JP4659831B2 - 化合物に対するタンパク質の結合力を解析する方法 - Google Patents
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Description
本発明は、質量分析による化合物に対するタンパク質の結合力を解析する方法に関する。
タンパク質とタンパク質との結合に関する解析は、各タンパク質の機能を探る上で多くの有益な情報を与える。また、薬剤となりうる化合物とタンパク質との結合に関する解析は、生体に対する化合物の影響を明らかにする上で重要な情報を与える。
そして、ある物質とタンパク質との結合に関する解析においては、ある物質と結合するタンパク質の特異性のみならず、ある物質とタンパク質との結合力(「結合活性」ともいう)もまた重要な指標となる。
例えば、ある酵素に対する阻害剤を開発する場合、その酵素に対する阻害剤の結合力がその酵素の本来の基質よりも弱ければ、阻害剤としての機能を発揮しにくい。
分子間の結合力は、一般的に結合定数(あるいは解離定数)により表される。結合定数は、結合する二つの物質が抗原−抗体の関係にある場合には、ELISA又はRIAによって算出することができる。また、二つの物質が抗原−抗体の関係以外の場合であっても、平行透析法、蛍光消光法、原子間力顕微鏡、水晶振動子法、表面プラズモン共鳴、フロンタルアフィニティークロマトグラフィーなどの方法によって結合定数を求めることができる(文献1及び2参照)。しかしながら、これらの方法は、結合する二つの物質が予め既知であること、及び、両物質とも精製・単離した物質を用いて測定することが必要である。そのため、前記方法では、ある物質について、未知の複数種のタンパク質を含む混合物中の各々のタンパク質に対する結合力を検討することはできない。
(1)Borch,J.;Roepstorff,P.Anal.Chem.2004,76,5243−5248.
(2)Zhang,B.;Palcic,M.M.;Schriemer,D.C.;Alvarez−Manilla,G.;Pierce,M.;Hindsgaul,O.Anal.Biochem.2001,299,173−182.
そして、ある物質とタンパク質との結合に関する解析においては、ある物質と結合するタンパク質の特異性のみならず、ある物質とタンパク質との結合力(「結合活性」ともいう)もまた重要な指標となる。
例えば、ある酵素に対する阻害剤を開発する場合、その酵素に対する阻害剤の結合力がその酵素の本来の基質よりも弱ければ、阻害剤としての機能を発揮しにくい。
分子間の結合力は、一般的に結合定数(あるいは解離定数)により表される。結合定数は、結合する二つの物質が抗原−抗体の関係にある場合には、ELISA又はRIAによって算出することができる。また、二つの物質が抗原−抗体の関係以外の場合であっても、平行透析法、蛍光消光法、原子間力顕微鏡、水晶振動子法、表面プラズモン共鳴、フロンタルアフィニティークロマトグラフィーなどの方法によって結合定数を求めることができる(文献1及び2参照)。しかしながら、これらの方法は、結合する二つの物質が予め既知であること、及び、両物質とも精製・単離した物質を用いて測定することが必要である。そのため、前記方法では、ある物質について、未知の複数種のタンパク質を含む混合物中の各々のタンパク質に対する結合力を検討することはできない。
(1)Borch,J.;Roepstorff,P.Anal.Chem.2004,76,5243−5248.
(2)Zhang,B.;Palcic,M.M.;Schriemer,D.C.;Alvarez−Manilla,G.;Pierce,M.;Hindsgaul,O.Anal.Biochem.2001,299,173−182.
本発明は、標識法またはタンパク質定量法と質量分析とを利用した、化合物に対するタンパク質の結合力を解析する方法及びシステムを提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、担体に固定化された化合物に結合したタンパク質を複数の画分に分画し、内部標準画分としてもう一つ別に分画した1の画分又は全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を用意し、当該内部標準画分を前記分画された画分のそれぞれに一定量添加し、各画分について質量分析処理し、質量分析情報から各ピーク強度比を検出することにより、化合物に対するタンパク質の結合力を解析(比較)し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
(1)化合物に対するタンパク質の結合力を解析する方法であって、以下の工程:
(a)同位体標識された第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する工程と、
(b)第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する工程と、
(c)工程(b)で得られた1の画分、又は工程(b)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を、工程(a)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する工程と、
(d)工程(c)で得られた画分を質量分析処理する工程と、
(e)質量分析情報から、各画分について、工程(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと工程(b)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程と
を含む、前記方法。
(2)化合物に対するタンパク質の結合力を解析する方法であって、以下の工程:
(a)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する工程と、
(b)同位体標識された第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する工程と、
(c)工程(b)で得られた1の画分、又は工程(b)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を、工程(a)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する工程と、
(d)工程(c)で得られた画分を質量分析処理する工程と、
(e)質量分析情報から、各画分について、工程(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと工程(b)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程と
を含む、前記方法。
(3)化合物に対するタンパク質の結合力を解析する方法であって、以下の工程:
(a)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する工程と、
(b)第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する工程と、
(c)工程(a)で得られた画分を標識する工程と、
(d)工程(b)で得られた1の画分、又は工程(b)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を、工程(c)で標識された画分のそれぞれに一定量添加する工程と、
(e)工程(d)で得られた画分を質量分析処理する工程と、
(f)質量分析情報から、各画分について、工程(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと工程(b)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程と
を含む、前記方法。
(4)化合物に対するタンパク質の結合力を解析する方法であって、以下の工程:
(a)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する工程と、
(b)第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する工程と、
(c)工程(b)で得られた1の画分、又は工程(b)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を標識する工程と、
(d)工程(c)で標識された画分又は混合物を、工程(a)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する工程と、
(e)工程(d)で得られた画分を質量分析処理する工程と、
(f)質量分析情報から、各画分について、工程(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと工程(b)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程と
を含む、前記方法。
(5)工程(a)および/または工程(b)の分画する工程が、溶出溶媒の強度を変化させることにより分画する工程である、(1)〜(4)のいずれか一項に記載の方法。
(6)質量分析情報から、各画分に含まれる各タンパク質を同定する工程とをさらに含む(1)〜(5)のいずれか一項に記載の方法。
上記(1)〜(6)において、第二のタンパク質群は、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画せずに第一のタンパク質群由来の画分のそれぞれに一定量添加してもよい。
また、上記(1)〜(6)において、タンパク質標識法を利用する代わりにタンパク質の定量法を用いることにより、または各タンパク質のEMPAIを指標に用いることにより、化合物に対するタンパク質の結合力を解析することもできる。
(7)化合物に対するタンパク質の結合力を解析するためのシステムであって、以下の手段:
(a)同位体標識された第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する手段と、
(b)第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する手段と、
(c)手段(b)で得られた1の画分、又は手段(b)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を、手段(a)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する手段と、
(d)手段(c)で得られた画分を質量分析処理する手段と、
(e)質量分析情報から、各画分について、手段(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと手段(b)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する手段と
を含む、前記システム。
(8)化合物に対するタンパク質の結合力を解析するためのシステムであって、以下の手段:
(a)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する手段と、
(b)同位体標識された第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する手段と、
(c)手段(b)で得られた1の画分、又は手段(b)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を、手段(a)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する手段と、
(d)手段(c)で得られた画分を質量分析処理する手段と、
(e)質量分析情報から、各画分について、手段(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと手段(b)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する手段と
を含む、前記システム。
(9)化合物に対するタンパク質の結合力を解析するためのシステムであって、以下の手段:
(a)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する手段と、
(b)第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する手段と、
(c)手段(a)で得られた画分を標識する手段と、
(d)手段(b)で得られた1の画分、又は手段(b)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を、手段(c)で標識された画分のそれぞれに一定量添加する手段と、
(e)手段(d)で得られた画分を質量分析処理する手段と、
(f)質量分析情報から、各画分について、手段(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと手段(b)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する手段と
を含む、前記システム。
(10)化合物に対するタンパク質の結合力を解析するためのシステムであって、以下の手段:
(a)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する手段と、
(b)第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する手段と、
(c)手段(b)で得られた1の画分、又は手段(b)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を標識する手段と、
(d)手段(c)で標識された画分又は混合物を、手段(a)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する手段と、
(e)手段(d)で得られた画分を質量分析処理する手段と、
(f)質量分析情報から、各画分について、手段(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと手段(b)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する手段と
を含む、前記システム。
(11)手段(a)および/または手段(b)の分画する手段が、溶出溶媒の強度を変化させることにより分画する手段である、(7)〜(10)のいずれか一項に記載のシステム。
(12)質量分析情報から、各画分に含まれる各タンパク質を同定する手段とをさらに含む(7)〜(11)のいずれか一項に記載のシステム。
上記(7)〜(12)において、第二のタンパク質群は、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画せずに第一のタンパク質群由来の画分のそれぞれに一定量添加してもよい。
また、上記(7)〜(12)において、タンパク質標識手段を利用する代わりにタンパク質の定量手段を用いることにより、または各タンパク質のEMPAIを指標に用いることにより、化合物に対するタンパク質の結合力を解析することもできる。
本発明により、化合物に結合しうる複数種の物質群(タンパク質)の結合の強さについて序列を作ることができる。本発明の一態様により、複数種の未知物質間について、化合物に対する結合力を解析することが可能となった。本発明の一態様によれば、対象物質が未知で、かつ混合試料においてそれぞれの物質同士が分離不十分な場合であっても適用できる点で有用である。
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、担体に固定化された化合物に結合したタンパク質を複数の画分に分画し、内部標準画分としてもう一つ別に分画した1の画分又は全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を用意し、当該内部標準画分を前記分画された画分のそれぞれに一定量添加し、各画分について質量分析処理し、質量分析情報から各ピーク強度比を検出することにより、化合物に対するタンパク質の結合力を解析(比較)し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
(1)化合物に対するタンパク質の結合力を解析する方法であって、以下の工程:
(a)同位体標識された第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する工程と、
(b)第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する工程と、
(c)工程(b)で得られた1の画分、又は工程(b)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を、工程(a)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する工程と、
(d)工程(c)で得られた画分を質量分析処理する工程と、
(e)質量分析情報から、各画分について、工程(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと工程(b)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程と
を含む、前記方法。
(2)化合物に対するタンパク質の結合力を解析する方法であって、以下の工程:
(a)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する工程と、
(b)同位体標識された第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する工程と、
(c)工程(b)で得られた1の画分、又は工程(b)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を、工程(a)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する工程と、
(d)工程(c)で得られた画分を質量分析処理する工程と、
(e)質量分析情報から、各画分について、工程(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと工程(b)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程と
を含む、前記方法。
(3)化合物に対するタンパク質の結合力を解析する方法であって、以下の工程:
(a)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する工程と、
(b)第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する工程と、
(c)工程(a)で得られた画分を標識する工程と、
(d)工程(b)で得られた1の画分、又は工程(b)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を、工程(c)で標識された画分のそれぞれに一定量添加する工程と、
(e)工程(d)で得られた画分を質量分析処理する工程と、
(f)質量分析情報から、各画分について、工程(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと工程(b)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程と
を含む、前記方法。
(4)化合物に対するタンパク質の結合力を解析する方法であって、以下の工程:
(a)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する工程と、
(b)第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する工程と、
(c)工程(b)で得られた1の画分、又は工程(b)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を標識する工程と、
(d)工程(c)で標識された画分又は混合物を、工程(a)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する工程と、
(e)工程(d)で得られた画分を質量分析処理する工程と、
(f)質量分析情報から、各画分について、工程(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと工程(b)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程と
を含む、前記方法。
(5)工程(a)および/または工程(b)の分画する工程が、溶出溶媒の強度を変化させることにより分画する工程である、(1)〜(4)のいずれか一項に記載の方法。
(6)質量分析情報から、各画分に含まれる各タンパク質を同定する工程とをさらに含む(1)〜(5)のいずれか一項に記載の方法。
上記(1)〜(6)において、第二のタンパク質群は、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画せずに第一のタンパク質群由来の画分のそれぞれに一定量添加してもよい。
また、上記(1)〜(6)において、タンパク質標識法を利用する代わりにタンパク質の定量法を用いることにより、または各タンパク質のEMPAIを指標に用いることにより、化合物に対するタンパク質の結合力を解析することもできる。
(7)化合物に対するタンパク質の結合力を解析するためのシステムであって、以下の手段:
(a)同位体標識された第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する手段と、
(b)第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する手段と、
(c)手段(b)で得られた1の画分、又は手段(b)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を、手段(a)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する手段と、
(d)手段(c)で得られた画分を質量分析処理する手段と、
(e)質量分析情報から、各画分について、手段(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと手段(b)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する手段と
を含む、前記システム。
(8)化合物に対するタンパク質の結合力を解析するためのシステムであって、以下の手段:
(a)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する手段と、
(b)同位体標識された第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する手段と、
(c)手段(b)で得られた1の画分、又は手段(b)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を、手段(a)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する手段と、
(d)手段(c)で得られた画分を質量分析処理する手段と、
(e)質量分析情報から、各画分について、手段(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと手段(b)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する手段と
を含む、前記システム。
(9)化合物に対するタンパク質の結合力を解析するためのシステムであって、以下の手段:
(a)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する手段と、
(b)第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する手段と、
(c)手段(a)で得られた画分を標識する手段と、
(d)手段(b)で得られた1の画分、又は手段(b)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を、手段(c)で標識された画分のそれぞれに一定量添加する手段と、
(e)手段(d)で得られた画分を質量分析処理する手段と、
(f)質量分析情報から、各画分について、手段(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと手段(b)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する手段と
を含む、前記システム。
(10)化合物に対するタンパク質の結合力を解析するためのシステムであって、以下の手段:
(a)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する手段と、
(b)第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する手段と、
(c)手段(b)で得られた1の画分、又は手段(b)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を標識する手段と、
(d)手段(c)で標識された画分又は混合物を、手段(a)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する手段と、
(e)手段(d)で得られた画分を質量分析処理する手段と、
(f)質量分析情報から、各画分について、手段(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと手段(b)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する手段と
を含む、前記システム。
(11)手段(a)および/または手段(b)の分画する手段が、溶出溶媒の強度を変化させることにより分画する手段である、(7)〜(10)のいずれか一項に記載のシステム。
(12)質量分析情報から、各画分に含まれる各タンパク質を同定する手段とをさらに含む(7)〜(11)のいずれか一項に記載のシステム。
上記(7)〜(12)において、第二のタンパク質群は、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画せずに第一のタンパク質群由来の画分のそれぞれに一定量添加してもよい。
また、上記(7)〜(12)において、タンパク質標識手段を利用する代わりにタンパク質の定量手段を用いることにより、または各タンパク質のEMPAIを指標に用いることにより、化合物に対するタンパク質の結合力を解析することもできる。
本発明により、化合物に結合しうる複数種の物質群(タンパク質)の結合の強さについて序列を作ることができる。本発明の一態様により、複数種の未知物質間について、化合物に対する結合力を解析することが可能となった。本発明の一態様によれば、対象物質が未知で、かつ混合試料においてそれぞれの物質同士が分離不十分な場合であっても適用できる点で有用である。
図1は、アフィニティー精製法におけるタンパク質溶出プロファイルの一例を示す図。
図2は、本発明の方法の概要を示す図。
図3は、本発明のシステムの構成例を示すブロック図。
図4は、本発明のシステムの各ユニットの一例を示す模式図。
図5は、制御ユニットの詳細構成図の一例。
図6は、制御ユニットの動作のフローチャートの一例を示す図。
図2は、本発明の方法の概要を示す図。
図3は、本発明のシステムの構成例を示すブロック図。
図4は、本発明のシステムの各ユニットの一例を示す模式図。
図5は、制御ユニットの詳細構成図の一例。
図6は、制御ユニットの動作のフローチャートの一例を示す図。
1a:チューブ、1b:チューブ、2a:攪拌羽根、2b:攪拌羽根、11a:培養装置、11b:培養装置、12a:培養液ボトル、12b:培養液ボトル、13a:細胞破砕器、13b:細胞破砕器、14:標識装置、15a:化合物が固定化された担体、15b:化合物が固定化された担体、16a:タンパク質分画用制御装置、16b:タンパク質分画用制御装置、17a:精製タンパク質分取器、17b:精製タンパク質分取器、17c:混合器、18−1:チューブ、18−2:チューブ、18−3:チューブ、18−4:チューブ、18−5:チューブ、19:プレート、20:質量分析処理装置、21:コンピュータ、30:中央コンピュータ、100:LAN、301:制御ユニット、302:タンパク質分画ユニット、303:タンパク質混合ユニット、304:質量分析ユニット、501:CPU、502:送信/受信部、503:入力部、504:出力部、505:ROM、506:RAM、507:ハードディスクドライブ(HDD)、508:CD−ROMドライブ、509:タンパク質データベース(DB)、510:CD−ROM、511:インターネット
以下に本発明の実施の形態について説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態にのみ限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、さまざまな形態で実施をすることができる。
なお、本明細書において引用した文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、2005年7月29日に出願し、本願優先権主張の基礎となる特願JP2005−222097号の特許請求の範囲、明細書、図面及び要約書の開示内容は、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。
本発明において用いる用語「タンパク質」は、二以上のアミノ酸がペプチド結合によって結合したペプチドを含む。また、タンパク質には、生理的な修飾を受けているもの(例えば、リン酸化タンパク質、糖鎖結合タンパク質等)も含まれる。また、本発明において用いる用語「タンパク質群」は、二種以上のタンパク質を含む集団をいう。
本発明において用いる用語「標識されたタンパク質」とは、タンパク質を構成する分子の一部が標識されたタンパク質をいう。特に、同位体で標識されたタンパク質を「同位体標識されたタンパク質」という。また、本発明において用いる用語「同位体標識されたタンパク質群」とは、二種以上の同位体標識されたタンパク質を含む集合をいう。
本発明において用いる用語「代謝的に同位体標識されたタンパク質」とは、同位体標識された当該タンパク質の前駆体(例えば、アミノ酸)を加えることにより、代謝的にタンパク質を構成する分子の一部が同位体で標識されたタンパク質をいう。また、本発明において用いる用語「代謝的に同位体標識されたタンパク質群」とは、二種以上の代謝的に同位体標識されたタンパク質を含む集合をいう。前記「代謝的に」とは、酵素反応などを介した生理的条件を示し、好ましくは培養細胞における代謝反応を示す。
