JPWO2006004213A1 - タンパク質構造親和性相関の解析方法 - Google Patents
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Abstract
Description
近年、創薬上の特定の標的タンパク質を定めた場合には、HTS(High Throughput Screening)等の手法により、数多くの化合物群の中からその標的に対して最適な化合物をスクリーニングすることが可能になり、このスタイルが創薬研究の主流になっている。しかしながら、選び出された化合物のタンパク質に対する特異性(結合、相互作用など)については、数種類程度のタンパク質について確認する程度であって、より網羅的な特異性の検討は行われていない。
そして、薬剤候補品の真の標的分子やその標的分子が関わる情報伝達経路を同定することは、薬効、副作用の機序を明らかにすることにつながり、臨床試験で他薬剤との薬効、副作用等の差別化を図る上で大きな役割を果たす。薬剤の標的分子探索にはいくつかの手法があるが、薬剤と標的タンパク質の相互作用の直接的な証明は、最終的には生化学的な実験で立証しなければならない。
一方、プロテオミクスでは薬剤の結合タンパク質を直接、質量分析計(MS)で解析することができ、タンパク質試料は、培養細胞由来でも臓器由来でも良いといった、ジェネティクスにはない魅力がある。
ある特定のタンパク質を単離する手法として、アフィニティークロマトグラフィーが広く用いられている。化合物の結合タンパク質を単離する目的でアフィニティークロマトグラフィーを用いた代表例として、免疫抑制剤FK506のターゲットタンパク質であるcis−trans peptidyl−prolyl isomerase(FKBP)を同定した例があげられる1、2)。Hardingらは,活性を保持した状態でFK506をアフィニティーマトリックスに固定化し,脾臓から調製したライセートをカラムに流した。そして、リガンドに結合したタンパク質を、固定化していないFK506溶液で競合的に溶出することにより、特異的に結合するタンパク質としてFKBPを得た。また、天然物由来生理活性物質の中には、ターゲットと共有結合することによってその活性をより強固にするものがある3−5)。このような物質に、ビオチンなどのタグを導入し、それを細胞などに加えて一定時間インキュベートした後にライセートを調製する。そして得られたライセートから、アビジンを固定化したカラムによってビオチンタグで標識された化合物を回収して化合物に結合したタンパク質を同定することが可能になる。Sinらは,血管新生抑制作用のあるfumagillinのビオチン化誘導体を合成し,ウシ脳の抽出液と反応させた。そして数段階のクロマトグラフィーの後,アビジンカラムを用いてビオチン化誘導体を回収し,特異的な結合タンパク質としてII型メチオニンアミノペプチダーゼ(MetAP−2)を同定した。この系は,化合物を固定化したアフィニティークロマトグラフィーとは異なり,細胞抽出液のみならず生理的条件下での培養細胞とプローブとの反応が可能であり、細胞の分画やライセートの調製段階で容易に変性してしまうような結合タンパク質の単離には有効な方法である5)。
アフィニティークロマトグラフィーによって,当初予想した以外のタンパク質も同定されることがある6−9)。Knockaertら7)は、種々のcycline−dependent kinase(CDK)阻害剤を、まずin vitro kinase panelの測定系で評価した。ただし、ここで用いた酵素は、数種のCDKとglycogen synthase kinase−3α/β(GSK−3α/β)を主とするごく限られたものであった。本アッセイにより、paulloneがCDKおよびGSK−3α/βの阻害剤であることが示されたが、paulloneをアフィニティーマトリクスに固定化し、それをプローブとして結合タンパク質を精製した際には予想外の結果が得られた。すなわち、これらのkinase以外にmitochondrial malate dehydrogenase(mMDH)が特異的にこのプローブに結合することが見出された。そして、その後のin vitroの酵素活性測定系において,paulloneが確かにmMDH活性を阻害することが確認されたことから,アフィニティークロマトグラフィーを用いる手法によって初めて,paulloneについて想定外の新規細胞内ターゲット(mMDH)が明らかにされたといえる。本実験結果は,化合物のターゲットおよび作用機序探索研究に幾つかの示唆を与えるものと考えられる。上記示唆のひとつは,その化合物の作用が、想定しているターゲットタンパク質を介した機序のみならず、複数の作用機序の総合として発現されている可能性である。
アフィニティークロマトグラフィーでは,一部の天然物由来生理活性物質を除き,化合物とタンパク質の相互作用は非共有結合であることを基本としている。しかしながら、親和性が弱い場合には、真のターゲットが操作の過程で化合物から解離してしまう場合がある。たとえば、化合物がより親和性の高いタンパク質や、親和性は同等でも量的により多く含まれるタンパク質によって飽和されてしまうような場合がある。つまり、アフィニティークロマトグラフィーで得られたタンパク質の中には、非特異的相互作用による結合タンパク質が少なからず存在する。特にタンパク結合率が高い薬剤は、血清中などで非常に多くのタンパク質と結合しうるため、例えばアフィニティーカラムにおいて1M塩化ナトリウムで入念に洗浄した後でも、200−300種類のタンパク質が結合していることが多々ある。従って、プロテオーム技術が発達し、多くのタンパク質を同定することが比較的容易になったとはいえ、如何にしてこれらの中から特異的なタンパク質を見つけるかが重要になる。Shimizuらは、マトリックスの表面を親水性の高い高分子重合体でコーティングし,汎用されているマトリックスに比べてこの非特異的な吸着を低減している2)。
非特異的相互作用を軽減する別の試みの一つとして、アフィニティークロマトグラフィーを行う前に、化合物に特異的に結合するであろうタンパク質群をあらかじめ絞り込んでおく方法がある10)。キノリン系骨格を有する抗マラリア薬であるクロロキンの結合タンパク質を調べるために、まずATP(Adenosine triphosphate)を固定化したカラムでATP結合タンパク質群を精製し、結合タンパク質候補群を得る。キノリンは、プリン体に似た構造を持つため、ATPやDNAなどプリンヌクレオチドと結合しうるタンパク質と親和性を持つことが考えられる。そこで、ATPカラムであらかじめ標的候補タンパク質を絞り込むことによって、非特異的相互作用を軽減でき、クロロキンの標的タンパク質を同定することができた。これによりクロロキンはマラリアではなくヒトに作用していることが明らかとなり、作用メカニズムと副作用メカニズムも推察できた。
特異性を高める別の試みとしては、化合物固定化カラムから結合タンパク質を溶出する際に、固定化していない化合物や結合部位を競合すると思われる分子、例えばATPやNADH(Nicotinamide adenine dinucleotide)などを用いて競合的に溶出する方法がある。p38阻害剤SB203580の結合タンパク質解析では、化合物とATPを組み合わせて溶出することで、p38の回収率を上げることに成功している11)。この方法により、p38特異的と考えられていたSB203580に結合する新たなキナーゼを多数同定するに至った。同様に化合物で競合的に溶出させるためには、化合物が水溶液に充分量溶けることが必要であるため、難溶性薬剤には適用が難しい。しかしアフィニティーカラムにアプライする前のタンパク質混合液中に固定化していないフリー化合物を混ぜておくことでターゲットをマスクすることができる。このマスクしたタンパク質を含むサンプルをアフィニティーカラムにアプライして、カラム結合タンパク質についてSDS−PAGEで分離する。マスクの有無でSDS−PAGE上のバンドの比較を行い、マスクすることによって消えたバンドがターゲットであると考えられる2)。この場合、化合物の水に対する溶解性が悪くてもタンパク質混合液中であれば、ある程度の溶解性を期待できる。
しかし、低分子化合物は、そのほとんどが少なからず血清タンパク質と結合する。したがって、結合タンパク質群の中から低分子化合物に特異的な標的タンパク質を見つけなければいけない。
そのためには、目的の化合物と構造が似ているが活性の異なる化合物を用意して、結合タンパク質のディファレンシャル・ディスプレイを行えばよい。SDS−PAGEで違いのあるバンドを見つけても良いが、結合タンパク質が多い場合は全てのバンドを分離するのは容易ではない。そこで、本発明者らは、2次元電気泳動又は安定同位体標識法を用いたMS解析12)により、薬剤のターゲットタンパク質の同定手法を、新規抗癌剤E7070を用いて検討し報告した13)。E7070は,マウス由来癌細胞P388の細胞周期をG1期で阻害することを指標にしてスクリーニングされた化合物14)で、その結合タンパク質はこれまで不明であった。そこで、E7070をアフィニティー・プローブとして、その結合タンパク質を同定することにした。プローブを用いた手法では、いかに良質なプローブを用いるかが鍵となる。そのプローブが元の化合物と同程度の活性を有していることが理想である。化合物にはその活性発現に必須な構造があるが,必須構造はケミストが化合物の構造変換を行い,その活性を高めていく過程で構造活性相関として明らかになる。そしてこの必須構造部分とは異なる部分にリンカーを伸ばしてマトリックスに導入することになるのであるが,E7070ではその構造活性相関から,sulfamoyl基を変換することによってプローブを合成した。そして、E7070を固定化したアフィニティークロマトグラフィーで結合タンパク質の同定を行った。しかしながら,このプローブには非常に多くのタンパク質が結合し,ターゲットタンパク質の絞込みが困難であった。一般に,低分子の合成化合物は特異性が低く様々なタンパク質に結合する傾向がある。また,E7070など合成低分子化合物は水溶液に難溶であることが多いため、固定化していない薬剤をアフィニティーカラムへ大量に流すことで特異的に溶出させる方法が困難であることが多い。E7070も溶解度が低く,界面活性剤や変性剤のような溶出力を高めた溶液を段階的に用いることによって溶出せざるを得なかった。そして精製条件について種々検討したが、E7070の場合,溶出されたタンパク質のほとんどは化合物に結合したもので,ビーズやリンカーなどに対する非特異吸着によるものではなかった。そこで,構造が類似していながら抗腫瘍活性の異なる化合物を用いたプローブを新たに調製し,それぞれのプローブから溶出されたタンパク質をICAT15、16)および2D−DIGE17)の定量的プロテオームの手法を用いて解析することによって、E7070により強く吸着するタンパク質を同定する戦略を構築した13)。その結果、非常に多くのタンパク質が2つのマトリックスに吸着していた中で、E7070タイプのプローブに特異性が高く吸着するタンパク質の同定に成功した。従来のSDS−PAGEでのバンドの有無による定性的判断とは違い、このような定量的な判定により信頼性の高い結果を得ることが出来る。
しかし、前述の方法には、依然幾つかの課題が残っている。例えば、(1)化合物を担体(カラムに充填された担体を含む、以下、単に「カラム」と称する場合がある)に固定化する必要があるにもかかわらず、スクリーニングのために合成された化合物のほとんどは担体(カラム)に固定化できない場合がある。そのため別途合成する必要があるが、多くの時間も労力も要する。さらに担体(カラム)に固定化する化合物の部位によって結合するタンパク質の種類が変わることも多い。(2)化合物を担体(カラム)に固定化できるように構造を変える際には、活性が変わらないようにすべきであるが、構造を変えることにより、特異性や親和性が変わってしまうことがある。(3)アフィニティーカラムとして固定化する化合物を変えることでディファレンシャル・ディスプレイを行う際に、ポジティブ化合物(活性の比較的強い化合物)の選択よりもネガティブ化合物(活性の比較的弱い化合物)の選択に迷うことが多い。理想的にはネガティブ化合物全てをアフィニティーカラムにすればよいが、現実的には(1)の理由から容易ではない。(4)一般的にアフィニティーカラムとして固体化されている化合物量は多くの場合ゲル1mlあたり0.1mgから数mg程度であり、これは1mM前後に相当する。ところが細胞に対して何らかの表現型を誘導する(活性がある)薬剤は、数μMから数nM、ときにはpMオーダーで活性を示す。したがって、活性を示す濃度は、カラム内に固定化された薬剤濃度と大きな乖離がある。一般に薬剤を薬効用量よりもはるかに高い濃度で使用すると非特異的な毒性作用が現れることが多い。つまりカラム内に高い濃度の薬剤が固定化されているということは、このような毒性領域の作用が含まれていることがあると思われる。そこで担体(カラム)に対する化合物の固定化量を数μMから数nMに減らすことも可能であるが、そのような微量の固定化量をコントロールすることは必ずしも容易ではなく、また結合するタンパク質の量、つまりアフィニティーカラムの負荷量も大きく減るため目的のタンパク質をMSで検出できなくなる可能性もある。その際にはカラムサイズを大きく、例えば100〜1000倍にすることになるが実用的には扱いづらくなる。
参照文献
1)M.W.Harding,A.Galat,D.E.Uehling,and S.L.Schreiber,Nature,341,758(1989).
2)N.Shimizu,K.Sugimoto,J.Tang,T.Nishi,I.Sato,M.Hiramoto,S.Aizawa,M.Hatakeyama,R.Ohba,H.Hatori,T.Yoshikawa,F.Suzuki,A.Oomori,H.Tanaka,H.Kawaguchi,H.Watanabe,and H.Handa,Nat Biotechnol,18,877(2000).
3)N.Sin,L.Meng,M.Q.W.Wang,J.J.Wen,W.G.Bornmann,and C.M.Crews,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,94,6099(1997).
4)E.C.Griffith,Z.Su,B.E.Turk,S.Chen,Y.−H.Chen,Z.Wu,K.Biemann,and J.O.Liu,Chem.Biol.,4,461(1997).
5)N.Kudo,N.Matsumori,H.Taoka,D.Fujiwara,E.P.Schreiner,B.Wolff,M.Yoshida,and S.Horinouch,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,96,9112(1999).
6)M.Knockaert,N.Gray,E Damiens,Y−T.Chang,P.Grellier,K.Grant,D.Fergusson,J.Mottram,M.Soete,J−F.Dubremetz,K.L Roch,C.Doering,P.G.Shultz,and L.Meijer,Chem.Biol.,7,411(2000).
7)M.Knockaert,K.Wieking,S.Schmitt,M.Leost,K.M.Grant,J.C.Mottram,C.Kunick,and L.Meijer,J.Biol.Chem.,28,25493(2002).
8)J.B.Schnier,G.Kaur,A.Kaiser,S.F.Stinson,E.A.Sausville,J.Gardner,K.Nishi,E.M.Bradbury,and A.M.Senderowicz,FEBS Lett.,454,100(1999).
9)A.Kaiser,K.Nishi,F.A.Gorin,D.A.Walsh,E.M.Bradbury,and J.B.Schnier,Arch.Biochem.Biophys.,386,179(2001).
10)P.R.Graves,J.J.Kwiek,P.Fadden,R.Ray,K.Hardeman,A.M.Coley,M.Foley,T.A.Haystead,Mol.Pharmacol.62,1364−1372(2002).
11)K.Godl,J.Wissing,A.Kurtenbach,P.Habenberger,S.Blencke,H.Gutbrod,K.Salassidis,M.Stein−Gerlach,A.Missio,M.Cotten,H.Daub.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100,15434−15439(2003).
12)S.Sechi,Y.Oda,Curr.Opin.Chem Biol.7,70−77(2003).
13)Y.Oda,T.Owa,T.Sato,B.Boucher,S.Danicls,H.Yamanaka,Y.Shinohara,A.Yokoi,J.Kuromitsu,and T.Nagasu,Anal.Chem.,75,2159(2003).
14)T.Owa,H.Yoshino,T.Okauchi,K.Yoshimatsu,Y.Ozawa,N.H.Sugi,T.Nagasu,N,Koyanagi,and K.Kitoh,J.Med.Chem.,42,3789(1999).
15)S.P.Gygi,B.Rist,S.A.Gerber,F.Turecek,M.H.Gelb,and R.Aebersold,Nat.Biotechnol,17,994(1999).
16)D.K.Han,J.Eng,H.Zhou,and R.Aebersold,Nat.Biotechnol.,19,946(2001).
17)R.Tonge,J.Shaw,B.Middleton,R.Rowlinson,J.Young,E.Hawims,I.Currie,and M.Davison,Proteomics,1(1),377(2001).
