CN111936860A - 质谱法中的抗体的自上而下分析 - Google Patents

Abstract

分离设备从样本中分离已知mAb类的未知的完整mAb或还原mAb亚基。离子源设备将mAb离子化。质谱仪使用ECD设备使离子化的mAb碎裂，并使用质量分析仪对所得到的产物离子进行质量分析，从而产生一个或多个产物离子谱。计算mAb类的一个或多个恒定部分的理论产物离子峰。从一个或多个产物离子谱中移除理论产物离子峰，从而产生一个或多个差异产物离子谱。从头测序被应用于一个或多个差异产物离子谱，从而产生用于mAb的一个或多个可变部分的一个或多个候选序列。在基因组数据库中搜索与一个或多个候选序列的匹配，从而产生用于一个或多个可变部分的一个或多个匹配序列。

Description

质谱法中的抗体的自上而下分析

相关申请

本申请要求于2018年4月10日提交的美国临时专利申请序列No.62/655,540和于2019年3月5日提交的美国临时专利申请序列No.62/813,877的权益，这两者的内容都通过引用整体并入本文。

技术领域

本文的教导涉及用于对未知的单克隆抗体(mAb)的可变部分进行测序(sequencing)的质谱系统和方法。更具体而言，电子捕获解离(ECD)设备被用于使完整的、消化的或还原的未知mAb碎裂，从而产生产物质谱。从产物质谱中移除针对mAb类的恒定部分计算的理论产物离子峰，从而产生差异产物质谱。从头测序被应用于差异产物离子谱，从而产生用于mAb的可变部分的候选序列。使用所谓的同源性搜索在基因组数据库中搜索与一个或多个候选序列的匹配，从而产生用于可变部分的匹配序列。

本文公开的系统和方法还与处理器、控制器、微控制器或计算机系统(诸如图1的计算机系统)一起执行。

背景技术

单克隆抗体识别

mAb是由免疫细胞制造的蛋白质。这些抗体是单克隆的，因为某个抗体将仅结合到单个结合部位或互补位。一般而言，抗体被生物体的免疫系统用来标记异质或患病组织以用于移除。相反，在自身免疫疾病中，抗体错误地附连到正常组织，从而导致该组织也被移除或损坏。

mAb可以在实验室中针对许多不同物种大量产生。这些实验室产生的mAb已被证明是对人类高度有效且耐受良好的生物药物。它们已被发现可以用于对抗多种不同类型的癌症和自身免疫疾病，并且目前正在包括阿尔茨海默氏症的其它疾病中进行测试。根据Cotham等人，Anal.Chem.，2016，88，4004-4013(下文中简称为“Cotham论文”)，迟至2016年才有超过300种治疗性mAb候选及其衍生物处于临床药物开发中。

图2是IgG mAb的示例图示200。图2的mAb包括两个相同的长的重链210和两个相同的较短的轻链220。重链210和轻链220中的每一个包括恒定部分和可变部分。mAb的恒定或固定部分的氨基酸序列没有很多变型。例如，mAb的IgG类具有四个不同的亚类。对于这四个不同的亚类中的每一个，IgG mAb的恒定部分可以变化。因此，对于整个IgG类，恒定部分只有四种不同的变型。

相反，mAb的可变部分可以显著变化，并使mAb具有发现并附连到数十亿种不同类型的异质或患病组织的独特能力。这些可变部分包括mAb的结合部位或互补位。虽然人类基因组包括少于20000个基因，但身体能够产生具有数十亿种不同可变部分(或更具体而言，数十亿种不同互补位)的抗体。Susumu Tonegawa博士因发现基因的不同部分可以被选择并组合以产生这些数十亿种不同可变部分而获得1987年诺贝尔生理学或医学奖。

图2中IgG mAb的每个重链210包括恒定部分211、212和213以及一个可变部分214。每个轻链220包括一个恒定部分221和一个可变部分222。每个重链210的可变部分214包括结合部位215，并且每个轻链220的可变部分222包括结合部位223。

治疗性mAb的增加的使用已增加了在实验上识别其氨基酸序列的需求。质谱法/质谱法(MS/MS)常常被用于确定肽和蛋白质的氨基酸序列。最近，自上而下和自中而下的MS/MS方法已被用于识别已知的治疗性mAb的序列。

例如，Fornelli等人，Mol Cell Proteomics，2012年12月；11(12)：1758-67(下文中称为“第一Fornelli论文”)提出了自上而下的MS/MS方法来对完整的mAb进行测序。选择这种方法是为了表征mAb及其翻译后修饰(post-translational modification，PTM)。

图3是示出在第一Fornelli论文中使用的自上而下的MS/MS方法的示意图300。在图3的步骤310中，制备溶液中已知完整mAb的许多拷贝的样本。在步骤320中，对溶液执行液相色谱法(LC)以对mAb进行分离和脱盐。

