WO2006004213A1 - タンパク質構造親和性相関の解析方法 - Google Patents

タンパク質構造親和性相関の解析方法 Download PDF

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Yoshiya Oda
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Eisai R & D Manegement Co., Ltd.
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    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/24—Nuclear magnetic resonance, electron spin resonance or other spin effects or mass spectrometry

Definitions

  • the present invention relates to a method for analyzing a structure affinity relationship between a plurality of types of proteins and compounds.
  • Genomic drug discovery has been attracting attention because it analyzes the genome sequences of many organisms, including humans, and creates highly efficient and inevitable drugs based on the genomic information obtained.
  • Many of the drug targets are proteins, but the number of proteins synthesized from human genes, estimated to be 32,000 in total, is simply calculated from the number of genes, considering post-translational modifications. It becomes several times the number.
  • drugs that do not act directly on humans such as antibiotics
  • the ability to analyze a considerable number of proteins for drug discovery is limited to what can actually be targeted by drugs. .
  • Identifying the true target molecule of a drug candidate and the signal transduction pathway involving that target molecule will lead to the elucidation of the mechanism of drug efficacy and side effects, and the efficacy and side effects of other drugs in clinical trials. It plays a big role in trying to differentiate. There are several ways to search for drug target molecules, but direct evidence of drug-target protein interactions must ultimately be verified by biochemical experiments.
  • MS mass spectrometer
  • affinity mouth matrix As a method for isolating a specific protein, the affinity mouth matrix is widely used.
  • a typical example of using affinity chromatography for the purpose of isolating compound binding proteins is the identification of cis-trans peptidyl-prolyl isomerase (FKBP), the target protein of the immunosuppressant FK506. 1 ' 2) Harding et al. Fixed FK506 to Affinity Matritus while maintaining the activity, and loaded the lysate prepared from the spleen onto the column. Then, FKBP was obtained as a protein that specifically binds by competitively eluting the protein bound to the ligand with a non-immobilized FK506 solution.
  • FKBP cis-trans peptidyl-prolyl isomerase
  • the natural product-derived physiologically active substance there is one that that the thus its activity covalently bound to the target stronger 3 - 5).
  • Introduce a tag such as piotin into such a substance add it to cells and incubate for a certain period of time, and then prepare lysate. From the obtained lysate, the compound labeled with a piotine tag can be recovered by a column having avidin immobilized thereon, and the protein bound to the compound can be identified.
  • Sin et al Synthesized a piotinated derivative of fumagillin, which has an anti-angiogenic effect, and reacted it with the extract of moth brain.
  • Affinity chromatography is based on the fact that the interaction between compounds and proteins is non-covalent, except for some naturally-occurring biologically active substances. However, if the affinity is weak, the true target may be dissociated from the compound during the process. For example, a compound may be saturated by a higher affinity protein or a protein that is equivalent in affinity but quantitatively higher. In other words, there are not a few binding proteins due to non-specific interactions among the proteins obtained by affinity chromatography. Drugs with a particularly high protein binding rate can bind to a large number of proteins in serum, etc., so 200-300 types of proteins can bind even after careful washing with 1M sodium chloride in an affinity column, for example. There are many things.
  • Another attempt to increase specificity is to use non-immobilized compounds or molecules that may compete for binding sites, such as ATP or NADH (Nicotinamide adenine dinucleotide), when eluting the binding protein from the compound-immobilized column.
  • ATP ATP
  • NADH Nicotinamide adenine dinucleotide
  • the binding protein analysis of p38 inhibitor SB203580, by elution in combination of compound and ATP have been successful in increasing the recovery of p38 iota upsilon. This method has led to the identification of a number of new kinases that bind to SB203580, which was thought to be specific for ⁇ 38.
  • the target can be masked by mixing free compounds that are not immobilized in the protein mixture before application to the affinity column.
  • the sample containing the masked protein is applied to an affinity column and the column bound protein is separated by SDS-PAGE.
  • the band on SDS-PAGE is compared with and without the mask, and the band disappeared by masking is considered to be the target 2) .
  • the compound has poor solubility in water, a certain degree of solubility can be expected in the protein mixture.
  • E7070 is a compound 14 > screened using the inhibition of the cell cycle of mouse-derived cancer cell P388 in the G1 phase as an indicator, and its binding protein has been unknown. Therefore, we decided to identify the binding protein using E7070 as the affinity probe. In the technique using a probe, how to use a good quality probe is the key. Ideally, the probe should be as active as the original compound.
  • a compound has a structure that is essential for the expression of its activity, but the essential structure is revealed as a structure-activity relationship in the process of the chemical conversion of the compound by the chemist and increasing its activity.
  • the linker is extended to a different part from the essential structure and introduced into the matrix.
  • E7070 a probe was synthesized by converting the sulfamoyl group from the structure-activity relationship.
  • the binding protein was identified by affinity chromatography with E7070 immobilized. However, a large number of proteins bound to this probe, and it was difficult to narrow down the target protein.
  • low-molecular synthetic compounds have low specificity and tend to bind to various proteins.
  • Synthetic low molecular weight compounds such as E7070 are often poorly soluble in aqueous solutions, and it is often difficult to perform specific elution by flowing a large amount of unimmobilized drug through an affinity column. E7070 also has low solubility, and it was unavoidable to elute it by using a step-wise solution such as a surfactant or a denaturant. A variety of purification conditions were examined. In the case of E7070, most of the eluted protein was bound to the compound, not due to nonspecific adsorption to the beads or linker.
  • the compound was synthesized for screening even though it was necessary to immobilize the compound on a carrier (including a carrier packed in a column, hereinafter sometimes referred to simply as “column”). Most of the compounds may not be immobilized on the support (column). Therefore, it needs to be synthesized separately, but it takes a lot of time and effort.
  • the type of protein that binds depends on the site of the compound immobilized on the carrier (column).
  • the activity should not be changed. However, changing the structure may change the specificity and affinity. There is.
  • Negative compound compound with relatively weak activity
  • selection of positive compound compound with relatively strong activity
  • affinity column In general, all negative compounds should be used as affinity columns, but in reality, this is not easy for the reason (1).
  • (4) In general, the amount of compound that is solidified as an affinity column is often about 0.1 mg to several mg per ml of gel, which corresponds to around 1 mM. However, drugs that induce some phenotype on cells (active) show activity on the order of several to several ⁇ and sometimes ⁇ . Therefore, the concentration that shows activity has a large difference from the concentration of the drug immobilized in the force ram.
  • the high concentration of the drug immobilized in the column may include the effects of this toxic region. So against the carrier (column) It is also possible to reduce the amount of immobilized compounds from a few iM to a few nM. It is not always easy to control such a small amount of immobilization, and the amount of protein to be bound, that is, Since the load on the tea column is greatly reduced, the target protein may not be detected by MS. In this case, the column size is increased, for example, 100 to 1000 times, but it is difficult to handle practically.
  • the present invention has been made in view of such a situation, and the problem to be solved is to simultaneously and efficiently analyze the structural affinity correlation between a plurality of types of proteins and compounds. is there.
  • purification includes separation and / or enrichment.
  • purification includes separation and / or enrichment.
  • the above-mentioned compound was fixed out of the contact between the isotope-labeled protein group and the compound.
  • affinity chromatography column multiple types of proteins bound to the column were purified.
  • purified proteins are mixed, the mixed protein is analyzed with a mass spectrometer, each protein is identified from the mass spectrometry information, and the intensity ratio between the labeled peak and the unlabeled peak of each protein is determined. From the difference in binding rate depending on the presence or absence of compounds, we found that the affinity ratio of compounds to each protein was quantified to analyze the structural affinity relationship between multiple types of proteins and compounds. The invention has been completed.
  • the present invention relates to the following.
  • a method for analyzing a structural affinity relationship between a plurality of types of proteins and a compound wherein (a) a carrier on which the compound is immobilized is used on the carrier from among a group of isotope-labeled proteins. Purifying a plurality of types of proteins that bind to the compound of
  • step (c) mixing the proteins obtained in step (a) and step (b);
  • step (d) mass spectrometric treatment of the mixture obtained in step (c);
  • step (c) mixing the proteins obtained in step (a) and step (b); (d) mass spectrometric treatment of the mixture obtained in step (c);
  • step (c) isotopically labeling one of the protein obtained in step (a) or the protein obtained in step (b);
  • step (d) Mixing the labeled protein obtained in step (c) with the protein obtained in step (a) and step (b) that is not labeled in step (c) and the other protein And a process of
  • step (e) mass spectrometric treatment of the mixture obtained in step (d);
  • step (f) a step of identifying each protein in a plurality of types of proteins from mass spectrometry information, and (g) a peak derived from the protein obtained in step (a) and a peak obtained in step (b) for each protein. Determining the ratio of the intensity of the compound to each protein by determining the intensity ratio with the peak derived from the protein,
  • step (b) mixing the protein obtained in step (a) with an isotope-labeled protein group that is an internal standard; (c) mass spectrometric treatment of the mixture obtained in step (b);
  • step (e) mixing the protein obtained in step (d) with an isotope-labeled protein group as an internal standard substance;
  • step (f) mass spectrometric treatment of the mixture obtained in step (e);
  • step (g) a step of identifying each protein in a plurality of types of proteins from the mass spectrometry information obtained in step (c) and step (f), and (h) for each protein, obtained in step (a).
  • the intensity ratio of the peak derived from the protein and the peak derived from the protein that is the internal standard substance and the peak derived from the protein obtained in step (d) and the peak derived from the protein that is the internal standard substance Quantifying the ratio of the affinity of the compound for each protein by determining the intensity ratio and comparing the intensity ratios;
  • step (a2) mass spectrometric treatment of the purified product obtained in step (al);
  • step (a3) a step of identifying each protein in a plurality of types of proteins from the mass spectrometry information obtained in step (a2);
  • step (b2) mass spectrometric treatment of the purified product obtained in step (bl);
  • step (b3) a step of identifying each protein in a plurality of types of proteins from the mass spectrometry information obtained in step (b2); (b4) a step of quantifying each protein in multiple types of proteins; (c) for each protein, the protein mass derived from the protein obtained in step (al) and the protein obtained in step (bl) Determining the ratio to the amount of protein derived, and quantifying the ratio of the affinity of the compound for each protein.
  • step (9) The method according to (5), wherein the contact between the protein group and the compound in step (bl) is performed for a plurality of types of compounds.
  • the isotope is any isotope selected from the group consisting of 2H, 13C, 15N, 170, 0, 33p and 34 S , or a combination thereof, (1) to (4), (6) The method according to any one of (8) and (10).
  • the peak derived from the protein obtained in (d) and the tamper which is an internal standard substance A means for quantifying the ratio of the affinity of a compound for each protein by obtaining an intensity ratio with a peak derived from the protein and comparing the intensity ratios;
  • (a4) means for quantifying each protein in a plurality of types of proteins
  • (b3) Means Means for identifying each protein in a plurality of types of proteins from the mass spectrometry information obtained in (b2), and
  • (b4) means for quantifying each protein in a plurality of types of proteins
  • the isotope is any isotope selected from the group consisting of 2 H,;, 15N, 170, 0, 33 ⁇ and 3, or a combination thereof (13) to (16), ( 18) The system according to any one of (20) and (22).
  • the present invention provides comprehensive coverage of the affinity of the compound structure to which proteins by using compounds having various structures by changing the structure of the compound used in the present invention. It is possible to analyze the structure affinity relationship between a compound and a protein. This makes it possible to obtain useful information that reduces the side effects while enhancing the main effects in the synthesis and development of compounds, especially drugs.
  • ATP ATP
  • GTP Guanosine
  • NAD / NAD H Nicotinamide adenine dinucleotide 7
  • NADP / NADPH Nicotine amide dinucleotide phosphate
  • the carrier on which ATP is immobilized according to the present invention to obtain information on the structure affinity relationship, it is possible to cover which kinase affinity is affected by changing the structure of the compound. It was possible to obtain useful information on specificity, selectivity, etc. in screening for kinase inhibitors.
  • the concentration of the compound bound to the carrier on which the compound is immobilized is generally about 0.1 mg to several mg per ml of the carrier, which corresponds to about 1 mM.
  • concentration of the compound immobilized on a carrier on which the compound is immobilized for example, a chromatography column.
  • the compound concentration can be reduced from several to several nM.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing a first embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing a first embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram schematically showing a second embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a diagram schematically showing a third embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 shows the structural affinity relationship between multiple types of proteins and the compounds represented by Formula 2—Formula 6 (Dich 2—Chemical 6). The smaller the number, the stronger the affinity for the compound.
  • FIG. 6 is a block diagram showing the configuration of the system of the present invention.
  • FIG. 7 is a schematic diagram showing each unit of the system of the present invention.
  • FIG. 8 is a detailed configuration diagram of the control queue.
  • FIG. 9 is a flowchart of the operation of the control unit.
  • FIG. 10 is a schematic diagram of an apparatus for dividing a protein group collected from one culture apparatus into a plurality of groups. Explanation of symbols
  • HDD Hard disk drive
  • the present invention relates to a method for analyzing a structure affinity relationship between a plurality of types of proteins and one or more types of compounds.
  • a protein is purified using a carrier on which a certain compound is immobilized, and
  • a group of proteins and a compound are contacted and the contacted protein is used using the carrier.
  • the quantitative ratio of each protein purified by (i) and (ii) above is basically measured by mass spectrometry using an isotope label or index EMPAI.
  • a carrier (column) on which a certain compound is immobilized a plurality of types of proteins that bind to the compound on the column are purified from a group of isotope-labeled proteins.
  • the carrier (column) on which the compound is immobilized the isotope-unlabeled protein group previously contacted with one or more compounds or the protein group labeled with a different isotope Purify multiple proteins that bind to the compounds on the column.
  • a wide variety of proteins exist in the protein group for example, a protein group extracted from cells
  • the method of the present invention uses a carrier (column), thereby allowing a plurality of types to bind to a compound on a carrier (column).
  • a carrier column
  • a plurality of types of proteins having similar properties of binding to the compound are selected from a protein group including various proteins as a population, and the plurality of types of proteins and one or more types of proteins are selected. Analyzes the structural affinity relationship with a compound.
  • a protein group as a population is previously brought into contact with a compound, and a plurality of types of proteins that bind to the compound on the carrier (column) are purified therefrom using the carrier (column).
  • the proteins there are proteins that bind to the compound in advance, so that the binding sites compete with each other and are difficult to bind to the compound on the carrier (column).
  • the amount of the protein purified from the column (referred to as (cc)) is less than the amount of the protein purified from the column without any prior contact with the compound (referred to as (c)).
  • the present invention analyzes the structure affinity relationship between a plurality of types of proteins and one or more types of compounds using the above principle.
  • structural affinity correlation refers to the correlation between the structural change of a chemical substance having a group of common skeletons and the affinity (binding strength) between the chemical substance and protein.
  • the “protein” includes a peptide in which two or more amino acids are bound by a peptide bond.
  • a carrier on which a compound is immobilized refers to a carrier in which a compound is covalently or non-covalently bonded via a functional group.
  • the carrier on which the compound is immobilized is, for example, as a functional group on the carrier side,
  • N-hydroxy-succinimide and Hydrazide can be covalently bonded, simply converted to an amino group, or Protein A, Heparin, Cibacron Blue F3GA, etc. can be immobilized, and the compound can be directly or compounded to the functional group of such a carrier. A part of the structure of Some of them are shared or non-covalently linked.
  • the compound to be immobilized on the carrier is not particularly limited.
  • a synthetic low molecular weight compound for example, a synthetic low molecular weight compound, a synthetic peptide, a purified or partially purified polypeptide, an antibody, a bacterial release substance (including bacterial metabolites), an in vivo nucleic acid substance (ATP) , GTP, NAD / NADH or NADP / NADPH) and lipids.
  • ATP in vivo nucleic acid substance
  • GTP GTP
  • NAD / NADH or NADP / NADPH lipids
  • the compound immobilized on the carrier has a predetermined activity.
  • the “predetermined activity” means an activity of a compound immobilized on a carrier or a non-immobilized compound described below, and is not particularly limited, for example, physiological activity, biological activity, pharmacological activity, binding And the like.
  • the carrier examples include agarose gel, acrylamide, magnetic beads, cellulose, silica gel, and the like, preferably agarose gel.
  • the carrier can be purchased from, for example, Bio-Rad (Affigle 10, Bio-Radone Earth, Power Tag No. 153-6099).
  • the carrier on which the compound is immobilized can be prepared by binding a desired compound to the carrier.
  • the carrier on which the compound is immobilized can be prepared by the following procedure. First, a compound solution having an amino group is added to a carrier to which N-hydroxy-succinimide is bonded (for example, Affigenole 10). Next, it can be prepared by adding triethylamine, incubating, adding 2-aminoethanol, and further incubation. In addition, it is preferable to appropriately perform a washing operation.
  • the production of the carrier on which the compound is immobilized can be carried out by the following procedure if the compound has a carboxylic acid.
  • rubodiimide is added to a compound solution containing a carboxylic acid, incubated, and then added to a carrier to which an amino group is bound. It can then be made by adding acetic acid (or lactic acid) and further incubation. In addition, it is desirable to appropriately perform a washing operation.
  • the carrier on which NADP analog is immobilized can be purchased from, for example, Amersham Biosciences (2,5'ADP Sepharose 4B (code number 17-0700-01)) o
  • the amount of the compound immobilized on the carrier is not particularly limited, but is preferably about 0.1 mg to several mg per ml of the carrier.
  • the carrier on which the compound is immobilized can be used as a carrier for affinity chromatography, such as a suitable column (for example, a polyprepempty column (Biorad, Cat No. 731-1550), etc. ) Can be used as an affinity chromatography column on which the compound is immobilized. Further, the carrier on which the compound is immobilized can be used by adding it to an appropriate tube (for example, Eppendorf tube (manufactured by Eppendorf)).
  • a first aspect of the present invention is a method for analyzing a structure affinity relationship between a plurality of types of proteins and compounds
  • step (c) mixing the proteins obtained in step (a) and step (b);
  • step (d) mass spectrometric treatment of the mixture obtained in step (c);
  • the method is provided.
  • a first embodiment of the present invention will be schematically described (see FIG. 1).
  • a carrier for example, an affinity chromatography column or the like
  • the amount of the active compound immobilized is preferably about 0.1 mg to several mg per ml of carrier. That's right.
  • Apply this protein group (indicated by triangles, circles, and ellipses in Fig. 1 (a)) labeled with isotopes on the carrier on which this compound is immobilized. Purify the binding protein bound to the compound (indicated by circles and ellipses in Fig. 1 (a)).
  • the obtained multiple types of proteins are designated as protein A (Fig. 1 (a)).
  • the “protein group” means a sample that becomes a population to be applied (applied) to a carrier.
  • a compound not immobilized on a carrier one or more compounds having a predetermined activity. It is preferable that the activity intensity of each compound is different.
  • a, b, c, d) are added to a group of non-isotopically labeled proteins (indicated by triangles, circles and ellipses in Fig. 1 (b)) to an appropriate concentration (eg, several ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ). Incubate for a certain time to bring the protein group into contact with the compound (sample solution).
  • a compound that is added to contact a protein group and is not immobilized may be referred to as a “non-immobilized compound”.
  • this sample solution contains a large amount of protein, even a compound that is difficult to water can be dissolved to some extent.
  • a protein group labeled with an isotope different from the above-mentioned “isotopically labeled protein group” can also be used.
  • Each sample solution is placed on a carrier on which the compound having the predetermined activity is immobilized, and the binding protein bound to the compound is purified.
  • protein B is a set of multiple types of proteins.
  • a sample solution is prepared for each non-immobilized compound, there are as many types of protein B as there are non-immobilized compounds added (Fig. 1 (b)).
  • Fig. 1 (b) four types of non-immobilized compounds (compounds a, b, c, d) are brought into contact with the protein group in advance, indicating that there are four types of B.
  • This protein A and protein B are mixed in a certain ratio (Fig. 1 (c);)
  • Proteins are separated by SDS-PAGE, etc., digested with trypsin, etc., and subjected to mass spectrometry (Fig. 1 (d)) to identify proteins (Fig. 1 (e)).
  • mass spectrometry spectrum Fig. 1 (d)
  • Two peaks the protein A peak from the isotope-labeled sample (dashed line peak) and the protein B peak from the non-isotope labeled sample or from a sample labeled with a different isotope (black solid line peak).
  • the intensity ratio between the peak derived from A and the peak derived from B is obtained, and the ratio of the affinity of the compound for each protein is quantified (Fig. 1 (f)).
  • Proteins bound to non-immobilized compounds are less likely to bind to compound a immobilized on the carrier, so the peak derived from protein B on the mass spectrometry spectrum Is smaller than that derived from protein A.
  • the binding site of compound a and the binding site of compound b on the protein derived from B are the same or overlap, and the affinity for protein P2 is
  • compound b is larger than compound a, or when the concentration of compound b is higher than compound a
  • protein P 2 is immobilized on the carrier because the binding site is used for binding to compound b. It becomes difficult to bind to the compound a.
  • the amount of B-derived protein P2 purified from the carrier is smaller than the amount of A-derived protein P2. Therefore, the mass spectrum peak derived from B is smaller than that derived from A (b—P 2 in Fig. 1).
  • the case where the binding site between the protein P 2 and the compound b masks the binding site with the compound a on the protein P 2 can be similarly considered.
  • proteins that do not bind to the added non-immobilized compound are not affected by the binding to the compound immobilized on the carrier.
  • the substantial amount of protein P 1 that binds to the compound on the carrier will be the same whether or not non-immobilized compound is added.
  • “substantial” means a case where a change in the amount of nonspecific binding of the protein to the carrier-immobilized compound caused by the addition of the non-immobilized compound is not considered. Therefore, the peak of protein P1 derived from B is substantially the same as the peak of protein P1 derived from A (b-Pl in Fig. 1), and the peak intensity ratio does not change.
  • the compound a immobilized on the carrier is a protein (for example,
  • -P3 is a non-specific binding protein bound to a part other than the compound (for example, a carrier part).
  • the peak derived from B is comparable to the peak derived from A on the mass spectrometry spectrum.
  • the protein for example, protein P3 of Fig. 1
  • the protein is added as an active compound, that is, added. It is not considered to be a specific binding protein important for the activity of the compounds a, b, c and d.
  • the non-immobilized compound having a predetermined activity to be added (for example, compound d in FIG. 1) has a low concentration, the peak derived from B is small on the mass spectrometry spectrum.
  • the protein (eg, protein P 4 in FIG. 1) may be an important protein for the activity of the compound.
  • the protein P 4 is likely to be a specific binding protein important for the activity of the non-immobilized compound d having the activity described above.
  • a carrier or column in which ATP, GTP, NAD / NADH, NADP / NADPH, etc. are immobilized can be used as the carrier on which the compound is immobilized (for example, Affinity Mouth Matrix One-Strength Ram). .
  • the compounds and proteins that bind to the ATP, GTP, NAD / NADH or NADP / NADPH binding sites of specific proteins can be determined by examining the degree of affinity of various compounds as well. It is also possible to find a structure affinity relationship with.
  • the “isotope-labeled protein group” refers to a collection of proteins in which a part of the molecules constituting the protein is labeled with an isotope.
  • Isotope-labeled proteins need only have a part of the molecules (amino acids) constituting the protein labeled with an isotope. It is not limited to.
  • Isotope-labeled proteins can be prepared by metabolically isotopically labeling. For example, by culturing a culturable cell in a medium containing an isotopically labeled amino acid, the protein in the cell can be metabolically isotopically labeled. Any culture condition may be used, and a condition suitable for culturing the cells in a liquid medium or a solid medium may be selected. For example, when animal cells are selected, use media such as DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM, etc., and add serum such as urinary fetal serum (FCS), amino acids, glucose, penicillin, or streptomycin as necessary. Incubation can be performed for about 15 to 200 hours at a pH of about 6 to 8 and 30 to 40 ° C. In addition, the culture medium can be exchanged as needed, and aeration and agitation can be performed.
  • FCS urinary fetal serum
  • the isotope-labeled protein group By isolating the cells containing the metabolically isotope-labeled protein group thus obtained, the isotope-labeled protein group can be prepared.
  • the method of crushing is, for example, Downs type Teflon ⁇ ⁇ homogenizer, polytron, ⁇ ring ⁇ blender, potter type glass ⁇ homogenizer, ultrasonic crusher, cell lysate (eg PIERCE M-PER: cat no. 78501) , T-PER: cat no. 78510, etc.) or a freeze-thaw method, and a method using a cell lysate is preferable. It is preferable to remove insoluble substances from the disrupted cells by centrifugation. In this way, an isotope-labeled protein group can be prepared.
  • a radioisotope can be applied, but a stable isotope having no radioactivity is particularly preferable because it is easy to handle.
  • Stable isotopes include, but are not limited to, 2 H, i3C, 15 N, 170, 180 , 33 P or 34 S or combinations thereof, preferably 2 H, i 3 C, 15 N or 180 or a combination thereof, more preferably 13 C, N or 18 0 or a combination thereof, more preferably i 3 C.
  • the isotope used in the present invention is not particularly limited as long as it can label a protein. Nare ,.
  • 13 C-labeled (i 3 C x 6) leucine (manufactured by Cambridge Isotope Labs (CIL), L-Leucine U. 13 C6, CLM-2262) is given as a precursor of isotope-labeled protein. be able to.
  • isotope-labeled proteins can be prepared in vitro.
  • isotope labeling can be achieved by alkylating a cysteine residue in a protein with an isotope-labeled alkylating reagent ('Labid' Communications' In 'Mass' Spectrum (Rapid Communications in Mass SpectroscoDv), Vol. 16, Vol. 15, No. 15, 2000, pp. 1416-1424).
  • isotope labeling can also be performed by piotination of cysteine residues in proteins using an isotope-labeled piotination reagent.
  • it is possible to purify only the labeled protein using an avidin column ("Nature Biotechnology J 17th, 10th, 1 9 9 9 1 October, ⁇ .994 ⁇ 999).
  • non-isotopically labeled protein group refers to a collection of proteins that have not been subjected to the action of isotope labeling.
  • the protein group not labeled with an isotope can be prepared by crushing a biological sample containing the protein, preferably a cell, particularly preferably a cultured cell, and extracting the protein.
  • Destruction methods include, for example, Downs-type Teflon homogenizer, Polytron , Waring 'renderer, Potter type glass' homogenizer, ultrasonic breaker, cell lysate (eg PIERCE MvPER: cat no. 78501, T -PER: cat no.
  • a freeze-thaw method or a freeze-thaw method, and a method using a cell lysate is preferable. It is preferable to remove insoluble substances from the broken cells by centrifugation. In this way, a group of proteins that are not isotopically labeled can be prepared.
  • isotope-labeled protein groups and non-isotope-labeled protein groups may be produced by chemical synthesis.
  • the mass group can be stored under appropriate conditions, preferably not more than 120 ° C., particularly preferably not more than ⁇ 80 ° C.
  • isotope-labeled (isotope non-labeled) protein group is the same as “isotope-labeled protein group” using a natural type reagent (non-isotope reagent). Les, preferably prepared by the method.
  • proteins labeled with different isotopes can be used.
  • the isotopes in the “protein groups labeled with different isotopes” are “isotope-labeled protein groups” as long as the proteins can be labeled so that the masses of the corresponding proteins from both protein groups are different.
  • the isotope may be a different isotope or may contain the same isotope.
  • the carrier on which the compound is immobilized is equilibrated with an appropriate solution.
  • the solution to be equilibrated is not particularly limited, but a solution that can dissolve the protein group and does not denature it is desirable. Examples include phosphate buffer, Hepes buffer or Tris buffer adjusted to physiological pH, and sodium chloride and / or surfactant (such as n-octyldarcoside) as necessary. Can be added in an appropriate amount.
  • the carrier on which the compound is immobilized is packed in an appropriate force ram
  • the compound is immobilized by applying an appropriate solution to the column.
  • the prepared carrier is added to an appropriate tube, it can be carried out by adding an appropriate solution to the tube.
  • the isotope-labeled protein group is dissolved in an appropriate solution. Subsequently, the isotope-labeled protein group is brought into contact with the carrier on which the compound is immobilized. The step of bringing the isotope-labeled protein group into contact with the carrier on which the compound is immobilized is carried out when the carrier on which the compound is immobilized is packed in an appropriate column. If the carrier on which the compound is immobilized has been added to the appropriate tube, add the isotope-labeled protein group to the tube. Can do. Thereafter, it is desirable to wash the carrier on which the compound is immobilized with an appropriate solution.
  • the carrier on which the compound is immobilized is packed in an appropriate column
  • the carrier on which the compound is immobilized is added to the appropriate tube by adding an appropriate solution to the column.
  • the isotope-labeled protein group is eluted with an appropriate elution solution.
  • the elution solution is not particularly limited. For example, 6 M guanidine hydrochloride, 8 M urea, 2% CHAPS, or about 10 mM ATP or GTP can be used.
  • the carrier on which the compound is immobilized is packed in an appropriate column, the compound is immobilized by applying an appropriate elution solution to the column.
  • the activated carrier is added to an appropriate tube, it can be performed by adding an appropriate elution solution to the tube and centrifuging.
  • a protein group that binds to a compound immobilized on a carrier can be purified.
  • the above operating temperatures are not particularly limited, but from 4 ° C to 37 ° C and even from 4 ° C
  • the protein group used in the step (b) includes a protein group not labeled with an isotope label and a protein group labeled with an isotope different from the isotope of the “isotope labeled protein group” in the step (a). It can also be used. In the following description, the case of using a protein group that is not labeled with an isotope will be described, but the same can be applied to the case of a “protein group labeled with a different isotope”.
  • the non-isotopically labeled protein group is brought into contact with the non-immobilized compound, and then the non-isotopically labeled protein group that has been brought into contact with the non-immobilized compound is purified with a carrier on which the compound is immobilized.
  • a plurality of types of proteins that bind to a compound immobilized on a carrier can be purified from a group of proteins that are not labeled with an isotope and contacted with a non-immobilized compound.
  • a compound (non-immobilized compound) to be contacted with a protein group not labeled with an isotope is not particularly limited.
  • These compounds may be novel compounds or known compounds. These compounds have a predetermined activity.
  • Non-immobilized compound to be brought into contact with a protein group not labeled with an isotope
  • a plurality of kinds for example, five or more kinds.
  • these compounds and the compounds immobilized on the carrier are not particularly limited, but are preferably similar in structure to each other.
  • the non-immobilized compound may contain a compound immobilized on a carrier.
  • the intensity of the predetermined activity such as physiological activity or pharmacological activity is different.
  • Various conditions such as the solvent, concentration and incubation of the compound at the time of contact are not particularly limited and can be freely set. Dissolve unisotopically labeled proteins Since the solution contains a large amount of protein, even a compound that is difficult to water can be dissolved.
  • step (c) Step of mixing the proteins obtained in step (a) and step (b)
  • the protein groups obtained in step (a) and step (b) are mixed at a certain ratio.
  • the constant ratio may be equal or the ratio may be changed.
  • the compound In order to improve the dynamic range of the intensity ratio described later, from the above-mentioned "1.
  • (1) (a) isotope-labeled protein group it binds to the compound on the carrier using the carrier on which the compound is immobilized.
  • the compound is selected from the group of proteins previously contacted with the compound against the multiple types of proteins obtained in “1.
  • (2) (b)”. Add an excess amount (eg, 2 to 10 times) of multiple types of proteins obtained in the step of “purifying multiple types of proteins that bind to compounds on the support using an immobilized carrier”. It is preferable.