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討を重ねた結果、化合物を固定したアフィニティークロマトグラフィーカラムにて、当該カラムに結合する複数種のタンパク質を精製(本明細書において、「精製」とは、分離および/または濃縮(enrichment)することを含むものとする)した。一方で、同位体標識されたタンパク質群と化合物とを接触させたものの中から、前記の化合物を固定したアフィニティークロマトグラフィーカラムにて、当該カラムに結合する複数種のタンパク質を精製した。これらの精製タンパク質を混合し、当該混合したタンパク質を質量分析計により分析し、質量分析の情報から各タンパク質を同定し、各タンパク質の標識ピークと非標識ピークとの強度比を求めて、化合物の有無による結合率の差から、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量することによって、複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下に関する。
(1)複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析する方法であって、
(a)同位体標識されたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
(b)予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
(c)工程(a)および工程(b)で得られたタンパク質を混合する工程と、
(d)工程(c)で得られた混合物を質量分析処理する工程と、
(e)質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程と、
(f)各タンパク質について、工程(a)で得られたタンパク質に由来するピークと工程(b)で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程と、
を含む、前記方法。
(2)複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析する方法であって、
(a)タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
(b)予め化合物と接触させておいた同位体標識されたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
(c)工程(a)および工程(b)で得られたタンパク質を混合する工程と、
(d)工程(c)で得られた混合物を質量分析処理する工程と、
(e)質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程と、
(f)各タンパク質について、工程(a)で得られたタンパク質に由来するピークと工程(b)で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程と、
を含む、前記方法。
(3)複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析する方法であって、
(a)タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
(b)予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
(c)工程(a)で得られたタンパク質または工程(b)で得られたタンパク質の一方を同位体標識する工程と、
(d)工程(c)で得られた標識されたタンパク質と、工程(a)および工程(b)で得られたタンパク質のうち工程(c)で標識されていない他方のタンパク質とを混合する工程と、
(e)工程(d)で得られた混合物を質量分析処理する工程と、
(f)質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程と、
(g)各タンパク質について、工程(a)で得られたタンパク質に由来するピークと工程(b)で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程と、
を含む、前記方法。
(4)複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析する方法であって、
(a)タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
(b)工程(a)で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群とを混合する工程と、
(c)工程(b)で得られた混合物を質量分析処理する工程と、
(d)予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
(e)工程(d)で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群とを混合する工程と、
(f)工程(e)で得られた混合物を質量分析処理する工程と、
(g)工程(c)および工程(f)で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程と、
(h)各タンパク質について、工程(a)で得られたタンパク質に由来するピークと内部標準物質であるタンパク質に由来するピークとの強度比および工程(d)で得られたタンパク質に由来するピークと内部標準物質であるタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、当該強度比を比較することにより各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程と、
を含む、前記方法。
(5)複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析する方法であって、
(a1)タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
(a2)工程(a1)で得られた精製物を質量分析処理する工程と、
(a3)工程(a2)で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程と、
(a4)複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する工程と、
(b1)予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
(b2)工程(b1)で得られた精製物を質量分析処理する工程と、
(b3)工程(b2)で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程と、
(b4)複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する工程と、
(c)各タンパク質について、工程(a1)で得られたタンパク質に由来するタンパク質量と工程(b1)で得られたタンパク質に由来するタンパク質量との比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程と、
を含む、前記方法。
(6)化合物が固定化された担体が、アフィニティークロマトグラフィー用の担体である、(1)〜(5)のいずれか1項に記載の方法。
(7)工程(b)におけるタンパク質群と化合物との接触を複数種の化合物について行うことを特徴とする、(1)〜(3)のいずれか1項に記載の方法。
(8)工程(d)におけるタンパク質群と化合物との接触を複数種の化合物について行うことを特徴とする、(4)に記載の方法。
(9)工程(b1)におけるタンパク質群と化合物との接触を複数種の化合物について行うことを特徴とする、(5)記載の方法。
(10)担体に固定化された化合物が、ATP、GTP、NADおよびNADPからなる群から選択されるいずれかの化合物である、(1)〜(9)のいずれか1項に記載の方法。
(11)同位体が、2H、13C、15N、17O、18O、33Pおよび34Sからなる群から選択されるいずれかの同位体又はこれらの組み合わせである、(1)〜(4)、(6)〜(8)および(10)のいずれか1項に記載の方法。
(12)同位体が、13Cである、(11)に記載の方法。
(13)複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析するシステムであって、
(a)同位体標識されたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
(b)予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
(c)手段(a)および手段(b)で得られたタンパク質を混合する手段と、
(d)手段(c)で得られた混合物を質量分析処理する手段と、
(e)質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段と、
(f)各タンパク質について、手段(a)で得られたタンパク質に由来するピークと手段(b)で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段と、
を含む、前記システム。
(14)複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析するシステムであって、
(a)タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
(b)予め化合物と接触させておいた同位体標識されたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
(c)手段(a)および手段(b)で得られたタンパク質を混合する手段と、
(d)手段(c)で得られた混合物を質量分析処理する手段と、
(e)質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段と、
(f)各タンパク質について、手段(a)で得られたタンパク質に由来するピークと手段(b)で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段と、
を含む、前記システム。
(15)複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析するシステムであって、
(a)タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
(b)予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
(c)手段(a)で得られたタンパク質または手段(b)で得られたタンパク質の一方を同位体標識する手段と、
(d)手段(c)で得られた標識されたタンパク質と、手段(a)および手段(b)で得られたタンパク質のうち手段(c)で標識されていない他方のタンパク質とを混合する手段と、
(e)手段(d)で得られた混合物を質量分析処理する手段と、
(f)質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段と、
(g)各タンパク質について、手段(a)で得られたタンパク質に由来するピークと手段(b)で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段と、
を含む、前記システム。
(16)複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析するシステムであって、
(a)タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
(b)手段(a)で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群とを混合する手段と、
(c)手段(b)で得られた混合物を質量分析処理する手段と、
(d)予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
(e)手段(d)で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群とを混合する手段と、
(f)手段(e)で得られた混合物を質量分析処理する手段と、
(g)手段(c)および手段(f)で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段と、
(h)各タンパク質について、手段(a)で得られたタンパク質に由来するピークと内部標準物質であるタンパク質に由来するピークとの強度比および手段(d)で得られたタンパク質に由来するピークと内部標準物質であるタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、当該強度比を比較することにより各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段と、
を含む、前記システム。
(17)複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析するシステムであって、
(a1)タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
(a2)手段(a1)で得られた精製物を質量分析処理する手段と、
(a3)手段(a2)で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段と、
(a4)複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する手段と、
(b1)予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
(b2)手段(b1)で得られた精製物を質量分析処理する手段と、
(b3)手段(b2)で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段と、
(b4)複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する手段と、
(c)各タンパク質について、手段(a1)で得られたタンパク質に由来するタンパク質量と手段(b1)で得られたタンパク質に由来するタンパク質量との比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段と、
を含む、前記システム。
(18)化合物が固定化された担体が、アフィニティークロマトグラフィー用の担体である、(13)〜(17)のいずれか1項に記載のシステム。
(19)手段(b)におけるタンパク質群と化合物との接触を複数種の化合物について行うことを特徴とする、(13)〜(15)のいずれか1項に記載のシステム。
(20)手段(d)におけるタンパク質群と化合物との接触を複数種の化合物について行うことを特徴とする、(16)に記載のシステム。
(21)手段(b1)におけるタンパク質群と化合物との接触を複数種の化合物について行うことを特徴とする、(17)記載のシステム。
(22)担体に固定化された化合物が、ATP、GTP、NADおよびNADPからなる群から選択されるいずれかの化合物である、(13)〜(21)のいずれか1項に記載のシステム。
(23)同位体が、2H、13C、15N、17O、18O、33Pおよび34Sからなる群から選択されるいずれかの同位体又はこれらの組み合わせである、(13)〜(16)、(18)〜(20)および(22)のいずれか1項に記載のシステム。
(24)同位体が、13Cである、(23)に記載のシステム。
本発明により、簡便かつ効率的に、複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を同時に解析することが可能となった。
また、本発明により、化合物を固定化したアフィニティークロマトグラフィーカラムを複数種用意する必要がなくなり、簡便かつ効率的に複数種の化合物に基づく構造親和性相関の情報を得ることができるようになった。また、本発明で用いる化合物中の一種類の化合物を固定化するだけで、他の化合物は固定化せずに使用するため、各化合物本来の構造でタンパク質に対する親和性を評価することができるようになり、より正確な構造親和性相関の情報を得ることが可能となった。
さらに、本発明により、本発明で用いる化合物の構造を変えることによって、種々の構造を有する化合物を使用することにより、化合物の構造がいかなるタンパク質との親和性に影響を与えるのかを網羅的に解析することが可能となり、網羅的に化合物とタンパク質との構造親和性相関を解析することができる。これによって、化合物、特に薬剤を合成、開発する上で、主作用を増強しつつ、副作用を軽減するような有益な情報を得ることが可能となった。
また、本発明により、担体に固定化する化合物として、ATP、GTP(Guanosine Triphosphate)、NAD/NADH(Nicotinamide adenine dinucleotide)またはNADP/NADPH(Nicotineamide dinucleotide phosphate)を用いることにより、ATP、GTP、NADまたはNADPに結合する複数種のタンパク質に対する化合物の構造親和性相関の情報を得ることが可能となった。
具体的には、本発明によりATPを固定化した担体を用いて構造親和性相関の情報を得ることにより、化合物の構造を変えることによって、いかなるkinaseとの親和性に影響を与えるのかを網羅的に解析することが可能となり、kinase阻害剤のスクリーニングをする上で、特異性、選択性などに関する有益な情報を得ることが可能となった。
また、本発明によりGTPを固定化した担体を用いて構造親和性相関の情報を得ることにより、化合物の構造を変えることによって、いかなるGTP結合タンパク質との親和性に影響を与えるのかを網羅的に解析することが可能となり、GTP結合タンパク質阻害剤のスクリーニングをする上で、特異性、選択性などに関する有益な情報を得ることが可能となった。
さらに、本発明によりNADまたはNADPを固定化した担体を用いて構造親和性相関の情報を得ることにより、化合物の構造を変えることによって、いかなるdehydrogenaseとの親和性に影響を与えるのかを網羅的に解析することが可能となり、dehydrogenase阻害剤のスクリーニングをする上で、特異性、選択性などに関する有益な情報を得ることが可能となった。
さらに、化合物が固定化された担体(例えば、アフィニティークロマトグラフィーカラム)に結合した化合物の濃度は、一般的に担体1mlあたり0.1mgから数mg程度であり、これは1mM前後に相当する。しかし、細胞に対して何らかの活性を有する化合物は、数μMから数nM、ときには数pM程度で活性を示すことが知られている。したがって、細胞に対して何らかの活性を示す濃度と、化合物が固定化された担体(例えば、アフィニティークロマトグラフィーカラム)に固定化された化合物濃度との間には大きな乖離がある。本発明においては、担体に固定化していない化合物を用いるため、化合物濃度を数μMから数nMに減らすことも可能となった。
図2は、本発明の第一の態様を概略的に示す図である。
図3は、本発明の第二の態様を概略的に示す図である。
図4は、本発明の第三の態様を概略的に示す図である。
図5は、複数種のタンパク質と式2−式6(化2−化6)で表される化合物との構造親和性相関を表す。数字が小さいほど化合物に対して親和性が強いことを意味している。
図6は、本発明のシステムの構成を示すブロック図である。
図7は、本発明のシステムの各ユニットを示す模式図である。
図8は、制御ユニットの詳細構成図である。
図9は、制御ユニットの動作のフローチャートである。
図10は、一つの培養装置から採取されるタンパク質群を複数個に分ける際の装置の模式図である。
1b:チューブ
2a:攪拌羽根
2b:攪拌羽根
11a:培養装置
11b:培養装置
11c:培養装置
12a:培養液ボトル
12b:培養液ボトル
13a:細胞破砕器
13b:細胞破砕器
13c:細胞破砕器
14:化合物との接触器
14c−1:化合物との接触器
14c−2:化合物との接触器
14c−3:化合物との接触器
15a:化合物が固定化された担体
15b:化合物が固定化された担体
16a:タンパク質精製用制御装置
16b:タンパク質精製用制御装置
17a:精製タンパク質分取器
17b:精製タンパク質分取器
18:チューブ
19:プレート
20:質量分析処理装置
21:コンピュータ
30:中央コンピュータ
31:サンプル分注装置
100:LAN
601:制御ユニット
602:タンパク質精製ユニット
603:タンパク質混合ユニット
604:質量分析ユニット
801:CPU
802:送信/受信部
803:入力部
804:出力部
805:ROM
806:RAM
807:ハードディスクドライブ(HDD)
808:CD−ROMドライブ
809:タンパク質データベース(DB)
810:CD−ROM
811:インターネット
なお、本明細書において引用した文献、公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。
本発明は、複数種のタンパク質と1種以上の化合物との構造親和性相関を解析する方法に関するものである。本発明の方法は、(i)ある化合物が固定化された担体を用いてタンパク質を精製し、他方、(ii)タンパク質の群と化合物とを接触させてその接触したタンパク質を前記担体を用いて精製し、(iii)上記(i)と(ii)により精製された各タンパク質の量比を、同位体標識または指標EMPAIを利用し、質量分析により測定することを基本とする。
上記方法の例としては、まず、ある化合物が固定された担体(カラム)を用いて、同位体標識されたタンパク質群から、当該カラム上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する。一方で、化合物が固定された前記の担体(カラム)を用いて、予め1種以上の化合物と接触させておいた同位体非標識のタンパク質群または異なる同位体で標識されたタンパク質群から、当該カラム上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する。
上記の担体(カラム)に添加するタンパク質群(例えば、細胞から抽出したタンパク質群)の中には、多種多様のタンパク質が存在する。本発明の方法は、担体(カラム)を用いることにより、担体(カラム)上の化合物に結合する複数種のタンパク質を選別して、続く解析の対象とするものである。つまり、本発明の方法は、母集団である多種のタンパク質を含むタンパク質群から、当該化合物に結合するという類似した性質を有する複数種のタンパク質を選択し、当該複数種のタンパク質と1種以上の化合物との構造親和性相関を解析するものである。
また、本発明では、母集団であるタンパク質群を予め化合物と接触させておき、そこから担体(カラム)を用いて担体(カラム)上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する。当該タンパク質群の中には、予め化合物と結合していることにより、結合部位が競合し、担体(カラム)上の化合物に結合しにくくなるタンパク質も存在する。その結果、カラムから精製した当該タンパク質の量((cc)とする)は、予め化合物と接触する操作をしないでカラムから精製した当該タンパク質の量((c)とする)よりも少なくなる。そして、どちらかのタンパク質を同位体標識することで、(c)と(cc)を同時に質量分析処理で比較することができ、親和性の比を算出することができる。本発明は、以上の原理を利用して、複数種のタンパク質と1種以上の化合物との構造親和性相関の解析を行うものである。
