PT2170952E

PT2170952E - Moléculas de ligação específicas para rsv e meios para as produzir

Info

Publication number: PT2170952E
Application number: PT08766756T
Authority: PT
Inventors: Spits Hergen; Beaumont Tim; Yasuda Etsuko; Jeroen Kwakkenbos Mark
Original assignee: Medimmune Ltd
Priority date: 2007-06-01
Filing date: 2008-05-30
Publication date: 2016-06-16
Also published as: US9321831B2; US20160244509A1; IL202288A0; ZA200908320B; RU2014125126A; CN104961825A; HUE029225T2; CN101778866A; NZ581512A; RU2009148886A; HK1146073A1; HRP20160632T1; EP2170952B1; NZ621824A; AU2008257801B2; ES2575129T3; KR20150036796A; JP2017019836A; AU2008257801A1; EP2578600A2

Description

DESCRIÇÃO

"MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO ESPECÍFICAS PARA RSV E MEIOS PARA AS PRODUZIR" A invenção refere-se aos campos da biologia e medicina. 0 virus sincicial respiratório (RSV) é um vírus da constipação comum que pertence à família de paramixovírus. 0 RSV é virulento, facilmente transmissível e a causa mais comum de doença do aparelho respiratório inferior em crianças com menos de 2 anos de idade. Até 98% de crianças que frequentam creches serão infetadas numa única temporada de RSV. Entre 0,5% e 3,2% das crianças com infeção por RSV requerem hospitalização. Nos Estados Unidos foram reportadas aproximadamente 90 000 admissões hospitalares e 4 500 mortes por ano. Os fatores de risco principais para a hospitalização devido a RSV são parto prematuro, doença pulmonar crónica, doença cardíaca congénita, imunidade comprometida, e idade inferior a 6 semanas em crianças, de outra maneira, saudáveis. Não está disponível um tratamento eficaz para a bronquiolite positiva para RSV, além dos cuidados de apoio na forma de nutrição adequada e terapia de oxigénio. As terapias antivirais tais como a Ribavirina não mostraram ser eficazes na infeção por RSV. Um anticorpo monoclonal, Palivizumab (também chamado Synagis), está registado para a profilaxia contra a infeção por RSV. O Palivizumab é um anticorpo monoclonal geneticamente modificado (humanizado) contra a proteína de fusão do RSV. No entanto, o Palivizumab não é sempre eficaz. Por conseguinte, há uma necessidade na técnica para anticorpos e terapias alternativos contra o RSV. É um objetivo da presente invenção proporcionar meios e métodos para neutralizar e/ou prevenir um doença relacionada com o RSV. É um objetivo adicional da invenção proporcionar anticorpos alternativos e/ou melhorados contra RSV, e para proporcionar estável células capaz de produzir anticorpos contra o RSV.

Assim, a presente invenção proporciona os anticorpos isolados das reivindicações 1-3, as sequências de ácidos nucleicos isoladas das reivindicações 4-5, a célula da reivindicação 6, o método da reivindicação 7, a composição da reivindicação 8 e os anticorpos, ácidos nucleicos ou composições das reivindicações 9-11, para a utilização da reivindicação 9-11. A presente invenção proporciona anticorpos que são capazes de ligar especificamente o RSV. Tais anticorpos também aqui chamados "anticorpos anti-RSV" ou "anticorpos específicos contra o RSV", são capazes de ligar especificamente pelo menos um componente de RSV, tal como, por exemplo, um epítopo de uma proteína de RSV. A fixação não específica não está abrangida pelo termo "ligar especificamente". Os anticorpos anti-RSV de acordo com a presente invenção são particularmente adequados para neutralizar e/ou, pelo menos, prevenir em parte uma infeção por RSV e/ou efeitos adversos de uma infeção por RSV. Um anticorpo anti-RSV particularmente preferido de acordo com a presente invenção é o anticorpo designado "D25", o qual tem uma região de cadeia pesada e uma região de cadeia leve como representadas nas Figuras 11A-D. As sequências de CDR de D25, as quais contribuem em particular para as propriedades de ligação ao antigénio do D25, são representadas na Figura HD. 0 anticorpo D25 parece ter características superiores em comparação com o anticorpo anti-RSV registado, Palivizumab (Figura 8) . Por exemplo, o D25 tem um valor de IC50 de cerca de 0,4-1,5 ng/mL num ensaio de neutralização in vitro em que as células HEp-2 são infetadas com RSV, enquanto o Palivizumab tem um valor de IC50 de cerca de 453 ng/mL.

Um equivalente funcional de um anticorpo é aqui definido como uma parte funcional, derivada ou análoga de um anticorpo.

Uma parte funcional de um anticorpo é definida como uma parte que tem pelo menos uma mesma propriedade que o referido anticorpo em tipo, não necessariamente em quantidade. A referida parte funcional é capaz de ligar o mesmo antigénio que o referido anticorpo, se bem que não necessariamente no mesmo grau. Uma parte funcional de um anticorpo compreende preferencialmente um anticorpo de domínio único, um anticorpo de cadeia simples, um fragmento variável de cadeia simples (scFv), um fragmento Fab ou um fragmento F(ab')2.

Um derivado funcional de um anticorpo é definido como um anticorpo que foi alterado de tal forma que pelo menos uma propriedade - preferencialmente uma propriedade de ligação ao antigénio - do composto resultante é essencialmente do mesmo tipo, não necessariamente em quantidade. Um derivado é proporcionado de muitas maneiras, por exemplo através da substituição conservadora de aminoácidos, em que um resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo com propriedades geralmente semelhantes (tamanho, hidrofobicidade, etc), de tal forma que o funcionamento global não é provavelmente afetado de forma grave.

Um especialista na técnica é muito capaz de gerar compostos análogos de um anticorpo. Isto é feito, por exemplo, através da triagem de uma biblioteca de péptidos ou biblioteca de apresentação em fagos. Um tal análogo tem essencialmente, pelo menos, uma propriedade igual à do referido anticorpo em tipo, não necessariamente em quantidade.

Como é bem conhecido pelo especialista, uma cadeia pesada de um anticorpo é a maior dos dois tipos de cadeias que constituem uma molécula de imunoglobulina. Uma cadeia pesada compreende domínios constantes e um domínio variável, domínio variável esse que está envolvido na ligação ao antigénio. Uma cadeia leve de um anticorpo é a menor dos dois tipos de cadeias que constituem uma molécula de imunoglobulina. Uma cadeia leve compreende um domínio constante e um domínio variável. 0 domínio variável está, em conjunto com o domínio variável da cadeia pesada, envolvido na ligação ao antigénio.

As regiões determinantes de complementaridade (CDRs) são as regiões hipervariáveis presentes nos domínios variáveis da cadeia pesada e domínios variáveis da cadeia leve. As CDRs de uma cadeia pesada e a cadeia leve conectada de um anticorpo formam, em conjunto, o sítio de ligação de antigénio.

Agora que a presente invenção proporciona a compreensão de que as sequências de CDR representadas na Figura 11 proporcionam características de ligação de RSV desejadas, as variantes podem compreender pelo menos uma sequência de CDR alterada. Por exemplo, aplica-se a substituição conservadora de aminoácidos. A substituição conservadora de aminoácidos envolve a substituição de um aminoácido por outro com propriedades geralmente semelhantes (tamanho, hidrofobicidade, etc), de tal forma que o funcionamento global não é provavelmente afetado de forma grave. É também possível mudar pelo menos uma sequência de CDR representada na Figura 11 para gerar um anticorpo variante, ou um equivalente funcional do mesmo, com pelo menos uma propriedade alterada em comparação com o D25. Um anticorpo ou equivalente funcional pode compreender uma sequência de CDR que é pelo menos 70% idêntica a uma sequência de CDR como representada na Figura 11, para que as características de ligação favoráveis de D25 sejam, pelo menos em parte, mantidas ou até mesmo melhoradas. Uma sequência de CDR como representada na Figura 11 pode ser alterada de tal forma que o anticorpo ou equivalente funcional resultante compreenda, pelo menos, uma propriedade melhorada, tal como, por exemplo, uma afinidade de ligação, seletividade e/ou estabilidade melhorada, em comparação com D25. Estão disponíveis na técnica vários métodos para alterar uma sequência de aminoácidos. Por exemplo, uma sequência da cadeia pesada ou cadeia leve com uma sequência de CDR desejada é sintetizada artificialmente. Preferencialmente, uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de CDR é mutada, por exemplo utilizando mutagénese aleatória - ou específica de um lócus. É aqui divulgado um anticorpo isolado, sintético ou recombinante ou um equivalente funcional do mesmo que é capaz de ligar especificamente o Vírus Sincicial Respiratório e que compreende: uma sequência de CDR1 da cadeia pesada que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência NYIIN, e/ou uma sequência de CDR2 da cadeia pesada que compreende uma sequência que é pelo menos 75% idêntica à sequência GIIPVLGTVHYAPKFQG, e/ou uma sequência de CDR3 da cadeia pesada que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência ETAL WSTTYLPH YFD N, e/ou uma sequência de CDR1 da cadeia leve que compreende uma sequência que é pelo menos 85% idêntica à sequência QASQDIVNYLN, e/ou uma sequência de CDR2 da cadeia leve que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência VASNLET. O referido anticorpo também compreende uma sequência de CDR3 da cadeia leve que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência QQYDNLP.

Um anticorpo ou um equivalente funcional pode compreender uma sequência de CDR que é pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90% idêntica a, pelo menos, uma das sequências de CDR representadas na Figura HD. Muito preferencialmente, um anticorpo ou um equivalente funcional pode compreender uma sequência de CDR que é pelo menos 95% idêntica a, pelo menos, uma das sequências de CDR representadas na Figura HD. O anticorpo D25 particularmente preferido, descrito acima, compreende sequências de CDR que consistem nas sequências de CDR representadas na Figura HD. Uma forma de realização particularmente preferida de acordo com a invenção proporciona, desse modo, um anticorpo isolado, sintético ou recombinante ou um equivalente funcional do mesmo que é capaz de ligar especificamente o Virus Sincicial Respiratório e que compreende: uma sequência de CDR1 da cadeia pesada que compreende a sequência NYIIN, uma sequência de CDR2 da cadeia pesada que compreende a sequência GIIPVLGTVHYAPKFQG, uma sequência de CDR3 da cadeia pesada que compreende a sequência ETALWSTTYLPHYFDN, uma sequência de CDR1 da cadeia leve que compreende a sequência QAS QD IVNYLN, uma sequência de CDR2 da cadeia leve que compreende a sequência VASNLET e uma sequência de CDR3 da cadeia leve que compreende a sequência QQYDNLP. É aqui divulgado um anticorpo ou equivalente funcional é proporcionado que compreende as três sequências de CDR da cadeia pesada e as três sequências de CDR da cadeia leve como representadas na Figura HD, ou sequências que são pelo menos 70%, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85% idênticas àquelas. É ainda divulgado um anticorpo isolado, sintético ou recombinante ou um equivalente funcional do mesmo que compreende uma sequência de CDR1 da cadeia pesada que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência NYIIN e uma sequência de CDR2 da cadeia pesada que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência GIIPVLGTVHYAPKFQG e uma sequência de CDR3 da cadeia pesada que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência ETALWSTTYLPHYFDN e uma sequência de CDR1 da cadeia leve que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência QASQDIVNYLN e uma sequência de CDR2 da cadeia leve que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência VASNLET, e uma sequência de CDR3 da cadeia leve que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência QQYDNLP. O referido anticorpo ou equivalente funcional compreende preferencialmente sequências de CDR que são pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, muito preferencialmente pelo menos 95% idênticas às sequências de CDR da cadeia pesada e a sequências de CDR da cadeia leve como representadas na Figura HD. É também divulgado um anticorpo ou equivalente funcional que compreende as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada supramencionadas bem como as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve supramencionadas. São também divulgados anticorpos ou equivalentes funcionais dos mesmos que compreendem uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada variável que é pelo menos 70% idêntica à sequência da cadeia pesada como representada na Figura 11. Tais sequências da cadeia pesada proporcionam propriedades de ligação ao RSV desejadas, como evidenciado pelo anticorpo D25. Por conseguinte, é ainda divulgado um anticorpo ou um equivalente funcional do mesmo, que tem uma sequência da cadeia pesada que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência QVQLVQSGAEVKKPGSSVMVSCQASGGPLRNYIINWLRQAPGQGPEWMGGII PVLGTVHYAPKFQGRVTITADE S T DTAYIHLISLRSE DTAMYYCATE TALWS T TYLPHYFDNWGQGTLVTVSS. Além do mars, as sequências de aminoácidos da cadeia leve variável que são pelo menos 70% idênticas à sequência da cadeia leve como representada na Figura 11 também proporcionam propriedades de ligação ao RSV desejadas, como evidenciado pelo anticorpo D25. Por conseguinte, é também divulgado um anticorpo, ou um equivalente funcional do mesmo possuindo uma sequência da cadeia leve que é pelo menos 70% idêntica à sequência DIQMTQSPSSLSAAVGDRVTITCQASQDIVNYLNWYQQKPGKAPKLLIYVASN LETGVPSRFSGSGSGTDFSLTISSLQPEDVATYYCQQYDNLPLTFGGGTKVEIK RTV. Um anticorpo ou parte funcional pode compreender uma sequência variável da cadeia pesada e/ou uma sequência variável da cadeia leve que é pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, muito preferencialmente pelo menos 95% idêntica à sequência da cadeia pesada e/ou a sequência da cadeia leve como representada na Figura 11. Quanto maior a homologia, mais o referido anticorpo ou parte funcional se assemelha muito de perto ao anticorpo D25. Um anticorpo ou parte funcional pode compreender uma cadeia pesada bem como uma cadeia leve que se assemelham à cadeia pesada e leve de D25. Por conseguinte, é ainda divulgado um anticorpo ou parte funcional que compreende uma sequência da cadeia pesada e uma sequência da cadeia leve que são pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, muito preferencialmente pelo menos 95% idênticas à sequência da cadeia pesada e à sequência da cadeia leve como representadas na Figura 11.

Uma forma de realização proporciona um anticorpo que compreende uma sequência da cadeia pesada que consiste na sequência da cadeia pesada como representada na Figura 11, e uma sequência da cadeia leve que consiste na sequência da cadeia leve como representada na Figura 11. Alternativamente, como é bem conhecido pelo especialista, é possivel gerar uma sequência da cadeia pesada ou cadeia leve encurtada e que mantenha, ao mesmo tempo, uma propriedade de ligação de interesse. Preferencialmente, é gerada uma tal cadeia pesada ou cadeia leve encurtada que tem uma região constante mais curta, em comparação com a cadeia pesada ou leve original. O dominio variável é preferencialmente mantido. Por exemplo, é produzido um fragmento Fab ou fragmento F(ab')2 com base numa sequência da cadeia pesada ou sequência da cadeia leve representada na Figura 11. Por conseguinte, é também divulgado um equivalente funcional de um anticorpo que compreende, pelo menos, uma parte funcional de uma sequência como representada na Figura 11. Uma parte funcional pode ter um comprimento de pelo menos 20 aminoácidos e pode compreender uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência de CDR1 da cadeia pesada representada na Figura HD, e/ou uma sequência que é pelo menos 75% idêntica à sequência de CDR2 da cadeia pesada representada na Figura HD, e/ou uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência de CDR3 da cadeia pesada representada na Figura HD, e/ou uma sequência que é pelo menos 85% idêntica à sequência de CDR1 da cadeia leve representada na Figura HD, e/ou uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência de CDR2 da cadeia leve representada na Figura HD. Preferencialmente, a referida parte funcional pode compreender também uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência de CDR3 da cadeia leve representada na Figura HD.

Outro anticorpo anti-RSV particularmente preferido de acordo com a presente invenção é o anticorpo designado "AM 14", o qual tem uma região de cadeia pesada e uma região de cadeia leve como representada na Figura 14A. As sequências de CDR de AM14, que contribuem, em particular, para as propriedades de ligação ao antigénio de AM14, são também representadas na Figura 14A.

Agora que a presente invenção proporciona a compreensão de que as sequências de CDR representadas na Figura 14A proporcionam caracteristicas de ligação de RSV desejadas, as variantes podem compreender pelo menos uma sequência de CDR alterada. Por exemplo, aplica-se a substituição conservadora de aminoácidos. A substituição conservadora de aminoácidos envolve a substituição de um aminoácido por outro com propriedades geralmente semelhantes (tamanho, hidrofobicidade, etc), de tal forma que o funcionamento global não é provavelmente afetado de forma grave. É também possível mudar pelo menos uma sequência de CDR representada na Figura 14A para gerar um anticorpo variante, ou um equivalente funcional do mesmo, com pelo menos uma propriedade alterada em comparação com ο AM14. Um anticorpo ou equivalente funcional pode compreender uma sequência de CDR que é pelo menos 7 0% idêntica a uma sequência de CDR como representada na Figura 14A, para que as características de ligação favoráveis de AM14 sejam, pelo menos em parte, mantidas ou até mesmo melhoradas. Uma sequência de CDR como representada na Figura 14A pode ser alterada de tal forma que o anticorpo ou equivalente funcional resultante compreenda, pelo menos, uma propriedade melhorada, tal como, por exemplo, uma afinidade de ligação, seletividade e/ou estabilidade melhorada, em comparação com ο AM14.

Na técnica estão disponíveis vários métodos para alterar uma sequência de aminoácidos. Por exemplo, uma sequência da cadeia pesada ou cadeia leve com uma sequência de CDR desejada é sintetizada artificialmente. Preferencialmente, uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de CDR é mutada, por exemplo utilizando mutagénese aleatória - ou específica de um lócus. É aqui divulgado um anticorpo isolado, sintético ou recombinante ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo que é capaz de ligar especificamente o Vírus Sincicial Respiratório e que compreende: uma sequência de CDR1 da cadeia pesada que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência GFSFSHYA, e/ou uma sequência de CDR2 da cadeia pesada que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência ISYDGENT, e/ou uma sequência de CDR3 da cadeia pesada que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência ARDRIVDDYYYYGMDV, e/ou uma sequência de CDR1 da cadeia leve que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência QDIKKY, e/ou uma sequência de CDR2 da cadeia leve que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência DAS, e/ou uma sequência de CDR3 da cadeia leve que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência QQYD NLPPLT.

Um anticorpo ou um equivalente funcional pode compreender uma sequência de CDR que é pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90% idêntica a, pelo menos, uma das sequências de CDR representadas na Figura 14A. Muito preferencialmente, um anticorpo ou um equivalente funcional pode compreender uma sequência de CDR que é pelo menos 95% idêntica a, pelo menos, uma das sequências de CDR representadas na Figura 14A. O anticorpo AM14 particularmente preferido, descrito acima, compreende sequências de CDR que consistem nas sequências de CDR representadas na Figura 14A. Uma forma de realização particularmente preferida de acordo com a invenção proporciona, desse modo, um anticorpo isolado, sintético ou recombinante que é capaz de ligar especificamente o Virus Sincicial Respiratório e que compreende: uma sequência de CDR1 da cadeia pesada que compreende a sequência GFSFSHYA, uma sequência de CDR2 da cadeia pesada que compreende a sequência ISYDGENT, uma sequência de CDR3 da cadeia pesada que compreende a sequência ARDRIVDDYYYYGMDV, uma sequência de CDR1 da cadeia leve que compreende a sequência QDIKKY, uma sequência de CDR2 da cadeia leve que compreende a sequência DAS e uma sequência de CDR3 da cadeia leve que compreende a sequência QQYD NLPPLT. É aqui divulgado um anticorpo ou equivalente funcional que compreende as três sequências de CDR da cadeia pesada e as três sequências de CDR da cadeia leve como representadas na Figura 14A, ou sequências que são pelo menos 70% idênticas àquelas. Por conseguinte, é ainda divulgado um anticorpo isolado, sintético ou recombinante ou um equivalente funcional do mesmo que compreende uma sequência de CDR1 da cadeia pesada que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência GFSFSHYA e uma sequência de CDR2 da cadeia pesada que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência ISYDGENT e uma sequência de CDR3 da cadeia pesada que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência ARDRIVDDYYYYGMDV e uma sequência de CDR1 da cadeia leve que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência QDIKKY e uma sequência de CDR2 da cadeia leve que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência DAS, e uma sequência de CDR3 da cadeia leve que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência QQYDNLPPLT. O referido anticorpo ou equivalente funcional compreende preferencialmente sequências de CDR que são pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, muito preferencialmente pelo menos 95% idênticas às sequências de CDR da cadeia pesada e às sequências de CDR da cadeia leve como representadas na

Figura 14A. É também divulgado um anticorpo ou equivalente funcional que compreende as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada supramencionadas de Figura 14A bem como as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve supramencionadas da Figura 14A. São também divulgados anticorpos ou equivalentes funcionais dos mesmos que compreendem uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada que é, pelo menos, 70% idêntica a uma sequência da cadeia pesada como representada na Figura 14A. Tais sequências da cadeia pesada proporcionam propriedades de ligação ao RSV desejadas, como evidenciado pelo anticorpo AM14. É ainda divulgado um anticorpo ou um equivalente funcional do mesmo, que tem uma sequência da cadeia pesada que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência

EVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFSFSHYAMHWVRQAPGKGLEWVAVIS YDGENTYYADSVKGRFSISRDNSKNTVSLQMNSLRPEDTALYYCARDRIVDD YYYYGMDVWGQGATVTVSS. Além do mais, as sequências de aminoácidos da cadeia leve que são pelo menos 70% idênticas a uma sequência da cadeia leve como representada na Figura 14A também proporcionam propriedades de ligação ao RSV desejadas, como evidenciado pelo anticorpo AM14. Por conseguinte, é também divulgado um anticorpo, ou um equivalente funcional do mesmo, que tem uma sequência da cadeia leve que é pelo menos 70% idêntica à sequência DIQMTQS PS SLSASVGDRVT I

TCQASQDIKKYLNWYHQKPGKVPELLMHDASNLETGVPSRF SGRGSGTDFTLTI SSLQPEDI GTYYCQQYDNLPPLTFGGGTKVEIKRTV. Um anticorpo ou parte funcional pode compreender preferencialmente uma sequência variável da cadeia pesada e/ou uma sequência variável da cadeia leve que é pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, muito preferencialmente pelo menos 95% idêntica a uma sequência da cadeia pesada e/ou uma sequência da cadeia leve como representada na Figura 14A. Quanto maior a homologia, mais o referido anticorpo ou parte funcional se assemelha muito de perto ao anticorpo AM14. Um anticorpo ou parte funcional em conformidade pode compreender uma cadeia pesada bem como uma cadeia leve que se assemelham à cadeia pesada e leve de AM14. Por conseguinte, é ainda divulgado um anticorpo ou parte funcional que compreende uma sequência da cadeia pesada e uma sequência da cadeia leve que são pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, muito preferencialmente pelo menos 95% idênticas à sequência da cadeia pesada e à sequência da cadeia leve como representadas na Figura 14A.