  • Step (c) The obtained mixture is subjected to mass spectrometry.
  • the mixture may be directly analyzed by a mass spectrometer, but it is preferable to perform concentration (for example, by Amicon Ultra-15 10,000 MWCO) or the following separation or digestion.
  • concentration for example, by Amicon Ultra-15 10,000 MWCO
  • a mixture that has been subjected to the separation or digestion described below is referred to as “separated protein” or “digested protein”.
  • separation methods include two-dimensional electrophoresis, SDS-PAGE, and various types of chromatography (for example, affinity chromatography, reverse phase chromatography, anion exchange chromatography, cation exchange chromatography, etc.).
  • the present invention is not limited to this, and an appropriate one may be selected.
  • Examples of the digestion method include enzyme digestion, chemical decomposition, and the like, and preferably enzyme digestion. However, the digestion method is not limited to this, and an appropriate one may be selected.
  • Examples of the enzyme used for the enzymatic digestion include trypsin, chymotrypsin, Lys-C, Asp-N, and Glu C, and preferably trypsin.
  • a surfactant preferably 5-cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltoside (American Patent Publications US5674987 and US5763586, Anatrace Inc., Maumee, OH, USA) ) Should be added.
  • the concentrated protein, separated protein or digested protein thus obtained can be separated by HPLC, and the obtained protein is referred to as “protein separated by HPLC”.
  • a column used for HPLC may be selected appropriately according to common technical knowledge of those skilled in the art, and is preferably a key-on exchange column or a force thione exchange column.
  • Various HPLC conditions flow rate, detector, mobile phase, etc. can be appropriately selected according to common technical knowledge in the art.
  • a mass spectrometer is a gas chromatography mass spectrometer (GC / MS) that is a mass spectrometer combined with a gas chromatograph or a liquid chromatography mass spectrum that is a mass spectrometer combined with a liquid chromatograph. It can be performed using a general-purpose device such as a trometer (LC / MS). The ionization method in the mass spectrometer can be appropriately selected according to each apparatus.
  • GC / MS gas chromatography mass spectrometer
  • LC / MS liquid chromatography mass spectrum
  • MALDI Mass Assisted Laser Desorption / Ionization
  • ESI Electro Spray Ionization
  • EI Electro Ionization
  • CI Cellular Ionization
  • APCI Admospheric Pressure Chemical Ionization
  • FAB Fluor Atoms Impact method
  • LD FD
  • SIMS SIMS
  • TSP Time-of-flight type
  • ion trap ion trap
  • quadrupole type ion trap
  • Fourier transform type ion trap
  • the apparatus and method of the mass spectrometer are not limited to those described here, and those skilled in the art can appropriately select one that is usually used for mass spectrometry.
  • the “peak derived from the protein obtained in step (a)” means the signal intensity derived from the isotope-labeled protein group in the mass spectrometry spectrum obtained from the mass spectrometry measurement result or It means the sum of them (the ordinary area can be understood by those skilled in the art) (hereinafter sometimes simply referred to as “labeled peak”).
  • the “peak derived from the protein obtained in step (b)” means a protein group that is not isotopically labeled or a different isotope in the mass spectrometry spectrum obtained from the measurement result of mass spectrometry.
  • the signal intensity derived from the protein group labeled with or the sum of the signal intensity hereinafter simply referred to as “unlabeled peak” for convenience of explanation).
  • peak intensity ratio the intensity of the protein
  • isotope-labeled proteins Compared with non-isotopically labeled proteins, isotope-labeled proteins have a molecular weight that is larger than that of isotope-labeled molecules, and are observed as peak peaks on the mass spectrometry spectrum.
  • the molecular weight of an isotopically labeled protein can be determined by calculation from the identified protein and its amino acid sequence.
  • the protein bound to the non-immobilized compound is less likely to bind to the compound on the carrier due to the binding to the non-immobilized compound, so that an unlabeled peak appears on the mass spectrometry spectrum.
  • the amount of protein is smaller than the amount of protein mixed in step (a) (hereinafter sometimes referred to as “protein mixing ratio”).
  • proteins that do not bind to the attached non-immobilized compound are not affected by the binding to the carrier on which the compound is immobilized, so the unlabeled peak does not become small, and the peak intensity ratio and protein mixing ratio No change occurs between.
  • the unlabeled peak of a protein is comparable on a mass spectrometry spectrum.
  • the protein is not a specific binding protein that is important for the activity of the active compound, that is, the non-immobilized compound used for comparison. Conceivable.
  • the non-immobilized compound having a predetermined activity referred to as compound C for explanation
  • the unlabeled peak becomes small on the mass spectrometry spectrum, that is, the peak intensity ratio is protein. If it is smaller than the mixing ratio, the protein may be an important protein for the activity of the non-immobilized compound.
  • the unlabeled peak is affected on the mass spectrometry spectrum by other non-immobilized compounds that are similar in structure to compound C but differ in certain activities such as biological activity, biological activity, pharmacological activity or binding activity. If the peak intensity ratio is not affected, the protein is a non-immobilized compound having a predetermined activity. It is likely that it is a specific binding protein important for the activity of C.
  • the affinity between the non-immobilized compound and the protein is extremely weak (how much is unknown), and if the concentration of the non-immobilized compound is low, the protein is not allowed to pass through the column.
  • the non-immobilized compound that binds to the non-immobilized compound may replace the compound immobilized at a high concentration in the column, but this is affected by increasing the concentration of the non-immobilized compound. Can be reduced.
  • the degree of affinity can be determined by examining various compounds in the same manner. It is also possible to find a structural affinity relationship between a protein and a protein that binds to the ATP, GTP, NAD / NADH, or NADP / NADPH binding site of this protein.
  • the present invention further relates to a system for analyzing a structure affinity relationship between a plurality of types of proteins and compounds,
  • the protein group labeled with isotope is not brought into contact with the compound, and the purification step is performed after the protein group not labeled with isotope is brought into contact with the compound (first embodiment, FIG. 1).
  • the protein is not contacted with a compound group that is not isotope-labeled, and the purification process is performed after the protein group that is labeled with an isotope is contacted with the compound.
  • the system according to the present invention can be implemented by appropriately replacing the devices as the respective constituent elements.
  • the value of the peak intensity ratio is obtained by the formula “labeled peak intensity” / “unlabeled peak intensity”.
  • isotope labeled It is possible to implement the system of the present invention using a protein group labeled with a different isotope instead of a non-protein group.
  • the system for analyzing the structural affinity relationship between a plurality of types of proteins and compounds in the first aspect of the present invention will be described in detail below.
  • the protein group of means (b) will be described below by taking proteins that are not isotopically labeled as an example.
  • FIG. 6 is a block diagram showing the configuration of the system of the present invention.
  • the system of the present invention comprises a control unit 601, a protein purification unit 602, a protein mixing unit 603, and a mass spectrometry unit 604.
  • the control unit 601 controls the overall operation of each unit necessary to carry out the method of the present invention.
  • the protein purification unit 602, the protein mixing unit 603, and the mass spectrometry unit 604 are respectively connected to the control unit 601, and are controlled by the control unit 601 so as to execute independently of each other or in cooperation with each unit.
  • each unit protein purification unit 602, protein mixing unit 603 and mass spectrometry unit 604 is controlled independently from the control unit 601 and the control unit 601 indicates what each unit will do.
  • the control mute 601 monitors the execution contents of each unit, for example, the progress of each unit, and the units cooperate with each other. Controlled.
  • the protein purification unit 602 is a unit for purifying proteins, and includes a cell culture device, a cell disruptor, a contact treatment device with a compound, a carrier for performing chromatography and the like, a recovery device for purified protein, and the like. Each component included in the refining unit is controlled independently or in cooperation with each component according to the command of the control unit 601.
  • the protein mixing unit 603 is a unit that mixes the proteins purified by the protein purification unit 602.
  • the protein mixing unit 603 is connected to the control unit 601, and receives a command such as a mixing amount and a mixing ratio from the control unit 601, and performs mixing processing.
  • the mass spectrometry unit 604 is a unit for subjecting the mixed protein to mass spectrometry, a spotter for spotting the mixed protein on the measurement plate, a tray for subjecting the measurement plate to the mass analyzer, etc. Is provided. These components in the mass analysis unit 604 are connected to the control unit 601 and execute mass analysis processing in accordance with instructions from the control unit 601.
  • FIG. 7 is a schematic diagram showing an embodiment of each unit.
  • the protein purification unit 602 includes a culture apparatus 11a and llb, a culture solution pot 12a and 12b, a cell crusher 13a and 13b, a contactor 14 with a compound, a carrier 15a and 15b on which a compound is fixed, and a protein purification.
  • Culture device 11a and lib is a device for performing cell culture, the temperature, C0 2 concentration, etc. adjusted to the cells for a predetermined time culture.
  • Culture medium bottles 12a and 12b are connected to the culture apparatuses 11a and lib, respectively, and the culture medium may be supplied to each culture apparatus via tubes la and lb, respectively.
  • the culture apparatus 11a and lib may be provided with stirring blades 2a and 2b, respectively.
  • the culture apparatuses 11a and lib are illustrated as containers for culturing floating cells, but this is an embodiment for explaining the system of the present invention, and is not limited. Therefore, when culturing cells adhering to the culture plate, those skilled in the art can select a culture container according to the purpose.
  • the culture apparatuses 11a and lib are connected to the control unit 601 via the LAN 100.
  • the culture solution bottles 12a and 12b are containers for storing a culture solution for culturing cells.
  • the culture solution bottle 12a is mixed with an amino acid or the like for isotopically labeling a protein group.
  • the culture solution bottles 12a and 12b may be connected to the control unit 601 via the LAN 100.
  • the cell disrupters 13a and 13b are devices for crushing cultured cells to obtain a protein group.
  • the cells are collected from the culture apparatus lla and lib force to crush the cells, and the protein groups are suspended. A step of obtaining a suspension is performed.
  • the cell disrupters 13a and 13b may be connected to the control unit 601 via the LAN100.
  • Compound contactor 14 is a device for contacting proteins with compounds. is there.
  • FIG. 7 shows an embodiment in which a protein group not labeled with an isotope and a compound are preliminarily brought into contact with each other before being applied to a carrier (the first embodiment of the present invention). Indicates.
  • the compound contactor 14 may be placed next to the cell disruptor 13a to pre-contact the isotope-labeled protein group with the compound prior to application to the carrier. This can be easily understood by those skilled in the art.
  • the contactor 14 with the compound may be connected to the control unit 601 via the LAN 100.
  • the carriers 15a and 15b on which the compound is immobilized are force rams for purifying the protein, and the compound is immobilized inside.
  • the protein group and each compound may be brought into contact with each other in the contactor 14 with the compound.
  • the sample derived from the culture apparatus lib is the same sample subjected to the same treatment. Therefore, the protein group to be introduced into the contactor 14 with the compound may be a protein group collected using a culture apparatus lib and a cell destructor 13b that are different for each compound.
  • a single culture device lib and a cell crusher 13b are used, and the protein group collected therefrom is divided into a plurality (for example, the number of non-immobilized compounds) and introduced into the contactor 14 with the compound. May be.
  • the protein purification controllers 16a and 16b introduce proteins into the carriers 15a and 15b on which the compounds are immobilized, and pass the carriers through the purified protein fractionators 17a, The process sent to 17b is executed.
  • the protein purification controllers 16a and 16b may be connected to the control unit 601 via the LAN 100.
  • the purified protein fractionators 17a and 17b temporarily store the purified protein obtained in one purification step and the purified protein obtained in the other purification step. If the amount of protein is large, the same type of protein (protein purified from the same cell) can be dispensed into multiple bottles.
  • Figure 7 shows one type of culture purification process.
  • Several types of culture purification steps can be performed, and as a result, multiple types of proteins from different cells can be purified. In that case, it is necessary to distinguish and store each purified protein in a sorter.
  • the purified protein sorters 17a and 17b store separate proteins for each sorter. It is also possible to adopt a mode in which different types of proteins are stored for each bottle in the sorter.
  • FIG. 7 shows a mode in which the purified protein fractionators 17a and 17b are controlled by the protein purification controllers 16a and 16b.
  • the present invention is not limited to this, and independently via LAN100. It may be connected to the control unit 601.
  • a protein mixing unit 603 is a unit that mixes one protein purified by the protein purification unit 602 and the other protein. The protein mixing unit 603 selects the samples arranged in the purified protein fractionators 17a and 17b and mixes them at a certain ratio according to the instruction from the control unit 601.
  • FIG. 7 shows a state in which the samples with the same number are mixed in the tube 18 such as samples 1 and 2.
  • the mass spectrometry unit 604 is a unit that analyzes one or more kinds of protein samples to be subjected to mass spectrometry.
  • the mass spectrometry unit 604 spots the sample mixed by the protein mixing unit 603 on the mass analysis plate 19 in accordance with the instruction of the control unit 601, and executes the mass spectrometry processing by the mass spectrometry processing device 20.
  • a computer-controlled mouth bot-type sample handling device can be used.
  • Mass spectrometry is executed according to the command of the control unit 601 via the LAN 100.
  • the mass spectrometry processing can be executed by installing a computer 21 attached to the mass spectrometry processing device 20.
  • Information on the mass spectrometry processing is transmitted to the control unit 601 via the LAN 100, and is subjected to processing for obtaining a protein identification profile, an intensity ratio profile, and an affinity ratio profile.
  • a control unit 601 is a central control unit for implementing the system of the present invention. It is equipped with a central computer 30 and an internet communication line.
  • the control unit 601 executes protein identification, determines the intensity ratio between the isotope labeled peak and the unlabeled peak, and the affinity ratio, and displays them on the display unit in the control unit 601. Each data is automatically organized by the control unit 601.
  • FIG. 8 is a detailed configuration diagram of the control unit 601.
  • the central computer 30 includes a CPU 801, a transmission Z reception unit 802, an input unit 803, an output unit 804 ROM805 RAM806, a disk drive (HDD) 807, a CD-ROM drive 808, and a protein database (hereinafter “DB”). ”) 809 is provided.
  • the CPU 801 controls the operation of the entire system of the present invention, and records data of mass analysis results, identified protein data, intensity ratio data, affinity data, and the like in the DB 809.
  • the CPU 801 can collate with other protein data via the Internet 811 using the communication control of the transmission / reception unit 802 and the data stored in the DB 809.
  • the transmission Z reception unit 802 performs data transmission and reception processing with the protein purification unit 602, the protein mixing unit 603, and the mass spectrometry unit 603 in accordance with instructions from the CPU 801.
  • the input unit 803 is a keyboard, a mouse, a touch panel, etc., and is operated when inputting information from the user, updating the contents of the database, or the like.
  • the output unit 804 is an LCD (liquid crystal display) or the like, and converts the code data from the CPU 801 into display data each time when updating various databases, and performs display processing.
  • the ROM 805 stores a processing program for the system of the present invention.
  • the RAM 806 temporarily stores data necessary for processing of the system of the present invention.
  • the HDD 807 is a drive for storing mass analysis data and the like.
  • the CD-ROM drive 808 reads a program and the like necessary for executing the system of the present invention (execution of various aspects) stored in the CD-ROM 810 according to a command from the CPU 801, and writes it in the RAM 806 or the like.
  • a rewritable CD-R CD-RW or the like can be used as a recording medium instead of a CD-ROM.
  • a CD-R or CD-RW drive is provided instead of the CD-ROM drive 808.
  • DVD MO flash memory states It is also possible to use a medium such as a disk and have a drive corresponding to it.
  • the central computer 30 communicates with the protein group purification unit 602, the mixing unit 603, and the mass spectrometry unit 604, and sends control information for these units to function, as well as protein identification results and protein Receives mass analysis results and displays identification results, intensity ratio, and affinity ratio identification results.
  • the central computer 30 of the control unit 601 instructs the filling device (not shown) to fill the one culture device 11a with the culture solution, sample (cell), and other reagents necessary for the implementation of the present invention, and the protein.
  • the reagent filling device (not shown) is instructed to add an isotope-labeled substance (isotopically-labeled amino acid, etc.) necessary for labeling, and the filling device performs filling (S901a).
  • the central computer 30 instructs the reagent filling device (not shown) to fill the other culture device lib with the culture solution, sample (cell) and other reagents necessary for carrying out the present invention.
  • the filling device (not shown) performs filling (S901b).
  • the central computer 30 next instructs each culture apparatus lla and lib to incubate under predetermined conditions, and each culture apparatus lla and lib performs culture. Execute (S902a, S902b).
  • the "predetermined condition" incubation time, incubation temperature, C0 2 concentration, presence or absence of stirring and the like.
  • the central computer 30 After culturing under the predetermined conditions, the central computer 30 instructs the cell disruption devices 13a and 13 to perform the cell disruption process, and each of the cell disruption devices 13a and 13 executes the cell disruption (S903a and S903b). ). After disrupting the cells collected from the medium containing the isotope-labeled substance by S903a, the central computer 30 then instructs the carrier 15a, on which the predetermined compound is immobilized, to perform the protein purification step, and the carrier Performs protein purification (S905a). On the other hand, after disrupting cells collected from the medium containing no isotope by S903b, the central computer 30 then performs contact treatment between the compound and the compound so that the disrupted product (protein group) is contacted with the compound.
  • the contactor 14 is commanded, and the contactor 14 performs contact (S904).
  • purification of the protein is performed in the same manner as S905a (S905b).
  • the central computer 30 prepares for protein purification in preparation for later mixing (S907).
  • the controller 16a and 16b are instructed to temporarily store the protein sample after it has been separated by the purified protein fractionators 17a and 17b, and the controller executes the separation and temporary storage (S906a and S906b). Thereafter, the central computer 30 instructs the purified protein mixing unit 603 to mix the separated purified protein, and the purified protein mixing unit 603 mixes the purified protein (S907).
  • the central computer 30 commands the preparation of a sample for mass spectrometry (S908).
  • This sample preparation step for mass spectrometry may be performed in a well tray for culture or in another well tray (S908).
  • the central computer 30 causes the spotter (not shown) to spot the prepared material on a plate for mass spectrometry (for example, plate 19 in FIG. 7), and then the mass spectrometer opens the sample for mass analysis.
  • the spotter executes the spot, and the mass spectrometer performs the analysis (S909).
  • the central computer 30 identifies the protein (S910), calculates the intensity ratio between the labeled peak and the unlabeled peak of each protein, and quantifies the ratio of the affinity of the compound for each protein (S911). Protein identification results and intensity ratio data are reported to the central computer 30 and the output device or computer display displays the identification results and intensity ratio (S912).
  • the central computer 30 inquires the data of the intensity ratio and the identification result with the existing information, and stores it in the hard disk to create a database (S913).
  • a second aspect of the present invention is a method for analyzing a structure affinity relationship between a plurality of types of proteins and compounds
  • step (b) purifying a plurality of types of proteins that bind to the compound on the carrier from a group of proteins previously contacted with the compound using a carrier on which the compound is immobilized; (c) isotopically labeling one of the protein obtained in step (a) or the protein obtained in step (b);
  • step (e) mass spectrometric treatment of the mixture obtained in step (d);
  • the method is provided.
  • the step consists of the above-mentioned “1.
  • (1) (a) from the group of isotope-labeled proteins, a plurality of types of proteins that bind to the compound on the carrier using the carrier on which the compound is immobilized.
  • a plurality of types of proteins that bind to the compound immobilized on the carrier can be purified by the same method as in the “purifying step”.
  • the protein group used in step (a) may be a protein group not labeled with an isotope, or a protein group labeled with an isotope different from the isotope used in step (c).
  • the process includes the above-mentioned “1. (2) (b) Multiple types of proteins that bind to the compound on the carrier using the carrier on which the compound is immobilized from the protein group previously contacted with the compound. A plurality of types of proteins that bind to the compound immobilized on the carrier can be purified by the method according to the “step of purifying the protein”.
  • the protein group used in step (b) may be a protein group not labeled with an isotope, or a protein group labeled with an isotope different from the isotope used in step (c).
  • Either the protein obtained in step (a) or the protein obtained in step (b) is isotopically labeled.
  • the isotope used in step (c) can be a radioactive isotope, but a stable isotope that is not radioactive is particularly preferred because it is easy to handle.
  • the stable isotopes include, but are not limited to, 2H, @ 13 C, 15 N, 17_Rei, 18 0, 33p or 34g or combinations thereof, preferably 2 H, 13 C, i 5 N or 180 or a combination thereof, more preferably 13 C, 15 N or ISO or a combination thereof, and more preferably i 3 C.
  • the isotope used in the present invention is not particularly limited as long as it can label a protein. The specific isotope labeling method is described below.
  • the protein obtained in step (a) or step (b) can be isotopically labeled in vitro.
  • isotope labeling can be achieved by alkylating cysteine residues in proteins with isotope-labeled alkylating reagents (“Rapid Communications 'In'mass' spectrum metric (Rapid Communications in Mass Spectrometry) J, Vol. 16, Vol. 15, No. 15, 2000, pp.1416-1424)
  • isolating the biotin reagent labeled with cysteine residues in proteins It is also possible to use an avidin column to purify only the labeled protein (see “Nature Biotechnology”). ) ”No. 17, No. 10, 1 9 9 10 October, pp.994'999).
  • peptide fragments obtained by digesting proteins can be labeled with isotope-labeled molecules such as C-terminal, N-terminal, dartamic acid residue, and aspartic acid residue.
  • isotope-labeled molecules such as C-terminal, N-terminal, dartamic acid residue, and aspartic acid residue.
  • digesting proteins with enzymes label them with 180 in buffer. Add water.
  • chymotrypsin, trypsin, Asp-N, Lys_C, Glu-C can be used.
  • Kimotoribushin when using the Asp-N is 18 0 Gertz be located at the C-terminus of peptides after hydrolysis, trypsin, Lys-C, when using a Glu C is the peptide after hydrolysis C It is known that both oxygen atoms of the terminal carboxylic acid are 180 .
  • N-terminal of peptide fragments obtained by digesting proteins can be converted to nicotinic acid derivatives (Munchbach M, Quadroni M, Miotto G, James P. Quantitation and facilitated de novo sequencing of proteins by isotropic N-terminal labeling of peptides.
  • Anal. Chem. 2000: 72, pp.4047-4057 and acetylation methods (Ji. J. C. Kraborborty A, Geng M, Zhang X, Amini A, Bina M, Regnier F. Strategy for quantitative and quantitative analysis in proteomics based on signature peptides. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 2000-745, pp.197-210) is known. Therefore, isotope labeling can also be performed by using these isotope-labeled reagents.
  • This step can be performed by a method according to the above “1 (3) (c) Step of mixing the proteins obtained in step (a) and step (b)”.
  • Step (d) Step of mass spectrometric treatment of the resulting mixture This step can be performed by the same method as the above-mentioned “1. (4) (d) Step of mass spectrometry treatment of the mixture obtained in step (c)”.
  • This step can be carried out by the same method as in “1. (5) (e) Identifying each protein in a plurality of types of proteins from mass spectrometry information” above.
  • the intensity of the peak derived from the protein obtained in step (a) and the peak derived from the protein obtained in step (b) The ratio can be determined by a method similar to the step of quantifying the affinity ratio of a compound to each protein.
  • one of the protein obtained in the step (a) and the protein obtained in the step (b) is isotopically labeled in the step (c), and the other is not isotopically labeled.
  • the value of the peak intensity ratio is calculated by the formula of “peak intensity derived from the protein obtained in step (a)” / “peak intensity derived from the protein obtained in step (b)”. Desired.
  • the present invention further provides a system for analyzing a structure affinity relationship between a plurality of types of proteins and compounds,
  • (c) means for isotopically labeling one of the protein obtained by means (a) or the protein obtained by means (b);
  • (d) A means for mixing the labeled protein obtained in the means (c) with the other protein not labeled in the means (c) among the proteins obtained in the means (a) and the means (b)
  • the means for purifying a plurality of types of proteins that bind to the compound on the carrier using the carrier on which the compound is immobilized is described in “1.
  • the protein group that is not labeled with an isotope can be used, or a protein group that is labeled with an isotope different from the isotope used in the means (c) can be used.
  • a means for purifying a plurality of types of proteins that bind to a compound on a carrier from a group of proteins that have been contacted with a compound in advance using a carrier on which the compound is immobilized is described in ⁇ 1.
  • a protein group that is not labeled with an isotope can be used, or a protein group labeled with an isotope different from the isotope used in the means (c) can be used.
  • step (c) A means for isotopically labeling one of the protein obtained in the means (a) or the protein obtained in the means (b) is obtained in the above-mentioned “2.
  • step (a) It is the same as the means used in the step of isotopically labeling one of the protein or the protein obtained in step (b).
  • step (d) A means for mixing the labeled protein obtained in the means (c) with the other protein not labeled in the means (c) among the proteins obtained in the means (a) and the means (b) Is equivalent to the means used in the above “1.
  • step (c) Step of mixing the protein obtained in step (a) and step (b)”.
  • step (d) According to the means used in “the step of mass spectrometric treatment of the mixture obtained in step (c)”.
  • the means for identifying each protein in a plurality of types of proteins from the information of mass spectrometry is the above-mentioned step (1) (5)
  • step (g) For each protein, determine the intensity ratio between the peak derived from the protein obtained in step (a) and the peak derived from the protein obtained in step (b), and determine the affinity of the compound for each protein.
  • the means for quantifying the ratio of “1. (6) (f)” for each protein is the peak derived from the protein obtained in step (a) and the peak derived from the protein obtained in step (b). This is in accordance with the means used in the step of “determining the ratio of the affinity of a compound for each protein by determining the strength ratio of the compound”. In this case, the value of the peak intensity ratio is calculated by the formulas “the intensity of the peak derived from the protein obtained by means (a)” and “the intensity of the peak derived from the protein obtained by means (b)”. Desired.
  • the system for analyzing the structural affinity relationship between a plurality of types of proteins and compounds in the second aspect of the present invention is in accordance with the description of the system in the first aspect (FIGS. 6, 7, 8 and 9).
  • the order and composition of processing in the protein purification unit 602 are partially different.
  • the protein purification unit 602 may further include a protein dispensing device, an isotope labeling control device, and the like in addition to the device described in the first aspect.
  • the arrangement of the isotope labeling treatment means on the protein is different from the first embodiment, and in principle, no isotope labeling substance is mixed in the culture solution bottle 12a.
  • the sample derived from the culture device 11a is the same as the sample derived from the culture device lib before the contact treatment with the compound by the contactor 14. Therefore,
  • the protein group introduced into the contactor 14 with the compound may be a protein group collected from one of the different culture apparatuses 11a and lib. Alternatively, use only one culture device (11a, lib, or 11c (Fig. 10)), and divide the protein group collected from it into multiple pieces (for example, dozens of non-immobilized compounds). It may be contacted with a compound.
  • FIG. 10 shows a schematic diagram of an apparatus for dividing a protein group collected from one culture apparatus into a plurality of groups.
  • a protein group collected from one culture apparatus 11c is disrupted by a cell disrupter 13c.
  • the central computer 30 divides the crushed sample into a plurality of parts, a part is introduced into the carrier 15a on which the compound is immobilized, and another part is a contactor 14c-l, 14 2, 14c with the compound.
  • -3 (Fig. 10 shows three contactors with compounds shown), instructed the sample dispenser 31 to divide the sample into multiple samples, each of which is fixed by the compound It introduce
  • the isotope labeling step is performed after the protein is purified by the carriers 15a and 15b on which the compound is immobilized.
  • the central computer 30 performs the isotope labeling control so that either the protein purified by S905a or the protein purified by S905b is isotopically labeled after protein purification by S905a and S905b. (Not shown) and the controller performs isotope labeling of the protein.
  • the central computer 30 can further instruct the isotope labeling controller to perform post-labeling purification.
  • the labeled protein is fractionated by the purified protein fractionators 17a and 17b and temporarily stored (S906a, S906b).
  • the isotope labeling step can be performed after fractionation with the purified protein fractionators 17a and 17b.
  • the central computer 30 sorts and temporarily stores the purified protein with S906a and S906b, and then isotope-labeled control device (not shown) so that one of the proteins stored with S906a and S906b is isotopically labeled.
  • the controller performs isotope labeling of the protein.
  • the protein mixing unit 603 and the mass spectrometry unit 604 are the same as in the first embodiment. 3.
  • a third aspect of the present invention is a method for analyzing a structure affinity relationship between a plurality of types of proteins and compounds
  • step (b) mixing the protein obtained in step (a) with an isotope-labeled protein group that is an internal standard;
  • step (c) mass spectrometric treatment of the mixture obtained in step (b);
  • step (e) mixing the protein obtained in step (d) with an isotope-labeled protein group as an internal standard substance;
  • step (f) mass spectrometric treatment of the mixture obtained in step (e);
  • step (g) identifying each protein in a plurality of types of proteins from the mass spectrometry information obtained in step (c) and step (f);
  • step (h) For each protein, the intensity ratio between the peak derived from the protein obtained in step (a) and the peak derived from the protein that is the internal standard substance, and the peak derived from the protein obtained in step (d) Obtaining an intensity ratio with a peak derived from a protein that is an internal standard substance, and quantifying the ratio of the affinity of the compound for each protein by comparing the intensity ratio;
  • the method is provided.
  • the process includes the steps described in “1.
  • (1) (a) From the group of isotope-labeled proteins, a plurality of types of tags that bind to the compound on the carrier using a carrier on which the compound is immobilized.
  • a plurality of types of proteins that bind to the compound immobilized on the carrier can be purified by the same method as in the step of “purifying the protein”.
  • a protein group not labeled with an isotope can be used as the protein group.
  • a protein group labeled with an isotope different from the isotope used in the internal standard substance of the present invention can be used instead of the protein group not labeled with an isotope.
  • step (b) Step of mixing the protein obtained in step (a) with an isotope-labeled protein group that is an internal standard substance
  • the protein obtained in step (a) and the isotope-labeled protein group which is an internal standard substance are mixed at a certain ratio.
  • the constant ratio may be equal or the ratio may be changed.
  • the internal standard means the standard substance in the measurement system, and the isotope-labeled protein group here functions as the internal standard.
  • the internal standard substance is preferably derived from a biological sample having the same quality as the plurality of types of proteins obtained in step (a), but may be derived from a different biological sample.
  • An example of a method for preparing an isotope-labeled protein group (hereinafter sometimes referred to as “internal standard substance of the present invention”) that can function as an internal standard substance is described below.
  • the internal standard substance of the present invention can be prepared by metabolically isotopically labeling. For example, by culturing a culturable cell in a medium containing an isotopically labeled amino acid, the protein in the cell can be metabolically isotopically labeled. Any culture condition may be used, and a suitable condition for culturing the cells in a liquid medium or solid medium may be selected. For example, when animal cells are selected, use a medium such as DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM, etc., and if necessary, serum such as urinary fetal serum (FCS), amino acid, glucose, penicillin, or streptomycin. At about pH 6-8, 30-40 ° C 15
  • Cultivation can be performed for about 200 hours.
  • the medium can be changed or aeration and agitation can be performed as needed.
  • Cells containing the metabolically isotopically labeled proteins thus obtained are By crushing, the internal standard substance of the present invention can be prepared.
  • the internal standard substance of the present invention can be prepared.
  • M-PER PIERCE M-PER: cat no. 78501, T'PER: cat no. 78510, etc.
  • a freeze-thaw method, etc. are preferable, and a method using a cell lysate is preferable. It is preferable to remove insoluble substances from the disrupted cells by centrifugation. In this way, the internal standard substance of the present invention can be prepared.
