KR20130088131A - 단백질 시료들의 비교 - Google Patents

단백질 시료들의 비교 Download PDF

Info

Publication number
KR20130088131A
KR20130088131A KR1020137001111A KR20137001111A KR20130088131A KR 20130088131 A KR20130088131 A KR 20130088131A KR 1020137001111 A KR1020137001111 A KR 1020137001111A KR 20137001111 A KR20137001111 A KR 20137001111A KR 20130088131 A KR20130088131 A KR 20130088131A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
protein
sample
sitrs
heavy chain
unlabeled
Prior art date
Application number
KR1020137001111A
Other languages
English (en)
Inventor
앤턴 브이. 마누일로브
데이비드 에이치. 리
Original Assignee
아비에 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 아비에 인코포레이티드 filed Critical 아비에 인코포레이티드
Publication of KR20130088131A publication Critical patent/KR20130088131A/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry

Abstract

단백질 시료 속에서 돌연변이, 변형 또는 분순물의 존재를 정성적으로 및/또는 정량적으로 검출하는 방법이 제공된다. 당해 방법은 단백질 분해 전에 단백질내로 혼입된 아미노산의 동위원소 표지된 변이체를 사용하여 보텀-업 액체 크로마토그래피내에서 2개의 단백질 시료의 비교를 가능하도록 한다. 본 발명에 의해 달성된 측정은 단백질분해적 분해동안 생성된 펩타이드의 질량만을 계수하는 것이 아니라, 각각의 수득되는 펩타이드의 풍부성도 고려한다. MS에 의한 펩타이드의 풍부성의 측정은 단백질 분해 전에 표지되지 않은 단백질과 혼합된 SITRS 시료를 이용함으로써 가능하다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "SITRS 시료" 또는 "SITRS 표준물"은 단백질내에 존재하는 적어도 하나의 아미노산의 안정한 동위원소 표지된 변이체로 표지된, 공지된 서열의 단백질(예를 들면, 항체)을 의미한다.