Uma forma de realização proporciona um anticorpo que compreende uma sequência da cadeia pesada que consiste na sequência da cadeia pesada como representada na Figura 14A, e uma sequência da cadeia leve que consiste na sequência da cadeia leve como representada na Figura 14A. Alternativamente, como é bem conhecido pelo especialista, é possível gerar uma sequência da cadeia pesada ou cadeia leve encurtada e que mantenha ao mesmo tempo uma propriedade de ligação de interesse. Preferencialmente, é gerada uma tal cadeia pesada ou cadeia leve encurtada que tem uma região constante mais curta, em comparação com a cadeia pesada ou leve original. O domínio variável é preferencialmente mantido. Por exemplo, é produzido um fragmento Fab ou fragmento F(ab')2 com base numa sequência da cadeia pesada ou sequência da cadeia leve representada na Figura 14A. Por conseguinte, é também divulgado um equivalente funcional de um anticorpo que compreende pelo menos uma parte funcional de uma sequência como representada na Figura 14A. A parte funcional pode ter um comprimento de pelo menos 20 aminoácidos e pode compreender uma sequência que é pelo menos 70% idêntica a, pelo menos, uma das sequências de CDR representadas na Figura 14A.

Outro anticorpo anti-RSV particularmente preferido de acordo com a presente invenção é o anticorpo designado "AM16", o qual tem uma região de cadeia pesada e uma região de cadeia leve como representada na Figura 14B. As sequências de CDR de AM16, que contribuem, em particular, para as propriedades de ligação ao antigénio do AM16, são também representadas na Figura 14B.

Agora que a presente invenção proporciona a compreensão de que as sequências de CDR representadas na Figura 14B proporcionam caracteristicas de ligação de RSV desejadas, as variantes podem compreender pelo menos uma sequência de CDR alterada. Por exemplo, aplica-se a substituição conservadora de aminoácidos. A substituição conservadora de aminoácidos envolve a substituição de um aminoácido por outro com propriedades geralmente semelhantes (tamanho, hidrofobicidade, etc), de tal forma que o funcionamento global não é provavelmente afetado de forma grave. É também possível mudar pelo menos uma sequência de CDR representada na Figura 14B para gerar um anticorpo variante, ou um equivalente funcional do mesmo, com pelo menos uma propriedade alterada em comparação com ο AM16. Um anticorpo ou equivalente funcional pode compreender uma sequência de CDR que é pelo menos 70% idêntica a uma sequência de CDR como representada na Figura 14B, para que as caracteristicas de ligação favoráveis do AM16 sejam, pelo menos em parte, mantidas ou até mesmo melhoradas. Uma sequência de CDR como representada na Figura 14B pode ser alterada de tal forma que o anticorpo ou equivalente funcional resultante compreenda pelo menos uma propriedade melhorada, tal como, por exemplo, uma afinidade de ligação, seletividade e/ou estabilidade melhorada, em comparação com ο AM16. Estão disponíveis na técnica vários métodos para alterar uma sequência de aminoácidos. Por exemplo, uma sequência da cadeia pesada ou cadeia leve com uma sequência de CDR desejada é sintetizada artificialmente. Preferencialmente, uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de CDR é mutada, por exemplo utilizando mutagénese aleatória - ou especifica de um lócus. É aqui divulgado um anticorpo isolado, sintético ou recombinante ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo que é capaz de ligar especificamente o Virus Sincicial Respiratório e que compreende: uma sequência de CDR1 da cadeia pesada que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência GFTFSSYN, e/ou uma sequência de CDR2 da cadeia pesada que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência ISAGSSYI, e/ou uma sequência de CDR3 da cadeia pesada que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência AREDYGPGNYYSPNWFDP, e/ou uma sequência de CDRl da cadeia leve que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência SSNIGAGYD, e/ou uma sequência de CDR2 da cadeia leve que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência GNT, e/ou uma sequência de CDR3 da cadeia leve que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência HSYDRSLSG.

Um anticorpo ou um equivalente funcional pode compreender uma sequência de CDR que é pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90% idêntica a, pelo menos, uma das sequências de CDR representadas na Figura 14B. Muito preferencialmente, um anticorpo ou um equivalente funcional pode compreender uma sequência de CDR que é pelo menos 95% idêntica a, pelo menos, uma das sequências de CDR representadas na Figura 14B. O anticorpo AM16 particularmente preferido, descrito acima, compreende sequências de CDR que consistem nas sequências de CDR representadas na Figura 14B. Uma forma de realização particularmente preferida de acordo com a invenção proporciona, desse modo, um anticorpo isolado, sintético ou recombinante que é capaz de ligar especificamente o Virus Sincicial Respiratório e que compreende: uma sequência de CDR1 da cadeia pesada que compreende a sequência GFTFSSYN, e/ou uma sequência de CDR2 da cadeia pesada que compreende a sequência ISAGSSYI, uma sequência de CDR3 da cadeia pesada que compreende a sequência AREDYGPGNYYSPNWFDP, uma sequência de CDR1 da cadeia leve que compreende a sequência SSNIGAGYD, uma sequência de CDR2 da cadeia leve que compreende a sequência GNT e uma sequência de CDR3 da cadeia leve que compreende a sequência HSYDRSLSG. É aqui divulgado um anticorpo ou equivalente funcional que compreende as três sequências de CDR da cadeia pesada e as três sequências de CDR da cadeia leve como representadas na Figura 14B, ou sequências que são pelo menos 70% idênticas àquelas. Por conseguinte, é ainda divulgado um anticorpo isolado, sintético ou recombinante ou um equivalente funcional do mesmo que compreende uma sequência de CDR1 da cadeia pesada que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência GFTFSSYN e uma sequência de CDR2 da cadeia pesada que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência ISAGSSYI e uma sequência de CDR3 da cadeia pesada que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência AREDYGPGNYYSPNWFDP e uma sequência de CDR1 da cadeia leve que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência SSNIGAGYD e uma sequência de CDR2 da cadeia leve que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência GNT, e uma sequência de CDR3 da cadeia leve que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência HSYDRSLSG. O referido anticorpo ou equivalente funcional compreende preferencialmente sequências de CDR que são pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, muito preferencialmente pelo menos 95% idênticas às sequências de CDR da cadeia pesada supramencionadas e às sequências de CDR da cadeia leve supramencionadas como representadas na Figura 14B. É também divulgado um anticorpo ou equivalente funcional compreendendo as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada supramencionadas da Figura 14B bem como as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve supramencionadas da Figura 14B. São também divulgados anticorpos ou equivalentes funcionais dos mesmos que compreendem uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada que é pelo menos 70% idêntica a uma sequência da cadeia pesada como representada na Figura 14B. Tais sequências da cadeia pesada proporcionam propriedades de ligação ao RSV desejadas, como evidenciado pelo anticorpo

AMI 6. É ainda divulgado um anticorpo ou um equivalente funcional do mesmo, que tem uma sequência da cadeia pesada que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica a sequência EVQLVETGGGLAQPGGSLRLSCAASGFTFSSYNMNWVRQAPGKGLEWVSHISAGSSYIY YSD SVKGRFTVSRDNVRNSVILQMNSLRAADTAVYYCAREDYGPGNYYSPNWFDPWGQGTLV TVS S. Além do mais, as sequências de aminoácidos da cadeia leve que são pelo menos 70% idênticas a uma sequência da cadeia leve como representada na Figura 14B também proporcionam propriedades de ligação ao RSV desejadas, como evidenciado pelo anticorpo AM16. Por conseguinte, é também divulgado um anticorpo, ou um equivalente funcional do mesmo que tem uma sequência da cadeia leve que é pelo menos 70% idêntica à sequência QSWTQPPSVSGAPGQRVT I SCTGS SSNI GAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNTNRPSGVS D RFSGSKSGTSASLAI TGLQAEDEADYYCHSYDRSLSGSVFGGGTKLTV. Um anticorpo ou parte funcional pode compreender uma sequência variável da cadeia pesada e/ou uma sequência variável da cadeia leve que é pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, muito preferencialmente pelo menos 95% idêntica à sequência da cadeia pesada e/ou à sequência da cadeia leve como representada na Figura 14B. Quanto maior a homologia, mais o referido anticorpo ou parte funcional se assemelha muito de perto ao anticorpo AM16. Um anticorpo ou parte funcional pode compreender uma cadeia pesada bem como uma cadeia leve que se assemelham à cadeia pesada e leve de AM16. Por conseguinte, é ainda divulgado um anticorpo ou parte funcional que compreende uma sequência da cadeia pesada e uma sequência da cadeia leve que são pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, muito preferencialmente pelo menos 95% idênticas à sequência da cadeia pesada e à sequência da cadeia leve como representadas na Figura 14B.

Uma forma de realização proporciona um anticorpo que compreende uma sequência da cadeia pesada que consiste na sequência da cadeia pesada como representada na Figura 14B, e uma sequência da cadeia leve que consiste na sequência da cadeia leve como representada na Figura 14B. Alternativamente, como é bem conhecido pelo especialista, é possível gerar uma sequência da cadeia pesada ou cadeia leve encurtada e que mantenha ao mesmo tempo uma propriedade de ligação de interesse. Preferencialmente, é gerada uma tal cadeia pesada ou cadeia leve encurtada que tem uma região constante mais curta, em comparação com a cadeia pesada ou leve original. 0 domínio variável é preferencialmente mantido. Por exemplo, é produzido um fragmento Fab ou fragmento F(ab')2 com base numa sequência da cadeia pesada ou sequência da cadeia leve representada na Figura 14B. Por conseguinte, é também divulgado um equivalente funcional de um anticorpo que compreende pelo menos uma parte funcional de uma sequência como representada na Figura 14B. Uma parte funcional pode ter um comprimento de pelo menos 20 aminoácidos e pode compreender uma sequência que é pelo menos 70% idêntica a, pelo menos, uma das sequências de CDR representadas na Figura 14B.

Outro anticorpo anti-RSV particularmente preferido de acordo com a presente invenção é o anticorpo designado "AM23", que tem uma região de cadeia pesada e uma região de cadeia leve como representadas na Figura 14C. As sequências de CDR de AM23, que contribuem, em particular, para as propriedades de ligação ao antigénio do AM23, são também representadas na Figura 14C.

Agora que a presente invenção proporciona a compreensão de que as sequências de CDR representadas na Figura 14C proporcionam caracteristicas de ligação de RSV desejadas, as variantes podem compreender pelo menos uma sequência de CDR alterada. Por exemplo, aplica-se uma substituição conservadora de aminoácidos. A substituição conservadora de aminoácidos envolve a substituição de um aminoácido por outro com propriedades geralmente semelhantes (tamanho, hidrofobicidade, etc), de tal forma que o funcionamento global não é provavelmente afetado de forma grave. É também possivel mudar pelo menos uma sequência de CDR representada na Figura 14C para gerar um anticorpo variante, ou um equivalente funcional do mesmo, com pelo menos uma propriedade alterada em comparação com ο AM23. Um anticorpo ou equivalente funcional pode compreender uma sequência de CDR que é pelo menos 7 0% idêntica a uma sequência de CDR como representada na Figura 14C, para que as caracteristicas de ligação favoráveis do AM23 sejam, pelo menos em parte, mantidas ou até mesmo melhoradas. Uma sequência de CDR como representada na Figura 14C pode ser alterada de tal forma que o anticorpo ou equivalente funcional resultante compreenda pelo menos uma propriedade melhorada, tal como, por exemplo, um afinidade de ligação, seletividade e/ou estabilidade melhorada, em comparação com ο AM23. Estão disponíveis na técnica vários métodos para alterar uma sequência de aminoácidos. Por exemplo, uma sequência da cadeia pesada ou cadeia leve com uma sequência de CDR desejada é sintetizada artificialmente. Preferencialmente, uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de CDR é mutada, por exemplo utilizando mutagénese aleatória - ou especifica de um lócus. É aqui divulgado um anticorpo isolado, sintético ou recombinante ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo que é capaz de ligar especificamente o Virus Sincicial Respiratório e que compreende: uma sequência de CDR1 da cadeia pesada que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência GFNFHNYG, e/ou uma sequência de CDR2 da cadeia pesada que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência VWYDGSKK, e/ou uma sequência de CDR3 da cadeia pesada que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência VRD KVGPTPYFD S, e/ou uma sequência de CDRl da cadeia leve que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência NIGSET, e/ou uma sequência de CDR2 da cadeia leve que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência DDD, e/ou uma sequência de CDR3 da cadeia leve que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência QVWDRSNYH QV.

Um anticorpo ou um equivalente funcional pode compreender uma sequência de CDR que é pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90% idêntica a, pelo menos, uma das sequências de CDR representadas na Figura 14C. Muito preferencialmente, um anticorpo ou um equivalente funcional pode compreender uma sequência de CDR que é pelo menos 95% idêntica a, pelo menos, uma das sequências de CDR representadas na Figura 14C. 0 anticorpo AM23 particularmente preferido, descrito acima, compreende sequências de CDR que consistem nas sequências de CDR representadas na Figura 14C. Uma forma de realização particularmente preferida de acordo com a invenção proporciona, desse modo, um anticorpo isolado, sintético ou recombinante que é capaz de ligar especificamente o Virus Sincicial Respiratório e que compreende: uma sequência de CDR1 da cadeia pesada que compreende a sequência GFNFHNYG, uma sequência de CDR2 da cadeia pesada que compreende a sequência VWYDGSKK, uma sequência de CDR3 da cadeia pesada que compreende a sequência VRDKVGPTPYFDS, uma sequência de CDR1 da cadeia leve que compreende a sequência NIGSET, uma sequência de CDR2 da cadeia leve que compreende a sequência DDD e uma sequência de CDR3 da cadeia leve que compreende a sequência QVWDRSNYH QV. É aqui divulgado um anticorpo ou equivalente funcional que compreende as três sequências de CDR da cadeia pesada e as três sequências de CDR da cadeia leve como representadas na Figura 14C. Por conseguinte, é ainda divulgado um anticorpo isolado, sintético ou recombinante ou um equivalente funcional do mesmo que compreende uma sequência de CDR1 da cadeia pesada que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência GFNFHNYG e uma sequência de CDR2 da cadeia pesada que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência VWYDGSKK e uma sequência de CDR3 da cadeia pesada que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência VRDKVGPTPYFDS e uma sequência de CDR1 da cadeia leve que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência NIGSET e uma sequência de CDR2 da cadeia leve que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência DDD, e uma sequência de CDR3 da cadeia leve que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência QVWDRSNYH QV. O referido anticorpo ou equivalente funcional compreende preferencialmente sequências de CDR que são pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, muito preferencialmente pelo menos 95% idênticas às sequências de CDR da cadeia pesada supramencionadas e às sequências de CDR da cadeia leve supramencionadas como representadas na Figura 14C. É também divulgado um anticorpo ou equivalente funcional que compreende as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada supramencionadas de Figura 14C bem como as sequências de CDRl, CDR2 e CDR3 da cadeia leve supramencionadas de Figura 14C. São também divulgados anticorpos ou equivalentes funcionais dos mesmos que compreendem uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada que é pelo menos 70% idêntica a uma sequência da cadeia pesada como representada na Figura 14C. Tais sequências da cadeia pesada proporcionam propriedades de ligação ao RSV desejadas, como evidenciado pelo anticorpo AM23. É ainda divulgado um anticorpo ou um equivalente funcional do mesmo, que tem uma sequência da cadeia pesada que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica a sequência EVQLVESGGNVVKPGTSLRLSCAATGFNFHNYGMNWVRQAPGKGLEWVAWWYDGSKKYY AD SVTGRFAI SRDNSKNTLYLQMNSLRVEDTAVYYCVRDKVGPTPYFDSWGQGTLVTVS S. Além do mais, as sequências de aminoácidos da cadeia leve que são pelo menos 70% idênticas a uma sequência da cadeia leve como representada na Figura 14C também proporcionam propriedades de ligação ao RSV desejadas, como evidenciado pelo anticorpo AM23. Por conseguinte, é também divulgado um anticorpo, ou um equivalente funcional do mesmo que tem uma sequência da cadeia leve que é pelo menos 70% idêntica à sequência SYVLTQPPSVSLAPGGTAAI TCGRNNIGSETVHWYQQKPGQAPVLWYDDDDRPSGI PERFS GSNSGNTATLT I SRVEAGDEADYYCQVWDRSNYHQVFGGGTKLTV. Um anticorpo ou parte funcional pode compreender uma sequência variável da cadeia pesada e/ou uma sequência variável da cadeia leve que é pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, muito preferencialmente pelo menos 95% idêntica à sequência da cadeia pesada e/ou à sequência da cadeia leve como representada na Fiqura 14C. Quanto maior a homoloqia, mais o referido anticorpo ou parte funcional se assemelha muito de perto ao anticorpo AM23. Um anticorpo ou parte funcional pode compreender uma cadeia pesada bem como uma cadeia leve que se assemelham à cadeia pesada e leve do AM23. Por conseguinte, é ainda divulgado um anticorpo ou parte funcional que compreende uma sequência da cadeia pesada e uma sequência da cadeia leve que são pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, muito preferencialmente pelo menos 95% idênticas à sequência da cadeia pesada e à sequência da cadeia leve como representadas na Figura 14C.

Uma forma de realização proporciona um anticorpo que compreende uma sequência da cadeia pesada que consiste na sequência da cadeia pesada como representada na Figura 14C, e uma sequência da cadeia leve que consiste na sequência da cadeia leve como representada na Figura 14C. Alternativamente, como é bem conhecido pelo especialista, é possivel gerar uma sequência da cadeia pesada ou cadeia leve encurtada e que mantenha ao mesmo tempo uma propriedade de ligação de interesse. Preferencialmente, é gerada uma tal cadeia pesada ou cadeia leve encurtada que tem uma região constante mais curta, em comparação com a cadeia pesada ou leve original. 0 dominio variável é preferencialmente mantido. Por exemplo, é produzido um fragmento Fab ou fragmento F(ab')2 com base numa sequência da cadeia pesada ou sequência da cadeia leve representada na Figura 14C. Por conseguinte, é também divulgado um equivalente funcional de um anticorpo que compreende pelo menos uma parte funcional de uma sequência como representada na Figura 14C. Uma parte funcional pode ter um comprimento de pelo menos 20 aminoácidos e pode compreender uma sequência que é pelo menos 70% idêntica a, pelo menos, uma das sequências de CDR representadas na Figura 14C. A presente invenção proporciona anticorpos específicos contra o RSV como definidos nas reivindicações que têm propriedades melhoradas em comparação com os anticorpos da técnica anterior. Os inventores tiveram sucesso em gerar anticorpos específicos contra o RSV com valores de IC50 baixos. Tais anticorpos têm uma afinidade particularmente alta ou forte para o RSV e são, portanto, particularmente adequados para neutralizar e/ou pelo menos prevenir, em parte, uma infeção por RSV e/ou os efeitos adversos de uma infeção por RSV. Uma divulgação proporciona um anticorpo que tem um valor de IC50 inferior a 10 ng/mL num ensaio de neutralização in vitro em que células HEp-2 são infetadas com RSV, e um equivalente funcional do referido anticorpo. O referido anticorpo ou equivalente funcional tem preferencialmente um valor de IC50 inferior a 5 ng/mL, mais preferencialmente inferior a 2 ng/mL. O anticorpo preferido D25 tem um valor de IC50 de cerca de 0,5-1,5 ng/mL no ensaio de neutralização in vitro descrito nos exemplos (ver Figura 8).

Um anticorpo de acordo com a invenção é preferencialmente um anticorpo humano. A utilização de anticorpos humanos para terapia humana diminui a possibilidade de efeitos secundários devido a uma reação imunológica num indivíduo humano contra sequências não humanas. Noutra forma de realização preferida, um anticorpo ou parte funcional, derivado ou análogo de acordo com a invenção é um anticorpo quimérico. Deste modo, sequências de interesse, tais como, por exemplo, um sítio de ligação de interesse, podem ser incluídas num anticorpo ou equivalente funcional de acordo com a invenção. A invenção proporciona ainda uma sequência de ácido nucleico isolada, sintética ou recombinante que codifica um anticorpo de acordo com a invenção. Um tal ácido nucleico é, por exemplo, isolado a partir de uma célula B que é capaz de produzir um anticorpo de acordo com a invenção, como delineado em mais pormenor abaixo. Uma sequência de ácido nucleico aqui divulgada pode compreender uma sequência que é pelo menos 70% homóloga a, pelo menos, uma parte funcional de uma sequência de ácido nucleico como representada na Figura 11, Figura 12, Figura 14A, Figura 14B e/ou Figura 14B. A referida sequência de ácido nucleico pode compreender uma sequência que é pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, muito preferencialmente pelo menos 95% homóloga a, pelo menos, uma parte funcional de uma sequência de ácido nucleico como representada na Figura 11, Figura 12, Figura 14A, Figura 14B e/ou Figura 14B. A referida parte funcional tem um comprimento de pelo menos 30 nucleótidos, preferencialmente pelo menos 50 nucleótidos, mais preferencialmente pelo menos 75 nucleótidos. A referida parte funcional pode codificar pelo menos uma sequência de ácido nucleico como representada na Figura HD, Figura 12, Figura 14A, Figura 14B e/ou Figura 14B. A referida sequência é preferencialmente uma sequência de CDR.