在步骤330中，对分离的mAb执行MS/MS。例如，使用离子源设备331对分离的mAb进行离子化，并在线性离子阱(LTQ)332中使用电子转移解离(ETD)使mAb前驱物离子碎裂。第一Fornelli论文描述了电子捕获解离(ECD)和ETD是离子激活技术，其允许在减少PTM损失的情况下进行多肽碎裂。最后，使用轨道阱傅立叶变换质谱仪(FT-MS)333检测前驱物离子和产物离子，从而产生多个产物离子谱334。

在步骤340中，使用自上而下的MS/MS分析软件执行对多个产物离子谱334中的碎裂模式(fragmentation pattern)的分析。针对包含已知mAb的轻链和重链二者的已知序列的自定义序列数据库341执行搜索。从这些搜索，第一Fornelli论文报道了具有完整已知mAb的大约33％的覆盖的匹配序列342。

Fornelli等人，Anal.Chem.2014，86，3005-3012(下文中简称为“第二Fornelli论文”)提出了一种自中而下的MS/MS方法来对mAb进行测序。第二Fornelli论文描述了mAb作为治疗剂的成功已要求在结构上对这些mAb进行充分表征，以确保其安全性、效率、批次间的一致性和稳定性。因此，必须改进第一Fornelli论文的方法的33％的序列覆盖。为此，第二Fornelli论文提出在MS/MS分析之前将mAb化学还原为大的碎片或亚基(subunit)。还原的mAb亚基的这种使用被称为自中而下MS/MS分析。

图4是示出第二Fornelli论文中使用的自中而下MS/MS方法的示意图400。在图4的步骤410中，制备溶液中已知完整mAb的许多拷贝的样本。但是，在步骤420中，在LC之前执行mAb的免疫球蛋白G降解酶的化脓链球菌(IdeS)消化和使用二硫键还原剂421对消化的mAb的还原。在步骤430中，对mAb亚基执行LC以对mAb亚基进行分离和脱盐。

在步骤440中，对分离的mAb亚基执行MS/MS。例如，使用离子源设备441对分离的mAb亚基进行离子化，并在线性离子阱(LTQ)442中使用电子转移解离(ETD)使mAb亚基前驱物离子碎裂。最后，使用轨道阱FT-MS 443检测前驱物离子和产物离子，从而产生多个产物离子谱444。

在步骤450中，使用MS分析软件执行对多个产物离子谱444中的碎裂模式的分析。针对包含已知mAb的轻链和重链二者的已知序列的数据库451执行搜索。从这些搜索，第二Fornelli论文报道了具有完整已知mAb的大约50％的覆盖的匹配序列452。

像第二Fornelli论文一样，Cotham论文描述了mAb的治疗功效由关于初级序列的结构完整性以及PTM的存在和丰度来调节。因此，Cotham论文发现，除了PTM识别和部位定位外，抗体初级序列的表征对于确保mAb安全性和功效也至关重要。Cotham论文回顾了第一Fornelli论文和第二Fornelli论文的方法，并提出了一种像第二Fornelli论文一样但是用193nm紫外光解离(UVPD)取代ETD碎裂的自中而下方法。

图5是示出在Cotham论文中使用的自中而下MS/MS方法的示意图500。在图5的步骤510中，制备溶液中已知完整mAb的许多拷贝的样本。在步骤520中，在LC之前执行mAb的IdeS消化以及消化的mAb的还原和变性。在步骤530中，对mAb亚基执行LC。

在步骤540中，对分离的mAb亚基执行MS/MS。例如，使用离子源设备541对分离的mAb亚基进行离子化，并在较高能碰撞解离(HCD)室542中使用UVPD使mAb亚基前驱物离子碎裂。最后，使用轨道阱FT-MS 543检测前驱物离子和产物离子，从而产生多个产物离子谱544。

在步骤550中，使用MS分析软件分析多个产物离子谱544。使用图5的方法，Cotham论文报道了已知mAb的大约60％的总序列覆盖。

在步骤550中，使用MS分析软件执行对从多个产物离子谱544平均的单个谱545的碎裂模式的分析。针对包含已知mAb的轻链和重链二者的已知序列的数据库551执行搜索。从这些搜索，Cotham论文报告了具有完整已知mAb的大约60％的覆盖的匹配序列552。

第一Fornelli论文、第二Fornelli论文和Cotham论文均针对识别样本溶液中的已知mAb。如第二Fornelli论文所述，这些方法可以被用在mAb药物开发中，以示出制造的mAb具有与创新产品相似的理化特点、功能特性和临床效率。

第一Fornelli论文、第二Fornelli论文和Cotham论文的方法不针对对未知mAb进行测序。换句话说，这些方法不针对mAb药物发现。确定未知mAb的序列是比识别或确认溶液中已知mAb的序列困难得多的问题。这是更加困难的问题，因为如上所述，mAb的可变部分可以具有数十亿种不同的可能序列。

因此，需要用于确定未知mAb的序列的系统和方法。更具体而言，需要确定未知mAb的可变部分的序列的系统和方法。

质谱法背景

质谱法(MS)是一种用于基于对由化学化合物形成的离子的m/z值的分析对那些化合物进行检测和定量的分析技术。MS涉及来自样本的感兴趣的一种或多种化合物的离子化、产生前驱物离子和对前驱物离子的质量分析。