1.本発明の概要
本発明は、質量分析を使って、化合物に結合しうる既知又は未知物質群(タンパク質)の結合力の強さについて解析し、その強さの序列を作る方法に関する。
一般に、化合物が固定化された担体が充填されたカラム(アフィニティークロマトグラフィーカラム)中の担体に固定化された化合物に結合した物質群を溶出させる際には、溶出溶媒の溶出力を徐々に強くしながら溶出物を分画する。したがって、アフィニティークロマトグラフィーカラムから最後に溶出する物質が、担体に固定化された化合物に対して、もっとも結合力が強いということになる。例えば、図1に示すようにアフィニティークロマトグラフィーカラムからタンパク質を溶出すると、フラクション(画分)5に含まれるタンパク質が最も結合力が強い。そして、画分5に含まれるタンパク質を同定するとタンパク質C、D及びEの3つのタンパク質が含まれていたとする。ここで、タンパク質C、D及びEの結合力の強度を比較するためには、各タンパク質について、個々のタンパク質標品を準備し、あるいは色の異なる蛍光タグや異なるエピトープタグを導入すれば、溶出プロファイルを調べることができ、その結果タンパク質Eが最も溶出が遅い、つまり結合力が強いということがわかる。
しかし、アフィニティークロマトグラフィーカラムから溶出するタンパク質は、一つの画分に全て溶出する場合もあれば、最初から最後まで広い範囲に広がって溶出することもある。しかも一つの画分に複数種のタンパク質が混在するために、各タンパク質の溶出パターンを知ることは容易ではない。また、標品を準備すること、及びタグを導入することは普遍的に行えるほど容易ではなく、またタグなどの導入により人為的な影響を受け、真の結合力を評価することができないこともある。さらに、どのようなタンパク質が結合しているか、あらかじめ同定する必要がある。
そこで、本発明においては、タンパク質群を、化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する。また、内部標準画分として、もう一つ別にタンパク質群を、化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画し、当該得られた画分を全てまたは隣り合った複数個の画分をまとめた画分の混合物を用意する。ここで、化合物が固定化された担体が充填されたカラム(アフィニティークロマトグラフィーカラム)に負荷する試料のうち一方のタンパク質群は、同位体標識されたものである(あるいは分画後、標識する)。次に、一つにまとめた(あるいは隣り合った分画を複数個まとめた)画分の混合物を内部標準画分として、一定量ずつ別に分画した試験試料に加える。画分は、必要に応じてSDS−PAGEなどで分離し、トリプシンなどでタンパク質を消化することができる。その後それぞれの画分について、質量分析装置で測定する。
ここで分画された試験試料、あるいは内部標準画分用試料のいずれかは、同位体によって標識されている。図2は、アフィニティー精製前に試験試料を同位体標識した態様(図2a1)を示す。従って、標識された試料をアフィニティー精製したときの画分(図2a1)と、標識されていない試料をアフィニティー精製したときの画分(図2a2)とを混合し(図2b)、その混合試料を質量分析処理すると(図2c)、質量分析スペクトルでは、同位体標識された画分由来のタンパク質のピーク(図2c、破線で示すピーク)と標識されていない画分由来のタンパク質のピーク(図2c、実線で示すピーク)が、ペアで観測される。このピーク強度比を求めたとき、あるタンパク質が複数の画分にまたがって溶出されている場合、そのタンパク質は一番ピーク強度比が大きい画分にもっとも濃縮されて溶出されていることになる。また、ある画分の中に複数種のタンパク質が含まれる場合、一番ピーク強度比が大きいタンパク質がその画分にもっとも濃縮されて溶出されたことになる。例えば、図2において、タンパク質C及びDは画分5よりも4に多いのに対して、タンパク質Eは画分5に多い(図2c)。したがって、画分4においてはタンパク質Dのピーク強度比が大きく、画分5においてはタンパク質Eのピーク強度比が大きい。これらのことから、タンパク質DとEとを比較すると、タンパク質D、Eの順に遅く分画され、タンパク質Eが一番遅く溶出していることがわかる。
なお、図2bに示す工程において、内部標準画分は全部まとめる必要はなく、比べたいところだけ、連続する画分を混ぜれば良い。例えば、画分3、画分4及び画分5、又はタンパク質C、D及びEを試験の対象とする場合は、連続する画分、すなわち画分3、画分4及び画分5を混合して内部標準画分とすればよい。これにより、内部標準画分の全体が希釈されて目的物が検出できないことを防止することができる。また、それぞれの画分の全量を混合して内部標準画分としてもよいし、一定量ずつ混合して内部標準画分としてもよい。なお、標識されていない試料を1又は複数の画分に分画する工程(図2a2)において、分画された画分が1つのときは、その1の画分を内部標準画分とすることができる(図2a2’)。
各タンパク質がどの画分にもっとも濃縮されて溶出されているかを比較し、遅く溶出されてくる画分に濃縮されているタンパク質ほど、担体に固定化された化合物に対する結合力が強いと判断できる。なお、内部標準画分用の試料については、必ずしも化合物が固定化された担体によって分画する必要性がない。しかしながら、何ら濃縮操作を施していない試料から質量分析装置で検出されるタンパク質の多くは、発現量が極めて多いタンパク質である。また、濃縮操作を施していないタンパク質と化合物が固定化された担体によって濃縮されたタンパク質との間に濃度差が生じる。そのため、質量分析のダイナミックレンジの狭さを考慮すると内部標準画分の添加量を調整することが難しい。従って、内部標準画分用試料も化合物が固定化された担体で一旦濃縮することが望ましい。
また、本発明によって、化合物に対する複数種のタンパク質の結合力の強度比を算出することが可能となるため、複数種の化合物について本発明の解析を行い、化合物間での化合物と各タンパク質との結合力の相関を算出することで、生体、細胞等に対する化合物の特性を解析することが可能となる。
2.本発明の解析方法の態様
(1)第一の態様
本発明の方法の第一の態様は、化合物に対するタンパク質の結合力を解析するために以下の工程を含むものであり、解析の対象となるタンパク質群が分画前に同位体標識されている態様である。
(a)同位体標識された第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する工程
(b)第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する工程
(c)工程(b)で得られた1の画分、又は工程(b)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を、工程(a)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する工程
(d)工程(c)で得られた画分を質量分析処理する工程
(e)質量分析情報から、各画分について、工程(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと工程(b)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程
(a)同位体標識された第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する工程
本発明において、第一のタンパク質群は解析対象のタンパク質試料であり、例えば、組織、生体液、細胞、細胞器官及びタンパク質複合体などから得られた試料を用いることができる。
同位体標識されたタンパク質群は、タンパク質を構成する分子(アミノ酸)の一部が同位体で標識されていればよく、その調製方法や標識部位については、特に限定されない。
以下、具体的な調製方法について記載する。
同位体標識されたタンパク質群は、代謝的に同位体標識することによって、調製することができる。例えば、培養可能な細胞を、同位体標識されたタンパク質の前駆体(例えば、アミノ酸)を含む培地で培養することによって、細胞中のタンパク質を代謝的に同位体標識することができる。培養条件はどのようなものであってもよく、液体培地あるいは固体培地に該細胞を培養するのに好適な条件を選択すればよい。例えば、動物細胞を選択した場合には、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM等の培地を用い、必要に応じウシ胎児血清(FCS)等の血清、アミノ酸、グルコース、ペニシリン又はストレプトマイシンなどを添加することができ、pH約6〜8、30〜40℃において15〜200時間前後の培養を行うことができる。その他、必要に応じ途中で培地の交換を行ったり、通気及び攪拌を行ったりすることができる。
このようにして得られた代謝的に同位体標識されたタンパク質群を含む細胞を破砕することで、同位体標識されたタンパク質群を調製することができる。破砕する方法は、例えば、ダウンス型テフロンTM・ホモジナイザー、ポリトロン、ワーリング・ブレンダー、ポッター型ガラス・ホモジナイザー、超音波破砕装置、細胞溶解液(例えば、PIERCE社のM−PER:cat no.78501,T−PER:cat no.78510など)を用いる方法又は凍結融解法があげられ、好ましくは細胞溶解液を用いる方法があげられる。破砕した細胞は、遠心分離操作により、不溶性物質を除去することが好ましい。このようにして、同位体標識されたタンパク質群を調製することができる。
本発明で用いる同位体は、放射性同位体を適用することもできるが、放射性を有さない安定同位体が、取り扱いが容易であることから、特に好ましい。安定同位体は、例えば、2H、13C、15N、17O、18O、31P若しくは34S又はこれらの組み合わせが挙げられ、好ましくは2H、13C、15N若しくは18O又はこれらの組み合わせであり、より好ましくは13C、15N若しくは18O又はこれらの組み合わせであり、さらに好ましくは13Cである。本発明に利用される同位体は、タンパク質を標識し得るものであれば、その種類は特に限定されない。具体的には、同位体標識されたタンパク質の前駆体として、13C標識(13Cx6個)ロイシン(Cambridge Isotope Labs(CIL)社製、L−Leucine U−13C6,CLM−2262)を挙げることができる。上記同位体は、本発明の態様のすべてに適用することができる。
また、同位体標識されたタンパク質群は、in vitroにおいても調製することができる。たとえば、タンパク質中のシステイン残基を同位体標識されたアルキル化試薬を用いてアルキル化することにより、同位体標識することができる(「ラピッド・コミュケーションズ・イン・マス・スペクトルメトリー(Rapid Communications in Mass Spectrometry)」第16巻、第15号、2002年、pp.1416−1424参照)。さらに、タンパク質中のシステイン残基を同位体標識されたビオチン化試薬を用いてビオチン化することにより、同位体標識することもできる。標識後は、さらにアビジンカラムを用いて、標識されたタンパク質のみを精製することが可能である(「ネイチャー・バイオテクノロジー(Nature Biotechnology)」第17巻、第10号、1999年10月、pp.994−999)。
また、同位体標識されたタンパク質群は、化学合成により製造してもよい。
当該同位体標識されたタンパク質群は、予備的に分画することができる。予備的に分画する方法は、例えば、分画遠心法及びショ糖密度勾配遠心法などがあげられ、好ましくはショ糖密度勾配遠心法があげられる。
また、必要に応じて、前記同位体標識されたタンパク質群を分離することができる。分離する方法は、例えば、電気泳動(例えば、二次元電気泳動、SDS−PAGEなど)、群特異的アフィニティークロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーを利用する方法、免疫沈降法、硫安沈殿法、有機溶媒による沈殿法、限外ろ過法、ゲルろ過法及び透析法などがあげられ、好ましくは逆相クロマトグラフィーを利用する方法があげられる。
なお、同位体標識されたタンパク質群は、適当な条件、好ましくは−20℃以下、特に好ましくは−80℃以下で保存することができる。
本発明において、「化合物が固定化された担体」とは、担体に官能基を介して化合物を共有又は非共有結合させたものをいう。
化合物が固定化された担体は、例えば、まず、担体側に官能基として、N−hydroxy−succinimideやHydrazideを共有結合させたり、単にアミノ基にしたり、又はProtein A、HeparinもしくはCibacron Blue F3GAなどを固定化し、このような担体の官能基に対して、化合物を直接又は化合物の構造の一部を変えたものを共有又は非共有結合させたものがある。
担体に固定化する化合物は、特に限定されず、例えば、合成低分子化合物、タンパク質、合成ペプチド、精製又は部分精製ポリペプチド、抗体、細菌放出物質(細菌代謝産物を含む)、生体内核酸物質(ATP、GTP、NAD/NADH又はNADP/NADPHなど)、脂質などが挙げられる。これら化合物は、新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
担体としては、アガロースゲル、アクリルアミド、磁気ビーズ、セルロース、シリカゲルなどがあげられ、好ましくはアガロースゲルである。担体は、例えば、バイオラド社等から購入することができる(アフィゲル10、バイオラド社製、カタログ番号153−6099)。
化合物が固定化された担体は、担体に所望の化合物を結合させることにより、作製することができる。化合物が固定化された担体の作製は、例えば、アミノ基を有する化合物であれば、以下の手順で行うことができる。まず、アミノ基を有する化合物溶液をN−hydroxy−succinimideが結合している担体(例えばアフィゲル10)に加える。次に、トリエチルアミンを加え、インキュベーションした後、2−アミノエタノールを加え、さらにインキュベーションすることによって作製することができる。また、適宜洗浄操作を加えることが好ましい。
また、化合物が固定化された担体の作製は、例えば、カルボン酸を有する化合物であれば、以下の手順で行うことができる。まず、カルボン酸を有する化合物溶液にカルボジイミドを加え、インキュベーションした後、アミノ基が結合している担体に加える。次に、酢酸(もしくは乳酸)を加え、さらにインキュベーションすることによって作製することができる。また、適宜洗浄操作を加えることが望ましい。さらに、NADPアナログを固定化した担体などは、例えば、アマシャムバイオサイエンス社から購入することができる(2’5’ADP Sepharose 4B(コード番号17−0700−01))。
また、化合物が固定化された担体は、チオール基を有する化合物であれば、例えば、SulfoLink(ピアス社、カタログ番号:44895)を使って作製することができ、また、アルデヒド基を有する化合物であれば、例えば、CarboLink(ピアス社、カタログ番号:44900)を使って作製することができる。
さらに、化合物が固定化された担体は、糖のような水酸基を持つ化合物の場合には、例えば、室温下10mM過ヨウ素酸酸化によって前記化合物の水酸基からアルデヒド基を生じさせることができるため、CarboLink(ピアス社、カタログ番号:44900)などを使って作製することができる。また、活性型水素原子(交換可能な水素原子)を持つ化合物の場合には(例えば、コレステロール骨格を持ったエストラジオール17ベータなど)、前記化合物とホルムアルデヒトと担体に固定化されたアミノ基との3種間でマンニッヒ反応による濃縮反応を行うことにより、前記化合物を担体に固定化することができる。
担体に固定化する化合物の量は、特に限定されないが、担体1mlあたり0.1mgから数mg程度とすることが好ましい。
化合物が固定化された担体は、アフィニティークロマトグラフィー用の担体として用いることができ、適当なカラム(例えば、ポリプレップエンプティカラム(バイオラド社製、Cat No.731−1550)等)に充填することによって、化合物を固定化したアフィニティークロマトグラフィーカラムとして使用できる。また、化合物が固定化された担体は、適当なチューブ(例えば、エッペンドルフチューブ(エッペンドルフ社製)等)に加えることによって、使用することもできる。
同位体標識されたタンパク質群を、化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する。これにより、担体に固定化した化合物に結合する複数種のタンパク質を分画し、画分を得ることができる。本明細書において「担体を用いて」とは、母集団のタンパク質群を分画する際に、化合物が固定化された担体を利用して、という意味である。
以下、詳細に説明する。
初めに、適当な溶液で化合物が固定化された担体を平衡化する。平衡化する溶液は、特に限定されないが、タンパク質群を溶解することができ、かつ、変性させない溶液が望ましい。例えば、生理的pHに調製したリン酸緩衝液、Hepes緩衝液又はトリス緩衝液などが挙げられ、必要に応じて、これらに塩化ナトリウム及び/又は界面活性剤(n−オクチルグルコシドなど)を適当量加えることができる。
平衡化する工程は、化合物が固定化された担体が適当なカラムに充填されている場合には、適当な溶液をカラムにアプライすることによって、また、化合物が固定化された担体が、適当なチューブに加えられている場合には、適当な溶液をチューブに添加することによって、それぞれ行うことができる。
次に、同位体標識されたタンパク質群と化合物が固定化された担体とを接触させる。同位体標識されたタンパク質群と化合物が固定化された担体とを接触させる工程は、化合物が固定化された担体が適当なカラムに充填されている場合には、同位体標識されたタンパク質群をカラムに負荷することによって、また、化合物が固定化された担体が、適当なチューブに加えられている場合には、同位体標識されたタンパク質群をチューブに添加することによって、それぞれ行うことができる。
その後、化合物が固定化された担体を適当な溶液で洗浄することが望ましい。洗浄操作は、化合物が固定化された担体が、適当なカラムに充填されている場合には、適当な溶液をカラムに添加することによって、また、化合物が固定化された担体が、適当なチューブに加えられている場合には、適当な溶液をチューブに添加し、遠心操作をすることによって、それぞれ行うことができる。
そして、適当な溶出溶媒で同位体標識されたタンパク質群を溶出する。
試料の溶出は、溶出溶媒の強度を変化させて行うことができる。「強度」は「溶出力」ともいい、カラムに結合した試料を溶出させるための化学的強度を意味し、強度は溶出溶媒の濃度などにより影響される。従って、「強度を変化させて」とは、例えば連続的又は非連続的に溶媒の濃度勾配をかけることなどを意味する。溶出は、例えば、塩酸グアニディン、尿素などによりカラムに結合した試料を変性させる方法、KCl、NaClなどにより塩濃度を変化させる方法、pHを変化させる方法などにより行うことができる。
また、担体に固定化した化合物と同一又は類似の骨格を有する化合物を過剰量加えることにより、化合物に結合した試料を溶出することもできる。
同位体標識されたタンパク質群を溶出させる工程は、化合物が固定化された担体が、適当なカラムに充填されている場合には、適当な溶出溶液をカラムに負荷することによって、また、化合物が固定化された担体が、適当なチューブに加えられている場合には、適当な溶出溶液をチューブに添加し、遠心操作をすることによって、それぞれ行うことができる。
これらの方法により、担体に固定化した化合物に結合するタンパク質群を分画し、画分を得ることができる。
以上の操作温度は、特に限定されないが、4℃から37℃、さらには4℃から20℃で行うことが好ましい。
(b)第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する工程
本工程において、第二のタンパク質群は、内部標準画分用の試料である。
この工程は、上記工程(a)とは別に同位体標識されていない同一試料(第二のタンパク質群)について、前記化合物が固定された担体を用いて1又は複数の画分に分画するというものである。本発明の第一の態様では、同位体標識されたタンパク質群の画分を試験対象(解析対象)とし、同位体標識されていないタンパク質群の画分を内部標準画分として使用する。内部標準画分とは、測定系において基準となる画分を意味する。
本発明において、「同位体標識されていないタンパク質群」とは、同位体標識する行為を施していないタンパク質の集合をいう。
同位体標識されていないタンパク質群(第一の態様では第二のタンパク質群)は、例えば、組織、生体液、細胞、細胞器官及びタンパク質複合体などから得られた試料を用いることができる。
破砕する方法は、例えば、ダウンス型テフロンTM・ホモジナイザー、ポリトロン、ワーリング・ブレンダー、ポッター型ガラス・ホモジナイザー、超音波破砕装置、細胞溶解液(例えば、PIERCE社のM−PER:cat no.78501,T−PER:cat no.78510など)を用いる方法又は凍結融解法があげられ、好ましくは細胞溶解液を用いる方法があげられる。破砕した細胞は、遠心分離操作により、不溶性物質を除去することが好ましい。このようにして、同位体標識されていないタンパク質群を調製することができる。
また、同位体標識されていないタンパク質群は、化学合成により製造してもよい。
なお、同位体標識されたタンパク質群及び同位体標識されていないタンパク質群は、適当な条件、好ましくは−20℃以下、特に好ましくは−80℃以下で保存することができる。
本発明において、「同位体標識されていない(同位体非標識)タンパク質群」については、天然型試薬(同位体でない試薬)を用いて、「同位体標識されたタンパク質群」と同一の方法で調製することが好ましい。
本発明において、「同位体標識されていないタンパク質群」の代わりに「同位体標識されたタンパク質群」の同位体とは異なる同位体で標識されたタンパク質群(以下、「異なる同位体で標識されたタンパク質群」ともいう。)を用いることもできる。当該「異なる同位体で標識されたタンパク質群」中の同位体は、両タンパク質群由来の対応する各タンパク質の質量が異なるようにタンパク質を標識できる限り、「同位体標識されたタンパク質群」中の同位体とは別の同位体であってもよいし、同一の同位体を含んでいてもよい。
ここで、同位体標識されていないタンパク質群は、好ましくは、工程(a)で用いた担体と同じ担体を用いて分画することができる。これにより、担体に固定化した化合物に結合する複数種のタンパク質を分画し、画分を得ることができる。
試料の溶出は、溶出溶媒の強度を変化させて行うこともできるし、溶出溶媒の強度を変化させず一定の溶出力で行うこともできる。(b)第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する工程では、工程(a)と同じ溶出条件を選択することが望ましい。また、本明細書において、内分標準画分用の試料を分画して得られる画分の数は、実施例で示すように一つでもよい。
(c)工程(b)で得られた1の画分、又は工程(b)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を、工程(a)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する工程
この工程は、同位体標識されたタンパク質群を化合物が固定化された担体を用いて分画して得られた画分のそれぞれに、内部標準画分を添加する工程である。「添加」とは画分同士を混合することを意味する。
本工程において、内部標準画分は、「工程(b)で得られた1の画分」、又は工程(b)で得られた画分のうち、「全画分の混合物」もしくは「隣り合う複数個の画分の混合物」を意味する。「工程(b)で得られた1の画分」とは、工程(b)の分画操作により得られた画分が1つであったときのその画分を意味する。「全画分の混合物」とは、溶出された画分全部をひとつにまとめた混合物又は溶出された全部の画分のそれぞれ一定量をひとつにまとめた混合物を意味する。「隣り合う複数個の画分の混合物」とは、連続する隣りどうしの画分の複数個をひとつにまとめた混合物又は複数個の画分のそれぞれの一定量をひとつにまとめた混合物を意味する。
本発明において、内部標準画分用タンパク質試料を試験タンパク質試料(図2a1)と同様にして分画処理したときに5つの画分を得る場合(図2a2)を例に挙げて説明する。図2は、アフィニティー精製の溶出を例示してある。この画分をそれぞれ画分1〜画分5とすると、隣り合う画分の複数個とは、画分1と画分2、画分2と画分3、画分3〜画分5のように、隣りあう連続する画分を集めたものを意味する。「一定量」は、目的に応じて任意に設定することができ、各画分(例えば図2bの画分1〜5)に添加する量がいずれも同量となるようにすることが好ましい。また、内部標準画分用の試料を分画処理し1つの画分を得る場合も(図2a2’)、各画分(例えば図2bの画分1〜5)に添加する量がいずれも同量となるようにすることが好ましい。
(d)工程(c)で得られた画分を質量分析処理する工程
この工程は、工程(c)で得られた画分、すなわち同位体標識画分に内部標準画分を添加した後の混合物試料を質量分析処理する工程である。
混合物試料は、そのまま質量分析装置により分析してもよく、濃縮、分離などの前処理を行ってもよい。濃縮方法は、例えば、Amicon Ultra−15 10,000MWCOなどによる方法などがあげられる。分離方法は、例えば、電気泳動(例えば、二次元電気泳動、SDS−PAGEなど)及び各種クロマトグラフィー(例えば、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィーなど)等があげられる。
また、混合物試料は、消化を行ってもよい。消化方法には、酵素消化、化学分解等があげられ、好ましくは酵素消化である。酵素消化に用いる酵素としては、トリプシン、キモトリプシン、Lys−C,Asp−N,Glu−Cなどがあげられ、好ましくはトリプシンである。また、酵素消化の際には、界面活性剤、好ましくは5−cyclohexyl−pentyl−beta−D−maltoside(米国特許第5674987号明細書(US5674987)及び米国特許第5763586号明細書(US5763586)、アナトレース社(Anatrace Inc.,Maumee,OH,USA))を加えることが望ましい。
質量分析装置は、ガスクロマトグラフと結合された質量分析装置であるガスクロマトグラフィーマススペクトロメトリー(GC/MS)、あるいは液体クロマトグラフと結合された質量分析装置である液体クロマトグラフィーマススペクトロメトリー(LC/MS)等の汎用の装置があげられる。質量分析装置におけるイオン化方法は、例えば、MALDI(マトリックス支援レーザー脱離イオン化法)、ESI(エレクトロスプレーイオン化法)、EI(電子イオン化法)、CI(化学イオン化法)、APCI(大気圧化学イオン化法)、FAB(高速原子衝撃法)、LD、FD、SIMS、TSP等があげられ、好ましくはMALDI又はESIである。アナライザーは、例えば、TOF(飛行時間型)、イオントラップ、二重収束型、四重極型、フーリエ変換型等があげられる。
また、質量分析装置は、2台の直列に接続された質量分析計を有する装置(MS/MS)が好ましい。
質量分析装置による測定から質量分析スペクトルが得られる。質量分析スペクトルからは、タンパク質(又はペプチド)に由来するピークに関する情報を入手することができる。
また、質量分析装置による測定から得られたデータを、ソフトウェアを使用して、タンパク質のデータベースと照合することにより、試料中のタンパク質を同定することができる。ソフトウェアは、例えば、SonarMSMS(Genomic solution社製)、MASCOT(Matrix Science社製)、The Global Proteome Machine(GPM)(The Global Proteome Machine Organization,http://h451.thegpm.org/tandem/thegpm_tandem.html)などがあげられる。データベースとしては、例えば、NCBInr(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、IPI、Sprot等があげられる。質量分析装置による測定から得られたデータを用いて、タンパク質のデータベースと照合することにより、タンパク質を同定することができる(Nat Genet.1998:20,46−50;J Cell Biol.1998:141,967−977;J Cell Biol.2000:148,635−651;Nature.2002:415,141−147;Nature.2002:415,180−183;Curr Opin Cell Biol.2003:15,199−205;Curr Opin Cell Biol.2003:7,21−27)。また、同定されたタンパク質の情報から、アミノ酸配列情報を得ることができる。
(e)質量分析情報から、各画分について、工程(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと工程(b)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程
本発明において、「工程(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピーク」とは、質量分析装置による測定から得られる質量分析スペクトルにおいて、試験用タンパク質試料に由来するシグナル強度又はその総和(通常、面積で表されることは当業者であれば理解できる)をいう(以下、説明の便宜上単に「試験画分ピーク」と称する場合がある)。
また、「工程(b)で得られた画分中のタンパク質に由来するピーク」とは、質量分析装置による測定から得られる質量分析スペクトルにおいて、内部標準画分に由来するシグナル強度又はその総和をいう(以下、説明の便宜上単に「内部標準ピーク」と称する場合がある)。
質量分析装置による測定から得られたデータを用いて、各タンパク質について、試験画分ピークと内部標準ピークとの強度比(=「試験画分ピークの強度」/「内部標準ピークの強度」)(以下、単に「ピーク強度比」と称する場合がある)を求めることにより、複数種のタンパク質について、化合物に対する各タンパク質の結合力の強度を比較することができる。ここで、「化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する」とは、複数種類のタンパク質におけるピーク強度比を用いて、それぞれのタンパク質がどの画分に最も濃縮されたのかをタンパク質間で比較することにより、タンパク質とタンパク質との間において化合物に対する結合力を比較することを意味する。