Description

단백질 시료들의 비교{COMPARISON OF PROTEIN SAMPLES}
관련 출원
본 출원은, 2010년 6월 16일자로 출원된 미국 가특허원 제61/355,269호에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 이의 전문은 본원에 참조로 인용된다.
본 발명은 안정한 동위원소-태그된 참조 표준물(SITRS: Stable Isotope - Tagged Reference Standard)을 사용한 보텀-업 액체 크로마토그래피(bottom-up Liquid Chromatography) - 질량 분광법(LC-MS)을 사용하여 2개 이상의 단백질 시료를 비교하는 분석 방법에 관한 것이다.
질량 분광법(MS) 검출을 이용한 펩타이드 맵핑(peptide mapping)은 1차 서열의 구조에 대한 단백질 분석에서 사용된다. 공지된 분석 방법은 주로 예측된 펩타이드의 존재를 정성적으로 확인한다.
발명의 개요
하나의 국면에서, 본 발명은
(i) 공지된 아미노산 서열을 가지며, 적어도 하나의 아미노산이 동위원소로 표지된 아미노산으로 대체된 제1 단백질의 시료를 제공하는 단계; (ii) 상기 제1 단백질내 동위원소로 표지된 변이체에 상응하는 표지되지 않은 아미노산을 포함하는 제2의, 표지되지 않은 단백질의 시료를 제공하는 단계; (iii) 상기 제1 시료와 제2 시료를 혼합하여 혼합물을 형성시키는 단계; (iv) 상기 혼합물을 단백질 분해에 적용시켜 제1 분해물을 형성시키는 단계; (v) 제1 분해물을 보텀-업 액체 크로마토그래피 - 질량 분광법에 적용시켜 하나 이상의 이중선 피크(doublet peak) 또는 단일선 피크를 포함하는 제1 스펙트럼을 형성시키는 단계(여기서, 각각의 이중선 피크는 제1 시료로부터의 동위원소로 표지된 펩타이드 및 제2 시료로부터의 상응하는 표지되지 않은 펩타이드의 존재를 나타내며 각각의 단일선 피크는 돌연변이, 변형 또는 불순물을 갖는 펩타이드의 존재를 나타낸다)를 포함하는, 단백질 시료를 특성확인하는 방법에 관한 것이다. 특정 양태에서, 당해 방법은 (vi) 이중선인 피크들의 상대적 강도들을 비교하여 각각의 펩타이드의 상대적인 양을 측정하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 1:1 피크 비(peak ratio)는, 제1 펩타이드 및 제2 펩타이드의 실질적인 동질성을 나타내고, 여기서 피크 강도에 있어서의 차이는 화학적으로 구별되는 펩타이드의 존재를 반영한다. 다른 양태에서, 화학적으로 구별되는 펩타이드의 양을 정량화하는 단계를 추가로 포함하는 방법은 피크 강도에 있어서의 상대적 감소를 기반으로 한다. 다른 양태에서, (vii) 상기 분해물을 탄뎀 질량 분광법(tandem mass spectroscopy)에 적용시켜 펩타이드의 서열을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법은 스펙트럼내 단일선 피크에 의해 나타낸다.
다른 국면에서, 본 발명은 단백질 시료 속에서 돌연변이, 변형 또는 분순물의 존재를 정성적으로 측정하는 방법이다. 당해 방법은 각각의 시료를 안정한 동위원소 - 태그된 참조 표준(SITRS) 단백질과 비교함으로써 2개 이상의 단백질 시료를 서로에 대해 비교하는 단계를 허용한다. 당해 방법은 제1 단백질의 시료를 제공하는 단계[여기서, 공지된 아미노산 서열을 갖는 제1 단백질(SITRS)내 적어도 하나의 아미노산은 동위원소 표지된 아미노산으로 대체된다]; 제1 단백질내 동위원소 표지된 아미노산에 상응하는 표지되지 않은 아미노산을 포함하는 표지되지 않은 단백질의 시료를 제공하는 단계; 제1 단백질과 표지되지 않은 단백질 표준물을 혼합하여 혼합물을 형성시키는 단계; 혼합물을 분해 및 보텀-업 액체 크로마토그래피 - 질량 분광법에 의한 후속적인 분석에 적용시켜 스펙트럼이 각각의 단백질내 이러한 특수 펩타이드의 존재를 나타내는 이중선을 포함하는지를 측정하는 단계를 포함한다. 이중선 피크가 관찰되지 않는 경우, 단일선 피크는 다음 가능성들 중 하나로부터 생성되는 펩타이드에 상응할 수 있다: (1) 펩타이드는 표지된 아미노산을 함유하지 않는다; (2) 펩타이드는 변형을 함유한다; (3) 펩타이드는 돌연변이, 삽입 또는 결실을 함유한다; (4) 펩타이드는 분순물에 상응하며, 단백질 시료 속에 존재하는 아미노산 서열을 함유하지 않는다. 이후에, 단일선 피크를 MS/MS로 분석하여 펩타이드의 서열을 나타내고 상기 나열한 4개의 가능성들 중 어느 것이 존재하는지를 측정할 수 있다.
다른 국면에서, 본 발명은 단백질 시료 속에서 돌연변이 또는 변형의 존재를 정량적으로 측정하는 방법이다. 당해 방법은 공지된 아미노산 서열을 가진 제1 단백질(SITRS)의 시료를 제공하는 단계(여기서, 제1 단백질 중 적어도 하나의 아미노산 서열은 동위원소 표지된 아미노산으로 대체된다); 제1 단백질내 동위원소 표지된 아미노산에 상응하는 표지되지 않은 아미노산을 포함하는 표지되지 않은 단백질 시료의 시료를 제공하는 단계; 제1 단백질과 표지되지 않은 단백질 시료를 혼합하여 혼합물을 형성시키는 단계; 혼합물을 분해 및 보텀-업 액체 크로마토그래피 - 질량 분광법에 의한 후속적인 분석에 적용시켜 스펙트럼이 SITRS 및 표지되지 않은 단백질 시료 둘다에서 이러한 특수 펩타이드의 존재를 나타내는 이중선을 포함하는지를 측정하고, 이중선내 피크의 강도를 비교하여 각각의 단백질내 이러한 특수 펩타이드의 상대적인 풍부성을 측정하는 단계를 포함한다. 추가의 표지되지 않은 단백질 시료는 위에서 기술한 바와 동일한 SITRS 항체를 우선 비교한 후, 각각의 표지되지 않은 단백질 시료 중에서의 결과를 비교하는 단계에 의해 서로에 대해 비교할 수 있다.
본 발명의 이들 및 다른 국면은 당해 분야의 통상의 기술자가 명세서를 고찰하면 이해할 것이며 명백해질 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 SITRS 실험의 개략적인 도해이다.
도 2는 본 발명에 따라 이의 SITRS 대응물의 존재하에서 트립신 분해에 의해 생성된 MAb-1 펩타이드의 대표적인 질량 스펙트럼이다.
도 3은, wt mAb-1을 본 발명에 따라 20%[야생형(wt)과 돌연변이체 mAb 둘다에 존재하는 wt HC(255-273) 펩타이드가 나타남]에 대해 돌연변이체로 스파이크된(spiked) mAb-1과 비교한 SITRS 실험에 대한 추출된 이온 질량 스펙트럼이다.
도 4는 본 발명에 따라서 도 3으로부터 HC(255-273)에 대한 단일동위원소 피크 강도(monoisotopic peak intensity)의 표이다.
도 5는, wt mAb-1을 본 발명에 따라 20%[돌연변이체 mAb에서 변형된 wt HC(218-247) 펩타이드가 나타나 있다]에 대한 돌연변이체로 스파이크된 mAb-1과 비교한 SITRS 실험에 대한 추출된 이온 질량 스펙트럼이다.
도 6은 본 발명에 따라 도 5로부터 HC(218-247)에 대한 단일동위원소 피크 강도의 표이다.
도 7은, wt mAb-1를 본 발명에 따라 20%[돌연변이체 mAb에서만 존재하고 SITRS 시료로부터는 부재한 돌연변이된 HC(218-247) 펩타이드가 나타나 있다]에 대한 돌연변이체로 스파이크된 mAb-1과 비교한 SITRS 실험에 대한 추출된 이온 질량 스펙트럼이다.
도 8은, 본 발명에 따라 크기 배제 크로마토그래피 - 고 성능 액체 크로마토그래피(SEC-HPLC)를 이용하여 항체 탈염을 입증하는 LC 크로마토그램이다.
도 9는 (A) 순수한 표지되지 않은 MAb-1 및 (B) 10% MAb-2로 오염된 MAb-1로부터의 펩타이드의 질량 스펙트럼의 비교이다. SITRS를 본 발명에 따라 트립신 분해 및 분석 전에 1:1 비로 각각 혼합하였다.
도 10은 본 발명에 따라 10% MAb-2로 오염된 MAb-1 시료의 정량화에 있어 연구된 6개 펩타이드에 대한 SITRS 값을 나타내는 그래프이다.
도 11은 본 발명에 따라 사람 배아 신장 293개 세포 대 차이니즈 햄스터 난소 세포(Chinese Hamster Ovary cell)로부터 기원한 MAb-1 펩타이드로부터의 SV의 비교이다.
도 12는, wt mAb-1를 본 발명에 따라 20%에 대한 돌연변이체를 사용하여 스파이크된 mAb-1과 비교한 SITRS 실험에 대한 SITRS 막대 그래프이다.
도 13은, wt mAb-1를 본 발명에 따라 2.5%에 대한 돌연변이체를 사용하여 스파이크된 mAb-1과 비교한 SITRS 실험에 대한 SITRS 막대 그래프이다.
도 14는 본 발명에 따라 각종의 돌연변이체-스파이크된 mAb-1 시료의 SITRS 분석으로 측정한 야생형 항체의 플롯에 대한 돌연변이체-스파이크된 항체내 펩타이드 HC(218-247), HC(344-359) 및 HC(288-300)의 양의 플롯이다.
도 15는 본 발명에 따라 2개의 상이한 공정들[CHO-생산됨(도 15a) 및 HEK-생산됨(도 15b)]을 사용하여 2개의 상이한 세포주들에 의해 생산된 MAb-1 시료의 뱃치(batch)의 비교를 위한 SITRS 막대 그래프이다.
도 16은 본 발명에 따라 통상의 분석을 사용하여 도 15b에서 나타낸 안정한 동위원소-태그된 참조 표준물(SITRS) 결과의 표이다. 뱃치 2(CHO-생산됨) 및 뱃치 3(HEK-생산됨)으로부터 mAb-1의 SITRS 분석(n=6)의 선택된 결과를 통상의 방법으로 수득한 결과와 비교한다(n=3).
도 17은 본 발명에 따라 2개의 상이한 제형 완충액 속에서 약하게 스트레스받은 mAb-1 시료의 비교를 위한 SITRS 막대 그래프이다.
도 18은 본 발명에 따라 변형되지 않은 MAb-1에 대한 DTPA-MAb-1 접합체의 비교를 위한 SITRS 막대 그래프이다.
바람직한 양태의 상세한 설명
이제 참조가 본 발명의 양태들에 대해 상세히 이루어질 것이며, 이중 하나 이상의 예가 다음에 기재된다. 각각의 예는 본 발명을 설명하기 위해 제공되며, 본 발명을 한정하지 않는다. 실제로, 당해 분야의 숙련가에게는, 각종 변형 및 변화가 본 발명의 영역 또는 취지로부터 벗어나지 않고 본 발명내에서 이루어질 수 있음이 명백할 것이다. 예를 들면, 하나의 양태 중 일부로서 설명되거나 기술된 특징들이 다른 양태에서 사용되어 여전히 추가의 양태를 수득할 수 있다.
따라서, 본 발명은 첨부된 특허청구범위 및 이들의 등가물의 영역내에 포함되는 이러한 변형 및 변화를 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 다른 목적, 특징 및 국면은 다음의 상세한 설명에 기재되어 있거나 이로부터 명백하다. 당해 분야에서 통상의 기술을 가진 자는, 본 논의가 단지 예시적인 양태의 설명이며, 본 발명의 보다 광범위한 국면을 제한하는 것으로 의도되지 않음을 이해하여야 한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "단백질" 또는 "폴리펩타이드"는 10개 이상의 아미노산, 예를 들면, 50, 100, 200, 300, 400, 500개 이상의 아미노산의 중합체를 말한다. 본 발명의 예시적인 단백질은 재조합체 단백질, 생물치료학적 단백질, 단클론 항체 및 다른 항체, 항체-약물 접합체 또는 기타 생물접합체, 영상화 항체, 융합 단백질, 또는 PEG화된 단백질을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "단클론 항체"는 하나의 특이적인 부위(항원성 부위)에서 특이적인 표적 분자(항원)에 결합하는 항체 단백질의 부류를 말한다.
