KR20120134138A

KR20120134138A - 인간 ｃｓｆ-1ｒ에 대한 항체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20120134138A
Application number: KR1020127025956A
Authority: KR
Inventors: 게오르그 페르티그; 알렉산더 피들러; 클라우스 칼루자; 마를렌 토마스; 카롤라 리즈; 스테판 시버
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2010-03-05
Filing date: 2011-03-03
Publication date: 2012-12-11
Also published as: EP2542588A1; RU2012142230A; US20170275368A1; US9624302B2; US20130005949A1; KR101647871B1; CN102918061A; CA2789071A1; US9221910B2; CA2789071C; WO2011131407A1; BR112012022046A2; RU2617966C2; MX2012010019A; MX336682B; CN102918061B; JP5989547B2; JP2013520978A; US20160053015A1

Abstract

본 발명은 인간 CSF-1R에 대한 항체(CSF-1R 항체), 이의 제조 방법, 상기 항체를 포함하는 약학 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

인간 ＣＳＦ-1Ｒ에 대한 항체 및 이의 용도{ANTIBODIES AGAINST HUMAN CSF-1R AND USES THEREOF}

본 발명은 인간 CSF-1R에 대한 항체(CSF-1R 항체), 이의 제조 방법, 상기 항체를 함유하는 약학 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.

CSF-1 수용체(CSF-1R; 유의어: M-CSF 수용체; 대식세포 콜로니 자극 인자-1 수용체, EC 2.7.10.1, Fms 원 종양 형성 유전자, c-fms, 스위스 프롯(Swiss Prot) P07333, CD115)는 1986년 이래로 공지되어 있다(문헌[Coussens, L., et al., Nature 320 (1986) 277-280]). CSF-1R은 성장 인자이며 c-fms 원 종양 형성 유전자에 의해 암호화된다(예를 들어, 문헌[Roth, P., and Stanley, E.R., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 181 (1992) 141-67]에서 검토되었다).

CSF-1R은 M-CSF(대식세포 콜로니 자극 인자, 또한 CSF-1이라 칭한다)에 대한 수용체이며 상기 사이토카인의 생물 효과를 매개한다(문헌[Sherr, C.J., et al., Cell 41 (1985) 665-676]). 콜로니 자극 인자-1 수용체(CSF-1R)(또한 c-fms라 칭한다)의 클로닝은 문헌[Roussel, M.F., et al., Nature 325 (1987) 549-552]에 최초로 개시되었다. 상기 발행물에서, CSF-1R은, Cb1에 결합하고 이에 의해 수용체 하향 조절을 조절하는 억제성 타이로신 969 인산화의 상실을 포함하여 단백질의 C-말단 꼬리의 변화에 따른 형질전환 잠재력을 갖는 것으로 입증되었다(문헌[Lee, P.S., et al., Embo J. 18 (1999) 3616-3628]).

CSF-1R은 단일 쇄, 막전위 수용체 타이로신 키나아제(RTK)이고 수용체의 세포외 부분에서 반복된 면역글로불린(Ig) 도메인을 특징으로 하는 면역글로불린 (Ig) 동기 함유 RTK 계열의 일원이다. 세포내 단백질 타이로신 키나아제 도메인은 독특한 삽입 도메인에 의해 중단되며, 상기 삽입 도메인은 혈소판 유래된 성장 인자 수용체(PDGFR), 줄기 세포 성장 인자 수용체(c-키트) 및 지느러미-형 사이토카인 수용체(FLT3)를 포함하는 다른 연관된 RTK 부류 III 계열 구성원들 중에 또한 존재한다. 이러한 성장 인자 수용체 계열 중의 구조적 상동성에도 불구하고, 이들은 독특한 조직-특이적 작용을 갖는다. CSF-1R은 단핵구 계통 및 여성 생식관 및 태반 중의 세포 상에서 주로 발현된다. 또한 CSF-1R의 발현은 평활근 세포의 부분집합인 랑게르한스 세포(문헌[Inaba, T., et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 5693-5699]), B 세포(문헌[Baker, A.H., et al., Oncogene 8 (1993) 371-378]) 및 미세아교세포(문헌[Sawada, M., et al., Brain Res. 509 (1990) 119-124])에서 보고되었다.

CSF-1R 신호전달의 주요 생물 효과는 조혈 전구 세포의 대식세포 계통(파골세포 포함)으로의 분화, 증식, 이동 및 생존이다. CSF-1R의 활성화는 그의 리간드인 M-CSF에 의해 매개된다. CSF-1R에 대한 M-CSF의 결합은 동종이량체의 형성 및 타이로신 인산화에 의한 키나아제의 활성화를 유도한다(문헌[Stanley, E.R., et al., Mol. Reprod. Dev. 46 (1997) 4-10]). 추가의 신호전달은 각각 PI3K/AKT 및 Ras/MAPK 경로에 연결된 PI3K 및 Grb2의 p85 서브유닛에 의해 매개된다. 이들 2개의 중요한 신호전달 경로는 증식, 생존 및 세포자멸사를 조절할 수 있다. CSF-1R의 인산화된 세포내 도메인에 결합하는 다른 신호전달 분자는 STAT1, STAT3, PLCy 및 Cb1을 포함한다(문헌[Bourette, R.P. and Rohrschneider, L.R., Growth Factors 17 (2000) 155-166]).

CSF-1R 신호전달은 면역 반응, 뼈 리모델링 및 생식계에서 생리학적 역할을 한다. M-CSF-1(문헌[Pollard, J.W., Mol. Reprod. Dev. 46 (1997) 54-61]) 또는 CSF-1R(문헌[Dai, X.M., et al., Blood 99 (2002) 111-120])에 대한 녹아웃 동물들은 각각의 세포 유형들에서 CSF-1R에 대한 역할과 일치하는 골화석화, 조혈, 조직 대식세포 및 생식 표현형을 갖는 것으로 나타났다.

문헌[Sherr, C.J., et al., Blood 73 (1989) 1786-1793]은 CSF-1 활성을 억제하는 CSF-1R에 대한 일부 항체에 관해 기재한다(문헌[Sherr, C.J. et al., Blood 73 (1989) 1786-1793] 참조). 문헌[Ashmun, R.A., et al., Blood 73 (1989) 827-837]은 CSF-1R 항체에 관한 것이다. 문헌[Lenda, D.M., et al., Journal of Immunology 170 (2003) 3254-3262]은 신장 염증 동안 관(tubular) 세포자멸사를 감소시키는 CSF-1-결함 마우스에서의 감소된 대식세포 보충, 증식 및 활성화에 관한 것이다. 문헌[Kitaura, H., et al., Journal of Dental Research 87 (2008) 396-400]은 치과 교정 중 치아 이동을 억제하는 항-CSF-1 항체에 관한 것이다. 국제특허출원공개 제2001/030381호는 CSF-1 안티센스 뉴클레오타이드만을 개시하면서 안티센스 뉴클레오타이드 및 항체를 포함하는 CSF-1 활성 억제제를 언급한다. 국제특허출원공개 제2004/045532호는 길항물질로서 항-CSF-1-항체만을 개시하는, M-CSF 길항물질에 의한 전이암의 전이 및 골 손실 예방 및 치료에 관한 것이다. 국제특허출원공개 제2005/046657호는 항-CSF-1-항체에 의한 염증성 장 질병의 치료에 관한 것이다. 미국특허출원공개 제2002/0141994호는 콜로니 자극 인자의 억제제에 관한 것이다. 국제특허출원공개 제2006/096489호는 항-CSF-1-항체에 의한 류마티스성 관절염의 치료에 관한 것이다.

본 발명은 기탁된 항체 DSM ACC2921과 동일한 에피토프에 결합하는, 인간 CSF-1R에 결합하는 항체를 포함한다.

하나의 양태에서, 항체는 서열번호 1의 CDR3 영역을 중쇄 가변 도메인 CDR3 영역으로서 포함한다.

하나의 양태에서, 항체는

(a) 중쇄 가변 도메인이 서열번호 1의 CDR3 영역, 서열번호 2의 CDR2 영역 및 서열번호 3의 CDR1 영역을 포함하고, 경쇄 가변 도메인이 서열번호 4의 CDR3 영억, 서열번호 5의 CDR2 영역 및 서열번호 6의 CDR1 영역을 포함하거나,

(b) (a)의 특징을 갖는 항체의 CDR 이식되거나, 인간화되거나, T 세포 에피토프 결실된 항체 변이인

것을 특징으로 한다.

하나의 양태에서, 항체는

(a) 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열이 서열번호 7이고, 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열이 서열번호 8이거나,

것을 특징으로 한다.

하나의 양태에서, 항체는 인간 CSF-1R에 결합하고, 상기 언급된 아미노산 서열 및 아미노산 서열 단편이 인간 IgG1의 하위 부류 또는 인간 IgG4 하위 부류인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 추가의 양태는 본 발명에 따른 항체를 포함하는 약학 조성물이다.

본 발명은 상기 언급된 에피토프 결합 성질 또는 다르게는 상기 언급된 아미노산 서열 및 아미노산 서열 단편에 의해 특징지어지는 인간 CSF-1R에 결합하는 항체를 포함함을 특징으로 하는 약학 조성물을 또한 포함한다.

본 발명은 약학 조성물을 제조하기 위한, 상기 언급된 에피토프 결합 성질 또는 다르게는 상기 언급된 아미노산 서열 및 아미노산 서열 단편에 의해 특징지어지는 인간 CSF-1R에 결합하는 항체를 포함함을 특징으로 하는 항체의 용도를 추가로 포함한다.

본 발명은 CSF-1R 매개된 질병의 치료를 위한, 상기 언급된 에피토프 결합 성질 또는 다르게는 상기 언급된 아미노산 서열 및 아미노산 서열 단편에 의해 특징지어지는 인간 CSF-1R에 결합하는 항체를 포함함을 특징으로 하는 항체의 용도를 또한 포함한다.

본 발명은 암의 치료를 위한, 상기 언급된 에피토프 결합 성질 또는 다르게는 상기 언급된 아미노산 서열 및 아미노산 서열 단편에 의해 특징지어지는 인간 CSF-1R에 결합하는 항체를 포함함을 특징으로 하는 항체의 용도를 또한 포함한다.

본 발명은 골 손실의 치료를 위한, 상기 언급된 에피토프 결합 성질 또는 다르게는 상기 언급된 아미노산 서열 및 아미노산 서열 단편에 의해 특징지어지는 인간 CSF-1R에 결합하는 항체를 포함함을 특징으로 하는 항체의 용도를 또한 포함한다.

본 발명은 전이의 예방 및 치료를 위한, 상기 언급된 에피토프 결합 성질 또는 다르게는 상기 언급된 아미노산 서열 및 아미노산 서열 단편에 의해 특징지어지는 인간 CSF-1R에 결합하는 항체를 포함함을 특징으로 하는 항체의 용도를 또한 포함한다.

본 발명은 염증성 질병의 치료를 위한, 상기 언급된 에피토프 결합 성질 또는 다르게는 상기 언급된 아미노산 서열 및 아미노산 서열 단편에 의해 특징지어지는 인간 CSF-1R에 결합하는 항체를 포함함을 특징으로 하는 항체의 용도를 또한 포함한다.

본 발명의 일 양태는 서열번호 1의 CDR3 영역을 중쇄 가변 도메인 CDR3 영역으로서 포함함을 특징으로 하는, 인간 CSF-1R에 결합하는 항체이다.

본 발명의 추가의 양태는

(a) 중쇄 가변 도메인이 서열번호 1의 CDR3 영역, 서열번호 2의 CDR2 영역 및 서열번호 3의 CDR1 영역을 포함하고, 경쇄 가변 도메인이 서열번호 4의 CDR3 영역, 서열번호 5의 CDR2 영역 및 서열번호 6의 CDR1 영역을 포함하거나,

(b) (a)의 특징을 갖는 항체의 CDR 이식되거나, 인간화되거나, T 세포 에피토프 결실된 항체 변이체인

인간 CSF-1R에 결합하는 항체이다.

하나의 양태에서, 항체는

것을 특징으로 한다.

본 발명의 하나의 양태에서, 본 발명에 따른 항체는 인간 CSF-1R과 적어도 10^-8 mol/l 내지 10^-12 mol/l의 친화성으로 결합한다.

본 발명의 하나의 양태에서, 본 발명에 따른 항체는 인간화된 항체이다.

본 발명의 다른 추가의 양태는 본 발명에 따른 항체의 중쇄 가변 도메인 및/또는 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산이다. 바람직하게는, 핵산은 서열번호 1의 CDR3 영역을 중쇄 CDR3 영역으로서 포함함을 특징으로 하는, 인간 CSF-1R에 결합하는 항체의 중쇄를 암호화한다.

본 발명의 추가의 양태는

본 발명에 따른 항체를 암호화하는 핵산이다.

본 발명은 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에서 본 발명에 따른 핵산을 발현할 수 있는, 핵산을 함유하는 발현 벡터, 및 본 발명에 따른 항체의 재조합 제조를 위한 상기와 같은 벡터를 함유하는 숙주 세포를 또한 제공한다.

본 발명은 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포를 또한 포함한다.

본 발명은 본 발명에 따른 핵산을 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에서 발현시키고 상기 세포 또는 세포 배양 상청액으로부터 본 발명에 따른 재조합 인간 또는 인간화된 항체를 회수함을 특징으로 하는, 상기 항체의 제조 방법을 또한 포함한다. 본 발명은 상기와 같은 재조합 방법에 의해 수득된 항체를 또한 포함한다.

본 발명에 따른 항체는 CSF-1R 표적화 요법이 필요한 환자에게 이점을 나타낸다. 본 발명에 따른 항체는 종양 질병, 특히 암을 앓고 있는 환자에게 이점을 야기하는 신규하고 독창적인 성질을 갖는다.

본 발명은 암에 걸린 것으로 진단된 환자(및 따라서 이러한 암의 치료가 필요한 환자)에게 효과량의 본 발명에 따른 인간 CSF-1R에 결합하는 항체를 투여함을 포함하는, 상기 환자의 치료 방법을 또한 제공한다. 항체를 바람직하게는 약학 조성물로서 투여한다.

본 발명의 추가의 양태는 암을 앓고 있는 환자에게 본 발명에 따른 항체를 투여함을 특징으로 하는, 상기 환자의 치료 방법이다.

본 발명은 암을 앓고 있는 환자의 치료 및 본 발명에 따른 약학 조성물을 제조하기 위한 본 발명에 따른 항체의 용도를 또한 포함한다. 또한, 본 발명은 본 발명에 따른 약학 조성물의 제조 방법을 포함한다.

본 발명은 선택적으로 약학적 목적을 위한 항체 제형화에 유용한 완충액 및/또는 보조제와 함께, 본 발명에 따른 항체를 포함하는 약학 조성물을 또한 포함한다.

본 발명은 약학적으로 허용가능한 담체 중에 본 발명에 따른 항체를 포함하는 약학 조성물을 또한 제공한다. 하나의 양태에서, 약학 조성물은 제조 제품 또는 키트에 포함될 수 있다.

도 1은 10 ㎍/㎖의 농도에서 상이한 항-CSF-1R 단클론 항체들에 의한 처리 하의 3D 배양물 중의 BeWo 종양 세포의 성장 억제를 도시한다.
X 축: 세포의 ATP-함량에 상응하는 생존력 평균 상대 광 단위(RLU)(셀티터글로(CellTiterGlo) 분석).
Y 축: 시험된 탐침: 최소 배지(0.5% FBS), 마우스 IgG1(mIgG1, 10 ㎍/㎖), 마우스 IgG2a(mIgG2a 10 ㎍/㎖), CSF-1 단독, <CSF-1R>7G5.3B6, 및 SC0-02, 클론 2-4A5.
CSF-1 유도 성장의 최고 억제는 본 발명에 따른 항-CSF-1R 항체에 의해 관찰되었다.