本発明において「構造親和性相関」とは、一群の共通骨格を有する化学物質の構造変化と、その化学物質とタンパク質との親和性(結合の強さ)との相関関係をいう。
本発明において「タンパク質」とは、2以上のアミノ酸がペプチド結合によって結合したペプチドを含む。
<化合物が固定化された担体>
本発明において、「化合物が固定化された担体」とは、担体に官能基を介して、化合物を共有または非共有結合させたものをいう。
化合物が固定化された担体は、例えば、まず、担体側に官能基として、N−hydroxy−succinimideやHydrazideを共有結合させたり、単にアミノ基にしたり、またはProtein A、HeparinもしくはCibacron Blue F3GAなどを固定化し、このような担体の官能基に対して、化合物を直接または化合物の構造の一部を変えたものを共有または非共有結合させたものがある。
担体に固定化する化合物は、特に限定されず、例えば、合成低分子化合物、合成ペプチド、精製または部分精製ポリペプチド、抗体、細菌放出物質(細菌代謝産物を含む)、生体内核酸物質(ATP、GTP、NAD/NADHまたはNADP/NADPHなど)、脂質などが挙げられる。これら化合物は、新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。担体に固定化する化合物は、所定の活性を有するものである。本明細書において「所定の活性」とは、担体に固定化される化合物または後述の非固定化化合物が有する活性を意味し、特に限定されず、例えば、生理活性、生物活性、薬理活性、結合活性等を挙げることができる。
担体としては、アガロースゲル、アクリルアミド、磁気ビーズ、セルロース、シリカゲルなどがあげられ、好ましくはアガロースゲルである。担体は、例えば、バイオラド社等から購入することができる(アフィゲル10、バイオラド社製、カタログ番号153−6099)。
化合物が固定化された担体は、担体に所望の化合物を結合させることにより、作製することができる。化合物が固定化された担体の作製は、例えば、アミノ基を有する化合物であれば、以下の手順で行うことができる。まず、アミノ基を有する化合物溶液をN−hydroxy−succinimideが結合している担体(例えばアフィゲル10)に加える。次に、トリエチルアミンを加え、インキュベーションした後、2−アミノエタノールを加え、さらにインキュベーションすることによって作製することができる。また、適宜洗浄操作を加えることが好ましい。
また、化合物が固定化された担体の作製は、カルボン酸を有する化合物であれば、以下の手順で行うことができる。まず、カルボン酸を有する化合物溶液にカルボジイミドを加え、インキュベーションした後、アミノ基が結合している担体に加える。次に、酢酸(もしくは乳酸)を加え、さらにインキュベーションすることによって作製することができる。また、適宜洗浄操作を加えることが望ましい。さらに、NADPアナログを固定化した担体などは、例えば、アマシャムバイオサイエンス社から購入することができる(2’5’ADP Sepharose 4B(コード番号17−0700−01))。
担体に固定化する化合物の量は、特に限定されないが、担体1mlあたり0.1mgから数mg程度とすることが好ましい。
化合物が固定化された担体は、アフィニティークロマトグラフィー用の担体として用いることができ、適当なカラム(例えば、ポリプレップエンプティカラム(バイオラド社製、Cat No.731−1550)等)に充填することによって、化合物を固定化したアフィニティークロマトグラフィーカラムとして使用できる。また、化合物が固定化された担体は、適当なチューブ(例えば、エッペンドルフチューブ(エッペンドルフ社製)等)に加えることによって、使用することもできる。
1.本発明の第一の態様
本発明の第一の態様は、複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析する方法であって、
(a)同位体標識されたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
(b)予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
(c)工程(a)および工程(b)で得られたタンパク質を混合する工程と、
(d)工程(c)で得られた混合物を質量分析処理する工程と、
(e)質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程と、
(f)各タンパク質について、工程(a)で得られたタンパク質に由来するピークと工程(b)で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程と、
を含む、前記方法を提供する。
本発明の第一の態様を概略的に説明する(図1を参照)。
本発明においては、まず、所定の活性を有する化合物が固定化された担体(例えば、アフィニティークロマトグラフィーカラム等)を用意する。活性を有する化合物の固定化量は、担体1mlあたり0.1mgから数mg程度とすることが好ましい。この化合物が固定化された担体に同位体で標識した(図1中「*」印で表示)タンパク質群(図1(a)中、三角形並びに円およびだ円で表示)をアプライし、前記化合物に結合した結合タンパク質(図1(a)中、円およびだ円で表示)を精製する。得られた複数種のタンパク質をタンパク質Aとする(図1(a))。ここで、「タンパク質群」とは、担体にのせる(プライする)母集団となるサンプルのことを意味する。
一方、担体に固定化されていない化合物(所定の活性を有する1種又は複数種の化合物。それぞれの化合物の活性の強度は、異なっていることが好ましい。)(図1(b)中、化合物a、b、c、d)を、適当な濃度(例えば数μM)になるように同位体非標識のタンパク質群(図1(b)中、三角形並びに円およびだ円で表示)に添加して、一定時間インキュベートして当該タンパク質群と化合物とを接触させる(サンプル液)。本明細書において、タンパク質群に接触させるために添加する化合物であって、固定化されていない化合物を、「非固定化化合物」ということもある。このサンプル液には大量のタンパク質が含まれているため、水に対して難容性の化合物であっても、ある程度溶解させることができる。ここで、同位体非標識のタンパク質群に代えて、前記の「同位体標識されたタンパク質群」とは異なる同位体で標識されたタンパク質群を用いることもできる。
この各サンプル液を、前記の所定の活性を有する化合物が固定化された担体にのせ、当該化合物に結合した結合タンパク質を精製する。得られた複数種のタンパク質の集合をタンパク質Bとする。ただし、非固定化化合物毎にサンプル液を調製するため、タンパク質Bは添加した非固定化化合物の種類だけ数がある(図1(b))。図1(b)では、4種類の非固定化化合物(化合物a、b、c、d)を予めタンパク質群に接触させているため、Bは4種類存在することを示している。
このタンパク質Aとタンパク質Bとを一定の割合で混合し(図1(c))、SDS−PAGEなどでタンパク質を分離後、トリプシンなどで消化して質量分析処理し(図1(d))、タンパク質の同定を行う(図1(e))。ここで、質量分析処理の結果として得られる質量分析スペクトル(図1(d))では、同一タンパク質についての、同位体標識したサンプル由来であるタンパク質Aのピーク(破線ピーク)と同位体非標識のサンプル由来又は異なる同位体で標識したサンプル由来であるタンパク質Bのピーク(黒色実線ピーク)の2本のペアで観測される。そして、各タンパク質について、A由来のピークとB由来のピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する(図1(f))。
以下に、タンパク質Aとタンパク質Bとを1対1で混合した場合における解析例を示す。
非固定化化合物(図1の化合物bを例とする)と結合したタンパク質は、担体上に固定化した化合物aに結合しにくくなるので、質量分析スペクトル上でタンパク質B由来のピークは、タンパク質A由来のものと比べて小さくなる。例えば、B由来のタンパク質(図1のタンパク質P2を例に用いる)上の化合物aとの結合部位と化合物bとの結合部位が同じまたは重なるときであって、タンパク質P2に対する親和性が化合物bの方が化合物aよりも大きいとき、または化合物bの濃度が化合物aより高いときには、当該結合部位が化合物bとの結合で使用されているために、タンパク質P2は担体上に固定した化合物aに結合しにくくなる。その結果、担体から精製されるB由来のタンパク質P2の量は、A由来のタンパク質P2の量に比べて少なくなる。したがって、B由来の質量分析スペクトルピークはA由来のものよりも小さくなる(図1のb−P2)。また例えば、タンパク質P2と化合物bとの結合によって、タンパク質P2上の化合物aとの結合部位がマスクされしまう場合も、同様に考えることができる。
逆に、添加した非固定化化合物(例えば図1の化合物b)と結合しないタンパク質(例えば図1のタンパク質P1)は、担体上に固定化された化合物への結合に影響を受けないので、担体上の化合物に結合するタンパク質P1の実質的な量は、非固定化化合物の添加の有無に関わらず同じになる。この場合、「実質的な」とは、非固定化化合物の添加によって生じる担体固定化化合物へのタンパク質の非特異的な結合量の変化は含めないで考えた場合を意味する。したがって、B由来のタンパク質P1のピークはA由来のタンパク質P1のピークと実質的に同じであり(図1のb−P1)、ピーク強度比に変化は生じない。
添加した非固定化化合物と担体に固定化された化合物とが同一である場合(例えば、図1の化合物a)、担体上に固定化された化合物aは、タンパク質(例えばP1)との結合を非固定化化合物aによって競合的に拮抗されるため、担体上に固定化された化合物aに結合するタンパク質の量が少なくなる。その結果、精製して得られたタンパク質Aとタンパク質Bを1対1で混合したとき、質量分析スペクトル上で非標識タンパク質B由来のピークは、標識タンパク質A由来のものと比べて小さくなる(図1のa−P1)。
一方、添加した非固定化化合物と担体に固定化された化合物とが同じであって、精製タンパク質A及びBを1対1で混合した場合において、B由来のピークがA由来のピークよりも小さくならないピークパターンを示すタンパク質(図1のa−P3)は、当該化合物以外の部分(例えば担体部分等)に結合した非特異的結合タンパク質であることがわかる。
また、活性の異なる非固定化化合物同士(例えば図1のa、b、c、d同士)の比較において、質量分析スペクトル上でB由来のピークがA由来のピークと比べて同程度小さくなる場合には(図1(d)、質量分析スペクトル中の各P3のスペクトル)、当該タンパク質(例えば図1のタンパク質P3)は、活性を有する化合物、つまり添加された化合物a、b、c、dの活性に重要な特異的結合タンパク質ではないと考えられる。
一方、添加する所定の活性を有する非固定化化合物(例えば図1の化合物d)が低濃度であっても質量分析スペクトル上でB由来のピークが小さくなる場合(図1のd−P4)には、当該タンパク質(例えば図1のタンパク質P4)は、その化合物の活性に重要なタンパク質である可能性がある。同様に、構造は近いが活性が異なる別の非固定化化合物(例えば図1の化合物c)によって質量分析スペクトル上でB由来のピークが影響を受けないのであれば(図1のc−P4)、当該タンパク質P4が前記の活性を有する非固定化化合物dの当該活性に重要な特異的結合タンパク質である可能性が高い。
また、非固定化化合物とタンパク質との親和性が極めて弱い場合(どの程度弱いかは不明)であって、当該化合物濃度が低い場合には、カラムを通過する際に、タンパク質と結合している化合物がカラム内に高濃度に固定化された化合物と置き換わるという影響を受ける可能性もあるが、このことは、非固定化化合物濃度を高めることでそのような影響を低下させることができる。
このような方法を用いることによって、簡便かつ効率的に、複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を同時に解析することが可能となる。
また、化合物が固定化された担体(例えば、アフィニティークロマトグラフィーカラムなど)としては、ATP、GTP、NAD/NADHまたはNADP/NADPHなどを固定化した担体またはカラムを使うこともできる。このような担体またはカラムを用いて、同様に様々な化合物で親和性の程度を調べれば、特定のタンパク質のATP、GTP、NAD/NADHまたはNADP/NADPH結合部位に結合する化合物とタンパク質との構造親和性相関を見出すことも可能になる。
さらに、この方法では同位体を使っているため、SDS−PAGE上でのバンドの有無だけではなく、質量分析スペクトル上でピーク強度比を計算することで定量的な情報を得ることができる。このような情報は、化合物を合成する研究者に大きな情報を与えることが出来る。これまで構造活性相関では1つの標的分子あるいは1つのアッセイ系に対して、化合物の種類を変えて活性値の変化を調べて次の合成展開をはかってきた。一方、本発明の方法を使えば、1種又は複数種の化合物と複数種のタンパク質との構造親和性相関を網羅的に解析することができる。つまり、1つの化合物に着目すれば結合する複数種のタンパク質それぞれに対する特異性の違いを定量的に評価でき、また、あるタンパク質に注目すれば化合物間での結合の違いを定量的に知ることができる。
以下、本発明の第一の態様について、詳細に記載する。
<同位体標識されたタンパク質群および同位体標識されていないタンパク質群>
本発明において、「同位体標識されたタンパク質群」とは、タンパク質を構成する分子の一部が同位体で標識されたタンパク質の集合をいう。
同位体標識されたタンパク質群は、タンパク質を構成する分子(アミノ酸)の一部が同位体で標識されていればよく、その調製方法や標識部位については、特に限定されない。
以下、具体的な調製方法について記載する。
同位体標識されたタンパク質群は、代謝的に同位体標識することによって、調製することができる。例えば、培養可能な細胞を、同位体標識されたアミノ酸を含む培地で培養することによって、細胞中のタンパク質を代謝的に同位体標識することができる。培養条件はどのようなものであってもよく、液体培地あるいは固体培地に該細胞を培養するのに好適な条件を選択すればよい。例えば、動物細胞を選択した場合には、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM等の培地を用い、必要に応じウシ胎児血清(FCS)等の血清、アミノ酸、グルコース、ペニシリン又はストレプトマイシンなどを添加することができ、pH約6〜8、30〜40℃において15〜200時間前後の培養を行うことができる。その他、必要に応じ途中で培地の交換を行ったり、通気及び攪拌を行ったりすることができる。
このようにして得られた代謝的に同位体標識されたタンパク質群を含む細胞を破砕することで、同位体標識されたタンパク質群を調製することができる。破砕する方法は、例えば、ダウンス型テフロンTM・ホモジナイザー、ポリトロン、ワーリング・ブレンダー、ポッター型ガラス・ホモジナイザー、超音波破砕装置、細胞溶解液(例えば、PIERCE社のM−PER:cat no.78501,T−PER:cat no.78510など)を用いる方法又は凍結融解法があげられ、好ましくは細胞溶解液を用いる方法があげられる。破砕した細胞は、遠心分離操作により、不溶性物質を除去することが好ましい。このようにして、同位体標識されたタンパク質群を調製することができる。
本発明で用いる同位体は、放射性同位体を適用することもできるが、放射性を有さない安定同位体が、取り扱いが容易であることから、特に好ましい。安定同位体には、以下に限定されるものではないが、2H、13C、15N、17O、18O、33P若しくは34S又はこれらの組み合わせが挙げられ、好ましくは2H、13C、15N若しくは18O又はこれらの組み合わせであり、より好ましくは13C、15N若しくは18O又はこれらの組み合わせであり、さらに好ましくは13Cである。本発明に利用される同位体は、タンパク質を標識し得るものであれば、その種類は特に限定されない。具体的には、同位体標識タンパク質の前駆体として、13C標識(13Cx6個)ロイシン(Cambridge Isotope Labs(CIL)社製、L−Leucine U−13C6,CLM−2262)を挙げることができる。
また、同位体標識されたタンパク質群は、in vitroにおいても調製することができる。たとえば、タンパク質中のシステイン残基を同位体標識されたアルキル化試薬を用いてアルキル化することにより、同位体標識することができる(「ラピッド・コミュケーションズ・イン・マス・スペクトルメトリー(Rapid Communications in Mass Spectroscopy)」第16巻、第15号、2002年、pp.1416−1424参照)。さらに、タンパク質中のシステイン残基を同位体標識されたビオチン化試薬を用いてビオチン化することにより、同位体標識することもできる。これを、さらに、アビジンカラムを用いて、標識されたタンパク質のみを精製することが可能である(「ネイチャー・バイオテクノロジー(Nature Biotechnology)」第17巻、第10号、1999年10月、pp.994−999)。
本発明において、「同位体標識されていないタンパク質群」とは、同位体標識する行為を施していないタンパク質の集合をいう。
同位体標識されていないタンパク質群は、タンパク質を含む生体試料、好ましくは細胞、特に好ましくは培養細胞を破砕し、タンパク質を抽出することで調製することができる。
破砕する方法は、例えば、ダウンス型テフロンTM・ホモジナイザー、ポリトロン、ワーリング・ブレンダー、ポッター型ガラス・ホモジナイザー、超音波破砕装置、細胞溶解液(例えば、PIERCE社のM−PER:cat no.78501,T−PER:cat no.78510など)を用いる方法又は凍結融解法があげられ、好ましくは細胞溶解液を用いる方法があげられる。破砕した細胞は、遠心分離操作により、不溶性物質を除去することが好ましい。このようにして、同位体標識されていないタンパク質群を調製することができる。
また、同位体標識されたタンパク質群および同位体標識されていないタンパク質群は、化学合成により製造してもよい。
なお、同位体標識されたタンパク質群および同位体標識されていないタンパク質群は、適当な条件、好ましくは−20℃以下、特に好ましくは−80℃以下で保存することができる。
本発明において、「同位体標識されていない(同位体非標識)タンパク質群」については、天然型試薬(同位体でない試薬)を用いて、「同位体標識されたタンパク質群」と同一の方法で調製することが好ましい。
本発明において、「同位体標識されていないタンパク質群」の代わりに「同位体標識されたタンパク質群」の同位体とは異なる同位体で標識されたタンパク質群(以下、「異なる同位体で標識されたタンパク質群」ともいう。)を用いることもできる。当該「異なる同位体で標識されたタンパク質群」中の同位体は、両タンパク質群由来の対応する各タンパク質の質量が異なるようにタンパク質を標識できる限り、「同位体標識されたタンパク質群」中の同位体とは別の同位体であってもよいし、同一の同位体を含んでいてもよい。
(1)(a)同位体標識されたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程
同位体標識されたタンパク質群を、化合物が固定化された担体を用いて精製する。これにより、担体に固定化した化合物に結合する複数種のタンパク質を精製することができる。本明細書において「担体を用いて」とは、母集団のタンパク質群を精製する際に、化合物が固定化された担体を利用することを意味する。
以下、詳細に説明する。
初めに、適当な溶液で化合物が固定化された担体を平衡化する。平衡化する溶液は、特に限定されないが、タンパク質群を溶解することができ、かつ、変性させない溶液が望ましい。例えば、生理的pHに調製したリン酸緩衝液、Hepes緩衝液またはトリス緩衝液などが挙げられ、必要に応じて、これらに塩化ナトリウムおよび/または界面活性剤(n−オクチルグルコシドなど)を適当量加えることができる。
平衡化する工程は、化合物が固定化された担体が適当なカラムに充填されている場合には、適当な溶液をカラムにアプライすることによって、化合物が固定化された担体が、適当なチューブに加えられている場合には、適当な溶液をチューブに添加することによって、それぞれ行うことができる。
次に、同位体標識されたタンパク質群を、適当な溶液に溶解する。続いて、同位体標識されたタンパク質群と化合物が固定化された担体とを接触させる。同位体標識されたタンパク質群と化合物が固定化された担体とを接触させる工程は、化合物が固定化された担体が適当なカラムに充填されている場合には、同位体標識されたタンパク質群をカラムにアプライすることによって、化合物が固定化された担体が、適当なチューブに加えられている場合には、同位体標識されたタンパク質群をチューブに添加することによって、それぞれ行うことができる。
その後、化合物が固定化された担体を適当な溶液で洗浄することが望ましい。洗浄操作は、化合物が固定化された担体が、適当なカラムに充填されている場合には、適当な溶液をカラムに添加することによって、化合物が固定化された担体が、適当なチューブに加えられている場合には、適当な溶液をチューブに添加し、遠心操作をすることによって、それぞれ行うことができる。
そして、適当な溶出溶液で同位体標識されたタンパク質群を溶出する。溶出溶液は、特に限定されないが、例えば、6M塩酸グアニディン、8M尿素、2%CHAPS、あるいは10mM程度のATPやGTP等を用いることができる。同位体標識されたタンパク質群を溶出させる工程は、化合物が固定化された担体が、適当なカラムに充填されている場合には、適当な溶出溶液をカラムにアプライすることによって、化合物が固定化された担体が、適当なチューブに加えられている場合には、適当な溶出溶液をチューブに添加し、遠心操作をすることによって、それぞれ行うことができる。
これらの方法により、担体に固定化した化合物に結合するタンパク質群を精製することができる。
以上の操作温度は、特に限定されないが、4℃から37℃、さらには4℃から20℃で行うことが好ましい。
(2)(b)予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程
工程(b)で用いられるタンパク質群は、同位体標識されていないタンパク質群の他、工程(a)の「同位体標識されたタンパク質群」の同位体と異なる同位体で標識されたタンパク質群を用いることもできる。以下の説明では、同位体標識されていないタンパク質群を用いた場合について説明するが、「異なる同位体で標識されたタンパク質群」の場合も同様に実施することができる。
同位体標識されていないタンパク質群と非固定化化合物とを接触させ、その後、非固定化化合物と接触させた当該同位体標識されていないタンパク質群を、化合物が固定化された担体で精製する。これにより、非固定化化合物と接触させた同位体標識されていないタンパク質群について、担体に固定化した化合物に結合する複数種のタンパク質を精製することができる。
以下、詳細に説明する。
初めに、同位体標識されていないタンパク質群を、適当な溶液に溶解する。続いて、同位体標識されていないタンパク質群と非固定化化合物とを接触させる。
