JP7326324B2 - 質量分析における抗体のトップダウン分析 - Google Patents
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Description
本願は、両方の内容が参照することによってその全体として本明細書に組み込まれる、2018年4月10日に出願された米国仮特許出願第62/655,540号、および2019年3月5日に出願された米国仮特許出願第62/813,877号の利益を主張する。
本明細書の教示は、未知のモノクローナル抗体(mAb)の可変部分を配列決定するための質量分析システムおよび方法に関する。より具体的には、電子捕捉解離(ECD)デバイスが、無傷、消化された、または還元された未知のmAbを断片化し、生成質量スペクトルを生成するために使用される。mAbクラスの一定部分に関して計算される理論的生成イオンピークは、生成質量スペクトルから除去され、差異生成質量スペクトルを生成する。デノボシークエンシングが、差異生成イオンスペクトルに適用され、mAbの可変部分に関して候補配列を生成する。ゲノムデータベースが、いわゆる相同性検索を使用して、1つ以上の候補配列への合致に関して検索され、可変部分に関して合致した配列を生成する。
mAbは、免疫細胞によって作製されるタンパク質である。これらの抗体は、ある抗体が単一の結合部位またはパラトープのみに結合するであろうという点で、モノクローナルである。抗体は、一般に、除去のために異または罹患組織をマークするために、生物の免疫系によって使用される。逆に、自己免疫疾患では、抗体は、正常な組織に誤って付着し、その組織も除去または損傷させる。
質量分析(MS)は、それらの化合物から形成されるイオンのm/z値の分析に基づく、化学化合物の検出および定量化のための分析技法である。MSは、サンプルからの1つ以上の着目化合物のイオン化、前駆イオンの生成、および前駆イオンの質量分析を伴う。
電子ベースの解離(ExD)、紫外線光解離(UVPD)、赤外線光解離(IRMPD)、および衝突誘発解離(CID)が、多くの場合、タンデム質量分析(MS/MS)のための断片化技法として使用される。ExDは、限定ではないが、電子捕捉解離(ECD)または電子伝達解離(ETD)を含むことができる。CIDは、タンデム質量分析計における解離のための最も従来的技法である。
システム、方法、およびコンピュータプログラム製品が、未知のmAbの1つ以上の可変部分を配列決定するために開示される。本システムは、ゲノムデータベースと、分離デバイスと、イオン源デバイスと、1つ以上の解離デバイスを伴う質量分析計と、プロセッサとを含む。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
未知のモノクローナル抗体(mAb)の1つ以上の可変部分を配列決定するためのシステムであって、
相同性検索のためのゲノムデータベースと、
分離デバイスと、
イオン源デバイスと、
解離デバイスと、質量分析器とを含む、質量分析計と、
プロセッサと
を備え、
前記プロセッサは、
サンプルから未知の無傷mAbまたは既知のmAbクラスの還元型mAbサブユニットを分離するように前記分離デバイスに命令することと、
前記未知の無傷mAbまたは還元型mAbサブユニットをイオン化するように前記イオン源デバイスに命令することと、
前記解離デバイスを使用して、前記イオン化された未知の無傷mAbまたは還元型mAbサブユニットを断片化し、前記質量分析器を使用して、結果として生じる生成イオンを質量分析し、1つ以上の生成イオンスペクトルを生成するように前記質量分析計に命令することと、
前記既知のmAbクラスの1つ以上の一定部分に関して理論的生成イオンピークを計算することと、
前記1つ以上の生成イオンスペクトルから前記計算された理論的生成イオンピークを除去し、1つ以上の差異生成イオンスペクトルを生成することと、
デノボシークエンシングを前記1つ以上の差異生成イオンスペクトルに適用し、前記未知の無傷mAbまたは還元型mAbサブユニットの1つ以上の可変部分に関して、1つ以上の候補配列を生成することと、