  • a radioisotope can be applied, but a stable isotope having no radioactivity is particularly preferable because it is easy to handle.
  • Stable isotopes include, but are not limited to, 2 H, i 3 C, 15 N, 170, is 0, 33 P or 34 S or combinations thereof, preferably 2 H, 13 C, 15 N or 180 or a combination thereof, more preferably i 3 C, 15 N or WO or a combination thereof, more preferably i 3 C.
  • the isotope used in the present invention is not particularly limited as long as it can label a protein. Specifically, as a precursor of an isotope-labeled protein, 0 3 C x 6 labels) Leucine (manufactured by Cambridge Isotope Labs (CIL), L'Leucine U- 13 C6, CLM-2262) can be mentioned .
  • the internal standard substance of the present invention can also be prepared in vitro.
  • isotope labeling can be achieved by alkylating a cysteine residue in a protein using an isotope-labeled alkylating reagent (“Rabbit * communications in mass spectrum”). (Rapid Communications in Mass Spectroscopy), Vol. 16, Vol. 15, Vol. 15, 2002, pp.1416-1424).
  • isotope labeling can also be carried out by piotination of a cysteine residue in a protein using an isotope-labeled piotination reagent.
  • it is possible to purify only the labeled protein using an avidin column ("Nature Biotechnology" Vol. 17, Vol.
  • the C-terminal, N-terminal, and dull of peptide fragments obtained by digesting proteins can be labeled with an isotope-labeled molecule such as a tamic acid residue or aspartic acid residue.
  • an isotope-labeled molecule such as a tamic acid residue or aspartic acid residue.
  • water labeled with WO is added to a buffer solution.
  • chymotrypsin, trypsin, Asp-N, Lys-C, and Glu-C can be used.
  • ISO is located on the C-terminal side of the hydrolyzed peptide, and when trypsin, Lys'C or Glu-C is used, the hydrolyzed peptide C It is known that both oxygen atoms of the terminal carboxylic acid are 180 .
  • N-terminal of peptide fragments obtained by digesting proteins may be nicotinic acid derivatives (Munchbach M, Quadroni M, Miotto G, James P. Quantitation and facilitated de novo sequencing of proteins by isotropic N-terminal labeling of Anal. Chem. 2000: 72, pp.4047-4057) and acetylation methods (Ji. J. Chakraborty A, Geng M, Zhang X, Amini A, Bina M, Reernier E Strategy for quantitative and quantitative analysis in proteomics based on signature peptides. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 2000: 745, pp.197-210) is known. Therefore, isotope labeling can also be performed by using these isotope-labeled reagents.
  • step (d) Step of mass spectrometry treatment of the mixture obtained in step (c)”.
  • the compound is A step of purifying a plurality of types of proteins that bind to a compound on the carrier using a standardized carrier
  • the process includes the above-mentioned “1. (2) (b) Multiple types of proteins that bind to the compound on the carrier using the carrier on which the compound is immobilized from the protein group previously contacted with the compound. A plurality of types of proteins that bind to the compound immobilized on the carrier can be purified by the same method as in the step of purifying the protein.
  • a protein group not labeled with an isotope can be used as in the step (a). Further, a protein group labeled with an isotope different from the isotope used in the internal standard substance of the present invention can be used instead of the protein group not labeled with an isotope.
  • step (e) Step of mixing the protein obtained in step (d) with an isotope-labeled protein group as an internal standard substance
  • the protein obtained in the step (d) and the isotope-labeled protein group which is an internal standard substance are mixed at a certain ratio.
  • the constant ratio may be equal or the ratio may be changed.
  • the isotope-labeled protein group here functions as an internal standard, and is preferably derived from a biological sample that is the same as the multiple types of proteins obtained in step (d), but is different. It may be derived from a biological sample. In addition, since it functions as an internal standard substance, it is the same as the above-mentioned "3.
  • the internal standard of the present invention is used.
  • This step can be carried out by the same method as in “1. (5) (e) Identifying each protein in a plurality of types of proteins from mass spectrometry information” above.
  • each protein it is derived from the protein obtained in step (a).
  • the peak intensity of the protein-derived peak obtained in step (a) or step (d) and the labeled peak derived from the internal standard substance of the present invention By obtaining the ratio and comparing the peak intensity ratio values, the affinity between each protein and the compound can be quantified.
  • the peak / labeled peak in the protein (two-peak intensity ratio B )
  • the affinity ratio between the compounds A and B and each protein can be quantified.
  • the comparison can be performed, for example, by calculating the ratio between the peak intensity ratio B and the peak intensity ratio A.
  • the obtained value can be used as the ratio of the affinity of Compound B to the affinity of Compound A for each protein.
  • a protein that is present in the protein obtained in step (a) or step (d) but not in the internal standard of the present invention when measured with a mass spectrometer, a peak derived from a nearby internal standard substance of the present invention, preferably a peak with an elution time close to chromatography for LC / MS,
  • the peak intensity ratio can be determined for peaks with similar molecular weights, and the peak intensity ratio can be compared for quantification. Therefore, for all proteins in the protein obtained in step (a) or step (d), It is possible to measure the affinity ratio between the protein and the compound.
  • Protein X when comparing the affinity between Compound A and protein X immobilized on a carrier and the affinity between Compound B and protein X not immobilized on a carrier, Protein X may not exist in the internal standard, and a peak derived from protein Y may exist in the vicinity.
  • the nearby peak is a peak derived from the internal standard substance of the present invention, a peak with a short elution time in chromatography for LC / MS, and a peak with a close molecular weight for MALDI-MS.
  • the present invention further provides a system for analyzing a structure affinity relationship between a plurality of types of proteins and compounds,
  • step (h) For each protein, the intensity ratio between the peak derived from the protein obtained in step (a) and the peak derived from the protein that is the internal standard substance and the peak derived from the protein obtained in step (d) A means for determining an intensity ratio with a peak derived from a protein that is an internal standard substance, and comparing the intensity ratio, and quantifying the affinity ratio of the compound to each protein;
  • step (b) Means for mixing the protein obtained in (a) with the isotope-labeled protein group that is an internal standard substance was obtained in the above “3.
  • step (a) This is the same as the method used in the step of mixing the protein and the isotope-labeled protein group which is an internal standard substance.
  • a carrier on which the compound is immobilized a plurality of types of proteins that bind to the compound on the carrier are purified from a group of proteins that have been contacted with the compound in advance.
  • proteins described in “1. (2) (b)” above a plurality of types of proteins that bind to the compound on the carrier using the carrier on which the compound is immobilized are used. This is in accordance with the means used in the “purifying step”.
  • a protein group that is not isotope-labeled can be used, or a protein group that is labeled with an isotope different from the isotope used in the internal standard substance of the present invention is used. You can also
  • step (e) Means for mixing the protein obtained in the means (d) with the isotope-labeled protein group as the internal standard substance was obtained in the above “3. (5) (e) step (d)”. This is the same as the method used in the process of mixing the protein and the isotope-labeled protein group as the internal standard substance.
  • Means for subjecting the mixture obtained in the means (e) to mass spectrometry is the means used in the above “1. (4) (d) Step of mass spectrometry treating the mixture obtained in the step (c)”. It is based on.
  • the intensity ratio between the peak derived from the protein obtained in step (a) and the peak derived from the protein that is the internal standard substance and the peak derived from the protein obtained in step (d) The means for quantifying the ratio of the affinity of a compound for each protein by determining the intensity ratio between the protein and the peak derived from the internal standard protein and comparing the intensity ratio is described in “3. (8) ( h) For each protein, the intensity ratio between the peak derived from the protein obtained in step (a) and the peak derived from the protein that is the internal standard substance and the protein obtained in step (b) Determine the intensity ratio between the peak derived from the peak derived from the protein that is the internal standard substance and compare the intensity ratio to determine the ratio of the affinity of the compound for each protein.
  • the structural parent of a plurality of types of proteins and compounds in the third aspect of the present invention is described below.
  • a system for analyzing the compatibility correlation is described. This system conforms to the description of the system of the first aspect (FIGS. 6, 7, 8 and 9), but the processing order and configuration of the protein purification unit 602 and the protein mixing unit 603 are partially different.
  • the protein purification unit 602 may further include a protein dispensing device in addition to the device described in the first embodiment.
  • the arrangement of the isotope labeling treatment means on the protein is different from the first embodiment, and in principle, no isotope labeling substance is mixed in the culture solution bottle 12a. Therefore, the sample derived from the culture apparatus 11a is the same as the sample derived from the culture apparatus lib before the contact treatment with the compound by the contactor 14. Therefore, the protein introduced into the contactor 14 with the compound may be a protein group collected from one of the different culture apparatuses 11a and lib. Alternatively, use only one culture device (11a, lib, or 11c (Fig. 10)), and divide the protein group collected from it into multiple pieces (for example, the number of non-immobilized compounds + 1) Even if it is contacted with a compound, it is good.
  • FIG. 10 shows a schematic diagram of an apparatus for dividing a protein group collected from one culture apparatus into a plurality of groups.
  • a protein group collected from one culture apparatus 11c is disrupted by a cell disrupter 13c.
  • the central computer 30 divides the crushed sample into a plurality of parts, a part is introduced into the carrier 15a on which the compound is immobilized, and the other part is a contactor 14c-l, 14c-2, 14 3 (Fig. 10 shows three contactors with compounds shown) to the sample dispenser 31 to be introduced, the sample dispenser divides the sample into multiple samples, each of which is fixed by a compound It is introduced into contactors 14c-l, 14c-2, and 14c-3 with the converted carrier 15a or compound.
  • the cells are cultured under predetermined conditions using a culture apparatus lla, a culture solution bottle, 12a, and a cell crusher 13a to obtain a protein group. Keep it.
  • the culture solution bottle 12a is mixed with amino acids for isotopically labeling the protein group to obtain an isotopically labeled protein group as an internal standard substance.
  • the central computer 30 of the control unit 601 is an isotope label, an internal standard.
  • the filling device (not shown) is instructed to fill the culture device 11a with the culture medium, sample (cells), and other reagents necessary to obtain the specified protein group. Execute.
  • the central computer 30 next instructs the culture apparatus 11a to perform the culture under a predetermined condition, and the culture apparatus 11a executes the culture. After culturing under the predetermined conditions, the central computer 30 instructs the cell crushing device 13a to perform the cell crushing process, and the cell crushing device 13a executes the cell crushing.
  • the protein mixing unit 603 is a unit that mixes the protein purified by the protein purification unit 602 and an isotope-labeled protein group which is an internal standard substance.
  • the central computer 30 instructs the protein mixing unit 603 to mix the purified purified protein and the isotope-labeled protein group, which is an internal standard, after sorting and temporary storage by S906a and S906b.
  • the purified protein mixing unit 603 mixes the purified protein (S907).
  • a fourth aspect of the present invention is a method for analyzing a structure affinity relationship between a plurality of types of proteins and compounds
  • step (a2) mass spectrometric treatment of the purified product obtained in step (al);
  • step (a3) a step of identifying each protein in a plurality of types of proteins from the mass spectrometry information obtained in step (a2);
  • step (b2) mass spectrometric treatment of the purified product obtained in step (bl); (b3) a step of identifying each protein in a plurality of types of proteins from the mass spectrometry information obtained in step (b2);
  • the method is provided.
  • the process includes the above-mentioned “1.
  • (1) (a) From the group of isotope-labeled proteins, a plurality of types of proteins that bind to the compound on the carrier using the carrier on which the compound is immobilized.
  • a plurality of types of proteins that bind to the compound immobilized on the carrier can be purified by the same method as in the step of “purifying the protein”.
  • a protein group not labeled with an isotope can be used as the protein group. Further, an isotope-labeled protein group can be used in place of the non-isotope-labeled protein group.
  • step (d) Step of mass spectrometry treatment of the mixture obtained in step (c)”.
  • This step can be carried out by the same method as in “1. (5) (e) Identifying each protein in a plurality of types of proteins from mass spectrometry information” above.
  • the method for quantifying each protein is not particularly limited, and for example, it can be carried out by the following method.
  • the detected peptides Calculate the number (N. bsd ) and the number of peptides that can be detected (N. bsb i).
  • “Number of detected peptides (N. bs d)” is the number of peptides actually detected in “4. (2) (a2) Mass spectrometry of purified product obtained in step (al)”. Means. The number of detected peptides (N. bsd ) can be calculated based on the mass spectrometry data and the sequence information of the identified protein. The number of peptides detected (N obs d) matches the number of peaks detected by mass spectrometry for each protein when calculated based on mass spectrometry data.
  • the number of peptides that can be detected is a value that can be theoretically detected in “4.
  • the number of peptides that can be detected (N. bs bi) can be calculated based on the sequence information of the identified protein. For each protein, the number of peptides theoretically generated by separation, digestion or HPLC separation in the above steps is calculated based on the sequence information, and the number of peptides that can be detected by mass spectrometry (N. bsbl ) Can be requested.
  • the peptide chain is cleaved at the carboxyl side of lysine and arginine by trypsin, so the number of peptides generated by cleavage can be predicted from the sequence information of each protein. it can.
  • the number of peptides that can be detected (Nobsbl) can be determined in consideration of the measurement range of the mass spectrometer.
  • EMPAI Set (.exponentially modined protein abundance index) and calculate.
  • EMPAI is an index proportional to the protein content in the protein mixture. Furthermore, the protein content (mol%) can be calculated according to the following formula (II).
  • protein content (% by weight) can be calculated according to the following formula (III).
  • EMPAI X MW (EMPAI X MW) where MW represents the molecular weight of each identified protein.
  • ⁇ (EMPAI XMW) represents the sum of EMPAI XMW for all identified proteins.
  • the molecular weight of each protein can be calculated from the amino acid sequence.
  • the total weight of the protein obtained in step (al) can be easily measured by existing methods such as Lowry method, Bradford method, and 280 nm absorbance measurement. Then, each protein can be quantified from the total weight of the protein obtained in the step (al) and the protein content determined as described above.
  • each protein can be quantified by the above method.
  • the process involves purifying a plurality of types of proteins that bind to the compound on the carrier using the carrier in which the compound is immobilized, using the force of the protein group previously contacted with the compound as described in “1.
  • (2) (b)” above A plurality of types of proteins that bind to the compound immobilized on the carrier can be purified by the same method as in the step.
  • the protein group a protein group that is not isotopically labeled can be used.
  • a protein group that is labeled with an isotope can be used instead of a protein group that is not labeled with an isotope.
  • (6) (b2) Process of mass-analyzing the purified product obtained in step (bl)
  • step (d) Step of mass spectrometry treatment of the mixture obtained in step (c)”.
  • This step can be carried out by the same method as in “1. (5) (e) Identifying each protein in a plurality of types of proteins from mass spectrometry information” above.
  • This step can be performed by the same method as in “4. (4) (a4) Step of quantifying each protein in a plurality of types of proteins”.
  • the affinity between each protein and the compound is determined by determining the ratio between the amount of protein derived from the protein obtained in step (a4) and the amount of protein derived from the protein obtained in step (b4). Can be quantified.
  • the method according to the fourth aspect of the present invention is characterized in that it is not necessary to perform isotope labeling for each protein.
  • the present invention further provides a system for analyzing a structure affinity relationship between a plurality of types of proteins and compounds,
  • (a4) means for quantifying each protein in a plurality of types of proteins
  • (b3) Means Means for identifying each protein in a plurality of types of proteins from the mass spectrometry information obtained in (b2), and
  • (b4) means for quantifying each protein in a plurality of types of proteins
  • the means for purifying a plurality of types of proteins that bind to the compound on the carrier using the carrier on which the compound is immobilized is described in “1.
  • a protein group that is not isotopically labeled can be used as the protein group.
  • an isotope-labeled protein group can be used in place of the non-isotope-labeled protein group.
  • step (d) According to the means used in “the step of mass spectrometric treatment of the mixture obtained in step (c)”.
  • (bl) Compound immobilized from a group of proteins previously contacted with the compound
  • the means for purifying a plurality of types of proteins that bind to the compound on the carrier using the prepared carrier is the above-mentioned “1.
  • the protein group a protein group that is not isotopically labeled can be used. Further, an isotope-labeled protein group can be used in place of the non-isotopically labeled protein group.
  • step (c) For each protein, determine the ratio of the protein mass derived from the protein obtained in step (al) and the amount of protein derived from the protein obtained in step (bl) to obtain the affinity of the compound for each protein.
  • the means for quantifying the sex ratio is described in ⁇ 4.
  • the system for analyzing the structural affinity relationship between a plurality of types of proteins and compounds in the fourth aspect of the present invention will be described below.
  • This system conforms to the description of the system of the first aspect (FIGS. 6, 7, 8 and 9), but the protein mixing unit 603 is omitted, and the processing sequence and structure in the protein purification unit 602 are omitted.
  • the composition is partially different.
  • the arrangement of the isotope labeling treatment means on the protein is different from the first embodiment, and in principle, no isotope labeling substance is mixed in the culture solution bottle 12a. Therefore, the sample derived from the culture apparatus 11a is the same as the sample derived from the culture apparatus lib before the contact treatment with the compound by the contactor 14. Therefore, the protein introduced into the contactor 14 with the compound may be a protein group collected from one of the different culture apparatuses 11a and lib. Alternatively, use only one culture device (11a, lib, or 11c (Fig. 10)), and divide the protein group collected from it into multiple parts (for example, the number of non-immobilized compounds + 1) May be contacted with the compound.
  • FIG. 10 shows a schematic diagram of an apparatus for dividing a protein group collected from one culture apparatus into a plurality of groups.
  • a protein group collected from one culture apparatus 11c is disrupted by a cell disrupter 13c.
  • the central computer 30 divides the crushed sample into a plurality of parts, a part is introduced into the carrier 15a on which the compound is immobilized, and the other part is a contactor 14 1, 14c-2, 14 with the compound.
  • 3 (Fig. 10 shows three contactors with compounds shown) to the sample dispenser 31 to be introduced, and the sample dispenser divides the sample into multiple samples, each of which is immobilized by a compound.
  • the contactor 14 cl 14 2, 14 3 with the supported carrier 15a or compound.
  • the mass spectrometric unit is in accordance with instructions from the control unit 601 for each sample arranged in the purified protein fractionators 17a and 17b. (S908) and mass spectrometry (S909).
  • the central computer 30 identifies the protein derived from 17a and the protein derived from 17b (S910), and based on the data at the time of mass spectrometry, amino acid sequence information by protein identification, etc. Quantify. For each protein, the ratio of the protein mass derived from 17a to the amount of protein derived from 17b is determined, and the affinity ratio of the compound to each protein is quantified.
  • HCT116 human colon adenocarcinoma cell line HCT116 (ATCC) was cultured.
  • RPMI-1640 Sigma, R-7130
  • MOREGATE 10% fetal bovine serum
  • GOBCO 100 U / ml penicillin G
  • streptomycin 100 g / ml streptomycin
  • RPMI-1640 a powder medium not containing legglutamine, L-lysine, remethionine, L-leucine, or sodium bicarbonate was selected, and the medium (L-glutamine (Sigma, G-8540), L-lysine (Sigma, L-9037), L-methionine (Sigma, ⁇ 5308), hydrogen carbonate Sodium (Wako Pure Chemical, 191-01305) was added at 0.3 g / L, 0.04 g / L, 0.015 g / L, and 2 g / L, respectively, and natural L-leucine or stable isotope i 3 C L-leucine (Cambridge Isotope Laboratories, CLM-2262) labeled with (6) was added at 0.05 g / L).
  • the medium thus prepared was cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 .
  • the cells obtained by this culture were used in the following experiments as cells cultured in a natural medium or a stable isotope
  • Cells were collected by cultivating cells in stable isotope medium for 50 15 centimeter dishes and cells cultured in natural medium for 20 centimeter dishes.
  • a solubilized fraction was prepared by solubilizing with approximately 1.21111: ⁇ 1 £ 1 (PIERCE, 78501) per 15 cm dish and removing the insoluble fraction by centrifugation.
  • the soluble fraction thus obtained was used as a protein extract not metabolically labeled with a stable isotope and a protein extract labeled with a metabolically stable isotope.
  • Compound (6) was produced from compound (2) represented by formula 2 to formula 6 by the method described in JP-A-7-165708. Next, about the compound represented by Formula 2 to Formula 6, about 20 mg of the compound (2) consisting of Formula 2, about 13 mg of the compound (3) consisting of Formula 3 and about 4 mg of the compound consisting of Formula 4 (4 ) About 12 mg, about 5 mg of the compound consisting of Formula 5 (5) about 14 mg of about 6 mg of the compound consisting of Formula 6 (6), dissolved in DMSO, and the concentration of each compound I made it.
  • These compounds are known to have cell growth inhibitory activity as follows: Compound (2)> Compound (4)> Compound 5> Compound 3> Compound 6 (Y. Oda, T. Owa, ⁇ Sato, B. Boucher, S. Daniels, H. Yamanaka, Y. Shinohara, A. Yokoi, J. Kuromitsu, and T. Nagasu, Anal. Chem., 75, 2159 (2003).).
  • Example (4) Add 300 wL, and incubate at 4 ° C for 3 hours. This was used as a protein extract mixed with the compound.
  • the protein purified solution 3 not mixed with the compound was mixed at a ratio of 1 to the protein purified solution 3 mixed with the compound.
  • This mixture was concentrated with Amicon Ultra-15 10,000 MWCO (Millipore, catalog number UFC901096), washed repeatedly with 50 mM aqueous ammonia hydrogen carbonate, and then SDS-PAGE (D.C. 20% T gel, l mm, 7 well, 4 cm, 200V), the electrophoresis lane was divided into 12 equal parts, and gel trypsin digestion was performed to obtain a digested protein solution (H. Katayama, K. Sato , M. Takeuchi, M. Deguchi-Tawarada, Y. Oda and T. Nagasu, Rapid Commun. Mass Spectrom. 17, 1071-1078 (2003).).
  • the digested protein solution was dissolved in 5% acetonitrile with 0.1% trifluoroacetic acid to obtain a protein solution to be measured.
  • MS as LCQ-Duo (Thermo
  • LC / MS LC is a homemade ODS column (Y. Ishihama, J. Rappsilber, JS Andersen, M. Mann, J. Chromatogr A. 979, 233-239 (2002).) Inner diameter 0.2 mm, length approximately 15 cm, containing 0.5% acetic acid as the mobile phase.
  • the acetonitrile concentration is 4% in 1 minute, then the acetonitrile concentration is increased linearly to 20% in 35 minutes, then the acetonitrile concentration is increased to 80% in 0.1 minutes and maintained for 5 minutes, and then the acetonitrile concentration is 0%. After 12 minutes, the next sample was injected.
  • the Shimadzu LC-10A series ROM was made micro-compatible, and for the mixing chamber, the supplied Shimadzu Corporation was removed and a Parco T connector was adopted.
  • a flow-splitting method was adopted as the flow rate, and the column was prepared to have a flow rate of 1-2 – L per minute.
  • the protein solution to be measured was injected by CTC autosampler PAL.
  • the measurement was performed by feeding ions obtained by directly spraying the eluate from the column outlet into the LCQ. A spray voltage of 2.5 kV was applied.
  • the measurement was set to 1 for Dynamic Exclusion Repeat in Data Dependent mode. In order to increase the number of scans, the measurement was performed in the so-called double play mode without the Zoom Scan mode.
  • the protein was automatically identified using the NCBInr database. At this time, a part of the program was modified so that NCBInr could be searched even for leucine labeled with a stable isotope (an increase in molecular weight of 6 per leucine).
  • FIG. 5 shows a structural affinity relationship between a plurality of types of proteins and compounds represented by compound 2 (compound 2) to compound 6 (compound 6). A smaller number means stronger affinity for the compound.
  • the protein with the highest affinity for compound (3) (Chemical Formula 3) is glutathione-S-transferase omega 1 and the protein with the next highest affinity is , Heme binding protein 1, so that the order of affinity strength is known, so compound (3) force Obtain information on what kind of protein has high affinity in addition to the target protein (Fig. 5).
  • the method of the present invention can comprehensively analyze what kind of protein affinity is affected by changing the structure of the compound. It is possible to obtain useful information that reduces side effects while enhancing
  • the present invention it is not necessary to prepare a plurality of affinity chromatography columns in which the compound is immobilized, and it is possible to easily and efficiently obtain information on the structure affinity relationship based on the plurality of compounds. Became.
  • the present invention it is possible to comprehensively analyze what kind of protein the affinity is affected by changing the structure of the compound, and it has the main effect in synthesizing a compound, particularly a drug. It has become possible to obtain useful information that can reduce side effects while enhancing. For example, it is possible to comprehensively determine what dehydrogenase affinity is affected by changing the structure of a compound by obtaining information on the structure affinity relationship using a carrier on which NAD or NADP is immobilized according to the present invention. It became possible to obtain useful information on specificity, selectivity, etc. in screening dehydrogenase inhibitors.
  • any kinase, ATP-ase, GTP'ase can be obtained by changing the structure of the compound by obtaining information on the structural affinity relationship using the carrier on which ATP or GTP is immobilized according to the present invention. It will be possible to obtain comprehensive information on specificity, selectivity, etc. when screening these inhibitors. It was.
  • the concentration of the compound bound to the carrier on which the compound is immobilized is generally about 0.1 mg to several mg per ml of gel, which corresponds to about 1 mM.
  • concentration of the compound immobilized on the carrier on which the compound is immobilized for example, an affinity chromatography column.