同位体標識されたタンパク質は、同位体標識されていないタンパク質に比べ、同位体標識されている分子の分、分子量が大きくなり、同位体標識されたタンパク質とされていないタンパク質は、質量分析スペクトル上でペアのピークとして観測される(図2c)。異なる同位体で標識されたタンパク質群について質量分析を行った場合も、これらはペアのピークとして観測される。同位体標識されたタンパク質の分子量は、同定されたタンパク質及びそのアミノ酸配列から計算によって求めることができる。このピーク強度比を求めたとき、あるタンパク質が複数の画分にまたがって溶出されている場合、そのタンパク質は一番ピーク強度比が大きい画分にもっとも濃縮されて溶出されていることになる。そして、各画分において一番ピーク強度比が大きいタンパク質が、その画分に最も濃縮されたものと判断することができる。遅く溶出されてくる画分(溶出溶媒の強度が一番強い条件で溶出されてくる画分)に濃縮されているタンパク質ほど、担体に固定化された化合物に対する結合力が強いと判断することができる。
(2)第二の態様
本発明の方法の第二の態様は、化合物に対するタンパク質の結合力を解析するために以下の工程を含むものであり、内部標準画分用の試料が分画前に同位体標識されている態様である。
(a)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する工程
(b)同位体標識された第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する工程
(c)工程(b)で得られた1の画分、又は工程(b)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を、工程(a)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する工程
(d)工程(c)で得られた画分を質量分析処理する工程
(e)質量分析情報から、各画分について、工程(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと工程(b)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程
本発明の方法において、第二の態様では、上記第一の態様と同様にタンパク質群が分画される前に同位体標識されている。つまり、第一の態様では試験試料である第一のタンパク質群が同位体標識されていたのに対し、第二の態様では、内部標準画分用である第二のタンパク質群が同位体標識されている。それ以外の工程は、上記第一の態様と同様である。但し、第一のタンパク質群を、第二のタンパク質群を標識した同位体とは異なる同位体で標識してもよい。
(3)第三の態様
本発明の方法の第三の態様は、化合物に対するタンパク質の結合力を解析する方法であって、以下の工程を含むものであり、試験用タンパク質試料を分画後に標識する態様である。
(a)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する工程
(b)第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する工程
(c)工程(a)において得られた画分を標識する工程
(d)工程(b)で得られた1の画分、又は工程(b)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を、工程(c)で標識された画分のそれぞれに一定量添加する工程
(e)工程(d)で得られた画分を質量分析処理する工程
(f)質量分析情報から、各画分について、工程(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと工程(b)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程
上記第三の態様は、解析対象である第一のタンパク質群を分画した後、その分画後の画分(試験用画分)を標識する態様である。すなわち、図2a1において分画した後の画分(図2a1の画分1〜5)を標識するというものである。それ以外は、前記した第一の態様と同様である。
標識は、同一種のタンパク質について、第一のタンパク質群由来のタンパク質と第二のタンパク質群由来のタンパク質が、質量分析において区別し得る標識であればよく、前記した態様における同位体標識のほか、例えば、メチル化、エチル化、ビオチン化及びこれらの組合せなどがあげられる。このようなタンパク質の標識は、当業者であれば、公知の方法により実施することができる。
また、第一のタンパク質群と第二のタンパク質群とを異なる同位体で標識することも、他の標識物で標識することも可能である。
(4)第四の態様
本発明の方法の第四の態様は、化合物に対するタンパク質の結合力を解析する方法であって、以下の工程を含むものであり、内部標準画分用の試料を分画し、その分画後の内部標準画分を標識する態様である。
(a)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する工程
(b)第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する工程
(c)工程(b)で得られた1の画分、又は工程(b)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を標識する工程
(d)工程(c)で標識された画分又は混合物を、工程(a)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する工程
(e)工程(d)で得られた画分を質量分析処理する工程
(f)質量分析情報から、各画分について、工程(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと工程(b)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程
この第四の態様は、内部標準画分用のタンパク質試料を分画した後、溶出された全画分又は隣り合う複数個の画分をまとめてひとつの混合物とし、その混合物全体を標識するというものである。画分をまとめてひとつの混合物とする点については、前記「1.本発明の概要」の項又は上記「第一の態様」の項で説明したとおりである。但し、工程(c)において、画分全部(例えば図2では画分1〜5)を標識する必要はなく、一定量だけ各画分から採取し、その採取した画分を標識してもよい。また、分画により得られる画分の数が一つになるように溶出し、その画分の全量又は一定量を標識してもよい。また、各画分をまとめた混合物を標識してもよいし、各画分を標識してから混合物としてもよい。
標識は、同一種のタンパク質について、第一のタンパク質群由来のタンパク質と第二のタンパク質群由来のタンパク質が、質量分析において区別し得る標識であればよく、前記した態様における同位体標識のほか、例えば、メチル化、エチル化、ビオチン化及びこれらの組合せなどがあげられる。このようなタンパク質の標識は、当業者であれば、公知の方法により実施することができる。この態様の場合も、第一のタンパク質群と第二のタンパク質群とを異なる同位体で標識すること、あるいは他の標識物で標識することが可能である。
(5)第五の態様
本発明の方法の第五の態様は、化合物に対するタンパク質の結合力を解析する方法であって、以下の工程を含むものであり、試験用タンパク質試料および内部標準画分用の試料を分画後に定量する態様である。
(a1)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する工程
(a2)工程(a1)で得られた画分を質量分析処理する工程
(a3)工程(a2)で得られた質量分析の情報から工程(a1)で得られた画分中の各タンパク質を同定する工程
(a4)工程(a1)で得られた画分中の各タンパク質を定量する工程
(b1)第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する工程
(b2)工程(b1)で得られた1の画分、又は工程(b1)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を、質量分析処理する工程
(b3)工程(b2)で得られた質量分析の情報から工程(b2)に記載の1の画分又は混合物中の各タンパク質を同定する工程
(b4)工程(b2)に記載の1の画分又は混合物中の各タンパク質を定量する工程
(c)工程(a1)で得られた各画分について、工程(a4)で得られたタンパク質量と工程(b4)で得られたタンパク質量との比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程
この第五の態様は、解析対象である第一のタンパク質群を分画した後、その分画後の画分(試験用画分)を定量し、また、内部標準画分用のタンパク質試料を分画した後、溶出された全画分又は隣り合う複数個の画分をまとめてひとつの混合物とし、その混合物全体を定量するというものである。
以下、本発明の第五の態様について、詳細に記載する。
(a1)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する工程
当該工程は、上記第一の態様中、「(a)同位体標識された第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する工程」と同様の方法により、行うことができる。但し、第一のタンパク質群は、同位体標識されている必要はない。
(a2)工程(a1)で得られた画分を質量分析処理する工程
当該工程は、上記第一の態様中、「(d)工程(c)で得られた画分を質量分析処理する工程」と同様の方法により、行うことができる。
(a3)工程(a2)で得られた質量分析の情報から工程(a1)で得られた画分中の各タンパク質を同定する工程
当該工程は、上記第一の態様中、「(d)工程(c)で得られた画分を質量分析処理する工程」に記載された方法により、行うことができる。
(a4)工程(a1)で得られた画分中の各タンパク質を定量する工程
当該工程において、各タンパク質を定量する方法は、特に限定されないが、例えば、以下の方法により行うことができる。
まず、工程(a3)において、同定された各タンパク質について、検出されたペプチド数(Nobsd)および検出され得るペプチド数(Nobsbl)を算出する。
ここで、「検出されたペプチド数(Nobsd)」は、「(a2)工程(a1)で得られた画分を質量分析処理する工程」において、実際に検出されたペプチド数を意味する。検出されたペプチド数(Nobsd)は、質量分析のデータおよび同定されたタンパク質の配列情報をもとに算出することができる。検出されたペプチド数(Nobsd)は、質量分析のデータをもとに算出する場合、各タンパク質について質量分析で検出されたピークの数と一致する。
また、「検出され得るペプチド数(Nobsbl)」は、「(a2)工程(a1)で得られた画分を質量分析処理する工程」において、理論上検出され得るペプチド数を意味する。検出され得るペプチド数(Nobsbl)は、同定されたタンパク質の配列情報をもとに算出することができる。各タンパク質について、上記工程における濃縮、分離(例えばHPLCによる分離)又は消化などの操作によって理論的に生じるペプチド数を配列情報をもとに算出し、質量分析で検出され得るペプチド数(Nobsbl)を求めることができる。例えば、トリプシンによる消化操作を行った試料を質量分析する場合は、トリプシンによりリシン、アルギニンのカルボキシル側でペプチド鎖が切断されるため、各タンパク質の配列情報から切断により生じるペプチド数が予測できる。場合によっては、質量分析器の測定範囲も考慮して、検出され得るペプチド数(Nobsbl)を求めることができる。
次に、上記の検出され得るペプチド数(Nobsbl)と検出されたペプチド数(Nobsd)とを用いて各タンパク質を定量するために、以下の式(I)にしたがって、EMPAI(exponentially modified protein abundance index)を設定し、算出する。
式(I):
EMPAI=10Nobsd/Nobsbl−1
EMPAIは、タンパク質混合物中のタンパク質含有量に比例する指数である。
さらに、以下の式(II)にしたがって、タンパク質含有率(mol%)を算出することができる。
式(II):
ここで、Σ(EMPAI)は、すべての同定されたタンパク質のEMPAIの和を表す。
また、以下の式(III)にしたがって、タンパク質含有率(重量%)を算出することができる。
式(III):
ここで、MWは、同定された各タンパク質の分子量を表す。Σ(EMPAI×MW)は、すべての同定されたタンパク質のEMPAI×MWの和を表す。
各タンパク質の分子量は、アミノ酸配列から算出することができる。また、工程(a1)で得られた画分中のタンパク質の総重量は、既存の方法、例えば、Lowry法、Bradford法、280nmの吸光度測定などの方法によって容易に測定することができる。そうすると、工程(a1)で得られた画分中のタンパク質の総重量および上記で求めたタンパク質含有率から、各タンパク質を定量することができる。
よって、上記方法により、各タンパク質を定量することができる。
各タンパク質を定量する工程は、コンピュータを用いてもよい。
(b1)第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する工程
当該工程は、上記第一の態様中、「(b)第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する工程」と同様の方法により、行うことができる。
(b2)工程(b1)で得られた1の画分、又は工程(b1)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を、質量分析処理する工程
本工程において、「工程(b1)で得られた1の画分」、「全画分の混合物」、「隣り合う複数個の画分の混合物」は、上記「第一の態様」の項で説明した「工程(b)で得られた1の画分」、「全画分の混合物」、「隣り合う複数個の画分の混合物」のとおりである。また、当該工程は、上記第一の態様中、「(d)工程(c)で得られた画分を質量分析処理する工程」と同様の方法により、行うことができる。
(b3)工程(b2)で得られた質量分析の情報から工程(b1)に記載の1の画分又は混合物中の各タンパク質を同定する工程
当該工程は、上記第一の態様中、「(d)工程(c)で得られた画分を質量分析処理する工程」に記載された方法により、行うことができる。
(b4)工程(b2)に記載の1の画分又は混合物中の各タンパク質を定量する工程
当該工程は、上記「(a4)工程(a1)で得られた画分中の各タンパク質を定量する工程」と同様の方法により、行うことができる。
(c)工程(a1)で得られた各画分について、工程(a4)で得られたタンパク質量と工程(b4)で得られたタンパク質量との比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程
当該工程は、工程(a3)および工程(b3)で同定された各タンパク質について、工程(a1)で得られた各画分中のタンパク質量および工程(b2)に記載の1の画分又は混合物中のタンパク質量の比(=「工程(a4)で得られたタンパク質量」/「工程(b4)で得られたタンパク質量」)を求めることにより、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較することができる。
すなわち、タンパク質量の比を求める第五の態様において、あるタンパク質が工程(a1)で得られた複数の画分にまたがって溶出されている場合、そのタンパク質は一番タンパク質量の比が大きい画分にもっとも濃縮されて溶出されていることになる。そして、各画分において一番タンパク質量の比が大きいタンパク質が、その画分に最も濃縮されたものと判断することができる。遅く溶出されてくる画分(溶出溶媒の強度が一番強い条件で溶出されてくる画分)に濃縮されているタンパク質ほど、担体に固定化された化合物に対する結合力が強いと判断することができる。
本発明の第五の態様における方法は、各タンパク質について同位体標識する必要がないことに特徴を有する。
(6)第六の態様
本発明の方法の第六の態様は、化合物に対するタンパク質の結合力を解析する方法であって、以下の工程を含むものであり、試験用タンパク質試料および内部標準画分用の試料を分画後に各タンパク質のEMPAIを算出する態様である。
(a1)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する工程
(a2)工程(a1)で得られた画分を質量分析処理する工程
(a3)工程(a2)で得られた質量分析の情報から工程(a1)で得られた画分中の各タンパク質を同定する工程
(a4)工程(a1)で得られた画分中の各タンパク質のEMPAIを算出する工程
(b1)第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する工程
(b2)工程(b1)で得られた1の画分、又は工程(b1)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を、質量分析処理する工程
(b3)工程(b2)で得られた質量分析の情報から工程(b2)に記載の1の画分又は混合物中の各タンパク質を同定する工程
(b4)工程(b2)に記載の1の画分又は混合物中の各タンパク質のEMPAIを算出する工程
(c)工程(a1)で得られた各画分について、工程(a4)で得られたEMPAIと工程(b4)で得られたEMPAIとの比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程
前述のとおり、EMPAIは、タンパク質混合物中のタンパク質含有量に比例する指数である。よって、工程(a3)および工程(b3)で同定された各タンパク質について、工程(a1)で得られた各画分中のタンパク質のEMPAIと、工程(b2)に記載の1の画分又は混合物中のタンパク質のEMPAIとの比(=「工程(a4)で得られたEMPAI」/「工程(b4)で得られたEMPAI」)を求めることにより、複数種のタンパク質について、化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較することができる。
すなわち、EMPAIの比を求める第六の態様において、あるタンパク質が複数の画分にまたがって溶出されている場合、そのタンパク質はEMPAIの比が大きい画分にもっとも濃縮されて溶出されていることになる。そして、各画分において一番EMPAIの比が大きいタンパク質が、その画分に最も濃縮されたものと判断することができる。遅く濃縮されてくる画分に濃縮されているタンパク質ほど、担体に固定化された化合物に対する結合力が強いと判断することができる。
上記のとおり、本発明の解析方法の第一〜第六の態様では、内部標準画分用の試料について、化合物が固定化された担体によって分画する方法について示したが、内部標準画分用の試料について、化合物が固定化された担体によって分画せずに用いる態様も本発明に含まれる。
(7)第七の態様
本発明の方法の第七の態様は、化合物に対するタンパク質の結合力を解析するために以下の工程を含むものである。
(a)同位体標識された第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する工程
(b)第二のタンパク質群を、工程(a)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する工程
(c)工程(b)で得られた画分を質量分析処理する工程
(d)質量分析情報から、各画分について、工程(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと第二のタンパク質群中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程
第七の態様は、第一の態様において、内部標準用画分である第二のタンパク質群を、化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画せずに工程(a)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する方法である。それ以外の工程は、第一の態様と同様である。
(8)第八の態様
本発明の方法の第八の態様は、化合物に対するタンパク質の結合力を解析するために以下の工程を含むものである。
(a)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する工程
(b)同位体標識された第二のタンパク質群を、工程(a)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する工程
(c)工程(b)で得られた画分を質量分析処理する工程
(d)質量分析情報から、各画分について、工程(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと第二のタンパク質群中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程
第八の態様は、第二の態様において、内部標準用画分である同位体標識された第二のタンパク質群を、化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画せずに工程(a)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する方法である。それ以外の工程は、第二の態様と同様である。
(9)第九の態様
本発明の方法の第九の態様は、化合物に対するタンパク質の結合力を解析するために以下の工程を含むものである。
(a)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する工程
(b)工程(a)で得られた画分を標識する工程
(c)第二のタンパク質群を、工程(b)で標識された画分のそれぞれに一定量添加する工程
(d)工程(c)で得られた画分を質量分析処理する工程
(e)質量分析情報から、各画分について、工程(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと第二のタンパク質群中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程
第九の態様は、第三の態様において、内部標準用画分である第二のタンパク質群を、化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画せずに工程(b)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する方法である。それ以外の工程は、第三の態様と同様である。
(10)第十の態様
本発明の方法の第十の態様は、化合物に対するタンパク質の結合力を解析するために以下の工程を含むものである。
(a1)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する工程
(a2)工程(a1)で得られた画分を質量分析処理する工程
(a3)工程(a2)で得られた質量分析の情報から工程(a1)で得られた画分中の各タンパク質を同定する工程
(a4)工程(a1)で得られた画分中の各タンパク質を定量する工程
(b1)第二のタンパク質群を質量分析処理する工程
(b2)工程(b1)で得られた質量分析の情報から第二のタンパク質群中の各タンパク質を同定する工程
(b3)第二のタンパク質群中の各タンパク質を定量する工程
(c)工程(a1)で得られた各画分について、工程(a4)で得られたタンパク質量と工程(b3)で得られたタンパク質量との比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程
第十の態様は、第五の態様において、第二のタンパク質群を、化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画せずに第二のタンパク質群中の各タンパク質を定量する方法である。それ以外の工程は、第五の態様と同様である。
(11)第十一の態様
本発明の方法の第十一の態様は、化合物に対するタンパク質の結合力を解析するために以下の工程を含むものである。
(a1)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する工程
(a2)工程(a1)で得られた画分を質量分析処理する工程
(a3)工程(a2)で得られた質量分析の情報から工程(a1)で得られた画分中の各タンパク質を同定する工程
(a4)工程(a1)で得られた画分中の各タンパク質のEMPAIを算出する工程
(b1)第二のタンパク質群を質量分析処理する工程
(b2)工程(b1)で得られた質量分析の情報から第二のタンパク質群中の各タンパク質を同定する工程
(b3)第二のタンパク質群中の各タンパク質のEMPAIを算出する工程
(c)工程(a1)で得られた各画分について、工程(a4)で得られたEMPAIと工程(b3)で得られたEMPAIとの比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程
第十一の態様は、第六の態様において、第二のタンパク質群を、化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画せずに第二のタンパク質群中の各タンパク質のEMPAIを算出する方法である。それ以外の工程は、第六の態様と同様である。
3.解析システム
本発明の解析システムは、化合物に対するタンパク質の結合力を解析する方法を実行するためのシステムであり、以下の手段を含むものである。
(1)試料を分画前に同位体標識する態様
(a)同位体標識された第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する手段
(b)第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する手段
(c)手段(b)で得られた1の画分、又は手段(b)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を、手段(a)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する手段
(d)手段(c)で得られた画分を質量分析処理する手段
(e)質量分析情報から、各画分について、手段(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと手段(b)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する手段
(2)内部標準画分用試料を分画前に同位体標識する態様
(a)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する手段
(b)同位体標識された第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する手段
(c)手段(b)で得られた1の画分、又は手段(b)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を、手段(a)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する手段
(d)手段(c)で得られた画分を質量分析処理する手段
(e)質量分析情報から、各画分について、手段(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと手段(b)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する手段
(3)試料を分画後標識する態様
(a)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する手段
(b)第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する手段
(c)手段(a)で得られた両分を標識する手段
(d)手段(b)で得られた1の画分、又は手段(b)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を、手段(c)で標識された画分のそれぞれに一定量添加する手段
(e)手段(d)で得られた画分を質量分析処理する手段
(f)質量分析情報から、各画分について、手段(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと手段(b)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する手段
(4)内部標準画分用試料を分画後、標識する態様
(a)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する手段
(b)第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する手段
(c)手段(b)で得られた1の画分、又は手段(b)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を標識する手段
(d)手段(c)で標識された画分又は混合物を、手段(a)で画分のそれぞれに一定量添加する手段
(e)手段(d)で得られた画分を質量分析処理する手段
(f)質量分析情報から、各画分について、手段(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと手段(b)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する手段
(5)試験用タンパク質試料および内部標準画分用の試料を分画後に定量する態様
(a1)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する手段
(a2)手段(a1)で得られた画分を質量分析処理する手段
(a3)手段(a2)で得られた質量分析の情報から手段(a1)で得られた画分中の各タンパク質を同定する手段
(a4)手段(a1)で得られた画分中の各タンパク質を定量する手段
(b1)第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する手段
(b2)手段(b1)で得られた1の画分、又は手段(b1)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を、質量分析処理する手段
(b3)手段(b2)で得られた質量分析の情報から手段(b2)に記載の1の画分又は混合物中の各タンパク質を同定する手段
(b4)手段(b2)に記載の1の画分又は混合物中の各タンパク質を定量する手段