정의

용어 "항체"는 비제한적으로 완전 항체, 항체 단편, 인간화된 항체, 키메릭 항체, T 세포 에피토프 결실된 항체, 및 추가로 본 발명에 따른 특징적인 성질들을 유지하는 유전자 조작된 항체를 포함한 다양한 형태의 항체들을 포함한다.

"항체 단편"은 전장 항체의 일부, 바람직하게는 그의 가변 도메인, 또는 적어도 그의 항원 결합 부위를 포함한다. 항체 단편의 예는 다이아바디, 단쇄 항체 분자 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. scFv 항체는 예를 들어 문헌[Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-88]에 개시되어 있다. 또한, 항체 단편은 CSF-1R에 결합하는, 즉 작용성 항원 결합 부위에 대해 V_L 도메인과 함께 조립할 수 있고 이에 의해 상기 성질을 제공할 수 있는 V_H 도메인, 또는 CSF-1R에 결합하는, 즉 작용성 항원 결합 부위에 대해 V_H 도메인과 함께 조립할 수 있고 이에 의해 상기 성질을 제공할 수 있는 V_L 도메인의 특징을 갖는 단쇄 폴리펩타이드를 포함한다.

본 발명에 사용된 용어 "단클론 항체" 또는 "단클론 항체 조성물"은 단일 아미노산 조성의 항체 분자 제제를 지칭한다.

용어 "키메릭 항체"는 통상적으로 재조합 DNA 기법에 의해 제조된, 마우스로부터의 가변 영역, 즉 결합 영역 및 상이한 출처 또는 종으로부터 유래된 불변 영역의 적어도 일부를 포함하는 단클론 항체를 지칭한다. 마우스 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 키메릭 항체가 특히 바람직하다. 상기와 같은 래트/인간 키메릭 항체는 래트 면역글로불린 가변 영역을 암호화하는 DNA 구획 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 암호화하는 DNA 구획을 포함하는 발현된 면역글로불린 유전자의 산물이다. 본 발명에 의해 포함되는 "키메릭 항체"의 다른 형태들은 상기 부류 또는 하위 부류가 원래 항체의 것으로부터 변형되거나 변화된 것들이다. 상기와 같은 "키메릭" 항체를 또한 "부류-변환된 항체"라 지칭한다. 키메릭 항체의 제조 방법은 현재 당해 분야에 널리 공지된 통상적인 재조합 DNA 및 유전자 형질감염 기법들을 포함한다. 예를 들어 문헌[Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855], 미국특허 제5,202,238호 및 미국특허 제5,204,244호를 참조한다.

본 명세서에 사용된 용어 "CDR-이식된 변이"는 통상적으로 재조합 DNA 기법에 의해 제조된, 하나의 공급원 또는 종으로부터의 영역(CDR 또는 초가변영역) 및 상이한 공급원 또는 종으로부터의 골격 영역(FR)을 상보적으로 결정함을 포함하는 항체의 가변 도메인을 지칭한다. 뮤린 CDR 및 인간 FR을 포함하는 가변 도메인의 CDR-이식된 변이가 바람직하다.

본 명세서에 사용된 용어 "T-세포 에피토프 결실된 변이"는 인간 T-세포 에피토프(MHC 클래스 II 분자에 결합하는 능력을 갖는 가변 도메인 내의 펩타이드 서열)의 제거에 의해 제거되거나 감소된 면역성이 개질된 항체의 가변 도메인을 지칭한다. 이 방법에 의해 가변 도메인의 아미노산 측쇄와 MHC 클래스 II 결합 그루브를 갖는 특정 결합 포켓 사이의 상호작용이 확인된다. 확인된 면역원성 영역은 면역성을 제거하도록 돌연변이된다. 이러한 방법은 통상적으로, 예를 들어 국제특허출원공개 제98/52976호에 기재되었다.

본 명세서에 사용된 용어 "인간화된 변이"는 항체의 가변 도메인을 지칭하고, 이는 비-인간 기원의 상보성 결정 영역(CDR)으로부터, 예를 들어 비-인간 종으로부터, 및 인간 기원의 골격 영역(FR)으로부터 재구성되었고, 이는 원래의 비-인간 가변 도메인의 결합 친화력 및 특이성을 또한 재구성하거나 향상시키기 위해 추가로 개질되었다. 이러한 인간화된 변이는 통상적으로 재조합 DNA 기업에 의해 제조된다. 모 비-인간 가변 도메인의 친화력 및 특이성의 재구성은 중요한 단계이고, 상이한 방법이 현재 사용된다. 하나의 방법에서, 돌연변이, 즉 복귀돌연변이의 도입이 비-인간 CDR뿐만 아니라 인간 FR에서 이익인지 아닌지 결정되었다. 이러한 복귀돌연변이에 적합한 위치는 예를 들어, 서열 또는 상동성 분석, 인간 골격의 선택(고정된 골격 접근; 상동성 매칭 또는 최적합), 공통 서열의 사용, 여러 상이한 인간 단클론 항체로부터 FR의 선택, 또는 인간 단클론 항체에서 발견된 가장 공통의 잔기를 갖는 3차원 표면상에서 비-인간 잔기의 대체("재표면처리" 또는 "베니어링(veneering)")에 의해 확인될 수 있다.

본 발명에 따른 항체는 또한 "보존적인 서열 변형", 즉 본 발명에 따른 항체의 상기 언급한 특징에 영향을 미치지 않거나 상기 특징을 변경시키지 않는 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열 변형을 갖는 항체를 포함한다. 변형을 당해 분야에 공지된 표준 기법, 예를 들어 부위-지정 돌연변이유발 및 PCR-매개된 돌연변이유발에 의해 도입시킬 수 있다. 보존적인 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환된 것들을 포함한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 계열들은 당해 분야에서 정의되었다. 이들 계열은 염기성 측쇄(예를 들어 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄(예를 들어 글리신, 아스파라진, 글루타민, 세린, 쓰레오닌, 타이로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예를 들어 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지된 측쇄(예를 들어 쓰레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산들을 포함한다. 따라서, 인간 항-CSF-1R 항체 중의 예견되는 불필수 아미노산 잔기를 바람직하게는 동일한 측쇄 계열로부터의 또 다른 아미노산 잔기로 치환시킬 수 있다.

아미노산 치환을 문헌[Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327] 및 문헌[Queen, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033]에 개시된 바와 같이 분자 모델링에 근거한 돌연변이유발에 의해 수행할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "CSF-1R"은 인간 CSF-1R(서열번호 15)을 나타내고, CSF-1R(유의어: CSF-1 수용체 M-CSF 수용체; 대식세포 콜로니 자극 인자-1 수용체, EC 2.7.10.1, Fms 원 종양 형성 유전자, c-fms, 스위스 프롯 P07333, CD115)은 1986년 이래로 공지되어 있다(문헌[Coussens, L., et al., Nature 320 (1986) 277-280]). CSF-1R은 성장 인자이며 c-fms 원 종양 형성 유전자에 의해 암호화된다(예를 들어, 문헌[Roth, P. and Stanley, E.R., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 181 (1992) 141-67]에서 검토되었다).

CSF-1R은 M-CSF(대식세포 콜로니 자극 인자, 또한 CSF-1이라 칭한다)에 대한 수용체이며 이 사이토카인의 생물학적 효과를 매개한다(문헌[Sherr, C.J., et al., Cell 41 (1985) 665-676]). 콜로니 자극 인자-1 수용체(또한 c-fms라 칭함)의 클로닝이 최초로 문헌[Roussel, M.F., et al., Nature 325 (1987) 549-552]에 개시되었다. 상기 문헌에서, CSF-1R은, Cb1에 결합하고 이에 의해 수용체 하향 조절을 조절하는 억제성 타이로신 969 인산화의 상실을 비롯한 단백질의 C-말단 꼬리의 변화에 따른 형질전환 잠재력을 갖는 것으로 나타났다(문헌[Lee, P.S., et al., Embo J. 18 (1999) 3616-3628]).

CSF-1R은 단일 쇄, 막전위 수용체 타이로신 키나아제(RTK)이며 수용체의 세포외 부분 중의 반복된 Ig-형 도메인을 특징으로 하는 면역글로불린(Ig) 동기 함유 RTK 계열의 일원이다. 세포내 단백질 타이로신 키나아제 도메인은 독특한 삽입 도메인에 의해 중단되며, 상기 삽입 도메인은 혈소판 유래된 성장 인자 수용체(PDGFR), 줄기 세포 성장 인자 수용체(c-키트) 및 지느러미-형 사이토카인 수용체(FLT3)를 포함하는 다른 관련된 RTK 부류 III 계열 구성원들 중에 또한 존재한다. 이러한 성장 인자 수용체 계열 가운데 구조적 상동성에도 불구하고, 이들은 독특한 조직-특이성 작용을 갖는다. CSF-1R은 단핵구 계통 및 여성 생식관 및 태반 중의 세포 상에서 주로 발현된다. 또한, CSF-1R의 발현은 평활근 세포의 부분집합인 피부내 랑게르한스 세포(문헌[Inaba, T., et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 5693-5699]), B 세포(문헌[Baker, A.H., et al., Oncogene 8 (1993) 371-378]) 및 미세아교세포(문헌[Sawada, M., et al., Brain Res. 509 (1990) 119-124])에서 보고되었다.

본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "인간 CSF-1R에 결합하는" 또는 "인간 CSF-1R 또는 항-CSF-1R에 결합하는"은 인간 CSF-1R 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 나타낸다. 결합 친화성은 35℃에서 1.0 x 10^-8 mol/l 이하의 KD 값, 바람직하게는 35℃에서 1.0 x 10^-9 mol/l 이하의 KD 값이다. 결합 친화성은 35℃에서 표준 결합 어세이, 예를 들어 표면 플라스몬 공명 기법(비아코어(Biacore: 등록상표))에 의해 측정된다(실시예 4 참고).

용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정인자를 나타낸다. 에피토프는 통상적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자들의 화학적으로 활성인 표면 그루핑(grouping)으로 이루어지며, 통상적으로 에피토프는 특정한 3차원 구조 특징뿐만 아니라 특정 전하 특징을 갖는다. 형태상 및 비형태상 에피토프는 상기 형태상 에피토프에 대한 결합이 변성 용매의 존재 하에서 상실되지만 상기 비형태상 에피토프는 그렇지 않다는 점에서 구별된다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체는 고유 및 변성된 CSF-1R에 특이적으로 결합한다.

본원에 사용된 용어 "기탁된 항체 DSM ACC2921과 동일한 에피토프에 결합하는"은 항체 <CSF-1R>7G5.3B6(기탁 번호 DSM ACC2921)가 CSF-1R 상에서 동일한 에피토프에 결합하는 본 발명의 항-CSF-1R-항체를 나타낸다. 본 발명의 항-CSF-1R 항체의 에피토프 결합 성질은 당해 분야에 공지된 기법을 사용하여 결정될 수 있다. CSF-1R 항체는 시험관 내 경쟁 결합 억제 어세이에서 25℃에서 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 측정되어 CSF-1R에 대한 <CSF-1R>7G5.3B6(기탁 번호 DSM ACC2921) 항체의 결합을 억제하는 시험 항체의 능력을 결정한다. 이는 예를 들어 실시예 5에서와 같이 비아코어 어세이(스웨덴 웁살라 소재, 파마시아 바이오센서(Pharmacia Biosensor) AB)에 의해 조사될 수 있다. 실시예 5에서, 결합된 <CSF-1R>7G5.3B6(기탁 번호 DSM ACC2921)과 경쟁하는 본 발명의 CSF-1R 항체의 기대된 결합 반응의 백분율(%)은 "100*상대 반응(초기 통상적인 안정성)/rMax"에 의해 계산되었고, 이때 rMAX는 비아코어 어세이 에피토프 맵핑 설명서에 기재된 바와 같은 "상대 반응(후기 통상적인 안정성)*항체 분자량/항원 분자량"에 의해 계산되었다. 최소 결합 반응은 동일한 항체 1 및 항체 2의 쌍으로부터 또한 계산되었다(실시예 5 참고). 이의 수득된 최대 값 +100%, 바람직하게는 50%는 유의한 경쟁, 및 이에 따른 동일한 에피토프에 대한 유의한 결합을 위한 한계 값으로서 설정된다(항체 <CSF-1R>7G5.3B6에 대한 계산된 한계 값은 3+3=6, 바람직하게는 3+1.5=4.5이다. 실시예 5 참고). 이와 같이, "<CSF-1R>7G5.3B6(기탁 번호 DSM ACC2921)과 동일한 에피토프에 결합하는"을 특징으로 하는, 인간 CSF-1R에 결합하는 항체는 6 미만, 바람직하게는 4.5 미만의 예상된 결합 반응의 %를 갖는다(6 미만, 바람직하게는 4.5 미만의 예상된 결합 반응의 %).

하나의 양태에서, 본 발명에 따른 항체는 인간 CSF-1R에 결합하기 위한 기탁된 항체 DSM ACC2921과 경쟁한다. 이러한 결합 경쟁은 당해 분야에 공지된 기법을 사용하여 결정될 수 있다. CSF-1R 항체는 25℃에서 시험관 내 경쟁 결합 억제 어세이에서 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 측정되어 인간 CSF-1R에 대한 항체 <CSF-1F>7G5.3B6(기탁 번호 DSM ACC2921)의 결합을 억제하기 위한 시험 항체의 능력을 결정할 수 있다. 이는, 예를 들어 실시예 5에서와 같이, 비아코어 어세이(스웨덴 웁살라 소재, 파마시아 바이오센서 AB)에 의해 조사될 수 있다.

본 발명에 사용된 "가변 도메인"(경쇄의 가변 도메인(V_L), 중쇄의 가변 도메인(V_H))은 항원에 대한 항체의 결합에 직접 관련되는 경쇄 및 중쇄 도메인 쌍의 각각을 나타낸다. 가변 경쇄 및 중쇄 도메인은 동일한 일반 구조를 가지며 각각의 도메인은, 서열들이 광범위하게 보존되고 3개의 "초가변 영역"(또는 상보성 결정 영역, CDR)에 의해 연결되는 4개의 골격(FR) 영역을 포함한다. 골격 영역은 β-시트 형태를 채용하며 CDR은 β-시트 구조를 연결하는 루프를 형성할 수도 있다. 각 쇄 중에서 CDR은 골격 영역에 의해 그의 3차원 구조를 유지하며 다른 쇄로부터의 CDR과 함께 항원 결합 부위를 형성한다. 항체의 중쇄 및 경쇄 CDR3 영역은 본 발명에 따른 항체의 결합 특이성/친화성에 특히 중요한 역할을 하며, 따라서 본 발명의 추가의 목적을 제공한다.

"항체의 항원 결합 부분"이란 용어는 본 발명에 사용되는 경우 항원 결합을 맡고 있는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 항체의 항원 결합 부분은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. "골격" 또는 "FR" 영역은 본 발명에서 정의한 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 영역들이다. 따라서, 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인은 N-말단에서부터 C-말단까지 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 특히, 상기 중쇄의 CDR3은 항원 결합에 가장 기여하는 영역이며 항체의 성질을 정의한다. CDR 및 FR 영역은 문헌[Kabat, E., A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]의 표준 정의 및/또는 "초가변 루프"로부터의 잔기들에 따라 결정된다.

본 발명에 사용된 용어 "핵산" 또는 "핵산 분자"는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함함을 의미한다. 핵산 분자는 단일 가닥이거나 이중 가닥일 수 있으나, 바람직하게는 이중 가닥 DNA이다.