串联质谱法或质谱法/质谱法(MS/MS)涉及来自样本的感兴趣的一种或多种化合物的离子化、一种或多种化合物的一种或多种前驱物离子的选择、将一种或多种前驱物离子碎裂为产物离子和对产物离子的质量分析。

MS和MS/MS二者都可以提供定性和定量信息。测得的前驱物或产物离子谱可以被用于识别感兴趣的分子。前驱物离子和产物离子的强度也可以被用于对样本中存在的化合物的量进行定量。

碎裂技术背景

基于电子的解离(ExD)、紫外光解离(UVPD)、红外光解离(IRMPD)和碰撞诱导解离(CID)常常被用作用于串联质谱法(MS/MS)的碎裂技术。ExD可以包括但不限于电子捕获解离(ECD)或电子转移解离(ETD)。CID是串联质谱仪中最常规的解离技术。

如上所述，在自上而下和自中而下的蛋白质组学中，完整的或消化的蛋白质被离子化并经历串联质谱法。例如，ECD是一种优先解离肽和蛋白质主链的解离技术。因此，这种技术是使用自上而下和自中而下的蛋白质组学方法分析肽或蛋白质序列的理想工具。

发明内容

公开了用于对未知mAb的一个或多个可变部分进行测序的系统、方法和计算机程序产品。系统包括基因组数据库、分离设备、离子源设备、具有一个或多个解离设备的质谱仪以及处理器。

处理器指示分离设备从样本中分离已知mAb类的未知的完整mAb或还原mAb亚基。处理器指示离子源设备将未知的完整mAb或还原mAb亚基离子化。质谱仪包括解离设备和质量分析仪。解离设备优选地是ECD设备。处理器指示质谱仪使用解离设备使离子化的未知的完整mAb或还原mAb亚基碎裂，并使用质量分析仪对所得到的产物离子进行质量分析，从而产生一个或多个产物离子谱。

处理器计算已知mAb类的一个或多个恒定部分的理论产物离子峰。处理器从一个或多个产物离子谱中移除计算出的理论产物离子峰，从而产生一个或多个差异产物离子谱。处理器将从头测序应用于一个或多个差异产物离子谱，从而产生用于未知的完整mAb或还原mAb亚基的一个或多个可变部分的一个或多个候选序列。处理器在基因组数据库中搜索(同源性搜索)与一个或多个候选序列的匹配，从而产生用于一个或多个可变部分的一个或多个匹配序列。

本文阐述申请人的教导的这些和其它特征。

附图说明

本领域技术人员将理解的是，以下描述的附图仅用于说明目的。附图无意以任何方式限制本教导的范围。

图1是图示可以在其上实现本教导的实施例的计算机系统的框图。

图2是IgG单克隆抗体(mAb)的示例图示。

图3是示出在第一Fornelli论文中使用的自上而下MS/MS方法的示意图。

图4是示出在第二Fornelli论文中使用的自中而下MS/MS方法的示意图。

图5是示出在Cotham论文中使用的自中而下MS/MS方法的示意图。

图6是示出根据各种实施例的用于对未知mAb的一个或多个可变部分进行测序的系统的示例性示意图。

图7是根据各种实施例的电子捕获解离(ECD)设备的示意图。

图8是根据各种实施例的ECD设备和碰撞诱导解离(CID)碰撞室的剖切三维立体图。

图9是根据各种实施例的通过使用ECD解离使未还原的完整mAb碎裂而产生的示例性产物离子谱。

图10是根据各种实施例的示例性表，该表示出了通过从计算出的单电荷转换的产物离子峰的列表中移除或减去用于mAb类的恒定部分的理论产物离子峰而产生的差异产物离子峰列表，并示出了与差异产物离子峰列表对应的从头序列的列表。

图11是示出根据各种实施例的用于对未知mAb的一个或多个可变部分进行测序的方法的流程图。

图12是根据各种实施例的包括执行用于对未知mAb的一个或多个可变部分进行测序的方法的一个或多个不同软件模块的系统的示意图。

在详细描述本教导的一个或多个实施例之前，本领域的技术人员将认识到的是，本教导的应用不限于在以下详细描述中阐述的或在附图中图示的构造的细节、部件的布置和步骤的布置。而且，应该理解的是，本文所使用的措词和术语是出于描述的目的，而不应当被认为是限制性的。

具体实施方式

计算机实现的系统

图1是图示可以在其上实现本教导的实施例的计算机系统100的框图。计算机系统100包括总线102或用于传送信息的其它通信机构，以及与总线102耦合以用于处理信息的处理器104。计算机系统100还包括存储器106，存储器106可以是随机存取存储器(RAM)或其它动态存储设备，存储器106耦合到总线102以用于存储要由处理器104执行的指令。存储器106还可以用于在要由处理器104执行的指令的执行期间存储临时变量或其它中间信息。计算机系统100还包括耦合到总线102的只读存储器(ROM)108或其它静态存储设备，用于存储用于处理器104的静态信息和指令。诸如磁盘或光盘之类的存储设备110被提供并且耦合到总线102以用于存储信息和指令。