본 발명에 의해 달성된 측정은 단백질분해성 분해 동안 생성된 펩타이드의 덩어리 뿐 아니라, 각각의 수득되는 펩타이드의 풍부성도 고려한다. MS에 의한 펩타이드의 풍부성의 측정은 단백질 분해 전에 표지되지 않은 단백질과 혼합된 SITRS 시료를 사용함으로써 가능하다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "SITRS 시료" 또는 "SITRS 표준물"은 단백질 속에 존재하는 적어도 하나의 아미노산의 안정한 동위원소 표지된 변이체를 사용하여 표지된, 공지된 서열의 단백질(예를 들면, 항체)를 의미한다.
따라서, 하나의 국면에서, 본 발명은 단백질(예를 들면, 항체)의 2개의 시료를 비교하여 시료속에서 돌연변이, 변형 또는 분순물과 같은 차이를 정성적으로 및/또는 정량적으로 확인하는 방법이다. 측정은 단백질 분해 및 LC-MS 전에 표지되지 않은 단백질(예를 들면, 표지되지 않은 항체)와 혼합된 SITRS 시료를 사용하여 수행할 수 있다.
내부 표준물로서 안정한 동위원소-표지된 변이체의 도입은 정량화에 영향을 미칠 수 있는 시료 취급 및 MS 검출로부터의 변형 및 인공물(artifact)을 경감(mitigating)시킨다. 본 발명에 따라 경감되는 잠재적인 변화의 예는 단백질 분해의 정도, 시료 취급으로 인한 인공물의 형성 및/또는 MS 검출 동안 이온화 효능에 있어서의 변화를 포함한다. 본 방법을 이용함으로써, 이러한 매개변수를 SITRS 시료와 관련하여 표준화시킬 수 있다.
하나의 국면에서, 본 방법은 표지된 단백질(SITRS 시료)을 제조하는 단계 및 표지된 단백질을 표지되지 않은 단백질 시료와 혼합하는 단계를 포함한다. 이후에, 혼합된 시료를 보텀-업 LC-MS에 적용시켜 표지되지 않은 시료 속에서 낮은-수준의 돌연변이, 변형 또는 불순물을 정성적으로 및/또는 정량적으로 측정할 수 있다. 당해 분석을 또한 사용하여 발현 세포주의 불량한 선택, 성장 배지내에서 비효율, 세포 배양 조건에서 비효율, 정제 공정에서 비효율 또는, 제형 완충액의 부적절성을 측정할 수 있다.
하나의 예시적인 양태에서, 표지되지 않은 항체는 실험적 성장 배지 속에서 형성되거나 실험 세포주/클론에 의해 생산되며, 수득되는 표지되지 않은 항체는 SITRS 시료와 혼합한 후, 혼합된 시료를 단백질 분해 및 보텀-업 LC - MS에 적용시키며, 이를 사용하여, 실험적 성장 배지 세포주/클론이 바람직한 항체 생산을 위해 허용가능한지 여부를 측정할 수 있다.
표준 역상 - 고 성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 조건하에서, 표지된 및 표지되지 않은 펩타이드는 거의 동일한 보유 시간을 가지므로, 함께 이동한다. 크로마토그래피에 의해 해결될 수 없지만, 표지된 및 표지되지 않은 펩타이드는 MS 검출에 의해 구별가능하며 특수 펩타이드내에서 다수의 표지된 잔기에 대해 등가인 달톤(Da)에 있어서의 차이를 생성한다. 따라서, SITRS 시료를 표지되지 않은 항체 또는 다른 단백질과 혼합하는 경우, Da에 있어서 차이를 나타내는 이중선은 질량 스펙트럼에서 나타날 것이며, 이는 표지된 아미노산의 SITRS 시료내로의 혼입, 및 SITRS 시료와 표지되지 않은 항체 둘다에 있어서 동일한 아미노산 서열을 가진 펩타이드의 존재를 나타낸다. SITRS 시료와 이의 표지되지 않은 대응물(1:1 혼합으로)로부터의 차이만이 표지된 아미노산의 존재인 SITRS 시료는, 각각의 피크가 동일한 강도를 가진 이중선을 생산할 것이다.
SITRS 시료는, 중쇄 아미노산을 표준 아미노산 대신 사용하는 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 아르기닌 및 라이신 잔기를 포함하는 단백질을 제조하는 경우, 성장 배지는 천연적으로 풍부한 12C 원자(아르기닌-6 및 라이신-6) 대신에 6개의 13C 원자로 구성된 아르기닌 및 라이신 잔기를 포함할 수 있다.
당해 분야에 공지된 중쇄 동위원소-표지된 변이체는 본 발명에 따라서 유용한 것으로 고려된다. 당해 분야의 숙련가들은, 중쇄 동위원소-표지된 변이체의 선택이 LC-MS 검출을 위한 제조시 단백질 상에서 수행될 단백질 분해 및 형성되는 단백질에 의존할 것임을 인식할 것이다. 예를 들어, 생산되는 단백질이 아르기닌 및/또는 라이신을 포함하고 트립신 분해에 적용될 경우, 중쇄 아르기닌 및/또는 라이신이 바람직할 수 있다. 유사하게, 생산되는 단백질이 아스파르트산을 포함하고 엔도프로테이나제 AspN 분해에 적용될 경우, 중쇄 아스파르트산이 바람직할 수 있다. 생산되는 단백질이 글루탐산을 포함하고 엔도프로테이나제 GluC 분해에 적용될 경우, 중쇄 글루탐산이 바람직할 수 있다. 생산되는 단백질이 아스파르트산 - 아스파르트산 - 아스파르트산 - 아스파르트산 - 라이신의 쇄를 포함하고 엔테로키나제 분해에 적용될 경우, 중쇄 아스파르트산 및/또는 중쇄 라이신이 바람직할 수 있다. 생산되는 단백질이 이소루이신 - 글루탐산 또는 아스파르트산 - 글리신 - 아르기닌의 쇄를 포함하고 인자 Xa 분해에 적용될 경우, 중쇄 이소루이신, 글루탐산, 아스파르트산, 글리신, 및/또는 아르기닌이 바람직할 수 있다. 생산되는 단백질이 아르기닌 - X - X - 아르기닌의 쇄를 포함하고 푸린 분해에 적용될 경우, 중쇄 아르기닌이 바람직할 수 있다. 생산되는 단백질이 히스티딘 - 타이로신 연결을 포함하고 게네아제 I 분해에 적용될 경우, 중쇄 히스티딘 및/또는 타이로신이 바람직할 수 있다. 생산되는 단백질이 방향족 측쇄를 갖는 아미노산을 포함하고 키모트립신 분해에 적용될 경우, 방향족 측쇄를 갖는 중쇄 아미노산이 바람직할 수 있다. 생산되는 단백질이 라이신을 포함하고 Lys-C 또는 Lys-N 분해에 적용될 경우, 중쇄 라이신이 바람직할 수 있다. 생산되는 단백질이 메티오닌을 포함하고 CNBr 분해에 적용될 경우, 중쇄 메티오닌이 바람직할 수 있다. 생산되는 단백질이 아르기닌을 포함하고 엔도프로테이나제 ArgC 분해에 적용될 경우, 중쇄 아르기닌이 바람직할 수 있다. 본 발명은 특수한 동위원소 표지된 변이체 또는 단백질 분해의 특수 방법 및 동위원소 표지된 변이체에 제한되는 것으로 의도되지 않으며 방법들은 단백질에 따라 변할 수 있다.
본 발명은 단백질 정제 단계를 추가로 포함할 수 있다. 당해 분야에 공지된 단백질 정제 방법은 본 발명에 따라 유용한 것으로 고려되며 사용할 수 있다. 단백질 정제 단계는 단백질 분해 전에 수행될 수 있으며, 일부 양태에서, 시료를 혼합하기 전에 단백질 정제 단계를 수행하는 것이 바람직할 수 있다. 다른 양태에서, 시료를 혼합한 후, 그러나, 단백질 분해 전에 단백질 정제 단계를 수행하는 것이 바람직할 수 있다.
일부 양태에서, 단백질 분해 전에 혼합된 시료를 변성시키고/시키거나, 환원시키고/시키거나 알킬화하는 것이 바람직할 수 있다. 변성, 환원 및 알킬화 단계는 당해 분야에 공지된 방법으로 수행할 수 있다. 예를 들면, 변성 단계는 투석, 오프-라인 고체-상 추출(off-line solid-phase extraction: SPE), 온-라인(on-line) SPE, 또는 액체 크로마토그래피(LC), 예를 들면, 크기 배제 크로마토그래피 - 고 성능 액체 크로마토그래피(SEC-HPLC) 또는 역상 - 고 성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)의 사용으로 수행할 수 있다. 온-라인 SPE 또는 LC 방법에서, 유동-속도는 조절될 수 있으며, 자외선(UV) 시그날은 모니터링될 수 있고, 분획 수집은 시간을 맞추어 수행하여 정제된 단백질 만을 수집하고 어떠한 잔류 완충액 또는 성장 과정 또는 시료 처리로부터의 다른 오염물을 수집하지 않을 수 있다.
도 1은 개략적인 SITRS 분석을 제공한다. 도 3 및 도 5는 표지되지 않은 MAb 및 이의 상응하는 SITRS 표준물(변형 또는 돌연변이 없음)을 포함하는 2개의 혼합된 시료에 대한 SITRS 분석으로부터의 질량 스펙트럼을 나타낸다. 알 수 있는 바와 같이, SITRS 표준물 및 표지되지 않은 MAb를 1:1 비로 혼합하여, 단백질(트립신) 분해에 적용시킨 후 보텀-업 LC-MS에 적용시켰다. 표지되지 않은 시료 및 SITRS 표준물 둘다에 대해 일반적인 펩타이드의 수득되는 질량 스펙트럼은, SITRS 표준물 속의 표지된 아미노산의 존재로 인하여, 질량 대 전하(m/z) 피크가 이중선으로 나타난다는 점에서 독특하다. 따라서, 이의 SITRS 대응물에 대해 화학적 조성에 있어 동일하고 이의 SITRS 대응물과 동일한 양으로 존재하는 펩타이드는 표준물(1:1 혼합으로)의 것과 동일한 강도를 가질 것이다(참조: 예를 들면, 도 3).
이의 집단이 예를 들면, 탈아미드화, N-말단 피로글루타메이트, 또는 차등적인 글리코실화와 같이 점 돌연변이체 또는 부위-특이적으로 변형된 분자로 부분적으로 구성된 펩타이드는, 표지되지 않은 시료로부터의 피크 강도가 SITRS 표준물과 비교하여 도 5에서 알 수 있는 바와 같이 화학적으로 명백한 펩타이드의 풍부성을 반영하는 양까지 감소하는 질량 스펙트럼을 가질 것이다. 따라서, SITRS 표준물을 표지되지 않은 단백질 제제와 혼합하고 혼합된 시료를 단백질 분해 및 보텀-업 LC-MS에 적용시킴으로써, 표지되지 않은 단백질 제제내 돌연변이, 변형 및/또는 부위-특이적으로 변형된 분자의 존재를 확인하고 정량화할 수 있다.
상이한 세포주들로부터의 항체 제제는 위에서 기술한 전략을 사용하여 비교할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 방법을 사용하여 실험 성장 배지 속에서 성장시키거나 실험 클론/세포주에 의해 생산된 표지되지 않은 항체 속에서 돌연변이 및/또는 변형의 존재를 정성석으로 확인할 수 있다. 당해 양태에서, 적어도 하나의 동위원소 표지된(isotopically labeled) 아미노산("SITRS 표준물")을 포함하는 표준 시료를 실험 세포주에 의해 생산된 표지되지 않은 항체와 혼합한다. 이후에, 혼합된 시료를 단백질 분해 및 보텀-업 LC - MS에 적용시켜, 실험 세포주가 바람직한 항체의 생산에 허용되는지를 측정할 수 있다.
위에서 논의한 양태와 유사하게, 표지되지 않은 항체 및 SITRS 표준물이 SITRS 표준물내 표지된 아미노산의 존재에 있어서만 상이한 경우, 2개의 시료들은 MS를 통해 함께 이동할 것이며 질량 스펙트럼에서 단지 유의적인 차이는 SITRS 표준물내 표지된 아미노산의 존재를 나타내는 이중선의 형태로 나타날 것이다.
이중선 피크가 관찰되지 않는 경우, 단일선 피크는 다음 가능성들 중 하나로부터 생성되는 펩타이드에 상응할 수 있다: (1) 펩타이드는 표지된 아미노산을 함유하지 않는다; (2) 펩타이드는 변형을 함유한다; (3) 펩타이드는 돌연변이, 삽입 또는 결실을 함유한다; (4) 펩타이드는 분순물에 상응하며 항체 시료 속에 존재하는 아미노산 서열을 함유하지 않는다. 이후에 단일선 피크를 MS/MS로 분석하여 펩타이드의 서열을 밝히고 이들 4개의 가능성들 중 어느 것이 존재하는지를 측정할 수 있다. 도 7은, 예를 들면, 자매 이중선(sister doublet)을 가지지 않는, 돌연변이체 펩타이드의 존재를 나타낸다. 따라서, SITRS 표준물을 표지되지 않은 항체와 혼합하고 혼합된 시료를 단백질 분해 및 보텀-업 LC-MS에 적용시킴으로써, 표지되지 않은 항체내 돌연변이, 변형 및/또는 부위-특이적으로 변형된 분자의 존재를 확인할 수 있다. 이후에, 상이한 세포주에 의해 제조된 수개의 표지되지 않은 MAb를 위에서 기술한 동일한 전략을 이용하여 비교함으로써 가장 우수한 클론을 선택할 수 있다.