본원에 사용된 용어 "아미노산"은 알라닌(3 글자 코드: ala, 한 글자 코드: A), 아르기닌(arg, R), 아스파라긴(asn, N), 아스파르트산(asp, D), 시스테인(cys, C), 글루타민(gln, Q), 글루탐산(glu, E), 글리신(gly, G), 히스티딘(his, H), 이소류신(ile, I), 류신(leu, L), 리신(lys, K), 메티오닌(met, M), 페닐알라닌(phe, F), 프롤린(pro, P), 세린(ser, S), 쓰레오닌(thr, T), 트립토판(trp, W), 타이로신(tyr, Y) 및 발린(val, V)을 포함하는 천연 발생 카복시 α-아미노산의 군을 나타낸다.

"면역접합"은 비제한적으로 세포독성제를 포함하는, 하나 이상의 이종 분자와 접합된 항체이다.

"개체" 또는 "대상"은 포유동물이다. 포유동물은 비제한적으로, 가축(예를 들어, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예를 들어, 인간, 및 원숭이와 같은 비-인간 영장류), 토끼 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함한다. 특정 양태에서, 개체 또는 대상은 인간이다.

"단리된" 항체는 그것의 천연의 환경의 성분으로부터 분리된 것이다. 일부 양태에서, 항체는 예를 들어, 전기영동(예컨대, SDS-페이지, 등전점 전기영동(IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피(예컨대, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 결정된 바와 같이 95% 또는 99% 초과의 순도에서 정제된다. 항체 순도의 평가를 위한 방법의 검토를 위해 예를 들어, 문헌[Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)]을 참고한다.

"단리된" 핵산은 그것의 천연의 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 나타낸다. 단리된 핵산은 통상적으로 핵산 분자를 함유하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함하지만, 핵산 분자는 그것의 천연의 염색체의 위치와 상이한 염색체의 위치 또는 염색체 외에 존재한다.

"항-CSF-1R 항체를 암호화하는 단리된 핵산"은 단일 벡터 또는 분리 벡터 중 이러한 핵산 분자, 및 숙주 세포 중 하나 이상의 위치에 존재하는 이러한 핵산 분자를 포함하는, 항체 중쇄 및 경쇄(또는 이의 단편)를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 나타낸다.

"네이티브 항체"는 다양한 구조를 갖는 천연적으로 발생하는 면역글로불린 분자를 나타낸다. 예를 들어, 네이티브 IgG 항체는 이황화-결합된 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 이루어진, 약 150,000 달톤의 헤테로4합체 당단백질이다. N-말단에서부터 C-말단까지, 각각의 중쇄는 가변 영역(VH)(또한 가변 중 도메인 또는 중쇄 가변 도메인이라 불림), 및 이어서, 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게는, N-말단에서부터 C-말단까지, 각각의 경쇄는 가변 영역(VL)(또한 가변 경 도메인 또는 경쇄 가면 도메인이라 불림), 및 이어서, 불변 도메인(CL)을 갖는다. 항체의 경쇄는 그것의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로, 2개의 유형(카파(κ) 및 람다(λ)로 지칭됨) 중 하나에 할당될 수 있다.

용어 "패키지 삽입"은 이러한 치료 제품의 사용에 관한 지시, 용법, 복용량, 투여, 조합 치료, 금기 및/또는 경고에 관한 정보를 함유하는, 치료 제품의 통상적인 패키지에 포함된 관례적인 지시를 나타내기 위해 사용되었다.

참조 폴리펩티드 서열에 대하여 "아미노산 서열 동일성의 %"는 최대 % 서열 동일성을 달성시키기 위해, 필요한 경우, 서열을 정렬하고 갭을 도입한 후, 참고 폴리펩티드 서열 중 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 중 아미노산의 %로서 정의되고, 서열 동일성의 부분으로서 임의의 보존적인 치환기를 고려하지 않는다. 아미노산 서열 동일성의 %를 결정하는 목적을 위한 정렬은 예를 들어, 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램, 예컨대 BLAST, BLAST-2, 얼라인(ALIGN) 또는 메그얼라인(DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여, 당해 분야에 공지된 다양한 방법으로 성취될 수 있다. 당해 분야의 숙련자는 비교된 서열의 전장상에서 최대 정렬을 성취하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하는, 서열 정렬을 위한 적합한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적을 위해, 아미노산 서열 동일성의 %가 서열 비교 컴퓨터 그로프램 얼라인-2를 사용하여 발생된다. 얼라인-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제네테크 인코포레이티드(Genetech, Inc.)에 의해 저술되었고, 소스 코드는 미국 저작권 협회(미국 워싱톤 D.C., 20559)에서 사용자 문서로 기재되었고, 이는 미국 저작권 등록 번호 TXU510087호로 등록되었다. 얼라인-2 프로그램은 제네테크 인코포레이티드(미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재)로부터 공개적으로 이용가능하거나, 소스 코드로부터 편집될 수 있다. 얼라인-2 프로그램은 디지탈 UNIX V4.0D를 포함하는, UNIX 작동 시스템상에서 사용하기 위해 편집되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 얼라인-2 프로그램에 의해 설정되고 변하지 않는다.

얼라인-2가 아미노산 서열 비교를 위해 사용된 경우에, 주어진 아미노산 서열 B에 대하여 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성의 %(다르게는, 주어진 아미노산 서열 B에 대하여 특정 아미노산 서열에 동일성의 %를 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 표현할 수 있다)는 다음과 같이 계산되었다:

100 * X/Y 분율

이때, X는 프로그램이 A 및 B의 정렬인 서열 정렬 프로그램 얼라인-2에 의해 동일한 점수 매겨진 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서 아미노산 잔기의 전체 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않고, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성의 %가 A의 B에 대한 아미노산 서열 동일성의 %와 같지 않음이 인정될 수 있다. 특별히 달리 언급하지 않으면, 본원에 사용된 아미노산 서열 동일성의 모든 %값은 얼라인-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 앞으로의 단락에 즉시 기재된 바와 같이 수득되었다.

조성 및 방법

하나의 양태에서, 본 발명은 기탁된 항체 DSM ACC2921과 동일한 에피토프에 부분적으로 근거한다. 본 발명의 항체는 예를 들어, 암, 염증성 질병 또는 골 손실의 진단 또는 치료를 위하거나, 전이의 예방 또는 치료에 유용하다.

예시적인 항- CSF - IR 항체

하나의 양태에서, 본 발명은 인간 CSF-1R에 결합하는 항체를 제공한다. 특정 양태에서, 항-CSF-1R 항체는 기탁된 항체 DSM ACC2921과 동일한 에피토프에 결합하는 특징이 있다.

본 발명의 또 다른 양태는

인간 CSF-1R에 결합하는 항체이다.

본 발명의 또 다른 양태는

인간 CSF-1R에 결합하는 항체이고, 이는 하기 특징 중 하나 이상을 갖는다(실시예 2, 3, 4, 6, 7 및 8에 기재된 어세이로 측정됨):

- 항-CSF-1R 항체가 25 ng/ml 이하의 IC50, 하나의 양태에서, 20 ng/ml 이하의 IC50으로 CSF-1R에 결합하는 CSF-1을 억제하는 특징;

- 항-CSF-1R 항체가 100 ng/ml 이하의 IC50, 하나의 양태에서, 50 ng/ml 이하의 IC50으로 CSF-1-유도된 CSF-1R 인산화(NIH3T3-CSF-1R 재조합 세포에서)를 억제하는 특징;

- 항-CSF-1R 항체가 인간 CSF-1R(서열번호 15)을 80% 이상(항체의 부재와 비교하여), 바람직하게는 90% 이상만큼 발현하는 재조합 NIH3T3 세포의 성장을 억제하는 특징;

- 항-CSF-1R이 BeWo 종양 세포(ATCC CCL-98)의 성장을 80% 이상(10 ㎍/ml의 항체 농도에서, 항체의 부재와 비교하여), 바람직하게는 90% 이상만큼 억제하는 특징;

- 항-CSF-1R 항체가 대식세포 분화를 억제하는 특징(하나의 양태에서, 항-CSF-1R 항체는 1.5 nM 이하의 IC50, 바람직하게는 1.0 nM 이하의 IC50으로 단핵구의 생존을 억제한다); 및

- 항-CSF-1R 항체가 35℃에서 KD = 1.0 x 10^-9mol/l 이하의 결합 친화력으로 인간 CSF-1R에 결합하는 특징.

다른 양태에서, 본 발명에 따른 항-CSF-1R 항체는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열에서 (a) 서열번호 3과 동일하거나, 이에 대해 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 CDR1H, (b) 서열번호 2와 동일하거나, 이에 대해 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 CDR2H, 및 (c) 서열번호 1과 동일하거나, 이에 대해 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 CDR3H를 포함한다.

특정 양태에서, (a) 서열번호 3과 동일하거나, 이에 대해 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 CDR1H, (b) 서열번호 2와 동일하거나, 이에 대해 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 CDR2H, 및 (c) 서열번호 1과 동일하거나, 이에 대해 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 CDR3H를 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열은 참고 서열과 비교하여 치환(예를 들어, 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 이러한 서열을 포함하는 항 CSF-1R 항체는 CSF-1R에 결합하는 능력을 유지한다.

또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 항-CSF-1R 항체는 경쇄 가변 도메인(VL) 서열에서 (a) 서열번호 6과 동일하거나, 이에 대해 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 CDR1L, (b) 서열번호 5와 동일하거나, 이에 대해 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 CDR2L, 및 (c) 서열번호 4와 동일하거나, 이에 대해 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 CDR3L을 포함한다.

특정 양태에서, (a) 서열번호 6과 동일하거나, 이에 대해 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 CDR1L, (b) 서열번호 5와 동일하거나, 이에 대해 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 CDR2L, 및 (c) 서열번호 4와 동일하거나, 이에 대해 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 CDR3L을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL) 서열은 참고 서열과 비교하여 치환(예를 들어, 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 이러한 서열을 포함하는 항 CSF-1R 항체는 CSF-1R에 결합하는 능력을 유지한다.

또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 항-CSF-1R 항체는

- 중쇄 가변 도메인(VH) 서열에서 (a) 서열번호 3과 동일하거나, 이에 대해 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 CDR1H, (b) 서열번호 2와 동일하거나, 이에 대해 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 CDR2H, 및 (c) 서열번호 1과 동일하거나, 이에 대해 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 CDR3H를 포함하고, 경쇄 가변 도메인(VL) 서열에서 (d) 서열번호 6과 동일하거나, 이에 대해 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 CDR1L, (e) 서열번호 5와 동일하거나, 이에 대해 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 CDR2L, 및 (f) 서열번호 4와 동일하거나, 이에 대해 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 CDR3L을 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 항-CSF-1R 항체는

- 중쇄 가변 도메인(VH) 서열에서 (a) 서열번호 3과 동일하거나, 이에 대해 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 CDR1H, (b) 서열번호 2와 동일하거나, 이에 대해 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 CDR2H, 및 (c) 서열번호 1과 동일하거나, 이에 대해 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 CDR3H를 포함하고, 경쇄 가변 도메인(VL) 서열에서 (d) 서열번호 6과 동일하거나, 이에 대해 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 CDR1L, (e) 서열번호 5와 동일하거나, 이에 대해 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 CDR2L, 및 (f) 서열번호 4와 동일하거나, 이에 대해 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 CDR3L을 포함하고,

항-CSF-1R 항체는 하기 특징 중 하나 이상을 갖는다(실시예 2, 3, 4, 6, 7 및 8에 기재된 어세이에서 측정됨):

- 항-CSF-1R 항체가 인간 CSF-1R(서열번호 15)을 발현하는 재조합 NIH3T3 세포의 성장을 80% 이상(항체의 부재와 비교하여), 바람직하게는 90% 이상만큼 억제하는 특징;

- 항-CSF-1R 항체가 BeWo 종양 세포(ATCC CCL-98)의 성장을 80% 이상(10 ㎍/ml의 항체 농도에서, 항체의 부재와 비교하여), 바람직하게는 90% 이상만큼 억제하는 특징;

- 항-CSF-1R 항체가 대식세포 분화를 억제하는 특징(하나의 양태에서, 항-CSF-1F 항체는 1.5 nM 이하의 IC50, 바람직하게는 1.0 nM 이하의 IC50으로 단핵구의 생존을 억제한다); 및

- 항-CSF-1R 항체가 35℃에서 KD = 1.0 x 10^-9 mol/l 이하의 결합 친화력으로 인간 CSF-1R에 결합하는 특징.

재조합 방법 및 조성

본 발명에 따른 항체를 바람직하게는 재조합 수단에 의해 생산한다. 상기와 같은 재조합 방법은 당해 분야의 발달 수준으로 널리 공지되어 있으며 원핵생물 및 진핵생물 세포에서의 단백질 발현에 이어서, 상기 항체 폴리펩타이드를 단리하고 통상적으로 약학적으로 허용 가능한 순도로 정제함을 포함한다. 단백질 발현을 위해서, 경쇄 및 중쇄 또는 그의 단편을 암호화하는 핵산을 표준 방법에 의해 발현 벡터에 삽입한다. 발현을 CHO 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, HEK293 세포, COS 세포, 효모, 또는 에스케리키아 콜라이 세포와 같은 적합한 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에서 수행하고, 상기 세포(상청액 또는 용해 후 세포)로부터 항체를 회수한다.

항체의 재조합 생산은 당해 분야의 발달 수준으로 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202]; 문헌[Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282]; 문헌[Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161]; 문헌[Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880]에 개시되어 있다.

항체들은 완전 세포 중에, 세포 용해물 중에, 또는 부분적으로 정제되거나 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 정제를 다른 세포 성분 또는 다른 오염물질, 예를 들어 다른 세포 핵산 또는 단백질을 제거하기 위해서, 표준 기법, 예를 들어 알칼리성/SDS 처리, CsCl 분염법(banding), 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 젤 전기영동 및 당해 분야에 널리 공지된 다른 기법들에 의해 수행한다. 문헌[Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)]을 참조한다.

NS0 세포에서의 발현은 예를 들어, 문헌[Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123] 및 문헌[Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270]에 개시되어 있다. 일시적인 발현은 예를 들어, 문헌[Durocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9]에 개시되어 있다. 가변 도메인의 클로닝은 문헌[Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837]; 문헌[Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289] 및 문헌[Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87]에 개시되어 있다. 바람직한 일시적인 발현 시스템(HEK 293)은 문헌[Schlaeger, E.-J. and Christensen, K., in Cytotechnology 30 (1999) 71-83] 및 문헌[Schlaeger, E.-J., in J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199]에 개시되어 있다.

원핵생물에 적합한 조절 서열은 예를 들어, 프로모터, 선택적인 작동 유전자 서열 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵생물 세포는 프로모터, 인핸서 및 폴리아데닐화 신호를 사용하는 것으로 공지되어 있다.

핵산은 또 다른 핵산 서열과 작용 관계에 놓일 때 "작동적으로 결합된다". 예를 들어, 전-서열 또는 분비 리더용 DNA가 폴리펩타이드의 분비에 관여하는 전구 단백질로서 발현되는 경우, 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동적으로 결합되거나; 또는 프로모터 또는 인핸서가 서열의 전사에 영향을 미치는 경우, 암호화 서열에 작동적으로 결합되거나; 리보솜 결합 부위가 번역을 촉진하기 위해서 위치되는 경우, 암호화 서열에 작동적으로 결합된다. 일반적으로 "작동적으로 결합된"은 결합되는 DNA 서열이 연속적이고, 분비 리더의 경우에, 연속적이고 판독 프레임 중에 있음을 의미한다. 그러나, 인핸서는 연속적일 필요는 없다. 결합은 편리한 제한 부위에서의 결합에 의해 수행된다. 상기와 같은 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커가 통상적인 실시에 따라 사용된다.