计算机系统100可以经由总线102耦合到显示器112(诸如阴极射线管(CRT)或液晶显示器(LCD))，以用于向计算机用户显示信息。包括字母数字键和其它键的输入设备114耦合到总线102，以用于将信息和命令选择传送到处理器104。另一种类型的用户输入设备是光标控件116，诸如鼠标、轨迹球或光标方向键，用于将方向信息和命令选择传送到处理器104并用于控制显示器112上的光标移动。这种输入设备通常具有两个轴(即，第一轴(即，x)和第二轴(即，y))上的两个自由度，这允许设备指定平面中的位置。

计算机系统100可以执行本教导。与本教导的某些实施方式一致，响应于处理器104执行存储器106中包含的一个或多个指令的一个或多个序列而由计算机系统100提供结果。这样的指令可以从诸如存储设备110之类的另一个计算机可读介质读入存储器106。存储器106中包含的指令序列的执行使处理器104执行本文所述的处理。可替代地，可以使用硬连线电路代替软件指令或与软件指令结合来实现本教导。因此，本教导的实施方式不限于硬件电路系统和软件的任何具体组合。

在各种实施例中，计算机系统100可以跨网络连接到一个或多个其它计算机系统(像计算机系统100一样)，以形成联网系统。网络可以包括私有网络或诸如互联网之类的公共网络。在联网系统中，一个或多个计算机系统可以存储数据并将数据供应给其它计算机系统。在云计算场景中，可以将存储和供应数据的一个或多个计算机系统称为服务器或云。例如，一个或多个计算机系统可以包括一个或多个web服务器。例如，向服务器或云发送数据和从服务器或云接收数据的其它计算机系统可以被称为客户端或云设备。

如本文所使用的，术语“计算机可读介质”是指参与向处理器104提供指令以供执行的任何介质。这样的介质可以采取许多形式，包括但不限于非易失性介质、易失性介质和传输介质。非易失性介质包括例如光盘或磁盘，诸如存储设备110。易失性介质包括动态存储器，诸如存储器106。传输介质包括同轴线缆、铜线和光纤，包括包含总线102的电线。

计算机可读介质或计算机程序产品的常见形式包括例如软盘、柔性盘、硬盘、磁带或任何其它磁性介质、CD-ROM、数字视频盘(DVD)、蓝光盘、任何其它光学介质、拇指驱动器、存储器卡、RAM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、任何其它存储器芯片或盒式磁带、或计算机可以从中读取的任何其它有形介质。

各种形式的计算机可读介质可以涉及将一个或多个指令的一个或多个序列携带给处理器104以供执行。例如，指令最初可以被携带在远程计算机的磁盘上。远程计算机可以将指令加载到其动态存储器中，并使用调制解调器通过电话线发送指令。计算机系统100本地的调制解调器可以在电话线上接收数据，并使用红外发送器将数据转换成红外信号。耦合到总线102的红外检测器可以接收红外信号中携带的数据，并将数据放置在总线102上。总线102将数据携带给存储器106，处理器104从存储器106检索并执行指令。由存储器106接收的指令可以可选地在被处理器104执行之前或之后存储在存储设备110上。

根据各种实施例，被配置为由处理器执行以执行方法的指令被存储在计算机可读介质上。计算机可读介质可以是存储数字信息的设备。例如，计算机可读介质包括如本领域中已知的用于存储软件的致密盘只读存储器(CD-ROM)。计算机可读介质由适于执行被配置为被执行的指令的处理器访问。

为了说明和描述的目的，已经给出了本教导的各种实施方式的以下描述。它不是穷尽的并且不将本教导限制到所公开的精确形式。鉴于以上教导，修改和变化是可能的，或者可以从本教导的实践中获得。此外，所描述的实施方式包括软件，但是本教导可以被实现为硬件和软件的组合或者单独地以硬件来实现。本教导可以用面向对象和非面向对象的编程系统二者来实现。

MABS可变部分确定

如上所述，单克隆抗体(mAb)的自上而下和自中而下的分析仅在已知mAb的氨基酸序列时才被证明。确定未知mAb的序列是比识别或确认已知mAb的序列困难得多的问题。这是更加困难的问题，因为如上所述，mAb的可变部分可以具有数十亿种不同的可能序列。

因此，需要用于确定未知mAb的序列的系统和方法。更具体而言，需要用于确定未知mAb的可变部分的序列的系统和方法。

在各种实施例中，提供了用于对未知mAb的可变部分进行测序的系统和方法。使用自上而下或自中而下的LC-MS/MS。自上而下的LC-MS/MS被应用于完整的mAb。自中而下的LC-MS/MS被应用于还原的mAb亚基。