(c)手段(a1)で得られた各画分について、手段(a4)で得られたタンパク質量と手段(b4)で得られたタンパク質量との比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する手段
(6)試験用タンパク質試料および内部標準画分用の試料を分画後に各タンパク質のEMPAIを算出する態様
(a1)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する手段
(a2)手段(a1)で得られた画分を質量分析処理する手段
(a3)手段(a2)で得られた質量分析の情報から手段(a1)で得られた画分中の各タンパク質を同定する手段
(a4)手段(a1)で得られた画分中の各タンパク質のEMPAIを算出する手段
(b1)第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する手段
(b2)手段(b1)で得られた1の画分、又は手段(b1)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を、質量分析処理する手段
(b3)手段(b2)で得られた質量分析の情報から手段(b2)に記載の1の画分又は混合物中の各タンパク質を同定する手段
(b4)手段(b2)に記載の1の画分又は混合物中の各タンパク質のEMPAIを算出する手段
(c)手段(a1)で得られた各画分について、手段(a4)で得られたEMPAIと手段(b4)で得られたEMPAIとの比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する手段
上記の本発明のシステムの態様では、内部標準画分用の試料について、化合物が固定化された担体によって分画するシステムについて示した。本発明には、以下に示すように、内部標準画分用の試料について、化合物が固定化された担体によって分画せずに用いる態様も含まれる。
(7)(1)のシステムの態様において、内部標準用画分である第二のタンパク質群を、化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画せずに手段(a)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する態様
(a)同位体標識された第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する手段
(b)第二のタンパク質群を、手段(a)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する手段
(c)手段(b)で得られた画分を質量分析処理する手段
(d)質量分析情報から、各画分について、手段(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと第二のタンパク質群中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する手段
(8)(2)のシステムの態様において、内部標準用画分である同位体標識された第二のタンパク質群を、化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画せずに手段(a)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する態様
(a)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する手段
(b)同位体標識された第二のタンパク質群を、手段(a)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する手段
(c)手段(b)で得られた画分を質量分析処理する手段
(d)質量分析情報から、各画分について、手段(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと第二のタンパク質群中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する手段
(9)(3)のシステムの態様において、内部標準用画分である第二のタンパク質群を、化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画せずに手段(b)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する態様
(a)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する手段
(b)手段(a)で得られた画分を標識する手段
(c)第二のタンパク質群を、手段(b)で標識された画分のそれぞれに一定量添加する手段
(d)手段(c)で得られた画分を質量分析処理する手段
(e)質量分析情報から、各画分について、手段(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと第二のタンパク質群中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する手段
(10)(5)のシステムの態様において、第二のタンパク質群を、化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画せずに第二のタンパク質群中の各タンパク質を定量する態様
(a1)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する手段
(a2)手段(a1)で得られた画分を質量分析処理する手段
(a3)手段(a2)で得られた質量分析の情報から手段(a1)で得られた画分中の各タンパク質を同定する手段
(a4)手段(a1)で得られた画分中の各タンパク質を定量する手段
(b1)第二のタンパク質群を質量分析処理する手段
(b2)手段(b1)で得られた質量分析の情報から第二のタンパク質群中の各タンパク質を同定する手段
(b3)第二のタンパク質群中の各タンパク質を定量する手段
(c)手段(a1)で得られた各画分について、手段(a4)で得られたタンパク質量と手段(b3)で得られたタンパク質量との比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する手段
(11)(6)のシステムの態様において、第二のタンパク質群を、化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画せずに第二のタンパク質群中の各タンパク質のEMPAIを算出する態様
(a1)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する手段
(a2)手段(a1)で得られた画分を質量分析処理する手段
(a3)手段(a2)で得られた質量分析の情報から手段(a1)で得られた画分中の各タンパク質を同定する手段
(a4)手段(a1)で得られた画分中の各タンパク質のEMPAIを算出する手段
(b1)第二のタンパク質群を質量分析処理する手段
(b2)手段(b1)で得られた質量分析の情報から第二のタンパク質群中の各タンパク質を同定する手段
(b3)第二のタンパク質群中の各タンパク質のEMPAIを算出する手段
(c)手段(a1)で得られた各画分について、手段(a4)で得られたEMPAIと手段(b3)で得られたEMPAIとの比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する手段
(12)本発明のシステムの詳細
図3は、本発明のシステムの構成例を示すブロック図である。図3の例において、本発明のシステムは、制御ユニット301、タンパク質分画ユニット302、タンパク質混合ユニット303及び質量分析ユニット304からなる。
制御ユニット301は、本発明の方法を実行するために必要な各ユニットの動作全体を制御する。タンパク質分画ユニット302、タンパク質混合ユニット303及び質量分析ユニット304は、制御ユニット301にそれぞれ接続され、互いに独立して、又は各ユニットと連携して実行するように制御ユニット301により制御される。例えば、本発明の方法を主としてバッチ式で実行するときは、各ユニット(タンパク質分画ユニット302、タンパク質混合ユニット303及び質量分析ユニット304)はそれぞれ独立して制御され、制御ユニット301はそれぞれのユニットが実行する内容を指示する。また、本発明の方法を主として連続的に流れ作業として実行するときは、制御ユニット301は、それぞれのユニットの実行内容、例えば各ユニットの進行状況を監視し、各ユニットは連携して制御される。
タンパク質分画ユニット302は、カラム内の担体に固定化された化合物に結合したタンパク質を溶出させるためのユニットであり、第一のタンパク質群を複数の画分に分画するための担体、第二のタンパク質群を1又は複数の画分に分画するための担体、細胞培養器、細胞破砕器、担体に結合した化合物の溶出処理器、溶出画分(分画されたタンパク質)の回収器などを備える。分画ユニットに含まれる各構成要素は、制御ユニット301の指令に従って、独立して、又は各構成要素と互いに連携して制御される。
タンパク質混合ユニット303は、タンパク質分画ユニット302により分画されたタンパク質を混合するユニットであり、例えば、上記第一の態様の場合は、同位体標識した第一のタンパク質群試料由来の画分に、第二のタンパク質群試料由来の1の画分又は全画分の混合物若しくは隣り合う画分の複数個の混合物の一定量を添加する工程を制御する。タンパク質混合ユニット303は制御ユニット301に接続されており、添加する量などの指令を制御ユニット301から受けて混合処理する。
質量分析ユニット304は、上記混合されたタンパク質を質量分析にかけるユニットであり、混合されたタンパク質を測定用プレートにスポットするためのスポッター、当該測定プレートを質量分析器にかけるためのトレー等を備える。質量分析ユニット304におけるこれらの構成要素は制御ユニット301に接続されており、制御ユニット301の指令に従って質量分析処理を実行する。
図4は、上記各ユニットの一態様を例示する模式図である。
図4において、タンパク質分画ユニット302は、例えば、培養装置11a及び11b、培養液ボトル12a及び12b、細胞破砕器13a及び13b、標識装置14、化合物が固定化された担体15a及び15b、タンパク質分画用制御装置(以下「制御装置」ともいう)16a及び16b、精製タンパク質分取器17a及び17b、混合器17cなどを備える。
培養装置11a及び11bは、細胞培養を行うための装置であり、温度、CO2濃度などを調節して細胞を所定時間培養する。培養装置11a及び11bには、それぞれ培養液ボトル12a及び12bが接続されており、それぞれチューブ1a及び1bを介して各培養装置に培養液を供給してもよい。培養装置11a及び11bには、それぞれ攪拌羽根2a、2bを供えてもよい。培養装置11a及び11bは、浮遊細胞を培養するための容器として例示してあるが、これは本発明のシステムを説明するための一態様であり、限定されるものではない。従って、培養プレートに付着する細胞を培養する場合は、当業者は目的に応じた培養容器を選択することができる。培養装置11a及び11bは、LAN100を経由して制御ユニット301に接続される。
培養液ボトル12a及び12bは、細胞を培養するための培養液を貯蔵する容器である。本発明の第一の態様および第七の態様では、培養液ボトル12aには、第一のタンパク質を同位体標識するためのアミノ酸などが混合される。図4に示すように、標識装置14を培養液ボトル12aに接続することもできる。培養液ボトル12a及び12bは、LAN100を介して制御ユニット301に接続されていてもよい。
細胞破砕器13a及び13bは、培養された細胞を破砕してタンパク質を得るための装置であり、培養装置11a、11bから細胞を回収して細胞を破砕し、タンパク質の懸濁液を得る工程を実行する。細胞破砕器13a及び13bは、LAN100を介して制御ユニット301に接続されていてもよい。
標識装置14は、タンパク質試料又は分画されたタンパク質画分を標識(例えば同位体標識)するための装置である。図4は、分画する前にタンパク質試料を標識する態様として培養液ボトル12aに標識装置14が接続されている態様を例示する。本発明において第二の態様は、内部標準画分用の試料を分画前に同位体標識するものであるため、標識装置14は、内部標準画分用試料を培養するための培養液(培養液ボトル12b)に接続することができる。
本発明において第八の態様は、内部標準画分用の試料を第一のタンパク質群由来の画分に添加する前に同位体標識するものであるため、標識装置14は、内部標準画分用試料を培養するための培養液(培養液ボトル12b)に接続することができる。
また、本発明において第三及び第四の態様は、試験試料又は内部標準画分用試料を分画後に標識するものであるため、標識装置14は、試験試料を標識するときは担体15aと制御装置16aとの間、制御装置16aと精製タンパク質分取器17aとの間、又は精製タンパク質分取器17aに続いて接続することができ、あるいは内部標準画分用試料を標識するときは担体15bと制御装置16bとの間、制御装置16bと精製タンパク質分取器17bとの間、又は精製タンパク質分取器17b若しくは混合器17cに続いて接続することができる。
本発明において第九の態様は、試験試料を分画後に標識するものであるため、標識装置14は、担体15aと制御装置16aとの間、制御装置16aと精製タンパク質分取器17aとの間、又は精製タンパク質分取器17aに続いて接続することができる。
但し、本発明においては、標識装置14の接続の態様は、上記の態様に限定されるものではなく、本発明の目的達成のために別の態様とし得ることは、当業者であれば容易に理解できる。標識装置14は、LAN100を介して制御ユニット301に接続されていてもよい。
なお、本発明において第五、第六、第十及び第十一の態様は、タンパク質について標識する必要がないため、タンパク質分画ユニット302は標識装置14を備えなくてもよい。
担体15a及び15bは、タンパク質を精製するためのカラムであり、タンパク質との結合力を有する物質が担体に固定されている。
制御装置16a及び16bは、制御ユニット301からの指令に従って、タンパク質をそれぞれ化合物が固定化された担体15a、15bに導入するとともに、溶出溶媒を通過させて溶出されたタンパク質画分を精製タンパク質分取器17a、17bに送る工程を実行する。ここで、溶出溶媒は、溶媒濃度がグラジエント勾配となるように担体に流すこともでき、段階的に濃度が設定された溶媒を流すこともできる。制御装置16a及び16bは、LAN100を介して制御ユニット301に接続されていてもよい。
精製タンパク質分取器17a及び17bは、一方の分画工程で得られたタンパク質と、他方の分画工程で得られたタンパク質とを分取し、画分を得るための装置であり、場合によっては画分を一時貯蔵することもできる。内部標準用タンパク質画分は、その全部、又は隣り合う画分の複数個を混合するための混合器17cを備えることができる。
なお、図4では1種類の分画工程を示しているが、システムを複数並列させて複数種類の分画工程を実行することができるようにし、その結果、複数種類の異なる細胞由来のタンパク質を分画することもできる。
図4は、精製タンパク質分取器17a及び17bが、制御装置16a及び16bにより制御される態様を示しているが、これに限定されるものではなく、独立して、LAN100を介して制御ユニット301に接続されていてもよい。
また、本発明の第七、第八、第九、第十および第十一の態様は、内部標準画分用の試料について、化合物が固定化された担体によって分画せずに用いる態様であるため、タンパク質分画ユニット302は担体15b、制御装置16b、精製タパク質分取器17bおよび混合器17cを備える必要はない。
図4において、タンパク質混合ユニット303は、タンパク質分画ユニット302において分画された第一のタンパク質群由来の画分に、第二のタンパク質群由来の画分を添加するユニットである。タンパク質混合ユニット303は、制御ユニット301からの指令に従って、精製タンパク質分取器17aに配列された画分を選択して、精製タンパク質分取器17b又は混合器17cに配列された画分の一定量を添加する。図4は、溶出された画分1〜画分5(精製タンパク質分取器17aからの画分)を含むそれぞれのチューブ(チューブ18−1〜18−5)に、精製タンパク質分取器17bの画分1〜画分3の混合物を混合器17cから添加する態様を例示してある。
また、本発明の第五、第六、第十および第十一の態様は、第一のタンパク質群由来の画分に、第二のタンパク質群由来の画分または第二のタンパク質群を添加することなく、それぞれの画分またはタンパク質群を質量分析処理する態様であるため、タンパク質混合ユニット303を経ずに、タンパク質分画ユニット302から質量分析ユニット304に進むことができる。したがって、これらの態様では、本発明のシステムは、タンパク質混合ユニット303を備えなくてもよい。
質量分析ユニット304は、質量分析の対象となる1つ又は複数種のタンパク質試料を解析するユニットである。質量分析ユニット304は、制御ユニット301の指令に従って、タンパク質混合ユニット303により混合された試料を質量分析用のプレート19にスポットし、質量分析処理装置20により質量分析処理を実行する。プレート19を質量分析処理装置20に移送するには、コンピュータ制御のロボット型試料取扱装置を用いることもできる。
質量分析は、LAN100を介して制御ユニット301の指令に従って実行される。質量分析処理は、質量分析処理装置20に付属のコンピュータ21を設置して実行させることも可能である。
質量分析処理の情報は、LAN100を介して制御ユニット301に送信され、タンパク質の同定プロファイル、強度比プロファイル、結合力の比プロファイル、質量比プロファイル、EMPAI比プロファイルを得るための処理に付される。
制御ユニット301は、本発明のシステムを実行させるための中央制御ユニットであり、中央コンピュータ30、インターネット通信回線等を備える。
制御ユニット301は、タンパク質の同定を実行するとともに、同位体標識ピークと非標識ピークとの強度比及び結合力の比を決定し、制御ユニット301内の表示装置に表示する。あるいは、制御ユニット301は、同定したタンパク質の情報から指標EMPAIを用いて試験画分中と内部標準画分中の各タンパク質量比又はEMPAI比を決定し、制御ユニット301内の表示装置に表示する。各データは、制御ユニット301により自動整理される。
図5は、制御ユニット301の詳細構成図の一例である。図5において、中央コンピュータ30は、CPU501、送信/受信部502、入力部503、出力部504、ROM505、RAM506、ハードディスクドライブ(HDD)507、CD−ROMドライブ508及びタンパク質データベース(以下「DB」という)509を備える。
CPU501は、本発明のシステム全体の動作を制御するとともに、質量分析結果のデータ、同定されたタンパク質データ、強度比データ、結合力データ等をDB509に記録する。CPU501は、送信/受信部502の通信を制御し、DB509に記憶されているデータを利用して、インターネット511を介して他のタンパク質のデータと照合することもできる。
送信/受信部502は、CPU501の指令に従って、タンパク質分画ユニット302、タンパク質混合ユニット303又は質量分析ユニット304との間でデータの送信及び受信処理を行う。
入力部503は、キーボード、マウス、タッチパネル等であり、ユーザからの情報入力時、データベースの内容更新時等に操作される。出力部504はLCD(液晶ディスプレイ)等であり、各種データベースの更新時等にCPU501からのコードデータをその都度表示用データに変換して表示処理を行う。ROM505は、本発明のシステムの処理プログラムを格納する。RAM506は、本発明のシステムの処理に必要なデータを一時的に格納する。HDD507は、質量分析データ等を格納するためのドライブである。CD−ROMドライブ508は、CPU501からの指令に従って、CD−ROM510に格納されている、本発明のシステムの実行(各種態様の実行)に必要なプログラム等を読み出してRAM506等に書き込む。CD−ROMの代わりに記録媒体として書き換え可能なCD−R、CD−RW等を用いることもできる。その場合には、CD−ROMドライブ508の代わりにCD−R又はCD−RW用ドライブを設ける。また、上記媒体の他に、DVD、MO、フラッシュメモリースティック等の媒体を用い、それに対応するドライブを備える構成としても良い。
中央コンピュータ30は、タンパク質群の分画ユニット302、混合ユニット303、質量分析ユニット304と通信し、これらのユニットが機能するように、制御情報を送信するとともに、タンパク質の同定結果及びタンパク質の質量分析結果を受信して同定結果、強度比、結合力比、タンパク質量比、EMPAI比などの同定結果を表示する。
以下、制御ユニットの動作(第一の態様)の例を、図面(図6)を用いて説明する。
制御ユニット301の中央コンピュータ30は、本発明の実施に必要な培養液、タンパク質試料(細胞)、その他の試薬を一方の培養装置11aに充填するよう充填装置に命令するとともに、タンパク質の標識に必要な同位体標識物質(同位体標識されたアミノ酸等)を添加するよう標識装置14に命令し、標識装置14は同位体標識物質の添加を実行する(S601a)。これと並行して、中央コンピュータ30は、本発明の実施に必要な培養液、試料(細胞)その他の試薬を他方の培養装置11bに充填するよう、試薬充填装置(図示せず)に命令し、充填装置(図示せず)は充填を実行する(S601b)。各培養装置11a、11bへの培養液等の充填が完了すると、中央コンピュータ30は次に、所定条件で培養するよう各培養装置11a、11bに命令し、各培養装置11a、11bは培養を実行する(S602a、S602b)。
「所定条件」としては、培養時間、培養温度、CO2濃度、攪拌の有無などが挙げられる。所定条件での培養が終了した後、中央コンピュータ30は、細胞破砕工程を実施するよう、細胞破砕器13a、13bに命令し、各細胞破砕器13a、13bは細胞破砕を実行する(S603a、S603b)。S603aにより同位体標識物質含有培地から採取された細胞を破砕した後は、次に、中央コンピュータ30は所定の物質(化合物)が固定化された担体15aにタンパク質分画工程を実施するよう命令し、当該担体はタンパク質(試験用の第一のタンパク質群)の分画を実行する(S604a)。他方、S603bにより同位体を含有しない培地から採取された細胞を破砕した後は、次に、中央コンピュータ30は所定の化合物が固定化された担体15bにタンパク質分画工程を実施するよう命令し、当該担体はタンパク質(内部標準用の第二のタンパク質群)の分画を実行する(S604b)。タンパク質の分画が完了すると、中央コンピュータ30は、後に実施する混合(S606、S607)に備えて、タンパク質分画用制御装置16a及び16bに、タンパク質試料を精製タンパク質分取器17a、17bにて分取後、一時保存するよう命令し、当該制御装置は分取及び一時保存を実行する(S605a、S605b)。但し、当該一時保存を実行するか否かは任意である。次に、中央コンピュータ30は、内部標準用の第二のタンパク質群由来の画分の全部を混合するよう命令するか、あるいは隣り合う画分の複数個を混合するよう混合器17cに命令し、混合器17cはタンパク質画分の混合を実行する(S606)。但し、分画された画分が1つのときは、混合器17cによる第二のタンパク質群由来の画分の混合は行われない。その後、中央コンピュータ30は、タンパク質混合ユニット303に対し、試験用タンパク質画分のそれぞれに内部標準用タンパク質画分を添加するよう命令し、タンパク質混合ユニット303は一定量の内部標準用タンパク質画分を試験用タンパク質画分のそれぞれに添加混合する(S607)。
S607において混合が完了すると、中央コンピュータ30は、質量分析のための試料を調製するよう命令する(S608)。但し、当該調製を実行するか否かは任意である。次に中央コンピュータ30は、スポッター(図示せず)が調製後の試料を質量分析用プレート(例えば図4のプレート19)にスポットし、続いて質量分析装置が試料の質量分析を開始するよう命令し、スポッターはスポットを実行し、質量分析装置はその分析を実行する(S609)。
中央コンピュータ30は、タンパク質を同定するとともに(S610)、各タンパク質の標識ピークと非標識ピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の結合力の比を定量する(S611)。タンパク質の同定結果、強度比のデータは中央コンピュータ30に報告され、出力装置又はコンピュータのディスプレイは、当該同定結果及び強度比を表示するとともに(S612)、ある化合物に結合しうるタンパク質の結合の強さについて序列を作成する。
中央コンピュータ30は、強度比及び同定結果のデータを既存の情報と照会するとともに、ハードディスクに蓄積してデータベース化を実行する(S613)。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
なお、本明細書において引用した文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、2005年7月29日に出願し、本願優先権主張の基礎となる特願JP2005−222097号の特許請求の範囲、明細書、図面及び要約書の開示内容は、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。
本発明において用いる用語「タンパク質」は、二以上のアミノ酸がペプチド結合によって結合したペプチドを含む。また、タンパク質には、生理的な修飾を受けているもの(例えば、リン酸化タンパク質、糖鎖結合タンパク質等)も含まれる。また、本発明において用いる用語「タンパク質群」は、二種以上のタンパク質を含む集団をいう。
本発明において用いる用語「標識されたタンパク質」とは、タンパク質を構成する分子の一部が標識されたタンパク質をいう。特に、同位体で標識されたタンパク質を「同位体標識されたタンパク質」という。また、本発明において用いる用語「同位体標識されたタンパク質群」とは、二種以上の同位体標識されたタンパク質を含む集合をいう。
本発明において用いる用語「代謝的に同位体標識されたタンパク質」とは、同位体標識された当該タンパク質の前駆体(例えば、アミノ酸)を加えることにより、代謝的にタンパク質を構成する分子の一部が同位体で標識されたタンパク質をいう。また、本発明において用いる用語「代謝的に同位体標識されたタンパク質群」とは、二種以上の代謝的に同位体標識されたタンパク質を含む集合をいう。前記「代謝的に」とは、酵素反応などを介した生理的条件を示し、好ましくは培養細胞における代謝反応を示す。
1.本発明の概要
本発明は、質量分析を使って、化合物に結合しうる既知又は未知物質群(タンパク質)の結合力の強さについて解析し、その強さの序列を作る方法に関する。
一般に、化合物が固定化された担体が充填されたカラム(アフィニティークロマトグラフィーカラム)中の担体に固定化された化合物に結合した物質群を溶出させる際には、溶出溶媒の溶出力を徐々に強くしながら溶出物を分画する。したがって、アフィニティークロマトグラフィーカラムから最後に溶出する物質が、担体に固定化された化合物に対して、もっとも結合力が強いということになる。例えば、図1に示すようにアフィニティークロマトグラフィーカラムからタンパク質を溶出すると、フラクション(画分)5に含まれるタンパク質が最も結合力が強い。そして、画分5に含まれるタンパク質を同定するとタンパク質C、D及びEの3つのタンパク質が含まれていたとする。ここで、タンパク質C、D及びEの結合力の強度を比較するためには、各タンパク質について、個々のタンパク質標品を準備し、あるいは色の異なる蛍光タグや異なるエピトープタグを導入すれば、溶出プロファイルを調べることができ、その結果タンパク質Eが最も溶出が遅い、つまり結合力が強いということがわかる。
しかし、アフィニティークロマトグラフィーカラムから溶出するタンパク質は、一つの画分に全て溶出する場合もあれば、最初から最後まで広い範囲に広がって溶出することもある。しかも一つの画分に複数種のタンパク質が混在するために、各タンパク質の溶出パターンを知ることは容易ではない。また、標品を準備すること、及びタグを導入することは普遍的に行えるほど容易ではなく、またタグなどの導入により人為的な影響を受け、真の結合力を評価することができないこともある。さらに、どのようなタンパク質が結合しているか、あらかじめ同定する必要がある。
そこで、本発明においては、タンパク質群を、化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する。また、内部標準画分として、もう一つ別にタンパク質群を、化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画し、当該得られた画分を全てまたは隣り合った複数個の画分をまとめた画分の混合物を用意する。ここで、化合物が固定化された担体が充填されたカラム(アフィニティークロマトグラフィーカラム)に負荷する試料のうち一方のタンパク質群は、同位体標識されたものである(あるいは分画後、標識する)。次に、一つにまとめた(あるいは隣り合った分画を複数個まとめた)画分の混合物を内部標準画分として、一定量ずつ別に分画した試験試料に加える。画分は、必要に応じてSDS−PAGEなどで分離し、トリプシンなどでタンパク質を消化することができる。その後それぞれの画分について、質量分析装置で測定する。
ここで分画された試験試料、あるいは内部標準画分用試料のいずれかは、同位体によって標識されている。図2は、アフィニティー精製前に試験試料を同位体標識した態様(図2a1)を示す。従って、標識された試料をアフィニティー精製したときの画分(図2a1)と、標識されていない試料をアフィニティー精製したときの画分(図2a2)とを混合し(図2b)、その混合試料を質量分析処理すると(図2c)、質量分析スペクトルでは、同位体標識された画分由来のタンパク質のピーク(図2c、破線で示すピーク)と標識されていない画分由来のタンパク質のピーク(図2c、実線で示すピーク)が、ペアで観測される。このピーク強度比を求めたとき、あるタンパク質が複数の画分にまたがって溶出されている場合、そのタンパク質は一番ピーク強度比が大きい画分にもっとも濃縮されて溶出されていることになる。また、ある画分の中に複数種のタンパク質が含まれる場合、一番ピーク強度比が大きいタンパク質がその画分にもっとも濃縮されて溶出されたことになる。例えば、図2において、タンパク質C及びDは画分5よりも4に多いのに対して、タンパク質Eは画分5に多い(図2c)。したがって、画分4においてはタンパク質Dのピーク強度比が大きく、画分5においてはタンパク質Eのピーク強度比が大きい。これらのことから、タンパク質DとEとを比較すると、タンパク質D、Eの順に遅く分画され、タンパク質Eが一番遅く溶出していることがわかる。