단클론 항체를 통상적인 면역글로불린 정제 과정, 예를 들어, 단백질 A-세파로스, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 젤 전기영동, 투석, 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 배양 배지로부터 적합하게 분리시킨다. 단클론 항체를 암호화하는 DNA 또는 RNA를 쉽게 단리하고 통상적인 과정을 사용하여 서열화한다. 하이브리도마 세포는 상기와 같은 DNA 및 RNA의 공급원으로서 작용할 수 있다. DNA가, 일단 단리되면, 발현 벡터에 삽입시킬 수 있고, 이어서, 달리 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 숙주 세포, 예를 들어 HEK 293 세포, CHO 세포, 또는 골수종 세포에 형질감염시켜 숙주 세포에서 재조합 단클론 항체의 합성을 획득한다.

항-CSF-1R 항체의 아미노산 서열 변이를 암호화하는 핵산 분자는 당해 분야에 공지된 다수의 방법에 의해 제조된다. 이들 방법은 비제한적으로, 천연 공급원(아미노산 서열 변이가 자연적으로 발생하는 경우에서)으로부터 단리되거나 올리고뉴클레오티드-매개된(또는 사이트-유도된) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발, 및 인간화된 항-CSF-1R 항체의 초기 제조된 변이 또는 비변이의 카세트 돌연변이유발에 의한 제조를 포함한다.

본 발명에 따른 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 프로모토, 전사 시작, 불변 영역, 3' 전사되지 않은 영역, 폴리아데닐화 및 전사 종결의 서열과 조합되어 발현 벡터 구조체를 형성한다. 중쇄 및 경쇄 발현 구조체는 숙주 세포로 같이 형질감염되거나, 순차적으로 형질 감염되거나, 개별적으로 형질감염되고, 이어서, 융합되어 쇄를 둘다 발현하는 단일 숙주 세포를 형성하는 단일 벡터로 조합될 수 있다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"이란 표현은 호환적으로 사용되며 모든 상기와 같은 명칭들은 자손을 포함한다. 따라서, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"란 단어는 1차 대상 세포 및 전이 수에 관계없이 상기로부터 유래한 배양물을 포함한다. 모든 자손이, 계획적이거나 우연한 돌연변이로 인해, DNA 함량이 정확하게 동일할 수는 없는 것이 또한 이해된다. 원래 형질전환된 세포에 대해 선별된 바와 동일한 작용 또는 생물 활성을 갖는 변이 자손들이 포함된다.

항체의 "Fc 부분"은 항원에 대한 항체의 결합에 직접 관련되지 않지만, 다양한 효과기 작용을 나타낸다. "항체의 Fc 부분"은 숙련가에게 널리 공지된 용어이며 항체의 파파인 절단을 기초로 하여 정의된다. 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라, 항체 또는 면역글로불린을 소정 부류들(IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM)로 분류하며, 이들 중 여러 개를 하위 부류들(이소타입), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가 분류할 수도 있다. 중쇄 불변 영역에 따라, 상이한 부류의 면역글로불린들을 각각 α, δ, ε, γ 및 μ라 칭한다. 항체의 Fc 부분은 보체 활성화, C1q 결합 및 Fc 수용체 결합에 근거하여 ADCC(항체-의존성 세포-매개된 세포독성) 및 CDC(보체-의존성 세포독성)에 직접 관여한다. 보체 활성화(CDC)는 대부분의 IgG 항체 하위 부류의 Fc 부분에 대한 보체 인자 C1q의 결합에 의해 개시된다. 보체 시스템에 대한 항체의 영향이 일부 조건들에 의존하는 반면, C1q에 대한 결합은 Fc 부분 중의 한정된 결합 부위들에 의해 유발된다. 상기와 같은 결합 부위들은 당해 분야의 발달 수준으로 공지되어 있으며 문헌[Boackle, R.J., et al., Nature 282 (1979) 742-743], 문헌[Lukas, T.J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560], 문헌[Brunhouse, R., and Cenbra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917], 문헌[Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344], 문헌[Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004], 문헌[Idusogie, E.E., et al., J. Immunol.164 (2000) 4178-4184], 문헌[Hezareh, M., et al., J. Virology 75 (2001) 12161-12168], 문헌[Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324], 유럽특허 제0307434호에 개시되어 있다. 상기와 같은 결합 부위는 예를 들어 L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 및 P329(넘버링은 카밧 이에이(Kabat, E.A.)(하기 참조)의 EU 인덱스에 따른다)이다. 하위 부류 IgG1, IgG2 및 IgG3의 항체들은 일반적으로 보체 활성화 및 C1q 및 C3 결합을 나타내는 반면, IgG4는 보체 시스템을 활성화하지 않고 C1q 및 C3에 결합하지 않는다.

하나의 양태에서, 본 발명에 따른 항체는 인간 기원으로부터 유래된 Fc 부분 및 바람직하게는 인간 불변 영역의 모든 다른 부분을 포함한다. 본 발명에 사용된 바와 같이, "인간 기원으로부터 유래된 Fc 부분"이란 용어는 하위 부류 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 인간 항체의 Fc 부분, 바람직하게는 인간 IgG1 하위 부류의 Fc 부분, 인간 IgG1 하위 부류로부터의 돌연변이된 Fc 부분(바람직하게는 L234A + L235A에 대해 돌연변이됨), 인간 IgG4 하위 부류로부터의 Fc 부분이거나 인간 IgG4 하위 부류로부터의 돌연변이된 Fc 부분(S228P에 대해 돌연변이됨)인 Fc 부분을 나타낸다. 대개 서열번호 11(인간 IgG1 하위 부류), 서열번호 12(L234A 및 L235A 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 하위 부류), 서열번호 13(인간 IgG4 하위 부류) 또는 서열번호 14(S228P 돌연변이를 갖는 인간 IgG4 하위 부류)의 인간 중쇄 불변 영역이 바람직하다.

하나의 양태에서, 본 발명에 따른 항체는 불변 쇄가 인간 기원의 것임을 특징으로 한다. 상기와 같은 불변 쇄는 당해 분야의 발달 수준으로 널리 공지되어 있으며 예를 들어 카밧 이에이에 의해 개시되어 있다(예를 들어, 문헌[Johnson, G. and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218] 참조). 예를 들어, 유용한 인간 중쇄 불변 영역은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 유용한 인간 경쇄 불변 영역은 서열번호 10의 카파-경쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 포함한다. 항체가 마우스 기원의 것이고, 카밧에 따른 마우스 항체의 항체 가변 서열 프레임을 포함하는 것이 추가로 바람직하다.

면역접합체

본 발명은 또한 하나 이상의 세포 독성제, 예를 들어 화합 요법제 또는 약물, 성장 억제제, 독성제(예컨대, 단백질 독성제, 박테리아, 곰팡이, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독성제, 또는 이들의 단편), 또는 방사성 동위원소에 접합된 본원의 항-CSF-1R 항체를 포함하는 면역접합체를 제공한다.

하나의 양태에서, 면역접합체는 항체-약물 접합체(ADC)이고, 이는 항체가 비제한적으로, 메이탄시노이드(미국특허출원 제5,208,020호, 제5,416,064호 및 유럽특허출원 제0 425 235 B1호 참조); 아우리스타틴, 예를 들어, 모노메틸라우리스타틴 약물 성분 DE 및 DF(MMAE 및 MMAF)(미국특허출원 제5,635,483호, 제5,780,588호 및 제7,498,298호 참조); 돌라스타틴; 칼리케아미신 또는 이의 유도체(미국특허출원 제5,712,374호, 제5,714,586호, 제5,739,116호, 제5,767,285호, 제5,770,701호, 제5,770,710호, 제5,773,001호 및 제5,877,296호; 문헌[Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993)] 및 문헌[Lode et al., Cancer res. 58:2925-2928 (1998)] 참조); 안트라사이클린, 예를 들어, 다우노마이신 또는 독소루비신(문헌[Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006)]; 문헌[Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006)]; 문헌[Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005)]; 문헌[Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834(2000)]; 문헌[Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002)]; 문헌[King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)] 및 미국특허출원 제6,630,579호 참조); 메토트렉스에이트; 빈데신; 탁산, 예를 들어 도세탁셀, 파클리타셀, 라로타셀, 테세타셀 및 오르타타셀; 트라이코테센; 및 CC1065를 비롯한 하나 이상의 약물과 접합된다.

또 다른 양태에서, 면역접합체는 비제한적으로, 디프테리아 A 쇄, 티프테리아 독성제의 비결합 활성 단편, 엑소톡신 A 쇄(슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 다이안틴 단백질, 파이톨라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트라이코테센을 비롯한, 효소적 활성 독성제 또는 이의 단편과 접합된 본원에 기재된 바와 같은 항체를 포함한다.

또 다른 양태에서, 면역접합체는 방사성활성 원자와 접합하여 방사성접합체를 형성하는, 본원에 기재된 바와 같은 항체를 포함한다. 다수의 방사성활성 동위원소가 방사성접합체의 생산을 위해 이용가능하다. 예는 At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Pb²¹² 및 Lu의 방사성활성 동위원소를 포함한다. 방사선접합체가 검출에 사용되었을 때, 이는 신티그래프 연구를 위한 방사성 원자를 포함할 수 있고, 예를 들어, tc199m 또는 I123, 또는 핵 자기 공명(NMR) 이미징(또한 자기공명 이미징, mri로서 공지됨)을 위한 스핀 표지, 예를 들어 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.

항체 및 세포독성제의 접합체는 다수의 이작용성 단백질 커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜다이티오)프로피오네이트(SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC), 이미노티올란(IT), 이미도에스터의 이작용성 유도체(예를 들어, 다이메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스터(예를 들어 다이숙신이미딜 수베레이트), 알데하이드(예를 들어, 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물(예를 들어, 비스(p-아지도벤조일) 헥산다이아민), 비스-다이아조늄 유도체(예를 들어, 비스-(p-다이아조늄벤조일)-에틸렌다이아민), 다이이소시아네이트(예를 들어, 톨루엔 2,6-다이이소시아네이트) 및 비스-활성 불소 화합물(예를 들어, 1,5-다이플루오로-2,4-다이니트로벤젠)을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독성제는 문헌[Vitetta et al., Science 238:1098(1987)]에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-베틸다이에틸렌 트라이아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 항체에 방사성뉴클레오타이드의 접합을 위한 예시적인 킬레이트제이다. 국제특허출원공개 제94/11026호를 참조한다. 연결기는 세포에서 세포독성 약물의 배출을 용이하게 하는 "절단가능한 연결기"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정한 연결기, 펩티다제-민감성 연결제, 광불안정한 연결기, 다이메틸 연결기 또는 다이설파이드-함유 연결기(문헌[Chari et al., Cancer Res. 52:127-131(1992)]; 미국특허출원 제5,208,020호)가 사용될 수 있다.

본원의 면역접합체 또는 ADC는 비제한적으로 시판(예를 들어, 피어스 바이오테크놀로지 인코포레이티드(Pierce Biotechnology, Inc.) 미국 일리노이주 록폴드 소재)중인 BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 설포SMPB 및 SVSB(숙신이미딜-(4-비닐설폰)벤조에이트)를 비롯한 가교 결합제에 의해 제조된 접합체를 분명히 고려한다.

치료 방법 및 조성물

본 발명은 치료가 필요한 환자에게 본 발명에 따른 치료 효과량의 항체를 투여함을 특징으로 하는, 상기 환자의 치료 방법을 포함한다.

본 발명은 치료를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도를 포함한다.

본 발명의 하나의 바람직한 양태는 "CSF-1R 매개된 질병"의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 CSF-1R 항체 또는 "CSF-1R 매개된 질병"의 치료용 약제의 제조에 사용하기 위한 본 발명의 CSF-1R 항체이며, 이는 하기와 같이 개시될 수 있다:

CSF-1R 신호전달이 종양 성장 및 전이에 관여하는 듯한 3개의 독특한 기전들이 존재한다. 첫번째는 CSF-리간드 및 수용체의 발현이 여성 생식계(유방, 난소, 자궁내막, 경부)에서 기원하는 종양 세포에서 발견되었고(문헌[Scholl, S.M., et al., J. Natl. Cancer Inst. 86 (1994) 120-126]; 문헌[Kacinski, B.M., Mol. Reprod. Dev. 46 (1997) 71-74]; 문헌[Ngan, H.Y., et al., Eur. J. Cancer 35 (1999) 1546-1550]; 문헌[Kirma, N., et al., Cancer Res 67 (2007) 1918-1926]) 발현이 유방암 이종이식편편 성장뿐만 아니라 유방암 환자에게서의 불량한 예후와 관련되었다는 것이다. 2개의 점 돌연변이가 한 연구에서 시험된 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 및 골수이형성 환자의 약 10 내지 20%에서 CSF-1R에서 발견되었고, 상기 돌연변이 중 하나는 수용체 턴오버를 붕괴시키는 것으로 밝혀졌다(문헌[Ridge, S.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 87 (1990) 1377-1380]). 그러나, 돌연변이의 발생률은 나중의 연구들에서 입증될 수 없었다(문헌[Abu-Duhier, F.M., et al., Br. J. Haematol. 120 (2003) 464-470]). 돌연변이는 또한 간세포암(문헌[Yang, D.H., et al., Hepatobiliary Pancreat. Dis. Int. 3 (2004) 86-89]) 및 특발성 골수 섬유증(문헌[Abu-Duhier, F.M., et al., Br. J. Haematol. 120 (2003) 464-470])의 일부 사례에서 발견되었다.

색소성 융모결절성 활막염(PVNS) 및 건초 거대세포 종양(TGCT)이, M-CSF 유전자가 콜라겐 유전자 COL6A3에 융합하여 M-CSF의 과발현을 생성시키는 전좌의 결과로서 발생할 수 있다(문헌[West, R.B., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 690-695]). 조망(landscape) 효과는 M-CSF를 발현하는 세포들에 의해 유인된 단핵구 세포들로 이루어진 생성된 종양 덩어리들에 기여하는 것으로 제안된다. TGCT는 상기 종양이 주로 발생하는 손가락으로부터 비교적 쉽게 제거될 수 있는 보다 작은 종양이다. PVNS는 큰 관절에서 재발할 수 있고 수술에 의해서 쉽게 제어되지 않으므로 보다 공격적이다.

두번째 기전은 파골세포 발생, 뼈 재흡수 및 골용해성 골 병변이 유발된 뼈의 전이 부위에서 M-CSF/CSF-1R을 통한 신호전달의 차단을 기본으로 한다. 유방, 다발성 골수종 및 폐암이 상기 뼈로 전이되고 골격 합병증을 생성시키는 골용해성 골 질병을 유발하는 것으로 밝혀진 암의 예이다. 종양 세포 및 간질에 의해 방출되는 M-CSF는 핵 인자 카파-B 리간드-RANKL의 수용체 활성화제와 협력하여 조혈 골수성 단핵구 선조의 성숙한 파골세포로의 분화를 유도한다. 이 과정 동안, M-CSF는 파골세포에 생존 신호를 제공함으로써 허용 인자로서 작용한다(문헌[Tanaka, S., et al., J. Clin. Invest. 91 (1993) 257-263]). 파골세포 분화 및 성숙 동안 항-CSF-1R 항체에 의한 CSF-1R 활성의 억제는 골용해성 질병 및 전이성 질병에서의 결합된 골격 관련 사건을 유발하는 파골세포의 불균형한 활성을 예방하는 듯하다. 유방암, 폐암 및 다발성 골수종이 전형적으로 골용해성 병변을 생성시키는 반면, 전립선암에서 뼈로의 전이는 처음에, 증가된 골 형성 활성이 정상적인 뼈의 전형적인 라멜라 구조와 상이한 "직골(woven bone)"을 생성시키는 조골성 외관을 갖는다. 질병이 진행하는 동안 골 병변은 현저한 골용해성 성분뿐만 아니라 높은 혈청 수준의 골 재흡수를 나타내고 이는 재흡수 억제 요법이 유용할 수 있음을 암시한다. 비스포스포네이트는 골용해성 병변의 형성을 억제하는 것으로 나타났으며 호르몬-무반응성 전이성 전립선암이 있는 남성에게서만 골격-관련된 사건의 수를 감소시켰으나, 지금은 조골성 병변에 대한 효과가 논쟁의 대상이 되고 있으며 지금까지로는 비스포스포네이트가 골 전이 또는 호르몬 반응성 전립선암의 예방에 유리하지 않았다. 복합된 골용해성/조골성 전립선암에 있어서 재흡수 억제제의 효과는 여전히 임상에서 연구중에 있다(문헌[Choueiri, M.B., et al., Cancer Metastasis Rev. 25 (2006) 601-609]; 문헌[Vessella, R.L. and Corey, E., Clin. Cancer Res. 12 (20 Pt 2) (2006) 6285s-6290s]).

