KR20100028592A - Ｒｓｖ-특이적 결합 분자 및 이의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 RSV에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 및 이의 기능적 등가물과, 이를 제조하는 수단 및 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 생물학 및 의학 분야에 관한 것이다.
호흡기 합포체 바이러스(RSV; Respiratory Syncytial Virus)는 파라믹소바이러스 패밀리에 속하는 감기 바이러스이다. RSV는 독성이 강하고, 쉽게 전염될 수 있으며, 2세 미만의 유아에 있어 하기도(lower respiratory tract) 질병의 가장 흔한 원인이다. 데이 케어에 다니는 아동의 최대 98%가 단일 RSV 유행기에 감염된다. RSV에 감염된 아동의 0.5%∼3.2%는 입원이 필요하다. 매년 대략 90,000명의 입원과 4500명의 사망이 미국 내에서 보고되었다. RSV로 인한 입원에 대한 주요 위험 요인은 조산, 만성 폐 질환, 선천성 심장 질환, 저하된(compromised) 면역성, 및 그렇지 않은 경우 건강한 유아에서 6주 더 어린 연령이다. 충분한 영양섭취와 산소 요법의 형태로 지탱하는 관리에 의해서는 RSV 양성 세기관지염의 효과적인 치료가 가능하지 않다. 리바비린(Ribavirin)과 같은 항바이러스 요법은 RSV 감염에 효과적인 것으로 입증되지 않았다. 하나의 단일클론 항체, 팔리비주맙(Palivizumab; 또한 시나지스(Synagis)로도 언급됨)은 RSV의 감염 예방을 위해 등록되어 있다. 팔리비주맙은 RSV의 융합 단백질에 대한 유전자 조작된 (인간화) 단일클론 항체이다. 하지 만, 팔리비주맙이 항상 효과적인 것은 아니다. 따라서, RSV에 대한 대안적인 항체와 요법이 당업계에 필요한 실정이다.
본 발명의 목적은 RSV 관련 질병을 막고/막거나 예방하는 수단 및 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 추가 목적은 RSV에 대한 대안 및/또는 향상된 항체, 또는 상기 항체의 기능적 등가물을 제공하고, RSV에 대한 항체를 생성할 수 있는 안정한 세포 (또는 이의 기능적 등가물)를 제공하는 것이다.
본 발명은 RSV에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 및 이의 기능적 등가물을 제공한다. 본원에서 "항-RSV 항체" 또는 "RSV-특이적 항체"로 언급되는 상기 항체 및/또는 기능적 등가물은 RSV의 하나 이상의 성분, 예를 들어 RSV 단백질의 에피토프 등에 특이적으로 결합할 수 있다. 비특이적 접착은 용어 "특이적으로 결합하는"에 포함되지 않는다. 본 발명에 따른 항-RSV 항체 및 기능적 등가물은 RSV-감염 및/또는 RSV 감염의 악영향을 막고/막거나 적어도 부분적으로 예방하는데 특히 적당하다. 본 발명에 따른 특히 바람직한 하나의 항-RSV 항체는 도 11A∼도 D에 도시된 바와 같이 중쇄 영역 및 경쇄 영역을 갖는 "D25"로 고안된 항체이다. 특히 D25의 항원 결합성에 기여하는 D25의 CDR 서열은 도 11D에 도시한다. 항체 D25는 등록된 항-RSV 항체 팔리비주맙과 비교하였을 때 뛰어난 특징을 갖는 것으로 여겨진다(도 8). 예를 들어, HEp-2 세포가 RSV에 감염된 경우, 시험관내 중화 분석에서 D25는 IC50 값이 약 0.4∼1.5 ng/㎖인 반면, 팔리비주맙은 IC50 값이 약 453 ng/㎖이다.
항체의 기능적 등가물은 본원에서 항체의 기능적 부분, 유도체 또는 유사체로 규정된다.
항체의 기능적 부분은 양에서는 아니지만 같은 식으로 상기 항체와 하나 이상의 동일한 성질을 갖는 부분으로 규정된다. 상기 기능적 부분은 동일한 정도는 아니지만 상기 항체와 동일한 항원에 결합할 수 있다. 항체의 기능적 부분은 바람직하게는 단일 도메인 항체, 단일 쇄 항체, 단일 쇄 가변 단편(scFv), Fab 단편 또는 F(ab')2 단편을 포함한다.
항체의 기능적 유도체는 생성된 화합물의 하나 이상의 성질(바람직하게는 항원 결합성)이 양에서는 아니지만 같은 식으로 실질적으로 동일하도록 변경되는 항체로 규정된다. 유도체는 다수의 방식, 예를 들어 보존적 아미노산 치환을 통해 제공되어, 아미노산 잔기가 통상 유사한 성질(크기, 소수성 등)을 갖는 또다른 잔기로 치환되므로, 전체적인 기능에 심각하게 영향을 미치지는 않는다.
당업자는 항체의 유사 화합물을 잘 생성할 수 있다. 이는, 예를 들어 펩티드 라이브러리 또는 파지 표시 라이브러리의 스크리닝을 통해 실시된다. 상기 유사체는 양에서는 아니지만 실질적으로 같은 식으로 상기 항체와 하나 이상의 동일한 성질을 갖는다.
당업자에게 잘 공지된 바와 같이, 항체의 중쇄는 면역글로불린 분자를 구성하는 2개 유형의 쇄 중 더 큰 것이다. 중쇄는 불변 도메인과 가변 도메인을 포함하고, 상기 가변 도메인은 항원 결합성을 수반한다. 항체의 경쇄는 면역글로불린 분자를 구성하는 2개 유형의 쇄 중 더 작은 것이다. 경쇄는 불변 도메인과 가변 도메인을 포함한다. 상기 가변 도메인은, 중쇄의 가변 도메인과 함께, 항원 결합성을 수반한다.
상보성 결정 영역(CDR: Complementary-determining region)은 중쇄 가변 도메인과 경쇄 가변 도메인에 존재하는 극가변 영역이다. 항체의 중쇄 및 연결된 경쇄의 CDR은 함께 항원 결합 부위를 형성한다.
이하, 본 발명은 도 11에 도시된 CDR 서열이 바람직한 RSV 결합 특성을 제공하는 식견을 제공하므로, 당업자는 하나 이상의 변경된 CDR 서열을 포함하는 변이체를 잘 생성할 수 있다. 예를 들어, 보존적 아미노산 치환이 적용된다. 보존적 아미노산 치환은 하나의 아미노산을 통상 유사한 성질(크기, 소수성 등)을 갖는 또다른 아미노산으로 치환하는 것과 연관되므로, 전체적인 기능에 심각하게 영향을 미치지는 않는다.
또한 도 11에 도시된 하나 이상의 CDR 서열을 변화시켜 D25와 비교하였을 때 하나 이상의 변경된 성질을 갖는 변이 항체, 또는 이의 기능적 등가물을 생성할 수도 있다. 바람직하게는, 항체 또는 기능적 등가물은 도 11에 도시된 CDR 서열과 70% 이상 동일한 CDR 서열을 포함하도록 제공되므로, 바람직한 D25의 결합 특성은 적어도 부분적으로 유지되거나 또는 심지어 향상된다. 도 11에 도시된 CDR 서열은, 바람직하게는 생성된 항체 또는 기능적 등가물이 D25와 비교하였을 때 하나 이상의 향상된 성질, 예를 들어 향상된 결합 친화성, 선택성 및/또는 안정성 등을 포함하도록 변경된다. 따라서, 도 11에 도시된 CDR 서열과 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이 항체 또는 이의 기능적 등가물은 본 발명의 범위에 속한다. 아미노산 서열을 변경시키는 각종 방법들이 당업계에서 이용가능하다. 예를 들어, 목적하는 CDR 서열을 갖는 중쇄 또는 경쇄 서열은 인공적으로 합성된다. 바람직하게는, 예를 들어 무작위 (또는 부위 지정) 돌연변이유발을 이용하여 CDR 서열을 코딩하는 핵산 서열을 돌변변이시킨다.
일 측면에서, 본 발명은 이에 따라 호흡기 합포체 바이러스에 특이적으로 결합할 수 있고,
- 서열 NYIIN과 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 CDR1 서열, 및/또는
- 서열 GIIPVLGTVHYAPKFQG와 75% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 서열, 및/또는
- 서열 ETALVVSTTYLPHYFDN과 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 서열, 및/또는
- 서열 QASQDIVNYLN과 85% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 CDR1 서열, 및/또는
- 서열 VASNLET와 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 서열
을 포함하는 단리된, 합성 또는 재조합 항체 또는 이의 기능적 등가물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 항체는 또한 서열 QQYDNLP와 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 서열을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 항체 또는 기능적 등가물은 도 11D에 도시된 CDR 서열 중 하나 이상과 75% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상 동일한 CDR 서열을 포함한다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체 또는 기능적 등가물은 도 11D에 도시된 CDR 서열 중 하나 이상과 95% 이상 동일한 CDR 서열을 포함한다. 상기 기술된, 특히 바람직한 항체 D25는 도 11D에 도시된 CDR 서열로 이루어진 CDR 서열을 포함한다. 따라서, 본 발명에 따른 특히 바람직한 구체예는 호흡기 합포체 바이러스에 특이적으로 결합할 수 있고,
- 서열 NYIIN을 포함하는 중쇄 CDR1 서열, 및/또는
- 서열 GIIPVLGTVHYAPKFQG를 포함하는 중쇄 CDR2 서열, 및/또는
- 서열 ETALVVSTTYLPHYFDN을 포함하는 중쇄 CDR3 서열, 및/또는
- 서열 QASQDIVNYLN을 포함하는 경쇄 CDR1 서열, 및/또는
- 서열 VASNLET를 포함하는 경쇄 CDR2 서열
을 포함하는 단리된, 합성 또는 재조합 항체 또는 이의 기능적 등가물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 항체는 또한 서열 QQYDNLP를 포함하는 경쇄 CDR3 서열을 포함한다.
일 구체예에서, 항체 또는 기능적 등가물은 도 11D에 도시된 3개의 중쇄 CDR 서열과 3개의 경쇄 CDR 서열, 또는 이에 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상 동일한 서열을 포함하는 것이 제공된다. 따라서, 서열 NYIIN에 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 CDR1 서열 및 서열 GIIPVLGTVHYAPKFQG와 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 서열 및 서열 ETALVVSTTYLPHYFDN과 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 서열 및 서열 QASQDIVNYLN과 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 CDR1 서열 및 서열 VASNLET와 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 서열, 및 서열 QQYDNLP와 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 단리된, 합성 또는 재조합 항체 또는 이의 기능적 등가물을 추가로 제공한다. 상기 항체 또는 기능적 등가물 바람직하게는 도 11D에 도시된 중쇄 CDR 서열 및 경쇄 CDR 서열과 75% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상 동일한 CDR 서열을 포함한다. 상기 언급된 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열과, 상기 언급된 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체 또는 기능적 등가물이 또한 제공된다.
도 11에 도시된 중쇄 서열과 70% 이상 동일한 가변성 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 기능적 등가물이 또한 제공된다. 항체 D25에 의해 입증된 바와 같이, 상기 중쇄 서열은 바람직한 RSV-결합성을 제공한다. 따라서, 서열 QVQLVQSGAEVKKPGSSVMVSCQASGGPLRNYIINWLRQAPGQGPEWMGGIIPVLGTVHYAPKFQGRVTITADESTDTAYIHLISLRSEDTAMYYCATETALVVSTTYLPHYFDNWGQGTLVTVSS와 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 서열을 갖는 항체 또는 이의 기능적 등가물이 추가로 제공된다. 또한, 항체 D25에 의해 입증된 바와 같이, 도 11에 도시된 경쇄 서열과 70% 이상 동일한 가변성 경쇄 아미노산 서열은 또한 바람직한 RSV-결합성을 제공한다. 따라서, 서열 DIQMTQSPSSLSAAVGDRVTITCQASQDIVNYLNWYQQKPGKAPKLLIYVASNLETGVPSRFSGSGSGTDFSLTISSLQPEDVATYYCQQYDNLPLTFGGGTKVEIKRTV와 70% 이상 동일한 경쇄 서열을 갖는 항체, 또는 이의 기능적 등가물을 또한 제공한다. 본 발명에 따른 항체 또는 기능적 부분은 바람직하게는 도 11에 도시된 중쇄 서열 및/또는 경쇄 서열과 75% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상 동일한 가변성 중쇄 서열 및/또는 가변성 경쇄 서열을 포함한다. 상동성이 높을수록, 상기 항체 또는 기능적 부분이 항체 D25와 더욱 가깝게 닮는다. 본 발명에 따른 항체 또는 기능적 부분은 바람직하게는 D25의 중쇄 및 경쇄와 닮은 중쇄와 경쇄를 포함한다. 따라서, 도 11에 도시된 중쇄 서열 및 경쇄 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상 동일한 중쇄 서열 및 경쇄 서열을 포함하는 항체 또는 기능적 부분이 추가로 제공된다.
일 구체예는 도 11에 도시된 중쇄 서열로 이루어진 중쇄 서열, 및 도 11에 도시된 경쇄 서열로 이루어진 경쇄 서열을 포함하는 항체 또는 이의 기능적 등가물을 제공한다. 대안적으로, 당업자에게 잘 공지된 바와 같이, 관심 결합성을 유지하면서 단축된 중쇄 또는 경쇄 서열을 생성할 수 있다. 바람직하게는, 상기 단축된 중쇄 또는 경쇄는, 원래의 중쇄 또는 경쇄와 비교하였을 때, 단축된 불변 영역을 갖는 것이 생성된다. 가변 도메인은 바람직하게는 유지된다. 예를 들어, 도 11에 도시된 중쇄 서열 또는 경쇄 서열을 기초로 하는 Fab 단편 또는 F(ab')2 단편이 생성된다. 따라서, 도 11에 도시된 서열의 적어도 기능적 부분을 포함하는 항체의 기능적 등가물이 또한 제공된다. 상기 기능적 부분은 길이가 20개 이상인 아미노산을 갖고, 도 11D에 도시된 중쇄 CDR1 서열과 70% 이상 동일한 서열, 및/또는 도 11D도 도시된 중쇄 CDR2 서열과 75% 이상 동일한 서열, 및/또는 도 11D에 도시된 중쇄 CDR3 서열과 70% 이상 동일한 서열, 및/또는 도 11D에 도시된 경쇄 CDR1 서열과 85% 이상 동일한 서열, 및/또는 도 11D에 도시된 경쇄 CDR2 서열과 70% 이상 동일한 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 기능적 부분은 또한 도 11D에 도시된 경쇄 CDR3 서열과 70% 이상 동일한 서열을 포함한다.
본 발명에 따른 특히 바람직한 또다른 항-RSV 항체는 도 14A에 도시된 중쇄 영역과 경쇄 영역을 갖는 "AM14"로 고안된 항체이다. 특히 AM14의 항원 결합성에 기여하는 AM14의 CDR 서열은 또한 도 14A에 도시된 바와 같다.
이하, 본 발명은 도 14A에 도시된 CDR 서열이 바람직한 RSV 결합 특성을 제공하는 식견을 제공하므로, 당업자는 하나 이상의 변경된 CDR 서열을 포함하는 변이체를 잘 생성할 수 있다. 예를 들어, 보존적 아미노산 치환이 적용된다. 보존적 아미노산 치환은 하나의 아미노산을 통상 유사한 성질(크기, 소수성 등)을 갖는 또다른 아미노산으로 치환하는 것과 연관되므로, 전체적인 기능에 심각하게 영향을 미치지는 않는다.
또한 도 14A에 도시된 하나 이상의 CDR 서열을 변화시켜 AM14와 비교하였을 때 하나 이상의 변경된 성질을 갖는 변이 항체, 또는 이의 기능적 등가물을 생성할 수도 있다. 바람직하게는, 항체 또는 기능적 등가물은 도 14A에 도시된 CDR 서열과 70% 이상 동일한 CDR 서열을 포함하도록 제공되므로, 바람직한 AM14의 결합 특성은 적어도 부분적으로 유지되거나 또는 심지어 향상된다. 도 14A에 도시된 CDR 서열은, 바람직하게는 생성된 항체 또는 기능적 등가물이 AM14와 비교하였을 때 하나 이상의 향상된 성질, 예를 들어 향상된 결합 친화성, 선택성 및/또는 안정성 등을 포함하도록 변경된다. 따라서, 도 14A에 도시된 CDR 서열과 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이 항체 또는 이의 기능적 등가물은 본 발명의 범위에 속한다. 아미노산 서열을 변경시키는 각종 방법들이 당업계에서 이용가능하다. 예를 들어, 목적하는 CDR 서열을 갖는 중쇄 또는 경쇄 서열은 인공적으로 합성된다. 바람직하게는, 예를 들어 무작위 (또는 부위 지정) 돌연변이유발을 이용하여 CDR 서열을 코딩하는 핵산 서열을 돌변변이시킨다.
일 측면에서, 본 발명은 이에 따라 호흡기 합포체 바이러스에 특이적으로 결합할 수 있고,
- 서열 GFSFSHYA와 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 CDR1 서열, 및/또는
- 서열 ISYDGENT와 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 서열, 및/또는
- 서열 ARDRIVDDYYYYGMDV와 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 서열, 및/또는
- 서열 QDIKKY와 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 CDR1 서열, 및/또는
- 서열 DAS와 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 서열, 및/또는
- 서열 QQYDNLPPLT와 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 서열
을 포함하는 단리된, 합성 또는 재조합 항체 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 제공한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 항체 또는 기능적 등가물은 도 14A에 도시된 CDR 서열 중 하나 이상과 75% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상 동일한 CDR 서열을 포함한다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체 또는 기능적 등가물은 도 14A에 도시된 CDR 서열 중 하나 이상과 95% 이상 동일한 CDR 서열을 포함한다. 상기 기술된 특히 바람직한 항체 AM14는 도 14A에 도시된 CDR 서열로 이루어진 CDR 서열을 포함한다. 따라서, 본 발명에 따른 특히 바람직한 구체예는 호흡기 합포체 바이러스에 특이적으로 결합할 수 있고,
- 서열 GFSFSHYA를 포함하는 중쇄 CDR1 서열, 및/또는
- 서열 ISYDGENT를 포함하는 중쇄 CDR2 서열, 및/또는
- 서열 ARDRIVDDYYYYGMDV를 포함하는 중쇄 CDR3 서열, 및/또는
- 서열 QDIKKY를 포함하는 경쇄 CDR1 서열, 및/또는
- 서열 DAS를 포함하는 경쇄 CDR2 서열, 및/또는
- 서열 QQYDNLPPLT를 포함하는 경쇄 CDR3 서열
을 포함하는 단리된, 합성 또는 재조합 항체 또는 이의 기능적 등가물을 제공한다.
일 구체예에서, 항체 또는 기능적 등가물은 도 14A에 도시된 3개의 중쇄 CDR 서열 및 3개의 경쇄 CDR 서열, 또는 이에 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 것이 제공된다. 따라서, 서열 GFSFSHYA와 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 CDR1 서열 및 서열 ISYDGENT와 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 서열 및 서열 ARDRIVDDYYYYGMDV와 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 서열 및 서열 QDIKKY와 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 CDR1 서열 및 서열 DAS와 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 서열, 및 서열 QQYDNLPPLT와 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 단리된, 합성 또는 재조합 항체 또는 이의 기능적 등가물이 추가로 제공된다. 상기 항체 또는 기능적 등가물은 바람직하게는 도 14A에 도시된 중쇄 CDR 서열 및 경쇄 CDR 서열과 75% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상 동일한 CDR 서열을 포함한다. 상기 언급된 도 14A의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열과, 상기 언급된 도 14A의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체 또는 기능적 등가물이 또한 제공된다.
도 14A에 도시된 중쇄 서열과 70% 이상 동일한 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 기능적 등가물이 또한 제공된다. 항체 AM14에 의해 입증된 바와 같이, 상기 중쇄 서열은 바람직한 RSV-결합성을 제공한다. 따라서, 서열 EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSHYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGENTYYADSVKGRFSISRDNSKNTVSLQMNSLRPEDTALYYCARDRIVDDYYYYGMDVWGQGATVTVSS와 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 서열을 갖는 항체 또는 이의 기능적 등가물이 추가로 제공된다. 또한, 도 14A에 도시된 경쇄 서열과 70% 이상 동일한 경쇄 아미노산 서열은 또한 항체 AM14에 의해 입증된 바와 같이 바람직한 RSV-결합성을 제공한다. 따라서, 서열 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDIKKYLNWYHQKPGKVPELLMHDASNLETGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQPEDIGTYYCQQYDNLPPLTFGGGTKVEIKRTV와 70% 이상 동일한 경쇄 서열을 갖는 항체, 또는 이의 기능적 등가물이 또한 제공된다. 본 발명에 따른 항체 또는 기능적 부분은 바람직하게는 도 14A에 도시된 중쇄 서열 및/또는 경쇄 서열과 75% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상 동일한 가변성 중쇄 서열 및/또는 가변성 경쇄 서열을 포함한다. 상동성이 높을수록, 상기 항체 또는 기능적 부분이 항체 AM14와 더욱 가깝게 닮는다. 본 발명에 따른 항체 또는 기능적 부분은 바람직하게는 AM14의 중쇄 및 경쇄와 닮은 중쇄와 경쇄를 포함한다. 따라서, 도 14A에 도시된 중쇄 서열 및 경쇄 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상 동일한 중쇄 서열 및 경쇄 서열을 포함하는 항체 또는 기능적 부분이 추가로 제공된다.
일 구체예는 도 14A에 도시된 중쇄 서열로 이루어진 중쇄 서열, 및 도 14A에 도시된 경쇄 서열로 이루어진 경쇄 서열을 포함하는 항체 또는 이의 기능적 등가물을 제공한다. 대안적으로, 당업자에게 잘 공지된 바와 같이, 관심 결합성을 유지하면서 단축된 중쇄 또는 경쇄 서열을 생성할 수 있다. 바람직하게는, 상기 단축된 중쇄 또는 경쇄는, 원래의 중쇄 또는 경쇄와 비교하였을 때, 단축된 불변 영역을 갖는 것이 생성된다. 가변 도메인은 바람직하게는 유지된다. 예를 들어, 도 14A에 도시된 중쇄 서열 또는 경쇄 서열을 기초로 하는 Fab 단편 또는 F(ab')2 단편이 생성된다. 따라서, 도 14A에 도시된 서열의 적어도 기능적 부분을 포함하는 항체의 기능적 등가물이 또한 제공된다. 상기 기능적 부분은 길이가 20개 이상인 아미노산을 갖고, 도 14A에 도시된 CDR 서열 중 하나 이상과 70% 이상 동일한 서열을 포함한다.
본 발명에 따른 특히 바람직한 또다른 항-RSV 항체는 도 14B에 도시된 중쇄 영역과 경쇄 영역을 갖는 "AM16"으로 고안된 항체이다. 특히 AM16의 항원 결합성에 기여하는 AM16의 CDR 서열은 또한 도 14B에 도시된 바와 같다.
이하, 본 발명은 도 14B에 도시된 CDR 서열이 바람직한 RSV 결합 특성을 제공하는 식견을 제공하므로, 당업자는 하나 이상의 변경된 CDR 서열을 포함하는 변이체를 잘 생성할 수 있다. 예를 들어, 보존적 아미노산 치환이 적용된다. 보존적 아미노산 치환은 하나의 아미노산을 통상 유사한 성질(크기, 소수성 등)을 갖는 또다른 아미노산으로 치환하는 것과 연관되므로, 전체적인 기능에 심각하게 영향을 미치지는 않는다.
또한 도 14B에 도시된 하나 이상의 CDR 서열을 변화시켜 AM16과 비교하였을 때 하나 이상의 변경된 성질을 갖는 변이 항체, 또는 이의 기능적 등가물을 생성할 수도 있다. 바람직하게는, 항체 또는 기능적 등가물은 도 14B에 도시된 CDR 서열과 70% 이상 동일한 CDR 서열을 포함하도록 제공되므로, 바람직한 AM16의 결합 특성은 적어도 부분적으로 유지되거나 또는 심지어 향상된다. 도 14B에 도시된 CDR 서열은, 바람직하게는 생성된 항체 또는 기능적 등가물이 AM16과 비교하였을 때 하나 이상의 향상된 성질, 예를 들어 향상된 결합 친화성, 선택성 및/또는 안정성 등을 포함하도록 변경된다. 따라서, 도 14B에 도시된 CDR 서열과 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이 항체 또는 이의 기능적 등가물은 본 발명의 범위에 속한다. 아미노산 서열을 변경시키는 각종 방법들이 당업계에서 이용가능하다. 예를 들어, 목적하는 CDR 서열을 갖는 중쇄 또는 경쇄 서열은 인공적으로 합성된다. 바람직하게는, 예를 들어 무작위 (또는 부위 지정) 돌연변이유발을 이용하여 CDR 서열을 코딩하는 핵산 서열을 돌변변이시킨다.