同位体標識されていないタンパク質群と接触させる化合物(非固定化化合物)は、特に限定されず、例えば、合成低分子化合物、合成ペプチド、精製または部分精製ポリペプチド、抗体、細菌放出物質(細菌代謝産物を含む)、生体内核酸物質(ATP、GTP、NAD/NADHまたはNADP/NADPHなど)、脂質などが挙げられる。これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。また、これら化合物は所定の活性を有している。
同位体標識されていないタンパク質群と接触させる化合物(非固定化化合物)は、一種であってもよいが、複数種、例えば、5種以上であることが好ましい。また、これらの化合物および担体に固定化された化合物は、特に限定されないが、互いに構造において類似することが好ましい。非固定化化合物は、担体に固定化された化合物を含んでいてもよい。さらに、生理活性または薬理活性等の所定の活性の強度が異なることが好ましい。
接触に際しての化合物の溶媒、濃度、インキュベーション等の諸条件は、特に限定されず、自由に設定できる。同位体標識されていないタンパク質群を溶解した溶液は、大量のタンパク質が含まれているため、水に対して難容性の化合物でも溶解させることができる。
次に、化合物と接触させた当該同位体標識されていないタンパク質群を、上記1.(1)(a)で作製した化合物が固定化された担体で精製する。タンパク質の精製方法は、上記「1.(1)(a)同位体標識されたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程」と同様の方法によって行うことができる。
これらの方法により、化合物と接触させた同位体標識されていないタンパク質群について、担体に固定化した化合物に結合する複数種のタンパク質を精製することができる。
(3)(c)工程(a)および工程(b)で得られたタンパク質を混合する工程
工程(a)および工程(b)で得られたタンパク質群を、一定の割合で混合する。一定の割合は、等量でもよく、比率を変えてもよい。後述する強度比のダイナミックレンジを向上させるため、上記「1.(1)(a)同位体標識されたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程」で得られた複数種のタンパク質に対して、上記「1.(2)(b)予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程」で得られた複数種のタンパク質を過剰量(例えば、2倍から10倍)加えることが好ましい。
(4)(d)工程(c)で得られた混合物を質量分析処理する工程
工程(c)得られた混合物を質量分析処理する。混合物は、そのまま質量分析計により分析してもよいが、濃縮(例えば、Amicon Ultra−15 10,000MWCOなどによる)や以下の分離または消化を行うことが好ましい。後述の分離または消化操作を施した混合物を、「分離したタンパク質」または「消化したタンパク質」とする。分離方法は、二次元電気泳動、SDS−PAGE、各種クロマトグラフィー(例えば、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィーなど)等が考えられるが、これに限定されるものではなく、適当なものを選択すればよい。消化方法には、酵素消化、化学分解等があげられ、好ましくは酵素消化があげられるが、これに限定されるものではなく、適当なものを選択すればよい。酵素消化に用いる酵素としては、トリプシン、キモトリプシン、Lys−C,Asp−N,Glu−Cなどがあげられ、好ましくはトリプシンがあげられる。また、酵素消化の際には、界面活性剤、好ましくは5−cyclohexyl−pentyl−beta−D−maltoside(アメリカ特許公報US5674987およびUS5763586、アナトレース社(Anatrace Inc.,Maumee,OH,USA))を加えることが望ましい。
こうして得られた濃縮したタンパク質、分離したタンパク質又は消化したタンパク質は、HPLCにより分離することができ、得られたタンパク質を、「HPLCにより分離されたタンパク質」とする。HPLCに用いるカラムは、当業者における技術常識により、適当なものを選択すればよく、好ましくはアニオン交換カラム又はカチオン交換カラムである。HPLCの諸条件(流速、検出器、移動相など)は、当業者における技術常識により、適宜選択できる。
次に、上記の操作により得られた複数種のタンパク質を質量分析計で質量分析処理する。質量分析計は、ガスクロマトグラフと結合された質量分析装置であるガスクロマトグラフィーマススペクトロメトリー(GC/MS)や液体クロマトグラフと結合された質量分析装置である液体クロマトグラフィーマススペクトロメトリー(LC/MS)等の汎用の装置を用いて行うことができる。質量分析計におけるイオン化方法は、各装置に応じて適宜選択できる。例えば、MALDI(マトリックス支援レーザー脱離イオン化法)、ESI(エレクトロスプレーイオン化法)、EI(電子イオン化法)、CI(化学イオン化法)、APCI(大気圧化学イオン化法)、FAB(高速原子衝撃法)、LD、FD、SIMS、TSP等があげられ、好ましくはMALDI又はESIがあげられる。アナライザーは、各装置に応じて適宜選択できる。例えば、TOF(飛行時間型)、イオントラップ、二重収束型、四重極型、フーリエ変換型等の汎用の装置を用いて行うことができる。質量分析計の装置及び方法は、ここにあげたものに限定されるものではなく、当業者において質量分析に通常使用されるものを適宜選択すればよい。
(5)(e)質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程
質量分析計による測定の結果得られたデータを用いて、複数種のタンパク質中のタンパク質を同定することができる。すなわち、得られたデータをソフトフェア(例えば、SonarMSMS(Genomic solution社製))およびデータベース(例えば、NCBInr(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、IPI、Sport等のデータベース)を使用することにより解析し、サンプル中のタンパク質を同定することが可能である。質量分析計による測定データを用いて、タンパク質を同定することは当業者にとって容易である(Nat Genet.1998:20,46−50;J Cell Biol.1998:141,967−977;J Cell Biol.2000:148,635−651;Nature.2002:415,141−147;Nature.2002:415,180−183;Curr Opin Cell Biol.2003:15,199−205;Curr Opin Cell Biol.2003:7,21−27)。同定されたタンパク質の情報から、アミノ酸配列情報を得ることは、当業者にとって容易である。
(6)(f)各タンパク質について、工程(a)で得られたタンパク質に由来するピークと工程(b)で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程
本発明において、「工程(a)で得られたタンパク質に由来するピーク」とは、質量分析の測定結果から得られる質量分析スペクトルにおいて、同位体標識されたタンパク質群に由来するシグナル強度又はその総和(通常面積で表されることは当業者であれば理解できる)をいう(以下、単に「標識ピーク」と称する場合がある)。
本発明において、「工程(b)で得られたタンパク質に由来するピーク」とは、質量分析の測定結果から得られる質量分析スペクトルにおいて、同位体標識されていないタンパク質群または異なる同位体で標識されたタンパク質群に由来するシグナル強度又はその総和をいう(以下、説明の便宜上単に「非標識ピーク」と称する場合がある)。
質量分析による測定の結果得られたデータを用いて、各タンパク質について、非標識ピークと標識ピークとの強度比(=「非標識ピークの強度」/「標識ピークの強度」)(以下、単に「ピーク強度比」と称する場合がある)を求めることにより、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量することができる。
同位体標識されたタンパク質は、同位体標識されていないタンパク質に比べ、同位体標識されている分子の分、分子量が大きくなり質量分析スペクトル上でペアのピークとして観測される。同位体標識されたタンパク質の分子量は、同定されたタンパク質およびそのアミノ酸配列から計算によって求めることができる。
工程(b)のタンパク質群のうち、非固定化化合物と結合したタンパク質は、非固定化化合物との結合により、担体上の化合物に結合しにくくなるので、質量分析スペクトル上で非標識ピークが小さくなり、ピーク強度比は、工程(b)で得られたタンパク質と工程(a)で得られたタンパク質とを工程(c)において混合したときの比(=工程(b)で得られたタンパク質量の混合量/工程(a)で得られたタンパク質量の混合量)(以下、「タンパク質混合比」と称する場合がある)に比べて小さくなる。一方、添加した非固定化化合物と結合しないタンパク質は、化合物が固定化された担体への結合に影響を受けないので、非標識ピークが小さくならず、ピーク強度比とタンパク質混合比との間で変化は生じない。また、生理活性、生物活性、薬理活性または結合活性等の所定の活性が異なる非固定化化合物同士の比較において、質量分析スペクトル上で、あるタンパク質における非標識ピークが同程度小さくなる場合、すなわち、ピーク強度比が同程度小さくなる場合には、当該タンパク質は、活性を有する化合物、すなわち比較に用いた非固定化化合物の当該活性に重要な特異的結合タンパク質ではないと考えられる。
一方、所定の活性を有する非固定化化合物(説明上、化合物Cとする)が低濃度であっても質量分析スペクトル上で非標識ピークが小さくなる場合、すなわち、ピーク強度比がタンパク質混合比に比べて小さくなる場合には、当該タンパク質は、その非固定化化合物の活性に重要なタンパク質である可能性がある。同時に、化合物Cと構造は類似するが、生理活性、生物活性、薬理活性または結合活性等の所定の活性が異なる他の非固定化化合物によって、質量分析スペクトル上で非標識ピークが影響を受けずに小さくならない場合、すなわち、ピーク強度比が影響を受けない場合には、当該タンパク質が、所定の活性を有する非固定化化合物Cの当該活性に重要な特異的結合タンパク質である可能性が高い。
また、非固定化化合物とタンパク質との親和性が極めて弱い場合(どの程度弱いかは不明)であって、当該非固定化化合物の濃度が低い場合には、カラムを通過する際に、タンパク質と結合している前記非固定化化合物が、カラム内に高濃度に固定化された化合物と置き換わる可能性もあるが、このことは、非固定化化合物の濃度を高めることで影響を低下させることができる。
このような方法を用いることによって、簡便かつ効率的に、複数種のタンパク質と一種以上の化合物との構造親和性相関を同時に解析することが可能となる。
なお、前記解析方法は、同位体標識されたタンパク質群を化合物と接触させず、同位体標識されていないタンパク質群を化合物と接触させた場合(図1参照)について説明したが、同位体標識されていないタンパク質群を化合物と接触させず、同位体標識されたタンパク質群を化合物と接触させた場合(図2参照)でも本発明に係る解析方法が実施可能であることは、当業者には容易に理解できる。なお、この場合はピーク強度比の値は、「標識ピークの強度」/「非標識ピークの強度」の式により求める。また、同位体標識されていないタンパク質群に代えて、異なる同位体で標識されたタンパク質群を用いても本発明の解析方法を実施することができる。
また、化合物が固定化された担体として、ATP、GTP、NAD/NADHまたはNADP/NADPHなどを固定化した担体またはカラムを使って、同様に様々な化合物で親和性の程度を調べれば、特定のタンパク質のATP、GTP、NAD/NADHまたはNADP/NADPH結合部位に結合する化合物とタンパク質との構造親和性相関を見出すことも可能になる。
さらに、この方法では安定同位体を使っているため、SDS−PAGE上でのバンドの有無だけではなく、質量分析スペクトル上でピーク強度比を計算することで定量的な情報を得ることができる。このような情報は、化合物を合成する研究者に大きな情報を与えることが出来る。これまで構造活性相関では1つの標的分子あるいは1つのアッセイ系に対して、化合物の種類を変えて活性値の変化を調べて次の合成展開をはかってきた。一方、本発明の方法を使えば、複数種の化合物と複数種のタンパク質との構造親和性相関を網羅的に解析することができる。つまり、1つの化合物に着目すれば結合する複数種のタンパク質それぞれに対する特異性の違いを定量的に評価でき、また、あるタンパク質に注目すれば化合物間での結合の違いを定量的に知ることができる。
本発明は、さらに、複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析するシステムであって、
(a)同位体標識されたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
(b)予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
(c)手段(a)および手段(b)で得られたタンパク質を混合する手段と、
(d)手段(c)で得られた混合物を質量分析処理する手段と、
(e)質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段と、
(f)各タンパク質について、手段(a)で得られたタンパク質に由来するピークと手段(b)で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段と、
を含む、前記システムを提供する。
(a)同位体標識されたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段は、上記の「1.(1)(a)同位体標識されたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程」において用いられる手段と同一のものである。
(b)予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段は、上記の「1.(2)(b)予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程」において用いられる手段と同一のものである。手段(b)において、タンパク質群は、同位体標識されていないものを用いることもできるし、手段(a)の同位体標識されたタンパク質群とは異なる同位体で標識されたタンパク質群を用いることもできる。
(c)手段(a)および手段(b)で得られたタンパク質を混合する手段は、上記の「1.(3)(c)工程(a)および工程(b)で得られたタンパク質を混合する工程」において用いられる手段と同一のものである。
(d)手段(c)で得られた混合物を質量分析処理する手段は、上記の「1.(4)(d)工程(c)で得られた混合物を質量分析処理する工程」において用いられる手段と同一のものである。
(e)質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段は、上記の「1.(5)(e)質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程」において用いられる手段と同一のものである。
(f)各タンパク質について、手段(a)で得られたタンパク質に由来するピークと手段(b)で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段は、上記の「1.(6)(f)各タンパク質について、工程(a)で得られたタンパク質に由来するピークと工程(b)で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程」において用いられる手段と同一のものである。
なお、前記システムは、同位体標識されたタンパク質群を化合物と接触させず、同位体標識されていないタンパク質群を化合物と接触させてから精製工程を実行する態様(第一の態様、図1)について説明したが、同位体標識されていないタンパク質群を化合物と接触させず、同位体標識されたタンパク質群を化合物と接触させてから精製工程を実行する態様(図2)でも、システム内の各構成要素となる装置を適宜入れかえて本発明に係るシステムが実施可能であることは、当業者には容易に理解できる。なお、この場合はピーク強度比の値は、「標識ピークの強度」/「非標識ピークの強度」の式により求める。また、同位体標識されていないタンパク質群に代えて、異なる同位体で標識されたタンパク質群を用いても、本発明のシステムを実施可能である。
以下に、本発明の第一態様における複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析するシステムについて詳しく述べる。なお、手段(b)のタンパク質群は、同位体標識されていないタンパク質を例として以下に説明する。
図6は、本発明のシステムの構成を示すブロック図である。図6において、本発明のシステムは、制御ユニット601、タンパク質精製ユニット602、タンパク質混合ユニット603及び質量分析ユニット604からなる。
制御ユニット601は、本発明の方法を実行するために必要な各ユニットの動作全体を制御する。タンパク質精製ユニット602、タンパク質混合ユニット603及び質量分析ユニット604は、制御ユニット601にそれぞれ接続され、互いに独立して、又は各ユニットと連携して実行するように制御ユニット601により制御される。例えば、本発明の方法を主としてバッチ式で実行するときは、各ユニット(タンパク質精製ユニット602、タンパク質混合ユニット603及び質量分析ユニット604)は制御ユニット601から独立して制御され、制御ユニット601はそれぞれのユニットが実行する内容を指示する。また、本発明の方法を主として連続的に流れ作業として実行するときは、制御ユニット601は、それぞれのユニットの実行内容、例えば各ユニットの進行状況を監視し、各ユニットは連携して制御される。
タンパク質精製ユニット602は、タンパク質を精製するためのユニットであり、細胞培養器、細胞破砕器、化合物との接触処理器、クロマトグラフィー等を行うための担体、精製タンパク質の回収器などを備える。精製ユニットに含まれる各構成要素は、制御ユニット601の指令に従って、独立して、又は各構成要素と互いに連携して制御される。
タンパク質混合ユニット603は、タンパク質精製ユニット602により精製されたタンパク質を混合するユニットである。タンパク質混合ユニット603は制御ユニット601に接続されており、混合量、混合比などの指令を制御ユニット601から受けて混合処理する。
質量分析ユニット604は、上記混合されたタンパク質を質量分析にかけるユニットであり、混合タンパク質を測定用プレートにスポットするためのスポッター、当該測定プレートを質量分析器にかけるためのトレー等を備える。質量分析ユニット604におけるこれらの構成要素は制御ユニット601に接続されており、制御ユニット601の指令に従って質量分析処理を実行する。
図7は、上記各ユニットの一態様を示す模式図である。
図7において、タンパク質精製ユニット602は、培養装置11a及び11b、培養液ボトル12a及び12b、細胞破砕器13a及び13b、化合物との接触器14、化合物が固定された担体15a及び15b、タンパク質精製用制御装置16a及び16b、精製タンパク質分取器17a及び17bを備える。
培養装置11a及び11bは、細胞培養を行うための装置であり、温度、CO2濃度などを調節して細胞を所定時間培養する。培養装置11a及び11bには、それぞれ培養液ボトル12a及び12bが接続されており、それぞれチューブ1a、1bを介して各培養装置に培養液を供給してもよい。培養装置11a及び11bには、それぞれ攪拌羽根2a、2bを供えてもよい。培養装置11a及び11bは、浮遊細胞を培養するための容器として例示してあるが、これは本発明のシステムを説明するための一態様であり、限定されるものではない。従って、培養プレートに付着する細胞を培養する場合は、当業者は目的に応じた培養容器を選択することができる。培養装置11a及び11bは、LAN100を経由して制御ユニット601に接続される。
培養液ボトル12a及び12bは、細胞を培養するための培養液を貯蔵する容器である。本発明の第一の態様では、培養液ボトル12aには、タンパク質群を同位体標識するためのアミノ酸などが混合される。培養液ボトル12a及び12bは、LAN100を介して制御ユニット601に接続されていてもよい。
細胞破砕器13a及び13bは、培養された細胞を破砕してタンパク質群を得るための装置であり、培養装置11a、11bから細胞を回収して細胞を破砕し、タンパク質群の懸濁液を得る工程を実行する。細胞破砕器13a及び13bは、LAN100を介して制御ユニット601に接続されていてもよい。
化合物との接触器14は、タンパク質群と化合物とを接触させるための装置である。図7は、同位体標識していないタンパク質群と化合物とを、担体に適用する前に予め接触させるため、細胞破砕器13bの次に配置されている態様(本発明の第一の態様)を示す。第一の態様の別の側面として、化合物との接触器14は、同位体標識したタンパク質群と化合物とを、担体に適用する前に予め接触させるため、細胞破砕器13aの次に配置し得ることは、当業者であれば容易に理解できる。化合物との接触器14は、LAN100を介して制御ユニット601に接続されていてもよい。
化合物が固定化された担体15a及び15bは、タンパク質を精製するためのカラムであり、内部に化合物が固定されている。
複数種のタンパク質と複数種の化合物との構造親和性相関を解析する場合には、タンパク質群とそれぞれの化合物とを、化合物との接触器14において接触させればよい。この場合、化合物との接触器14による接触処理前までは、培養装置11b由来のサンプルは同じ処理が施された同一のものである。そのため、化合物との接触器14に導入するタンパク質群としては、化合物毎に異なる培養装置11bおよび細胞破砕器13bを用いて採取されるタンパク質群であってよい。あるいは、一つの培養装置11bおよび細胞破砕器13bを用い、そこから採取されるタンパク質群を、複数個(例えば、非固定化化合物の数)に分け、化合物との接触器14に導入していてもよい。
タンパク質精製用制御装置16a及び16bは、制御ユニット601からの指令に従って、タンパク質をそれぞれ化合物が固定化された担体15a、15bに導入するとともに、担体を通過させて精製タンパク質分取器17a、17bに送る工程を実行する。タンパク質精製用制御装置16a及び16bは、LAN100を介して制御ユニット601に接続されていてもよい。
精製タンパク質分取器17a及び17bは、一方の精製工程で得られた精製タンパク質と、他方の精製工程で得られた精製タンパク質とを一時貯蔵する。タンパク質の分量が多いときは、同一種類のタンパク質(同一細胞から精製されたタンパク質)を複数のボトルに分注しておくこともできる。
図7では1種類の培養精製工程を示しているが、システムを複数並列させて複数種類の培養精製工程を実行することができるようにし、その結果、複数種類の異なる細胞由来のタンパク質を精製することもできる。その場合は、各精製タンパク質を区別して分取器に貯蔵する必要があるが、本発明においては、精製タンパク質分取器17a及び17bは、分取器ごとに別々のタンパク質を貯蔵する態様であってもよく、分取器内のボトルごとに、それぞれ種類の異なるタンパク質を貯蔵する態様であってもよい。