세번째 기전은 종양 결합된 대식세포(TAM)가 불량한 예후와 상관 있는 유방, 전립선, 난소 및 경부 암의 고형 종양에서 발견된다는 최근의 관찰을 기본으로 한다(문헌[Bingle, L., et al., J. Pathol. 196 (2002) 254-265]; 문헌[Pollard, J.W., Nat. Rev. Cancer 4 (2004) 71-78]). 대식세포는 M-CSF 및 다른 케모카인들에 의해 종양으로 모인다. 이어서, 대식세포는 혈관형성 인자, 프로테아제 및 다른 성장 인자 및 사이토카인의 분비를 통해 종양 진행에 기여할 수 있으며 CSF-1R 신호전달의 억제에 의해 차단될 수도 있다. 최근에 진(Zins) 등에 의해(문헌[Zins, K., et al., Cancer Res. 67 (2007) 1038-1045]) 종양 괴사 인자 알파(TNF 알파), M-CSF 또는 이 둘의 조합의 siRNA의 발현이 마우스 이종이식편 모델에서 종양 성장을 각각의 siRNA의 종양 내 주사 후 34% 내지 50% 감소시킴이 입증되었다. 인간 SW620 세포에 의해 분비된 TNF 알파를 표적화하는 siRNA는 마우스 M-CSF 수준을 감소시켰으며 종양 중 대식세포의 감소를 이끌어냈다. 또한, M-CSF에 대한 항원 결합 단편에 의한 MCF7 종양 이종이식편의 치료는 40% 종양 성장 억제를 야기하였고, 화학요법제에 대한 내성을 역전시켰으며, 화학요법제와 조합되어 제공 시 상기 마우스의 생존을 개선시켰다(문헌[Paulus, P., et al., Cancer Res. 66 (2006) 4349-4356]).

TAM은 만성 염증과 암 사이에 최근에 만들어진 연계의 유일한 예이다. 다수의 만성 질병들이 암의 증가된 위험성과 관련 있고, 암이 만성 염증 부위에서 발생하며, 염증의 화학적 매개물질들이 많은 암에서 발견되고; 염증의 세포 또는 화학적 매개물질의 결실이 실험상 암의 발병을 억제하며 소염제의 장기적인 사용이 일부 암의 위험성을 감소시키는 것과 같은 염증과 암 간의 연계에 대한 추가적인 증거가 존재한다. 암에 대한 연계는 다수의 염증 상태에 대해 존재한다, 즉 위암의 경우 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori) 유발된 위염, 방광암의 경우 주혈흡충증, 카포시 육종의 경우 HHVX, 난소암의 경우 자궁내막증 및 전립선암의 경우 전립선염(문헌[Balkwill, F., et al., Cancer Cell 7 (2005) 211-217])이다. 대식세포는 만성 염증에서 핵심 세포이며 미세환경에 차별적으로 반응한다. 작용 상태의 연속성에 있어서 극단으로 간주되는 2가지 유형의 대식세포가 존재한다, 즉 M1 대식세포는 1형 반응에 관련된다. 상기 반응은 미생물 생성물에 의한 활성화 및 반응성 산소 중간체를 생성시키는 병원성 미생물의 결과적인 살해를 포함한다. 극단의 다른 끝은 세포 증식을 촉진하고 염증 및 적응 면역을 조율하며 조직 리모델링, 혈관형성 및 보수를 촉진하는 2형 반응에 관련된 M2 대식세포이다(문헌[Mantovani, A., et al., Trends Immunol. 25 (2004) 677-686]). 확립된 종양 형성을 야기하는 만성 염증은 대개 M2 대식세포와 관련이 있다. 염증 반응을 매개하는 중추적인 사이토카인은 TNF 알파이며 그 이름에 충실하게 고 용량에서 종양 억제 면역 및 출혈성 괴사를 자극할 수 있으나 또한 최근에 종양 세포에 의해 발현되고 종양 촉진제로서 작용하는 것으로 밝혀졌다(문헌[Zins, K., et al., Cancer Res. 67 (2007) 1038-1045]; 문헌[Balkwill, F., Cancer Metastasis Rev. 25 (2006) 409-416]). 작용에 대한 잠재적인 공간적, 시간적 의존성 및 특정 종양 유형에 대한 관련성을 포함하여 상기 종양에 대한 대식세포의 구체적인 역할은 여전히 더 잘 이해되어야할 필요가 있다.

따라서, 본 발명의 하나의 양태는 암의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 CSF-1R 항체이다. 본 발명에 사용된 바와 같은 "암"이란 용어는 예를 들어 폐암, 비 소세포 폐(NSCL)암, 기관지폐포 세포 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항분 부위 암, 위암, 위선암, 결장암, 유방암, 자궁암, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 경부 암종, 질 암종, 외음부암, 호지킨(Hodgkin)병, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 고환암, 전립선암, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신세포 암종, 신우 암종, 중피종, 간세포암, 담즙암, 중추 신경계(CNS)의 종양, 척추 종양, 뇌간 교세포종, 다형성 교모세포종, 성상세포종, 시반종, 상의세포종, 수모세포종, 뇌수막종, 편평세포 암종, 뇌하수체 선종, 림프종, 림프구성 백혈병, 상기 암들 중 임의의 암의 난치성 버전들, 또는 상기 암들 중 하나 이상의 조합일 수 있다. 바람직하게는, 상기와 같은 암은 유방암, 난소암, 경부암, 폐암 또는 전립선암이다. 바람직하게는, 상기와 같은 암은 CSF-1 또는 CSF-1R 발현 또는 과발현을 추가의 특징으로 한다. 본 발명의 하나의 추가의 양태는 원발성 종양 및 신생 전이의 동시 치료에 사용하기 위한 본 발명의 CSF-1R 항체이다.

따라서, 본 발명의 또 다른 양태는 치주염, 조직구 증식증 X, 골다공증, 뼈의 파제트(Paget) 병(PDB), 암 치료로 인한 골 손실, 삽입물 주위 골용해, 글루코코르티코이드-유래된 골다공증, 류마티스성 관절염, 건선 관절염, 골관절염, 염증성 관절염 및 염증의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 CSF-1R 항체이다.

문헌[Rabello, D., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 347 (2006) 791-796]은 CSF1 유전자 중의 SNP가 공격성 치주염, 즉 치조골의 재흡수로 인한 치아 손실을 유발하는 치주 조직의 염증 질병과 양성적인 관련을 나타냄을 입증하였다.

조직구 증식증 X(또한 랑게르한스 세포 조직구 증식증, LCH라 칭함)는 뼈 및 여분의 골 LCH 병변에서 파골세포로 분화하는 것으로 보이는 랑게르한스 수지상 세포의 증식성 질병이다. 랑게르한스 세포는 순환하는 단핵구로부터 유래한다. 혈청 및 병변에서 측정된 M-CSF의 증가된 수준은 질병 증증도와 상관 있는 것으로 밝혀졌다(문헌[da Costa, C.E., et al., J. Exp. Med. 201 (2005) 687-693]). 질병은 주로 소아과 환자 집단에서 발생하며 상기 질병이 전신적으로 되거나 재발하는 경우에 화학요법으로 치료되어야 한다.

골다공증의 병리 생리학은 골 형성 조골세포의 상실 및 증가된 파골세포 의존성 골 재흡수에 의해 매개된다. 지지 데이터는 항-M-CSF 항체 주사가 골 밀도를 보존하고 난소절제된 마우스에서 골 재흡수를 억제함을 보인 센치(Cenci) 등에 의해 개시되었다(문헌[Cenci, S., et al., J. Clin. Invest. 105 (2000) 1279-1287]). 최근에 에스트로젠 결핍으로 인한 폐경 후 골 손실 간의 잠재적인 연계가 확인되었으며 TNF 알파 생산 T-세포의 존재가 골 대사에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다(문헌[Roggia, C., et al., Minerva Med. 95 (2004) 125-132]). 가능한 기전은 생체 내에서 TNF 알파에 의한 M-CSF의 유도일 수 있다. TNF-알파-유래된 파골세포 형성에 있어서 M-CSF의 중요한 역할이, 마우스에서 TNF 알파 유래된 골용해를 차단하고 이에 의해 염증성 관절염에 대한 CSF-1R 신호전달 잠재성 표적의 억제제를 만드는 M-CSF에 대한 항체의 효과에 의해 확인되었다(문헌[Kitaura, H., et al., J. Clin. Invest. 115 (2005) 3418-3427]).

뼈의 파제트병(PDB)은 증가된 골 턴오버의 집중 이상이 골 통증, 기형, 병적인 골절 및 난청과 같은 합병증에 이르게 하는, 골다공증 후 두 번째로 가장 통상적인 골 대사 질환이다. 정상적인 파골세포 작용을 조절하고 개인을 PDB 및 관련된 질환에 걸리기 쉽게 만드는 4개 유전자의 돌연변이가 확인되었다: 핵 인자(NF) 카파B(RANK)-파골세포 작용의 중요한 조절 인자의 수용체 활성화제를 암호화하는 TNFRSF11A의 삽입 돌연변이, 오스테오프로테제린(RANK 리간드에 대한 유인 수용체)을 암호화하는 TNFRSF11B의 불활성화 돌연변이, NF카파B 경로에서 중요한 골격 단백질을 암호화하는 세퀘스토솜 1 유전자(SQSTM1)의 돌연변이 및 발로신-함유 단백질(VCP) 유전자의 돌연변이. 상기 유전자는 프로테오솜에 의한 분해에 대한 NF카파B의 억제제를 표적화함에 있어서 한 역할을 하는 VCP를 암호화한다(문헌[Daroszewska, A. and Ralston, S.H., Nat. Clin. Pract. Rheumatol. 2 (2006) 270-277]). 표적화된 CSF-1R 억제제는 상기 RANKL 신호전달의 조절 해제를 간접적으로 차단할 기회를 제공하며 현재 사용되는 비스포스포네이트에 대한 추가적인 치료 선택권을 더한다.

특히 유방암 및 전립선암 환자들에게서 암 요법 유발된 골 손실은 표적화된 CSF-1R 억제제가 골 손실을 예방할 수 있다는 추가의 표시이다(문헌[Lester, J.E., et al., Br. J. Cancer 94 (2006) 30-35]). 초기 유방암에 대한 개선된 예후와 함께, 보조 요법들의 장기적인 결과는, 화학 요법, 방사선, 아로마타제 억제제 및 난소절제를 포함한 상기 요법들 중 일부가 골 무기질 밀도를 감소시켜 골다공증 및 관련된 골절의 위험성을 증가시킴으로써 골 대사에 영향을 미치기 때문에 보다 중요해 지고 있다(문헌[Lester, J.E., et al., Br. J. Cancer 94 (2006) 30-35]). 유방암에서 보조적인 아로마타제 억제제 요법에 상당하는 것은 전립선암에서 안드로젠 절제이며 이는 골 무기질 밀도의 손실에 이르게 하고 골다공증 관련된 골절의 위험성을 현저하게 증가시킨다(문헌[Stoch, S.A., et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 86 (2001) 2787-2791]).

CSF-1R 신호전달의 표적화된 억제는 다른 적응증, 표적화된 세포 유형이 파골세포 및 대식세포를 포함하는 경우, 예를 들어 류마티스성 관절염의 결과로서 관절 치환에 대한 특정한 합병증의 치료에도 유용한 듯하다. 인공관절 주위 골 손실로 인한 이식 실패 및 결과적인 인공관절의 느슨함이 관절 치환의 주 합병증이며 이는 개인 환자 및 의료보험제도에 큰 사회경제적 부담이 되는 반복된 수술을 요한다. 지금까지, 인공관절 주위 골 용해를 예방하거나 억제하는데 승인된 약물 요법은 없다(문헌[Drees, P., et al., Nat. Clin. Pract. Rheumatol. 3 (2007) 165-171]).

글루코코르티코이드-유발된 골다공증(GIOP)은, CSF-1R 억제제가 다양한 병태들, 특히 만성 폐색성 폐 질병, 천식 및 류마티스성 관절염의 결과로서 제공되는 장기간 글루코코르티코스테로이드 사용 후의 골 손실을 예방할 수 있는 또 다른 적응증이다(문헌[Guzman-Clark, J.R., et al., Arthritis Rheum. 57 (2007) 140-146]; 문헌[Feldstein, A.C., et al., Osteoporos. Int. 16 (2005) 2168-2174]).

류마티스성 관절염, 건선 관절염 및 염증성 관절염은 본질적으로, 대식세포 성분으로 이루어지고 다양한 정도의 골 파괴가 존재한다는 점에서 CSF-1R 신호전달 억제제에 대한 잠재적인 적응증이다(문헌[Ritchlin, C.T., et al., J. Clin. Invest. 111 (2003) 821-831]). 골관절염 및 류마티스성 관절염은 결합 조직 중 대식세포의 축적 및 관절낭액 내로의 대식세포의 침윤(적어도 부분적으로 M-CSF에 의해 매개된다)에 의해 유발되는 염증성 자가면역 질병이다. 문헌[Campbell, I., K., et al., J. Leukoc. Biol. 68 (2000) 144-150]은 M-CSF가 시험관 내에서 인간-관절 조직 세포(연골세포, 활막 섬유아세포)에 의해 생산되며 류마티스성 관절염이 있는 환자의 관절낭액에서 발견됨을 입증하였으며, 이는 상기 M-CSF가 상기 질병의 병인과 관련 있는 활액 조직 증식 및 대식세포 침윤에 기여함을 암시한다. CSF-1R 신호전달의 억제는 관절 중 대식세포의 수를 조절하고 관련된 골 파괴로부터의 통증을 경감시키는 듯하다. 부작용을 최소화하고 상기 적응증들에서 CSF-1R 신호전달의 영향을 더 이해하기 위하여, 하나의 방법은 무수히 많은 다른 키나아제들, 예를 들어 Raf 키나아제를 표적화하지 않고 CSF-1R을 특이적으로 억제하는 것이다.

최근의 문헌 보고서들은 만성적인 관상 동맥 질병에서 죽상 동맥경화증의 진행과 불량한 예후를 갖는 증가된 순환하는 M-CSF를 연관시키며(문헌[Saitoh, T., et al., J. Am. Coll. Cardiol. 35 (2000) 655-665]; 문헌[Ikonomidis, I., et al., Eur. Heart. J. 26 (2005) p. 1618-1624]); M-CSF는 CSF-1R을 발현하고 초기 플라크를 나타내는 포말 세포(섭취된 산화된 LDL을 갖는 대식세포)의 형성을 도움으로써 상기 죽상 동맥경화증 과정에 영향을 미친다(문헌[Murayama, T., et al., Circulation 99 (1999) 1740-1746]).

