대적 정량적 단백체학에 적합하다.
단백질분해 후, 12 BioArteryTM μUHSEC 분획 각각을 BioArteryTM RPLC 장치에 적용하였다. BioArteryTM RPLC 장치는 32 개의 상호연결된 채널을 갖는 석영 랩 칩이었다. 각 채널은 길이 10 cm, 폭 5 μm, 및 깊이 5 μm였다. 내부 채널 표면을 C2-C4-C8-C18 알킬 기의 등몰 농도로 화학적으로 변형시켰다. C2-4-8-18 표면 화학은 광범위한 소수성, 양친매성, 및 소수성 펩티드를 분리하는 능력을 제공하므로, 하류 전기분무 이온화 및 질량 분광법 분석을 용이하게 한다. BioArteriTM RPLC 장치를 사용하여 각 샘플을 온라인 탈염하고, 온라인 전환 밸브로 질량 분광계에서 멀리 전환하고, 분리하였다. 샘플을 질량 분광계에 도입하기 위해 BioArteryTM RPLC 장치를 전기분무 이온화 소스와 결합시켰다. 전기분무 이온화는 가열된 전기분무 공급원 및 질소 분무기로 수행하였다.
BioArteryTM RPLC 장치의 성능은 상업적으로 이용가능한 2 m-길이 모놀리식 C18 모세관 컬럼(100 μm ID; GL Sciences)에 대해 벤치마킹하였다. BioArteryTM RPLC 장치를 사용하여 트립신 펩티드 수의 60-70% 증가를 전형적으로 관찰하였다. 이 벤치마킹 연습은 상업적으로 이용가능한 개방 관형 컬럼에 대해 제안된 BioArteryTM RPLC 장치의 진보된 성능을 입증하였다.
초고해상도 질량 분광법 매개변수는 아래에 기재된 바와 같이, Garay-Baquero 등, 2020, JCI Insight 5에 보고된 것들에 기반하였다. 간단히 말해서, 고에너지 충돌 해리(HCD) 및 충돌 유도 해리(CID) 단편화를 SEC 분획 각각에 상응하는 각각 표지되고 탈염된 샘플에 대해 수행하였다. 펩티드 및 다른 더 큰 분자의 경우, MS 관찰 창을 380 내지 1500 m/z로 설정하였다. 상위 10 개의 +2 및 +3 다중 하전된 이온을 탠덤 MS(MS/MS)에 의해 추가로 특성화하였다. 소분자(대사물)의 경우, MS 관찰 창을 80 내지 600 m/z로 설정하고 단일 + 1, 및 이중 하전된 이온만을 모니터링하였다. 전체 MS 스캔을 120,000 반치전폭(FWHM)에서 획득하였고, MS/MS 스캔을 30,000 FWHM의 해상도에서 획득하였다. 질량 정확도를 향상시키기 위해, 445.120025 m/z 이온(DMSO)에 대한 잠금 질량 옵션이 가능하였다. 발견 플랫폼의 예시적인 작업 흐름은 도 2에 제시되어 있다.
차등적으로 발현된 단백질의 식별을 위한 스펙트럼 처리 및 위발견율(FDR)-보정된 통계 분석을 수행하였다. 처리되지 않은 원시 파일을 Sequest를 사용하여 표적 유인 검색을 위해 Proteome Discoverer 1.4에 제출하였다. 20,159 개의 항목을 함유하는 UniProtKB 호모 사피엔스 데이터베이스를 활용하였다. 검색은 최대 2 개의 누락된 절단, 10ppm의 전구체 질량 허용오차, 6 개의 최소 펩티드 길이 및 산화(M), 탈아미드화(N, Q), 또는 인산화(S, T, Y) 중 최대 2 개의 가변(하나는 동일) 변형을 허용하였다. 메틸티오(C) 및 TMT(K, 펩티드 N-말단)를 고정 변형으로 설정하였다. 펩티드 수준에서 FDR 보정된 p-값을 <0.05로 설정하였다. 정량화로부터 펩티드를 제외한 공분리 퍼센트는 50으로 설정하였다. 고유한 펩티드로부터의 리포터 이온 존재비만을 각각의 단백질의 정량화를 위한 고려사항으로 고려하였다.
통계적 분석은 그룹 간의 유의한 차이를 평가하기 위해 불평등 분산에 대한 Welch의 2-샘플 t 검정에 이어 다중-보정 테스트에 대한 FDR 보정에 기반하였다(p ≤0.01). 이 Welch 2-샘플　t　검정은 그룹 내 샘플의 균형이 있었고, 각 그룹이 그룹 당 15 개의 제안된 수준을 훨씬 초과하여, 비정규 분포에서도 유형 I 오류율을 제어하였으므로 적절하였다. ComBat 방법을 사용하여 배치 효과 보정을 수행하였다.
분석 결과는 고처리량 방식으로 소량의 고갈되지 않은 혈장 또는 혈청(예를 들어, 150μL 미만)으로부터 더 큰 선형 동적 범위(예를 들어, 12-자릿수 이상)에 걸친 다양한 단백질 세트(예를 들어, 분비된, 내인성 절단 생성물, 분비된 - 가용성 단백질, 엑소솜 또는 지질 미세소포 풍부 단백질 등)의 포획이 포함된 광범위한 단백체 적용범위를 입증하였다. 방법은 장치 간 작동의 높은 보완 원칙 정도를 고려하여, 단일 수직 통합 파이프라인을 구성하였다. 더욱이, 파이프라인은 자동화에 매우 적합하고 최소한의 인간 개입으로 분석 용량을 증가시키기 위해 확장될 수 있다.
실시예 2: PROMINIA 컴퓨터 생물학 플랫폼
"PROMINIA"( Pro tein MIN ing I ntelligent A lgorithm)라는 명칭의 컴퓨터 생물학 플랫폼을 개발하였다. PROMINIA는 실시예 1에 기재된 바와 같은 발견 단백체학 방법에 의해 포획된 차등적으로 발현된 단백질로부터 유도된 질환 특이적 신호전달 결로 및 분자 네트워크를 식별한다. 예를 들면, 발견 단백체학 플랫폼은 적합한 대조군과 비교하여 질환을 앓는 환자로부터 단백체 서명을 식별하는 데 적용될 수 있고, 단백체 서명은 제공된 PROMINIA 플랫폼을 사용하여 추가로 분석될 수 있다. PROMINIA 플랫폼은 질환의 분자 묘사를 식별하기 위해 임의의 인간 질환의 단백체 서명에 적용될 수 있다. 일부 예에서, PROMINIA 플랫폼은 질환의 분자 묘사를 약물-특이적 분자 프로파일과 일치시켜, 주어진 질환에 대한 치료제(예컨대 FDA-승인되거나 알려진 치료제, 또는 주어진 질환에 대한 신규 치료제)의 식별을 초래한다. 따라서, 일부 측면에서, PROMINIA 플랫폼의 출력물은 생물학적 샘플(예를 들어, 혈장)이 분석된 환자에 대한 치료적 잠재력을 가질 수 있는 약물 히트(drug hit)를 포함한다.
PROMINIA 플랫폼을 사용하기 위해, 단백체 서명은 입력물로서 제공될 수 있고, PROMINIA 플랫폼은 단백체 서명을 분석하기 위한 다수의 상이한 단계를 포함한다. 이들 분석 단계는 (i) 단백체 서명에 고도로 나타낸 세포 구성요소, 분자 경로, 및 신호전달 경로; (ii) 단백체 서명의 단백질을 조절하는 전사 인자 및 키나제; (iii) 단백체 서명의 단백질 중에서 기능적 관계를 설명하는 단백질-단백질 상호작용 네트워크, 뿐만 아니라 이의 하위-네트워크 및 허브; 및 (iv) 단백체 서명의 단백질-단백질 상호작용 네트워크의 허브를 표적하는 것을 포함하는, 단백체 서명의 단백질을 표적하는 알려진 약물 및 신규 약물을 식별하는 단계를 포함할 수 있다.
하기는 예시적인 질환에 대해 식별된 단백체 서명에 대해 수행되었을 때 PROMINIA 플랫폼의 사용을 기재한다. 단백체 서명은 실시예 1에 기재된 발견 단백체학 플랫폼을 사용하여 식별하였다.
A. PROMINIA를 사용하여 예시적인 단백체 서명 분석
실시예 1에 기재된 발견 단백체학 플랫폼을 사용하여, 예시적인 질환에 대한 단백체 서명을 식별하였다. 실시예 1에 기재된 바와 같이 8 명의 예시적인 질환을 갖는 대상체 뿐만 아니라 8 명의 성별 및 연령 일치된 건강한 대조군 대상체로부터 혈장 샘플을 수집하고 처리하였다. 샘플 단백질은 발견 단백체학 플랫폼을 사용하여 식별하였고 질환을 앓는 대상체와 건강한 대상체 사이의 단백질 양을 비교할 때 차등적으로 발현된 단백질의 단백체 서명을 식별하였다. 단백질 양은 샘플을 사용하여 생성된 질량 분광법 데이터(예를 들어, 질량 스펙트럼 플롯)에서 검출된 피크 면적을 정량화함으로써 결정하였다. 단백체 서명은 예시적인 질환에서 상향조절된 단백질 뿐만 아니라 예시적인 질환에서 하향조절된 단백질을 포함하였다.
식별 후, PROMINIA 플랫폼을 사용하여 단백체 서명을 분석하였다. 먼저, 단백체 서명과 연관된 세포 구성요소를 식별하기 위해 단백체 서명을 ToppGene Suite에 삽입하였다(Chen J 등, Nucleic Acids Res, 37:W305-11, 2009). 이 분석은 단백체 서명에서 매우 풍부하고 샘플의 공급원(즉, 혈장)과 매우 관련된 세포 구성요소를 입증하였다. 또한 ToppGene Suite를 사용하여 단백체 서명과 관련된 분자 경로를 식별하였다.