Um anticorpo de acordo com a invenção é particularmente adequado para utilização como um medicamento ou agente profilático. Por conseguinte, é também aqui proporcionado um anticorpo de acordo com a invenção para utilização como um medicamento e/ou agente profilático. Numa forma de realização particularmente preferida, o referido anticorpo compreende o anticorpo D25, AM14, AM16 e/ou AM23. 0 referido medicamento ou agente profilático é preferencialmente utilizado para neutralizar ou pelo menos prevenir, em parte, uma infeção por RSV ou para neutralizar ou pelo menos prevenir, em parte, efeitos adversos de uma infeção por RSV. Por conseguinte é também divulgada uma utilização de um anticorpo, parte funcional, derivado ou análogo de acordo com a invenção para a preparação de um medicamento e/ou agente profilático para tratar e/ou prevenir, pelo menos em parte, um distúrbio relacionado com RSV, bem como um método para tratar ou prevenir, pelo menos em parte, um distúrbio relacionado com RSV, compreendendo o método a administração, a um indivíduo que necessita do mesmo, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ou equivalente funcional de acordo com a invenção. 0 referido anticorpo compreende preferencialmente o anticorpo D25, AM14, AM16 e/ou AM23. A fim de neutralizar o RSV, um anticorpo de acordo com a invenção pode ser administrado a um indivíduo antes de ocorrer uma infeção por RSV. Alternativamente, um anticorpo de acordo com a invenção pode ser administrado quando um indivíduo já está infetado pelo RSV. 0 referido anticorpo pode ser administrado a indivíduos com um risco aumentado de distúrbios relacionados com RSV, tais como, por exemplo, crianças de parto prematuro, indivíduos com doença pulmonar crónica, doença cardíaca congénita e/ou imunidade comprometida, e crianças com um idade inferior a 6 semanas. Os idosos também têm um risco aumentado de distúrbios relacionados com RSV. Os anticorpos de acordo com a invenção podem ser administrados por via oral ou através de uma ou mais injeções. As gamas de doses de anticorpos de acordo com a invenção a serem utilizadas nas aplicações terapêuticas como descritas acima são determinadas com base em estudos de dose crescente na clinica em ensaios clínicos para os quais existem requisitos de protocolo rigorosos. As doses típicas situam-se entre 0,1 e 10 mg por kg de peso corporal. Para aplicação terapêutica, os anticorpos de acordo com a invenção são tipicamente combinados com um transportador, adjuvante, diluente e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Os exemplos de veículos adequados compreendem, por exemplo, hemocianina de lapa californiana (KLH), albumina sérica (por exemplo BSA ou RSA) e ovalbumina. Muitos adjuvantes adequados, de base oleosa e base aquosa, são conhecidos para um especialista na técnica. Numa forma de realização, o referido adjuvante compreende Specol. Noutra forma de realização, o referido veículo adequado compreende uma solução como, por exemplo, soro fisiológico.

Ainda noutra forma de realização, é utilizado um ácido nucleico que codifica um anticorpo de acordo com a invenção. Após administração de um tal ácido nucleico, os anticorpos ou equivalentes funcionais são produzidos pela maquinaria do hospedeiro. Os anticorpos ou equivalentes funcionais produzidos são capazes de prevenir e/ou neutralizar a infeção por RSV e/ou os efeitos adversos de uma infeção por RSV. Por conseguinte é também aqui proporcionada uma sequência de ácido nucleico de acordo com a invenção para utilização como um medicamento e/ou agente profilático. O referido ácido nucleico é preferencialmente utilizado para neutralizar o RSV. Por conseguinte, é ainda divulgada uma utilização de uma sequência de ácido nucleico, parte funcional, derivado e/ou análogo de acordo com a invenção para a preparação de um medicamento e/ou agente profilático para tratar e/ou prevenir, pelo menos em parte, um distúrbio relacionado com RSV.

Por pelo menos uma parte funcional de um ácido nucleico, entende-se uma parte do referido ácido nucleico com pelo menos 30 pares de bases de comprimento, preferencialmente pelo menos 50 pares de bases de comprimento, mais preferencialmente pelo menos 100 pares de bases de comprimento, compreendendo pelo menos uma expressão caracteristica (em tipo, não necessariamente em quantidade) como um ácido nucleico da invenção. A referida parte funcional codifica, pelo menos, uma sequência de aminoácidos que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica a uma sequência de CDR como representada na Figura HD, Figura 14A, Figura 14B e/ou Figura 14C.

Além disso, a invenção proporciona uma célula produtora de anticorpos isolada capaz de produzir um anticorpo, de acordo com a invenção. As possíveis maneiras (mas não limitativas) de obter tais células produtoras de anticorpos são delineadas em pormenor nos exemplos. Os inventores têm desenvolvido e utilizado um novo método para melhorar a estabilidade de células produtoras de anticorpos específicos para RSV. Utilizando este método, são geradas células produtoras de anticorpos específicos para RSV que são estáveis durante pelo menos seis meses. Por conseguinte, é também aqui divulgada uma célula produtora de anticorpos específicos para RSV de acordo com a invenção, a qual é estável durante pelo menos nove semanas, preferencialmente durante pelo menos três meses, mais preferencialmente durante pelo menos seis meses.

Os presentes inventores utilizaram a sua perceção de que a estabilidade de uma célula produtora de anticorpos específicos para RSV é influenciada ao influenciar a quantidade de produto de expressão BCL6 e/ou Blimp-1 na referida célula produtora de anticorpos. A quantidade de produto de expressão BCL6 e/ou Blimp-1 é influenciada seja direta ou indiretamente. Preferencialmente, as quantidades de produtos de expressão BCL6 e Blimp-1 na referida célula produtora de anticorpos são reguladas, uma vez que ambos os produtos de expressão estão envolvidos na estabilidade de uma célula produtora de anticorpos. A estabilidade de uma célula produtora de anticorpos é definida como a capacidade da referida célula produtora de anticorpos para permanecer numa certa etapa de desenvolvimento (preferencialmente depois de a referida célula ter sido colocada na referida etapa). As diferentes etapas do desenvolvimento de uma célula envolvem pelo menos uma característica diferente da referida célula. Por exemplo, sabe-se que uma célula B de memória se diferencia após estimulação numa célula plasmática secretora de anticorpos através de uma etapa que alguns investigadores chamam um plasmablasto. Uma célula B de memória, um plasmablasto e uma célula plasmática são diferentes etapas de desenvolvimento de uma célula B, em que a célula B tem diferentes características. Uma célula B de memória exibe baixa proliferação e secreção de anticorpos. Um plasmablasto exibe tanto uma proliferação mais alta como níveis mais altos de secreção de anticorpos em comparação com uma célula B de memória, enquanto uma célula plasmática segrega níveis altos de anticorpos mas não é capaz de proliferar. Com os métodos aqui divulgados tornou-se possível regular a expectativa de vida replicativa de uma célula produtora de anticorpos. Uma expectativa de vida replicativa de uma célula produtora de anticorpos é aqui definida como o período de tempo em que uma célula B e as suas células de descendência são capazes de se replicar, mantendo ao mesmo tempo a sua capacidade de produzir anticorpos e/ou evoluir para uma célula que produz anticorpos. Preferencialmente, a expectativa de vida replicativa de uma célula produtora de anticorpos é prolongada, o que significa que a referida célula produtora de anticorpos não se diferenciará terminalmente - ou apenas depois de um periodo mais longo em comparação com o mesmo tipo de células produtoras de anticorpos que são atualmente utilizadas - e continuará a proliferar in vitro. De acordo com os inventores, é possivel regular a quantidade de produto de expressão BCL6 e/ou Blimp-1 numa célula produtora de anticorpos em tal medida que a célula produtora de anticorpos é colocada, e/ou mantida, num estado de desenvolvimento predeterminado em que as células continuam a proliferar. Com o método divulgado pelos inventores, tornou-se portanto possivel aumentar a expectativa de vida replicativa de uma célula produtora de anticorpos, uma vez que é possivel manter uma célula B numa certa etapa de desenvolvimento, em que ocorre replicação. Faz-se referência à PCT/NL2006/000625, apresentada pelo mesmo requerente. São aqui divulgados meios e métodos de produção de células produtoras de anticorpos específicos para RSV estáveis.

Uma célula produtora de anticorpos é definida como uma célula, cuja célula é capaz de produzir e/ou segregar anticorpos ou um equivalente funcional dos mesmos, e/ou cuja célula é capaz de evoluir para uma célula que é capaz de produzir e/ou segregar anticorpos ou um equivalente funcional dos mesmos. Uma célula produtora de anticorpos específicos para RSV é aqui definida como uma célula capaz de produzir e/ou segregar anticorpos ou equivalentes funcionais dos mesmos que são capazes de ligar especificamente o RSV e/ou um componente de RSV, tal como, por exemplo, um epítopo da proteína (de fusão) F do RSV, a proteína (de fixação) G do RSV ou proteína (hidrófoba pequena) SH do RSV. Preferencialmente, a referida célula produtora de anticorpos específicos para RSV compreende uma célula B e/ou uma célula plasmática derivada de células B. Uma célula B é aqui chamada uma célula produtora de anticorpos, mesmo quando a célula B está numa etapa em que a produção de anticorpos é baixa ou não está de todo presente, tal como uma célula B naif ou uma célula B de memória, que está ativada ou não, porque tais células são capazes de evoluir para células que produzem anticorpos, tais como plasmablastos e/ou células plasmáticas.

Uma célula produtora de anticorpos específicos para RSV compreende preferencialmente uma célula de mamífero. Os exemplos não limitativos incluem células produtoras de anticorpos derivadas de um indivíduo humano, roedor, coelho, lama, porco, vaca, cabra, cavalo, macaco, gorila. Preferencialmente, a referida célula produtora de anticorpos compreende uma célula humana, uma célula muridea, uma célula de coelho e/ou uma célula de lama. 0 BCL6 codifica um repressor da transcrição que é necessário para desenvolvimento e maturação normais de células B e células T e que é necessário para a formação de centros germinativos. (Ye, 1997). 0 BCL6 é altamente expresso em células B de centros germinativos enquanto é dificilmente expresso em células plasmáticas. 0 BCL6 inibe a diferenciação de células B ativadas em células plasmáticas. 0 repressor da transcrição, proteína de maturação induzida por linfócitos B-l (Blimp-1), é necessário para a evolução de uma célula B para uma célula plasmática. A variante humana da Blimp-1 é denominada Prdml. Como aqui utilizada, qualquer referência a Blimp-1 inclui uma referência à Prdml. A Blimp-1 conduz a diferenciação de células plasmáticas. 0 BCL6 e a Blimp-1 reprimem a expressão uma da outra; Assim, numa situação natural quando um atinge um nivel de expressão mais alto do que o outro, a etapa de diferenciação é compelida. No corpo humano, a diferenciação de células plasmáticas a partir de células B naif ou de memória ativadas envolve a regulação negativa de BCL6 e a regulação positiva de Blimp-1. Nas células de centros germinativos, a expressão de BCL6 é alta e expressão de Blimp-1 é baixa. Nas células de memória em repouso, a expressão de BCL6 e Blimp-1 é baixa. Os sinais que desencadeiam a diferenciação originam uma regulação positiva da Blimp-1, e esta Blimp-1 neutraliza a expressão de BCL6. A etapa em que tanto o BCL6 como a Blimp-1 são expressas é de curta duração e é chamado um plasmablasto. Com os niveis progressivamente crescentes de Blimp-1, a expressão de BCL6 é anulada, resultando uma célula plasmática.

Pode ser proporcionada uma célula produtora de anticorpos específicos para RSV em que o BCL6 e a Blimp-1 são coexpressos (o que significa que tanto o BCL6 como a Blimp-1 são expressos na referida célula produtora de anticorpos durante pelo menos 1 dia, preferencialmente pelo menos uma semana, mais preferencialmente pelo menos seis semanas, muito preferencialmente pelo menos três meses. A referida célula produtora de anticorpos específicos para RSV é capaz de proliferar quando é proporcionado um sinal apropriado. Verificou-se que a coexpressão de BCL6 e Blimp-1 resulta numa célula produtora de anticorpos que é capaz de proliferar e produzir anticorpos. 0 BCL6 e a Blimp-1 são preferencialmente coexpressos numa célula B, preferencialmente uma célula B humana. A coexpressão de BCL6 e Blimp-1 numa célula B resulta na estabilização da referida célula B numa etapa semelhante a plasmablasto. Os plasmablastos, tal como as células plasmáticas, são capazes de segregar anticorpos. No entanto, os plasmablastos ainda são capazes de proliferar, enquanto as células plasmáticas perderam a sua capacidade de proliferar. As células plasmáticas são, portanto, impróprias para cultivar linhas de células produtoras de anticorpos.

Uma célula produtora de anticorpos especificos para RSV pode compreender uma sequência de ácido nucleico exógena que codifica o BCL6 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo. Um ácido nucleico exógeno é aqui definido como uma sequência de ácido nucleico que não faz naturalmente parte do genoma de uma célula. Com esta molécula de ácido nucleico exógena é possivel regular a concentração de BCL6 numa célula produtora de anticorpos independentemente da expressão de BCL6 endógeno. Assim, mesmo que a expressão de BCL6 endógeno seja baixa ou esteja ausente, por exemplo provocada pela Blimp-1, uma sequência de ácido nucleico exógena que codifica o BCL6 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo, continua a ser capaz de produzir uma concentração de BCL6 que é suficiente para influenciar a estabilidade de uma célula produtora de anticorpos. Preferencialmente, a referida sequência de ácido nucleico que codifica o BCL6 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo é constitutivamente ativa, para que a expressão de BCL6 seja mantida mesmo quando a expressão de BCL6 endógeno da referida célula é inibida por um repressor endógeno, tal como Blimp-1. Muito preferencialmente, a expressão da referida sequência de ácido nucleico que codifica o BCL6 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo é regulada por um indutor exógeno do repressor, para que o grau de expressão de BCL6 seja regulado à vontade.

Preferencialmente, como delineado abaixo em mais pormenor, uma célula produtora de anticorpos especificos para RSV pode compreender uma sequência de ácido nucleico exógena que codifica a Bcl-xL ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma. Se estiver presente Bcl-xL ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma, é possível cultivar os plasmablastos sob condições de baixa densidade celular. A expressão da referida sequência de ácido nucleico que codifica a Bcl-xL ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma é preferencialmente regulada por um indutor exógeno do repressor, para que o grau de expressão de Bcl-xL seja regulado à vontade. É aqui divulgada uma célula produtora de anticorpos específicos para RSV que compreende: - uma sequência de ácido nucleico exógena que codifica o BCL6 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo, e/ou - uma sequência de ácido nucleico exógena que codifica a Bcl-xL ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma. A referida célula produtora de anticorpos específicos para RSV compreende preferencialmente tanto uma sequência de ácido nucleico exógena que codifica o BCL6 - ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo - e uma sequência de ácido nucleico exógena que codifica a Bcl-xL - ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma. Preferencialmente, a expressão da referida sequência de ácido nucleico que codifica o BCL6, Bcl-xL ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo de BCL6 ou Bcl-xL é regulada por um ativador e/ou repressor que é induzível por um composto exógeno. Por exemplo, é utilizado um sistema promotor induzível tal como um sistema Tet-on ou Tet-off.

Uma célula produtora de anticorpos específicos para RSV estável pode ser gerada coexpressando o BCL6 e a Blimp-1 numa célula produtora de anticorpos específicos para RSV. Uma célula produtora de anticorpos específicos para RSV é preferencialmente obtida a partir de um indivíduo que foi exposto ao RSV. Os métodos para isolar células produtoras de anticorpos são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, os compostos derivados de RSV que são marcados com um marcador e/ou etiqueta são incubados com uma amostra de um indivíduo que foi exposto ao RSV, amostra essa que compreende células produtoras de anticorpos. As células produtoras de anticorpos específicos para RSV que reconhecem os compostos derivados de RSV marcados são isolados, enquanto as células não ligadas são eliminadas por lavagem. As células produtoras de anticorpos específicos para RSV resultantes são subsequentemente estabilizadas pela coexpressão de BCL6 bem como de Blimp-1.

As células produtoras de anticorpos totais de um doador exposto ao RSV podem ser primeiro estabilizadas e, em seguida, as células que reconhecem o composto derivado de RSV marcado isoladas. Alternativamente, as células produtoras de anticorpos são munidas de um marcador (fluorescente) a jusante do seu recetor de células B (BCR, forma expressa na membrana do anticorpo) que sinaliza quando a célula produtora de anticorpos liga um antigénio não etiquetado/não marcado através do BCR. As células produtoras de anticorpos às quais está ligado o marcador são selecionadas e são subsequentemente estabilizadas por coexpressão de BCL6 bem como de Blimp-1. Quando não existem compostos derivados de antigénio disponíveis mas quando existem ensaios disponíveis para pesquisar anticorpos únicos, as células produtoras de anticorpos totais/a granel podem ser estabilizadas por coexpressão de BCL6 bem como de Blimp-1 e, opcionalmente, também Bcl-XL. Por conseguinte, as células são cultivadas a baixas densidades, preferencialmente entre 10 e 100 células por 96 poços, na presença de células L (miniculturas a granel, MBC) . Os sobrenadantes das culturas podem ser utilizados diretamente em ensaios de triagem, como ELISA, transferência de Western ou ensaios funcionais como ELISPOT, ensaios de neutralização ou ensaios de migração celular. As MBC podem ser selecionadas e, para se obter linhas de células monoclonais da célula produtora de anticorpos de interesse, são pré-preparadas culturas de diluição limitante e, preferencialmente, 2-3 semanas mais tarde, os sobrenadantes daquelas culturas são novamente pesquisados no ensaio preferido.

Como é bem conhecido pelo especialista, estão disponíveis na técnica muitos métodos alternativos. Os métodos supramencionados são não limitativos.

Por conseguinte, é ainda divulgado um método de produção de uma célula produtora de anticorpos, a qual é estável durante pelo menos três meses e que é capaz de produzir anticorpos específicos contra o RSV ou equivalentes funcionais dos mesmos, em que o método compreende: aumentar um nível de expressão de Blimp-1 numa célula que é capaz de produzir anticorpos específicos contra o RSV ou equivalentes funcionais dos mesmos; e aumentar e/ou manter um nível de expressão de BCL6 na referida célula.

Tornou-se possível converter uma célula B de memória específica para RSV numa célula de plasmablasto análoga e estabilizar a referida célula, para que não ocorra diferenciação rápida numa célula plasmática. Isto é oposto ao desenvolvimento natural de células plasmáticas, em que a expressão de Blimp-1 numa célula B de memória resulta na evolução rápida para uma célula plasmática, inibindo, desse modo, a expressão de BCL6 pelo que a célula plasmática resultante dificilmente expressa BCL6. Uma forma de divulgação envolve assim a coexpressão de BCL6 e Blimp-1 numa célula B específica para RSV, resultando numa célula que é capaz de proliferar e produzir anticorpos. 0 nivel de expressão de BCL6 na referida célula B específica para RSV é preferencialmente provocado e mantido essencialmente ao mesmo nível ou a um nível mais alto em comparação com um plasmablasto. Deste modo é gerada uma cultura estável de células B específicas para RSV, células essas que permanecem capazes de produzir anticorpos específicos contra o RSV. Estas células B específicas para RSV que coexpressam BCL6 e Blimp-1 são ainda preferencialmente estabilizadas através da adição do gene antiapoptótico Bcl-xL. Com a introdução de Bcl-xL é agora possível cultivar plasmablastos sob condições de baixa densidade celular. Assim, a invenção também proporciona um método para cultivar plasmablastos sob condições de baixa densidade celular que compreende gerar uma célula produtora de anticorpos específicos para RSV com níveis de expressão de BCL6, Blimp-1 e Bcl-xL com qualquer um dos métodos aqui descritos. A quantidade de produto de expressão BCL6 (preferencialmente uma proteína BCL6) numa célula produtora de anticorpos específicos para RSV é regulada de uma diversidade de maneiras.

Uma célula produtora de anticorpos pode ser divulgada com um composto capaz de influenciar, direta ou indiretamente, a expressão de BCL6. Uma célula produtora de anticorpos é preferencialmente divulgada com um composto capaz de aumentar a expressão de BCL6, para neutralizar a regulação negativa de BCL6 durante a expressão de Blimp-1. Tal composto compreende preferencialmente uma proteína Transdutora de sinais de Ativação e Transcrição 5 (STAT5) ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma, e/ou uma sequência de ácido nucleico que codifica para a mesma. A STAT5 é um transdutor de sinal capaz de aumentar a expressão de BCL6. Existem duas formas conhecidas de STAT5, STAT5a e STAT5b, as quais são codificadas por dois genes ligados em tandem diferentes. A administração e/ou a ativação da STAT5 resulta em níveis aumentados de BCL6. Assim, a regulação negativa de BCL6 pela Blimp-1 é, pelo menos em parte, compensada pela regulação positiva da expressão de BCL6 pela STAT5 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma. Assim, a STAT5 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma é capaz de influenciar diretamente a expressão de BCL6. É também possível influenciar indiretamente a expressão de BCL6. Isto é, por exemplo, feito regulando a quantidade de um composto que, por sua vez, é capaz de ativar direta ou indiretamente a STAT5 e/ou regulando a expressão de STAT5. Deste modo, a expressão e/ou atividade da STAT5 endógena e/ou exógena é aumentada. Por exemplo, é possível melhorar indiretamente a expressão de BCL6 cultivando uma célula produtora de anticorpos na presença de interleucina (IL) 2 e/ou IL 4 que são capazes de ativar a STAT5.

Uma célula produtora de anticorpos específicos para RSV pode compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica a STAT5 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma, em que a referida sequência de ácido nucleico é constitutivamente ativa, o que significa que a STAT5 é expressa continuamente, independentemente da presença de reguladores (endógenos). No caso de a expressão de STAT5 endógena ser baixa, ou estar ausente, é preferencialmente aplicada uma sequência de ácido nucleico constitutivamente ativa exógena que codifica a STAT5 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma, que resulte numa concentração de STAT5 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma que seja suficiente para melhorar a expressão de BCL6. Muito preferencialmente, uma célula produtora de anticorpos específicos para RSV pode compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica um composto que compreende a STAT5 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma, preferencialmente uma proteína de fusão, cuja atividade é regulada por um indutor exógeno do repressor, para que o grau de ativação de expressão de BCL6 seja regulado à vontade. Outro sistema que permite a indução de BCL-6 é proporcionado por um sistema Tet-on, no qual a adição de tetraciclina e/ou derivados de tetraciclina induz a atividade de um transativador que induzia a transcrição do gene de BCL6 seguida de síntese da proteína BCL. Numa forma de realização preferida da divulgação, uma célula produtora de anticorpos pode compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica um recetor de estrogénio (ER) e STAT5 como uma proteína de fusão ER-STAT5. Esta proteína de fusão é inativo porque formas um complexo com proteínas de choque térmico no citosol. Desta maneira, a STAT5 não é capaz de atingir o núcleo e a expressão de BCL6 não é aumentada. Após administração do indutor exógeno 4 hidroxi-tamoxifeno (4HT), a proteína de fusão ER-STAT5 dissocia-se das proteínas de choque térmico, para que a STAT5 seja capaz de entrar no núcleo e ativar a expressão de BCL6.

Adicionalmente, ou alternativamente, a expressão de BCL6 numa célula produtora de anticorpos específicos para RSV é aumentada cultivando a referida célula produtora de anticorpos na presença de um composto capaz de aumentar, direta ou indiretamente, a expressão de BCL6. É aqui divulgado um método de produção de uma célula produtora de anticorpos específicos para RSV que compreende: proporcionar uma célula produtora de anticorpos específicos para RSV com um composto capaz de aumentar, direta ou indiretamente, a expressão de BCL6; e/ou cultivar uma célula produtora de anticorpos específicos para RSV na presença de um composto capaz de aumentar, direta ou indiretamente, a expressão de BCL6. 0 referido composto capaz de aumentar, direta ou indiretamente, a expressão de BCL6 compreende preferencialmente a STAT5 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma.