M-CSF 및 CSF-1R의 발현 및 신호전달은 활성화된 미세아교세포에서 발견된다. 상기 중추 신경계의 내재하는 대식세포인 미세아교세포는 감염 및 외상성 상해를 포함한 다양한 손상에 의해 활성화될 수 있다. M-CSF는 뇌에서의 염증 반응의 핵심 조절 인자로 간주되며 M-CSF 수준은 HIV-1, 뇌염, 알츠하이머병(AD) 및 뇌 종양에서 증가한다. M-CSF/CSF-1R에 의한 자가분비 신호전달의 결과로서 미세아교세포종은, 예를 들어 실험적인 신경 손상 모델을 사용함으로써 입증된 바와 같이 염증성 사이토카인의 유도 및 질소 산화물 방출을 발생시킨다(문헌[Hao, A.J., et al., Neuroscience 112 (2002) 889-900]; 문헌[Murphy, G.M., Jr., et al., J. Biol. Chem. 273 (1998) 20967-20971]). CSF-1R의 증가된 발현을 갖는 미세아교세포는 AD 및 AD의 아밀로이드 전구체 단백질 V717F 유전자이식 마우스 모델에서 플라크를 둘러싸는 것으로 밝혀졌다(문헌[Murphy, G.M., Jr., et al., Am. J. Pathol. 157 (2000) 895-904]). 반면에, 뇌 중에 보다 적은 미세아교세포를 갖는 op/op 마우스는 정상 대조군에 비해 A-베타의 근원섬유 침착 및 신경세포 손실을 발생시켰으며, 이는 미세아교세포가 op/op 마우스에 없는 AD의 발병에 있어서의 신경보호 작용을 가짐을 암시한다(문헌[Kaku, M., et al., Brain Res. Brain Res. Protoc. 12 (2003) 104-108]).

M-CSF 및 CSF-1R의 발현 및 신호전달은 염증성 장 질병(IBD)과 관련이 있다(국제특허출원공개 제2005/046657호). "염증성 장 질병"이란 용어는 위장관의 다양한 부위에서의 만성 염증을 특징으로 하는 상기 장관의 심한 만성 질환을 지칭하며, 구체적으로 궤양성 대장염(UC) 및 크론병을 포함한다.

본 발명은 암의 치료를 위한 상기 언급한 에피토프 결합 성질 또는 다르게는 상기 언급한 아미노산 서열 및 아미노산 서열 단편을 특징으로 하는 인간 CSF-1R에 결합하는 항체를 포함한다.

본 발명은 골 손실의 치료를 위한 상기 언급한 에피토프 결합 성질 또는 다르게는 상기 언급한 아미노산 서열 및 아미노산 서열 단편을 특징으로 하는 인간 CSF-1R에 결합하는 항체를 포함한다.

본 발명은 전이의 예방 또는 치료를 위한 상기 언급한 에피토프 결합 성질 또는 다르게는 상기 언급한 아미노산 서열 및 아미노산 서열 단편을 특징으로 하는 인간 CSF-1R에 결합하는 항체를 포함한다.

본 발명은 염증성 질병의 치료를 위한 상기 언급한 에피토프 결합 성질 또는 다르게는 상기 언급한 아미노산 서열 및 아미노산 서열 단편을 특징으로 하는 인간 CSF-1R에 결합하는 항체를 포함한다.

본 발명은 암의 치료를 위한 또는 다르게는 암의 치료용 약제의 제조를 위한 상기 언급한 에피토프 결합 성질 또는 다르게는 상기 언급한 아미노산 서열 및 아미노산 서열 단편을 특징으로 하는 인간 CSF-1R에 결합하는 항체를 포함함을 특징으로 하는 상기 항체의 용도를 포함한다.

본 발명은 골 손실의 치료를 위한 또는 다르게는 골 손실의 치료용 약제의 제조를 위한 상기 언급한 에피토프 결합 성질 또는 다르게는 상기 언급한 아미노산 서열 및 아미노산 서열 단편을 특징으로 하는 인간 CSF-1R에 결합하는 항체를 포함함을 특징으로 하는 상기 항체의 용도를 포함한다.

본 발명은 전이의 예방 또는 치료를 위한 또는 다르게는 전이의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 상기 언급한 에피토프 결합 성질 또는 다르게는 상기 언급한 아미노산 서열 및 아미노산 서열 단편을 특징으로 하는 인간 CSF-1R에 결합하는 항체를 포함함을 특징으로 하는 상기 항체의 용도를 포함한다.

본 발명은 염증성 질병의 치료를 위한 또는 다르게는 염증성 질병의 치료용 약제의 제조를 위한 상기 언급한 에피토프 결합 성질 또는 다르게는 상기 언급한 아미노산 서열 및 아미노산 서열 단편을 특징으로 하는 인간 CSF-1R에 결합하는 항체를 포함함을 특징으로 하는 상기 항체의 용도를 포함한다.

하나의 양태에서, 본 발명에 따른 항체는 25 ng/ml 이하의 IC50, 바람직하게는 20 ng/ml 이하의 IC50으로 CSF-1R에 결합하는 CSF-1을 억제한다. CFS-1R에 결합하는 CSF-1의 IC50의 억제는 실시예 2에 나타낸 바와 같이 측정될 수 있다.

하나의 양태에서, 본 발명에 따른 항체는 100 ng/ml 이하의 IC50, 바람직하게는 50 ng/ml 이하의 IC50, 더욱 바람직하게는 25 ng/ml 이하의 IC50으로 CSF-1-유도된 CSF-1R 인산화(NIH3T3-CSF-1R 재조합 세포에서)를 억제한다. CSF-1-유도된 CSF-1R 인산화의 IC50은 실시예 3에 나타낸 바와 같이 측정될 수 있다.

하나의 양태에서, 본 발명에 따른 항체는 재조합 NIT3T3 세포 발현 인간 CSF-1R(서열번호 15)의 성장을 80% 이상(항체의 부재와 비교하여), 바람직하게는 90% 이상만큼 억제한다. 성장 억제%는 실시예 6에 나타낸 바와 같이 측정되고 이때 생존%가 측정된다. 생존%로부터 성장 억제%가 다음과 같이 계산되었다: 성장억제%=100-생존%. 예를 들어, <CSF-1R>7G5.3B6은 100-0=100%의 야생형 CSF-1R 발현 NIH3T3 세포의 성장 억제를 나타낸다.

하나의 양태에서, 본 발명에 따른 항체는 재조합 NIH3T3 세포 발현 인간 돌연변이 CSF-1R L301S T969F(서열번호 16)의 성장을 5% 이상(항체의 부재와 비교하여), 하나의 양태에서, 20% 이상만큼 자극한다. 성장 자극%는 실시예 6에 나타낸 바와 같이 측정되고, 이때 생존%가 측정된다. 생존%로부터 성장 자극%는 다음과 같이 계산되었다: 성장 자극%=-(100-생존%). 예를 들어, <CSF-1F>7H5.3B6은 -(100-0)=-(100-140)%=+40%의 돌연변이 인간 CSF-1R 발현 NIH3T3 세포의 성장 자극을 나타낸다.

하나의 양태에서, 본 발명에 따른 항체는 BeWo 종양 세포(ATCC CCL098)의 성장을 80% 이상(10㎍/ml의 항체 농도에서, 항체의 부재와 비교하여), 바람직하게는 90% 이상만큼 억제한다. 성장 억제%는 실시예 7에 나타낸 바와 같이 측정되었다. 예를 들어, <CSF-1R>7G5.3B6은 101%의 BeWe 암 세포의 성장 억제를 나타낸다.

하나의 양태에서, 본 발명에 따른 항체는 대식세포 분화를 억제한다. 하나의 양태에서, 본 발명에 따른 항체는 1.5 nM 이하의 IC50, 바람직하게는 1.0 nM 이하의 IC50으로 단핵구의 생존을 억제한다. 대식세포의 성장 억제는 실시예 8에 나타낸 바와 같이 측정하였다.

본 발명의 추가의 양태는 본 발명에 따른 인간 CSF-1R에 결합하는 인간 IgG1 부류 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산, 상기 변형된 핵산 및 상기 항체의 경쇄를 암호화하는 핵산의 서열을 발현 벡터에 삽입하고, 상기 벡터를 진핵생물 숙주 세포에 삽입하고, 암호화된 단백질을 발현시키고 숙주세포 또는 상청액으로부터 회수함을 특징으로 하는, CSF-1R에 대한 항체의 제조 방법이다.

약학 제형

용어 "약학 제형"은 제형이 투여되는 대상에게 받아들일 수 없는 독성인 추가적인 성분을 함유하지 않고 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 하는 형태의 제제를 나타낸다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 제형화된, 본 발명의 단클론 항체들 중 하나 또는 이들의 조합, 또는 이들의 항원-결합 부분을 함유하는 조성물, 예를 들어 약학 조성물을 제공한다.

"약학적으로 허용 가능한 담체"는 대상에게 비독성인, 활성 성분을 제외한 약학 제형내의 성분을 나타낸다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 비제한적으로, 완충액, 부형제, 안정화제 또는 방부제를 포함한다. 본 발명에 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용 가능한 담체"는 생리학적으로 상용성인 임의 용매 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장성 및 흡수/재흡수 지연제 등을 포함한다. 바람직하게는, 담체는 주사 또는 주입에 적합하다.

본 발명의 조성물을 당해 분야에 공지된 다양한 방법들에 의해 투여할 수 있다. 숙련가에 의해 인정될 수 있는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 따라 변할 수 있다.

약학적으로 허용 가능한 담체는 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 약학적인 활성 물질을 위한 상기 매질 및 작용제의 용도는 당해 분야에 공지되어 있다. 물 이외에, 담체는 예를 들어 등장성 완충 염수 용액일 수 있다.

선택된 투여 경로와 상관없이, 적합한 수화된 형태로 사용될 수도 있는 본 발명의 화합물 및/또는 본 발명의 약학 조성물을, 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 통상적인 방법에 의해 약학적으로 허용 가능한 투여형으로 제형화한다.

본 발명의 약학 조성물 중의 활성 성분의 실제 투여량 수준을 환자에 대한 독성 없이, 특정 환자의 목적하는 치료 반응, 조성, 및 투여 방식을 성취하기에 효과적인 활성 성분의 양(효과량)을 획득하기 위해 변화시킬 수 있다. 선택된 투여량 수준은 다양한 약동학적 인자들, 예를 들어 사용되는 본 발명의 특정 조성물, 또는 그의 에스터, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 배출 속도, 사용되는 특정 조성물과 병용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 조건, 일반적인 건강 및 선행 의료 병력및 의학 분야에 널리 공지된 유사한 인자들에 따라 변할 수 있다.

본 발명은 암, 특히 결장암, 폐암 또는 췌장암을 앓고 있는 환자의 치료를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도를 포함한다.

본 발명은 또한 상기 질병을 앓고 있는 환자의 치료 방법을 포함한다.

본 발명은 또한 효과량의 본 발명에 따른 항체를 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 포함하는 약학 조성물의 제조 방법 및 상기 방법을 위한 본 발명에 따른 항체의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 암을 앓고 있는 환자의 치료를 위한, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 약제의 제조를 위한 효과량의 본 발명에 따른 항체의 용도를 제공한다.

제조 물품

본 발명의 또 다른 양태에서, 상기 기재된 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품이 제공되었다. 제조 물품은 용기 및 라벨 또는 용기 상의 또는 용기에 결합된 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들어, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 백 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다수의 물질로부터 형성될 수 있다. 용기는 그 자체로서, 또는 병태의 치료, 예방 및/또는 진단에 효과적인 다른 조성물과 조합되어 조성물을 유지하고, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 스토퍼를 갖는 정맥 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 조성물 중 적어도 하나의 활성제는 본 발명의 항체이다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물이 선택된 병태를 처리하기 위해 사용됨을 나타낸다. 더욱이, 제조 물품은 (a) 함유된 조성물을 갖는 첫번째 용기(이때, 조성물은 본 발명의 항체를 포함한다), 및 (b) 함유된 조성물을 갖는 두번째 용기(이때, 조성물은 추가의 세포독성제, 또는 다른 치료제를 포함한다)를 포함할 수 있다. 본 발명의 이 양태에서, 제조 물품이 특정 병태를 치료하기 위해 사용될 수 있음을 나타내는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 다르게는, 또는 추가적으로, 제조 물품은 약학적으로 허용가능한 완충액, 예를 들어, 정균성 주사용수(BWFI), 인산 완충 염수(PBS), 링거 용액 및 덱스트로즈 용액을 포함하는 두번째(또는 세번째) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘 또는 주사기를 포함하는, 상업적인 사용자의 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함한다.

임의의 상기 제조 물품이 항-CSF-1R 항체를 대신하거나 더하여 본 발명의 면역접합체를 포함할 수 있음이 이해된다.

본 발명의 이해를 돕기 위해 하기의 실시예 및 서열 목록을 제공하며, 본 발명의 진정한 범주는 첨부된 청구범위에 나타나 있다. 본 발명의 진의로부터 이탈됨 없이 나열된 과정에 변형을 수행할 수 있는 것으로 이해된다.

항체 기탁

서열의 설명

서열번호 1 중쇄 CDR3, <CSF-1R>7G5.3B6

서열번호 2 중쇄 CDR2, <CSF-1R>7G5.3B6

서열번호 3 중쇄 CDR1, <CSF-1R>7G5.3B6

서열번호 4 경쇄 CDR3, <CSF-1R>7G5.3B6

서열번호 5 경쇄 CDR2, <CSF-1R>7G5.3B6

서열번호 6 경쇄 CDR1, <CSF-1R>7G5.3B6

서열번호 7 중쇄 가변 도메인, <CSF-1R>7G5.3B6

서열번호 8 경쇄 가변 도메인, <CSF-1R>7G5.3B6

서열번호 9 감마 중쇄 불변 영역

서열번호 10 κ 경쇄 불변 영역

서열번호 11 IgG1로부터 유래된 인간 중쇄 불변 영역

서열번호 12 L234A 및 L235A 상에서 돌연변이된 IgG1로부터 유래된 인 간 중쇄 불변 영역

서열번호 13 IgG4로부터 유래된 인간 중쇄 불변 영역

서열번호 14 S228P 상에서 돌연변이된 IgG4로부터 유래된 인간 중쇄 불변 영역

서열번호 15 야생형 CSF-1R(wt CSF-1R)

서열번호 16 돌연변이 CSF-1R L301S Y969F

본 발명의 이해를 돕기 위해 실시예, 서열 목록 및 도면을 제공하며, 본 발명의 진정한 범주는 첨부된 청구범위에 나타나 있다. 본 발명의 진의로부터 이탈됨 없이 나열된 과정에 변형을 수행할 수 있는 것으로 이해된다.

실시예

실시예 1

항- CSF -1R 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주의 생성

NMRI 마우스의 면역화 과정

NMRI 마우스를 전기천공법을 사용함으로써 huCSF-1R의 세포외 도메인을 암호화하는 발현 벡터 p디스플레이(pDisplay: 상표)(인비트로젠(Invitrogen), 미국 소재)로 면역화시켰다. 모든 마우스를 100 ㎍의 DNA로 4회 면역화시켰다. 항-huCSF-1R의 혈청 역가가 충분한 것으로 밝혀졌으면, 마우스를 주입 전 4 및 3일째에 PBS 200 ㎕ 중의 50 ㎍의 huCSF-1R ECD/huCSF-1R ECDhuFc 키메라 1:1 혼합물로 정맥 내(i.v.)로 1회 추가 접종하였다.

항원 특이적 ELISA

면역화된 마우스의 혈청 중 항-CSF-1R 역가를 항원 특이적 ELISA에 의해 측정하였다.