前記1つ以上の候補配列への合致に関して前記ゲノムデータベースを検索し、前記1つ以上の可変部分に関して、1つ以上の合致した配列を生成することと
を行う、システム。
(項目2)
前記プロセッサは、N末端生成イオンの理論的生成イオンピークを除去することによって、前記計算された理論的生成イオンピークを除去する、項目1に記載のシステム。
(項目3)
前記プロセッサは、デノボシークエンシングを前記1つ以上の差異生成イオンスペクトルの残留C生成イオンに適用し、1つ以上の候補配列を生成する、項目2に記載のシステム。
(項目4)
前記プロセッサは、前記1つ以上の生成イオンスペクトルからピークリストを計算する、項目1に記載のシステム。
(項目5)
前記プロセッサは、1価の生成イオンピークに変換される前記1つ以上の生成イオンスペクトルからピークリストを計算する、項目4に記載のシステム。
(項目6)
前記プロセッサは、前記ピークリストから前記理論的生成イオンピークを除去することによって、前記1つ以上の生成イオンスペクトルから前記計算された理論的生成イオンピークを除去し、差異ピークリストを生成する、項目4に記載のシステム。
(項目7)
前記プロセッサは、デノボシークエンシングを前記差異ピークリストに適用することによって、デノボシークエンシングを前記1つ以上の差異生成イオンスペクトルに適用する、項目6に記載のシステム。
(項目8)
前記プロセッサが、前記還元された未知のmAbを分離および脱塩するように前記分離デバイスに命令する前に、化膿連鎖球菌の免疫グロブリンG分解酵素(IdeS)消化を前記無傷の未知のmAbに適用し、前記還元された未知のmAbを生成することをさらに含む、項目1に記載のシステム。
(項目9)
前記分離デバイスが、前記IdeS消化される還元された未知のmAbを分離および脱塩するにつれて、ジチオスレイトール(DTT)を、前記無傷の未知のmAbを伴う溶液の中および前記分離デバイスの中に注入することをさらに含む、項目8に記載のシステム。
(項目10)
前記解離デバイスは、電子捕捉解離(ECD)デバイスを備える、項目1に記載のシステム。
(項目11)
前記プロセッサは、0~3eVの電子エネルギーを使用し、前記ECDデバイスを使用して前記イオン化された未知の無傷mAbまたは還元型mAbサブユニットを断片化するように前記質量分析計に命令する、項目10に記載のシステム。
(項目12)
前記質量分析計は、前記未知の無傷mAbまたは還元型mAbサブユニットの電子およびイオンを前記ECDデバイスの中に同時に注入する、項目10に記載のシステム。
(項目13)
前記ECDデバイスは、四重極、六重極、または八重極解離デバイスを備える、項目10に記載のシステム。
(項目14)
未知のモノクローナル抗体(mAb)の1つ以上の可変部分を配列決定するための方法であって、
プロセッサを使用して、サンプルから未知の無傷mAbまたは既知のmAbクラスの還元型mAbサブユニットを分離するように分離デバイスに命令することと、
前記プロセッサを使用して、前記未知の無傷mAbまたは還元型mAbサブユニットをイオン化するようにイオン源デバイスに命令することと、
前記プロセッサを使用して、質量分析計の解離デバイスを使用して、前記イオン化された未知の無傷mAbまたは還元型mAbサブユニットを断片化し、前記質量分析計の質量分析器を使用して、結果として生じる生成イオンを質量分析し、1つ以上の生成イオンスペクトルを生成するように前記質量分析計に命令することと、
前記プロセッサを使用して、前記既知のmAbクラスの1つ以上の一定部分に関して理論的生成イオンピークを計算することと、
前記プロセッサを使用して、前記1つ以上の生成イオンスペクトルから前記計算された理論的生成イオンピークを除去し、1つ以上の差異生成イオンスペクトルを生成することと、
前記プロセッサを使用して、デノボシークエンシングを前記1つ以上の差異生成イオンスペクトルに適用し、前記未知の無傷mAbまたは還元型mAbサブユニットの1つ以上の可変部分に関して、1つ以上の候補配列を生成することと、
前記プロセッサを使用して、前記1つ以上の候補配列への合致に関してゲノムデータベースを検索し、前記1つ以上の可変部分に関して、1つ以上の合致した配列を生成することと
を含む、方法。
(項目15)
非一過性の有形コンピュータ可読記憶媒体を備えるコンピュータプログラム製品であって、そのコンテンツは、未知のモノクローナル抗体(mAb)の1つ以上の可変部分を配列決定するための方法を実施するように、プロセッサ上で実行されている命令を伴うプログラムを含み、前記方法は、
システムを提供することであって、前記システムは、1つ以上の明確に異なるソフトウェアモジュールを備え、前記明確に異なるソフトウェアモジュールは、制御モジュールと、分析モジュールとを備える、ことと、
前記制御モジュールを使用して、サンプルから未知の無傷mAbまたは既知のmAbクラスの還元型mAbサブユニットを分離するように分離デバイスに命令することと、
前記制御モジュールを使用して、前記未知の無傷mAbまたは還元型mAbサブユニットをイオン化するようにイオン源デバイスに命令することと、
前記制御モジュールを使用して、質量分析計の解離デバイスを使用して、前記イオン化された未知の無傷mAbまたは還元型mAbサブユニットを断片化し、前記質量分析計の質量分析器を使用して、結果として生じる生成イオンを質量分析し、1つ以上の生成イオンスペクトルを生成するように前記質量分析計に命令することと、
前記分析モジュールを使用して、前記既知のmAbクラスの1つ以上の一定部分に関して理論的生成イオンピークを計算することと、
前記分析モジュールを使用して、前記1つ以上の生成イオンスペクトルから前記計算された理論的生成イオンピークを除去し、1つ以上の差異生成イオンスペクトルを生成することと、
前記分析モジュールを使用して、デノボシークエンシングを前記1つ以上の差異生成イオンスペクトルに適用し、前記未知の無傷mAbまたは還元型mAbサブユニットの1つ以上の可変部分に関して、1つ以上の候補配列を生成することと、
前記分析モジュールを使用して、前記1つ以上の候補配列への合致に関してゲノムデータベースを検索し、前記1つ以上の可変部分に関して、1つ以上の合致した配列を生成することと
を含む、コンピュータプログラム製品。
(コンピュータ実装システム)
図1は、本教示の実施形態が実装され得る、コンピュータシステム100を図示するブロック図である。コンピュータシステム100は、情報を通信するためのバス102または他の通信機構と、情報を処理するためのバス102と結合されるプロセッサ104とを含む。コンピュータシステム100はまた、プロセッサ104によって実行されるべき命令を記憶するために、バス102に結合されるランダムアクセスメモリ(RAM)または他の動的記憶デバイスであり得る、メモリ106も含む。メモリ106はまた、プロセッサ104によって実行されるべき命令の実行の間にテンポラリ変数または他の中間情報を記憶するために使用されてもよい。コンピュータシステム100はさらに、プロセッサ104のための静的情報および命令を記憶するためのバス102に結合される読取専用メモリ(ROM)108または他の静的記憶デバイスを含む。磁気ディスクまたは光ディスク等の記憶デバイス110が、情報および命令を記憶するために提供され、バス102に結合される。
上記に説明されるように、モノクローナル抗体(mAb)のトップダウンおよびミドルダウン分析は、mAbのアミノ酸配列が把握されるときのみ実証された。未知のmAbの配列を判定することは、既知のmAbの配列を識別または確認することよりもはるかに困難な問題である。これは、上記に説明されるように、mAbの可変部分が数十億もの異なる可能性として考えられる配列を有し得るため、はるかに困難な問題である。
図6は、種々の実施形態による、未知のmAbの1つ以上の可変部分を配列決定するためのシステムを示す、例示的概略図600である。図6のシステムは、ゲノムデータベース610と、分離デバイス620と、イオン源デバイス630と、質量分析計640と、プロセッサ650とを含む。
図11は、種々の実施形態による、未知のmAbの1つ以上の可変部分を配列決定するための方法1100を示す、フローチャートである。
種々の実施形態では、コンピュータプログラム製品は、そのコンテンツが、未知のmAbの1つ以上の可変部分を配列決定するための方法を実施するように、プロセッサ上で実行されている命令を伴うプログラムを含む、有形コンピュータ可読記憶媒体を含む。本方法は、1つ以上の明確に異なるソフトウェアモジュールを含む、システムによって実施される。
ECDは、トップダウンシークエンシング、デノボシークエンシング,グリコシル化分析、および有益なジスルフィド結合開裂等の一意の特徴を提供し、無傷抗体を分析するための理想的なツールである。RFイオントラップに基づく小型および高スループットECDデバイスが、いくつかの実験で使用された。本技術は、本研究では、無傷mAbに適用された。これはまた、新規のオンラインジスルフィド結合還元技法を使用して還元された、mAbサブユニットに適用された。
Claims (15)
- 未知のモノクローナル抗体(mAb)の1つ以上の可変部分を配列決定するためのシステムであって、
相同性検索のためのゲノムデータベースと、
分離デバイスと、
イオン源デバイスと、
解離デバイスと、質量分析器とを含む、質量分析計と、
プロセッサと
を備え、
前記プロセッサは、
サンプルから未知の無傷mAbまたは既知のmAbクラスの還元型mAbサブユニットを分離するように前記分離デバイスに命令することと、
前記未知の無傷mAbまたは還元型mAbサブユニットをイオン化するように前記イオン源デバイスに命令することと、
前記解離デバイスを使用して、前記イオン化された未知の無傷mAbまたは還元型mAbサブユニットを断片化し、前記質量分析器を使用して、結果として生じる生成イオンを質量分析し、1つ以上の生成イオンスペクトルを生成するように前記質量分析計に命令することと、
前記既知のmAbクラスの1つ以上の一定部分に関して理論的生成イオンピークを計算することと、
前記1つ以上の生成イオンスペクトルから前記計算された理論的生成イオンピークを除去し、1つ以上の差異生成イオンスペクトルを生成することと、
デノボシークエンシングを前記1つ以上の差異生成イオンスペクトルに適用し、前記未知の無傷mAbまたは還元型mAbサブユニットの1つ以上の可変部分に関して、1つ以上の候補配列を生成することと、
前記1つ以上の候補配列への合致に関して前記ゲノムデータベースを検索し、前記1つ以上の可変部分に関して、1つ以上の合致した配列を生成することと
を行う、システム。 - 前記プロセッサは、N末端生成イオンの理論的生成イオンピークを除去することによって、前記計算された理論的生成イオンピークを除去する、請求項1に記載のシステム。
- 前記プロセッサは、デノボシークエンシングを前記1つ以上の差異生成イオンスペクトルの残留C生成イオンに適用し、1つ以上の候補配列を生成する、請求項2に記載のシステム。
- 前記プロセッサは、前記1つ以上の生成イオンスペクトルからピークリストを計算する、請求項1に記載のシステム。
- 前記プロセッサは、1価の生成イオンピークに変換される前記1つ以上の生成イオンスペクトルからピークリストを計算する、請求項4に記載のシステム。
- 前記プロセッサは、前記ピークリストから前記理論的生成イオンピークを除去することによって、前記1つ以上の生成イオンスペクトルから前記計算された理論的生成イオンピークを除去し、差異ピークリストを生成する、請求項4に記載のシステム。
- 前記プロセッサは、デノボシークエンシングを前記差異ピークリストに適用することによって、デノボシークエンシングを前記1つ以上の差異生成イオンスペクトルに適用する、請求項6に記載のシステム。
- 前記プロセッサが、前記還元型mAbサブユニットを分離および脱塩するように前記分離デバイスに命令する前に、化膿連鎖球菌の免疫グロブリンG分解酵素(IdeS)消化を前記未知の無傷mAbに適用し、前記還元型mAbサブユニットを生成することをさらに含む、請求項1に記載のシステム。
- 前記分離デバイスが、前記還元型mAbサブユニットを分離および脱塩するにつれて、ジチオスレイトール(DTT)を、前記未知の無傷mAbを伴う溶液の中および前記分離デバイスの中に注入することをさらに含む、請求項8に記載のシステム。
- 前記解離デバイスは、電子捕捉解離(ECD)デバイスを備える、請求項1に記載のシステム。
