JP2010531142A - 液体濃縮装置、オートロガスな濃縮体液、およびそれらの使用方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図2
Description
別に言及しない限り、明細書中に用いた全ての技術および科学用語は、当業者に一般に理解される意味と同じ意味をもつ。明細書に記載されるのと同等または等価である方法、装置および材料は全て実際に用いることができるが、ここで、これらの方法、装置および材料を以下に記載する。
本発明は、体液を濃縮する液体濃縮装置を含む。この体液はオートロガスな体液であってよい。本発明の濃縮装置10は、分離室14を画定する主格納部12を先ず有する。製造と組み立てを容易にするために、主格納部12は、図1に示すように底板部16、中央格納部18、および天板部20として形成してもよい。主格納部12は、好ましくはプラスチックを成形したものであるが、任意の滅菌材料で成形可能である。製造組み立てでは、底板部16、中央格納部18、および天板部20は、エポキシ密閉剤または音波接合などによって互いに密閉することが好ましい。あるいは、底板部16、中央格納部18、および天板部20は、互いに螺合して通常のO−リングなどで密閉されるように、ねじ山部による結合部分により形成してもよい。
本発明の濃縮装置は、体液を濃縮することに加えて、細胞小器官、細胞、またはタンパク質を分離するのに使用できる。分離は、遠心分離または重力による分離によって実施できる。ある実施形態では、体液はオートロガスな体液であってよい。遠心分離は、液体媒体中懸濁した物質を分離または濃縮するために使用する工程である。遠心分離技術の理論的基礎は、懸濁液中でマクロ分子を含む粒子に重力加速度を加えることにある。異なる質量をもつ2つの粒子は、重力加速度に応じて異なる速度で管の中を沈降する。この沈降速度を速めるのに遠心力(g)を使用するが、その速度を速める手段が遠心分離である。発生させる遠心力は、ローターの回転速度(RPMで示す)およびローター中心と遠心分離管との距離に比例する。従って、遠心分離条件の選定に幅をもたすために、遠心分離では多様なローターサイズを使用してよい。
本発明の方法によって得た濃縮体液は、外科手術への適用、移植用のアログラフト材料の調製、組織再生または組織培養、幹細胞の増殖または分離、精液分画化、タンパク質分離、および、DNA精製を含む幅広い用途に使用できるが、これらに限定されるものではない。実施形態では、本発明の濃縮体液はオートロガスな体液である。
本発明の濃縮装置は、血液または血小板に富む血漿(PRP)および血小板欠乏血漿(PPP)を含む血漿の濃縮フラクションを得るために使用できる。実施形態では、本発明の濃縮装置を、骨治癒などの外科手術に使用するために手術中に患者の血液試料から濃縮PRPを得るために使用する。ある実施形態では、全血を患者から抜き取り、本発明の濃縮装置で5分間から30分間、25gから1000gずつの量を遠心分離する。また、別の実施形態では、全血を約15分間400gの量を遠心分離する。遠心分離した血液の中央にあるPRP層を、色で視覚的に同定し、分離室から取り出す。シリンジで圧力をかけ、PRP層を1回から10回フィルターを通すが、ある実施形態では、PRP層を6回フィルターに通す。ろ過方法には、タンジェント流ろ過またはデッドエンドろ過方式がある。ある実施形態では、カットサイズ0.1nmから100,000nm、表面積1cm2から6000cm2の中空糸フィルター膜を用いたタンジェント流ろ過方式を使用する。こうして得た濃縮PRPは、全血に比べて血小板および白血球の濃度を増した、濃厚なジェル様の粘性を持つ。血小板の濃度を高めることで、このようにして得た材料には、血液の増殖因子が高い濃度で含まれる。このようにして濃縮したPRP産物は、例えば、折れたまたは損傷した骨、傷、外科切開、または、損傷組織に、外科手術中直接塗布できる。ある実施形態では、濃縮装置で得た濃縮PRPは、損傷したまたは折れた骨、傷、外科切開、または、損傷組織に直接塗布できる骨増殖刺激因子である。患者の血液から得た患者自身の増殖因子の濃度を高めることで、骨の治癒速度を速め、外科手術の部位または傷口周囲の感染度合いを低くし、軟部組織の炎症反応を減らすことができる。所望ならば、緩衝生理食塩水などの様々な公知の希釈液を用いて、色々な用途のためにオートロガスな濃縮PRPの粘度を調節してもよい。