0.3 ㎍/㎖의 huCSF-1R-huFc 키메라(용해성 세포외 도메인)를 0.1 ㎎/㎖의 비오틴화된 항 Fcγ(잭슨 이뮤노리써치(Jackson ImmunoResearch), 카탈로그 번호 109-066-098)와 함께 스트렙타비딘 플레이트(맥시솔브(MaxiSorb); 마이크로코트(MicroCoat), 독일 소재, 카탈로그 번호 11974998/MC1099) 상에 포획하고 PBS/0.05% 트윈(Tween)20/0.5% BSA 중에서 1/800 희석한 양고추 냉이 퍼옥시다제(HRP)-접합된 F(ab')₂ 항 마우스 IgG(GE 헬쓰케어(Healthcare), 영국 소재, 카탈로그 번호 NA9310V)를 첨가하였다. 모든 탭(tap)으로부터의 혈청을 PBS/0.05% 트윈20/0.5% BSA에서 1/40 희석하고 1/1638400까지 연속해서 희석하였다. 희석된 혈청을 웰에 첨가하였다. 프리-탭(pre-tap) 혈청을 음성 대조군으로서 사용하였다. 500 ng/㎖ 내지 0.25 ng/㎖의 일련의 마우스 항-인간 CSF-1R Mab3291(R&D 시스템스(Systems), 영국 소재)의 희석물을 양성 대조군으로서 사용하였다. 모든 성분들을 1.5시간 동안 함께 배양하고, 웰을 PBST(PBS/0.2% 트윈20)로 6회 세척하고 새로 제조한 ABTS(등록상표) 용액(1 ㎎/㎖)(ABTS: 2,2'-아지노 비스(3-에틸벤즈티아졸린-6-설폰산)으로 실온에서 10분간 분석을 전개시켰다. 흡광도를 405 ㎚에서 측정하였다.

하이브리도마 생성

마우스 림프구를 단리하고 PEG 기재 표준 프로토콜을 사용하여 마우스 골수종 세포주와 융합시켜 하이브리도마를 생성시킬 수 있다. 이어서, 생성되는 하이브리도마를 항원-특이적 항체의 생산을 위해 선별한다. 예를 들어, 면역화된 마우스로부터의 비장 유래된 림프구의 단세포 현탁액을 50% PEG와 함께 Ag8 비-분비 마우스 골수종 세포 P3X63Ag8.653(ATCC, CRL-1580)에 융합시킨다. 세포를 편평 바닥 96 웰 미세 적정 플레이트 중에 약 10⁴로 도말한 다음, 선택성 배지 중에서 약 2주간 배양한다. 이어서, 개별적인 웰을 인간 항-CSF-1R 단클론 IgM 및 IgG 항체에 대해 ELISA에 의해 선별한다. 일단 광범위한 하이브리도마 성장이 일어났으면, 항체 분비 하이브리도마를 재도말하고, 다시 선별하고, 인간 IgG에 대해 여전히 양성인 경우, 항-CSF-1R 단클론 항체를 FACS에 의해 서브클로닝할 수 있다. 이어서, 안정한 서브클론들은 시험관 내에서 배양되어 특성화를 위한 조직 배양 배지에서 항체를 생산한다.

하이브리도마의 배양

생성된 muMAb 하이브리도마를 37 ℃ 및 5% CO₂에서 2 mM L-글루타민(깁코(GIBCO) - 카탈로그 번호 35050-038), 1 mM Na-피루배트(Pyruvat)(깁코 - 카탈로그 번호 11360-039), 1x NEAA(깁코 - 카탈로그 번호 11140-035), 10% FCS(PAA - 카탈로그 번호 A15-649), 1x 펜 스트렙(Pen Strep)(로슈(Roche) - 카탈로그 번호 1074440), 1x 뉴트리도마(Nutridoma) CS(로슈 - 카탈로그 번호 1363743), 50 μM 머캅토에탄올(깁코 - 카탈로그 번호 31350-010) 및 50 U/㎖ IL 6 마우스(로슈 - 카탈로그 번호 1 444 581)가 보충된 RPMI 1640(PAN - 카탈로그 번호 PO4-17500)에서 배양하였다.

실시예 2

CSF -1R에 결합하는 CSF -1의 억제( ELISA )

시험을 실온에서 384 웰 미세적정 플레이트(마이크로코트, 독일 소재, 카탈로그 번호 464718) 상에서 수행하였다. 각각의 배양 단계 후에 플레이트를 PBST로 3회 세척하였다.

초기에, 플레이트를 0.5 ㎎/㎖의 염소 F(ab')₂ 비오틴화된 항 Fcγ(잭슨 이뮤노리써치, 카탈로그 번호 109-006-170)로 1시간 동안 코팅하였다.

이어서, 웰을 0.2% 트윈(등록상표)-20 및 2% BSA(로슈 다이아그노스틱스 게엠베하(Roche Diagnostics GmbH), 독일 소재)가 보충된 PBS로 0.5시간 동안 차단하였다. 75 ng/㎖의 huCSF-1R-huFc 키메라(용해성 세포외 도메인)를 플레이트에 1시간 동안 고정화시켰다. 이어서, PBS/0.05% 트윈20/0.5% BSA 중 정제된 항체의 희석물을 1시간 동안 배양하였다. 3 ng/㎖의 CSF-1(바이오몰(Biomol), 독일 소재, 카탈로그 번호 60530), 50 ng/㎖의 비오틴화된 항 CSF-1 클론 BAF216(R&D 시스템스, 영국 소재) 및 1:5000 희석된 스트렙타비딘 HRP(로슈 다이아그노스틱스 게엠베하, 독일 소재, 카탈로그 번호 11089153001)의 혼합물을 1시간 동안 첨가한 후에, 플레이트를 PBST로 6회 세척하였다. 리간드-수용체 상호작용을 억제하는 항 CSF-1R SC-02, 클론 2-4A5(산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology), 미국 소재)를 양성 대조군으로서 사용하였다. 플레이트를 새로 제조한 BM 블루(blue)(등록상표) POD 기질 용액(BM 블루(등록상표): 3,3'-5,5'-테트라메틸벤지딘, 로슈 다이아그노스틱스 게엠베하, 독일 소재, 카탈로그 번호 11484281001)으로 실온에서 30분간 전개시켰다. 흡광도를 370 ㎚에서 측정하였다. 모든 항-CSF-1R 항체는 CSF-1R에 결합하는 CSF-1의 현저한 억제를 나타내었다(표 1 참조). 리간드-수용체 상호작용을 억제하는 항 CSF-1R SC-02, 클론 2-4A5(산타 크루즈 바이오테크놀로지, 미국 소재)를 참고 대조군으로서 사용하였다.

CSF -1/ CSF -1R 상호작용의 억제에 대해 계산된 IC50 값
항체	IC50 CSF -1/ CSF -1R 억제 [ ng / ml ]
<CSF-1R>7G5.3B6	18.8
SC-02, 클론 2-4A5	30.9

실시예 3

NIH3T3 - CSF -1R 재조합 세포에서 CSF -1-유래된 CSF -1R 인산화의 억제

전장 CSF-1R에 대한 발현 벡터로 레트로바이러스에 의해 감염된 4.5 x 10³ NIH 3T3 세포를 합류에 도달할 때까지 DMEM(PAA 카탈로그 번호 E15-011), 2 mM L-글루타민(시그마, 카탈로그 번호 G7513), 2 mM 나트륨 피루베이트, 1 x 불필수 아미노산, 10% FKS(PAA, 카탈로그 번호 A15-649) 및 100 ㎍/㎖ 펜스트렙(시그마, 카탈로그 번호 P4333[10 ㎎/㎖]) 중에서 배양하였다. 이어서, 세포를 나트륨 셀레나이트[5 ng/㎖](시그마, 카탈로그 번호 S9133), 트랜스페린[10 ㎍/㎖](시그마, 카탈로그 번호 T8158), BSA[400 ㎍/㎖](로슈 다이아그노스틱스 게엠베하, 카탈로그 번호 10735078), 4 mM L-글루타민(시그마, 카탈로그 번호 G7513), 2 mM 나트륨 피루베이트(깁코, 카탈로그 번호 11360), 1 x 불필수 아미노산(깁코, 카탈로그 번호 11140-035), 2-머캅토에탄올[0.05 mM](머크(Merck), 카탈로그 번호 M7522), 100 ㎍/㎖ 및 펜스트렙(시그마, 카탈로그 번호 P4333)이 보충된 무혈청 DMEM 배지(PAA 카탈로그 번호 E15-011)로 세척하고, 30 ㎕의 동일한 배지에서 16시간 동안 배양하여 수용체 상향조절을 허용하였다. 10 ㎕의 희석된 항-CSR-1R 항체를 세포에 1.5시간 동안 첨가하였다. 이어서, 세포를 10 ㎕의 100 ng/㎖의 huM-CSF-1(바이오몰 카탈로그 번호 60530)로 5분간 자극하였다. 배양 후에, 상청액을 제거하고, 세포를 80 ㎕의 빙냉 PBS로 2회 세척하고 50 ㎕의 새로 제조한 빙냉 용해 완충제(150 mM NaCl/20 mM 트리스 pH 7.5/1 mM EDTA/1 mM EGTA/1% 트리톤 X-100/1 프로테아제 억제제 정제(로슈 다이아그노스틱스 게엠베하 카탈로그 번호 1 836 170)/완충제 10 ㎖/10 ㎕/㎖ 포스파타제 억제제 칵테일 1(시그마 카탈로그 번호 P-2850, 100 x 스톡)/10 ㎕/㎖ 프로테아제 억제제 1(시그마 카탈로그 번호 P-5726, 100 x 스톡)/10 ㎕/㎖ 1M NaF)를 첨가하였다. 얼음 상에서 30분 후에 상기 플레이트를 플레이트 진탕기 상에서 3분간 격렬히 진탕하고, 이어서 2200 rpm에서 10분간 원심분리하였다(헤래우스 메가퓨즈(Heraeus Megafuge) 10).

세포 용해물 중의 인산화된 수용체 및 전체 CSF-1 수용체의 존재를 ELISA에 의해 분석하였다. 상기 인산화된 수용체의 검출을 위해서 R&D 시스템스(카탈로그 번호 DYC3268-2)로부터의 키트를 공급자의 설명에 따라 사용하였다. 전체 CSF-1R의 검출을 위해서 10 ㎕의 상기 용해물을 상기 키트 중에 함유된 포획 항체의 사용에 의해 상기 플레이트 상에 고정화시켰다. 이어서, 1:750 희석된 비오틴화된 항 CSF-1R 항체 BAF329(R&D 시스템스) 및 1:1000 희석된 스트렙타비딘-HRP 접합체를 첨가하였다. 60분 후에, 플레이트를 새로 제조한 ABTS(등록상표) 용액으로 전개시키고 흡광도를 검출하였다. 데이터를 항체 부재 하의 양성 대조군의 %로서 계산하였으며 포스포/발현된 전체 수용체 비 값으로 나타내었다. 음성 대조군을 M-CSF-1이 첨가되지 않은 것으로 정의하였다. 리간드-수용체 상호작용을 억제하는 항 CSF-1R SC-02, 클론 2-4A5(산타 크루즈 바이오테크놀로지, 미국 소재, 문헌[Sherr, C.J. et al., Cell 41 (1985) 665-676] 참조)를 참고 대조군으로서 사용하였다.

CSF -1 수용체 인산화의 억제에 대해 계산된 IC50 값
항체	IC50 CSF -1R 인산화 [ ng / ml ]
<CSF-1R>7G5.3B6	< 11.0
SC-02, 클론 2-4A5	412.0

실시예 4

CSF -1R에 대한 항- CSF -1R 항체의 친화성의 측정

장비: 비아코어(등록상표) A100

칩: CM5(비아코어 BR-1006-68)

커플링: 아민 커플링

완충제: PBS(비아코어 BR-1006-72), pH 7.4, 35 ℃

친화성 측정을 위해서, 36 ㎍/㎖의 항 마우스 Fcγ 항체(염소로부터, 잭슨 임뮤노 리써치 JIR115-005-071)를 CSF-1R에 대한 항체를 포획하기 위해서 칩 표면에 커플링시켰다. CSF-1R-ECD(R&D 시스템스 329-MR 또는 사내에서 서브클로닝된 pCMV-presS-HisAvitag-hCSF-1R-ECD)를 용액 중의 다양한 농도로 첨가하였다. 35 ℃에서 1.5분의 CSF-1R-주입에 의해 회합을 측정하고; 상기 칩 표면을 35 ℃에서 10분간 완충제로 세척함으로써 해리를 측정하였다. 리간드-수용체 상호작용을 억제하는, 항 CSF-1R SC-02, 클론 2-4A5(산타 크루즈 바이오테크놀로지; 또한 문헌[Sherr, C.J., et al., Cell 41 (1085) 665-676] 참조)를 참고 대조군으로서 사용하였다.

동력학 매개변수의 계산을 위해서 랭뮤어 1:1 모델을 사용하였다.

35 ℃에서 SPR ( 비아코어 (등록상표) A100)에 의해 측정된 친화성 데이터
항체	K _d ( nM )	K _a (1/ Ms )	K _d (1/s)	t ₁ _/2 (분)
<CSF-1R>7G5.3B6	0.61	8.0E+06	4.9E-03	2.37
SC-02, 클론 2-4A5	2.73	5.09E+05	1.39E-03	8.31

실시예 5

SPR 을 이용함으로써 교차 경쟁에 근거한 항- CSF -1R 단클론 항체의 에피토프 맵핑

장비: 비아코어(등록상표) A100

칩: CM5(비아코어 BR-1006-68)

커플링: 아민 커플링

완충제: PBS(비아코어 BR-1006-72), pH 7.4, 35 ℃

교차 비교를 통한 에피토프 맵핑 어세이를 위해서, 36 ㎍/㎖의 항 마우스 Fcγ 항체 또는 항 래트 Fcγ항체(염소로부터, 잭슨 임뮤노 리써치 카탈로그 번호 115-005-071 및 카탈로그 번호 112-005-071)를 CSF-1R에 대한 항체를 제조하기 위해서 칩 표면에 커플링시켰다. 5㎍/ml의 항-CSF-1R 단클론 항체로부터의 포획 후, 포획 항체의 자유 결합력은 250 ㎍/ml의 마우스 또는 래트 면역글로불린(피어스 카탈로그 번호 31202 및 피어스 카탈로그 번호 31233), 및 이어서 12.5 ㎍/ml CSF-1R(R&D 시스템스 카탈로그 번호 329-MR)의 2분 동안 주입에 의해 차단되었다. 두번째 항-CSF-1R 항체의 결합을 2분 동안 주입하여 분석하였고, 해리를 5분 동안 완충액으로 세척하여 측정하였다. 어세이 및 측정을 25℃에서 수행하였다. 두번째 항-CSF-1R 항체의 특이적인 결합을 CSF-1R의 주입 없이 동일한 칩 설정으로 점에 대해 참고하였다. 교차 경쟁 데이터를 두번째 항-CSF-1R 항체의 예견된 결합 반응의 백분율(%)로 계산하였다. 두번째 항체의 결합을 위한 항목 "예견된 결합 반응의 백분율(%)"을 "100*상대 반응(초기 통상적인 안정성)/rMax"로 계산하였고, 이때 rMax는 "상대 반응(후기 통상적인 안정성)*항체 분자량/항원 분자량"으로 계산하였다(비아코어 에피토프 맵핑 설명서(비아코어: 등록상표) A 100 장비)에 기술됨).