図7では、精製タンパク質分取器17a及び17bが、タンパク質精製用制御装置16a及び16bにより制御される態様を示しているが、これに限定されるものではなく、独立して、LAN100を介して制御ユニット601に接続されていてもよい。
図7において、タンパク質混合ユニット603は、タンパク質精製ユニット602において精製された一方のタンパク質と他方のタンパク質とを混合するユニットである。タンパク質混合ユニット603は、制御ユニット601からの指令に従って、精製タンパク質分取器17a及び17bに配列されたサンプルを選択して一定の割合で混合する。図7は、チューブ18に1番のサンプル同士、2番のサンプル同士のように同じ番号のサンプルを混合する態様を示している。
質量分析ユニット604は、質量分析の対象となる1つ又は複数種のタンパク質試料を解析するユニットである。質量分析ユニット604は、制御ユニット601の指令に従って、タンパク質混合ユニット603により混合された試料を質量分析用のプレート19にスポットし、質量分析処理装置20により質量分析処理を実行する。プレート19を質量分析処理装置20に移送するには、コンピュータ制御のロボット型試料取扱装置を用いることもできる。
質量分析は、LAN100を介して制御ユニット601の指令に従って実行される。質量分析処理は、質量分析処理装置20に付属のコンピュータ21を設置して実行させることも可能である。
質量分析処理の情報は、LAN100を介して制御ユニット601に送信され、タンパク質の同定プロファイル、強度比プロファイル、親和性の比プロファイルを得るための処理に付される。
制御ユニット601は、本発明のシステムを実行させるための中央制御ユニットであり、中央コンピュータ30、インターネット通信回線等を備える。
制御ユニット601は、タンパク質の同定を実行するとともに、同位体標識ピークと非標識ピークとの強度比及び親和性の比を決定し、制御ユニット601内の表示装置に表示する。各データは、制御ユニット601により自動整理される。
図8は、制御ユニット601の詳細構成図である。図8において、中央コンピュータ30は、CPU801、送信/受信部802、入力部803、出力部804、ROM805、RAM806、ハードディスクドライブ(HDD)807、CD−ROMドライブ808及びタンパク質データベース(以下「DB」という)809を備える。
CPU801は、本発明のシステム全体の動作を制御するとともに、質量分析結果のデータ、同定されたタンパク質データ、強度比データ、親和性データ等をDB809に記録する。CPU801は、送信/受信部802の通信制御、DB809に記憶されているデータを利用して、インターネット811を介して他のタンパク質のデータと照合することもできる。
送信/受信部802は、CPU801の指令に従って、タンパク質精製ユニット602、タンパク質混合ユニット603、質量分析ユニット603との間でデータの送信及び受信処理を行う。
入力部803は、キーボード、マウス、タッチパネル等であり、ユーザからの情報入力時、データベースの内容更新時等に操作される。出力部804はLCD(液晶ディスプレイ)等であり、各種データベースの更新時等にCPU801からのコードデータをその都度表示用データに変換して表示処理を行う。ROM805は、本発明のシステムの処理プログラムを格納する。RAM806は、本発明のシステムの処理に必要なデータを一時的に格納する。HDD807は、質量分析データ等を格納するためのドライブである。CD−ROMドライブ808は、CPU801からの指令に従って、CD−ROM810に格納されている、本発明のシステムの実行(各種態様の実行)に必要なプログラム等を読み出してRAM806等に書き込む。CD−ROMの代わりに記録媒体として書き換え可能なCD−R、CD−RW等を用いることもできる。その場合には、CD−ROMドライブ808の代わりにCD−R又はCD−RW用ドライブを設ける。また、上記媒体の他に、DVD、MO、フラッシュメモリースティック等の媒体を用い、それに対応するドライブを備える構成としても良い。
中央コンピュータ30は、タンパク質群の精製ユニット602、混合ユニット603、質量分析ユニット604と通信し、これらのユニットが機能するように、制御情報を送信するとともに、タンパク質の同定結果およびタンパク質の質量分析結果を受信して同定結果、強度比、親和性比の同定結果を表示する。
以下、制御ユニットの動作(第一の態様)を、図面(図9)を用いて説明する。
制御ユニット601の中央コンピュータ30は、本発明の実施に必要な培養液、試料(細胞)、その他の試薬を一方の培養装置11aに充填するよう充填装置(図示せず)に命令するとともに、タンパク質の標識に必要な同位体標識物質(同位体標識されたアミノ酸等)を添加するよう試薬充填装置(図示せず)に命令し、充填装置は充填を実行する(S901a)。これと並行して、中央コンピュータ30は、本発明の実施に必要な培養液、試料(細胞)その他の試薬を他方の培養装置11bに充填するよう、試薬充填装置(図示せず)に命令し、充填装置(図示せず)は充填を実行する(S901b)。各培養装置11a、11bへの培養液等の充填が完了すると、中央コンピュータ30は次に、所定条件で培養するよう各培養装置11a、11bに命令し、各培養装置11a、11bは培養を実行する(S902a、S902b)。「所定条件」としては、培養時間、培養温度、CO2濃度、攪拌の有無などが挙げられる。所定条件での培養が終了した後、中央コンピュータ30は、細胞破砕工程を実施するよう、細胞破砕装置13a、13bに命令し、各細胞破砕装置13a、13bは細胞破砕を実行する(S903a、S903b)。S903aにより同位体標識物質含有培地から採取された細胞を破砕した後は、次に、中央コンピュータ30は所定の化合物が固定化された担体15aにタンパク質精製工程を実施するよう命令し、当該担体はタンパク質の精製を実行する(S905a)。他方、S903bにより同位体を含有しない培地から採取された細胞を破砕した後は、次に、中央コンピュータ30は破砕物(タンパク質群)と化合物との接触処理を行うよう、化合物との接触器14に命令し、当該接触器14は接触を実行する(S904)。化合物との接触処理後、S905aと同様に、タンパク質の精製を実行する(S905b)。タンパク質の精製が完了すると、中央コンピュータ30は、後に実施する混合(S907)に備えて、タンパク質精製用制御装置16a及び16bに、タンパク質試料を精製タンパク質分取器17a、17bにて分取後、一時保存するよう命令し、当該制御装置は分取及び一時保存を実行する(S906a、S906b)。その後、中央コンピュータ30は、精製タンパク質混合ユニット603に、分取された精製タンパク質を混合するよう命令し、精製タンパク質混合ユニット603は精製タンパク質を混合する(S907)。
混合が完了すると、中央コンピュータ30は、質量分析のための試料を調製するよう命令する(S908)。この質量分析用試料調製工程は、培養用のウェルトレイで行っても、別のウェルトレイで行ってもよい(S908)。次に中央コンピュータ30は、スポッター(図示せず)が調製後の資料を質量分析用プレート(例えば図7のプレート19)にスポットし、続いて質量分析装置が試料の質量分析を開始するよう命令し、スポッターはスポットを実行し、質量分析装置はその分析を実行する(S909)。
中央コンピュータ30は、タンパク質を同定するとともに(S910)、各タンパク質の標識ピークと非標識ピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する(S911)。タンパク質の同定結果、強度比のデータは中央コンピュータ30に報告され、出力装置又はコンピュータのディスプレイは、当該同定結果及び強度比を表示する(S912)。
中央コンピュータ30は、強度比および同定結果のデータを既存の情報と照会するとともに、ハードディスクに蓄積してデータベース化を実行する(S913)。
2.本発明の第二の態様
本発明の第二の態様は、複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析する方法であって、
(a)タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
(b)予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
(c)工程(a)で得られたタンパク質または工程(b)で得られたタンパク質の一方を同位体標識する工程と、
(d)工程(c)で得られた標識されたタンパク質と、工程(a)および工程(b)で得られたタンパク質のうち工程(c)で標識されていない他方のタンパク質とを混合する工程と、
(e)工程(d)で得られた混合物を質量分析処理する工程と、
(f)質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程と、
(g)各タンパク質について、工程(a)で得られたタンパク質に由来するピークと工程(b)で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程と、
を含む、前記方法を提供する。
以下、本発明の第二の態様について、詳細に記載する(図3を参照)。
(1)(a)タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程
当該工程は、上記「1.(1)(a)同位体標識されたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程」と同様の方法により、担体に固定化した化合物に結合する複数種のタンパク質を精製することができる。
工程(a)で用いられるタンパク質群は、同位体標識されていないタンパク質群の他、工程(c)で用いる同位体と異なる同位体で標識されたタンパク質群を用いることもできる。
(2)(b)予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程
当該工程は、上記「1.(2)(b)予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程」に準じる方法により、担体に固定化した化合物に結合する複数種のタンパク質を精製することができる。
工程(b)で用いられるタンパク質群は、同位体標識されていないタンパク質群の他、工程(c)で用いる同位体と異なる同位体で標識されたタンパク質群を用いることもできる。
(3)(c)工程(a)で得られたタンパク質または工程(b)で得られたタンパク質の一方を同位体標識する工程
工程(a)で得られたタンパク質または工程(b)で得られたタンパク質の一方を同位体標識する。いずれを同位体標識するかは、特に限定されない。工程(c)で用いる同位体は、放射性同位体を適用することもできるが、放射性を有さない安定同位体が、取り扱いが容易であることから、特に好ましい。安定同位体には、以下に限定されるものではないが、2H、13C、15N、17O、18O、33P)若しくは34S又はこれらの組み合わせが挙げられ、好ましくは2H、13C、15N若しくは18O又はこれらの組み合わせであり、より好ましくは13C、15N若しくは18O又はこれらの組み合わせであり、さらに好ましくは13Cである。本発明に利用される同位体は、タンパク質を標識し得るものであれば、その種類は特に限定されない。
以下、具体的な同位体標識方法について記載する。
工程(a)または工程(b)で得られたタンパク質は、in vitroにおいて同位体標識することができる。たとえば、タンパク質中のシステイン残基を同位体標識されたアルキル化試薬を用いてアルキル化することにより、同位体標識することができる(「ラピッド・コミュケーションズ・イン・マス・スペクトルメトリー(Rapid Communications in Mass Spectrometry)」第16巻、第15号、2002年、pp.1416−1424参照)。さらに、タンパク質中のシステイン残基を同位体標識されたビオチン化試薬を用いてビオチン化することにより、同位体標識することもできる。これを、さらに、アビジンカラムを用いて、標識されたタンパク質のみを精製することが可能である(「ネイチャー・バイオテクノロジー(Nature Biotechnology)」第17巻、第10号、1999年10月、pp.994−999)。
さらにまた、タンパク質を消化して得られたペプチド断片のC末、N末、グルタミン酸残基、アスパラギン酸残基などを同位体標識した分子で標識することができる。具体的には、タンパク質を酵素で消化する際に、緩衝液中に18Oで標識された水を加える。消化酵素としては、キモトリプシン、トリプシン、Asp−N、Lys−C、Glu−Cを用いることができる。キモトリプシン、Asp−Nを用いたときには、加水分解後のペプチドのC末側に18Oが一つ、トリプシン、Lys−C、Glu−Cを用いたときには、加水分解後のペプチドのC末のカルボン酸の酸素原子が二つとも18Oになることが知られている。
くわえて、タンパク質を消化して得られたペプチド断片のC末、グルタミン酸残基、アスパラギン酸残基のカルボン酸をメチルエステルにする方法が知られており(Goodlett DR,Keller A,Watts JD,Newitt R,Yi EC,Purvine S,Eng JK,von Haller P,Aebersold,Koller E.Differential stable isotope labeling of peptides for quantitation and de nove sequence derivation.Rapid Communmass Spectrom.2001:15,pp.1214−1221参照)、同位体標識されたメタノールを用いてメチル化することにより、同位体標識することも可能である。
また、タンパク質を消化して得られるペプチド断片のN末をニコチン酸誘導体化する方法(Munchbach M,Quadroni M,Miotto G,James P.Quantitation and facilitated de novo sequencing of proteins by isotropic N−terminal labeling of peptides with a fragmentation−directing moiety.Anal.Chem.2000:72,pp.4047−4057参照)や、アセチル化する方法(Ji.J.Chakraborty A,Geng M,Zhang X,Amini A,Bina M,Regnier F.Strategy for quantitative and quantitative analysis in proteomics based on signature peptides.J Chromatogr B Biomed Sci Appl.2000:745,pp.197−210参照)が知られている。そのため、これらの同位体標識された試薬を用いることにより、同位体標識することもできる。
(4)(d)工程(c)で得られた標識されたタンパク質と、工程(a)および工程(b)で得られたタンパク質のうち工程(c)で標識されていない他方のタンパク質とを混合する工程
当該工程は、上記「1(3)(c)工程(a)および工程(b)で得られたタンパク質を混合する工程」に準じる方法により、行うことができる。
(5)(e)工程(d)得られた混合物を質量分析処理する工程
当該工程は、上記「1.(4)(d)工程(c)で得られた混合物を質量分析処理する工程」と同様の方法により、行うことができる。
(6)(f)質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程
当該工程は、上記「1.(5)(e)質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程」と同様の方法により、行うことができる。
(7)(g)各タンパク質について、工程(a)で得られたタンパク質に由来するピークと工程(b)で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程
当該工程は、上記「1.(6)(f)各タンパク質について、工程(a)で得られたタンパク質に由来するピークと工程(b)で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程」と同様の方法により、行うことができる。ここで、工程(a)で得られたタンパク質および工程(b)で得られたタンパク質の一方は、工程(c)で同位体標識されており、他方は同位体標識されていない。なお、この場合、ピーク強度比の値は、「工程(a)で得られたタンパク質に由来するピークの強度」/「工程(b)で得られたタンパク質に由来するピークの強度」の式により求められる。
このような方法を用いることによって、簡便かつ効率的に、複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を同時に解析することが可能となる。
本発明はさらに、複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析するシステムであって、
(a)タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
(b)予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
(c)手段(a)で得られたタンパク質または手段(b)で得られたタンパク質の一方を同位体標識する手段と、
(d)手段(c)で得られた標識されたタンパク質と、手段(a)および手段(b)で得られたタンパク質のうち手段(c)で標識されていない他方のタンパク質とを混合する手段と、
(e)手段(d)で得られた混合物を質量分析処理する手段と、
(f)質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段と、
(g)各タンパク質について、手段(a)で得られたタンパク質に由来するピークと手段(b)で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段と、
を含む、前記システムを提供する。
(a)タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段は、上記の「1.(1)(a)同位体標識されたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程」において用いられる手段に準じるものである。手段(a)において、タンパク質群は、同位体標識されていないものを用いることもできるし、手段(c)で用いる同位体とは異なる同位体で標識されたタンパク質群を用いることもできる。
(b)予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段は、上記「1.(2)(b)予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程」において用いられる手段に準じるものである。手段(b)において、タンパク質群は、同位体標識されていないものを用いることもできるし、手段(c)で用いる同位体とは異なる同位体で標識されたタンパク質群を用いることもできる。
(c)手段(a)で得られたタンパク質または手段(b)で得られたタンパク質の一方を同位体標識する手段は、上記「2.(3)(c)工程(a)で得られたタンパク質または工程(b)で得られたタンパク質の一方を同位体標識する工程」において用いられる手段と同一のものである。
(d)手段(c)で得られた標識されたタンパク質と、手段(a)および手段(b)で得られたタンパク質のうち手段(c)で標識されていない他方のタンパク質とを混合する手段は、上記「1.(3)(c)工程(a)および工程(b)で得られたタンパク質を混合する工程」において用いられる手段に準じるものである。
(e)手段(d)で得られた混合物を質量分析処理する手段は、上記「1.(4)(d)工程(c)で得られた混合物を質量分析処理する工程」において用いられる手段に準じるものである。
(f)質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段は、上記「1.(5)(e)質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程」において用いられる手段に準じるものである。
(g)各タンパク質について、手段(a)で得られたタンパク質に由来するピークと手段(b)で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段は、上記「1.(6)(f)各タンパク質について、工程(a)で得られたタンパク質に由来するピークと工程(b)で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程」において用いられる手段に準じるものである。なお、この場合、ピーク強度比の値は、「手段(a)で得られたタンパク質に由来するピークの強度」/「手段(b)で得られたタンパク質に由来するピークの強度」の式により求められる。
本発明の第二の態様における複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析するシステムは、第一の態様の当該システムについての説明(図6、7,8および9)に準じるが、タンパク質精製ユニット602における処理の順序、構成が一部異なる。タンパク質精製ユニット602は、第一の態様で説明した装置の他、タンパク質分注装置や同位体標識制御装置などをさらに備えていても良い。
本発明の第二の態様では、タンパク質への同位体標識処理手段の配置が第一の態様と異なり、培養液ボトル12aには同位体標識物質は原則として混合されない。したがって、培養装置11a由来のサンプルは、化合物との接触器14による接触処理前までは、培養装置11b由来のサンプルと同一のものである。そのため、化合物との接触器14に導入するタンパク質群としては、異なる培養装置11aおよび11bを用い、その一方から採取されるタンパク質群であってもよい。あるいは一つの培養装置(11aまたは11bあるいは11c(図10))のみを用い、そこから採取されるタンパク質群を複数個(例えば、非固定化化合物の数+1個)に分け、その一部分を化合物に接触させても良い。
一つの培養装置から採取されるタンパク質群を複数個に分ける際の装置の模式図を図10に示す。一つの培養装置11cから採取されるタンパク質群は、細胞破砕器13cにより細胞破砕される。その後に、中央コンピュータ30は、破砕後のサンプルを複数個に分け、一部は化合物が固定化された担体15aに導入し、別の部分は化合物との接触器14c−1,14c−2,14c−3(図10では化合物との接触器は3つ表示した)に導入するよう、サンプル分注装置31に命令し、サンプル分注装置はサンプルを複数個に分け、各々を化合物が固定化された担体15aまたは化合物との接触器14c−1,14c−2,14c−3に導入する。
同位体標識の工程は、化合物が固定化された担体15a及び15bによりタンパク質が精製された後に実行する。中央コンピュータ30は、S905aおよびS905bによりタンパク質の精製を実行した後は、S905aにより精製されたタンパク質またはS905bにより精製されたタンパク質のどちらかが同位体標識されるように同位体標識制御装置(図示せず)に命令し、当該制御装置はタンパク質への同位体標識を実行する。中央コンピュータ30は、標識後の精製を同位体標識制御装置にさらに命令することもできる。標識後のタンパク質は、精製タンパク質分取器17aおよび17bにより分取され、一時保存(S906a、S906b)される。