본 발명의 다른 국면에서, 표지된 SITRS 표준물은 각각의 표지된 SITRS 표준물 펩타이드의 m/z 피크의 강도를 각각의 이중선내 표지되지 않는 시료의 이의 상응하는 표지되지 않은 펩타이드의 것에 대해 비교함을 통해, 질량 분광분석법에 의한 단백질의 정량화를 가능하도록 한다. 이는 결국 거의 전체 단백질 서열을 포괄하는(spanning) 모든 펩타이드를 비교하도록 한다. 수개의 표지되지 않은 단백질을 이후에 위에서 기술한 전략을 이용하여 서로 비교할 수 있다.
본 발명의 당해 국면에서, 표지되지 않은 단백질이 제조된다. 또한, 표지되지 않은 MAb에 상응하는 SITRS 표준물이 수득된다. 표지되지 않은 단백질 및 SITRS 표준물을 실질적으로 동일하며, 혼합될 경우 도 1에서 알 수 있는 바와 같이, MS에서 1:1 이중선을 나타내어야 한다. 표지되지 않은 단백질내 어떠한 돌연변이 또는 변형의 존재도 정량화하기 위하여, 상응하는 SITRS 표준물을 표지되지 않은 시료와 혼합한다. 상응하는 SITRS 표준물과 표지되지 않은 시료의 혼합물을 이후에 단백질 분해 및 보텀-업 LC-MS에 적용시킬 수 있다. 수득되는 스펙트럼을 이후에 분석하여, 이중선 피크의 강도가 동일한지를 측정할 수 있다.
추가로, 표지되지 않은 MAb 및 SITRS 표준물이 SITRS 표준물내 동위원소 표지된 변이체를 제외하고는 동일한지를 입증하기 위해, 표지되지 않은 MAb 및 SITRS 표준물을 함께 혼합하고, 단백질 분해에 적용시키며, 보텀-업 LS-MS에 적용시킬 수 있다. 수득되는 질량 스펙트럼 패턴은 도 1에서 알 수 있는 바와 같이 실질적으로 1:1 피크를 생성하여야 한다. 이의 집단이 점 돌연변이 또는 부위-특이적으로 변형된 분자(예를 들면, 탈아미드화, N-말단 피로글루타메이트 또는 차등적인 글리코실화)로 부분적으로 구성되는 펩타이드는, 그러나, 표지되지 않은 표준물 시료로부터의 피크의 강도가 SITRS 표준물과 비교하여 화학적으로 명백한 펩타이드의 풍부성을 반영하는 양까지 감소되는 질량 스펙트럼을 가질 것이다(도 1).
2개의 표지되지 않은 단백질 시료를 서로 비교하는 경우, 예를 들면, 표지되지 않은 시료 A를 표지되지 않은 시료 B와 비교하는 경우, 피펫팅 오차(pipetting error) 및 MS 검출로부터 발생할 수 있는 변화를 추가로 최소화하기 위해 필요할 수 있다. 이러한 변화를 최소화하기 위하여, 표지되지 않은 시료 A 대 SITRS 표준물의 비를 수학식 1에 나타낸 바와 같이, 표지되지 않은 시료 B 대 SITRS 표준물의 것과 비교할 수 있다. 수득되는 값은 SITRS 값(SV)으로 명명된다.
Figure pct00001
수학식 1에서, IA는 표지되지 않은 시료 A의 피크 강도이고, ISITRS -A는 표지되지 않은 시료 A와 혼합된 SITRS 표준물의 피크 강도이며, IB는 표지되지 않은 표준물 시료 B의 피크 강도이고, ISITRS-B는 표지되지 않은 표준물 시료 B와 혼합된 SITRS 표준물의 피크 강도이다. 표지되지 않은 시료 A 대 표지되지 않은 표준물 시료 B의 피크 강도 비는 수학식 2에 따라서 [(IA/ISITRS -A)/(IB/ISITRS -B)]의 가장 유사한 비의 평균을 수득함으로써 실험적으로 측정된 상수인 c를 곱함으로써 예측된 시그날의 퍼센트로 전환된다. 2개의 수행들 사이의 일반적인 펩타이드들은 유사한 비를 가질 것인 반면 차이를 지니는 펩타이드들은 상이한 비를 가질 것이다.
Figure pct00002
대안적으로, 수학식 3에 나타낸 바와 같이, 표지되지 않은 시료 A 대 SITRS 표준물의 비를 표지되지 않은 시료 B 대 SITRS 표준물의 것과 비교할 수 있다:
Figure pct00003
수학식 3에서, A 및 B는 각각 시료 A내 펩타이드와 시료 B내 동일한 펩타이드의 상대적인 양이다. IA, IB, ISITRS-A 및 ISITRS-B는 각각 시료 A, B, 시료 A와 혼합된 SITRS 표준물 및 시료 B와 혼합된 SITRS 표준물에서 동일한 펩타이드에 대한 m/z 이온 피크의 강도이다. 상수 c는 시료 A 대 시료 B에 대한 SITRS 표준물의 가능한 동등하지 않은 첨가에 대해 고려된 표준화 인자이다. 구체적으로, c는 전형적으로 해독 후 변형을 겪지 않는 펩타이드의 세트에 대한 B/A 값의 95% 신뢰 구간 밖의 이상치를 제외한 B/A 값의 절삭 평균(trimmed mean)이다. 따라서, c에 의한 IA/ISITRS-A의 곱은 정량화된 펩타이드의 대부분에 대한 IB/ISITRS-B의 비와 동일한 결과를 생산한다.
따라서, 단일의 정량화 실험은 적어도 2개의 단백질 분해물, 즉, 표지되지 않은 시료 A(예를 들면, 잘 특성확인된 참조 항체) 및 SITRS 표준물을 함유하는 것 및 표지되지 않은 시료 B(예를 들면, 문제의 항체 시료) 및 SITRS 표준물을 함유하는 다른 것의 실시(running)를 포함할 수 있다.
다음 실시예는 본 발명의 예시적인 양태를 기술한다. 본원의 특허청구범위의 영역내 다른 양태들은 본원에 기재된 명세서의 고려 또는 본 발명의 실시로부터 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 실시예와 함께, 명세서는 다음 실시예에 수반된 특허청구범위에 의해 나타나는 본 발명의 영역 및 취지와 함께 단지 예로 고려되는 것으로 의도된다.
실시예
달리 나타내지 않는 한, 다음 물질 및 장치가 본 실시예에서 이용되었다. 그러나, 본원에 기술된 방법은 이들 물질들 및/또는 장치만을 사용하는 방법에 한정되지 않는다:
차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 배지 및 아미노산에 사용된 물질은 다음을 포함한다:
· Lys/Arg가 제거된 배지[캘리포니아주 칼스바드 소재의 Invitrogen에서 시판함];
· L-아르기닌(Arg-6) 모노하이드로클로라이드[매사츄세츠주 안도버(Andover) 소재의 Cambridge Isotope Laboratories에서 시판함, 제품번호 CLM-2265-0.25 (MW 216.62)];
· L-라이신 (Lys-6) 디하이드로클로라이드[Cambridge Isotope Laboratories에서 시판함, 제품번호 CLM-2247-0.25 (MW 225.07)];
· L-아르기닌 모노하이드로클로라이드[위스콘신주 밀워키 소재의 Sigma에서 시판함, 제품 번호 A5131-1G (MW 210.66)]; 및
· L-라이신 모노하이드로클로라이드[위스콘신주 밀워키 소재의 Sigma에서 시판함, 제품 번호 L5626-1G, (MW 182.65)]
·밀리-큐(Milli-Q) 물 또는 등가물.
단백질 A 정제에 사용된 물질은 다음을 포함한다:
· r단백질 A 세파로즈 패스트 플로우(Sepharose Fast Flow)[위스콘신주 와우와토사 소재의 GE Healthcare에서 시판함, 제품번호 17-1279-03];
· 1M 트리스 완충된 염수(트리스), pH 8.5;
· IX 인산염 완충된 염수(PBS), pH 7.4;
· 아세트산;
· 염화나트륨;
· 폴리-Prep 크로마토그래피 컬럼[캘리포니아주 허큘레스 소재의 Bio-Rad에서 시판함, 제품번호 731-1550];
· 진공 매니폴드(vacuum manifold);
· UV-Vis 분광광도계, 모델: Cary 50; (캘리포니아주 팔로 알토 소재의 Varian에서 시판함); 및
· Microcon YM-30(매사츄세츠주 빌러리카 소재의 Millipore에서 시판함, 제품번호 42410).
펩타이드 맵핑에서 트립신 분해에 사용된 물질은 다음을 포함한다:
· 요오도아세트산(IAA)(Sigma에서 시판함; 제품 번호 14386-10G);
· 디티오트레이톨(DTT)(Sigma에서 시판함; 제품번호 D-9163);
· 트립신(뉴저지주 레이크우드 소재의 Worthington에서 시판함, 제품 번호 TRSEQZ, 4.61 u/mgP);
· 1M 트리스-HCl, pH 8.0;
· 1M 트리스-HCl, pH 7.5;
· 구아니딘 하이드로클로라이드(Gua-HCl)(뉴저지주 깁스타운 소재의 Calbiochem에서 시판함; 제품번호 369075);
· 5N 염산(HC1); 뉴저지주 필립스버그 소재의 JT Baker에서 시판함; 제품번호 5618-02; 및
· 0.22 ㎛(CA) 멸균 여과기 1회용 장치, Corning Life Sciences에서 시판함; 제품번호 430015.
변성물 및 다른 불순물을 제거하기 위한 겔 여과에 사용된 SEC-HPLC 시스템:
· 아질런트 1200 4급 HPLC 시스템(캘리포니아주 산타 클라라 소재의 Agilent Technologies에서 시판함);
· 아질런트 저장기 트레이(Agilent reservoir tray)(Agilent에서 시판함);
· 아질런트 G1311 A 4급 펌프(Agilent에서 시판함);
· 아질런트 G1322A 디개서(degasser)(라인내)(in-line)(Agilent에서 시판함);
· 아질런트 G1367B HiP-ALS 고 성능 오토샘플러(high performance autosampler)(Agilent에서 시판함);
· 온도 조절기가 장착된 아질런트 G1316A TCC 컬럼 분획(Agilent에서 시판함);
· 토쇼(Tosoh) TSK-Gel SW3000XL 가아드 컬럼(guard column), 6.0mm ID x 40 mm L, 7㎛ 입자(일본 도쿄 소재의 Tosoh에서 시판함, 제품번호 08543);
· 아질런트 G1364C 분석 분획 수집기(Agilent에서 시판함);
· 분획 수집기용 아질런트 G1330B 온도 조절기(Agilent에서 시판함);
· 아질런트 G1365D MWD (UV-VIS 검출기)(Agilent에서 시판함); 및
· 컴퓨터가 장착된 아질런트 케모스테이션 데이타 획득 시스템(Agilent Chemstation data acquisition system)(Agilent에서 시판함).
MS 검출을 사용한 RP-HPLC에 의한 펩타이드 맵핑에 사용된 물질은 다음을 포함한다:
· 트리플루오로아세트산(TFA); (JT Baker에서 시판함; 제품번호 9470-00);
· 포름산(FA); (EMD Chemicals에서 시판함; 제품번호 FX0440-5); 및
· 아세토니트릴(ACN), HPLC-등급(뉴저지주 모리스 타운쉽 소재의 Honeywell Burdick and Jackson에서 시판함, 제품번호 AH015-4).
MS 검출을 사용한 RP-HPLC에 의한 펩타이드 맵핑에 사용된 LC-MS 시스템:
· 아질런트 저장기 트레이(Agilent에서 시판함);
· 아질런트 G1376A 모세관 이원 펌프(Agilent에서 시판함);
· 아질런트 G1379B 마이크로 진공 디개서(인-라인)(Agilent에서 시판함);
· 아질런트 G 1377A 마이크로 WPS 오토샘플러(autosampler)(Agilent에서 시판함);
· 아질런트 G1330B FC/ALS 썸 오토샘플러 터모스타트(Therm autosampler thermostat)(Agilent에서 시판함);
· 온도 조절기가 장착된 아질런트 G1316B TCC SL 컬럼 구획(Agilent에서 시판함);
· 아질런트 G6510A - 6510Q-TOF LC/MS 시스템(Agilent에서 시판함);
· 히긴스 분석 프로토(Higgins Analytical Proto) 200 C18, 5㎛, 250x1.0 mm, 제품번호 RS-2501-D185(캘리포니아주 마운틴 뷰 소재의 Higgins Analytical에서 시판함, 일련 번호 157337);