计算已知mAb类的一个或多个恒定部分的理论产物离子峰。这些计算出的理论产物离子峰被从通过自上而下或自中而下的LC-MS/MS产生的一个或多个产物离子谱中移除或减去。从头测序被应用于一个或多个差异产物离子谱，从而产生用于未知的完整mAb或还原mAb亚基的一个或多个可变部分的一个或多个候选序列。最后，在基因组数据库中搜索(同源性搜索)与一个或多个候选序列的匹配，从而产生用于未知mAb的一个或多个可变部分的一个或多个匹配序列。在各种实施例中，再次执行传统的自上而下或自中而下的MS/MS以验证这一个或多个匹配序列。

用于对未知mAb的可变部分进行测序的系统

图6是示出根据各种实施例的用于对未知mAb的一个或多个可变部分进行测序的系统的示例性示意图600。图6的系统包括基因组数据库610、分离设备620、离子源设备630、质谱仪640和处理器650。

处理器650指示分离设备620从样本中分离已知mAb类的未知的完整mAb或还原mAb亚基。在各种实施例中，处理器650被用于控制分离设备620、离子源设备630和质谱仪640或向分离设备620、离子源设备630和质谱仪640提供指令，以搜索基因组数据库610，并分析所收集的数据。处理器650通过例如控制一个或多个电压、电流或压力源(未示出)来控制或提供指令。处理器650可以是如图6中所示的单独设备，或者可以是质谱仪640的一个或多个设备的处理器或控制器。处理器650可以是但不限于控制器、计算机、微处理器、图1的计算机系统或能够发送和接收控制信号和数据以及分析数据的任何设备。

在各种实施例中，如步骤601中所示，在自上而下的方法中，处理器650指示分离设备620分离完整的未知mAb。在这种自上而下的方法中，溶液603中的完整的未知mAb被供应给分离设备620，并且完整的未知mAb 621通过分离设备620被脱盐并分离。

在各种替代实施例中，如步骤602中所示，在自中而下的方法中，处理器650指示分离设备620分离消化的未知mAb。通过将IdeS施加到溶液603来消化消化溶液603中的完整的未知mAb。然后，在这种自中而下的方法中，消化的未知mAb被供应给分离设备620，并且消化的未知mAb 622被分离设备620脱盐。

在各种实施例中，二硫苏糖醇(DTT)被用于还原消化的未知mAb。例如，DTT被注入分离设备620中以进行在线还原。分离设备620分离未知mAb的还原的IdeS消化物。

分离设备620可以是但不限于液相色谱(LC)设备或毛细管电泳设备。在优选实施例中，分离设备620是LC柱，该LC柱随时间分离和脱盐未知的完整mAb或还原mAb亚基。

处理器650指示离子源设备630将未知的完整mAb 621或还原mAb亚基622离子化。离子源设备630可以是电喷射离子源(ESI)设备。在图6中，离子源设备630被示为质谱仪640的一部分。

质谱仪640除其它设备外尤其还包括解离设备641和质量分析仪643。处理器650指示质谱仪640使用解离设备641使离子化的未知的完整mAb或还原mAb亚基碎裂，并使用质量分析仪643对所得到的产物离子进行质量分析，从而产生一个或多个产物离子谱644。质量分析仪643可以包括但不限于飞行时间(TOF)质量分析仪、四极、离子阱、线性离子阱、轨道阱、磁扇区质量分析仪、混合四极飞行时间(Q-TOF)质量分析仪或傅立叶变换离子回旋共振质量分析仪。在优选实施例中，质量分析仪643是TOF质量分析仪。

解离设备641例如使用ExD、IRMPD、CID或UVPD使离子化的未知的完整mAb或还原mAb亚基碎裂。在优选的实施例中，解离设备641是ECD设备。

图7是根据各种实施例的ECD设备的示意图700。ECD设备包括电子发射器或灯丝710和电子门720。垂直于离子730的流并平行于磁场740的方向发射电子。

返回图6，包括解离设备的质谱仪通常包括另一个解离设备，如用于CID的Q2解离设备642。Q2解离设备642例如用于使蛋白质或肽以外的化合物碎裂。在蛋白质或肽的分析期间，Q2解离设备642充当离子引导件，并且将产物离子从解离设备641简单地传输至质量分析仪643。

图8是根据各种实施例的ECD设备和CID碰撞室的剖切三维立体图800。图8示出了可以在ECD设备814中的位置811处或在CID碰撞室815中的位置812处选择性地执行离子的碎裂。

返回图6，在各种实施例中，处理器650指示质谱仪640用ECD解离设备641使用0eV和3eV之间的电子能量来使离子化的未知的完整mAb或还原mAb亚基碎裂。质谱仪640同时将未知的完整mAb或还原mAb亚基的电子和离子注入ECD解离设备641。

在各种实施例中，ECD解离设备641是四极、六极或八极解离设备。

处理器650计算已知mAb类的一个或多个恒定部分的理论产物离子峰651。mAb类可以包括但不限于IgG、IgE、IgD、IgM和IgA。

处理器650从一个或多个产物离子谱644中移除或减去计算出的理论产物离子峰651，从而产生一个或多个差异产物离子谱652。

处理器650对一个或多个差异产物离子谱652应用从头测序，从而产生用于未知的完整mAb或还原mAb亚基的一个或多个可变部分的一个或多个候选序列653。处理器650在基因组数据库610中搜索(同源性搜索)与一个或多个候选序列653的匹配，从而产生用于一个或多个可变部分的一个或多个匹配序列654。