あるいは、同位体標識の工程は、精製タンパク質分取器17aおよび17bにより分取した後、行うこともできる。中央コンピュータ30は、S906a、S906bにより精製タンパク質の分取、一時保存をした後、S906a、S906bにより保存されたタンパク質のどちらかが同位体標識されるように同位体標識制御装置(図示せず)に命令し、当該制御装置はタンパク質への同位体標識を実行する。
第二の態様では、タンパク質混合ユニット603および質量分析ユニット604は、第一の態様と同様である。
3.本発明の第三の態様
本発明の第三の態様は、複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析する方法であって、
(a)タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
(b)工程(a)で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群とを混合する工程と、
(c)工程(b)で得られた混合物を質量分析処理する工程と、
(d)予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物を固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
(e)工程(d)で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群とを混合する工程と、
(f)工程(e)で得られた混合物を質量分析処理する工程と、
(g)工程(c)および工程(f)で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程と、
(h)各タンパク質について、工程(a)で得られたタンパク質に由来するピークと内部標準物質であるタンパク質に由来するピークとの強度比および工程(d)で得られたタンパク質に由来するピークと内部標準物質であるタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、当該強度比を比較することにより各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程と、
を含む、前記方法を提供する。
以下、本発明の第三の態様について、詳細に記載する(図4参照)。
(1)(a)タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体に結合する複数種のタンパク質を精製する工程
当該工程は、上記「1.(1)(a)同位体標識されたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて、当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程」と同様の方法により、担体に固定化した化合物に結合する複数種のタンパク質を精製することができる。
工程(a)において、当該タンパク質群は、同位体標識されていないタンパク質群を用いることができる。また、同位体標識されていないタンパク質群の代わりに、本発明の内部標準物質で用いられた同位体とは異なる同位体で標識されたタンパク質群を用いることもできる。
(2)(b)工程(a)で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群とを混合する工程
工程(a)で得られたタンパク質および内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群を、一定の割合で混合する。一定の割合は、等量でもよく、比率を変えてもよい。内部標準物質とは、測定系において基準となる物質を意味し、ここでいう同位体標識されたタンパク質群が内部標準物質として機能する。内部標準物質は、好ましくは、工程(a)で得られた複数種のタンパク質と同質の生体試料に由来するものであるが、異なる生体試料に由来するものであってもよい。
以下に、内部標準物質として機能しうる同位体標識されたタンパク質群(以下、「本発明の内部標準物質」と称する場合がある)の調製方法の一例について記載する。
本発明の内部標準物質は、代謝的に同位体標識することによって、調製することができる。例えば、培養可能な細胞を、同位体標識されたアミノ酸を含む培地で培養することによって、細胞中のタンパク質を代謝的に同位体標識することができる。培養条件はどのようなものであってもよく、液体培地あるいは固体培地に該細胞を培養するのに好適な条件を選択すればよい。例えば、動物細胞を選択した場合には、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM等の培地を用い、必要に応じウシ胎児血清(FCS)等の血清、アミノ酸、グルコース、ペニシリン又はストレプトマイシンなどを添加することができ、pH約6〜8、30〜40℃において15〜200時間前後の培養を行うことができる。その他、必要に応じ途中で培地の交換を行ったり、通気及び攪拌を行ったりすることができる。
このようにして得られた代謝的に同位体標識されたタンパク質群を含む細胞を、破砕することで、本発明の内部標準物質を調製することができる。破砕する方法は、例えば、ダウンス型テフロンTM・ホモジナイザー、ポリトロン、ワーリング・ブレンダー、ポッター型ガラス・ホモジナイザー、超音波破砕装置、細胞溶解液(例えば、PIERCE社のM−PER:cat no.78501,T−PER:cat no.78510など)を用いる方法又は凍結融解法などがあげられ、好ましくは細胞溶解液を用いる方法があげられる。破砕した細胞は、遠心分離操作により、不溶性物質を除去することが好ましい。このようにして、本発明の内部標準物質を調製することができる。
本発明で用いる同位体は、放射性同位体を適用することもできるが、放射性を有さない安定同位体が、取り扱いが容易であることから、特に好ましい。安定同位体には、以下に限定されるものではないが、2H、13C、15N、17O、18O、33P若しくは34S又はこれらの組み合わせが挙げられ、好ましくは2H、13C、15N若しくは18O又はこれらの組み合わせであり、より好ましくは13C、15N若しくは18O又はこれらの組み合わせであり、さらに好ましくは13Cである。本発明に利用される同位体は、タンパク質を標識し得るものであれば、その種類は特に限定されない。具体的には、同位体標識タンパク質の前駆体として、13C標識(13Cx6個)ロイシン(Cambridge Isotope Labs(CIL)社製、L−Leucine U−13C6,CLM−2262)を挙げることができる。
また、本発明の内部標準物質は、in vitroにおいても調製することができる。たとえば、タンパク質中のシステイン残基を同位体標識されたアルキル化試薬を用いてアルキル化することにより、同位体標識することができる(「ラピッド・コミュケーションズ・イン・マス・スペクトルメトリー(Rapid Communications in Mass Spectroscopy)」第16巻、第15号、2002年、pp.1416−1424参照)。さらに、タンパク質中のシステイン残基を同位体標識されたビオチン化試薬を用いてビオチン化することにより、同位体標識することもできる。これを、さらに、アビジンカラムを用いて、標識されたタンパク質のみを精製することが可能である(「ネイチャー・バイオテクノロジー(Nature Biotechnology)」第17巻、第10号、1999年10月、pp.994−999)。
さらにまた、タンパク質を消化して得られたペプチド断片のC末、N末、グルタミン酸残基、アスパラギン酸残基などを同位体標識した分子で標識することができる。具体的には、タンパク質を酵素で消化する際に、緩衝液中に18Oで標識された水を加える。消化酵素としては、キモトリプシン、トリプシン、Asp−N、Lys−C、Glu−Cを用いることができる。キモトリプシン、Asp−Nを用いたときには、加水分解後のペプチドのC末側に18Oが一つ、トリプシン、Lys−C、Glu−Cを用いたときには、加水分解後のペプチドのC末のカルボン酸の酸素原子が二つとも18Oになることが知られている。
くわえて、タンパク質を消化して得られたペプチド断片のC末、グルタミン酸残基、アスパラギン酸残基のカルボン酸をメチルエステルにする方法が知られており(Goodlett DR,Keller A,Watts JD,Newitt R,Yi EC,Purvine S,Eng JK,von Haller P,Aebersold,Koller E.Differential stable isotope labeling of peptides for quantitation and de nove sequence derivation.Rapid Communmass Spectrom.2001:15,pp.1214−1221参照)、同位体標識されたメタノールを用いてメチル化することにより、同位体標識することも可能である。
また、タンパク質を消化して得られるペプチド断片のN末をニコチン酸誘導体化する方法(Munchbach M,Quadroni M,Miotto G,James P.Quantitation and facilitated de novo sequencing of proteins by isotropic N−terminal labeling of peptides with a fragmentation−directing moiety.Anal.Chem.2000:72,pp.4047−4057参照)や、アセチル化する方法(Ji.J.Chakraborty A,Geng M,Zhang X,Amini A,Bina M,Regnier F.Strategy for quantitative and quantitative analysis in proteomics based on signature peptides.J Chromatogr B Biomed Sci Appl.2000:745,pp.197−210参照)が知られている。そのため、これらの同位体標識された試薬を用いることにより、同位体標識することもできる。
(3)(c)工程(b)で得られた混合物を質量分析処理する工程
当該工程は、上記「1.(4)(d)工程(c)で得られた混合物を質量分析処理する工程」と同様の方法により、行うことができる。
(4)(d)予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程
当該工程は、上記「1.(2)(b)予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程」と同様の方法により、担体に固定化した化合物に結合する複数種のタンパク質を精製することができる。
工程(d)においては、当該タンパク質群は、工程(a)と同様に同位体標識されていないタンパク質群を用いることができる。また、同位体標識されていないタンパク質群の代わりに、本発明の内部標準物質で用いられた同位体とは異なる同位体で標識されたタンパク質群を用いることもできる。
(5)(e)工程(d)で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群とを混合する工程
工程(d)で得られたタンパク質および内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群を、一定の割合で混合する。一定の割合は、等量でもよく、比率を変えてもよい。ここでいう同位体標識されたタンパク質群は、内部標準物質として機能するため、好ましくは、工程(d)で得られた複数種のタンパク質と同質の生体試料に由来するものであるが、異なる生体試料に由来するものであってもよい。また、内部標準物質として機能するため、上記「3.(2)(b)工程(a)で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群とを混合する工程」と同一の本発明の内部標準物質を使用する。
(6)(f)工程(e)で得られた混合物を質量分析処理する工程
当該工程は、上記「1.(4)(d)工程(c)得られた混合物を質量分析処理する工程」と同様の方法により、行うことができる。
(7)(g)工程(c)および工程(f)で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程
当該工程は、上記「1.(5)(e)質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程」と同様の方法により、行うことができる。
(8)(h)各タンパク質について、工程(a)で得られたタンパク質に由来するピークと内部標準物質であるタンパク質に由来するピークとの強度比および工程(d)で得られたタンパク質に由来するピークと内部標準物質であるタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、当該強度比を比較することにより各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程
質量分析による測定の結果得られたデータを用いて、各タンパク質について、工程(a)または工程(d)で得られたタンパク質由来のピークと本発明の内部標準物質由来の標識ピークのピーク強度比を求めて、該ピーク強度比の値を比較することにより、各タンパク質と化合物との親和性を定量することができる。
より具体的には、例えば、担体に固定化された化合物Aおよび担体に固定化されていない非固定化化合物Bと各タンパク質との親和性を解析する場合、化合物Bと接触させていないタンパク質群における各タンパク質のピークを本発明の内部標準物質における該タンパク質の標識ピークで除することによって、該タンパク質におけるピーク/標識ピーク(=ピーク強度比A)を求める。一方、化合物Bと接触させたタンパク質群における各タンパク質のピークを本発明の内部標準物質における該タンパク質の標識ピークで除することによって、該タンパク質におけるピーク/標識ピーク(=ピーク強度比B)を求める。次に、ピーク強度比Bとピーク強度比Aとを比較することで、化合物Aおよび化合物Bと各タンパク質との親和性の比を定量することができる。比較は、例えば、ピーク強度比Bとピーク強度比Aとの比を算出して行うことができる。そして、求めた値を各タンパク質に対する化合物Bの親和性と化合物Aの親和性との比として用いることができる。
なお、工程(a)または工程(d)で得られたタンパク質中では存在していて、本発明の内部標準物質中では存在していないタンパク質が存在することがある。この場合には、質量分析計で測定した際に、近傍の本発明の内部標準物質由来のピーク、好ましくはLC/MSならクロマトグラフィーでの溶出時間が近いピーク、MALDI−MSなら分子量が近いピークを対象としてピーク強度比を求めて、該ピーク強度比を比較することによって定量することができる。したがって、工程(a)または工程(d)で得られたタンパク質中のすべてのタンパク質について、タンパク質と化合物との親和性の比を測定することが可能である。
より具体的には、担体に固定化された化合物Aとタンパク質Xとの親和性および担体に固定化されていない化合物Bとタンパク質Xとの親和性とを比較する場合、本発明の内部標準物質にタンパク質Xが存在せず、近傍にタンパク質Y由来のピークが存在することがある。ここで、近傍のピークとは、本発明の内部標準物質由来のピークで、かつ、LC/MSならクロマトグラフィーでの溶出時間が近いピーク、MALDI−MSなら分子量が近いピークである。この場合には、非固定化化合物Bと接触させていないタンパク質群におけるタンパク質Xのピークをタンパク質Yに対応する本発明の内部標準物質の標識ピークで除することによって、タンパク質Xにおけるピーク/タンパク質Yにおける標識ピーク(=ピーク強度比C)を求める。一方、化合物Bと接触させたタンパク質群におけるタンパク質Xのピークをタンパク質Yに対応する本発明の内部標準物質の標識ピークで除することによって、タンパク質Xにおけるピーク/タンパク質Yにおける標識ピーク(=ピーク強度比D)を求める。次に、ピーク強度比Cとピーク強度比Dとを比較することで、化合物Aとタンパク質Xとの親和性および化合物Bとタンパク質Xとの親和性の比を定量することができる。また、近傍のタンパク質を複数選択することによって、測定の精度を上げることができる。
このような方法を用いることによって、簡便かつ効率的に、複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を同時に解析することが可能となる。
本発明はさらに、複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析するシステムであって、
(a)タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
(b)手段(a)で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群とを混合する手段と、
(c)手段(b)で得られた混合物を質量分析処理する手段と、
(d)予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
(e)手段(d)で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群とを混合する手段と、
(f)手段(e)で得られた混合物を質量分析処理する手段と、
(g)手段(c)および手段(f)で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段と、
(h)各タンパク質について、手段(a)で得られたタンパク質に由来するピークと内部標準物質であるタンパク質に由来するピークとの強度比および手段(d)で得られたタンパク質に由来するピークと内部標準物質であるタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、当該強度比を比較することにより各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段と、
を含む、前記システムを提供する。
(a)タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段は、上記「1.(1)(a)同位体標識されたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて、当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程」において用いられる手段に準じるものである。手段(a)において、タンパク質群は、同位体標識されていないものを用いることもできるし、本発明の内部標準物質で用いられた同位体とは異なる同位体で標識されたタンパク質群を用いることもできる。
(b)手段(a)で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群とを混合する手段は、上記「3.(2)(b)工程(a)で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群とを混合する工程」において用いられる手段と同一のものである。
(c)手段(b)で得られた混合物を質量分析処理する手段は、上記「1.(4)(d)工程(c)で得られた混合物を質量分析処理する工程」において用いられる手段に準じるものである。
(d)予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段は、上記「1.(2)(b)予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程」において用いられる手段に準じるものである。手段(a)において、タンパク質群は、同位体標識されていないものを用いることもできるし、本発明の内部標準物質で用いられた同位体とは異なる同位体で標識されたタンパク質群を用いることもできる。
(e)手段(d)で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群とを混合する手段は、上記「3.(5)(e)工程(d)で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群とを混合する工程」において用いられる手段と同一のものである。
(f)手段(e)で得られた混合物を質量分析処理する手段は、上記「1.(4)(d)工程(c)で得られた混合物を質量分析処理する工程」において用いられる手段に準じるものである。
(g)手段(c)および手段(f)で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段は、上記「1.(5)(e)質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程」において用いられる手段に準じるものである。
(h)各タンパク質について、手段(a)で得られたタンパク質に由来するピークと内部標準物質であるタンパク質に由来するピークとの強度比および手段(d)で得られたタンパク質に由来するピークと内部標準物質であるタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、当該強度比を比較することにより各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段は、上記「3.(8)(h)各タンパク質について、工程(a)で得られたタンパク質に由来するピークと内部標準物質であるタンパク質に由来するピークとの強度比および工程(b)で得られたタンパク質に由来するピークと内部標準物質であるタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、当該強度比を比較することにより各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程」において用いられる手段と同一のものである。
以下に、本発明の第三の態様における複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析するシステムについて述べる。本システムは、第一の態様の当該システムについての説明(図6、7,8および9)に準じるが、タンパク質精製ユニット602及びタンパク質混合ユニット603における処理の順序、構成が一部異なる。タンパク質精製ユニット602は、第一の態様で説明した装置の他、タンパク質分注装置をさらに備えていても良い。
本発明の第三の態様では、タンパク質への同位体標識処理手段の配置が第一の態様と異なり、培養液ボトル12aには同位体標識物質は原則として混合されない。したがって、培養装置11a由来のサンプルは、化合物との接触器14による接触処理前までは、培養装置11b由来のサンプルと同一のものである。そのため、化合物との接触器14に導入するタンパク質としては、異なる培養装置11aおよび11bを用い、その一方から採取されるタンパク質群であってもよい。あるいは一つの培養装置(11aまたは11bあるいは11c(図10))のみを用い、そこから採取されるタンパク質群を複数個(例えば、非固定化化合物の数+1個)に分け、その一部分を化合物に接触させても良い。