일 측면에서, 본 발명은 이에 따라 호흡기 합포체 바이러스에 특이적으로 결합할 수 있고,
- 서열 GFTFSSYN에 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 CDR1 서열, 및/또는
- 서열 ISAGSSYI에 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 서열, 및/또는
- 서열 AREDYGPGNYYSPNWFDP에 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 서열, 및/또는
- 서열 SSNIGAGYD에 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 CDR1 서열, 및/또는
- 서열 GNT에 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 서열, 및/또는
- 서열 HSYDRSLSG에 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 서열
을 포함하는 단리된, 합성 또는 재조합 항체 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 제공한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 항체 또는 기능적 등가물은 도 14B에 도시된 CDR 서열 중 하나 이상과 75% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상 동일한 CDR 서열을 포함한다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체 또는 기능적 등가물은 도 14B에 도시된 CDR 서열 중 하나 이상과 95% 이상 동일한 CDR 서열을 포함한다. 상기 기술된 특히 바람직한 항체 AM16은 도 14B에 도시된 CDR 서열로 이루어진 CDR 서열을 포함한다. 따라서, 본 발명에 따른 특히 바람직한 구체예는 호흡기 합포체 바이러스에 특이적으로 결합할 수 있고,
- 서열 GFTFSSYN을 포함하는 중쇄 CDR1 서열, 및/또는
- 서열 ISAGSSYI를 포함하는 중쇄 CDR2 서열, 및/또는
- 서열 AREDYGPGNYYSPNWFDP를 포함하는 중쇄 CDR3 서열, 및/또는
- 서열 SSNIGAGYD를 포함하는 경쇄 CDR1 서열, 및/또는
- 서열 GNT를 포함하는 경쇄 CDR2 서열, 및/또는
- 서열 HSYDRSLSG를 포함하는 경쇄 CDR3 서열
을 포함하는 단리된, 합성 또는 재조합 항체 또는 이의 기능적 등가물을 제공한다.
일 구체예에서, 항체 또는 기능적 등가물은 도 14B에 도시된 3개의 중쇄 CDR 서열 및 3개의 경쇄 CDR 서열, 또는 이에 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 것이 제공된다. 따라서, 서열 GFTFSSYN에 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 CDR1 서열 및 서열 ISAGSSYI에 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 서열 및 서열 AREDYGPGNYYSPNWFDP에 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 서열 및 서열 SSNIGAGYD에 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 CDR1 서열 및 서열 GNT에 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 서열, 및 서열 HSYDRSLSG에 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 단리된, 합성 또는 재조합 항체 또는 이의 기능적 등가물이 추가로 제공된다. 상기 항체 또는 기능적 등가물은 바람직하게는 도 14B에 도시된 상기 언급된 중쇄 CDR 서열 및 상기 언급된 경쇄 CDR 서열과 75% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상 동일한 CDR 서열을 포함한다. 도 14B의 상기 언급된 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열과, 도 14B의 상기 언급된 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체 또는 기능적 등가물이 또한 제공된다.
도 14B에 도시된 중쇄 서열과 70% 이상 동일한 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 기능적 등가물이 또한 제공된다. 항체 AM16에 의해 입증된 바와 같이, 상기 중쇄 서열은 바람직한 RSV-결합성을 제공한다. 따라서, 서열 EVQLVETGGGLAQPGGSLRLSCAASGFTFSSYNMNWVRQAPGKGLEWVSHISAGSSYIYYSDSVKGRFTVSRDNVRNSVYLQMNSLRAADTAVYYCAREDYGPGNYYSPNWFDPWGQGTLVTVSS와 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 서열을 갖는 항체 또는 이의 기능적 등가물이 추가로 제공된다. 또한, 항체 AM16에 의해 입증된 바와 같이, 도 14B에 도시된 경쇄 서열과 70% 이상 동일한 경쇄 아미노산 서열은 또한 바람직한 RSV-결합성을 제공한다. 따라서, 서열 QSVVTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNTNRPSGVSDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCHSYDRSLSGSVFGGGTKLTV와 70% 이상 동일한 경쇄 서열을 갖는 항체, 또는 이의 기능적 등가물이 또한 제공된다. 본 발명에 따른 항체 또는 기능적 부분은 바람직하게는 도 14B에 도시된 중쇄 서열 및/또는 경쇄 서열과 75% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상 동일한 가변성 중쇄 서열 및/또는 가변성 경쇄 서열을 포함한다. 상동성이 높을수록, 상기 항체 또는 기능적 부분이 항체 AM16과 더욱 가깝게 닮는다. 본 발명에 따른 항체 또는 기능적 부분은 바람직하게는 AM16의 중쇄 및 경쇄와 닮은 중쇄와 경쇄를 포함한다. 따라서, 도 14B에 도시된 중쇄 서열 및 경쇄 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상 동일한 중쇄 서열 및 경쇄 서열을 포함하는 항체 또는 기능적 부분이 추가로 제공된다.
일 구체예는 도 14B에 도시된 중쇄 서열로 이루어진 중쇄 서열, 및 도 14B에 도시된 경쇄 서열로 이루어진 경쇄 서열을 포함하는 항체 또는 이의 기능적 등가물을 제공한다. 대안적으로, 당업자에게 잘 공지된 바와 같이, 관심 결합성을 유지하면서 단축된 중쇄 또는 경쇄 서열을 생성할 수 있다. 바람직하게는, 상기 단축된 중쇄 또는 경쇄는, 원래의 중쇄 또는 경쇄와 비교하였을 때, 단축된 불변 영역을 갖는 것이 생성된다. 가변 도메인은 바람직하게는 유지된다. 예를 들어, 도 14B에 도시된 중쇄 서열 또는 경쇄 서열을 기초로 하는 Fab 단편 또는 F(ab')2 단편이 생성된다. 따라서, 도 14B에 도시된 서열의 적어도 기능적 부분을 포함하는 항체의 기능적 등가물이 또한 제공된다. 상기 기능적 부분은 길이가 20개 이상인 아미노산을 갖고, 도 14B에 도시된 CDR 서열 중 하나 이상과 70% 이상 동일한 서열을 포함한다.
본 발명에 따른 특히 바람직한 또다른 항-RSV 항체는 도 14C에 도시된 중쇄 영역과 경쇄 영역을 갖는 "AM23"으로 고안된 항체이다. 특히 AM23의 항원 결합성에 기여하는 AM23의 CDR 서열은 또한 도 14C에 도시된 바와 같다.
이하, 본 발명은 도 14C에 도시된 CDR 서열이 바람직한 RSV 결합 특성을 제공하는 식견을 제공하므로, 당업자는 하나 이상의 변경된 CDR 서열을 포함하는 변이체를 잘 생성할 수 있다. 예를 들어, 보존적 아미노산 치환이 적용된다. 보존적 아미노산 치환은 하나의 아미노산을 통상 유사한 성질(크기, 소수성 등)을 갖는 또다른 아미노산으로 치환하는 것과 연관되므로, 전체적인 기능에 심각하게 영향을 미치지는 않는다.
또한 도 14C에 도시된 하나 이상의 CDR 서열을 변화시켜 AM23과 비교하였을 때 하나 이상의 변경된 성질을 갖는 변이 항체, 또는 이의 기능적 등가물을 생성할 수도 있다. 바람직하게는, 항체 또는 기능적 등가물은 도 14C에 도시된 CDR 서열과 70% 이상 동일한 CDR 서열을 포함하도록 제공되므로, 바람직한 AM23의 결합 특성은 적어도 부분적으로 유지되거나 또는 심지어 향상된다. 도 14C에 도시된 CDR 서열은, 바람직하게는 생성된 항체 또는 기능적 등가물이 AM23과 비교하였을 때 하나 이상의 향상된 성질, 예를 들어 향상된 결합 친화성, 선택성 및/또는 안정성 등을 포함하도록 변경된다. 따라서, 도 14C에 도시된 CDR 서열과 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이 항체 또는 이의 기능적 등가물은 본 발명의 범위에 속한다. 아미노산 서열을 변경시키는 각종 방법들이 당업계에서 이용가능하다. 예를 들어, 목적하는 CDR 서열을 갖는 중쇄 또는 경쇄 서열은 인공적으로 합성된다. 바람직하게는, 예를 들어 무작위 (또는 부위 지정) 돌연변이유발을 이용하여 CDR 서열을 코딩하는 핵산 서열을 돌변변이시킨다.
일 측면에서, 본 발명은 이에 따라 호흡기 합포체 바이러스에 특이적으로 결합할 수 있고,
- 서열 GFNFHNYG에 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 CDR1 서열, 및/또는
- 서열 VWYDGSKK에 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 서열, 및/또는
- 서열 VRDKVGPTPYFDS에 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 서열, 및/또는
- 서열 NIGSET에 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 CDR1 서열, 및/또는
- 서열 DDD에 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 서열, 및/또는
- 서열 QVWDRSNYHQV에 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 서열
을 포함하는 단리된, 합성 또는 재조합 항체 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 제공한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 항체 또는 기능적 등가물은 도 14C에 도시된 CDR 서열 중 하나 이상과 75% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상 동일한 CDR 서열을 포함한다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체 또는 기능적 등가물은 도 14C에 도시된 CDR 서열 중 하나 이상과 95% 이상 동일한 CDR 서열을 포함한다. 상기 기술된 특히 바람직한 항체 AM23은 도 14C에 도시된 CDR 서열로 이루어진 CDR 서열을 포함한다. 따라서, 본 발명에 따른 특히 바람직한 구체예는 호흡기 합포체 바이러스에 특이적으로 결합할 수 있고,
- 서열 GFNFHNYG를 포함하는 중쇄 CDR1 서열, 및/또는
- 서열 VWYDGSKK를 포함하는 중쇄 CDR2 서열, 및/또는
- 서열 VRDKVGPTPYFDS를 포함하는 중쇄 CDR3 서열, 및/또는
- 서열 NIGSET를 포함하는 경쇄 CDR1 서열, 및/또는
- 서열 DDD를 포함하는 경쇄 CDR2 서열, 및/또는
- 서열 QVWDRSNYHQV를 포함하는 경쇄 CDR3 서열
을 포함하는 단리된, 합성 또는 재조합 항체 또는 이의 기능적 등가물을 제공한다.
일 구체예에서, 항체 또는 기능적 등가물은 도 14C에 도시된 3개의 중쇄 CDR 서열 및 3개의 경쇄 CDR 서열, 또는 이에 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 것이 제공된다. 따라서, 서열 GFNFHNYG에 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 CDR1 서열 및 서열 VWYDGSKK에 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 서열 및 서열 VRDKVGPTPYFDS에 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 서열 및 서열 NIGSET에 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 CDR1 서열 및 서열 DDD에 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 서열, 및 서열 QVWDRSNYHQV에 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 단리된, 합성 또는 재조합 항체 또는 이의 기능적 등가물이 추가로 제공된다. 상기 항체 또는 기능적 등가물은 바람직하게는 도 14C에 도시된 상기 언급된 중쇄 CDR 서열 및 상기 언급된 경쇄 CDR 서열과 75% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상 동일한 CDR 서열을 포함한다. 도 14C의 상기 언급된 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열과, 도 14C의 상기 언급된 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체 또는 기능적 등가물이 또한 제공된다.
도 14C에 도시된 중쇄 서열과 70% 이상 동일한 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 기능적 등가물이 또한 제공된다. 항체 AM23에 의해 입증된 바와 같이, 상기 중쇄 서열은 바람직한 RSV-결합성을 제공한다. 따라서, 서열 EVQLVESGGNVVKPGTSLRLSCAATGFNFHNYGMNWVRQAPGKGLEWVAVVWYDGSKKYYADSVTGRFAISRDNSKNTLYLQMNSLRVEDTAVYYCVRDKVGPTPYFDSWGQGTLVTVSS와 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 서열을 갖는 항체 또는 이의 기능적 등가물이 추가로 제공된다. 또한, 항체 AM23에 의해 입증된 바와 같이, 도 14C에 도시된 경쇄 서열과 70% 이상 동일한 경쇄 아미노산 서열은 또한 바람직한 RSV-결합성을 제공한다. 따라서, 서열 SYVLTQPPSVSLAPGGTAAITCGRNNIGSETVHWYQQKPGQAPVLVVYDDDDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDRSNYHQVFGGGTKLTV와 70% 이상 동일한 경쇄 서열을 갖는 항체, 또는 이의 기능적 등가물이 또한 제공된다. 본 발명에 따른 항체 또는 기능적 부분은 바람직하게는 도 14C에 도시된 중쇄 서열 및/또는 경쇄 서열과 75% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상 동일한 가변성 중쇄 서열 및/또는 가변성 경쇄 서열을 포함한다. 상동성이 높을수록, 상기 항체 또는 기능적 부분이 항체 AM23과 더욱 가깝게 닮는다. 본 발명에 따른 항체 또는 기능적 부분은 바람직하게는 AM23의 중쇄 및 경쇄와 닮은 중쇄와 경쇄를 포함한다. 따라서, 도 14C에 도시된 중쇄 서열 및 경쇄 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상 동일한 중쇄 서열 및 경쇄 서열을 포함하는 항체 또는 기능적 부분이 추가로 제공된다.
일 구체예는 도 14C에 도시된 중쇄 서열로 이루어진 중쇄 서열, 및 도 14C에 도시된 경쇄 서열로 이루어진 경쇄 서열을 포함하는 항체 또는 이의 기능적 등가물을 제공한다. 대안적으로, 당업자에게 잘 공지된 바와 같이, 관심 결합성을 유지하면서 단축된 중쇄 또는 경쇄 서열을 생성할 수 있다. 바람직하게는, 상기 단축된 중쇄 또는 경쇄는, 원래의 중쇄 또는 경쇄와 비교하였을 때, 단축된 불변 영역을 갖는 것이 생성된다. 가변 도메인은 바람직하게는 유지된다. 예를 들어, 도 14C에 도시된 중쇄 서열 또는 경쇄 서열을 기초로 하는 Fab 단편 또는 F(ab')2 단편이 생성된다. 따라서, 도 14C에 도시된 서열의 적어도 기능적 부분을 포함하는 항체의 기능적 등가물이 또한 제공된다. 상기 기능적 부분은 길이가 20개 이상인 아미노산을 갖고, 도 14C에 도시된 CDR 서열 중 하나 이상과 70% 이상 동일한 서열을 포함한다.
본 발명은 기존의 항체와 비교하였을 때 향상된 성질을 갖는 RSV-특이적 항체 또는 이의 기능적 등가물을 제공한다. 본 발명자들은 IC50 값이 낮은 RSV-특이적 항체를 생성하는데 성공하였다. 상기 항체는 RSV에 대해 특히 높거나 강한 친화력을 가져서 RSV-감염 및/또는 RSV 감염의 악영향을 막고/막거나 적어도 부분적으로 예방하는데 특히 적당하다. 일 구체예는, HEp-2 세포를 RSV, 및 상기 항체의 기능적 등가물로 감염시킨 시험관내 중화 분석법에서 IC50 값이 10 ng/㎖ 미만인 항체를 제공한다. 상기 항체 또는 기능적 등가물은 바람직하게는 IC50 값이 5 ng/㎖ 미만, 더욱 바람직하게는 2 ng/㎖ 미만이다. 바람직한 항체 D25는 실시예(도 8 참조)에 기술된 시험관내 중화 분석법에서 IC50 값이 약 0.5∼1.5 ng/㎖이다.
본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 인간 항체이다. 인간 치료를 위한 인간 항체의 사용은 인간 개체 내에서 인간외 서열에 대한 면역 반응으로 인한 부작용의 가능성을 줄인다. 또다른 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 항체 또는 기능적 부분, 유도체 또는 유사체는 키메라 항체이다. 이런 식으로, 관심 서열, 예컨대 관심 결합 부위 등이 본 발명에 따른 항체 또는 기능적 등가물로 포함될 수 있다.
본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 기능적 등가물을 코딩하는 단리된, 합성 또는 재조합 핵산 서열, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 또는 유사체를 추가로 제공한다. 하기 더욱 자세하게 개설된 바와 같이, 상기 핵산은, 예를 들어 본 발명에 따른 항체를 생성할수 있는 B 세포로부터 단리된다. 바람직한 구체예는 도 11, 도 12, 도 14A, 도 14B 및/또는 도 14B에 도시된 핵산 서열의 적어도 기능적 부분과 70% 상동성이 있는 서열을 포함하는 핵산 서열을 제공한다. 상기 핵산 서열은 바람직하게는 도 11, 도 12, 도 14A, 도 14B 및/또는 도 14B에 도시된 핵산 서열의 적어도 기능적 부분과 75% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상 상동성이 있는 서열을 포함한다. 상기 기능적 부분은 길이가 30개 이상인 뉴클레오티드, 바람직하게는 50개 이상인 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 75개 이상인 뉴클레오티드를 갖는다. 바람직하게는, 상기 기능적 부분은 도 11D, 도 12, 도 14A, 도 14B 및/또는 도 14B에 도시된 하나 이상의 핵산 서열을 코딩한다. 상기 서열은 바람직하게는 CDR 서열이다.
본 발명에 따른 항체 또는 기능적 등가물은 의약 또는 예방제로 사용하기에 특히 적당하다. 따라서, 의약 및/또는 예방제로 사용하기 위한 본 발명에 따른 항체, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 또는 유사체가 또한 여기에 제공된다. 특히 바람직한 구체예에서, 상기 항체는 항체 D25, AM14, AM16 및/또는 AM23, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 또는 유사체를 포함한다. 상기 의약 또는 예방제는 바람직하게는 RSV-감염을 막거나 적어도 부분적으로 예방하거나 또는 RSV-감염의 악영향을 막거나 적어도 부분적으로 예방하는데 사용된다. 따라서, RSV-관련 질환을 적어도 부분적으로 치료하고/하거나 예방하는 의약 및/또는 예방제를 제조하기 위한 본 발명에 따른 항체, 이의 기능적 부분, 유도체 또는 유사체의 용도, 및 RSV-관련 질환을 적어도 부분적으로 치료하거나 예방하는 방법으로서, 이것이 필요한 개체에게 본 발명에 따른 항체 또는 기능적 등가물의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법이 제공된다. 상기 항체는 바람직하게는 항체 D25, AM14, AM16 및/또는 AM23, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 또는 유사체를 포함한다.
RSV를 막기 위해, 본 발명에 따른 항체 또는 기능적 등가물은 바람직하게는 RSV-감염이 일어나기 전에 개체에 투여된다. 대안적으로, 본 발명에 따른 항체 또는 기능적 등가물은 개체가 이미 RSV에 감염된 경우 투여된다. 상기 항체 또는 기능적 등가물은 바람직하게는 RSV-관련 질환의 위험이 증가된 개체, 예를 들어 조산된 영아, 만성 폐 질환, 선천성 심장 질환 및/또는 저하된 면역성을 앓는 개체, 및 6주 더 어린 연령의 유아에게 투여된다. 또한 고령자는 RSV-관련 질환의 위험이 증가된다. 본 발명에 따른 항체 또는 기능적 등가물은 바람직하게는 경구 또는 하나 이상의 주사를 통해 투여된다. 본원에 기술된 치료 용도로 사용하고자 하는 본 발명에 따른 항체 및/또는 기능적 등가물의 투여 범위는 엄격한 프로토콜 조건이 존재하는 임상 실험의 임상에서 상승하는 용량 연구를 기초로 하여 고안된다. 통상적인 투여량은 체중 1 kg 당 0.1∼10 mg이다. 치료 용도의 경우, 본 발명에 따른 항체 또는 기능적 등가물은 통상 약학적으로 허용되는 담체, 보조제, 희석제 및/또는 부형제와 조합된다. 예를 들어, 적당한 담체의 예는 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH; keyhole limpet haemocyanin), 혈청 알부민(예, BSA 또는 RSA) 및 난백알부민을 포함한다. 유계 및 수계의 다수의 적당한 보조제는 당업자에게 공지되어 있다. 일 구체예에서, 상기 보조제는 스페콜(Specol)을 포함한다. 또다른 구체예에서, 상기 적당한 담체는, 예를 들어 식염수와 같은 용액을 포함한다.
또다른 구체예에서, 본 발명에 따른 항체 또는 기능적 부분을 코딩하는 핵산이 사용된다. 상기 핵산의 투여시, 항체 또는 기능적 등가물은 숙주의 기관(machinery)에 의해 생성된다. 생성된 항체 또는 기능적 등가물은 RSV-감염 및/또는 RSV-감염의 악영향을 예방하고/하거나 막을 수 있다. 따라서, 의약 및/또는 예방제로 사용하기 위해 본 발명에 따른 핵산 서열, 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체가 여기에 제공된다. 상기 핵산은 바람직하게는 RSV를 막는데 사용된다. 따라서, RSV-관련 질환을 적어도 부분적으로 치료하고/하거나 예방하는 의약 및/또는 예방제를 제조하기 위한 본 발명에 따른 핵산 서열, 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체의 용도가 추가로 제공된다.
본 발명의 핵산의 적어도 기능적 부분에 의한 것은, 본 발명의 핵산으로서 하나 이상의 발현 특성(같은 식으로, 양에서는 아니지만)을 포함하는 상기 핵산 중 일부, 30개 이상의 염기 쌍 길이, 바람직하게는 50개 이상의 염기 쌍 길이, 더욱 바람직하게는 100개 이상의 염기 쌍 길이를 의미한다. 상기 기능적 부분은 적어도 도 11D, 도 14A, 도 14B 및/또는 도 14C에 도시된 CDR 서열과 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 아미노산 서열을 코딩한다.
본 발명은 본 발명에 따른 항체, 이의 기능적 부분, 유도체 또는 유사체를 생성할 수 있는, 단리된 항체 생성 세포를 추가로 제공한다. 상기 항체 생성 세포를 얻는 가능한 (한정하지 않음) 방식은 실시예에 상세하게 개설한다. 본 발명자들은 신규한 방법을 개발하고 사용하여 RSV-특이적 항체 생성 세포의 안정성을 향상시켰다. 상기 방법을 사용하여, 6개월 이상 동안 안정한 RSV-특이적 항체 생성 세포가 생성된다. 따라서, 9주 이상, 바람직하게는 3개월 이상, 더욱 바람직하게는 6개월 이상 동안 안정한 본 발명에 따른 RSV-특이적 항체 생성 세포가 여기에 제공된다.
본 발명자들은 상기 항체 생성 세포 내 BCL6 및/또는 Blimp-1 발현 생성물의 양에 영향을 줌으로써 RSV 특이적 항체 생성 세포의 안정성에 영향을 주는 식견을 사용하였다. BCL6 및/또는 Blimp-1 발현 생성물의 양은 직간접적으로 영향을 받는다. 바람직하게는 발현 생성물 모두가 항체 생성 세포의 안정성을 수반하기 때문에, 상기 항체 생성 세포 내 BCL6 및 Blimp-1의 발현 생성물 모두의 양을 조절한다. 항체 생성 세포의 안정성은 특정한 발달 단계(바람직하게는 상기 세포가 상기 단계로 들어간 이후)에서 유지하기 위해 상기 항체 생성 세포의 능력으로 규정된다. 세포의 상이한 발달 단계는 상기 세포의 하나 이상의 상이한 특징을 수반한다. 예를 들어, 기억 B 세포는 일부 조사자가 형질모구(plasmablast)로 지칭하는 단계를 통해 항체 분비 혈장 세포로 자극시 분화되는 것으로 공지되어 있다. 기억 B 세포, 형질모구 및 혈장 세포는 B 세포의 상이한 발달 단계이고, 여기서 B 세포는 상이한 특징을 갖는다. 기억 B 세포는 낮은 증식 및 항체 분비를 보인다. 형질모구는 기억 B 세포와 비교하였을 때, 더 높은 증식 및 더 높은 항체 분비 수준을 보이는 반면, 혈장 세포는 높은 항체 수준을 분비하지만, 증식은 그렇지 않았다. 본 발명자들의 방법에 따르면, 항체 생성 세포의 세포복제(replicative) 수명을 조절하는 것이 가능하게 되었다. 항체 생성 세포의 세포복제 수명은 본원에서 B 세포 및 이의 자손 세포가 항체를 생성하는 능력을 유지하고/하거나 항체 생성 세포로 발생하는 동안 세포복제할 수 있는 기간으로 정의된다. 바람직하게는, 항체 생성 세포의 세포복제 수명은 연장되는데, 이것은 상기 항체 생성 세포가 최종적으로 분화하지 않고 (또는 기존에 사용된 동일한 유형의 항체 생성 세포와 비교하였을 때 보다 긴 기간이 지난 후에서야 분화하고) 시험관내에서 증식을 계속하는 것을 의미한다. 본 발명자들에 따르면, 항체 생성 세포가 소정의 발생 상태(세포가 증식을 계속함)로 되게하고/하거나 이러한 상태에서 유지되는 정도로 항체 생성 세포 내 BCL6 및/또는 Blimp-1 발현 생성물의 양을 조절할 수 있다. 본 발명자들의 방법에 따르면, 이에 따라 세포복제가 일어나는 특정 발생 단계에서 B 세포를 유지할 수 있기 때문에 항체 생성 세포의 세포복제 수명을 증가시킬 수 있게 되었다. 동일한 출원인에 의해 출원된 PCT/NL2006/000625를 참조한다. 본 발명은 안정한 RSV-특이적 항체 생성 세포를 생성하는 수단 및 방법을 제공한다.
항체 생성 세포는 항체 또는 이의 기능적 등가물을 생성 및/또는 분비할 수 있는 세포, 및/또는 항체 또는 이의 기능적 등가물을 생성 및/또는 분비할 수 있는 세포로 발생할 수 있는 세포로 정의된다. RSV-특이적 항체 생성 세포는 RSV 및/또는 RSV의 성분, 예를 들어 RSV F (융합) 단백질, RSV G (결합) 단백질 또는 RSV SH (적은 소수성) 단백질의 에피토프 등에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 이의 기능적 등가물을 생성 및/또는 분비할 수 있는 세포로 본원에 정의된다. 바람직하게는, 상기 RSV-특이적 항체 생성 세포는 B 세포 및/또는 B 세포 유래 혈장 세포를 포함한다. 항체 생성이 낮거나 거의 존재하지 않는 단계에서, 예를 들어 B 세포가 활성화되거나 그렇지 않은 본래의 B 세포 또는 기억 B 세포인 경우에도, 상기 세포들은 항체 생성 세포, 예컨대 형질모구 및/또는 혈장 세포로 발생할 수 있기 때문에, B 세포는 본원에서 항체 생성 세포로 지칭된다.
본 발명에 따른 RSV-특이적 항체 생성 세포는 바람직하게는 포유동물 세포를 포함한다. 비제한적 예는 인간 개체, 설치동물, 토끼, 라마, 돼지, 소, 염소, 말, 유인원, 고릴라에서 유래된 항체 생성 세포를 포함한다. 바람직하게는, 상기 항체 생성 세포는 인간 세포, 쥐과동물 세포, 토끼 세포 및/또는 라마 세포를 포함한다.
BCL6은 정상 B 세포와 T 세포의 발생 및 성숙에 필요하고 배아 중심의 형성에 필요한 전사 억제인자를 코딩한다. (Ye, 1997). BCL6은 배아 중심 B 세포에서 고도로 발현되는 반면, 혈장 세포에서는 거의 발현되지 않는다. BCL6은 활성된 B 세포의 혈장 세포로의 분화를 억제한다. 전사 억제인자 B 림프구 유도된 성숙 단백질-1(Blimp-1)은 B 세포의 혈장 세포로의 발생에 필요하다. Blimp-1의 인간 변이체는 Prdm1로 지칭된다. 본원에 사용된 바와 같이, Blimp-1에 대한 임의의 언급은 Prdm1에 대한 언급을 포함한다. Blimp-1은 혈장 세포의 분화를 추진한다. BCL6과 Blimp-1은 다른 하나의 발현을 억제하여; 자연 상황에서 하나가 다른 하나보다 높은 발현 수준에 도달하는 경우, 분화 단계가 진행된다. 인체에서, 활성된 본래의 또는 기억 B 세포 유래의 혈장 세포의 분화는 BCL6의 하향조절과 Blimp-1의 상향조절을 수반한다. 배아 중심 세포에서, BCL6 발현은 높고 Blimp-1 발현은 낮다. 나머지 기억 세포에서 BCL6과 Blimp-1의 발현은 낮다. 분화를 촉발시키는 신호는 Blimp-1의 상향조절을 유발하고, 상기 Blimp-1은 BCL6의 발현을 막는다. BCL6과 Blimp-1 모두가 발현되는 단계는 수명이 짧으며 이것을 형질모구로 지칭한다. Blimp-1의 농도가 점점더 증가하게 되면, BCL6의 발현은 소멸되게 되고, 그 결과 혈장 세포가 생성된다.
본 발명의 일 구체예에서, RSV-특이적 항체 생성 세포는 BCL6 및 Blimp-1이 동시발현(1일 이상, 바람직하게는 1주 이상, 더욱바람직하게는 6주 이상, 가장 바람직하게는 3개월 이상 동안 상기 항체 생성 세포에서 BCL6과 Blimp-1이 모두 발현되는 것을 의미함)되는 것이 제공된다. 상기 RSV-특이적 항체 생성 세포는 적당한 신호가 제공되는 경우 증식할 수 있다. BCL6과 Blimp-1의 동시발현은, 항체를 증식시키고 생성할 수 있는 항체 생성 세포를 초래한다는 것을 발견하였다. BCL6과 Blimp-1은 바람직하게는 B 세포, 바람직하게는 인간 B 세포에서 동시발현된다. B 세포 내에서 BCL6과 Blimp-1의 동시발현은 형질모구 유사 단계에서 상기 B 세포의 안정화를 초래한다. 혈장 세포와 같은 형질모구는 항체를 분비할 수 있다. 하지만, 형질모구는 여전히 증식을 할 수 있지만, 혈장 세포는 증식할 수 있는 능력을 잃게 되었다. 따라서, 혈장 세포는 항체 생성 세포주를 배양하기에 부적당하다.
바람직한 일 구체예는 BCL6 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 코딩하는 외인성 핵산 서열을 포함하는 RSV-특이적 항체 생성 세포를 제공한다. 외인성 핵산은 본원에서 세포의 게놈에 자연적으로 속하지 않는 핵산 서열로 정의된다. 상기 외인성 핵산 분자를 가지고, 내인성 BCL6의 발현으로부터 독립적인 항체 생성 세포에서 BCL6 농도를 조절할 수 있다. 따라서, 예를 들어 Blimp-1에 의해 유발되는 내인성 BCL6의 발현이 낮거나 없는 경우에도, BCL6 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 코딩하는 외인성 핵산 서열은 여전히 항체 생성 세포의 안정성에 영향을 주기에 충분한 BCL6의 농도를 생성할 수 있다. 바람직하게는, BCL6 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 코딩하는 상기 핵산 서열은 구성적으로 활성이므로, 상기 세포의 내인성 BCL6 발현이 내인성 억제인자, 예컨대 Blimp-1에 의해 억제되는 경우에도 BCL6 발현이 유지된다. 가장 바람직하게는, BCL6 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 코딩하는 상기 핵산 서열의 발현은 억제인자의 외인성 유도인자에 의해 조절되므로, BCL6 발현의 정도가 마음대로 조절된다.
바람직하게는, 더욱 상세하게 하기 개설된 바와 같이, 본 발명에 따른 RSV-특이적 항체 생성 세포는 Bcl-xL 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 코딩하는 외인성 핵산 서열을 포함한다. Bcl-xL 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체가 존재하는 경우, 낮은 세포 밀도의 조건 하에 형질모구가 성장할 수 있다. Bcl-xL 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 코딩하는 상기 핵산 서열의 발현은 바람직하게는 억제인자의 외인성 유도인자에 의해 조절되므로, Bcl-xL 발현의 정도가 마음대로 조절된다. 따라서, 바람직한 구체예는
- BCL6 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 코딩하는 외인성 핵산 서열, 및/또는
- Bcl-xL 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 코딩하는 외인성 핵산 서열을 포함하는 RSV-특이적 항체 생성 세포를 제공한다. 상기 RSV-특이적 항체 생성 세포는 바람직하게는 BCL6(또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체)을 코딩하는 외인성 핵산 서열 및 Bcl-xL(또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체)을 코딩하는 외인성 핵산 서열을 모두 포함한다. 바람직하게는, BCL6, Bcl-xL 또는 BCL6 또는 Bcl-xL의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 코딩하는 상기 핵산 서열의 발현은 외인성 화합물에 의해 유도될 수 있는 활성인자 및/또는 억제인자에 의해 조절된다. 예를 들어, Tet-온 또는 Tet-오프 시스템과 같은 유도될 수 있는 프로모터 시스템을 사용한다.
본 발명에 따른 안정한 RSV-특이적 항체 생성 세포는 바람직하게는 RSV-특이적 항체 생성 세포에서 BCL6과 Blimp-1을 동시발현함으로써 생성된다. RSV-특이적 항체 생성 세포는 바람직하게는 RSV에 노출된 개체로부터 얻어진다. 항체 생성 세포를 단리시키는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 표지자 및/또는 태그로 표시된 RSV 유래 화합물은 RSV에 노출된 개체의 샘플(상기 샘플은 항체 생성 세포를 포함함)과 항온처리된다. 태깅된 RSV 유래 화합물을 인식하는 RSV-특이적 항체 생성 세포는 비결합 세포들을 세척해내는 동안 단리된다. 생성된 RSV-특이적 항체 생성 세포는 이어서 BCL6과 Blimp-1을 동시발현함으로써 안정화된다.
일 구체예는 우선 RSV 노출된 공여자로부터의 전체 항체 생성 세포를 안정화시킨 후 태깅된 RSV 유래 화합물을 인식하는 세포를 단리시키는 것을 수반한다. 또다른 구체예에서, 항체 생성 세포에는 항체 생성 세포가 BCR을 통해 태깅되지 않은/미표지된 항원에 결합하는 경우에 신호를 형질도입하는 B 세포 수용체(BCR, 항체의 막 발현 형태)의 하류에 (형광) 마커가 장착된다. 마커가 회전된 항체 생성 세포를 선택되고 이어서 이는 BCL6과 Blimp-1을 동시발현함으로써 안정된다. 또다른 구체예에서, 이용가능한 항원 유래 화합물이 존재하지 않지만, 유일한 항체에 대해 스크리닝할 수 있는 분석법이 존재하는 경우, 전체/벌크 항체 생성 세포가 BCL6과, Blimp-1 및, 경우에 따라, 또한 Bcl-XL을 동시발현함으로써 안정된다. 상기 구체예에 따르면, L-세포(미니 벌크 배양, MBC)의 존재 하에서 낮은 밀도, 바람직하게는 96웰 당 10∼100개의 세포로 세포를 배양한다. 배양 상청액은 ELISA, 웨스턴 블롯과 같은 스크리닝 분석법 또는 ELISPOT와 같은 기능적 분석법, 중화 분석법 또는 세포 이동 분석법에서 직접 사용할 수 있다.
일 구체예에서, MBC가 선택되고, 항체를 생성하는 관심 세포의 단일클론 세포주를 얻기 위해, 한정된 희석 배양을 수행하고, 바람직하게는 2∼3주 후, 바람직한 분석법으로 상기 배양물의 상청액을 다시 스크리닝한다.
당업자에게 잘 공지된 바와 같이, 다수의 대안적인 방법이 당업계에서 이용가능하다. 상기 언급된 구체예는 비제한적이다.
따라서, 3개월 이상 동안 안정하고 RSV-특이적 항체 또는 이의 기능적 등가물을 생성할 수 있는, 항체 생성 세포를 생성하는 방법으로서,
- RSV-특이적 항체 또는 이의 기능적 등가물을 생성할 수 있는 세포에서 Blimp-1의 발현 농도를 증가시키는 것; 및
- 상기 세포에서 BCL6의 발현 농도를 증가 및/또는 유지시키는 것
을 포함하는 방법을 추가로 제공한다.
본 발명에 따른 방법을 이용하여, RSV-특이적 기억 B 세포를 형질모구 유사 세포로 전환시키고 상기 세포를 안정시킬 수 있으므로, 혈장 세포로의 신속한 분화는 일어나지 않는다. 이는 혈장 세포의 천연 발생에 반대되는데, 여기서 기억 B 세포 내 Blimp-1의 발현은 혈장 세포로의 신속한 발생을 초래하여, 생성된 혈장 세포가 BCL6을 거의 발현하지 않도록 BCL6의 발현을 억제한다. 따라서, 본 발명의 일 구체예는 RSV-특이적 B 세포 내 BCL6과 Blimp-1 둘다 동시발현하는 것을 수반하고, 이는 항체를 증식하고 생성할 수 있는 세포를 초래한다. 상기 RSV-특이적 B 세포에서 BCL6 발현 농도는 바람직하게는 형질모구와 비교하였을 때 실질적으로 동일한 농도 또는 더 높은 농도가 되고, 이것이 유지된다. 이러한 식으로, RSV-특이적 B 세포의 안정한 배양물이 생성되고, 상기 세포는 RSV-특이적 항체를 생성할 수 있게 된다. BCL6과 Blimp-1을 동시발현하는 상기 RSV-특이적 B 세포는 바람직하게는 세포사멸방지 유전자 Bcl-xL의 첨가를 통해 추가로 안정된다. Bcl-xL의 도입으로, 이제 낮은 세포 밀도 조건 하에서 형질모구를 성장시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 본원에 기술된 방법 중 임의의 방법을 이용하여 BCL6, Blimp-1 및 Bcl-xL의 발현 농도를 갖는 RSV-특이적 항체 생성 세포를 생성하는 것을 포함하는, 낮은 세포 밀도 조건 하에서 형질모구를 배양하는 방법을 제공한다.
RSV-특이적 항체 생성 세포에서 BCL6 발현 생성물(바람직하게는, BCL6 단백질)의 양은 각종 방식으로 조절된다.
일 구체예에서, 항체 생성 세포에는 BCL6 발현에 직간접적으로 영향을 줄 수 있는 화합물이 제공된다. 바람직하게는 항체 생성 세포에 BCL6 발현을 향상시킬 수 있는 화합물을 제공하여, Blimp-1의 발현 동안 BCL6의 하향조절을 막는다. 상기 화합물은 바람직하게는 활성 및 전사 신호 형질도입인자(STAT5; Signal Transducer of Activation and Transcription 5) 단백질 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체, 및/또는 이를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. STAT5는 BCL6 발현을 향상시킬 수 있는 신호 형질도입인자이다. STAT5는 2개의 상이한 일렬로 연결된 유전자에 의해 코딩되는 2개의 공지된 형태, STAT5a 및 STAT5b가 존재한다. STAT5의 투여 및/또는 활성은 향상된 BCL6 농도를 초래한다. 따라서, Blimp-1에 의한 BCL6의 하향조절은 STAT5 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체에 의한 BCL6의 상향조절 발현에 의해 적어도 부분적으로 보상된다. 따라서, STAT5 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체는 BCL6 발현에 직접적으로 영향을 줄 수 있다. 또한 BCL6 발현에 간접적으로 영향을 줄 수도 있다. 예를 들어, 이것은 결국에 직간접적으로 STAT5를 활성시키고/시키거나 STAT5 발현을 조절할 수 있는 화합물의 양을 조절함으로써 실시된다. 따라서, 일 구체예에서, 내인성 및/또는 외인성 STAT5의 발현 및/또는 활성이 증가된다. 예를 들어, STAT5를 활성시킬 수 있는 인터루킨(IL) 2 및/또는 IL 4의 존재 하에서 항체 생성 세포를 배양함으로써 BCL6 발현을 간접적으로 향상시킬 수 있다.
일 구체예에서, RSV-특이적 항체 생성 세포에 STAT5 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 코딩하는 핵산 서열이 제공되는데, 상기 핵산 서열은 구성적으로 활성이며, 이는 STAT5가 (내인성) 조절자의 존재와 무관하게 연속해서 발현된다는 것을 의미한다. 내인성 STAT5의 발현이 낮거나, 없는 경우, STAT5 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 코딩하는 외인성 구성적 활성 핵산 서열은 바람직하게는 BCL6 발현을 향상시키는데 충분한 STAT5 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체의 농도를 초래하도록 적용된다. 가장 바람직하게는, RSV-특이적 항체 생성 세포에 STAT5 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체, 바람직하게는 활성이 억제인자의 외인성 유도인자에 의해 조절되는 융합 단백질을 포함하는 화합물을 코딩하는 핵산 서열이 제공되므로, BCL6 발현의 활성화 정도는 마음대로 조절된다. BCL-6을 유도할 수 있는 또다른 시스템은 테트라시클린 및/또는 테트라시클린의 유도체를 첨가하여 BCL6 유전자 전사 후 BCL 단백질 합성을 유도하는 전이활성인자의 활성을 유도하는 Tet-온 시스템에 의해 제공된다. 바람직한 일 구체예에서, 항체 생성 세포에 융합 단백질 ER-STAT5로서 에스트로겐 수용체(ER)와 STAT5를 코딩하는 핵산 서열이 제공된다. 상기 융합 단백질은 시토졸에서 열 충격 단백질과 복합체를 형성하기 때문에 불활성이다. 이런 식으로, STAT5는 핵에 도달할 수 없고 BCL6 발현이 향상되지 않는다. 외인성 유도인자 4 히드록시-타목시펜(4HT)의 투여 하에, 융합 단백질 ER-STAT5는 열 충격 단백질로부터 해리되므로, STAT5는 핵으로 진입할 수 있고 BCL6 발현을 활성시킨다.
또한, 또는 대안적으로, RSV-특이적 항체 생성 세포 내 BCL6 발현은 BCL6 발현을 직간접적으로 향상시킬 수 있는 화합물의 존재 하에 상기 항체 생성 세포를 배양함으로써 향상된다.
따라서, 일 구체예는
- RSV-특이적 항체 생성 세포에 BCL6 발현을 직간접적으로 향상시킬 수 있는 화합물을 제공하는 것; 및/또는
- BCL6 발현을 직간접적으로 향상시킬 수 있는 화합물의 존재 하에서 RSV-특이적 항체 생성 세포를 배양하는 것을 포함하는, RSV-특이적 항체 생성 세포를 생성하는 방법을 제공한다. BCL6 발현을 직간접적으로 향상시킬 수 있는 상기 화합물은 바람직하게는 STAT5 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 포함한다. 따라서, 상기 RSV-특이적 항체 생성 세포에 STAT5 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 코딩하는 핵산 서열을 제공하는 것을 포함하는 본 발명에 따른 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 항체 생성 세포는 STAT5 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 코딩하는 핵산 서열을 상기 세포로 도입한 후 배양한다. 상기 핵산 서열은, 예를 들어 형질감염 및/또는 바이러스-매개 유전자 전이에 의해 상기 세포로 도입된다. 세포로 핵산 서열을 도입하기 위한 다수의 대안 방법은 여기서 추가 설명 없이 당업계에서 이용가능하다.
BCL6 발현을 직간접적으로 향상시킬 수 있는 화합물을 이용하여, 내인성 BCL6의 발현을 향상시킬 수 있다. 하지만, 바람직한 일 구체예에서, 항체 생성 세포에 BCL6 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 코딩하는 핵산 서열이 제공된다. 본원에서 이전에 설명한 바와 같이, 내인성 BCL6의 발현으로부터 독립적으로 세포 내 BCL6 농도를 조절할 수 있기 때문에, BCL6을 코딩하는 외인성 핵산이 바람직하다. 그러므로, 예를 들어 Blimp-1에 의해 유도된 내인성 BCL6의 발현이 낮거나 없더라도, BCL6 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 코딩하는 외인성 핵산 서열은 여전히 항체 생성 세포의 안정성에 영향을 주기에 충분한 BCL6의 농도를 생성할 수 있다. 따라서, RSV 특이적 항체 생성 세포에 BCL6 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 코딩하는 핵산 서열을 제공하는 것을 포함하는 본 발명에 따른 방법을 또한 제공한다. 바람직하게는, 상기 항체 생성 세포에는 BCL6 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 코딩하는 구성적으로 활성인 핵산 서열이 제공되므로, BCL6 발현은 상기 세포의 내인성 BCL6 발현이 내인성 억제인자, 예컨대 Blimp-1에 의해 억제되는 경우에도 유지된다. 가장 바람직하게는, BCL6 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 코딩하는 상기 핵산 서열의 발현은 억제인자의 외인성 유도인자에 의해 조절되므로, BCL6 발현의 정도는 마음대로 조절된다. 예를 들어, 이미 기술된 바와 같이, Tet-온 또는 Tet-오프 시스템과 같은 유도성 프로모터 시스템을 사용한다.
또다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 BCL6의 양이 RSV 특이적 항체 생성 세포에 E47 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 코딩하는 핵산 서열을 제공함으로써 간접적으로 조절되는 방법을 제공한다. E47은 E-단백질로 명명되는 나선-고리-나선 단백질의 패밀리에 속하는 전사 인자를 코딩한다. E12, E47, E2-2 및 HEB의 4개의 E-단백질이 존재하고, 이들은 림프구 발생에 연관된다. E12 및 E47은 E2A로 명명되는 하나의 유전자에 의해 코딩되고, 이는 상이하게 절편된다. E-단백질은 E 단백질 억제자 Id2, 및 Id3에 의해, 그리고 ABF-I에 의해 억제될 수 있다(Mathas S., 2006). E 단백질은 종양 억압인자로 기술되었고 과발현은 세포사멸을 유도하는 것으로 나타났다. E47의 특이적 표적 중 하나는 Socs1 및 Socs3 유전자이다. 상기 Socs 유전자는 STAT5b의 음성 조절자이고 이에 따라 간접적인 BCL6의 조절자로 공지되어 있다. 다시 말해, B 세포 내 E47의 발현은 표현형(원형질세포)을 생성하는 항체로 B 세포의 분화를 초래하는 Blimp-1의 발현을 향상시킨다.
RSV-특이적 항체 생성 세포 내 Blimp-1 발현량은 또한 각종 방식으로 조절된다. 일 구체예에서, RSV-특이적 항체 생성 세포에는 Blimp-1 발현에 직간접적으로 영향을 줄 수 있는 화합물이 제공된다. 추가적으로, 또는 대안적으로, 항체 생성 세포는 Blimp-1의 발현에 직간접적으로 영향을 줄 수 있는 화합물의 존재 하에서 배양된다. 따라서, RSV-특이적 항체 생성 세포에 Blimp-1 발현에 직간접적으로 영향을 줄 수 있는 화합물이 제공되는 것을 포함하는 본 발명에 따른 방법이 추가로 제공된다. Blimp-1 발현에 직간접적으로 영향을 줄 수 있는 화합물의 존재 하에 상기 항체 생성 세포를 배양하는 것을 포함하는 본 발명에 따른 방법을 추가로 제공한다. 바람직하게는, Blimp-1 발현을 향상시켜 BCL6의 발현 동안 Blimp-1의 하향조절을 막을 수 있는 화합물을 사용한다. 상기 화합물은 가장 바람직하게는 IL-21을 포함한다.
바람직한 일 구체예에서, Blimp-1 발현에 직간접적으로 영향을 줄 수 있는 상기 화합물은 활성화 및 전사의 신호 형질도입인자 3(STAT3) 단백질 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체, 및/또는 이에 따라 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. STAT3은 B 세포의 발생 및 분화에 연관되는 신호 형질도입인자이다. STAT3은 Blimp-1 발현을 상향조절할 수 있다. 따라서, Blimp-1 발현에 직간접적으로 영향을 줄 수 있는 상기 화합물이 STAT3 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체, 또는 STAT3 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 본 발명에 따른 방법을 추가로 제공한다. 가장 바람직하게는, STAT3 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 코딩하는 상기 핵산 서열의 발현은 억제인자의 외인성 유도인자에 의해 조절되므로, STAT3 발현의 정도는 마음대로 조절된다. 예를 들면, Tet-온 또는 Tet-오프 시스템 등과 같은 유도성 프로모터 시스템이 사용된다. 일 구체예에서, STAT3, 유도체 또는 유사체, 및 ER을 포함하는 융합 생성물은 히드록시타목시펜에 의해 STAT3 발현을 조절할 수 있는 상기 세포에 도입된다.
STAT3이 Blimp-1 발현에 영향을 줄 수 있기 때문에, 또한 STAT3의 활성 및/또는 발현을 직간접적으로 조절할 수 있는 화합물을 투여함으로써 Blimp-1 발현을 간접적으로 조절할 수도 있다. 일 구체예에서, 항체 생성 세포에는 STAT3의 활성을 향상시킬 수 있는 화합물이 제공되므로, Blimp-1 발현도 간접적으로 향상된다. 따라서, 항체 생성 세포에 STAT3의 활성을 직간접적으로 향상시킬 수 있는 화합물이 제공되는 본 발명에 따른 방법이 추가로 제공된다.
따라서, 일 구체예에서, 항체 생성 세포에 STAT3을 직간접적으로 활성시킬 수 있는 화합물이 제공되어 Blimp-1 발현을 향상시킨다.
STAT3은 각종 방식으로 활성된다. 바람직하게는, STAT3은 항체 생성 세포에 시토카인을 제공함으로써 활성된다. B 세포 분화에 자연적으로 연관되는 시토카인은 STAT 단백질을 조절하는데 매우 효과적이다. STAT3의 매우 효과적인 활성인자는 IL-21과 IL-6이며, 또한 IL-2, IL-7, IL-IO, IL-15 및 IL-27도 STAT3을 활성시키는 것으로 공지되어 있다. 또한, 선천 면역에 연관된 유사 수용체(TLR; Toll-like receptor)도 STAT3을 활성시킬 수 있다. 따라서, 일 구체예는 Blimp-1 발현에 직간접적으로 영향을 줄 수 있는 상기 화합물이 IL-21, IL-2, IL-6, IL-7, IL-IO, IL-15 및/또는 IL-27을 포함하는 본 발명의 방법을 제공한다. 가장 바람직하게는, IL-21을 사용하는데, 그 이유는 IL-21이 항체 생성 세포의 안정성에 영향을 주는데 특히 적당하기 때문이다. IL-21은 Blimp-1 발현이 BCL6에 의해 막히는 경우에도 Blimp-1 발현을 상향조절할 수 있다.
추가적으로, 또는 대안적으로, 돌연변이된 야누스 키나아제(JAK; Janus kinase)를 사용하여 STAT3을 활성시킨다. 본래, JAK는, 그 자체가 하나 이상의 시토카인에 의해 활성된 후 STAT3을 인산화시킬 수 있다. 시토카인의 존재와 무관하게, STAT3을 활성시킬 수 있는 돌연변이된 야누스 키나아제는 본 발명에 따른 방법에 특히 적당하다.
이전에 이미 설명한 바와 같이, 일 구체예에서, Blimp-1 발현을 향상시킬 수 있는 화합물은 STAT3 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. STAT3 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 코딩하는 외인성 핵산 서열의 존재는, 내인성 STAT3의 발현이 매우 낮거나 없는 경우에도 STAT3 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 계속 존재하게 할 수 있다.
또한 STAT5의 발현 및/또는 활성을 감소시켜 Blimp-1을 상향조절할 수도 있다. STAT5의 양 및/또는 활성을 감소시키는 경우, BCL6 발현의 활성화도 감소되고, 이는 BCL6 발현 생성물의 양을 감소시킨다. BCL6과 Blimp-1이 서로의 발현을 막기 때문에, BCL6 발현 생성물의 감소된 양은 Blimp-1 발현 생성물의 증가된 양을 초래한다. 따라서, STAT5의 활성을 하향조절할 수 있는 화합물은 간접적으로 Blimp-1을 상향조절할 수 있다. 예를 들어, 상기 화합물은 시토카인 신호전달 억압인자(SOCS) 단백질의 구성원을 포함한다. 일 구체예에서, RSV-특이적 항체 생성 세포 내 Blimp-1 발현 생성물의 양은 이에 따라 상기 세포에 SOCS 단백질을 제공하고/하거나 상기 세포 내에서 SOCS 단백질을 활성시킴으로써 상향조절된다.