· 컴퓨터가 장착된 아질런트 매스헌터 데이타 획득 시스템(Agilent MassHunter data acquisition system)(Agilent에서 시판함);
· 아질런트 매스헌터 워크스테이션 소프트웨어 정성적 분석(Agilent MassHunter Workstation Software Qualitative Analysis); 바이오컨펌(Bioconfirm)으로 버젼 B.03.00(Agilent에서 시판함); 및
· 마이크로소프트 엑셀 2003 소프트웨어(Microsoft에서 시판함).
실시예 1
본 실시예에서, 표지되지 않은 단클론 항체(MAb) 및 표지된 단클론 항체를 아르기닌과 라이신 아미노산이 결여된 화학적으로 정의된 배지 속에서 생산하였다. 이후에, 배지에 표지되지 않거나 표지된 L-아르기닌(Arg) 및 L-라이신(Lys)을 각각 3.97 mM 및 5.95 mM로 보충하였다. 항체의 표지되지 않은 버젼 및 표지된 버젼을 당해 분야에 공지된 표준 방법을 사용하여 생산한 다음, 필요할 때까지 -80℃에서 저장하였다.
표지된 MAb-1(SITRS) 및 표지되지 않은 MAb-1의 단백질 A 정제:
컬럼 팩킹
r단백질 A 세파로즈 패스트 플로우를 사용하여 MAb-1(표지된 것 및 표지되지 않은 것)을 정제하였다. 수지를 격렬히 진탕시킴으로써 재현탁시켰다. 세파로즈(1.65 mL, 약 1.2 mL의 수지)를 10 mL의 1X PBS를 함유한 바이오-라드 폴리 프렙 컬럼(Bio-Rad Poly Prep column)(컬럼의 하부는 캡핑(capping)되어 있다)내로 이전시켰다.
수지가 하부에 침전되도록 하였다. 이후에, 뚜껑을 열고 완충액이 이를 통해 유동되도록 하였으나, 수지의 층에 도달하기 직전에 중지시켰다.
단백질 A 정제
수지를 20 mL의 1X PBS(약 2 컬럼 용적)를 ~3-5 mL/분의 속도로 통과시켜 평형화하였다. 시료(10 mL ~ 10 mg)를 컬럼에 ~1 mL/분의 속도로 적용시켰다. 10 mg의 표지된 MAb-1 및 10 mg의 표지되지 않은 MAb-1을 가공하였다.
이후에, 컬럼을 4 x 10 mL(컬럼 용적의 약 2배)의 1X PBS를 ~3-5 mL/분의 속도로 세정하고 시료를 5 mL의 0.1 M 아세트산, 0.15M 염화나트륨, pH 3.5를 사용하여 중력 유동으로 용출시켰다.
시료 재구성
A280의 용출된 MAb-1을 용출물의 10X 희석물 위에서 측정하였다. 구체적으로, 20μL의 단백질을 180 μL의 10 mM 트리스, pH 8.0 완충액을 첨가하여 200 μL로 희석시켰다. MAb-1의 흡광계수(extinction coefficient)는 1.43 mL/mg*AU이었다.
용출된 MAb-1(5 mL)을 0.5 mL의 1M 트리스, pH 8.5로 중화시켜 pH를 7 내지 8 범위로 되도록 하고 시료 속의 트리스의 최종 농도가 100 mM로 되도록 세정하였다.
정제된 MAb-1를 마이크로콘(Microcon) YM-30 원심분리 여과기를 사용하여 추가로 농축시켰다. 여과기의 용적은 0.5 mL이었으므로, 농도는 2 단계로 수행하였다. 시료를 10 내지 15분 동안 10,000 g에서 원심분리시켜 용적을 약 0.25 mL(4x 농도)로 감소시켰다. 최종 시료 농도는 표지되지 않은 MAb-1의 경우 6.07 mg/mL이었고 표지된 MAb-1의 경우 5.63 mg/mL이었다. 이후에, 시료를 -80℃에서 동결시켰다.
SITRS 실험용 시료 제조:
시료는 다음 과정에 따라 제조하였다:
· 표지되지 않은 MAb-1, MAb-2(MAb-1의 이중-점 돌연변이체), HEK-기원한 MAb-1 및 표지된 MAb-1 시료를 밀리-큐 물을 사용하여 4 mg/mL로 희석시켰다.
· MAb-1(4mg/mL)를 이의 이중-점 돌연변이 MAb-2(4 mg/mL)와 혼합하여 MAb-1의 20%, 10%, 5%, 2.5%, 1.25% 및 0.625% MAb-2 돌연변이체-스파이크된 시료를 수득하였다.
· MAb-1 및 돌연변이체-스파이크된 MAb-1 시료(25μL의 4 mg/mL)를 25μL의 4 mg/mL 표지된 MAb-1과 혼합하였다.
· MAb-1, (HEK-기원함, 25 μL의 4 mg/mL)을 25μL의 4 mg/mL의 표지된 MAb-1과 혼합하였다.
시료의 변성, 환원 및 알킬화
각각의 SITRS-스파이크된 시료(25μL)를 75μL의 8M 구아니딘-HCl, 0.1M 트리스, pH 8.0에 가하였다. 시료를 실온에서 15분 동안 항온처리하였다.
환원은 1μL의 1M DTT를 각각의 시료에 가한 후 37℃에서 30분 동안 항온처리하여 수행하였다.
시료를 5 μL의 0.5M IAA를 가한 후 37℃에서 30분 동안 호일 커버(foil cover)하에 항온처리하여 알킬화하였다. 항온처리 후, 과량의 IAA는 1.5μL의 1M DTT를 각각의 시료에 가하여 불활성화시켰다.
SEC-HPLC를 사용한 변성된, 환원된 및 알킬화된 시료의 겔 여과
다음 조건 및 물질을 SEC-HPLC에 대해 사용하였다:
· 컬럼: 토쇼 TSKgel SW3000XL 가아드 컬럼, 6.0mm ID x 40 mm L, 7μm 입자
· 이동상 A: 10 mM 트리스, pH 7.5
· 구배: 등용매
· 유속: 0.25 mL/분, 일정
· 오토샘플러 및 FC 냉각기 온도: 4℃
· 컬럼 오븐 온도: 주위 온도
· 파장: 280 nm
· 총 수행 시간: 6분
· 주입 용적: 100μL(약 100㎍)
· 분획 수집: 시간을 기준으로 함, 실온에서 2 내지 3분 사이에 1개 분획을 수집
SEC-HPLC에 의한 겔 여과
100μL의 각각의 시료를 세척 단계 중간에 SEC-HPLC내로 주입하였다. 대표적인 크로마토그램은 도 8에 나타낸다. 250μL의 정제된 시료를 분획 수집에 의해 회수하였으며; 따라서 최종 농도는 약 0.4 mg/mL이었고 정제 동안 시료 손실이 일어나지 않은 것으로 추정하였다.
컬럼 세척은 각각의 시료 수행 사이에, 100μL의 세정 용액(75mM 트리스 중 6M Gua-HCL, pH 8.0)을 주입함으로써 수행하였다. 컬럼 세척 방법은, 유속이 6분 동안 0.4 mL/분이고 분획을 수집하지 않은 것을 제외하고는 위와 동일하였다.
트립신 분해
8μL의 0.25 mg/mL 트립신(1 mM HCl 속에 재현탁됨)을 200 μL(80 ㎍)의 SEC-HPLC 정제된 시료(1:40의 효소 대 시료 중량비)에 가하였다. 이후에, 혼합물을 30분 동안 37℃에서 항온처리하였다. 항온처리 후, 반응을 4 μL의 1M HCl을 20 mM의 최종 농도가 되도록 첨가하여 퀀칭(quenching)시켰다. 20 μL(또는 약 8μg)의 시료를 HPLC 위에 MS 분석을 위해 로딩(loading)하였다.
트립신-분해된 항체의 LC - MS 분석
다음 조건 및 물질을 LC-MS를 위해 사용하였다:
· 컬럼: 히긴스 분석 프로토(Higgins Analytical Proto) 200 C18 RP 컬럼(5 μm, 200 Å, 1 x 250 mm)
· 이동상 A: 수 중 0.02% TFA, 0.08% 포름산
· 이동상 B: ACN 중 0.02% TFA, 0.08% 포름산
· 구배: 이원(binary)
· 유속: 50 μL/분, 일정
· 초기 조건: 2% B
· 자동샘플러 냉각기 온도: 4℃
· 컬럼 오븐 온도; 60℃
· 총 수행 시간: 120분
· 주입 용적: 20μL(8㎍의 시료)
· 이원 구배 프로그램:
Figure pct00004
본 방법은 처음 4분 동안 용출물을 폐기물로 돌린 후, 이를 바로 질량 분광계내로 돌렸다. 이러한 수행 동안 MS/MS 정보를 수집하지 않음으로써 결과의 정량화를 증진시켰다.
각각의 이중선에서 피크 강도의 정량화를 수행하였으며 항체의 거의 전체 서열에 해당되는 펩타이드의 조합된 서열에 상응하였다. 데이타는 도 10, 도 11, 도 12 및 도 13에 나타낸 바와 같이 "SITRS 막대 그래프"의 형태로 나타내었다.
상기 실시예들로부터 알 수 있는 바와 같이, SITRS의 사용은 단백질 시료의 정성적 및 정량적 비교 둘다에 대한 MS-생성된 데이타의 마이닝(mining)을 가능하게 한다.
상기 실시예들은 SEC-HPLC에 의한 앞서-논의된 겔 여과를 사용하여 변성물질 및 다른 불순물을 제거하였다. 도 8에서 알 수 있는 바와 같이, 용출물을 전통적인 탈염 기술에서 이용가능한 것보다 정제된 및 거의 희석되지 않은 항체 시료의 말기 결과를 사용하여 모니터링하였다. 또한, 시료로부터 구아니딘 염을 거의-완전하게 제거하는 것은 트립신 분해 시간의 유의적인 단축을 허용함으로써 연장된 항온처리에 의해 도입될 수 있었던 시료-취급 인공물을 최소화시켰다.
SEC-HPLC 컬럼 위에 MAb-1을 3회 주입하여 구아니딘 및 다른 오염물질을 제거하였다. 280nm에서의 흡광도를 수행 전체에서 모니터링하였다. 도 8에서 화살표는 시료 수집 개시 및 말기를 나타낸다. 항체는 구아니딘 및 다른 오염물질로부터 분해된 기본선이었다.
등몰량의 SITRS 표준물의 존재하에서 구아니딘 및 다른 오염물질의 제거 후 MAb-1 시료의 분해는 적절한 시그날 강도의 예측된 이중선에 의해 특성확인된 펩타이드의 질량 스펙트럼을 생성하였다. 도 2는 SITRS 표준물과 등몰비로 혼합된, MAb-1의 트립신 분해로부터의 피크의 대표적인 질량 스펙트럼을 나타낸다. 899.9418의 예측된 m/z 피크(LC의 펩타이드 127-142번에 상응하는 [M+2H]+2 피크), 및 표지되지 않은 펩타이드에 대한 천연적으로 존재하는 13C-함유 펩타이드로부터의 단일동위원소(monoisotopic) 피크 외에, SITRS로부터 추가 세트의 피크가 존재한다. MAb-1:SITRS의 피크 강도의 예측된 비는 1이다. 모든 관련 피크의 피크 높이들을 합하여 이루어진 실험 비 측정은 0.811이다. 크로마토그램에서 경쇄로부터의 11개 피크에 대한 비의 계산은 0.823±0.014의 평균 비를 생성한다. 당해 수는 2%의 표준 편차를 사용하여, 시험한 모든 42개 펩타이드에 걸쳐 일치하였다. 이론에 얽메이지 않고, 예측된 비 1로부터의 편차는 초기 단백질 농도에서 피펫팅 오차와 같은 시스템 요인에 기인할 수 있는 것으로 여겨진다.
도 3은 SITRS 표준물과 등몰량으로 혼합된, MAb-1의 트립신 분해물로부터의 피크의 다른 대표적인 질량 스펙트럼을 나타낸다. 중쇄의 펩타이드 255-273번에 대한 1070.5085 [M+2H]2+의 예측된 m/z, 및 표지되지 않은 펩타이드에 대한 천연적으로 존재하는 13C-함유 펩타이드로부터의 단일동위원소 피크 외에, SITRS(1073.5184 [M+2H]2+의 m/z 및 천연적으로 존재하는 13C-함유 펩타이드로부터의 단일동위원소 피크의 m/z)로부터의 피크의 추가의 세트가 존재한다. MAb-1:SITRS의 피크 강도의 예측된 비는 1이다(시료를 1:1의 비로 혼합하고 특수 펩타이드의 변형이 일어나지 않은 경우). 모든 관련 피크의 피크 높이들을 합하여 이루어진 실험적 비 측정은 1.07이다(도 4). 동일한 비가 20% 돌연변이체-스파이크된 MAb-1에서 동일한 펩타이드 HC(255-273)에 대해 수득되었다. 당해 수는 시험한 펩타이드의 대부분에 걸쳐 일치하였다. 그러나, 펩타이드 HC(218-247)를 시험하는 경우(835.15의 m/z), 20%의 돌연변이체-스파이크된 MAb-1에서 표지되지 않은 펩타이드에 상응하는 피크 강도의 상대적인 풍부성은 SITRS 표준물에서 동일한 서열의 표지된 펩타이드에 비하여 감소하였다(도 5). 피크 강도 비에 있어서 명백한 변화를 정량화하여 도 6에 나타내었다. 야생형 MAb 시료(0% 돌연변이체)에서 모든 관련된 피크의 피크 높이들을 합하여 이루어진 실험적 비 측정은 1.11인 반면, 20% 돌연변이체-스파이크된 MAb-1에 대한 동일한 측정은 0.87이다. 20% 돌연변이체-스파이크된 MAb-1으로부터 표지되지 않은 펩타이드 HC(218-247)의 상대 강도에 있어서의 이러한 감소는 MAb-1(MAb-2 시료)의 돌연변이체에서 변형된 당해 펩타이드와 일치한다.