Por conseguinte, é divulgado um método que compreende proporcionar a referida célula produtora de anticorpos específicos para RSV com STAT5 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo dos mesmos, ou com uma sequência de ácido nucleico que codifica a STAT5 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma. A referida célula produtora de anticorpos pode ser cultivada após introdução de uma sequência de ácido nucleico que codifica a STAT5 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma na referida célula. A referida sequência de ácido nucleico é, por exemplo, introduzida na referida célula por transfeção e/ou transferência de genes mediada por vírus. Na técnica estão disponíveis muitos métodos alternativos de introdução de uma sequência de ácido nucleico numa célula, o que não necessita de explicações adicionais neste documento.

Com um composto capaz de aumentar, direta ou indiretamente, a expressão de BCL6 é possível melhorar a expressão de BCL6 endógeno. No entanto, uma célula produtora de anticorpos pode compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica o BCL6 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo. Como se explicou acima, um ácido nucleico exógeno que codifica o BCL6 é preferido porque este permite a regulação de uma concentração de BCL6 dentro de uma célula independentemente da expressão de BCL6 endógeno. Deste modo, mesmo que a expressão de BCL6 endógeno seja baixa ou ausente, por exemplo provocada pela Blimp-1, uma sequência de ácido nucleico exógena que codifique o BCL6 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo continua a ser capaz de produzir uma concentração de BCL6 que é suficiente para influenciar a estabilidade de uma célula produtora de anticorpos. Por conseguinte, é também divulgado um método que compreende proporcionar uma célula produtora de anticorpos específicos para RSV com uma sequência de ácido nucleico que codifica o BCL6 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo. Preferencialmente, a referida célula produtora de anticorpos é proporcionada com uma sequência de ácido nucleico constitutivamente ativa que codifica o BCL6 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo, para que a expressão de BCL6 seja mantida mesmo quando a expressão de BCL6 endógeno da referida célula é inibida por um repressor endógeno tal como Blimp-1. Muito preferencialmente, a expressão da referida sequência de ácido nucleico que codifica o BCL6 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo é regulada por um indutor exógeno do repressor, para que o grau de expressão de BCL6 seja regulado à vontade. Por exemplo, é utilizado um sistema promotor induzível tal como um sistema Tet-on ou Tet-off, como já foi descrito. É também divulgado um método em que a quantidade de BCL6 é indiretamente regulada proporcionando uma célula produtora de anticorpos específicos para RSV com uma sequência de ácido nucleico que codifica a E47 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma. 0 E47 codifica um fator de transcrição que pertence a uma familia de proteínas hélice-ansa-hélice, denominadas proteínas E. Existem quatro proteínas E, E12, E47, E2-2 e HEB, as quais estão envolvidas no desenvolvimento de linfócitos. A E12 e a E47 são codificadas por um gene, denominado E2A, que sofre excisão-união diferenciada. As proteínas E podem ser inibidas pelo inibidor de proteinas E Id2, e Id3, e pelo ABF-I (Mathas S., 2006). As proteinas E foram descritas como supressores de tumores e foi demonstrado que a sobreexpressão induz a apoptose. Um dos alvos específicos de E47 são os genes Socsl e Socs3. Esses genes Soes são conhecidos como reguladores negativos de STAT[delta]b e, desse modo, indiretamente de BCL6. Por outras palavras, a expressão de E47 dentro de uma célula B melhora a expressão de Blimp-1, o que resulta na diferenciação de células B para um fenótipo produtor de anticorpos (célula plasmática). A quantidade de expressão de Blimp-1 numa célula produtora de anticorpos específicos para RSV é também regulada de uma diversidade de maneiras. É proporcionado uma célula produtora de anticorpos específicos para RSV com um composto capaz de influenciar, direta ou indiretamente, a expressão de Blimp-1. Adicionalmente, ou alternativamente, uma célula produtora de anticorpos é cultivada na presença de um composto capaz de influenciar, direta ou indiretamente, a expressão de Blimp-1. Por conseguinte, é ainda divulgado um método que compreende proporcionar uma célula produtora de anticorpos específicos para RSV com um composto capaz de influenciar, direta ou indiretamente, a expressão de Blimp-1. É ainda divulgado um método que compreende cultivar a referida célula produtora de anticorpos na presença de um composto capaz de influenciar, direta ou indiretamente, a expressão de Blimp-1. Pode ser utilizado um composto que seja capaz de aumentar a expressão de Blimp-1 para neutralizar a regulação negativa de Blimp-1 durante a expressão de BCL6. O referido composto compreende muito preferencialmente IL-21. O referido composto capaz de influenciar, direta ou indiretamente, a expressão de Blimp-1 pode compreender uma proteína Transdutora de sinais de Ativação e Transcrição 3 (STAT3) ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma, e/ou uma sequência de ácido nucleico que codifica a mesma. A STAT3 é um transdutor de sinal que está envolvido no desenvolvimento e diferenciação de células B. A STAT3 é capaz de regular positivamente a expressão de Blimp-1. Por conseguinte, é ainda divulgado um método em que o referido composto capaz de influenciar, direta ou indiretamente, a expressão de Blimp-1 compreende STAT3 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma, ou uma sequência de ácido nucleico que codifica a STAT3 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma. Muito preferencialmente, a expressão da referida sequência de ácido nucleico que codifica a STAT3 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma é regulada por um indutor exógeno do repressor, para que o grau de expressão de STAT3 seja regulado à vontade. Por exemplo, é utilizado um sistema promotor induzível tal como, por exemplo, um sistema Tet-on ou Tet-off. Um produto de fusão que compreende a STAT3, um derivado ou análogo, e ER pode ser introduzido na referida célula permitindo a regulação da expressão de STAT3 pelo hidroxitamoxifeno.

Uma vez que a STAT3 é capaz de influenciar a expressão de Blimp-1, é também possível regular indiretamente a expressão de Blimp-1 administrando um composto capaz de regular, direta ou indiretamente, a atividade e/ou a expressão de STAT3. Pode ser proporcionado uma célula produtora de anticorpos com um composto que é capaz de aumentar a atividade de STAT3, para que a expressão de Blimp-1 seja também aumentada indiretamente. Por conseguinte, é ainda proporcionado um método em que é proporcionada uma célula produtora de anticorpos com um composto capaz de aumentar, direta ou indiretamente, a atividade de STAT3.

Pode ser proporcionada uma célula produtora de anticorpos com um composto capaz de ativar, direta ou indiretamente, a STAT3, para aumentar a expressão de Blimp-1. A STAT3 é ativada de uma variedade de maneiras. Preferencialmente, a STAT3 é ativada proporcionando uma célula produtora de anticorpos com uma citocina. As citocinas, estando naturalmente envolvidas na diferenciação de células B, são muito eficazes na regulação de proteínas STAT. Os ativadores muito eficazes de STAT3 são IL-21 e IL-6, mas também é conhecido que as IL-2, IL-7, IL-10, IL-15 e IL-27 ativam a STAT3. Além do mais, os recetores de tipo Toll (TLRs) que estão envolvidos na imunidade inata são também capazes de ativar a STAT3. Por conseguinte, uma forma de realização desta divulgação proporciona um método em que o referido composto capaz de influenciar, direta ou indiretamente, a expressão de Blimp-1 compreende IL-21, IL-2, IL-6, IL-7, IL-10, IL-15 e/ou IL-27. Muito preferencialmente é utilizada a IL-21, uma vez que a IL-21 é particularmente adequada para influenciar a estabilidade de uma célula produtora de anticorpos. A IL-21 é capaz de regular positivamente a expressão de Blimp-1, mesmo quando a expressão de Blimp-1 é neutralizada pelo BCL6.

Adicionalmente, ou alternativamente uma Janus cinase (JAK) mutada é utilizada para ativar a STAT3. Naturalmente, uma JAK é capaz de fosforilar a STAT3, depois de ela mesmo ter sido ativada por, pelo menos, uma citocina. Uma Janus cinase mutada capaz de ativar a STAT3, independentemente da presença de citocinas, é particularmente adequada num método aqui divulgado.

Como já se explicou atrás, um composto capaz de aumentar a expressão de Blimp-1 pode compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica a STAT3 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma. A presença de uma sequência de ácido nucleico exógena que codifica a STAT3 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma permite uma presença continua de STAT3 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma, mesmo quando a expressão de STAT3 endógena é muito baixa ou ausente. É também possível diminuir a expressão e/ou atividade de STAT5 para regular positivamente a Blimp-1. Se a quantidade e/ou atividade de STAT5 é reduzida, a ativação da expressão de BCL6 é também reduzida, o que resulta numa menor quantidade de produto de expressão BCL6. Uma vez que o BCL6 e a Blimp-1 contrabalançam a expressão um do outro, uma menor quantidade do produto de expressão BCL6 resulta numa maior quantidade do produto de expressão Blimp-1. Os compostos capazes de regular negativamente a atividade de STAT5 são, desse modo, capazes de regulação indireta positiva da Blimp-1. Tais compostos compreendem, por exemplo, os membros do supressor das proteínas de sinalização de citocinas (SOCS). Por conseguinte, a quantidade do produto de expressão Blimp-1 numa célula produtora de anticorpos específicos para RSV pode ser regulada positivamente proporcionando a referida célula com uma proteina SOCS, e/ou ativando uma proteina SOCS dentro da referida célula. A expressão e/ou atividade de STAT5 pode ser diminuída quando uma célula produtora de anticorpos específicos para RSV é proporcionada com uma sequência de ácido nucleico que codifica a E47 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma. A expressão de E47 dentro das células B que expressam niveis altos de STAT[delta]b interfere com a diferenciação e proliferação, isto é, o bloqueio da STAT5 através de E47 e SOCS resulta em niveis de BCL6 reduzidos e, subsequentemente, em niveis de Blimp-1 aumentados. Os níveis regulados positivamente de Blimp-1 resultam numa proliferação diminuída e numa diferenciação da célula envolvida numa célula produtora de anticorpos. Por outras palavras, a expressão de E47 dentro de uma célula B melhora a expressão de Blimp-1, o que resulta na diferenciação de células B para um fenótipo produtor de anticorpos (célula plasmática).

Por pelo menos uma parte funcional de uma proteína STAT5, uma proteína STAT3, Bcl-xL e/ou BCL6, entende-se uma molécula proteica que tem a mesma capacidade - em tipo, não necessariamente em quantidade - de influenciar a estabilidade de uma célula produtora de anticorpos em comparação com uma proteína STAT5, uma proteína STAT3, Bcl-xL e/ou BCL6, respetivamente. Uma parte funcional de uma proteína STAT5 ou uma proteína STAT3 está, por exemplo, desprovida de aminoácidos que não estão, ou estão apenas muito pouco, envolvidos na referida capacidade. Um derivado de uma proteína STAT5, uma proteína STAT3, Bcl-xL e/ou BCL6 é definido como uma proteína que foi alterada de tal forma que a capacidade da referida proteína para influenciar a estabilidade de uma célula produtora de anticorpos é essencialmente a mesma em tipo, não necessariamente em quantidade. Um derivado é proporcionado de muitas maneiras, por exemplo, através da substituição conservadora de aminoácidos em que um aminoácido está substituído por outro aminoácido com propriedades geralmente semelhantes (tamanho, hidrofobicidade, etc), de tal forma que o funcionamento global não é provavelmente afetado de forma grave. Um derivado compreende, por exemplo, uma proteína de fusão, tal como uma proteína de fusão STAT5-ER ou STAT3-ER, cuja atividade depende da presença de 4 hidroxi-tamoxifeno (4HT). Um análogo de uma proteína STAT5, uma proteína STAT3, Bcl-xL e/ou BCL6 é definido como uma molécula que tem a mesma capacidade de influenciar a estabilidade de uma célula produtora de anticorpos em tipo, não necessariamente em quantidade. 0 referido análogo não é necessariamente derivado da referida proteína STAT5, proteína STAT3, Bcl-xL e/ou BCL6. A referida célula produtora de anticorpos específicos para RSV pode ser cultivada na presença de IL-21, antes de a referida célula produtora de anticorpos ser proporcionada com uma sequência de ácido nucleico que codifica o BCL6 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo. É preferido cultivar as células produtoras de anticorpos específicos para RSV, preferencialmente células B, na presença de IL-21, antes da referida célula ser proporcionada com uma sequência de ácido nucleico que codifica o BCL6 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo, porque a estabilidade, proliferação e/ou produção de anticorpos é particularmente bem melhorada. A divulgação proporciona um método para influenciar a estabilidade de uma célula produtora de anticorpos específicos para RSV como aqui descrito, que compreende ainda aumentar, direta ou indiretamente, a quantidade de produto de expressão Bcl-xL dentro da referida célula produtora de anticorpos. Isto é, por exemplo, conseguido proporcionando a referida célula produtora de anticorpos com uma sequência de ácido nucleico que codifica a Bcl-xL ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma ou com sequências de ácidos nucleicos que codificam outros genes antiapoptóticos incluindo, mas não se limitando a, Bcl-2. Ainda noutra forma de realização desta divulgação, isto é conseguido proporcionando a referida célula produtora de anticorpos com um composto capaz de aumentar, direta ou indiretamente, a expressão de Bcl-xL, preferencialmente o referido composto compreende APRIL, BAFF, CD40, estimulação de BCR, citocinas, fatores de crescimento ou efetores a jusante como JNK e ART (PKB). A Bcl-xL é um membro da família de Bcl-2 antiapoptóticas, as proteínas Bcl2 interagem e neutralizam os chamados membros da família apenas de domínio 3 de homologia para Bcl-2 (BH3) , tais como Bax, Bak, Bim e Bad, os quais induzem a libertação de citocromo c após estímulos de morte intrínseca (Boise, L. H., 1993). Assim, a proteção da integridade da membrana das mitocôndrias através de proteínas como a Bcl-xL é crítica para a sobrevivência celular.

Foi demonstrado que a ativação de STAT5 protege as células da morte celular. Foi demonstrado que a STAT5 regula a expressão de Bcl-xL, apoiando um papel antiapoptótico para a STAT5. A STAT5 regula positivamente a expressão de Bcl-xL através de elementos de ligação STAT dentro do promotor de Bcl-xL. In vivo, a expressão de Bcl-xL está ausente na medula óssea de ratos com deficiência dupla de STAT5A/B. Além disso, a sobrevivência de eritroblastos mediada pela STAT5 é dependente da regulação positiva de Bcl-xL. Recentemente, foi demonstrado que a sobreexpressão transgénica de Bcl-xL em células B de rato promove a sobrevivência de células B e os focos de células plasmáticas não malignas.

Um método desta divulgação é particularmente adequado para produzir uma cultura de células que compreende células produtoras de anticorpos específicos para RSV que são capazes de ser utilizadas para produzir uma cultura de células B ex vivo. A referida célula B de memória é preferencialmente humana pelo que são produzidos anticorpos humanos. A referida célula B tem preferencialmente prigem num indivíduo, indivíduo esse que foi previamente exposto ao Vírus Sincicial Respiratório. As células B específicas para RSV podem ser isoladas a partir de uma amostra de sangue periférico e/ou um amostra de amígdala, utilizando métodos conhecidos na técnica. As células B de memória são, por exemplo, isoladas por seleção (classificação com esférulas magnéticas) para o marcador de células B CD19 e/ou CD22 e seleção (subsequente) para IgG e/ou CD27 na superfície celular e/ou por seleção negativa para a IgM, IgD e/ou IgA. Numa célula B de centro germinativo, a expressão de BCL6 é alta, enquanto a expressão de Blimp-1 é baixa. A evolução natural para uma célula secretora de anticorpos envolve a regulação positiva da expressão de Blimp-1. Uma vez que a Blimp-1 reprime a expressão de BCL6, a regulação positiva de Blimp-1 resulta na regulação negativa de BCL6 numa situação natural. No entanto, a expressão de Blimp-1 é regulada positivamente, enquanto a expressão de BCL6 é, pelo menos em parte, mantida. Isto resulta numa célula produtora de anticorpos específicos para RSV em que o BCL6 e a Blimp-1 são coexpressos. A referida célula produtora de anticorpos específicos para RSV é capaz de proliferar e segregar anticorpos anti-RSV e é, por conseguinte, adequada para utilização num cultura de células B ex vivo. A referida célula produtora de

anticorpos pode ser protegida por apoptose pela Bcl-xL. Uma célula produtora de anticorpos específicos para RSV proporciona a vantagem de que é estável e não sofre de diferenciação terminal durante um período prolongado. A referida célula produtora de anticorpos é estável durante pelo menos uma semana, preferencialmente durante pelo menos um mês, mais preferencialmente durante pelo menos três meses, muito preferencialmente durante pelo menos seis meses. Uma célula B é preferencialmente cultivada na presença de CD40L, uma vez que a replicação da maioria das células B é favorecida pela CD40L. A expressão de BCL6 pode ser mantida essencialmente ao mesmo nivel, ou a um nivel mais alto, em comparação com uma célula B de centro germinativo, uma vez que uma expressão significativa de BCL6, em conjunto com expressão de Blimp-1, resulta numa célula produtora de anticorpos com proliferação e propriedades de produção de anticorpos e/ou estabilidade preferidas. A referida expressão de BCL6 e/ou expressão de Blimp-1 pode ser acompanhada da expressão de Bcl-xL, resultando em proliferação e propriedades de produção de anticorpos e/ou estabilidade ainda mais preferidas. É aqui divulgado um método de produção de uma célula produtora de anticorpos específicos para RSV que é estável durante pelo menos uma semana, preferencialmente durante pelo menos um mês, mais preferencialmente durante pelo menos três meses, mais preferencialmente durante pelo menos seis meses, em que o método compreende: proporcionar uma célula B de memória especifica para RSV; aumentar um nivel de expressão de Blimp-1 na referida célula; e aumentar e/ou manter um nivel de expressão de BCL6 na referida célula. É também proporcionado um método de produção ex vivo de uma célula produtora de anticorpos específicos para RSV que compreende aumentar um nível de expressão de Blimp-1 numa célula B de memória específica para RSV e aumentar e/ou manter um nível de expressão de BCL6 na referida célula. Os referidos níveis de expressão de BCL6 e Blimp-1 são preferencialmente provocados, e/ou mantidos, essencialmente ao mesmo nível, ou a um nível mais alto, em comparação com um plasmablasto. A referida célula B pode ser transduzida com BCL6 e Bcl-xL. Por conseguinte é ainda proporcionado um método de produção de uma célula produtora de anticorpos específicos para RSV que é estável durante pelo menos três meses, que compreende: proporcionar uma célula B capaz de produzir anticorpos específicos contra o RSV com BCL6, ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo; e proporcionar a referida célula B com Bcl-xL ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma; e cultivar a referida célula B. A referida célula B é preferencialmente proporcionada com uma sequência de ácido nucleico que codifica o BCL6, ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo, e com uma sequência de ácido nucleico Bcl-xL ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma. A referida célula B é preferencialmente cultivada na presença de um composto capaz de aumentar a expressão de Blimp-1, tal como, por exemplo, IL-21, IL-2, IL-6, 11-7, IL-IO, IL-15, IL-27, ou uma Janus cinase mutada.

Preferencialmente, é utilizada a IL-21 porque esta citocina é particularmente adequada para melhorar a expressão de Blimp-1 e estabilizar uma célula produtora de anticorpos com um método aqui divulgado. Além do mais, para aumentar a eficácia de transdução, a referida célula B é preferencialmente cultivada na presença de IL-21 antes da referida célula B ser transduzida com uma sequência de ácido nucleico que codifica o BCL6 e/ou Bcl-xL, ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo dos mesmos. A referida célula B é proporcionada com uma proteína SOCS ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma, ou um ácido nucleico que codifica a mesma, uma vez que uma proteína SOCS ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma é capaz de aumentar indiretamente a expressão de Blimp-1. Noutra forma de realização alternativa ou adicional desta divulgação, a referida célula B é proporcionado com E47 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma, ou um ácido nucleico que codifica a mesma. Como já foi referido antes, como consequência de um nível aumentado de E47 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma, a função da proteína Soes é melhorada e a expressão de Blimp-1 é indiretamente aumentada.

Nos exemplos são apresentadas formas de realização particularmente preferidas da divulgação. De acordo com uma forma de realização particularmente preferida da divulgação, as células B específicas para RSV são primeiramente cultivadas na presença de IL-21. Subsequentemente, as células B são submetidas a uma reação de transdução utilizando um ácido nucleico que codifica o BCL6 e um ácido nucleico que codifica a Bcl-xL. Preferencialmente, é utilizada transdução centrífuga. Muito preferencialmente, as células B e o vírus que compreende pelo menos um ácido nucleico de interesse são misturados, após o que a mistura é centrifugada para se conseguir uma alta eficácia de transdução. Após transdução, as células B são cultivadas na ausência de IL-21 e na presença de IL-4 e células L durante 3-5 dias para permitir a expressão de BCL6. Subsequentemente, as células B podem ser submetidas novamente a uma reação de transdução utilizando um ácido nucleico que codifica o BCL6 e um ácido nucleico que codifica a Bcl-xL. Depois, as células B são novamente cultivadas na ausência de IL-21 e na presença de IL-4 e células L durante 3-5 dias para permitir a expressão de BCL6. Subsequentemente, as células que expressam BCL6 e Bcl-xL são isoladas e é novamente administrada IL-21 à cultura para aumentar a replicação e produção de anticorpos. Os anticorpos que são segregados por células que expressam Bcl-6, Blimp 1 e Bcl-XL no sobrenadante da cultura são preferencialmente pesquisados quanto à capacidade neutralizante/atividade/reatividade contra a RSV in vitro. As células produtoras de anticorpos que produzem aqueles anticorpos são ainda preferencialmente selecionadas, por exemplo por cultura de diluição limitante. São assim obtidas células B especificas para RSV estáveis em que são coexpressos o BCL6 e a Blimp-1. As referidas células B são capazes de replicar-se e produzir anticorpos numa cultura in vitro durante pelo menos seis meses. É aqui divulgado um método que compreende ainda a seleção e/ou isolamento de um anticorpo especifico para RSV ou um equivalente funcional do mesmo. As células produtoras de IgM e as células produtoras de IgG podem ser selecionadas e/ou isoladas. Preferencialmente, é selecionada e/ou isolado uma célula produtora de IgG.