바람직한 일 구체예에서, RSV-특이적 항체 생성 세포에 E47 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 코딩하는 핵산 서열이 제공되는 경우, STAT5의 발현 및/또는 활성이 감소한다. STAT5b를 높은 농도로 발현하는 B 세포 내 E47의 발현은 분화와 증식이 개재되는데, 즉 E47 및 SOCS를 통한 STAT5의 차단은 BCL6 농도를 감소시킨 후 Blimp-1 농도를 증가시킨다. Blimp-1의 상향조절된 농도는 감소된 증식 및 연관된 세포의 항체 생성 세포로의 분화를 초래한다. 다시 말해, B 세포 내 E47의 발현은 Blimp-1의 발현을 향상시키고, 이는 항체 생성 표현형(혈장 세포)으로 B 세포를 분화시킨다.
STAT5 단백질, STAT3 단백질, Bcl-xL 및/또는 BCL6의 적어도 기능적 부분은 각각 STAT5 단백질, STAT3 단백질, Bcl-xL 및/또는 BCL6과 비교하였을 때, 항체 생성 세포의 안정성에 영향을 주는 동일한 능력(같은 식으로, 양에서는 아니지만)을 갖는 단백질성 분자를 의미한다. STAT5 단백질 또는 STAT3 단백질의 기능적 부분은, 예를 들어 상기 능력에 연관되지 않은, 또는 거의 연관되지 않은 아미노산이 결여된 것이다. STAT5 단백질, STAT3 단백질, Bcl-xL 및/또는 BCL6의 유도체는 항체 생성 세포의 안정성에 영향을 주는 상기 단백질의 능력이 양에서는 아니지만 실질적으로 동일하도록 변경된 단백질로 정의된다. 예를 들어, 하나의 아미노산이 통상 유사한 성질(크기, 소수성 등)을 갖는 또다른 아미노산으로 치환되는 보존적 아미노산 치환을 통해, 다수의 방식으로 유도체가 제공되므로, 전체적인 기능에는 심각하게 영향을 미치지는 않는다. 예를 들어 유도체는 4 히드록시-타목시펜(4HT)의 존재에 따라 활성되는 융합 단백질, 예컨대 STAT5-ER 또는 STAT3-ER 융합 단백질을 포함한다. STAT5 단백질, STAT3 단백질, Bcl-xL 및/또는 BCL6의 유사체는, 양에서는 아니지만, 같은 식으로 항체 생성 세포의 안정성에 영향을 주는 동일한 능력을 갖는 분자로 정의된다. 상기 유사체는 반드시 그렇지는 않지만 상기 STAT5 단백질, STAT3 단백질, Bcl-xL 및/또는 BCL6에서 유래된다.
바람직한 일 구체예에서, 상기 항체 생성 세포에 BCL6 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 코딩하는 핵산 서열이 제공되기 전에, 상기 RSV-특이적 항체 생성 세포는 IL-21의 존재 하에서 배양된다. 상기 세포에 BCL6 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 코딩하는 핵산 서열이 제공되기 전에, IL-21의 존재 하에, RSV-특이적 항체 생성 세포, 바람직하게는 B 세포를 배양하는 것이 바람직한데, 그 이유는 상기 구체예에서 안정성, 증식 및/또는 항체 생성이 특히 잘 향상되기 때문이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 본원에 기술된 RSV-특이적 항체 생성 세포의 안정성에 영향을 주는 방법으로서, 상기 항체 생성 세포 내 Bcl-xL 발현 생성물의 양을 직간접적으로 증가시키는 것을 추가로 포함하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 이는 상기 항체 생성 세포에 Bcl-xL 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 코딩하는 핵산 서열 또는 Bcl-2에 한정되지 않은 것을 포함하는 다른 세포사멸방지 유전자를 코딩하는 핵산 서열이 제공됨으로써 실현된다. 또다른 구체예에서, 이는 상기 항체 생성 세포에 Bcl-xL 발현을 직간접적으로 향상시킬 수 있는 화합물(바람직하게는, 상기 화합물은 APRIL, BAFF, CD40, BCR 자극, 시토카인, 성장 인자 또는 하류 작동인자, 예컨대 JNK 및 AKT(PKB)를 포함함)이 제공됨으로써 실현된다.
Bcl-xL은 세포사멸방지 Bcl-2 패밀리의 구성원이고, Bcl2-단백질은 내인성 사망 자극 후 시토크롬 c 방출을 유도하는 소위 Bcl-2 상동성 도메인 3(BH3)-패밀리 구성원, 예컨대 Bax, Bak, Bim, 및 Bad와 상호작용하고 막는다(Boise, L. H., 1993). 따라서, Bcl-xL과 같은 단백질을 통한 미토콘드리아 막 완전성의 보호는 세포 생존에 중요하다.
STAT5 활성화는 세포사로부터 세포를 보호하는 것으로 확인되었다. STAT5는 Bcl-xL의 발현을 조절하고, STAT5에 대한 세포사멸방지 역할을 지원하는 것으로 확인되었다. STAT5는 STAT 결합 성분을 통해 Bcl-xL 프로모터 내에서 Bcl-xL 발현을 긍정적으로 조절한다. 생체내, Bcl-xL 발현은 STAT5A/B-이중 결핍성 마우스의 골수 내에서 일어나지 않는다. 또한, STAT5-매개된 적아세포 생존은 Bcl-xL의 상향조절에 따라 달라진다. 최근 들어, 마우스 B 세포에서 Bcl-xL의 형질전환 과발현은 B 세포의 생존과 비악성 혈장 세포의 포커스를 향상시키는 것으로 확인되었다.
본 발명에 따른 방법은 항체를 증식시키고 분비할 수 있는 RSV-특이적 항체 생성 세포를 포함하는 세포 배양물을 생성하는데 특히 적당하다. 일 구체예에서, RSV-특이적 기억 B 세포는 생체외 B 세포 배양물을 생성하는데 사용된다. 상기 기억 B 세포는 바람직하게는 인간 항체가 생성되도록 인간이다. 상기 B 세포는 바람직하게는 개체에서 기인하며, 상기 개체는 이전에 호흡기 합포체 바이러스에 노출된 바 있다. 일 구체예에서, RSV-특이적 B 세포는, 당업계에 공지된 방법을 사용하여, 말초 혈액 샘플 및/또는 편도선 샘플로부터 단리된다. 기억 B 세포는, 예를 들어 B 세포 마커 CD19 및/또는 CD22에 대한 선택(자성 비드 분류) 및 세포 표면 IgG 및/또는 CD27에 대한 (후속) 선택 및/또는 IgM, IgD 및/또는 IgA에 대한 음성 선택에 의해 단리된다. 배아 중심 B 세포에서, BCL6 발현이 높은 반면 Blimp-1 발현은 낮다. 항체 분비 세포로의 자연 발생은 Blimp-1 발현의 상향조절을 수반한다. Blimp-1이 BCL6 발현을 억제하기 때문에, Blimp-1의 상향조절은 자연적 상황에서 BCL6의 하향조절을 초래한다. 하지만, 본 발명의 바람직한 구체예에서, Blimp-1 발현은 상향조절되는 반면 BCL6 발현은 적어도 부분적으로 유지된다. 이는 BCL6과 Blimp-1이 동시발현되는 RSV-특이적 항체 생성 세포를 초래한다. 상기 RSV-특이적 항체 생성 세포는 항-RSV 항체를 증식시키고 분비할 수 있어서 생체외 B 세포 배양에 사용하기에 적당하다. 추가의 바람직한 구체예에서, 상기 항체 생성 세포는 Bcl-xL에 의한 세포사멸에 의해 보호된다. 본 발명에 따른 RSV-특이적 항체 생성 세포는 안정하며 장기간 동안 말단 분화를 겪지 않는 이점을 제공한다. 본 발명에 따른 상기 항체 생성 세포는 1주 이상, 바람직하게는 1개월 이상, 더욱 바람직하게는 3개월 이상, 가장 바람직하게는 6개월 이상 동안 안정하다. 본 발명에 따른 B 세포는 바람직하게는 대부분의 B 세포 복제는 CD40L에 의한 것이 유리하기 때문에 CD40L의 존재 하에 배양된다.
일 구체예에서, Blimp-1 발현과 더불어 유의적인 BCL6의 발현은 바람직한 증식 및 항체 생성 특성 및/또는 안정성을 갖는 항체 생성 세포를 초래하기 때문에 배아 중심 B 세포와 비교하였을 때, BCL6 발현은 실질적으로 동일한 수준, 또는 더 높은 수준으로 유지된다. 바람직한 구체예에서, 상기 BCL6 발현 및/또는 Blimp-1 발현은 Bcl-xL 발현에 의해 이루어지고, 그 결과 더욱 더 바람직한 증식 및 항체 생성 특성 및/또는 안정성을 갖는다.
따라서, 일 구체예는 1주 이상, 바람직하게는 1개월 이상, 더욱 바람직하게는 3개월 이상, 더욱 바람직하게는 6개월 이상 동안 안정한 RSV-특이적 항체 생성 세포를 생성하는 방법으로서,
- RSV-특이적 기억 B 세포를 제공하는 것;
- 상기 세포에서 Blimp-1의 발현 수준을 증가시키는 것; 및
- 상기 세포에서 BCL6 발현 수준을 증가 및/또는 유지시키는 것을 포함하는 방법을 제공한다. RSV-특이적 기억 B 세포 내 Blimp-1의 발현 수준을 증가시키는 것과 상기 세포 내 BCL6 발현 수준을 증가 및/또는 유지시키는 것을 포함하는 RSV-특이적 항체 생성 세포를 생성하는 생체외 방법이 또한 제공된다. 상기 BCL6 및 Blimp-1 발현 수준은, 형질모구와 비교하였을 때, 바람직하게는 실질적으로 동일한 수준, 또는 더 높은 수준이 되고/되거나 유지된다. 바람직한 구체예에서, 상기 B 세포는 BCL6 및 Bcl-xL로 형질도입된다. 따라서, 3개월 이상 동안 안정한 RSV-특이적 항체 생성 세포를 생성하는 방법으로서,
- RSV-특이적 항체를 생성할 수 있는 B 세포에 BCL6, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 제공하는 것; 및
- 상기 B 세포에 Bcl-xL 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 제공하는 것; 및
- 상기 B 세포를 배양하는 것을 포함하는 방법이 추가로 제공된다.
상기 B 세포에는 바람직하게는 BCL6, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 코딩하는 핵산 서열, 및 핵산 서열 Bcl-xL 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 코딩하는 핵산 서열이 제공된다.
상기 B 세포는 바람직하게는 Blimp-1 발현을 향상시킬 수 있는 화합물, 에컨대 IL-21, IL-2, IL-6, IL, IL-IO, IL-15, IL-27, 또는 돌연변이된 야누스 키나아제 등의 존재 하에서 배양된다. 바람직하게는, 상기 시토카인은 Blimp-1 발현을 향상시키고 본 발명에 따른 방법으로 항체 생성 세포를 안정시키는데 특히 적당하기 때문에 IL-21이 사용된다. 또한, 형질도입 효능을 향상시키기 위해, 상기 B 세포는 바람직하게는 상기 B 세포에 BCL6 및/또는 Bcl-xL, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 코딩하는 핵산 서열이 형질도입되기 전에 IL-21의 존재 하에서 배양된다.
일 구체예에서, 상기 B 세포에는 SOCS 단백질 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체, 또는 이에 따라 코딩되는 핵산이 제공되는데, SOCS 단백질 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체가 Blimp-1 발현을 간접적으로 향상시킬 수 있기 때문이다. 또다른 대안적인 또는 추가의 구체예에서, 상기 B 세포에는 E47 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체, 또는 이에 따라 코딩되는 핵산이 제공된다. 이전에 이미 개설된 바와 같이, E47 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체의 증가된 농도의 결과로서, Socs 단백질 기능이 향상되고 Blimp-1 발현은 간접적으로 증가된다.
실시예에서 특히 바람직한 구체예를 나타낸다. 특히 바람직한 일 구체예에 따르면, RSV-특이적 B 세포는 IL-21의 존재 하에 우선 배양된다. 그 결과, B 세포는 BCL6을 코딩하는 핵산 및 Bcl-xL을 코딩하는 핵산을 사용하여 형질도입 반응을 실시한다. 바람직하게는 회전 형질도입을 사용한다. 가장 바람직하게는, B 세포 및 하나 이상의 관심 핵산을 포함하는 바이러스를 혼합시키고, 이후 혼합물을 회전시켜 높은 형질도입 효능을 실현한다. 형질도입 후, 3∼5일 동안 B 세포를 IL-21의 부재 및 IL-4 및 L 세포의 존재 하에서 배양하여 BCL6을 발현시킬 수 있다. 그 결과, 상기 바람직한 구체예에 따르면, B 세포에 다시 BCL6을 코딩하는 핵산 및 Bcl-xL을 코딩하는 핵산을 사용하여 형질도입 반응을 실시한다. 그 후에, 3∼5일 동안 IL-21의 부재 및 IL-4 및 L 세포의 존재 하에 B 세포를 다시 배양하여 BCL6을 발현시킬 수 있다. 그 결과, BCL6과 Bcl-xL을 발현하는 세포를 단리시키고 IL-21을 다시 배양물에 투여하여 복제 및 항체 생성을 향상시킨다. 배양 상청액 내 Bcl-6에 의해 분비되는 항체, Blimp1 및 Bcl-XL을 발현하는 세포를 바람직하게는 RSV에 대한 시험관내 중화 능력/활성/반응성에 대하여 스크리닝한다. 상기 항체를 생성하는 항체 생성 세포는, 예를 들어 희석 배양을 한정함으로써 추가로 바람직하게 선택된다. 따라서, 안정한 RSV-특이적 B 세포는 BCL6과 Blimp-1이 동시발현되는 경우 얻어진다. 상기 B 세포는 6개월 이상 동안 시험관내 배양으로 항체를 복제 및 생성할 수 있다.
일 구체예는 RSV-특이적 항체 또는 이의 기능적 등가물을 선택 및/또는 단리시키는 것을 추가로 포함하는 본 발명에 따른 방법을 제공한다. 일 구체예에서, IgM 생성 세포 및 IgG 생성 세포는 분리되고/되거나 단리된다. 바람직하게는, IgG 생성 세포는 분리되고/되거나 단리된다.
본 발명에 따른 방법으로 생성된 RSV-특이적 항체 생성 세포는 RSV에 대한 항체를 생성하기에 적당하다. 하지만, 바람직한 일 구체예에서, Ig 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 유전자는 상기 세포로부터 단리되고 제2 세포, 예컨대 차이니스 햄스터 난소(CHO) 세포주의 세포 또는 293(T) 세포 등에 발현된다. 또한 본원에서 생산자 세포로 지칭되는 상기 제2 세포는 바람직하게는 상업용 항체 생성에 적합하다. 상기 생산자 세포의 증식은 RSV-특이적 항체를 생성할 수 있는 생산자 세포주를 초래한다. 바람직하게는, 상기 생산자 세포주는 인간에서 사용하기 위한 화합물을 생성하는데 적당하다. 따라서, 상기 생산자 세포주는 바람직하게는 병원성 미생물과 같은 병원성 물질을 포함하지 않는다.
본 발명에 따른 방법은 바람직하게는 상업적 항체 생성이 가능하도록 1주 이상, 바람직하게는 1개월 이상, 더욱 바람직하게는 3개월 이상, 더욱 바람직하게는 6개월 이상 동안 안정한 항체 생성 세포를 생성하는데 사용된다. 가장 바람직하게는, 단일클론 항체를 생성할 수 있는 안정한 세포주가 생성되는 것이다. 이는, 바람직하게는 예를 들어 CD19 및/또는 CD22(B 세포 마커) 및 세포 표면 IgG 및/또는 CD27(기억 세포를 표지하기 위함)에 대한 선택 및/또는 IgM, IgD 및/또는 IgA에 대한 음성 선택에 의해 샘플로부터 단리된 기억 B 세포를 사용함으로써 수행된다. 또한, RSV-특이적 항체 생성 세포는, 예를 들어 RSV 또는 RSV에서 유래된 성분, 예컨대 RSV F 단백질, G 단백질 및/또는 SH 단백질 등을 사용하여 결합 분석법으로 선택된다. 그 결과, 상기 바람직한 구체예에 따르면, Blimp-1과 BCL6은 상기 RSV-특이적 항체 생성 세포에서 동시발현되고, RSV(의 성분)에 특이적으로 결합할 수 있는 세포 배양물을 초래한다. 또다른 바람직한 구체예에서, 상기 B 세포에는 Bcl-xL 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체가 추가로 제공된다.
하나의 기억 세포만을 사용하는 경우, 단일클론 항체를 생성하는 본 발명에 따른 세포주가 얻어진다. 또한 RSV에 대한 항체를 생성할 수 있는 B 세포로 시작하는 단일클론 항체 생성 세포주를 생성할 수도 있다. 안정한 B 세포 배양물이 본 발명에 따른 방법으로 생성된 후, RSV의 특이적 항원에 대한 항체를 생성할 수 있는 B 세포가 단리되고, 상기 B 세포로부터의 Ig 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 유전자의 적어도 기능적 부분은 바람직하게는 제2 세포주에서 발현된다. 바람직하게는 상기 B 세포로부터의 Ig 중쇄를 코딩하는 유전자의 적어도 기능적 부분 및 Ig 경쇄를 코딩하는 유전자의 적어도 기능적 부분이 제2 세포주에서 발현된다.
일 구체예에서, 바람직하게는 기억 B 세포는 아니지만, 이전에 RSV에 노출된 개체로부터 얻은, 항체 생성 세포가 본 발명에 따른 방법에 사용된다. 이런 식으로, 생체외 관심 인간 항체를 생성할 수 있게 된다.
따라서, 호흡기 합포체 바이러스에 특이적으로 결합하고/하거나 이를 중화시킬 수 있는 항체를 생성하는 방법으로서,
- 본 발명에 따른 방법으로 RSV-특이적 항체를 생성할 수 있는 항체 생성 세포를 생성하는 것; 및
- 상기 항체 생성 세포에 의해 생성된 항체를 얻는 것
을 포함하는 방법이 추가로 제공된다.
본 발명에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는 단리된 또는 재조합 항체, 및 단리된 또는 재조합 항체 생성 세포, 또는 이의 기능적 등가물이 또한 제공된다. 상기 항체는 바람직하게는 항체 D25, AM14, AM16 및/또는 AM23, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 또는 유사체를 포함한다.
일단, 본 발명에 따른 RSV-특이적 항체 생성 세포를 얻으면, 바람직하게는 상기 세포의 Ig 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 유전자의 적어도 기능적 부분을 단리시키고/시키거나 인공적으로 생성한다. 일 구체예에서, 도 11, 도 12, 도 14A, 도 14B 및/또는 도 14C에 도시된 핵산 서열의 적어도 기능적 부분을 포함하는 핵산 서열이 제공된다. 상기 기능적 부분은 바람직하게는 도 11D, 도 12, 도 14A, 도 14B 및/또는 도 14C에 도시된 하나 이상의 핵산 서열을 포함한다. 상기 기능적 부분은 바람직하게는 도 11D, 도 12, 도 14A, 도 14B 및/또는 도 14C에 도시된 하나 이상의 CDR을 코딩한다.
서열
의 적어도 일부분(이 부분은 15개 이상의 뉴클레오티드를 가짐)과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상 상동성이 있는 중쇄 서열을 포함하는 단리된, 합성 또는 재조합 핵산 서열을 추가로 제공한다. 상기 중쇄 서열은 바람직하게는 항체 D25에서 유래된다. 상기 중쇄 서열은 바람직하게는 도 11D에 도시된 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상 상동성이 있는 서열을 포함한다. 상기 언급된 중쇄 서열 중 어느 하나로 이루어진 중쇄 서열을 포함하는 단리된, 합성 또는 재조합 핵산 서열이 또한 여기에 제공된다.
서열
의 적어도 일부분(이 부분은 15개 이상의 뉴클레오티드를 가짐)과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상 상동성인 경쇄 서열을 포함하는 단리된, 합성 또는 재조합 핵산 서열이 또한 제공된다. 상기 경쇄 서열은 바람직하게는 항체 D25에서 유래된다.
상기 경쇄 서열은 바람직하게는 도 11D에 도시된 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상 상동성인 서열을 포함한다. 상기 언급된 경쇄 서열 중 어느 하나로 이루어진 중쇄 서열을 포함하는 단리된, 합성 또는 재조합 핵산 서열이 또한 여기에 제공된다.
서열
의 적어도 일부분(이 부분은 15개 이상의 뉴클레오티드를 가짐)과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상 상동성인 중쇄 서열을 포함하는 단리된, 합성 또는 재조합 핵산 서열이 추가로 제공된다. 상기 중쇄 서열은 바람직하게는 항체 AM14로부터 유래된다. 상기 언급된 중쇄 서열 중 어느 하나로 이루어진 중쇄 서열을 포함하는 단리된, 합성 또는 재조합 핵산 서열이 또한 여기에 제공된다.
서열
의 적어도 일부분(이 부분은 15개 이상의 뉴클레오티드를 가짐)과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상 상동성인 경쇄 서열을 포함하는 단리된, 합성 또는 재조합 핵산 서열이 또한 제공된다. 상기 경쇄 서열은 바람직하게는 항체 AM14로부터 유래된다. 상기 언급된 경쇄 서열 중 어느 하나로 이루어진 중쇄 서열을 포함하는 단리된, 합성 또는 재조합 핵산 서열이 또한 여기에 제공된다.
서열
의 적어도 일부분(이 부분은 15개 이상의 뉴클레오티드를 가짐)과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상 상동성인 중쇄 서열을 포함하는 단리된, 합성 또는 재조합 핵산 서열이 추가로 제공된다. 상기 중쇄 서열은 바람직하게는 항체 AM16으로부터 유래된다. 상기 언급된 중쇄 서열 중 어느 하나로 이루어진 중쇄 서열을 포함하는 단리된, 합성 또는 재조합 핵산 서열이 또한 여기에 제공된다.
서열
의 적어도 일부분(이 부분은 15개 이상의 뉴클레오티드를 가짐)과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상 상동성인 경쇄 서열을 포함하는 단리된, 합성 또는 재조합 핵산 서열이 또한 제공된다. 상기 경쇄 서열은 바람직하게는 항체 AM16으로부터 유래된다. 상기 언급된 경쇄 서열 중 어느 하나로 이루어진 중쇄 서열을 포함하는 단리된, 합성 또는 재조합 핵산 서열이 또한 여기에 제공된다.
서열
의 적어도 일부분(이 부분은 15개 이상의 뉴클레오티드를 가짐)과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상 상동성인 중쇄 서열을 포함하는 단리된, 합성 또는 재조합 핵산 서열이 추가로 제공된다. 상기 중쇄 서열은 바람직하게는 항체 AM23으로부터 유래된다. 상기 언급된 중쇄 서열 중 어느 하나로 이루어진 중쇄 서열을 포함하는 단리된, 합성 또는 재조합 핵산 서열이 또한 여기에 제공된다.
서열
의 적어도 일부분(이 부분은 15개 이상의 뉴클레오티드를 가짐)과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상 상동성인 경쇄 서열을 포함하는 단리된, 합성 또는 재조합 핵산 서열이 또한 제공된다. 상기 경쇄 서열은 바람직하게는 항체 AM23으로부터 유래된다. 상기 언급된 중쇄 서열 중 어느 하나로 이루어진 중쇄 서열을 포함하는 단리된, 합성 또는 재조합 핵산 서열이 또한 여기에 제공된다.
도 11, 도 14A, 도 14B 및/또는 도 14C에 도시된 아미노산 서열의 적어도 기능적 부분(상기 부분은 5개 이상의 아미노산 잔기를 가짐)과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열이 또한 제공된다. 상기 핵산 서열은 바람직하게는 도 11D에 도시된 중쇄 CDR 서열 1, 2 및/또는 3 및/또는 경쇄 CDR 서열 1 또는 2와 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 코딩한다. 또다른 바람직한 구체예에서, 상기 핵산 서열은 도 14A, 도 14B 및/또는 도 14C에 도시된 CDR 서열 중 하나 이상과 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 코딩한다. 바람직한 일 구체예에서, 상기 핵산 서열은 도 11A에 도시된 중쇄 서열, 도 14A에 도시된 중쇄 서열, 도 11B에 도시된 중쇄 서열, 도 14C에 도시된 중쇄 서열, 도 11A에 도시된 경쇄 서열, 도 14A에 도시된 경쇄 서열, 도 14B에 도시된 경쇄 서열, 및/또는 도 14C에 도시된 경쇄 서열과 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 코딩한다.
따라서, 도 11A∼도 D에 도시된 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 서열을 포함하는 단리된, 합성 또는 재조합 핵산 서열이 추가로 제공된다. 상기 핵산 서열은 바람직하게는 도 11A∼도 D에 도시된 중쇄 CDR 서열 1, 2 및/또는 3 및/또는 경쇄 CDR 서열 1 또는 2와 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 코딩한다. 일 구체예는 아미노산 서열 NYIIN과 70% 이상 동일하고/하거나, 서열 GIIPVLGTVHYAPKFQG와 75% 이상 동일하고/하거나, 서열 ETALVVSTTYLPHYFDN과 70% 이상 동일하고/하거나, 서열 QASQDIVNYLN과 85% 이상 동일하고/하거나, 서열 VASNLET와 70% 이상 동일하고/하거나, 서열 QVQLVQSGAEVKKPGSSVMVSCQASGGPLRNYIINWLRQAPGQGPEWMGGIIPVLGTVHYAPKFQGRVTITADESTDTAYIHLISLRSEDTAMYYCATETALVVSTTYLPHYFDNWGQGTLVTVSS와 70% 이상 동일하고/하거나, 서열 DIQMTQSPSSLSAAVGDRVTITCQASQDIVNYLNWYQQKPGKAPKLLIYVASNLETGVPSRFSGSGSGTDFSLTISSLQPEDVATYYCQQYDNLPLTFGGGTKVEIKRTV와 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 서열을 포함하는 단리된, 합성 또는 재조합 핵산 서열을 제공한다.
본 발명에 따른 핵산 서열은 바람직하게는 상기 인용된 서열 중 어느 하나와 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상 상동성이다.
도 14A∼도 C에 도시된 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상 상동성인 아미노산 서열을 코딩하는 서열을 포함하는 단리된, 합성 또는 재조합 핵산 서열이 추가로 제공된다. 상기 핵산 서열은 바람직하게는 도 14A, 14B 및/또는 14C에 도시된 CDR 서열과 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 코딩한다. 일 구체예는
로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열과 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 서열을 포함하는 단리된, 합성 또는 재조합 핵산 서열을 제공한다.
본 발명에 따른 핵산 서열은 바람직하게는 상기 인용된 서열 중 어느 하나와 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상 상동성이 있다.
본원에서 이전에 이미 설명된 바와 같이, 본 발명에 따른 핵산 서열은 핵산 발현 시스템에서 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능적 부분, 유도체 또는 유사체, 바람직하게는 D25, AM14, AM16, AM23 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 발현하는데 특히 적당하다. 본 발명에 따른 핵산 서열은 바람직하게는 세포, 더욱 바람직하게는 항체 생성하는데 적합한 생산자 세포에서 발현된다.
본 발명은 하기 실시예에서 추가로 설명된다. 그러한 예들은 본 발명의 범위를 한정하려는 것이 아니고, 단지 본 발명을 명백하게 하려는 것이다.
도 1
인간 IgG 양성 기억 B 세포의 단리. MACS 컬럼(Miltenyi)을 사용하여 단리시키기 전에 피콜 밀도 분리기(Amersham)를 사용하여 연막에서 단리된 PBMC를 항-CD22 자성 비드와 항온처리하였다. 이후 CD22 양성 세포를 인간 CD19, CD27, IgM, IgD 및 IgA에 대한 항체(BD)와 항온처리하였다. 고속 단일 세포 분류기(FACSAria, BD)를 사용하여 IgM, IgD 및 IgA에 대해 음성이고 CD19 및 CD27에 대해 양성인 세포를 분류하였다.
도 2
CFSE 염색. 새로운 인간 기억 B 세포를 단리시키고, CSFE로 표지하고 36시간 동안 IL-21로 자극한 후 Bcl-6-IRES-NGFR로 형질도입하였다. IL-21 상에서 추가 3일 동안 세포를 유지시킨 후 CFSE 함량을 측정하였다. 매 세포 분열마다 CFSE 염료를 희석시켰다.
도 3
Bcl-6과 Bcl-XL 또는 Bcl-XL 단독으로 형질도입된 인간 B 세포의 예.
CD40L 및 시토카인 IL-21을 발현하고 있는 조사된 L 세포 상에 세포를 유지시켰다. 좌측도에 도시된 것은 카파 및 람다 염색(카파 람다 양성 세포의 93%는 IgG 이소타입의 것임, 제시 안됨)에 의해 측정된 BCR 발현이다. 우측도는 X 축 상에 CD38 발현과 Y 축 상에 CD20 발현을 도시하고 있다. CD38dullCD20+ 염색은 기억 또는 배아 중심 B 세포를 나타내고; CD38+CD20- 염색은 형질모구를 나타낸다.
도 4
불멸화된 항원 특이적 인간 B 세포의 단리. 도 1에 도시된 바와 같이 인간 기억 B 세포를 단리시킨 후 Bcl-6-IRES-NGFR 및 Bcl-XL-IRES-GFP로 형질도입하였다. FACSAria를 사용하여 NGFR을 발현하는 세포, PE 표지된 파상풍 독소에 결합된 GFP를 단리시켰다. 세포는, FACS Canto(BD)를 사용하여 결합한 TT-PE를 기초로 선택되기 전에 조사된 L 세포 및 IL-21의 존재 하에 96웰 평판 플레이트에서 배양된 단일 세포이다.
도 5
6XL B 세포 클론의 누적 세포 성장과 분열. IL-21과 조사된 L 세포의 존재 하에서 (A) 2개의 항-TT 클론과 (B) 하나의 항-RSV 클론(B63D10-D25)으로부터의 B 세포를 배양하였다.
도 6
8% FCS를 갖는 1.0 ㎖ IMDM 및 pen/strep 내에서 200,000개 세포/24웰로 새로운 배양을 시작하였다. 사용된 FCS는 정상 (HyClone) 또는 Ultralow Bovine IgG FCS(Gibco)였다. 3일 후, 배양 상청액을 대체하고 세포 수를 200,000개 세포/㎖로 조정하였다. 도시된 것은 3번 연속 시점에서 측정된 3일째 평균 IgG 생성물이며 유의적인 차이점은 없었다(p 값 0.2).
도 7
D25 항-RSV 클론의 경쇄 표현형을 측정하기 위해, D25 B 세포주를 카파-피코에리트린 또는 람다-피코에리트린(BD) 항체로 염색하였다. 카파-피코에리트린 항체만 세포주에 결합되어, 상기 항체가 카파 경쇄를 갖는 것을 도시하고 있다.
도 8
공여자 B63으로부터, Bcl-6 Bcl-XL 양성 인간 기억 B 세포를 사용하여 100개 세포/웰 배양물을 성장시켰다. 상기 배양물 중 하나인 D10은 강력한 중화를 보여주었다. LD 유래된 단일클론 세포주를 생성하고, 하나의 D25가 RSV A-2 바이러스를 효율적으로 중화시켰다. 여기에는 팔리비주맙(시나지스) 및 다클론 염소 항-RSV와 비교하였을 때의 D25를 도시하였다. 높은 항체 수준을 생성하지만 RSV의 감염은 막지 못하는 IL-21 및 CD40L 신호전달로 배양된 Bcl6 Bcl-XL 형질도입된 B 세포 클론의 관계없는 배양물 상청액은 제시하지 않았다. 추가 특성화에 D25 클론을 사용하 였다.
도 9
도 9a: HEp2 세포를 IMDM/5% FCS로 T175 플라스크(Nunc) 당 10-12e6 세포로 시딩하였다. 다음 날, RSV 바이러스(1.0 MOI)를 포함한 배지 5 ㎖로 배지를 대체하고 RT에서 45' 동안 항온처리한 후 새로운 배지 20 ㎖를 첨가하고 세포를 37℃에서 밤새 배양하였다. 다음 날, 배지를 IMDM/1% FCS로 대체하고 37℃에서 뚜껑을 닫고 밤새 배양하였다. 다음 날, PBS로 세포를 세척하고 트립신을 처리하였다. 감염된 세포를 염색하기 위해, 배양 상청액과 1차 항온처리하였다. 항-인간 IgG-PE(BD)와 2차 항온처리하였다. LSRII(BD)를 사용하여 세포를 분석하였다. 양성 대조군으로서, r-Biopharm으로부터의 상업적 ELISA KIT의 양성 대조군을 사용하였다.
도 9b: EL-4 세포를 RSV F 또는 G 단백질(John Rose로부터 제공받음)로 위형화(pseudotyped)된 VSV 바이러스로 감염시키고 D25 배양 상청액과 항온처리하였다. 세포를 세척하고 이를 항-인간-IgG-PE(Jackson)와 항온처리하여 감염된 세포에 D25가 결합한 것을 검출하였다. RSV F 단백질로 위형화된 VSV 바이러스 감염된 세포에 D25가 결합한 것만을 검출하였다.
도 9c는 농도 의존 방식으로 팔리비주맙 (시나지스) 및 D25가 감염된 HEp2 세포에 결합한 것을 도시하고 있다. 도시된 것은 평균 형광 강도(MFI)이다.
도 10
다클론 염소 항-RSV(양성 대조군), 팔리비주맙(시나지스) 및 D25의 코팅된 HEp2 감염된 세포 분해물로의 결합.
도 11
D25 클론의 서열 분석. 11a는 가변 중쇄 및 경쇄 도메인의 뉴클레오티드 및 예측된 아미노산 서열을 도시하고, 11b/c는 예측된 배선과 비교하였을 때 D25 중쇄 및 경쇄 서열을 도시하였다. 별표시는 생체내 B 세포 클론의 선택 및 친화력 성숙 동안 발생될 수 있는 돌연변이를 나타낸다.
도 12
BCL6 BCL-xL 형질도입된 B 세포주로부터의 재조합 인간 항체의 클로닝 및 발현. 이는 이미 D25 항체에 대해 도시된 바 있다(도 11). 본래의 D25 서열과 비교하였을 때, 여기에 GENEART 뉴클레오티드 변형을 도시하고, 상기 돌연변이는 D25 항체의 아미노산 조성물을 변화시키지 않는다는 것을 유념한다.
도 13
D25와 시나지스 유래된 정제된 B 세포 상청액으로 감염시킨 BALB/c 마우스. (A) 비내용 분무제에 의한 RSV 감염 (1x107 RSV-A2 입자) 1일 전에, 동물에 시나지스(MedImmune), 정제된 D25 또는 IgG1 대조군 항체(Eureka)(표 3)의 상이한 양으로 IP 주사하였다. (B) 5일로부터 마우스 혈청에서의 인간 IgG 농도 및 5일째 항체 혈청 농도의 드롭을 측정하였다. (C) 표 4는 반감기 값의 개관을 나타내고 있다. 도 13D는 처리 및 미처리 동물에서 5일째에 폐 세척(BAL)에서 발견된 바이러스 역가를 도시하는 반면 도 13E는 처리 및 미처리 마우스의 말초 혈액에서 T 및 B 세포 수를 도시하고 있다. (F)는 기관지를 포함한 폐의 조직학과 미처리 및 처리 동물의 침 투(주로 정상적인 호산구)를 도시한다.
도 14
신규한 3개의 강력한 RSV 중화 항체 (A) AM14, (B) AM16 및 (C) AM23의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열.
도 15
D25(sD25), 재조합 정제된 D25(rD25), 재조합 GENEART 코돈 최적화된 D25(rD25 GA), AM14, AM16, AM23(모든 정제된 재조합 단백질) 및 시나지스 유래된 정제된 B 세포주 상청액을 이용한 RS 바이러스 중화 분석법. 2개의 상이한 세포주(도 15-I) Vero 및 (도 15-II) Hep2 세포 상에서 바이러스 항체 중화를 테스트하였고 상이한 항체 A2(A), X(B) 및 2006/1(C)은 RSV 서브타입 A인 반면 바이러스 Z(D) 및 2007-2(E)는 서브타입 B이다. 각 바이러스의 100TCID50을 DMEM/1% FCS 중의 일련의 항체 희석물에 첨가하고 이를 37℃에서 1시간 동안 항온처리한 후 lOO ㎕ Vero 또는 HEp2 세포(1xlO6/㎖)를 첨가하였다.
도 16
농도를 증가시킨 제시된 비표지 항체와 미리 항온처리된 RSV 감염된 HEp2 세포에 APC 표지된 시나지스 및 PE 표지된 rD25 고정량(3 pmol)을 상대 결합시키는 것.
재료 및 방법
인간 B 세포의 유지 및 단리
표준 절차를 이용하여, CD19 양성 인간 B 세포를 혈액은행 유래된 연막(다른 공급원은 응고방지 인자를 포함하는 새로운 혈액, 또는 림프 장기, 예컨대 편도선 또는 비장일 수 있음)으로부터 단리시켰다. 간단히 말해서, 피콜 밀도 분리기(Amersham, 영국 버킹엄샤이어 소재)를 사용하여 전체 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 단리시켰다. 제조자(Miltenyi(네덜란드 위트레흐트))에 의해 기술된 바와 같이, MACS 세포 분류 기법에 의해 B 세포를 양성 선택하는데 CD22 표지된 비드를 사용하였다. 이어서 CD19, CD27, IgD, IgM 및 IgA(Becton Dickinson(BD), 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크 소재)에 대한 단일클론 항체(mAbs)의 적절한 조합물로 세포를 염색하였다. 이후 FACSAria(BD)를 이용하여 CD19 및 CD27에 대하여 양성이고 IgM, IgA 및 IgD에 대하여 음성인 기억 B 세포를 분류하였다(도 1). 기억 B 세포 이외에, 적절한 마커를 사용하여 미처리된 다른 B 세포의 서브세트, 미처리된 여포, 기억, 항체 생성된 중심아세포, 중심세포, 배아 중심, 형질모구, 혈장 세포, 변연부, 혈관주변 또는 이행 B 세포(상기 서브세트의 대다수는 마우스에서만 측정됨)를 단리시킬 수 있다.
세포 배양
분류된 세포를 세척하고, 완전한 배지(8% 소태아혈청(FCS) 및 페니실린/스트렙토마이신을 포함한 Iscove's Modified D Minimal Essential Medium) 내 80 회색의 조사된 CD40L 발현 L 세포(5 x 104 세포/㎖; 프랑스 다르디이 소재의 Schering Plough France의 DR. J. Banchereau에 의해 제공받음) 상에서 24웰 플레이트에서 배양하였다(1.5 내지 2 x lO5 세포/㎖). 달리 언급하지 않는 한, 상기 CD40L 발현 L 세포는 항상 8% FCS와 함께 배양물 내에 존재한다. 레트로바이러스 형질도입을 위한 B 세포를 생성하기 위해, 마우스 IL-21(50 ng/㎖, R&D, 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)의 존재 하에서 36시간 동안 세포를 배양하였다. 형질도입 후, IL-21의 존재 하에 세포를 우선적으로 배양하였지만, 세포들은 IL-4, IL-15 및 IL-10(다른 시토카인을 제외하지 않음)에 반응하지 않았다. 예를 들어, IL-4 유도된 B 세포의 증식은 IL-21과 비교하였을 때 더 낮으며 세포 분열의 낮은 수준도 일부 실험에 필요할 수 있다.
레트로바이러스 구성체 및 재조합 레트로바이러스의 생성
STAT5a 및 b의 구성적 활성 돌연변이체는 이전에 기술된 바 있다. 상기 돌연변이체 및 야생형 STAT5b를 코딩하는 DNA를 T. Kitamura(일본 도쿄 소재 IMSUT)로부터 얻었다. 항증식성 p19ARF-p53 신호전달 억제자로서 쥐과동물 섬유아세포에서 노화 구조 스크리닝으로 Bcl-6을 동정하였다. Dr. Korsmeyer(Howard Hughes Medical Institute(미국 보스턴 소재))로부터 제공받은 항-세포사멸 인자로서의 Bcl-XL을 동정하였다. 상기 DNA를 이전(Heemskerk et al., 1997; Heemskerk et al., 1999)에 기술된 LZRS-링커-IRES-GFP (또는 IRES-YFP 또는 IRES-NGFR) 벡터와 결찰하였다. IRES-GFP(녹색 형광 단백질) 마커 대신에, 또한 IRES-YFP(황색 형광 단백질) 또는 IRES-NGFR(신경 성장 인자 수용체)를 사용하였다. NGFR은 Dr. C. Bonini로부터 얻은 NGFR의 신호전달 부전 돌연변이체이다. NGFR(Chromaprobe(미국 캘리포니아주 마운틴뷰 소재) 또는 Miltenyi)에 대한 단일클론 항체를 사용하여 NGFR 발현 세포를 시각화하였다.
재조합 레트로바이러스를 생성하기 위해, 제조자 프로토콜에 따라 Fugene-6(네덜란드 알메르 소재의 Roche Diagnostics Netherlands)을 사용하여 레트로바이러스 플라스미드에 헬퍼-바이러스 무함유 양종향성 생산자 세포주 Phoenix-A, 인간 배아 신장 세포주 293(Kinsella 및 Nolan(1996))(Dr. G. Nolan 제공(미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 스탠포드 대학교)의 유도체를 형질감염시켰다. 2일 후, 퓨로마이신(Becton Dickinson Clontech Laboratories(미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)) 2 ㎍/㎖를 첨가함으로써 형질감염된 세포의 선택을 시작하였다. 형질감염 10∼14일 후, 퓨로마이신 불포함 완전 배지 10 ㎖ 중에 10 cm 패트리디쉬(Becton Dickinson Discovery Labware(미국 메사추세츠주 베드포드 소재)) 당 6 x 106 세포를 평판배양하였다. 다음 날, 배지를 새로 바꾸고 그 이튿날 레트로바이러스 상청액을 채취하고, 원심분리시키고, -70℃에서 세포 무함유 분취물로 냉동시켰다. 이러한 접근법은 3 x 106 이상의 감염성 바이러스 입자/㎖의 신속한 재생과 대규모의 높은 역가의 레트로바이러스를 생성할 수 있다.
레트로바이러스 형질도입
재조합 인간 피브로넥틴 단편인 CH-296의 형질도입 절차(RetroNectin(TM); Takara(일본 오츠시 소재))를 이전에 기술한 바와 같이 수행하였다(Heemskerk et al., 1997; Heemskerk et al., 1999). 실온에서 2시간 동안 또는 4℃에서 밤새 비조직 배양 처리된 24웰 플레이트(Costar(네덜란드 Badhoevedorp 소재))를 30 ㎍/㎖ 재조합 인간 피브로넥틴 단편 CH-296 0.3 ㎖로 코팅하였다. 상이한 크기의 비조직 배양 플레이트를 사용하는 경우, 그에 비례하게 시약을 사용하였다. CH-296 용액을 제거한 후, 인산염 완충된 식염수(PBS) 중의 2% 인간 혈청 알부민(HSA)과 실온에서 30분 동안 항온처리하고, 이후 PBS로 1회 세척하였다. 레트로바이러스 형질도입으로 생성된 5 x 105 B 세포를 FCS 및 L 세포가 없는 RPMI 0.25 ㎖ 중에 평판 배양하고 해동된 레트로바이러스 상청액 0.25 ㎖와 혼합하였다. Bcl-6 Bcl-XL 이중 형질도입을 위해, Bcl-6-IRES-NGFR (또는 IRES-YFP)(Shvarts A. et al. Genes Dev., 2002) 125 ㎕와 Bcl-XL-IRES-GFP(Howard Hughes Medical Institute[미국 보스턴 Childrens Hospital 소재]의 S. Korsmeyer에 의해 제공됨) 125 ㎕를 혼합하고 세포에 첨가하였다. 이후, 배양물을 60분 간 25℃에서 1800 rpm으로 원심분리하고 37℃에서 6시간 동안 항온처리하였다. 다음으로, 상청액 0.25 ㎖를 제거하고 새로운 레트로바이러스 상청액 0.25 ㎖를 첨가하였다. 다시 배양물을 60분 간 25℃에서 1800 rpm으로 원심분리하고 밤새 37℃에서 항온처리하였다. 다음날 아침, 세포를 24웰 조직 배양 처리 플레이트(Costar)로 옮기고 인간 IL-4(50 ng/㎖) 또는 마우스 IL-21(50 ng/㎖, R&D(미국 미네소타주 미니애폴리스 소재))의 존재 하에 정상 조건 하에서 3∼5일 동안 배양하였다. 신경 성장 인자 수용체(ΔNGFR(이탈리아 밀란 세인트 라파엘 병원의 C. Bonini 제공)의 절두된 신호전달 부전의 돌연변이체 또는 GFP 및/또는 YFP의 (동시)발현의 항체 염색에 의해 형질도입 효능을 측정하였다. 이후, 관심 형질전환유전자(들)를 포함한 세포를 추가 실험을 위해 선택하였다.
유세포분석
FITC, PE, PERCP, PE-Cy5, APC 또는 APC-Cy7로 직접 표지되는 인간 분자 IgD, IgG, CD3, CD19, CD20, CD27, CD38, CD40, CD45, CD56, CD70, CD80, CD86, HLA-DR(BD) 및 PE(DAKO)로 직접 표지되는 IgM, 카파 경쇄, 람다 경쇄, CD 138에 대한 항체에 유세포분석기 분석을 사용하였다. LSRII(BD)를 사용하여 염색된 세포를 분석하고 FACS 데이타를 FlowJo 컴퓨터 소프트웨어(Tree Star, Inc)로 처리하였다.
증식 실험
FACSAria 상에서 새로운 PBMC로부터 본래의 세포 및 기억 B 세포를 단리시킴: 본래의 B 세포: CD19-Pe-Cy7 pos, CD27-APC neg, IgD-PE pos 기억 B 세포: CD19-Pe-Cy7 pos, CD27-APC pos, IgD-PE neg, IgA-FITC neg. PBS로 세포를 세척하고 FCS 불포함 RPMI(37℃) 0.5 ㎖ 중에 재현탁시켰다. 2 μM 카르복시플루오레신 숙신이미딜 에스테르(CFSE)를 함유한 IMDM의 동량을 세포 혼합물에 첨가하고 37℃에서 7분 동안 항온처리하였다. 냉각된 FCS로 세포를 세척함으로써 세포의 상승 표지하는 것을 정지하였다. IMDM-8% FCS 500 ㎕ 중에 세포를 재현탁시키고 L 세포와 함께 IL-21의 부재 또는 존재 하에서 배양하였다. 비표지된 세포를 대조군으로 사용하였다. 36시간 후(형질도입 직전), CFSE 함량으로 세포 비율을 분석하였다. Bcl-6-IRES-NGFR로 잔여 세포를 회전 형질도입시키고, 3일 동안 배양하고, LSRII를 사용하여 이의 CFSE 함량을 측정하였다. FlowJo 소프트웨어(Treestar)를 사용하여 데이타를 분석하였다.
고속 단일 세포 분류를 이용한 항원 특이적 인간 B 세포의 단리.
MBC(즉, 100 세포/웰 배양)로 시작하는 상기 기술된 기억 B 세포 단리 방법 이외에, 인간 기억 B 세포는 또한 형광 표지된 항원과 항온처리되고 항원 인식을 기초로 분류할 수 있다. 예는 파상풍 톡소이드(A. Radbruch(독일 베를린) 제공)로 표지된 피코에리트린(PE)에 결합하는 B 세포의 단리이다(도 4). 세포를 1 세포/웰로 배양하고 TT 결합에 대해 검토하였다. 하지만, 다른 표지된 임의의 항원도 사용할 수 있다.
B 세포 수용체(BCR) 발현을 측정하는 것은 Bcl-6 및 Bcl-XL 형질도입된 세포의 장기간 배양을 변경함
시험관내 배양 동안 분화하는 B 세포는 이의 BCR 막 발현을 잃고, 이는 또한 EBV 형질변환된 B 세포에서도 관찰되는 것이 공지되어 있다.
따라서, Bcl-6과 Bcl-XL로 형질도입되고 IL-21의 존재 하에 배양된 B 세포는 GFP, NGFR, CD19, 카파 및/또는 람다 또는 IgG 또는 표지된 파상풍 톡소이드로 염색되었다. BCR 발현의 유용성을 보여주기 위해, L 세포 및 IL-21 함유 배양 배지가 시딩된 96웰 플레이트 내 1 세포/웰에서 FACSAria(BD)를 사용하여 TT-PE(Radbruch) 결합 세포를 분류하였다. 3주 후, FACS Canto(BD)를 사용하여 고속성장(outgrowing) 클론의 파상풍 톡소이드 결합을 검토하였다. 따라서, 세포를 채취하고 96웰 플레이트 중에서 GFP, NGFR, CD19 및 TT-PE로 염색하였다.
항체를 분비하는 Bcl-6 및 Bcl-XL 이중 긍정 B 세포주의 발생
단일클론 항체를 생성하는 B 세포주를 생성하고 이는 100% Bcl-6과 Bcl-XL 이중 긍정이다. 우선, 이는 IL-21을 사용하여 증식과 분화를 유도함으로써 실현되었다. 한편, 상기 세포를 Bcl-6-IRES-NGFR 및 Bcl-XL-IRES-GFP 레트로바이러스로 형질도입하였다. 3∼4일 동안 IL-4 상에서 세포를 유지하였다. 이후 하나 또는 레트로바이러스 모두로 형질도입되는 세포는 형질전환유전자를 발현하고 이에 따라 NGFR 또는 GFP 단백질을 발현할 것이다. LSRII(BD)를 사용하여 NGFR 및/또는 GFP의 발현을 시각화할 수 있다. 필요하다면, 세포를 다시 형질도입하여 형질전환유전자들 모두를 발현하는 더 많은 수의 세포를 얻을 수 있다. 두번째 형질도입과는 상관없이, 형질전환유전자 모두가 발현된 세포는 FACS Aria (BD)를 사용하여 분류되고 세포 밀도는 IL-21의 존재 하에 96웰 플레이트에서 10∼500 세포/웰 및 2500∼5000 L 세포/웰의 범위로 배양되었다. 이러한 미니-벌크-배양물(MBC)은 5일째 이미 배양 상청액 내의 상대적으로 대량의 항체를 분비하여, 이후 스크리닝 목적으로 사용할 수 있었다. 스크리닝은, 관심 항원을 이용할 수 있는 기법, 예컨대 ELISA/EIA/RIA, 웨스턴 블롯 또는 직접 기능 분석법, 예컨대 시토카인 차단의 중화 실험을 기초로 할 수 있다. 관심 항원(본 실험에서 TT 및 RSV)을 인식하는 MBC의 스크리닝 및 선별 후, IL-21의 존재 하에서 96웰 내 0.5∼1 세포/웰로 세포를 서브클로닝하였다. 서브클로닝은 정상적으로 2∼3주가 걸리며 유세포분석기(FACSAria)를 사용하는 한계 희석(LD) 배양 또는 단일 세포 분류에 의해 수행할 수 있다.
RSV A-2 바이러스 스톡 및 HEp2 세포주
RSV A-2 바이러스(G. van Bleek(위트레흐트 WKZ) 제공) 및 HEp2 세포주 (Clinical Laboratory(암스테르담 AMC))를 대량으로 배양하고 액체 질소로 동결시켰다. T175 Falcon 병 내 정상 배지에서 부착된 HEp2 세포주를 배양한 후 분취액을 동결시켰다.
높은 역가의 RSV 스톡을 얻기 위해, HEp2 세포를 시딩하고 50∼60%의 융합에 도달하도록 배양하였다. HEp2 세포 상에서 RT에서 45' 동안 처음의 RSV 스톡(1/20 희석액 총 부피 5 ㎖)을 첨가하였다. 새로운 배지 15 ㎖를 첨가하고 세포를 37℃, 5% CO2에서 뚜껑을 연 채로 밤새 정치시켰다. 다음 날 아침, 배양 상청액을 신중하게 제거하고 1% FCS 함유 배지 15 ㎖를 첨가하였다. 24∼36시간 동안 37℃, 5% CO2에서 뚜껑을 닫고 세포를 정치시켰다. RSV 유도된 세포융합이 명확하게 가시화되고 대부분의 세포융합이 여전히 비손상되는 경우, 배지를 채취하고, 여과(0.22 μm)하고 1450 rpm, RT에서 회전시킨 후 샘플을 급동결시키고 액체 질소 중에 저장하였다. 1% FCS를 함유한 새로운 배지를 즉시 첨가하고 4∼6시간 후 상기 뱃치를 동결시킴으로써 두번째 채취를 얻을 수 있다.
ELISA를 위한 RSV 분해물
RSV A-2로 감염시켜 바이러스 스톡을 얻기 위한 HEp2 세포는 RSV 단백질을 단리시키는데 사용하였다. 우선 세포를 PBS로 신중하게 세척하고 트립신화하였다. 1% 옥틸글루코시드(하나의 T175 플라스크 중 세포 펠렛을 옥틸글루코시드 2 ㎖로 처리함)로 트립신(Gibco)을 세척하고 세포 펠렛을 용해시켰다.
시린지와 니들로 현탁액을 균질화시키고(10회 밀고 당김), 1시간 동안 얼음 위에 처리한 후 4℃에서 밤새 TBS 완충액 pH 7.4 2 ℓ에 대해 투석하였다. 세포 잔사물을 회전시켜 가라앉힌 후 상청액을 얻었다. 단백질 함량을 3.6 mg/㎖에서 측정하고 ELISA로 20 ㎍/㎖(50 ㎕)에서 사용하였다.
RSV 스톡의 TCID50 및 PFU 측정
TCID50을 측정하기 위해, 104 HEp2를 96웰 플레이트에 시딩하고 4-plo에서 RSV 바이러스의 2단계 또는 10단계 연속 희석으로 감염시켰다. 2∼3일 후, 배양 상청액을 제거하고 RT에서 10' 동안 80% 아세톤으로 세포를 고정시켰다. 아세톤의 제거 후, 고정된 세포 층을 건조시키고 4℃로 유지시키거나 -2O℃에서 동결하였다. RSV HEp2를 염색하기 위해, 우선 플레이트를 PBS 0.1% Tween 20 중 5% 분유로 블로킹하였다. 이후, 플레이트를 3회 세척한 후 37℃에서 3∼5시간 동안 다클론 염소 항-RSV-HRP (1:500, Biodesign, Saco(미국 메인주))와 항온처리하고 폭넓게 세척하였다. 그 다음으로, RT에서 30' 동안 웰을 AEC 기질과 항온처리하였다. 감염된 포커스를 적색으로 염색하고 광 현미경을 사용하여 육안으로 관찰할 수 있고 계수할 수 있다. TCID50을 측정하는데 표준 액셀 소프트웨어를 사용하였다.
바이러스의 플라크 형성 단위(PFU)의 양을 측정하기 위해, 24웰 플레이트 내 HEp2 세포 1x1O5/㎖를 45' 동안 37℃에서 1% FCS를 포함한 배지(200 ㎕) 중 RSV 바이러스 스톡의 10배 연속 희석물(10-3∼10-7)과 항온처리한 후 세포 및 바이러스를 핸드 웜(hand warm) 0.25% 씨플라크 한천(Biozyme) 0.5 ㎖로 피복하였다. 아가로스 층은 배양 배지를 통해 바이러스의 미감염된 세포로의 전이를 막는다. 이에 따라, 바이러스는 오직 인접한 세포에만 감염될 수 있고, 이는 결국에는 HEp2 세포의 단일층 내 플라크를 생성하는 바이러스에 의해 사멸된다. 상기 플라크는 1% 크리스탈 바이올렛 용액으로 고정된 세포(96% 에탄올 - 100% 아세트산 - 10% 포르말린 6:2:1)를 염색함으로써 최적으로 시각화될 수 있다. (둘 이상의 상이한 개체에 의해) 플라크를 계수하고 PFU 값을 측정하였다.
호흡기 합포체 바이러스(RSV)를 중화시키는 항체의 선택
항-호흡기 합포체 바이러스(RSV) B 세포 클론을 얻기 위해, 2명의 공여자로부터의 말초 혈액 세포(PBMC)를 혈액은행 유래 연막(공여자 B62 및 B63)으로부터 단리시켰다. FACSAria(BD)를 사용하여 CD19posIgMnegIgDnegIgAnegCD27pos 세포를 분류하기 전(도 1), MACS 비드 및 컬럼(Miltenyi)을 사용하여 CD22+ 세포를 단리시켰다. 상이하게 언급된 경우에만, L 세포를 이용하여 세포를 배양하였다. IL-21의 존재 하에서 36시간 동안 세포를 배양한 후 Bcl-6-IRES-NGFR만을 형질도입하였다. 12시간 후, 세포를 채취하고 IL-4의 존재 하에 3일 동안 배양한 후 MACS 비드(Miltenyi)를 이용하여 NGFR 발현 세포를 분류하고 즉시 Bcl-XL-IRES-GFP를 형질도입하였다. MACS 비드에 결합하지 않은 B 세포를 세척하고 동시에 Bcl-6과 Bcl-XL을 형질도입하였다. 12시간 후, 세포를 채취하고, 풀링하고 IL-4의 존재 하에서 3일 동안 배양한 후 FACSAria 상에서 GFP와 NGFR의 발현을 분류하였다. 세포를 세척하고 IL-21의 존재 하에서 96웰 플레이트(Costar) 내에 100 세포/웰 밀도로 배양하 였다.
이중 형질도입된 Bcl-6 및 Bcl-XL B 세포 배양물을 RSV 감염된 HEp2 세포 분해물 ELISA를 사용하여 RSV 결합에 대해 스크리닝하고 동시에 RSV 미세중화 실험을 이용하여 테스트하였다. 간단히 말해서, 평판 96웰 플레이트(Costar) 내 완전 배지 중에서 104 HEp2 세포를 시딩하였다. 다음 날, 37℃에서 30분 동안 미리 항온처리한 RSV 바이러스와 세포 배양 상청액의 혼합물로 배지를 RT에서 1시간 동안 대체하였다. 총 부피는 25 ㎕이고 RSV 최종 농도는 0.1 MOI이다. 1시간 후, 바이러스 상청액 혼합물은 PBS로 9회 희석되고 100 ㎕ IMDM/5%FCS로 치환하였다. 2일 후, 세포를 80% 아세톤으로 고정하고 다클론 항-RSV-HRP(Biodesign)로 염색하였다. H2O2 및 RSV로 감염된 AEC 세포를 이용하여 적색 염색을 현상하였다. 광 현미경을 이용하여 감염딘 세포를 관찰하고 필요하면 계수할 수 있다. RSV 중화를 위한 대조군으로서, 염소 다클론 항-RSV(Abeam(미국 메사추세츠주 캠브리지 소재))를 사용하였다.
RT-PCR과 VH 및 VL 영역의 클로닝
RNeasy® 미니 키트(Qiagen, Venlo(네덜란드))를 이용하여 ∼5xlO5 B 세포로부터 전체 RNA를 단리시켰다. 총 RNA 250 ng을, 1X 퍼스트 표준 완충액, 500 μM dNTP, 250 ng 무작위 6량체, 5 mM DTT, 40 U RNasin(Promega) 및 200 U Superscript III RT(Invitrogen)를 포함하는 20 ㎕ 부피로 역 전사시켰다. cDNA를 초정제수에 1OX로 희석시키고, 20 mM Tris-HCL, 50 mM KCL, 2.5 mM MgCl2, 250 μM dNTP, 1 U AmpliTaq Gold DNA 중합효소(Applied Biosystems Inc.), 및 각 프라이머 25 pmol을 포함하는 50 ㎕ 용액과 cDNA 2.5 ㎕에 PCR을 실시하였다. PCR 조건은 다음과 같다: 96℃에서 8분간 변성 단계 후 96℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 1분 35회 반복, 및 72℃에서 최종 10분간 연장 단계. PCR 생성물을 아가로스 겔에 러닝시키고, 정제하고 제조자의 권장에 따라 pCR2.1 TA 클로닝 벡터로 클로닝하였다. BigDye Terminator chemistry(Applied Biosystems Inc.) 및 Vector-NTI 소프트웨어(Invitrogen)를 사용하여 서열 분석을 수행하였다.
돌연변이를 유도하는 역전사효소 및/또는 DNA 중합효소를 배제하기 위해, 수차례 독립적 cDNA 전환과 PCR 반응을 수행하고 개별적으로 클로닝하고 서열 분석하였다. Vector-NTI Contig Express 소프트웨어를 사용하여 공통 서열을 측정하였다.
293T 세포 내 재조합 단백질 항체 발현을 위해 전장 중쇄 및 경쇄 구성체를 pCDNA3.1(+)Zeo(Invitrogen) 내에서 생성하였다. 중쇄 발현 벡터는 5'-NheI 부위 및 3'-XhoI 부위를 도입하는 클론 D25의 중쇄 선도 서열 및 VH 영역의 PCR 증폭에 의해 구성되었다. 5'-XhoI 및 3'-NotI 부위를 도입시키면서 동일한 cDNA로부터 IgG1 불변 영역(CH1-hinge-CH2-CH3)을 증폭시켰다. NheI/NotI 분해된 pCDNA3.1(+)Zeo로 3점 결찰에 의해 전장 중쇄 발현 벡터를 얻었다. 5'-NheI 및 3'-NotI 부위를 도입하는 프라이머를 이용하여 경쇄 선도 서열, VL 영역 및 경쇄 불변 영역의 PCR 증폭에 의해 전장 경쇄 발현 구성체를 생성하였다. NheI/NotI 분해된 pCDNA3.1(+)Zeo로 후자 생성물을 클로닝하여 전장 경쇄 발현 벡터를 얻었다. 서열 분석을 수행하여 발현 구성체의 정확성을 확인하였다.
중쇄 및 경쇄 발현 벡터 모두를 갖는 293T 세포의 이행 이중 형질감염(Fugene-6, Roche, Germany 또는 리포펙타민 LTX, Invitrogen)을 수행하여 재조합 단일클론 항체를 생성하였다. RSV 감염된 Hep2 세포 상에서 생성된 배양 상청액(48시간)으로 FACS 염색하여 RSV F-단백질로의 항체의 기능적 결합을 제시하였다.
PCR 증폭에 사용되는 올리고뉴클레오티드
발현 벡터 수성에 사용된 올리고뉴클레오티드는
이다.
EBV RT-PCR
강한 증폭 반응이 EBV의 존재와 관련이 있는 경우 테스트하기 위해, EBV RT-PCR을 수행하였다. RT 절차는 상기 기술된 바와 같다. PCR 조건은 다음과 같다: 94℃에서 변성 단계 7분 후, 94℃에서 30초, 62℃(HPRT1)에서, 52℃(LMP-1)에서 그리고 58℃(EBNA1/2)에서 30초 및 72℃에서 30초의 30회 반복, 및 72℃최종 7분 연장. RT-PCR에 사용된 올리고뉴클레오티드는 다음과 같다: HPRT1 정방향(5'- TATGGACAGGACTGAACGTCTTGC-3') 및 HPRT1 역방향(5'-GACACAAACATGATTCAAATCCCTGA-3'); LMP-1 정방향(5'-GCGACTCTGCTGGAAATGAT-3') 및 LMP-1 역방향(5'-GACATGGTAATGCCTAGAAG-3'); EBNA1/2 정방향(5'-AGCAAGAAGAGGAGGTGGTAAG-3') 및 EBNA1/2 역방향(5'-GGCTCAAAGTGGTCTCTAATGC-3'). RT-PCR 이외에, 세포 펠렛 및 QIAmp 단리 키트(Qiagen)를 사용하여 단리된 상청액 DNA 상에 직접적으로 PCR을 수행하였다.
실시예
1
결론
B 세포 표현형
치료 의약을 단리시키기 위한 플랫폼으로서의 인간 기억 B 세포의 용도는 비교적 장시간 동안 상기 세포를 성장 및 테스트하는 능력에 의존한다. 인간 B 세포는 실험실 셋팅으로 배양하고 유지할 수 있지만, 관심 항원에 대하여 단일 B 세포주를 팽창, 선택 및 클로닝하는 것에는 충분하지 못하다. 본 발명자들은 인간 B 세포의 유전적 변형을 기초로 불멸화 기법을 개발하였다. 본 발명자들은 STAT5의 하류 표적을 연구하였다. 기타 외의 하나의 표적은 Bcl-6이다. Bcl-6은 B 세포의, 증식을 저지하는 혈장 세포로의 분화를 억제한다. Bcl-6의 과발현은 BLIMP1의 균형, IL-21(STAT3을 통해 작용)로 B 세포를 자극시킴으로써 발현을 강하게 향상시키는 전사 인자를 유지시킨다. BLIMP1은 Ig 생성 세포(CD20-CD38+)의 발생을 유도하는데 필요한 반면 Bcl-6은 이것을 막을 수 있다(세포가 CD20 발현을 유지시킴, 소위 배아 중심 표현형).
B 세포 구획 내 특정 세포 집단의 가능한 왜곡을 연구하기 위해, 새로운 기억 및 본래의 인간 B 세포의 자극 이전에 CFSE 표지는 모든 세포가 분열을 시작하고 B 세포의 모든 집단이 동등하게 형질도입되는 것을 밝혀냈다(도 2). Bcl-6으로 형질도입되고 IL-21 및 IL-4의 존재 하에 배양된 기억 B 세포가 확인되었다. 본래의 B 세포를 저 농도에서 형질도입하고 36시간째에 분열 비율은 더 낮아졌지만 배양하고 추가 3일 후에는 기억 B 세포와 동일하였다(데이타 제시 안됨).
다음으로, Bcl-XL(STAT5의 세포사멸방지 하류 표적)과 함께, CD40L 신호전달 및 IL-21의 존재 하에서, 장시간(> 3개월) 동안 Bcl-6은 CD20+CD38dull 표현형으로 인간 IgG 기억 B 세포를 유지하였다(도 3). 또한, Bcl-6 Bcl-XL B 세포는, 상기 세포에서 CD80, CD86 및 HLA-DR이 발현하기 때문에 활성화된 B 세포(3 TT+ B 세포 클론의 FACS 염색에 의해 예시된 표 1 참조)와 상응한 표현형을 가진다.
IL-21 및 CD40L 신호전달로 배양된 3개의 상이한 Bcl-6 Bcl-XL B 세포 클론 상에서 측정됨.
[표 1]
항체 막 발현
Bcl-6 Bcl-XL 형질도입된 EBV 음성세포는 항원 결합 또는 카파 및 람다 염색에 의해 측정된 바와 같은 BCR 발현 양상을 유지하였다(도 3 및 4). 따라서, 상기 세포는, 예컨대 표지된 항원을 사용하는데 목적하는 특이성을 위한 배양을 하고 장시간 후에 단리 및/또는 스크리닝하는데 특히 적당한데, 그 이유는 상기 세포가 BCR을 갖는 상기 표지된 항원에 결합하기 때문이다. 이는 FACSAria를 사용하여 PE 표지된 TT에 결합하는 Bcl-6과 Bcl-XL의 이중 형질도입된 B 세포의 단일 세포 분류에 의해 확인되었다. 3주 후, 단일 세포 분류된 클론을 96웰 플레이트에서 적당한 마커 및 TT-PE로 염색하고 FACS Canto(BD)에 결합하는 것에 대해 측정하였다(도 4). 결론적으로, 예를 들어 스크리닝 분석법 등에서 B 세포 상에 B 세포 수용체의 존재가 바람직한 경우, B 세포는 바람직하게는 Bcl-6과 Bcl-XL을 형질도입시키고 EBV를 감염시키지 않았다.
세포분열 및 성장 곡선
Bcl-6 Bcl-XL을 형질도입시킨 B 세포는 1일 당 평균 0.6시간 분열한다. 분열 비율은 공여자와 배양물의 세포 밀도 사이에서 달라진다(도 5a). 항-RSV 클론 D25는 1일 당 0.47회의 분열 비율을 갖는다(도 5b). 클로닝 목적을 위해 1 세포/96웰 이하의 밀도에서 세포를 성장시킬 수 있다.
Bcl-6 Bcl-XL B 세포의 항체 분비
Bcl-6 Bcl-XL을 형질도입시킨 B 세포는 항체 평균 1 ㎍/㎖를 분비하고, 이는 예비임상 테스트에 필요한 양을 성장시키는데 충분하다(도 6). 놀랍게도, D25 항-RSV 클론은 테스트된 다른 세포주와 비교하였을 때 3배 이상의 항체를 생성하였다.
EBV 함량 측정
IL-21 및 CD40L 신호전달을 이용하여 배양된 Bcl-6 Bcl-XL 세포주의 mRNA 상에서의 EBV RT-PCR. 불멸화 기법으로 얻어진 세포에서, EBV 유전자 전사산물은 검출되지 않았다(데이타 제시 안함).
선별 절차
BCR의 성장 및 발현에서 안정성으로 인해, 상기 세포들은 항원 특이적 B 세포를 단리시키는 것에 잘 맞춰져 있다. 이것은 여러 개의 상이한 선별 및 클로닝 절차를 사용할 기회를 제공한다. 하나는 표지된 관심 항원을 사용하여 복수의 항원 특이적 B 세포 클론 생성의 가능성을 향상시키는 FACS 또는 자성 비드 분류법에 의한 Bcl-6과 Bcl-XL의 도입 후 항원 특이적 세포를 즉시 얻는 것이다. 또다른 선택은 낮은 세포 밀도(예, 100 세포/웰)에서 정제된 벌크 Bcl-6 Bcl-XL이 형질도입된 기억 (또는 임의의 다른) B 세포를 성장시키는 것이다. 이러한 100 c/w 배양물로부터의 상청액을 수집하고 이의 특이성에 대해 테스트할 수 있다. 이후, 항원 인식에 대하여 긍정으로 밝혀진 100 세포/웰 배양물을 희석 배양물을 한정하여 서브클로닝하여 단일클론 세포주를 얻었다. 두 방법 모두를 사용하여, 본 발명자들은 40개 이상의 파상풍 톡소이드(TT)를 인식하는 B 세포 클론을 단리시킬 수 있었다. 따라서, 이러한 클론들은 FACSAria 상의 BCR에 결합하는 TT 상에서 선택되거나 또는 단일한 항-TT 단일클론 세포주가 단리될 때까지 일련의 배양물의 ELISA 스크리닝에 의해 선택되었다(미제시).
RSV 중화 항체의 선별
공여자 B63으로부터, 25개의 100 세포/웰 배양물이 RSV 감염 및 복제를 완벽하게 차단하였다. 중화된 100 세포/웰 배양물 중 하나인 D10은 강한 항-RSV 항체를 생성하였고, 본 발명자들은 희석 배양물을 한정함으로써 클로닝하였다. 단일클론 항체 중 하나인 D25는 연구를 계속하는데 사용되었다. 상업용 ELISA(Sanquin, Amsterdam, 미제시)에 의해 측정된 IgG1 중쇄 및 카파 경쇄를 갖는 단일클론 항체(도 7)인 D25는 0.5∼1.5 ng/㎖(±10 pM) 사이의 IC50 값으로 RSV 감염을 매우 효과적으로 차단한 반면, 임상(MedImmune에 의해 개발된 팔리비주맙)에 사용된 표준 항-RSV 항체 IC50은 0.453 ㎍/㎖(3.02nM)(H. Wu et at. 2005 J. Mol. Biol, 및 A. Mejias et al. 2005 Antimicrob. Agents Chemother.)이다(도 8).
항원 인식
중화 실험 이외에, RSV 감염된 HEp2 세포로의 D25의 결합이 측정되었다. 정규 바이러스 생성 프로토콜을 사용하여 HEp2 세포를 감염시켰다. RSV에 감염된 HEp2 세포를 트립신화시키고 배양 상청액 25∼50 ㎕와 항온처리하였다. 세포를 세척하고 마우스-항-인간 IgG-PE(BD 또는 Jackson)로 염색하여 감염된 세포에 D25 항체가 결합하는 것을 검출하였다. r-Biopharm ELISA 대조군 항체를 내부 대조군으로 사용하였다. 도 9A는 비손상된 RSV 감염된 HEp2 세포에 D25의 결합을 도시하고 있다.
RSV 엔벨롭(막) 단백질에는 2개의 단백질, 즉 G 및 F-단백질이 존재하기 때문에, 아무것도 처리되지 않거나 RSV F 또는 RSV G 단백질(John K Rose 제공)에 의해 위형화된 VSV 바이러스로 감염된 세포에 대하여 D25의 결합을 테스트하였다. 도 9B에 도시된 바와 같이, D25는 VSV-F 단백질에 감염된 EL-4 세포에 강하게 결합하였다. 연구를 시도하는데 있어서, D25 대 팔리비주맙, VSV-F 단백질 감염된 EL-4 세포에 의해 인식된 에피토프는 D25 또는 팔리비주맙의 양을 증가시키면서 항온처리하였다. 세포를 세척하고 3 마우스-항-RSV-F 항체(Dako)의 혼합물로 염색하였다. 마우스-항-RSV-F 항체를 이용한 감염된 VSV-F 세포에 결합하는 것에 대한 경쟁을 보여주는 팔리비주맙과 대조적으로, D25의 결합은 영향을 주지 않았다(데이타 제시 안함).
도 9c는 감염된 HEp2 세포에 대한 농도 의존적 방식으로 팔리비주맙(시나지스)과 D25의 결합을 도시하고 있다. 성가 항체들은 이의 표적 단백질에 1 대 1로 결합하게 때문에, 감염된 HEp2 세포에 결합한 것과 차이가 없다.
RSV 항원 결합 대 중화 클론의 빈도
공여자 B63에 대하여 측정한 바와 같이, RSV에 결합하는 항원 특이적 기억 B 세포의 빈도는 17%이고 RSV를 중화시키는 항원 특이적 세포의 빈도는 6%였다는 것을 계산하였다. D25는 팔리비주맙에 의해 인식되는 에피토프와 상이한 구조 에피토프에 결합한다. 이것은, 팔리비주맙이 변성된 (F) 단백질에 결합하는 동안 D25가 ELISA 플레이트 상에 코팅된 분해된 RSV 감염 세포 분해물에 의해 제시되는 변성된 선형 에피토프에 결합하지 않는 도 10에 도시되었다.
항체 단편의 단리 및 정제
고도로 RSV가 중화된 클론 D25를 포함하는 여러개의 B 세포주로부터, 본 발명자들은 500 ㎖ 정도의 부피로 D25를 성장시킬 수 있었다. 상기 배양 상청액은 2 ㎍/㎖ 이상을 포함하여서, 본 발명자들은 충분히 정제된 항체를 얻어서 예비 임상(동물) 연구를 수행할 수 있었다. Montage 항원 정제 키트(Millipore, Billerica(미국 메사추세츠주 소재)) 및 HiTrap 단백질 A HP 컬럼(GE Healthcare, Diegem(벨기에 소재))을 사용하여 정제를 수행하였다. 또한, 리포펙타민 LTX(Invitrogen)를 이용한 pCDA3.1 단백질 발현 벡터 내에 서브클론화된 D25의 중쇄 및 경쇄를 293T 세포에 형질감염시켰다. 상청액의 존재 하에 있는 IgG의 양은 대략 22 ㎍/㎖(총 부피 50 ㎖)였다. D25 B 세포주에 의해 발현된 항체의 클로닝된 뉴클레오티드 서열로부터 유래된 상기 항체는 또한 감염된 HEp2 세포를 인식하였다(데이타 제시 안함).
항체 서열
도 11a는 B63D10-D25 클론의 중쇄 및 경쇄 뉴클레오티드와 아미노산 서열을 도시하고 있다. 표준 RT-PCR 및 항체 특이적 프라이머를 사용하여, 중쇄(Vh1-69) 및 경쇄(VkI 08/018) 서열을 측정하였다. TOPO 벡터를 이용하여 전체 항체 서열을 클로닝하고, 서열 조절 후 pCDNA3.1 포유동물 단백질 발현 벡터(Invitrogen)로 서브클로닝하였다. 도 11B 및 11C는 클론의 VH 및 VL4 쇄를 도시하고, 별표는 친화력 성숙 및 추가 B 세포 선별 동안 발생해야 하는 Vh1-69의 배선 서열과 비교하였을 때 돌연변이를 나타낸다.
요약하자면, 본 발명자들은 형질전환유전자 Bcl-6과 Bcl-XL을 이용하여 인간 기억 B 세포의 단리, 특징화 및 장기간 배양을 본원에 나타내었다. 이는 독특한 성질을 갖는 항체, 예컨대 항-RSV 단일클론 항체 B63D10-B25를 단리시키는데 필요한 도구를 제공하였다. B 세포가 인간으로부터 생성되기 때문에, 이들은 치료용 의약으로 쉽게 전개될 수 있다.