  • the compound concentration is reduced from several M to several nM, so that it is closer to the state of the compound in the living body. Both became possible

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Abstract

複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析する方法であって、（a）同位体標識されたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、（b）予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、（c）工程（a）および工程（b）で得られたタンパク質を混合する工程と、（d）工程（c）で得られた混合物を質量分析処理する工程と、（e）質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程と、（f）各タンパク質の標識ピークと非標識ピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程と、を含む、前記方法。

Description

明 細 書 タンパク質構造親和性相関の解析方法 技術分野
本発明は、 複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析する方法に 関する。 背景技術
ヒ トをはじめ多くの生物のゲノム配列が解析され、 得られたゲノム情報をもと に効率よく、 かつ必然性の高い薬剤を作るゲノム創薬が注目されている。 薬剤の 標的の多くは、 タンパク質であるが、 総数糸勺 32,000 と推定されているヒ ト遺伝 子から合成されるタンパク質の数は、 翻訳後修飾等を考えると遺伝子の数から単 純に計算される数の数倍になる。 また、 抗生物質などヒ トに直接作用しない薬剤 もあることを考慮すると、創薬上相当な数のタンパク質を解析することになる力 実際に薬剤のターゲットになりうるものはごく'限られている。
近年、 創薬上の特定の標的タンパク質を定めた場合には、 HTS ( High Throughput Screening)等の手法により、数多くの化合物群の中からその標的に 対して最適な化合物をスクリーユングすることが可能になり、 このスタイルが創 薬研究の主流になっている。 しかしながら、 選び出された化合物のタンパク質に 対する特異性 （結合、 相互作用など） については、 数種類程度のタンパク質につ いて確認する程度であって、 より網羅的な特異性の検討は行われていない。
そして、 薬剤候補品の真の標的分子やその標的分子が関わる情報伝達経路を同 定することは、 薬効、 副作用の機序を明らかにすることにつながり、 臨床試験で 他薬剤との薬効、 副作用等の差別化を図る上で大きな役割を果たす。 薬剤の標的 分子探索にはいくつかの手法があるが、 薬剤と標的タンパク質の相互作用の直接 的な証明は、 最終的には生化学的な実験で立証しなければならない。
—方、 プロテオミクスでは薬剤の結合タンパク質を直接、 質量分析計 （MS) で解析することができ、 タンパク質試料は、 培養細胞由来でも臓器由来でも良い といった、 ジエネティタスにはない魅力がある。
ある特定のタンパク質を単離する手法として、 ァフィ二ティーク口マトグラフ ィ一が広く用いられている。 化合物の結合タンパク質を単離する目的でァフィ- ティークロマトグラフィーを用いた代表例として、 免疫抑制剤 FK506のターゲ ットタンパク質である cis-trans peptidyl-prolyl isomerase (FKBP) を同定し た例があげられる1 ' 2 )。 Hardingらは， 活性を保持した状態で FK506をァフィ 二ティーマトリッタスに固定化し， 脾臓から調製したライセートをカラムに流し た。 そして、 リガンドに結合したタンパク質を、 固定化していない FK506溶液 で競合的に溶出することにより、特異的に結合するタンパク質として FKBPを得 た。 また、 天然物由来生理活性物質の中には、 ターゲットと共有結合することに よってその活性をより強固にするものがある3— 5 )。 このような物質に、 ピオチン などのタグを導入し、 それを細胞などに加えて一定時間インキュベートした後に ライセートを調製する。 そして得られたライセートから、 アビジンを固定化した カラムによってピオチンタグで標識された化合物を回収して化合物に結合したタ ンパク質を同定することが可能になる。 Sin らは， 血管新生抑制作用のある fumagillinのピオチン化誘導体を合成し， ゥシ脳の抽出液と反応させた。 そして 数段階のクロマトグラフィ一の後， アビジンカラムを用いてピオチン化誘導体を 回収し， 特異的な結合タンパク質として II 型メチォニンアミノぺプチダーゼ (MetAP-2) を同定した。 この系は， 化合物を固定化したァフィ二ティークロマ トグラフィ一とは異なり， 細胞抽出液のみならず生理的条件下での培養細胞とプ ローブとの反応が可能であり、 細胞の分画ゃライセ一トの調製段階で容易に変性 してしまうような結合タンパク質の単離には有効な方法である 5 )。
ァフィ二ティークロマトグラフィーによって， 当初予想した以外のタンパク質 も同定されることがある6 9 )。 Knockaert ら 7)は、 種々の cycline- dependent kinase (CDK) 阻害剤を、 まず in vitro kinase panelの測定系で評価した。 ただ し、 ここで用いた酵素は、 数種の CDK と glycogen synthase kinase-3 α / β
(GSK-3 a / j3 ) を主とするごく限られたものであった。 本アツセィにより、 paullone 力； CDK および GSK'3 ct / ]3の阻害剤であることが示されたが、 paulloneをァフィ二ティーマトリクスに固定化し、それをプローブとして結合タ ンパク質を精製した際には予想外の結果が得られた。 すなわち、 これらの kinase 以外に mitochondrial malate dehydrogenase (mMDH) が特異的にこのプロ一 ブに結合することが見出された。 そして、 その後の in vitroの酵素活性測定系に おいて， paulloneが確かに mMDH活性を阻害することが確認されたことから， ァフィ二ティークロマトグラフィーを用いる手法によって初めて， paulloneにつ いて想定外の新規細胞内ターゲット （mMDH) が明らかにされたといえる。 本実 験結果は， 化合物のターゲットおよび作用機序探索研究に幾つかの示唆を与える ものと考えられる。 上記示唆のひとつは， その化合物の作用が、 想定しているタ ーゲットタンパク質を介した機序のみならず、 複数の作用機序の総合として発現 されている可能性である。
ァフィ二ティークロマトグラフィーでは， 一部の天然物由来生理活性物質を除 き， 化合物とタンパク質の相互作用は非共有結合であることを基本としている。 しかしながら、 親和性が弱い場合には、 真のターゲットが操作の過程で化合物か ら解離してしまう場合がある。 たとえば、 化合物がより親和性の高いタンパク質 や、 親和性は同等でも量的により多く含まれるタンパク質によって飽和されてし まうような場合がある。 つまり、 ァフィ二ティークロマトグラフィーで得られた タンパク質の中には、 非特異的相互作用による結合タンパク質が少なからず存在 する。 特にタンパク結合率が高い薬剤は、 血清中などで非常に多くのタンパク質 と結合しうるため、例えばァフィ二ティーカラムにおいて 1M塩化ナトリゥムで 入念に洗浄した後でも、 200-300種類のタンパク質が結合していることが多々あ る。 従って、 プロテオーム技術が発達し、 多くのタンパク質を同定することが比 較的容易になったとはいえ、 如何にしてこれらの中から特異的なタンパク質を見 つけるかが重要になる。 Shimizuらは、 マトリックスの表面を親水性の高い高分 子重合体でコーティングし， 汎用されているマトリックスに比べてこの非特異的 な吸着を低減している 2 )。
非特異的相互作用を軽減する別の試みの一つとして、 ァフィ二ティーク口マト ダラフィ一を行う前に、 化合物に特異的に結合するであろうタンパク質群をあら かじめ絞り込んでおく方法がある 1 Q )。キノリン系骨格を有する抗マラリア薬であ るクロ口キンの結合タンパク質を調べるために、 まず ATP (Adenosine triphosphate) を固定化したカラムで ATP結合タンパク質群を精製し、結合タン パク質候補群を得る。 キノリンは、プリン体に似た構造を持っため、 ATPや DNA などプリンヌクレオチドと結合しうるタンパク質と親和性を持つことが考えられ る。 そこで、 ATPカラムであらかじめ標的候補タンパク質を絞り込むことによつ て、 非特異的相互作用を軽減でき、 クロ口キンの標的タンパク質を同定すること ができた。 これによりクロ口キンはマラリアではなくヒ トに作用していることが 明らかとなり、 作用メカニズムと副作用メカニズムも推察できた。
特異性を高める別の試みとしては、 化合物固定化カラムから結合タンパク質を 溶出する際に、 固定化していない化合物や結合部位を競合すると思われる分子、 例えば ATPや NADH (Nicotinamide adenine dinucleotide) などを用いて競合 的に溶出する方法がある。 p38阻害剤 SB203580の結合タンパク質解析では、 化 合物と ATPを組み合わせて溶出することで、 p38の回収率を上げることに成功し ている ι υ。 この方法により、 ρ38特異的と考えられていた SB203580に結合す る新たなキナーゼを多数同定するに至った。 同様に化合物で競合的に溶出させる ためには、 化合物が水溶液に充分量溶けることが必要であるため、 難溶性薬剤に は適用が難しい。 しかしァフィユティーカラムにアプライする前のタンパク質混 合液中に固定化していないフリー化合物を混ぜておくことでターゲットをマスク することができる。 このマスクしたタンパク質を含むサンプルをァフィ二ティー カラムにアプライして、カラム結合タンパク質について SDS-PAGEで分離する。 マスクの有無で SDS-PAGE上のバンドの比較を行い、 マスクすることによって 消えたバンドがターゲットであると考えられる 2 )。 この場合、 化合物の水に対す る溶解性が悪くてもタンパク質混合液中であれば、 ある程度の溶解性を期待でき る。
し力 し、 低分子化合物は、 そのほとんどが少なからず血清タンパク質と結合す る。 したがって、 結合タンパク質群の中から低分子化合物に特異的な標的タンパ ク質を見つけなければいけない。
そのためには、 目的の化合物と構造が似ているが活性の異なる化合物を用意し て、 結合タンパク質のディファレンシャル ·ディスプレイを行えばよレ、。
SDS-PAGEで違いのあるバンドを見つけても良レ、が、結合タンパク質が多い場合 は全てのバンドを分離するのは容易ではない。 そこで、 本発明者らは、 2次元電 気泳動又は安定同位体標識法を用いた MS解析1 2)により、 薬剤のターゲットタ ンパク質の同定手法を、 新規抗癌剤 E7070を用いて検討し報告した 1 3 )。 E7070 は， マウス由来癌細胞 P388の細胞周期を G1期で阻害することを指標にしてス クリーニングされた化合物 1 4 >で、その結合タンパク質はこれまで不明であつた。 そこで、 E7070をァフィ二ティー .プローブとして、 その結合タンパク質を同定 することにした。 プローブを用いた手法では、 いかに良質なプローブを用いるか が鍵となる。 そのプローブが元の化合物と同程度の活性を有していることが理想 である。 化合物にはその活性発現に必須な構造があるが， 必須構造はケミストが 化合物の構造変換を行い， その活性を高めていく過程で構造活性相関として明ら かになる。 そしてこの必須構造部分とは異なる部分にリンカ一を伸ばしてマトリ ックスに導入することになるのであるが， E7070 ではその構造活性相関から， sulfamoyl基を変換することによってプローブを合成した。 そして、 E7070を固 定化したァフィ二ティークロマトグラフィーで結合タンパク質の同定を行った。 しかしながら， このプローブには非常に多くのタンパク質が結合し， ターゲット タンパク質の絞込みが困難であった。 一般に， 低分子の合成化合物は特異性が低 く様々なタンパク質に結合する傾向がある。 また， E7070など合成低分子化合物 は水溶液に難溶であることが多いため、 固定化していない薬剤をァフィ二ティー カラムへ大量に流すことで特異的に溶出させる方法が困難であることが多い。 E7070も溶解度が低く， 界面活性剤や変性剤のような溶出力を高めた溶液を段階 的に用いることによって溶出せざるを得なかった。 そして精製条件について種々 検討したが、 E7070の場合， 溶出されたタンパク質のほとんどは化合物に結合し たもので， ビーズゃリンカーなどに対する非特異吸着によるものではなかった。 そこで， 構造が類似していながら抗腫瘍活性の異なる化合物を用いたプローブを 新たに調製し， それぞれのプローブから溶出されたタンパク質を ICAT1 5' 1 6 )お よび 2D-DIGE1 7)の定量的プロテオームの手法を用いて解析することによって、 E7070により強く吸着するタンパク質を同定する戦略を構築した 1 3 )。 その結果、 非常に多くのタンパク質が 2つのマトリッタスに吸着していた中で、 E7070タイ プのプローブに特異性が高く吸着するタンパク質の同定に成功した。 従来の SDS-PAGEでのバンドの有無による定性的判断とは違い、このような定量的な判 定により信頼性の高い結果を得ることが出来る。
し力、し、 前述の方法には、 依然幾つかの課題が残っている。 例えば、 （1)化合物 を担体 （カラムに充填された担体を含む、 以下、 単に 「カラム」 と称する場合が ある） に固定化する必要があるにもかかわらず、 スクリーニングのために合成さ れた化合物のほとんどは担体 （カラム） に固定化できない場合がある。 そのため 別途合成する必要があるが、 多くの時間も労力も要する。 さらに担体 （カラム） に固定化する化合物の部位によって結合するタンパク質の種類が変わることも多 レ、。 （2)化合物を担体 （カラム） に固定化できるように構造を変える際には、 活性 が変わらないようにすべきであるが、 構造を変えることにより、 特異性や親和性 が変わってしまうことがある。（3)ァフィ二ティーカラムとして固定化する化合物 を変えることでディファレンシャル .ディスプレイを行う際に、 ポジティブ化合 物 （活性の比較的強い化合物） の選択よりもネガティブ化合物 （活性の比較的弱 い化合物） の選択に迷うことが多い。 理想的にはネガティブ化合物全てをァフィ 二ティーカラムにすればよいが、現実的には (1)の理由から容易ではなレ、。（4)—般 的にァフィユティーカラムとして固体化されている化合物量は多くの場合ゲル 1 mlあたり 0.1 mgから数 mg程度であり、 これは 1 mM前後に相当する。 ところ が細胞に対して何らかの表現型を誘導する （活性がある） 薬剤は、 数 から数 ηΜ、 ときには ρΜオーダーで活性を示す。 したがって、 活性を示す濃度は、 力 ラム内に固定化された薬剤濃度と大きな乖離がある。 一般に薬剤を薬効用量より もはるかに高い濃度で使用すると非特異的な毒性作用が現れることが多い。 つま りカラム内に高い濃度の薬剤が固定化されているということは、 このような毒性 領域の作用が含まれていることがあると思われる。 そこで担体 （カラム） に対す る化合物の固定化量を数 i Mから数 nMに減らすことも可能である力 そのよう な微量の固定化量をコントロールすることは必ずしも容易ではなく、 また結合す るタンパク質の量、 つまりァフィ二ティーカラムの負荷量も大きく減るため目的 のタンパク質を MSで検出できなくなる可能性もある。 その際にはカラムサイズ を大きく、 例えば 100〜： 1000倍にすることになるが実用的には扱いづらくなる。 参照文献
1 ) M.W. Harding, A. Galat, D.E. Uehling, and S.L. Schreiber, Nature, 341, 758 (1989) .
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3 ) N. Sin, L. Meng, M.Q.W. Wang, J.J. Wen, W.G. Bornmann, and CM. Crews, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 94, 6099 (1997) .
4 ) E.C. Griffith, Z. Su, B.E. Turk, S. Chen, Y,H. Chen, Z. Wu, K. Biemann, and J.O. Liu, Chem. Biol., 4, 461 (1997) .
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7 ) M. Knockaert, K. Wieking, S. Schmitt, M. Leost, KM. Grant, J.C. Mottram, C. Kunick, and L. Meijer, J. Biol. Chem., 28， 25493 (2002) . 8 ) J.B. Schnier, G. Kaur, A. Kaiser, S.F. Stinson, E.A. Sausville, J. Gardner, K. Nishi, E. M. Bradbury, and A.M. Senderowicz, FEBS Lett.,454, 100 (1999) .
9 ) A. Kaiser, K. Nishi, F.A. Gorin, D.A. Walsh, E.M. Bradbury, and J.B. Schnier, Arch. Biochem. Biophys., 386, 179 (2001) .
1 0 ) P.R. Graves, J.J. Kwiek, P. Fadden, R. Ray, K. Hardeman, A.M.Coley, M. Foley, T.A. Haystead, Mol. Pharmacol. 62， 1364- 1372 (2002).
1 1 ) K. Godl, J. Wissing, A. Kurtenbac , P. Habenberger, S. Blencke, H. Gutbrod, K. Salassidis, M. Stein -Gerlach, A. Missio, M. Cotten, H. Daub.
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1 7 ) R. Tonge, J. Shaw, B. Middleton, R. Rowlinson, J. Young, E. Hawims, I. Currie, and M. Davison, Proteomics, 1(1)， 377 (2001) . 発明の開示
本発明は、 このような状況を鑑みてなされたものであり、 その解決しようとす る課題は、 簡便かつ効率的に、 複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関 を同時に解析することにある。
本発明者らは、 上記課題を解決するため、 鋭意検討を重ねた結果、 化合物を固 定したァフィ二ティークロマトグラフィーカラムにて、 当該カラムに結合する複 数種のタンパク質を精製 （本明細書において、 「精製」 とは、 分離および または 濃縮 （enrichment) することを含むものとする） した。 一方で、 同位体標識され たタンパク質群と化合物とを接触させたものの中から、 前記の化合物を固定した ァフィ二ティークロマトグラフィーカラムにて、 当該カラムに結合する複数種の タンパク質を精製した。 これらの精製タンパク質を混合し、 当該混合したタンパ ク質を質量分析計により分析し、 質量分析の情報から各タンパク質を同定し、 各 タンパク質の標識ピークと非標識ピークとの強度比を求めて、 化合物の有無によ る結合率の差から、 各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量することに よって、 複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析することを見出 し、 本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、 以下に関する。
( 1 )複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析する方法であって、 (a) 同位体標識されたタンパク質群の中から、 化合物が固定化された担体を用 いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
(b) 予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、 化合物が固定化さ れた担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製 する工程と、
(c) 工程 （a) および工程 （b) で得られたタンパク質を混合する工程と、
(d) 工程 （c) で得られた混合物を質量分析処理する工程と、
(e)質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程と、
(f) 各タンパク質について、 工程 （a) で得られたタンパク質に由来するピーク と工程 （b) で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、 各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程と、
を含む、 前記方法。
( 2 )複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析する方法であって、 (a) タンパク質群の中から、 化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の 化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
(b) 予め化合物と接触させておいた同位体標識されたタンパク質群の中から、 化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種の タンパク質を精製する工程と、
(c) 工程 （a) および工程 （b) で得られたタンパク質を混合する工程と、 (d) 工程 （c) で得られた混合物を質量分析処理する工程と、
(e)質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程と、
(f) 各タンパク質について、 工程 （a) で得られたタンパク質に由来するピーク と工程 （b) で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、 各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程と、
を含む、 前記方法。
( 3 )複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析する方法であって、
(a) タンパク質群の中から、 化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の 化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
(b) 予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、 化合物が固定化さ れた担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製 する工程と、
(c) 工程 （a) で得られたタンパク質または工程 （b) で得られたタンパク質の 一方を同位体標識する工程と、
(d) 工程 （c) で得られた標識されたタンパク質と、 工程 （a) および工程 （b) で得られたタンパク質のうち工程（c) で標識されていなレ、他方のタンパク質 とを混合する工程と、
(e) 工程 （d) で得られた混合物を質量分析処理する工程と、
(f)質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程と、 (g) 各タンパク質について、 工程 （a) で得られたタンパク質に由来するピーク と工程 （b) で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、 各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程と、
を含む、 前記方法。
( 4 )複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析する方法であって、 (a) タンパク質群の中から、 化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の 化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
(b) 工程 （a) で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタ ンパク質群とを混合する工程と、 (c) 工程 （b) で得られた混合物を質量分析処理する工程と、
(d) 予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、 化合物が固定化さ れた担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製 する工程と、
(e) 工程 （d) で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタ ンパク質群とを混合する工程と、
(f) 工程 （e) で得られた混合物を質量分析処理する工程と、
(g) 工程 （c) および工程 （f) で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク 質中の各タンパク質を同定する工程と、 (h) 各タンパク質について、 工程 （a) で得られたタンパク質に由来するピーク と内部標準物質であるタンパク質に由来するピークとの強度比および工程 (d) で得られたタンパク質に由来するピークと内部標準物質であるタンパ ク質に由来するピークとの強度比を求めて、 当該強度比を比較することによ り各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程と、
を含む、 前記方法。
( 5 )複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析する方法であって、 (al) タンパク質群の中から、 化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の 化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
(a2) 工程 （al) で得られた精製物を質量分析処理する工程と、
(a3) 工程 （a2) で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タン パク質を同定する工程と、
(a4) 複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する工程と、
(bl) 予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、 化合物が固定化さ れた担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製 する工程と、
(b2) 工程 （bl) で得られた精製物を質量分析処理する工程と、
(b3) 工程 （b2) で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タン パク質を同定する工程と、 (b4) 複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する工程と、 (c) 各タンパク質について、 工程 （al) で得られたタンパク質に由来するタン パク質量と工程 （bl) で得られたタンパク質に由来するタンパク質量との比 を求めて、 各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程と、 を含む、 前記方法。
(6) 化合物が固定化された担体が、 ァフィ二ティークロマトグラフィー用の担 体である、 （1) 〜 （5) のいずれか 1項に記載の方法。
(7) 工程 （b) におけるタンパク質群と化合物との接触を複数種の化合物につ いて行うことを特徴とする、 （1) 〜 （3) のいずれか 1項に記載の方法。 (8) 工程 （d) におけるタンパク質群と化合物との接触を複数種の化合物につ いて行うことを特徴とする、 （4) に記載の方法。
(9) 工程 （bl) におけるタンパク質群と化合物との接触を複数種の化合物につ いて行うことを特徴とする、 （5) 記載の方法。
(10) 担体に固定化された化合物が、 ATP、 GTP、 NADおよび NADPからな る群から選択されるいずれかの化合物である、 （1) 〜 （9) のいずれか 1項に 記載の方法。
(1 1) 同位体が、 2H、 13C、 15N、 170、 0、 33pおよび 34Sからなる群から選 択されるいずれかの同位体又はこれらの組み合わせである、 （1)〜（4)、 (6) 〜 （8) および （10) のいずれか 1項に記載の方法。
(12) 同位体が、 である、 （1 1) に記載の方法。
(13) 複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析するシステムで あって、
(a) 同位体標識されたタンパク質群の中から、 化合物が固定化された担体を用 レ、て当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、 (b) 予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、 化合物が固定化さ れた担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製 する手段と、
(c) 手段 （a) および手段 （b) で得られたタンパク質を混合する手段と、 (d) 手段 （c) で得られた混合物を質量分析処理する手段と、
(e)質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段と、
(f) 各タンパク質について、 手段 （a) で得られたタンパク質に由来するピーク と手段 （b) で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、 各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段と、
を含む、 前記システム。
( 1 4 ) 複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析するシステムで あって、
(a) タンパク質群の中から、 化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の 化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
(b) 予め化合物と接触させておいた同位体標識されたタンパク質群の中から、 化合物が固定化された担体を用いて当 担体上の化合物に結合する複数種の タンパク質を精製する手段と、
(c) 手段 （a) および手段 （b) で得られたタンパク質を混合する手段と、 (d) 手段 （c) で得られた混合物を質量分析処理する手段と、
(e)質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段と、
(f) 各タンパク質について、 手段 （a) で得られたタンパク質に由来するピーク と手段 （b) で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、 各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段と、
を含む、 前記システム。
( 1 5 ) 複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析するシステムで あって、
(a) タンパク質群の中から、 化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の 化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
(b) 予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、 化合物が固定化さ れた担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製 する手段と、
(c) 手段 （a) で得られたタンパク質または手段 （b) で得られたタンパク質の 一方を同位体標識する手段と、
(d) 手段 （c) で得られた標識されたタンパク質と、 手段 （a) および手段 （b) で得られたタンパク質のうち手段（c) で標識されていない他方のタンパク質 とを混合する手段と、
(e) 手段 （d) で得られた混合物を質量分析処理する手段と、
(f)質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段と、
(g) 各タンパク質について、 手段 （a) で得られたタンパク質に由来するピーク と手段 （b) で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、 各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段と、
を含む、 前記システム。
( 1 6 ) 複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析するシステムで あって、
(a) タンパク質群の中から、 化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の 化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
(b) 手段 （a) で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタ ンパク質群とを混合する手段と、
(c) 手段 （b) で得られた混合物を質量分析処理する手段と、
(d) 予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、 化合物が固定化さ れた担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製 する手段と、
(e) 手段 （d) で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタ ンパク質群とを混合する手段と、
(f) 手段 （e) で得られた混合物を質量分析処理する手段と、
(g) 手段 （c) および手段 （f) で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク 質中の各タンパク質を同定する手段と、
(h) 各タンパク質について、 手段 （a) で得られたタンパク質に由来するピーク と内部標準物質であるタンパク質に由来するピークとの強度比および手段
(d) で得られたタンパク質に由来するピークと内部標準物質であるタンパ ク質に由来するピークとの強度比を求めて、 当該強度比を比較することによ り各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段と、
を含む、 前記システム。
( 1 7 ) 複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析するシステム であって、
(al) タンパク質群の中から、 化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の 化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
(a2) 手段 （al) で得られた精製物を質量分析処理する手段と、
(a3) 手段 （a2) で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タン パク質を同定する手段と、
(a4) 複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する手段と、
(bl) 予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、 化合物が固定化さ れた担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製 する手段と、
(b2) 手段 （bl) で得られた精製物を質量分析処理する手段と、
(b3) 手段 （b2) で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タン パク質を同定する手段と、
(b4) 複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する手段と、
(c) 各タンパク質について、 手段 （al) で得られたタンパク質に由来するタン パク質量と手段 （bl) で得られたタンパク質に由来するタンパク質量との比 を求めて、 各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段と、 を含む、 前記システム。
( 1 8 ) 化合物が固定化された担体が、 ァフィ二ティークロマトグラフィー用の 担体である、 （1 3 ) 〜 （1 7 ) のいずれか 1項に記載のシステム。
( 1 9 ) 手段 （b) におけるタンパク質群と化合物との接触を複数種の化合物に ついて行うことを特徴とする、 （1 3 ) 〜 （1 5 ) のいずれか 1項に記載のシス テム。
( 2 0 ) 手段 （d) におけるタンパク質群と化合物との接触を複数種の化合物に ついて行うことを特徴とする、 （16) に記載のシステム。
(21) 手段 （bl) におけるタンパク質群と化合物との接触を複数種の化合物に ついて行うことを特徴とする、 （17) 記載のシステム。
(22) 担体に固定化された化合物が、 ATP、 GTP、 NADおよび NADPからな る群から選択されるいずれかの化合物である、 （13) 〜 （21) のいずれか 1 項に記載のシステム。
(23) 同位体が、 2H、 ；、 15N、 170、 0、 33ρおよび 3 からなる群から選 択されるいずれかの同位体又はこれらの組み合わせである、（13)〜（16)、 (18) 〜 （20) および （22) のいずれか 1項に記載のシステム。
(24) 同位体が、 13Cである、 （23) に記載のシステム。 本発明により、 簡便かつ効率的に、 複数種のタンパク質と化合物との構造親和 性相関を同時に解析することが可能となつた。
また、 本発明により、 化合物を固定化したァフイエティ一クロマトグラフィー カラムを複数種用意する必要がなくなり、 簡便かつ効率的に複数種の化合物に基 づく構造親和性相関の情報を得ることができるようになった。 また、 本発明で用 いる化合物中の一種類の化合物を固定化するだけで、 他の化合物は固定化せずに 使用するため、 各化合物本来の構造でタンパク質に対する親和性を評価すること ができるようになり、 より正確な構造親和性相関の情報を得ることが可能となつ た。
さらに、 本発明により、 本発明で用いる化合物の構造を変えることによって、 種々の構造を有する化合物を使用することにより、 化合物の構造がいかなるタン パク質との親和性に影響を与えるのかを網羅的に解析することが可能となり、 網 羅的に化合物とタンパク質との構造親和性相関を解析することができる。 これに よって、 化合物、 特に薬剤を合成、 開発する上で、 主作用を増強しつつ、 副作用 を軽減するような有益な情報を得ることが可能となった。
また、本発明により、担体に固定化する化合物として、 ATP、 GTP (Guanosine
Triphosphate )、 NAD/NAD H ( Nicotinamide adenine dinucleotide ) 7こ（ま NADP/NADPH (Nicotine amide dinucleotide phosphate)を用いることにより、 ATP, GTP、 NADまたは NADPに結合する複数種のタンパク質に対する化合物 の構造親和性相関の情報を得ることが可能となつた。
具体的には、本発明により ATPを固定化した担体を用いて構造親和性相関の情 報を得ることにより、 化合物の構造を変えることによって、 いかなる kinase と の親和性に影響を与えるのかを網羅的に解析することが可能となり、 kinase阻害 剤のスクリーニングをする上で、 特異性、 選択性などに関する有益な情報を得る ことが可能となった。
また、 本発明により GTP を固定化した担体を用いて構造親和性相関の情報を 得ることにより、 化合物の構造を変えることによって、 いかなる GTP結合タン パク質との親和性に影響を与えるのかを網羅的に解析することが可能となり、 GTP結合タンパク質阻害剤のスクリーニングをする上で、 特異性、 選択性など に関する有益な情報を得ることが可能となった。
さらに、本発明により NADまたは NADPを固定化した担体を用いて構造親和 性相関の情報を得ることにより、 化合物の構造を変えることによって、 いかなる dehydrogenase との親和性に影響を与えるのかを網羅的に解析することが可能 となり、 dehydrogenase阻害剤のスクリ一二ングをする上で、 特異性、 選択性な どに関する有益な情報を得ることが可能となった。
さらに、 化合物が固定化された担体 （例えば、 ァフィ二ティーク口マトグラフ ィーカラム） に結合した化合物の濃度は、 一般的に担体 l mlあたり 0.1 mgから 数 mg程度であり、 これは I mM前後に相当する。 し力 し、 細胞に対して何らか の活性を有する化合物は、 数/ Mから数 nM、 ときには数 pM程度で活性を示す ことが知られている。 したがって、 細胞に対して何らかの活性を示す濃度と、 化 合物が固定化された担体 （例えば、 ァフイエティークロマトグラフィーカラム） に固定化された化合物濃度との間には大きな乖離がある。 本発明においては、 担 体に固定化していない化合物を用いるため、化合物濃度を数 から数 nMに減 らすことも可能となった。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明の第一の態様を概略的に示す図である。