なお、図2bに示す工程において、内部標準画分は全部まとめる必要はなく、比べたいところだけ、連続する画分を混ぜれば良い。例えば、画分3、画分4及び画分5、又はタンパク質C、D及びEを試験の対象とする場合は、連続する画分、すなわち画分3、画分4及び画分5を混合して内部標準画分とすればよい。これにより、内部標準画分の全体が希釈されて目的物が検出できないことを防止することができる。また、それぞれの画分の全量を混合して内部標準画分としてもよいし、一定量ずつ混合して内部標準画分としてもよい。なお、標識されていない試料を1又は複数の画分に分画する工程(図2a2)において、分画された画分が1つのときは、その1の画分を内部標準画分とすることができる(図2a2’)。
各タンパク質がどの画分にもっとも濃縮されて溶出されているかを比較し、遅く溶出されてくる画分に濃縮されているタンパク質ほど、担体に固定化された化合物に対する結合力が強いと判断できる。なお、内部標準画分用の試料については、必ずしも化合物が固定化された担体によって分画する必要性がない。しかしながら、何ら濃縮操作を施していない試料から質量分析装置で検出されるタンパク質の多くは、発現量が極めて多いタンパク質である。また、濃縮操作を施していないタンパク質と化合物が固定化された担体によって濃縮されたタンパク質との間に濃度差が生じる。そのため、質量分析のダイナミックレンジの狭さを考慮すると内部標準画分の添加量を調整することが難しい。従って、内部標準画分用試料も化合物が固定化された担体で一旦濃縮することが望ましい。
また、本発明によって、化合物に対する複数種のタンパク質の結合力の強度比を算出することが可能となるため、複数種の化合物について本発明の解析を行い、化合物間での化合物と各タンパク質との結合力の相関を算出することで、生体、細胞等に対する化合物の特性を解析することが可能となる。
2.本発明の解析方法の態様
(1)第一の態様
本発明の方法の第一の態様は、化合物に対するタンパク質の結合力を解析するために以下の工程を含むものであり、解析の対象となるタンパク質群が分画前に同位体標識されている態様である。
(a)同位体標識された第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する工程
(b)第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する工程
(c)工程(b)で得られた1の画分、又は工程(b)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を、工程(a)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する工程
(d)工程(c)で得られた画分を質量分析処理する工程
(e)質量分析情報から、各画分について、工程(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと工程(b)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程
(a)同位体標識された第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する工程
本発明において、第一のタンパク質群は解析対象のタンパク質試料であり、例えば、組織、生体液、細胞、細胞器官及びタンパク質複合体などから得られた試料を用いることができる。
同位体標識されたタンパク質群は、タンパク質を構成する分子(アミノ酸)の一部が同位体で標識されていればよく、その調製方法や標識部位については、特に限定されない。
以下、具体的な調製方法について記載する。
同位体標識されたタンパク質群は、代謝的に同位体標識することによって、調製することができる。例えば、培養可能な細胞を、同位体標識されたタンパク質の前駆体(例えば、アミノ酸)を含む培地で培養することによって、細胞中のタンパク質を代謝的に同位体標識することができる。培養条件はどのようなものであってもよく、液体培地あるいは固体培地に該細胞を培養するのに好適な条件を選択すればよい。例えば、動物細胞を選択した場合には、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM等の培地を用い、必要に応じウシ胎児血清(FCS)等の血清、アミノ酸、グルコース、ペニシリン又はストレプトマイシンなどを添加することができ、pH約6〜8、30〜40℃において15〜200時間前後の培養を行うことができる。その他、必要に応じ途中で培地の交換を行ったり、通気及び攪拌を行ったりすることができる。
このようにして得られた代謝的に同位体標識されたタンパク質群を含む細胞を破砕することで、同位体標識されたタンパク質群を調製することができる。破砕する方法は、例えば、ダウンス型テフロンTM・ホモジナイザー、ポリトロン、ワーリング・ブレンダー、ポッター型ガラス・ホモジナイザー、超音波破砕装置、細胞溶解液(例えば、PIERCE社のM−PER:cat no.78501,T−PER:cat no.78510など)を用いる方法又は凍結融解法があげられ、好ましくは細胞溶解液を用いる方法があげられる。破砕した細胞は、遠心分離操作により、不溶性物質を除去することが好ましい。このようにして、同位体標識されたタンパク質群を調製することができる。
本発明で用いる同位体は、放射性同位体を適用することもできるが、放射性を有さない安定同位体が、取り扱いが容易であることから、特に好ましい。安定同位体は、例えば、2H、13C、15N、17O、18O、31P若しくは34S又はこれらの組み合わせが挙げられ、好ましくは2H、13C、15N若しくは18O又はこれらの組み合わせであり、より好ましくは13C、15N若しくは18O又はこれらの組み合わせであり、さらに好ましくは13Cである。本発明に利用される同位体は、タンパク質を標識し得るものであれば、その種類は特に限定されない。具体的には、同位体標識されたタンパク質の前駆体として、13C標識(13Cx6個)ロイシン(Cambridge Isotope Labs(CIL)社製、L−Leucine U−13C6,CLM−2262)を挙げることができる。上記同位体は、本発明の態様のすべてに適用することができる。
また、同位体標識されたタンパク質群は、in vitroにおいても調製することができる。たとえば、タンパク質中のシステイン残基を同位体標識されたアルキル化試薬を用いてアルキル化することにより、同位体標識することができる(「ラピッド・コミュケーションズ・イン・マス・スペクトルメトリー(Rapid Communications in Mass Spectrometry)」第16巻、第15号、2002年、pp.1416−1424参照)。さらに、タンパク質中のシステイン残基を同位体標識されたビオチン化試薬を用いてビオチン化することにより、同位体標識することもできる。標識後は、さらにアビジンカラムを用いて、標識されたタンパク質のみを精製することが可能である(「ネイチャー・バイオテクノロジー(Nature Biotechnology)」第17巻、第10号、1999年10月、pp.994−999)。
また、同位体標識されたタンパク質群は、化学合成により製造してもよい。
当該同位体標識されたタンパク質群は、予備的に分画することができる。予備的に分画する方法は、例えば、分画遠心法及びショ糖密度勾配遠心法などがあげられ、好ましくはショ糖密度勾配遠心法があげられる。
また、必要に応じて、前記同位体標識されたタンパク質群を分離することができる。分離する方法は、例えば、電気泳動(例えば、二次元電気泳動、SDS−PAGEなど)、群特異的アフィニティークロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーを利用する方法、免疫沈降法、硫安沈殿法、有機溶媒による沈殿法、限外ろ過法、ゲルろ過法及び透析法などがあげられ、好ましくは逆相クロマトグラフィーを利用する方法があげられる。
なお、同位体標識されたタンパク質群は、適当な条件、好ましくは−20℃以下、特に好ましくは−80℃以下で保存することができる。
本発明において、「化合物が固定化された担体」とは、担体に官能基を介して化合物を共有又は非共有結合させたものをいう。
化合物が固定化された担体は、例えば、まず、担体側に官能基として、N−hydroxy−succinimideやHydrazideを共有結合させたり、単にアミノ基にしたり、又はProtein A、HeparinもしくはCibacron Blue F3GAなどを固定化し、このような担体の官能基に対して、化合物を直接又は化合物の構造の一部を変えたものを共有又は非共有結合させたものがある。
担体に固定化する化合物は、特に限定されず、例えば、合成低分子化合物、タンパク質、合成ペプチド、精製又は部分精製ポリペプチド、抗体、細菌放出物質(細菌代謝産物を含む)、生体内核酸物質(ATP、GTP、NAD/NADH又はNADP/NADPHなど)、脂質などが挙げられる。これら化合物は、新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
担体としては、アガロースゲル、アクリルアミド、磁気ビーズ、セルロース、シリカゲルなどがあげられ、好ましくはアガロースゲルである。担体は、例えば、バイオラド社等から購入することができる(アフィゲル10、バイオラド社製、カタログ番号153−6099)。
化合物が固定化された担体は、担体に所望の化合物を結合させることにより、作製することができる。化合物が固定化された担体の作製は、例えば、アミノ基を有する化合物であれば、以下の手順で行うことができる。まず、アミノ基を有する化合物溶液をN−hydroxy−succinimideが結合している担体(例えばアフィゲル10)に加える。次に、トリエチルアミンを加え、インキュベーションした後、2−アミノエタノールを加え、さらにインキュベーションすることによって作製することができる。また、適宜洗浄操作を加えることが好ましい。
また、化合物が固定化された担体の作製は、例えば、カルボン酸を有する化合物であれば、以下の手順で行うことができる。まず、カルボン酸を有する化合物溶液にカルボジイミドを加え、インキュベーションした後、アミノ基が結合している担体に加える。次に、酢酸(もしくは乳酸)を加え、さらにインキュベーションすることによって作製することができる。また、適宜洗浄操作を加えることが望ましい。さらに、NADPアナログを固定化した担体などは、例えば、アマシャムバイオサイエンス社から購入することができる(2’5’ADP Sepharose 4B(コード番号17−0700−01))。
また、化合物が固定化された担体は、チオール基を有する化合物であれば、例えば、SulfoLink(ピアス社、カタログ番号:44895)を使って作製することができ、また、アルデヒド基を有する化合物であれば、例えば、CarboLink(ピアス社、カタログ番号:44900)を使って作製することができる。
さらに、化合物が固定化された担体は、糖のような水酸基を持つ化合物の場合には、例えば、室温下10mM過ヨウ素酸酸化によって前記化合物の水酸基からアルデヒド基を生じさせることができるため、CarboLink(ピアス社、カタログ番号:44900)などを使って作製することができる。また、活性型水素原子(交換可能な水素原子)を持つ化合物の場合には(例えば、コレステロール骨格を持ったエストラジオール17ベータなど)、前記化合物とホルムアルデヒトと担体に固定化されたアミノ基との3種間でマンニッヒ反応による濃縮反応を行うことにより、前記化合物を担体に固定化することができる。
担体に固定化する化合物の量は、特に限定されないが、担体1mlあたり0.1mgから数mg程度とすることが好ましい。
化合物が固定化された担体は、アフィニティークロマトグラフィー用の担体として用いることができ、適当なカラム(例えば、ポリプレップエンプティカラム(バイオラド社製、Cat No.731−1550)等)に充填することによって、化合物を固定化したアフィニティークロマトグラフィーカラムとして使用できる。また、化合物が固定化された担体は、適当なチューブ(例えば、エッペンドルフチューブ(エッペンドルフ社製)等)に加えることによって、使用することもできる。
同位体標識されたタンパク質群を、化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する。これにより、担体に固定化した化合物に結合する複数種のタンパク質を分画し、画分を得ることができる。本明細書において「担体を用いて」とは、母集団のタンパク質群を分画する際に、化合物が固定化された担体を利用して、という意味である。
以下、詳細に説明する。
初めに、適当な溶液で化合物が固定化された担体を平衡化する。平衡化する溶液は、特に限定されないが、タンパク質群を溶解することができ、かつ、変性させない溶液が望ましい。例えば、生理的pHに調製したリン酸緩衝液、Hepes緩衝液又はトリス緩衝液などが挙げられ、必要に応じて、これらに塩化ナトリウム及び/又は界面活性剤(n−オクチルグルコシドなど)を適当量加えることができる。
平衡化する工程は、化合物が固定化された担体が適当なカラムに充填されている場合には、適当な溶液をカラムにアプライすることによって、また、化合物が固定化された担体が、適当なチューブに加えられている場合には、適当な溶液をチューブに添加することによって、それぞれ行うことができる。
次に、同位体標識されたタンパク質群と化合物が固定化された担体とを接触させる。同位体標識されたタンパク質群と化合物が固定化された担体とを接触させる工程は、化合物が固定化された担体が適当なカラムに充填されている場合には、同位体標識されたタンパク質群をカラムに負荷することによって、また、化合物が固定化された担体が、適当なチューブに加えられている場合には、同位体標識されたタンパク質群をチューブに添加することによって、それぞれ行うことができる。
その後、化合物が固定化された担体を適当な溶液で洗浄することが望ましい。洗浄操作は、化合物が固定化された担体が、適当なカラムに充填されている場合には、適当な溶液をカラムに添加することによって、また、化合物が固定化された担体が、適当なチューブに加えられている場合には、適当な溶液をチューブに添加し、遠心操作をすることによって、それぞれ行うことができる。
そして、適当な溶出溶媒で同位体標識されたタンパク質群を溶出する。
試料の溶出は、溶出溶媒の強度を変化させて行うことができる。「強度」は「溶出力」ともいい、カラムに結合した試料を溶出させるための化学的強度を意味し、強度は溶出溶媒の濃度などにより影響される。従って、「強度を変化させて」とは、例えば連続的又は非連続的に溶媒の濃度勾配をかけることなどを意味する。溶出は、例えば、塩酸グアニディン、尿素などによりカラムに結合した試料を変性させる方法、KCl、NaClなどにより塩濃度を変化させる方法、pHを変化させる方法などにより行うことができる。
また、担体に固定化した化合物と同一又は類似の骨格を有する化合物を過剰量加えることにより、化合物に結合した試料を溶出することもできる。
同位体標識されたタンパク質群を溶出させる工程は、化合物が固定化された担体が、適当なカラムに充填されている場合には、適当な溶出溶液をカラムに負荷することによって、また、化合物が固定化された担体が、適当なチューブに加えられている場合には、適当な溶出溶液をチューブに添加し、遠心操作をすることによって、それぞれ行うことができる。
これらの方法により、担体に固定化した化合物に結合するタンパク質群を分画し、画分を得ることができる。
以上の操作温度は、特に限定されないが、4℃から37℃、さらには4℃から20℃で行うことが好ましい。
(b)第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する工程
本工程において、第二のタンパク質群は、内部標準画分用の試料である。
この工程は、上記工程(a)とは別に同位体標識されていない同一試料(第二のタンパク質群)について、前記化合物が固定された担体を用いて1又は複数の画分に分画するというものである。本発明の第一の態様では、同位体標識されたタンパク質群の画分を試験対象(解析対象)とし、同位体標識されていないタンパク質群の画分を内部標準画分として使用する。内部標準画分とは、測定系において基準となる画分を意味する。
本発明において、「同位体標識されていないタンパク質群」とは、同位体標識する行為を施していないタンパク質の集合をいう。
同位体標識されていないタンパク質群(第一の態様では第二のタンパク質群)は、例えば、組織、生体液、細胞、細胞器官及びタンパク質複合体などから得られた試料を用いることができる。
破砕する方法は、例えば、ダウンス型テフロンTM・ホモジナイザー、ポリトロン、ワーリング・ブレンダー、ポッター型ガラス・ホモジナイザー、超音波破砕装置、細胞溶解液(例えば、PIERCE社のM−PER:cat no.78501,T−PER:cat no.78510など)を用いる方法又は凍結融解法があげられ、好ましくは細胞溶解液を用いる方法があげられる。破砕した細胞は、遠心分離操作により、不溶性物質を除去することが好ましい。このようにして、同位体標識されていないタンパク質群を調製することができる。
また、同位体標識されていないタンパク質群は、化学合成により製造してもよい。
なお、同位体標識されたタンパク質群及び同位体標識されていないタンパク質群は、適当な条件、好ましくは−20℃以下、特に好ましくは−80℃以下で保存することができる。
本発明において、「同位体標識されていない(同位体非標識)タンパク質群」については、天然型試薬(同位体でない試薬)を用いて、「同位体標識されたタンパク質群」と同一の方法で調製することが好ましい。
本発明において、「同位体標識されていないタンパク質群」の代わりに「同位体標識されたタンパク質群」の同位体とは異なる同位体で標識されたタンパク質群(以下、「異なる同位体で標識されたタンパク質群」ともいう。)を用いることもできる。当該「異なる同位体で標識されたタンパク質群」中の同位体は、両タンパク質群由来の対応する各タンパク質の質量が異なるようにタンパク質を標識できる限り、「同位体標識されたタンパク質群」中の同位体とは別の同位体であってもよいし、同一の同位体を含んでいてもよい。
ここで、同位体標識されていないタンパク質群は、好ましくは、工程(a)で用いた担体と同じ担体を用いて分画することができる。これにより、担体に固定化した化合物に結合する複数種のタンパク質を分画し、画分を得ることができる。
試料の溶出は、溶出溶媒の強度を変化させて行うこともできるし、溶出溶媒の強度を変化させず一定の溶出力で行うこともできる。(b)第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する工程では、工程(a)と同じ溶出条件を選択することが望ましい。また、本明細書において、内分標準画分用の試料を分画して得られる画分の数は、実施例で示すように一つでもよい。
(c)工程(b)で得られた1の画分、又は工程(b)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を、工程(a)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する工程
この工程は、同位体標識されたタンパク質群を化合物が固定化された担体を用いて分画して得られた画分のそれぞれに、内部標準画分を添加する工程である。「添加」とは画分同士を混合することを意味する。
本工程において、内部標準画分は、「工程(b)で得られた1の画分」、又は工程(b)で得られた画分のうち、「全画分の混合物」もしくは「隣り合う複数個の画分の混合物」を意味する。「工程(b)で得られた1の画分」とは、工程(b)の分画操作により得られた画分が1つであったときのその画分を意味する。「全画分の混合物」とは、溶出された画分全部をひとつにまとめた混合物又は溶出された全部の画分のそれぞれ一定量をひとつにまとめた混合物を意味する。「隣り合う複数個の画分の混合物」とは、連続する隣りどうしの画分の複数個をひとつにまとめた混合物又は複数個の画分のそれぞれの一定量をひとつにまとめた混合物を意味する。
本発明において、内部標準画分用タンパク質試料を試験タンパク質試料(図2a1)と同様にして分画処理したときに5つの画分を得る場合(図2a2)を例に挙げて説明する。図2は、アフィニティー精製の溶出を例示してある。この画分をそれぞれ画分1〜画分5とすると、隣り合う画分の複数個とは、画分1と画分2、画分2と画分3、画分3〜画分5のように、隣りあう連続する画分を集めたものを意味する。「一定量」は、目的に応じて任意に設定することができ、各画分(例えば図2bの画分1〜5)に添加する量がいずれも同量となるようにすることが好ましい。また、内部標準画分用の試料を分画処理し1つの画分を得る場合も(図2a2’)、各画分(例えば図2bの画分1〜5)に添加する量がいずれも同量となるようにすることが好ましい。
(d)工程(c)で得られた画分を質量分析処理する工程
この工程は、工程(c)で得られた画分、すなわち同位体標識画分に内部標準画分を添加した後の混合物試料を質量分析処理する工程である。
混合物試料は、そのまま質量分析装置により分析してもよく、濃縮、分離などの前処理を行ってもよい。濃縮方法は、例えば、Amicon Ultra−15 10,000MWCOなどによる方法などがあげられる。分離方法は、例えば、電気泳動(例えば、二次元電気泳動、SDS−PAGEなど)及び各種クロマトグラフィー(例えば、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィーなど)等があげられる。
また、混合物試料は、消化を行ってもよい。消化方法には、酵素消化、化学分解等があげられ、好ましくは酵素消化である。酵素消化に用いる酵素としては、トリプシン、キモトリプシン、Lys−C,Asp−N,Glu−Cなどがあげられ、好ましくはトリプシンである。また、酵素消化の際には、界面活性剤、好ましくは5−cyclohexyl−pentyl−beta−D−maltoside(米国特許第5674987号明細書(US5674987)及び米国特許第5763586号明細書(US5763586)、アナトレース社(Anatrace Inc.,Maumee,OH,USA))を加えることが望ましい。
質量分析装置は、ガスクロマトグラフと結合された質量分析装置であるガスクロマトグラフィーマススペクトロメトリー(GC/MS)、あるいは液体クロマトグラフと結合された質量分析装置である液体クロマトグラフィーマススペクトロメトリー(LC/MS)等の汎用の装置があげられる。質量分析装置におけるイオン化方法は、例えば、MALDI(マトリックス支援レーザー脱離イオン化法)、ESI(エレクトロスプレーイオン化法)、EI(電子イオン化法)、CI(化学イオン化法)、APCI(大気圧化学イオン化法)、FAB(高速原子衝撃法)、LD、FD、SIMS、TSP等があげられ、好ましくはMALDI又はESIである。アナライザーは、例えば、TOF(飛行時間型)、イオントラップ、二重収束型、四重極型、フーリエ変換型等があげられる。
また、質量分析装置は、2台の直列に接続された質量分析計を有する装置(MS/MS)が好ましい。
質量分析装置による測定から質量分析スペクトルが得られる。質量分析スペクトルからは、タンパク質(又はペプチド)に由来するピークに関する情報を入手することができる。
また、質量分析装置による測定から得られたデータを、ソフトウェアを使用して、タンパク質のデータベースと照合することにより、試料中のタンパク質を同定することができる。ソフトウェアは、例えば、SonarMSMS(Genomic solution社製)、MASCOT(Matrix Science社製)、The Global Proteome Machine(GPM)(The Global Proteome Machine Organization,http://h451.thegpm.org/tandem/thegpm_tandem.html)などがあげられる。データベースとしては、例えば、NCBInr(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、IPI、Sprot等があげられる。質量分析装置による測定から得られたデータを用いて、タンパク質のデータベースと照合することにより、タンパク質を同定することができる(Nat Genet.1998:20,46−50;J Cell Biol.1998:141,967−977;J Cell Biol.2000:148,635−651;Nature.2002:415,141−147;Nature.2002:415,180−183;Curr Opin Cell Biol.2003:15,199−205;Curr Opin Cell Biol.2003:7,21−27)。また、同定されたタンパク質の情報から、アミノ酸配列情報を得ることができる。
(e)質量分析情報から、各画分について、工程(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと工程(b)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程
本発明において、「工程(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピーク」とは、質量分析装置による測定から得られる質量分析スペクトルにおいて、試験用タンパク質試料に由来するシグナル強度又はその総和(通常、面積で表されることは当業者であれば理解できる)をいう(以下、説明の便宜上単に「試験画分ピーク」と称する場合がある)。
また、「工程(b)で得られた画分中のタンパク質に由来するピーク」とは、質量分析装置による測定から得られる質量分析スペクトルにおいて、内部標準画分に由来するシグナル強度又はその総和をいう(以下、説明の便宜上単に「内部標準ピーク」と称する場合がある)。
質量分析装置による測定から得られたデータを用いて、各タンパク質について、試験画分ピークと内部標準ピークとの強度比(=「試験画分ピークの強度」/「内部標準ピークの強度」)(以下、単に「ピーク強度比」と称する場合がある)を求めることにより、複数種のタンパク質について、化合物に対する各タンパク質の結合力の強度を比較することができる。ここで、「化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する」とは、複数種類のタンパク質におけるピーク強度比を用いて、それぞれのタンパク質がどの画分に最も濃縮されたのかをタンパク質間で比較することにより、タンパク質とタンパク質との間において化合物に対する結合力を比較することを意味する。
同位体標識されたタンパク質は、同位体標識されていないタンパク質に比べ、同位体標識されている分子の分、分子量が大きくなり、同位体標識されたタンパク質とされていないタンパク質は、質量分析スペクトル上でペアのピークとして観測される(図2c)。異なる同位体で標識されたタンパク質群について質量分析を行った場合も、これらはペアのピークとして観測される。同位体標識されたタンパク質の分子量は、同定されたタンパク質及びそのアミノ酸配列から計算によって求めることができる。このピーク強度比を求めたとき、あるタンパク質が複数の画分にまたがって溶出されている場合、そのタンパク質は一番ピーク強度比が大きい画分にもっとも濃縮されて溶出されていることになる。そして、各画分において一番ピーク強度比が大きいタンパク質が、その画分に最も濃縮されたものと判断することができる。遅く溶出されてくる画分(溶出溶媒の強度が一番強い条件で溶出されてくる画分)に濃縮されているタンパク質ほど、担体に固定化された化合物に対する結合力が強いと判断することができる。
(2)第二の態様
本発明の方法の第二の態様は、化合物に対するタンパク質の結合力を解析するために以下の工程を含むものであり、内部標準画分用の試料が分画前に同位体標識されている態様である。
(a)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する工程
(b)同位体標識された第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する工程
(c)工程(b)で得られた1の画分、又は工程(b)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を、工程(a)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する工程
(d)工程(c)で得られた画分を質量分析処理する工程
(e)質量分析情報から、各画分について、工程(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと工程(b)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程
本発明の方法において、第二の態様では、上記第一の態様と同様にタンパク質群が分画される前に同位体標識されている。つまり、第一の態様では試験試料である第一のタンパク質群が同位体標識されていたのに対し、第二の態様では、内部標準画分用である第二のタンパク質群が同位体標識されている。それ以外の工程は、上記第一の態様と同様である。但し、第一のタンパク質群を、第二のタンパク質群を標識した同位体とは異なる同位体で標識してもよい。
(3)第三の態様
本発明の方法の第三の態様は、化合物に対するタンパク質の結合力を解析する方法であって、以下の工程を含むものであり、試験用タンパク質試料を分画後に標識する態様である。
(a)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する工程
(b)第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する工程
(c)工程(a)において得られた画分を標識する工程
(d)工程(b)で得られた1の画分、又は工程(b)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を、工程(c)で標識された画分のそれぞれに一定量添加する工程
(e)工程(d)で得られた画分を質量分析処理する工程
(f)質量分析情報から、各画分について、工程(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと工程(b)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程
上記第三の態様は、解析対象である第一のタンパク質群を分画した後、その分画後の画分(試験用画分)を標識する態様である。すなわち、図2a1において分画した後の画分(図2a1の画分1〜5)を標識するというものである。それ以外は、前記した第一の態様と同様である。
標識は、同一種のタンパク質について、第一のタンパク質群由来のタンパク質と第二のタンパク質群由来のタンパク質が、質量分析において区別し得る標識であればよく、前記した態様における同位体標識のほか、例えば、メチル化、エチル化、ビオチン化及びこれらの組合せなどがあげられる。このようなタンパク質の標識は、当業者であれば、公知の方法により実施することができる。