本発明の濃縮装置を、例えば、濃縮液体、または、外科手術で使用するオートロガスな濃縮液体PRP、PPP、増殖因子、分化因子、走化性因子、接着分子、または幹細胞などの濃縮オートロガス液体を得るために使用できる。ある実施形態では、移植材料は、ヒト、ウシおよびブタ原料などの哺乳類原料から得られる、アロゲニックまたはゼノゲニック材料である。ある実施形態では、オートロガスな濃縮液体PRP、PPP、増殖因子、分化因子、走化性因子、接着分子、幹細胞、またはそれらを組み合わせた液体を、臓器または組織を移植手術する前または手術の間、遺伝的に異なるドナーから臓器または組織に塗布する。このように、アログラフトまたはゼノグラフト材料を用いることで、新たに移植した臓器または組織に対する受容者の免疫系受容性を増し、拒絶反応を減少し、新たに移植した臓器または組織の周囲の組織再生を助長し、さらに、移植手術後の治癒に要する時間を短縮することも助長する。
本発明の方法によって得た濃縮液体は、組織再生、組織培養、および細胞培養に使用できる。増殖因子、分化因子、走化性因子、接着分子、またはそれらの組み合わせ因子を1つ以上有する濃縮液体を、増殖マトリックスまたは直接に組織や細胞培養の培地に加えることができる。ある実施形態では、細胞の増殖を促進し、損傷部位の組織修復および組織再生を促進するために、負傷または損傷部位に濃縮液体を塗布する。
ある実施形態では、本発明の濃縮液体は骨髄由来の幹細胞を有する液体である。ある実施形態では、濃縮液体はオートロガスな液体である。ある実施形態では、外科医が患者の腰骨の骨髄腔に直接太い注射針を挿入し、骨に注射針を何回も挿入することで骨から骨髄を吸引する。続いて、吸引した骨髄を本発明の濃縮装置で5分間400g遠心分離する。吸引した骨髄は、遠心分離操作によって異なるフラクションに骨髄を分離するので、十分に大きさおよび重量の異なる細胞および分子を有する血液に似た物質である。所望ならば、遠心分離の前に、吸引した骨髄を0.56%(0.075M)KCl(0.56g/100ml脱イオン水)と混合できる。続いて、下層を取り出して1から10回、好適には4回フィルターを通してろ過する。本願の明細書に記載されるようなフィルターエレメントまたはフィルター膜を有するろ過システムを用いて、上記で得た層をろ過する。
本発明の濃縮装置および方法を、精子の選別に使用することができる。ある実施形態では、哺乳類の精液から精子を収集して、XまたはY遺伝子型精子のいずれかを選別するために、本発明の濃縮装置を使用することができる。このような方法は、pHまたは密度の違いによって哺乳類の2つの精子遺伝型(X型およびY型)が分別できるという事実に基づくものである。ある実施形態では、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、またはヤギなどの家畜哺乳類から精子を得る。密度の違いによる分別では、液体分離媒体中での浮力を用いて、浮力の小さい精子と浮力のより大きい精子とを、分離媒体中異なる高さに分別する。本発明の濃縮装置を使用して精液を遠心分離すると、各遺伝子型の密度の違いによって、X遺伝子型またはY遺伝子型のいずれかの遺伝子型を含有するフラクションに精液を分別する。精液試料がヒトの患者からの試料である場合、XおよびY遺伝子型精子に分別するためには、本発明の濃縮装置中でpH勾配を用いる必要がある。こうして十分な純度の精子フラクション(X遺伝子型またはY遺伝子型のいずれかの遺伝子型特性をもつ)を、本発明の濃縮装置で得た濃縮液体の上層または下層のいずれかの層として単離する。場合によっては、濃縮装置のフィルターエレメントまたはフィルター膜に圧力(加圧または負圧)をかけることで、ある特定の遺伝子型をもつフラクションに精子を分別または濃縮できる。精子を密度で分離する方法は公知の方法であり、例えば、米国特許第4,327,177号明細書に記載される。