図 2は、 本発明の第一の態様を概略的に示す図である。
図 3は、 本発明の第二の態様を概略的に示す図である。
図 4は、 本発明の第三の態様を概略的に示す図である。
図 5は、 複数種のタンパク質と式 2—式 6 (ィヒ 2—化 6 ) で表される化合物 との構造親和性相関を表す。 数字が小さいほど化合物に対して親和性が強いこと を意味している。
図 6は、 本発明のシステムの構成を示すブロック図である。
図 7は、 本発明のシステムの各ユニットを示す模式図である。
図 8は、 制御ュ-ッ トの詳細構成図である。
図 9は、 制御ュニットの動作のフローチャートである。
図 1 0は、 一つの培養装置から採取されるタンパク質群を複数個に分ける際 の装置の模式図である。 符号の説明
1 a ：チューブ
1 b ：チューブ
2. a ：攬拌羽根
2 b ：攪拌羽根
1 1 a ：培養装置
1 1 b ：培養装置
1 1 c ：培養装置
1 2 a ：培養液ボトル
1 2 b ：培養液ボ,トル
1 3 a ：細胞破砕器
1 3 b ：細胞破砕器
1 3 c ：細胞破砕器 1 4 化合物との接触器
1 4 c一 1 ：化合物との接触器
1 4 c一 2 ：化合物との接触器
1 4 c一 3 ：化合物との接触器
1 5 a ：化合物が固定化された担体
1 5 b ：化合物が固定化された担体
1 6 a ： タンパク質精製用制御装置
1 6 b ： タンパク質精製用制御装置
1 7 a ：精製タンパク質分取器
1 7 b ：精製タンパク質分取器
1 8 ： チューブ
1 9 ： プレート
2 0 ：質量分析処理装置
2 1 ： コンピュータ
3 0 ： 中央コンピュータ
3 1 ： サンプル分注装置
1 0 0 ： L A N
6 0 1 ：制御ュニット
6 0 2 ：タンパク質精製ュニット
6 0 3 ：タンパク質混合ュニット
6 0 4 ：質量分析ュニット
8 0 1 ： C P U
8 0 2 ：送信/受信部
8 0 3 ：入力部
8 0 4 ：出力部
8 0 5 ： R OM
8 0 6 ： R AM
8 0 7 ：ハードディスク ドライブ (HDD) 8 0 8 ： C D - R OMドライブ
8 0 9 : タンパク質データベース (DB)
8 1 0 : C D - R OM
8 1 1 ：ィンターネット 発明を実施するための最良の形態
以下に本発明の実施の形態について説明する。 以下の実施の形態は、 本発明を 説明するための例示であり、 本発明をこの実施の形態にのみ限定する趣旨ではな レ、。 本発明は、 その要旨を逸脱しない限り、 さまざまな形態で実施をすることが できる。
なお、 本明細書において引用した文献、 公開公報、 特許公報その他の特許文献 は、 参照として本明細書に組み込むものとする。 本発明は、 複数種のタンパク質と 1種以上の化合物との構造親和性相関を解析 する方法に関するものである。 本発明の方法は、 （i)ある化合物が固定化された担 体を用いてタンパク質を精製し、他方、 （ii)タンパク質の群と化合物とを接触させ てその接触したタンパク質を前記担体を用いて精製し、 （iii)上記 (i)と (ii)により精 製された各タンパク質の量比を、 同位体標識または指標 EMPAIを利用し、 質量 分析により測定することを基本とする。
上記方法の例としては、 まず、 ある化合物が固定された担体 （カラム） を用い て、 同位体標識されたタンパク質群から、 当該カラム上の化合物に結合する複数 種のタンパク質を精製する。 一方で、 化合物が固定された前記の担体 （カラム） を用いて、 予め 1種以上の化合物と接触させておいた同位体非標識のタンパク質 群または異なる同位体で標識されたタンパク質群から、 当該カラム上の化合物に 結合する複数種のタンパク質を精製する。
上記の担体 （カラム） に添加するタンパク質群 （例えば、 細胞から抽出したタ ンパク質群） の中には、 多種多様のタンパク質が存在する。 本発明の方法は、 担 体 （カラム） を用いることにより、 担体 （カラム） 上の化合物に結合する複数種 のタンパク質を選別して、 続く解析の対象とするものである。 つまり、 本発明の 方法は、 母集団である多種のタンパク質を含むタンパク質群から、 当該化合物に 結合するという類似した性質を有する複数種のタンパク質を選択し、 当該複数種 のタンパク質と 1種以上の化合物との構造親和性相関を解析するものである。 また、本発明では、母集団であるタンパク質群を予め化合物と接触させておき、 そこから担体 （カラム） を用いて担体 （カラム） 上の化合物に結合する複数種の タンパク質を精製する。 当該タンパク質群の中には、 予め化合物と結合している ことにより、 結合部位が競合し、 担体 （カラム） 上の化合物に結合しにくくなる タンパク質も存在する。 その結果、 カラムから精製した当該タンパク質の量（（c c ) とする） は、 予め化合物と接触する操作をしないでカラムから精製した当該 タンパク質の量 （（c ) とする） よりも少なくなる。 そして、 どちらかのタンパク 質を同位体標識することで、 （C ) と （C C ) を同時に質量分析処理で比較するこ とができ、 親和性の比を算出することができる。 本発明は、 以上の原理を利用し て、 複数種のタンパク質と 1種以上の化合物との構造親和性相関の解析を行うも のである。 本発明において 「構造親和性相関」 とは、 一群の共通骨格を有する化学物質の 構造変化と、 その化学物質とタンパク質との親和性 （結合の強さ） との相関関係 をレ、う。
本発明において 「タンパク質」 とは、 2以上のアミノ酸がペプチド結合によつ て結合したペプチドを含む。
<化合物が固定化された担体〉
本発明において、 「化合物が固定化された担体」 とは、 担体に官能基を介して、 化合物を共有または非共有結合させたものをいう。
化合物が固定化された担体は、 例えば、 まず、 担体側に官能基として、
N-hydroxy-succinimideや Hydrazideを共有結合させたり、単にァミノ基にした り、または Protein A、 Heparinもしくは Cibacron Blue F3GAなどを固定化し、 このような担体の官能基に対して、 化合物を直接または化合物の構造の一部を変 えたものを共有または非共有結合させたものがある。
担体に固定化する化合物は、 特に限定されず、 例えば、 合成低分子化合物、 合 成ペプチド、 精製または部分精製ポリペプチド、 抗体、 細菌放出物質 （細菌代謝 産物を含む）、生体内核酸物質（ATP、 GTP、 NAD/NADHまたは NADP/NADPH など）、脂質などが挙げられる。これら化合物は、新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であってもよい。 担体に固定化する化合物は、 所定の活性を有する ものである。 本明細書において 「所定の活性」 とは、 担体に固定化される化合物 または後述の非固定化化合物が有する活性を意味し、 特に限定されず、 例えば、 生理活性、 生物活性、 薬理活性、 結合活性等を挙げることができる。
担体としては、 ァガロースゲル、 アクリルアミ ド、 磁気ビーズ、 セルロース、 シリカゲルなどがあげられ、好ましくはァガロースゲルである。担体は、例えば、 バイオラド社等から購入することができる （ァフィグル 10、 バイオラドネ土製、 力 タログ番号 153-6099)。
化合物が固定化された担体は、 担体に所望の化合物を結合させることにより、 作製することができる。 化合物が固定化された担体の作製は、 例えば、 アミノ基 を有する化合物であれば、 以下の手順で行うことができる。 まず、 アミノ基を有 する化合物溶液を N-hydroxy-succinimideが結合している担体（例えばァフィゲ ノレ 1 0 )に加える。次に、 トリェチルァミンを加え、インキュベーションした後、 2-アミノエタノールを加え、 さらにィンキュベーションすることによって作製す ることができる。 また、 適宜洗浄操作を加えることが好ましい。
また、 化合物が固定化された担体の作製は、 カルボン酸を有する化合物であれ ば、 以下の手順で行うことができる。 まず、 カルボン酸を有する化合物溶液に力 ルボジイミ ドを加え、 インキュベーションした後、 ァミノ基が結合している担体 に加える。 次に、 酢酸 （もしくは乳酸） を加え、さらにインキュベーションするこ とによつて作製することができる。また、適宜洗浄操作を加えることが望ましい。 さらに、 NADPアナログを固定化した担体などは、 例えば、 アマシャムバイオサ ィエンス社から購入することができる （2，5'ADP Sepharose 4B (コード番号 17-0700-01)) o 担体に固定化する化合物の量は、特に限定されないが、担体 1 mlあたり 0.1 mg から数 mg程度とすることが好ましい。
化合物が固定化された担体は、 ァフィ二ティークロマトグラフィー用の担体と して用いることができ、 適当なカラム （例えば、 ポリプレップェンプティカラム (バイオラド社製、 Cat No. 731-1550) 等） に充填することによって、 化合物 を固定化したァフィ二ティークロマトグラフィーカラムとして使用できる。また、 化合物が固定化された担体は、 適当なチューブ （例えば、 エツペンドルフチュー ブ （エツペンドルフ社製） 等） に加えることによって、 使用することもできる。 1 . 本発明の第一の態様
本発明の第一の態様は、 複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解 析する方法であって、
(a) 同位体標識されたタンパク質群の中から、 化合物が固定化された担体を用 いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、 (b) 予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、 化合物が固定化さ れた担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する 工程と、
(c) 工程 （a) および工程 （b) で得られたタンパク質を混合する工程と、
(d) 工程 （c) で得られた混合物を質量分析処理する工程と、
(e)質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程と、
(f) 各タンパク質について、 工程 （a) で得られたタンパク質に由来するピーク と工程 （b) で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、 各タ ンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程と、
を含む、 前記方法を提供する。
本発明の第一の態様を概略的に説明する （図 1を参照)。
本発明においては、 まず、 所定の活性を有する化合物が固定化された担体 （例 えば、 ァフィ二ティークロマトグラフィーカラム等） を用意する。 活性を有する 化合物の固定化量は、 担体 l mlあたり 0.1 mgから数 mg程度とすることが好ま しい。 この化合物が固定化された担体に同位体で標識した （図 1中 「*」 印で表 示） タンパク質群 （図 1 (a) 中、 三角形並びに円およびだ円で表示） をァプラ ィし、 前記化合物に結合した結合タンパク質 （図 1 (a) 中、 円およびだ円で表 示）を精製する。得られた複数種のタンパク質をタンパク質 Aとする（図 1 (a))。 ここで、 「タンパク質群」 とは、 担体にのせる （アプライする） 母集団となるサン プルのことを意味する。
一方、 担体に固定化されていない化合物 （所定の活性を有する 1種又は複数種 の化合物。それぞれの化合物の活性の強度は、異なっていることが好ましい。） （図 1 (b) 中、 化合物 a、 b、 c、 d) を、 適当な濃度 （例えば数 μΜ) になるよ うに同位体非標識のタンパク質群 （図 1 (b) 中、 三角形並びに円およびだ円で 表示） に添加して、 一定時間インキュベートして当該タンパク質群と化合物とを 接触させる （サンプル液)。 本明細書において、 タンパク質群に接触させるために 添加する化合物であって、 固定化されていない化合物を、 「非固定化化合物」 とい うこともある。 このサンプル液には大量のタンパク質が含まれているため、 水に 対して難容性の化合物であっても、 ある程度溶解させることができる。 ここで、 同位体非標識のタンパク質群に代えて、前記の「同位体標識されたタンパク質群」 とは異なる同位体で標識されたタンパク質群を用いることもできる。
この各サンプル液を、 前記の所定の活性を有する化合物が固定化された担体に のせ、 当該化合物に結合した結合タンパク質を精製する。 得られた複数種のタン パク質の集合をタンパク質 Bとする。 ただし、 非固定化化合物毎にサンプル液を 調製するため、 タンパク質 Bは添加した非固定化化合物の種類だけ数がある （図 1 (b))。 図 1 (b) では、 4種類の非固定化化合物 （化合物 a、 b、 c、 d) を予めタンパク質群に接触させているため、 Bは 4種類存在することを示してい る。
このタンパク質 A とタンパク質 B とを一定の割合で混合し （図 1 (c)；)、
SDS-PAGEなどでタンパク質を分離後、 トリプシンなどで消化して質量分析処理 し （図 1 (d))、 タンパク質の同定を行う （図 1 (e))。 ここで、 質量分析処理 の結果として得られる質量分析スぺクトル （図 1 (d)) では、 同一タンパク質に ついての、 同位体標識したサンプル由来であるタンパク質 Aのピーク （破線ピー ク） と同位体非標識のサンプル由来又は異なる同位体で標識したサンプル由来で あるタンパク質 Bのピーク （黒色実線ピーク） の 2本のペアで観測される。 そし て、 各タンパク質について、 A由来のピークと B由来のピークとの強度比を求め て、 各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する （図 1 ( f ) )。
以下に、タンパク質 Aとタンパク質 Bとを 1対 1で混合した場合における解析 例を示す。
非固定化化合物 （図 1の化合物 bを例とする） と結合したタンパク質は、 担体 上に固定化した化合物 aに結合しにくくなるので、 質量分析スぺクトル上でタン パク質 B由来のピークは、タンパク質 A由来のものと比べて小さくなる。例えば、 B由来のタンパク質 （図 1のタンパク質 P 2を例に用いる） 上の化合物 aとの結 合部位と化合物 bとの結合部位が同じまたは重なるときであって、 タンパク質 P 2に対する親和性が化合物 bの方が化合物 aよりも大きいとき、 または化合物 b の濃度が化合物 aより高いときには、 当該結合部位が化合物 bとの結合で使用さ れているために、 タンパク質 P 2は担体上に固定した化合物 aに結合しにくくな る。 その結果、 担体から精製される B由来のタンパク質 P 2の量は、 A由来のタ ンパク質 P 2の量に比べて少なくなる。 したがって、 B由来の質量分析スぺクト ルピークは A由来のものよりも小さくなる （図 1の b— P 2 )。 また例えば、 タン パク質 P 2と化合物 bとの結合によって、 タンパク質 P 2上の化合物 aとの結合 部位がマスクされしまう場合も、 同様に考えることができる。
逆に、 添加した非固定化化合物 （例えば図 1の化合物 b ) と結合しないタンパ ク質 （例えば図 1のタンパク質 P 1 ) は、 担体上に固定化された化合物への結合 に影響を受けないので、 担体上の化合物に結合するタンパク質 P 1の実質的な量 は、 非固定化化合物の添加の有無に関わらず同じになる。 この場合、 「実質的な」 とは、 非固定化化合物の添加によって生じる担体固定化化合物へのタンパク質の 非特異的な結合量の変化は含めないで考えた場合を意味する。 したがって、 B由 来のタンパク質 P 1のピークは A由来のタンパク質 P 1のピークと実質的に同じ であり （図 1の b— P l )、 ピーク強度比に変化は生じない。 添加した非固定化化合物と担体に固定化された化合物とが同一である場合 （例 えば、 図 1の化合物 a)、 担体上に固定化された化合物 aは、 タンパク質 （例えば
P1) との結合を非固定化化合物 aによって競合的に拮抗されるため、 担体上に固 定化された化合物 aに結合するタンパク質の量が少なくなる。 その結果、 精製し て得られたタンパク質 Aとタンパク質 Bを 1対 1で混合したとき、質量分析スぺ クトル上で非標識タンパク質 B由来のピークは、標識タンパク質 A由来のものと 比べて小さくなる （図 1の a— P1)。
一方、添加した非固定化化合物と担体に固定化された化合物とが同じであって、 精製タンパク質 A及び Bを 1対 1で混合した場合において、 B由来のピークが A 由来のピークよりも小さくならないピークパターンを示すタンパク質 （図 1の a
-P3) は、 当該化合物以外の部分 （例えば担体部分等） に結合した非特異的結合 タンパク質であることがわかる。
また、 活性の異なる非固定化化合物同士 （例えば図 1の a、 b、 c、 d同士） の比較において、質量分析スぺクトル上で B由来のピークが A由来のピークと比 ベて同程度小さくなる場合には （図 1 ( d )、質量分析スペク トル中の各 P 3のス ぺクトル）、 当該タンパク質 （例えば図 1のタンパク質 P 3 ) は、 活性を有する化 合物、 つまり添加された化合物 a、 b、 c、 dの活性に重要な特異的結合タンパ ク質ではないと考えられる。
一方、 添加する所定の活性を有する非固定化化合物 （例えば図 1の化合物 d ) が低濃度であっても質量分析スぺク トル上で B 由来のピークが小さくなる場合
(図 1の d— P 4 ) には、 当該タンパク質 （例えば図 1のタンパク質 P 4 ) は、 その化合物の活性に重要なタンパク質である可能性がある。 同様に、 構造は近い が活性が異なる別の非固定化化合物 （例えば図 1の化合物 c ) によって質量分析 スぺク トル上で B由来のピークが影響を受けないのであれば（図 1の c — P 4 )、 当該タンパク質 P 4が前記の活性を有する非固定化化合物 dの当該活性に重要な 特異的結合タンパク質である可能性が高い。
また、 非固定化化合物とタンパク質との親和性が極めて弱い場合 （どの程度弱 いかは不明）であって、当該化合物濃度が低い場合には、カラムを通過する際に、 タンパク質と結合している化合物がカラム内に高濃度に固定化された化合物と置 き換わるという影響を受ける可能性もあるが、 このことは、 非固定化化合物濃度 を高めることでそのような影響を低下させることができる。
このような方法を用いることによって、 簡便かつ効率的に、 複数種のタンパク 質と化合物との構造親和性相関を同時に解析することが可能となる。
また、 化合物が固定化された担体 （例えば、 ァフィ二ティーク口マトグラフィ 一力ラムなど） としては、 ATP、 GTP、 NAD/NADHまたは NADP/NADPHな どを固定化した担体またはカラムを使うこともできる。 このような担体または力 ラムを用いて、 同様に様々な化合物で親和性の程度を調べれば、 特定のタンパク 質の ATP、 GTP、 NAD/NADHまたは NADP/NADPH結合部位に結合する化合 物とタンパク質との構造親和性相関を見出すことも可能になる。 ' さらに、 この方法では同位体を使っているため、 SDS-PAGE上でのバンドの有 無だけではなく、 質量分析スぺクトル上でピーク強度比を計算することで定量的 な情報を得ることができる。 このような情報は、 化合物を合成する研究者に大き な情報を与えることが出来る。 これまで構造活性相関では 1つの標的分子あるい は 1つのァッセィ系に対して、 化合物の種類を変えて活性値の変化を調べて次の 合成展開をはかってきた。 一方、 本発明の方法を使えば、 1種又は複数種の化合 物と複数種のタンパク質との構造親和性相関を網羅的に解析することができる。 つまり、 1つの化合物に着目すれば結合する複数種のタンパク質それぞれに対す る特異性の違いを定量的に評価でき、 また、 あるタンパク質に注目すれば化合物 間での結合の違いを定量的に知ることができる。
以下、 本発明の第一の態様について、 詳細に記載する。
く同位体標識されたタンパク質群および同位体標識されていないタンパク質群
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本発明において、 「同位体標識されたタンパク質群」 とは、 タンパク質を構成す る分子の一部が同位体で標識されたタンパク質の集合をレヽう。
同位体標識されたタンパク質群は、 タンパク質を構成する分子 （アミノ酸） の 一部が同位体で標識されていればよく、 その調製方法や標識部位については、 特 に限定されない。
以下、 具体的な調製方法について記載する。
同位体標識されたタンパク質群は、 代謝的に同位体標識することによって、 調 製することができる。 例えば、 培養可能な細胞を、 同位体標識されたアミノ酸を 含む培地で培養することによって、 細胞中のタンパク質を代謝的に同位体標識す ることができる。 培養条件はどのようなものであってもよく、 液体培地あるいは 固体培地に該細胞を培養するのに好適な条件を選択すればよい。 例えば、 動物細 胞を選択した場合には、 DMEM、 MEM、 RPMI1640、 IMDM等の培地を用い、 必要に応じゥシ胎児血清 （FCS) 等の血清、 アミノ酸、 グルコース、 ペニシリン 又はストレプトマイシンなどを添加することができ、 pH約 6〜8、 30〜40°Cにお いて 15〜200時間前後の培養を行うことができる。 その他、 必要に応じ途中で培 地の交換を行ったり、 通気及び攪拌を行ったりすることができる。
このようにして得られた代謝的に同位体標識されたタンパク質群を含む細胞を 破砕することで、 同位体標識されたタンパク質群を調製することができる。 破砕 する方法は、 例えば、 ダウンス型テフロン ΤΜ ·ホモジナイザー、 ポリ トロン、 ヮ ーリング ·プレンダー、 ポッター型ガラス ·ホモジナイザー、 超音波破砕装置、 細胞溶解液（例えば、 PIERCE社の M-PER: cat no. 78501， T-PER: cat no. 78510 など） を用いる方法又は凍結融解法があげられ、 好ましくは細胞溶解液を用いる 方法があげられる。 破砕した細胞は、 遠心分離操作により、 不溶性物質を除去す ることが好ましい。 このようにして、 同位体標識されたタンパク質群を調製する ことができる。
本発明で用いる同位体は、 放射性同位体を適用することもできるが、 放射性を 有さない安定同位体が、 取り扱いが容易であることから、 特に好ましい。 安定同 位体には、 以下に限定されるものではないが、 2H、 i3C、 15N、 170、 180、 33P若 しくは 34 S又はこれらの組み合わせが挙げられ、 好ましくは 2 H、 i3C、 15N若し くは 180又はこれらの組み合わせであり、 より好ましくは13 C、 N若しくは 180 又はこれらの組み合わせであり、 さらに好ましくは i3Cである。 本発明に利用さ れる同位体は、 タンパク質を標識し得るものであれば、 その種類は特に限定され なレ、。 具体的には、 同位体標識タンパク質の前駆体として、 13C標識 （i3C x 6個） ロイシン （Cambridge Isotope Labs(CIL)社製、 L-Leucine U.13C6, CLM-2262) を挙げることができる。
また、 同位体標識されたタンパク質群は、 in vitroにおいても調製することが できる。 たとえば、 タンパク質中のシスティン残基を同位体標識されたアルキル 化試薬を用いてアルキル化することにより、同位体標識することができる （「ラビ ッ ド ' コミュケーシヨ ンズ ' イン ' マス ' スぺク トルメ ト リー （ Rapid Communications in Mass SpectroscoDv)」 第 1 6卷、 第 1 5号、 2 0 0 2年、 pp.1416-1424参照）。 さらに、 タンパク質中のシスティン残基を同位体標識され たピオチン化試薬を用いてピオチン化することにより、 同位体標識することもで きる。 これを、 さらに、 アビジンカラムを用いて、 標識されたタンパク質のみを 精製することが可能である （「ネイチヤー 'バイオテクノロジー （Nature Biotechnology) J 第 1 7卷、 第 1 0号、 1 9 9 9年 1 0月、 ρρ.994·999)。
本発明において、 「同位体標識されていないタンパク質群」 とは、 同位体標識す る行為を施していないタンパク質の集合をいう。
同位体標識されていないタンパク質群は、 タンパク質を含む生体試料、 好まし くは細胞、 特に好ましくは培養細胞を破砕し、 タンパク質を抽出することで調製 することができる。
破碎する方法は、 例えば、 ダウンス型テフロン ΤΜ ·ホモジナイザー、 ポリ トロ ン、 ワーリング' プレンダー、 ポッター型ガラス ' ホモジナイザー、 超音波破碎 装置、細胞溶解液 （例えば、 PIERCE社の MvPER: cat no. 78501, T-PER: cat no.
78510など） を用いる方法又は凍結融解法があげられ、 好ましくは細胞溶解液を 用いる方法があげられる。 破碎した細胞は、 遠心分離操作により、 不溶性物質を 除去することが好ましい。 このようにして、 同位体標識されていないタンパク質 群を調製することができる。
また、 同位体標識されたタンパク質群および同位体標識されていないタンパク 質群は、 化学合成により製造してもよレ、。
なお、 同位体標識されたタンパク質群および同位体標識されていないタンパク 質群は、 適当な条件、 好ましくは一 2 0 °C以下、 特に好ましくは— 8 0 °C以下で 保存することができる。
本発明において、 「同位体標識されていない （同位体非標識） タンパク質群」 に ついては、 天然型試薬 （同位体でない試薬） を用いて、 「同位体標識されたタンパ ク質群」 と同一の方法で調製することが好ましレ、。
本発明において、 「同位体標識されていないタンパク質群」 の代わりに 「同位体 標識されたタンパク質群」 の同位体とは異なる同位体で標識されたタンパク質群
(以下、 「異なる同位体で標識されたタンパク質群」 ともいう。） を用いることも できる。 当該 「異なる同位体で標識されたタンパク質群」 中の同位体は、 両タン パク質群由来の対応する各タンパク質の質量が異なるようにタンパク質を標識で きる限り、 「同位体標識されたタンパク質群」中の同位体とは別の同位体であって もよいし、 同一の同位体を含んでいてもよい。
( 1 ) (a) 同位体標識されたタンパク質群の中から、 化合物が固定化された担 体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程 同位体標識されたタンパク質群を、 化合物が固定化された担体を用いて精製す る。 これにより、 担体に固定化した化合物に結合する複数種のタンパク質を精製 することができる。 本明細書において 「担体を用いて」 とは、 母集団のタンパク 質群を精製する際に、 化合物が固定化された担体を利用することを意味する。 以下、 詳細に説明する。
初めに、 適当な溶液で化合物が固定化された担体を平衡化する。 平衡化する溶 液は、 特に限定されないが、 タンパク質群を溶解することができ、 かつ、 変性さ せない溶液が望ましい。 例えば、 生理的 pHに調製したリン酸緩衝液、 Hepes緩 衝液またはトリス緩衝液などが挙げられ、 必要に応じて、 これらに塩化ナトリウ ムおよび/または界面活性剤 （n-ォクチルダルコシドなど） を適当量加えること ができる。
平衡化する工程は、 化合物が固定化された担体が適当な力ラムに充填されてい る場合には、 適当な溶液をカラムにアプライすることによって、 化合物が固定化 された担体が、 適当なチューブに加えられている場合には、 適当な溶液をチュー ブに添加することによって、 それぞれ行うことができる。
次に、 同位体標識されたタンパク質群を、 適当な溶液に溶解する。 続いて、 同 位体標識されたタンパク質群と化合物が固定化された担体とを接触させる。 同位 体標識されたタンパク質群と化合物が固定化された担体とを接触させる工程は、 化合物が固定化された担体が適当なカラムに充填されている場合には、 同位体標 識されたタンパク質群をカラムにアプライすることによって、 化合物が固定化さ れた担体が、 適当なチューブに加えられている場合には、 同位体標識されたタン パク質群をチューブに添加することによって、 それぞれ行うことができる。 その後、 化合物が固定化された担体を適当な溶液で洗浄することが望ましい。 洗浄操作は、 化合物が固定化された担体が、 適当なカラムに充填されている場合 には、 適当な溶液をカラムに添加することによって、 化合物が固定化された担体 力 適当なチューブに加えられている場合には、適当な溶液をチユーブに添加し、 遠心操作をすることによって、 それぞれ行うことができる。
そして、 適当な溶出溶液で同位体標識されたタンパク質群を溶出する。 溶出溶 液は、 特に限定されないが、 例えば、 6 M 塩酸グァニディン、 8 M 尿素、 2% CHAPS, あるいは 10 mM程度の ATPや GTP等を用いることができる。 同位体 標識されたタンパク質群を溶出させる工程は、 化合物が固定化された担体が、 適 当なカラムに充填されている場合には、 適当な溶出溶液をカラムにアプライする ことによって、 化合物が固定化された担体が、 適当なチューブに加えられている 場合には、 適当な溶出溶液をチューブに添加し、 遠心操作をすることによって、 それぞれ行うことができる。
これらの方法により、 担体に固定化した化合物に結合するタンパク質群を精製 することができる。
以上の操作温度は、 特に限定されないが、 4 °Cから 3 7 °C、 さらには 4 °Cから
2 0 °Cで行うことが好ましい。
( 2 ) (b) 予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、 化合物が固 定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精 製する工程
工程 （b ) で用いられるタンパク質群は、 同位体標識されていないタンパク質 群の他、 工程 （a) の 「同位体標識されたタンパク質群」 の同位体と異なる同位 体で標識されたタンパク質群を用いることもできる。 以下の説明では、 同位体標 識されていないタンパク質群を用いた場合について説明するが、「異なる同位体で 標識されたタンパク質群」 の場合も同様に実施することができる。
同位体標識されていないタンパク質群と非固定化化合物とを接触させ、その後、 非固定化化合物と接触させた当該同位体標識されていないタンパク質群を、 化合 物が固定化された担体で精製する。 これにより、 非固定化化合物と接触させた同 位体標識されていないタンパク質群について、 担体に固定化した化合物に結合す る複数種のタンパク質を精製することができる。
以下、 詳細に説明する。 .
初めに、 同位体標識されていないタンパク質群を、 適当な溶液に溶解する。 続 レ、て、 同位体標識されていないタンパク質群と非固定化化合物とを接触させる。 同位体標識されていないタンパク質群と接触させる化合物 （非固定化化合物） は、 特に限定されず、 例えば、 合成低分子化合物、 合成ペプチド、 精製または部 分精製ポリペプチド、 抗体、 細菌放出物質 （細菌代謝産物を含む）、 生体内核酸物 質 （ATP、 GTP、 NAD/NADHまたは NADP/NADPHなど）、 脂質などが挙げら れる。 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であっても よい。 また、 これら化合物は所定の活性を有している。
同位体標識されていないタンパク質群と接触させる化合物 （非固定化化合物） は、 一種であってもよいが、 複数種、 例えば、 5種以上であることが好ましい。 また、これらの化合物および担体に固定化された化合物は、特に限定されないが、 互いに構造において類似することが好ましい。 非固定化化合物は、 担体に固定化 された化合物を含んでいてもよい。 さらに、 生理活性または薬理活性等の所定の 活性の強度が異なることが好ましい。
接触に際しての化合物の溶媒、 濃度、 インキュベーション等の諸条件は、 特に 限定されず、 自由に設定できる。 同位体標識されていないタンパク質群を溶解し た溶液は、 大量のタンパク質が含まれているため、 水に対して難容性の化合物で も溶解させることができる。
次に、 化合物と接触させた当該同位体標識されていないタンパク質群を、 上記
1 . ( 1 ) ( a ) で作製した化合物が固定化された担体で精製する。 タンパク質の 精製方法は、 上記 「1 . ( 1 ) (a) 同位体標識されたタンパク質群の中から、 化 合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパ ク質を精製する工程」 と同様の方法によって行うことができる。
これらの方法により、 化合物と接触させた同位体標識されていないタンパク質 群について、 担体に固定化した化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する ことができる。
( 3 ) (c) 工程 （a) および工程 （b) で得られたタンパク質を混合する工程 工程（a)および工程（b)で得られたタンパク質群を、一定の割合で混合する。 一定の割合は、 等量でもよく、 比率を変えてもよい。 後述する強度比のダイナミ ックレンジを向上させるため、 上記 「1 . ( 1 ) (a) 同位体標識されたタンパク 質群の中から、 化合物が固定化された担体用いて当該担体上の化合物に結合する 複数種のタンパク質を精製する工程」 で得られた複数種のタンパク質に対して、 上記 「1 . ( 2 ) (b) 予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、 化 合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパ ク質を精製する工程」 で得られた複数種のタンパク質を過剰量 （例えば、 2倍か ら 1 0倍） 加えることが好ましい。
( 4 ) (d) 工程 （c) で得られた混合物を質量分析処理する工程
工程 （c) 得られた混合物を質量分析処理する。 混合物は、 そのまま質量分析計 により分析してもよいが、 濃縮 （例えば、 Amicon Ultra- 15 10，000MWCOなど による） や以下の分離または消化を行うことが好ましい。 後述の分離または消化 操作を施した混合物を、 「分離したタンパク質」 または 「消化したタンパク質」 と する。 分離方法は、 二次元電気泳動、 SDS-PAGE、 各種クロマトグラフィー （例 えば、 ァフィ二ティークロマトグラフィー、 逆相クロマトグラフィー、 ァニオン 交換クロマトグラフィー、 カチオン交換クロマトグラフィーなど） 等が考えられ るが、 これに限定されるものではなく、 適当なものを選択すればよい。 消化方法 には、 酵素消化、 化学分解等があげられ、 好ましくは酵素消化があげられるが、 これに限定されるものではなく、 適当なものを選択すればよい。 酵素消化に用い る酵素としては、 トリプシン、 キモトリプシン、 Lys-C, Asp-N, Glu Cなどがあ げられ、 好ましくはトリプシンがあげられる。 また、 酵素消化の際には、 界面活 性剤、 好ましくは 5-cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltoside (アメ リカ特許公報 US5674987および US5763586、 アナトレース社（Anatrace Inc., Maumee, OH, USA) ) を加えることが望ましい。
こうして得られた濃縮したタンパク質、 分離したタンパク質又は消化したタン パク質は、 HPLC により分離することができ、 得られたタンパク質を、 「HPLC により分離されたタンパク質」 とする。 HPLCに用いるカラムは、 当業者におけ る技術常識により、 適当なものを選択すれ よく、 好ましくはァ-オン交換カラ ム又は力チオン交換カラムである。 HPLCの諸条件 （流速、検出器、移動相など） は、 当業者における技術常識により、 適宜選択できる。
次に、 上記の操作により得られた複数種のタンパク質を質量分析計で質量分析 処理する。 質量分析計は、 ガスクロマトグラフと結合された質量分析装置である ガスクロマトグラフィーマススぺク トロメ トリ一 （GC/MS) や液体クロマトグラ フと結合された質量分析装置である液体クロマトグラフィーマススぺク トロメ ト リー （LC/MS) 等の汎用の装置を用いて行うことができる。 質量分析計における イオン化方法は、 各装置に応じて適宜選択できる。 例えば、 MALDI (マトリツ タス支援レーザー脱離イオン化法）、 ESI (エレク トロスプレーイオン化法）、 EI (電子イオン化法）、 CI (化学イオン化法）、 APCI (大気圧化学イオン化法）、 FAB (高速原子衝撃法）、 LD、 FD、 SIMS, TSP等があげられ、 好ましくは MALDI 又は ESIがあげられる。 アナライザ一は、 各装置に応じて適宜選択できる。 例え ば、 TOF (飛行時間型）、 イオントラップ、 二重収束型、 四重極型、 フーリエ変 換型等の汎用の装置を用いて行うことができる。 質量分析計の装置及び方法は、 ここにあげたものに限定されるものではなく、 当業者において質量分析に通常使 用されるものを適宜選択すればよレ、。 ( 5 ) (e) 質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定す る工程
質量分析計による測定の結果得られたデータを用いて、 複数種のタンパク質中 のタンパク質を同定することができる。 すなわち、 得られたデータをソフトフエ ァ （例えば、 SonarMSMS (Genomic solution社製）） およびデータベース （例 えば、 NCBInr (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) , IPI、 Sport等のデータベース） を使用することにより解析し、 サンプル中のタンパク質を同定することが可能で ある。 質量分析計による測定データを用いて、 タンパク質を同定することは当業 者にとって容易である (Nat Genet. 1998: 20, 46.50; J Cell Biol. 1998: 141, 967-977； J Cell Biol. 2000: 148, 635.651; Nature. 2002: 415， 141-147； Nature. 2002: 415, 180-183； Curr Opin Cell Biol. 2003: 15, 199.205; Curr Opin Cell Biol. 2003: 7, 21-27)。 同定されたタンパク質の情報から、 アミノ酸配列情報を得 ることは、 当業者にとって容易である。
( 6 ) (f) 各タンパク質について、 工程 （a) で得られたタンパク質に由来する ピークと工程 (b)で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、 各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程
本発明において、 「工程 （a) で得られたタンパク質に由来するピーク」 とは、 質量分析の測定結果から得られる質量分析スぺクトルにおいて、 同位体標識され たタンパク質群に由来するシグナル強度又はその総和 （通常面積で表されること は当業者であれば理解できる） をいう （以下、 単に 「標識ピーク」 と称する場合 がある）。
本発明において、 「工程 （b) で得られたタンパク質に由来するピーク」 とは、 質量分析の測定結果から得られる質量分析スぺク トルにおいて、 同位体標識され ていないタンパク質群または異なる同位体で標識されたタンパク質群に由来する シグナル強度又はその総和をいう （以下、 説明の便宜上単に 「非標識ピーク」 と 称する場合がある）。
質量分析による測定の結果得られたデータを用いて、 各タンパク質について、 非標識ピークと標識ピークとの強度比 （= 「非標識ピークの強度」 / 「標識ピー クの強度」） （以下、 単に 「ピーク強度比」 と称する場合がある） を求めることに より、 各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量することができる。
同位体標識されたタンパク質は、 同位体標識されていないタンパク質に比べ、 同位体標識されている分子の分、 分子量が大きくなり質量分析スぺク トル上でぺ ァのピークとして観測される。 同位体標識されたタンパク質の分子量は、 同定さ れたタンパク質およびそのァミノ酸配列から計算によって求めることができる。 工程 （b) のタンパク質群のうち、 非固定化化合物と結合したタンパク質は、 非固定化化合物との結合により、 担体上の化合物に結合しにくくなるので、 質量 分析スペク トル上で非標識ピークが小さくなり、 ピーク強度比は、 工程 （b) で 得られたタンパク質と工程 （a) で得られたタンパク質とを工程 （c) において混 合したときの比 （=工程 （b) で得られたタンパク質量の混合量 エ程 （a) で得 られたタンパク質量の混合量） （以下、 「タンパク質混合比」 と称する場合がある） に比べて小さくなる。一方、添カ卩した非固定化化合物と結合しないタンパク質は、 化合物が固定化された担体への結合に影響を受けないので、 非標識ピークが小さ くならず、 ピーク強度比とタンパク質混合比との間で変化は生じない。 また、 生 理活性、 生物活性、 薬理活性または結合活性等の所定の活性が異なる非固定化化 合物同士の比較において、 質量分析スぺク トル上で、 あるタンパク質における非 標識ピークが同程度小さくなる場合、 すなわち、 ピーク強度比が同程度小さくな る場合には、 当該タンパク質は、 活性を有する化合物、 すなわち比較に用いた非 固定化化合物の当該活性に重要な特異的結合タンパク質ではないと考えられる。 一方、 所定の活性を有する非固定化化合物 （説明上、 化合物 Cとする） が低濃 度であっても質量分析スぺクトル上で非標識ピークが小さくなる場合、すなわち、 ピーク強度比がタンパク質混合比に比べて小さくなる場合には、 当該タンパク質 は、その非固定化化合物の活性に重要なタンパク質である可能性がある。同時に、 化合物 Cと構造は類似するが、 生理活性、 生物活性、 薬理活性または結合活性等 の所定の活性が異なる他の非固定化化合物によって、 質量分析スぺク トル上で非 標識ピークが影響を受けずに小さくならない場合、 すなわち、 ピーク強度比が影 響を受けない場合には、 当該タンパク質が、 所定の活性を有する非固定化化合物 Cの当該活性に重要な特異的結合タンパク質である可能性が高い。