위에서 기술한 SITRS 실험으로부터 수득된 정량적 데이타 외에, 시료에 대한 정성적 정보가 또한 수득될 수 있다. 도 7은 이중선 부재하에 단일동위원소 피크의 세트를 나타낸다. 당해 피크는 야생형 MAb-1에서 존재하지 않는 MAb-2(MAb-1의 이중-점 돌연변이체)로부터의 펩타이드 HC(218-247)에 상응한다.
실시예 2
SITRS 표준물로부터 m/z 피크의 존재는 제공된 펩타이드의 풍부성에 있어서 차이의 정량화를 가능하게 한다. 당해 실시예는 MAb-1 이외의 항체, 예를 들면, MAb-1의 서열과 완전히 일치하지 않는 아미노산 서열을 가진 MAb-2 항체에 의한 MAb-1의 시료의 오염 수준의 정량화를 설명한다.
하나의 실험에서, MAb-1의 시료를 MAb-2를 사용하여 10%(90% MAb-1 + 10% MAb-2)의 최종 농도로 스파이크하였다. 당해 실험은 점 돌연변이를 지닌 항체의 변화하는 양을 함유하는 시료, 제조 동안 사고에 의해 또는 천연의 생물학적 과정에 의해 유발될 수 있는 타당한 시나리오를 모사하기 위한 것이었다. 매우 상동성이기 때문에, 트립신 분해에 의해 생성된 대부분의 펩타이드는 2개의 항체 사이에서 일반적이며 100%의 STIRS 값(SV)을 수득하는 것으로 예측되었다. 6개의 이러한 펩타이드를 연구를 위해 선택하였다. 그러나, 1개 이상의 아미노산에 의해 상이하고 90%의 SV를 갖는 것으로 예측된 약간의 것이 존재한다. 도 9는 이러한 "돌연변이체" 펩타이드로부터의 2개의 질량 스펙트럼을 나타낸다. 제1 스펙트럼은 SITRS와 혼합된 표지되지 않은 항체 표준물(MAb-2를 함유하지 않는 것이 첨가되었다)로부터 기원하며 제2 스펙트럼은 SITRS와 혼합된 10% MAb-2를 함유하는 표지되지 않은, 오염된 시료로부터 온다. 당해 돌연변이를 지닌 펩타이드에 대한 관찰된 SV는 대략 93.3%이다. 보다 광범위하게, MAb-1과 MAb-2 사이에 상이한 펩타이드는, 평균 SV가 93%인 반면, 일반적인 펩타이드는 대략 100%의 예측된 값을 가졌다(도 10). 이러한 차이는 계산되지 않았지만, 이론에 얽메이지 않고, 피펫팅 또는 농도에 있어서의 오차로 설명될 수 있다. 따라서, SITRS 방법을 성공적으로 사용하여 전체 단백질의 10% 수준에서 분자내 점 돌연변이를 확인하였다.
도 11 및 표 1은 CHO 및 293 세포주로부터 기원한 물질을 사용하는 SITRS 실험으로부터의 데이타를 나타낸다. 293-기원한 물질은 CHO로부터 MAb-1보다 중쇄내에서 20% 미만의 아갈락토실화된 당형태(NGA2F) 글리코실화를 갖는다. 또한, 2개의 뱃치는 또한 중쇄에서 C-말단 라이신의 양, 및 또한 N-말단 피로글루타메이트 형성의 양에 있어 상이하다. 이들 변형을 지닌 펩타이드는 SV에서 이들의 현저한 변화에 의한 SITRS 실험에 있어 용이하게 명백하다(도 11에서 별표로 표시된 컬럼). 또한, 풍부성 수준에 있어서의 차이를 나타내지 않는 것으로 예측된 펩타이드(즉, 모든 일반적인 펩타이드)는, 1.4%(0.22 내지 6.31%의 범위)의 변형되지 않은 펩타이드에 대한 평균 표준 편차와 함께, 이들의 SITRS 비에 있어 유사했다.
Figure pct00005
따라서, 알 수 있는 바와 같이, 신규 방법은 내부 참조 표준물로서 안정한 동위원소-태그된 단백질을 사용하여 제공된 단백질의 뱃치들 사이에서 차이를 정량화하도록 고안되었다. MAb-1내로 라이신-6 및 아르기닌-6을 균일하게 혼입하는 것은 표지된 아미노산이 보충된 라이신- 및 아르기닌-결핍성의 화학적으로-정의된 배지를 사용한 세포 배양에서 MAb-1을 생산함으로써 달성되었다. 표지되지 않은 MAb-1과 이의 SITRS 표준물 대응부의 질량 분광법에 의한 비교는, 당해 방법에 의해 생성된 데이타가 2%의 표준 편차로 일치함을 입증하였다. HEK 293 세포주에 의해 생산된 MAb-1에 대한 방법의 적용은 N-말단 피로글루타메이트, C-말단 라이신, 및 NGA2F 수준과 같은 변형의 수준에서 차이를 지닌 펩타이드를 정확하게 확인하였다. 또한, 당해 방법을 성공적으로 사용하여 대략 10%의 수준에서 MAb-2와 MAb-1 사이의 1개 아미노산 차이를 지닌 펩타이드를 확인하였다.
실시예 3
다른 실험에서, MAb-1의 시료를 2점 돌연변이(MAb-2)를 함유하는 돌연변이체 MAb-1으로 스파이크하였다. 구체적으로, 하나의 돌연변이가 펩타이드 HC(218-247)내에 잔류하고 다른 것은 HC(344-349)내에 잔류한다. 돌연변이체를 20%(90% MAb-1 + 20% 돌연변이체 MAb-1, 도 12) 내지 2%(98% MAb-1, 2% 돌연변이체 MAb-1, 도 13) 범위의 최종 농도로 가하였다. 도 12 및 도 13은, 야생형 및 돌연변이체 MAb-1 둘다에 대해 일반적인 펩타이드가 대략 100%의 예측된 값을 가짐을 나타낸다. 2개의 돌연변이체 펩타이드는 대략 80%(도 12) 또는 98%(도 13)의 예측된 값을 가진다. 당펩타이드 HC(GOF-288-300) 및 HC(439-446)는 또한 2개의 시료들 사이에서 상이하다. 이는, 2개의 시료내 당펩타이드와 C-말단 펩타이드가 이들의 올리고사카라이드 조성 및 C-말단 라이신 함량에 있어서 각각 상이한 것으로 알려져 있는 것으로 예측되었다. 도 14는 SITRS에 의해 측정된 것으로서 야생형 MAb내로 스파이크된 돌연변이체 MAb-1의 다양한 양에 대한 야생형 펩타이드 HC(218-247), HC(344-349) 및 HC(G0F-288-300)의 수준에 있어서의 차이 퍼센트를 나타낸다. 당해 방법은 존재하는 돌연변이체의 양에 선형으로 반응하며 방법 검출 한계는 2.4%이다.
실시예 4
시료들 사이를 구별하기 위한 SITRS 방법의 능력을 추가로 시험하기 위하여, 제조 공정에 있어서의 변화가 HEK 세포주내에서 mAb-1을 생산함으로써 자극되었다. CHO- 및 HEK-기원한 mAb의 SITRS 분석은 도 15a 및 도 15b 각각에 나타낸다. 3개의 펩타이드가 분석으로부터 즉시 두드러진다. 첫째로, N-말단 피로글루타메이트 잔기를 지닌 HC(1-39)는 HEK 시료내에서 7.1%까지 보다 풍부하다. 이러한 결과와 일치하여, N-말단 폐환되지 않은 글루타민 잔기를 지닌 HC(1-39)는 CHO-기원한 mAb에서 74%까지 보다 풍부하다. 차이(differentiation)의 제2 부위는 C-말단 중쇄 펩타이드 HC(439-446)내에 있다. 이는 mAb내 일반적인 전사 후 현상인, Lys446의 단백질분해 프로세싱에 있어서의 약간의 차이에 기인하였다. 제3의 유의적인 차이는 각종 당펩타이드의 상대적인 풍부성내에 있다
이들 차이를 입증하기 위하여, MAb를 PNGase F로 탈글리코실화하고 올리코사카라이드를 2-아미노벤조산으로 표지한 후 HPLC로 정량화하였다. SITRS 방법 대 효소 분해에 의해 측정된 것으로서 올리고사카라이드 함량에 있어서의 차이를 도 16에 요약한다. 또한 Agilent로부터의 바이오컨펌 소프트웨어 패키지(Bioconfirm software package)를 지닌 매쓰헌터(MassHunter)를 통해 탈-하전된 및 탈-동위원소화된 피크의 강도의 비교로 측정된 것으로서, SITRS와 표지-유리된 MS 분석 사이의 N-말단 글루타민 전환 및 C-말단 라이신 제거의 수준의 비교가 도 16에 포함된다. 이들 2개의 직교 방법의 결과는 특히 풍부한 펩타이드의 경우 충분히 잘 일치한다.
대조적으로, CHO 세포내에서 동일한 제조 방법에 의해 생산된 mAb의 2개 뱃치는 매우 유사한 것으로 밝혀졌다(도 15a). 3% 미만의 차이가 펩타이드 HC(1-39)내 N-말단 피로글루타메이트 양에서 관찰되었다. 유사하게, HC(392-445)에 있어 상대적인 차이는 단지 3.3%이었다. HEK 세포에서 생산된 뱃치와는 달리, 2개의 CHO-기원한 뱃치는 또한 올리고사카라이드 프로파일링에 의해 지지되는 결과인, 비교가능한 글리코실화 양식을 나타내었다.
실시예 5
SITRS 방법을 또한 성공적으로 사용하여 항체상에서 스트레스의 효과를 평가하였다. 2개의 상이한 완충액 속에 4℃에서 6개월 또는 12개월 동안 저장한 mAb로부터 기원한 펩타이드의 비교는 2개의 시료들 사이의 약간의 차이만을 나타내는 것으로 여겨졌다(도 17). 그럼에도 불구하고, 이러한 약간의 차이가 정량화될 수 있었다. 예를 들면, 12개월 시료의 경우 HC(l-39)에서 피로글루타메이트의 양이 6.2% 증가되었다. 당해 결과는 6개월 시료의 것의 26.8%까지 N-말단 Gln을 함유하는 HC(1-39)의 손실과 관련되었다. 또한, HC(370-391)는 4.7%까지 감소되었다. 이러한 감소는, 탈아민화된 펩타이드가 12개월 시료에서 231%까지 보다 큰 풍부성이 존재하였던 바와 같이, 증가된 탈아미드화에 기여할 수 있었다. 부분 분해된 펩타이드 HC(60-72)(도 17)에서는 12개월 시료에서 6개월 시료에서 관찰된 것보다 911% 더 큰 풍부성이 관찰되었다. 당해 결과는 HC(60-65), HC(66-72), 및 HC(68-72)에서 동시 감소와 관련되었다.
실시예 6
SITRS 방법을 또한 사용하여 단백질에 대한 소 분자, 약물 또는 영상화제의 생접합 실험을 모니터링하였다. 예를 들면, 도 18은, 금속-킬레이팅 영상화제, CHX-A"-DTPA가 항체의 라이신 잔기에 접합된 SITRS 실험으로부터의 데이타를 나타낸다. 원칙적으로, mAb내에 92개의 가능한 반응 부위가 존재한다. 그러나, SITRS 실험은, 단지 3개의 부위(화살표로 표시된 펩타이드)가 > 20%의 정도로 반응함을 나타낸다. 이들 반응 부위는, 이웃하는 C-말단 펩타이드가 또한 이의 상대적인 풍부성에 있어서 변형된 N-말단 펩타이드와 대략 동등한 양까지 감소한다는 사실에 의해 구별된다. 당해 현상은, 트립신 분해 부위가 CHX-A"-DTPA와의 접합시 상실된다는 사실에 기인한다.
모든 논문, 공보, 특허, 특허원, 프리젠테이션, 교본, 보고서, 원고, 브로셔, 서적, 인터넷 포스팅, 학술지 및/또는 정기 간행물 모두를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 본 명세서에 인용된 모든 참조 문헌은, 이들의 전문이 본 명세서내에 참조로 혼입된다. 본원에서 참조문헌의 논의는 단지 이들의 저자에 의해 이루어진 주장을 요약하기 위한 것이며, 어떠한 참조 문헌도 선행 기술을 구성한다는 허락은 허용되지 않는다. 본 출원인은 인용된 참조문헌의 정확성 및 지속성에 도전하는 권리를 보유한다.
본 발명에 대한 이들 및 다른 변형 및 변화는 첨부된 특허청구범위에 보다 특히 설정된, 본 발명의 취지 및 영역에 벗어남이 없이, 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 실시될 수 있다. 또한, 각종 양태의 국면이 전체적으로 또는 부분적으로 상호교환될 수 있음을 이해하여야 한다. 또한, 당해 분야의 통상의 기술자들은, 앞서의 설명이 단지 예이며, 본 발명은 이러한 첨부된 특허청구범위에 기술된 바와 같이 한정하는 것으로 의도되지 않음을 인식할 것이다. 따라서, 첨부된 특허청구범위의 취지 및 영역은 이에 포함된 버젼의 설명에 제한되지 않아야 한다.