本発明の濃縮装置および方法を、タンパク質の選別または分別に使用することができる。ある実施形態では、タンパク質は、増殖因子、分化因子、走化性因子、または接着分子であってよい。次に記載した一般分類のタンパク質も、本発明の分別方法に使用できる。プレアルブミン(チロキシンおよびレチノール結合タンパク質)、アルブミン、αおよびβグロブリン、アポリポタンパク質、凝固タンパク質、細胞関連血漿タンパク質、イムノグロブリン、アミロイドタンパク質などが挙げられる。Frank Putnam著、「The Plasma Proteins」第4巻、第2版、1984に記載される、これらタンパク質ファミリーおよび個々のタンパク質を、表1に示す。
本発明の濃縮装置および方法を、DNAの単離および精製に使用することができる。ある実施形態では、DNAには、ゲノムDNA、プラスミドDNA、組織または細胞から単離したDNA、合成オリゴヌクレオチドなどがある。DNAの分離および精製の基本的方法は、化学的または機械的手段でDNA含有細胞または組織を破壊する必要がある。破壊した細胞または組織は、続いてフィルターエレメントを用いてろ過し、次に本発明の濃縮装置で遠心分離する。細胞または組織層を、フィルター上に一旦保持し、圧力を加えてDNA含有液体層をフィルターを通し、濃縮装置の遠心分離室の中に入れる。遠心分離は、超遠心分離またはミクロ遠心分離により、15,000RPMまでの高速で行うことができる。本発明の濃縮装置によりDNAをさらに精製するために、様々なフィルター類を使用できる。例えば、本発明のフィルターエレメントは、液体中のDNAを吸着し、続いて溶離するアッフィニティーカラムであってよい。本発明の精製方法によって、DNAを簡便に、効率的に、最小限の機械的または化学的操作を用いて精製できる。本発明の精製方法によって得たDNAは、様々な診断目的および治療目的に使用できる。
ある実施形態では、PRPおよび/またはPPPなどの濃縮液体を、止血ゲージや止血パッドとして使用できる。好適には、止血ゲージや止血パッドは生体吸収素材で作られる。あるいは、不織包帯材をオートロガスな濃縮PRPを満たしてもよい。ある実施形態では、止血ゲージや止血パッドを損傷部位に塗布する。先ず、経皮カテーテルまたはチューブを除去した後の血管に近い部位などの出血を止め、次に、止血ゲージや止血パッドは生体吸収素材なので組織治癒を速めるために、出血部位に止血ゲージや止血パッドを直接塗布できる。
Claims (75)
- 生物学的液体を保持するための分離室を区画する主格納部、
前記分離室に連通するフィルター格納部、
前記フィルター格納部が保持するフィルター、および
前記生物学的液体のフラクションを前記分離室から前記フィルターに移送するための配管を有する 液体濃縮装置であって、前記分離室は前記配管により液体を連通している、位置調整可能な第1ポートを有することを特徴とする液体濃縮装置。 - 圧力を加えて前記生物学的液体のフラクションを前記フィルターを通過させるためのポートを1つ以上さらに有する、請求項1の液体濃縮装置。
- 圧力を加えて前記生物学的液体のフラクションをフィルターを通過させるための1つ以上のポートに対して移動可能に取り付けられたポンプをさらに有する、請求項2の液体濃縮装置。
- 前記ポンプが、シリンジまたは貯水槽を有する真空ポンプであることを特徴とする、請求項3の液体濃縮装置。
- フィルターを通して真空圧力を加えるためのポートを少なくとも1つ有することを特徴とする、請求項1の液体濃縮装置。
- 前記生物学的液体を前記分離室に導入するための第2ポートを、前記分離室がさらに有することを特徴とする、請求項1の液体濃縮装置。
- 遠心分離中、前記分離室を長手方向に規定し、および、ろ過中に前記抽出したフラクションの流れを前記分離室の長手方向と一致させて、ろ過中に抽出したフラクションの流れを前記フィルター格納部および前記フィルターは長手方向に規定することを特徴とする、請求項1の液体濃縮装置。