また、 非固定化化合物とタンパク質との親和性が極めて弱い場合 （どの程度弱 いかは不明） であって、 当該非固定化化合物の濃度が低い場合には、 カラムを通 過する際に、 タンパク質と結合している前記非固定化化合物が、 カラム内に高濃 度に固定化された化合物と置き換わる可能性もあるが、 このことは、 非固定化化 合物の濃度を高めることで影響を低下させることができる。
このような方法を用いることによって、 簡便かつ効率的に、 複数種のタンパク 質と一種以上の化合物との構造親和性相関を同時に解析することが可能となる。 なお、前記解析方法は、同位体標識されたタンパク質群を化合物と接触させず、 同位体標識されていないタンパク質群を化合物と接触させた場合 （図 1参照） に ついて説明したが、同位体標識されていないタンパク質群を化合物と接触させず、 同位体標識されたタンパク質群を化合物と接触させた場合 （図 2参照） でも本発 明に係る解析方法が実施可能であることは、当業者には容易に理解できる。なお、 この場合はピーク強度比の値は、 「標識ピークの強度」 / 「非標識ピークの強度」 の式により求める。 また、 同位体標識されていないタンパク質群に代えて、 異な る同位体で標識されたタンパク質群を用いても本発明の解析方法を実施すること ができる。
また、 化合物が固定化された担体として、 ATP、 GTP、 NAD/NADH または NADP/NADPHなどを固定化した担体またはカラムを使って、同様に様々な化合 物で親和性の程度を調べれば、 特定のタンパク質の ATP、 GTP、 NAD/NADHま たは NADP/NADPH結合部位に結合する化合物とタンパク質との構造親和性相 関を見出すことも可能になる。
さらに、 この方法では安定同位体を使っているため、 SDS-PAGE上でのバンド の有無だけではなく、 質量分析スぺク トル上でピーク強度比を計算することで定 量的な情報を得ることができる。 このような情報は、 化合物を合成する研究者に 大きな情報を与えることが出来る。 これまで構造活性相関では 1つの標的分子あ るレ、は 1つのアツセィ系に対して、 化合物の種類を変えて活性値の変化を調べて 次の合成展開をはかってきた。 一方、 本発明の方法を使えば、 複数種の化合物と 複数種のタンパク質との構造親和性相関を網羅的に解析することができる。 つま り、 1つの化合物に着目すれば結合する複数種のタンパク質それぞれに対する特 異性の違いを定量的に評価でき、 また、 あるタンパク質に注目すれば化合物間で の結合の違いを定量的に知ることができる。 本発明は、 さらに、 複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析す るシステムであって、
(a) 同位体標識されたタンパク質群の中から、 化合物が固定化された担体を用 いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
(b) 予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、 化合物が固定化さ れた担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する 手段と、 ，
(c) 手段 （a) および手段 （b) で得られたタンパク質を混合する手段と、
(d) 手段 （c) で得られた混合物を質量分析処理する手段と、
(e)質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段と、 (f) 各タンパク質について、 手段 （a) で得られたタンパク質に由来するピーク と手段 （b) で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、 各タ ンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段と、
を含む、 前記システムを提供する。
(a) 同位体標識されたタンパク質群の中から、 化合物が固定化された担体を 用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段は、 上 記の 「1 . ( 1 ) (a) 同位体標識されたタンパク質群の中から、 化合物が固定化 された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製す る工程」 において用いられる手段と同一のものである。
(b) 予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、 化合物が固定化 された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製す る手段は、 上記の 「1 . ( 2 ) ( b ) 予め化合物と接触させておいたタンパク質群 の中から、 化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複 数種のタンパク質を精製する工程」において用いられる手段と同一のものである。 手段 （b) において、 タンパク質群は、 同位体標識されていないものを用いるこ ともできるし、 手段 （a) の同位体標識されたタンパク質群とは異なる同位体で 標識されたタンパク質群を用いることもできる。
(c) 手段 （a) および手段 （b) で得られたタンパク質を混合する手段は、 上 記の 「1 . ( 3 ) (c) 工程 （a) および工程 （b) で得られたタンパク質を混合す る工程」 において用いられる手段と同一のものである。
(d) 手段 （c) で得られた混合物を質量分析処理する手段は、 上記の 「1 . ( 4 ) (d) 工程 （c) で得られた混合物を質量分析処理する工程」 において用いられる 手段と同一のものである。
(e)質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段 は、 上記の 「1 . ( 5 ) (e) 質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパ ク質を同定する工程」 において用いられる手段と同一のものである。
(f) 各タンパク質について、 手段 （a) で得られたタンパク質に由来するピー クと手段 （b) で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、 各 タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段は、上記の 「1 . ( 6 ) (f) 各タンパク質について、 工程 （a) で得られたタンパク質に由来するピークとェ 程 （b) で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、 各タンパ ク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程」 において用いられる手段と同 一のものである。
なお、前記システムは、同位体標識されたタンパク質群を化合物と接触させず、 同位体標識されていないタンパク質群を化合物と接触させてから精製工程を実行 する態様 （第一の態様、 図 1 ) について説明したが、 同位体標識されていないタ ンパク質群を化合物と接触させず、 同位体標識されたタンパク質群を化合物と接 触させてから精製工程を実行する態様 （図 2 ) でも、 システム内の各構成要素と なる装置を適宜入れかえて本発明に係るシステムが実施可能であることは、 当業 者には容易に理解できる。 なお、 この場合はピーク強度比の値は、 「標識ピークの 強度」 / 「非標識ピークの強度」 の式により求める。 また、 同位体標識されてい ないタンパク質群に代えて、異なる同位体で標識されたタンパク質群を用いても、 本発明のシステムを実施可能である。
以下に、 本発明の第一態様における複数種のタンパク質と化合物との構造親和 性相関を解析するシステムについて詳しく述べる。 なお、 手段 （b) のタンパク 質群は、 同位体標識されていないタンパク質を例として以下に説明する。
図 6は、 本発明のシステムの構成を示すブロック図である。 図 6において、 本 発明のシステムは、 制御ュ-ッ ト 601、 タンパク質精製ュニッ ト 602、 タンパク 質混合ュニット 603及び質量分析ュニット 604からなる。
制御ュニット 601は、本発明の方法を実行するために必要な各ュニットの動作 全体を制御する。 タンパク質精製ュュット 602、 タンパク質混合ュニット 603及 び質量分析ュニット 604は、制御ュニット 601にそれぞれ接続され、互いに独立 して、 又は各ュニットと連携して実行するように制御ュニット 601により制御さ れる。 例えば、 本発明の方法を主としてバッチ式で実行するときは、 各ユニット (タンパク質精製ュニット 602、 タンパク質混合ュニット 603及び質量分析ュニ ット 604) は制御ュニット 601から独立して制御され、 制御ュニット 601はそれ ぞれのユニットが実行する内容を指示する。 また、 本発明の方法を主として連続 的に流れ作業として実行するときは、 制御ュ-ット 601は、 それぞれのュニット の実行内容、 例えば各ユニッ トの進行状況を監視し、 各ユニットは連携して制御 される。
タンパク質精製ュニット 602は、タンパク質を精製するためのュニットであり、 細胞培養器、 細胞破碎器、 化合物との接触処理器、 クロマトグラフィー等を行う ための担体、 精製タンパク質の回収器などを備える。 精製ユニットに含まれる各 構成要素は、 制御ユニット 601の指令に従って、 独立して、 又は各構成要素と互 いに連携して制御される。
タンパク質混合ュ-ット 603は、タンパク質精製ュニット 602により精製され たタンパク質を混合するュニットである。 タンパク質混合ュニット 603は制御ュ ニット 601に接続されており、混合量、 混合比などの指令を制御ュニット 601か ら受けて混合処理する。 質量分析ュニット 604は、 上記混合されたタンパク質を質量分析にかけるュニ ットであり、混合タンパク質を測定用プレートにスポットするためのスポッター、 当該測定プレートを質量分析器にかけるためのトレー等を備える。 質量分析ュニ ット 604におけるこれらの構成要素は制御ュニット 601に接続されており、制御 ユニット 601の指令に従って質量分析処理を実行する。
図 7は、 上記各ユニットの一態様を示す模式図である。
図 7において、 タンパク質精製ュニット 602は、 培養装置 11a及び llb、 培養 液ポトル 12a及び 12b、 細胞破砕器 13a及び 13b、 化合物との接触器 14、 化合 物が固定された担体 15a及び 15b、 タンパク質精製用制御装置 16a及び 16b、 精 製タンパク質分取器 17a及び 17bを備える。
培養装置 11a及び libは、 細胞培養を行うための装置であり、 温度、 C02濃度 などを調節して細胞を所定時間培養する。 培養装置 11a及び libには、 それぞれ 培養液ボトル 12a及び 12bが接続されており、 それぞれチューブ la、 lbを介し て各培養装置に培養液を供給してもよい。 培養装置 11a及び libには、 それぞれ 攪拌羽根 2a、 2bを供えてもよい。 培養装置 11a及び libは、 浮遊細胞を培養す るための容器として例示してあるが、 これは本発明のシステムを説明するための 一態様であり、 限定されるものではない。 従って、 培養プレートに付着する細胞 を培養する場合は、 当業者は目的に応じた培養容器を選択することができる。 培 養装置 11a及び libは、 LAN100を経由して制御ュニット 601に接続される。 培養液ボトル 12a及び 12bは、細胞を培養するための培養液を貯蔵する容器で ある。 本発明の第一の態様では、 培養液ボトル 12aには、 タンパク質群を同位体 標識するためのアミノ酸などが混合される。 培養液ボトル 12a及び 12b は、 LAN100を介して制御ュニット 601に接続されていてもよい。
細胞破碎器 13a及び 13bは、培養された細胞を破砕してタンパク質群を得るた めの装置であり、 培養装置 lla、 lib力 ら細胞を回収して細胞を破砕し、 タンパ ク質群の懸濁液を得る工程を実行する。 細胞破砕器 13a及び 13b は、 LAN100 を介して制御ュニット 601に接続されていてもよレ、。
化合物との接触器 14 は、 タンパク質群と化合物とを接触させるための装置で ある。 図 7は、 同位体標識していないタンパク質群と化合物とを、 担体に適用す る前に予め接触させるため、 細胞破砕器 13bの次に配置されている態様 （本発明 の第一の態様） を示す。第一の態様の別の側面として、化合物との接触器 14は、 同位体標識したタンパク質群と化合物とを、 担体に適用する前に予め接触させる ため、 細胞破砕器 13aの次に配置し得ることは、 当業者であれば容易に理解でき る。 化合物との接触器 14は、 LAN100を介して制御ュニット 601に接続されて いてもよい。
化合物が固定化された担体 15a及び 15bは、タンパク質を精製するための力ラ ムであり、 内部に化合物が固定されている。
複数種のタンパク質と複数種の化合物との構造親和性相関を解析する場合には、 タンパク質群とそれぞれの化合物とを、 化合物との接触器 14 において接触させ ればよい。 この場合、 化合物との接触器 14 による接触処理前までは、 培養装置 lib 由来のサンプルは同じ処理が施された同一のものである。 そのため、 化合物 との接触器 14に導入するタンパク質群としては、化合物毎に異なる培養装置 lib およぴ細胞破碎器 13bを用いて採取されるタンパク質群であつてよい。あるいは、 一つの培養装置 libおよび細胞破砕器 13bを用い、そこから採取されるタンパク 質群を、 複数個 （例えば、 非固定化化合物の数） に分け、 化合物との接触器 14 に導入していてもよい。
タンパク質精製用制御装置 16a及び 16bは、制御ュニット 601からの指令に従 つて、 タンパク質をそれぞれ化合物が固定化された担体 15a、 15bに導入すると ともに、 担体を通過させて精製タンパク質分取器 17a、 17bに送る工程を実行す る。 タンパク質精製用制御装置 16a及び 16bは、 LAN100を介して制御ュニット 601に接続されていてもよい。
精製タンパク質分取器 17a及び 17bは、一方の精製工程で得られた精製タンパ ク質と、 他方の精製工程で得られた精製タンパク質とを一時貯蔵する。 タンパク 質の分量が多いときは、 同一種類のタンパク質 （同一細胞から精製されたタンパ ク質） を複数のボトルに分注しておくこともできる。
図 7では 1種類の培養精製工程を示しているが、 システムを複数並列させて複 数種類の培養精製工程を実行することができるようにし、 その結果、 複数種類の 異なる細胞由来のタンパク質を精製することもできる。 その場合は、 各精製タン ノ 質を区別して分取器に貯蔵する必要があるが、 本発明においては、 精製タン パク質分取器 17a及び 17bは、分取器ごとに別々のタンパク質を貯蔵する態様で あってもよく、 分取器内のボトルごとに、 それぞれ種類の異なるタンパク質を貯 蔵する態様であってもよい。
図 7では、精製タンパク質分取器 17a及び 17bが、 タンパク質精製用制御装置 16a及び 16bにより制御される態様を示しているが、 これに限定されるものでは なく、 独立して、 LAN100を介して制御ユニット 601に接続されていてもよい。 図 7において、 タンパク質混合ユニット 603は、 タンパク質精製ユニット 602 において精製された一方のタンパク質と他方のタンパク質とを混合するュニット である。タンパク質混合ュニット 603は、制御ュニット 601からの指令に従って、 精製タンパク質分取器 17a及び 17bに配列されたサンプルを選択して一定の割合 で混合する。 図 7は、 チューブ 18 に 1番のサンプル同士、 2番のサンプル同士 のように同じ番号のサンプルを混合する態様を示している。
質量分析ュニット 604は、 質量分析の対象となる 1つ又は複数種のタンパク質 試料を解析するュニットである。 質量分析ュニット 604は、制御ュニット 601の 指令に従って、 タンパク質混合ュニット 603により混合された試料を質量分析用 のプレート 19にスポットし、質量分析処理装置 20により質量分析処理を実行す る。 プレート 19を質量分析処理装置 20に移送するには、 コンピュータ制御の口 ボット型試料取扱装置を用いることもできる。
質量分析は、 LAN100を介して制御ュニット 601の指令に従って実行される。 質量分析処理は、質量分析処理装置 20に付属のコンピュータ 21を設置して実行 させることも可能である。
質量分析処理の情報は、 LAN100を介して制御ュニット 601に送信され、 タン パク質の同定プロファイル、 強度比プロファイル、 親和性の比プロファイルを得 るための処理に付される。
制御ュニット 601は、 本発明のシステムを実行させるための中央制御ュニット であり、 中央コンピュータ 30、 インターネット通信回線等を備える。
制御ユニット 601は、 タンパク質の同定を実行するとともに、 同位体標識ピー クと非標識ピークとの強度比及び親和性の比を決定し、制御ュニット 601内の表 示装置に表示する。 各データは、 制御ュニット 601により自動整理される。 図 8は、 制御ユニット 601の詳細構成図である。 図 8において、 中央コンビュ ータ 30は、 CPU801、 送信 Z受信部 802、 入力部 803、 出力部 804 ROM805 RAM806, ドディスクドライブ (HDD)807 CD-ROM ドライブ 808及びタン パク質データベース （以下 「DB」 という） 809を備える。
CPU801は、 本発明のシステム全体の動作を制御するとともに、 質量分析結果 のデータ、同定されたタンパク質デ一タ、強度比データ、親和性データ等を DB809 に記録する。 CPU801は、 送信 受信部 802の通信制御、 DB809に記憶されて いるデータを利用して、 インターネット 811を介して他のタンパク質のデータと 照合することもできる。
送信 Z受信部 802は、 CPU801の指令に従って、タンパク質精製ュ-ット 602 タンパク質混合ュニット 603、 質量分析ュニット 603との間でデータの送信及び 受信処理を行う。
入力部 803は、 キーボード、 マウス、 タツチパネル等であり、 ユーザからの情 報入力時、 データベースの内容更新時等に操作される。 出力部 804は LCD (液 晶ディスプレイ）等であり、各種データベースの更新時等に CPU801からのコー ドデータをその都度表示用データに変換して表示処理を行う。 ROM805は、本発 明のシステムの処理プログラムを格納する。 RAM806は、 本発明のシステムの処 理に必要なデータを一時的に格納する。 HDD807は、 質量分析データ等を格納す るためのドライブである。 CD-ROM ドライブ 808は、 CPU801からの指令に従 つて、 CD-ROM810に格納されている、 本発明のシステムの実行 （各種態様の実 行） に必要なプログラム等を読み出して RAM806等に書き込む。 CD-ROMの代 わりに記録媒体として書き換え可能な CD -R CD -RW等を用いることもできる。 その場合には、 CD-ROM ドライブ 808の代わりに CD-R又は CD-RW用ドライ ブを設ける。 また、 上記媒体の他に、 DVD MO、 フラッシュメモリーステイツ ク等の媒体を用い、 それに対応するドライブを備える構成としても良い。
中央コンピュータ 30は、タンパク質群の精製ュニット 602、混合ュニット 603、 質量分析ュ-ット 604と通信し、 これらのュニットが機能するように、 制御情報 を送信するとともに、 タンパク質の同定結果およびタンパク質の質量分析結果を 受信して同定結果、 強度比、 親和性比の同定結果を表示する。
以下、制御ュニットの動作 （第一の態様） を、 図面（図 9 ) を用いて説明する。 制御ュニット 601の中央コンピュータ 30は、 本発明の実施に必要な培養液、 試料 （細胞）、 その他の試薬を一方の培養装置 11a に充填するよう充填装置 （図 示せず） に命令するとともに、 タンパク質の標識に必要な同位体標識物質 （同位 体標識されたアミノ酸等） を添加するよう試薬充填装置 （図示せず） に命令し、 充填装置は充填を実行する（S901a)。これと並行して、中央コンピュータ 30は、 本発明の実施に必要な培養液、 試料 （細胞） その他の試薬を他方の培養装置 lib に充填するよう、 試薬充填装置 （図示せず） に命令し、 充填装置 （図示せず） は 充填を実行する （S901b)。 各培養装置 lla、 libへの培養液等の充填が完了する と、 中央コンピュータ 30は次に、 所定条件で培養するよう各培養装置 lla、 lib に命令し、各培養装置 lla、 libは培養を実行する （S902a、 S902b)。 「所定条件」 としては、 培養時間、 培養温度、 C02濃度、 攪拌の有無などが挙げられる。 所定 条件での培養が終了した後、 中央コンピュータ 30は、 細胞破碎工程を実施する よう、 細胞破砕装置 13a、 13 に命令し、 各細胞破砕装置 13a、 13 は細胞破砕 を実行する （S903a、 S903b)。 S903aにより同位体標識物質含有培地から採取さ れた細胞を破砕した後は、 次に、 中央コンピュータ 30 は所定の化合物が固定化 された担体 15aにタンパク質精製工程を実施するよう命令し、 当該担体はタンパ ク質の精製を実行する （S905a)。 他方、 S903bにより同位体を含有しない培地か ら採取された細胞を破砕した後は、 次に、 中央コンピュータ 30 は破砕物 （タン パク質群） と化合物との接触処理を行うよう、 化合物との接触器 14 に命令し、 当該接触器 14は接触を実行する （S904)。 化合物との接触処理後、 S905a と同 様に、 タンパク質の精製を実行する （S905b)。 タンパク質の精製が完了すると、 中央コンピュータ 30は、 後に実施する混合 （S907) に備えて、 タンパク質精製 用制御装置 16a及び 16bに、 タンパク質試料を精製タンパク質分取器 17a、 17b にて分取後、 一時保存するよう命令し、 当該制御装置は分取及び一時保存を実行 する （S906a、 S906b)。 その後、 中央コンピュータ 30は、 精製タンパク質混合 ユニット 603に、 分取された精製タンパク質を混合するよう命令し、 精製タンパ ク質混合ユニット 603は精製タンパク質を混合する （S907)。
混合が完了すると、 中央コンピュータ 30 は、 質量分析のための試料を調製す るよう命令する （S908)。 この質量分析用試料調製工程は、 培養用のウェルトレ ィで行っても、 別のウェルトレイで行ってもよい （S908)。 次に中央コンビユー タ 30 は、 スポッター （図示せず） が調製後の資料を質量分析用プレート （例え ば図 7のプレート 19) にスポットし、続いて質量分析装置が試料の質量分析を開 始するよう命令し、 スポッターはスポッ トを実行し、 質量分析装置はその分析を 実行する （S909)。
中央コンピュータ 30は、 タンパク質を同定するとともに （S910)、 各タンパク 質の標識ピークと非標識ピークとの強度比を求めて、 各タンパク質に対する化合 物の親和性の比を定量する （S911)。 タンパク質の同定結果、 強度比のデータは 中央コンピュータ 30に報告され、出力装置又はコンピュータのディスプレイは、 当該同定結果及び強度比を表示する （S912)。
中央コンピュータ 30は、 強度比および同定結果のデータを既存の情報と照会 するとともに、 ハードディスクに蓄積してデータベース化を実行する （S913)。
2 . 本発明の第二の態様
本発明の第二の態様は、 複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解 析する方法であって、
(a) タンパク質群の中から、 化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の 化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
(b) 予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、 化合物が固定化さ れた担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する 工程と、 (c) 工程 （a) で得られたタンパク質または工程 （b) で得られたタンパク質の 一方を同位体標識する工程と、
(d) 工程 （c) で得られた標識されたタンパク質と、 工程 （a) および工程 （b) で得られたタンパク質のうち工程（c) で標識されていない他方のタンパク質とを 混合する工程と、
(e) 工程 （d) で得られた混合物を質量分析処理する工程と、
(f)質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程と、
(g) 各タンパク質について、 工程 （a) で得られたタンパク質に由来するピーク と工程 （b) で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、 各タ ンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程と、
を含む、 前記方法を提供する。
以下、 本発明の第二の態様について、 詳細に記載する （図 3を参照）。
( 1 ) (a) タンパク質群の中から、 化合物が固定化された担体を用いて当該担 体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程
当該工程は、 上記 「1 . ( 1 ) (a) 同位体標識されたタンパク質群の中から、 化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタン パク質を精製する工程」 と同様の方法により、 担体に固定化した化合物に結合す る複数種のタンパク質を精製することができる。
工程 （a) で用いられるタンパク質群は、 同位体標識されていないタンパク質 群の他、 工程 （c) で用いる同位体と異なる同位体で標識されたタンパク質群を用 いることもできる。
( 2 ) (b) 予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、 化合物が固 定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精 製する工程
当該工程は、 上記 「1 . ( 2 ) (b) 予め化合物と接触させておいたタンパク質 群の中から、 化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する 複数種のタンパク質を精製する工程」 に準じる方法により、 担体に固定化した化 合物に結合する複数種のタンパク質を精製することができる。 工程 （b) で用いられるタンパク質群は、 同位体標識されていないタンパク質 群の他、 工程 （c) で用いる同位体と異なる同位体で標識されたタンパク質群を用 いることもできる。
( 3 ) (c) 工程 （a) で得られたタンパク質または工程 （b) で得られたタンパ ク質の一方を同位体標識する工程
工程 （a) で得られたタンパク質または工程 （b) で得られたタンパク質の一方 を同位体標識する。 いずれを同位体標識するかは、 特に限定されない。 工程 （c) で用いる同位体は、 放射性同位体を適用することもできるが、 放射性を有さない 安定同位体が、取り扱いが容易であることから、特に好ましレ、。安定同位体には、 以下に限定されるものではないが、 2H、 13C、 15N、 17〇、 180、 33p若しくは 34g 又はこれらの組み合わせが挙げられ、 好ましくは 2H、 13C、 i5N若しくは 180又 はこれらの組み合わせであり、 より好ましくは 13 C、 15N若しくは ISO又はこれ らの組み合わせであり、 さらに好ましくは i3Cである。 本発明に利用される同位 体は、 タンパク質を標識し得るものであれば、 その種類は特に限定されない。 以下、 具体的な同位体標識方法について記載する。
工程 （a) または工程 （b) で得られたタンパク質は、 in vitroにおいて同位体 標識することができる。 たとえば、 タンパク質中のシスティン残基を同位体標識 されたアルキル化試薬を用いてアルキル化することにより、 同位体標識すること ができる （「ラピッ ド · コミュケーションズ 'イン 'マス ' スぺク トルメ トリー (Rapid Communications in Mass Spectrometry) J 第 1 6卷、 第 1 5号、 2 0 0 2年、 pp.1416-1424参照）。 さらに、 タンパク質中のシスティン残基を同位体 標識されたビォチン化試薬を用いてピオチン化することにより、 同位体標識する こともできる。 これを、 さらに、 アビジンカラムを用いて、 標識されたタンパク 質のみを精製することが可能である （「ネイチヤー.バイオテクノロジー（Nature Biotechnology)」 第 1 7卷、 第 1 0号、 1 9 9 9年 1 0月、 pp.994'999)。
さらにまた、 タンパク質を消化して得られたペプチド断片の C末、 N末、 ダル タミン酸残基、 ァスパラギン酸残基などを同位体標識した分子で標識することが できる。 具体的には、 タンパク質を酵素で消化する際に、 緩衝液中に 180で標識 された水を加える。 消化酵素としては、 キモトリプシン、 トリプシン、 Asp-N、 Lys_C、 Glu-Cを用いることができる。 キモトリブシン、 Asp-Nを用いたときに は、 加水分解後のぺプチドの C末側に 180がーつ、 トリプシン、 Lys-C、 Glu C を用いたときには、加水分解後のぺプチドの C末のカルボン酸の酸素原子が二つ とも 180になることが知られている。
くわえて、 タンパク質を消化して得られたペプチド断片の C末、 グルタミン酸 残基、 ァスパラギン酸残基のカルボン酸をメチルエステルにする方法が知られて おり （Goodlett DR, Keller A, Watts JD, Newitt R, Yi EC, Purvine S, Eng JK, von Haller P, AeDersold , Roller E. Differential stable isotope labeling of peptides for quantitation and de nove sequence derivation. Rapid Commun mass Spectrom. 2001:15, pp.1214-1221参照）、 同位体標識されたメタノールを 用いてメチル化することにより、 同位体標識することも可能である。
また、タンパク質を消化して得られるペプチド 片の N末をニコチン酸誘導体 化する方法 （Munchbach M, Quadroni M， Miotto G, James P. Quantitation and facilitated de novo sequencing of proteins by isotropic N-terminal labeling of peptides with a fragmentation-directing moiety. Anal. Chem. 2000:72， pp.4047-4057参照） や、 ァセチル化する方法 （Ji. J. C akraborty A, Geng M, Zhang X， Amini A, Bina M, Regnier F. Strategy for quantitative and quantitative analysis in proteomics based on signature peptides. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 2000-745, pp.197-210参照） が知られている。 そのため、 これらの同位体標識された試薬を用いることにより、 同位体標識する こともできる。
( 4 ) (d) 工程 （c) で得られた標識されたタンパク質と、 工程 （a) およびェ 程 （b) で得られたタンパク質のうち工程 （c) で標識されていない他方のタンパ ク質とを混合する工程
当該工程は、 上記 「1 ( 3 ) (c) 工程 （a) および工程 （b) で得られたタンパ ク質を混合する工程」 に準じる方法により、 行うことができる。
( 5 ) (e) 工程 （d) 得られた混合物を質量分析処理する工程 当該工程は、 上記 「1 . ( 4 ) (d) 工程 （c) で得られた混合物を質量分析処理 する工程」 と同様の方法により、 行うことができる。
( 6 ) (f) 質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定す る工程
当該工程は、 上記 「1 . ( 5 ) (e) 質量分析の情報から複数種のタンパク質中の 各タンパク質を同定する工程」 と同様の方法により、 行うことができる。
( 7 ) (g) 各タンパク質について、 工程 （a) で得られたタンパク質に由来す るピークと工程 （b) で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求め て、 各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程
当該工程は、 上記 「1 . ( 6 ) (f) 各タンパク質について、 工程 （a) で得られ たタンパク質に由来するピークと工程 （b) で得られたタンパク質に由来するピ ークとの強度比を求めて、 各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する 工程」 と同様の方法により、 行うことができる。 ここで、 工程 （a) で得られた タンパク質および工程 （b) で得られたタンパク質の一方は、 工程 （c) で同位体 標識されており、 他方は同位体標識されていない。 なお、 この場合、 ピーク強度 比の値は、 「工程 （a) で得られたタンパク質に由来するピークの強度」 / 「工程 (b) で得られたタンパク質に由来するピークの強度」 の式により求められる。 このような方法を用いることによって、 簡便かつ効率的に、 複数種のタンパク 質と化合物との構造親和性相関を同時に解析することが可能となる。
本発明はさらに、 複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析する システムであって、
(a) タンパク質群の中から、 化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の 化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
(b) 予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、 化合物が固定化さ れた担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する 手段と、
(c) 手段 （a) で得られたタンパク質または手段 （b) で得られたタンパク質の 一方を同位体標識する手段と、 (d) 手段 （c) で得られた標識されたタンパク質と、 手段 （a) および手段 （b) で得られたタンパク質のうち手段（c) で標識されていない他方のタンパク質とを 混合する手段と、
(e) 手段 （d) で得られた混合物を質量分析処理する手段と、
(f)質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段と、 (g) 各タンパク質について、 手段 （a) で得られたタンパク質に由来するピーク と手段 （b) で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、 各タ ンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段と、
を含む、 前記システムを提供する。
(a) タンパク質群の中から、 化合物が固定化された担体を用いて当該担体上 の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段は、上記の「1 . ( 1 ) (a) 同位体標識されたタンパク質群の中から、 化合物が固定化された担体を用レ、て当 該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程」 において用い られる手段に準じるものである。 手段 （a) において、 タンパク質群は、 同位体 標識されていないものを用いることもできるし、 手段 （c) で用いる同位体とは異 なる同位体で標識されたタンパク質群を用いることもできる。
(b) 予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、 化合物が固定化 された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製す る手段は、 上記 「1 . ( 2 ) (b) 予め化合物と接触させておいたタンパク質群の 中から、 化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数 種のタンパク質を精製する工程」 において用いられる手段に準じるものである。 手段 （b) において、 タンパク質群は、 同位体標識されていないものを用いるこ ともできるし、 手段 （c) で用いる同位体とは異なる同位体で標識されたタンパク 質群を用いることもできる。
(c) 手段 （a) で得られたタンパク質または手段 （b) で得られたタンパク質 の一方を同位体標識する手段は、 上記 「2 . ( 3 ) (c) 工程 （a) で得られたタン パク質または工程 （b) で得られたタンパク質の一方を同位体標識する工程」 に おいて用いられる手段と同一のものである。 (d) 手段 （c) で得られた標識されたタンパク質と、 手段 （a) および手段 （b) で得られたタンパク質のうち手段（c) で標識されていない他方のタンパク質とを 混合する手段は、 上記 「1 . ( 3 ) (c) 工程 （a) および工程 （b) で得られたタ ンパク質を混合する工程」 において用いられる手段に準じるものである。
(e) 手段 （d) で得られた混合物を質量分析処理する手段は、 上記 「1 . ( 4 )
(d) 工程 （c) で得られた混合物を質量分析処理する工程」 において用いられる 手段に準じるものである。
(f)質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段 は、 上記 「1 . ( 5 ) (e) 質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク 質を同定する工程」 において用いられる手段に準じるものである。
(g) 各タンパク質について、 手段 （a) で得られたタンパク質に由来するピー クと手段 （b) で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、 各 タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段は、 上記 「1 . ( 6 ) (f) 各タンパク質について、 工程 （a) で得られたタンパク質に由来するピークとェ 程 （b) で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、 各タンパ ク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程」 において用いられる手段に準 じるものである。 なお、 この場合、 ピーク強度比の値は、 「手段 （a) で得られた タンパク質に由来するピークの強度」 「手段 （b) で得られたタンパク質に由 来するピークの強度」 の式により求められる。
本発明の第二の態様における複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関 を解析するシステムは、 第一の態様の当該システムについての説明 （図 6、 7 , 8および 9 ) に準じるが、 タンパク質精製ユニット 602における処理の順序、 構 成が一部異なる。 タンパク質精製ユニット 602は、 第一の態様で説明した装置の 他、 タンパク質分注装置や同位体標識制御装置などをさらに備えていても良い。 本発明の第二の態様では、 タンパク質への同位体標識処理手段の配置が第一の 態様と異なり、培養液ボトル 12aには同位体標識物質は原則として混合されない。 したがって、 培養装置 11a由来のサンプルは、 化合物との接触器 14による接触 処理前までは、 培養装置 lib由来のサンプルと同一のものである。 そのため、 化 合物との接触器 14に導入するタンパク質群としては、 異なる培養装置 11aおよ び libを用い、 その一方から採取されるタンパク質群であってもよい。 あるいは 一つの培養装置 （11aまたは libあるいは 11c (図 1 0 )) のみを用い、 そこから 採取されるタンパク質群を複数個（例えば、非固定化化合物の数十 1個）に分け、 その一部分を化合物に接触させても良い。
一つの培養装置から採取されるタンパク質群を複数個に分ける際の装置の模式 図を図 1 0に示す。 一つの培養装置 11cから採取されるタンパク質群は、 細胞破 砕器 13cにより細胞破碎される。 その後に、 中央コンピュータ 30は、 破砕後の サンプルを複数個に分け、 一部は化合物が固定化された担体 15aに導入し、 別の 部分は化合物との接触器 14c-l, 14 2， 14c-3 (図 1 0では化合物との接触器は 3 つ表示した） に導入するよう、 サンプル分注装置 31 に命令し、 サンプル分注装 置はサンプルを複数個に分け、各々を化合物が固定化された担体 15aまたは化合 物との接触器 14 c-1, 14c-2, 14c-3に導入する。
同位体標識の工程は、化合物が固定化された担体 15a及び 15bによりタンパク 質が精製された後に実行する。 中央コンピュータ 30は、 S905aおよび S905bに よりタンパク質の精製を実行した後は、 S905aにより精製されたタンパク質また は S905b により精製されたタンパク質のどちらかが同位体標識されるように同 位体標識制御装置 （図示せず） に命令し、 当該制御装置はタンパク質への同位体 標識を実行する。 中央コンピュータ 30 は、 標識後の精製を同位体標識制御装置 にさらに命令することもできる。 標識後のタンパク質は、 精製タンパク質分取器 17aおよび 17bにより分取され、 一時保存 （S906a、 S906b) される。