一つの培養装置から採取されるタンパク質群を複数個に分ける際の装置の模式図を図10に示す。一つの培養装置11cから採取されるタンパク質群は、細胞破砕器13cにより細胞破砕される。その後に、中央コンピュータ30は、破砕後のサンプルを複数個に分け、一部は化合物が固定化された担体15aに導入し、別の部分は化合物との接触器14c−1,14c−2,14c−3(図10では化合物との接触器は3つ表示した)に導入するよう、サンプル分注装置31に命令し、サンプル分注装置はサンプルを複数個に分け、各々を化合物が固定化された担体15aまたは化合物との接触器14c−1,14c−2,14c−3に導入する。
また、上記分取器17a、17bに分取されるタンパク質とは別に、培養装置11a、培養液ボトル、12a、細胞破砕器13aにより、細胞を所定の条件で培養し、タンパク質群を得ておく。ここで培養液ボトル12aには、タンパク質群を同位体標識するためのアミノ酸が混合され、内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群を得る。
制御ユニット601の中央コンピュータ30は、内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群を得るのに必要な培養液、試料(細胞)、その他の試薬を培養装置11aに充填するよう充填装置(図示せず)に命令し、充填装置(図示せず)は充填を実行する。培養装置11aへの培養液等の充填が完了すると、中央コンピュータ30は次に所定条件で培養するよう培養装置11aに命令し、培養装置11aは培養を実行する。所定条件での培養が終了した後、中央コンピュータ30は細胞破砕工程を実施するよう、細胞破砕装置13aに命令し、細胞破砕装置13aは細胞破砕を実行する。
第三の態様では、タンパク質混合ユニット603は、タンパク質精製ユニット602により精製されたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群とを混合するユニットである。
中央コンピュータ30は、S906a、S906bによる分取および一時保存の後、タンパク質混合ユニット603に、分取された精製タンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群とを混合するよう命令し、精製タンパク質混合ユニット603は精製タンパク質を混合する(S907)。
4.本発明の第四の態様
本発明の第四の態様は、複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析する方法であって、
(a1)タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
(a2)工程(a1)で得られた精製物を質量分析処理する工程と、
(a3)工程(a2)で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程と、
(a4)複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する工程と、
(b1)予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
(b2)工程(b1)で得られた精製物を質量分析処理する工程と、
(b3)工程(b2)で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程と、
(b4)複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する工程と、
(c)各タンパク質について、工程(a1)で得られたタンパク質に由来するタンパク質量と工程(b1)で得られたタンパク質に由来するタンパク質量との比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程と、
を含む、前記方法を提供する。
以下、本発明の第四の態様について、詳細に記載する。
(1)(a1)タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程
当該工程は、上記「1.(1)(a)同位体標識されたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて、当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程」と同様の方法により、担体に固定化した化合物に結合する複数種のタンパク質を精製することができる。
工程(a1)において、当該タンパク質群は、同位体標識されていないタンパク質群を用いることができる。また、同位体標識されていないタンパク質群の代わりに、同位体標識されたタンパク質群を用いることもできる。
(2)(a2)工程(a1)で得られた精製物を質量分析処理する工程
当該工程は、上記「1.(4)(d)工程(c)で得られた混合物を質量分析処理する工程」と同様の方法により、行うことができる。
(3)(a3)工程(a2)で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程
当該工程は、上記「1.(5)(e)質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程」と同様の方法により、行うことができる。
(4)(a4)複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する工程
当該工程において、各タンパク質を定量する方法は、特に限定されないが、例えば、以下の方法により行うことができる。
工程(a3)において、同定された各タンパク質について、検出されたペプチド数(Nobsd)および検出され得るペプチド数(Nobsbl)を算出する。
「検出されたペプチド数(Nobsd)」は、「4.(2)(a2)工程(a1)で得られた精製物を質量分析処理する工程」において、実際に検出されたペプチド数を意味する。検出されたペプチド数(Nobsd)は、質量分析のデータおよび同定されたタンパク質の配列情報をもとに算出することができる。検出されたペプチド数(Nobsd)は、質量分析のデータをもとに算出する場合、各タンパク質について質量分析で検出されたピークの数と一致する。
また、「検出され得るペプチド数(Nobsbl)」は、「4.(2)(a2)工程(a1)で得られた精製物を質量分析処理する工程」において、理論上検出され得るペプチド数を意味する。検出され得るペプチド数(Nobsbl)は、同定されたタンパク質の配列情報をもとに算出することができる。各タンパク質について、上記工程における分離、消化又はHPLCによる分離操作によって理論的に生じるペプチド数を配列情報をもとに算出し、質量分析で検出され得るペプチド数(Nobsbl)を求めることができる。例えば、トリプシンによる消化操作を行った精製物を質量分析する場合は、トリプシンによりリシン、アルギニンのカルボキシル側でペプチド鎖が切断されるため、各タンパク質の配列情報から切断により生じるペプチド数が予測できる。場合によっては、質量分析器の測定範囲も考慮して、検出され得るペプチド数(Nobsbl)を求めることができる。
次に、上記の検出され得るペプチド数(Nobsbl)と検出されたペプチド数(Nobsd)とを用いて各タンパク質を定量するために、以下の式(I)にしたがって、EMPAI(exponentially modified protein abundance index)を設定し、算出する。
式(I):
EMPAI=10Nobsd/Nobsbl−1
EMPAIは、タンパク質混合物中のタンパク質含有量に比例する指数である。
さらに、以下の式(II)にしたがって、タンパク質含有率(mol%)を算出することができる。
式(II):
ここで、Σ(EMPAI)は、すべての同定されたタンパク質のEMPAIの和を表す。
また、以下の式(III)にしたがって、タンパク質含有率(重量%)を算出することができる。
式(III):
ここで、MWは、同定された各タンパク質の分子量を表す。Σ(EMPAI×MW)は、すべての同定されたタンパク質のEMPAI×MWの和を表す。
各タンパク質の分子量は、アミノ酸配列から算出することができる。また、工程(a1)で得られたタンパク質の総重量は、既存の方法、例えば、Lowry法、Bradford法、280nmの吸光度測定などの方法によって容易に測定することができる。そうすると、工程(a1)で得られたタンパク質の総重量および上記で求めたタンパク質含有率から、各タンパク質を定量することができる。
よって、上記方法により、各タンパク質を定量することができる。
各タンパク質を定量する工程は、コンピュータを用いてもよい。
(5)(b1)予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程
当該工程は、上記「1.(2)(b)予め化合物と接触させたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程」と同様の方法により、担体に固定化した化合物に結合する複数種のタンパク質を精製することができる。工程(b1)において、当該タンパク質群は、同位体標識されていないタンパク質群を用いることができる。また、同位体標識されていないタンパク質群の代わりに、同位体標識されたタンパク質群を用いることもできる。
(6)(b2)工程(b1)で得られた精製物を質量分析処理する工程
当該工程は、上記「1.(4)(d)工程(c)で得られた混合物を質量分析処理する工程」と同様の方法により、行うことができる。
(7)(b3)工程(b2)で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程
当該工程は、上記「1.(5)(e)質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程」と同様の方法により、行うことができる。
(8)(b4)複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する工程
当該工程は、上記「4.(4)(a4)複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する工程」と同様の方法により、行うことができる。
(9)(c)各タンパク質について、工程(a1)で得られたタンパク質に由来するタンパク質量と工程(b1)で得られたタンパク質に由来するタンパク質量との比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程
当該工程は、工程(a4)で得られたタンパク質に由来するタンパク質量および工程(b4)で得られたタンパク質に由来するタンパク質量の比を求めることにより、各タンパク質と化合物との親和性を定量することができる。
本発明の第四の態様における方法は、各タンパク質について同位体標識する必要がないことに特徴を有する。
本発明はさらに、複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析するシステムであって、
(a1)タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
(a2)手段(a1)で得られた精製物を質量分析処理する手段と、
(a3)手段(a2)で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段と、
(a4)複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する手段と、
(b1)予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
(b2)手段(b1)で得られた精製物を質量分析処理する手段と、
(b3)手段(b2)で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段と、
(b4)複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する手段と、
(c)各タンパク質について、手段(a1)で得られたタンパク質に由来するタンパク質量と手段(b1)で得られたタンパク質に由来するタンパク質量との比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段と、
を含む、前記システムを提供する。
(a1)タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段は、上記の「1.(1)(a)同位体標識されたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて、当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程」において用いられる手段に準じるものである。手段(a1)において、当該タンパク質群は、同位体標識されていないタンパク質群を用いることができる。また、同位体標識されていないタンパク質群の代わりに、同位体標識されたタンパク質群を用いることもできる。
(a2)手段(a1)で得られた精製物を質量分析処理する手段は、上記「1.(4)(d)工程(c)で得られた混合物を質量分析処理する工程」において用いられる手段に準じるものである。
(a3)手段(a2)で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段は、上記「1.(5)(e)質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程」において用いられる手段に準じるものである。
(a4)複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する手段は、上記「4.(4)(a4)複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する工程」において用いられる手段と同一のものである。
(b1)予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段は、上記「1.(2)(b)予め化合物と接触させたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程」において用いられる手段に準じるものである。手段(b1)において、当該タンパク質群は、同位体標識されていないタンパク質群を用いることができる。また、同位体標識されていないタンパク質群の代わりに、同位体標識されたタンパク質群を用いることもできる。
(b2)手段(b1)で得られた精製物を質量分析処理する手段は、上記「1.(4)(d)工程(c)で得られた混合物を質量分析処理する工程」において用いられる手段に準じるものである。
(b3)手段(b2)で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段は、上記「1.(5)(e)質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程」において用いられる手段に準じるものである。
(b4)複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する手段は、上記「4.(4)(a4)複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する工程」において用いられる手段と同一のものである。
(c)各タンパク質について、手段(a1)で得られたタンパク質に由来するタンパク質量と手段(b1)で得られたタンパク質に由来するタンパク質量との比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段は、上記「4.(9)(c)各タンパク質について、工程(a1)で得られたタンパク質に由来するタンパク質量と工程(b1)で得られたタンパク質に由来するタンパク質量との比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程」で用いられる手段と同一のものである。
以下に、本発明の第四の態様における複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析するシステムについて述べる。本システムは、第一の態様の当該システムについての説明(図6、7,8および9)に準じるが、タンパク質混合ユニット603は省略され、タンパク質精製ユニット602における処理の順序、構成が一部異なる。
本発明の第四の態様では、タンパク質への同位体標識処理手段の配置が第一の態様と異なり、培養液ボトル12aには同位体標識物質は原則として混合されない。したがって、培養装置11a由来のサンプルは、化合物との接触器14による接触処理前までは、培養装置11b由来のサンプルと同一のものである。そのため、化合物との接触器14に導入するタンパク質としては、異なる培養装置11aおよび11bを用い、その一方から採取されるタンパク質群であってもよい。あるいは一つの培養装置(11aまたは11bあるいは11c(図10))のみを用い、そこから採取されるタンパク質群を複数個(例えば、非固定化化合物の数+1個)に分け、その一部分を化合物に接触させても良い。
一つの培養装置から採取されるタンパク質群を複数個に分ける際の装置の模式図を図10に示す。一つの培養装置11cから採取されるタンパク質群は、細胞破砕器13cにより細胞破砕される。その後に、中央コンピュータ30は、破砕後のサンプルを複数個に分け、一部は化合物が固定化された担体15aに導入し、別の部分は化合物との接触器14c−1,14c−2,14c−3(図10では化合物との接触器は3つ表示した)に導入するよう、サンプル分注装置31に命令し、サンプル分注装置はサンプルを複数個に分け、各々を化合物が固定化された担体15aまたは化合物との接触器14c−1,14c−2,14c−3に導入する。
第四の態様では、タンパク質混合ユニット603は存在せず、質量分析ユニットは、制御ユニット601からの指示に従って、精製タンパク質分取器17a及び17bに配列されたそれぞれのサンプルについて、質量分析用の試料を調製し(S908)、質量分析(S909)する。中央コンピュータ30は、17a由来のタンパク質および17b由来のタンパク質をそれぞれ同定するとともに(S910)、質量分析時のデータ、タンパク質同定によるアミノ酸配列情報などに基づいて、複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する。そして、各タンパク質について、17a由来のタンパク質量と17b由来のタンパク質量との比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する。
(1)化合物を固定したアフィニティークロマトグラフィーカラムの作製
次式1:
で表される化合物(1)を特開平7−165708に記載の方法で製造した。次に、式1で表される化合物(1)約52mgをテトラヒドロフラン(THF)4mL、メタノール(MeOH)4mLに溶かし、さらに水(Water)4mLを加えた。
この液6mLをTHF/MeOH/Water=1/1/1(v/v/v)18mLで希釈し、あらかじめTHF/MeOH/Water=1/1/1(v/v/v)で洗浄しておいたアフィゲル10(バイオラド社製、カタログ番号153−6099)25mLに加えた。
そこに、100μLのトリエチルアミン(東京化成工業社製、カタログ番号T0424)を加え、室温にて一晩インキュベーションした。翌朝、100μLの2−アミノエタノール(東京化成工業社製、カタログ番号A0297)を加え、室温にて3時間インキュベーションした。そして、このゲルをTHF/MeOH/Water=1/1/1(v/v/v)で十分洗浄し、メタノール液に置換後4℃にて保存し、これをアフィニティーゲルとした。なお、この反応で式1からなる化合物(1)が、ゲル1mLあたり約1mg結合した。作製したアフィニティーゲルをカラムに充填して、アフィニティークロマトグラフィーカラムとした。
(2)細胞の調製
ヒト結腸腺癌細胞株HCT116(ATCC)を培養した。培地には、10%牛胎児血清(MOREGATE社、BATCH 32300102)、100U/mlペニシリンG、100μg/mlストレプトマイシン(GIBCO社、15140−122)を含むRPMI−1640(Sigma社、R−7130)を用いた。RPMI−1640としては、L−グルタミン、L−リジン、L−メチオニン、L−ロイシン、炭酸水素ナトリウムを含まない粉末培地を選択し、当該培地に欠損した成分を加えて調製(L−グルタミン(Sigma社製、G−8540)、L−リジン(Sigma社製、L−9037)、L−メチオニン(Sigma社製、M−5308)、炭酸水素ナトリウム(和光純薬、191−01305)をそれぞれ0.3g/L、0.04g/L、0.015g/L、2g/Lを加え、さらに、天然型のL−ロイシンまたは安定同位体13C(6個)で標識されたL−ロイシン(Cambridge Isotope Laboratories社、CLM−2262)を0.05g/L加えた)した。このようにして調製した培地を用いて、5%CO2下37℃で培養した。この培養によって得られた細胞を、それぞれ天然型培地で培養した細胞、または安定同位体培地で培養した細胞として以下の実験に用いた。
(3)タンパク質の抽出
安定同位体培地で培養した細胞を15センチ皿50枚分、天然型培地で培養した細胞を15センチ皿20枚分、それぞれ用意し、細胞を集めた。15センチ皿1枚あたり約1.2mlのM−PER(PIERCE社、78501)で可溶化し、遠心分離により不溶性画分を除去して可溶性画分を調製した。こうして得られた可溶性画分を、それぞれ代謝的に安定同位体で標識されていないタンパク質抽出液、代謝的に安定同位体で標識されたタンパク質抽出液とした。
(4)化合物の調製
式2から式6で表された化合物(2)から化合物(6)を特開平7−165708に記載の方法で製造した。次に、式2から式6で表された化合物について、式2からなる化合物(2)を約20mg、式3からなる化合物(3)を約13mg、式4からなる化合物(4)を約12mg、式5からなる化合物(5)を約9mg、式6からなる化合物(6)を約14mg秤量し、DMSOを加えて溶かし、それぞれの化合物について濃度2mg/300μLにした。これらの化合物は、細胞増殖阻害活性が、化合物(2)>化合物(4)>化合物5>化合物3>化合物6であることが知られている(Y.Oda,T.Owa,T.Sato,B.Boucher,S.Danicls,H.Yamanaka,Y.Shinohara,A.Yokoi,J.Kuromitsu,and T.Nagasu,Anal.Chem.,75,2159(2003).)。
式2:
式3:
式4:
式5:
式6:
(5)化合物を固定したアフィニティークロマトグラフィーカラムにおける結合タンパク質群の精製
まず、代謝的に安定同位体で標識されたタンパク質抽出液10mlにPBS20mlを加えた。これに、調製した式2から式6で表された化合物(2)〜(6)溶液(実施例(4))300μLを加えて、4℃にて3時間インキュベーションを行い、これを化合物と混合したタンパク質抽出液とした。