다음으로, 혈장 단백질이 풍부하고 통계적으로 유의한(p<0.05) 신호전달 경로를 식별하기 위해 SPIA R Package(Tarca AL 등, Bioinformatics, 25:75-82, 2009)를 사용하여 단백체 서명을 분석하였다.
단백체 서명을 전사 인자 농축 분석(TFEA, https://github.com/wzthu/enrichTF) 및 키나제 농축 분석(KEA, Lachmann A & Ma'ayan A. Bioinformatics, 25: 684-6, 2009) 알고리즘으로 추가로 분석하여 단백체 서명의 조절자인 각각 전사 인자 및 키나제를 식별하였다.
그런 다음 단백질 서명을 GeneMANIA 알고리즘(Warde-Farley D 등, Nucleic Acids Res, 38:W214-220, 2010)에 삽입하여 단백질 네트워크, 서브네트워크, 및 핵심 서브네트워크의 허브 단백질을 식별하였다. 허브는 질환 세포 및 동물 모델에서 그의 기능적 중요성(예를 들면, 신규 질환 유전자 식별)에 대해 평가될 수 있다. 이 분석은 수백 개의 단백질-단백질 상호작용으로 밀접하게 연결된 단백질 네트워크를 입증하였으며, 이는 단백체 서명의 단백질 사이의 높은 기능적 상호작용 정도를 나타낸다.
궁극적으로, 단백체 서명을 L1000 FWD(Wang Z 등, Bioinformatics, 34: 2150-52, 2018) 알고리즘 및 ILINC(https://www.biorxiv.org/content/10.1101/826271v1) 화학적 혼란 알고리즘에 삽입하여 단백체 서명에서 나타낸 단백질 네트워크의 허브를 표적하는 FDA-승인된 약물 뿐만 아니라 허브를 표적하는 신규 약물을 식별하였다. 이 분석은 단백체 서명을 표적하는 데 사용될 수 있는 약물을 입증하였다. 이들 식별된 약물은 예시적인 질환의 치료에 이미 사용된 것들 뿐만 아니라, 예시적인 질환의 치료에 이전에 사용되지 않았던 것들을 포함하였다. 이들 약물은 발견 단백체 분석이 수행된 환자에 대한 치료제로서 사용될 수 있다. 신규 약물의 치료적 잠재력은 질환 세포 및 동물 모델에서 추가 평가를 위해 선택될 수 있다.
종합하면, 이들 결과는 단백체 서명이 질환-특이적 단백질에 포함되고 발견 단백체학 플랫폼이 단지 약 10-15 μL의 혈장 샘플에서 이들 단백질을 식별하고 정량화하였음을 입증한다. PROMINIA 플랫폼은 예시적인 질환의 발병에 연루된 알려진 경로 및 조절자 뿐만 아니라, 요법에 대해 표적화될 수 있는 신규 경로 및 조절자를 식별하였다. 유사하게, 예시적인 질환에 대해 예시된 바와 같이, PROMINIA 플랫폼은 향후 치료제로서 사용될 수 있는 질환의 치료에서 이전에 사용된 적 없는 신규 약물을 식별하였다. 따라서, 이들 결과는 PROMINIA 플랫폼의 예측력 뿐만 아니라 발견 단백체학 플랫폼의 예측력을 입증한다. 실시예 1에 제시된 바와 같은, 본원에 기재된 방법 및/또는 장치를 사용하여 달성된 샘플로부터 구성요소의 보다 완전한 식별은 PROMINIA를 사용하는 질환 특이적 신호전달 경로 및 분자 네트워크의 식별을 추가로 가능하게 한다.
실시예 3: PROMINIA를 사용하여 관상 동맥 질환(CAD) 서명 분석
하기 실시예는 CAD 단백체 서명을 식별하기 위해 인간 관상 동맥 질환(CAD)의 단백체 서명에 대해 수행되었을 때 PROMINIA 플랫폼의 사용을 기재한다.
실시예 1에 기재된 발견 단백체학 플랫폼을 사용하여, CAD에 대한 단백체 서명을 식별하였다. 실시예 1에 기재된 바와 같이 8 명의 CAD를 앓는 대상체 뿐만 아니라 3 명의 성별 및 연령 일치 건강한 대조군 대상체로부터 혈장 샘플을 수집하고 처리하였다. CAD 연구 참가자의 특성은 표 2에 제시되어 있다.
표 2. CAD 연구 참가자의 특성.
샘플 단백질은 발견 단백체학 플랫폼을 사용하여 식별하였고, 질환을 앓는 대상체와 건강한 대상체 사이의 단백질 양을 비교할 때 차등적으로 발현된 단백질의 단백체 서명을 식별하였다. 샘플을 사용하여 생성된 질량 분광법 데이터(예를 들어, 질량 스펙트럼 플롯)에서 검출된 피크 면적을 정량화함으로써 단백질 양을 결정하였다. 단백체학 연구는 1,407 개의 고유한 단백질 그룹의 정량화를 초래하였다(p<0.05). 292 개의 차등적으로 발현된 단백질의 서명을 건강한 대조군 및 CAD를 앓는 환자로부터 유도된 샘플로부터 단백체 혈장 분석에서 식별하였다. 단백체 서명은 건강한 대조군에 비해 CAD 환자에서 상향조절된 139 개의 단백질 뿐만 아니라 하향조절된 153 개의 단백질을 포함하였다.
A. 292-단백질 CAD 서명과 관련된 ToppGene 소프트웨어 세포 구성요소 및 경로 컴퓨터 분석
식별 후, CAD 환자 및 건강한 개체로부터의 혈장 샘플 분석으로부터 유도된 292 개의 CAD-혈장 단백질 단백체 서명을 PROMINIA 플랫폼을 사용하여 분석하였다. 먼저, CAD 서명과 연관된 세포 구성요소를 식별하기 위해 292-단백질 CAD 서명을 ToppGene Suite(Chen J 등, Nucleic Acids Res, 37:W305-11, 2009)에 삽입하였다. 이 분석은 단백체 서명에 매우 풍부하고 샘플의 공급원(즉, 혈장)과 관련성이 높은 세포 구성요소를 입증하였다. 혈액 미립자, 세포외 매트릭스, 분비 소포 및 소포 내강 세포 구획과 관련된 가장 풍부한 경로는 모두 테스트된 샘플의 실제 공급원과 관련성이 높다(도 6). 또한 ToppGene Suit를 사용하여 292-단백질 CAD 서명과 관련된 분자 경로를 식별하였다. 면역계 관련(호중구, 혈소판, 보체) 경로, 세포외 매트릭스, 및 칼슘-관련 경로는 292-단백질 CAD 서명에 매우 풍부하였다(도 7).
이들 데이터는 특이적 292-단백질 CAD 서명이 "바이오마커" 능력을 가질 뿐만 아니라 CAD 질환의 병리생물학과 관련한 단백질 서명임을 보여준다.
B. 292-단백질 CAD 서명과 관련된 SPIA 알고리즘-식별된 신호전달 경로
다음으로, 신호전달 경로 영향 분석(SPIA) R 패키지(Tarca AL 등, Bioinformatics, 25:75-82, 2009)를 사용하여 292-단백질 CAD 서명을 분석하여 CAD 발병 및 병리생물학과 상관관계가 있는 혈장 단백질이 풍부하고 통계적으로 유의한(p<0.05) 신호전달 경로를 식별하였다. 표 3에 제시된 바와 같이, 분석은 CAD와 관련된 발병 분자 메커니즘과 매우 관련된 신호전달 경로를 식별하였다.
표 3. CAD에서 차등적으로 발현된 단백질에 대한 SRIA 풍부 경로(p<0.05).
이들 경로는 2 가지 주요 그룹으로 구분될 수 있다; 첫번째 그룹은 칼슘, cAMP, β-아드레날린성 및 스핑고지질 신호전달 경로와 같은 심혈관 관련 경로를 포함한다. 두번째 그룹은 보체, HIF1, 자연 살해 면역 세포, 및 아디포사이토카인 신호전달 경로와 같은 면역 관련 경로를 포함한다.
종합하면, 이들 데이터는 혈장 혈액 단백체 기술의 힘 및 또한 무작위 또는 대용 바이오마커 뿐만 아니라 CAD 발병에 매우 특이적인 단백질을 식별하기 위한 특이적 292-단백질 CAD 서명의 가치를 입증한다.
C. 292-단백질 CAD 서명과 관련된 전사 인자 농축 분석(TFEA) 알고리즘 및 키나제 농축 분석
292-단백질 CAD 서명을 전사 인자 농축 분석(TFEA, https://github.com/wzthu/enrichTF) 알고리즘으로 추가로 분석하여 292-단백질 CAD 서명의 조절자인 각각 전사 인자 및 키나제를 식별하였다. 분석은 292-단백질 CAD 네트워크에서 풍부한 20 개의 전사 인자를 입증하였다(도 8). CAD DEP 네트워크를 조절하는 것으로 식별된 상위 3 개의 전사 인자는 HNF4A, FOXA2, 및 LMO2였다. HNF4A 및 FOXA2는 둘 다 간 및 일반적으로 위장관에서 주로 발현되는 전사 인자이다.
집합적으로, CAD 발병과 매우 관련되고 292-단백질 서명의 핵심 조절자인 전사 인자의 식별은 식별된 단백질 서명과 CAD 발병의 상관관계를 시사한다.
다음으로, 292-단백질 CAD 서명을 키나제 농축 분석(KEA, Lachmann A & Ma'ayan A. Bioinformatics, 25: 684-6, 2009)에 삽입하여 CAD 서명을 잠재적 키나제 조절자와 연결하였다. 292 개의 CAD 단백질의 입력 목록과 연관된 것으로 밝혀진 키나제-기질 비율의 분포에 기반하여 키나제 농축 확률을 계산하기 위해 상이한 키나제-기질 데이터베이스를 사용하였다. 20 개의 단백질이 292-단백질 CAD 서명에서 통계적으로 유의하게 풍부하였다(도 9). 292-단백질 CAD 네트워크를 조절하는 것으로 예측된 상위 2 개의 키나제는 HIPK2 및 MAPK1이었다.