あるいは、 同位体標識の工程は、精製タンパク質分取器 17aおよび 17bにより 分取した後、 行うこともできる。 中央コンピュータ 30は、 S906a、 S906b によ り精製タンパク質の分取、 一時保存をした後、 S906a、 S906bにより保存された タンパク質のどちらかが同位体標識されるように同位体標識制御装置（図示せず） に命令し、 当該制御装置はタンパク質への同位体標識を実行する。
第二の態様では、タンパク質混合ュニット 603および質量分析ュニット 604は、 第一の態様と同様である。 3 . 本発明の第三の態様
本発明の第三の態様は、 複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解 析する方法であって、
(a) タンパク質群の中から、 化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の 化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
(b) 工程 （a) で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタ ンパク質群とを混合する工程と、
(c) 工程 （b) で得られた混合物を質量分析処理する工程と、
(d) 予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、 化合物を固定化さ れた担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する 工程と、
(e) 工程 （d) で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタ ンパク質群とを混合する工程と、
(f) 工程 （e) で得られた混合物を質量分析処理する工程と、
(g) 工程 （c) および工程 （f) で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク 質中の各タンパク質を同定する工程と、
(h) 各タンパク質について、 工程 （a) で得られたタンパク質に由来するピーク と内部標準物質であるタンパク質に由来するピークとの強度比および工程 （d) で得られたタンパク質に由来するピークと内部標準物質であるタンパク質に由来 するピークとの強度比を求めて、 当該強度比を比較することにより各タンパク質 に対する化合物の親和性の比を定量する工程と、
を含む、 前記方法を提供する。
以下、 本発明の第三の態様について、 詳細に記載する （図 4参照）。
( 1 ) (a) タンパク質群の中から、 化合物が固定化された担体を用いて当該担 体に結合する複数種のタンパク質を精製する工程
当該工程は、 上記 「1 . ( 1 ) (a) 同位体標識されたタンパク質群の中から、 化合物が固定化された担体を用いて、 当該担体上の化合物に結合する複数種のタ ンパク質を精製する工程」 と同様の方法により、 担体に固定化した化合物に結合 する複数種のタンパク質を精製することができる。
工程 （a) において、 当該タンパク質群は、 同位体標識されていないタンパク 質群を用いることができる。 また、 同位体標識されていないタンパク質群の代わ りに、 本発明の内部標準物質で用いられた同位体とは異なる同位体で標識された タンパク質群を用いることもできる。
( 2 ) (b) 工程 （a) で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識 されたタンパク質群とを混合する工程
工程 （a) で得られたタンパク質および内部標準物質である同位体標識された タンパク質群を、 一定の割合で混合する。 一定の割合は、 等量でもよく、 比率を 変えてもよい。 内部標準物質とは、 測定系において基準となる物質を意味し、 こ こでいう同位体標識されたタンパク質群が内部標準物質として機能する。 内部標 準物質は、 好ましくは、 工程 （a) で得られた複数種のタンパク質と同質の生体 試料に由来するものであるが、 異なる生体試料に由来するものであってもよい。 以下に、内部標準物質として機能しうる同位体標識されたタンパク質群（以下、 「本発明の内部標準物質」 と称する場合がある） の調製方法の一例について記載 する。
本発明の内部標準物質は、 代謝的に同位体標識することによって、 調製するこ とができる。 例えば、 培養可能な細胞を、 同位体標識されたアミノ酸を含む培地 で培養することによって、 細胞中のタンパク質を代謝的に同位体標識することが できる。 培養条件はどのようなものであってもよく、 液体培地あるいは固体培地 に該細胞を培養するのに好適な条件を選択すればよい。 例えば、 動物細胞を選択 した場合には、 DMEM、 MEM、 RPMI1640, IMDM等の培地を用い、 必要に応 じゥシ胎児血清 （FCS) 等の血清、 アミノ酸、 グルコース、 ペニシリン又はスト レプトマイシンなどを添加することができ、 pH約 6〜8、 30〜40°Cにおいて 15
〜200時間前後の培養を行うことができる。 その他、 必要に応じ途中で培地の交 換を行ったり、 通気及び攪拌を行ったりすることができる。
このようにして得られた代謝的に同位体標識されたタンパク質群を含む細胞を、 破砕することで、 本発明の内部標準物質を調製することができる。 破砕する方法 は、例えば、 ダウンス型テフロン ΤΜ ·ホモジナイザー、ポリ トロン、 ワーリング ' プレンダー、 ポッター型ガラス ·ホモジナイザー、 超音波破砕装置、 細胞溶解液
(例えば、 PIERCE社の M-PER: cat no. 78501, T'PER: cat no. 78510など） を 用いる方法又は凍結融解法などがあげられ、 好ましくは細胞溶解液を用いる方法 があげられる。 破砕した細胞は、 遠心分離操作により、 不溶性物質を除去するこ とが好ましい。このようにして、本発明の内部標準物質を調製することができる。 本発明で用いる同位体は、 放射性同位体を適用することもできるが、 放射性を 有さない安定同位体が、 取り扱いが容易であることから、 特に好ましい。 安定同 位体には、 以下に限定されるものではないが、 2H、 i3C、 15N、 170、 is〇、 33P若 しくは 34 S又はこれらの組み合わせが挙げられ、 好ましくは 2 H、 13C、 15N若し くは 180又はこれらの組み合わせであり、 より好ましくは i3C、 15N若しくは WO 又はこれらの組み合わせであり、 さらに好ましくは i3Cである。 本発明に利用さ れる同位体は、 タンパク質を標識し得るものであれば、 その種類は特に限定され なレ、。 具体的には、 同位体標識タンパク質の前駆体として、 標識 03C x 6個） ロイシン （Cambridge Isotope Labs(CIL)社製、 L'Leucine U-13C6， CLM-2262) を挙げることができる。
また、 本発明の内部標準物質は、 in vitroにおいても調製することができる。 たとえば、 タンパク質中のシスティン残基を同位体標識されたアルキル化試薬を 用いてアルキル化することにより、 同位体標識することができる （「ラビッド *コ ミュケーションズ ·ィン ·マス ·スぺク トルメ トリー （Rapid Communications in Mass Spectroscopy)」 第 1 6巻、 第 1 5号、 2 0 0 2年、 pp.1416-1424参照）。 さらに、 タンパク質中のシスティン残基を同位体標識されたピオチン化試薬を用 いてピオチン化することにより、同位体標識することもできる。これを、さらに、 アビジンカラムを用いて、 標識されたタンパク質のみを精製することが可能であ る （「ネイチヤー 'バイオテクノロジー （Nature Biotechnology)」 第 1 7巻、 第
1 0号、 1 9 9 9年 1 0月、 pp.994-999)。
さらにまた、 タンパク質を消化して得られたペプチド断片の C末、 N末、 ダル タミン酸残基、 ァスパラギン酸残基などを同位体標識した分子で標識することが できる。 具体的には、 タンパク質を酵素で消化する際に、 緩衝液中に WOで標識 された水を加える。 消化酵素としては、 キモトリプシン、 トリプシン、 Asp-N、 Lys-C、 Glu-Cを用いることができる。 キモトリブシン、 Asp-Nを用いたときに は、 加水分解後のぺプチドの C末側に ISOがーつ、 トリプシン、 Lys'C、 Glu-C を用いたときには、加水分解後のぺプチドの C末のカルボン酸の酸素原子が二つ とも 180になることが知られている。
くわえて、 タンパク質を消化して得られたペプチド断片の C末、 グルタミン酸 残基、 ァスパラギン酸残基のカルボン酸をメチルエステルにする方法が知られて おり （Goodlett DR, Keller A, Watts JD, Newitt R, Yi EC, Purvine S， Eng JK, von Haller P, Aebersold , Roller E. Differentia丄 stable isotope labeling of peptides for quantitation and de nove sequence derivation. Rapid Commun mass Spectrom. 2001:15, pp.1214'1221参照）、 同位体標識されたメタノールを 用いてメチル化することにより、 同位体標識することも可能である。
また、タンパク質を消化して得られるペプチド断片の N末をニコチン酸誘導体 ィ匕する方法 （Munchbach M, Quadroni M， Miotto G， James P. Quantitation and facilitated de novo sequencing of proteins by isotropic N-terminal labeling of peptides with a fragmentation-directing moiety. Anal. Chem. 2000:72， pp.4047-4057参照） や、 ァセチル化する方法 (Ji. J. Chakraborty A, Geng M, Zhang X， Amini A, Bina M, Reernier E Strategy for quantitative and quantitative analysis in proteomics based on signature peptides. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 2000:745， pp.197-210参照） が知られている。 そのため、 これらの同位体標識された試薬を用いることにより、 同位体標識する こともできる。
( 3 ) (c) 工程 （b) で得られた混合物を質量分析処理する工程
当該工程は、 上記 「1 . ( 4 ) (d) 工程 （c) で得られた混合物を質量分析処理 する工程」 と同様の方法により、 行うことができる。
( 4 ) (d) 予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、 化合物が固 定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精 製する工程
当該工程は、 上記 「1 . ( 2 ) (b) 予め化合物と接触させておいたタンパク質 群の中から、 化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する 複数種のタンパク質を精製する工程」 と同様の方法により、 担体に固定化した化 合物に結合する複数種のタンパク質を精製することができる。
工程 （d) においては、 当該タンパク質群は、 工程 （a) と同様に同位体標識さ れていないタンパク質群を用いることができる。 また、 同位体標識されていない タンパク質群の代わりに、 本発明の内部標準物質で用いられた同位体とは異なる 同位体で標識されたタンパク質群を用いることもできる。
( 5 ) (e) 工程 （d) で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識 されたタンパク質群とを混合する工程
工程 （d) で得られたタンパク質および内部標準物質である同位体標識された タンパク質群を、 一定の割合で混合する。 一定の割合は、 等量でもよく、 比率を 変えてもよい。 ここでいう同位体標識されたタンパク質群は、 内部標準物質とし て機能するため、 好ましくは、 工程 （d) で得られた複数種のタンパク質と同質 の生体試料に由来するものであるが、 異なる生体試料に由来するものであっても よレ、。 また、 内部標準物質として機能するため、 上記 「3 . ( 2 ) (b) 工程 （a) で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群とを 混合する工程」 と同一の本発明の内部標準物質を使用する。
( 6 ) (f) 工程 （e) で得られた混合物を質量分析処理する工程
当該工程は、 上記 「1 . ( 4 ) (d) 工程 （c) 得られた混合物を質量分析処理す る工程」 と同様の方法により、 行うことができる。
( 7 ) (g) 工程 （c) および工程 （f) で得られた質量分析の情報から複数種の タンパク質中の各タンパク質を同定する工程
当該工程は、 上記 「1 . ( 5 ) (e) 質量分析の情報から複数種のタンパク質中の 各タンパク質を同定する工程」 と同様の方法により、 行うことができる。
( 8 ) (h) 各タンパク質について、 工程 （a) で得られたタンパク質に由来す るピークと内部標準物質であるタンパク質に由来するピークとの強度比およびェ 程 （d) で得られたタンパク質に由来するピークと内部標準物質であるタンパク 質に由来するピークとの強度比を求めて、 当該強度比を比較することにより各タ ンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程
質量分析による測定の結果得られたデータを用いて、 各タンパク質について、 工程 （a) または工程 （d) で得られたタンパク質由来のピークと本発明の内部標 準物質由来の標識ピークのピーク強度比を求めて、 該ピーク強度比の値を比較す ることにより、 各タンパク質と化合物との親和性を定量することができる。
より具体的には、 例えば、 担体に固定化された化合物 Aおよび担体に固定化さ れていない非固定化化合物 Bと各タンパク質との親和性を解析する場合、 化合物 Bと接触させていないタンパク質群における各タンパク質のピークを本発明の内 部標準物質における該タンパク質の標識ピークで除することによって、 該タンパ ク質におけるピーク/標識ピーク （=ピーク強度比 A) を求める。 一方、 化合物 B と接触させたタンパク質群における各タンパク質のピークを本発明の内部標準物 質における該タンパク質の標識ピークで除することによって、 該タンパク質にお けるピーク/標識ピーク （二ピーク強度比 B ) を求める。 次に、 ピーク強度比 Bと ピーク強度比 Aとを比較することで、 化合物 Aおよび化合物 Bと各タンパク質と の親和性の比を定量することができる。 比較は、 例えば、 ピーク強度比 Bとピー ク強度比 Aとの比を算出して行うことができる。 そして、 求めた値を各タンパク 質に対する化合物 Bの親和性と化合物 Aの親和性との比として用いることができ る。
なお、 工程 （a) または工程 （d) で得られたタンパク質中では存在していて、 本発明の内部標準物質中では存在していないタンパク質が存在することがある。 この場合には、 質量分析計で測定した際に、 近傍の本発明の内部標準物質由来の ピーク、好ましくは LC/MSならクロマトグラフィ一での溶出時間が近いピーク、
MALDI-MS なら分子量が近いピークを対象としてピーク強度比を求めて、 該ピ ーク強度比を比較することによって定量することができる。 したがって、工程（a) または工程 （d) で得られたタンパク質中のすべてのタンパク質について、 タン ノ、 °ク質と化合物との親和性の比を測定することが可能である。
より具体的には、 担体に固定化された化合物 Aとタンパク質 Xとの親和性およ び担体に固定化されていない化合物 Bとタンパク質 Xとの親和性とを比較する場 合、 本発明の内部標準物質にタンパク質 Xが存在せず、 近傍にタンパク質 Y由来 のピークが存在することがある。 ここで、 近傍のピークとは、 本発明の内部標準 物質由来のピークで、かつ、 LC/MSならクロマトグラフィ一での溶出時間が近い ピーク、 MALDI-MS なら分子量が近いピークである。 この場合には、 非固定化 化合物 Bと接触させていないタンパク質群におけるタンパク質 Xのピークをタン パク質 Yに対応する本発明の内部標準物質の標識ピークで除することによって、 タンパク質 Xにおけるピーク/タンパク質 Yにおける標識ピーク （=ピーク強度比 C ) を求める。 一方、 化合物 Bと接触させたタンパク質群におけるタンパク質 X のピークをタンパク質 γに対応する本発明の内部標準物質の標識ピークで除する ことによって、 タンパク質 Xにおけるピーク/タンパク質 γにおける標識ピーク
(=ピーク強度比 D) を求める。 次に、 ピーク強度比 Cとピーク強度比 Dとを比 較することで、 化合物 Aとタンパク質 Xとの親和性および化合物 Bとタンパク質 Xとの親和性の比を定量することができる。 また、 近傍のタンパク質を複数選択 することによって、 測定の精度を上げることができる。
このような方法を用いることによって、 簡便かつ効率的に、 複数種のタンパク 質と化合物との構造親和性相関を同時に解析することが可能となる。
本発明はさらに、 複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析する システムであって、
(a) タンパク質群の中から、 化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の 化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
(b) 手段 （a) で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタ ンパク質群とを混合する手段と、
(c) 手段 （b) で得られた混合物を質量分析処理する手段と、
(d) 予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、 化合物が固定化さ れた担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する 手段と、
(e) 手段 （d) で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタ ンパク質群とを混合する手段と、
(f) 手段 （e) で得られた混合物を質量分析処理する手段と、
(g) 手段 （c) および手段 （f) で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク 質中の各タンパク質を同定する手段と、
(h) 各タンパク質について、 手段 （a) で得られたタンパク質に由来するピーク と内部標準物質であるタンパク質に由来するピークとの強度比および手段 （d) で得られたタンパク質に由来するピークと内部標準物質であるタンパク質に由来 するピークとの強度比を求めて、 当該強度比を比較することにより各タンパク質 に対する化合物の親和性の比を定量する手段と、
を含む、 前記システムを提供する。
(a) タンパク質群の中から、 化合物が固定化された担体を用いて当該担体上 の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段は、 上記 「1 . ( 1 ) (a) 同位体標識されたタンパク質群の中から、 化合物が固定化された担体を用いて、 当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程」 において用 いられる手段に準じるものである。 手段 （a) において、 タンパク質群は、 同位 体標識されていないものを用いることもできるし、 本発明の内部標準物質で用レ、 られた同位体とは異なる同位体で標識されたタンパク質群を用いることもできる。
(b) 手段 （a) で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識された タンパク質群とを混合する手段は、 上記 「3 . ( 2 ) (b) 工程 （a) で得られたタ ンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群とを混合するェ 程」 において用いられる手段と同一のものである。
(c) 手段 （b) で得られた混合物を質量分析処理する手段は、 上記 「1 . ( 4 ) (d) 工程 （c) で得られた混合物を質量分析処理する工程」 において用いられる 手段に準じるものである。
(d) 予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、 化合物が固定化 された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製す る手段は、 上記 「1 . ( 2 ) (b) 予め化合物と接触させておいたタンパク質群の 中から、 化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数 種のタンパク質を精製する工程」 において用いられる手段に準じるものである。 手段 （a) において、 タンパク質群は、 同位体標識されていないものを用いるこ ともできるし、 本発明の内部標準物質で用いられた同位体とは異なる同位体で標 識されたタンパク質群を用いることもできる。
(e) 手段 （d) で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識された タンパク質群とを混合する手段は、 上記 「3 . ( 5 ) (e) 工程 （d) で得られたタ ンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群とを混合するェ 程」 において用いられる手段と同一のものである。
(f) 手段 （e) で得られた混合物を質量分析処理する手段は、 上記 「1 . ( 4 ) (d) 工程 （c) で得られた混合物を質量分析処理する工程」 において用いられる 手段に準じるものである。
(g) 手段 （c) および手段 （f) で得られた質量分析の情報から複数種のタンパ ク質中の各タンパク質を同定する手段は、 上記 「1 . ( 5 ) (e) 質量分析の情報か ら複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程」 において用いられる手 段に準じるものである。
(h) 各タンパク質について、 手段 （a) で得られたタンパク質に由来するピー クと内部標準物質であるタンパク質に由来するピークとの強度比および手段 （d) で得られたタンパク質に由来するピークと内部標準物質であるタンパク質に由来 するピークとの強度比を求めて、 当該強度比を比較することにより各タンパク質 に対する化合物の親和性の比を定量する手段は、 上記 「3 . ( 8 ) (h) 各タンパ ク質について、 工程 （a) で得られたタンパク質に由来するピークと内部標準物 質であるタンパク質に由来するピークとの強度比および工程 （b) で得られたタ ンパク質に由来するピークと内部標準物質であるタンパク質に由来するピークと の強度比を求めて、 当該強度比を比較することにより各タンパク質に対する化合 物の親和性の比を定量する工程」 において用いられる手段と同一のものである。 以下に、 本発明の第三の態様における複数種のタンパク質と化合物との構造親 和性相関を解析するシステムについて述べる。 本システムは、 第一の態様の当該 システムについての説明 （図 6、 7 , 8および 9 ) に準じるが、 タンパク質精製 ュニット 602及びタンパク質混合ュニット 603における処理の順序、構成が一部 異なる。 タンパク質精製ユニット 602は、 第一の態様で説明した装置の他、 タン パク質分注装置をさらに備えていても良い。
本発明の第三の態様では、 タンパク質への同位体標識処理手段の配置が第一の 態様と異なり、培養液ボトル 12aには同位体標識物質は原則として混合されない。 したがって、 培養装置 11a由来のサンプルは、 化合物との接触器 14による接触 処理前までは、 培養装置 lib由来のサンプルと同一のものである。 そのため、 化 合物との接触器 14に導入するタンパク質としては、 異なる培養装置 11aおよび libを用い、 その一方から採取されるタンパク質群であってもよい。 あるいは一 つの培養装置 （11aまたは libあるいは 11c (図 1 0 )) のみを用い、 そこから採 取されるタンパク質群を複数個 （例えば、 非固定化化合物の数 + 1個） に分け、 その一部分を化合物に接触させても良レ、。
一つの培養装置から採取されるタンパク質群を複数個に分ける際の装置の模式 図を図 1 0に示す。 一つの培養装置 11cから採取されるタンパク質群は、 細胞破 碎器 13cにより細胞破砕される。 その後に、 中央コンピュータ 30は、 破砕後の サンプルを複数個に分け、 一部は化合物が固定化された担体 15aに導入し、 別の 部分は化合物との接触器 14c-l, 14c-2, 14 3 (図 1 0では化合物との接触器は 3 つ表示した） に導入するよう、 サンプル分注装置 31 に命令し、 サンプル分注装 置はサンプルを複数個に分け、 各々を化合物が固定化された担体 15aまたは化合 物との接触器 14c-l， 14c-2, 14c-3に導入する。
また、上記分取器 17a、 17bに分取されるタンパク質とは別に、培養装置 lla、 培養液ボトル、 12a、 細胞破砕器 13aにより、 細胞を所定の条件で培養し、 タン パク質群を得ておく。 ここで培養液ボトル 12aには、 タンパク質群を同位体標識 するためのアミノ酸が混合され、 内部標準物質である同位体標識されたタンパク 質群を得る。
制御ュニット 601の中央コンピュータ 30は、 内部標準物質である同位体標識 されたタンパク質群を得るのに必要な培養液、試料（細胞）、 その他の試薬を培養 装置 11aに充填するよう充填装置 （図示せず） に命令し、 充填装置 （図示せず） は充填を実行する。 培養装置 11aへの培養液等の充填が完了すると、 中央コンビ ュ一タ 30は次に所定条件で培養するよう培養装置 11aに命令し、 培養装置 11a は培養を実行する。 所定条件での培養が終了した後、 中央コンピュータ 30 は細 胞破砕工程を実施するよう、細胞破砕装置 13aに命令し、細胞破砕装置 13aは細 胞破砕を実行する。
第三の態様では、タンパク質混合ュニット 603は、タンパク質精製ュニット 602 により精製されたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタンパク質 群とを混合するユニットである。
中央コンピュータ 30は、 S906a、 S906bによる分取および一時保存の後、 タ ンパク質混合ュニット 603に、分取された精製タンパク質と内部標準物質である 同位体標識されたタンパク質群とを混合するよう命令し、 精製タンパク質混合ュ ニット 603は精製タンパク質を混合する （S907)。
4 . 本発明の第四の態様
本発明の第四の態様は、 複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解 析する方法であって、
(al) タンパク質群の中から、 化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の 化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
(a2) 工程 （al) で得られた精製物を質量分析処理する工程と、
(a3) 工程 （a2) で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タン パク質を同定する工程と、
(a4) 複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する工程と、
(bl) 予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、 化合物が固定化さ れた担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する 工程と、
(b2) 工程 （bl) で得られた精製物を質量分析処理する工程と、 (b3) 工程 （b2) で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タン パク質を同定する工程と、
(b4) 複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する工程と、
(c) 各タンパク質について、 工程 （al) で得られたタンパク質に由来するタン パク質量と工程 （bl) で得られたタンパク質に由来するタンパク質量との比を求 めて、 各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程と、
を含む、 前記方法を提供する。
以下、 本発明の第四の態様について、 詳細に記載する。
( 1 ) (al) タンパク質群の中から、 化合物が固定化された担体を用いて当該 担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程
当該工程は、 上記 「1 . ( 1 ) (a) 同位体標識されたタンパク質群の中から、 化合物が固定化された担体を用いて、 当該担体上の化合物に結合する複数種のタ ンパク質を精製する工程」 と同様の方法により、 担体に固定化した化合物に結合 する複数種のタンパク質を精製することができる。
工程 （al) において、 当該タンパク質群は、 同位体標識されていないタンパク 質群を用いることができる。 また、 同位体標識されていないタンパク質群の代わ りに、 同位体標識されたタンパク質群を用いることもできる。
( 2 ) (a2) 工程 （al) で得られた精製物を質量分析処理する工程
当該工程は、 上記 「1 . ( 4 ) (d) 工程 （c) で得られた混合物を質量分析処理 する工程」 と同様の方法により、 行うことができる。
( 3 ) (a3) 工程 （a2) で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中 の各タンパク質を同定する工程
当該工程は、 上記 「1 . ( 5 ) (e) 質量分析の情報から複数種のタンパク質中の 各タンパク質を同定する工程」 と同様の方法により、 行うことができる。
( 4 ) (a4) 複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する工程
当該工程において、 各タンパク質を定量する方法は、 特に限定されないが、 例 えば、 以下の方法により行うことができる。
工程 （a3) において、 同定された各タンパク質について、 検出されたペプチド 数 （N。bsd) および検出され得るペプチド数 （N。bsbi) を算出する。
「検出されたペプチド数 （N。bsd)」 は、 「4 . ( 2 ) (a2) 工程 （al) で得られた 精製物を質量分析処理する工程」 において、 実際に検出されたペプチド数を意味 する。 検出されたペプチド数 （N。bsd) は、 質量分析のデータおよび同定されたタ ンパク質の配列情報をもとに算出することができる。 検出されたペプチド数 (Nobsd) は、 質量分析のデータをもとに算出する場合、 各タンパク質について質 量分析で検出されたピークの数と一致する。
また、 「検出され得るペプチド数 （N。bsbl)」 は、 「4 . ( 2 ) (a2) 工程 （al) で 得られた精製物を質量分析処理する工程」 において、 理論上検出され得るぺプチ ド数を意味する。 検出され得るペプチド数 （N。bsbi) は、 同定されたタンパク質の 配列情報をもとに算出することができる。 各タンパク質について、 上記工程にお ける分離、消化又は HPLCによる分離操作によつて理論的に生じるぺプチド数を 配列情報をもとに算出し、 質量分析で検出され得るペプチド数 （N。bsbl) を求める ことができる。 例えば、 トリプシンによる消化操作を行った精製物を質量分析す る場合は、 トリプシンによりリシン、 アルギニンのカルボキシル側でペプチド鎖 が切断されるため、 各タンパク質の配列情報から切断により生じるぺプチド数が 予測できる。 場合によっては、 質量分析器の測定範囲も考慮して、 検出され得る ペプチド数 （Nobsbl) を求めることができる。 次に、上記の検出され得るぺプチド数（N。bsbl) と検出されたぺプチド数（N。bsd) とを用いて各タンパク質を定量するために、以下の式（I) にしたがって、 EMPAI (.exponentially modined protein abundance index) を設定し、 算出する。 式 （I) ：
EMPA.I = lONobsd/Nobsbl. l
EMPAIは、 タンパク質混合物中のタンパク質含有量に比例する指数である。 さらに、 以下の式 （II) にしたがって、 タンパク質含有率 （mol%) を算出す ることができる。
式 (II) ： タンパク質含有率 （mol%) = ΕΜΡΛΙ χ ΐοθ
Υ(ΕΜΡΑΙ) ここで、 ∑ (ΕΜΡΑΙ) は、 すべての同定されたタンパク質の ΕΜΡΑΙの和を表 す。
また、 以下の式 （III) にしたがって、 タンパク質含有率 （重量％) を算出する ことができる。
式 （III) ： タンパク質含有率 重量％ = ^ Y lOO
(EMPAI X MW) ここで、 MWは、同定された各タンパク質の分子量を表す。 ∑ (EMPAI XMW) は、 すべての同定されたタンパク質の EMPAI XMWの和を表す。
各タンパク質の分子量は、 アミノ酸配列から算出することができる。 また、 ェ 程 （al) で得られたタンパク質の総重量は、 既存の方法、 例えば、 Lowry 法、 Bradford 法、 280 nmの吸光度測定などの方法によつて容易に測定することがで きる。 そうすると、 工程 (al)で得られたタンパク質の総重量および上記で求めた タンパク質含有率から、 各タンパク質を定量することができる。
よって、 上記方法により、 各タンパク質を定量することができる。
各タンパク質を定量する工程は、 コンピュータを用いてもよレ、。
( 5 ) (bl) 予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、 化合物が 固定ィヒされた担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を 精製する工程
当該工程は、 上記 「1 . ( 2 ) (b) 予め化合物と接触させたタンパク質群の中 力 、 化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種 のタンパク質を精製する工程」 と同様の方法により、 担体に固定化した化合物に 結合する複数種のタンパク質を精製することができる。 工程 （bl) において、 当 該タンパク質群は、同位体標識されていないタンパク質群を用いることができる。 また、 同位体標識されていないタンパク質群の代わりに、 同位体標識されたタン パク質群を用いることもできる。 ( 6 ) (b2) 工程 （bl) で得られた精製物を質量分析処理する工程
当該工程は、 上記 「1 . ( 4 ) (d) 工程 （c) で得られた混合物を質量分析処理 する工程」 と同様の方法により、 行うことができる。
( 7 ) (b3) 工程 （b2) で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中 の各タンパク質を同定する工程
当該工程は、 上記 「1 . ( 5 ) (e) 質量分析の情報から複数種のタンパク質中の 各タンパク質を同定する工程」 と同様の方法により、 行うことができる。
( 8 ) (b4) 複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する工程
当該工程は、 上記 「4 . ( 4 ) (a4) 複数種のタンパク質中の各タンパク質を定 量する工程」 と同様の方法により、 行うことができる。
( 9 ) (c) 各タンパク質について、 工程 （al) で得られたタンパク質に由来す るタンパク質量と工程 （bl) で得られたタンパク質に由来するタンパク質量との 比を求めて、 各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程
当該工程は、 工程 （a4) で得られたタンパク質に由来するタンパク質量および 工程 （b4) で得られたタンパク質に由来するタンパク質量の比を求めることによ り、 各タンパク質と化合物との親和性を定量することができる。
本発明の第四の態様における方法は、 各タンパク質について同位体標識する必 要がないことに特徴を有する。
本発明はさらに、 複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析する システムであって、
(al) タンパク質群の中から、 化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の 化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
(a2) 手段 （al) で得られた精製物を質量分析処理する手段と、
(a3) 手段 （a2) で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タン パク質を同定する手段と、
(a4) 複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する手段と、
(bl) 予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、 化合物が固定化さ れた担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する 手段と、
(b2) 手段 （bl) で得られた精製物を質量分析処理する手段と、
(b3) 手段 （b2) で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タン パク質を同定する手段と、
(b4) 複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する手段と、
(c) 各タンパク質について、 手段 （al) で得られたタンパク質に由来するタン パク質量と手段 （bl) で得られたタンパク質に由来するタンパク質量との比を求 めて、 各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段と、
を含む、 前記システムを提供する。
(al) タンパク質群の中から、 化合物が固定化された担体を用いて当該担体上 の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段は、上記の「1 . ( 1 ) (a) 同位体標識されたタンパク質群の中から、 化合物が固定化された担体を用いて、 当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程」 において用 いられる手段に準じるものである。 手段 （al) において、 当該タンパク質群は、 同位体標識されていないタンパク質群を用いることができる。 また、 同位体標識 されていないタンパク質群の代わりに、 同位体標識されたタンパク質群を用いる こともできる。
(a2) 手段 （al) で得られた精製物を質量分析処理する手段は、 上記「1 . ( 4 )
(d) 工程 （c) で得られた混合物を質量分析処理する工程」 において用いられる 手段に準じるものである。
(a3) 手段 （a2) で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タ ンパク質を同定する手段は、 上記 「1 . ( 5 ) (e) 質量分析の情報から複数種のタ ンパク質中の各タンパク質を同定する工程」 において用いられる手段に準じるも のである。
(a4)複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する手段は、上記「4 . ( 4 )
(a4) 複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する工程」 において用いられ る手段と同一のものである。
(bl) 予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、 化合物が固定化 された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製す る手段は、 上記 「1 . ( 2 ) (b) 予め化合物と接触させたタンパク質群の中から、 化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタン パク質を精製する工程」 において用いられる手段に準じるものである。手段（bl) において、 当該タンパク質群は、 同位体標識されていないタンパク質群を用いる ことができる。 また、 同位体標識されていないタンパク質群の代わりに、 同位体 標識されたタンパク質群を用いることもできる。
(b2) 手段 （bl) で得られた精製物を質量分析処理する手段は、 上記「1 . ( 4 ) (d) 工程 （c) で得られた混合物を質量分析処理する工程」 において用いられる 手段に準じるものである。
(b3) 手段 （b2) で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タ ンパク質を同定する手段は、 上記 「1 . ( 5 ) (e) 質量分析の情報から複数種のタ ンパク質中の各タンパク質を同定する工程」 において用いられる手段に準じるも のである。
(b4)複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する手段は、上記「4 . ( 4 )
(a4) 複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する工程」 において用いられ る手段と同一のものである。
(c) 各タンパク質について、 手段 （al) で得られたタンパク質に由来するタ ンパク質量と手段 （bl) で得られたタンパク質に由来するタンパク質量との比を 求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段は、上記「4 .