- 前記フィルターの第3の部分にある分離フラクションに圧力を加えるための1つ以上の部分に結合する、移動搭載可能なポンプ、および、前記フィルターの長手方向の流れ方向に沿って位置する濃度検出器をさらに有することを特徴とする、請求項7の液体濃縮装置。
- 前記フィルターと前記ポンプとの間に、前記濃度検出器が位置することを特徴とする、請求項8の液体濃縮装置。
- 前記濃度検出器が光散乱フローセル、吸光度セル、または分光側色計を有することを特徴とする、請求項8の液体濃縮装置。
- 前記分離室がフィルターを有することを特徴とする、請求項1の液体濃縮装置。
- 前記フィルターが、アフィニティー膜、アフィニティー担体、アフィニティーカラム、充填床マトリックス、ビーズ、粒子、または増殖マトリックスを有することを特徴とする、請求項11の液体濃縮装置。
- 前記フィルターが1つ以上のリガンドを有することを特徴とする、請求項12の液体濃縮装置。
- リガンドを受容体または抗体であることを特徴とする、請求項13の液体濃縮装置。
- 1つ以上の増殖因子、1つ以上の分化因子、1つ以上の走化性因子、1つ以上の接着分子、またはそれらの因子の組み合わせに、前記リガンドが1つ以上結合することを特徴とする、請求項13の液体濃縮装置。
- 増殖マトリックスが、1つ以上のナノファイバー;ナノファイバー構造体;エッチングまたはマイクロパターニングした表面をもつガラス、シリコンまたはプラスチック;マクロポアまたはナノポアをもつガラス、シリコンまたはプラスチック表面からなるネットワーク、ポリマースキャホールド、成形スキャホールド、織物状または網状織物、棒、ねじ、ワイヤ、メッシュ、またはかごを有することを特徴とする、請求項12の液体濃縮装置。
- 前記生物学的液体が体液であることを特徴とする、請求項1の液体濃縮装置。
- 前記体液が、血液、血漿、血清、尿、唾液、粘液、脳脊髄液、リンパ液、精液、羊水、または硝子体液を有することを特徴とする、請求項17の液体濃縮装置。
- 前記体液が組織を有することを特徴とする、請求項17の液体濃縮装置。
- 前記組織が、骨、骨髄、筋組織、脳、心臓、肝臓、肺、胃、小腸、大腸、直腸、子宮、精巣、軟骨、軟組織、皮膚、皮下組織、または乳組織を有することを特徴とする、請求項19の液体濃縮装置。
- 濃縮生物学的液体を製造する方法であって、
請求項1の液体濃縮装置で生物学的液体を分離し、
請求項1の分離室から前記分離した生物学的液体の第1の層を取り出し、および
請求項1のフィルターに前記層を通すことによって、取り出した前記層をろ過する工程からなる濃縮生物学的液体を製造する方法。 - 前記生物学的液体が体液であることを特徴とする請求項21の製造方法。
- 前記体液が、血液、血漿、血清、尿、唾液、粘液、脳脊髄液、リンパ液、精液、羊水、または硝子体液を有することを特徴とする請求項22の製造方法。
- 前記体液が組織を有することを特徴とする請求項22の製造方法。
- 前記組織が、骨、骨髄、筋組織、脳、心臓、肝臓、肺、胃、小腸、大腸、直腸、子宮、精巣、軟骨、軟組織、皮膚、皮下組織、または乳組織を有することを特徴とする、請求項24の製造方法。
- 前記生物学的液体が血液であることを特徴とする請求項22の製造方法。
- 取り出した層がタンパク質欠乏血漿(PPP)またはタンパク質に富んだ血漿(PRP)であることを特徴とする請求項26の製造方法。
- 取り出した前記層の中にある1つ以上の成分の生理学的比が、前記生物学的液体中にある同じ1つ以上の成分の生理学的比と実質的に同じであることを特徴とする、請求項22の製造方法。
- 取り出した前記層の中にある1つ以上の成分を、前記生物学的液体中にある同じ1つ以上の成分の濃度に対して、
a)1:10、
b)1:20、
c)1:30、
d)1:40、
e)1:50.
f)1:100、
g)1:200、
h)1:500、または
i)1:1000
に濃縮することを特徴とする、請求項22の製造方法。 - 取り出した前記層の中にある1つ以上の成分を、前記生物学的液体中にある同じ1つ以上の成分の濃度に対して、
a)1:20から1:50、
b)1:20から1:100、
c)1:50から1:100、
d)1:50から1:200、
e)1:100から1:200.