As células produtoras de anticorpos específicos para RSV geradas com um método aqui divulgado são adequadas para produzir anticorpos contra RSV. No entanto, os genes que codificam as cadeias pesadas e/ou leves da Ig são isolados a partir da referida célula e expressos numa segunda célula, tal como, por exemplo, células de uma linha de células de ovário de hamster Chinês (CHO) ou células 293(T). A referida segunda célula, também aqui chamada uma célula produtora, é preferencialmente adaptada à produção comercial de anticorpos. A proliferação da referida célula produtora resulta numa linha de células produtoras capaz de produzir anticorpos específicos contra o RSV. Preferencialmente, a linha de células produtoras é adequada para produzir compostos para utilização em humanos. Assim, a referida linha de células produtoras é preferencialmente isenta de agentes patogénicos tais como microrganismos patogénicos.

Um método aqui divulgado é preferencialmente utilizado para gerar uma célula produtora de anticorpos que é estável durante pelo menos uma semana, preferencialmente pelo menos um mês, mais preferencialmente pelo menos três meses, mais preferencialmente pelo menos seis meses para que a produção comercial de anticorpos se torne possível. Muito preferencialmente, é produzida uma linha de células estáveis capaz de produzir anticorpos monoclonais. Isto é preferencialmente realizado utilizando células B de memória que foram, por exemplo, isoladas a partir de uma amostra por seleção para CD19 e/ou CD22 (marcador de células B) e IgG e/ou CD27 na superfície celular (para marcar células de memória) e/ou por seleção negativa para IgM, IgD e/ou IgA. Além disso, uma célula produtora de anticorpos específicos para RSV é, por exemplo, selecionada num ensaio de ligação que utiliza RSV ou um componente derivado de RSV, tal como, por exemplo, a proteína F, proteína G e/ou proteína SH de RSV. Subsequentemente, a Blimp-1 e o BCL6 podem ser coexpressos na referida célula produtora de anticorpos específicos para RSV, resultando numa cultura de células capazes de ligarem especificamente (um componente de) RSV. Ainda noutra forma de realização preferida da divulgação, a referida célula B é ainda proporcionada com Bcl-xL ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma.

Se for utilizada apenas uma célula de memória é obtida uma linha de células que produz anticorpos monoclonais. É também possível gerar uma linha de células produtora de anticorpos monoclonais começando com células B capazes de produzir anticorpos contra RSV. Depois de se ter produzido uma cultura de células B estáveis com um método aqui divulgado, uma célula B capaz de produzir anticorpos contra um antigénio especifico de RSV é isolada e, pelo menos, uma parte funcional de um gene que codifica a cadeia pesada e/ou cadeia leve de Ig da referida célula B é preferencialmente expressa numa segunda linha de células. Preferencialmente, pelo menos uma parte funcional do gene que codifica a cadeia pesada de Ig e pelo menos uma parte funcional do gene que codifica a cadeia leve de Ig da referida célula B são expressos numa segunda linha de células.

Uma célula produtora de anticorpos, preferencialmente, mas não necessariamente, uma célula B de memória, que foi obtida de um indivíduo que foi previamente exposto ao RSV, pode ser utilizada num método desta divulgação. Deste modo, tornou-se possível produzir anticorpos humanos de interesse ex vivo.

Por conseguinte, é ainda divulgado um método de produção de anticorpos que são capazes de ligar especificamente e/ou neutralizar o Vírus Sincicial Respiratório, em que o método compreende: produzir uma célula produtora de anticorpos capaz de produzir anticorpos específicos contra o RSV com um método de acordo com a invenção; e obter os anticorpos produzidos pela referida célula produtora de anticorpos. É também proporcionado um anticorpo isolado ou recombinante, como definido nas reivindicações, bem como uma célula produtora de anticorpos isolada ou recombinante, como definida nas reivindicações que pode ser obtida por um método de acordo com a invenção, como definido nas reivindicações. 0 referido anticorpo compreende preferencialmente o anticorpo D25, AM14, AM16 e/ou AM23.

Uma vez obtida uma célula produtora de anticorpos específicos para RSV de acordo com a invenção, como definida nas reivindicações, uma parte funcional de um gene que codifica a cadeia pesada e cadeia leve de Ig da referida célula é preferencialmente isolada e/ou gerada artificialmente. É proporcionada uma sequência de ácido nucleico que compreende pelo menos uma parte funcional de uma sequência de ácido nucleico como representada na Figura 11, Figura 12, Figura 14A, Figura 14B ou Figura 14C. A referida parte funcional compreende pelo menos uma sequência de ácido nucleico como representada na Figura 11D, Figura 12, Figura 14A, Figura 14B e/ou Figura 14C. A referida parte funcional codifica as CDRs como representadas na Figura HD, Figura 12, Figura 14A, Figura 14B ou Figura 14C. É ainda divulgada uma sequência de ácido nucleico isolada, sintética ou recombinante que compreende uma sequência da cadeia pesada que é pelo menos 70%, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 90% homóloga a, pelo menos, parte da sequência CAGGTGCAGCTGGTACAGTCTGGGGCTGAAGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGATGGT CTC CTGCCAGGCCTCTGGAGGCCCCCTCAGAA, ACTATATTATCAAC, TGGCTACGACAGGCCCCTGGACAAGGCCCTGAGTGGATGGGA, GGGATCATTCCTGTCTTGGGTACAGTACACTACGCACCGAAGTTCCAGGGC, AGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACAGACACAGCCTACATCCATCTGATCAGCCT GAG ATCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCGACG, GAAACAGCTCTGGTTGTATCTACTACCTACCTACCACACTACTTTGACAAC, TGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAG, e/ou

CAGGTGCAGCTGGTACAGTCTGGGGCTGAAGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGATGGT CTC

CTGCCAGGCCTCTGGAGGCCCCCTCAGAAACTATATTATCAACTGGCTACGACAGGCCC

CTG

GACAAGGCCCTGAGTGGATGGGAGGGATCATTCCTGTCTTGGGTACAGTACACTACGCA

CCG

AAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACAGACACAGCCTACATCCA

TCT

GATCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCGACGGAAACAGCTCTGG

TTG TATCTACTACCTACCTACCACACTACTTTGACAACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACC GTC TCCTCAG, em que a referida parte possui pelo menos 15 nucleótidos. A referida sequência da cadeia pesada é preferencialmente derivada do anticorpo D25. A referida sequência da cadeia pesada pode compreender preferencialmente uma sequência que é pelo menos 70%, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 90% homóloga a uma sequência como representada na Figura HD. É também aqui divulgada uma sequência de ácido nucleico isolada, sintética ou recombinante que compreende uma sequência da cadeia pesada que consiste em qualquer das sequências ds cadeia pesada supramencionadas. É também divulgada uma sequência de ácido nucleico isolada, sintética ou recombinante que compreende uma sequência da cadeia leve que é pelo menos 70%, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 90% homóloga a, pelo menos, uma parte da sequência GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCAGCTGTAGGAGACAGAGTCAC CAT CACTTGC, CAGGCGAGTCAGGACATTGTCAACTATTTAAAT, TGGTATCAACAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTAC, GTTGCATCCAATTTGGAGACA,

GGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTTAGTCTCACCATCAG

CAG CCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACATATTATTGT,CAACAATATGATAATCTCCCA, CTCACATTCGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAAAGA e/ou

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCAGCTGTAGGAGACAGAGTCAC

CAT

CACTTGCCAGGCGAGTCAGGACATTGTCAACTATTTAAATTGGTATCAACAGAAACCAG

GGA

AAGCCCCTAAGCTCCTGATCTACGTTGCATCCAATTTGGAGACAGGGGTCCCATCAAGG

TTC

AGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTTAGTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGA

TGT TGCAACATATTATTGTCAACAATATGATAATCTCCCACTCACATTCGGCGGAGGGACCA AGG TTGAGATCAAAAGA, em que a referida parte possui pelo menos 15 nucleótidos. A referida sequência da cadeia leve é preferencialmente derivada do anticorpo D25. A referida sequência da cadeia leve compreende preferencialmente uma sequência que é pelo menos 70%, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 90% homóloga a uma sequência como representada na Figura HD. É também aqui divulgada uma sequência de ácido nucleico isolada, sintética ou recombinante que compreende uma sequência da cadeia pesada que consiste em qualquer uma das sequências das cadeias leves supramencionadas. É ainda divulgada uma sequência de ácido nucleico isolada, sintética ou recombinante que compreende uma sequência da cadeia pesada que é pelo menos 70%, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 90% homóloga a, pelo menos, parte da sequência GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACT CTC CTGTGCGGCCTCT, GGATTCAGCTTCAGTCACTATGCC, ATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGGCAGTT, ATATCTTATGATGGAGAAAATACA, TATTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCTCCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACAC AGT GTCTCTGCAAATGAACAGCCTGAGACCTGAGGACACGGCTCTATATTACTGT, GCGAGAGACCGCATAGTGGACGACTACTACTACTACGGTATGGACGTC, TGGGGCCAAGGGGCCACGGTCACCGTCTCCTCAG e/ou

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACT

CTC

CTGTGCGGCCTCTGGATTCAGCTTCAGTCACTATGCCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTC

CAG

GCAAGGGACTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCTTATGATGGAGAAAATACATATTACGCA

GAC

TCCGTGAAGGGCCGATTCTCCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACAGTGTCTCTGCA

AAT

GAACAGCCTGAGACCTGAGGACACGGCTCTATATTACTGTGCGAGAGACCGCATAGTGG

ACG ACTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGGCCACGGTCACCGTCTCCTCA , em que a referida parte possui pelo menos 15 nucleótidos. A referida sequência da cadeia pesada é preferencialmente derivada do anticorpo AM14. É também aqui divulgada uma sequência de ácido nucleico isolada, sintética ou recombinante que compreende uma sequência da cadeia pesada que consiste em qualquer uma das sequências da cadeia pesada supramencionadas. É também divulgada uma sequência de ácido nucleico isolada, sintética ou recombinante que compreende uma sequência da cadeia leve que é pelo menos 70%, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 90% homóloga a, pelo menos, parte da sequência GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCAC CAT CACTTGCCAGGCGAGT, CAGGACATTAAGAAGTAT, TTAAATTGGTATCATCAGAAACCAGGGAAAGTCCCTGAGCTCCTGATGCAC, GATGCATCC, AATTTGGAAACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGGGGATCTGGGACAGATTTTAC TCT CACCATTAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGGAACATATTACTGT, CAACAGTATGATAATCTGCCTCCGCTCACT, TTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAAC e/ou

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCAC CAT

CACTTGCCAGGCGAGTCAGGACATTAAGAAGTATTTAAATTGGTATCATCAGAAACCAG

GGA

AAGTCCCTGAGCTCCTGATGCACGATGCATCCAATTTGGAAACAGGGGTCCCATCAAGG

TTC

AGTGGCAGGGGATCTGGGACAGATTTTACTCTCACCATTAGCAGCCTGCAGCCTGAAGA

TAT TGGAACATATTACTGTCAACAGTATGATAATCTGCCTCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGA CCA AGGTGGAGATCAAACGAACTGTG, em que a referida parte possui pelo menos 15 nucleótidos. A referida sequência da cadeia leve é preferencialmente derivada do anticorpo AM14. É também aqui divulgada uma sequência de ácido nucleico isolada, sintética ou recombinante que compreende uma sequência da cadeia pesada que consiste em qualquer uma das sequências das cadeias leves supramencionadas. É ainda divulgada uma sequência de ácido nucleico isolada, sintética ou recombinante que compreende uma sequência da cadeia pesada que é pelo menos 70%, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 90% homóloga a, pelo menos, parte da sequência GAGGTGCAGCTGGTGGAGACCGGGGGAGGCCTGGCCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACT CTC CTGTGCAGCCTCT,GGATTCACATTCAGTAGTTATAAC, ATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCACAC, ATTAGTGCGGGTAGTAGTTACATA, TACTACTCAGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCGTCTCCAGAGACAACGTCAGGAACTC AGT ATATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGCTGACACGGCTGTGTATTACTGT, GCGAGAGAGGATTATGGTCCGGGAAATTATTATAGTCCTAACTGGTTCGACCCC, TGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAG e/ou

GAGGTGCAGCTGGTGGAGACCGGGGGAGGCCTGGCCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACT CTC

CTGTGCAGCCTCTGGATTCACATTCAGTAGTTATAACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTC

CAG

GGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCACACATTAGTGCGGGTAGTAGTTACATATACTACTCA

GAC

TCAGTGAAGGGCCGATTCACCGTCTCCAGAGACAACGTCAGGAACTCAGTATATCTGCA

AAT

GAACAGCCTGAGAGCCGCTGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAGGATTATGGTC

CGG GAAATTATTATAGTCCTAACTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTC TCC TCA, em que a referida parte possui pelo menos 15 nucleótidos. A referida sequência da cadeia pesada é preferencialmente derivada do anticorpo AM16. É também aqui divulgada uma sequência de ácido nucleico isolada, sintética ou recombinante que compreende uma sequência da cadeia pesada que consiste em qualquer uma das sequências da cadeia pesada supramencionadas. É também divulgada uma sequência de ácido nucleico isolada, sintética ou recombinante que compreende uma sequência da cadeia leve que é pelo menos 70%, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 90% homóloga a, pelo menos, parte da sequência CAGTCTGTCGTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGAGTCACCAT CTC CTGCACTGGGAGC, AGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGAT, GTACACTGGTACCAGCAGCTTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTAT,GGCAACA CT, AATCGGCCCTCAGGGGTCTCCGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTC CCT GGCCATCACTGGACTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGC, CACTCCTATGACAGAAGCCTGAGTGGT,TCAGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCG TCCTAG e/ou

CAGTCTGTCGTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGAGTCACCAT CTC

CTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTACACTGGTACCAGCAGC

TTC

CAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGCAACACTAATCGGCCCTCAGGGGTCTCC

GAC

CGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGACTCCAGGC

TGA GGATGAGGCTGATTATTACTGCCACTCCTATGACAGAAGCCTGAGTGGTTCAGTATTCG GCG GAGGGACCAAGCTGACCGTC, em que a referida parte possui pelo menos 15 nucleótidos. A referida sequência da cadeia leve é preferencialmente derivada do anticorpo AM16. É também aqui divulgada uma sequência de ácido nucleico isolada, sintética ou recombinante que compreende uma sequência da cadeia pesada que consiste em qualquer uma das sequências das cadeias leves supramencionadas. É ainda divulgada uma sequência de ácido nucleico isolada, sintética ou recombinante que compreende uma sequência da cadeia pesada que é pelo menos 70%, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 90% homóloga a, pelo menos, parte da sequência CAGGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAAATGTGGTCAAGCCTGGGACGTCCCTGAGACT GTC CTGTGCAGCGACT, GGATTCAACTTCCATAACTACGGC, ATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCGGTT, GTTTGGTATGATGGAAGTAAGAAA, TACTATGCAGACTCCGTGACGGGCCGATTCGCCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACAC TCT GTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGTCGAGGACACGGCTGTTTATTATTGT, GTGAGAGATAAAGTGGGACCGACTCCCTACTTTGACTCC, TGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTATCCTCAG e/ou

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAAATGTGGTCAAGCCTGGGACGTCCCTGAGACT

GTC

CTGTGCAGCGACTGGATTCAACTTCCATAACTACGGCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTC

CAG

GCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCGGTTGTTTGGTATGATGGAAGTAAGAAATACTATGCA

GAC

TCCGTGACGGGCCGATTCGCCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACTCTGTATCTGCA

AAT GAACAGCCTGAGAGTCGAGGACACGGCTGTTTATTATTGTGTGAGAGATAAAGTGGGAC CGA CTCCCTACTTTGACTCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGT, em que a referida parte possui pelo menos 15 nucleótidos. A referida sequência da cadeia pesada é preferencialmente derivada do anticorpo AM23. É também aqui divulgada uma sequência de ácido nucleico isolada, sintética ou recombinante que compreende uma sequência da cadeia pesada que consiste em qualquer uma das sequências da cadeia pesada supramencionadas. É também divulgada uma sequência de ácido nucleico isolada, sintética ou recombinante que compreende uma sequência da cadeia leve que é pelo menos 70%, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 90% homóloga a, pelo menos, parte da sequência TCCTATGTGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCACTGGCCCCAGGAGGGACGGCCGCGAT CAC CTGTGGAAGAAAC, AACATTGGAAGTGAAACT, GTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCTGTGCTGGTCGTCTAT,GATGATG AC, GACCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACGGCCAC CCT GACCATCAGCAGGGTCGAGGCCGGGGATGAGGCCGACTATTACTGT, CAGGTGTGGGATAGGAGTAATTATCATCAGGTA,TTCGGCGGAGGGACCAAGTTGACCG TCCTAG e/ou

TCCTATGTGCTGACTCAGCCCCCCTCGGTGTCACTGGCCCCAGGAGGGACGGCCGCGAT CAC

CTGTGGAAGAAACAACATTGGAAGTGAAACTGTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCC

AGG

CCCCTGTGCTGGTCGTCTATGATGATGACGACCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTC

TCT

GGCTCCAACTCTGGGAACACGGCCACCCTGACCATCAGCAGGGTCGAGGCCGGGGATGA

GGC CGACTATTACTGTCAGGTGTGGGATAGGAGTAATTATCATCAGGTATTCGGCGGAGGGA CCA AGCTGACCGTC, em que a referida parte possui pelo menos 15 nucleótidos. A referida sequência da cadeia leve é preferencialmente derivada do anticorpo AM23. É também aqui divulgada uma sequência de ácido nucleico isolada, sintética ou recombinante que compreende uma sequência da cadeia pesada que consiste em qualquer uma das sequências da cadeia pesada supramencionadas. É também divulgada uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 90% idêntica a, pelo menos, uma parte funcional de uma sequência de aminoácidos como representada na Figura 11, Figura 14A, Figura 14B e/ou Figura 14C, em que a referida parte possui pelo menos 5 residuos de aminoácido. A referida sequência de ácido nucleico pode codificar uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica à sequência de CDR 1, 2 e/ou 3 da cadeia pesada e/ou sequência de CDR 1 ou 2 da cadeia leve representadas na Figura 11D. A referida sequência de ácido nucleico pode codificar uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a, pelo menos, uma das sequências de CDR representadas na Figura 14A, na Figura 14B e/ou na Figura 14C. A referida sequência de ácido nucleico pode codificar uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica a uma sequência da cadeia pesada representada na Figura 11A, a uma sequência da cadeia pesada representada na Figura 14A, a uma sequência da cadeia pesada representada na Figura 11B, a uma sequência da cadeia pesada representada na Figura 14C, a uma sequência da cadeia leve representada na Figura 11A, a uma sequência da cadeia leve representada na Figura 14A, a uma sequência da cadeia leve representada na Figura 14B e/ou a uma sequência da cadeia leve representada na Figura 14C.

Por conseguinte, é ainda divulgada uma sequência de ácido nucleico isolada, sintética ou recombinante que compreende uma sequência que codifica uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85% idêntica a uma sequência de aminoácidos como representada na Figura 11A-D. A referida sequência de ácido nucleico pode codificar uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica à sequência de CDR 1, 2 e/ou 3 da cadeia pesada e/ou sequência de CDR 1 ou 2 da cadeia leve como representadas na Figura 11A-D. Uma forma de realização divulga uma sequência de ácido nucleico isolada, sintética ou recombinante que compreende uma sequência que codifica uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica à sequência de aminoácidos NYIIN, e/ou pelo menos 75% idêntica à sequência GIIPVLGTVHYAPKFQG, e/ou pelo menos 70% idêntica à sequência ETAL WSTTYLPH YFD N, e/ou pelo menos 85% idêntica à sequência QASQDIVNYLN, e/ou pelo menos 70% idêntica à sequência VASNLET, e/ou pelo menos 70% idêntica à sequência QVQLVQSGAEVKKPGSSVMVSCQASGGPLRNYIINWLRQAPGQGPEWMGGII PVLGTVHYAPKFQGRVTITADESTDTAYIHLISLRSEDTAMYYCATETALWST TYLPHYFDN WGQGTLVTVSS, e/ou pelo menos 70% idêntica à sequência DIQMTQSPSSLSAAVGDRVTITCQASQDIVNYLNWYQQKPGKAPKLLIYVASN LETGVPSRFSGSGSGTDFSLTISSLQPEDVATYYCQQYDNLPLTFGGGTKVEIK RTV. Uma sequência de ácido nucleico aqui divulgada pode ser pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, muito preferencialmente pelo menos 95% homóloga a qualquer uma das sequências acima especificadas. É ainda divulgada uma sequência de ácido nucleico isolada, sintética ou recombinante que compreende uma sequência que codifica uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85% idêntica a uma sequência de aminoácidos como representada na Figura 14A-C. A referida sequência de ácido nucleico pode codificar uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica a uma sequência de CDR como representada na Figura 14A, 14B e/ou 14C. Uma sequência de ácido nucleico isolada, sintética ou recombinante pode compreender uma sequência que codifica uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: GFSFSHYA, ISYDGENT, ARDRIVDDYYYYGMDV, QDIKKY, DAS, QQYDNLPPLT, EVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFSFSHYAMHWVRQAPGKGLEWVAVIS YDGENTYYADSVKGRFSISRDNSKNTVSLQMNSLRPEDTALYYCARDRIVDD YYYYGMDVWGQGATVTVSS, DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDIKKYLNWYHQKPGKVPELLMHDASNLETGVP SRF SGRGSGTDFTLTISSLQPEDIGTYYCQQYDNLPPLTFGGGTKVEIKRTV, GFTFSSYN, ISAGSSYI, AREDYGPGNYYSPNWFDP, SSNIGAGYD, GNT, HSYDRSLSG,

EVQLVETGGGLAQPGGSLRLSCAASGFTFSSYNMNWVRQAPGKGLEWVSHI SAGS SYIYYS D SVKGRFTVSRDNVRNSVYLQMNSLRAADTAVYYCAREDYGPGNYYSPNWFDPWGQGTLV TVS s, QSVVTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNTNRPSG VSD RFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCHSYDRSLSGSVFGGGTKLTV,

GFNFHNYG, VWYDGSKK, VRDKVGPTPYFDS, NIGSET, DDD, QVWDRSNYHQV, EVQ LVESGGNWKPGTSLRLSCAATGFNFHNY

GMNWVRQAPGKGLEWVA WWYDGSKKYYAD SVTGRFAI SRDNSKNTLYLQMNSLRVEDTAVYYCVRDKVGPTPYFDSWGQGTLVTVSS, e S YVLTQPPSVS LAPGGTAAI TCGRNNI GSETVHWYQQKPGQAPVL WYDDDDRPSGI PERFS GSNSGNTATLT I SRVEAGDEADYYCQVWDRSNYHQVFGGGTKLTV. Uma sequência de ácido nucleico aqui divulgada pode ser pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, muito preferencialmente pelo menos 95% homóloga a qualquer uma das sequências acima especificadas.