在从头测序中，例如，将一个或多个氨基酸序列指派给产物离子谱中的产物离子。注意的是，从头测序不同于由第一Fornelli论文、第二Fornelli论文和Cotham论文为找出序列而执行的数据库搜索。在从头测序中不存在数据库搜索以便确定候选序列。

在各种实施例中，处理器650通过移除C端产物离子的理论产物离子峰来移除计算出的理论产物离子峰651。处理器650将从头测序应用于一个或多个差异产物离子谱652的剩余的N端产物离子，以产生一个或多个候选序列653。

如下所述，发现图6的系统产生未知的mAb的70％-80％的序列覆盖。在各种实施例中，处理器650通过进一步将一个或匹配序列与未知的完整mAb或还原mAb亚基的一个或多个产物离子谱进行比较来确定序列覆盖和确认一个或多个匹配序列。

在各种实施例中，处理器650从一个或多个产物离子谱644计算峰列表。例如，处理器650可以从被转换成单电荷产物离子峰的一个或多个产物离子谱644计算峰列表。然后，处理器650通过从峰列表中移除理论产物离子峰651来从一个或多个产物离子谱中移除计算出的理论产物离子峰651，从而产生差异峰列表。处理器650通过将从头测序应用于差异峰列表来将从头测序应用于一个或多个差异产物离子谱652。

图9是根据各种实施例的通过使用ECD解离使未还原的完整mAb碎裂而产生的示例性产物离子谱900。在ECD产物离子谱900中，单电荷产物离子出现在大约500和1500m/z之间。多电荷前驱物离子出现在大约2100和4500m/z之间。

图10是根据各种实施例的示例性表1000，其示出了通过从计算出的单电荷转换产物离子峰的列表中移除或减去mAb类的恒定部分的理论产物离子峰而产生的差异产物离子峰列表，并且示出了与差异产物离子峰列表对应的从头序列的列表。在表1000中，将已知mAb类的恒定部分的理论产物离子峰的列表1020的产物离子峰与单电荷产物离子的列表1010的产物离子峰进行比较。从列表1010中移除匹配的峰，从而生成差异峰列表1030。从头测序被应用于差异峰列表1030的产物离子峰，从而产生未知mAb的可变部分的从头候选序列的列表1040。

用于对未知mAb的可变部分进行测序的方法

图11是示出根据各种实施例的用于对未知mAb的一个或多个可变部分进行测序的方法1100的流程图。

在方法1100的步骤1110中，使用处理器指示分离设备从样本中分离已知mAb类的未知的完整mAb或还原mAb亚基。

在步骤1120中，使用处理器指示离子源设备将未知的完整mAb或还原mAb亚基离子化。

在步骤1130中，使用处理器指示质谱仪使用质谱仪的解离设备使离子化的未知的完整mAb或还原mAb亚基碎裂，并使用质谱仪的质量分析仪对所得到的产物离子进行质量分析，从而产生一个或多个产物离子谱。

在步骤1140中，使用处理器计算已知mAb类的一个或多个恒定部分的理论产物离子峰。

在步骤1150中，使用处理器从一个或多个产物离子谱中移除计算出的理论产物离子峰，从而产生一个或多个差异产物离子谱。

在步骤1160中，使用处理器将从头测序应用于一个或多个差异产物离子谱，从而产生用于未知的完整mAb或还原mAb亚基的一个或多个可变部分的一个或多个候选序列。

在步骤1170中，使用处理器在基因组数据库中搜索与一个或多个候选序列的匹配，从而产生用于一个或多个可变部分的一个或多个匹配序列。

在各种实施例中，在附加步骤1180中，将一个或匹配序列与未知的完整mAb或还原mAb亚基的一个或多个产物离子谱进行比较，以确认一个或多个匹配序列并确定一个或匹配序列的覆盖。例如，执行步骤1180以确定图6的一个或多个匹配序列654的70％-80％的序列覆盖。

用于对未知mAb的可变部分进行测序的计算机程序产品

在各种实施例中，计算机程序产品包括有形的计算机可读存储介质，该有形的计算机可读存储介质的内容包括具有在处理器上被执行以便执行用于对未知mAb的一个或多个可变部分进行测序的方法的指令的程序。这个方法由包括一个或多个不同软件模块的系统执行。

图12是根据各种实施例的系统1200的示意图，系统1200包括执行用于对未知mAb的一个或多个可变部分进行测序的方法的一个或多个不同的软件模块。系统1200包括控制模块1210和分析模块1220。

控制模块1210指示分离设备从样本中分离已知mAb类的未知的完整mAb或还原mAb亚基。控制模块1210指示离子源设备将未知的完整mAb或还原mAb亚基离子化。控制模块1210指示质谱仪使用质谱仪的解离设备使离子化的未知的完整mAb或还原mAb亚基碎裂。控制模块1210还指示质谱仪使用质谱仪的质量分析仪对所得到的产物离子进行质量分析，从而产生一个或多个产物离子谱。