f)1:200から1:500、
g)1:200から1:1000、
h)1:500から1:10000
に濃縮することを特徴とする、請求項22の製造方法。 - 請求項21の製造方法で製造した濃縮生物学的液体中にある移植材料を再構築する工程を有する、移植材料再構築方法。
- 前記移植材料がオートゲニック、アロゲニック、またはゼノゲニックな材料であることを特徴とする請求項31の移植材料再構築方法。
- 前記移植材料が、腱、靱帯、骨、軟骨、または皮膚からなることを特徴とする請求項32の移植材料再構築方法。
- 前記濃縮生物学的液体がオートロガスな材料であることを特徴とする請求項31の移植材料再構築方法。
- 前記濃縮生物学的液体がPRPまたはPPPであることを特徴とする請求項31の移植材料再構築方法。
- ポリマーコーティング、または、1つ以上の増殖因子、分化因子、走化性因子、接着分子、またはこれらを組み合わせたものと反応できる、または共有結合できる反応性官能基を1つ以上有するポリマー性コーティングを有する、埋め込み可能な移植材料。
- コーティング剤、または、1つ以上の増殖因子、分化因子、走化性因子、接着分子、またはこれらの組み合わせの正に荷電した部分と相互作用する、負に荷電した官能基または反応性種を有する1つ以上の置換基と、直接または間接的に付着する非ポリマー性コア分子を有するコーティング剤を有する埋め込み可能な移植材料。
- 前記1つ以上の増殖因子、分化因子、走化性因子、接着分子、またはこれらの組み合わせをコントロールリリースするためのポリマー性コーティングを提供することを特徴とする、請求項36の移植材料。
- 前記1つ以上の増殖因子、分化因子、走化性因子、接着分子、またはこれらの組み合わせをコントロールリリースするためのコーティング剤を提供することを特徴とする、請求項37の移植材料。
- 前記ポリマー性コーティングがナノファイバーまたはミクロファイバーからなることを特徴とする請求項36の移植材料。
- ポリマー性コーティングを有する、1つ以上のポリマー、コポリマー、またはその組み合わせの分解速度または溶出速度によって、前記1つ以上の増殖因子、分化因子、走化性因子、接着分子、またはこれらの組み合わせの放出速度によって測定することを特徴とする請求項38の移植材料。
- 生物学的液体からタンパク質を濃縮する方法であって、
請求項1の液体濃縮装置で前記生物学的液体を分離し、
請求項1の分離室から前記タンパク質を有する、分離した生物学的液体のフラクションを取り出し、および
請求項1のフィルターに前記フラクションを通すことによって、前記分離した生物学的液体の、取り出した前記フラクションをろ過する工程からなるタンパク質濃縮方法。 - 前記タンパク質が、増殖因子、分化因子、走化性因子、または接着分子からなることを特徴とする請求項42のタンパク質濃縮方法。
- 前記生物学的液体が、血液、組織、PRP、またはPPPを有することを特徴とする請求項42のタンパク質濃縮方法。
- 前記フィルターが、アフィニティー膜、アフィニティー担体、またはアフィニティーカラムからなることを特徴とする請求項42のタンパク質濃縮方法。
- 前記フィルターが、前記タンパク質に特異的に結合するリガンドを1つ以上有することを特徴とする請求項45のタンパク質濃縮方法。
- 前記リガンドが受容体または抗体であることを特徴とする請求項46のタンパク質濃縮方法。
- 前記分離室が密度勾配媒体を有することを特徴とする請求項42のタンパク質濃縮方法。
- 請求項21の製造方法によって製造した濃縮生物学的液体を投与することを含む骨治癒促進方法。
- 前記濃縮生物学的液体を骨空充填剤と混合することを特徴とする請求項49の骨治癒促進方法。
- 前記骨空充填剤が脱ミネラル化した骨マトリックスを有することを特徴とする請求項50の骨治癒促進方法。
- 請求項21の製造方法によって製造した濃縮生物学的液体を、損傷し、ひどく傷ついた軟骨に投与することを含む軟骨治癒促進方法。
- 前記濃縮生物学的液体を人工ポリマーまたはコラーゲン系軟骨置換材と混合することを特徴とする請求項52の骨治癒促進方法。
- 請求項21の製造方法によって製造した濃縮生物学的液体を、外科手術部位または損傷に投与することを含む、外科手術または損傷後の細胞再生または組織再生促進方法。