전사 인자 및 키나제 농축 분석은 혈장 단백체 분석이 CAD를 식별하는 예측 능력이 있는 단백질 서명을 식별하는 능력 외에도, CAD 병리생물학과 관련될 수 있는 신규 유전자의 식별에 또한 기여할 수 있음을 입증하였다.
D. 292-단백질 CAD 서명의 단백질-단백질 상호작용 네트워크로의 조직화 및 주요 서브네트워크와 서브네트워크 내 핵심 허브의 식별
그런 다음 292-단백질 CAD 서명을 GeneMANIA 알고리즘(Warde-Farley D 등, Nucleic Acids Res, 38:W214-220, 2010)에 삽입하여 단백질 네트워크를 식별하였다. 질의 단백질 및 예측 단백질 중에서 기능적 관계의 예측 네트워크를 예측된 공발현, 공국소화, 유전적 상호작용, 물리적 상호작용, 예측 및 공유 단백질 도메인 데이터에 기반하여 식별하였다. 도 10에 제시된 바와 같이, 분석은 긴밀한 단백질 네트워크 및 수백개의 단백질-단백질 상호작용을 입증하였으며, 이는 292 개의 CAD 단백질 사이의 기능적 유의성 및 상호작용을 시사한다.
단백질 서브네트워크 분석을 수행하여 또한 핵심 서브네트워크의 허브 단백질을 식별하였다. 허브를 질환 세포 및 동물 모델에서 기능적 중요성(예를 들면, 신규 질환 유전자 식별)에 대해 평가하였다. 분석은 다음 9 개의 서브네트워크를 식별하였다: a) 보체 서브네트워크(허브 단백질: C5)(도 11); b) 히스톤 조절 서브네트워크(허브 단백질: PHF13)(도 12); c) DNA 손상 서브네트워크(허브 단백질: SETX)(도 13); d) 칼슘 에너지 서브네트워크(허브 단백질: ATP2A1)(도 14); e) 대사체학 서브네트워크(허브 단백질: GPLD1)(도 15); f) 세포 부착 서브네트워크(허브 단백질: INPP5D)(도 16); g) 염증 서브네트워크(허브 단백질: JAK1)(도 17); h) 저산소증 서브네트워크(허브 단백질: HIF1A)(도 18) 및 i) 히스톤 메틸화 서브네트워크(허브 단백질: KDM5D)(도 19).
면역 관련, 대사 관련, 저산소증 관련, 및 히스톤 관련 서브네트워크는 292-단백질 CAD 서명에서 매우 풍부하다. 염증, 저산소증, 및 대사의 역할이 잘 알려져 있고 CAD 발병에 연루되는 것으로 설명되어 있지만, 데이터는 히스톤 조절 유전자, 이러한 PHF13, JARID2, 및 ARID3B가 CAD 병리생물학에 연루될 수 있음을 최초로 입증한다.
종합하면, 이 분석은 수백 개의 단백질-단백질 상호작용으로 밀접하게 연결된 단백질 네트워크를 입증하였으며, 이는 단백체 서명의 단백질 중에서 높은 기능적 상호작용 정도를 나타낸다. 이러한 발견은 PROMINIA 플랫폼이 또한 질환의 발병 및 혈장을 가져온 환자에 연루된 신규 유전자를 입증할 수 있음을 시사한다.
E. 약물 - CAD 단백질 네트워크 분석은 292-단백질 CAD 네트워크를 표적으로 하여 CAD에서 치료적 잠재력을 가질 수 있는 알려진 신규 약물을 입증한다
궁극적으로, 단백체 서명을 L1000 FWD(Wang Z 등, Bioinformatics, 34: 2150-52, 2018) 알고리즘에 삽입하여 292-단백질 CAD 서명에서 나타낸 단백질 네트워크의 허브를 표적하는 FDA-승인된 약물을 식별하였다. 이 분석은 Norvasc®(칼슘 채널 차단제), 투바스타틴 A(HDAC6 억제제), 포르스콜린(천연 산물), 트리코스타틴 A(HDAC 억제제), KN-93(CaMK II 억제제), CFM-1571(구아닐릴 사이클라제 활성제), Galardin®(메탈로프로테이아제 억제제) 및 Crestor®(로수바스타틴)을 포함하는, 292-단백질 CAD 네트워크(도 20a)를 표적하는 데 사용될 수 있는 8 개의 약물(p<0.001)을 입증하였다(도 20b). 이러한 식별된 약물은 CAD의 치료에 이미 사용된 것들(예를 들어, Norvasc® 및 Crestor®) 뿐만 아니라 CAD의 치료에 이전에 사용된 적 없는 것들(예를 들어, 투바스타틴 A)을 포함하였다. 이들 결과는 발견 단백체 분석이 수행된 환자에 대한 치료제로서 사용하기 위한 약물의 식별을 입증한다.
ILINC(https://www.biorxiv.org/content/10.1101/826271v1) 화학적 혼란 알고리즘을 사용하여 CAD 환자에 대한 치료적 잠재력을 가질 수 있는 허브를 표적하는 신규 약물을 식별하였다. 이 분석은 292-단백질 CAD 서명을 표적하는 상위 약물 중 하나로서 HDAC6 억제제이기도 한 CAY-10603(도 21)을 식별하였으며, 이는 이 범주의 후생적 약물이 CAD 환자에 대한 치료적 잠재력을 가질 수 있음을 시사한다.
종합하면,이들 결과는 292-단백질 CAD 서명이 CAD-특이적 단백질을 포함하였고 발견 단백체학 플랫폼이 단지 약 10-15 μL의 혈장 샘플에서 이들 단백질을 식별하고 정량화하였음을 입증한다. PROMINIA 플랫폼은 CAD의 발병에 연루된 알려진 경로 및 조절자 뿐만 아니라, CAD 요법에 표적될 수 있는 신규 경로 및 조절자를 식별하였다. 유사하게, PROMINIA 플랫폼은 치료제로서 사용될 수 있는 CAD의 치료에 이전에 사용된 적 없는 신규 약물을 식별하였다. 따라서, 이들 결과는 PROMINIA 플랫폼의 예측력 뿐만 아니라 발견 단백체학 플랫폼의 예측력을 입증한다. 실시예 1에 제시된 바와 같은, 본원에 기재된 방법 및/또는 장치를 사용하여 달성된 샘플로부터 구성요소의 보다 완전한 식별은 PROMINIA를 사용하여 질환 특이적 신호전달 경로 및 분자 네트워크의 식별을 추가로 가능하게 한다. 이러한 분석을 반복하였고 이 작업 흐름이 재현가능한 결과를 제공한다는 것을 입증하는 292-단백질 CAD 서명을 확인하였다. 292-단백질 CAD 서명은 모든 식별된 바이오마커를 측정하는 것의 비호환성 및 실행가능성 부족으로 인해 ELISA 또는 Luminox와 같은 다른 기술에 의해 독립적으로 검증되지 않았다.
본 발명은 예를 들어, 본 발명의 다양한 측면을 예시하기 위해 제공된 특정 개시된 구현예로 범위를 제한하려는 것으로 의도되지 않는다. 기재된 조성물 및 방법에 대한 다양한 변형은 본원의 설명 및 교시로부터 명백해질 것이다. 이러한 변경은 본 개시내용의 진정한 범위 및 취지로부터 벗어나지 않고 실시될 수 있으며 본 개시내용의 범위 내에 속하는 것으로 의도된다.

Claims (261)

  1. 질량 분광법 분석을 위한 테스트 샘플을 처리하는 방법으로서,
    (a) 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 미세유체 장치를 사용하여 테스트 샘플을 SEC 기술에 적용하되,
    상기 테스트 샘플은 하나 이상의 생체분자 및 카오트로픽제를 포함하고,
    상기 SEC 미세유체 장치는 복수의 상호연결된 채널을 포함하는 것인, 단계;
    (b) SEC 미세유체 장치로부터 용출된 복수의 분획을 수집하는 단계;
    (c) SEC 미세유체 장치로부터의 복수의 분획 중 하나 이상을 단백질분해 기술에 적용하는 단계; 및
    (d) 단계 (b) 및 (c) 중 하나 또는 둘 다로부터의 하나 이상의 분획을 질량 분광계에 도입하기 위한 하나 이상의 분획 각각의 구성요소를 제조하기 위한 조건 하에 역상 액체 크로마토그래피(RPLC) 미세유체 장치를 사용하여 RPLC 기술에 개별적으로 적용하되,
    상기 RPLC 미세유체 장치는 역상 매질을 포함하는 복수의 상호연결된 채널을 포함하고,
    상기 RPLC 미세유체 장치는 전기분무 이온화 소스에 결합되는 것인 단계를 포함하는 것인, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 테스트 샘플이 생물학적 샘플인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 테스트 샘플이 개체로부터 유래되는 것인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 테스트 샘플이 약 5 M 내지 약 8 M의 카오트로픽제의 농도를 갖는 것인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 카오트로픽제가 구아니딘 또는 이의 염, 구아니디늄 또는 이의 염, 칼륨 또는 이의 염, 리튬 또는 이의 염, 마그네슘 또는 이의 염, 또는 나트륨 또는 이의 염을 포함하는 것인, 방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 카오트로픽제가 구아니딘 하이드로클로라이드 또는 구아니디늄 클로라이드인, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 테스트 샘플 내 카오트로픽제가 액체 고정액으로부터 유래되는 것인, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 테스트 샘플이 약 5% 내지 약 40%의 점도 개질제의 농도를 갖는 것인, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 점도 개질제가 글리세롤인, 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 테스트 샘플이 적어도 약 6 M 구아니딘 및 약 10% 내지 약 30% 글리세롤을 포함하는 것인, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치를 사용하여 SEC 기술에 적용된 테스트 샘플이 약 1 μL 내지 약 200 μL의 부피를 갖는 것인, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SEC 기술의 이동상 카오트로픽제의 농도 범위가 테스트 샘플의 카오트로픽제의 미리 결정된 농도의 약 +/- 40% 이내인, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SEC 기술이 테스트 샘플 내 카오트로픽제 범위 내에서 이동상 카오트로픽제의 농도를 갖는 SEC 이동상의 사용을 포함하는 것인, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SEC 기술의 이동상 카오트로픽제가 테스트 샘플의 카오트로픽제와 동일한 것인, 방법.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SEC 기술의 이동상 카오트로픽제가 테스트 샘플의 카오트로픽제와 상이한 것인, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SEC 이동상이 약 4 M 내지 약 8 M의 농도에서 이동상 카오트로픽제를 포함하는 것인, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SEC 기술의 이동상 카오트로픽제가 구아니딘 또는 이의 염, 구아니디늄 또는 이의 염, 리튬 또는 이의 염, 마그네슘 또는 이의 염, 또는 나트륨 또는 이의 염을 포함하는 것인, 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SEC 기술의 이동상 카오트로픽제가 구아니딘 하이드로클로라이드, 구아니디늄 클로라이드, 구아니디늄 티오시난트, 리튬 퍼클로레이트, 리튬 아세테이트, 마그네슘 클로라이드, 칼륨 아세테이트, 및 나트륨 요오다이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SEC 이동상이 이동상 점도 개질제를 포함하는 것인, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 SEC 기술의 이동상 점도 개질제가 약 5% 내지 약 40%의 농도를 갖는 것인, 방법.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 점도 개질제가 글리세롤인, 방법.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SEC 기술의 이동상 점도 개질제가 액체 고정액의 점도 개질제와 동일한 것인, 방법.