分析模块1220计算已知mAb类的一个或多个恒定部分的理论产物离子峰。分析模块1220从一个或多个产物离子谱中移除计算出的理论产物离子峰，从而产生一个或多个差异产物离子谱。分析模块1220对一个或多个差异产物离子谱应用从头测序，从而产生用于未知的完整mAb或还原mAb亚基的一个或多个可变部分的一个或多个候选序列。最终，分析模块1220在基因组数据库中搜索与一个或多个候选序列的匹配，从而产生用于一个或多个可变部分的一个或多个匹配序列。

在各种实施例中，分析模块1220还将一个或匹配序列与未知的完整mAb或还原mAb亚基的一个或多个产物离子谱进行比较，以确认一个或多个匹配序列并确定一个或匹配序列的覆盖。

实验数据

ECD提供了独特的特征，诸如自上而下测序、从头测序、糖基化分析和提供信息的二硫键裂解，并且是用于分析完整抗体的理想工具。在许多实验中使用基于RF离子阱的小型且高吞吐量的ECD设备。在本工作中这种技术被应用于完整mAb。它也被应用于使用新型在线二硫键还原技术还原的mAb亚基。

ECD室被安装在四极TOF系统中的Q1和Q2之间。同时俘获ECD模式被用于高吞吐量分析，这是将电子束和前驱物离子同时注入ECD设备中。典型的电子束照射时间为10ms，并且电子束强度被调谐以获得适当的解离效率。TOF的质量分辨率为35000-47000，其解析高达Z～30+的碎片的同位素模式。脱盐的LC柱(Waters)被用于脱盐、在线还原和LC分离。为了进行演示，从NIST获得了人源化单克隆IgG(NIST-mAb)。

为了在使用ECD-TOF系统的自上而下分析中获得最佳的序列覆盖，(1)可以选择较低电荷的前驱物以获得较低的碎片电荷状态分布，(2)可以用0-3eV的电子能量来执行ECD，以及(3)可以使用30％～50％的前驱物消耗来检测处于高电荷状态的大碎片。发现使用较长的电子辐射(或较强的电子束)诱导初级ECD碎片的二级解离，这移除了大碎片并产生内部碎片，这没有对测序提供信息。

通过LC-ECD-TOF质谱仪分析了完整的NIST-mAb。通过单次LC运行获得的完整ECD谱的从头测序指示三个序列，并且其中两个与人类基因组中发现的轻链和重链中的可变部分的N端部分序列匹配。使用建议的完整序列(完整序列由NIST提供)以自上而下的方式进一步分析了完整的ECD谱，其中数据覆盖了mAb的轻链和重链的可变部分。3eV的ECD没有裂解蛋白质中的二硫键环。

为了获得几乎完全的序列覆盖，应用了IdeS酶(Genovis)。为了在线还原二硫键，将DTT注入完整的mAb中，并将IdeS消化物俘获在脱盐柱上1分钟。通过应用还原，获得了轻链的84.7％的序列覆盖、重链的可变部分(Fd')的78.3％的序列覆盖以及重链的固定部分(scFc)的84.7％的序列覆盖。另外，ECD指示scFc中的糖基化部位及其质量，以及CID告知了聚糖的组成。

虽然结合各种实施例描述了本教导，但是并不旨在将本教导限于这样的实施例。相反，如本领域技术人员将认识到的，本教导包含各种替代方案、修改和等同形式。

另外，在描述各种实施例时，说明书可以已经呈现了作为步骤的特定序列的方法和/或处理。但是，就方法或处理不依赖于本文阐述的步骤的特定次序而言，方法或处理不应当限于所描述的步骤的特定序列。如本领域普通技术人员将认识到的，步骤的其它序列可以是可能的。因此，说明书中阐述的步骤的特定次序不应当被解释为对权利要求的限制。此外，针对方法和/或处理的权利要求不应当限于以所写的次序执行其步骤，并且本领域技术人员可以容易地认识到，这些序列可以变化并且仍保持在各种实施例的精神和范围之内。

Claims (15)

1.一种用于对未知的单克隆抗体mAb的一个或多个可变部分进行测序的系统，包括：

用于同源性搜索的基因组数据库；

分离设备；

离子源设备；

质谱仪，所述质谱仪包括解离设备和质量分析仪；以及

处理器，所述处理器：

指示所述分离设备从样本中分离已知mAb类的未知的完整mAb或还原mAb亚基，

指示所述离子源设备将所述未知的完整mAb或还原mAb亚基离子化，

指示所述质谱仪使用所述解离设备使离子化的所述未知的完整mAb或还原mAb亚基碎裂，并使用所述质量分析仪对所得到的产物离子进行质量分析，从而产生一个或多个产物离子谱，