- 前記組織は軟部組織であることを特徴とする請求項54の細胞再生または組織再生促進方法。
- 請求項21の製造方法によって製造した濃縮生物学的液体を、損傷に投与することを含む、損傷治癒促進方法。
- 前記損傷が、外科切開、擦過傷、潰瘍、火傷であることを特徴とする請求項56の損傷治癒促進方法。
- 請求項21の製造方法によって製造した濃縮生物学的液体を、患者の整形外科的に不具合な部位に投与することを含む、患者の整形外科的不具合の治療方法。
- 前記濃縮生物学的液体を、骨空充填剤と混合することを特徴とする請求項58の整形外科的不具合の治療方法。
- 前記骨空充填剤が脱ミネラル骨マトリックスを有することを特徴とする請求項59の整形外科的不具合の治療方法。
- 整形外科的不具合が、脊椎固定、脊椎欠損、骨外傷、骨嚢胞、骨腫瘍、骨折、骨欠損充填、補助関節、上顎洞底挙上術、歯槽骨保存、関節補修、または、後側方固定法を含むことを特徴とする、請求項58乃至請求項60のいずれか1項の整形外科的不具合の治療方法。
- 前記濃縮生物学的液体が、1つ以上の増殖因子、1つ以上の分化因子、1つ以上の走化性因子、1つ以上の接着因子、幹細胞、またはそれらの組み合わせを有することを特徴とする、請求項21乃至請求項35または請求項49乃至請求項61のいずれか1項に記載される方法。
- 前記濃縮生物学的液体が、PRP、PPP、またはPRP+PPPであることを特徴とする、請求項29乃至請求項35または請求項49乃至請求項62のいずれか1項に記載される方法。
- 取り出した前記層が幹細胞を有し、および前記濃縮生物学的液体が骨髄または臍帯血を有することを特徴とする請求項21の製造方法。
- 前記濃縮生物学的液体を密度勾配遠心分離によって分離し、前記濃縮生物学的液体が精液を有し、取り出した前記層がX遺伝子型精子を含むがY遺伝子型精子を含まない、または、Y遺伝子型精子を含むがX遺伝子型精子を含まないことを特徴とする請求項21の製造方法。
- 前記濃縮生物学的液体をpH勾配遠心分離によって分離し、前記濃縮生物学的液体が精液を有し、取り出した前記層がX遺伝子型精子を含むがY遺伝子型精子を含まない、または、Y遺伝子型精子を含むがX遺伝子型精子を含まないことを特徴とする請求項21の製造方法。
- 前記分離室が密度勾配媒体を有することを特徴とする請求項1の液体濃縮装置。
- 請求項21の製造方法によって製造した濃縮生物学的液体を有する外科手術用接着剤またはシーラント。
- 細胞または組織を培養する方法であって、
請求項1の液体濃縮装置で生物学的液体を分離し、
請求項1の分離室から前記分離した生物学的液体中にある細胞を含む第1の層を取り出し、および
請求項1のフィルターに、取り出した細胞を含む前記層を通す工程を有し、前記フィルターが増殖マトリックスを有する結果、細胞濃縮フラクションを用いて前記濃縮マトリックスに細胞または組織を植え付けることを特徴とする、細胞または組織培養方法。 - 分離方法が遠心分離法または重力による分離法を含むことを特徴とする請求項21、請求項42または請求項69に記載される方法。
- 細胞増殖および/または細胞分化を促進する条件下で、濃縮した細胞を有する増殖マトリックスを培養する工程をさらに有する請求項69の方法。
- 前記濃縮生物学的液体が血液または粉砕した組織を有することを特徴とする請求項69の方法。
- 1つ以上の増殖因子、分化因子、走化性因子、接着因子、幹細胞、またはそれらの組み合わせを前記増殖マトリックスが有する請求項69の方法。
- 前記増殖マトリックスが、1つ以上のナノファイバー;ナノファイバー構造体;エッチングまたはマイクロパターニングした表面をもつガラス、シリコンまたはプラスチック;マクロポアまたはナノポアをもつガラス、シリコンまたはプラスチック表面からなるネットワーク、ポリマースキャホールド、成形スキャホールド、織物状または網状織物、棒、ねじ、ワイヤ、メッシュ、またはかごを有することを特徴とする請求項69の方法。
- 前記濃縮生物学的液体がオートロガスな材料であることを特徴とする請求項21乃至請求項35または請求項49乃至請求項66のいずれか1項に記載される方法。
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