최소 결합 반응을 동일한 항체 1 및 2의 쌍으로부터 또한 계산하였다. 이의 수득된 최대 값 +100%, 바람직하게는 50%를 유의한 결합 경쟁을 위한 역치로서 설정하였다(표 X 참조, 예를 들어, 항체 <CSF-1R>7G5.3B6을 위해 계산된 역치는 3+3=6, 바람직하게는 3+1.5=4.5임). 따라서, "<CSF-1R>7G5.3B6으로서 동일한 에피토프에 결합하는 항-CSF-1R 항체"는 6 미만, 바람직하게는 4.5 미만의 예견된 결합 반응의 %를 갖는다.

리간드-수용체 상호작용을 억제하는, 항-CSF-1R SC-02, 클론 2-4A5(산타 크루즈 바이오테크놀로지, 미국 소재, 또한 문헌[Sherr, C.J., et al., Cell 41 (1985) 665-676] 참조)를 참고 대조군으로서 사용하였다.

항 CSF -1R 항체의 교차 경쟁을 통한 에피토프 맵핑
	항체 2
항체 1	<CSF-1R>7G5.3B6	SC-02, 클론 2-4A5
<CSF-1R>7G5.3B6	3	36
SC-02, 클론 2-4A5	62	-2

결과는 항체 SC-02, 클론 2-4A5와는 다른 에피토프에 결합하는, <CSF-1R>7G5.3B6과 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 나타낸다.

실시예 6

항- CSF -1R 단클론 항체에 의한 처리 하에 3D 배양물에서 NIH3T3 - CSF -1R 재조합 세포의 성장 억제( 셀티터글로 어세이 )

전장 야생형 CSF-1R(서열번호 15) 또는 돌연변이 CSF-1R L301S Y969F(서열번호 16)에 대한 발현 벡터 중 어느 하나로 레트로바이러스에 의해 감염된 NIH 3T3 세포를, 플라스틱 표면에 대한 부착을 방지하기 위해 폴리-HEMA(폴리(2-하이드록시에틸메트아크릴레이트))(폴리사이언시스(Polysciences) 미국 펜실베니아주 워링톤 소재) 코팅된 접시 상에서, 2 mM L-글루타민, 2 mM 나트륨 피루베이트 및 불필수 아미노산 및 10% 소 태아 혈청(시그마, 독일 타우프키르켄 소재)이 보충된 DMEM 고 글루코스 배지(PAA, 오스트리아 파칭 소재)에서 배양하였다. 세포를 5 ng/㎖의 나트륨 셀레나이트, 10 ㎎/㎖의 트랜스페린, 400 ㎍/㎖의 BSA 및 0.05 mM 2-머캅토에탄올로 혈청을 대체한 배지에 시딩(seeding)하였다. 100 ng/㎖의 huCSF-1(바이오몰, 독일 함부르크 소재)로 처리 시, wtCSF-1R 발현 세포는 3차원적으로 성장하는 치밀한 회전 타원체를 형성하며, 상기 성질을 부착 비의존성이라 칭한다. 이러한 회전 타원체는 동일 반응계의 고형 종양의 3차원 구조 및 조직을 매우 닮는다. 돌연변이 CSF-1R 재조합 세포는 상기 CSF-1 리간드의 회전 타원체 비의존성을 형성할 수 있다. 회전 타원체 배양물을 10 ㎍/ml의 항체의 존재 하에서 3일간 배양하였다. 셀티터글로 분석을 사용하여 세포의 ATP 함량을 측정함으로써 세포 생존력을 검출하였다.

항체	야생형 CSF -1R을 발현하는 NIH3T 세포 생존%	돌연변이 CSF -1R을 발현하는 NIH3T 세포 생존 %
<CSF-1R>7G5.3B6	0	140
SC-02, 클론 2-4A5	62^**	66^***
^ 15회의 상이한 실험의 평균 ^*6회의 상이한 실험의 평균

실시예 7

항- CSF -1R 단클론 항체에 의한 처리 하에 3D 배양물에서 BeWo 종양 세포의 성장 억제( 셀티터글로 분석)

BeWo 융모암 세포(ATCC CCL-98)를 10% FBS(시그마) 및 2mM L-글루타민이 보충된 F12K 배지(시그마, 독일 스타인하임 소재)에서 배양하였다. 5 x 10⁴ 세포/웰을 0.5% FBS 및 5% BSA가 보충된 F12K 배지를 함유하는 96-웰 폴리-HEMA(폴리(2-하이드록시에틸메트아크릴레이트)) 코팅된 플레이트에 시딩하였다. 동시에, 200 ng/㎖의 huCSF-1 및 10 ㎍/㎖의 상이한 항-CSF-1R 단클론 항체를 첨가하고 6일간 배양하였다. 셀티터글로 분석을 사용하여 상대 광 단위(RLU)로 상기 세포의 ATP 함량을 측정함으로써 세포 생존력을 검출하였다. BeWo 회전 타원체 배양물을 상이한 항-CSF-1R 항체(10 ㎍/㎖)로 처리했을 때, CSF-1 유래된 성장의 억제가 관찰되었다. 항체-매개된 억제를 계산하기 위해서, 자극되지 않은 BeWo 세포의 평균 RLU 값을 모든 샘플로부터 감하였다. CSF-1 자극된 세포의 평균 RLU 값을 임의로 100%로 설정하였다. CSF-1로 자극되고 항-CSF-1R 항체로 처리된 세포의 평균 RLU 값을 CSF-1 자극된 RLU의 %로 계산하였다. 표 6은 계산된 데이터를 나타내고; 도 1은 평균 RLU 값을 도시한다. 각각의 평균 값은 3회의 실험으로 수득되었다.

항체	10 ㎍/㎖ 항체 농도의 억제 %
CSF-1 단독	0
<CSF-1R>7G5.3B6	101
SC-02, 클론 2-4A5	40

실시예 8

항- CSF -1R 단클론 항체에 의한 처리 하에 대식세포 분화/단핵구 생존의 억제( 셀티터글로 어세이 )

단핵구를 로세트셉(RosetteSep: 상표) 인간 단핵구 강화 칵테일(스템셀 테크(StemCell Tech.) - 카탈로그 번호 15028)을 사용하여 말초 혈액으로부터 단리하였다. 강화된 단핵구 집단을 10% FCS(깁코 - 카탈로그 번호 011 - 090014M), 4 mM L-글루타민(깁코 - 카탈로그 번호 25030) 및 1 x 펜스트렙(로슈 카탈로그 번호 1 074 440)이 보충된 100 ㎕의 RPMI 1640(깁코 - 카탈로그 번호 31870) 중의 96 웰 미세적정 플레이트(2.5 x 10⁴ 세포/웰) 내로 37 ℃ 및 5% CO₂에서 시딩하였다. 150 ng/㎖의 huCSF-1을 배지에 첨가했을 때, 부착성 대식세포로의 분명한 분화가 관찰될 수 있었다. 이러한 분화는 항-CSF-1R 항체의 첨가에 의해 억제될 수 있었다. 동시에, 단핵구 생존이 영향을 받으며 이를 셀티터글로(CTG) 분석에 의해 분석할 수 있었다. 항체 처리에 의한 단핵구의 생존의 농도 의존적인 억제로부터 IC50을 계산하였다(표 7 참조).

항체	IC50 [ nMl ]
<CSF-1R>7G5.3B6	0.4
SC-02, 클론 2-4A5	2.4

DSMZ-독일 잠룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하

DSMACC2921

20080610

SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Antibodies against human CSF-1R and uses thereof <130> 26608 WO <140> PCT/EP2011/053213 <141> 2011-03-03 <150> EP 10002269.8 <151> 2010-03-05 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Gly Gly Asp Glu Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Arg 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Asn Met Tyr 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Pro Thr 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Arg Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 7 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Arg Val Ser Cys Lys 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Tyr Arg Cys Thr Glu Pro Gly Asp Pro Leu Gly Gly Ser Ala Ala 85 90 95 Ile His Leu Tyr Val Lys Asp Pro Ala Arg Pro Trp Asn Val Leu Ala 100 105 110 Gln Glu Val Val Val Phe Glu Asp Gln Asp Ala Leu Leu Pro Cys Leu 115 120 125 Leu Thr Asp Pro Val Leu Glu Ala Gly Val Ser Leu Val Arg Val Arg 130 135 140 Gly Arg Pro Leu Met Arg His Thr Asn Tyr Ser Phe Ser Pro Trp His 145 150 155 160 Gly Phe Thr Ile His Arg Ala Lys Phe Ile Gln Ser Gln Asp Tyr Gln 165 170 175 Cys Ser Ala Leu Met Gly Gly Arg Lys Val Met Ser Ile Ser Ile Arg 180 185 190 Leu Lys Val Gln Lys Val Ile Pro Gly Pro Pro Ala Leu Thr Leu Val 195 200 205 Pro Ala Glu Leu Val Arg Ile Arg Gly Glu Ala Ala Gln Ile Val Cys 210 215 220 Ser Ala Ser Ser Val Asp Val Asn Phe Asp Val Phe Leu Gln His Asn 225 230 235 240 Asn Thr Lys Leu Ala Ile Pro Gln Gln Ser Asp Phe His Asn Asn Arg 245 250 255 Tyr Gln Lys Val Leu Thr Leu Asn Leu Asp Gln Val Asp Phe Gln His 260 265 270 Ala Gly Asn Tyr Ser Cys Val Ala Ser Asn Val Gln Gly Lys His Ser 275 280 285 Thr Ser Met Phe Phe Arg Val Val Glu Ser Ala Tyr Ser Asn Leu Ser 290 295 300 Ser Glu Gln Asn Leu Ile Gln Glu Val Thr Val Gly Glu Gly Leu Asn 305 310 315 320 Leu Lys Val Met Val Glu Ala Tyr Pro Gly Leu Gln Gly Phe Asn Trp 325 330 335 Thr Tyr Leu Gly Pro Phe Ser Asp His Gln Pro Glu Pro Lys Leu Ala 340 345 350 Asn Ala Thr Thr Lys Asp Thr Tyr Arg His Thr Phe Thr Leu Ser Leu 355 360 365 Pro Arg Leu Lys Pro Ser Glu Ala Gly Arg Tyr Ser Phe Leu Ala Arg 370 375 380 Asn Pro Gly Gly Trp Arg Ala Leu Thr Phe Glu Leu Thr Leu Arg Tyr 385 390 395 400 Pro Pro Glu Val Ser Val Ile Trp Thr Phe Ile Asn Gly Ser Gly Thr 405 410 415 Leu Leu Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Pro Gln Pro Asn Val Thr Trp Leu 420 425 430 Gln Cys Ser Gly His Thr Asp Arg Cys Asp Glu Ala Gln Val Leu Gln 435 440 445 Val Trp Asp Asp Pro Tyr Pro Glu Val Leu Ser Gln Glu Pro Phe His 450 455 460 Lys Val Thr Val Gln Ser Leu Leu Thr Val Glu Thr Leu Glu His Asn 465 470 475 480 Gln Thr Tyr Glu Cys Arg Ala His Asn Ser Val Gly Ser Gly Ser Trp 485 490 495 Ala Phe Ile 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Val Arg Arg Asp Ser Gly Phe Ser Ser Gln Gly Val 705 710 715 720 Asp Thr Tyr Val Glu Met Arg Pro Val Ser Thr Ser Ser Asn Asp Ser 725 730 735 Phe Ser Glu Gln Asp Leu Asp Lys Glu Asp Gly Arg Pro Leu Glu Leu 740 745 750 Arg Asp Leu Leu His Phe Ser Ser Gln Val Ala Gln Gly Met Ala Phe 755 760 765 Leu Ala Ser Lys Asn Cys Ile His Arg Asp Val Ala Ala Arg Asn Val 770 775 780 Leu Leu Thr Asn Gly His Val Ala Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala 785 790 795 800 Arg Asp Ile Met Asn Asp Ser Asn Tyr Ile Val Lys Gly Asn Ala Arg 805 810 815 Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Ile Phe Asp Cys Val Tyr 820 825 830 Thr Val Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Ile Leu Leu Trp Glu Ile 835 840 845 Phe Ser Leu Gly Leu Asn Pro Tyr Pro Gly Ile Leu Val Asn Ser Lys 850 855 860 Phe Tyr Lys Leu Val Lys Asp Gly Tyr Gln Met Ala Gln Pro Ala Phe 865 870 875 880 Ala Pro Lys Asn Ile Tyr Ser Ile Met Gln Ala Cys Trp Ala Leu Glu 885 890 895 Pro Thr His Arg Pro Thr Phe Gln Gln Ile Cys Ser Phe Leu Gln Glu 900 905 910 Gln Ala Gln Glu Asp Arg Arg Glu Arg Asp Tyr Thr Asn Leu Pro Ser 915 920 925 Ser Ser Arg Ser Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser Glu Leu Glu Glu 930 935 940 Glu Ser Ser Ser Glu His Leu Thr Cys Cys Glu Gln Gly Asp Ile Ala 945 950 955 960 Gln Pro Leu Leu Gln Pro Asn Asn Phe Gln Phe Cys 965 970

Claims

인간 CSF-1R에 결합하는 항체로서, 기탁된 항체 DSM ACC2921과 동일한 에피토프에 결합하는 항체.
제 1 항에 있어서,
중쇄 가변 도메인 CDR3 영역으로서, 서열번호 1의 CDR3 영역을 포함하는 항체.
제 2 항에 있어서,
(a) 중쇄 가변 도메인이 서열번호 1의 CDR3 영역, 서열번호 2의 CDR2 영역 및 서열번호 3의 CDR1 영역을 포함하고, 경쇄 가변 도메인이 서열번호 4의 CDR3 영역, 서열번호 5의 CDR2 영역 및 서열번호 6의 CDR1 영역을 포함하거나,
(b) (a)의 특징을 갖는 항체의 CDR 이식되거나, 인간화되거나, T 세포 에피토프 결실된 항체 변이체인
항체.
제 3 항에 있어서,
(a) 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열이 서열번호 7이고, 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열이 서열번호 8이거나,
(b) (a)의 특징을 갖는 항체의 CDR 이식되거나, 인간화되거나, T 세포 에피토프 결실된 항체 변이체인
항체.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
인간 IgG4 하위 부류 또는 인간 IgG1 하위 부류인 항체.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 단편을 포함하는 약학 조성물.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
암의 치료를 위한 항체.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
골 손실의 치료를 위한 항체.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
전이의 예방 또는 치료를 위한 항체.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
염증성 질병의 치료를 위한 항체.
CSF-1R에 결합하는 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산으로서, 제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 정의된 가변 도메인을 포함하는 핵산.
원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에서 CSF-1R에 결합하는 항체의 발현을 위해 제 11 항에 따른 핵산을 포함하는 발현 벡터.
제 12 항에 따른 벡터를 포함하는 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포.
원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에서 제 11 항에 따른 핵산을 발현시키고, 상기 세포 또는 세포 배양 상청액으로부터 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 재조합 항체를 회수하는, 상기 재조합 항체의 제조 방법.
(a) 중쇄 가변 도메인이 서열번호 1의 CDR3 영역, 서열번호 2의 CDR2 영역 및 서열번호 3의 CDR1 영역을 포함하고, 경쇄 가변 도메인이 서열번호 4의 CDR3 영역, 서열번호 5의 CDR2 영역 및 서열번호 6의 CDR1 영역을 포함하거나,
(b) (a)의 특징을 갖는 항체의 CDR 이식되거나, 인간화되거나, T 세포 에피토프 결실된 항체 변이체인
인간 CSF-1R에 결합하는 항체.
제 15 항에 있어서,
(a) 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열이 서열번호 7이고, 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열이 서열번호 8이거나,
(b) (a)의 특징을 갖는 항체의 CDR 이식되거나, 인간화되거나, T 세포 에피토프 결실된 항체 변이체인
항체.