また、第一のタンパク質群と第二のタンパク質群とを異なる同位体で標識することも、他の標識物で標識することも可能である。
(4)第四の態様
本発明の方法の第四の態様は、化合物に対するタンパク質の結合力を解析する方法であって、以下の工程を含むものであり、内部標準画分用の試料を分画し、その分画後の内部標準画分を標識する態様である。
(a)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する工程
(b)第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する工程
(c)工程(b)で得られた1の画分、又は工程(b)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を標識する工程
(d)工程(c)で標識された画分又は混合物を、工程(a)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する工程
(e)工程(d)で得られた画分を質量分析処理する工程
(f)質量分析情報から、各画分について、工程(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと工程(b)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程
この第四の態様は、内部標準画分用のタンパク質試料を分画した後、溶出された全画分又は隣り合う複数個の画分をまとめてひとつの混合物とし、その混合物全体を標識するというものである。画分をまとめてひとつの混合物とする点については、前記「1.本発明の概要」の項又は上記「第一の態様」の項で説明したとおりである。但し、工程(c)において、画分全部(例えば図2では画分1〜5)を標識する必要はなく、一定量だけ各画分から採取し、その採取した画分を標識してもよい。また、分画により得られる画分の数が一つになるように溶出し、その画分の全量又は一定量を標識してもよい。また、各画分をまとめた混合物を標識してもよいし、各画分を標識してから混合物としてもよい。
標識は、同一種のタンパク質について、第一のタンパク質群由来のタンパク質と第二のタンパク質群由来のタンパク質が、質量分析において区別し得る標識であればよく、前記した態様における同位体標識のほか、例えば、メチル化、エチル化、ビオチン化及びこれらの組合せなどがあげられる。このようなタンパク質の標識は、当業者であれば、公知の方法により実施することができる。この態様の場合も、第一のタンパク質群と第二のタンパク質群とを異なる同位体で標識すること、あるいは他の標識物で標識することが可能である。
(5)第五の態様
本発明の方法の第五の態様は、化合物に対するタンパク質の結合力を解析する方法であって、以下の工程を含むものであり、試験用タンパク質試料および内部標準画分用の試料を分画後に定量する態様である。
(a1)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する工程
(a2)工程(a1)で得られた画分を質量分析処理する工程
(a3)工程(a2)で得られた質量分析の情報から工程(a1)で得られた画分中の各タンパク質を同定する工程
(a4)工程(a1)で得られた画分中の各タンパク質を定量する工程
(b1)第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する工程
(b2)工程(b1)で得られた1の画分、又は工程(b1)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を、質量分析処理する工程
(b3)工程(b2)で得られた質量分析の情報から工程(b2)に記載の1の画分又は混合物中の各タンパク質を同定する工程
(b4)工程(b2)に記載の1の画分又は混合物中の各タンパク質を定量する工程
(c)工程(a1)で得られた各画分について、工程(a4)で得られたタンパク質量と工程(b4)で得られたタンパク質量との比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程
この第五の態様は、解析対象である第一のタンパク質群を分画した後、その分画後の画分(試験用画分)を定量し、また、内部標準画分用のタンパク質試料を分画した後、溶出された全画分又は隣り合う複数個の画分をまとめてひとつの混合物とし、その混合物全体を定量するというものである。
以下、本発明の第五の態様について、詳細に記載する。
(a1)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する工程
当該工程は、上記第一の態様中、「(a)同位体標識された第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する工程」と同様の方法により、行うことができる。但し、第一のタンパク質群は、同位体標識されている必要はない。
(a2)工程(a1)で得られた画分を質量分析処理する工程
当該工程は、上記第一の態様中、「(d)工程(c)で得られた画分を質量分析処理する工程」と同様の方法により、行うことができる。
(a3)工程(a2)で得られた質量分析の情報から工程(a1)で得られた画分中の各タンパク質を同定する工程
当該工程は、上記第一の態様中、「(d)工程(c)で得られた画分を質量分析処理する工程」に記載された方法により、行うことができる。
(a4)工程(a1)で得られた画分中の各タンパク質を定量する工程
当該工程において、各タンパク質を定量する方法は、特に限定されないが、例えば、以下の方法により行うことができる。
まず、工程(a3)において、同定された各タンパク質について、検出されたペプチド数(Nobsd)および検出され得るペプチド数(Nobsbl)を算出する。
ここで、「検出されたペプチド数(Nobsd)」は、「(a2)工程(a1)で得られた画分を質量分析処理する工程」において、実際に検出されたペプチド数を意味する。検出されたペプチド数(Nobsd)は、質量分析のデータおよび同定されたタンパク質の配列情報をもとに算出することができる。検出されたペプチド数(Nobsd)は、質量分析のデータをもとに算出する場合、各タンパク質について質量分析で検出されたピークの数と一致する。
また、「検出され得るペプチド数(Nobsbl)」は、「(a2)工程(a1)で得られた画分を質量分析処理する工程」において、理論上検出され得るペプチド数を意味する。検出され得るペプチド数(Nobsbl)は、同定されたタンパク質の配列情報をもとに算出することができる。各タンパク質について、上記工程における濃縮、分離(例えばHPLCによる分離)又は消化などの操作によって理論的に生じるペプチド数を配列情報をもとに算出し、質量分析で検出され得るペプチド数(Nobsbl)を求めることができる。例えば、トリプシンによる消化操作を行った試料を質量分析する場合は、トリプシンによりリシン、アルギニンのカルボキシル側でペプチド鎖が切断されるため、各タンパク質の配列情報から切断により生じるペプチド数が予測できる。場合によっては、質量分析器の測定範囲も考慮して、検出され得るペプチド数(Nobsbl)を求めることができる。
次に、上記の検出され得るペプチド数(Nobsbl)と検出されたペプチド数(Nobsd)とを用いて各タンパク質を定量するために、以下の式(I)にしたがって、EMPAI(exponentially modified protein abundance index)を設定し、算出する。
式(I):
EMPAI=10Nobsd/Nobsbl−1
EMPAIは、タンパク質混合物中のタンパク質含有量に比例する指数である。
さらに、以下の式(II)にしたがって、タンパク質含有率(mol%)を算出することができる。
式(II):
ここで、Σ(EMPAI)は、すべての同定されたタンパク質のEMPAIの和を表す。
また、以下の式(III)にしたがって、タンパク質含有率(重量%)を算出することができる。
式(III):
ここで、MWは、同定された各タンパク質の分子量を表す。Σ(EMPAI×MW)は、すべての同定されたタンパク質のEMPAI×MWの和を表す。
各タンパク質の分子量は、アミノ酸配列から算出することができる。また、工程(a1)で得られた画分中のタンパク質の総重量は、既存の方法、例えば、Lowry法、Bradford法、280nmの吸光度測定などの方法によって容易に測定することができる。そうすると、工程(a1)で得られた画分中のタンパク質の総重量および上記で求めたタンパク質含有率から、各タンパク質を定量することができる。
よって、上記方法により、各タンパク質を定量することができる。
各タンパク質を定量する工程は、コンピュータを用いてもよい。
(b1)第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する工程
当該工程は、上記第一の態様中、「(b)第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する工程」と同様の方法により、行うことができる。
(b2)工程(b1)で得られた1の画分、又は工程(b1)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を、質量分析処理する工程
本工程において、「工程(b1)で得られた1の画分」、「全画分の混合物」、「隣り合う複数個の画分の混合物」は、上記「第一の態様」の項で説明した「工程(b)で得られた1の画分」、「全画分の混合物」、「隣り合う複数個の画分の混合物」のとおりである。また、当該工程は、上記第一の態様中、「(d)工程(c)で得られた画分を質量分析処理する工程」と同様の方法により、行うことができる。
(b3)工程(b2)で得られた質量分析の情報から工程(b1)に記載の1の画分又は混合物中の各タンパク質を同定する工程
当該工程は、上記第一の態様中、「(d)工程(c)で得られた画分を質量分析処理する工程」に記載された方法により、行うことができる。
(b4)工程(b2)に記載の1の画分又は混合物中の各タンパク質を定量する工程
当該工程は、上記「(a4)工程(a1)で得られた画分中の各タンパク質を定量する工程」と同様の方法により、行うことができる。
(c)工程(a1)で得られた各画分について、工程(a4)で得られたタンパク質量と工程(b4)で得られたタンパク質量との比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程
当該工程は、工程(a3)および工程(b3)で同定された各タンパク質について、工程(a1)で得られた各画分中のタンパク質量および工程(b2)に記載の1の画分又は混合物中のタンパク質量の比(=「工程(a4)で得られたタンパク質量」/「工程(b4)で得られたタンパク質量」)を求めることにより、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較することができる。
すなわち、タンパク質量の比を求める第五の態様において、あるタンパク質が工程(a1)で得られた複数の画分にまたがって溶出されている場合、そのタンパク質は一番タンパク質量の比が大きい画分にもっとも濃縮されて溶出されていることになる。そして、各画分において一番タンパク質量の比が大きいタンパク質が、その画分に最も濃縮されたものと判断することができる。遅く溶出されてくる画分(溶出溶媒の強度が一番強い条件で溶出されてくる画分)に濃縮されているタンパク質ほど、担体に固定化された化合物に対する結合力が強いと判断することができる。
本発明の第五の態様における方法は、各タンパク質について同位体標識する必要がないことに特徴を有する。
(6)第六の態様
本発明の方法の第六の態様は、化合物に対するタンパク質の結合力を解析する方法であって、以下の工程を含むものであり、試験用タンパク質試料および内部標準画分用の試料を分画後に各タンパク質のEMPAIを算出する態様である。
(a1)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する工程
(a2)工程(a1)で得られた画分を質量分析処理する工程
(a3)工程(a2)で得られた質量分析の情報から工程(a1)で得られた画分中の各タンパク質を同定する工程
(a4)工程(a1)で得られた画分中の各タンパク質のEMPAIを算出する工程
(b1)第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する工程
(b2)工程(b1)で得られた1の画分、又は工程(b1)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を、質量分析処理する工程
(b3)工程(b2)で得られた質量分析の情報から工程(b2)に記載の1の画分又は混合物中の各タンパク質を同定する工程
(b4)工程(b2)に記載の1の画分又は混合物中の各タンパク質のEMPAIを算出する工程
(c)工程(a1)で得られた各画分について、工程(a4)で得られたEMPAIと工程(b4)で得られたEMPAIとの比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程
前述のとおり、EMPAIは、タンパク質混合物中のタンパク質含有量に比例する指数である。よって、工程(a3)および工程(b3)で同定された各タンパク質について、工程(a1)で得られた各画分中のタンパク質のEMPAIと、工程(b2)に記載の1の画分又は混合物中のタンパク質のEMPAIとの比(=「工程(a4)で得られたEMPAI」/「工程(b4)で得られたEMPAI」)を求めることにより、複数種のタンパク質について、化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較することができる。
すなわち、EMPAIの比を求める第六の態様において、あるタンパク質が複数の画分にまたがって溶出されている場合、そのタンパク質はEMPAIの比が大きい画分にもっとも濃縮されて溶出されていることになる。そして、各画分において一番EMPAIの比が大きいタンパク質が、その画分に最も濃縮されたものと判断することができる。遅く濃縮されてくる画分に濃縮されているタンパク質ほど、担体に固定化された化合物に対する結合力が強いと判断することができる。
上記のとおり、本発明の解析方法の第一〜第六の態様では、内部標準画分用の試料について、化合物が固定化された担体によって分画する方法について示したが、内部標準画分用の試料について、化合物が固定化された担体によって分画せずに用いる態様も本発明に含まれる。
(7)第七の態様
本発明の方法の第七の態様は、化合物に対するタンパク質の結合力を解析するために以下の工程を含むものである。
(a)同位体標識された第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する工程
(b)第二のタンパク質群を、工程(a)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する工程
(c)工程(b)で得られた画分を質量分析処理する工程
(d)質量分析情報から、各画分について、工程(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと第二のタンパク質群中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程
第七の態様は、第一の態様において、内部標準用画分である第二のタンパク質群を、化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画せずに工程(a)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する方法である。それ以外の工程は、第一の態様と同様である。
(8)第八の態様
本発明の方法の第八の態様は、化合物に対するタンパク質の結合力を解析するために以下の工程を含むものである。
(a)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する工程
(b)同位体標識された第二のタンパク質群を、工程(a)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する工程
(c)工程(b)で得られた画分を質量分析処理する工程
(d)質量分析情報から、各画分について、工程(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと第二のタンパク質群中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程
第八の態様は、第二の態様において、内部標準用画分である同位体標識された第二のタンパク質群を、化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画せずに工程(a)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する方法である。それ以外の工程は、第二の態様と同様である。
(9)第九の態様
本発明の方法の第九の態様は、化合物に対するタンパク質の結合力を解析するために以下の工程を含むものである。
(a)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する工程
(b)工程(a)で得られた画分を標識する工程
(c)第二のタンパク質群を、工程(b)で標識された画分のそれぞれに一定量添加する工程
(d)工程(c)で得られた画分を質量分析処理する工程
(e)質量分析情報から、各画分について、工程(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと第二のタンパク質群中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程
第九の態様は、第三の態様において、内部標準用画分である第二のタンパク質群を、化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画せずに工程(b)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する方法である。それ以外の工程は、第三の態様と同様である。
(10)第十の態様
本発明の方法の第十の態様は、化合物に対するタンパク質の結合力を解析するために以下の工程を含むものである。
(a1)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する工程
(a2)工程(a1)で得られた画分を質量分析処理する工程
(a3)工程(a2)で得られた質量分析の情報から工程(a1)で得られた画分中の各タンパク質を同定する工程
(a4)工程(a1)で得られた画分中の各タンパク質を定量する工程
(b1)第二のタンパク質群を質量分析処理する工程
(b2)工程(b1)で得られた質量分析の情報から第二のタンパク質群中の各タンパク質を同定する工程
(b3)第二のタンパク質群中の各タンパク質を定量する工程
(c)工程(a1)で得られた各画分について、工程(a4)で得られたタンパク質量と工程(b3)で得られたタンパク質量との比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程
第十の態様は、第五の態様において、第二のタンパク質群を、化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画せずに第二のタンパク質群中の各タンパク質を定量する方法である。それ以外の工程は、第五の態様と同様である。
(11)第十一の態様
本発明の方法の第十一の態様は、化合物に対するタンパク質の結合力を解析するために以下の工程を含むものである。
(a1)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する工程
(a2)工程(a1)で得られた画分を質量分析処理する工程
(a3)工程(a2)で得られた質量分析の情報から工程(a1)で得られた画分中の各タンパク質を同定する工程
(a4)工程(a1)で得られた画分中の各タンパク質のEMPAIを算出する工程
(b1)第二のタンパク質群を質量分析処理する工程
(b2)工程(b1)で得られた質量分析の情報から第二のタンパク質群中の各タンパク質を同定する工程
(b3)第二のタンパク質群中の各タンパク質のEMPAIを算出する工程
(c)工程(a1)で得られた各画分について、工程(a4)で得られたEMPAIと工程(b3)で得られたEMPAIとの比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程
第十一の態様は、第六の態様において、第二のタンパク質群を、化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画せずに第二のタンパク質群中の各タンパク質のEMPAIを算出する方法である。それ以外の工程は、第六の態様と同様である。
3.解析システム
本発明の解析システムは、化合物に対するタンパク質の結合力を解析する方法を実行するためのシステムであり、以下の手段を含むものである。
(1)試料を分画前に同位体標識する態様
(a)同位体標識された第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する手段
(b)第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する手段
(c)手段(b)で得られた1の画分、又は手段(b)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を、手段(a)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する手段
(d)手段(c)で得られた画分を質量分析処理する手段
(e)質量分析情報から、各画分について、手段(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと手段(b)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する手段
(2)内部標準画分用試料を分画前に同位体標識する態様
(a)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する手段
(b)同位体標識された第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する手段
(c)手段(b)で得られた1の画分、又は手段(b)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を、手段(a)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する手段
(d)手段(c)で得られた画分を質量分析処理する手段
(e)質量分析情報から、各画分について、手段(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと手段(b)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する手段
(3)試料を分画後標識する態様
(a)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する手段
(b)第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する手段
(c)手段(a)で得られた両分を標識する手段
(d)手段(b)で得られた1の画分、又は手段(b)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を、手段(c)で標識された画分のそれぞれに一定量添加する手段
(e)手段(d)で得られた画分を質量分析処理する手段
(f)質量分析情報から、各画分について、手段(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと手段(b)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する手段
(4)内部標準画分用試料を分画後、標識する態様
(a)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する手段
(b)第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する手段
(c)手段(b)で得られた1の画分、又は手段(b)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を標識する手段
(d)手段(c)で標識された画分又は混合物を、手段(a)で画分のそれぞれに一定量添加する手段
(e)手段(d)で得られた画分を質量分析処理する手段
(f)質量分析情報から、各画分について、手段(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと手段(b)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する手段
(5)試験用タンパク質試料および内部標準画分用の試料を分画後に定量する態様
(a1)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する手段
(a2)手段(a1)で得られた画分を質量分析処理する手段
(a3)手段(a2)で得られた質量分析の情報から手段(a1)で得られた画分中の各タンパク質を同定する手段
(a4)手段(a1)で得られた画分中の各タンパク質を定量する手段
(b1)第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する手段
(b2)手段(b1)で得られた1の画分、又は手段(b1)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を、質量分析処理する手段
(b3)手段(b2)で得られた質量分析の情報から手段(b2)に記載の1の画分又は混合物中の各タンパク質を同定する手段
(b4)手段(b2)に記載の1の画分又は混合物中の各タンパク質を定量する手段
(c)手段(a1)で得られた各画分について、手段(a4)で得られたタンパク質量と手段(b4)で得られたタンパク質量との比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する手段
(6)試験用タンパク質試料および内部標準画分用の試料を分画後に各タンパク質のEMPAIを算出する態様
(a1)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する手段
(a2)手段(a1)で得られた画分を質量分析処理する手段
(a3)手段(a2)で得られた質量分析の情報から手段(a1)で得られた画分中の各タンパク質を同定する手段
(a4)手段(a1)で得られた画分中の各タンパク質のEMPAIを算出する手段
(b1)第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する手段
(b2)手段(b1)で得られた1の画分、又は手段(b1)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を、質量分析処理する手段
(b3)手段(b2)で得られた質量分析の情報から手段(b2)に記載の1の画分又は混合物中の各タンパク質を同定する手段
(b4)手段(b2)に記載の1の画分又は混合物中の各タンパク質のEMPAIを算出する手段
(c)手段(a1)で得られた各画分について、手段(a4)で得られたEMPAIと手段(b4)で得られたEMPAIとの比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する手段
上記の本発明のシステムの態様では、内部標準画分用の試料について、化合物が固定化された担体によって分画するシステムについて示した。本発明には、以下に示すように、内部標準画分用の試料について、化合物が固定化された担体によって分画せずに用いる態様も含まれる。
(7)(1)のシステムの態様において、内部標準用画分である第二のタンパク質群を、化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画せずに手段(a)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する態様
(a)同位体標識された第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する手段
(b)第二のタンパク質群を、手段(a)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する手段
(c)手段(b)で得られた画分を質量分析処理する手段
(d)質量分析情報から、各画分について、手段(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと第二のタンパク質群中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する手段
(8)(2)のシステムの態様において、内部標準用画分である同位体標識された第二のタンパク質群を、化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画せずに手段(a)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する態様
(a)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する手段
(b)同位体標識された第二のタンパク質群を、手段(a)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する手段
(c)手段(b)で得られた画分を質量分析処理する手段
(d)質量分析情報から、各画分について、手段(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと第二のタンパク質群中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する手段
(9)(3)のシステムの態様において、内部標準用画分である第二のタンパク質群を、化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画せずに手段(b)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する態様
(a)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する手段
(b)手段(a)で得られた画分を標識する手段
(c)第二のタンパク質群を、手段(b)で標識された画分のそれぞれに一定量添加する手段
(d)手段(c)で得られた画分を質量分析処理する手段
(e)質量分析情報から、各画分について、手段(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと第二のタンパク質群中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する手段
(10)(5)のシステムの態様において、第二のタンパク質群を、化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画せずに第二のタンパク質群中の各タンパク質を定量する態様
(a1)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する手段
(a2)手段(a1)で得られた画分を質量分析処理する手段
(a3)手段(a2)で得られた質量分析の情報から手段(a1)で得られた画分中の各タンパク質を同定する手段
(a4)手段(a1)で得られた画分中の各タンパク質を定量する手段
(b1)第二のタンパク質群を質量分析処理する手段
(b2)手段(b1)で得られた質量分析の情報から第二のタンパク質群中の各タンパク質を同定する手段
(b3)第二のタンパク質群中の各タンパク質を定量する手段
(c)手段(a1)で得られた各画分について、手段(a4)で得られたタンパク質量と手段(b3)で得られたタンパク質量との比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する手段
(11)(6)のシステムの態様において、第二のタンパク質群を、化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画せずに第二のタンパク質群中の各タンパク質のEMPAIを算出する態様
(a1)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する手段
(a2)手段(a1)で得られた画分を質量分析処理する手段
(a3)手段(a2)で得られた質量分析の情報から手段(a1)で得られた画分中の各タンパク質を同定する手段
(a4)手段(a1)で得られた画分中の各タンパク質のEMPAIを算出する手段
(b1)第二のタンパク質群を質量分析処理する手段
(b2)手段(b1)で得られた質量分析の情報から第二のタンパク質群中の各タンパク質を同定する手段
(b3)第二のタンパク質群中の各タンパク質のEMPAIを算出する手段
(c)手段(a1)で得られた各画分について、手段(a4)で得られたEMPAIと手段(b3)で得られたEMPAIとの比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する手段
(12)本発明のシステムの詳細
図3は、本発明のシステムの構成例を示すブロック図である。図3の例において、本発明のシステムは、制御ユニット301、タンパク質分画ユニット302、タンパク質混合ユニット303及び質量分析ユニット304からなる。
制御ユニット301は、本発明の方法を実行するために必要な各ユニットの動作全体を制御する。タンパク質分画ユニット302、タンパク質混合ユニット303及び質量分析ユニット304は、制御ユニット301にそれぞれ接続され、互いに独立して、又は各ユニットと連携して実行するように制御ユニット301により制御される。例えば、本発明の方法を主としてバッチ式で実行するときは、各ユニット(タンパク質分画ユニット302、タンパク質混合ユニット303及び質量分析ユニット304)はそれぞれ独立して制御され、制御ユニット301はそれぞれのユニットが実行する内容を指示する。また、本発明の方法を主として連続的に流れ作業として実行するときは、制御ユニット301は、それぞれのユニットの実行内容、例えば各ユニットの進行状況を監視し、各ユニットは連携して制御される。
タンパク質分画ユニット302は、カラム内の担体に固定化された化合物に結合したタンパク質を溶出させるためのユニットであり、第一のタンパク質群を複数の画分に分画するための担体、第二のタンパク質群を1又は複数の画分に分画するための担体、細胞培養器、細胞破砕器、担体に結合した化合物の溶出処理器、溶出画分(分画されたタンパク質)の回収器などを備える。分画ユニットに含まれる各構成要素は、制御ユニット301の指令に従って、独立して、又は各構成要素と互いに連携して制御される。
タンパク質混合ユニット303は、タンパク質分画ユニット302により分画されたタンパク質を混合するユニットであり、例えば、上記第一の態様の場合は、同位体標識した第一のタンパク質群試料由来の画分に、第二のタンパク質群試料由来の1の画分又は全画分の混合物若しくは隣り合う画分の複数個の混合物の一定量を添加する工程を制御する。タンパク質混合ユニット303は制御ユニット301に接続されており、添加する量などの指令を制御ユニット301から受けて混合処理する。
質量分析ユニット304は、上記混合されたタンパク質を質量分析にかけるユニットであり、混合されたタンパク質を測定用プレートにスポットするためのスポッター、当該測定プレートを質量分析器にかけるためのトレー等を備える。質量分析ユニット304におけるこれらの構成要素は制御ユニット301に接続されており、制御ユニット301の指令に従って質量分析処理を実行する。
図4は、上記各ユニットの一態様を例示する模式図である。
図4において、タンパク質分画ユニット302は、例えば、培養装置11a及び11b、培養液ボトル12a及び12b、細胞破砕器13a及び13b、標識装置14、化合物が固定化された担体15a及び15b、タンパク質分画用制御装置(以下「制御装置」ともいう)16a及び16b、精製タンパク質分取器17a及び17b、混合器17cなどを備える。
培養装置11a及び11bは、細胞培養を行うための装置であり、温度、CO2濃度などを調節して細胞を所定時間培養する。培養装置11a及び11bには、それぞれ培養液ボトル12a及び12bが接続されており、それぞれチューブ1a及び1bを介して各培養装置に培養液を供給してもよい。培養装置11a及び11bには、それぞれ攪拌羽根2a、2bを供えてもよい。培養装置11a及び11bは、浮遊細胞を培養するための容器として例示してあるが、これは本発明のシステムを説明するための一態様であり、限定されるものではない。従って、培養プレートに付着する細胞を培養する場合は、当業者は目的に応じた培養容器を選択することができる。培養装置11a及び11bは、LAN100を経由して制御ユニット301に接続される。
培養液ボトル12a及び12bは、細胞を培養するための培養液を貯蔵する容器である。本発明の第一の態様および第七の態様では、培養液ボトル12aには、第一のタンパク質を同位体標識するためのアミノ酸などが混合される。図4に示すように、標識装置14を培養液ボトル12aに接続することもできる。培養液ボトル12a及び12bは、LAN100を介して制御ユニット301に接続されていてもよい。
細胞破砕器13a及び13bは、培養された細胞を破砕してタンパク質を得るための装置であり、培養装置11a、11bから細胞を回収して細胞を破砕し、タンパク質の懸濁液を得る工程を実行する。細胞破砕器13a及び13bは、LAN100を介して制御ユニット301に接続されていてもよい。
標識装置14は、タンパク質試料又は分画されたタンパク質画分を標識(例えば同位体標識)するための装置である。図4は、分画する前にタンパク質試料を標識する態様として培養液ボトル12aに標識装置14が接続されている態様を例示する。本発明において第二の態様は、内部標準画分用の試料を分画前に同位体標識するものであるため、標識装置14は、内部標準画分用試料を培養するための培養液(培養液ボトル12b)に接続することができる。
本発明において第八の態様は、内部標準画分用の試料を第一のタンパク質群由来の画分に添加する前に同位体標識するものであるため、標識装置14は、内部標準画分用試料を培養するための培養液(培養液ボトル12b)に接続することができる。
また、本発明において第三及び第四の態様は、試験試料又は内部標準画分用試料を分画後に標識するものであるため、標識装置14は、試験試料を標識するときは担体15aと制御装置16aとの間、制御装置16aと精製タンパク質分取器17aとの間、又は精製タンパク質分取器17aに続いて接続することができ、あるいは内部標準画分用試料を標識するときは担体15bと制御装置16bとの間、制御装置16bと精製タンパク質分取器17bとの間、又は精製タンパク質分取器17b若しくは混合器17cに続いて接続することができる。
本発明において第九の態様は、試験試料を分画後に標識するものであるため、標識装置14は、担体15aと制御装置16aとの間、制御装置16aと精製タンパク質分取器17aとの間、又は精製タンパク質分取器17aに続いて接続することができる。
但し、本発明においては、標識装置14の接続の態様は、上記の態様に限定されるものではなく、本発明の目的達成のために別の態様とし得ることは、当業者であれば容易に理解できる。標識装置14は、LAN100を介して制御ユニット301に接続されていてもよい。
なお、本発明において第五、第六、第十及び第十一の態様は、タンパク質について標識する必要がないため、タンパク質分画ユニット302は標識装置14を備えなくてもよい。
担体15a及び15bは、タンパク質を精製するためのカラムであり、タンパク質との結合力を有する物質が担体に固定されている。
制御装置16a及び16bは、制御ユニット301からの指令に従って、タンパク質をそれぞれ化合物が固定化された担体15a、15bに導入するとともに、溶出溶媒を通過させて溶出されたタンパク質画分を精製タンパク質分取器17a、17bに送る工程を実行する。ここで、溶出溶媒は、溶媒濃度がグラジエント勾配となるように担体に流すこともでき、段階的に濃度が設定された溶媒を流すこともできる。制御装置16a及び16bは、LAN100を介して制御ユニット301に接続されていてもよい。
精製タンパク質分取器17a及び17bは、一方の分画工程で得られたタンパク質と、他方の分画工程で得られたタンパク質とを分取し、画分を得るための装置であり、場合によっては画分を一時貯蔵することもできる。内部標準用タンパク質画分は、その全部、又は隣り合う画分の複数個を混合するための混合器17cを備えることができる。
なお、図4では1種類の分画工程を示しているが、システムを複数並列させて複数種類の分画工程を実行することができるようにし、その結果、複数種類の異なる細胞由来のタンパク質を分画することもできる。
図4は、精製タンパク質分取器17a及び17bが、制御装置16a及び16bにより制御される態様を示しているが、これに限定されるものではなく、独立して、LAN100を介して制御ユニット301に接続されていてもよい。
また、本発明の第七、第八、第九、第十および第十一の態様は、内部標準画分用の試料について、化合物が固定化された担体によって分画せずに用いる態様であるため、タンパク質分画ユニット302は担体15b、制御装置16b、精製タパク質分取器17bおよび混合器17cを備える必要はない。
図4において、タンパク質混合ユニット303は、タンパク質分画ユニット302において分画された第一のタンパク質群由来の画分に、第二のタンパク質群由来の画分を添加するユニットである。タンパク質混合ユニット303は、制御ユニット301からの指令に従って、精製タンパク質分取器17aに配列された画分を選択して、精製タンパク質分取器17b又は混合器17cに配列された画分の一定量を添加する。図4は、溶出された画分1〜画分5(精製タンパク質分取器17aからの画分)を含むそれぞれのチューブ(チューブ18−1〜18−5)に、精製タンパク質分取器17bの画分1〜画分3の混合物を混合器17cから添加する態様を例示してある。
また、本発明の第五、第六、第十および第十一の態様は、第一のタンパク質群由来の画分に、第二のタンパク質群由来の画分または第二のタンパク質群を添加することなく、それぞれの画分またはタンパク質群を質量分析処理する態様であるため、タンパク質混合ユニット303を経ずに、タンパク質分画ユニット302から質量分析ユニット304に進むことができる。したがって、これらの態様では、本発明のシステムは、タンパク質混合ユニット303を備えなくてもよい。
質量分析ユニット304は、質量分析の対象となる1つ又は複数種のタンパク質試料を解析するユニットである。質量分析ユニット304は、制御ユニット301の指令に従って、タンパク質混合ユニット303により混合された試料を質量分析用のプレート19にスポットし、質量分析処理装置20により質量分析処理を実行する。プレート19を質量分析処理装置20に移送するには、コンピュータ制御のロボット型試料取扱装置を用いることもできる。
質量分析は、LAN100を介して制御ユニット301の指令に従って実行される。質量分析処理は、質量分析処理装置20に付属のコンピュータ21を設置して実行させることも可能である。
質量分析処理の情報は、LAN100を介して制御ユニット301に送信され、タンパク質の同定プロファイル、強度比プロファイル、結合力の比プロファイル、質量比プロファイル、EMPAI比プロファイルを得るための処理に付される。
制御ユニット301は、本発明のシステムを実行させるための中央制御ユニットであり、中央コンピュータ30、インターネット通信回線等を備える。
制御ユニット301は、タンパク質の同定を実行するとともに、同位体標識ピークと非標識ピークとの強度比及び結合力の比を決定し、制御ユニット301内の表示装置に表示する。あるいは、制御ユニット301は、同定したタンパク質の情報から指標EMPAIを用いて試験画分中と内部標準画分中の各タンパク質量比又はEMPAI比を決定し、制御ユニット301内の表示装置に表示する。各データは、制御ユニット301により自動整理される。
図5は、制御ユニット301の詳細構成図の一例である。図5において、中央コンピュータ30は、CPU501、送信/受信部502、入力部503、出力部504、ROM505、RAM506、ハードディスクドライブ(HDD)507、CD−ROMドライブ508及びタンパク質データベース(以下「DB」という)509を備える。
CPU501は、本発明のシステム全体の動作を制御するとともに、質量分析結果のデータ、同定されたタンパク質データ、強度比データ、結合力データ等をDB509に記録する。CPU501は、送信/受信部502の通信を制御し、DB509に記憶されているデータを利用して、インターネット511を介して他のタンパク質のデータと照合することもできる。
送信/受信部502は、CPU501の指令に従って、タンパク質分画ユニット302、タンパク質混合ユニット303又は質量分析ユニット304との間でデータの送信及び受信処理を行う。
入力部503は、キーボード、マウス、タッチパネル等であり、ユーザからの情報入力時、データベースの内容更新時等に操作される。出力部504はLCD(液晶ディスプレイ)等であり、各種データベースの更新時等にCPU501からのコードデータをその都度表示用データに変換して表示処理を行う。ROM505は、本発明のシステムの処理プログラムを格納する。RAM506は、本発明のシステムの処理に必要なデータを一時的に格納する。HDD507は、質量分析データ等を格納するためのドライブである。CD−ROMドライブ508は、CPU501からの指令に従って、CD−ROM510に格納されている、本発明のシステムの実行(各種態様の実行)に必要なプログラム等を読み出してRAM506等に書き込む。CD−ROMの代わりに記録媒体として書き換え可能なCD−R、CD−RW等を用いることもできる。その場合には、CD−ROMドライブ508の代わりにCD−R又はCD−RW用ドライブを設ける。また、上記媒体の他に、DVD、MO、フラッシュメモリースティック等の媒体を用い、それに対応するドライブを備える構成としても良い。
中央コンピュータ30は、タンパク質群の分画ユニット302、混合ユニット303、質量分析ユニット304と通信し、これらのユニットが機能するように、制御情報を送信するとともに、タンパク質の同定結果及びタンパク質の質量分析結果を受信して同定結果、強度比、結合力比、タンパク質量比、EMPAI比などの同定結果を表示する。
以下、制御ユニットの動作(第一の態様)の例を、図面(図6)を用いて説明する。
制御ユニット301の中央コンピュータ30は、本発明の実施に必要な培養液、タンパク質試料(細胞)、その他の試薬を一方の培養装置11aに充填するよう充填装置に命令するとともに、タンパク質の標識に必要な同位体標識物質(同位体標識されたアミノ酸等)を添加するよう標識装置14に命令し、標識装置14は同位体標識物質の添加を実行する(S601a)。これと並行して、中央コンピュータ30は、本発明の実施に必要な培養液、試料(細胞)その他の試薬を他方の培養装置11bに充填するよう、試薬充填装置(図示せず)に命令し、充填装置(図示せず)は充填を実行する(S601b)。各培養装置11a、11bへの培養液等の充填が完了すると、中央コンピュータ30は次に、所定条件で培養するよう各培養装置11a、11bに命令し、各培養装置11a、11bは培養を実行する(S602a、S602b)。
「所定条件」としては、培養時間、培養温度、CO2濃度、攪拌の有無などが挙げられる。所定条件での培養が終了した後、中央コンピュータ30は、細胞破砕工程を実施するよう、細胞破砕器13a、13bに命令し、各細胞破砕器13a、13bは細胞破砕を実行する(S603a、S603b)。S603aにより同位体標識物質含有培地から採取された細胞を破砕した後は、次に、中央コンピュータ30は所定の物質(化合物)が固定化された担体15aにタンパク質分画工程を実施するよう命令し、当該担体はタンパク質(試験用の第一のタンパク質群)の分画を実行する(S604a)。他方、S603bにより同位体を含有しない培地から採取された細胞を破砕した後は、次に、中央コンピュータ30は所定の化合物が固定化された担体15bにタンパク質分画工程を実施するよう命令し、当該担体はタンパク質(内部標準用の第二のタンパク質群)の分画を実行する(S604b)。タンパク質の分画が完了すると、中央コンピュータ30は、後に実施する混合(S606、S607)に備えて、タンパク質分画用制御装置16a及び16bに、タンパク質試料を精製タンパク質分取器17a、17bにて分取後、一時保存するよう命令し、当該制御装置は分取及び一時保存を実行する(S605a、S605b)。但し、当該一時保存を実行するか否かは任意である。次に、中央コンピュータ30は、内部標準用の第二のタンパク質群由来の画分の全部を混合するよう命令するか、あるいは隣り合う画分の複数個を混合するよう混合器17cに命令し、混合器17cはタンパク質画分の混合を実行する(S606)。但し、分画された画分が1つのときは、混合器17cによる第二のタンパク質群由来の画分の混合は行われない。その後、中央コンピュータ30は、タンパク質混合ユニット303に対し、試験用タンパク質画分のそれぞれに内部標準用タンパク質画分を添加するよう命令し、タンパク質混合ユニット303は一定量の内部標準用タンパク質画分を試験用タンパク質画分のそれぞれに添加混合する(S607)。
S607において混合が完了すると、中央コンピュータ30は、質量分析のための試料を調製するよう命令する(S608)。但し、当該調製を実行するか否かは任意である。次に中央コンピュータ30は、スポッター(図示せず)が調製後の試料を質量分析用プレート(例えば図4のプレート19)にスポットし、続いて質量分析装置が試料の質量分析を開始するよう命令し、スポッターはスポットを実行し、質量分析装置はその分析を実行する(S609)。
中央コンピュータ30は、タンパク質を同定するとともに(S610)、各タンパク質の標識ピークと非標識ピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の結合力の比を定量する(S611)。タンパク質の同定結果、強度比のデータは中央コンピュータ30に報告され、出力装置又はコンピュータのディスプレイは、当該同定結果及び強度比を表示するとともに(S612)、ある化合物に結合しうるタンパク質の結合の強さについて序列を作成する。
中央コンピュータ30は、強度比及び同定結果のデータを既存の情報と照会するとともに、ハードディスクに蓄積してデータベース化を実行する(S613)。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
(1)化合物を固定したアフィニティークロマトグラフィーカラムの作製
次式(1):
で表される化合物の約10mgをテトラヒドロフラン(THF)4ml、メタノール(MeOH)4mlに溶かし、さらに水(Water)4mlを加えた。
この液6mLをTHF/MeOH/Water=1/1/1(v/v/v)18mlで希釈し、あらかじめTHF/MeOH/Water=1/1/1(v/v/v)で洗浄しておいたアフィゲル10(バイオラド社製、カタログ番号153−6099)25mlに加えた。
そこに、100μlのトリエチルアミン(東京化成工業社製、カタログ番号T0424)を加え、室温にて2時間インキュベーションした。続いて、500μlの2−アミノエタノール(東京化成工業社製、カタログ番号A0297)を加え、室温にて2時間インキュベーションした。そして、このゲルをTHF/MeOH/Water=1/1/1(v/v/v)で十分洗浄し、メタノール液に置換後4℃にて保存し、これをアフィニティーゲルとした。なお、この反応で式(1)で表される化合物は、ゲル1mlあたり約0.2mg結合した。作製したアフィニティーゲル約0.9mlをカラムに充填して、アフィニティークロマトグラフィーカラムとした。
(2)細胞の調製
ヒト結腸腺癌細胞株HCT116(ATCC)を培養した。培地には、10%牛胎児血清(MOREGATE社、BATCH32300102)、100U/mlペニシリンG、100μg/mlストレプトマイシン(Invitrogen社、15140−122)を含むRPMI−1640(Sigma社、R−7130)を用いた。RPMI−1640としては、L−グルタミン、L−リジン、L−メチオニン、L−ロイシン、炭酸水素ナトリウムを含まない粉末培地を選択し、当該培地に欠損した成分を加えて調製した。欠損成分の添加手法として、L−グルタミン(Sigma社製、G−8540)、L−リジン(Sigma社製、L−9037)、L−メチオニン(Sigma社製、M−5308)、炭酸水素ナトリウム(和光純薬、191−01305)をそれぞれ0.3g/L、0.04g/L、0.015g/L、2g/L加え、さらに、天然型のL−ロイシン又は安定同位体13C(6個)で標識されたL−ロイシン(Cambridge Isotope Laboratories社、CLM−2262)を0.05g/L加えた。このようにして調製した培地を用いて、5%CO2下37℃で培養した。この培養によって得られた細胞を、それぞれ天然型培地で培養した細胞、安定同位体培地で培養した細胞として以下の実験に用いた。
(3)タンパク質の抽出
安定同位体培地で培養した細胞を15センチ皿10枚分、天然型培地で培養した細胞を15センチ皿10枚分、それぞれ用意し、細胞を集めた。15センチ皿1枚あたり約2mlのM−PER(PIERCE社、78501)で可溶化し、遠心分離により不溶性画分を除去して可溶性画分を調製した。こうして得られた可溶性画分を、それぞれ代謝的に安定同位体で標識されたタンパク質抽出液、代謝的に安定同位体で標識されていないタンパク質抽出液とした。これらタンパク質抽出液(各約20ml)に4倍量のPBSを加えた(最終量各約100ml)。
(4)アフィニティーカラム操作
次に、アフィニティーゲル約0.9mlをオープンカラムとし、上から希釈済みの代謝的に安定同位体で標識されたタンパク質抽出液を加えて自然落下させた。続いて、1M NaClを含むPBS10mlをこのカラムに流した。そして、1M尿素、0.01%CHAPSを含むPBS7ml、2M尿素、0.01%CHAPSを含むPBS7ml、4M尿素、0.01%CHAPSを含むPBS7ml、8M尿素、0.01%CHAPSを含むPBS7ml、を順次流し、各溶出画分を集めた(合計4画分)。
この操作と並行して、希釈済みの代謝的に安定同位体で標識されていないタンパク質抽出液を、アフィニティーゲル約0.9mlに対して上から加えて自然落下させた。続いて、1M NaClを含むPBS10mlをこのカラムに流した。そして、8M尿素、0.01%CHAPSを含むPBS12mlを流して溶出画分を集めて、内部標準画分とした。
(5)分画された試料の処理
分画された4つの試料に対して、内部標準画分を3mlずつ加えて混合した。この混合液をAmicon Ultra−15 10,000MWCO(ミリポア、カタログ番号UFC901096)で約0.5mlまで濃縮した後、BIOMAX−10 K NMWL MEMBRANE0.5ml(ミリポア、カタログ番号UFV5BGC00)で約25μlに濃縮した。これをSDS−PAGEサンプルバッファーと等量混合後、その全量をSDS−PAGE(ディー・アール・シー株式会社、5−20%Tゲル、1mm、7well、4cm、200V)で分離し、泳動レーンを12等分してゲル内トリプシン消化を行い、消化されたタンパク質溶液とした(H.Katayama,T.Tabata,Y.Ishihama,T.Sato,Y.Oda and T.Nagasu,Rapid Commun.Mass Spectrom.,18,2388−2394(2004))。
(6)LC/MSによる測定
消化されたタンパク質溶液を、8μlの0.1%トリフルオロ酢酸を含む5%アセトニトリルに溶かし、LC/MSの測定対象のタンパク質溶液とした。MSとしてはLTQ(Thermo Electron社製)で測定を行った。LC/MSのLCとしては自家製のODSカラム(Y.Ishihama,J.Rappsilber,J.S.Andersen,M.Mann,J.Chromatogr A.979,233−239(2002).、内径0.2mm、長さ約15センチ)を用いた。移動相として0.5%酢酸を含み、最初の1分間でアセトニトリル濃度を4%にして、その後35分間でアセトニトリル濃度を20%まで直線的に増加させて、その後0.1分間でアセトニトリル濃度を80%にして5分間維持し、その後アセトニトリル濃度を0%として12分後に次のサンプルを注入した。
ポンプには島津製作所のLC−10AシリーズのROMをミクロ対応として、また、ミキシングチャンバーとしては付属の島津製作所製を外してバルコ社のTコネクターを採用した。
流速としてはFlow−splitting方式を採用し、カラムには約毎分0.5−1μLの流速となるように調製した。測定対象のタンパク質溶液をCTC社のオートサンプラーPALによってカラムに3μL注入した。カラムの出口から溶出物を直接スプレーして得られたイオンをLTQ内に送り込むことで測定を行った。スプレー電圧としては2.4kVを印加した。測定は、Data DependentモードでDynamic ExclusionのRepeatを1とした。なお、スキャン回数を稼ぐためにZoom Scanモードを外したいわゆるダブルプレーモードで測定した。
(7)データ解析
得られたデータについては、X!Tandem(http://thegpm.org/GPM/index.html)及びNCBInrデータベースを用いてタンパク質の自動同定を行った。このとき、安定同位体で標識したロイシン(ロイシン1つにつき分子量6の増加)でもNCBInrに対して検索できるように、プログラムの一部を改変した。
定量は、ロイシンを含むペプチドのピークで行うため、X!Tandemにより同定されたペプチドのうち、ロイシンを含むペプチドのみを選び出し、かつ、そのペプチドピークの溶出位置(HPLCでの保持時間=MSでのスキャン番号)を特定するために三井情報開発株式会社と共同開発したMass Navigatorの機能を利用してスキャン情報を自動で選び出すソフトウエアを構築した。そして、そのスキャン番号の情報から、そのスキャン番号のMSスペクトルを抜き出し、天然型ロイシンペプチドのピークと同位体ペプチドのピークについて、MS/MSを測定した際の親イオンの情報(m(質量数)/z(電荷)値)とそのペプチド内に何個のロイシンがあるか、そして、電荷は何個かをX!Tandemでの検索結果から求めて、ペアとなるピークを探し、そのピーク強度比を自動計算した。このように構築した解析ソフトウエアを用いてタンパク質の同定及びピーク強度比の算出を行った。
(8)結果
結果を表1に示す。
表1において、各濃度の尿素(Urea)の欄に記載の数字はピーク強度比(標識体ピーク面積/非標識体ピーク面積)を表す。表1において、尿素の濃度が大きいほど溶出力が強くなり、表1中の強度比の数値が大きいほど、その分画で多く溶出していることを意味する。本実施例では尿素濃度を1M,2M,4M,8Mの4段階に分け順次溶出させたので、8M尿素の分画にピークトップが現われるタンパク質ほど式(1)に示す化合物との結合力が強い。また、この8M尿素の分画のみの結果を見た場合、数値が大きなタンパク質ほど、この画分に多く濃縮、つまり結合が強いということになる。
本実施例では、AHCYは、8M尿素の画分に、PCMT1は、4M尿素の画分に、OS9は、2M尿素の画分に、SPRY4は、1M尿素の画分にそれぞれピークトップが現れている(表1)。よって、式(1)に示す化合物に対する各タンパク質の結合力は、AHCY、PCMT1、OS9、SPRY4の順に強いということが解析できる。また、各タンパク質について、8M尿素の画分におけるピーク強度比を比較した場合にも、AHCY、PCMT1、OS9、SPRY4の順に数値が大きく、式(1)に示す化合物に対する各タンパク質の結合力は、AHCY、PCMT1、OS9、SPRY4の順に強いということが解析できる。なお、MTAPは、4つの画分とも同程度の値0.8前後であるため、ピークトップが不明確であり、明確な溶出画分が特定できないものである。
次式(1):
で表される化合物の約10mgをテトラヒドロフラン(THF)4ml、メタノール(MeOH)4mlに溶かし、さらに水(Water)4mlを加えた。
この液6mLをTHF/MeOH/Water=1/1/1(v/v/v)18mlで希釈し、あらかじめTHF/MeOH/Water=1/1/1(v/v/v)で洗浄しておいたアフィゲル10(バイオラド社製、カタログ番号153−6099)25mlに加えた。
そこに、100μlのトリエチルアミン(東京化成工業社製、カタログ番号T0424)を加え、室温にて2時間インキュベーションした。続いて、500μlの2−アミノエタノール(東京化成工業社製、カタログ番号A0297)を加え、室温にて2時間インキュベーションした。そして、このゲルをTHF/MeOH/Water=1/1/1(v/v/v)で十分洗浄し、メタノール液に置換後4℃にて保存し、これをアフィニティーゲルとした。なお、この反応で式(1)で表される化合物は、ゲル1mlあたり約0.2mg結合した。作製したアフィニティーゲル約0.9mlをカラムに充填して、アフィニティークロマトグラフィーカラムとした。
(2)細胞の調製
ヒト結腸腺癌細胞株HCT116(ATCC)を培養した。培地には、10%牛胎児血清(MOREGATE社、BATCH32300102)、100U/mlペニシリンG、100μg/mlストレプトマイシン(Invitrogen社、15140−122)を含むRPMI−1640(Sigma社、R−7130)を用いた。RPMI−1640としては、L−グルタミン、L−リジン、L−メチオニン、L−ロイシン、炭酸水素ナトリウムを含まない粉末培地を選択し、当該培地に欠損した成分を加えて調製した。欠損成分の添加手法として、L−グルタミン(Sigma社製、G−8540)、L−リジン(Sigma社製、L−9037)、L−メチオニン(Sigma社製、M−5308)、炭酸水素ナトリウム(和光純薬、191−01305)をそれぞれ0.3g/L、0.04g/L、0.015g/L、2g/L加え、さらに、天然型のL−ロイシン又は安定同位体13C(6個)で標識されたL−ロイシン(Cambridge Isotope Laboratories社、CLM−2262)を0.05g/L加えた。このようにして調製した培地を用いて、5%CO2下37℃で培養した。この培養によって得られた細胞を、それぞれ天然型培地で培養した細胞、安定同位体培地で培養した細胞として以下の実験に用いた。
(3)タンパク質の抽出
安定同位体培地で培養した細胞を15センチ皿10枚分、天然型培地で培養した細胞を15センチ皿10枚分、それぞれ用意し、細胞を集めた。15センチ皿1枚あたり約2mlのM−PER(PIERCE社、78501)で可溶化し、遠心分離により不溶性画分を除去して可溶性画分を調製した。こうして得られた可溶性画分を、それぞれ代謝的に安定同位体で標識されたタンパク質抽出液、代謝的に安定同位体で標識されていないタンパク質抽出液とした。これらタンパク質抽出液(各約20ml)に4倍量のPBSを加えた(最終量各約100ml)。
(4)アフィニティーカラム操作
次に、アフィニティーゲル約0.9mlをオープンカラムとし、上から希釈済みの代謝的に安定同位体で標識されたタンパク質抽出液を加えて自然落下させた。続いて、1M NaClを含むPBS10mlをこのカラムに流した。そして、1M尿素、0.01%CHAPSを含むPBS7ml、2M尿素、0.01%CHAPSを含むPBS7ml、4M尿素、0.01%CHAPSを含むPBS7ml、8M尿素、0.01%CHAPSを含むPBS7ml、を順次流し、各溶出画分を集めた(合計4画分)。
この操作と並行して、希釈済みの代謝的に安定同位体で標識されていないタンパク質抽出液を、アフィニティーゲル約0.9mlに対して上から加えて自然落下させた。続いて、1M NaClを含むPBS10mlをこのカラムに流した。そして、8M尿素、0.01%CHAPSを含むPBS12mlを流して溶出画分を集めて、内部標準画分とした。
(5)分画された試料の処理
分画された4つの試料に対して、内部標準画分を3mlずつ加えて混合した。この混合液をAmicon Ultra−15 10,000MWCO(ミリポア、カタログ番号UFC901096)で約0.5mlまで濃縮した後、BIOMAX−10 K NMWL MEMBRANE0.5ml(ミリポア、カタログ番号UFV5BGC00)で約25μlに濃縮した。これをSDS−PAGEサンプルバッファーと等量混合後、その全量をSDS−PAGE(ディー・アール・シー株式会社、5−20%Tゲル、1mm、7well、4cm、200V)で分離し、泳動レーンを12等分してゲル内トリプシン消化を行い、消化されたタンパク質溶液とした(H.Katayama,T.Tabata,Y.Ishihama,T.Sato,Y.Oda and T.Nagasu,Rapid Commun.Mass Spectrom.,18,2388−2394(2004))。
(6)LC/MSによる測定
消化されたタンパク質溶液を、8μlの0.1%トリフルオロ酢酸を含む5%アセトニトリルに溶かし、LC/MSの測定対象のタンパク質溶液とした。MSとしてはLTQ(Thermo Electron社製)で測定を行った。LC/MSのLCとしては自家製のODSカラム(Y.Ishihama,J.Rappsilber,J.S.Andersen,M.Mann,J.Chromatogr A.979,233−239(2002).、内径0.2mm、長さ約15センチ)を用いた。移動相として0.5%酢酸を含み、最初の1分間でアセトニトリル濃度を4%にして、その後35分間でアセトニトリル濃度を20%まで直線的に増加させて、その後0.1分間でアセトニトリル濃度を80%にして5分間維持し、その後アセトニトリル濃度を0%として12分後に次のサンプルを注入した。
ポンプには島津製作所のLC−10AシリーズのROMをミクロ対応として、また、ミキシングチャンバーとしては付属の島津製作所製を外してバルコ社のTコネクターを採用した。
流速としてはFlow−splitting方式を採用し、カラムには約毎分0.5−1μLの流速となるように調製した。測定対象のタンパク質溶液をCTC社のオートサンプラーPALによってカラムに3μL注入した。カラムの出口から溶出物を直接スプレーして得られたイオンをLTQ内に送り込むことで測定を行った。スプレー電圧としては2.4kVを印加した。測定は、Data DependentモードでDynamic ExclusionのRepeatを1とした。なお、スキャン回数を稼ぐためにZoom Scanモードを外したいわゆるダブルプレーモードで測定した。
(7)データ解析
得られたデータについては、X!Tandem(http://thegpm.org/GPM/index.html)及びNCBInrデータベースを用いてタンパク質の自動同定を行った。このとき、安定同位体で標識したロイシン(ロイシン1つにつき分子量6の増加)でもNCBInrに対して検索できるように、プログラムの一部を改変した。
定量は、ロイシンを含むペプチドのピークで行うため、X!Tandemにより同定されたペプチドのうち、ロイシンを含むペプチドのみを選び出し、かつ、そのペプチドピークの溶出位置(HPLCでの保持時間=MSでのスキャン番号)を特定するために三井情報開発株式会社と共同開発したMass Navigatorの機能を利用してスキャン情報を自動で選び出すソフトウエアを構築した。そして、そのスキャン番号の情報から、そのスキャン番号のMSスペクトルを抜き出し、天然型ロイシンペプチドのピークと同位体ペプチドのピークについて、MS/MSを測定した際の親イオンの情報(m(質量数)/z(電荷)値)とそのペプチド内に何個のロイシンがあるか、そして、電荷は何個かをX!Tandemでの検索結果から求めて、ペアとなるピークを探し、そのピーク強度比を自動計算した。このように構築した解析ソフトウエアを用いてタンパク質の同定及びピーク強度比の算出を行った。
(8)結果
結果を表1に示す。
本実施例では、AHCYは、8M尿素の画分に、PCMT1は、4M尿素の画分に、OS9は、2M尿素の画分に、SPRY4は、1M尿素の画分にそれぞれピークトップが現れている(表1)。よって、式(1)に示す化合物に対する各タンパク質の結合力は、AHCY、PCMT1、OS9、SPRY4の順に強いということが解析できる。また、各タンパク質について、8M尿素の画分におけるピーク強度比を比較した場合にも、AHCY、PCMT1、OS9、SPRY4の順に数値が大きく、式(1)に示す化合物に対する各タンパク質の結合力は、AHCY、PCMT1、OS9、SPRY4の順に強いということが解析できる。なお、MTAPは、4つの画分とも同程度の値0.8前後であるため、ピークトップが不明確であり、明確な溶出画分が特定できないものである。
本発明により、化合物に結合しうる複数種の物質群(タンパク質)の結合の強さについて序列を作ることができる。本発明の方法により、複数種の未知物質問について、化合物に対する結合力を解析することが可能となった。本発明の方法によれば、対象物質が未知で、かつ混合試料においてそれぞれの物質同士が分離不十分な場合であっても適用できる点で有用である。
Claims (33)
- 化合物に対するタンパク質の結合力を解析する方法であって、以下の工程:
(a)同位体標識された第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する工程と、
(b)第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する工程と、
(c)工程(b)で得られた1の画分、又は工程(b)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を、工程(a)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する工程と、
(d)工程(c)で得られた画分を質量分析処理する工程と、
(e)質量分析情報から、各画分について、工程(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと工程(b)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程と
を含む、前記方法。 - 化合物に対するタンパク質の結合力を解析する方法であって、以下の工程:
(a)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する工程と、
(b)同位体標識された第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する工程と、
(c)工程(b)で得られた1の画分、又は工程(b)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を、工程(a)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する工程と、
(d)工程(c)で得られた画分を質量分析処理する工程と、
(e)質量分析情報から、各画分について、工程(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと工程(b)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程と
を含む、前記方法。 - 化合物に対するタンパク質の結合力を解析する方法であって、以下の工程:
(a)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する工程と、
(b)第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する工程と、
(c)工程(a)で得られた画分を標識する工程と、
(d)工程(b)で得られた1の画分、又は工程(b)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を、工程(c)で標識された画分のそれぞれに一定量添加する工程と、
(e)工程(d)で得られた画分を質量分析処理する工程と、
(f)質量分析情報から、各画分について、工程(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと工程(b)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程と
を含む、前記方法。 - 化合物に対するタンパク質の結合力を解析する方法であって、以下の工程:
(a)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する工程と、
(b)第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する工程と、
(c)工程(b)で得られた1の画分、又は工程(b)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を標識する工程と、
(d)工程(c)で標識された画分又は混合物を、工程(a)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する工程と、
(e)工程(d)で得られた画分を質量分析処理する工程と、
(f)質量分析情報から、各画分について、工程(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと工程(b)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程と
を含む、前記方法。 - 工程(a)および/または工程(b)の分画する工程が、溶出溶媒の強度を変化させることにより分画する工程である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 質量分析情報から、各画分に含まれる各タンパク質を同定する工程とをさらに含む請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程が、遅く溶出された画分に濃縮されているタンパク質ほど前記化合物に対する結合力が強いと判断することによって、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1もしくは2に記載の工程(e)または請求項3もしくは4に記載の工程(f)が、質量分析情報から、各画分について、工程(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと工程(b)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、各タンパク質がいずれの画分に濃縮されているかを決定し、複数種のタンパク質について、遅く溶出された画分に濃縮されているタンパク質ほど前記化合物に対する結合力が強いと判断することによって、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 化合物に対するタンパク質の結合力を解析する方法であって、以下の工程:
(a)同位体標識された第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する工程と、
(b)第二のタンパク質群を、工程(a)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する工程と、
(c)工程(b)で得られた画分を質量分析処理する工程と、
(d)質量分析情報から、各画分について、工程(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと第二のタンパク質群中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程と
を含む、前記方法。 - 化合物に対するタンパク質の結合力を解析する方法であって、以下の工程:
(a)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する工程と、
(b)同位体標識された第二のタンパク質群を、工程(a)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する工程と、
(c)工程(b)で得られた画分を質量分析処理する工程と、
(d)質量分析情報から、各画分について、工程(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと第二のタンパク質群中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程と
を含む、前記方法。 - 化合物に対するタンパク質の結合力を解析する方法であって、以下の工程:
(a)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する工程と、
(b)工程(a)で得られた画分を標識する工程と、
(c)第二のタンパク質群を、工程(b)で標識された画分のそれぞれに一定量添加する工程と、
(d)工程(c)で得られた画分を質量分析処理する工程と、
(e)質量分析情報から、各画分について、工程(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと第二のタンパク質群中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程と
を含む、前記方法。 - 工程(a)の分画する工程が、溶出溶媒の強度を変化させることにより分画する工程である、請求項9〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 質量分析情報から、各画分に含まれる各タンパク質を同定する工程とをさらに含む請求項9〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程が、遅く溶出された画分に濃縮されているタンパク質ほど前記化合物に対する結合力が強いと判断することによって、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程である、請求項9〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項9もしくは10に記載の工程(d)または請求項11に記載の工程(e)が、質量分析情報から、各画分について、工程(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと第二のタンパク質群中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、各タンパク質がいずれの画分に濃縮されているかを決定し、複数種のタンパク質について、遅く溶出された画分に濃縮されているタンパク質ほど前記化合物に対する結合力が強いと判断することによって、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程である、請求項9〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 化合物に対するタンパク質の結合力を解析する方法であって、以下の工程:
(a1)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する工程と、
(a2)工程(a1)で得られた画分を質量分析処理する工程と、
(a3)工程(a2)で得られた質量分析の情報から工程(a1)で得られた画分中の各タンパク質を同定する工程と、
(a4)工程(a1)で得られた画分中の各タンパク質を定量する工程と、
(b1)第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する工程と、
(b2)工程(b1)で得られた1の画分、又は工程(b1)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を、質量分析処理する工程と、
(b3)工程(b2)で得られた質量分析の情報から工程(b2)に記載の1の画分又は混合物中の各タンパク質を同定する工程と、
(b4)工程(b2)に記載の1の画分又は混合物中の各タンパク質を定量する工程と、
(c)工程(a1)で得られた各画分について、工程(a4)で得られたタンパク質量と工程(b4)で得られたタンパク質量との比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程と
を含む、前記方法。 - 化合物に対するタンパク質の結合力を解析する方法であって、以下の工程:
(a1)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する工程と、
(a2)工程(a1)で得られた画分を質量分析処理する工程と、
(a3)工程(a2)で得られた質量分析の情報から工程(a1)で得られた画分中の各タンパク質を同定する工程と、
(a4)工程(a1)で得られた画分中の各タンパク質のEMPAIを算出する工程と、
(b1)第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する工程と、
(b2)工程(b1)で得られた1の画分、又は工程(b1)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を、質量分析処理する工程と、
(b3)工程(b2)で得られた質量分析の情報から工程(b2)に記載の1の画分又は混合物中の各タンパク質を同定する工程と、
(b4)工程(b2)に記載の1の画分又は混合物中の各タンパク質のEMPAIを算出する工程と、
(c)工程(a1)で得られた各画分について、工程(a4)で得られたEMPAIと工程(b4)で得られたEMPAIとの比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程と
を含む、前記方法。 - 工程(a1)および/または工程(b1)の分画する工程が、溶出溶媒の強度を変化させることにより分画する工程である、請求項16または17に記載の方法。
- 化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程が、遅く溶出された画分に濃縮されているタンパク質ほど前記化合物に対する結合力が強いと判断することによって、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程である、請求項16または17に記載の方法。
- 工程(c)が、工程(a1)で得られた各画分について、工程(a4)で得られたタンパク質量と工程(b4)で得られたタンパク質量との比を求めて、各タンパク質がいずれの画分に濃縮されているかを決定し、複数種のタンパク質について、遅く溶出された画分に濃縮されているタンパク質ほど前記化合物に対する結合力が強いと判断することによって、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程である、請求項16に記載の方法。
- 工程(c)が、工程(a1)で得られた各画分について、工程(a4)で得られたEMPAIと工程(b4)で得られたEMPAIとの比を求めて、各タンパク質がいずれの画分に濃縮されているかを決定し、複数種のタンパク質について、遅く溶出された画分に濃縮されているタンパク質ほど前記化合物に対する結合力が強いと判断することによって、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程である、請求項17に記載の方法。
- 化合物に対するタンパク質の結合力を解析する方法であって、以下の工程:
(a1)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する工程と、
(a2)工程(a1)で得られた画分を質量分析処理する工程と、
(a3)工程(a2)で得られた質量分析の情報から工程(a1)で得られた画分中の各タンパク質を同定する工程と、
(a4)工程(a1)で得られた画分中の各タンパク質を定量する工程と、
(b1)第二のタンパク質群を質量分析処理する工程と、
(b2)工程(b1)で得られた質量分析の情報から第二のタンパク質群中の各タンパク質を同定する工程と、
(b3)第二のタンパク質群中の各タンパク質を定量する工程と、
(c)工程(a1)で得られた各画分について、工程(a4)で得られたタンパク質量と工程(b3)で得られたタンパク質量との比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程と
を含む、前記方法。 - 化合物に対するタンパク質の結合力を解析する方法であって、以下の工程:
(a1)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する工程と、
(a2)工程(a1)で得られた画分を質量分析処理する工程と、
(a3)工程(a2)で得られた質量分析の情報から工程(a1)で得られた画分中の各タンパク質を同定する工程と、
(a4)工程(a1)で得られた画分中の各タンパク質のEMPAIを算出する工程と、
(b1)第二のタンパク質群を質量分析処理する工程と、
(b2)工程(b1)で得られた質量分析の情報から第二のタンパク質群中の各タンパク質を同定する工程と、
(b3)第二のタンパク質群中の各タンパク質のEMPAIを算出する工程と、
(c)工程(a1)で得られた各画分について、工程(a4)で得られたEMPAIと工程(b3)で得られたEMPAIとの比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程と
を含む、前記方法。 - 工程(a1)の分画する工程が、溶出溶媒の強度を変化させることにより分画する工程である、請求項22または23に記載の方法。
- 化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程が、遅く溶出された画分に濃縮されているタンパク質ほど前記化合物に対する結合力が強いと判断することによって、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程である、請求項22または23に記載の方法。
- 工程(c)が、工程(a1)で得られた各画分について、工程(a4)で得られたタンパク質量と工程(b3)で得られたタンパク質量との比を求めて、各タンパク質がいずれの画分に濃縮されているかを決定し、複数種のタンパク質について、遅く溶出された画分に濃縮されているタンパク質ほど前記化合物に対する結合力が強いと判断することによって、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程である、請求項22に記載の方法。
- 工程(c)が、工程(a1)で得られた各画分について、工程(a4)で得られたEMPAIと工程(b3)で得られたEMPAIとの比を求めて、各タンパク質がいずれの画分に濃縮されているかを決定し、複数種のタンパク質について、遅く溶出された画分に濃縮されているタンパク質ほど前記化合物に対する結合力が強いと判断することによって、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する工程である、請求項23に記載の方法。
- 化合物に対するタンパク質の結合力を解析するためのシステムであって、以下の手段:
(a)同位体標識された第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する手段と、
(b)第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する手段と、
(c)手段(b)で得られた1の画分、又は手段(b)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を、手段(a)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する手段と、
(d)手段(c)で得られた画分を質量分析処理する手段と、
(e)質量分析情報から、各画分について、手段(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと手段(b)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する手段と
を含む、前記システム。 - 化合物に対するタンパク質の結合力を解析するためのシステムであって、以下の手段:
(a)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する手段と、
(b)同位体標識された第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する手段と、
(c)手段(b)で得られた1の画分、又は手段(b)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を、手段(a)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する手段と、
(d)手段(c)で得られた画分を質量分析処理する手段と、
(e)質量分析情報から、各画分について、手段(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと手段(b)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する手段と
を含む、前記システム。 - 化合物に対するタンパク質の結合力を解析するためのシステムであって、以下の手段:
(a)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する手段と、
(b)第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する手段と、
(c)手段(a)で得られた画分を標識する手段と、
(d)手段(b)で得られた1の画分、又は手段(b)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を、手段(c)で標識された画分のそれぞれに一定量添加する手段と、
(e)手段(d)で得られた画分を質量分析処理する手段と、
(f)質量分析情報から、各画分について、手段(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと手段(b)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する手段と
を含む、前記システム。 - 化合物に対するタンパク質の結合力を解析するためのシステムであって、以下の手段:
(a)第一のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて複数の画分に分画する手段と、
(b)第二のタンパク質群を、前記化合物が固定化された担体を用いて1又は複数の画分に分画する手段と、
(c)手段(b)で得られた1の画分、又は手段(b)で得られた画分のうち、全画分の混合物若しくは隣り合う複数個の画分の混合物を標識する手段と、
(d)手段(c)で標識された画分又は混合物を、手段(a)で得られた画分のそれぞれに一定量添加する手段と、
(e)手段(d)で得られた画分を質量分析処理する手段と、
(f)質量分析情報から、各画分について、手段(a)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークと手段(b)で得られた画分中のタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、複数種のタンパク質について、前記化合物に対するタンパク質の結合力の強度を比較する手段と
を含む、前記システム。 - 手段(a)および/または手段(b)の分画する手段が、溶出溶媒の強度を変化させることにより分画する手段である、請求項28〜31のいずれか一項に記載のシステム。
- 質量分析情報から、各画分に含まれる各タンパク質を同定する手段とをさらに含む請求項28〜32のいずれか一項に記載のシステム。
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