실시예
2
이전에 기술(p44 '항체 서열')된 바와 같이 D25 중쇄 및 경쇄를 표준 발현 벡터로 클로닝하였다. 단백질 발현을 최대화시킬 수 있는 발현 구성체를 생성하기 위해, D25 중쇄 및 경쇄 서열은 GENEART (Regensburg(독일))에 의해 최적화된 코돈이었다. 상기 절차에서, 추가의 제한 부위를 생성하여 추가의 클로닝 절차를 간소화시켰지만, 아미노산 서열을 번역하는 대부분의 중요한 뉴클레오티드 코돈은 단백질로 최대한 번역을 위해 최적화되었다. 따라서, 뉴클레오티드 서열은 최적화되었지만 아미노산 서열은 변하지 않고 유지되었다.
실시예 4에 나타내는 것은 정제된 B 세포 상청액 유래 D25, 재조합 D25 및 GENEART 최적화된 D25의 중화 능력이다. 모두 RSV를 효율적으로 중화시켰다. 원래의 D25 서열과 비교하였을 때 GENEART의 변형은 도 12에 도시하고 있다.
실시예
3
시험관내 RSV 중화 실험 다음으로, 본 발명자들은 생체내 모델 내에서 D25 단일클론 항체를 테스트하였다. 생체내 항-RSV 테스트를 기술하기 위한 모델은 BALB/c 마우스와 코튼 래트(시그모돈 히스피두스; Sigmodon hispidus)(Mejias A et al., Antimicrobial Agents and chemotherapy 2004;p1811, Johnson S et al., JID 1997; p1215 및 Wu H et al., JMB 2007: p652)이다. BALB/c 마우스 모델은 확실히 가장 약한 모델이지만 코튼 래트는 입수와 유지가 어렵기 때문에, 우선 BALB/c 마우스에서 D25 테스트를 시작하였다.
프로토콜:
BALB
/c 내
RSV
특이적 항체, 5일
실험 고안:
-1일. LP. lOO ㎕ 항체 주사
0일. 50 ㎕ 중 I.N 감염 1x1O7 pfu RSV A2
1일∼5일, 일반적인 관리(well being) 체크 및 마우스 무게 측정
5일, 부검, BAL, 혈액 및 폐 수집
정맥 천자를 통한 혈액 제거
기관 캐뉼을 통한 BAL 2.0 ㎖ 수집
폐 수집
BAL 재료(1 ㎖) 상에서 TCID50을 즉시 시작
1 ㎖의 BAL 재료(ELISA 시토카인/RT-PCR)를 -80℃로 동결
제조된 장기 재료(1 ㎖) 상에서 TCID50 수행
1 ㎖의 장기간 재료(ELISA 시토카인/RT-PCR)를 -80℃로 동결
-80℃에서 저장한 혈청 상에서 hIgG ELISA를 위해 혈액을 수집/회전
결과를 도 13에 도시한다:
(A) 비내용 분무제에 의해 RSV 감염(1x1O7 RSV-A2 입자)시키기 1일 전, 상이한 양의 시나지스(MedImmune), 정제된 D25 또는 IgG1 대조군 항체(Eureka)(표 3)로 동물에 IP 주사되었다. (도 13B) 5일째 마우스 혈청 내 인간 IgG 농도를 측정하고 5일째 항체 혈청 농도를 감소시켰다; 표 4는 반감기 값의 개관을 제시하고 있다. 도 13D는 처리 및 미처리된 동물에서 5일째 폐 세척(BAL)으로 발견된 바이러스 역가를 도시하는 반면, 도 13E는 처리 및 미처된 마우스의 말초 혈액 내 T 및 B 세포 수를 도시하고 있다. 도 13F는 기관지를 포함한 폐의 조직학 및 (통상 주로 호산구) 미처리 및 처리된 동물의 침투를 도시한다.
결론/결과:
D25 반감기의 추정치는 항체 60 및 30 ㎍을 0일에 주사(각각 2 및 1 mg/kg)하고 5일째 33 또는 16 ㎍을 검출하는 (선형) 계산을 기초로 5∼9일이다(마우스 1.5 총 부피). 0일에 동물 당 0.5 mg/kg 주사로 시작하는 경우. 5일째 Ig 농도가 15 ㎍에서 11 ㎍으로 떨어지고, 이는 9일의 반감기를 나타낸다(표 4).
[표 4]
| mg/kg | 0일 총 투여량(㎍) | 5일 검출량(㎍) | 반감기(일) |
| 2.0 | 60 | 33 | 5.6 |
| 1.0 | 30 | 16 | 5.4 |
| 0.5 | 15 | 11 | 9.4 |
TCID50 분석법에 측정된 바이러스 역가는 대조군 동물에서 1x1O4 PFU가 검출될 수 있는 반면 시나지스(2 mg/kg) 또는 D25(2, 1 및 0.5 mg/kg) 처리된 동물에서는 바이러스가 검출되지 않는 것을 보여주고 있다.
시나지스 또는 D25가 처리된 동물은 말초 CD4 T 세포와 B220 B 세포의 %보다 높게 유지된다. 시나지스(2 mg/kg)로 처리된 동물은 D25 처리된 동물과 비교하였을 때 CD4 T 세포의 %보다 낮았다. 이는 유의적이지 않을 수 있지만, 대조군 처리된 동물과 비교하였을 때 낮은 용량의 D25(1 및 0.5 mg/kg)로 처리된 동물이 B 및 T 세포를 높은 농도로 유지하는 것을 유념하는 것이 중요하다.
조직학 데이타(도 13F)가 정량이 아닐지라도, 대조군과 비교하였을 때 시나지스와 D25가 폐와 기관지 주변으로의 면역 세포의 유입을 감소시키는 것이 명확하였다. D25와 시나지스를 비교하는 경우, D25 처리된 동물은 폐와 기관지 주변으로 세포 침투가 덜 되는 것으로 여겨진다.
코튼 래트에서 D25를 테스트하기 위해, 실험을 설정하여 시나지스와 D25로 선처리된 동물과 비교한 후, NVI (Bilthoven, 네덜란드)에서 RSV-X 바이러스로 감염시켰다.
실시예
4
B63-D10-D25 이외에, 동일한 공여자(B63)로부터의 새로운 3개의 강력한 RSV 중화 항체(AM14, AM16 및 AM23)를 단리시켰다. 원래 RSV 중화에 선별되고 액체 질소로 동결시켜 저장되었던 100 세포/웰 벌크 B 세포 배양물을 해동시키고 RSV 감염된 HEp2 세포에 결합하는 것에 대하여 배양 상청액을 테스트하였다. 본 발명자들은, 이것이 천연의 소중합체 RSV 막 단백질, 예컨대 F 및 G 단백질의 항체 인식에 대한 마커이고 중화에 대한 탁월한 예측자로 제공할 수 있기 때문에 감염된 Hep2 세포에 결합하는 것에 대하여 테스트하였다. 결합을 검출하는 경우, 세포는 결합을 위해 배양되고 선별되어 클론을 얻게 되는 단일 세포였다. 3개의 모든 항체는 원래 D25를 위해 구성된 GENEART 벡터로 클로닝되었다. 또한, D25와 같이, 모두 RSV-F 단백질을 인식하였다(미제시). 293T 세포에서 클로닝과 발현 후, 재조합 단백질을 정제하였다(뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 도 14A, B 및 C에 도시되었다). 항체는 Vero 및 HEp2 세포 상에 여러개의 초기 RSV 단리물에 대한 중화를 테스트하였다(도 15). 3개의 모든 항체는 IgG1 이소타입의 것이다. AM14는 카파 경쇄를 가진 반면, AM16 및 AM23은 람다 경쇄를 가졌다. D25와 같은 3개의 모든 항체는 이의 항체 가변 도메인 내 체세포 초돌연변이를 포함하고, 이는 이들이 배아 중심 반응, 독특한 항체 서열을 생성하는 과정 동안 친화력 성숙이 진행되는 것을 시사하고 있다.
도 15-I 및 15-II에 결과가 도시되었다: D25 유래된 정제 B 세포주 상청액(sD25), 재조합 정제된 D25(rD25), 재조합 GENEART 코돈 최적화된 D25(rD25 GA), AM14, AM16, AM23(모든 정제된 재조합 단백질) 및 시나지스를 이용한 RS 바이러스 중화 분석법. 상이한 항체를 갖는 2개의 상이한 세포주인 (도 15-I) Vero 및 (도 15-II) Hep2 세포 상에서 바이러스 항체 중화를 테스트하였다:A2 (A), X (B) 및 2006/1 (C)는 RSV 서브타입 A인 반면 바이러스 Z (D) 및 2007-2 (E)는 서브타입 B이다. 각 바이러스의 100TCID50을 DMEM/1%FCS 중 일련의 항체 희석물에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 항온처리한 후 Vero 또는 HEp2 세포(1x1O6/㎖) 100 ㎕를 첨가하였다. 바이러스 항체 혼합물을 세척하지 않았다. 3일 후, 상청액을 제거하고 세포를 RT에서 10' 동안 80% 아세톤으로 고정하였다. 아세톤의 제거 후, 고정된 세포 층을 건조시키고 4℃에서 유지하거나 -20℃에서 동결시켰다. RSV 감염된 HEp2 세포를 염색하기 위해, 플레이트를 PBS 0.1% Tween 20 중 5% 분유로 우선 블로킹한 후, 플레이트를 3회 세척한 후 다클론 염소 항-RSV-HRP(1:500, Biodesign, Saco(미국 메인주 소재))와 37℃에서 3∼5시간 동안 항온처리하고 폭넓게 세척하였다. 이후, 모든 웰을 RT에서 30' 동안 AEC 기질과 항온처리하였다. 감염된 포커스를 적색으로 염색하고 광 현미경을 사용하여 육안으로 관찰할 수 있고 계수할 수 있다.
결과/결론
모든 항체는 RSV A 및 B 균주를 중화시켰다(표 5). 일반적으로, 소수의 상호 실험 변수가 나타날 수 있지만, 상이한 D25 항체는 RSV 바이러스를 효율적으로 중화시켰다. AM14는 단지 D25 정도 유효하였고 AM16은 단지 시나지스 정도 유효하였다. 하지만, AM23은 RSV A 균주를 매우 효율적으로 중화시킨 반면, 시나지스와 비교하였을 때 여전히 RSV B 균주를 중화시키는 것에는 덜 유효하였다.
[표 5]
실시예
5
항-RSV 항체의 상승적 효과 및 차단 효과.
D25, 시나지스 또는 신규한 AM 항체가 RSV F 단백질의 인식에 대해 서로 간섭하도록 설정되었는지 여부를 분석하기 위해, 최대 결합의 평탄역에 도달할 때까지 증가하는 농도의 비표지된 항체와 RSV 감염된 HEp2 세포를 미리항온처리하였다. 각 항체에 대하여, Ig의 양이 증가하였을 때 결합에 증가율이 측정되지 않는 평탄역 상을 측정하였다(미제시). 세척 후, PE 표지된 D25 또는 APC 표지된 시나지스의 표준 용량(3 pmol)과 샘플을 항온처리하였다. 상기 용량은 또한 최대 결합을 제공하였다.
결과
도 16에 도시된 바와 같이, 상기 세포들을 미표지된 시나지스 또는 D25와 미리 항온처리하는 경우 표지된 시나지스 및 D25는 RSV 감염된 HEp2 세포에 대하여 감소된 결합을 보여주었다. 시나지스는 또한 AM16에 의해 유도된 결합에 대해 약간 의 감소를 보여주었다. D25 결합은 AM23에 의해 강하게 차단되었지만 반대로 AM14와 미리 항온처리된 후 D25의 결합은 강하게 향상되었다. 이것은 D25에 의해 인식되는 에피토프가 정상적으로는 완전하게 노출되지 않지만 AM14의 천연의 에피토프로의 결합 후에는 노출이 향상되는 것을 의미한다. 이는 이러한 2개의 항체가 함께 작용하고 중화를 향상시킬 수 있다는 것을 입증하고 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> AIMM Therapeutics B.V.
Spits, Hergen
Beaumont, Tim
<120> RSV specific binding molecules and means for producing them
<130> P81193PC00
<140> PCT/NL2008/050333
<141> 2008-05-30
<150> EP07109472.6
<151> 2007-06-01
<160> 160
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Asn Tyr Ile Ile Asn
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
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1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
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1 5 10 15
Asn
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<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
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1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Val Ala Ser Asn Leu Glu Thr
1 5
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro
1 5
<210> 7
<211> 126
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
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20 25 30
Ile Ile Asn Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Val Leu Gly Thr Val His Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Ile His Leu Ile Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Glu Thr Ala Leu Val Val Ser Thr Thr Tyr Leu Pro His Tyr
100 105 110
Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 8
<211> 110
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ala Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Val Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Val Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
100 105 110
<210> 9
<211> 379
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 9
caggtgcagc tggtacagtc tggggctgaa gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgatggtc 60
tcctgccagg cctctggagg ccccctcaga aactatatta tcaactggct acgacaggcc 120
cctggacaag gccctgagtg gatgggaggg atcattcctg tcttgggtac agtacactac 180
gcaccgaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacaga cacagcctac 240
atccatctga tcagcctgag atctgaggac acggccatgt attactgtgc gacggaaaca 300
gctctggttg tatctactac ctacctacca cactactttg acaactgggg ccagggaacc 360
ctggtcaccg tctcctcag 379
<210> 10
<211> 324
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 10
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcag ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc aggcgagtca ggacattgtc aactatttaa attggtatca acagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctacgtt gcatccaatt tggagacagg ggtcccatca 180
aggttcagtg gaagtggatc tgggacagat tttagtctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagatgttg caacatatta ttgtcaacaa tatgataatc tcccactcac attcggcgga 300
gggaccaagg ttgagatcaa aaga 324
<210> 11
<211> 32
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Primer VH1
<400> 11
aaatcgatac caccatggac tggacctgga gg 32
<210> 12
<211> 32
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Primer VH1B
<400> 12
aaatcgatac caccatggac tggacctgga gm 32
<210> 13
<211> 34
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Primer VH2A
<400> 13
aaatcgatac caccatggac acactttgct mcac 34
<210> 14
<211> 35
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Primer VH2B
<400> 14
aaatcgatac caccatggac atactttgtt ccaac 35
<210> 15
<211> 32
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Primer VH3
<400> 15
aaatcgatac caccatggag tttgggctga gc 32
<210> 16
<211> 32
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Primer VH3B
<400> 16
aaatcgatac caccatggar ytkkgrctbh gc 32
<210> 17
<211> 34
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Primer VH4
<400> 17
aaatcgatac caccatgaaa cacctgtggt tctt 34
<210> 18
<211> 32
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Primer VH5
<400> 18
aaatcgatac caccatgggg tcaaccgcca tc 32
<210> 19
<211> 32
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Primer VH6
<400> 19
aaatcgatac caccatgtct gtctccttcc tc 32
<210> 20
<211> 32
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Primer Cgamma-Rev
<400> 20
gggtctagac aggcagccca gggccgctgt gc 32
<210> 21
<211> 32
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Primer Vk1
<400> 21
aaatcgatac caccatggac atgagggtcc cy 32
<210> 22
<211> 32
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Primer Vk1B
<400> 22
aaatcgatac caccatggac atgagrgtcc yy 32
<210> 23
<211> 32
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Primer Vk2
<400> 23
aaatcgatac caccatgagg ctccctgctc ag 32
<210> 24
<211> 31
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Primer Vk3
<400> 24
aaatcgatac caccatggaa rccccagcgc a 31
<210> 25
<211> 32
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Primer Vk4
<400> 25
aaatcgatac caccatggtg ttgcagaccc ag 32
<210> 26
<211> 42
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Primer Ck-Rev
<400> 26
gatcgcggcc gcttatcaac actctcccct gttgaagctc tt 42
<210> 27
<211> 36
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Primer V11aecb
<400> 27
aaatcgatac caccatggcc tggtcccctc tcctcc 36
<210> 28
<211> 36
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Primer V11g
<400> 28
aaatcgatac caccatggcc ggcttccctc tcctcc 36
<210> 29
<211> 36
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Primer V12/10
<400> 29
aaatcgatac caccatggcc tgggctctgc tcctcc 36
<210> 30
<211> 36
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Primer V13jpah
<400> 30
aaatcgatac caccatggcc tggaccgctc tcctgc 36
<210> 31
<211> 36
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Primer V15/7
<400> 31
aaatcgatac caccatggcc tggactcctc tccttc 36
<210> 32
<211> 36
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Primer V16/9
<400> 32
aaatcgatac caccatggcc tgggctcctc tccttc 36
<210> 33
<211> 36
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Primer V13rm
<400> 33
aaatcgatac caccatggcc tggatccctc tcctcc 36
<210> 34
<211> 36
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Primer V131
<400> 34
aaatcgatac caccatggcc tggacccctc tctggc 36
<210> 35
<211> 36
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Primer V13e
<400> 35
aaatcgatac caccatggcc tgggccacac tcctgc 36
<210> 36
<211> 36
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Primer V14c
<400> 36
aaatcgatac caccatggcc tgggtctcct tctacc 36
<210> 37
<211> 36
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Primer V18a
<400> 37
aaatcgatac caccatggcc tggatgatgc ttctcc 36
<210> 38
<211> 41
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Primer C12/7
<400> 38
gatcgcggcc gcttatcawg arcattctgy aggggccact g 41
<210> 39
<211> 31
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Primer VH1-L-NheI
<400> 39
gcggctagcc accatggact ggacctggag g 31
<210> 40
<211> 29
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Primer JH4/5-XhoI
<400> 40
gcgctcgaga cggtgaccag ggttccctg 29
<210> 41
<211> 35
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Primer CHfw-XhoI
<400> 41
cgcgctcgag tgcctccacc aagggcccat cggtc 35
<210> 42
<211> 41
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Primer CHrev-NotI
<400> 42
gatcgcggcc gcttatcatt tacccggrga cagggagagg c 41
<210> 43
<211> 31
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Primer VK1-L-NheI
<400> 43
gcggctagcc accatggaca tgagggtccc y 31
<210> 44
<211> 42
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Primer CK-NotI
<400> 44
gatcgcggcc gcttatcaac actctcccct gttgaagctc tt 42
<210> 45
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Primer HPRT1 forward
<400> 45
tatggacagg actgaacgtc ttgc 24
<210> 46
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Primer HPRT1 reverse
<400> 46
gacacaaaca tgattcaaat ccctga 26
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Primer LMP-1 forward
<400> 47
gcgactctgc tggaaatgat 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Primer LMP-1 reverse
<400> 48
gacatggtaa tgcctagaag 20
<210> 49
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Primer EBNA1/2 forward
<400> 49
agcaagaaga ggaggtggta ag 22
<210> 50
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Primer EBNA1/2 reverse
<400> 50
ggctcaaagt ggtctctaat gc 22
<210> 51
<211> 379
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Anti-RSV clone B63D10-D25
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(378)
<400> 51
cag gtg cag ctg gta cag tct ggg gct gaa gtg aag aag cct ggg tcc 48
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
tcg gtg atg gtc tcc tgc cag gcc tct gga ggc ccc ctc aga aac tat 96
Ser Val Met Val Ser Cys Gln Ala Ser Gly Gly Pro Leu Arg Asn Tyr
20 25 30
att atc aac tgg cta cga cag gcc cct gga caa ggc cct gag tgg atg 144
Ile Ile Asn Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Met
35 40 45
gga ggg atc att cct gtc ttg ggt aca gta cac tac gca ccg aag ttc 192
Gly Gly Ile Ile Pro Val Leu Gly Thr Val His Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
cag ggc aga gtc acg att acc gcg gac gaa tcc aca gac aca gcc tac 240
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
atc cat ctg atc agc ctg aga tct gag gac acg gcc atg tat tac tgt 288
Ile His Leu Ile Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcg acg gaa aca gct ctg gtt gta tct act acc tac cta cca cac tac 336
Ala Thr Glu Thr Ala Leu Val Val Ser Thr Thr Tyr Leu Pro His Tyr
100 105 110
ttt gac aac tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca g 379
Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 52
<211> 126
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 52
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Met Val Ser Cys Gln Ala Ser Gly Gly Pro Leu Arg Asn Tyr
20 25 30
Ile Ile Asn Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Val Leu Gly Thr Val His Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Ile His Leu Ile Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Glu Thr Ala Leu Val Val Ser Thr Thr Tyr Leu Pro His Tyr
100 105 110
Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 53
<211> 324
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> VL region
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(324)
<400> 53
gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca gct gta gga 48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
gac aga gtc acc atc act tgc cag gcg agt cag gac att gtc aac tat 96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Val Asn Tyr
20 25 30
tta aat tgg tat caa cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc ctg atc 144
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
tac gtt gca tcc aat ttg gag aca ggg gtc cca tca agg ttc agt gga 192
Tyr Val Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
agt gga tct ggg aca gat ttt agt ctc acc atc agc agc ctg cag cct 240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
gaa gat gtt gca aca tat tat tgt caa caa tat gat aat ctc cca ctc 288
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Leu
85 90 95
aca ttc ggc gga ggg acc aag gtt gag atc aaa aga 324
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 54
<211> 108
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 54
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Val Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Val Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 55
<211> 98
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> VH1-69 germl
<400> 55
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 56
<211> 126
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> B63D10-D25
<400> 56
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Met Val Ser Cys Gln Ala Ser Gly Gly Pro Leu Arg Asn Tyr
20 25 30
Ile Ile Asn Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Val Leu Gly Thr Val His Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Ile His Leu Ile Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Glu Thr Ala Leu Val Val Ser Thr Thr Tyr Leu Pro His Tyr
100 105 110
Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 57
<211> 95
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> VkI O8/O18
<400> 57
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro
85 90 95
<210> 58
<211> 110
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> B63D10-D25
<400> 58
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Val Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Val Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
100 105 110
<210> 59
<211> 91
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> FR1 VHeavy region D25
<400> 59
caggtgcagc tggtacagtc tggggctgaa gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgatggtc 60
tcctgccagg cctctggagg ccccctcaga a 91
<210> 60
<211> 14
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> CDR1 VHeavy region D25
<400> 60
actatattat caac 14
<210> 61
<211> 42
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> FR2 VHeavy region D25
<400> 61
tggctacgac aggcccctgg acaaggccct gagtggatgg ga 42
<210> 62
<211> 51
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> CDR2 VHeavy region D25
<400> 62
gggatcattc ctgtcttggg tacagtacac tacgcaccga agttccaggg c 51
<210> 63
<211> 96
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> FR3 VHeavy region D25
<400> 63
agagtcacga ttaccgcgga cgaatccaca gacacagcct acatccatct gatcagcctg 60
agatctgagg acacggccat gtattactgt gcgacg 96
<210> 64
<211> 51
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> CDR3 VHeavy region D25
<400> 64
gaaacagctc tggttgtatc tactacctac ctaccacact actttgacaa c 51
<210> 65
<211> 34
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> FR4 VHeavy region D25
<400> 65
tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc tcag 34
<210> 66
<211> 69
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> FR1 VLight region D25
<400> 66
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcag ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgc 69
<210> 67
<211> 33
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> CDR1 VLight region D25
<400> 67
caggcgagtc aggacattgt caactattta aat 33
<210> 68
<211> 45
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> FR2 VLight region D25
<400> 68
tggtatcaac agaaaccagg gaaagcccct aagctcctga tctac 45
<210> 69
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> CRD2 VLight region D25
<400> 69
gttgcatcca atttggagac a 21
<210> 70
<211> 96
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> FR3 VLight region D25
<400> 70
ggggtcccat caaggttcag tggaagtgga tctgggacag attttagtct caccatcagc 60
agcctgcagc ctgaagatgt tgcaacatat tattgt 96
<210> 71
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> CDR3 VLight region D25
<400> 71
caacaatatg ataatctccc a 21
<210> 72
<211> 39
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> FR4 VLight region D25
<400> 72
ctcacattcg gcggagggac caaggttgag atcaaaaga 39
<210> 73
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 73
Gly Phe Ser Phe Ser His Tyr Ala
1 5
<210> 74
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 74
Ile Ser Tyr Asp Gly Glu Asn Thr
1 5
<210> 75
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 75
Ala Arg Asp Arg Ile Val Asp Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 76
<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 76
Gln Asp Ile Lys Lys Tyr
1 5
<210> 77
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 77
Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Pro Leu Thr
1 5 10
<210> 78
<211> 123
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 78
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser His Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Glu Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Ile Val Asp Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Ala Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 79
<211> 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 79
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Lys Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Glu Leu Leu Met
35 40 45
His Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
100 105 110
<210> 80
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 80
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Asn
1 5
<210> 81
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 81
Ile Ser Ala Gly Ser Ser Tyr Ile
1 5
<210> 82
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 82
Ala Arg Glu Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Tyr Ser Pro Asn Trp Phe
1 5 10 15
Asp Pro
<210> 83
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 83
Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp
1 5
<210> 84
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 84
His Ser Tyr Asp Arg Ser Leu Ser Gly
1 5
<210> 85
<211> 125
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 85
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Ala Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser His Ile Ser Ala Gly Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Val Arg Asn Ser Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Tyr Ser Pro Asn Trp Phe
100 105 110
Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 86
<211> 110
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 86
Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys His Ser Tyr Asp Arg Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val
100 105 110
<210> 87
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 87
Gly Phe Asn Phe His Asn Tyr Gly
1 5
<210> 88
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 88
Val Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Lys
1 5
<210> 89
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 89
Val Arg Asp Lys Val Gly Pro Thr Pro Tyr Phe Asp Ser
1 5 10
<210> 90
<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 90
Asn Ile Gly Ser Glu Thr
1 5
<210> 91
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 91
Gln Val Trp Asp Arg Ser Asn Tyr His Gln Val
1 5 10
<210> 92
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 92
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asn Val Val Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Thr Gly Phe Asn Phe His Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Val Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Asp Lys Val Gly Pro Thr Pro Tyr Phe Asp Ser Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 93
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 93
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Leu Ala Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Ala Ala Ile Thr Cys Gly Arg Asn Asn Ile Gly Ser Glu Thr Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr
35 40 45
Asp Asp Asp Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Arg Ser Asn Tyr His
85 90 95
Gln Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val
100 105
<210> 94
<211> 75
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 94
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcgg cctct 75
<210> 95
<211> 24
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 95
ggattcagct tcagtcacta tgcc 24
<210> 96
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 96
atgcactggg tccgccaggc tccaggcaag ggactggagt gggtggcagt t 51
<210> 97
<211> 24
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 97
atatcttatg atggagaaaa taca 24
<210> 98
<211> 114
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 98
tattacgcag actccgtgaa gggccgattc tccatctcca gagacaattc caagaacaca 60
gtgtctctgc aaatgaacag cctgagacct gaggacacgg ctctatatta ctgt 114
<210> 99
<211> 48
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 99
gcgagagacc gcatagtgga cgactactac tactacggta tggacgtc 48
<210> 100
<211> 34
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 100
tggggccaag gggccacggt caccgtctcc tcag 34
<210> 101
<211> 369
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 101
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcgg cctctggatt cagcttcagt cactatgcca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg gactggagtg ggtggcagtt atatcttatg atggagaaaa tacatattac 180
gcagactccg tgaagggccg attctccatc tccagagaca attccaagaa cacagtgtct 240
ctgcaaatga acagcctgag acctgaggac acggctctat attactgtgc gagagaccgc 300
atagtggacg actactacta ctacggtatg gacgtctggg gccaaggggc cacggtcacc 360
gtctcctca 369
<210> 102
<211> 78
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 102
gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc aggcgagt 78
<210> 103
<211> 18
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 103
caggacatta agaagtat 18
<210> 104
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 104
ttaaattggt atcatcagaa accagggaaa gtccctgagc tcctgatgca c 51
<210> 105
<211> 108
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 105
aatttggaaa caggggtccc atcaaggttc agtggcaggg gatctgggac agattttact 60
ctcaccatta gcagcctgca gcctgaagat attggaacat attactgt 108