次に、アフィニティーゲル約1mlをオープンカラムとし、上から化合物と混合したタンパク質抽出液を加えて自然落下させた。続いて、0.5M NaCl、0.01%CHAPSを含むPBS15mlをこのカラムに流した。そして、5mM NADH、0.01%CHAPSを含むPBS6mlを流した。次に、5mM ATP、0.01%CHAPSを含むPBSを6ml流した。この後に、6M塩酸グアニディンおよび2%CHAPSを含む液6mlを流して溶出画分を集めて、化合物と混合したタンパク質精製液とした。
この操作と並行して、代謝的に安定同位体で標識されていないタンパク質抽出液20mlにPBS40mlを加え、30mlずつ2つに分けた。アフィニティーゲル約1mlをオープンカラムとして2本用意し、2つに分けた抽出液をそれぞれ上から加えて自然落下させた。続いて、0.5M NaCl、0.01%CHAPSを含むPBS15mlをこのカラムに流した。そして、5mM NADH、0.01%CHAPSを含むPBS6mlを流した。次に、5mM ATP、0.01%CHAPSを含むPBSを6ml流した。この後に、6M塩酸グアニディンおよび2%CHAPSを含む液6mlを流して溶出画分を集めて、化合物と混合していないタンパク質精製液とした。
そして、化合物と混合したタンパク質精製液3に対して、化合物と混合していないタンパク質精製液を1の割合で混合した。この混合液をAmicon Ultra−15 10,000MWCO(ミリポア、カタログ番号UFC901096)で濃縮し、50mMの炭酸水素アンモニア水で洗浄を繰り返した後、SDS−PAGE(ディー・アール・シー株式会社、5−20%Tゲル、1mm、7well、4cm、200V)で分離し、泳動レーンを12等分してゲル内トリプシン消化を行い、消化されたタンパク質溶液とした(H.Katayama,K.Satoh,M.Takeuchi,M.Deguchi−Tawarada,Y.Oda and T.Nagasu,Rapid Commun.Mass Spectrom.17,1071−1078(2003).)。
(6)LC/MSによる測定
消化されたタンパク質溶液を、0.1%トリフルオロ酢酸を含む5%アセトニトリルに溶かし、測定対象のタンパク質溶液とした。MSとしてはLCQ−Duo(Thermo Electron社製)で測定を行った。LC/MSのLCとしては自家製のODSカラム(Y.Ishihama,J.Rappsilber,J.S.Andersen,M.Mann,J.Chromatogr A.979,233−239(2002).)内径0.2mm、長さ約15センチに移動相として0.5%酢酸を含み、最初の1分間でアセトニトリル濃度4%として、その後35分間でアセトニトリル濃度を20%まで直線的に増加させて、その後0.1分間でアセトニトリル濃度を80%にして5分間維持し、その後アセトニトリル濃度を0%として12分後に次のサンプルを注入した。
ポンプには島津製作所のLC−10AシリーズのROMをミクロ対応として、また、ミキシングチャンバーとしては付属の島津製作所製を外してバルコ社のTコネクターを採用した。
流速としてはFlow−splitting方式を採用し、カラムには約毎分1−2μLの流速となるように調製した。測定対象のタンパク質溶液をCTC社のオートサンプラーPALによって10μL注入した。カラムの出口から溶出物を直接スプレーして得られたイオンをLCQ内に送り込むことで測定を行った。スプレー電圧としては2.5kVを印加した。測定は、Data DependentモードでDynamic ExclusionのRepeatを1とした。なお、スキャン回数を稼ぐためにZoom Scanモードを外したいわゆるダブルプレーモードで測定した。
(7)データ解析
得られたデータについては、SonarMSMS(Genomic solution社)およびNCBInrデータベース用いてタンパク質の自動同定を行った。このとき、安定同位体で標識したロイシン(ロイシン1つにつき分子量6の増加)でもNCBInrに対して検索できるように、プログラムの一部を改変した。
定量は、ロイシンを含むペプチドのピークで行うため、SonarMSMSにより同定されたペプチドのうち、ロイシンを含むペプチドのみを選び出し、かつ、そのペプチドピークの溶出位置(HPLCでの保持時間=MSでのスキャン番号)を特定するためにLCQ Duoの付属ソフトであるLCQ_dta.exeファイルからスキャン情報を自動で選び出すソフトウエアを構築した。そして、そのスキャン番号の情報から、そのスキャン番号のMSスペクトルを抜き出し、天然型ロイシンペプチドのピークと同位体ペプチドのピークについて、MS/MSを測定した際の親イオンの情報(m(質量数)/z(電荷)値)とそのペプチド内に何個のロイシンがあるか、そして、電荷は何個かをSonarMSMSでの検索結果から求めて、ペアとなるピークを探し、そのピーク強度比を自動計算した。このように構築した解析ソフトウエアを用いてタンパク質の同定およびピーク強度比の算出を行った。
得られた結果の一例について図5に示した。図5は、複数種のタンパク質と化合物2(化2)〜化合物6(化6)で表される化合物との構造親和性相関を表す。数字が小さいほど化合物に対して親和性が強いことを意味している。
この図5から、例えば、以下のような情報を得ることができる。
(1)図を縦方向に見て、例えば、化合物(3)(化3)に最も親和性の強いタンパク質は、glutathione−S−transferase omega 1で、次に親和性の強いタンパク質は、heme binding protein 1であるというように親和性の強さについての序列がわかるので、化合物(3)が、標的タンパク質以外にどのようなタンパク質に対して親和性が高いのかについての情報を得ることができる(図5)。
(2)図を横方向に見て、あるタンパク質、例えば、glutathione−S−transferase omega 1に着目して、そのタンパク質を標的にした化合物合成展開をしようとしたときに、化合物(4)(化4)なら化合物(3)に比べて親和性が強くなり、化合物(6)(化6)なら弱くなるという情報を得ることができる(図5)。
したがって、本発明の方法は、化合物の構造を変えることによって、いかなるタンパク質との親和性に影響を与えるのかを網羅的に解析することができるため、化合物、特に薬剤を合成する上で、主作用を増強しつつ、副作用を軽減するような有益な情報を得ることができる。
(3)さらに、図全体を見て、縦方向に見ても、横方向に見ても、1点だけ親和性が強いところがあれば、その化合物とタンパク質の組み合わせは特異性が高いという情報を得ることができる。そして、その化合物の標的タンパク質であるともいえるであろう。
また、本発明により、化合物を固定化したアフィニティークロマトグラフィーカラムを複数種用意する必要がなくなり、簡便かつ効率的に複数種の化合物に基づく構造親和性相関の情報を得ることができるようになった。また、一種類の化合物を固定化するだけで、他の化合物は固定化せずに使用するため、各化合物本来の構造でタンパク質に対する親和性を評価することで、より正確な構造親和性相関の情報を得ることが可能となった。
また、本発明により、化合物の構造を変えることによって、いかなるタンパク質との親和性に影響を与えるのかを網羅的に解析することが可能となり、化合物、特に薬剤を合成する上で、主作用を増強しつつ、副作用を軽減するような有益な情報を得ることが可能となった。例えば、本発明によりNADまたはNADPを固定化した担体を用いて構造親和性相関の情報を得ることにより、化合物の構造を変えることによって、いかなるdehydrogenaseとの親和性に影響を与えるのかを網羅的に解析することが可能となり、dehydrogenase阻害剤のスクリーニングをする上で、特異性、選択性などに関する有益な情報を得ることが可能となった。また、例えば、本発明によりATPまたはGTPを固定化した担体を用いて構造親和性相関の情報を得ることにより、化合物の構造を変えることによって、いかなるkinase、ATP−ase、GTP−aseなどとの親和性に影響を与えるのかを網羅的に解析することが可能となり、これらの阻害剤のスクリーニングをする上で、特異性、選択性などに関する有益な情報を得ることが可能となった。
さらに、化合物が固定化された担体(例えば、アフィニティークロマトグラフィーカラム)に結合した化合物の濃度は、一般的にゲル1mlあたり0.1mgから数mg程度であり、これは1mM前後に相当する。しかし、細胞に対して何らかの活性を有する化合物は、数μMから数nM、ときには数pM程度で活性を示すことが知られている。したがって、化合物が固定化された担体(例えば、アフィニティークロマトグラフィーカラム)に固定化された化合物濃度と大きな乖離がある。本発明においては、担体に固定化していない化合物を用いるため、化合物濃度を数μMから数nMに減らし、より生体における化合物に近い状態にすることも可能となった。
Claims (24)
- 複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析する方法であって、
(a)同位体標識されたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
(b)予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
(c)工程(a)および工程(b)で得られたタンパク質を混合する工程と、
(d)工程(c)で得られた混合物を質量分析処理する工程と、
(e)質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程と、
(f)各タンパク質について、工程(a)で得られたタンパク質に由来するピークと工程(b)で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程と、
を含む、前記方法。 - 複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析する方法であって、
(a)タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
(b)予め化合物と接触させておいた同位体標識されたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
(c)工程(a)および工程(b)で得られたタンパク質を混合する工程と、
(d)工程(c)で得られた混合物を質量分析処理する工程と、
(e)質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程と、
(f)各タンパク質について、工程(a)で得られたタンパク質に由来するピークと工程(b)で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程と、
を含む、前記方法。 - 複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析する方法であって、
(a)タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
(b)予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
(c)工程(a)で得られたタンパク質または工程(b)で得られたタンパク質の一方を同位体標識する工程と、
(d)工程(c)で得られた標識されたタンパク質と、工程(a)および工程(b)で得られたタンパク質のうち工程(c)で標識されていない他方のタンパク質とを混合する工程と、
(e)工程(d)で得られた混合物を質量分析処理する工程と、
(f)質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程と、
(g)各タンパク質について、工程(a)で得られたタンパク質に由来するピークと工程(b)で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程と、
を含む、前記方法。 - 複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析する方法であって、
(a)タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
(b)工程(a)で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群とを混合する工程と、
(c)工程(b)で得られた混合物を質量分析処理する工程と、
(d)予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
(e)工程(d)で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群とを混合する工程と、
(f)工程(e)で得られた混合物を質量分析処理する工程と、
(g)工程(c)および工程(f)で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程と、
(h)各タンパク質について、工程(a)で得られたタンパク質に由来するピークと内部標準物質であるタンパク質に由来するピークとの強度比および工程(d)で得られたタンパク質に由来するピークと内部標準物質であるタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、当該強度比を比較することにより各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程と、
を含む、前記方法。 - 複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析する方法であって、
(a1)タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
(a2)工程(a1)で得られた精製物を質量分析処理する工程と、
(a3)工程(a2)で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程と、
(a4)複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する工程と、
(b1)予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
(b2)工程(b1)で得られた精製物を質量分析処理する工程と、
(b3)工程(b2)で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程と、
(b4)複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する工程と、
(c)各タンパク質について、工程(a1)で得られたタンパク質に由来するタンパク質量と工程(b1)で得られたタンパク質に由来するタンパク質量との比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程と、
を含む、前記方法。 - 化合物が固定化された担体が、アフィニティークロマトグラフィー用の担体である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(b)におけるタンパク質群と化合物との接触を複数種の化合物について行うことを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(d)におけるタンパク質群と化合物との接触を複数種の化合物について行うことを特徴とする、請求項4に記載の方法。
- 工程(b1)におけるタンパク質群と化合物との接触を複数種の化合物について行うことを特徴とする、請求項5記載の方法。
- 担体に固定化された化合物が、ATP、GTP、NADおよびNADPからなる群から選択されるいずれかの化合物である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 同位体が、2H、13C、15N、17O、18O、33P)および34Sからなる群から選択されるいずれかの同位体又はこれらの組み合わせである、請求項1〜4、6〜8および10のいずれか1項に記載の方法。
- 同位体が、13Cである、請求項11に記載の方法。
- 複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析するシステムであって、
(a)同位体標識されたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
(b)予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
(c)手段(a)および手段(b)で得られたタンパク質を混合する手段と、
(d)手段(c)で得られた混合物を質量分析処理する手段と、
(e)質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段と、
(f)各タンパク質について、手段(a)で得られたタンパク質に由来するピークと手段(b)で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段と、
を含む、前記システム。 - 複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析するシステムであって、
(a)タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
(b)予め化合物と接触させておいた同位体標識されたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
(c)手段(a)および手段(b)で得られたタンパク質を混合する手段と、
(d)手段(c)で得られた混合物を質量分析処理する手段と、
(e)質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段と、
(f)各タンパク質について、手段(a)で得られたタンパク質に由来するピークと手段(b)で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段と、
を含む、前記システム。 - 複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析するシステムであって、
(a)タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
(b)予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
(c)手段(a)で得られたタンパク質または手段(b)で得られたタンパク質の一方を同位体標識する手段と、
(d)手段(c)で得られた標識されたタンパク質と、手段(a)および手段(b)で得られたタンパク質のうち手段(c)で標識されていない他方のタンパク質とを混合する手段と、
(e)手段(d)で得られた混合物を質量分析処理する手段と、
(f)質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段と、
(g)各タンパク質について、手段(a)で得られたタンパク質に由来するピークと手段(b)で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段と、
を含む、前記システム。 - 複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析するシステムであって、
(a)タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
(b)手段(a)で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群とを混合する手段と、
(c)手段(b)で得られた混合物を質量分析処理する手段と、
(d)予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
(e)手段(d)で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群とを混合する手段と、
(f)手段(e)で得られた混合物を質量分析処理する手段と、
(g)手段(c)および手段(f)で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段と、
(h)各タンパク質について、手段(a)で得られたタンパク質に由来するピークと内部標準物質であるタンパク質に由来するピークとの強度比および手段(d)で得られたタンパク質に由来するピークと内部標準物質であるタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、当該強度比を比較することにより各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段と、
を含む、前記システム。 - 複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析するシステムであって、
(a1)タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
(a2)手段(a1)で得られた精製物を質量分析処理する手段と、
(a3)手段(a2)で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段と、
(a4)複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する手段と、
(b1)予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
(b2)手段(b1)で得られた精製物を質量分析処理する手段と、
(b3)手段(b2)で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段と、
(b4)複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する手段と、
(c)各タンパク質について、手段(a1)で得られたタンパク質に由来するタンパク質量と手段(b1)で得られたタンパク質に由来するタンパク質量との比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段と、
を含む、前記システム。 - 化合物が固定化された担体が、アフィニティークロマトグラフィー用の担体である、請求項13〜17のいずれか1項に記載のシステム。
- 手段(b)におけるタンパク質群と化合物との接触を複数種の化合物について行うことを特徴とする、請求項13〜15のいずれか1項に記載のシステム。
- 手段(d)におけるタンパク質群と化合物との接触を複数種の化合物について行うことを特徴とする、請求項16に記載のシステム。
- 手段(b1)におけるタンパク質群と化合物との接触を複数種の化合物について行うことを特徴とする、請求項17記載のシステム。
- 担体に固定化された化合物が、ATP、GTP、NADおよびNADPからなる群から選択されるいずれかの化合物である、請求項13〜21のいずれか1項に記載のシステム。
- 同位体が、2H、13C、15N、17O、18O、33Pおよび34Sからなる群から選択されるいずれかの同位体又はこれらの組み合わせである、請求項13〜16、18〜20および22のいずれか1項に記載のシステム。
- 同位体が、13Cである、請求項23に記載のシステム。
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