计算所述已知mAb类的一个或多个恒定部分的理论产物离子峰，

从所述一个或多个产物离子谱中移除计算出的理论产物离子峰，从而产生一个或多个差异产物离子谱，

将从头测序应用于所述一个或多个差异产物离子谱，从而产生用于所述未知的完整mAb或还原mAb亚基的一个或多个可变部分的一个或多个候选序列，以及

在所述基因组数据库中搜索与所述一个或多个候选序列的匹配，从而产生用于所述一个或多个可变部分的一个或多个匹配序列。

2.如权利要求1所述的系统，其中所述处理器通过移除N端产物离子的理论产物离子峰来移除计算出的理论产物离子峰。

3.如权利要求2所述的系统，其中所述处理器将从头测序应用于所述一个或多个差异产物离子谱的剩余的C产物离子，以产生一个或多个候选序列。

4.如权利要求1所述的系统，其中所述处理器从所述一个或多个产物离子谱计算峰列表。

5.如权利要求4所述的系统，其中所述处理器从被转换成单电荷产物离子峰的所述一个或多个产物离子谱计算峰列表。

6.如权利要求4所述的系统，其中所述处理器通过从所述峰列表中移除所述理论产物离子峰来从所述一个或多个产物离子谱中移除计算出的理论产物离子峰，从而产生差异峰列表。

7.如权利要求6所述的系统，其中所述处理器通过将从头测序应用于所述差异峰列表来将从头测序应用于所述一个或多个差异产物离子谱。

8.如权利要求1所述的系统，还包括在所述处理器指示所述分离设备对还原的未知的mAb进行分离和脱盐之前，将化脓链球菌IdeS消化的免疫球蛋白G降解酶应用于完整的未知的mAb以产生还原的未知的mAb。

9.如权利要求8所述的系统，还包括当所述分离设备对经IdeS消化的还原的未知的mAb进行分离和脱盐时，将二硫苏糖醇DTT注入到具有完整的未知的mAb的溶液中并注入到所述分离设备中。

10.如权利要求1所述的系统，其中所述解离设备包括电子捕获解离ECD设备。

11.如权利要求10所述的系统，其中所述处理器指示所述质谱仪用所述ECD设备使用0eV和3eV之间的电子能量来使离子化的所述未知的完整mAb或还原mAb亚基碎裂。

12.如权利要求10所述的系统，其中所述质谱仪同时将所述未知的完整mAb或还原mAb亚基的电子和离子注入到所述ECD设备中。

13.如权利要求10所述的装置，其中所述ECD设备包括四极、六极或八极解离设备。

14.一种用于对未知的单克隆抗体mAb的一个或多个可变部分进行测序的方法，包括：

使用处理器指示分离设备从样本中分离已知mAb类的未知的完整mAb或还原mAb亚基；

使用所述处理器指示离子源设备将所述未知的完整mAb或还原mAb亚基离子化；

使用所述处理器指示质谱仪使用所述质谱仪的解离设备使离子化的所述未知的完整mAb或还原mAb亚基碎裂，并使用所述质谱仪的质量分析仪对所得到的产物离子进行质量分析，从而产生一个或多个产物离子谱；

使用所述处理器计算所述已知mAb类的一个或多个恒定部分的理论产物离子峰；

使用所述处理器从所述一个或多个产物离子谱中移除计算出的理论产物离子峰，从而产生一个或多个差异产物离子谱；

使用所述处理器将从头测序应用于所述一个或多个差异产物离子谱，从而产生用于所述未知的完整mAb或还原mAb亚基的一个或多个可变部分的一个或多个候选序列；以及

使用所述处理器在基因组数据库中搜索与所述一个或多个候选序列的匹配，从而产生用于所述一个或多个可变部分的一个或多个匹配序列。

15.一种计算机程序产品，所述计算机程序产品包括非暂态且有形的计算机可读存储介质，所述计算机可读存储介质的内容包括具有在处理器上被执行以便执行用于对未知的单克隆抗体mAb的一个或多个可变部分进行测序的方法的指令的程序，所述方法包括：

提供系统，其中所述系统包括一个或多个不同的软件模块，并且其中所述不同的软件模块包括控制模块和分析模块；

使用所述控制模块指示分离设备从样本中分离已知mAb类的未知的完整mAb或还原mAb亚基；

使用所述控制模块指示离子源设备将所述未知的完整mAb或还原mAb亚基离子化；

使用所述控制模块指示质谱仪使用所述质谱仪的解离设备使离子化的所述未知的完整mAb或还原mAb亚基碎裂，并使用所述质谱仪的质量分析仪对所得到的产物离子进行质量分析，从而产生一个或多个产物离子谱；

使用所述分析模块计算所述已知mAb类的一个或多个恒定部分的理论产物离子峰；

使用所述分析模块从所述一个或多个产物离子谱中移除计算出的理论产物离子峰，从而产生一个或多个差异产物离子谱；

使用所述分析模块将从头测序应用于所述一个或多个差异产物离子谱，从而产生用于所述未知的完整mAb或还原mAb亚基的一个或多个可变部分的一个或多个候选序列；以及

使用所述分析模块在基因组数据库中搜索与所述一个或多个候选序列的匹配，从而产生用于所述一个或多个可变部分的一个或多个匹配序列。

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