  23. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SEC 기술의 이동상 점도 개질제가 액체 고정액의 점도 개질제와 상이한 것인, 방법.
  24. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 테스트 샘플이 적어도 약 6 M 구아니딘 및 약 10% 내지 약 30% 글리세롤을 포함하는 것인, 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SEC 기술이 등용매 SEC 기술인, 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SEC 기술이 약 1 μL/ 분 내지 약 5 μL/ 분의 이동상 유속의 사용을 포함하는 것인, 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SEC 기술이 고온에서 수행되는 것인, 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SEC 기술이 약 45℃ 내지 약 60℃의 온도에서 수행되는 것인, 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 SEC 기술이 실질적으로 일관된 온도에서 수행되는 것인, 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치가 SEC 매질을 포함하는 것인, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 SEC 매질이 약 10 nm 내지 약 500 nm의 평균 기공 크기를 갖는 물질인, 방법.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 SEC 매질이 복수의 상호연결된 채널 각각의 내부 표면인, 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널의 내부 표면 물질이 약 0.5 μm 내지 약 2 μm의 두께를 갖는 것인, 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널이 개방 관형 형식으로 구성되는 것인, 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널이 8 개 이상의 상호연결된 채널을 포함하는 것인, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널이 32 개의 상호연결된 채널을 포함하는 것인, 방법.
  37. 제35항에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널이 64 개의 상호연결된 채널을 포함하는 것인, 방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각이 연결 채널의 상류 네트워크를 통해 SEC 미세유체 장치의 입력 포트와 유체 연통하는 것인, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 연결 채널의 상류 네트워크, 또는 이의 부분이 복수의 상호연결된 채널 각각의 근위 영역에 연결되는 것인, 방법.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 상기 연결 채널의 상류 네트워크가 유체 유동을 SEC 미세유체 장치의 입력 포트로부터 복수의 상호연결된 채널 각각으로 분할하도록 구성된 일련의 발산 채널을 포함하는 것인, 방법.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각이 연결 채널의 하류 네트워크를 통해 SEC 미세유체 장치의 출력 포트와 유체 연통하는 것인, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 연결 채널의 하류 네트워크, 또는 이의 부분이 복수의 상호연결된 채널 각각의 원위 영역에 연결되는 것인, 방법.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 상기 연결 채널의 하류 네트워크가 유체 유동을 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널로부터 출력 포트에 조합하도록 구성된 일련의 수렴 채널을 포함하는 것인, 방법.
  44. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널이 연결 채널의 상류 네트워크 또는 연결 채널의 하류 네트워크를 통해서만 연결되는 것인, 방법.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각이 약 2 cm 내지 약 50 cm의 길이를 갖는 것인, 방법.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각이 약 1 μm 내지 약 15 μm의 폭을 갖는 것인, 방법.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각이 약 1 μm 내지 약 15 μm의 깊이를 갖는 것인, 방법.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널이 기둥 배열을 통해 형성되는 것인, 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 기둥 배열이 무정형 기둥 배열인, 방법.
  50. 제48항에 있어서, 상기 기둥 배열이 비-무정형 기둥 배열인, 방법.
  51. 제32항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기둥 배열이 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각의 내부 표면을 형성하는 것인, 방법.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치가 석영 기판을 포함하는 것인, 방법.
  53. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치가 복수의 상호연결된 채널을 형성하는 모놀리식 기판을 포함하는 것인, 방법.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치가 석영 모놀리식 기판을 포함하는 것인, 방법.
  55. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치가 3차원(3D) 인쇄 기판을 포함하는 것인, 방법.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치로부터 용출된 복수의 분획을 수집하는 것이 분획 수집기를 사용하여 수행되는 것인, 방법.
  57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 분획 각각이 시간에 기반하여 SEC 미세유체 장치로부터 수집되는 것인, 방법.
  58. 제57항에 있어서, 상기 복수의 분획 각각이 약 30 초 내지 약 5 분의 기간 동안 SEC 미세유체 장치로부터 수집되는 것인, 방법.
  59. 제57항 또는 제58항에 있어서, 상기 복수의 분획 각각이 균일한 시간 동안 SEC 미세유체 장치로부터 수집되는 것인, 방법.
  60. 제47항 또는 제58항에 있어서, 상기 복수의 분획 중 일부가 복수의 분획 중 또 다른 분획과 상이한 시간 동안 SEC 미세유체 장치로부터 수집되는 것인, 방법.
  61. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 분획 각각이 SEC 미세유체 장치로부터의 용출액의 부피에 기반하여 SEC 미세유체 장치로부터 수집되는 것인, 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치로부터 수집된 복수의 분획 각각이 약 1 μL 내지 약 20 μL의 부피를 갖는 것인, 방법.
  63. 제61항 또는 제62항에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치로부터 수집된 복수의 분획 각각이 균일한 부피를 갖는 것인, 방법.
  64. 제62항 또는 제63항에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치로부터 수집된 복수의 분획 중 일부가 복수의 분획 중 또 다른 분획과 상이한 부피를 갖는 것인, 방법.
  65. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 분획이 약 5 내지 약 50 개의 분획인, 방법.
  66. 제65항에 있어서, 상기 복수의 분획이 약 12 내지 약 24 개의 분획인, 방법.
  67. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질분해 기술이 효소-기반 분해 기술을 포함하는 것인, 방법.
  68. 제67항에 있어서, 상기 효소-기반 분해 기술이 트립신, 키모트립신, 펩신, LysC, LysN, AspN, GluC 및 ArgC, 또는 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 효소의 사용을 포함하는 것인, 방법.
  69. 제67항 또는 제68항에 있어서, 상기 효소-기반 분해 기술이 SEC 미세유체 장치로부터 용출된 분획을 희석하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  70. 제69항에 있어서, 상기 희석 단계가 SEC 미세유체 장치로부터 용출된 분획을 물과 혼합하여 카오트로픽제의 농도에 도달하는 것을 포함하는 것인, 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 효소적 분해를 위한 카오트로픽제 농도의 최종 농도가 약 0.5 M인, 방법.
  72. 제67항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소-기반 분해 기술이 완충액 교환 단계를 포함하지 않는 것인, 방법.
  73. 제67항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소-기반 분해 기술이 알킬화 단계를 포함하지 않는 것인, 방법.
  74. 제67항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소-기반 분해 기술이 환원 단계를 포함하지 않는 것인, 방법.
  75. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질분해 기술이 비-효소-기반 접근법을 포함하는 것인, 방법.
  76. 제1항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 SEC 미세유체 장치로부터의 복수의 분획 중 하나 이상 및/또는 단백질분해 기술에 적용된 복수의 분획 중 하나 이상을 정량적 표지화 기술에 적용하는 단계를 추가로 포함하되, 상기 정량적 표지화 기술은 RPLC 미세유체 장치를 사용하여 역상 액체 크로마토그래피(RPLC) 기술 전에 수행되는 것인, 방법.
  77. 제76항에 있어서, 상기 정량적 표지화 기술이 등압 질량 태그의 사용을 포함하는 것인, 방법.
  78. 제76항 또는 제77항에 있어서, 상기 정량적 표지화 기술이 탠덤 질량 태그(TMT)의 사용을 포함하는 것인, 방법.
  79. 제76항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정량적 표지화 기술이 탈염 단계를 포함하는 것인, 방법.
  80. 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 내부 표준을 SEC 미세유체 장치로부터의 복수의 분획 중 하나 이상 및/또는 단백질분해 기술에 적용된 복수의 분획 중 하나 이상과 혼합하는 단계를 추가로 포함하되, 상기 내부 표준의 혼합은 RPLC 미세유체 장치를 사용하여 역상 액체 크로마토그래피(RPLC) 기술 전에 수행되는 것인, 방법.
  81. 제79항에 있어서, 상기 내부 표준이 동위원소 표지된 펩티드인, 방법.
  82. 제1항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPLC 기술에 적용된 하나 이상의 분획이 (i) SEC 미세유체 장치로부터 수득된 0 개 이상의 분획; 및 (ii) 단백질분해 기술에 적용된 복수의 분획 중 하나 이상으로부터 수득된 하나 이상의 분획, 또는 이의 부분을 포함하는 것인, 방법.
  83. 제1항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPLC 기술에 적용된 하나 이상의 분획 각각이 수용액과 혼합된 각각의 기원 분획을 포함하는 것인, 방법.
  84. 제1항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPLC 기술에 적용된 분획이 약 1 μL 내지 약 50 μL의 부피를 갖는 것인, 방법.
  85. 제1항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPLC 기술이 RPLC 이동상의 사용을 포함하는 것인, 방법.
  86. 제85항에 있어서, 상기 RPLC 기술이 약 0.05 μL/ 분 내지 약 2 μL/ 분의 RPLC 이동상의 이동상 유속을 포함하는 것인, 방법.
  87. 제1항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPLC 기술이 구배 RPLC 기술인, 방법.
  88. 제1항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPLC 기술이 고온에서 수행되는 것인, 방법.
  89. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPLC 기술이 약 30℃ 내지 약 100℃의 온도에서 수행되는 것인, 방법.
  90. 제88항 또는 제89항에 있어서, 상기 RPLC 기술이 실질적으로 일관된 온도에서 수행되는 것인, 방법.
  91. 제1항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 역상 매질이 다음 알킬 모이어티: C2, C4, C8, 및 C18 중 2 개 이상을 포함하는 RPLC 모이어티 혼합물을 포함하는 것인, 방법.
  92. 제91항에 있어서, 상기 RPLC 모이어티 혼합물이 다음 알킬 모이어티: C2, C4, C8, 및 C18 중 3 개 이상을 포함하는 것인, 방법.
  93. 제91항에 있어서, 상기 RPLC 모이어티 혼합물이 다음 알킬 모이어티: C2, C4, C8, 및 C18을 포함하는 것인, 방법.
  94. 제91항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPLC 모이어티 혼합물의 알킬 모이어티가 등몰량으로 존재하는 것인, 방법.
  95. 제91항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPLC 모이어티 혼합물의 알킬 모이어티가 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각의 표면에 공유적으로 결합되는 것인, 방법.
  96. 제95항에 있어서, 상기 복수의 상호연결된 채널 각각의 표면이 실리카(SiO2)를 포함하는 것인, 방법.
  97. 제1항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널이 8 개 이상의 상호연결된 채널을 포함하는 것인, 방법.
  98. 제97항에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널이 32 개의 상호연결된 채널을 포함하는 것인, 방법.
  99. 제97항에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널이 64 개의 상호연결된 채널을 포함하는 것인, 방법.
  100. 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각이 연결 채널의 상류 네트워크를 통해 RPLC 미세유체 장치의 입력 포트와 유체 연통하는 것인, 방법.
  101. 제100항에 있어서, 상기 연결 채널의 상류 네트워크, 또는 이의 부분이 복수의 상호연결된 채널 각각의 근위 영역에 연결되는 것인, 방법.
  102. 제100항 또는 제101항에 있어서, 상기 연결 채널의 상류 네트워크가 유체 유동을 RPLC 미세유체 장치의 입력 포트로부터 복수의 상호연결된 채널 각각으로 분할하도록 구성된 일련의 발산 채널을 포함하는 것인, 방법.
  103. 제1항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각이 연결 채널의 하류 네트워크를 통해 RPLC 미세유체 장치의 출력 포트와 유체 연통하는 것인, 방법.
  104. 제103항에 있어서, 상기 연결 채널의 하류 네트워크, 또는 이의 부분이 복수의 상호연결된 채널 각각의 원위 영역에 연결되는 것인, 방법.
  105. 제103항 및 제104항에 있어서, 상기 연결 채널의 하류 네트워크가 유체 유동을 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널로부터 출력 포트로 조합하도록 구성된 일련의 수렴 채널을 포함하는 것인, 방법.
  106. 제103항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널이 연결 채널의 상류 네트워크 또는 연결 채널의 하류 네트워크를 통해서만 연결되는 것인, 방법.
  107. 제1항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각이 약 2 cm 내지 약 50 cm의 길이를 갖는 것인, 방법.
  108. 제1항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각이 약 1 μm 내지 약 15 μm의 폭을 갖는 것인, 방법.
  109. 제1항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각이 약 1 μm 내지 약 15 μm의 깊이를 갖는 것인, 방법.
  110. 제1항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널이 기둥 배열을 통해 형성되는 것인, 방법.
  111. 제110항에 있어서, 상기 기둥 배열이 무정형 기둥 배열인, 방법.
  112. 제110항에 있어서, 상기 기둥 배열이 비-무정형 기둥 배열인, 방법.
  113. 제110항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기둥 배열이 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각의 내부 표면을 포함하여 형성되는 것인, 방법.
  114. 제1항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치가 온라인 전환 특징부를 포함하는 것인, 방법.
  115. 제114항에 있어서, 상기 온라인 전환 특징부가 밸브 및/또는 채널인, 방법.
  116. 제114항 또는 제115항에 있어서, 상기 온라인 전환 특징부가 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널과 전기분무 이온화 장치 사이에 위치하는 것인, 방법.
  117. 제1항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치가 석영 기판을 포함하는 것인, 방법.
  118. 제1항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치가 복수의 상호연결된 채널을 형성하는 모놀리식 기판을 포함하는 것인, 방법.
  119. 제1항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치가 석영 모놀리식 기판을 포함하는 것인, 방법.
  120. 제1항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치가 3차원(3D) 인쇄 기판을 포함하는 것인, 방법.
  121. 제1항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치가 개방 관형 형식으로 구성되는 것인, 방법.
  122. 제1항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치가 온라인 탈염을 위해 구성되는 것인, 방법.
  123. 제1항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전기분무 이온화 소스가 나노-전기분무 이온화 소스인, 방법.
  124. 제1항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전기분무 이온화 소스가 가열된 전기분무 이온화 소스인, 방법.
  125. 제1항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 혈액 샘플, 뇌척수액(CSF) 샘플, 복수 샘플, 정액 샘플, 및 유두 흡입액 샘플로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  126. 제1항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 약 10 μL 내지 약 200 μL의 부피를 갖는 것인, 방법.
  127. 제1항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 혈액 샘플인, 방법.
  128. 제1항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 개체로부터의 샘플이 혈액 샘플일 때, 방법이 혈장 샘플을 제조하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  129. 제128항에 있어서, 상기 혈장 샘플을 제조하는 단계가 혈액 샘플을 혈장 생성 기술에 적용하는 것을 포함하는 것인, 방법.
  130. 제129항에 있어서, 상기 혈장 생성 기술이 샘플을 폴리술폰 매질에 적용하는 것을 포함하는 것인, 방법.
  131. 제130항에 있어서, 상기 폴리술폰 매질이 비대칭 폴리술폰 물질인, 방법.
  132. 제129항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈장 생성 기술이 모세관 작용 여과 기술인, 방법.
  133. 제129항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈장 생성 기술에 적용된 혈액 샘플의 부피가 약 10 μL 내지 약 200 μL인, 방법.
  134. 제129항 내지 제133항 중 어느 한 항에 있어서, 생성된 혈장 샘플을 액체 고정액과 혼합하여 테스트 샘플을 생성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  135. 제134항에 있어서, 상기 테스트 샘플이 SEC 기술에 테스트 샘플을 적용하기 전에 추가로 고갈되지 않는 것인, 방법.
  136. 제129항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈장 생성 기술이 주위 온도에서 수행되는 것인, 방법.
  137. 제129항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 혈장 생성 기술 전에 고갈 단계에 적용되지 않았던 것인, 방법.
  138. 제1항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, RPLC 미세유체 장치로부터 용출된 구성요소, 또는 이의 생성물을 질량 분광계에 적용하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  139. 제138항에 있어서, 질량 분광계를 사용하여 샘플의 구성요소, 또는 이의 생성물의 질량 분광법 분석을 수행하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  140. 제139항에 있어서, 상기 질량 분광법 분석이 RPLC 미세유체 장치를 사용하여 RPLC 기술에 적용된 각각의 분획의 분석을 포함하는 것인, 방법.
  141. 제139항 또는 제140항에 있어서, 상기 질량 분광법 분석이 RPLC 미세유체 장치를 사용하여 RPLC 기술에 적용된 각각의 분획에 대해 질량 분광계로부터 수득된 정보를 포함하는 하나 이상의 데이터 세트를 수득하는 것을 포함하는 것인, 방법.
  142. 제141항에 있어서, 상기 단일 데이터 세트가 RPLC 미세유체 장치를 사용하여 RPLC 기술에 적용된 단일 분획으로부터 질량 분광계로부터 수득된 정보를 포함하는 것인, 방법.
  143. 제141항 또는 제142항에 있어서, 상기 하나 이상의 데이터 세트 각각이 질량 분광계에 도입된 구성요소, 또는 이의 생성물의 이온에 대한 질량 대 전하(m/z) 및 존재비 정보를 포함하는 것인, 방법.
  144. 제1항 내지 제143항의 방법 중 어느 하나로부터 수득된 조성물 집합으로서, 상기 조성물 집합의 각 조성물이 RPLC 미세유체 장치 용출액인, 조성물 집합.
  145. 질량 분광법을 사용하여 조성물 집합을 분석하는 방법으로서,
    (a) 조성물 집합의 각 조성물을 질량 분광계에 적용하는 단계; 및
    (b) 조성물 집합의 각 조성물의 질량 분광법 분석을 수행하는 단계를 포함하며,
    상기 조성물 집합은 SEC 미세유체 장치의 사용을 포함하는 SEC 기술을 사용하여 테스트 샘플의 분획화 후 각 분획, 또는 이의 생성물을 RPLC 미세유체 장치의 사용을 포함하는 RPLC 기술에 적용하는 것을 포함하는 처리 기술로부터 수득되는 것인, 방법.
  146. 제145항에 있어서, 상기 SEC 분획이 단백질분해 기술을 통해 추가로 처리되는 것인, 방법.
  147. 제141항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 데이터 세트 중 적어도 하나에 기반하여, 테스트 샘플에서 복수의 하나 이상의 생체분자 각각의 정체성을 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  148. 제141항 내지 제143항 및 제147항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 데이터 세트 중 적어도 하나에 기반하여, 테스트 샘플에서 복수의 하나 이상의 생체분자 각각의 양을 측정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  149. 제147항 또는 제148항에 있어서, 결정된 정체성으로부터 하나 이상의 식별된 생체분자를 포함하는 서명을 식별하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  150. 제149항에 있어서, 상기 식별 단계가 하나 이상의 식별된 생체분자의 측정량에 기반하여 하나 이상의 식별된 생체분자의 하위집합을 선택하는 것을 추가로 포함하는 것인, 방법.
  151. 제148항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 식별된 생체분자의 하위집합이 참조 샘플과 비교하여 하나 이상의 식별된 생체분자의 차등 측정량에 기반하여 선택되는 것인, 방법.
  152. 제141항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 식별된 생체분자를 포함하는 서명을 식별하는 단계를 추가로 포함하되, 식별 단계가
    하나 이상의 데이터 세트 중 적어도 하나에 기반하여, 테스트 샘플에서 복수의 하나 이상의 생체분자 각각의 양을 측정하는 단계;
    측정량에 기반하여 샘플에서 복수의 하나 이상의 생체분자의 하위집합을 선택하는 단계; 및
    테스트 샘플에서 복수의 하나 이상의 생체분자의 하위집합 각각의 정체성을 결정하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  153. 제152항에 있어서, 상기 테스트 샘플에서 복수의 하나 이상의 생체분자의 하위집합이 참조 샘플과 비교하여 테스트 샘플에서 복수의 하나 이상의 생체분자의 차등 측정량에 기반하여 선택되는 것인, 방법.
  154. 제151항 또는 제153항에 있어서, 상기 테스트 샘플이 병을 앓는 대상체로부터의 샘플이고 참조 샘플이 건강한 대상체 또는 대조군 대상체로부터의 샘플인, 방법.
  155. 제151항 또는 제153항에 있어서, 상기 테스트 샘플이 질환과 관련된 이전 병태를 앓는 대상체로부터의 샘플이고 참조 샘플이 건강한 대상체 또는 대조군 대상체로부터의 샘플인, 방법.
  156. 제151항 또는 제153항에 있어서, 상기 테스트 샘플이 활성 상태의 질환을 앓는 대상체로부터의 샘플이고 참조 샘플이 비활성 상태의 질환을 앓는 대상체로부터의 샘플이되, 임의적으로 상기 비활성 상태는 관해인, 방법.
  157. 제151항 또는 제153항에 있어서, 상기 테스트 샘플이 진행된 단계의 질환을 앓고 있는 대상체로부터의 샘플이고 참조 샘플이 초기 단계의 질환을 앓고 있는 대상체로부터의 샘플인, 방법.
  158. 제149항 내지 제157항 중 어느 한 항의 방법에 의해 식별된 복수의 식별된 생체분자 또는 이의 하위집합을 포함하는 서명.
  159. 제150항 내지 제158항 중 어느 한 항의 방법에 의해 식별된 식별된 생체분자의 하위집합을 포함하는 서명.
  160. 제147항 내지 제157항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스, 경로 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스, 및/또는 네트워크 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스에 입력물로서 서명의 식별된 생체분자의 전부 또는 하위집합을 제공하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  161. 샘플의 생체분자를 분석하는 방법으로서, 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스, 경로 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스, 및/또는 네트워크 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스에 입력물로서 제158항 또는 제159항의 서명의 식별된 생체분자를 제공하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  162. 제160항 또는 제161항에 있어서, 상기 서명의 하나 이상의 분자 유형의 식별된 생체분자가 입력물로서 제공되는 것인, 방법.
  163. 제162항에 있어서, 상기 하나 이상의 분자 유형이 단백질을 포함하는 것인, 방법.
  164. 제163항에 있어서, 상기 하나 이상의 분자 유형이 단백질로만 이루어지는 것인, 방법.
  165. 제160항 내지 제164항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스가 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 유전자 온톨로지를 식별하도록 구성된 프로세스를 포함하는 것인, 방법.
  166. 제160항 내지 제165항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스가
    입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 세포 구성요소 유전자 온톨로지를 식별하도록 구성된 프로세스;
    입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 분자 경로 유전자 온톨로지를 식별하도록 구성된 프로세스; 및/또는
    입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 생물학적 프로세스 유전자 온톨로지를 식별하도록 구성된 프로세스를 포함하는 것인, 방법.
  167. 제160항 내지 제166항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스가 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나의 하나 이상의 조절자를 식별하도록 구성된 프로세스를 포함하는 것인, 방법.
  168. 제160항 내지 제167항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스가
    입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나를 조절하는 하나 이상의 전사 인자를 식별하도록 구성된 프로세스; 및/또는
    입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나를 조절하는 하나 이상의 키나제를 식별하도록 구성된 프로세스를 포함하는 것인, 방법.
  169. 제160항 내지 제168항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 경로 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스가 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 경로를 식별하도록 구성된 프로세스를 포함하는 것인, 방법.
  170. 제160항 내지 제169항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 경로 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스가
    입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 분자 경로를 식별하도록 구성된 프로세스;
    입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 신호전달 경로를 식별하도록 구성된 프로세스; 및/또는
    입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 대사 경로를 식별하도록 구성된 프로세스를 포함하는 것인, 방법.
  171. 제160항 내지 제170항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 네트워크 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스가 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 네트워크를 식별하도록 구성된 프로세스를 포함하는 것인, 방법.
  172. 제160항 내지 제171항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 네트워크 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스가
    입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 분자 경로를 식별하도록 구성된 프로세스; 및/또는
    입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 신호전달 경로를 식별하도록 구성된 프로세스를 포함하는 것인, 방법.
  173. 제160항 내지 제172항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 네트워크 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스가 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 네트워크의 하나 이상의 허브를 식별하도록 구성된 프로세스를 포함하는 것인, 방법.
  174. 제160항 내지 제173항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 네트워크 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스가 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나를 각각 표적하는 하나 이상의 약물을 식별하도록 구성된 프로세스를 포함하되, 임의적으로 상기 프로세스는 입력물로서 제공된 서명의 복수의 식별된 생체분자를 포함하는 네트워크의 적어도 하나의 허브를 각각 표적하는 하나 이상의 약물을 식별하도록 구성되는 것인, 방법.
  175. 제160항 내지 제174항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 네트워크 분석을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세스가 입력물로서 제공된 서명의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나를 각각 표적하는 하나 이상의 약물을 식별하도록 구성된 2 개의 프로세스를 포함하되, 임의적으로 상기 2 개의 프로세스는 입력물로서 제공된 서명의 복수의 식별된 생체분자를 포함하는 네트워크의 적어도 하나의 허브를 각각 표적하는 하나 이상의 약물을 식별하도록 구성되는 것인, 방법.
  176. 식별된 생체분자의 서명을 분석하는 방법으로서, 유전자 농축 분석, 경로 분석, 또는 네트워크 분석을 수행하도록 각각 구성된 복수의 프로세스 각각에 복수의 식별된 생체분자를 제공하는 단계를 포함하며,
    상기 제공 단계가 임의의 순서로 제공되고;
    복수의 식별된 생체분자가 단백질 세트, 전사체 세트, 펩티드 세트, 및/또는 대사물 세트를 포함하고;
    복수의 프로세스가
    입력물로서 제공된 복수의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 유전자 온톨로지를 식별하기 위해 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 프로세스;
    입력물로서 제공된 복수의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 신호전달 경로를 식별하기 위해 경로 분석을 수행하도록 구성된 프로세스;
    입력물로서 제공된 복수의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나를 조절하는 하나 이상의 전사 인자를 식별하기 위해 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 프로세스;
    입력물로서 제공된 복수의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나의 유전자 산물을 조절하는 하나 이상의 키나제를 식별하기 위해 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 프로세스;
    입력물로서 제공된 복수의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 네트워크를 식별하기 위해 네트워크 분석을 수행하도록 구성된 프로세스; 및
    입력물로서 제공된 복수의 식별된 생체분자 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나를 각각 표적하는 하나 이상의 약물을 식별하기 위해 네트워크 분석을 수행하도록 구성된 2 개의 프로세스 각각을 포함하는 것인, 방법.
  177. 단백질 서명을 분석하는 방법으로서, 유전자 농축 분석, 경로 분석, 또는 네트워크 분석을 수행하도록 각각 구성된 복수의 프로세스 각각에 복수의 단백질을 제공하는 단계를 포함하며, 상기 제공 단계가 임의의 순서로 수행되고, 복수의 프로세스가
    입력물로서 제공된 복수의 단백질 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 유전자 온톨로지를 식별하기 위해 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 프로세스;
    입력물로서 제공된 복수의 단백질 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 신호전달 경로를 식별하기 위해 경로 분석을 수행하도록 구성된 프로세스;
    입력물로서 제공된 복수의 단백질 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나를 조절하는 하나 이상의 전사 인자를 식별하기 위해 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 프로세스;
    입력물로서 제공된 복수의 단백질 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나의 유전자 산물을 조절하는 하나 이상의 키나제를 식별하기 위해 유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 프로세스;
    입력물로서 제공된 복수의 단백질 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나와 각각 연관된 하나 이상의 네트워크를 식별하기 위해 네트워크 분석을 수행하도록 구성된 프로세스; 및
    입력물로서 제공된 복수의 단백질 중 적어도 하나, 또는 이의 생성물 중 적어도 하나를 각각 표적하는 하나 이상의 약물을 식별하기 위해 네트워크 분석을 수행하도록 구성된 2 개의 프로세스 각각을 포함하는 것인, 방법.
  178. 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 미세유체 장치로서,
    입력 포트;
    연결 채널의 상류 네트워크; 및
    복수의 상호연결된 채널
    을 포함하되,
    상기 복수의 상호연결된 채널의 각 채널은 개방 관형 형식이고,
    상기 복수의 상호연결된 채널의 각 채널은 SEC 매질을 포함하는 내부 표면을 포함하고,
    상기 복수의 상호연결된 채널의 각 채널은 연결 채널의 상류 네트워크를 통해 입력 포트와 유체 연통하는 것인, SEC 미세유체 장치.
  179. 제178항에 있어서, 상기 SEC 매질을 포함하는 내부 표면이 약 0.5 μm 내지 약 2 μm의 두께를 갖는 것인, SEC 미세유체 장치.
  180. 제178항 또는 제179항에 있어서, 상기 SEC 매질이 약 10 nm 내지 약 500 nm의 평균 기공 크기를 갖는 물질인, SEC 미세유체 장치.
  181. 제178항 내지 제180항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널이 8 내지 100 개의 상호연결된 채널을 포함하는 것인, SEC 미세유체 장치.
  182. 제178항 내지 제181항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널이 8 개 이상의 상호연결된 채널을 포함하는 것인, SEC 미세유체 장치.
  183. 제178항 내지 제182항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널이 32 개의 상호연결된 채널을 포함하는 것인, SEC 미세유체 장치.
  184. 제178항 내지 제182항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널이 64 개의 상호연결된 채널을 포함하는 것인, SEC 미세유체 장치.
  185. 제178항 내지 제184항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연결 채널의 상류 네트워크, 또는 이의 부분이 복수의 상호연결된 채널 각각의 근위 영역에 연결되는 것인, SEC 미세유체 장치.
  186. 제178항 내지 제185항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연결 채널의 상류 네트워크가 유체 유동을 SEC 미세유체 장치의 입력 포트로부터 복수의 상호연결된 채널 각각으로 분할하도록 구성된 일련의 발산 채널을 포함하는 것인, SEC 미세유체 장치.
  187. 제178항 내지 제186항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각이 연결 채널의 하류 네트워크를 통해 SEC 미세유체 장치의 출력 포트와 유체 연통하는 것인, SEC 미세유체 장치.
  188. 제187항에 있어서, 상기 연결 채널의 하류 네트워크가 유체 유동을 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널로부터 출력 포트로 조합하도록 구성된 일련의 수렴 채널을 포함하는 것인, SEC 미세유체 장치.
  189. 제178항 내지 제188항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각이 약 2 cm 내지 약 30 cm의 길이를 갖는 것인, SEC 미세유체 장치.
  190. 제178항 내지 제189항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각이 약 1 μm 내지 약 15 μm의 폭을 갖는 것인, SEC 미세유체 장치.
  191. 제178항 내지 제190항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각이 약 1 μm 내지 약 15 μm의 깊이를 갖는 것인, SEC 미세유체 장치.
  192. 제178항 내지 제191항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널이 기둥 배열을 통해 형성되는 것인, SEC 미세유체 장치.
  193. 제192항에 있어서, 상기 기둥 배열이 무정형 기둥 배열인, SEC 미세유체 장치.
  194. 제192항에 있어서, 상기 기둥 배열이 비-무정형 기둥 배열인, SEC 미세유체 장치.
  195. 제192항 내지 제194항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기둥 배열이 SEC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각의 내부 표면을 형성하는 것인, SEC 미세유체 장치.
  196. 제178항 내지 제195항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치가 석영 기판을 포함하는 것인, SEC 미세유체 장치.
  197. 제178항 내지 제196항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치가 복수의 상호연결된 채널을 형성하는 모놀리식 기판을 포함하는 것인, SEC 미세유체 장치.
  198. 제178항 내지 제197항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치가 석영 모놀리식 기판을 포함하는 것인, SEC 미세유체 장치.
  199. 제178항 내지 제198항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SEC 미세유체 장치가 3차원(3D) 인쇄 기판을 포함하는 것인, SEC 미세유체 장치.
  200. 역상 액체 크로마토그래피(RPLC) 미세유체 장치로서,
    입력 포트;
    연결 채널의 상류 네트워크; 및
    복수의 상호연결된 채널
    을 포함하되,
    상기 복수의 상호연결된 채널의 각 채널은 개방 관형 형식이고,
    상기 복수의 상호연결된 채널의 각 채널은 RPLC 매질을 포함하는 내부 표면을 포함하고,
    상기 복수의 상호연결된 채널의 각 채널은 연결 채널의 상류 네트워크를 통해 입력 포트와 유체 연통하는 것인, RPLC 미세유체 장치.
  201. 제200항에 있어서, 상기 RPLC 매질이 약 2 내지 약 20 개의 탄소를 갖는 알킬 모이어티를 포함하는 것인, RPLC 미세유체 장치.
  202. 제200항 또는 제201항에 있어서, 상기 RPLC 매질이 C2, C4, C8, 및 C18 중 하나 이상을 포함하는 것인, RPLC 미세유체 장치.
  203. 제200항 내지 제202항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPLC 매질이 다음 알킬 모이어티: C2, C4, C8, 및 C18 중 2 개 이상을 포함하는 RPLC 모이어티 혼합물을 포함하는 것인, RPLC 미세유체 장치.
  204. 제203항에 있어서, 상기 RPLC 모이어티 혼합물이 다음 알킬 모이어티: C2, C4, C8, 및 C18 중 3 개 이상을 포함하는 것인, RPLC 미세유체 장치.
  205. 제203항 또는 제204항에 있어서, 상기 RPLC 모이어티 혼합물이 다음 알킬 모이어티: C2, C4, C8, 및 C18을 포함하는 것인, RPLC 미세유체 장치.
  206. 제203항 내지 제205항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPLC 모이어티 혼합물의 알킬 모이어티가 등몰량으로 존재하는 것인, RPLC 미세유체 장치.
  207. 제200항 내지 제206항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPLC 매질이 실리카(SiO2)를 통해 상호연결된 복수의 병렬 채널의 각 채널의 내부 표면에 접합되는 것인, RPLC 미세유체 장치.
  208. 제200항 내지 제207항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널이 8 내지 100 개의 상호연결된 채널을 포함하는 것인, RPLC 미세유체 장치.
  209. 제200항 내지 제208항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널이 8 개 이상의 상호연결된 채널을 포함하는 것인, RPLC 미세유체 장치.
  210. 제200항 내지 제209항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널이 32 개의 상호연결된 채널을 포함하는 것인, RPLC 미세유체 장치.
  211. 제200항 내지 제209항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널이 64 개의 상호연결된 채널을 포함하는 것인, RPLC 미세유체 장치.
  212. 제200항 내지 제211항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연결 채널의 상류 네트워크, 또는 이의 부분이 복수의 상호연결된 채널 각각의 근위 영역에 연결되는 것인, RPLC 미세유체 장치.
  213. 제200항 내지 제212항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연결 채널의 상류 네트워크가 유체 유동을 RPLC 미세유체 장치의 입력 포트로부터 복수의 상호연결된 채널 각각으로 분할하도록 구성된 일련의 발산 채널을 포함하는 것인, RPLC 미세유체 장치.
  214. 제200항 내지 제213항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각이 연결 채널의 하류 네트워크를 통해 RPLC 미세유체 장치의 출력 포트와 유체 연통하는 것인, RPLC 미세유체 장치.
  215. 제214항에 있어서, 상기 연결 채널의 하류 네트워크가 유체 유동을 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널로부터 출력 포트로 조합하도록 구성된 일련의 수렴 채널을 포함하는 것인, RPLC 미세유체 장치.
  216. 제200항 내지 제215항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각이 약 2 cm 내지 약 30 cm의 길이를 갖는 것인, RPLC 미세유체 장치.
  217. 제200항 내지 제216항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각이 약 1 μm 내지 약 15 μm의 폭을 갖는 것인, RPLC 미세유체 장치.
  218. 제200항 내지 제217항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각이 약 1 μm 내지 약 15 μm의 깊이를 갖는 것인, RPLC 미세유체 장치.
  219. 제200항 내지 제218항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널이 기둥 배열을 통해 형성되는 것인, RPLC 미세유체 장치.
  220. 제219항에 있어서, 상기 기둥 배열이 무정형 기둥 배열인, RPLC 미세유체 장치.
  221. 제219항에 있어서, 상기 기둥 배열이 비-무정형 기둥 배열인, RPLC 미세유체 장치.
  222. 제219항 내지 제221항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기둥 배열이 RPLC 미세유체 장치의 복수의 상호연결된 채널 각각의 내부 표면을 형성하는 것인, RPLC 미세유체 장치.
  223. 제219항 내지 제221항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치가 석영 기판을 포함하는 것인, RPLC 미세유체 장치.
  224. 제219항 내지 제223항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치가 복수의 상호연결된 채널을 형성하는 모놀리식 기판을 포함하는 것인, RPLC 미세유체 장치.
  225. 제219항 내지 제224항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치가 석영 모놀리식 기판을 포함하는 것인, RPLC 미세유체 장치.
  226. 제219항 내지 제225항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPLC 미세유체 장치가 3차원(3D) 인쇄 기판을 포함하는 것인, RPLC 미세유체 장치.
  227. 테스트 샘플을 처리하는 방법으로서,
    (a) 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 미세유체 장치를 사용하여 테스트 샘플을 SEC 기술에 적용하되,
    상기 테스트 샘플은 하나 이상의 생체분자 및 카오트로픽제를 포함하고,
    상기 SEC 미세유체 장치는 복수의 상호연결된 채널을 포함하는 것인, 단계;
    (b) SEC 미세유체 장치로부터 용출된 하나 이상의 분획을 수집하는 단계;
    (c) SEC 미세유체 장치로부터 수집된 분획 중 하나 이상을 단백질분해 기술에 적용하는 단계; 및
    (d) 분획 중 하나 이상을 역상 액체 크로마토그래피(RPLC) 기술에 적용하여 질량 분광계에 도입하기 위한 분획을 제조하되,
    상기 하나 이상의 RPLC-분획은 (i) SEC 미세유체 장치로부터 수득된 0 개 이상의 분획; 및 (ii) 단백질분해 기술에 적용된 0 개 이상의 분획을 포함하는, 단계를 포함하는, 방법.
  228. 조성물을 분석하는 방법으로서,
    (a) 조성물을 질량 분광계에 적용하는 단계; 및
    (b) 조성물의 질량 분광법 분석을 수행하는 단계를 포함하되,
    상기 조성물은 SEC 미세유체 장치의 사용을 포함하는 SEC 기술을 사용하여 샘플의 분획화 후 SEC 미세유체 기술로부터의 하나 이상의 분획, 또는 이의 생성물을 RPLC 기술에 적용하는 것을 포함하는 처리 기술로부터 수득되는 것인, 방법.
  229. 식별된 구성요소의 서명을 분석하는 방법으로서, 유전자 농축 분석, 경로 분석, 및 네트워크 분석을 임의의 순서로 수행하는 단계를 포함하며,
    상기 식별된 구성요소의 서명이 단백질 세트, 전사체 세트, 펩티드 세트, 및/또는 대사물 세트를 포함하고;
    상기 수행하는 단계가
    유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 프로세스;
    경로 분석을 수행하도록 구성된 프로세스;
    유전자 농축 분석을 수행하도록 구성된 프로세스; 및
    네트워크 분석을 수행하여 약물 표적을 식별하도록 구성된 프로세스를 포함하는 것인, 방법.
  230. 개체에게 관상 동맥 질환(CAD) 진단 결정을 내리게 하는 방법으로서,
    (a) 개체로부터 수득된 샘플, 또는 이의 유도체로부터 질량 분광법(MS) 데이터를 수득하는 단계; 및
    (b) CAD 단백체 서명에 따라 MS 데이터를 분석하되,
    상기 CAD 단백체 서명은 표 1의 하나 이상의 바이오마커를 포함하는 것인, 단계; 및
    (c) 개체가 CAD 단백체 서명을 갖는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  231. 제230항에 있어서, 상기 개체가 CAD 단백체 서명을 갖는 경우, 개체가 CAD를 앓는 것으로 진단되는 것인, 방법.
  232. 개체가 관상 동맥 질환(CAD)을 앓는 것으로 진단하는 방법으로서,
    (a) 개체로부터 수득된 샘플, 또는 이의 유도체로부터 질량 분광법(MS) 데이터를 수득하는 단계; 및
    (b) CAD 단백체 서명에 따라 MS 데이터를 분석하되,
    상기 CAD 단백체 서명은 표 1의 하나 이상의 바이오마커를 포함하는 것인, 단계; 및
    (c) CAD 단백체 서명의 존재에 기반하여 개체가 CAD를 앓는 것으로 진단하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  233. 관상 동맥 질환(CAD)을 앓는 개체를 치료하는 방법으로서,
    (a) 개체로부터 수득된 샘플, 또는 이의 유도체에서 CAD 단백체 서명의 존재에 따라 개체가 CAD를 앓는 것으로 진단하되,
    상기 CAD 단백체 서명은 표 1의 하나 이상의 바이오마커를 포함하는 것인, 단계; 및
    (b) 개체에게 CAD 치료를 투여하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  234. 제233항에 있어서, 상기 CAD 단백체 서명의 존재가 CAD 단백체 서명에 따른 MS 데이터를 분석함으로써 결정되는 것인, 방법.
  235. 제234항에 있어서, 개체로부터 수득된 샘플, 또는 이의 유도체로부터 MS 데이터를 수득하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  236. 제233항 내지 제235항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CAD 치료가 생활 방식 조정을 포함하는 것인, 방법.
  237. 제233항 내지 제236항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CAD 치료가 약제학적 개입을 포함하는 것인, 방법.
  238. 제237항에 있어서, 상기 약제학적 개입이 칼슘 채널 차단제, 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 억제제(예컨대 HDAC6), Ca2+/칼모듈린(CaM)-의존적 단백질 키나제 II(CaMK II) 억제제, 구아닐릴 사이클라제(sGC) 활성제, MMP 억제제, 스타틴, 및 항고혈압제로 이루어진 군으로부터 선택된 약물의 투여를 포함하는 것인, 방법.
  239. 제237항 또는 제238항에 있어서, 상기 약제학적 개입이 암로디핀, 투바스타틴-a, 포르스콜린, 트리코스타틴 A, KN-93, CFM-1571, 일로마스타트, CAY-10603, 및 로수바스타틴, 또는 이의 약제학적 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 약물을 포함하는 것인, 방법.
  240. 제237항 또는 제238항에 있어서, 상기 약물이 BRD-K52306726, BRD-K71361154, 아세타졸아미드, 롤리프람, 룩솔리티닙, BRD-A59808129-001-01-7, BRD-K76876037, ZM336372, 트레할로스, SCHEMBL3092652, BMS-387032, BRD-K01425431, 4-하이드록시-레티노산, CHEMBL585951, CHEMBL1673039, HY-11007, 프리미돈, BRD-K81417919, SPECTRUM_000826, 타목시펜, BRD-K00544996, CID 67066889, CX-5461, BRD-K63944563, SCHEMBL6851809, BRD-A86146706, FR-180204, CHEMBL552425, 헥사클로로펜, Aggc, SUGA1_008424, BRD-K96640811, 아나스트로졸, 워트만닌, 반데타닙, AC1NWALF, OTSSP167, WZ3105, 디하이드로에르고타민, BRD-K99839793, SR 33805 옥살레이트, AT-7519, 술파독신, SPECTRUM_001319, MLS003329219, 트리코스타틴 A, 및 로테논, 또는 이의 약제학적 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  241. 개체의 관상 동맥 질환(CAD) 단백체 서명을 검출하는 방법으로서,
    (a) 개체로부터 수득된 샘플, 또는 이의 유도체로부터 질량 분광법(MS) 데이터를 수득하는 단계; 및
    (b) CAD 단백체 서명에 따라 MS 데이터를 분석하여 CAD 단백체 서명을 검출하되,
    상기 CAD 단백체 서명은 표 1의 하나 이상의 바이오마커를 포함하는 것인, 방법.
  242. 제241항에 있어서, 상기 개체가 CAD를 앓는 것으로 의심되는 것인, 방법.
  243. 제230항 내지 제242항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CAD 단백체 서명이 참조와 비교하여 표 1에 따른 하나 이상의 바이오마커의 발현 증가를 포함하는 것인, 방법.
  244. 제230항 내지 제243항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CAD 단백체 서명이 참조와 비교하여 표 1에 따른 하나 이상의 바이오마커의 발현 감소를 포함하는 것인, 방법.
  245. 제230항 내지 제244항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CAD 단백체 서명이 칼슘 신호전달 경로, 히스톤 조절, HIF-1 신호전달 경로, cAMP 신호전달 경로, 베타-아드레날린성 신호전달 경로, PI3K-Akt 신호전달 경로, 보체 및/ 또는 응고 캐스케이드, 스핑고지질 신호전달 경로, 자연 살해 세포 매개 세포독성, 아디포사이토카인 신호전달 경로, DNA 손상, 칼슘 에너지, 대사체학, 세포 부착, 염증, 저산소증, 및 히스톤 메틸화와 연관된 하나 이상의 바이오마커를 포함하는 것인, 방법.
  246. 제230항 내지 제245항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 바이오마커가 전사 인자와 연관된 하나 이상의 바이오마커를 포함하는 이의 하위집합을 포함하는 것인, 방법.
  247. 제230항 내지 제246항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 바이오마커가 키나제와 연관된 하나 이상의 바이오마커를 포함하는 이의 하위집합을 포함하는 것인, 방법.
  248. 제230항 내지 제247항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 바이오마커가 표 1의 적어도 10 개의 바이오마커를 포함하는 것인, 방법.
  249. 제230항 내지 제248항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 바이오마커가 표 1의 적어도 25 개의 바이오마커를 포함하는 것인, 방법.
  250. 제230항 내지 제249항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 바이오마커가 표 1의 적어도 50 개의 바이오마커를 포함하는 것인, 방법.
  251. 제230항 내지 제250항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 바이오마커가 표 1의 모든 바이오마커를 포함하는 것인, 방법.
  252. 제230항 내지 제251항 중 어느 한 항에 있어서, 개체로부터 샘플을 수득하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  253. 제230항 내지 제252항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플, 또는 이의 유도체가 혈액 샘플 또는 이의 유도체인, 방법.
  254. 제253항에 있어서, 상기 샘플, 또는 이의 유도체가 혈장 샘플인, 방법.
  255. 제254항에 있어서, 상기 샘플, 또는 이의 유도체가 액체 고정액을 포함하는 것인, 방법.
  256. 제230항 내지 제255항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플, 또는 이의 유도체로부터 MS 데이터를 수득하는 단계가 질량 분광계를 사용하여 샘플, 또는 이의 유도체의 질량 분광법 분석을 수행하는 것을 포함하는 것인, 방법.
  257. 제256항에 있어서, 상기 질량 분광법 분석이 제140항 내지 제143항의 방법에 따라 수행되는 것인, 방법.
  258. 제230항 내지 제257항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CAD 단백체 서명에 따라 MS 데이터를 분석하는 단계가 제161항 내지 제177항 중 어느 한 항의 방법에 MS 데이터를 적용하는 것을 포함하는 것인, 방법.
  259. 제230항 내지 제258항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CAD 단백체 서명에 따라 MS 데이터를 분석하는 단계가 MS 데이터에서 CAD 단백체 서명의 하나 이상의 바이오마커 각각의 존재 또는 부재 또는 수준을 평가하는 것을 포함하는 것인, 방법.
  260. 제230항 내지 제259항 중 어느 한 항에 있어서, 개체의 다음 인자 평가: 성별, 연령, 신체질량지수(BMI), 수축기 혈압, 확장기 혈압, 총 콜레스테롤, HDL, LDL, 트리글리세리드, 고지질혈증, 고혈압, 진성 당뇨병, 인슐린 저항, 신장 질환, 흡연 상태, 신체 활동 수준, 수면 수준, 또는 영양의 질 중 하나 이상을 수행하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  261. 제230항 내지 제260항 중 어느 한 항에 있어서, CAD의 존재를 평가하기 위해 개체에 대한 의료 절차를 수행하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
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