Como já se explicou acima, as sequências de ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção como definida nas reivindicações são particularmente adequadas para expressar um anticorpo de acordo com a invenção, preferencialmente D25, AM14, AM16, AM23 num sistema de expressão de ácido nucleico. Uma sequência de ácido nucleico de acordo com a presente invenção como definida nas reivindicações é preferencialmente expressa numa célula, mais preferencialmente numa célula produtora adaptada para a produção de anticorpos. A invenção é ainda explicada nos seguintes exemplos. Estes exemplos não limitam o âmbito da invenção, mas servem apenas para tornar mais clara a invenção.

Exemplos

MATERIAIS E MÉTODOS

Manutenção e isolamento de células B humanas

Utilizando procedimentos correntes, células B humanas positivas para CD19 foram isoladas a partir da camada leucocitária derivada de bancos de sangue (outras fontes podem ser sangue fresco com um fator anticoagulante, ou um órgão linfoide, por exemplo, amígdala ou baço). Em resumo, células mononucleares de sangue periférico (PBMC) totais foram isoladas utilizando separação por densidade ficoll (Amersham, Buckinghamshire, UK) . Esférulas marcadas com CD22 foram utilizadas para células B selecionadas positivamente pela técnica de triagem celular MACS como descrito pelo fabricante (Miltenyi, Utrecht, Países Baixos). As células foram subsequentemente reveladas com combinações apropriadas de anticorpos monoclonais (mAbs) contra CD19, CD27, IgD, IgM e IgA (Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ, EUA) . As células B de memória que são positivas para CD19 e CD27 e negativas para IgM, IgA e IgD foram em seguida classificadas utilizando o FACSAria (BD) (Figura 1). Além das células B de memória, outros subconjuntos de células B, como células B naif, naif, foliculares, de memória, produtoras de anticorpos, centroblastos, centrócitos, centros germinativos, plasmablastos, células plasmáticas, zona marginal, perissinusoidal ou transitórias (muitos daqueles subconjuntos foram apenas determinados em ratos) podem ser isoladas utilizando marcadores apropriados.

Cultura de Células

As células classificadas foram lavadas e cultivadas em placas de 24 poços (1,5 a 2xl05 células/mL) em células L que expressam CD40L irradiadas com 80 Gray (5xl04 células/mL; proporcionadas por Dr. J. Banchereau, Schering Plough Francia, Dardilly Francia) , em meio completo (Meio Essencial Minimo D Modificado por Iscove contendo soro fetal de vitelo a 8% (FCS) e Penicilina/Estreptomicina) . A menos que mencionado de outro modo, estas células L que expressam CD40L estão sempre presentes nas culturas em combinação com FCS a 8%. Para preparar as células B para transdução retroviral, as células foram cultivadas durante 36 horas na presença de IL-21 de rato (50 ng/mL, R&D,

Minneapolis, MN, EUA) . Após transdução, as células são preferencialmente cultivadas na presença de IL-21, contudo as células respondem a IL-4, IL-15 e IL-10 (não excluindo outras citocinas). Por exemplo, a expansão de células B induzida pela IL-4 é inferior em comparação com a IL-21 e podem ser necessários niveis mais baixos de divisão celular nalgumas experiências.

Construções retrovirais e produção de retrovirus recombinante

Os mutantes ativos constitutivos de STAT5a e b foram anteriormente descritos. Os ADNs que codificam estes mutantes e a STAT5b de tipo selvagem foram obtidos de T. Kitamura (IMSUT, Tokyo, Japão). O Bcl-6 foi identificado numa triagem de resgate por senescência em fibroblastos murideos como um inibidor de sinalização de pl9ARF-p53 antiproliferativa. A Bcl-XL foi identificada como um fator antiapoptótico, que foi amavelmente proporcionado pelo Dr Korsmeyer (Howard Hughes Medical Institute, Boston, EUA) . Estes ADNs foram ligados no vetor LZRS-unidade de ligação-IRES-GFP (ou IRES-YFP ou IRES-NGFR) que foi anteriormente descrito (Heemskerk et al., 1997; Heemskerk et al., 1999). Em vez do marcador IRES-GFP (Proteina Fluorescente Verde) também foi utilizada uma IRES-YFP (Proteina Fluorescente Amarela) ou um IRES-NGFR (Recetor do Fator de Crescimento de Tecido Nervoso) . 0 NGFR é um mutante incompetente de sinalização do NGFR, amavelmente proporcionado pelo Dr. C. Bonini. Foi utilizado um anticorpo monoclonal contra NGFR (Chromaprobe, Mountain View, CA, EUA ou Miltenyi) para visualizar as células que expressam NGFR.

Para a produção de retrovirus recombinante, os plasmideos retrovirais foram transfetados numa linha de células produtoras anfotrópicas livres de virus auxiliares Phoenix-A, um derivado da linha de células de rim embrionário humano 293 (Kinsella e Nolan, 1996) (uma oferta amável do Dr. G. Nolan, Stanford University, Palo Alto, CA) , utilizando Fugene-6 (Roche Diagnostics Netherlands, Almere, Parses Baixos) de acordo com os protocolos dos fabricantes. Dois dias mars tarde, a seleção das células transfetadas foi iniciada pela adição de 2 yg/mL de puromicina (Becton Dickinson Clontech Laboratories, Paio Alto, CA) . Dez a 14 dias após a transfeção foram aplicadas 6 x 106 células por placa de Petri de 10 cm (Becton Dickinson Discovery Labware, Bedford, MA) em 10 mL de meio completo sem puromicina. No dia seguinte, o meio foi refrescado e no dia seguinte o sobrenadante retroviral foi colhido, centrifugado e congelado em aliquotas isentas de células a -70 °C. Esta abordagem proporciona uma produção retroviral reprodutível, rápida, em grande escala e alto titulo de mais de 3 x 106 partículas virais infecciosas/mL.

Transdução Retroviral 0 procedimento de transdução de fragmentos de fibronectina humana recombinante CH-296 (RetroNectin™; Takara, Otsu, Japão) foi realizado como anteriormente descrito (Heemskerk et al., 1997; Heemskerk et al., 1999). Placas de 24 poços tratadas para culturas não tecidulares (Costar, Badhoevedorp, Parses Baixos) foram revestidas com 0,3 mL de fragmento de fibronectina humana recombinante CH-296 a 30 pg/mL, à temperatura ambiente durante 2 horas ou de um dia para o outro a 4 °C. Quando foram utilizadas placas para culturas não tecidulares de diferentes tamanhos, os reagentes foram utilizados proporcionalmente. A solução de CH-296 foi removida, seguida de incubação com albumina de soro humano a 2% (HSA) em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) durante 30 min à temperatura ambiente, seguida de lavagem uma vez com PBS. 5xl05 células B, as quais foram preparadas para transdução retroviral, foram aplicadas em 0,25 mL de RPMI sem FCS e células L e misturadas com 0,25 mL de sobrenadante retroviral descongelado. Para a dupla transdução Bcl-6 Bcl-XL, 125 pL de Bcl-6-IRES-NGFR (ou IRES-YFP) (Shvarts A. et al. Genes Dev., 2002) e 125 pL de Bcl-XL-IRES-GFP (proporcionado por S. Korsmeyer, Howard Hughes Medical Institute, Childrens Hospital, Boston, EUA) foram misturados e adicionados às células. A cultura foi subsequentemente centrifugada a 1800 rpm a 25 °C durante 60 minutos e incubada durante 6 horas a 37 °C. A seguir, foram retirados 0,25 mL de sobrenadante e foram adicionados 0,25 mL de sobrenadante retroviral fresco. A cultura foi novamente centrifugada a 1800 rpm a 25 °C durante 60 minutos e incubada a 37 °C de um dia para o outro. Na manhã seguinte, as células foram transferidas para placas de 24 poços tratadas para cultura de tecidos (Costar) e cultivadas durante 3-5 dias sob condições normais na presença de IL-4 humana (50 ng/mL) ou IL-21 de rato (50 ng/mL, R&D, Minneapolis, MN, EUA). A eficiência de transdução foi determinada por revelação com anticorpos de um mutante truncado, incompetente para sinalização do Recetor do Fator de Crescimento de Tecido Nervoso (ANGFR, proporcionado por C. Bonini, St. Raphael Hospital, Milan, Itália) ou (co) expressão de GFP e ou YFP. As células contendo o(s) transgene(s) de interesse são em seguida selecionadas para experiências adicionais.

Citometria de Fluxo

Os anticorpos contra as moléculas humanas IgD, IgG, CD3, CD19, CD2 0, CD27, CD38, CD40, CD45, CD56, CD70, CD80, CD86, HLA-DR (BD) marcados diretamente com FITC, PE, PERCP, PE-Cy5, APC ou APC-Cy7 e IgM, cadeia leve kappa, cadeia leve lambda, CD138, diretamente marcado com PE (DAKO) foram utilizados para análise por citometria de fluxo. As células reveladas foram analisadas utilizando um LSRII (BD) e os dados de FACS foram processados com o software de computador FlowJo (Tree Star, Inc).

Experiência de proliferação

As células B naif e de memória foram isoladas a partir de PBMC frescas na FACSAria: Células B naif: CD19-Pe-Cy7 pos, CD27-APC neg, IgD-ΡΕ pos Células B de memória: CD19-Pe-Cy7 pos, CD27-APC pos, IgD-ΡΕ neg, IgA-FITC neg As células foram lavadas em PBS e ressuspensas em 0,5 mL de RPMI (37 °C) sem FCS. Uma quantidade igual de IMDM contendo Éster succinimidilico de carboxifluoresceina (CFSE) 2μΜ foi adicionada à mistura de células e incubada durante 7 min a 37 °C. A marcação das células foi interrompida lavando as células com FCS frio. As células foram ressuspensas em 500 pL de IMDM-FCS a 8% e cultivadas com células L e na ausência ou presença de IL-21. As células não marcadas foram utilizadas como controlo. Após 36 h (imediatamente antes da transdução) uma proporção das células foi analisada quanto ao seu teor de CFSE. As células remanescentes foram transduzidas centrifugamente com Bcl-6-IRES-NGFR, cultivadas durante 3 dias, e analisadas quanto ao seu teor de CFSE utilizando o LSRII. Os dados foram analisados utilizando o software FlowJo (Treestar)

Isolamento de células B humanas especificas para o antigénio utilizando triagem celular única de alta velocidade

Além do método de isolamento de células B de memória descrito acima começando com MBC (isto é, culturas com 100 célula/poço), as células B de memória humanas podem ser também incubadas com um antigénio marcado fluorescentemente e classificadas com base no reconhecimento de antigénio. Um exemplo é o isolamento de células B que ligam o Toxoide Tetânico marcado com ficoeritrina (PE) (proporcionado por A. Radbruch, Berlim, Alemanha) (Figura 4). As células foram cultivadas a 1 célula/poço e verificadas para ligação TT. Não obstante o anterior, pode utilizar-se qualquer outro antigénio marcado.

Determinação da expressão do recetor de células B (BCR) altera a cultura a longo prazo de células transduzidas com Bcl-6 e Bcl-XL

Sabe-se que as células B que se diferenciam durante a cultura in vitro perdem a sua expressão de BCR na membrana, o que é também observado em células B transformadas com EBV. Por conseguinte, as células B transduzidas com Bcl-6 e Bcl-XL e cultivadas na presença de IL-21 foram reveladas para GFP, NGFR, CD19, Kappa e/ou Lambda ou IgG ou com Toxoide Tetânico marcado. Para mostrar a utilidade expressão do BCR, as células de ligação de TT-PE (Radbruch) foram classificadas utilizando o FACSAria (BD) a 1 célula/poço em placas de 96 poços, que foram aplicados com meio de cultura contendo células L e IL-21. Após três semanas a ligação do Toxoide Tetânico de clones em crescimento foi verificada utilizando o FACS Canto (BD) . Para esse fim, as células foram colhidas e reveladas em placas de 96 poços com GFP, NGFR, CD19 e TT-PE.

Desenvolvimento de linhas de células B de duplo positivo para Bcl-6 e Bcl-XL que segregam anticorpos

Foram geradas linhas de células B que produzem anticorpos monoclonais e são 100% duplos positivos para Bcl-6 e Bcl-XL. Primeiro, isto foi conseguido induzindo a proliferação e diferenciação utilizando IL-21. Entretanto, estas células são transduzidas com os retrovirus Bcl-6-IRES-NGFR e Bcl-XL-IRES-GFP. As células são mantidas em IL-4 durante 3-4 dias. As células que são transduzidas quer seja com um ou ambos retrovirus, expressam em seguida o transgene e, portanto, expressarão a proteína NGFR ou GFP. A expressão de NGFR e/ou GFP pode ser visualizada utilizando o LSRII (BD) . Se for necessário, as células podem ser novamente transduzidas para se obter números mais altos de células que expressam ambos os transgenes. Independentemente de uma segunda transdução, as células que expressam ambos os transgenes são classificadas utilizando o FACS Aria (BD) e cultivadas a uma densidade celular que varia desde 10-500 células/poço em placas de 96 poços na presença de IL-21 e 2 500 a 5 000 células L/poço. Estas miniculturas a granel (MBC) segregam quantidades relativamente grandes de anticorpo no sobrenadante da cultura já no dia 5, o qual pode ser depois utilizado para fins de triagem. A triagem pode basear-se em técnicas disponíveis para o antigénio de interesse, por exemplo, ELISA/EIA/RIA, transferência de

Western ou ensaios funcionais diretos como a neutralização de experiências de bloqueio de citocinas. Após triagem e seleção de MBC que reconhecem o antigénio de interesse (TT e RSV nas nossas experiências) , as células são subclonadas a 0,5 - 1 células/poço em 96 poços na presença de IL-21. A subclonagem demora normalmente 2-3 semanas e pode ser realizada por culturas de diluição limitante (LD) ou triagem de células únicas utilizando citometria de fluxo (FACSAria) .

Cultura-mãe de virus RSV A-2 e linha de células HEp2 O virus RSV A-2 (amavelmente proporcionado por G. van Bleek, WKZ, Utrecht) e a linha de células HEp2 (Clinicai Laboratory, AMC, Amsterdam), foram cultivados em grandes quantidades e congelados em azoto liquido. A linha de células HEp2 aderente foi cultivada em meio normal em frascos Falcon T175, antes de se congelar em aliquotas.

Para se obter uma cultura-mãe de RSV de alto título, as células HEp2 foram aplicadas e cultivadas até atingir 50-60% de confluência. A cultura-mãe de RSV original foi adicionada (1/20 diluição volume total 5 mL) durante 45' à TA sobre as células HEp2. Foram adicionados 15 mL de meio fresco e as células foram deixadas de um dia para o outro a 37 °C, 5% de C02 com a tampa aberta. Na manhã seguinte, o sobrenadante da cultura foi cuidadosamente removido e foram adicionados 15 mL de meio contendo 1% de FCS. As células foram deixadas durante 24 a 36 horas a 37 °C, 5% de C02 com a tampa fechada. Quando eram claramente visíveis sincícios induzidos por RSV e a maioria dos sincícios ainda estavam intactos, o meio foi colhido, filtrado (0,22 ym) e centrifugado a 1450 rpm à TA, antes das amostras terem sido instantaneamente congeladas e armazenadas em azoto liquido. Pode ser obtida uma segunda colheita adicionando imediatamente um meio novo contendo FCS a 1% e congelando este lote 4-6 horas mais tarde.

Lisado de RSV para ELISA

As células HEp2 que foram infetadas com RSV A-2 para se obter culturas-mãe de virus foram utilizadas para isolar proteínas de RSV. Primeiro, as células foram cuidadosamente lavadas com PBS e tripsinizadas. A tripsina (Gibco) foi eliminada por lavagem e o sedimento celular foi lisado com octilglucosídeo a 1% (sedimento celular de um balão T175 foi tratado com 2 mL de octilglucosídeo) . A suspensão foi homogeneizada com seringa e agulha (10 vezes para cima e para baixo) , incubada durante 1 hora sobre gelo e, em seguida, submetida a diálise contra 2 L de tampão de TBS, pH 7,4, de um dia para o outro a 4 °C. O sobrenadante foi obtido depois de centrifugar os detritos celulares. O teor de proteína foi determinado a 3,6 mg/mL e foi utilizado a 20 pg/mL (50 pL) em ELISAs.

Determinação de TCID50 e PFU da culturas-mãe de RSV

Para determinar a TCID50, 104 HEp2 foram aplicadas em placas de 96 poços e infetadas com uma diluição sucessiva de 2 ou 10 passos de vírus RSV em 4-plo. 2-3 dias mais tarde o sobrenadante da cultura foi removido e as células foram fixas com acetona a 80% durante 10' à TA. Após remoção da acetona, a camada de células fixas foi seca e mantida a 4 °C ou congelado a -20 °C. Para revelar as células RSV HEp2 as placas foram primeiro bloqueadas com leite em pó a 5% em PBS 0,1% de Tween 20. Em seguida, as placas foram lavadas 3 vezes, antes de serem incubadas durante 3-5 horas a 37 °C com anti-RSV-HRP policlonal de cabra (1:500, Biodesign, Saco, ME, EUA) e lavadas exaustivamente. A seguir, os poços foram incubados com substrato AEC durante 30' à TA. Os focos infetados revelam de vermelho e podem ser observados visualmente utilizando um microscópio ótico e podem ser contados. Foi utilizado o software Excel padrão para determinar a TCID50.

Para determinar a quantidade de unidades formadoras de placas (PFU) do virus, lxloVmL de células HEp2 em placas de 24 poços foram incubadas com diluições sucessivas de 10 vezes (10“3 - 10“7) de cultura-mãe de virus RSV em meio com FCS a 1% a 37 °C durante 45' (200 yL), antes das células e virus terem sido cobertos com 0,5 mL de ágar de placa marinha a 0,25% tibio (Biozyme). A camada de agarose previne a disseminação do virus para células não infetadas através do meio de cultura. Desse modo, o virus pode apenas infetar células vizinhas, as quais são eventualmente mortas pelas placas geradoras de virus na monocamada de células HEp2. Essas placas podem visualizar-se melhor por revelação das células fixas (etanol a 96% - ácido acético a 100% -formalina a 10% 6:2:1) com solução de violeta de cristal a 1%. As placas são contadas (por pelo menos dois indivíduos diferentes) e pode determinar-se o valor de PFU.

Seleção de anticorpos neutralizantes do Vírus Sincicial Respiratório (RSV)

Para se obter clones de células B anti-virus sincicial respiratório (RSV), as células sanguíneas periféricas (PBMC) de dois doadores foram isoladas a partir de camadas leucocitárias derivadas de bancos de sangue (doadores B62 e B63) . Antes de classificar as células CD19posIgMnegIgDnegIgAnegCD2 7pos utilizando o FACSAria (BD)(Figura 1), as células CD22+ foram isoladas utilizando esférulas de MACS e colunas (Miltenyi). Apenas se mencionado de maneira diferente, as células foram cultivadas com células L. As células foram cultivadas durante 36 horas na presença de IL-21, antes de serem transduzidas apenas com Bel-6-IRES-NGFR. Após 12 h, as células foram colhidas e cultivadas durante 3 dias na presença de IL-4, antes das células que expressam NGFR terem sido classificadas utilizando esférulas de MACS (Miltenyi) e imediatamente transduzidas com Bcl-XL-IRES-GFP. As células B que não se ligaram às esférulas de MACS foram lavadas e transduzidas com Bcl-6 e Bcl-XL ao mesmo tempo. Após 12 h, as células foram colhidas, agrupadas e cultivadas durante 3 dias na presença de IL-4, antes de serem classificadas quanto à expressão de GFP e NGFR por FACSAria. As células foram lavadas e cultivadas a uma densidade de 100 células/poço em placas de 96 poços (Costar) na presença de IL-21.

As culturas de células B transduzidas duplamente com Bcl-6 e Bcl-XL foram pesquisadas quanto à ligação ao RSV utilizando um ELISA de lisado de células HEp2 infetadas por RSV e foram testadas em paralelo utilizando uma experiência de microneutralização de RSV. Em resumo, 104 células HEp2 são aplicadas em placas de 96 poços de fundo plano (Costar) em meio completo. No dia seguinte, o meio é substituído durante 1 h à TA pela mistura de vírus RSV e sobrenadante da cultura de células que foi pré-incubada durante 30 min a 37 °C. O volume total é de 25 yL e a concentração final de RSV é de 0,1 MOI. Após 1 h, a mistura sobrenadante de vírus é diluída 9 vezes com PBS e substituída com 100 pL de IMDM/5% de FCS. Após 2 dias, as células são fixas com acetona a 80% e reveladas com anti-RSV-HRP policlonal (Biodesign). Utilizando H202 e AEC, as células infetadas por RSV desenvolveram uma cor vermelha. Se for necessário, as células infetadas podem ser observadas e contadas, utilizando microscopia ótica. Como um controlo para neutralização do RSV é utilizado um anti-RSV policlonal de cabra (Abeam, Cambridge, MA) .

RT-PCR e clonagem de regiões VH e VL 0 ARN total foi isolado a partir de ~5xl05 células B com o mini kit RNeasy® (Qiagen, Venlo, Países Baixos). 250 ng de ARN total foi transcrito de forma inversa num volume de 20 pL contendo IX tampão da primeira cadeia, dNTP 500 μΜ, 250 ng de hexâmeros aleatórios, DTT 5 mM, 40 U de RNasin (Promega) e 200 U de Superscript III RT (Invitrogen) . O ADNc foi diluído 10X em água Ultrapura e 2,5 pL de ADNc foram submetidos a PCR numa solução de 50 pL contendo Tris-HCL 20 mM, KCL 50 mM, MgC12 2,5 mM, dNTP 250 μΜ, 1 U de ADN-polimerase AmpliTaq Gold (Applied Biosystems Inc.), e 25 pmol de cada iniciador. As condições de PCR foram como se segue: 8 min de passo de desnaturação a 96 °C, seguido de 35 ciclos de 30 s a 96 °C, 30 s a 60 °C, 1 min a 72 °C, e uma extensão final de 10 min a 72 °C.

Os produtos de PCR foram corridos em geles agarose, purificados e clonados no vetor de clonagem pCR2.1 TA de acordo com as recomendações do fabricante. A análise de sequência foi realizada utilizando química BigDye

Terminator (Applied Biosystems Inc.) e o software Vetor-NTI (Invitrogen). A fim de descartar mutações induzidas pela transcriptase inversa e/ou ADN polimerase, foram realizadas várias conversões de ADNc independentes e reações de PCR e individualmente clonadas e analisadas quanto à sequência. As sequências consenso foram determinadas com o software Vetor-NTI Contig Express.