Claims (24)

  1. 단백질 시료를 특성확인하는 방법으로서,
    (i) 공지된 아미노산 서열을 가지며, 적어도 하나의 아미노산이 동위원소 표지된 아미노산(isotopically labeled amino acid)으로 대체된 제1 단백질의 시료를 제공하는 단계;
    (ii) 상기 제1 단백질내의 상기 동위원소로 표지된 변이체에 상응하는 표지되지 않은 아미노산을 포함하는 제2의, 표지되지 않은 단백질의 시료를 제공하는 단계;
    (iii) 상기 제1 시료와 제2 시료를 혼합하여 혼합물을 형성시키는 단계;
    (iv) 상기 혼합물을 단백질 분해에 적용시켜 제1 분해물을 형성시키는 단계;
    (v) 제1 분해물을 보텀-업 액체 크로마토그래피 - 질량 분광법(bottom-up Liquid Chromatography - Mass Spectroscopy)에 적용시켜 하나 이상의 이중선 피크 또는 단일선 피크를 포함하는 제1 스펙트럼을 형성시킴(여기서, 각각의 이중선 피크는 제1 시료로부터의 동위원소로 표지된 펩타이드 및 제2 시료로부터의 상응하는 표지되지 않은 펩타이드의 존재를 나타내며 각각의 단일선 피크는 돌연변이, 변형 또는 불순물을 갖는 펩타이드의 존재를 나타낸다)으로써 제2 단백질 시료를 특성확인하는 단계를 포함하는, 단백질 시료를 특성확인하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, (vi) 이중선인 피크들의 상대적 강도들을 비교하여 각각의 펩타이드의 상대적인 양을 측정하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 1:1 피크 비는 제1 펩타이드 및 제2 펩타이드의 실질적인 동질성을 나타내고, 여기서 피크 강도에 있어서의 차이는 화학적으로 구별되는 펩타이드의 존재를 반영하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 피크 강도에 있어서의 상대적 감소를 기본으로하여 화학적으로 구별되는 펩타이드의 양을 정량화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, (vii) 상기 분해물을 탄뎀 질량 분광법(tandem mass spectroscopy)에 적용시켜 스펙트럼내 단일선 피크로 나타내어지는 펩타이드의 서열을 측정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1 단백질내의 실질적으로 모든 등가 아미노산(equivalent amino acid)들이 동위원소로 표지되는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 동위원소 표지된 아미노산이 적어도 하나의 중동위원소(heavy isotope)를 포함하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 분해 및 상기 동위원소 표지된 아미노산이,
    (a) 트립신 분해 및 중쇄 아르기닌, 중쇄 라이신, 및 이들의 조합들 중 하나 이상;
    (b) 엔도프로테이나제 GluC 분해 및 중쇄 글루탐산;
    (c) 엔테로키나제 경쇄 분해 및 중쇄 아스파르트산, 중쇄 라이신, 및 이들의 조합물 중 하나 이상으로부터 선택된 동위원소 표지된 변이체;
    (d) 인자 Xa 분해 및 중쇄 이소루이신, 중쇄 글루탐산, 중쇄 아스파르트산, 중쇄 글리신, 중쇄 아르기닌 및 이들의 조합물 중 하나 이상;
    (e) 푸린 분해 및 중쇄 아르기닌;
    (f) 게네아제 I 분해 및, 중쇄 히스티딘, 중쇄 타이로신 및 이들의 조합물 중 하나 이상;
    (g) 키모트립신 분해 및 중쇄 방향족 아미노산;
    (h) Lys-C 또는 Lys-N 분해 및 중쇄 라이신; 및
    (i) 엔도프로테이나제 ArgC 분해 및 중쇄 아르기닌으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 단백질 분해 전에, 표지된 단백질과 표지되지 않은 단백질을 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질이 재조합체 단백질, 생물치료학적 단백질, 항체, 단클론 항체, 항체 약물-접합체, 영상화 항체, 융합 단백질, 및 페길화된 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질이 항체인, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 분해물이 단백질의 완전한 아미노산 서열의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상을 나타내는 조합된 서열을 갖는 펩타이드들의 집단을 포함하는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 조합된 서열이 상기 단백질의 완전한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서,
    (i) 제1 단백질내 동위원소 표지된 변이체에 상응하는 표지되지 않은 아미노산을 포함하는 제3의 표지되지 않은 단백질의 시료를 제공하는 단계;
    (ii) 상기 제1 시료와 제3 시료를 혼합하여 제2 혼합물을 형성시키는 단계;
    (iii) 제2 혼합물을 제2 단백질 분해에 적용시켜 제2 분해물을 형성시키는 단계; 및
    (iv) 제2 분해물을 보텀-업 액체 크로마토그래피 - 질량 분광법에 적용시켜 하나 이상의 이중선 피크 또는 단일선 피크를 포함하는 제2 스펙트럼을 형성시킴(여기서, 각각의 이중선 피크는 제1 시료로부터의 동위원소 표지된 펩타이드 및 제3 시료로부터의 상응하는 표지되지 않은 펩타이드의 존재를 나타내며 각각의 단일선 피크는 돌연변이, 변형 또는 불순물을 갖는 펩타이드의 존재를 나타낸다)으로써 제3 단백질 시료를 특성확인하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, (v) 제2 분해물로부터의 스펙트럼에서의 이중선 피크들의 상대적 강도들을 비교하여 각각의 펩타이드의 상대적인 양을 측정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 제1 분해물의 결과와 제2 분해물의 결과를 비교하여 제2 단백질 시료와 제3 단백질 시료 사이의 모든 차이들을 측정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  16. 제13항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 비교가 제1 분해물로부터의 스펙트럼의 피크 시그날 비(peak signal ratio)를 제2 분해물로부터의 스펙트럼의 상응하는 피크 시그날 비와 비교함을 포함하는, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1 단백질 시료가 생물의약품 신약(innovator biologic)이고 제2 단백질 시료가 상기 생물의약품 신약의 동등생물의약품(biosimilar)인, 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1 단백질 시료가 접합되지 않은 단백질이고 제2 단백질 시료가 접합된 단백질인, 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1 단백질 시료 및 제2 단백질 시료가 상이한 세포주들, 상이한 세포 유형들 또는 상이한 제조 방법들로 생산되는, 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1 단백질 시료 및 제2 단백질 시료가 상이한 저장 조건들하에서 저장되는, 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 제2 단백질 시료내 돌연변이, 변형 또는 불순물을 검출하기 위해 사용되는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 돌연변이, 변형 또는 불순물이, 변경된 올리고사카라이드 함량, N-말단 글루타민 전환, C-말단 라이신 제거, 변경된 피로글루타메이트 함량, 및 증가된 탈아미드화 또는 산화로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1 시료 및 제2 시료가 실질적으로 동질성인 단백질 제제들인, 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1 시료 및 제2 시료가 약제학적 조성물들인, 방법.
KR1020137001111A 2010-06-16 2011-06-16 단백질 시료들의 비교 KR20130088131A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US35526910P 2010-06-16 2010-06-16
US61/355,269 2010-06-16
PCT/US2011/040669 WO2011159878A1 (en) 2010-06-16 2011-06-16 Comparison of protein samples