- 前記プロセッサは、0~3eVの電子エネルギーを使用し、前記ECDデバイスを使用して前記イオン化された未知の無傷mAbまたは還元型mAbサブユニットを断片化するように前記質量分析計に命令する、請求項10に記載のシステム。
- 前記質量分析計は、前記未知の無傷mAbまたは還元型mAbサブユニットの電子およびイオンを前記ECDデバイスの中に同時に注入する、請求項10に記載のシステム。
- 前記ECDデバイスは、四重極、六重極、または八重極解離デバイスを備える、請求項10に記載のシステム。
- 未知のモノクローナル抗体(mAb)の1つ以上の可変部分を配列決定するための方法であって、
プロセッサを使用して、サンプルから未知の無傷mAbまたは既知のmAbクラスの還元型mAbサブユニットを分離するように分離デバイスに命令することと、
前記プロセッサを使用して、前記未知の無傷mAbまたは還元型mAbサブユニットをイオン化するようにイオン源デバイスに命令することと、
前記プロセッサを使用して、質量分析計の解離デバイスを使用して、前記イオン化された未知の無傷mAbまたは還元型mAbサブユニットを断片化し、前記質量分析計の質量分析器を使用して、結果として生じる生成イオンを質量分析し、1つ以上の生成イオンスペクトルを生成するように前記質量分析計に命令することと、
前記プロセッサを使用して、前記既知のmAbクラスの1つ以上の一定部分に関して理論的生成イオンピークを計算することと、
前記プロセッサを使用して、前記1つ以上の生成イオンスペクトルから前記計算された理論的生成イオンピークを除去し、1つ以上の差異生成イオンスペクトルを生成することと、
前記プロセッサを使用して、デノボシークエンシングを前記1つ以上の差異生成イオンスペクトルに適用し、前記未知の無傷mAbまたは還元型mAbサブユニットの1つ以上の可変部分に関して、1つ以上の候補配列を生成することと、
前記プロセッサを使用して、前記1つ以上の候補配列への合致に関してゲノムデータベースを検索し、前記1つ以上の可変部分に関して、1つ以上の合致した配列を生成することと
を含む、方法。 - プログラムが記憶された非一過性の有形コンピュータ可読記憶媒体であって、前記プログラムは、プロセッサによって実行されると、未知のモノクローナル抗体(mAb)の1つ以上の可変部分を配列決定するための方法を前記プロセッサに実施させ、前記方法は、
システムを提供することであって、前記システムは、1つ以上の明確に異なるソフトウェアモジュールを備え、前記明確に異なるソフトウェアモジュールは、制御モジュールと、分析モジュールとを備える、ことと、
前記制御モジュールを使用して、サンプルから未知の無傷mAbまたは既知のmAbクラスの還元型mAbサブユニットを分離するように分離デバイスに命令することと、
前記制御モジュールを使用して、前記未知の無傷mAbまたは還元型mAbサブユニットをイオン化するようにイオン源デバイスに命令することと、
前記制御モジュールを使用して、質量分析計の解離デバイスを使用して、前記イオン化された未知の無傷mAbまたは還元型mAbサブユニットを断片化し、前記質量分析計の質量分析器を使用して、結果として生じる生成イオンを質量分析し、1つ以上の生成イオンスペクトルを生成するように前記質量分析計に命令することと、
前記分析モジュールを使用して、前記既知のmAbクラスの1つ以上の一定部分に関して理論的生成イオンピークを計算することと、
前記分析モジュールを使用して、前記1つ以上の生成イオンスペクトルから前記計算された理論的生成イオンピークを除去し、1つ以上の差異生成イオンスペクトルを生成することと、
前記分析モジュールを使用して、デノボシークエンシングを前記1つ以上の差異生成イオンスペクトルに適用し、前記未知の無傷mAbまたは還元型mAbサブユニットの1つ以上の可変部分に関して、1つ以上の候補配列を生成することと、
前記分析モジュールを使用して、前記1つ以上の候補配列への合致に関してゲノムデータベースを検索し、前記1つ以上の可変部分に関して、1つ以上の合致した配列を生成することと
を含む、非一過性の有形コンピュータ可読記憶媒体。
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