Para a expressão de anticorpo de proteína recombinante em células 293T, foram geradas construções da cadeia pesada e leve de comprimento total em pCDNA3.1(+)Zeo (Invitrogen). 0 vetor de expressão da cadeia pesada foi construído através de amplificação por PCR da sequência líder da cadeia pesada e região VH do clone D25 introduzindo um sítio 5'-NheI e um sítio 3'-XhoI. A região constante de IgGl (CHl-charneira-CH2-CH3) foi amplificada a partir do mesmo ADNc, introduzindo contudo um sítio 5'-XhoI e um 3'-NotI. 0 vetor de expressão da cadeia pesada de comprimento total foi obtido através de ligação de três pontos em pCDNA3.1(+)Zeo digerido com Nhel/Notl. A construção de expressão da cadeia leve de comprimento total foi gerada através de amplificação por PCR da sequência líder da cadeia leve, região VL e região constante da cadeia leve com iniciadores introduzindo um sítio 5'-NheI e 3'-NotI. 0 último produto foi clonado em pCDNA3.1(+)Zeo digerido com Nhel/Notl para se obter um vetor de expressão da cadeia leve de comprimento total.

Foi realizada análise de sequência para confirmar a exatidão das construções de expressão.

Foi realizada transfeção dupla transitória (Fugene-6, Roche, Alemanha ou Lipofectamina LTX, Invitrogen) de células 293T com vetores de expressão tanto da cadeia pesada como da leve para produzir anticorpos monoclonais recombinantes. Foi realizada uma revelação FACS com o sobrenadante da cultura resultante (48 horas) em células Hep2 infetadas por RSV para mostrar a ligação funcional do anticorpo à proteína F do RSV.

Os oligonucleótidos utilizados para amplificações por PCR foram:

Regiões VH: VHl-For 5'-AAATCGATACCACCATGGACTGGACCTGGAGG-3' VHIB-For 5'-AAATCGATACCACCATGGACTGGACCTGGAGM-3' VH2A-For 5'-AAATCGATACCACCATGGACACACTTTGCTMCAC-3' VH2B-For 5'-AAATCGATACCACCATGGACATACTTTGTTCCAAC-3' VH3-For 5'-AAATCGATACCACCATGGAGTTTGGGCTGAGC-3' VH3B-For 5'-AAATCGATACCACCATGGARYTKKGRCTBHGC-3' VH4-For 5'-AAATCGATACCACCATGAAACACCTGTGGTTCTT-3' VH5-For 5'-AAATCGATACCACCATGGGGTCAACCGCCATC-3' VH6- For 5'-AAATCGATACCACCATGTCTGTCTCCTTCCTC-3'

Cgamma-Rev 5'-GGGTCTAGACAGGCAGCCCAGGGCCGCTGTGC-3'

Regiões Vkappa:

Vkl-For 5'-AAATCGATACCACCATGGACATGAGGGTCCCY-3'

VklB-For 5'-AAATCGATACCACCATGGACATGAGRGTCCYY-3'

Vk2-For 5'-AAATCGATACCACCATGAGGCTCCCTGCTCAG-3'

Vk3-For 5'-AAATCGATACCACCATGGAARCCCCAGCGCA-3'

Vk4-For 5'-AAATCGATACCACCATGGTGTTGCAGACCCAG-3'

Ck-Rev 5'-GATCGCGGCCGCTTATCAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT-3'

Regiões Vlambda:

Vllaecb 5'-AAATCGATACCACCATGGCCTGGTCCCCTCTCCTCC-3'

Vil g 5'-AAATCGATACCACCATGGCCGGCTTCCCTCTCCTCC-3' V12/10 5'-AAATCGATACCACCATGGCCTGGGCTCTGCTCCTCC-3' V13jpah 5'-AAATCGATACCACCATGGCCTGGACCGCTCTCCTGC-3' V15/7 5'-AAATCGATACCACCATGGCCTGGACTCCTCTCCTTC-3' VI6/9 5'-AAATCGATACCACCATGGCCTGGGCTCCTCTCCTTC-3'

Vl3rm 5'-AAATCGATACCACCATGGCCTGGATCCCTCTCCTCC-3' V131 5'-AAATCGATACCACCATGGCCTGGACCCCTCTCTGGC-3' V13e 5'-AAATCGATACCACCATGGCCTGGGCCACACTCCTGC-3' V14c 5'-AAATCGATACCACCATGGCCTGGGTCTCCTTCTACC-3' V18a 5'-AAATCGATACCACCATGGCCTGGATGATGCTTCTCC-3' C12/7 5'-GATCGCGGCCGCTTATCAWGARCATTCTGYAGGGGCCACTG-3'

Os oligonucleótidos utilizados para as construções do vetor de expressão foram:

Vetor de expressão da cadeia pesada: VHl-L-Nhel: 5'-GCGGCTAGCCACCATGGACTGGACCTGGAGG-3' JH4/5-XhoI: 5'-GCGCTCGAGACGGTGACCAGGGTTCCCTG-3' CHfw-Xhol: 5'-CGCGCTCGAGTGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC-3' CHrev-Notl: 5'-GATCGCGGCCGCTTATCATTTACCCGGRGACAGGGAGAGGC-3'

Vetor de expressão da cadeia leve: VKl-L-Nhel: 5'-GCGGCTAGCCACCATGGACATGAGGGTCCCY-3' CK-Notl: 5'-GATCGCGGCCGCTTATCAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT- 3'

RT-PCR de EBV A fim de testar se a forte resposta proliferativa estava relacionada com a presença de EBV, foi realizada uma RT-PCR de EBV. 0 procedimento de RT é descrito acima. As condições de PCR foram como se segue: um passo de desnaturação de 7 minutos a 94 °C, seguido de 30 ciclos de 30s a 94 °C, 30 s a 62 °C (HPRT1) , 52 °C (LMP-1) e 58 °C (EBNA1/2) e 30s a 72 °C e uma extensão final de 7 minutos a 72 °C. Os oligonucleótidos utilizados para RT-PCR foram como se segue: HPRT1 direto (5'-TATGGACAGGACTGAACGTCTTGC-3') e HPRTl inverso (5'-GACACAAACATGATTCAAATCCCTGA-3'); LMP-1 direto: (5'-GCGACTCTGCTGGAAATGAT-3') e LMP-1 inverso (5'- GACATGGTAATGCCTAGAAG-3'); EBNAl/2 direto (5'- AGCAAGAAGAGGAGGTGGTAAG-3') e EBNAl/2 inverso (5'-GGCTCAAAGTGGTCTCTAATGC-3').

Além do RT-PCR, nós realizamos um PCR diretamente no ADN do sedimento celular e sobrenadante que foi isolado utilizando o kit de isolamento QIAmp (Qiagen).

EXEMPLO 1 RESULTADOS

Fenótipo de células B A utilização de células B de memória humanas como a plataforma para isolar medicamentos terapêuticos baseia-se na capacidade para cultivar e testar estas células durante um intervalo de tempo relativamente longo. As células B humanas podem ser cultivadas e mantidas num cenário laboratorial, contudo durante um tempo que não é suficientemente longo para expandir, selecionar e clonar linhas de células B únicas contra um antigénio de interesse. Nós desenvolvemos técnicas de imortalização com base em modificações genéticas de células B humanas. Nós estudamos os alvos a jusante de STAT5. Um alvo, além de outros, é o Bcl-6. 0 Bcl-6 inibe a diferenciação de células B em células plasmáticas que são mantidas em proliferação. A sobreexpressão de Bcl-6 mantém a BLIMP1 em equilíbrio, um fator de transcrição cuja expressão é fortemente melhorada estimulando as células B com IL-21 (funciona através de STAT3). A BLIMP1 é necessária para induzir o desenvolvimento de células produtoras de Ig (CD20-CD38+) enquanto o Bcl-6 pode impedir isto (as células mantêm a expressão de CD20, o chamado fenótipo de centro germinativo).

Para estudar a possivel distorção de certas populações de células dentro do compartimento de células B, a marcação com CFSE antes da estimulação de células B humanas de memória e naif frescas revelou que todas as células começam a dividir-se e que todas as populações de células B são igualmente transduzidas (Figura 2). São mostradas células B de memória transduzidas com Bcl-6 e cultivadas na presença de IL-21 e IL-4. As células B nalf foram transduzidas a um nível mais baixo e as taxas de divisão foram inferiores a 36 h, mas foram idênticas para as células B de memória após mais 3 dias de cultura (dados não apresentados). A seguir, nós mostramos que o Bcl-6, em conjunto com a Bcl-XL (alvo antiapoptótico a jusante de STAT5), sinalização de CD40L e na presença de IL-21, mantêm as células B de memória de IgG humana no fenótipo CD20+CD38dull durante intervalos de tempo longos (>3 meses) (Figura 3) . Além disso, as células B Bcl-6 Bcl-XL têm um fenótipo que corresponde às células B ativadas (ver Tabela 1, exemplificada pela revelação FACS de 3 clones de células B TT+), uma vez que estas células têm alta expressão de CD80, CD86 e HLA-DR.

Determinação sobre três clones de células B Bcl-6 Bcl-XL diferentes cultivados com IL-21 e sinalização de CD40L revelação resultado revelação resultado CD2 neg CD 6 9 neg CD5 neg CD7 0 pos CD7 neg CD71 pos CD10 pos CD73 neg CD2 0 pos CD8 0 pos/alto CD21 pos CD8 6 pos CD22 pos CD95 pos/alto CD23 neg/5% pos CD12 6 neg CD24 neg CD132 (gama comum) pos CD25 pos CD138 neg/2%pos CD27 neg/baixo CD154 (CD40L) 8% pos CD2 8 neg ICOSL pos CD30 pos (56-74%) IgM neg CD38 pos/intermediário IgG pos revelação resultado revelação resultado CD4 0 pos HLA-DR pos(alto) CD44 pos Kappa pos/neg CD45 pos Lambda pos/neg CD45RA pos/alto IL21-R pos

Expressão de membranas de anticorpo

As células negativas EBV transduzidas com Bcl-6 Bcl-XL permaneceram positivas para a expressão de BCR como determinado pela ligação ao antigénio ou revelação Kappa e Lambda (Figura 3 e 4) . Assim, estas células são particularmente adequadas para isolar e/ou pesquisar após um período de cultura longo para uma especificidade desejada, utilizando, por exemplo, antigénio marcado, porque tais células ligarão o referido antigénio marcado com o seu BCR. Isto foi confirmado por triagem de células únicas de células B transduzidas duplamente com Bcl-6 e Bcl-XL que se ligam a TT marcado com PE utilizando o FACSAria. Após três semanas, os clones classificados de células únicas foram revelados com marcadores apropriados e TT-PE em placas de 96 poços e medidos quanto à ligação no FACS Canto (BD) (Figura 4) . Em conclusão, nos casos em que é desejada a presença de um recetor de células B em células B, tal como, por exemplo, em ensaios de triagem, as células B são preferencialmente transduzidas com Bcl-6 e Bcl-XL e não infetadas por EBV.

Divisão celular e curvas de crescimento

As células B transduzidas com Bcl-6 Bcl-XL dividem-se em média 0,6 vezes por dia. A taxa de divisão varia entre doadores e densidade celular das culturas (Figura 5a) . O clone anti-RSV D25 teve uma taxa de divisão de 0,47 vezes por dia (figura 5b) . As células podem ser cultivadas a densidades abaixo de 1 célula/96 poços para efeitos de clonagem.

Secreção de anticorpos de células B Bcl-6 Bcl-XL

As células B transduzidas com Bcl-6 Bcl-XL segregam em média um yg/mL de anticorpos, o que é suficiente para desenvolver as quantidades necessárias para os ensaios pré-clínicos (Figura 6) . Surpreendentemente, o clone anti-RSV D25 produziu três vezes mais anticorpos em comparação com as outras linhas de células testadas.

Determinação do teor de EBV RT-PCR de EBV no ARNm de linhas de células Bcl-6 Bcl-XL que foram cultivadas com IL-21 e sinalização de CD40L. Nas linhas de células obtidas com esta técnica de imortalização nunca foi detetado transcrito de gene de EBV (dados não apresentados).

Procedimento de seleção

Devido à estabilidade no crescimento e expressão de BCR, estas células são muito adequadas para isolar células B especificas para o antigénio. Isto deu-nos a oportunidade de utilizar vários procedimentos de seleção e clonagem diferentes. Um deles consiste em obter imediatamente células especificas para o antigénio após introdução de Bcl-6 e Bcl-XL por FACS ou triagem com Esférulas Magnéticas utilizando antigénio marcado de interesse, melhorando, desse modo, a probabilidade de gerar múltiplos clones de células B específicos para o antigénio. Outra opção consiste em cultivar células B de memória (ou qualquer outra) transduzidas com Bcl-6 Bcl-XL a granel, purificadas a baixas densidades celulares (por exemplo, 100 células/poço). Os sobrenadantes destas culturas de 100 células/poço podem ser recolhidos e testados para a sua especificidade. As culturas de 100 célula/poço que são determinadas como sendo positivas para o reconhecimento de antigénio, são em seguida subclonadas por culturas de diluição limitante para obter linhas de células monoclonais. Utilizando ambos os métodos, nós podemos isolar mais de 40 clones de células B que reconhecem o Toxoide Tetânico (TT). Assim, estes clones foram selecionados com base na ligação de TT ao BCR no FACSAria ou foram selecionados por triagem em ELISA de séries de culturas até que fosse isolada a linha de células monoclonais anti-TT única (não apresentado).

Seleção de anticorpos neutralizantes de RSV A partir do doador B63, 25 culturas de 100 células/poço bloquearam completamente a infeção por RSV e a replicação. D10, uma das culturas de 100 células/poço neutralizantes produziu um forte anticorpo anti-RSV que nós clonamos através de cultura de diluição limitante. Um dos anticorpos monoclonais, o D25 foi utilizado para continuar os estudos. O D25, um anticorpo monoclonal com uma cadeia pesada de IgGl, como determinada por ELISA comercial (Sanquin, Amsterdam, não apresentado) e uma cadeia leve kappa (Figura 7), bloqueou muito eficazmente a infeção por RSV com um valor de IC50 entre 0,5 e 1,5 ng/mL (± ΙΟρΜ) , enquanto a IC50 do anticorpo anti-RSV padrão utilizado em clinica (palivizumab desenvolvido pela Medlmmune) é de 0,453 yg/mL (3,02nM) (H. Wu et al. 2005 J.Mol.Biol. e A. Mejias et al. 2005 Antimicrob. Agentes Chemother.) (Figura 8).

Reconhecimento de antigénio

Além das experiências de neutralização, foi determinada a ligação de D25 a células HEp2 infetadas por RSV. As células HEp2 foram infetadas utilizando o protocolo de produção de virus regular. As células HEp2 infetadas com RSV foram tripsinizadas e incubadas com 25-50 yL de sobrenadante da cultura. As células foram lavadas e reveladas com anti-IgG humana de rato-PE (BD ou Jackson) para detetar a ligação do anticorpo D25 às células infetadas. O anticorpo de controlo de ELISA r-Biopharm foi utilizado como um controlo interno. Na figura 9a é mostrada a ligação de D25 a células HEp2 infetadas por RSV, intactas.

Uma vez que existem proteínas de envelope (membrana) de RSV de duas proteínas nomeadamente a proteína G e F, a ligação de D25 foi testada contra células infetadas com o vírus VSV pseudotipado com nenhuma ou a proteína F de RSV ou G de RSV (amavelmente proporcionada por John K Rose). Como se mostra na figura 9b, o D25 ligou-se fortemente a células EL-4 infetadas com a proteína F de VSV. Numa tentativa para estudar o epítopo reconhecido pelo D25 versus o palivizumab, as células EL-4 infetadas com a proteína F de VSV foram incubadas com quantidades crescentes de D25 ou palivizumab. As células foram lavadas e revfeladas com uma mistura de 3 anticorpos anti-RSV-F de rato (Dako). Em contraste com o Palivizumab que exibiu competição para ligação a células infetadas com VSV-F com o anticorpo anti-RSV-F de rato, a ligação de D25 não foi afetada (dados não apresentados). A Figura 9c mostra a ligação de Palivizumab (Synagis) e D25 de uma maneira dependente da concentração a células HEp2 infetadas. Uma vez que ambos os anticorpos se ligam a 1 para 1 com a sua proteína alvo não há diferença na ligação a células HEp2 infetadas.

Frequência de ligação ao antigénio de RSV vs clones neutralizantes Nós calculámos que a frequência de células B de memória específicas para o antigénio que ligam o RSV foi de 17% e a frequência de células específicas para o antigénio que neutralizam o RSV foi de 6%, como determinado para o doador B63. 0 D25 liga-se a um epítopo conf ormacional que é diferente do epítopo reconhecido pelo palivizumab. Isto é ilustrado na figura 10, na qual o D25 não se liga a epítopos lineares, desnaturados apresentados por lisados de células infetadas por RSV de lisados revestidos sobre placas de ELISA, enquanto o palivizumab se liga à proteína (F) desnaturada.

Isolamento e purificação de fragmentos de anticorpos A partir de várias linhas de células B incluindo o clone altamente neutralizante de RSV D25, nós fomos capazes de cultivar volumes tão grandes quanto 500 mL. Estes sobrenadantes das culturas contêm pelo menos 2 pg/mL, portanto nós deveríamos ser capazes de obter anticorpo purificado suficiente para realizar estudos pré-clínicos (animais). A purificação é realizada utilizando o Kit de Purificação de Antigénios Montage (Millipore, Billerica, MA, EUA) e colunas HiTrap Protein A HP (GE Healthcare, Diegem, Bélgica).

Além disso, células 293T foram transfetadas com a cadeia pesada e leve de D25 que foram subclonados em vetores de expressão de proteína pCDA3.1 utilizando lipofectamina LTX (Invitrogen). A quantidade de IgG que estava presente no sobrenadante foi de aproximadamente 22 yg/mL (volume total 50 mL). Este anticorpo derivado da sequência de nucleótidos clonada do anticorpo expresso pela linha de células B D25 reconheceu também as células HEp2 infetadas (dados não apresentados).

Sequência do anticorpo A Figura 11a mostra a sequência de nucleótidos e aminoácidos da cadeia pesada e leve do clone B63D10-D25. Utilizando RT-PCR padrão e iniciadores específicos para o anticorpo, foram determinadas as sequências da cadeia pesada (Vhl-69) e leve (Vkl 08/018). A sequência de anticorpo inteira foi clonada utilizando vetores TOPO e após o controlo de sequência, subclonada no vetor de expressão de proteínas de mamíferos pCDNA3.1 (Invitrogen).

As Figuras 11b e 11c representam as cadeias VH e VL4 do clone, os asteriscos indicam mutações em comparação com a sequência de linha germinativa do Vhl-69 que deve ter ocorrido durante a maturação da afinidade e seleção de células B adicionais.

Para resumir, nós mostramos aqui o isolamento, caracterização e cultura a longo prazo de células B de memória humanas utilizando os transgenes Bcl-6 e Bcl-XL. Eles dão-nos as ferramentas necessárias para isolar anticorpos com propriedades únicas, como o anticorpo monoclonal anti-RSV B63D10-B25. Uma vez que as células B são de uma origem humana, elas podem ser facilmente implantadas como uma medicina terapêutica. EXEMPLO 2

As cadeias pesada e leve de D25 foram clonadas em vetores de expressão padrão como descritos antes ('sequência de anticorpo' p44). Para gerar uma construção de expressão que permita a expressão máxima de proteínas, as sequências das cadeias pesada e leve de D25 foram otimizadas em termos de codão por GENEART (Regensburg, Alemanha). Neste procedimento, sítios de restrição adicionais foram gerados para simplificar procedimentos de clonagem futuros, mas, mais importante ainda, os codões nucleotídicos que se traduzem em sequências de aminoácidos foram otimizados para tradução máxima em proteína. Assim, a sequência de nucleótidos foi otimizada, mas a sequência de aminoácidos permaneceu inalterada. No exemplo 4 é mostrada a capacidade neutralizante do D25 derivado do sobrenadante de células B purificadas, D25 recombinante e D25 otimizado por GENEART. Todos neutralizam eficientemente o RSV.

Na Figura 12 são representadas as modificações GENEART em comparação com a sequência D25 original. EXEMPLO 3 A seguir às experiências de neutralização do RSV in vitro, nós testámos o anticorpo monoclonal D25 em modelos in vivo. Os modelos que foram descritos para testes anti-RSV in vivo são ratos BALB/c e ratazanas do algodão (Sigmodon hispidus) (Mejias A et al., Antimicrobial Agents and chemotherapy 2004;pl811, Johnson S et al., JID 1997;pl215 e Wu H et al., JMB 2007:p652) . 0 modelo de rato BALB/c é claramente ο modelo mais fraco, mas uma vez que as ratazanas do algodão são difíceis de obter e manter, nós estabelecemos primeiro testes de D25 em ratos BALB/c.

Protocolo: anticorpos específicos contra o RSV em BALB/c, Dia 5

Conceção experimental:

Dia -1. injeção I.P. de lOOyL de anticorpos Dia 0. infeção I.N. de lxlO7 pfu de RSV Ά2 em 50yL Dia 1 a 5, verificar o bem-estar geral e pesar os ratos Dia 5, autópsia, recolher a BAL, sangue e pulmões Colher sangue via punção venosa

Recolher 2,0 mL de BAL através de cânula da traqueia Recolher os pulmões

Iniciar imediatamente a TCID50 em material BAL (1 mL) Congelar 1 mL de material BAL (ELISA de citocinas/RT-PCR) -80 °C

Realizar a TCID50 em material longo preparado (1 mL)

Congelar 1 mL de material longo (ELISA de citocinas/RT-PCR) -80 °C

Recolher/centrifugar o sangue para ELISA de hlgG em soro e conservar a -80 °C

Os resultados são mostrados na Figura 13: (A) Um dia antes da exposição a RSV (lxlO7 partículas de RSV-A2) por pulverização nasal, os animais foram injetados IP com quantidades diferentes de Synagis (Medlmmune), D25 purificado ou um anticorpo de controlo de IgGl (Eureka) (Tabela 3) . (Figura 13B) Os níveis de IgG humana foram determinados em soros de ratos a partir do dia 5 e a queda nos níveis séricos de anticorpos em 5 dias; a Tabela 4 mostra uma panorâmica dos valores da semivida. A Figura 13D representa os títulos de vírus encontrados nas lavagens pulmonares (BAL) no dia 5 em animais tratados e não tratados, enquanto a figura 13E representa os números de células T e B em sangue periférico de ratos tratados e não tratados. A Figura 13F mostra a histologia dos pulmões com brônquios e a infiltração de (em geral, principalmente eosinófilos) em animais não tratados e tratados.