<210> 106
<211> 30
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 106
caacagtatg ataatctgcc tccgctcact 30
<210> 107
<211> 31
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 107
ttcggcggag ggaccaaggt ggagatcaaa c 31
<210> 108
<211> 333
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 108
gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc aggcgagtca ggacattaag aagtatttaa attggtatca tcagaaacca 120
gggaaagtcc ctgagctcct gatgcacgat gcatccaatt tggaaacagg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcaggggatc tgggacagat tttactctca ccattagcag cctgcagcct 240
gaagatattg gaacatatta ctgtcaacag tatgataatc tgcctccgct cactttcggc 300
ggagggacca aggtggagat caaacgaact gtg 333
<210> 109
<211> 75
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 109
gaggtgcagc tggtggagac cgggggaggc ctggcccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctct 75
<210> 110
<211> 24
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 110
ggattcacat tcagtagtta taac 24
<210> 111
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 111
atgaactggg tccgccaggc tccagggaag gggctggagt gggtctcaca c 51
<210> 112
<211> 24
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 112
attagtgcgg gtagtagtta cata 24
<210> 113
<211> 114
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 113
tactactcag actcagtgaa gggccgattc accgtctcca gagacaacgt caggaactca 60
gtatatctgc aaatgaacag cctgagagcc gctgacacgg ctgtgtatta ctgt 114
<210> 114
<211> 54
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 114
gcgagagagg attatggtcc gggaaattat tatagtccta actggttcga cccc 54
<210> 115
<211> 34
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 115
tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc tcag 34
<210> 116
<211> 375
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 116
gaggtgcagc tggtggagac cgggggaggc ctggcccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacattcagt agttataaca tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcacac attagtgcgg gtagtagtta catatactac 180
tcagactcag tgaagggccg attcaccgtc tccagagaca acgtcaggaa ctcagtatat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgctgac acggctgtgt attactgtgc gagagaggat 300
tatggtccgg gaaattatta tagtcctaac tggttcgacc cctggggcca gggaaccctg 360
gtcaccgtct cctca 375
<210> 117
<211> 75
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 117
cagtctgtcg tgacgcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag agtcaccatc 60
tcctgcactg ggagc 75
<210> 118
<211> 27
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 118
agctccaaca tcggggcagg ttatgat 27
<210> 119
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 119
gtacactggt accagcagct tccaggaaca gcccccaaac tcctcatcta t 51
<210> 120
<211> 108
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 120
aatcggccct caggggtctc cgaccgattc tctggctcca agtctggcac ctcagcctcc 60
ctggccatca ctggactcca ggctgaggat gaggctgatt attactgc 108
<210> 121
<211> 27
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 121
cactcctatg acagaagcct gagtggt 27
<210> 122
<211> 37
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 122
tcagtattcg gcggagggac caagctgacc gtcctag 37
<210> 123
<211> 330
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 123
cagtctgtcg tgacgcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag agtcaccatc 60
tcctgcactg ggagcagctc caacatcggg gcaggttatg atgtacactg gtaccagcag 120
cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatggcaaca ctaatcggcc ctcaggggtc 180
tccgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactggactc 240
caggctgagg atgaggctga ttattactgc cactcctatg acagaagcct gagtggttca 300
gtattcggcg gagggaccaa gctgaccgtc 330
<210> 124
<211> 75
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 124
caggtgcaac tggtggagtc tgggggaaat gtggtcaagc ctgggacgtc cctgagactg 60
tcctgtgcag cgact 75
<210> 125
<211> 24
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 125
ggattcaact tccataacta cggc 24
<210> 126
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 126
atgaactggg tccgccaggc tccaggcaag gggctggagt gggtggcggt t 51
<210> 127
<211> 24
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 127
gtttggtatg atggaagtaa gaaa 24
<210> 128
<211> 114
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 128
tactatgcag actccgtgac gggccgattc gccatctcca gagacaattc caagaacact 60
ctgtatctgc aaatgaacag cctgagagtc gaggacacgg ctgtttatta ttgt 114
<210> 129
<211> 39
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 129
gtgagagata aagtgggacc gactccctac tttgactcc 39
<210> 130
<211> 34
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 130
tggggccagg gaaccctggt caccgtatcc tcag 34
<210> 131
<211> 360
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 131
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaaat gtggtcaagc ctgggacgtc cctgagactg 60
tcctgtgcag cgactggatt caacttccat aactacggca tgaactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcggtt gtttggtatg atggaagtaa gaaatactat 180
gcagactccg tgacgggccg attcgccatc tccagagaca attccaagaa cactctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agtcgaggac acggctgttt attattgtgt gagagataaa 300
gtgggaccga ctccctactt tgactcctgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcgagt 360
<210> 132
<211> 75
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 132
tcctatgtgc tgactcagcc accctcggtg tcactggccc caggagggac ggccgcgatc 60
acctgtggaa gaaac 75
<210> 133
<211> 18
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 133
aacattggaa gtgaaact 18
<210> 134
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 134
gtgcactggt accagcagaa gccaggccag gcccctgtgc tggtcgtcta t 51
<210> 135
<211> 108
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 135
gaccggccct cagggatccc tgagcgattc tctggctcca actctgggaa cacggccacc 60
ctgaccatca gcagggtcga ggccggggat gaggccgact attactgt 108
<210> 136
<211> 33
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 136
caggtgtggg ataggagtaa ttatcatcag gta 33
<210> 137
<211> 31
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 137
ttcggcggag ggaccaagtt gaccgtccta g 31
<210> 138
<211> 321
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 138
tcctatgtgc tgactcagcc cccctcggtg tcactggccc caggagggac ggccgcgatc 60
acctgtggaa gaaacaacat tggaagtgaa actgtgcact ggtaccagca gaagccaggc 120
caggcccctg tgctggtcgt ctatgatgat gacgaccggc cctcagggat ccctgagcga 180
ttctctggct ccaactctgg gaacacggcc accctgacca tcagcagggt cgaggccggg 240
gatgaggccg actattactg tcaggtgtgg gataggagta attatcatca ggtattcggc 300
ggagggacca agctgaccgt c 321
<210> 139
<211> 378
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 139
caggtgcagc tggtacagtc tggggctgaa gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgatggtc 60
tcctgccagg cctctggagg ccccctcaga aactatatta tcaactggct acgacaggcc 120
cctggacaag gccctgagtg gatgggaggg atcattcctg tcttgggtac agtacactac 180
gcaccgaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgga cacagcctac 240
atccatctga tcagcctgag atctgaggac acggccatgt attactgtgc gacggaaaca 300
gctctggttg tatctactac ctacctacca cactactttg acaactgggg ccagggaacc 360
ctggtcaccg tctcctca 378
<210> 140
<211> 378
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> RSV#D25 VH codon optimized
<400> 140
caggtgcagc tggtgcagag cggagccgag gtgaagaaac ccggcagcag cgtgatggtg 60
tcctgccagg ccagcggcgg acccctgcgg aactacatca tcaactggct gcggcaggcc 120
ccaggccagg gccctgagtg gatgggcggc atcatccccg tgctgggcac cgtgcactac 180
gcccccaagt tccagggccg ggtgaccatc accgccgacg agagcaccga caccgcctac 240
atccacctga tcagcctgcg gagcgaggac accgccatgt actactgcgc caccgagacc 300
gccctggtgg tgtccaccac ctacctgccc cactacttcg acaactgggg ccagggcacc 360
ctggtgacag tctcgagt 378
<210> 141
<211> 326
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 141
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcag ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc aggcgagtca ggacattgtc aactatttaa attggtatca acagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctacgtt gcatccaatt tggagacagg ggtcccatca 180
aggttcagtg gaagtggatc tgggacagat tttagtctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagatgttg caacatatta ttgtcaacaa tatgataatc tcccactcac attcggcgga 300
gggaccaagg ttgagatcaa aagaac 326
<210> 142
<211> 326
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> RSV#D25 VL codon optimized
<400> 142
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgtctgccg ccgtgggcga ccgggtgacc 60
atcacctgcc aggccagcca ggacatcgtg aactacctga actggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctacgtg gccagcaacc tggaaaccgg cgtgcccagc 180
cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcagcctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacgtgg ccacctacta ctgccagcag tacgacaacc tgcccctgac ctttggcggc 300
ggaacaaagg tggagatcaa gcggac 326
<210> 143
<211> 369
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(369)
<400> 143
gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc gtg gtc cag cct ggg agg 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
tcc ctg aga ctc tcc tgt gcg gcc tct gga ttc agc ttc agt cac tat 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser His Tyr
20 25 30
gcc atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag gga ctg gag tgg gtg 144
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
gca gtt ata tct tat gat gga gaa aat aca tat tac gca gac tcc gtg 192
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Glu Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
aag ggc cga ttc tcc atc tcc aga gac aat tcc aag aac aca gtg tct 240
Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Ser
65 70 75 80
ctg caa atg aac agc ctg aga cct gag gac acg gct cta tat tac tgt 288
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcg aga gac cgc ata gtg gac gac tac tac tac tac ggt atg gac gtc 336
Ala Arg Asp Arg Ile Val Asp Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
100 105 110
tgg ggc caa ggg gcc acg gtc acc gtc tcc tca 369
Trp Gly Gln Gly Ala Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 144
<211> 123
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 144
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser His Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Glu Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Ile Val Asp Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Ala Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 145
<211> 333
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(333)
<400> 145
gac atc cag atg acc cag tct cca tct tcc ctg tct gca tct gta gga 48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
gac aga gtc acc atc act tgc cag gcg agt cag gac att aag aag tat 96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Lys Lys Tyr
20 25 30
tta aat tgg tat cat cag aaa cca ggg aaa gtc cct gag ctc ctg atg 144
Leu Asn Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Glu Leu Leu Met
35 40 45
cac gat gca tcc aat ttg gaa aca ggg gtc cca tca agg ttc agt ggc 192
His Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
agg gga tct ggg aca gat ttt act ctc acc att agc agc ctg cag cct 240
Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
gaa gat att gga aca tat tac tgt caa cag tat gat aat ctg cct ccg 288
Glu Asp Ile Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Pro
85 90 95
ctc act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc aaa cga act gtg 333
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
100 105 110
<210> 146
<211> 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 146
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Lys Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Glu Leu Leu Met
35 40 45
His Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
100 105 110
<210> 147
<211> 98
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> IGHV#-30 germl.
<400> 147
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 148
<211> 98
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> IGKV1-33 germl.
<400> 148
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Pro
85 90 95
Leu Thr
<210> 149
<211> 375
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(375)
<400> 149
gag gtg cag ctg gtg gag acc ggg gga ggc ctg gcc cag cct ggg ggg 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Ala Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc aca ttc agt agt tat 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
aac atg aac tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gag tgg gtc 144
Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
tca cac att agt gcg ggt agt agt tac ata tac tac tca gac tca gtg 192
Ser His Ile Ser Ala Gly Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
aag ggc cga ttc acc gtc tcc aga gac aac gtc agg aac tca gta tat 240
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Val Arg Asn Ser Val Tyr
65 70 75 80
ctg caa atg aac agc ctg aga gcc gct gac acg gct gtg tat tac tgt 288
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcg aga gag gat tat ggt ccg gga aat tat tat agt cct aac tgg ttc 336
Ala Arg Glu Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Tyr Ser Pro Asn Trp Phe
100 105 110
gac ccc tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca 375
Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 150
<211> 125
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 150
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Ala Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser His Ile Ser Ala Gly Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Val Arg Asn Ser Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Tyr Ser Pro Asn Trp Phe
100 105 110
Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 151
<211> 330
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(330)
<400> 151
cag tct gtc gtg acg cag ccg ccc tca gtg tct ggg gcc cca ggg cag 48
Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
aga gtc acc atc tcc tgc act ggg agc agc tcc aac atc ggg gca ggt 96
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
tat gat gta cac tgg tac cag cag ctt cca gga aca gcc ccc aaa ctc 144
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
ctc atc tat ggc aac act aat cgg ccc tca ggg gtc tcc gac cga ttc 192
Leu Ile Tyr Gly Asn Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe
50 55 60
tct ggc tcc aag tct ggc acc tca gcc tcc ctg gcc atc act gga ctc 240
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
cag gct gag gat gag gct gat tat tac tgc cac tcc tat gac aga agc 288
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys His Ser Tyr Asp Arg Ser
85 90 95
ctg agt ggt tca gta ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc 330
Leu Ser Gly Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val
100 105 110
<210> 152
<211> 110
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 152
Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys His Ser Tyr Asp Arg Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val
100 105 110
<210> 153
<211> 73
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> IGHV3-21 germl.
<400> 153
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro
1 5 10 15
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr
20 25 30
Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
35 40 45
Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
50 55 60
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
65 70
<210> 154
<211> 99
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> IGLV1-40 germl.
<400> 154
Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Gly
<210> 155
<211> 360
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(360)
<400> 155
gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga aat gtg gtc aag cct ggg acg 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asn Val Val Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
tcc ctg aga ctg tcc tgt gca gcg act gga ttc aac ttc cat aac tac 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Thr Gly Phe Asn Phe His Asn Tyr
20 25 30
ggc atg aac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ctg gag tgg gtg 144
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
gcg gtt gtt tgg tat gat gga agt aag aaa tac tat gca gac tcc gtg 192
Ala Val Val Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
acg ggc cga ttc gcc atc tcc aga gac aat tcc aag aac act ctg tat 240
Thr Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
ctg caa atg aac agc ctg aga gtc gag gac acg gct gtt tat tat tgt 288
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
gtg aga gat aaa gtg gga ccg act ccc tac ttt gac tcc tgg ggc cag 336
Val Arg Asp Lys Val Gly Pro Thr Pro Tyr Phe Asp Ser Trp Gly Gln
100 105 110
gga acc ctg gtc acc gtc tcg agt 360
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 156
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 156
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asn Val Val Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Thr Gly Phe Asn Phe His Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Val Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Asp Lys Val Gly Pro Thr Pro Tyr Phe Asp Ser Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 157
<211> 321
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(321)
<400> 157
tcc tat gtg ctg act cag ccc ccc tcg gtg tca ctg gcc cca gga ggg 48
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Leu Ala Pro Gly Gly
1 5 10 15
acg gcc gcg atc acc tgt gga aga aac aac att gga agt gaa act gtg 96
Thr Ala Ala Ile Thr Cys Gly Arg Asn Asn Ile Gly Ser Glu Thr Val
20 25 30
cac tgg tac cag cag aag cca ggc cag gcc cct gtg ctg gtc gtc tat 144
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr
35 40 45
gat gat gac gac cgg ccc tca ggg atc cct gag cga ttc tct ggc tcc 192
Asp Asp Asp Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
aac tct ggg aac acg gcc acc ctg acc atc agc agg gtc gag gcc ggg 240
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
gat gag gcc gac tat tac tgt cag gtg tgg gat agg agt aat tat cat 288
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Arg Ser Asn Tyr His
85 90 95
cag gta ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc 321
Gln Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val
100 105
<210> 158
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 158
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Leu Ala Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Ala Ala Ile Thr Cys Gly Arg Asn Asn Ile Gly Ser Glu Thr Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr
35 40 45
Asp Asp Asp Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Arg Ser Asn Tyr His
85 90 95
Gln Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val
100 105
<210> 159
<211> 98
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> IGHV3-33 germl.
<400> 159
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 160
<211> 98
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> IGLV3-21 germl.
<400> 160
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr
35 40 45
Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His
85 90 95
Gln Val
Claims (35)
- - 서열 NYIIN과 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 CDR1 서열, 및/또는- 서열 GIIPVLGTVHYAPKFQG와 75% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 서열, 및/또는- 서열 ETALVVSTTYLPHYFDN과 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 서열, 및/또는- 서열 QASQDIVNYLN과 85% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 CDR1 서열, 및/또는- 서열 VASNLET와 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 서열을 포함하고, 호흡기 합포체 바이러스에 특이적으로 결합할 수 있는 단리된, 합성 또는 재조합 항체 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체.
- 제1항에 있어서,서열
와 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 서열 및/또는서열
와 70% 이상 동일한 경쇄 서열을 갖는 항체, 이의 기능적 부분, 유도체 또는 유사체. - HEp-2 세포를 RSV로 감염시킨 시험관내 중화 분석법에서 IC50 값이 10 ng/㎖ 미만, 바람직하게는 2 ng/㎖ 미만인 항체, 또는 상기 항체의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체.
- - 서열 GFSFSHYA와 80% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 CDR1 서열, 및/또는- 서열 ISYDGENT와 80% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 서열, 및/또는- 서열 ARDRIVDDYYYYGMDV와 80% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 서열, 및/또는- 서열 QDIKKY와 80% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 CDR1 서열, 및/또는- 서열 DAS와 80% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 서열, 및/또는- 서열 QQYDNLPPLT와 80% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 서열을 포함하고, 호흡기 합포체 바이러스에 특이적으로 결합할 수 있는 단리된, 합성 또는 재조합 항체 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체.
- 제4항에 있어서,서열
와 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 서열 및/또는서열
와 70% 이상 동일한 경쇄 서열을 갖는 항체, 이의 기능적 부분, 유도체 또는 유사체. - - 서열 GFTFSSYN과 80% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 CDR1 서열, 및/또는- 서열 ISAGSSYI와 80% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 서열, 및/또는- 서열 AREDYGPGNYYSPNWFDP와 80% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 서열, 및/또는- 서열 SSNIGAGYD와 80% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 CDR1 서열, 및/ 또는- 서열 GNT와 80% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 서열, 및/또는- 서열 HSYDRSLSG와 80% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 서열을 포함하고, 호흡기 합포체 바이러스에 특이적으로 결합할 수 있는 단리된, 합성 또는 재조합 항체 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체.
- 제6항에 있어서,서열
와 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 서열 및/또는서열
와 70% 이상 동일한 경쇄 서열을 갖는 항체, 이의 기능적 부분, 유도체 또는 유사체. - - 서열 GFNFHNYG와 80% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 CDR1 서열, 및/또는- 서열 VWYDGSKK와 80% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 서열, 및/또 는- 서열 VRDKVGPTPYFDS와 80% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 서열, 및/또는- 서열 NIGSET와 80% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 CDR1 서열, 및/또는- 서열 DDD와 80% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 서열, 및/또는- 서열 QVWDRSNYHQV와 80% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 서열을 포함하고, 호흡기 합포체 바이러스에 특이적으로 결합할 수 있는 단리된, 합성 또는 재조합 항체 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체.
- 제6항에 있어서,서열
와 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 서열 및/또는서열
와 70% 이상 동일한 경쇄 서열을 갖는 항체, 이의 기능적 부분, 유도체 또는 유사체. - 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 인간 항체 및/또는 키메라 항체인 항체, 이의 기능적 부분, 유도체 또는 유사체.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 따른 항체, 이의 기능적 부분, 유도체 또는 유사체를 코딩하는 단리된, 합성 또는 재조합 핵산 서열, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 또는 유사체.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 의약 및/또는 예방제로서 사용하기 위한 항체, 이의 기능적 부분, 유도체 또는 유사체.
- RSV-관련 질환을 적어도 부분적으로 치료 및/또는 예방하는 의약 및/또는 예방제를 제조하기 위한 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 따른 항체, 이의 기능적 부분, 유도체 또는 유사체의 용도.
- 제11항에 있어서, 의약 및/또는 예방제로서 사용하기 위한 핵산 서열, 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체.
- RSV-관련 질환을 적어도 부분적으로 치료 및/또는 예방하는 의약 및/또는 예방제를 제조하기 위한 제11항에 따른 핵산 서열, 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체의 용도.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 따른 항체, 이의 기능적 부분, 유도체 또는 유사체를 생성할 수 있는 단리된 항체 생성 세포.
- 제16항에 있어서, 9주 이상, 바람직하게는 3개월 이상, 더욱 바람직하게는 6개월 이상 동안 안정한 항체 생성 세포.
- 제16항 또는 제17항에 있어서, BCL6과 Blimp-1이 동시 발현되는 항체 생성 세포.
- 제16항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 있어서,- BCL6 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 코딩하는 외인성 핵산 서열, 및/또는- Bcl-xL 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 코딩하는 외인성 핵산 서열을 포함하는 항체 생성 세포.
- 제16항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 있어서, BCL6, Bcl-xL 또는 BCL6 또는 Bcl-xL의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 코딩하는 핵산 서열의 발현은 외인성 화합물에 의해 유도될 수 있는 활성인자 및/또는 억제인자에 의해 조절되는 것인 항체 생성 세포.
- - RSV-특이적 항체를 생성할 수 있는 B 세포에서 Blimp-1의 발현 농도를 증가시키는 것; 및- 상기 B 세포에서 BCL6 발현 농도를 증가 및/또는 유지시키는 것을 포함하는, 3개월 이상 동안 안정하고 RSV-특이적 항체를 생성할 수 있는 항체 생성 세포의 제조 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 B 세포 내 BCL6 발현 농도가 형질모구와 비교하였을 때 실질적으로 동일한 농도 또는 더 높은 농도가 되고/되거나 상기 농도에서 유지되는 제조 방법.
- 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 B 세포에 BCL6 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 코딩하는 핵산 서열을 제공하는 것을 포함하는 제조 방법.
- 제21항 내지 제23항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 세포에서 Bcl-xL의 발현 농도를 증가시키는 것을 추가로 포함하는 제조 방법.
- 제24항에 있어서, 상기 세포에 Bcl-xL 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 코딩하는 핵산을 제공하는 것을 포함하는 제조 방법.
- 제21항 내지 제25항 중 어느 하나의 항에 있어서,- RSV-특이적 항체를 생성할 수 있는 B 세포에 BCL6, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 제공하는 것;- 상기 B 세포에 Bcl-xL 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 제공하는 것; 및- 상기 B 세포를 배양하는 것을 포함하는 제조 방법.
- 제21항 내지 제26항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 B 세포는 IL-21의 존재 하에서 배양되는 것인 제조 방법.
- 제21항 내지 제27항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 B 세포는 이전에 호흡기 합포체 바이러스에 노출된 바 있는 개체로부터 얻은 것인 제조 방법.
- 제21항 내지 제28항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제2 세포에서 Ig 중쇄 및/또는 Ig 경쇄를 코딩하는 상기 B 세포의 유전자를 발현시키는 것을 추가로 포함하는 제조 방법.
- - 제21항 내지 제29항 중 어느 하나의 항에 따른 방법으로 RSV-특이적 항체 를 생성할 수 있는 항체 생성 세포를 제조하는 것; 및- 상기 항체 생성 세포에 의해 생성된 항체를 얻는 것을 포함하는, 호흡기 합포체 바이러스에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 제조 방법.
- 제30항에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는 단리된 항체, 또는 상기 항체의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체.
- 도 11, 도 12, 도 14A, 도 14B 또는 도 14C에 도시된 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부(이 부분은 15개 이상의 뉴클레오티드를 가짐)와 70% 이상 상동성이 있는 서열을 포함하는 단리된, 합성 또는 재조합 핵산 서열.
- 제32항에 있어서,서열
와 70% 이상 상동성이 있는 서열을 포함하는 핵산 서열. - 서열 NYIIN과 70% 이상 동일하고/하거나, 서열 GIIPVLGTVHYAPKFQG와 75% 이상 동일하고/하거나, 서열 ETALVVSTTYLPHYFDN과 70% 이상 동일하고/하거나, 서열 QASQDIVNYLN과 85% 이상 동일하고/하거나, 서열 VASNLET와 70% 이상 동일하고/하거나, 서열
와 70% 이상 동일하고/하거나,서열
와 70% 이상 동일하고/하거나,
로 이루어진 군에서 선택된 서열과 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 서열을 포함하는 단리된, 합성 또는 재조합 핵산 서열. - 제1항 내지 제10항 또는 제31항 중 어느 하나의 항에 따른 항체 또는 기능적 부분, 유도체 또는 유사체의 치료적 유효량을 RSV-관련 질환의 적어도 부분적 치료 또는 예방이 필요한 개체에게 투여하는 것을 포함하는, RSV-관련 질환을 적어도 부분적으로 치료 또는 예방하는 방법.
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