( 9 ) (c) 各タンパク質について、 工程 （al) で得られたタンパク質に由来する タンパク質量と工程 （bl) で得られたタンパク質に由来するタンパク質量との比 を求めて、 各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程」 で用いら れる手段と同一のものである。
以下に、 本発明の第四の態様における複数種のタンパク質と化合物との構造親 和性相関を解析するシステムについて述べる。 本システムは、 第一の態様の当該 システムについての説明 （図 6、 7， 8および 9 ) に準じるが、 タンパク質混合 ユニット 603は省略され、 タンパク質精製ュニット 602における処理の順序、構 成が一部異なる。
本発明の第四の態様では、 タンパク質への同位体標識処理手段の配置が第一の 態様と異なり、培養液ボトル 12aには同位体標識物質は原則として混合されない。 したがって、 培養装置 11a由来のサンプルは、 化合物との接触器 14による接触 処理前までは、 培養装置 lib由来のサンプルと同一のものである。 そのため、 化 合物との接触器 14に導入するタンパク質としては、 異なる培養装置 11aおよび libを用い、 その一方から採取されるタンパク質群であってもよい。 あるいは一 つの培養装置 （11aまたは libあるいは 11c (図 1 0 )) のみを用い、 そこから採 取されるタンパク質群を複数個 （例えば、 非固定化化合物の数 + 1個） に分け、 その一部分を化合物に接触させても良い。
一つの培養装置から採取されるタンパク質群を複数個に分ける際の装置の模式 図を図 1 0に示す。 一つの培養装置 11cから採取されるタンパク質群は、 細胞破 砕器 13cにより細胞破砕される。 その後に、 中央コンピュータ 30は、 破砕後の サンプルを複数個に分け、 一部は化合物が固定化された担体 15aに導入し、 別の 部分は化合物との接触器 14 1， 14c-2, 14 3 (図 1 0では化合物との接触器は 3 つ表示した） に導入するよう、 サンプル分注装置 31 に命令し、 サンプル分注装 置はサンプルを複数個に分け、 各々を化合物が固定化された担体 15aまたは化合 物との接触器 14 c-l, 14 2, 14 3に導入する。
第四の態様では、 タンパク質混合ュニット 603は存在せず、 質量分析ュニット は、 制御ュニット 601からの指示に従って、 精製タンパク質分取器 17a及び 17b に配列されたそれぞれのサンプルについて、 質量分析用の試料を調製し (S908)、 質量分析 (S909)する。 中央コンピュータ 30は、 17a由来のタンパク質および 17b 由来のタンパク質をそれぞれ同定するとともに (S910)、 質量分析時のデータ、 タ ンパク質同定によるアミノ酸配列情報などに基づいて、 複数種のタンパク質中の 各タンパク質を定量する。 そして、 各タンパク質について、 17a由来のタンパク 質量と 17b由来のタンパク質量との比を求めて、 各タンパク質に対する化合物の 親和性の比を定量する。 実施例
以下に、 具体的な例をもって本発明を示すが、 本発明はこれに限られるもので はない。
( 1 ) 化合物を固定したァフィ二ティ一クロマトグラフィーカラムの作製 次式 1 ：
Figure imgf000074_0001
で表される化合物 （1 ) を特開平 7-165708に記載の方法で製造した。 次に、 式 1で表される化合物 （1 ) 約 52 mgをテトラヒドロフラン （THF) 4 mL、 メタ ノール （MeOH) 4 mLに溶かし、 さらに水 （Water) 4 mLを加えた。
この液 6 mLを THF/MeOH/Water=l/l/l(v/v/v)18 mLで希釈し、 あらかじめ THF/MeOHAVater=l/l/l(v/v/v)で洗浄しておいたァフィゲル 10 (バイオラド社 製、 カタログ番号 153-6099) 25 mLに加えた。
そこに、 100 Lのトリェチルァミン（東京化成工業社製、カタ口グ番号 T0424) を加え、 室温にてー晚インキュベーションした。 翌朝、 100 /z Lの 2-アミノエタ ノール （東京化成工業社製、 カタ口グ番号 A0297) を加え、 室温にて 3時間ィン キュベーシヨンした。 そして、 このゲルを THF/MeOH/Water=l/l/l(v/v/v)で十分 洗浄し、 メタノール液に置換後 4°Cにて保存し、 これをアブイ二ティーゲルとし た。 なお、 この反応で式 1からなる化合物 （1 ) 1 ゲル I mLあたり約 l mg 結合した。 作製したァフィ二ティーゲルをカラムに充填して、 ァフィ-ティーク 口マトグラフィーカラムとした。
( 2 ) 細胞の調製
ヒ ト結腸腺癌細胞株 HCT116 (ATCC)を培養した。 培地には、 10%牛胎児血清 (MOREGATE社、 BATCH 32300102)、 100 U/ml ペニシリン G、 100 g/ml ストレプトマイシン （GIBCO社、 15140-122) を含む RPMI-1640 (Sigma社、 R - 7130) を用いた。 RPMI-1640としては、 レグルタミン、 L-リジン、 レメチォ ニン、 L-ロイシン、 炭酸水素ナトリウムを含まない粉末培地を選択し、 当該培地 に欠損した成分を加えて調製 （L-グルタミン （Sigma社製、 G-8540) , L-リジン (Sigma社製、 L-9037)、 L-メチォニン （Sigma社製、 Μ·5308)、 炭酸水素ナト リウム （和光純薬、 191-01305) をそれぞれ 0.3g/L、 0.04g/L、 0.015g/L、 2 g/L を加え、 さらに、 天然型の L-ロイシンまたは安定同位体 i3C(6個)で標識された L-ロイシン （Cambridge Isotope Laboratories社、 CLM-2262) を 0.05 g/L加え た） した。 このようにして調製した培地を用いて、 5% C02下 37°Cで培養した。 この培養によつて得られた細胞を、 それぞれ天然型培地で培養した細胞、 または 安定同位体培地で培養した細胞として以下の実験に用いた。
( 3 ) タンパク質の抽出
安定同位体培地で培養した細胞を 15センチ皿 50枚分、天然型培地で培養した 細胞を 15センチ皿 20枚分、 それぞれ用意し、 細胞を集めた。 15センチ皿 1枚 あたり約 1.2 1111の：\1 £1 (PIERCE社、 78501) で可溶化し、 遠心分離により 不溶性画分を除去して可溶性画分を調製した。 こうして得られた可溶性画分を、 それぞれ代謝的に安定同位体で標識されていないタンパク質抽出液、 代謝的に安 定同位体で標識されたタンパク質抽出液とした。
( 4 ) 化合物の調製
式 2から式 6で表された化合物 （2 ) から化合物 （6 ) を特開平 7-165708に 記載の方法で製造した。 次に、 式 2から式 6で表された化合物について、 式 2か らなる化合物 （2 ) を約 20 mg、 式 3からなる化合物 （3 ) を約 13 mg、 式 4か らなる化合物 （4 ) を約 12 mg、 式 5からなる化合物 （5 ) を約 9 mg、 式 6か らなる化合物 （6 ) を約 14 mg秤量し、 DMSOを加えて溶かし、 それぞれの化 合物について濃度
Figure imgf000075_0001
にした。これらの化合物は、細胞増殖阻害活性が、 化合物 （2 ) >化合物 （4 ) 〉化合物 5 >化合物 3 >化合物 6であることが知ら れている （Y. Oda, T. Owa, Τ· Sato, B. Boucher, S. Daniels, H. Yamanaka, Y. Shinohara, A. Yokoi, J. Kuromitsu, and T. Nagasu, Anal. Chem., 75, 2159 (2003) . )。
式 2 ：
Figure imgf000076_0001
Figure imgf000076_0002
Figure imgf000076_0003
Figure imgf000076_0004
式 6 ：
Figure imgf000076_0005
(5) 化合物を固定したァフィ二ティークロマトグラフィーカラムにおける結合 タンパク質群の精製
まず、 代謝的に安定同位体で標識されたタンパク質抽出液 10 mlに PBS 20 ml を加えた。 これに、 調製した式 2から式 6で表された化合物 （2) 〜 （6) 溶液
(実施例 （4)) 300wLを加えて、 4°Cにて 3時間インキュベーションを行い、 これを化合物と混合したタンパク質抽出液とした。
次に、 アブイ二ティ一ゲル約 1 mlをオープンカラムとし、 上から化合物と混 合したタンパク質抽出液を加えて自然落下させた。 続いて、 0.5 M NaCl、 0.01% CHAPSを含む PBS 15 mlをこのカラムに流した。そして、 5 mM NADH、 0.01% CHAPSを含む PBS 6 mlを流した。 次に、 5 mM ATP, 0.01% CHAPSを含む PBSを 6 ml流した。 この後に、 6 M塩酸グァニディンおよび 2% CHAPSを含 む液 6 mlを流して溶出画分を集めて、 化合物と混合したタンパク質精製液とし た。
この操作と並行して、 代謝的に安定同位体で標識されていないタンパク質抽出 液20 1^に？8840 1111を加ぇ、 30 mlずつ 2つに分けた。 ァフィ二ティーゲル約 l mlをオープンカラムとして 2本用意し、 2つに分けた抽出液をそれぞれ上から 加えて自然落下させた。 続いて、 0.5 M NaCl、 0.01% CHAPSを含む PBS 15 ml をこのカラムに流した。 そして、 5 mM NADH、 0.01% CHAPSを含む PBS 6 ml を流した。 次に、 5 mM ATP、 0.01% CHAPSを含む PBSを 6 ml流した。 この 後に、 6 M塩酸グァニディンおよび 2% CHAPSを含む液 6 mlを流して溶出画分 を集めて、 化合物と混合していないタンパク質精製液とした。
そして、 化合物と混合したタンパク質精製液 3に対して、 化合物と混合してい ないタンパク質精製液を 1の割合で混合した。 この混合液を Amicon Ultra- 15 10,000MWCO (ミリポア、 カタログ番号 UFC901096)で濃縮し、 50 mMの炭酸 水素アンモニア水で洗浄を繰り返した後、 SDS-PAGE (ディー .アール .シー株 式会社、 5-20% Tゲル、 l mm、 7 well, 4 cm, 200V) で分離し、 泳動レーンを 12等分してゲル内トリプシン消化を行い、消化されたタンパク質溶液とした（H. Katayama, K. Sato , M. Takeuchi, M. Deguchi-Tawarada, Y. Oda and T. Nagasu, Rapid Commun. Mass Spectrom. 17, 1071-1078(2003).)。
( 6 ) LC/MSによる測定
消化されたタンパク質溶液を、 0.1%トリフルォロ酢酸を含む 5%ァセトニトリ ノレに溶かし、測定対象のタンパク質溶液とした。 MSとしては LCQ-Duo(Thermo
Electron社製)で測定を行つた。 LC/MSの LCとしては自家製の ODSカラム （Y. Ishihama, J. Rappsilber, J.S. Andersen, M. Mann, J. Chromatogr A. 979, 233-239(2002).) 内径 0.2mm、 長さ約 15センチに移動相として 0.5%酢酸を含 み、最初の 1分間でァセトニトリル濃度 4%として、その後 35分間でァセトニト リル濃度を 20%まで直線的に增加させて、その後 0.1分間でァセトニトリル濃度 を 80%にして 5分間維持し、 その後ァセトニトリル濃度を 0%として 12分後に 次のサンプルを注入した。
ポンプには島津製作所の LC- 10Aシリーズの ROMをミクロ対応として、また、 ミキシングチャンバ一としては付属の島津製作所製を外してパルコ社の Tコネク ターを採用した。
流速としては Flow-splitting方式を採用し、カラムには約毎分 1— 2 // Lの流速 となるように調製した。 測定対象のタンパク質溶液を CTC社のオートサンブラ 一 PALによって 注入した。 カラムの出口から溶出物を直接スプレーして 得られたイオンを LCQ 内に送り込むことで測定を行った。 スプレー電圧として は 2.5kVを印加した。 測定は、 Data Dependentモードで Dynamic Exclusion の Repeatを 1とした。 なお、 スキャン回数を稼ぐために Zoom Scanモードを外 したいわゆるダブルプレーモードで測定した。
( 7 ) データ解析
得られたデータについては、 SonarMSMS (Genomic solution 社） および
NCBInrデータべ一ス用いてタンパク質の自動同定を行った。 このとき、 安定同 位体で標識したロイシン （ロイシン 1つにつき分子量 6の増加） でも NCBInrに 対して検索できるように、 プログラムの一部を改変した。
定量は、 ロイシンを含むペプチドのピークで行うため、 SonarMSMSにより同 定されたペプチドのうち、 ロイシンを含むペプチドのみを選び出し、 かつ、 その ぺプチドピークの溶出位置 （HPLCでの保持時間 == MSでのスキャン番号） を特 定するために LCQ Duoの付属ソフトである LCQ_dta.exeファイルからスキャン 情報を自動で選び出すソフトウェアを構築した。 そして、 そのスキャン番号の情 報から、 そのスキャン番号の MSスペク トルを抜き出し、 天然型ロイシンべプチ ドのピークと同位体ペプチドのピークについて、 MS/MS を測定した際の親ィォ ンの情報 (m (質量数） /z (電荷）値)とそのぺプチド内に何個のロイシンがあるか、 そして、電荷は何個かを SonarMSMSでの検索結果から求めて、ペアとなるピー クを探し、 そのピーク強度比を自動計算した。 このように構築した解析ソフトゥ エアを用いてタンパク質の同定およびピーク強度比の算出を行った。
得られた結果の一例について図 5に示した。 図 5は、 複数種のタンパク質と化 合物 2 (化 2 )〜化合物 6 (化 6 )で表される化合物との構造親和性相関を表す。 数字が小さいほど化合物に対して親和性が強いことを意味している。
この図 5から、 例えば、 以下のような情報を得ることができる。
( 1 ) 図を縦方向に見て、 例えば、 化合物 （3 ) (化 3 ) に最も親和性の強いタン ノ ク質は、 glutathione-S-transferase omega 1で、 次に親和性の強いタンパク質 は、 heme binding protein 1であるというように親和性の強さについての序列が わかるので、 化合物 （3 ) 力 標的タンパク質以外にどのようなタンパク質に対 して親和性が高いのかについての情報を得ることができる （図 5 )。
( 2 ) 図を横方向に見て、 あるタンパク質、 例えば、 glutathione-S-transferase omega 1に着目して、 そのタンパク質を標的にした化合物合成展開をしょうとし たときに、 化合物 （4 ) (ィ匕 4 ) なら化合物 （3 ) に比べて親和性が強くなり、 化 合物 （6 ) (化 6 ) なら弱くなるという情報を得ることができる （図 5 )。
したがって、 本発明の方法は、 化合物の構造を変えることによって、 いかなる タンパク質との親和性に影響を与えるのかを網羅的に解析することができるため、 化合物、 特に薬剤を合成する上で、 主作用を増強しつつ、 副作用を軽減するよう な有益な情報を得ることができる。
( 3 ) さらに、 図全体を見て、 縦方向に見ても、 横方向に見ても、 1点だけ親和 性が強いところがあれば、 その化合物とタンパク質の組み合わせは特異性が高い という情報を得ることができる。 そして、 その化合物の標的タンパク質であると もいえるであろう。 産業上の利用の可能性
本発明により、 簡便かつ効率的に、 複数種のタンパク質と化合物との構造親和 性相関を同時に解析することが可能となった。
また、 本発明により、 化合物を固定化したァフィ二ティークロマトグラフィー カラムを複数種用意する必要がなくなり、 簡便かつ効率的に複数種の化合物に基 づく構造親和性相関の情報を得ることができるようになった。 また、 一種類の化 合物を固定化するだけで、 他の化合物は固定化せずに使用するため、 各化合物本 来の構造でタンパク質に対する親和性を評価することで、 より正確な構造親和性 相関の情報を得ることが可能となった。
また、 本発明により、 化合物の構造を変えることによって、 いかなるタンパク 質との親和性に影響を与えるのかを網羅的に解析することが可能となり、化合物、 特に薬剤を合成する上で、 主作用を増強しつつ、 副作用を軽減するような有益な 情報を得ることが可能となった。 例えば、 本発明により NADまたは NADPを固 定化した担体を用いて構造親和性相関の情報を得ることにより、 化合物の構造を 変えることによって、いかなる dehydrogenaseとの親和性に影響を与えるのかを 網羅的に解析することが可能となり、 dehydrogenase阻害剤のスクリー-ングを する上で、 特異性、 選択性などに関する有益な情報を得ることが可能となった。 また、 例えば、 本発明により ATPまたは GTPを固定化した担体を用いて構造親 和性相関の情報を得ることにより、 化合物の構造を変えることによって、 いかな る kinase、 ATP-ase、 GTP'aseなどとの親和性に影響を与えるのかを網羅的に解 析することが可能となり、これらの阻害剤のスクリーニングをする上で、特異性、 選択性などに関する有益な情報を得ることが可能となった。
さらに、 化合物が固定化された担体 （例えば、 ァフィ二ティーク口マトグラフ ィーカラム） に結合した化合物の濃度は、 一般的にゲル l mlあたり 0.1 mgから 数 mg程度であり、 これは I mM前後に相当する。 しかし、 細胞に対して何らか の活性を有する化合物は、 数 Mから数 nM、 ときには数 pM程度で活性を示す ことが知られている。 したがって、 化合物が固定化された担体 （例えば、 ァフィ 二ティークロマトグラフィーカラム） に固定化された化合物濃度と大きな乖離が ある。 本発明においては、 担体に固定化していない化合物を用いるため、 化合物 濃度を数 Mから数 nMに減らし、 より生体における化合物に近レ、状態にするこ とも可能となった

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析する方法であって、
(a) 同位体標識されたタンパク質群の中から、 化合物が固定化された担体を用 いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
(b) 予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、 化合物が固定化さ れた担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製 する工程と、
(c) 工程 （a) および工程 （b) で得られたタンパク質を混合する工程と、 (d) 工程 （c) で得られた混合物を質量分析処理する工程と、
(e)質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程と、
(f) 各タンパク質について、 工程 （a) で得られたタンパク質に由来するピーク と工程 （b) で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、 各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程と、
を含む、 前記方法。
2 . 複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析する方法であって、
(a) タンパク質群の中から、 化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の 化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
(b) 予め化合物と接触させておいた同位体標識されたタンパク質群の中から、 化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種の タンパク質を精製する工程と、
(c) 工程 （a) および工程 （b) で得られたタンパク質を混合する工程と、
(d) 工程 （c) で得られた混合物を質量分析処理する工程と、
(e)質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程と、 (f) 各タンパク質について、 工程 （a) で得られたタンパク質に由来するピーク と工程 （b) で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、 各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程と、
を含む、 前記方法。
3 . 複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析する方法であって、
(a) タンパク質群の中から、 化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の 化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
(b) 予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、 化合物が固定化さ れた担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製 する工程と、
(c) 工程 （a) で得られたタンパク質または工程 （b) で得られたタンパク質の 一方を同位体標識する工程と、
(d) 工程 （c) で得られた標識されたタンパク質と、 工程 （a) および工程 （b) で得られたタンパク質のうち工程（c) で標識されていない他方のタンパク質 とを混合する工程と、
(e) 工程 （d) で得られた混合物を質量分析処理する工程と、
(f)質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程と、
(g) 各タンパク質について、 工程 （a) で得られたタンパク質に由来するピーク と工程 （b) で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、 各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程と、
を含む、 前記方法。
4 . 複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析する方法であつて、
(a) タンパク質群の中から、 化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の 化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
(b) 工程 （a) で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタ ンパク質群とを混合する工程と、
(c) 工程 （b) で得られた混合物を質量分析処理する工程と、
(d) 予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、 化合物が固定化さ れた担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製 する工程と、
(e) 工程 （d) で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタ ンパク質群とを混合する工程と、 (f) 工程 （e) で得られた混合物を質量分析処理する工程と、
(g) 工程 （c) および工程 （f) で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク 質中の各タンパク質を同定する工程と、
(h) 各タンパク質について、 工程 （a) で得られたタンパク質に由来するピーク と内部標準物質であるタンパク質に由来するピークとの強度比および工程
(d) で得られたタンパク質に由来するピークと内部標準物質であるタンパ ク質に由来するピークとの強度比を求めて、 当該強度比を比較することによ り各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程と、
を含む、 前記方法。
5 . 複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析する方法であって、 (al) タンパク質群の中から、 化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の 化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
(a2) 工程 （al) で得られた精製物を質量分析処理する工程と、
(a3) 工程 （a2) で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タン パク質を同定する工程と、
(a4) 複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する工程と、
(bl) 予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、 化合物が固定化さ れた担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製 する工程と、
(b2) 工程 （bl) で得られた精製物を質量分析処理する工程と、
(b3) 工程 （b2) で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タン パク質を同定する工程と、
(b4) 複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する工程と、
(c) 各タンパク質について、 工程 （al) で得られたタンパク質に由来するタン パク質量と工程 （bl) で得られたタンパク質に由来するタンパク質量との比 を求めて、 各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程と、 を含む、 前記方法。
6 . 化合物が固定化された担体が、 ァフィ二ティークロマトグラフィー用の担体 である、 請求項 1〜 5のいずれか 1項に記載の方法。
7 . 工程 （b) におけるタンパク質群と化合物との接触を複数種の化合物につい て行うことを特徴とする、 請求項 1〜3のいずれか 1項に記載の方法。
8 . 工程 （d) におけるタンパク質群と化合物との接触を複数種の化合物につい て行うことを特徴とする、 請求項 4に記載の方法。
9 . 工程 （bl) におけるタンパク質群と化合物との接触を複数種の化合物につい て行うことを特徴とする、 請求項 5記載の方法。
1 0 . 担体に固定化された化合物が、 ATP、 GTP、 NADおよび NADPからなる 群から選択されるいずれかの化合物である、 請求項 1〜 9のいずれか 1項に記 載の方法。
1 1 . 同位体が、 2H、 13C、 N、 170、 180、 33pおよび 34Sからなる群から選択 されるいずれかの同位体又はこれらの組み合わせである、 請求項 1〜4、 6〜 8および 1 0のいずれか 1項に記載の方法。
1 2 . 同位体が、 i3Cである、 請求項 1 1に記載の方法。
1 3 . 複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析するシステムであ つて、
(a) 同位体標識されたタンパク質群の中から、 化合物が固定化された担体を用 いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
(b) 予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、 化合物が固定化さ れた担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製 する手段と、
(c) 手段 （a) および手段 （b) で得られたタンパク質を混合する手段と、
(d) 手段 （c) で得られた混合物を質量分析処理する手段と、
(e)質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段と、 (f) 各タンパク質について、 手段 （a) で得られたタンパク質に由来するピーク と手段 （b) で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、 各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段と、
を含む、 前記システム。
1 4 . 複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析するシステムであ つて、
(a) タンパク質群の中から、 化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の 化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
(b) 予め化合物と接触させておいた同位体標識されたタンパク質群の中から、 化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種の タンパク質を精製する手段と、
(c) 手段 （a) および手段 （b) で得られたタンパク質を混合する手段と、
(d) 手段 （c) で得られた混合物を質量分析処理する手段と、
(e)質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段と、 (f) 各タンパク質について、 手段 （a) で得られたタンパク質に由来するピーク と手段 （b) で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、 各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段と、
を含む、 前記システム。
1 5 . 複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析するシステムであ つて、
(a) タンパク質群の中から、 化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の 化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
(b) 予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、 化合物が固定化さ れた担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製 する手段と、
(c) 手段 （a) で得られたタンパク質または手段 （b) で得られたタンパク質の 一方を同位体標識する手段と、
(d) 手段 （c) で得られた標識されたタンパク質と、 手段 （a) および手段 （b) ' で得られたタンパク質のうち手段（c) で標識されていない他方のタンパク質 とを混合する手段と、
(e) 手段 （d) で得られた混合物を質量分析処理する手段と、
(f)質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段と、 (g) 各タンパク質について、 手段 （a) で得られたタンパク質に由来するピーク と手段 （b) で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、 . 各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段と、
を含む、 前記システム。
1 6 . 複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析するシステムであ つて、
(a) タンパク質群の中から、 化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の 化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
(b) 手段 （a) で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタ ンパク質群とを混合する手段と、
(c) 手段 （b) で得られた混合物を質量分析処理する手段と、
(d) 予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、 化合物が固定化さ れた担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製 する手段と、
(e) 手段 （d) で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタ ンパク質群とを混合する手段と、
(f) 手段 （e) で得られた混合物を質量分析処理する手段と、
(g) 手段 （c) および手段 （f) で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク 質中の各タンパク質を同定する手段と、 (h) 各タンパク質について、 手段 （a) で得られたタンパク質に由来するピーク と内部標準物質であるタンパク質に由来するピークとの強度比および手段 (d) で得られたタンパク質に由来するピークと内部標準物質であるタンパ ク質に由来するピークとの強度比を求めて、 当該強度比を比較することによ り各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段と、 を含む、 前記システム。
1 7 . 複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析するシステムであ つて、
(al) タンパク質群の中から、 化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の 化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
(a2) 手段 （al) で得られた精製物を質量分析処理する手段と、
(a3) 手段 （a2) で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タン パク質を同定する手段と、
(a4) 複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する手段と、
(bl) 予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、 化合物が固定化さ れた担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製 する手段と、
(b2) 手段 （bl) で得られた精製物を質量分析処理する手段と、
(b3) 手段 （b2) で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タン パク質を同定する手段と、
(b4) 複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する手段と、
(c) 各タンパク質について、 手段 （al) で得られたタンパク質に由来するタン パク質量と手段 （bl) で得られたタンパク質に由来するタンパク質量との比 を求めて、 各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段と、 を含む、 前記システム。
1 8 . 化合物が固定化された担体が、 ァフィ二ティークロマトグラフィー用の担 体である、 請求項 1 3〜1 7のいずれか 1項に記載のシステム。
1 9 . 手段 （b) におけるタンパク質群と化合物との接触を複数種の化合物につ いて行うことを特徴とする、 請求項 1 3〜 1 5のいずれか 1項に記載のシステ ム。
2 0 . 手段 （d) におけるタンパク質群と化合物との接触を複数種の化合物につ いて行うことを特徴とする、 請求項 1 6に記載のシステム。
2 1 . 手段 （bl) におけるタンパク質群と化合物との接触を複数種の化合物につ レ、て行うことを特徴とする、 請求項 1 7記載のシステム。
2 2 . 担体に固定化された化合物が、 ATP、 GTP、 NADおよび NADPからなる 群から選択されるいずれかの化合物である、 請求項 1 3〜2 1のいずれか 1項 に記載のシステム。
3 . 同位体が、 2H、 "C、 15N、 "0、 180、 33pおよび 34Sからなる群から選択 されるいずれかの同位体又はこれらの組み合わせである、 請求項 1 3〜1 6、 1 8〜2 0および 2 2のいずれか 1項に記載のシステム。
4 . 同位体が、 13Cである、 請求項 2 3に記載のシステム。
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