Conclusão/Resultado:

Uma estimativa da semivida do D25 é 5 a 9 dias com base no cálculo (linear) de que foram injetados 60 e 30 yg de anticorpo no dia 0 (2 e 1 mg/kg, respetivamente) e de que no dia 5 foram detetados 33 ou 16 yg (volume total de ratos 1,5) . Quando nós começámos com uma injeção de 0,5 mg/kg por animal no dO, em seguida os niveis de Ig cairam desde 15 yg para 11 yg no dia 5, o que indicaria uma semivida de 9 dias (Tabela 4).

Tabela 4 mg/kg total administrado dO detetado no d5 semivida (yg) (yg) (dias) 2,0 60 33 5,6 1, 0 30 16 5,4 0,5 15 11 9,4 O titulo de virus como determinado no ensaio de TCID50 mostra que nos animais de controlo podem ser detetadas lxlO4 PFU, enquanto não foi detetado virus nos animais tratados com Synagis (2 mg/kg) ou D25 (2, 1 e 0,5 mg/kg).

Os animais tratados com Synagis ou D25 mantêm % mais altas de células T CD4 periféricas e células B B220. Os animais tratados com Synagis (2 mg/kg) têm % inferior de células T CD4 em comparação com animais tratados com D25. Embora isto possa não ser significativo é importante referir que os animais tratados com uma dose baixa de D25 (1 e 0,5 mg/kg) mantêm niveis altos de células B e T quando comparados com os animais tratados com controlo.

Embora os dados de histologia (figura 13F) não sejam quantitativos é evidente que o Synagis e o D25 reduzem o influxo de células imunitárias para os pulmões e em torno dos brônquios em comparação com o controlo. Quando o D25 e o Synagis são comparados, então os animais tratados com D25 parecem ter menos infiltração celular para os pulmões e em torno dos brônquios. A fim de testar o D25 nas ratazanas do algodão, são estabelecidas experiências para comparar animais pré-tratados com Synagis e D25, antes da exposição ao virus RSV-X no NVI (Bilthoven, Países Baixos). EXEMPLO 4

Além de B63-D10-D25, nós isolámos três novos anticorpos neutralizantes de RSV potentes (AM14, AM16 e AM23) a partir do mesmo doador (B63). Culturas de células B a granel a 100 células por poço que foram originalmente selecionadas para neutralização do RSV e que foram congeladas e armazenadas em liquido azoto, foram descongeladas e o sobrenadante da cultura foi testado para a ligação a células HEp2 infetadas por RSV. Nós testámos para a ligação a células Hep2 infetadas, uma vez que é um marcador para o reconhecimento pelo anticorpo de proteínas da membrana de RSV oligoméricas, nativas como a proteína F e G e pode servir como um bom indicador de neutralização. Quando foi detetada ligação, as células foram cultivadas em célula única e pesquisadas para a ligação para obter clones. Todos os três anticorpos foram clonados no vetor GENEART que foi originalmente construído para o D25. Além disso, como o D25, todos reconhecem a proteína F do RSV (não apresentado). Após clonagem e expressão em células 293T, a proteína recombinante foi purificada (as sequências de nucleótidos e aminoácidos são representadas nas figuras 14A, B e C) . Os anticorpos foram testados para a neutralização contra vários isolados de RSV primários em células Vero e HEp2 (Figura 15) . Todos os três anticorpos são do isotipo IgGl. 0 AM14 tem uma cadeia leve kappa, enquanto ο AM16 e ο AM23 têm uma cadeia leve lambda. Todos os três anticorpos, como o D25, contêm hipermutações somáticas nos seus dominios variáveis de anticorpo, o que sugere que sofreram maturação in vivo da afinidade durante uma reação de centro germinativo, um processo que gera sequências de anticorpos únicas.

Os resultados são mostrados nas Figuras 15-1 e 15-11: o ensaio de neutralização do virus RS com o D25 derivado do sobrenadante de linhas de células B purificadas (sD25), D25 recombinante purificado (rD25), D25 de codão otimizado por GENEART recombinante (rD25 GA), AM14, AM16, AM23 (todos proteina recombinante purificada) e Synagis. A neutralização de anticorpos virais foi testada em duas linhas de células diferentes (Figura 15-1) Vero e (Figura 15-11) células Hep2 com anticorpos diferentes: A2 (A), X (B) e 2006/1 (C) são RSV subtipo A, enquanto o vírus Z (D) e 2007-2 (E) são de subtipo B. A 100TCID50 de cada vírus foi adicionada a diluições sucessivas de anticorpo em DMEM/1%FCS e incubada durante 1 hora a 37 graus, antes de terem sido adicionados 100 uL de células Vero ou HEp2 (lxloVmL) . A mistura de anticorpos virais não foi eliminada por lavagem. Após três dias, o sobrenadante foi removido e as células foram fixas com acetona a 80% durante 10' à TA. Após remoção da acetona, a camada de células fixas foi seca e mantida a 4 °C ou congelada a -20 °C. Para revelar as células HEp2 infetadas por RSV, as placas foram primeiro bloqueadas com leite em pó a 5% em PBS 0,1% de Tween 20, em seguida as placas foram lavadas 3 vezes, antes de serem incubadas durante 3-5 horas a 37 °C com anti-RSV- HRP policlonal de cabra (1:500, Biodesign, Saco, ME, EUA) e lavadas exaustivamente. Subsequentemente todos os poços foram incubados com substrato AEC durante 30' à TA. Os focos infetados revelaram a vermelho e podem ser observados visualmente utilizando um microscópio ótico e podem ser contados.

Resultado/conclusão

Todos os anticorpos neutralizam as estirpes A e B de RSV (Tabela 5) . Em geral, os diferentes anticorpos D25 neutralizam o virus RSV eficientemente, embora se possam observar variações menores entre experiências. Ο AM14 é tão potente quanto o D25, enquanto ο AM16 é tão potente quanto o Synagis. No entanto, ο AM23 neutraliza as estirpes A de RSV de forma muito eficiente, enquanto é menos potente na neutralização das estirpes B de RSV, embora continue a ser comparável ao Synagis.

Tabela 5 Valores de IC50 (ng/mL)

Linha de subtipo rD25 células sD2 5 rD25 AM14 AM16 AM23

de RSV GA utilizada O valor de IC50 para cada anticorpo no virus RS de subtipo A em células Vero ou HEp2 foi calculado como a média da neutralização de 50% em três estirpes de virus (A2, X e 2006-1) . O valor de IC50 para cada anticorpo no virus RS de subtipo B em células Vero ou HEp2 foi calculado como a média da neutralização de 50% em duas estirpes de virus (2007-2 e Z) . Cada um dos ensaios de neutralização foi realizado em triplado e repetido duas vezes (também mostrado na figura 15A e B). sD25 = sobrenadante da cultura derivada de células B purificada rD25 = D25 recombinante purificado rD25 GA = sobrenadante de células 293T com D25 recombinante de codão otimizado por GENEART EXEMPLO ~5

Efeitos sinérgico e de bloqueio de anticorpos anti-RSV.

Para analisar se o D25, o Synagis ou o novo conjunto de anticorpos AM interferem entre si para o reconhecimento da proteína F de RSV, nós pré-incubámos células HEp2 infetadas por RSV com concentrações crescentes de anticorpos não marcados até que atingissem o patamar de ligação máxima. Nós determinámos para cada anticorpo a fase de patamar na qual não era detetado nenhum aumento na ligação quando a quantidade de Ig era aumentada, (não apresentado). Depois de lavar, as amostras foram incubadas com uma dose padrão (3 pmol) de D25 marcado com PE ou Synagis marcado com APC. Esta dose dá também ligação máxima.

Resultado

Como se mostra na Figura 16, os Synagis e D25 marcados apresentam uma ligação reduzida a células HEp2 infetadas por RSV quando estas células foram pré-incubadas com Synagis ou D25 não marcado. Além disso, o Synagis apresenta uma ligeira redução na ligação induzida pelo AM16. A ligação de D25 é fortemente bloqueada pelo AM23, mas pelo contrário a ligação de D25 é fortemente melhorada após pré-incubação com AM14. Isso indica que o epitopo reconhecido pelo D25 normalmente não é totalmente exposto, mas a exposição é melhorada após ligação do AM14 ao seu epitopo nativo. Isso demonstra que estes dois anticorpos podem funcionar em conjunto e melhorar a neutralização.

Breve descrição dos desenhos

Figura 1.

Isolamento de células B de memória, positivas para IgG, humanas. As PBMC isoladas a partir da camada leucocitária utilizando separação por densidade Ficoll (Amersham) foram incubadas com esférulas magnéticas anti-CD22, antes de serem isoladas utilizando colunas MACS (Miltenyi). As células positivas para CD22 foram em seguida incubadas com anticorpos contra CD19, CD27, IgM, IgD e IgA (BD) humano.

As células negativas para IgM, IgD e IgA e positivas para CD19 e CD27 foram classificadas utilizando triagem de células únicas de alta velocidade (FACSAria, BD).

Figura 2

Revelação com CFSE. Células B de memória humanas frescas foram isoladas, marcadas com CSFE e estimuladas durante 36 h com IL-21, antes de serem transduzidas com Bcl-6-IRES-NGFR. As células foram mantidas durante mais 3 dias em IL-21, antes que se determine o teor de CFSE. 0 corante CFSE é diluído com cada divisão celular.

Figura 3

Um exemplo de células B humanas transduzidas com Bcl-6 e Bcl-XL ou Bcl-XL apenas. As células foram mantidas em células L irradiadas que expressam CD40L e a citocina IL-21. À esquerda é mostrada a expressão de BCR como determinada por revelação kappa e lambda (93% das células positivas para kappa e lambda são do isotipo de IgG, não apresentadas). À direita é mostrada a expressão de CD38 no eixo dos X e a expressão de CD20 no eixo dos Y. A revelação com CD38dullCD20+ indica células B de memória ou de centros germinativos; a revelação com CD38+CD20" indica plasmablastos.

Figura 4

Isolamento de células B humanas especificas para o antigénio, imortalizadas. As células B de memória humanas foram isoladas como descrito na figura 1 e subsequentemente transduzidas com Bcl-6-IRES-NGFR e Bcl-XL-IRES-GFP. As células que expressavam NGFR, GFP e que ligavam a Toxina do Tétano marcada PE com foram isoladas utilizando o FACSAria. As células foram células únicas cultivadas em placas de 96 poços de fundo plano na presença de células L irradiadas e IL-21, antes de serem selecionadas com base na ligação TT-PE utilizando o FACS Canto (BD).

Figura 5

Crescimento e taxa de divisão celulares cumulativos de clones de células B 6XL. As células B de (A) dois clones anti-TT e (B) um clone anti-RSV (B63D10-D25) foram cultivadas na presença de IL-21 e células L irradiadas.

Figura 6

As culturas frescas foram iniciadas com 200 000 célula/24 poços em 1,0 mL de IMDM com 8% de FCS e pen/estrep. O FCS utilizado foi FCS normal (HyClone) ou de IgG Bovina Ultralow (Gibco). Após 3 dias, o sobrenadante da cultura foi substituído e os números de células foram ajustados a 200 000 células/mL. É mostrada a produção média de IgG em 3 dias medidas em 3 pontos no tempo consecutivos, a diferença não foi significativa (p valor 0,2).

Figura 7

Para determinar o fenótipo de cadeia leve do clone anti-RSV D25, a linha de células B D25 foi revelada com anticorpos kappa-ficoeritrina ou lambda-ficoeritrina (BD) . Apenas os anticorpos kappa-ficoeritrina ligaram-se à linha de células, o que mostra que este anticorpo tem uma cadeia leve kappa.

Figura 8 A partir do doador B63, culturas de 100 células/poço foram cultivadas utilizando células B de memória humanas positivas para Bcl-6 Bcl-XL. Uma das culturas, D10 mostrou uma forte neutralização. Foram geradas linhas de células monoclonais derivadas de LD, um D25 neutralizou o vírus RSV A-2 eficientemente. É aqui mostrado o D25 em comparação com o palivizumab (synagis) e um anti-RSV policlonal de cabra. Não são mostrados os sobrenadantes de culturas irrelevantes de clones de células B transduzidos com Bcl6 Bcl-XL com IL-21 e sinalização de CD40L que produzem níveis altos de anticorpos, mas que não bloqueavam a infeção por RSV. O clone D25 foi utilizado para caracterização adicional.

Figura 9

Na figura 9a: células HEp2 foram aplicadas a 10-12e6 células por balão T175 (Nunc) em IMDM/5% de FCS. No dia seguinte, o meio foi substituído por 5 mL de meio com vírus RSV (1,0 MOI) e incubado durante 45' à ΤΑ, antes de terem sido adicionados 20 mL de meio fresco e as células terem sido cultivadas de um dia para o outro a 37 °C. No dia seguinte, o meio foi substituído por IMDM/1%FCS e cultivada de um dia para o outro com a tampa fechada a 37 °C. As células do dia seguinte foram lavadas com PBS e tratadas com tripsina. Para revelar as células infetadas, a incubação primária foi realizada com o sobrenadante da cultura. A incubação secundária foi feita com IgG-PE anti-humano (BD). As células foram analisadas utilizando o LSRII (BD) . Como um controlo positivo foi utilizado o controlo positivo do KIT ELISA comercial de r-Biopharm.

Na figura 9b: células EL-4 foram infetadas com virus VSV pseudotipado com proteina F ou G de RSV (amavelmente proporcionada por John Rose) e incubadas com o sobrenadante da cultura D25. As células foram lavadas e incubadas com anti- IgG humana-PE (Jackson) para detetar a ligação de D25 às células infetadas. Apenas foi detetada a ligação de D25 com as células infetadas pelo virus VSV pseudotipado com a proteina F de RSV. A Figura 9c mostra a ligação de

Palivizumab (Synagis) e D25 de uma maneira dependente da concentração com células HEp2 infetadas. É mostrada a intensidade de fluorescência média (MFI).

Figura 10

Ligação de anti-RSV policlonal de cabra (controlo positivo), palivizumab (synagis) e D25 ao lisado de células infetadas com HEp2 revestidas.

Figura 11

Análise de sequência do clone D25. A 11a mostra a sequência de nucleótidos e aminoácidos prevista dos dominios variáveis da cadeia pesada e leve. A llb/c mostra a sequência da cadeia pesada e leve do D25 em comparação com a linha germinativa prevista. Os asteriscos indicam mutações que ocorreram provavelmente durante a seleção e maturação da afinidade do clone de células B in vivo.

Figura 12 A clonagem e expressão de anticorpos humanos recombinantes de linhas de células B transduzidas com BCL6 BCL-xL. Isto já foi descrito para o anticorpo D25 (Figura 11). Aqui são representadas as modificações de nucleótidos GENEART em comparação com a sequência D25 original, assinale-se que estas mutações não alteram a composição de aminoácidos do anticorpo D25.

Figura 13

Exposição de ratos BALB/c ao D25 derivado do sobrenadante de células B, purificado e Synagis. (A) Um dia antes da exposição ao RSV (lxlO7 partículas de RSV-A2) por pulverização nasal, os animais foram injetados IP com quantidades diferentes de Synagis (Medlmmune), D25 purificado ou um anticorpo de controlo de IgGl (Eureka) (tabela 3) . (B) os níveis de IgG humana foram determinados em soros de ratos desde o dia 5 e a queda nos níveis séricos de anticorpo em 5 dias (C) ; a tabela 4 mostra uma panorâmica dos valores de semivida. A Figura 13D representa os títulos de vírus encontrados em lavagens dos pulmões (BAL) no dia 5 em animais tratados e não tratados, enquanto a figura 13E representa os números de células T e B no sangue periférico de ratos tratados e não tratados. (F) mostra a histologia dos pulmões com brônquios e a infiltração de (em geral, principalmente eosinófilos) em animais não tratados e tratados.

Figura 14

Sequências de nucleótidos e aminoácidos de três novos anticorpos neutralizantes de RSV potentes (A) ΔΜ14, (B) AMI6 e (C) AM23.

Figura 15

Ensaio de neutralização de vírus RS com D25 derivado do sobrenadante de linhas de células B purificadas (sD25), D25 recombinante purificado (rD25), D25 de codão otimizado por GENEART recombinante (rD25 GA), AM14, AM16, AM23 (todos, proteína recombinante purificada) e Synagis. A neutralização dos anticorpos virais foi testada em duas linhas de células diferentes (figura 15-1) células Vero e (figura 15-11) Hep2 com anticorpos diferentes A2 (A) , X (B) e 2006/1 (C) são RSV de subtipo A, enquanto o vírus Z (D) e 2007-2 (E) são de subtipo B. A 100TCID50 de cada vírus foi adicionada a diluições sucessivas dos anticorpos em DMEM/1% de FCS e incubada durante 1 hora a 37 graus, antes de terem sido adicionados 100 uL de células Vero ou HEp2 (lxloVmL).

Figura 16

Ligação relativa de uma quantidade fixa (3 pmol) de Synagis marcado com APC e rD25 marcado com PE a células HEp2 infetadas por RSV que foram pré-incubadas com concentrações crescentes dos anticorpos não marcados indicados.

Referências

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Lisboa, 8 de Junho de 2016

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo isolado ou parte funcional do mesmo que é capaz de ligar especificamente o antigénio F do virus sincicial respiratório (RSV), e em que o anticorpo ou parte funcional do mesmo compreende: a. uma região determinante de complementaridade (CDR) 1 da cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos NYIIN (SEQ ID NO: 1), uma CDR2 da cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos GIIPVLGTVHYAPKFQG (SEQ ID NO: 2), uma CDR3 cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos ETALVVSTTYLPHYFDN (SEQ ID NO: 3), uma CDR1 da cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos QASQDIVNYLN (SEQ ID NO: 4), uma CDR2 da cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos VASNLET (SEQ ID NO: 5), e uma CDR3 da cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos QQYDNLP (SEQ ID NO: 6); ou b. uma CDR 1 cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos GFSFSHYA (SEQ ID NO: 73), uma sequência de CDR2 da cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos ISYDGENT (SEQ ID NO: 74), uma sequência de CDR3 da cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos ARDRIVDDYYYYGMDV (SEQ ID NO: 75), uma CDR1 da cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos QDIKKY (SEQ ID NO:76), uma CDR2 da cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos DAS, e uma CDR3 da cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos QQYDNLPPLT (SEQ ID NO: 77); ou c. uma CDR 1 da cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos GFTFSSYN (SEQ ID NO: 80), uma sequência de CDR2 da cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos ISAGSSYI (SEQ ID NO: 81), uma sequência de CDR3 da cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos AREDYGPGNYYSPNWFDP (SEQ ID NO: 82), uma CDR1 da cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos SSNIGAGYD (SEQ ID NO :83), uma CDR2 da cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos GNT, e uma CDR3 da cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos HSYDRSLSG (SEQ ID NO: 84); ou d. uma CDR 1 da cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos GFNFHNYG (SEQ ID NO: 87), uma sequência de CDR2 da cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos VWYDGSKK (SEQ ID NO: 88), uma sequência de CDR3 da cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos VRDKVGPTPYFDS (SEQ ID NO: 89), uma CDR1 da cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos NIGSET (SEQ ID NO:90), uma CDR2 da cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos DDD, e uma CDR3 da cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos QVWDRSNYHQV (SEQ ID NO: 91).
2. Anticorpo ou parte funcional do mesmo da reivindicação 1, em que o anticorpo compreende uma sequência variável da cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos QVQLVQSGAEVKKPGSSVMVSCQASGGPLRNYIINWLRQAPGQGPEWMGGIIPV LG TVHYAPKFQGRVTITADESTDTAYIHLISLRSEDTAMYYCATETA LVVSTTYLPHYFDN WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 7) e/ou uma sequência variável da cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos DIQMTQSPSSLSAAVGDRVTITCQASQDIVNYLNWYQQKPGKAPKLLIYVASNL ETG VPSRFSGSGSGTDFSLTISSLQPEDVATYYCQQYDNLPLTFGGGT KVEIKRTV (SEQ ID NO: 8).
3. Anticorpo ou parte funcional do mesmo da reivindicação 1, em que a parte funcional do mesmo é um anticorpo de domínio único, um anticorpo de cadeia simples, um fragmento variável de cadeia simples (scFv), um fragmento Fab ou um fragmento F(ab')2.
4. Ácido nucleico isolado que codifica o anticorpo ou parte funcional do mesmo de qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
5. Sequência de ácido nucleico isolada da reivindicação 4, em que a sequência de ácido nucleico compreende sequências de nucleótidos da cadeia pesada e leve selecionadas do grupo que consiste em: (i) SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10; (ii) SEQ ID NO: 139 e SEQ ID NO: 141; e (iii) SEQ ID NO: 140 e SEQ ID NO: 142;
6. Célula que expressa a sequência de ácido nucleico da reivindicação 4 ou 5.
7. Método de produção de um anticorpo ou uma parte funcional do mesmo de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que os métodos compreendem cultivar a célula da reivindicação 6 in vitro, e obter os anticorpos ou partes funcionais dos mesmos produzidos pelas células.
8. Composição que compreende o anticorpo ou parte funcional do mesmo de qualquer uma das reivindicações 1 a 6, e um veiculo, diluente e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
9. Anticorpo ou uma parte funcional do mesmo de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou a composição da reivindicação 8, ou a sequência de ácido nucleico da reivindicação 4 ou 5 para utilização no tratamento ou prevenção de um distúrbio relacionado com RSV, ou prevenção ou neutralização dos efeitos adversos de uma infeção por RSV num indivíduo humano.
10. Utilização do anticorpo ou uma parte funcional do mesmo de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou a composição da reivindicação 8, ou a sequência de ácido nucleico da reivindicação 4 ou 5 na preparação de um medicamento para tratar ou prevenir um distúrbio relacionado com RSV, ou prevenir ou neutralizar os efeitos adversos de uma infeção por RSV num indivíduo humano.
11. Anticorpo ou uma parte funcional do mesmo, composição ou a sequência de ácido nucleico da reivindicação 9 para utilização da reivindicação 9, ou a utilização da reivindicação 10, em que o indivíduo humano tem uma doença pulmonar crónica, doença cardíaca congénita ou imunidade comprometida, ou o indivíduo humano é uma criança com menos de 6 semanas de idade ou um indivíduo idoso, opcionalmente em que o anticorpo ou parte funcional do mesmo é formulado para administração numa dosagem de 0,1 a 10 mg/kg do peso corporal do indivíduo humano. Lisboa, 8 de Junho de 2016