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20130088131A true KR20130088131A (ko) 2013-08-07

Family

ID=45329013

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020137001111A KR20130088131A (ko) 2010-06-16 2011-06-16 단백질 시료들의 비교

Country Status (15)

Country Link
US (1) US9170262B2 (ko)
EP (1) EP2582380A4 (ko)
JP (1) JP2013528818A (ko)
KR (1) KR20130088131A (ko)
CN (1) CN103025342A (ko)
AU (1) AU2011268310A1 (ko)
BR (1) BR112012032206A2 (ko)
CA (1) CA2802057A1 (ko)
MX (1) MX2012014838A (ko)
NZ (1) NZ604013A (ko)
RU (1) RU2013101779A (ko)
SG (1) SG186302A1 (ko)
TW (1) TW201207383A (ko)
WO (1) WO2011159878A1 (ko)
ZA (1) ZA201209390B (ko)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2367891T3 (es) 2000-09-29 2011-11-10 Schering Corporation Interleucina-10 pegilada.
EP2468293B1 (en) 2006-09-28 2014-10-22 Merck Sharp & Dohme Corp. Use of pegylated il-10 to prevent metastasis of a cancer or tumor to the lung
WO2012128810A1 (en) 2011-03-23 2012-09-27 Abbott Laboratories Methods and systems for the analysis of protein samples
KR101442117B1 (ko) 2011-06-01 2014-09-18 가부시키가이샤 쓰무라 패턴 또는 fp의 특징량작성방법, 작성프로그램, 및 작성장치
RU2679889C2 (ru) 2013-04-18 2019-02-14 Армо Байосайенсиз, Инк. Способы применения интерлейкина-10 для лечения заболеваний и расстройств
CA2914837A1 (en) * 2013-06-17 2014-12-24 Armo Biosciences, Inc. Method for assessing protein identity and stability
US10010588B2 (en) 2013-08-30 2018-07-03 Armo Biosciences, Inc. Methods of using pegylated interleukin-10 for treating hyperlipidemia
EP3058362B1 (en) * 2013-10-18 2019-01-02 Dr. Reddy's Laboratories Limited In-vitro method for determining fate of polypeptide variant
WO2015070060A1 (en) 2013-11-11 2015-05-14 Armo Biosciences, Inc. Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders
CN106573072A (zh) 2014-06-02 2017-04-19 阿尔莫生物科技股份有限公司 降低血清胆固醇的方法
EP3206713A4 (en) 2014-10-14 2018-06-27 Armo Biosciences, Inc. Interleukin-15 compositions and uses thereof
CN107106655A (zh) 2014-10-22 2017-08-29 阿尔莫生物科技股份有限公司 使用白细胞介素‑10治疗疾病和病症的方法
WO2016126615A1 (en) 2015-02-03 2016-08-11 Armo Biosciences, Inc. Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders
EP3302547A1 (en) 2015-05-28 2018-04-11 Armo Biosciences, Inc. Pegylated interleukin-10 for use in treating cancer
AU2016312510A1 (en) 2015-08-25 2018-03-08 Armo Biosciences, Inc. Methods of using Interleukin-10 for treating diseases and disorders
US11698378B2 (en) * 2015-09-25 2023-07-11 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions for tauopathy diagnosis and treatment
CN109477819A (zh) * 2016-03-02 2019-03-15 沃特世科技公司 通过质谱法鉴定和定量抗体药物缀合物中的缀合肽
JP6943872B2 (ja) * 2016-03-25 2021-10-06 ジェネンテック， インコーポレイテッド 多重全抗体及び抗体複合体化薬物定量化アッセイ
CN105785048B (zh) * 2016-04-15 2017-07-28 同济大学 基于轻同位素近同重标记的整体蛋白质定量分析方法
CN105866429B (zh) * 2016-05-06 2017-12-15 同济大学 基于自带电荷同位素试剂的生物分子标记和定量分析方法
US11385238B2 (en) * 2017-06-30 2022-07-12 Amgen Inc. Methods of protein clips recovery
WO2019094752A1 (en) * 2017-11-09 2019-05-16 University Of Washington A mistranslation method for assessing the effects of amino acid substitutions on protein stability and function
CN109856253A (zh) * 2017-11-30 2019-06-07 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 一种peg修饰蛋白多关键参数同时检测方法
TW202311746A (zh) * 2018-02-02 2023-03-16 美商再生元醫藥公司 用於表徵蛋白質二聚合之系統及方法
EP3775929A4 (en) * 2018-04-10 2022-01-05 DH Technologies Development Pte. Ltd. TOP-DOWN ANALYSIS OF ANTIBODIES IN MASS SPECTROMETRY
EA202190355A1 (ru) * 2018-08-08 2021-05-25 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Применение жх-мс/мс для количественного определения белковых биомаркеров
WO2020245839A1 (en) * 2019-06-06 2020-12-10 Dr. Reddy's Laboratories Limited Method for identification and absolute quantification of product-related impurities in a protein using high-resolution mass spectrometry

Family Cites Families (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
USRE30985E (en) 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
US5476996A (en) 1988-06-14 1995-12-19 Lidak Pharmaceuticals Human immune system in non-human animal
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
ATE135397T1 (de) 1988-09-23 1996-03-15 Cetus Oncology Corp Zellenzuchtmedium für erhöhtes zellenwachstum, zur erhöhung der langlebigkeit und expression der produkte
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
WO1992020791A1 (en) 1990-07-10 1992-11-26 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
EP0564531B1 (en) 1990-12-03 1998-03-25 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
ES2330052T3 (es) 1991-03-01 2009-12-03 Dyax Corporation Proteina quimerica que comprende micro-proteinas que tienen dos o mas puentes disulfuro y relaizaciones de las mismas.
EP0580737B1 (en) 1991-04-10 2004-06-16 The Scripps Research Institute Heterodimeric receptor libraries using phagemids
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
US6914128B1 (en) 1999-03-25 2005-07-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing
US20060141632A1 (en) * 2000-07-25 2006-06-29 The Procter & Gamble Co. New methods and kits for sequencing polypeptides
EP1430436A2 (en) 2000-10-19 2004-06-23 Target Discovery, Inc. Methods for determining protein and peptide terminal sequences
EP1420254A3 (en) * 2002-11-06 2004-05-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Amyloid quantification
RS20050501A (en) * 2002-12-26 2007-08-03 Mountain View Pharmaceuticals Inc., Polymer conjugates of cytokines,chemokines,growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity
US7422865B2 (en) 2003-01-13 2008-09-09 Agilent Technologies, Inc. Method of identifying peptides in a proteomic sample
US7759130B2 (en) 2003-11-21 2010-07-20 Eisai R & D Management Co., Ltd. Mass spectrometric quantitation method for biomolecules based on metabolically labeled internal standards
JP2007519910A (ja) * 2004-01-28 2007-07-19 イマティクス バイオテクノロジーズ ゲーエムベーハー 腫瘍関連ペプチドの同定および定量方法
JP2005300430A (ja) * 2004-04-14 2005-10-27 Shimadzu Corp ラベル化ペプチドの特異的検出法、および片在ピークの特異的検出法
WO2006004213A1 (ja) 2004-07-02 2006-01-12 Eisai R & D Manegement Co., Ltd. タンパク質構造親和性相関の解析方法
US7939331B2 (en) * 2005-03-07 2011-05-10 Life Technologies Corporation Isotopically-labeled proteome standards
JP2006300758A (ja) * 2005-04-21 2006-11-02 Apro Life Science Institute Inc 内部標準ペプチドを用いて生体由来試料に含まれる標的タンパク質を定量する方法
CA2575507A1 (en) * 2006-05-25 2007-11-25 Her Majesty The Queen In Right Of Canada As Represented By The Minister Of The Department Of Fisheries And Oceans Quantification of vitellogenin
FI119190B (fi) * 2006-06-21 2008-08-29 Ipsat Therapies Oy Modifioitu beta-laktamaasi ja menetelmä sen valmistamiseksi
US8679771B2 (en) 2007-01-25 2014-03-25 The Regents Of The University Of California Specific N-terminal labeling of peptides and proteins in complex mixtures
US7943330B2 (en) 2007-03-23 2011-05-17 Academia Sinica Tailored glycoproteomic methods for the sequencing, mapping and identification of cellular glycoproteins
GB0815576D0 (en) * 2008-08-28 2008-10-01 Lucas & Co Analysis of glycated proteins
GB2471155B (en) * 2009-05-06 2016-04-20 Agilent Technologies Inc Data dependent acquisition system for mass spectrometery and methods of use
EP2309262A1 (en) * 2009-10-06 2011-04-13 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Method for quantifying biomolecules
US8847152B2 (en) * 2009-11-30 2014-09-30 Physikron Sa Multiplexed tandem mass spectrometry method
WO2012128810A1 (en) 2011-03-23 2012-09-27 Abbott Laboratories Methods and systems for the analysis of protein samples

Also Published As

Publication number Publication date
BR112012032206A2 (pt) 2016-10-04
EP2582380A1 (en) 2013-04-24
ZA201209390B (en) 2014-02-26
US20110312010A1 (en) 2011-12-22
WO2011159878A1 (en) 2011-12-22
RU2013101779A (ru) 2014-07-27
AU2011268310A1 (en) 2013-01-10
JP2013528818A (ja) 2013-07-11
US9170262B2 (en) 2015-10-27
SG186302A1 (en) 2013-02-28
EP2582380A4 (en) 2014-03-05
NZ604013A (en) 2014-10-31
CA2802057A1 (en) 2011-12-22
MX2012014838A (es) 2013-02-07
CN103025342A (zh) 2013-04-03
TW201207383A (en) 2012-02-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20130088131A (ko) 단백질 시료들의 비교
Huang et al. Higher order structure characterization of protein therapeutics by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry
Chirino et al. Characterizing biological products and assessing comparability following manufacturing changes
Leurs et al. Getting to the core of protein pharmaceuticals–Comprehensive structure analysis by mass spectrometry
US20120264155A1 (en) Multiplex Quantitation of Individual Recombinant Proteins in a Mixture by Signature Peptides and Mass Spectrometry
US20150362506A1 (en) A method for determining glycosylation and terminal modification of samples during protein purification process
Regl et al. A generic HPLC method for absolute quantification of oxidation in monoclonal antibodies and Fc-fusion proteins using UV and MS detection
Todoroki et al. Current mass spectrometric tools for the bioanalyses of therapeutic monoclonal antibodies and antibody-drug conjugates
Li et al. High throughput peptide mapping method for analysis of site specific monoclonal antibody oxidation
US20200369720A1 (en) Characterization of domain-specific charge variants of antibodies
Luo et al. Characterization and analysis of biopharmaceutical proteins
Hühmer et al. Separation and analysis of peptides and proteins
Bou-Assaf et al. Biophysical mass spectrometry for biopharmaceutical process development: focus on hydrogen/deuterium exchange
Gao et al. Physicochemical and functional characterization of HS016, a biosimilar of adalimumab (humira)
Kim et al. A MALDI-MS-based quantitative glycoprofiling method on a 96-well plate platform
Yang et al. In-Depth Characterization of Acidic Variants Induced by Metal-Catalyzed Oxidation in a Recombinant Monoclonal Antibody
Bhattacharya et al. A novel filter-assisted protein precipitation (FAPP) based sample pre-treatment method for LC-MS peptide mapping for biosimilar characterization
Willrich Analysis of tryptic peptides from therapeutic monoclonal antibodies using LC-MS/MS
Kim et al. Characterization of biopharmaceuticals focusing on antibody therapeutics
Ye et al. Detection of protein modifications and counterfeit protein pharmaceuticals using isotope tags for relative and absolute quantification and matrix-assisted laser desorption/ionization tandem time-of-flight mass spectrometry: studies of insulins
Nupur et al. Elucidating chemical and disulfide heterogeneities in rituximab using reduced and non‐reduced peptide mapping
Das et al. Biophysical and Biochemical Characterization of Peptide, Protein, and Bioconjugate Products
Elsayed et al. Edman Degradation Reveals Unequivocal Analysis of the Disulfide Connectivity in Peptides and Proteins
Rock et al. Macromolecular Reference Standards for Biotherapeutic Pharmacokinetic Analysis
Das et al. 8|| Biophysical and biochemical characterization

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid