BRPI0812878B1

BRPI0812878B1 - anticorpo isolado ou parte funcional do mesmo, vetor, método para produzir um anticorpo ou uma parte funcional do mesmo, para produzir uma célula produtora de anticorpo e para produzir um anticorpo capaz de se ligar especificamente a rsv, composição, e, uso de um anticorpo ou parte funcional do mesmo ou de uma composição ou de vetor

Info

Publication number: BRPI0812878B1
Application number: BRPI0812878A
Authority: BR
Inventors: Yasuda Etsuko; Spits Hergen; Jeroen Kwakkenbos Mark; Beaumont Tim
Original assignee: Medimmune Ltd
Priority date: 2007-06-01
Filing date: 2008-05-30
Publication date: 2020-01-21
Also published as: NZ621824A; MX2009012843A; JP2018196380A; CN104961825A; CA2950515A1; IL202288A0; PL2170952T3; CY1117767T1; US20200325213A1; AU2008257801A8; HK1146073A1; EP2578600A3; US20100239593A1; BRPI0812878B8; BRPI0812878C1; IL202288A; EP2578600A2; BRPI0812878A2; RU2009148886A; MX350375B

Abstract

anticorpo isolado ou parte funcional do mesmo, vetor, método para produzir um anticorpo ou uma parte funcional do mesmo, para produzir uma célula produtora de anticorpo e para produzir um anticorpo capaz de se ligar especificamente a rsv, composição, e, uso de um anticorpo ou parte funcional do mesmo ou de uma composição ou de vetor a invenção fornece anticorpos e equivalentes funcionais destes que são capazes de especificamente ligar rsv e meios e métodos para produzi-las.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para ANTICORPO ISOLADO OU PARTE FUNCIONAL DO MESMO, VETOR, MÉTODO PARA PRODUZIR UM ANTICORPO OU UMA PARTE FUNCIONAL DO MESMO, PARA PRODUZIR UMA CÉLULA PRODUTORA DE ANTICORPO E PARA PRODUZIR UM ANTICORPO CAPAZ DE SE LIGAR ESPECIFICAMENTE A RSV, COMPOSIÇÃO, E, USO DE UM ANTICORPO OU PARTE FUNCIONAL DO MESMO OU DE UMA COMPOSIÇÃO OU DE VETOR.

[001] A invenção diz respeito aos campos da biologia e medicina.

[002] O Vírus Sincicial Respiratório (RSV) é um vírus da gripe pertencente à família de paramixovírus. O RSV é virulento, facilmente transmissível e a causa mais comum de doença do trato respiratório inferior em crianças de menos do que 2 anos de idade. Até 98 % das crianças que frequentam creche serão infectadas em uma única temporada de RSV. Entre 0,5 % e 3,2 % das crianças com infecção pelo RSV requerem hospitalização. Aproximadamente 90.000 entradas em hospital e 4500 mortes por ano foram relatadas nos Estados Unidos. Os fatores de rico principais para a hospitalização devido ao RSV são nascimento prematuro, doença pulmonar crônica, doença cardíaca congênita, imunidade comprometida e idade mais jovem do que 6 semanas em crianças de outro modo saudáveis. Nenhum tratamento eficaz da bronquiolite positiva em RSV além do tratamento de suporte na forma de nutrição adequada e terapia com oxigênio está disponível. As terapias antivirais tais como Ribavirina não foram comprovadas serem eficazes na infecção pelo RSV. Um anticorpo monoclonal, Palivizumab (também chamado de Synagis), é registrado para a profilaxia contra a infecção pelo RSV. Palivizumab é um anticorpo monoclonal geneticamente engendrado (humanizado) para a proteína de fusão do RSV. Entretanto, Palivizumab não é sempre

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2/105 eficaz. Portanto, existe uma necessidade na técnica quanto a anticorpos e terapias alternativas contra o RSV.

[003] É um objetivo da presente invenção fornecer meios e métodos para contra-atacar e/ou prevenir uma doença relacionada com RSV. É um outro objetivo da invenção fornecer anticorpos alternativos e/ou melhorados contra RSV, ou equivalentes funcionais de tais anticorpos e fornecer células estáveis capazes de produzir anticorpos - ou equivalentes funcionais deste - contra RSV.

[004] A presente invenção fornece anticorpos e equivalentes funcionais deste que são capazes de especificamente ligar RSV. Tais anticorpos e/ou equivalentes funcionais, também aqui chamados anticorpos anti-RSV ou anticorpos específicos de RSV, são capazes de especificamente ligar pelo menos um componente do RSV, tal como por exemplo um epítopo de uma proteína do RSV. A adesão não específica não é abrangida pelo termo especificamente ligar. Os anticorpos anti-RSV e equivalentes funcionais de acordo com a presente invenção são particularmente adequados para contraatacar e/ou pelo menos em parte prevenir uma infecção pelo RSV e/ou efeitos adversos de uma infecção pelo RSV. Um anticorpo anti-RSV particularmente preferidos de acordo com a presente invenção é o anticorpo designado D25, que tem uma região de cadeia pesada e uma região de cadeia leve como representado nas Figuras 11A-D. As sequências de CDR de D25, que em particular contribuem para as propriedades de ligação de antígeno de D25, são representados na Figura 11 D. O anticorpo D25 parece ter características superior quando comparado ao anticorpo anti-RSV registrado Palivizumab (Figura 8). Por exemplo, D25 tem um valor de IC50 de cerca de 0,4 a

1,5 ng/ml em um ensaio de neutralização in vitro em que as células HEp-2 são infectadas com RSV, ao passo que Palivizumab tem um valor de IC50 de cerca de 453 ng/ml.

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3/105 [005] Um equivalente funcional de um anticorpo é aqui definido como uma parte funcional, derivado ou análogo de um anticorpo.

[006] Uma parte funcional de um anticorpo é definido como uma parte que tem pelo menos uma mesma propriedade como o dito anticorpo no tipo, não necessariamente na quantidade. A dita parte funcional é capaz de ligar o mesmo antígeno como o dito anticorpo, embora não necessariamente no mesmo grau. Uma parte funcional de um anticorpo preferivelmente compreende um anticorpo de domínio único, um anticorpo de cadeia única, um fragmento variável de cadeia única (scFv), um fragmento Fab ou um fragmento F(ab’)2.

[007] Um derivado funcional de um anticorpo é definido como um anticorpo que foi alterado tal que pelo menos uma propriedade preferivelmente uma propriedade de ligação de antígeno - do composto resultante seja essencialmente a mesma no tipo, não necessariamente na quantidade. Um derivado é fornecido em muitos modos, por exemplo através da substituição de aminoácido conservative, por meio da qual um resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo com propriedades no geral similares (tamanho, hidrofobicidade, etc.), tal que o funcionamento global não seja provável de ser seriamente afetado.

[008] Uma pessoa habilitada na técnica é bem capaz de gerar compostos análogos de um anticorpo. Isto é por exemplo feito através da triagem de uma biblioteca de peptídeo ou biblioteca de demonstração de fago. Um tal análogo tem essencialmente pelo menos uma mesma propriedade como o dito anticorpo no tipo, não necessariamente na quantidade.

[009] Como é bem conhecido pela pessoa habilitada, uma cadeia pesada de um anticorpo é o maior dos dois tipos de cadeias que compõem uma molécula de imunoglobulina. Uma cadeia pesada compreende domínios constantes e um domínio variável, domínio

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4/105 variável este que está envolvido na ligação de antígeno. Uma cadeia leve de um anticorpo é o menor dos dois tipos de cadeias que compõem uma molécula de imunoglobulina. Uma cadeia leve compreende um domínio constante e um domínio variável. O domínio variável é, junto com o domínio variável da cadeia pesada, envolvido na ligação de antígeno.

[0010] As regiões determinadoras de complementaridade (CDRs) são as regiões hipervariáveis presentes nos domínios variáveis de cadeia pesada e domínios variáveis de cadeia leve. As CDRs de uma cadeia pesada e a cadeia leve conectada de um anticorpo juntas formam o sítio de ligação de antígeno.

[0011] Agora que a presente invenção fornece a compreensão de que as sequências de CDR representadas na Figura 11 fornecem as características de ligação de RSV desejadas, uma pessoa habilitada é bem capaz de gerar variantes que compreendem pelo menos uma sequência de CDR alterada. Por exemplo, a substituição de aminoácido conservativa é aplicada. A substituição de aminoácido conservativa envolve a substituição de um aminoácido com um outro com propriedades no geral similares (tamanho, hidrofobicidade, etc.), tal que o funcionamento global não seja provável de ser seriamente afetado.

[0012] Também é possível trocar pelo menos uma sequência de CDR representada na Figura 11 de modo a gerar um anticorpo variante, ou um equivalente funcional deste, com pelo menos uma propriedade alterada quando comparado ao D25. Preferivelmente, um anticorpo ou equivalente funcional é fornecido de modo que compreenda uma sequência de CDR que é pelo menos 70 % idêntica a uma sequência de CDR como representado na Figura 11, de modo que as características de ligação favoráveis de D25 sejam pelo menos em parte mantidas ou mesmo melhoradas. Uma sequência de CDR

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5/105 como representada na Figura 11 é preferivelmente alterada tal que o anticorpo resultante ou equivalente funcional compreende pelo menos uma propriedade melhorada, tal como por exemplo uma afinidade de ligação, seletividade e/ou estabilidade melhoradas, quando comparada ao D25. Os anticorpos variantes ou equivalentes funcionais deste que compreendem uma sequência de aminoácido que é pelo menos 70 % idêntica a uma sequência de CDR como representada na Figura 11 estão portanto dentro do escopo da presente invenção. Vários métodos estão disponíveis na técnica para alterar uma sequência de aminoácido. Por exemplo, uma sequência de cadeia pesada ou cadeia leve com uma sequência desejada de CDR é artificialmente sintetizada. Preferivelmente, uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de CDR é mutada, por exemplo usando a mutagênese aleatória - ou loco-dirigida.

[0013] Em um primeiro aspecto a invenção fornece assim um anticorpo isolado, sintético ou recombinante ou um equivalente funcional deste que são capazes de especificamente ligar o Vírus Sincicial Respiratório e que compreende:

- uma	sequência	de	CDR1	de	cadeia	pesada	que
compreende uma	sequência	que	é pelo	menos 70	% idêntica à
sequência NYIIN, e/ou
- uma	sequência	de	CDR2	de	cadeia	pesada	que
compreende uma	sequência	que	é pelo	menos 75	% idêntica à
sequência GIIPVLGTVHYAPKFQG, e/ou
- uma	sequência	de	CDR3	de	cadeia	pesada	que
compreende uma	sequência	que	é pelo	menos 70	% idêntica à

sequência ETALVVSTTYLPHYFDN, e/ou

- uma sequência de CDR1 de cadeia leve que compreende uma sequência que é pelo menos 85 % idêntica à sequência QASQDIVNYLN, e/ou

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- uma sequência de CDR2 de cadeia leve que compreende uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica à sequência VASNLET.

[0014] Preferivelmente, o dito anticorpo também compreende uma sequência de CDR3 de cadeia leve que compreende uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica à sequência QQYDNLP.

[0015] Preferivelmente, um anticorpo ou um equivalente funcional de acordo com a invenção compreende uma sequência de CDR que é pelo menos 75%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85 %, mais preferivelmente pelo menos 90% idêntica a pelo menos uma das sequências de CDR representadas na Figura 11 D. Mais preferivelmente, um anticorpo ou um equivalente funcional de acordo com a invenção compreende uma sequência de CDR que é pelo menos 95 % idêntica a pelo menos uma das sequências de CDR representada na Figura 11 D. O anticorpo D25 particularmente preferido, descrito acima, compreende as sequências de CDR que consistem das sequências de CDR representadas na Figura 11 D. Uma forma de realização particularmente preferida de acordo com a invenção fornece assim um anticorpo isolado, sintético ou recombinante ou um equivalente funcional deste que são capazes de especificamente ligar o Vírus Sincicial Respiratório e que compreende:

- uma sequência de CDR1 de cadeia pesada que compreende a sequência NYIIN, e/ou

- uma sequência de CDR2 de cadeia pesada que compreende a sequência GIIPVLGTVHYAPKFQG, e/ou

- uma sequência de CDR3 de cadeia pesada que compreende a sequência ETALVVSTTYLPHYFDN, e/ou

- uma sequência de CDR1 de cadeia leve que compreende a sequência QASQDIVNYLN, e/ou

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- uma sequência de CDR2 de cadeia leve que compreende a sequência VASNLET.

[0016] Preferivelmente, o dito anticorpo também compreende uma sequência de CDR3 de cadeia leve que compreende a sequência

QQYDNLP.

[0017] Em uma forma de realização um anticorpo ou equivalente funcional é fornecido que compreende as três sequências de CDR de cadeia pesada e as três sequências de CDR de cadeia leve como representado na Figura 11D, ou sequências que são pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85% idêntica a esta. Portanto é fornecido ainda um anticorpo isolado, sintético ou recombinante ou um equivalente funcional deste que compreende uma sequência de CDR1 de cadeia pesada que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência NYIIN e uma sequência de CDR2 de cadeia pesada que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência GIIPVLGTVHYAPKFQG e uma sequência de CDR3 de cadeia pesada que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência ETALVVSTTYLPHYFDN e uma sequência de CDR1 de cadeia leve que compreende uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica à sequência QASQDIVNYLN e uma sequência de CDR2 de cadeia leve que compreende uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica à sequência VASNLET e uma sequência de CDR3 de cadeia leve que compreende uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica à sequência QQYDNLP. O dito anticorpo ou equivalente funcional preferivelmente compreende as sequências de CDR que são pelo menos 75%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, o mais preferivelmente pelo menos 95% idêntica às sequências de CDR de cadeia pesada e às sequências de CDR de

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8/105 cadeia leve como representado na Figura 11 D. Um anticorpo ou equivalente funcional que compreende as sequências CDR1, CDR2 e

CDR3 de cadeia pesada mencionadas acima assim como as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve mencionadas acima também são fornecidos.

[0018] Anticorpos ou equivalentes funcionais destes que compreende uma sequência de aminoácido de cadeia pesada variável que é pelo menos 70 % idêntica à sequência de cadeia pesada como representada na Figura 11 também são fornecidos. Tais sequências de cadeia pesada fornecem as propriedades de ligação de RSV desejadas, como evidenciado pelo anticorpo D25. Portanto é fornecido ainda um anticorpo ou um equivalente funcional deste, tendo uma sequência de cadeia pesada que compreende uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica à sequência QVQLVQSGAEVKKPGSSVMVSCQASGGPLRNYIINWLRQAPGQGP EWMGGIIPVLGTVHYAPKFQGRVTITADESTDTAYIHLISLRSEDTAMY YCATETALVVSTTYLPHYFDNWGQGTLVTVSS.

[0019] Além disso, as sequências de aminoácido de cadeia leve variáveis que são pelo menos 70 % idênticas à sequência de cadeia leve como representada na Figura 11 também fornecem as propriedades de ligação de RSV desejadas, como evidenciado pelo anticorpo D25. Um anticorpo, ou um equivalente funcional deste tendo uma sequência de cadeia leve que é pelo menos 70 % idêntica à sequência DIQMTQSPSSLSAAVGDRVTITCQASQDIVNYLNWYQQKPGKAPKLLI YVASNLETGVPSRFSGSGSGTDFSLTISSLQPEDVATYYCQQYDNLP LTFGGGTKVEIKRTV portanto também é fornecido. Um anticorpo ou parte funcional de acordo com a invenção preferivelmente compreende uma sequência de cadeia pesada variável e/ou uma sequência de cadeia

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9/105 leve variável que é pelo menos 75%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90 %, o mais preferivelmente pelo menos 95 % idêntica à sequência de cadeia pesada e/ou à sequência de cadeia leve como representada na Figura 11. Quanto mais alta a homologia, mais estreitamente o dito anticorpo ou parte funcional se parece com o anticorpo D25. Um anticorpo ou parte funcional de acordo com a invenção preferivelmente compreende uma cadeia pesada assim como uma cadeia leve que se parece com a cadeia pesada e leve de D25. Portanto é fornecido ainda um anticorpo ou parte funcional que compreende uma sequência de cadeia pesada e uma sequência de cadeia leve que são pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, o mais preferivelmente pelo menos 95 % idêntica à sequência de cadeia pesada e a sequência de cadeia leve como representado na Figura 11.

[0020] Uma forma de realização fornece um anticorpo ou equivalente funcional deste que compreende uma sequência de cadeia pesada que consiste da sequência de cadeia pesada como representada na Figura 11 e uma sequência de cadeia leve que consiste da sequência de cadeia leve como representada na Figura

11. Alternativamente, como é bem conhecido pela pessoa habilitada, é possível gerar uma sequência de cadeia pesada ou cadeia leve encurtada enquanto se mantém uma propriedade de ligação de interesse. Preferivelmente, uma tal cadeia pesada ou cadeia leve encurtadas são geradas de modo que tenham uma região constante mais curta, quando comparadas com as cadeias pesada ou leve originais. O domínio variável é preferivelmente mantido. Por exemplo, um fragmento Fab ou fragmento F(ab’)2 com base em uma sequência de sequência de cadeia pesada ou cadeia leve representada na Figura

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10/105 é produzido. Um equivalente funcional de um anticorpo que compreende pelo menos uma parte funcional de uma sequência como representada na Figura 11 portanto também é fornecido. A dita parte funcional tem um comprimento de pelo menos 20 aminoácidos e compreende uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica à sequência de CDR1 de cadeia pesada representada na Figura 11D e/ou uma sequência que é pelo menos 75 % idêntica à sequência de CDR2 de cadeia pesada representada na Figura 11D e/ou uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica à sequência de CDR3 de cadeia pesada representada na Figura 11D e/ou uma sequência que é pelo menos 85 % idêntica à sequência de CDR1 de cadeia leve representada na Figura 11D e/ou uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica à sequência de CDR2 de cadeia leve representada na Figura 11 D. Preferivelmente, a dita parte funcional também compreende uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica à sequência de CDR3 de cadeia leve representada na Figura 11D.

[0021] Um outro anticorpo anti-RSV particularmente preferido de acordo com a presente invenção é o anticorpo designado AM 14, que tem uma região de cadeia pesada e uma região de cadeia leve como representadas na Figura 14A. As sequências de CDR de AM 14, que em particular contribuem para as propriedades de ligação de antígeno de AM 14, também são representadas na Figura 14A.

[0022] Agora que a presente invenção fornece a compreensão de que as sequências de CDR representadas na Figura 14A fornecem as características de ligação de RSV desejadas, uma pessoa habilitada é bem capaz de gerar variantes que compreendem pelo menos uma sequência de CDR alterada. Por exemplo, a substituição de aminoácido conservative é aplicada. A substituição de aminoácido conservative envolve a substituição de um aminoácido com um outro com propriedades no geral similares (tamanho, hidrofobicidade, etc.),

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11/105 tal que o funcionamento global não seja provável de ser seriamente afetado.

[0023] Também é possível trocar pelo menos uma sequência de CDR representada na Figura 14A de modo a gerar um anticorpo variante, ou um equivalente funcional deste, com pelo menos uma propriedade alterada quando comparada ao AM 14. Preferivelmente, um anticorpo ou equivalente funcional é fornecido de modo que compreenda uma sequência de CDR que é pelo menos 70 % idêntica a uma sequência de CDR como representada na Figura 14A, de modo que as características de ligação favoráveis de AM 14 são pelo menos em parte mantidas ou ainda melhoradas. Uma sequência de CDR como representada na Figura 14A é preferivelmente alterada tal que o anticorpo resultante ou equivalente funcional compreenda pelo menos uma propriedade melhorada, tal como por exemplo uma afinidade de ligação, seletividade e/ou estabilidade melhoradas, quando comparada ao AM 14. As variantes de anticorpo ou equivalentes funcionais deste que compreendem uma sequência de aminoácido que é pelo menos 70 % idêntica a uma sequência de CDR como representada na Figura 14A estão portanto dentro do escopo da presente invenção. Vários métodos são disponíveis na técnica para alterar uma sequência de aminoácido . Por exemplo, uma sequência de cadeia pesada ou cadeia leve com uma sequência desejada de CDR é artificialmente sintetizada. Preferivelmente, uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de CDR é mutada, por exemplo usando a mutagênese aleatória - ou loco-dirigida.

[0024] Em um aspecto a invenção fornece assim um anticorpo isolado, sintético ou recombinante ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo que são capazes de especificamente ligar o Vírus Sincicial Respiratório e que compreende:

- uma sequência de CDR1 de cadeia pesada que

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12/105 compreende uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica à sequência GFSFSHYA, e/ou

- uma sequência de CDR2 de cadeia pesada que compreende uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica à sequência ISYDGENT, e/ou

- uma sequência de CDR3 de cadeia pesada que compreende uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica à sequência ARDRIVDDYYYYGMDV, e/ou

- uma sequência de CDR1 de cadeia leve que compreende uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica à sequência QDIKKY e/ou

- uma sequência de CDR2 de cadeia leve que compreende uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica à sequência DAS, e/ou

- uma sequência de CDR3 de cadeia leve que compreende uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica à sequência QQYDNLPPLT.

[0025] Preferivelmente, um anticorpo ou um equivalente funcional de acordo com a invenção compreende uma sequência de CDR que é pelo menos 75%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90% idêntica a pelo menos uma das sequências de CDR representadas na Figura 14A. O mais preferivelmente, um anticorpo ou um equivalente funcional de acordo com a invenção compreende uma sequência de CDR que é pelo menos 95 % idêntica a pelo menos uma das sequências de CDR representadas na Figura 14A. O anticorpo AM 14 particularmente preferido, descrito acima, compreende as sequências de CDR que consistem das sequências de CDR representadas na Figura 14A. Uma forma de realização particularmente preferida de acordo com a invenção fornece assim um

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13/105 ligar o

Vírus de de de cadeia cadeia cadeia pesada pesada pesada que que que anticorpo isolado, sintético ou recombinante ou um equivalente funcional deste que são capazes de especificamente

Sincicial Respiratório e que compreende:

- uma sequência de CDR1 compreende a sequência GFSFSHYA, e/ou

- uma sequência de CDR2 compreende a sequência ISYDGENT, e/ou

- uma sequência de CDR3 compreende a sequência ARDRIVDDYYYYGMDV, e/ou

- uma sequência de CDR1 de cadeia leve que compreende a sequência QDIKKY, e/ou

- uma sequência de CDR2 de cadeia leve que compreende a sequência DAS, e/ou

- uma sequência de CDR3 de cadeia leve que compreende a sequência QQYDNLPPLT.

[0026] Em uma forma de realização um anticorpo ou equivalente funcional é fornecido que compreende as três sequências de CDR de cadeia pesada e as três sequências de cadeia leve de CDR como representada na Figura 14A, ou sequências que são pelo menos 70 % idêntica a esta. Portanto é fornecido ainda um anticorpo isolado, sintético ou recombinante ou um equivalente funcional deste que compreende uma sequência de CDR1 de cadeia pesada que compreende uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica à sequência GFSFSHYA e uma sequência de CDR2 de cadeia pesada que compreende uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica à sequência ISYDGENT e uma sequência de CDR3 de cadeia pesada que compreende uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica à sequência ARDRIVDDYYYYGMDV e uma sequência de CDR1 de cadeia leve que compreende uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica à sequência QDIKKY e uma sequência de CDR2 de cadeia

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14/105 leve que compreende uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica à sequência DAS e uma sequência de CDR3 de cadeia leve que compreende uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica à sequência QQYDNLPPLT. O dito anticorpo ou equivalente funcional preferivelmente compreende as sequências de CDR que são pelo menos 75%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, o mais preferivelmente pelo menos 95 % idêntica às sequências de CDR de cadeia pesada e às sequências de CDR de cadeia leve como representada na Figura 14A. Um anticorpo ou equivalente funcional que compreende as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada mencionadas acima da Figura 14A assim como as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve mencionadas acima da Figura 14A também é fornecido.

[0027] Os anticorpos ou equivalentes funcionais deste que compreendem uma sequência de aminoácido de cadeia pesada que é pelo menos 70 % idêntica a uma sequência de cadeia pesada como representada na Figura 14A também são fornecidos. Tais sequências de cadeia pesada fornecem as propriedades de ligação de RSV desejadas, como evidenciado pelo anticorpo AM 14. Portanto é fornecido ainda um anticorpo ou um equivalente funcional deste, tendo uma sequência de cadeia pesada que compreende uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica à sequência EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSHYAMHWVRQAPGKGL EWVAVISYDGENTYYADSVKGRFSISRDNSKNTVSLQMNSLRPEDTA LYYCARDRIVDDYYYYGMDVWGQGATVTVSS.

[0028] Além disso, as sequências de aminoácido de cadeia leve que são pelo menos 70% idênticas a uma sequência de cadeia leve como representada na Figura 14A também fornecem as propriedades de ligação de RSV desejadas, como evidenciado pelo anticorpo AM 14.

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Um anticorpo, ou um equivalente funcional deste tendo uma sequência de cadeia leve que é pelo menos 70 % idêntica à sequência

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDIKKYLNWYHQKPGKVPELL

MHDASNLETGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQPEDIGTYYCQQYDNL

PPLTFGGGTKVEIKRTV portanto também é fornecido. Um anticorpo ou parte funcional de acordo com a invenção preferivelmente compreende uma sequência de cadeia pesada variável e/ou uma sequência de cadeia leve variável que é pelo menos 75%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, o mais preferivelmente pelo menos 95% idêntica a uma sequência de cadeia pesada e/ou uma sequência de cadeia leve como representada na Figura 14A. Quanto mais alta a homologia, mais estreitamente o dito anticorpo ou parte funcional se parecem com o anticorpo AM 14. Um anticorpo ou parte funcional de acordo com a invenção preferivelmente compreende uma cadeia pesada assim como uma cadeia leve que se parece com a cadeia pesada e leve de AM 14. Portanto é fornecido ainda um anticorpo ou parte funcional que compreende uma sequência de cadeia pesada e uma sequência de cadeia leve que são pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, o mais preferivelmente pelo menos 95 % idêntica à sequência de cadeia pesada e a sequência de cadeia leve como representada na Figura 14A.

[0029] Uma forma de realização fornece um anticorpo ou equivalente funcional deste que compreende uma sequência de cadeia pesada que consiste da sequência de cadeia pesada como representada na Figura 14A e uma sequência de cadeia leve que consiste da sequência de cadeia leve como representada na Figura 14A. Alternativamente, como é bem conhecido pela pessoa habilitada,

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16/105 é possível gerar uma sequência de cadeia pesada ou cadeia leve encurtada enquanto se mantém uma propriedade de ligação de interesse. Preferivelmente, uma tal cadeia pesada ou cadeia leve são geradas que tem uma região constante mais curta, quando comparado à cadeia pesada ou leve original. O domínio variável é preferivelmente mantido. Por exemplo, um fragmento Fab ou fragmento F(ab’)2 com base em uma sequência de sequência de cadeia pesada ou cadeia leve representada na Figura 14A é produzido. Um equivalente funcional de um anticorpo que compreende pelo menos uma parte funcional de uma sequência como representada na Figura 14A portanto também é fornecido. A dita parte funcional tem um comprimento de pelo menos 20 aminoácidos e compreende uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica a pelo menos uma das sequências de CDR representadas na Figura 14A.

[0030] Um outro anticorpo anti-RSV particularmente preferido de acordo com a presente invenção é o anticorpo designado AM 16, que tem uma região de cadeia pesada e uma região de cadeia leve como representada na Figura 14B. As sequências de CDR de AM 16, que em particular contribuem para as propriedades de ligação de antígeno de AM 16, também são representadas na Figura 14B.

[0031] Agora que a presente invenção fornece a compreensão de que as sequências de CDR representadas na Figura 14B fornecem as características de ligação de RSV desejadas, uma pessoa habilitada é bem capaz de gerar variantes que compreende pelo menos uma sequência de CDR alterada. Por exemplo, a substituição de aminoácido conservative é aplicada. A substituição de aminoácido conservative envolve a substituição de um aminoácido com um outro com propriedades no geral similares (tamanho, hidrofobicidade, etc.), tal que o funcionamento global não seja provável de ser seriamente afetado.

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17/105 [0032] Também é possível trocar pelo menos uma sequência de CDR representada na Figura 14B de modo a gerar um anticorpo variante, ou um equivalente funcional deste, com pelo menos uma propriedade alterada quando comparado ao AM 16. Preferivelmente, um anticorpo ou equivalente funcional é fornecido de modo que compreenda uma sequência de CDR que seja pelo menos 70 % idêntica a uma sequência de CDR como representada na Figura 14B, de modo que as características de ligação favoráveis de AM 16 sejam pelo menos em parte mantidas ou ainda melhoradas. Uma sequência de CDR como representada na Figura 14B é preferivelmente alterada tal que o anticorpo resultante ou equivalente funcional compreenda pelo menos uma propriedade melhorada, tal como por exemplo uma afinidade de ligação, seletividade e/ou estabilidade melhoradas, quando comparado ao AM 16. Anticorpos variantes ou equivalentes funcionais destes que compreendem uma sequência de aminoácido que é pelo menos 70% idêntica a uma sequência de CDR como representada na Figura 14B estão portanto dentro do escopo da presente invenção. Vários métodos são disponíveis na técnica para alterar uma sequência de aminoácido. Por exemplo, uma sequência de cadeia pesada ou cadeia leve com uma sequência desejada de CDR é artificialmente sintetizada. Preferivelmente, uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de CDR é mutada, por exemplo usando a mutagênese aleatória - ou loco-dirigida.

[0033] Em um aspecto a invenção fornece assim um anticorpo isolado, sintético ou recombinante ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo que são capazes de especificamente ligar o Vírus Sincicial Respiratório e que compreende:

- uma sequência de CDR1 de cadeia pesada que compreende uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica à sequência GFTFSSYN, e/ou

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-	uma	sequência	de	CDR2	de	cadeia	pesada	que
compreende	uma	sequência	que	é pelo	menos 70	% idêntica à
sequência ISAGSSYI, e/ou
-	uma	sequência	de	CDR3	de	cadeia	pesada	que
compreende	uma	sequência	que	é pelo	menos 70	% idêntica à

sequência AREDYGPGNYYSPNWFDP, e/ou

- uma sequência de CDR1 de cadeia leve que compreende uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica à sequência SSNIGAGYD, e/ou

- uma sequência de CDR2 de cadeia leve que compreende uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica à sequência GNT, e/ou

- uma sequência de CDR3 de cadeia leve que compreende uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica à sequência HSYDRSLSG.

[0034] Preferivelmente, um anticorpo ou um equivalente funcional de acordo com a invenção compreende uma sequência de CDR que é pelo menos 75%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90% idêntica a pelo menos uma das sequências de CDR representadas na Figura 14B. O mais preferivelmente, um anticorpo ou um equivalente funcional de acordo com a invenção compreende uma sequência de CDR que é pelo menos 95 % idêntica a pelo menos uma das sequências de CDR representadas na Figura 14B. O anticorpo AM 16 particularmente preferido, descrito acima, compreende as sequências de CDR que consistem das sequências de CDR representadas na Figura 14B. Uma forma de realização particularmente preferida de acordo com a invenção fornece assim um anticorpo isolado, sintético ou recombinante ou um equivalente funcional deste que são capazes de especificamente ligar o Vírus

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19/105

Sincicial Respiratório e que compreende:

- uma sequência de CDR1 de cadeia pesada que compreende a sequência GFTFSSYN, e/ou

- uma sequência de CDR2 de cadeia pesada que compreende a sequência ISAGSSYI, e/ou

- uma sequência de CDR3 de cadeia pesada que compreende a sequência AREDYGPGNYYSPNWFDP, e/ou

- uma sequência de CDR1 de cadeia leve que compreende a sequência SSNIGAGYD, e/ou

- uma sequência de CDR2 de cadeia leve que compreende a sequência GNT, e/ou

- uma sequência de CDR3 de cadeia leve que compreende a sequência HSYDRSLSG.

[0035] Em uma forma de realização um anticorpo ou equivalente funcional é fornecido que compreende as três sequências de CDR de cadeia pesada e as três sequências de CDR de cadeia leve como representadas na Figura 14B, ou sequências que são pelo menos 70 % idênticas a estas. Portanto é fornecido ainda um anticorpo isolado, sintético ou recombinante ou um equivalente funcional deste que compreende uma sequência de CDR1 de cadeia pesada que compreende uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica à sequência GFTFSSYN e uma sequência de CDR2 de cadeia pesada que compreende uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica à sequência ISAGSSYI e uma sequência de CDR3 de cadeia pesada que compreende uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica à sequência AREDYGPGNYYSP NWFDP e uma sequência de CDR1 de cadeia leve que compreende uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica à sequência SSNIGAGYD e uma sequência de CDR2 de cadeia leve que compreende uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica à sequência GNT e uma sequência de CDR3 de cadeia leve

Petição 870180144059, de 24/10/2018, pág. 21/133

20/105 que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência HSYDRSLSG. O dito anticorpo ou equivalente funcional preferivelmente compreende as sequências de CDR que são pelo menos 75%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85 %, mais preferivelmente pelo menos 90%, o mais preferivelmente pelo menos 95 % idênticas às sequências de CDR de cadeia pesada mencionadas acima e as sequências de CDR de cadeia leve mencionadas acima como representada na Figura 14B. Um anticorpo ou equivalente funcional que compreende as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada mencionadas acima da Figura 14B assim como as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve mencionadas acima da Figura 14B também é fornecido.

[0036] Os anticorpos ou equivalentes funcionais destes que compreendem uma sequência de aminoácido de cadeia pesada que é pelo menos 70 % idêntica a uma sequência de cadeia pesada como representada na Figura 14B também são fornecidos. Tais sequências de cadeia pesada fornecem as propriedades de ligação de RSV desejadas, como evidenciado pelo anticorpo AM 16. Portanto é fornecido ainda um anticorpo ou um equivalente funcional deste, tendo uma sequência de cadeia pesada que compreende uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica à sequência EVQLVETGGGLAQPGGSLRLSCAASGFTFSSYNMNWVRQAPGKGL EVWSHISAGSSYIYYSDSVKGRFTVSRDNVRNSVYLQMNSLRAADTA VYYCAREDYGPGNYYSPNWFDPWGQGTLVTVSS.

[0037] Além disso, as sequências de aminoácido de cadeia leve que são pelo menos 70% idênticas a uma sequência de cadeia leve como representada na Figura 14B também fornecem as propriedades de ligação de RSV desejadas, como evidenciado pelo anticorpo AM 16. Um anticorpo, ou um equivalente funcional deste tendo uma sequência

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21/105 de cadeia leve que é pelo menos 70 % idêntica à sequência

QSVVTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHVVYQQLPGTAP

KLLIYGNTNRPSGVSDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCHSY

DRSLSGSVFGGGTKLTV portanto também é fornecido. Um anticorpo ou parte funcional de acordo com a invenção preferivelmente compreende uma sequência de cadeia pesada variável e/ou uma sequência de cadeia leve variável que é pelo menos 75%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, o mais preferivelmente pelo menos 95% idêntica à sequência de cadeia pesada e/ou a sequência de cadeia leve como representada na Figura 14B. Quanto mais alta a homologia, mais estreitamente o dito anticorpo ou parte funcional se parecem com o anticorpo AM 16. Um anticorpo ou parte funcional de acordo com a invenção preferivelmente compreende uma cadeia pesada assim como uma cadeia leve que se parece com a cadeia pesada e leve de AM 16. Portanto é fornecido ainda um anticorpo ou parte funcional que compreende uma sequência de cadeia pesada e uma sequência de cadeia leve que são pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, o mais preferivelmente pelo menos 95 % idênticas à sequência de cadeia pesada e à sequência de cadeia leve como representadas na Figura 14B.

[0038] Uma forma de realização fornece um anticorpo ou equivalente funcional deste que compreende uma sequência de cadeia pesada que consiste da sequência de cadeia pesada como representada na Figura 14B e uma sequência de cadeia leve que consiste da sequência de cadeia leve como representada na Figura 14B. Alternativamente, como é bem conhecido pela pessoa habilitada, é possível gerar uma sequência de cadeia pesada ou cadeia leve

Petição 870180144059, de 24/10/2018, pág. 23/133

22/105 encurtada enquanto se mantém uma propriedade de ligação de interesse. Preferivelmente, uma tal cadeia pesada ou cadeia leve encurtadas são geradas de modo que tenham a região constante mais curta, quando comparadas com as cadeias pesada ou leve originais. O domínio variável é preferivelmente mantido. Por exemplo, um fragmento Fab ou fragmento F(ab’)2 com base em uma sequência da sequência de cadeia pesada ou cadeia leve representada na Figura 14B é produzidos Um equivalente funcional de um anticorpo que compreende pelo menos uma parte funcional de uma sequência como representada na Figura 14B portanto também é fornecido. A dita parte funcional tem um comprimento de pelo menos 20 aminoácidos e compreende uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica a pelo menos uma das sequências de CDR representadas na Figura 14B.

[0039] Um outro anticorpo anti-RSV particularmente preferido de acordo com a presente invenção é o anticorpo designado AM23, que tem uma região de cadeia pesada e uma região de cadeia leve como representada na Figura 14C. As sequências de CDR de AM23, que em particular contribuem para as propriedades de ligação de antígeno de AM23, também são representadas na Figura 14C.

[0040] Agora que a presente invenção fornece a compreensão de que as sequências de CDR representadas na Figura 14C fornecem características de ligação de RSV desejadas, uma pessoa habilitada é bem capaz de gerar variantes que compreendem pelo menos uma sequência de CDR alterada. Por exemplo, a substituição de aminoácido conservativa é aplicada. A substituição de aminoácido conservativa envolve a substituição de um aminoácido com um outro com propriedades no geral similares (tamanho, hidrofobicidade, etc.), tal que o funcionamento global não seja provável de ser seriamente afetado.

[0041] Também é possível trocar pelo menos uma sequência de

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CDR representada na Figura 14C de modo a gerar um anticorpo variante, ou um equivalente funcional deste, com pelo menos uma propriedade alterada quando comparado ao AM23. Preferivelmente, um anticorpo ou equivalente funcional é fornecido de modo que compreenda uma sequência de CDR que seja pelo menos 70 % idêntica a uma sequência de CDR como representada na Figura 14C, de modo que as características de ligação favoráveis de AM23 sejam pelo menos em parte mantidas ou ainda melhoradas. Uma sequência de CDR como representada na Figura 14C é preferivelmente alterada tal que o anticorpo resultante ou equivalente funcional compreenda pelo menos uma propriedade melhorada, tal como por exemplo uma afinidade de ligação, seletividade e/ou estabilidade melhoradas, quando comparado ao AM23. Anticorpos variantes ou equivalentes funcionais deste que compreendem uma sequência de aminoácido que é pelo menos 70% idêntica a uma sequência de CDR como representada na Figura 14C estão portanto dentro do escopo da presente invenção. Vários métodos estão disponíveis na técnica para alterar uma sequência de aminoácido. Por exemplo, uma sequência de cadeia pesada ou cadeia leve com uma sequência desejada de CDR é artificialmente sintetizada. Preferivelmente, uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de CDR é mutada, por exemplo usando a mutagênese aleatória - ou loco-dirigida.

[0042] Em um aspecto a invenção fornece assim um anticorpo isolado, sintético ou recombinante ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo que são capazes de especificamente ligar o Vírus Sincicial Respiratório e que compreendem:

- uma sequência	de	CDR1	de	cadeia	pesada	que
compreende uma sequência	que	é pelo	menos 70	% idêntica à
sequência GFNFHNYG, e/ou
- uma sequência	de	CDR2	de	cadeia	pesada	que

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compreende	uma	sequência	que	é	pelo	menos 70	%	idêntica	à
sequência VWYDGSKK, e/ou
-	uma	sequência	de	CDR3	de cadeia	pesada que
compreende	uma	sequência	que	é	pelo	menos 70	%	idêntica	à

sequência VRDKVGPTPYFDS, e/ou

- uma sequência de CDR1 de cadeia leve que compreende uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica à sequência NIGSET, e/ou

- uma sequência de CDR2 de cadeia leve que compreende uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica à sequência DDD, e/ou

- uma sequência de CDR3 de cadeia leve que compreende uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica à sequência QVWDRSNYHQV.

[0043] Preferivelmente, um anticorpo ou um equivalente funcional de acordo com a invenção compreende uma sequência de CDR que é pelo menos 75%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90% idêntica a pelo menos uma das sequências de CDR representadas na Figura 14C. O mais preferivelmente, um anticorpo ou um equivalente funcional de acordo com a invenção compreende uma sequência de CDR que é pelo menos 95 % idêntica a pelo menos uma das sequências de CDR representadas na Figura 14C. O anticorpo AM23 particularmente preferido, descrito acima, compreende as sequências de CDR que consistem das sequências de CDR representadas na Figura 14C. Uma forma de realização particularmente preferida de acordo com a invenção fornece assim um anticorpo isolado, sintético ou recombinante ou um equivalente funcional deste que são capazes de especificamente ligar o Vírus Sincicial Respiratório e que compreendem:

Petição 870180144059, de 24/10/2018, pág. 26/133

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- uma sequência de CDR1 de cadeia pesada que compreende a sequência GFNFHNYG, e/ou

- uma sequência de CDR2 de cadeia pesada que compreende a sequência WVYDGSKK, e/ou

- uma sequência de CDR3 de cadeia pesada que compreende a sequência VRDKVGPTPYFDS, e/ou

- uma sequência de CDR1 de cadeia leve que compreende a sequência NIGSET, e/ou

- uma sequência de CDR2 de cadeia leve que compreende a sequência DDD, e/ou

- uma sequência de CDR3 de cadeia leve que compreende a sequência QVWDRSNYHQV.

[0044] Em uma forma de realização um anticorpo ou equivalente funcional é fornecido que compreende as três sequências de CDR de cadeia pesada e as três sequências de CDR de cadeia leve como representadas na Figura 14C, ou sequências que são pelo menos 70% idênticas a estas. Portanto é fornecido ainda um anticorpo isolado, sintético ou recombinante ou um equivalente funcional deste que compreende uma sequência de CDR1 de cadeia pesada que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência GFNFHNYG e uma sequência de CDR2 de cadeia pesada que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência WVYDGSKK e uma sequência de CDR3 de cadeia pesada que compreende uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica à sequência VRDKVGPTPYFDS e uma sequência de CDR1 de cadeia leve que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência NIGSET e uma sequência de CDR2 de cadeia leve que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à sequência DDD e uma sequência de CDR3 de cadeia leve que compreende uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à

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26/105 sequência QVWDRSNYHQV. O dito anticorpo ou equivalente funcional preferivelmente compreende as sequências de CDR que são pelo menos 75%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85 %, mais preferivelmente pelo menos 90%, o mais preferivelmente pelo menos 95 % idênticas às sequências de CDR de cadeia pesada mencionadas acima e as sequências de CDR de cadeia leve mencionadas acima como representadas na Figura 14C. Um anticorpo ou equivalente funcional que compreende as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada mencionadas acima da Figura 14C assim como as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve mencionadas acima da Figura 14C também são fornecidos.

[0045] Anticorpos ou equivalentes funcionais destes que compreendem uma sequência de aminoácido de cadeia pesada que é pelo menos 70 % idêntica a uma sequência de cadeia pesada como representada na Figura 14C também são fornecidos. Tais sequências de cadeia pesada fornecem as propriedades de ligação de RSV desejadas, como evidenciado pelo anticorpo AM23. Portanto é fornecido ainda um anticorpo ou um equivalente funcional deste, tendo uma sequência de cadeia pesada que compreende uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica à sequência EVQLVESGGNVVKPGTSLRLSCAATGFNFHNYGMNWVRQAPGKGL EWVAVVWYDGSKKYYADSVTGRFAISRDNSKNTLYLQMNSLRVEDT AVYYCVRDKVGPTPYFDSWGQGTLVTVSS.

[0046] Além disso, as sequências de aminoácido de cadeia leve que são pelo menos 70 % idênticas a uma sequência de cadeia leve como representada na Figura 14C também fornecem as propriedades de ligação de RSV desejadas, como evidenciado pelo anticorpo AM23. Um anticorpo, ou um equivalente funcional deste tendo uma sequência de cadeia leve que é pelo menos 70 % idêntica à sequência

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SYVLTQPPSVSLAPGGTAAITCGRNNIGSETVHWYQQKPGQAPVLVV

YDDDDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDRS

NYHQVFGGGTKLTV portanto também é fornecido. Um anticorpo ou parte funcional de acordo com a invenção preferivelmente compreende uma sequência de cadeia pesada variável e/ou uma sequência de cadeia leve variável que é pelo menos 75%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, o mais preferivelmente pelo menos 95% idêntica à sequência de cadeia pesada e/ou a sequência de cadeia leve como representada na Figura 14C. Quanto mais alta a homologia, mais estreitamente o dito anticorpo ou parte funcional se parecem com o anticorpo AM23. Um anticorpo ou parte funcional de acordo com a invenção preferivelmente compreende uma cadeia pesada assim como uma cadeia leve que se parece com a cadeia pesada e leve de AM23. Portanto é fornecido ainda um anticorpo ou parte funcional que compreende uma sequência de cadeia pesada e uma sequência de cadeia leve que são pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, o mais preferivelmente pelo menos 95% idêntica à sequência de cadeia pesada e a sequência de cadeia leve como representada na Figura 14C.

[0047] Uma forma de realização fornece um anticorpo ou equivalente funcional deste que compreende uma sequência de cadeia pesada que consiste da sequência de cadeia pesada como representada na Figura 14C e uma sequência de cadeia leve que consiste da sequência de cadeia leve como representada na Figura 14C. Alternativamente, como é bem conhecido pela pessoa habilitada, é possível gerar uma sequência de cadeia pesada ou cadeia leve encurtada enquanto se mantém uma propriedade de ligação de

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28/105 interesse. Preferivelmente, uma tal cadeia pesada ou cadeia leve encurtadas são geradas de modo que tenham região constante mais curta, quando comparadas às cadeias pesada ou leve originais. O domínio variável é preferivelmente mantido. Por exemplo, um fragmento Fab ou fragmento F(ab’)2 com base em uma sequência da sequência de cadeia pesada ou cadeia leve representada na Figura 14C são produzidos. Um equivalente funcional de um anticorpo que compreende pelo menos uma parte funcional de uma sequência como representada na Figura 14C portanto também é fornecido. A dita parte funcional tem um comprimento de pelo menos 20 aminoácidos e compreende uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica a pelo menos uma das sequências de CDR representadas na Figura 14C. [0048] A presente invenção fornece anticorpos específicos de RSV ou equivalentes funcionais deste tendo propriedades melhoradas quando comparados com os anticorpos da técnica anterior. Os inventores tiveram sucesso na geração de anticorpos específicos de RSV com valores de IC50 baixos. Tais anticorpos têm uma afinidade alta ou forte particular para o RSV e são portanto particularmente adequados para contra-atacar e/ou pelo menos em parte prevenir uma infecção pelo RSV e/ou efeitos adversos de uma infecção pelo RSV. Uma forma de realização fornece um anticorpo que tem um valor de IC50 de menos do que 10 ng/ml em um ensaio de neutralização in vitro em que as células HEp-2 são infectadas com RSV e um equivalente funcional do dito anticorpo. O dito anticorpo ou equivalente funcional preferivelmente tem um valor de IC50 de menos do que 5 ng/ml, mais preferivelmente menos do que 2 ng/ml. O anticorpo D25 preferido tem um valor de IC50 de cerca de 0,5 a 1,5 ng/ml no ensaio de neutralização in vitro descrito nos exemplos (ver a Figura 8).

[0049] Um anticorpo de acordo com a invenção é preferivelmente um anticorpo humano. O uso de anticorpos humanos para a terapia

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29/105 humana diminui a chance de efeitos colaterais devido a uma reação imunológica em um indivíduo humano contra sequências não humanas. Em uma outra forma de realização preferida um anticorpo ou parte funcional, derivado ou análogo de acordo com a invenção é um anticorpo quimérico. dessa maneira, as sequências de interesse, tais como por exemplo um sítio de ligação de interesse, podem ser incluídos em um anticorpo ou equivalente funcional de acordo com a invenção.

[0050] A invenção fornece ainda uma sequência de ácido nucleico isolada, sintética ou recombinante, ou uma parte funcional, derivado ou análogo do mesmo, que codifica um anticorpo ou equivalente funcional de acordo com a invenção. Tal ácido nucleico é por exemplo isolado de uma célula B que são capazes de produzir um anticorpo de acordo com a invenção, como esboçado em mais detalhes abaixo. Uma forma de realização preferida fornece uma sequência de ácido nucleico que compreende uma sequência que é pelo menos 70 % homóloga a pelo menos uma parte funcional de uma sequência de ácido nucleico como representada na Figura 11, Figura 12, Figura 14A, Figura 14B e/ou Figura 14B. A dita sequência de ácido nucleico preferivelmente compreende uma sequência que é pelo menos 75 %, mais preferivelmente pelo menos 80 %, mais preferivelmente pelo menos 85 %, mais preferivelmente pelo menos 90 %, o mais preferivelmente pelo menos 95 % homóloga a pelo menos uma parte funcional de uma sequência de ácido nucleico como representada na Figura 11, Figura 12, Figura 14A, Figura 14B e/ou Figura 14B. A dita parte funcional tem um comprimento de pelo menos 30 nucleotídeos, preferivelmente pelo menos 50 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 75 nucleotídeos. Preferivelmente, a dita parte funcional codifica pelo menos uma sequência de ácido nucleico como representada na Figura 11 D, Figura 12, Figura 14A, Figura 14B e/ou

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Figura 14B. A dita sequência é preferivelmente uma sequência de

CDR.

[0051] Um anticorpo ou equivalente funcional de acordo com a invenção são particularmente adequados para o uso como um remédio ou agente profilático. Um anticorpo de acordo com a invenção, ou uma parte funcional, derivado ou análogo do mesmo, para o uso como um medicamento e/ou agente profilático portanto também é fornecido anexo. Em uma forma de realização particularmente preferida o dito anticorpo compreende os anticorpos D25, AM 14, AM 16 e/ou AM23, ou uma parte funcional, derivado ou análogo do mesmos. O dito medicamento ou agente profilático é preferivelmente usado para contra-atacar ou pelo menos em parte prevenir uma infecção pelo uma infecção pelo RSV ou para contra-atacar ou pelo menos em parte prevenir efeitos adversos de uma infecção pelo RSV. Um uso de um anticorpo, parte funcional, derivado ou análogo de acordo com a invenção para a preparação de um medicamento e/ou agente profilático para pelo menos em parte tratar e/ou prevenir um distúrbio relacionado com RSV portanto também é fornecido, assim como um método para pelo menos em parte tratar ou prevenir um distúrbio relacionado com RSV, o método compreendendo administrar a um indivíduo em necessidade deste uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ou equivalente funcional de acordo com a invenção. O dito anticorpo preferivelmente compreende o anticorpo D25, AM14, AM16 e/ou AM23, ou uma parte funcional, derivado ou análogo do mesmo.

[0052] De modo a contra-atacar o RSV, um anticorpo ou equivalente funcional de acordo com a invenção é preferivelmente administrado a um indivíduo antes que uma infecção pelo RSV tenha ocorrido. Alternativamente, um anticorpo ou equivalente funcional de acordo com a invenção é administrado quando um indivíduo já está

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31/105 infectado pelo RSV. O dito anticorpo ou equivalente funcional é preferivelmente administrado aos indivíduos com um risco aumentado de distúrbios relacionados com RSV, tal como por exemplo crianças com nascimento prematuro, indivíduos com doença pulmonar crônica, doença cardíaca congênita e/ou imunidade comprometida e crianças com uma idade mais jovem do que 6 semanas. Também as pessoas idosas têm um risco aumentado de distúrbio relacionado com RSVs. Anticorpos ou equivalentes funcionais de acordo com a invenção são preferivelmente administrados oralmente ou por intermédio de uma ou mais injeções. As faixas de dose de anticorpos e/ou equivalentes funcionais de acordo com a invenção a ser usada nas aplicações terapêuticas como aqui descritas antes são planejadas com base em estudos de elevação de dose na clínica em testes clínicos para os quais exigências de protocolo rigoroso existem. As doses típicas estão entre 0,1 e 10 mg por kg de peso corporal. Para aplicação terapêutica, anticorpos ou equivalentes funcionais de acordo com a invenção são tipicamente combinados com um carregador, adjuvante, diluente e/ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis. Os exemplos de carregadores adequados por exemplo compreendem hemocianina do lapa buraco de fechadura (KLH), albumina sérica (por exemplo, BSA ou RSA) e ovalbumina. Muitos adjuvantes adequados, com base em óleo e com base em água, são conhecidos a uma pessoa habilitada na técnica. Em uma forma de realização o dito adjuvante compreende Speed. Em uma outra forma de realização, o dito carregador adequado compreende uma solução como por exemplo solução salina.

[0053] Já em uma outra forma de realização um ácido nucleico que codifica um anticorpo ou parte funcional de acordo com a invenção é usado. Na administração de tal ácido nucleico, anticorpos ou equivalentes funcionais são produzidos pelo mecanismo do

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32/105 hospedeiro. Os anticorpos ou equivalentes funcionais produzidos são capazes de prevenir e/ou contra-atacar a infecção pelo RSV e/ou os efeitos adversos de uma infecção pelo RSV. Uma sequência de ácido nucleico, parte funcional, derivado e/ou análogo de acordo com a invenção para o uso como um medicamento e/ou agente profilático portanto também é fornecida anexa. O dito ácido nucleico é preferivelmente usado para contra-atacar RSV. Portanto é fornecido ainda um uso de uma sequência de ácido nucleico, parte funcional, derivado e/ou análogo de acordo com a invenção para a preparação de um medicamento e/ou agente profilático para pelo menos em parte tratar e/ou prevenir um distúrbio relacionado com RSV.

[0054] Por pelo menos uma parte funcional de um ácido nucleico da invenção é intencionada uma parte do dito ácido nucleico, pelo menos 30 pares de base de comprimento, preferivelmente pelo menos 50 pares de base de comprimento, mais preferivelmente pelo menos 100 pares de base de comprimento, que compreenda pelo menos uma característica de expressão (no tipo não necessariamente na quantidade) como um ácido nucleico da invenção. A dita parte funcional pelo menos codifica uma sequência de aminoácido que compreende uma sequência que é pelo menos 70 % idêntica a uma sequência de CDR como representada na Figura 11 D, Figura 14A, Figura 14B e/ou Figura 14C.

[0055] A invenção além disso fornece uma célula que produz anticorpo isolado capaz de produzir um anticorpo, parte funcional, derivado ou análogo de acordo com a invenção. Os modos possível (mas não limitantes) de se obter tais células que produzem anticorpo são esboçados em detalhes nos exemplos. Os inventores desenvolveram e usaram um novo método de modo a melhorar a estabilidade de células que produzem anticorpo específicas do RSV. Usando este método, as células que produzem anticorpo específicas

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33/105 do RSV são geradas de modo que sejam estáveis por pelo menos seis meses. Uma célula que produz anticorpo específica do RSV de acordo com a invenção, que é estável por pelo menos nove semanas, preferivelmente por pelo menos três meses, mais preferivelmente por pelo menos seis meses portanto também é fornecida anexa.

[0056] Os presentes inventores usaram a sua compreensão de que a estabilidade de uma célula que produz anticorpo específica do RSV é influenciada influenciando-se a quantidade de produto de expressão BCL6 e/ou Blimp-1 dentro da dita célula que produz anticorpo. A quantidade de produto de expressão BCL6 e/ou Blimp-1 é direta ou indiretamente influenciada. Preferivelmente as quantidades dos produtos de expressão tanto de BCL6 quanto de Blimp-1 dentro da dita célula que produz anticorpo são reguladas, visto que ambos os produtos de expressão estão envolvidos na estabilidade de uma célula que produz anticorpo. A estabilidade de uma célula que produz anticorpo é definida como a capacidade da dita célula que produz anticorpo para permanecer em um certo estágio de desenvolvimento (preferivelmente depois que a dita célula foi levada ao dito estágio). Os estágios de desenvolvimento diferentes de uma célula envolvem pelo menos uma característica diferente da dita célula. Por exemplo, uma célula B de memória é conhecida diferenciar na estimulação em uma célula plasmática que secreta anticorpo por intermédio de um estágio que alguns pesquisadores chamam de um plasmoblasto. Uma célula B de memória, um plasmoblasto e uma célula plasmática são estágios de desenvolvimento diferentes de uma célula B, em que a célula B tem características diferentes. Uma célula B de memória exibe proliferação e secreção de anticorpo baixas. Um plasmoblasto exibe tanto proliferação mais alta quanto níveis de secreção de anticorpo mais altos quando comparado com uma célula B de memória, ao passo que uma célula plasmática secreta níveis de anticorpo altos mas não é

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34/105 capaz de proliferar. Com um método dos presentes inventores tornouse possível regular o período de vida replicativa de uma célula que produz anticorpo. Um período de vida replicativa de uma célula que produz anticorpo é aqui definido como o período de tempo em que uma célula B e suas células descendentes são capazes de replicar enquanto se mantém a sua capacidade de produzir anticorpo e/ou desenvolver em uma célula que produz anticorpo. Preferivelmente o período de vida replicativa de uma célula que produz anticorpo é prolongada, significando que a dita célula que produz anticorpo não diferenciar-se-á terminalmente - ou apenas depois de um período mais longo quando comparado com o mesmo tipo de células que produzem anticorpo que é correntemente usado - e continuam a proliferar in vitro. De acordo com os inventores é possível regular a quantidade de produto de expressão BCL6 e/ou Blimp-1 em uma célula que produz anticorpo a um tal grau que a célula que produz anticorpo é levada e/ou mantida em, um estado de desenvolvimento predeterminado em que as células continuam a proliferar. Com um método dos inventores tornou-se portanto possível aumentar o período de vida replicativa de uma célula que produz anticorpo visto que é possível manter uma célula B em um certo estágio de desenvolvimento em que a replicação ocorre. Referência é feita a PCT/NL2006/000625, depositado pelo mesmo requerente. A presente invenção fornece meios e métodos para produzir células que produzem anticorpo específicas do RSV estáveis.

[0057] Uma célula que produz anticorpo é definida como uma célula cuja célula é capaz de produzir e/ou secretar anticorpo ou um equivalente funcional deste e/ou cuja célula é capaz de desenvolver em uma célula que é capaz de produzir e/ou secretar anticorpo ou um equivalente funcional deste. Uma célula que produz anticorpo específica do RSV é aqui definida como uma célula capaz de produzir

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35/105 e/ou secretar anticorpos ou equivalentes funcionais deste que são capazes de especificamente ligar RSV e/ou um componente de RSV, tal como por exemplo um epítopo da proteína F (fusão) do RSV, a proteína G (ligação) do RSV ou a proteína SH (hidrofóbica pequena) do RSV. Preferivelmente, a dita célula que produz anticorpo específica do RSV compreende uma célula B e/ou uma célula plasmática derivada de célula B. Uma célula B é aqui chamada de uma célula que produz anticorpo, mesmo quando a célula B está em um estágio em que a produção de anticorpo é baixo ou não presente de nenhuma maneira, tal como uma célula B ingênua ou uma célula B de memória, seja ativada ou não, porque tais células são capazes de desenvolverem-se em células que produzem anticorpo, tal como um plasmoblasto e/ou célula plasmática.

[0058] Uma célula que produz anticorpo específica do RSV de acordo com a invenção preferivelmente compreende uma célula de mamífero. Os exemplos não limitantes incluem células que produzem anticorpo derivadas de um indivíduo humano, roedor, coelho, lhama, porco, vaca, cabra, cavalo, macaco, gorila. Preferivelmente, a dita célula que produz anticorpo compreende uma célula humana, uma célula de murino, uma célula de coelho e/ou uma célula de lhama.

[0059] BCL6 codifica um repressor transcricional que é requerido para o desenvolvimento e maturação de célula B e célula T normais e que é requerido para a formação de centros germinais. (Ye, 1997). BCL6 é altamente expressado em células B de centro germinal ao passo que o mesmo é dificilmente expressado em células plasmáticas. BCL6 inibe a diferenciação de células B ativadas em células plasmáticas. O linfócito B transcricional repressor que induziu a proteína 1 de maturação (Blimp-1) é requerido para o desenvolvimento de uma célula B em uma célula plasmática. A variante humana de Blimp-1 é chamada de Prdml. Como aqui usado, qualquer referência

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36/105 a Blimp-1 inclui uma referência a Prdml. Blimp-1 direciona a diferenciação de célula plasmática. BCL6 e Blimp-1 reprimem a expressão um do outro; assim em uma situação natural quando um atinge um nível de expressão mais alta do que o outro, o estágio de diferenciação é forçado. No corpo humano, a diferenciação de células plasmáticas a partir de células B ingênuas ou de memória ativadas envolve a regulagem negativa de BCL6 e a regulagem positiva de Blimp-1. Nas células BCL6 de centro germinal a expressão é alta e a expressão de Blimp-1 é baixa. No repouso a expressão das células de memória de BCL6 e Blimp-1 é baixa. Os sinais que deflagram a diferenciação causa uma regulagem positiva de Blimp-1 e este Blimp-1 contra-ataca a expressão de BCL6. O estágio onde tanto BCL6 quanto Blimp-1 são expressados tem vida curta e é chamado de um plasmoblasto. Com níveis de Blimp-1 progressivamente crescentes, a expressão de BCL6 é extinguida, resultando em uma célula plasmática.

[0060] Em uma forma de realização da presente invenção, uma célula que produz anticorpo específica do RSV é fornecida em que BCL6 e Blimp-1 são co-expressados (significando que tanto BCL6 quanto Blimp-1 são expressados na dita célula que produz anticorpo por pelo menos 1 dia, preferivelmente pelo menos uma semana, mais preferivelmente pelo menos seis semanas, o mais preferivelmente pelo menos três meses. A dita célula que produz anticorpo específica do RSV é capaz de proliferar quando um sinal apropriado é fornecido. Foi descoberto que a co-expressão de BCL6 e Blimp-1 resulta em uma célula que produz anticorpo que são capazes tanto de proliferar quanto produzir anticorpo. BCL6 e Blimp-1 são preferivelmente coexpressados em uma célula B, preferivelmente uma célula B humana. A co-expressão de BCL6 e Blimp-1 em uma célula B resulta na estabilização da dita célula B em um estágio equivalente ao

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37/105 plasmoblasto. Os plasmoblastos, equivalentes às células plasmáticas, são capazes de secretar anticorpo. Entretanto, os plasmoblastos são ainda capazes de proliferar, ao passo que as células plasmáticas perderam a sua capacidade de proliferar. As células plasmáticas são portanto inadequadas para cultivar linhagens de célula que produzem anticorpo.

[0061] Uma forma de realização preferida fornece uma célula que produz anticorpo específica do RSV que compreende uma sequência de ácido nucleico exógena que codifica BCL6 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo. Um ácido nucleico exógeno é aqui definido como uma sequência de ácido nucleico que não naturalmente pertence ao genoma de uma célula. Com tal molécula de ácido nucleico exógena é possível regular uma concentração de BCL6 em uma célula que produz anticorpo independentemente da expressão de BCL6 endógeno. Consequentemente, mesmo se a expressão de BCL6 endógeno é baixa ou ausente, por exemplo causada pelo Blimp-1, uma sequência de ácido nucleico exógena que codifica BCL6 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo desta é ainda capaz de produzir uma concentração de BCL6 que é suficiente para influenciar a estabilidade de uma célula que produz anticorpo. Preferivelmente, a dita sequência de ácido nucleico que codifica BCL6 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo é constitutivamente ativa, de modo que a expressão de BCL6 é mantida mesmo quando a expressão de BCL6 endógeno da dita célula é inibida por um repressor endógeno tal como Blimp-1. Mais preferivelmente, a expressão da dita sequência de ácido nucleico que codifica BCL6 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo desta é regulada por um indutor exógeno de repressor, de modo que o grau de expressão de BCL6 é regulada à vontade.

[0062] Preferivelmente, como esboçado abaixo em mais detalhes,

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38/105 uma célula que produz anticorpo específica do RSV de acordo com a invenção compreende uma sequência de ácido nucleico exógena que codifica Bcl-xL ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo. Se Bcl-xL ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo está presente, é possível cultivar plasmoblastos sob condições de densidade de célula baixa. A expressão da dita sequência de ácido nucleico que codifica Bcl-xL ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo desta é preferivelmente regulada por um indutor exógeno de repressor, de modo que o grau de expressão de Bcl-xL é regulada à vontade. Uma forma de realização preferida portanto fornece uma célula que produz anticorpo específica do RSV que compreende:

- uma sequência de ácido nucleico exógena que codifica BCL6 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo, e/ou

- uma sequência de ácido nucleico exógena que codifica Bcl-xL ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo. A dita célula que produz anticorpo específica do RSV preferivelmente compreende tanto uma sequência de ácido nucleico exógena que codifica BCL6 - ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo desta quanto uma sequência de ácido nucleico exógena que codifica Bcl-xL ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo desta. Preferivelmente, a expressão da dita sequência de ácido nucleico que codifica BCL6, Bcl-xL ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo de BCL6 ou BclxL é regulada por um ativador e/ou repressor que é indutível por um composto exógeno. Por exemplo, um sistema de promotor indutível é usado tal como um sistema Tet-on ou Tet-off.

[0063] Uma célula que produz anticorpo específica do RSV estável de acordo com a invenção é preferivelmente gerada pela co-expressão de BCL6 e Blimp-1 em uma célula que produz anticorpo específica do RSV. Uma célula que produz anticorpo específica do RSV é preferivelmente obtida de um indivíduo que foi exposto ao RSV. Os

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39/105 métodos para isolar as células que produzem anticorpo são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, compostos derivados de RSV que são comercializados com um rótulo e/ou caracter são incubados com uma amostra de um indivíduo que foi exposto ao RSV, amostra esta que compreende células que produzem anticorpo. As células que produzem anticorpo específicas do RSV que reconhecem os compostos rotulados derivados de RSV são isolados enquanto que as células não ligadas são retiradas por lavagem. As células que produzem anticorpo específicas do RSV resultantes são subsequentemente estabilizadas pela co-expressão de BCL6 assim como Blimp-1.

[0064] Uma forma de realização envolve primeiro estabilizar as células que produzem anticorpo totais de um doador exposto ao RSV e depois isolar as células que reconhecem o composto derivado de RSV caracterizado. Em uma outra forma de realização as células que produzem anticorpo são equipadas com um marcador (fluorescente) a jusante do seu receptor de célula B (BCR, membrana expressada a partir do anticorpo) que sinaliza quando a célula que produz anticorpo liga-se a um antígeno não caracterizado/não rotulado por intermédio de BCR. As células que produzem anticorpo nas quais o marcador é ativado são selecionadas e são subsequentemente estabilizadas pela co-expressão de BCL6 assim como Blimp-1. Em uma outra forma de realização, quando não existe nenhum composto derivado de antígeno disponível mas quando existem ensaios disponíveis para triar quanto a anticorpos únicos, células que produzem anticorpo totais/volumosas são estabilizadas pela co-expressão de BCL6 assim como Blimp-1 e, opcionalmente, também Bcl-XL. De acordo com esta forma de realização, as células são cultivadas em densidades baixas, preferivelmente entre 10 e 100 células por 96 reservatórios, na presença de células L (culturas de mini volume, MBC). Os

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40/105 sobrenadantes de cultura podem ser usados diretamente em ensaios de triagem, como ELISA, Western blot ou ensaios funcionais como ELISPOT, ensaios de neutralização ou ensaios de migração de célula. [0065] Em uma forma de realização MBCs são selecionadas e, para obter linhagens de célula monoclonal da célula que produz anticorpo de interesse, culturas de diluição limitante são realizadas e, preferivelmente 2 a 3 semanas mais tarde, os sobrenadantes destas culturas são triadas mais uma vez no ensaio preferido.

[0066] Como é bem conhecido pela pessoa habilitada, muitos métodos alternativos são disponíveis na técnica. As formas de realização mencionadas acima não são limitantes.

[0067] Portanto é fornecido ainda um método para produzir uma célula que produz anticorpo, que é estável por pelo menos três meses e que são capazes de produzir anticorpos específicos de RSV ou equivalentes funcionais deste, o método compreendendo:

- aumentar um nível de expressão de Blimp-1 em uma célula que é capaz de produzir anticorpos específicos de RSV ou equivalentes funcionais deste; e

- aumentar e/ou manter um nível de expressão de BCL6 na dita célula.

[0068] Com um método de acordo com a invenção tem se tornado possível converter uma célula B de memória específica de RSV em uma célula equivalente a plasmoblasto e estabilizar a dita célula, de modo que a diferenciação rápida em uma célula plasmática não ocorra. Isto é contrário ao desenvolvimento natural de células plasmáticas, em que a expressão de Blimp-1 em uma célula B de memória resulta no desenvolvimento rápido em uma célula plasmática, inibindo deste modo a expressão de BCL6 de modo que a célula plasmática resultante dificilmente expresse BCL6. Uma forma de realização da presente invenção assim envolve a co-expressão tanto

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41/105 de BCL6 quanto de Blimp-1 em uma célula B específica de RSV, resultando em uma célula que é capaz tanto de proliferar quanto de produzir anticorpo. O nível de expressão de BCL6 na dita célula B específica de RSV é preferivelmente levado e mantido, essencialmente no mesmo nível ou em um nível mais alto quando comparado a um plasmoblasto. Dessa maneira uma cultura estável de células B específica de RSV é gerada, células estas que permanecem capazes de produzir anticorpos específicos de RSV. Estas células B específicas de RSV que co-expressam BCL6 e Blimp-1 são preferivelmente estabilizadas ainda através da adição do gene Bcl-xL anti-apoptótico. Com a introdução de Bcl-xL é agora possível cultivar plasmoblastos sob condições de densidade de célula baixa. Consequentemente, a invenção também fornece um método para cultivar plasmoblastos sob condições de densidade de célula baixa que compreende gerar uma célula que produz anticorpo específica do RSV com níveis de expressão de BCL6, Blimp-1 e Bcl-xL com qualquer um dos métodos aqui descritos.

[0069] A quantidade de produto de expressão de BCL6 (preferivelmente uma proteína BCL6) em uma célula que produz anticorpo específica do RSV é regulada em uma variedade de modos. [0070] Em uma forma de realização uma célula que produz anticorpo é fornecida com um composto capaz de direta ou indiretamente influenciar a expressão de BCL6. Uma célula que produz anticorpo é preferivelmente fornecida com um composto capaz de realçar a expressão de BCL6, de modo a contra-atacar a regulagem negativa de BCL6 durante a expressão de Blimp-1. Tal composto preferivelmente compreende uma proteína de Transdutor de Sinal de Ativação e Transcrição 5 (STAT5) ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo desta e/ou uma sequência de ácido nucleico que codifica consequentemente. STAT5 é um transdutor de sinal

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42/105 capaz de realçar a expressão de BCL6. Existem duas formas conhecidas de STAT5, STAT5a e STAT5b, que são codificadas por dois genes diferentes, ligados em tandem. A administração e/ou ativação de STAT5 resulta em níveis de BCL6 realçados. Consequentemente, a regulagem negativa de BCL6 pelo Blimp-1 é pelo menos em parte compensada pela regulagem positiva da expressão de BCL6 pelo STAT5 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo. Consequentemente, STAT5 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo são capazes de influenciar diretamente a expressão de BCL6. Também é possível influenciar indiretamente a expressão de BCL6. Isto é por exemplo feito pela regulagem da quantidade de um composto que por sua vez é capaz de direta ou indiretamente ativar STAT5 e/ou regular a expressão de STAT5. Consequentemente, em uma forma de realização a expressão e/ou atividade de STAT5 endógeno e/ou exógeno é aumentada. É por exemplo possível realçar indiretamente a expressão de BCL6 cultivando-se uma célula que produz anticorpo na presença de interleucina (IL) 2 e/ou IL 4 que são capazes de ativar STAT5.

[0071] Em uma forma de realização, uma célula que produz anticorpo específica do RSV é fornecida com uma sequência de ácido nucleico que codifica STAT5 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo, em que a dita sequência de ácido nucleico é constitutivamente ativa, significando que STAT5 é continuamente expressada, independente da presença de reguladores (endógenos). no caso em que a expressão de STAT5 endógena é baixa, ou ausente, uma sequência de ácido nucleico que codifica STAT5 exógena constitutivamente ativa ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo é preferivelmente aplicada resultando em uma concentração de STAT5 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo que é suficiente para realçar a expressão de BCL6.

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O mais preferivelmente, uma célula que produz anticorpo específica do RSV é fornecida com uma sequência de ácido nucleico que codifica um composto que compreende STAT5 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo, preferivelmente uma proteína de fusão, cuja atividade é regulada por um indutor exógeno de repressor, de modo que o grau de ativação da expressão de BCL6 é regulada à vontade. Um outro sistema que permite a indução de BCL-6 é fornecida por um sistema Tet-on em que a adição de tetraciclina e/ou derivados de tetraciclina induzem a atividade de um transativador que induziu a transcrição de gene de BCL6 seguida pela síntese da proteína BCL. Em uma forma de realização preferida, uma célula que produz anticorpo é fornecida com uma sequência de ácido nucleico que codifica um receptor de estrogênio (ER) e STAT5 como uma proteína de fusão ER-STAT5. Esta proteína de fusão é inativa porque a mesma forma um complexo com proteínas de choque térmico no citossol. Dessa maneira, STAT5 é incapaz de atingir o núcleo e a expressão de BCL6 não é realçada. Na administração do indutor exógeno 4 hidróxi-tamoxifeno (4HT), a proteína de fusão ER-STAT5 dissocia-se das proteínas de choque térmico, de modo que STAT5 é capaz de entrar no núcleo e ativar a expressão de BCL6.

[0072] Adicional ou alternativamente, a expressão de BCL6 em uma célula que produz anticorpo específica do RSV é realçada cultivando-se a dita célula que produz anticorpo na presença de um composto capaz de direta ou indiretamente realçar a expressão de BCL6.

[0073] Uma forma de realização portanto fornece um método para produzir uma célula que produz anticorpo específica do RSV que compreende:

- fornecer uma célula que produz anticorpo específica do RSV com um composto capaz de direta ou indiretamente realçar a

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44/105 expressão de BCL6; e/ou

- cultivar uma célula que produz anticorpo específica do RSV na presença de um composto capaz de direta ou indiretamente realçar a expressão de BCL6. O dito composto capaz de direta ou indiretamente realçar a expressão de BCL6 preferivelmente compreende STAT5 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo. É portanto fornecido um método de acordo com a invenção que compreende fornecer a dita célula que produz anticorpo específica do RSV com STAT5 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo, ou com uma sequência de ácido nucleico que codifica STAT5 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo. Em uma forma de realização a dita célula que produz anticorpo é cultivada depois da introdução de uma sequência de ácido nucleico que codifica STAT5 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo na dita célula. A dita sequência de ácido nucleico é por exemplo introduzida na dita célula pela transfecção e/ou transferência de gene mediada por vírus. Muitos métodos alternativos para introduzir uma sequência de ácido nucleico em uma célula são disponíveis na técnica que não necessitam de nenhuma outra explicação aqui.

[0074] Com um composto capaz de realçar direta ou indiretamente a expressão de BCL6 é possível realçar a expressão de BCL6 endógeno. Em uma forma de realização preferida entretanto uma célula que produz anticorpo é fornecida com uma sequência de ácido nucleico que codifica BCL6 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo desta. Como aqui explicado antes, um ácido nucleico exógeno que codifica BCL6 é preferido porque isto permite a regulagem de uma concentração de BCL6 dentro de uma célula independentemente a partir da expressão de BCL6 endógeno. Consequentemente, mesmo se a expressão de BCL6 endógeno é baixa ou ausente, por exemplo causada pelo Blimp-1, uma sequência de ácido nucleico exógena que

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45/105 codifica BCL6 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo é ainda capaz de produzir uma concentração de BCL6 que é suficiente para influenciar a estabilidade de uma célula que produz anticorpo. Também é fornecido portanto um método de acordo com a invenção que compreende fornecer uma célula que produz anticorpo específica do RSV com uma sequência de ácido nucleico que codifica BCL6 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo. Preferivelmente, a dita célula que produz anticorpo é fornecida com uma sequência de ácido nucleico constitutivamente ativa que codifica BCL6 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo, de modo que a expressão de BCL6 seja mantida mesmo quando a expressão de BCL6 endógeno da dita célula é inibida por um repressor endógeno tal como Blimp-1. O mais preferivelmente, a expressão da dita sequência de ácido nucleico que codifica BCL6 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo é regulada por um indutor exógeno de repressor, de modo que o grau de expressão de BCL6 seja regulado à vontade. Por exemplo, um sistema de promotor indutível é usado tal como um sistema Tet-on ou Tet-off, como já descrito.

[0075] Em uma outra forma de realização preferida, a invenção fornece um método em que a quantidade de BCL6 é indiretamente regulada pelo fornecimento de uma célula que produz anticorpo específica do RSV com uma sequência de ácido nucleico que codifica E47 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo. E47 codifica um fator de transcrição que pertence a uma família de proteínas de hélice-alça-hélice, chamadas de proteínas E. Existem quatro proteínas E, E12, E47, E2-2 e HEB, que estão envolvidas no desenvolvimento de linfócito. E12 e E47 são codificadas por um gene, chamado de E2A, que é unido de modo diferente. As proteínas E podem ser inibidas pelos inibidores de proteína E Id2 e Id3 e por ABFPetição 870180144059, de 24/10/2018, pág. 47/133

46/105 (Mathas S., 2006). As proteínas E foram descritas como supressores de tumor e a supra-expressão tem sido mostrada induzir a apoptose. Um dos alvos específicos de E47 são os genes Socsl e Socs3. Estes genes Soes são conhecidos como reguladores negativos de STAT5b e assim indiretamente de BCL6. Em outras palavras, a expressão de E47 dentro de uma célula B realça a expressão de Blimp-1 que resulta na diferenciação de célula B contra um fenótipo que produz anticorpo (plasmacélula).

[0076] A quantidade de expressão de Blimp-1 em uma célula que produz anticorpo específica do RSV também é regulada em uma variedade de modos. Em uma forma de realização uma célula que produz anticorpo específica do RSV é fornecida com um composto capaz de direta ou indiretamente influenciar a expressão de Blimp-1. Adicional ou alternativamente, uma célula que produz anticorpo é cultivada na presença de um composto capaz de direta ou indiretamente influenciar a expressão de Blimp-1. Portanto é fornecido ainda um método de acordo com a invenção que compreende fornecer uma célula que produz anticorpo específica do RSV com um composto capaz de direta ou indiretamente influenciar a expressão de Blimp-1. Ainda é fornecido um método de acordo com a invenção que compreende cultivar a dita célula que produz anticorpo na presença de um composto capaz de direta ou indiretamente influenciar a expressão de Blimp-1. Preferivelmente, um composto é usado que é capaz de realçar a expressão de Blimp-1 de modo a contra-atacar a regulagem negativa de Blimp-1 durante a expressão de BCL6. O dito composto o mais preferivelmente compreende IL-21.

[0077] Em uma forma de realização preferida o dito composto capaz de direta ou indiretamente influenciar a expressão de Blimp-1 compreende um Sinal Transdutor de Ativação e Transcrição 3 (STAT3) proteína ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo

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47/105 e/ou uma sequência de ácido nucleico que codifica consequentemente. STAT3 é um transdutor de sinal que está envolvido no desenvolvimento e diferenciação de célula B. STAT3 é capaz de regular positivamente a expressão de Blimp-1. Portanto é fornecido ainda um método de acordo com a invenção em que o dito composto capaz de direta ou indiretamente influenciar a expressão de Blimp-1 compreende STAT3 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo, ou uma sequência de ácido nucleico que codifica STAT3 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo. O mais preferivelmente, a expressão da dita sequência de ácido nucleico que codifica STAT3 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo é regulada por um indutor exógeno de repressor, de modo que o grau de expressão de STAT3 é regulado à vontade. Por exemplo, um sistema de promotor indutível é usado tal como por exemplo um sistema Tet-on ou Tet-off. Em uma forma de realização um produto de fusão que compreende de STAT3, um derivado ou análogo e ER é introduzido na dita célula permitindo a regulagem da expressão de STAT3 pelo hidroxitamoxifeno.

[0078] Visto que STAT3 é capaz de influenciar a expressão de Blimp-1, também é possível indiretamente regular a expressão de Blimp-1 pela administração de um composto capaz de direta ou indiretamente regular a atividade e/ou expressão de STAT3. Em uma forma de realização uma célula que produz anticorpo é fornecida com um composto que é capaz de realçar a atividade de STAT3, de modo que a expressão de Blimp-1 também seja indiretamente realçada. Portanto é fornecido ainda um método de acordo com a invenção, em que uma célula que produz anticorpo é fornecida com um composto capaz de direta ou indiretamente realçar a atividade de STAT3.

[0079] Consequentemente, em uma forma de realização uma célula que produz anticorpo é fornecida com um composto capaz de

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48/105 direta ou indiretamente ativar STAT3, de modo a realçar a expressão de Blimp-1.

[0080] STAT3 é ativado em uma variedade de modos. Preferivelmente, STAT3 é ativado pelo fornecimento de uma célula que produz anticorpo com uma citocina. As citocinas, que estão naturalmente envolvidas na diferenciação de célula B, são muito eficazes na regulagem das proteínas STAT. Os ativadores muito eficazes de STAT3 são IL-21 e IL-6, mas também IL-2, IL-7, IL-10, IL15 e IL-27 são conhecidos por ativar STAT3. Além disso, receptores equivalentes a Toll (TLRs) que estão envolvidos na imunidade inata também são capazes de ativar STAT3. Uma forma de realização portanto fornece um método da invenção, em que o dito composto capaz de direta ou indiretamente influenciar a expressão de Blimp-1 compreende IL-21, IL-2, IL-6, IL-7, IL-10, IL-15 e/ou IL-27. O mais preferivelmente IL-21 é usado, visto que IL-21 é particularmente adequado para influenciar a estabilidade de uma célula que produz anticorpo. IL-21 é capaz de regular positivamente a expressão de Blimp-1 mesmo quando a expressão de Blimp-1 é contra-atacada por BCL6.

[0081] Adicional ou alternativamente uma Janus quinase (JAK) mutada é usada de modo a ativar STAT3. Naturalmente, uma JAK é capaz de fosforilar STAT3 depois que ela própria foi ativada por pelo menos uma citocina. Uma Janus quinase mutada capaz de ativar STAT3, independente da presença de citocinas, é particularmente adequada em um método de acordo com a presente invenção.

[0082] Como já explicado antes, um composto capaz de realçar a expressão de Blimp-1 em uma forma de realização compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica STAT3 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo. A presença de uma sequência de ácido nucleico exógena que codifica STAT3 ou uma

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49/105 parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo permite uma presença contínua de STAT3 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo, mesmo quando a expressão de STAT3 endógeno é muito baixa ou ausente.

[0083] Também é possível diminuir a expressão e/ou atividade de STAT5 de modo a regular positivamente Blimp-1. Se a quantidade e/ou atividade de STAT5 é diminuída, a ativação da expressão de BCL6 também é diminuída, que resulta em uma quantidade diminuída de produto de expressão de BCL6. Visto que BCL6 e Blimp-1 contraatacam a expressão um do outro, uma quantidade diminuída de produto de expressão de BCL6 resulta em uma quantidade aumentada de produto de expressão de Blimp-1. Os compostos capazes de regular negativamente a atividade de STAT5 são assim capazes de regular positivamente indiretamente Blimp-1. Tais compostos por exemplo compreendem membros do supressor das proteínas de sinalização de citocina (SOCS). Em uma forma de realização a quantidade de produto de expressão de Blimp-1 em uma célula que produz anticorpo específica do RSV é portanto regulada positivamente pelo fornecimento da dita célula com uma proteína SOCS e/ou pela ativação de uma proteína SOCS dentro da dita célula.

[0084] Em uma forma de realização preferida a expressão e/ou atividade de STAT5 é diminuída quando uma célula que produz anticorpo específica de RSV é fornecida com uma sequência de ácido nucleico que codifica E47 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo. A expressão de E47 dentro das células B que expressam altos níveis de STAT5b intervém com a diferenciação e proliferação, isto é, o bloqueio de STAT5 por intermédio de E47 e SOCS resulta em níveis de BCL6 diminuídos e subsequentemente em níveis aumentados de Blimp-1. Os níveis regulados positivamente de Blimp-1 resulta em uma proliferação diminuída e em uma

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50/105 diferenciação da célula envolvida na direção de uma célula que produz anticorpo. Em outras palavras, a expressão de E47 dentro de uma célula B realça a expressão de Blimp-1 que resulta na diferenciação de célula B na direção de um fenótipo que produz anticorpo (célula plasmática).

[0085] Por pelo menos uma parte funcional de uma proteína STAT5, uma proteína STAT3, Bcl-xL e/ou BCL6 é intencionada uma molécula proteinácea que tenha a mesma capacidade - no tipo, não necessariamente na quantidade - de influenciar a estabilidade de uma célula que produz anticorpo quando comparada a uma proteína STAT5, uma proteína STAT3, Bcl-xL e/ou BCL6, respectivamente. Uma parte funcional de uma proteína STAT5 ou uma proteína STAT3 é por exemplo destituída de aminoácidos que não são, ou apenas muito pouco, envolvidas na dita capacidade. Um derivado de uma proteína STAT5, uma proteína STAT3, Bcl-xL e/ou BCL6 é definido como uma proteína que foi alterada tal que a capacidade da dita proteína de influenciar a estabilidade de uma célula que produz anticorpo seja essencialmente a mesma no tipo, não necessariamente na quantidade. Um derivado é fornecido em muitos modos, por exemplo através da substituição de aminoácido conservativa em que um aminoácido é substituído por outro aminoácido com propriedades no geral similares (tamanho, hidrofobicidade, etc.), tal que o funcionamento global não seja provável de ser seriamente afetado. Um derivado por exemplo compreende uma proteína de fusão, tal como uma proteína de fusão STAT5-ER ou STAT3-ER cuja atividade depende da presença de 4 hidróxi-tamoxifeno (4HT). Um análogo de uma proteína STAT5, uma proteína STAT3, Bcl-xL e/ou BCL6 é definida como um molécula tendo a mesma capacidade de influenciar a estabilidade de uma célula que produz anticorpo no tipo, não necessariamente na quantidade. O dito análogo não é

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51/105 necessariamente derivado da dita proteína STAT5, proteína STAT3,

Bcl-xL e/ou BCL6.

[0086] Em uma forma de realização preferida a dita célula que produz anticorpo específica do RSV é cultivada na presença de IL-21 antes que a dita célula que produz anticorpo seja fornecida com uma sequência de ácido nucleico que codifica BCL6 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo. Cultivar as células que produzem anticorpo específicas do RSV, preferivelmente células B, na presença de IL-21 antes que a dita célula seja fornecida com uma sequência de ácido nucleico que codifica BCL6 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo é preferido, porque nestas formas de realização a estabilidade, proliferação e/ou produção de anticorpo são particularmente bem melhoradas.

[0087] Em uma forma de realização preferida, a invenção fornece um método para influenciar a estabilidade de uma célula que produz anticorpo específica do RSV como aqui descrita, que compreende ainda direta ou indiretamente aumentar a quantidade de produto de expressão de Bcl-xL dentro da dita célula que produz anticorpo. Isto é por exemplo realizado fornecendo-se a dita célula que produz anticorpo com uma sequência de ácido nucleico que codifica Bcl-xL ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo desta ou com sequências de ácido nucleico que codificam outros genes anti-apoptóticos incluindo mas não limitado a Bcl-2. Já em uma outra forma de realização isto é realizado fornecendo-se a dita célula que produz anticorpo com um composto capaz de direta ou indiretamente realçar a expressão de Bcl-xL, preferivelmente o dito composto compreende APRIL, BAFF, CD40, estimulação de BCR, citocinas, fatores de crescimento ou efetores a jusante como JNK e AKT (PKB).

[0088] Bcl-xL é um membro da família de Bcl-2 anti-apoptótico, as proteínas Bcl-2 interagem com e contra-atacam os assim chamados

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52/105 de membros da família apenas do domínio 3 de homologia com Bcl-2 (BH3) tais como Bax, Bak, Bim e Bad, que induzem a liberação de citocromo c liberam os seguintes estímulos de morte intrínseca (Boise, L. H., 1993). Assim, a proteção da integridade da membrana mitocondrial através das proteínas como Bcl-xL é crítica para a sobrevivência da célula.

[0089] A ativação de STAT5 tem sido mostrada proteger as células da morte celular. STAT5 foi mostrado regular a expressão de Bcl-xL, sustentando um papel anti-apoptótico para STAT5. STAT5 positivamente regula a expressão de Bcl-xL através de elementos de ligação de STAT dentro do promotor Bcl-xL. In vivo, a expressão de Bcl-xL é ausente na medula óssea de camundongos duplamente deficientes em STAT5A/B. Além disso, a sobrevivência de eritroblasto mediada por STAT5 é dependente da regulagem positiva de Bcl-xL. Recentemente, foi mostrado que a super-expressão transgênica de Bcl-xL em células B de camundongo promove a sobrevivência de célula B e focos de célula plasmática não maligna.

[0090] Um método de acordo com a invenção é particularmente adequado para produzir uma cultura de célula que compreende células que produzem anticorpo específicas do RSV que são capazes de proliferar e secretar anticorpo. Em uma forma de realização, uma célula B de memória específica de RSV é usada de modo a produzir uma cultura de célula B ex vivo. A dita célula B de memória é preferivelmente humana de modo que anticorpos humanos sejam produzidos. A dita célula B preferivelmente origina-se de um indivíduo, indivíduo este que foi anteriormente exposto ao Vírus Sincicial Respiratório. Em uma forma de realização as células B específicas de RSV são isoladas de uma amostra de sangue periférico e/ou uma amostra de amígdalas, usando métodos conhecido na técnica. As células B de memória são por exemplo isoladas pela seleção

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53/105 (classificação de pérola magnética) quanto ao marcador de célula B CD19 e/ou CD22 e (subsequente) seleção quanto a IgG de superfície celular e/ou CD27 e/ou pela seleção negativa quanto a IgM, IgD e/ou IgA. Em uma célula B de centro germinal, a expressão de BCL6 é alta ao passo que a expressão de Blimp-1 é baixa. O desenvolvimento natural em uma célula que secreta anticorpo envolve a regulagem positiva da expressão de Blimp-1. Visto que Blimp-1 reprime a expressão de BCL6, a regulagem positiva de Blimp-1 resulta na regulagem negativa de BCL6 em uma situação natural. Em uma forma de realização preferido da presente invenção entretanto, a expressão de Blimp-1 é regulada positivamente enquanto que a expressão de BCL6 é pelo menos em parte mantida. Isto resulta em uma célula que produz anticorpo específica do RSV em que BCL6 e Blimp-1 são coexpressados. A dita célula que produz anticorpo específica do RSV é capaz de proliferar e secretar anticorpos anti-RSV e é portanto adequada para o uso em uma cultura de célula B ex vivo. Em uma outra forma de realização preferida, a dita célula que produz anticorpo é protegida pela apoptose por Bcl-xL. Uma célula que produz anticorpo específica do RSV de acordo com a presente invenção fornece a vantagem de que ela é estável e não sofre a diferenciação de terminal durante um período prolongado. A dita célula que produz anticorpo de acordo com a invenção é estável por pelo menos uma semana, preferivelmente por pelo menos um mês, mais preferivelmente por pelo menos três meses, o mais preferivelmente por pelo menos seis meses. Uma célula B de acordo com a invenção é preferivelmente cultivada na presença de CD40L visto que a replicação da maioria das células B é favorecida por CD40L.

[0091] Em uma forma de realização a expressão de BCL6 é mantida essencialmente no mesmo nível, ou em um nível mais alto, quando comparada com uma célula B de centro germinal visto que

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54/105 uma expressão significante de BCL6, junto com a expressão de Blimp1, resulta em uma célula que produz anticorpo com propriedades de proliferação e produção de anticorpo e/ou estabilidade preferidas. Em uma forma de realização preferida, a dita expressão de BCL6 e/ou expressão de Blimp-1 são acompanhadas pela expressão de Bcl-xL, resultando em propriedades de proliferação e produção de anticorpo e/ou estabilidade ainda mais preferidas.

[0092] Uma forma de realização portanto fornece um método para produzir uma célula que produz anticorpo específica do RSV que é estável por pelo menos uma semana, preferivelmente por pelo menos um mês, mais preferivelmente por pelo menos três meses, mais preferivelmente por pelo menos seis meses, o método compreendendo:

- fornecer uma célula B de memória específica de RSV; - aumentar um nível de expressão de Blimp-1 na dita célula; e

- aumentar e/ou manter um nível de expressão de BCL6 na dita célula. Um método ex vivo para produzir uma célula que produz anticorpo específica do RSV que compreende aumentar um nível de expressão de Blimp-1 em uma célula B de memória específica de RSV e aumentar e/ou manter um nível de expressão de BCL6 na dita célula também é fornecido. Os ditos níveis de expressão de BCL6 e Blimp-1 são preferivelmente levados, e/ou mantidos, essencialmente no mesmo nível, ou em um nível mais alto, quando comparado a um plasmoblasto. Em uma forma de realização preferida a dita célula B é transduzida com BCL6 e Bcl-xL. Portanto é fornecido ainda um método para produzir uma célula que produz anticorpo específica do RSV que é estável por pelo menos três meses, que compreende:

- fornecer uma célula B capaz de produzir anticorpos específicos de RSV com BCL6, ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo; e

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- fornecer a dita célula B com Bcl-xL ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo; e

- cultivar a dita célula B.

[0093] A dita célula B é preferivelmente fornecida com uma sequência de ácido nucleico que codifica BCL6, ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo e com uma sequência de ácido nucleico Bcl-xL ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo.

[0094] A dita célula B é preferivelmente cultivada na presença de um composto capaz de realçar a expressão de Blimp-1, tal como por exemplo IL-21, IL-2, IL-6, II-7, IL-10, IL-15, IL-27, ou uma Janus quinase mutada. Preferivelmente, IL-21 é usada porque esta citocina é particularmente adequada para realçar a expressão de Blimp-1 e estabilizar uma célula que produz anticorpo com um método de acordo com a presente invenção. Além disso, de modo a realçar a eficácia de transdução, a dita célula B é preferivelmente cultivada na presença de IL-21 antes que a dita célula B seja transduzida com uma sequência de ácido nucleico que codifica BCL6 e/ou Bcl-xL, ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo.

[0095] Em uma forma de realização a dita célula B é fornecida com uma proteína SOCS ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo, ou um ácido nucleico que codifica consequentemente, visto que uma proteína SOCS ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo é capaz de realçar indiretamente a expressão de Blimp-1. Em uma outra forma de realização alternativa ou adicional, a dita célula B é fornecida com E47 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo desta, ou um ácido nucleico que codifica consequentemente. Como já esboçado mais no princípio, como um resultado de um nível aumentado de E47 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo, a função da

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56/105 proteína Soes é realçada e a expressão de Blimp-1 é indiretamente aumentada.

[0096] Nos Exemplos as formas de realização particularmente preferidas são mostradas. De acordo com uma forma de realização particularmente preferida, as células B específicas de RSV são primeiramente cultivadas na presença de IL-21. Subsequentemente as células B são submetidas a uma reação de transdução usando um ácido nucleico que codifica BCL6 e um ácido nucleico que codifica BclxL. Preferivelmente a transdução giratória é usada. O mais preferivelmente, as células B e o vírus que compreende pelo menos um ácido nucleico de interesse são misturados, onde depois a mistura é girada de modo a se obter uma alta eficácia de transdução. Depois da transdução, as células B são cultivadas na ausência de 11-21 e na presença de II-4 e células L durante 3 a 5 dias de modo a permitir a expressão de BCL6. Subsequentemente, de acordo com esta forma de realização preferida, as células B são submetidas mais uma vez a uma reação de transdução usando um ácido nucleico que codifica BCL6 e um ácido nucleico que codifica Bcl-xL. Subsequentemente, as células B são mais uma vez cultivadas na ausência de 11-21 e na presença de II-4 e células L durante 3 a 5 dias de modo a permitir a expressão de BCL6. Subsequentemente, as células que expressam BCL6 e Bcl-xL são isoladas e IL-21 é administrada mais uma vez à cultura de modo a realçar a replicação e produção de anticorpo. Os anticorpos que são secretados pelas células que expressam Bcl-6, Blimp-1 e Bcl-XL no sobrenadante de cultura são preferivelmente triados quanto a capacidade de neutralização/ atividade/reatividade in vitro ao RSV. As células que produzem anticorpo que produzem estes anticorpos são preferivelmente selecionadas ainda, por exemplo pela cultura de diluição limitante. As células B estáveis específicas de RSV são assim obtidas em que BCL6 e Blimp-1 são co-expressados. As ditas células

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B são capazes de replicar e produzir anticorpo em uma cultura in vitro durante pelo menos seis meses.

[0097] Uma forma de realização fornece um método de acordo com a invenção que compreende ainda selecionar e/ou isolar um anticorpo específico de RSV ou um equivalente funcional deste. Em uma forma de realização as células que produzem IgM e as células que produzem IgG são selecionadas e/ou isoladas. Preferivelmente uma célula que produz IgG é selecionada e/ou isolada.

[0098] As células que produzem anticorpo específicas do RSV geradas com um método de acordo com a invenção são adequadas para produzir anticorpos contra RSV. Em um forma de realização preferida entretanto, os genes que codificam as cadeias pesadas e/ou leves de Ig são isolados da dita célula e expressadas em uma segunda célula, tal como por exemplo células de uma linhagem de célula do ovário do hamster chinês (CHO) ou células 293(T). A dita segunda célula, também chamada aqui de uma célula produtora, é preferivelmente adaptada para a produção comercial de anticorpo. A proliferação da dita célula produtora resulta em uma linhagem de célula produtora capaz de produzir anticorpos específicos de RSV. Preferivelmente, a dita linhagem de célula produtora é adequada para produzir compostos para o uso em seres humanos. Consequentemente, a dita linhagem de célula produtora é preferivelmente livre de agentes patogênicos tais como microorganismos patogênicos.

[0099] Um método de acordo com a invenção é preferivelmente usado para gerar uma célula que produz anticorpo que é estável por pelo menos uma semana, preferivelmente pelo menos um mês, mais preferivelmente pelo menos três meses, mais preferivelmente pelo menos seis meses de modo que a produção comercial de anticorpo se torne possível. O mais preferivelmente uma linhagem de célula estável

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58/105 capaz de produzir anticorpos monoclonais é produzida. Isto é preferivelmente realizada usando-se células B de memória que por exemplo foram isoladas de uma amostra pela seleção quanto a CD19 e/ou CD22 (marcador de célula B) e IgG de superfície celular e/ou CD27 (para marcar as células de memória) e/ou pela seleção negativa quanto a IgM, IgD e/ou IgA. Além disso, uma célula que produz anticorpo específica do RSV é por exemplo selecionada em um ensaio de ligação usando RSV ou um componente derivado de RSV, tal como por exemplo a proteína RSV F, proteína G e/ou proteína SH. Subsequentemente, de acordo com esta forma de realização preferida Blimp-1 e BCL6 são co-expressados na dita célula que produz anticorpo específica do RSV, resultando em uma cultura de células capazes de especificamente ligar (um componente de) RSV. Já em uma outra forma de realização preferida, a dita célula B é fornecida ainda com Bcl-xL ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo.

[00100] Se apenas uma célula de memória é usada, uma linhagem de célula de acordo com a invenção que produz anticorpos monoclonais é obtida. Também é possível gerar uma linhagem de célula monoclonal que produz anticorpo partindo com células B capazes de produzir anticorpos contra RSV. Depois que uma cultura de célula B estável tenha sido produzida com um método de acordo com a invenção, uma célula B capaz de produzir anticorpos contra um antígeno específico de RSV é isolado e pelo menos uma parte funcional de um gene que codifica a cadeia pesada e/ou cadeia leve de Ig da dita célula B é preferivelmente expressada em uma segunda linhagem de célula. Preferivelmente pelo menos uma parte funcional do gene que codifica a cadeia pesada de Ig e pelo menos uma parte funcional do gene que codifica a cadeia leve de Ig da dita célula B são expressadas em uma segunda linhagem de célula.

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59/105 [00101] Em uma forma de realização uma célula que produz anticorpo, preferivelmente mas não necessariamente uma célula B de memória, que foi obtida a partir de um indivíduo que foi anteriormente exposto ao RSV, é usada em um método de acordo com a invenção. Dessa maneira, tem se tornado possível produzir anticorpos humanos de interesse ex vivo.

[00102] Portanto é fornecido ainda um método para produzir anticorpos que são capazes de especificamente ligar e/ou neutralizar o Vírus Sincicial Respiratório, o método compreendendo:

- produzir uma célula que produz anticorpo capaz de produzir anticorpos específicos de RSV com um método de acordo com a invenção; e

- obter anticorpos produzidos pela dita célula que produz anticorpo.

[00103] Um anticorpo isolado ou recombinante, assim como uma célula que produz anticorpo isolada ou recombinante, obteníveis por um método de acordo com a invenção, ou um equivalente funcional deste, também são fornecidos. O dito anticorpo preferivelmente compreende os anticorpos D25, AM 14, AM 16 e/ou AM23, ou uma parte funcional, derivado ou análogo do mesmos.

[00104] Uma vez que uma célula que produz anticorpo específica do RSV de acordo com a invenção é obtida, pelo menos uma parte funcional de um gene que codifica a cadeia pesada e/ou a cadeia leve de Ig da dita célula é preferivelmente isolada e/ou gerada artificialmente. Em uma forma de realização uma sequência de ácido nucleico que compreende pelo menos uma parte funcional de uma sequência de ácido nucleico como representada na Figura 11, Figura 12, Figura 14A, Figura 14B e/ou Figura 14C é fornecida. A dita parte funcional preferivelmente compreende pelo menos uma sequência de ácido nucleico como representada na Figura 11 D, Figura 12, Figura

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14A, Figura 14B e/ou Figura 14C. A dita parte funcional preferivelmente codifica pelo menos uma CDR como representada na

Figura 11 D, Figura 12, Figura 14A, Figura 14B e/ou Figura 14C.

[00105] É ainda fornecida uma sequência de ácido nucleico isolada, sintética ou recombinante que compreende uma sequência de cadeia pesada que é pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 80 %, mais preferivelmente pelo menos 90 % homóloga a pelo menos parte das sequências CAGGTGCAGCTGGTACAGTCTGGGGCTGAAGTGAAGAAGCCTG GGTCCTCGGTGATGGTCTCCTGCCAGGCCTCTGGAGGCCCCCTC A GAA, ACTATATTATCAAC, TGGCTACGACAGGCCCCTGGA CAAGGCCCTGAGTGGATGGGA, GGGATCATTCCTGTCTTGGGT ACAGTACACTACGCACCGAAGTTCCAGGGC, AGAGTCACGATT ACCGCGGACGAATCCACAGACACAGCCTACATCCATCTGATCAGC CTGAGATCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCGACG, GAAACAGCTCTGGTTGTATCTACTACCTACCTACCACACTACTTTG ACAAC, TGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAG e/ou CAGGTGCAGCTGGTACAGTCTGGGGCTGAAGTGAAGAAGCCTGG GTCCTCGGTGATGGTCTCCTGCCAGGCCTCTGGAGGCCCCCTCA GAAACTATATTATCAACTGGCTACGACAGGCCCCTGGACAAGGCC CTGAGTGGATGGGAGGGATCATTCCTGTCTTGGGTACAGTACACT ACGCACCGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAA TCCACAGACACAGCCTACATCCATCTGATCAGCCTGAGATCTGAG GACACGGCCATGTATTACTGTGCGACGGAAACAGCTCTGGTTGTA TCTACTACCTACCTACCACACTACTTTGACAACTGGGGCCAGGGA ACCCTGGTCACCGTCTCCTCAG, a dita parte tendo pelo menos 15 nucleotídeos. A dita sequência de cadeia pesada é preferivelmente derivada do anticorpo D25. A dita sequência de cadeia pesada preferivelmente compreende uma sequência que é pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos

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61/105 %, mais preferivelmente pelo menos 90 % homóloga a uma sequência como representada na Figura 11 D. Uma sequência de ácido nucleico isolada, sintética ou recombinante que compreende uma sequência de cadeia pesada que consiste de qualquer uma das sequências de cadeia pesada mencionadas acima também é fornecida anexa.

[00106] Uma sequência de ácido nucleico isolada, sintética ou recombinante que compreende uma sequência de cadeia leve que é pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 80 %, mais preferivelmente pelo menos 90 % homóloga a uma parte mínima das sequências GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCAGCTGTA GGAGACAGAGTCACCATCACTTGC, CAGGCGAGTCAGGAC ATTGTCAACTATTTAAAT, TGGTATCAACAGAAACCAGGGAAA GCCCCTAAGCTCCTGATCTAC, GTTGCATCCAATTTGGAGACA, GGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTT AGTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACATAT TATTGT, CAACAATATGATAATCTCCCA, CTCACATTCG GCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAAAGA e/ou

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCAGCTGTA GGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCGAGTCAGGACATTGT CAACTATTTAAATTGGTATCAACAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAG CTCCTGATCTACGTTGCATCCAATTTGGAGACAGGGGTCCCATCA AGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTTAGTCTCACCATC AGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACATATTATTGTCAACAAT ATGATAATCTCCCACTCACATTCGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGA TCAAAAGA, a dita parte tendo pelo menos 15 nucleotídeos, também é fornecida. A dita sequência de cadeia leve é preferivelmente derivada do anticorpo D25.

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62/105 [00107] A dita sequência de cadeia leve preferivelmente compreende uma sequência que é pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 80 %, mais preferivelmente pelo menos 90 % homóloga a uma sequência como representada na Figura 11 D. Uma sequência de ácido nucleico isolada, sintética ou recombinante que compreende uma sequência de cadeia pesada que consiste de qualquer uma das sequências de cadeia leve mencionadas acima também é fornecida anexa.

[00108] É ainda fornecida uma sequência de ácido nucleico isolada, sintética ou recombinante que compreende uma sequência de cadeia pesada que é pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 80 %, mais preferivelmente pelo menos 90 % homóloga a pelo menos parte das sequências GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTG GGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCGGCCTCT, GGATTCAGC TTCAGTCACTATGCC, ATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGC AAGGGACTGGAGTGGGTGGCAGTT, ATATCTTATGATGGAGA AAATACA, TATTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCTCCAT CTCCAGAGACAATTCCAAGAACACAGTGTCTCTGCAAATGAACAG CCTGAGACCTGAGGACACGGCTCTATATTACTGT, GCGAG

AGACCGCATAGTGGACGACTACTACTACTACGGTATGGACGTC, TGGGGCCAAGGGGCCACGGTCACCGTCTCCTCAG e/ou

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTG GGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCGGCCTCTGGATTCAGCTTCA GTCACTATGCCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGA CTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCTTATGATGGAGAAAATACATATT ACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCTCCATCTCCAGAGACAATT CCAAGAACACAGTGTCTCTGCAAATGAACAGCCTGAGACCTGAGG ACACGGCTCTATATTACTGTGCGAGAGACCGCATAGTGGACGACT ACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGGCCACGGTC

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ACCGTCTCCTCA, a dita parte tendo pelo menos 15 nucleotídeos. A dita sequência de cadeia pesada é preferivelmente derivada do anticorpo AM14. Uma sequência de ácido nucleico isolada, sintética ou recombinante que compreende uma sequência de cadeia pesada que consiste de qualquer uma das sequências de cadeia pesada mencionadas acima também é fornecida anexa.

[00109] Uma sequência de ácido nucleico isolada, sintética ou recombinante que compreende uma sequência de cadeia leve que é pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90% homóloga a uma parte mínima das sequências GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCCTGTCTGCATCTGTA GGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCGAGT, CAGGAC ATTAAGAAGTAT, TTAAATTGGTATCATCAGAAACCAGGGAAA GTCCCTGAGCTCCTGATGCAC, GATGCATCC, AATTTGGAAAC AGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGGGGATCTGGGACAGATT TTACTCTCACCATTAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGGAACATA TTACTGT, CAACAGTATGATAATCTGCCTCCGCTCACT,

TTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAAC e/ou

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCCTGTCTGCATCTGTA GGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCGAGTCAGGACATTAA GAAGTATTTAAATTGGTATCATCAGAAACCAGGGAAAGTCCCTGA GCTCCTGATGCACGATGCATCCAATTTGGAAACAGGGGTCCCATC AAGGTTCAGTGGCAGGGGATCTGGGACAGATTTTACTCTCACCAT TAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGGAACATATTACTGTCAACA GTATGATAATCTGCCTCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGT GGAGATCAAACGAACTGTG, a dita parte tendo pelo menos 15 nucleotídeos, também é fornecida. A dita sequência de cadeia leve é preferivelmente derivada

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64/105 do anticorpo AM14. Uma sequência de ácido nucleico isolada, sintética ou recombinante que compreende uma sequência de cadeia pesada que consiste de qualquer uma das sequências de cadeia leve mencionadas acima também é fornecida anexa.

[00110] É ainda fornecida uma sequência de ácido nucleico isolada, sintética ou recombinante que compreende uma sequência de cadeia pesada que é pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 80 %, mais preferivelmente pelo menos 90 % homóloga a pelo menos parte das sequências GAGGTGCAGCTGGTGGAGACCGGGGGAGGCCTGGCCCAGCCTG GGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCT, GGATTCACA TTCAGTAGTTATAAC, ATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG AAGGGGCTGGAGTGGGTCTCACAC, ATTAGTGCGGGTAGTAGT TACATA, TACTACTCAGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCGTC TCCAGAGACAACGTCAGGAACTCAGTATATCTGCAAATGAACAGC CTGAGAGCCGCTGACACGGCTGTGTATTACTGT, GCGAGA GAGGATTATGGTCCGGGAAATTATTATAGTCCTAACTGGTTCGAC CCC, TGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAG e/ou GAGGTGCAGCTGGTGGAGACCGGGGGAGGCCTGGCCCAGCCTG GGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACATTCA GTAGTTATAACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGG CTGGAGTGGGTCTCACACATTAGTGCGGGTAGTAGTTACATATAC TACTCAGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCGTCTCCAGAGACAAC GTCAGGAACTCAGTATATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGCT GACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAGGATTATGGTCCGGG AAATTATTATAGTCCTAACTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAAC CCTGGTCACCGTCTCCTCA, a dita parte tendo pelo menos 15 nucleotídeos. A dita sequência de cadeia pesada é preferivelmente derivada do anticorpo AM16. Uma sequência de ácido nucleico isolada, sintética ou

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65/105 recombinante que compreende uma sequência de cadeia pesada que consiste de qualquer uma das sequências de cadeia pesada mencionadas acima também é fornecida anexa.

[00111] Uma sequência de ácido nucleico isolada, sintética ou recombinante que compreende uma sequência de cadeia leve que é pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 80 %, mais preferivelmente pelo menos 90 % homóloga a uma parte mínima das sequências CAGTCTGTCGTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGG GCAGAGAGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGC, AGCTCCAACA TCGGGGCAGGTTATGAT, GTACACTGGTACCAGCAGCTTCCAG GAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTAT, GGCAACACT, AATCGG CCCTCAGGGGTCTCCGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAC CTCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGACTCCAGGCTGAGGATGAGG CTGATTATTACTGC, CACTCCTATGACAGAAGCCTGAGTGG T, TCAGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAG e/ou CAGTCTGTCGTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGG GCAGAGAGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCG GGGCAGGTTATGATGTACACTGGTACCAGCAGCTTCCAGGAACAG CCCCCAAACTCCTCATCTATGGCAACACTAATCGGCCCTCAGGGG TCTCCGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCC TGGCCATCACTGGACTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTACT GCCACTCCTATGACAGAAGCCTGAGTGGTTCAGTATTCGGCGGAG GGACCAAGCTGACCGTC, a dita parte tendo pelo menos 15 nucleotídeos, também é fornecida. A dita sequência de cadeia leve é preferivelmente derivada do anticorpo AM16. Uma sequência de ácido nucleico isolada, sintética ou recombinante que compreende uma sequência de cadeia pesada que consiste de qualquer uma das sequências de cadeia leve mencionadas acima também é fornecida anexa.

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66/105 [00112] É ainda fornecida uma sequência de ácido nucleico isolada, sintética ou recombinante que compreende uma sequência de cadeia pesada que é pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90% homóloga a pelo menos parte das sequências CAGGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAAATGTGGTCAAGCCTGG GACGTCCCTGAGACTGTCCTGTGCAGCGACT, GGATTCAAC TTCCATAACTACGGC, ATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGC AAGGGGCTGGAGTGGGTGGCGGTT, GTTTGGTATGATGGAAGT AAGAAA, TACTATGCAGACTCCGTGACGGGCCGATTCGCCATC TCCAGAGACAATTCCAAGAACACTCTGTATCTGCAAATGAACAGC CTGAGAGTCGAGGACACGGCTGTTTATTATTGT, GTGAGA

GATAAAGTGGGACCGACTCCCTACTTTGACTCC, TGGGGCCAG GGAACCCTGGTCACCGTATCCTCAG e/ou

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAAATGTGGTCAAGCCTGG GACGTCCCTGAGACTGTCCTGTGCAGCGACTGGATTCAACTTCCA TAACTACGGCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGC TGGAGTGGGTGGCGGTTGTTTGGTATGATGGAAGTAAGAAATACT ATGCAGACTCCGTGACGGGCCGATTCGCCATCTCCAGAGACAATT CCAAGAACACTCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGTCGAGG ACACGGCTGTTTATTATTGTGTGAGAGATAAAGTGGGACCGACTC CCTACTTTGACTCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCG AGT, a dita parte tendo pelo menos 15 nucleotídeos. A dita sequência de cadeia pesada é preferivelmente derivada do anticorpo AM23. Uma sequência de ácido nucleico isolada, sintética ou recombinante que compreende uma sequência de cadeia pesada que consiste de qualquer uma das sequências de cadeia pesada mencionadas acima também é fornecida anexa.

[00113] Uma sequência de ácido nucleico isolada, sintética ou

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67/105 recombinante que compreende uma sequência de cadeia leve que é pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90% homóloga a uma parte mínima da sequência TCCTATGTGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCACTGGCCCCAGGA GGGACGGCCGCGATCACCTGTGGAAGAAAC, AACATTGGA AGTGAAACT, GTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGC CCCTGTGCTGGTCGTCTAT, GATGATGAC, GACCGGCCCTCAG GGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACGGCC ACCCTGACCATCAGCAGGGTCGAGGCCGGGGATGAGGCCGACTA TTACTGT, CAGGTGTGGGATAGGAGTAATTATCATCAGGT A, TTCGGCGGAGGGACCAAGTTGACCGTCCTAG e/ou

TCCTATGTGCTGACTCAGCCCCCCTCGGTGTCACTGGCCCCAGG AGGGACGGCCGCGATCACCTGTGGAAGAAACAACATTGGAAGTG AAACTGTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCTGTG CTGGTCGTCTATGATGATGACGACCGGCCCTCAGGGATCCCTGA GCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACGGCCACCCTGACCAT CAGCAGGGTCGAGGCCGGGGATGAGGCCGACTATTACTGTCAGG TGTGGGATAGGAGTAATTATCATCAGGTATTCGGCGGAGGGACCA AGCTGACCGTC, a dita parte tendo pelo menos 15 nucleotídeos, também é fornecida. A dita sequência de cadeia leve é preferivelmente derivada do anticorpo AM23. Uma sequência de ácido nucleico isolada, sintética ou recombinante que compreende uma sequência de cadeia pesada que consiste de qualquer uma das sequências de cadeia pesada mencionadas acima também é fornecida anexa.

[00114] Uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácido que é pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90% idêntica a pelo menos uma parte funcional de uma sequência de aminoácido como

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68/105 representada na Figura 11, Figura 14A, Figura 14B e/ou Figura 14C, a dita parte tendo pelo menos 5 resíduos de aminoácido também é fornecida. A dita sequência de ácido nucleico preferivelmente codifica uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80% idêntica à sequência de cadeia pesada de CDR1, 2 e/ou 3 e/ou sequência de cadeia leve de CDR1 ou 2 representadas na Figura 11 D. Em uma outra forma de realização preferida a dita sequência de ácido nucleico codifica uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80 % idêntica a pelo menos uma das sequências de CDR representadas na Figura 14A, na Figura 14B e/ou na Figura 14C. Em uma forma de realização preferida a dita sequência de ácido nucleico codifica uma sequência de aminoácido que é pelo menos 70 % idêntica a uma sequência de cadeia sequência de cadeia sequência de cadeia sequência de cadeia sequência de cadeia sequência de cadeia pesada representada pesada representada pesada representada pesada representada leve representada i leve representada i na Figura 11 A, a uma na Figura 14A, a uma na Figura 11B, a uma na Figura 14C, a uma a Figura 11 A, a uma a Figura 14A, a uma sequência de cadeia leve representada na Figura 14B e/ou a uma sequência de cadeia leve representada na Figura 14C.

[00115] Portanto é fornecida ainda uma sequência de ácido nucleico isolada, sintética ou recombinante que compreende uma sequência que codifica uma sequência de aminoácido que é pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 80 %, mais preferivelmente pelo menos 85 % idêntica a uma sequência de aminoácido como representada na Figura 11A-D. A dita sequência de ácido nucleico preferivelmente codifica uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80 % idêntica à sequência de cadeia pesada de CDR1, 2 e/ou e/ou sequência de cadeia leve de CDR1 ou 2 como representada na

Figura 11A-D. Uma forma de realização fornece uma sequência de

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69/105 ácido nucleico isolada, sintética ou recombinante que compreende uma sequência que codifica uma sequência de aminoácido que é pelo menos 70% idêntica à sequência de aminoácido NYIIN e/ou pelo menos 75% idêntica à sequência GIIPVLGTVHYAPKFQG e/ou pelo menos 70% idêntica à sequência ETALVVSTTYLPHYFDN e/ou pelo menos 85% idêntica à sequência QASQDIVNYLN e/ou pelo menos 70% idêntica à sequência VASNLET e/ou pelo menos 70% idêntica à sequência QVQLVQSGAEVKKPGSSVMVSCQASGGPLRNYIINWLRQAPGQGP EWMGGIIPVLGTVHYAPKFQGRVTITADESTDTAYIHLISLRSEDTAMY YCATETALVVSTTYLPHYFDNWGQGTLVTVSS e/ou pelo menos 70 % idêntica à sequência DIQMTQSPSSLSAAVGDRVTITCQASQDIVNYLNWYQQKPGKAPKLLI YVASNLETGVPSRFSGSGSGTDFSLTISSLQPEDVATYYCQQYDNLP LTFGGGTKVEIKRTV.

[00116] Uma sequência de ácido nucleico de acordo com a invenção é preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, o mais preferivelmente pelo menos 95% homóloga a qualquer uma das sequências citadas acima.

[00117] É ainda fornecida uma sequência de ácido nucleico isolada, sintética ou recombinante que compreende uma sequência que codifica uma sequência de aminoácido que é pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85% idêntica a uma sequência de aminoácido como representada na Figura 14A-C. A dita sequência de ácido nucleico preferivelmente codifica uma sequência de aminoácido que é pelo menos 70% idêntica a uma sequência de CDR como representada na Figura 14A, 14B e/ou 14C. Uma forma de realização fornece uma sequência de ácido nucleico isolada, sintética ou recombinante que compreende uma

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70/105 sequência que codifica uma sequência de aminoácido que é pelo menos 70% idêntica a uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de:

GFSFSHYA, ISYDGENT, ARDRIVDDYYYYGMDV, QDIKKY, DAS,

QQYDNLPPLT, EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFS

FSHYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGENTYYADSVKGRFSISRDN SKNTVSLQMNSLRPEDTALYYCARDRIVDDYYYYGMDVWGQGATVT VSS, DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDIKKYL

NWYHQKPGKVPELLMHDASNLETGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQ PEDIGTYYCQQYDNLPPLTFGGGTKVEIKRTV, GFTFSSYN,

ISAGSSYI, AREDYGPGNYYSPNWFDP, SSNIGAGYD, GNT, HSYDRSLSG, EVQLVETGGGLAQPGGSLRLSCAASGFTFSSYNM NWVRQAPGKGLEWVSHISAGSSYIYYSDSVKGRFTVSRDNVRNSVY LQMNSLRAADTAVYYCAREDYGPGNYYSPNWFDPWGQGTLVTVSS, QSVVTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQ QLPGTAPKLLIYGNTNRPSGVSDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEA DYYCHSYDRSLSGSVFGGGTKLTV, GFNFHNYG, WVYDGSKK, VRDKVGPTPYFDS, NIGSET, DDD, QVWDRSNYHQV, EVQLVESGGNVVKPGTSLRLSCAATGFNFHNYGMNWVRQAPGKGL EVWAVVWYDGSKKYYADSVTGRFAISRDNSKNTLYLQMNSLRVEDT AVYYCVRDKVGPTPYFDSWGQGTLVTVSS, e

SYVLTQPPSVSLAPGGTAAITCGRNNIGSETVHWYQQKPGQAPVLVV YDDDDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDRS NYHQVFGGGTKLTV.

[00118] Uma sequência de ácido nucleico de acordo com a invenção é preferivelmente pelo menos 80 %, mais preferivelmente pelo menos 85 %, mais preferivelmente pelo menos 90 %, o mais preferivelmente pelo menos 95 % homóloga a qualquer uma das sequências citadas acima.

[00119] Como já aqui explicado antes, as sequências de ácido

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71/105 nucleico de acordo com a presente invenção são particularmente adequadas para expressar um anticorpo ou uma parte funcional, derivado ou análogo do mesmo de acordo com a invenção, preferivelmente D25, AM14, AM16, AM23 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmos, em um sistema de expressão de ácido nucleico. Uma sequência de ácido nucleico de acordo com a presente invenção é preferivelmente expressada em uma célula, mais preferivelmente em um célula produtora adaptada para a produção de anticorpo.

[00120] A invenção é ainda explicada nos seguintes exemplos. Estes exemplos não limitam o escopo da invenção, mas meramente servem para esclarecer a invenção.

Exemplos

MATERIAIS E MÉTODOS

Manutenção e isolação de células B humanas [00121] Usando procedimentos padrão, as células B humanas positivas em CD19 foram isoladas da camada de células brancas derivadas de banco de sangue (outras fontes podem ser sangue fresco com um fator de anti-coagulação, ou um órgão linfóide por exemplo das amígdalas ou baço). Em resumo, células mononucleares de sangue periférico total (PBMC) foram isoladas usando separação de densidade ficoll (Amersham, Buckinghamshire, UK). As pérolas rotuladas com CD22 foram usadas para as células B positivamente selecionadas pela técnica de classificação de célula MACS como descrita pelo fabricante (Miltenyi, Utrecht, Países Baixos). As células foram subsequentemente tingidas com combinações apropriadas de anticorpos monoclonais (mAbs) para CD19, CD27, IgD, IgM e IgA (Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ, USA). As células B de memória que são positivas para CD19 e CD27 e negativas para IgM, IgA e IgD foram depois classificadas usando o FACSAria (BD) (Figura

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1). Além das células B de memória, outros subconjuntos de células B, como células B ingênua, ingênua, folicular, de memória, que produz anticorpo, centroblástica, centrocítica, de centro germinal, de blast plasmático, célula plasmática, zona marginal, perisinusoidal ou transicional (muitos destes subconjuntos foram apenas determinados em camundongos) podem ser isoladas usando marcadores apropriados.

Cultura de Célula [00122] As células classificadas foram lavadas e cultivadas em placas de 24 reservatórios (1,5 a 2 x 10⁵ células/ml) em células L que expressam CD40L irradiadas, 80 Gray, (5 x 10⁴ células/ml; fornecidas pelo DR. J. Banchereau, Schering Plough France, Dardilly França), em meio completo (Meio Essencial Mínimo D Modificado de Iscove contendo 8 % de soro bovino fetal (FCS) e Penicilina/Estreptomicina). A menos que de outro modo mencionado, estas células L que expressam CD40L estão sempre presentes nas culturas em combinação com 8 % de FCS. Para preparar a célula B para a transdução retroviral as células foram cultivadas por 36 horas na presença de IL-21 de camundongo (50 ng/ml, R&D, Minneapolis, MN, USA). Depois das transdução as células são preferencialmente cultivadas na presença de IL-21, entretanto as células não respondem a IL-4, IL-15 e IL-10 (não excluindo outras citocinas). Por exemplo, a expansão de célula B induzida por IL-4 é mais baixa comparada com a IL-21 e os níveis mais baixos de divisão celular podem ser requeridos em alguns experimentos.

Construções retrovirais e produção de retrovirus recombinante [00123] Os mutantes ativos constitutivos de STAT5a e b foram descritos anteriormente. Os DNAs que codificam estes mutantes e STAT5b do tipo selvagem foram obtidos da T. Kitamura (IMSUT, Tóquio, Japão). Bcl-6 foi identificado em uma triagem de recuperação

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73/105 da senescência em fibroblastos de murino como um inibidor da sinalização de p19ARF-p53 anti-proliferativo. Bcl-XL foi identificado como um fator anti-apoptose, que foi gentilmente fornecido pelo Dr Korsmeyer (Howard Hughes Medical Institute, Boston, US). Estes DNAs foram ligados no vetor LZRS-ligador-IRES-GFP (ou IRES-YFP ou IRES-NGFR) que foi descrito anteriormente (Heemskerk et al., 1997; Heemskerk et al., 1999). Ao invés do marcador IRES-GFP (Proteína Fluorescente Verde) também um IRES-YFP (Proteína Fluorescente Amarela) ou um IRES-NGFR (Receptor do Fator de Crescimento de Nervo) foi usado. NGFR é um mutante incompetente em sinalização do NGFR, gentilmente fornecido pelo Dr. C. Bonini. Um anticorpo monoclonal contra NGFR (Chromaprobe, Mountain View, CA, US ou Miltenyi) foi usado para visualizar as células que expressam NGFR.

[00124] Para a produção de retrovirus recombinante, os plasmídeos retrovirais foram transfectados em uma linhagem de célula produtora anfotrópica isenta de vírus auxiliar Phoenix-A, um derivado da linhagem de célula 293 renal embrionária humana (Kinsella e Nolan, 1996) (um presente gentil do Dr. G. Nolan, Stanford University, Palo Alto, CA), usando Fugene-6 (Roche Diagnostics Netherlands, Almere, Países Baixos) de acordo com os protocolos do fabricantes. Dois dias mais tarde a seleção de células transfectadas começou pela adição de 2 pg/ml de puromicina (Becton Dickinson Clontech Laboratories, Palo Alto, CA). Dez a 14 dias depois da transfecção 6 x 10⁶ células foram plaqueadas por placa de Petri de 10 cm (Becton Dickinson Discovery Labware, Bedford, MA) em 10 ml de meio completo sem puromicina. No dia seguinte o meio foi renovado e no dia seguinte o sobrenadante retroviral foi colhido, centrifugado e congelado em alíquotas isentas de célula a -70°C. Este método produz uma produção viral reprodutível, rápida, em escala grande e de alto título de mais de 3 x 10⁶ partículas

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74/105 de vírus infeccioso/ml.

Transdução Retroviral [00125] O procedimento de transdução dos fragmentos de fibronectina humana recombinante CH-296 (RetroNectin®; Takara, Otsu, Japão) foi realizada como descrito anteriormente (Heemskerk et al., 1997; Heemskerk et al., 1999). As placas de 24 reservatórios tratadas com cultura que não de tecido (Costar, Badhoevedorp, Países Baixos) foram revestidos com 0,3 ml de fragmento de fibronectina humana recombinante CH-296 a 30 pg/ml na temperatura ambiente por 2 horas ou durante a noite a 4^oC. Quando placas de cultura que não de tecido de tamanho diferente foram usadas, os reagentes foram usados proporcionalmente. A solução de CH-296 foi removida, seguido pela incubação com 2 % de albumina sérica humana (HSA) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) por 30 min na temperatura ambiente, seguido por lavagem uma vez com PBS. 5 x 10⁵ células B, que foram preparadas para a transdução retroviral foram plaqueadas em 0,25 ml de RPMI sem FCS e células L e misturadas com 0,25 ml de sobrenadante retroviral descongelado. Para a transdução dupla Bcl-6 Bcl-XL 125 μΙ de Bcl-6-IRES-NGFR (ou IRESYFP) (Shvarts A. et al. Genes Dev., 2002) e 125 μΙ de Bcl-XL-IRESGFP (fornecido por S. Korsmeyer, Howard Hughes Medical Institute, Childrens Hospital, Boston, USA) foram misturados e adicionados às células. A cultura foi subsequentemente centrifugada a 1800 rpm a 25° C por 60 minutos e incubada por 6 horas a 37Ό. Em seguida 0,25 ml de sobrenadante foi removido e 0,25 ml de sobrenadante retroviral fresco foi adicionado. A cultura foi mais uma vez centrifugada a 1800 rpm a 25Ό por 60 minutos e incubada a 37Ό durante a noite. Na manhã seguinte as células foram transferidas para placas tratadas com cultura de tecido de 24 reservatórios (Costar) e cultivadas por 3 a 5 dias sob condições normais na presença de IL-4 humana (50 ng/ml)

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75/105 ou IL-21 de camundongo (50 ng/ml, R&D, Minneapolis, MN, USA). A eficiência de transdução foi determinada pelo tingimento de anticorpo de um mutante truncado, incompetente de sinalização do Receptor do Fator de Crescimento de Nervo (ANGFR, fornecido por C. Bonini, St. Raphael Hospital, Milan, Itália) ou a (co)expressão de GFP e ou YFP. As células contendo o(s) transgene(s) de interesse são depois selecionadas para outros experimentos.

Citometria de Fluxo [00126] Os anticorpos contra as moléculas de IgD, IgG, CD3, CD19, CD20, CD27, CD38, CD40, CD45, CD56, CD70, CD80, CD86, HLADR (BD) humanas diretamente rotuladas com FITC, PE, PERCP, PECy5, APC ou APC-Cy7 e IgM, cadeia leve capa, cadeia leve lambda, CD138, diretamente rotuladas com PE (DAKO) foram usados para a análise de citometria de fluxo. As células tingidas foram analisadas usando um LSRII (BD) e os dados de FACS foram processados com software de computador FlowJo (Tree Star, Inc).

Experimento de Proliferação [00127] Células B ingênuas e de memória foram isoladas a partir de PBMC frescas no FACSAria:

[00128] Células B Ingênuas: CD19-Pe-Cy7 pcs, CD27-APC neg, IgD-ΡΕ pos [00129] Células B de memória: CD19-Pe-Cy7 pos, CD27-APC pos, IgD-ΡΕ neg, IgA-FITC neg [00130] As células foram lavadas em PBS e recolocadas em suspensão em 0,5 ml de RPMI (37°C) sem FCS. Uma quantidade igual de IMDM contendo 2 μΜ de Éster carboxifluoresceína succinimidila (CFSE) foram adicionados à mistura de célula e incubados por 7 min a 37°C. O aumento da rotulação das células foi interrompido pela lavagem da célula com FCS frio. As células foram recolocadas em suspensão em 500 μΙ de IMDM-8% FCS e cultivadas com células L e

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76/105 na ausência ou presença de IL-21. As células não rotuladas foram usadas como controle.

[00131] Depois de 36 horas (imediatamente antes da transdução) uma proporção de células foi analisada quanto ao seu teor de CFSE. As células remanescentes foram transduzidas por rotação com Bcl-6IRES-NGFR, cultivadas por 3 dias e analisadas quanto ao seu teor de CFSE usando o LSRII. Os dados foram analisados usando o software FlowJo (Treestar)

Isolação de células B humanas específicas de antígeno usando a classificação de célula única de alta velocidade [00132] Além do método de isolação de célula B de memória descrito acima partindo com MBC (isto é, culturas de 100 células/ reservatório), as células B de memória humanas também podem ser incubadas com um antígeno de rótulo fluorescente e classificadas com base no reconhecimento de antígeno. Um exemplo é a isolação de células B que ligam Toxóide do Tétano rotulado com ficoeritrina (PE) (fornecidas por A. Radbruch, Berlin, Alemanha) (Figura 4). As células foram cultivadas a 1 célula/reservatório e checadas quanto a ligação de TT. Não obstante que qualquer outro antígeno rotulado possa ser usado.

Determinar a expressão do receptor de célula B (BCR) altera a cultura de longa duração de células transduzidas com Bcl-6 e Bcl-XL [00133] É conhecido que as células B que diferenciam durante a cultura in vitro perdem a sua expressão de membrana BCR, que também é observada nas células B transformadas com EBV. Portanto as células B transduzidas com Bcl-6 e Bcl-XL e cultivadas na presença de IL-21 foram tingidas para GFP, NGFR, CD19, Capa e/ou Lambda ou IgG ou com Toxóide do Tétano rotulado. Para mostrar a utilidade da expressão de BCR foram classificadas as células de ligação de TTPE (Radbruch) usando o FACSAria (BD) a 1 célula/reservatório em

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77/105 placas de 96 reservatórios, que foram semeadas com células L e meio de cultura contendo IL-21. Depois de três semanas a ligação ao

Toxóide do Tétano de clones amadurecidos foi checada usando o

FACS Canto (BD). Portanto as células foram colhidas e tingidas em placas de 96 reservatórios com GFP, NGFR, CD19 e TT-PE.

Desenvolvimento de linhagens de célula B duplo positivas em Bcl-6 e Bcl-XL que secretam anticorpos [00134] As linhagens de célula B foram criadas que produzem anticorpos monoclonais e são 100% duplo positivas em Bcl-6 e Bcl-XL. Primeiro isto foi obtido pela indução da proliferação e diferenciação usando IL-21. Provisoriamente estas células são transduzidas com os retrovirus Bcl-6-IRES-NGFR e Bcl-XL-IRES-GFP. As células são mantidas em IL-4 por 3 a 4 dias. As células que são transduzidas com um ou ambos os retrovirus depois expressam o transgene e portanto expressarão a proteína NGFR ou GFP. A expressão de NGFR e/ou GFP pode ser visualizada pelo uso de LSRII (BD). Se necessário, as células podem ser transduzidas novamente para se obter números mais altos de células que expressam ambos os transgenes. Independente de uma segunda transdução as células que expressam ambos os transgenes são classificadas usando o FACS Aria (BD) e cultivadas em uma densidade de célula variando de 10 a 500 células/reservatório em placas de 96 reservatórios na presença de IL21 e 2500 a 5000 células L/reservatório. Estas culturas de mini-volume (MBC) secretam quantidades relativamente grandes de anticorpo no sobrenadante de cultura já no dia 5 que depois podem ser usadas para propósitos de triagem. A triagem pode ser com base nas técnicas disponíveis para o antígeno de interesse por exemplo, ELISA/EIA/RIA, Western blot ou ensaios funcionais diretos como a neutralização de experimentos que bloqueiam a citocina. Depois da triagem e seleção de MBC que reconhecem o antígeno de interesse (TT e RSV em

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78/105 nossos experimentos), as células são subclonadas de 0,5 a 1 célula/reservatório em 96 reservatórios na presença de IL-21. A subclonagem normalmente leva de 2 a 3 semanas e pode ser realizada pelas culturas de diluição limitante (LD) ou classificação de célula única usando a citometria de fluxo (FACSAria).

Estoque viral de RSV A-2 e linhagem de célula HEp2 [00135] O vírus RSV A-2 (gentilmente fornecido por G. van Bleek, WKZ, Utrecht) e linhagem de célula HEp2 (Clinical Laboratory, AMC, Amsterdam), foram cultivadas em quantidades grandes e congeladas em nitrogênio líquido.

[00136] A linhagem de célula HEp2 aderente foi cultivada em meio normal em frascos Falcon T175 antes que as alíquotas fossem congeladas.

[00137] Para se obter um estoque de RSV de título mais alto, as células HEp2 foram semeadas e cultivadas para atingir 50 a 60 % de confluência. O estoque de RSV original foi adicionado (volume total de diluição 1/20 de 5 ml) por 45’ na temperatura ambiente nas células HEp2. 15 ml de meio fresco foram adicionados e as células foram deixadas durante a noite a 37°C, 5% de CO2 com a cobertura aberta. O sobrenadante de cultura na manhã seguinte foi cuidadosamente removido e 15 ml de meio contendo 1% de FCS foram adicionados. As células foram deixadas por 24 a 36 horas a 37°C, 5% de CO2 com a cobertura fechada. Quando 0 sincícios induzidos pelo RSV foram claramente visíveis e a maioria dos sincícios foram ainda intactos, 0 meio foi colhido, filtrado (0,22 μιτι) e girados a 1450 rpm na temperatura ambiente antes que as amostras fossem subitamente congeladas e armazenadas em nitrogênio líquido. Uma segunda colheita pode ser obtida adicionando-se imediatamente novo meio contendo 1% de FCS e congelando este lote de 4 a 6 horas mais tarde.

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Lido de RSV para ELISA [00138] As células HEp2 que foram infectadas com RSV A-2 para obter os estoques virais foram usadas para isolar as proteínas do RSV. Primeiro as células foram cuidadosamente lavadas com PBS e tripsinizadas. Tripsina (Gibco) foi retirada por lavagem e a pelota de célula foi lisada com 1 % de octilglicosídeo (a pelota de célula de um frasco T175 foi tratada com 2 ml de octilglicosídeo). A suspensão foi homogeneizada com seringa e agulha (10 vezes para cima e para baixo), incubadas por 1 hora em gelo e depois dialisada contra 2L de tampão de TBS pH 7,4, durante a noite a 4^o C. O sobrenadante foi obtido depois de sedimentar os fragmentos celulares. O teor de proteína foi determinado a 3,6 mg/ml e foi usado a 20 μο/ΓηΙ (50 μΙ) em ELISAs.

Determinação de TCID50 e PFU de estoques de RSV [00139] Para determinar a TCID50, 10⁴ HEp2 foram semeadas em placas de 96 reservatórios e infectadas com uma diluição em série de 2 ou 10 etapas de vírus do RSV em 4-plo. 2 a 3 dias mais tarde os sobrenadantes de cultura foram removidos e as células foram fixadas com 80% de acetona por 10’ na temperatura ambiente. Depois da remoção da acetona, a camada de célula fixada foi secada e mantida a 4°C ou congelada a -20°C. Para tingir as células HEp2 de RSV as placas foram primeiro bloqueadas com 5% de leite em pó em PBS 0,1% de Tween 20. Depois as placas foram lavadas 3 vezes antes de serem incubadas por 3 a 5 horas a 37°C com anti-RSV-HRP de cabra policlonal (1:500, Biodesign, Saco, ME, US) e lavadas extensivamente. Em seguida os reservatórios foram incubados com substrato AEC por 30’ na temperatura ambiente. Os focos infectados coloriram-se de vermelho e puderam ser observados pelo olho usando um microscópio de luz e puderam ser contados. O software Excel padrão foi usado para determinar a TCID50.

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80/105 [00140] Para determinar a quantidade de unidades formadoras de placa (PFU) do vírus, 1 x 10⁵/ml de células HEp2 em placas de 24 reservatórios foram incubadas com diluições em série de 10 vezes (10’ ³ a 10'⁷) de estoque viral do RSV em meio com 1 % de FCS a 37° C por 45’ (200 μΙ) antes que as células e vírus fossem cobertos com 0,5 ml ágar seaplaque a 0,25 % (Biozyme) aquecido manualmente. A camada de agarose impede a disseminação do vírus para as células não infectadas através do meio de cultura. Deste modo o vírus pode infectar apenas as células vizinhas, que eventualmente são mortas pelo vírus criando placas na monocamada de células HEp2. Estas placas podem ser melhor visualizadas pelo tingimento das células fixas (96 % de etanol - 100 % de ácido acético - 10 % de formalina 6:2:1) com 1 % de solução de violeta cristal. As placas são contadas (por pelo menos dois indivíduos diferentes) e o valor de PFU pôde ser determinado.

Seleção de anticorpos que neutralizam o Vírus Sincicial Respiratório (RSV) [00141] Para obter clones de célula B anti-Vírus Sincicial Respiratório (RSV), as células de sangue periférico (PBMC) de dois doadores foram isoladas das camadas de célula branca derivadas do banco de sangue (doador B62 e B63). Antes de classificar as células CD19^poslgM^neglgD^neglgA^negCD27^pos usando o FACSAria (BD) (Figura 1), as células CD22+ foram isoladas usando pérolas MACS e colunas (Miltenyi). Apenas se mencionado de modo diferente, as células foram cultivadas com células L. As células foram cultivadas por 36 horas na presença de IL-21 antes de serem transduzidas apenas com Bcl-6IRES-NGFR. Depois de 12 horas as células foram colhidas e cultivadas por 3 dias na presença de IL-4 antes que as células que expressam NGFR fossem classificadas usando pérolas MACS (Miltenyi) e imediatamente transduzidas com Bcl-XL-IRES-GFP. As

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81/105 células B que não se ligaram às pérolas MACS foram lavadas e transduzidas com Bcl-6 e Bcl-XL ao mesmo tempo. Depois de 12 horas, as células foram colhidas, reunidas e cultivadas por 3 dias na presença de IL-4 antes de serem classificadas na expressão de GFP e NGFR no FACSAria. As células foram lavadas e cultivadas na densidade de 100 células/reservatório em placas de 96 reservatórios (Costar) na presença de IL-21.

[00142] As culturas de célula B duplo transduzidas Bcl-6 e Bcl-XL foram triadas quanto a ligação de RSV usando um ELISA de lisado de célula HEp2 infectado com RSV e foram testadas em paralelo usando um experimento de microneutralização de RSV. Em resumo, 10⁴células HEp2 são semeadas em placas de 96 reservatórios de fundo chato (Costar) em meio completo. No dia seguinte o meio é substituído por 1 hora na temperatura ambiente com a mistura de vírus RSV e o sobrenadante de cultura de célula que foi pré-incubado por 30 min a 37Ό. O volume total é de 25 pl e a concentração fi nal de RSV é de 0,1 MOI. Depois de 1 hora a mistura de sobrenadante viral é diluída 9 vezes com PBS e substituída com 100 μΙ de IMDM/5 % de FCS. Depois de 2 dias as células são fixadas com 80 % de acetona e tingidas com anti-RSV-HRP policlonal (Biodesign). Usando H2O2 e as células AEC infectadas com RSV desenvolvem uma mancha vermelha. Usando a microscopia de luz as células infectadas puderam ser observadas e contadas se necessário. Como um controle para a neutralização do RSV um anti-RSV policlonal de cabra (Abeam, Cambridge, MA) é usado.

RT-PCR e clonagem de regiões VH e VL [00143] O RNA total foi isolado a partir de ~5 x 10⁵ células B com 0 kit RNeasy® mini (Qiagen, Venlo, Países Baixos). 250 ng de RNA total foram transcritos de modo reverso em um volume de 20 μI contendo 1X tampão de primeiro filamento, 500 μΜ de dNTP, 250 ng de

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82/105 hexâmeros aleatórios, 5 mM de DTT, 40 U de RNasin (Promega) e 200 U de Superscript III RT (Invitrogen). O cDNA foi diluído 10X em água Ultrapura e 2,5 pi de cDNA foram submetidos à PCR em uma solução a 50 μΙ contendo 20 mM de Tris-HCI, 50 mM de KCI, 2,5 mM de MgCÍ2, 250 μΜ de dNTP, 1 U de AmpliTaq Gold DNA polimerase (Applied Biosystems Inc.) e 25 pmol de cada iniciador. As condições de PCR foram como segue: 8 min de etapa de desnaturação a 96Ό seguido por 35 ciclos de 30 s a 96Ό, 30 s a 60Ό, 1 min a 72Ό e uma extensão final de 10 min a 72Ό.

[00144] Os produtos de PCR foram conduzidos em géis de agarose, purificados e clonados no vetor de clonagem pCR2.1 TA de acordo com as recomendações do fabricante. A análise de sequência foi realizada usando a química do BigDye Terminator (Applied Biosystems Inc.) e o software Vector-NTI (Invitrogen).

[00145] Para excluir as mutações induzidas pela transcriptase reversa e/ou DNA polimerase, várias conversões de cDNA e reações de PCR independentes foram realizadas e individualmente clonadas e a sequência analisada. As sequências de consenso foram determinadas com o software Vector-NTI Contig Express.

[00146] Para a expressão de anticorpo da proteína recombinante em células 293T, as construções de cadeia pesada e leve de tamanho natural foram geradas em pCDNA3.1(+)Zeo (Invitrogen). O vetor de expressão de cadeia pesada foi construído pela amplificação pela PCR da sequência líder de cadeia pesada e a região VH do clone D25 que introduz um sítio 5’-Nhel e um sítio 3’-Xhol. A região constante de lgG1 (CH1-dobradiça-CH2-CH3) foi amplificada a partir do mesmo cDNA enquanto se introduz um sítio 5’-Xhol e um 3’-Notl. O vetor de expressão de cadeia pesada de tamanho natural foi obtido pela ligação de três pontos no pCDNA3.1(+)Zeo digerido por Nhel/Notl. A construção de expressão de cadeia leve de tamanho natural foi gerada

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83/105 pela amplificação pela PCR da sequência líder de cadeia leve, a região VL e a região constante de cadeia leve com os preparadores que introduzem um sítio 5’-Nhel e 3’-Notl. O último produto foi clonado no pCDNA3.1(+)Zeo digerido com Nhel/Notl para se obter um vetor de expressão de cadeia leve de tamanho natural.

[00147] A análise de sequência foi realizada para confirmar a exatidão das construções de expressão.

[00148] A transfecção dupla transitória (Fugene-6, Roche, Alemanha ou Lipofectamina LTX, Invitrogen) de células 293T com vetores de expressão tanto de cadeia pesada quanto de cadeia leve foi realizada para produzir anticorpo monoclonal recombinante. Um tingimento de FACS com o sobrenadante de cultura resultante (48 horas) em células Hep2 infectadas com RSV foi realizada para mostrar a ligação funcional do anticorpo à proteína F do RSV.

[00149] Os oligonucleotídeos usados para as amplificações de PCR foram:

Regiões VH:

VH1-Para5'-AAATCGATACCACCATGGACTGGACCTGGAGG-3¹

VH1B-Para5'-AAATCGATACCACCATGGACTGGACCTGGAGM-3¹VH2A-Para5'-AAATCGATACCACCATGGACACACTTTGCTMCAC-3¹VH2B-Para5'-AAATCGATACCACCATGGACATACTTTGTTCCAAC-3¹VH3-Para5'-AAATCGATACCACCATGGAGTTTGGGCTGAGC-3¹

VH3B-Para5'-AAATCGATACCACCATGGARYTKKGRCTBHGC-3¹VH4-Para5'-AAATCGATACCACCATGAAACACCTGTGGTTCTT-3¹VH5-Para5'-AAATCGATACCACCATGGGGTCAACCGCCATC-3¹

VH6- Para 5'-AAATCGATACCACCATGTCTGTCTCCTTCCTC-3¹Cgama-Rev5¹-GGGTCTAGACAGGCAGCCCAGGGCCGCTGTGC-3¹

Regiões Vcapa:

Vkl-Para 5'-AAATCGATACCACCATGGACATGAGGGTCCCY-3'

VklB-Para5'-AAATCGATACCACCATGGACATGAGRGTCCYY-3' Vk2-Para5'-AAATCGATACCACCATGAGGCTCCCTGCTCAG-3'

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Vk3- Para 5'-AAATCGATACCACCATGGAARCCCCAGCGCA-3'

Vk4-Para5'-AAATCGATACCACCATGGTGTTGCAGACCCAG-3'

Ck-Rev 5'GATCGCGGCCGCTTATCAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT- 3'

Regiões Vlambda:

V11aecb 5'-aaatcgataccaccatggcctggtcccctctcctcc-3'

Vllg 5'-AAATCGATACCACCATGGCCGGCTTCCCTCTCC TCC-3'

VI2/10 5'-AAATCGATACCACCATGGCCTGGGCTCTGCTCCTCC-3'

VI3 j pah 5'-AAATCGATACCACCATGGCCTGGACCGCTCTCCTGC-3'

V15/7 5'-AAATCGATACCACCATGGCCTGGACTCCTCTCCTTC-3'

VI6/9 5'-AAATCGATACCACCATGGCCTGGGCTCCTCTCCTTC-3'

VI3 rm 5'-AAATCGATACCACCATGGCCTGGATCCCTCTCCTCC-3'

VI31 5'-AAATCGATACCACCATGGCCTGGACCCCTCTCTGGC-3'

V13e 5'-AAATCGATACCACCATGGCCTGGGCCACACTCCTGC-3'

V14c 5'-AAATCGATACCACCATGGCCTGGGTCTCCTTCTACC-3'

VI8a 5'-AAATCGATACCACCATGGCCTGGATGATGCTTCTCC-3'

Cl 2 / 7 5'-GATCGCGGCCGCTTATCAWGARCATTCTGYAGGGGCCACTG3' [00150] Os oligonucleotídeos usados para as construções de vetor de expressão foram:

Vetor de expressão de cadeia pesada:

VHl-L-Nhel: 5'-GCGGCTAGCCACCATGGACTGGACCTGGAGG-3'

JH4/5-XhoI: 5'-GCGCTCGAGACGGTGACCAGGGTTCCCTG-3'

CHfw-Xhol: 5'-CGCGCTCGAGTGCCTCCACCAAGGGCCCATCG

GTC-3'

CHrev-Notl: 5'GATCGCGGCCGCTTATCATTTACCCGGRGACAGGGAGAGGC-3'

Vetor de expressão de cadeia leve:

VKl-L-Nhel: 5'-GCGGCTAGCCACCATGGACATGAGGGTCCCY-3'

CK-NotI: 5'-GATCGCGGCCGCTTATCAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT-3'

EBV RT-PCR

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85/105 [00151] Para testar se a resposta proliferativa forte foi relacionada com a presença de EBV, um EBV RT-PCR foi realizado. O procedimento de RT é descrito acima. As condições de PCR foram como segue: uma etapa de desnaturação de 7 minutos a 94° C seguida por 30 ciclos de 30 s a 94° C, 30 s a 62° C (HPRT1), 52° C (LMP-1) e 58° C (EBNA1/2) e 30 s a 72° C e uma exte nsão final de 7 minutos a 72° C. Os oligonucleotídeos usados para a RT-PCR foram como segue: HPRT1 direto (5’-TATGGACAGGACTGAACGTCTTGC3’) e HPRT1 reverso (5’-GACACAAACATGATTCAAATCCCTGA-3’); LMP-1 direto: (5’-GCGACTCTGCTGGAAATGAT-3’) e LMP-1 reverso (5’-GACATGGTAATGCCTAGAAG-3’); EBNA1/2 direto (5’AGCAAGAAGAGGAGGTGGTAAG-3’) e EBNA1/2 reverso (5’GGCTCAAAGTGGTCTCTAATGC-3’).

[00152] Além do RT-PCR foi realizado um PCR diretamente na pelota de célula e DNA sobrenadante que foi isolado usando o kit de isolação QIAmp (Qiagen).

EXEMPLO 1 RESULTADOS Fenótipo de célula B [00153] O uso de células B de memória humanas como a plataforma para isolar remédios terapêuticos depende da capacidade para cultivar e testar estas células por um período relativamente longo de tempo. As células B humanas podem ser cultivadas e mantidas em um cenário de laboratório entretanto não por tempo suficiente para expandir, selecionar e clonar linhagens de célula B únicas contra um antígeno de interesse. Foram desenvolvidas técnicas de imortalização com base nas modificações genéticas de células B humanas. Foram estudados alvos a jusante de STAT5. Um alvo além de outros é Bcl-6. Bcl-6 inibe a diferenciação de células B para células plasmáticas que são paradas na proliferação. A superexpressão de Bcl-6 mantém

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BLIMP1 em equilíbrio, um fator de transcrição cuja expressão é fortemente realçada pelas células B estimuladoras com IL-21 (funciona por intermédio de STAT3). BLIMP1 é necessário para induzir o desenvolvimento de Ig para produzir células (CD20-CD38+) ao passo que Bcl-6 pode impedir isto (as células mantêm a expressão de CD20, o chamado de fenótipo de centro germinal).

[00154] Para estudar a possível inclinação de certas populações de célula dentro do compartimento de célula B, a rotulação com CFSE antes da estimulação de células B de memória e ingênuas humanas frescas revelou que todas as células começam a dividir e que todas as populações de células B são igualmente transduzidas (Figura 2). São mostradas células B de memória transduzidas com Bcl-6 e cultivadas na presença de IL-21 e IL-4. As células B ingênuas foram transduzidas em um nível mais baixo e as taxas de divisão foram mais baixas em 36 horas mas foram idênticas às células B de memória depois de mais 3 dias de cultura (dados não mostrados).

[00155] Em seguida foi mostrado que Bcl-6, junto com Bcl-XL (alvo anti-apoptótico a jusante de STAT5), a sinalização de CD40L e na presença de IL-21, mantém células B de memória de IgG humana no fenótipo CD20+CD38du// por períodos longos de tempo (>3 meses) (Figura 3). Além disso, as células B Bcl-6 Bcl-XL têm um fenótipo que corresponde às células B ativadas (ver a Tabela 1, exemplificado por tingimento de FACS de 3 clones de célula B TT+), visto que estas células têm expressão alta de CD80, CD86 e HLA-DR.

determinado em três clones de célula B Bcl-6 Bcl-XL diferentes cultivados com IL-21 e sinalização de CD40L

tingimento	resultado	tingimento	resultado
CD2	neg	CD69	neg
CD5	neg	CD70	pos
CD7	neg	CD71	pos
CD10	pos	CD73	neg

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CD20	pos	CD80	pos/alto
CD21	pos	CD86	pos
CD22	pos	CD95	pos/alto
CD23	neg/5 % pos	CD126	neg
CD24	neg	CD132 (gama comum)	pos
CD25	pos	CD138	neg/2 % pos
CD27	neg/baixo	CD154 (CD40L)	8 % pos
CD28	neg	ICOSL	pos
CD30	pos (56-74 %)	igM	neg
CD38	pos/intermediário	IgG	pos
CD40	pos	HLA-DR	Pos (alto)
CD44	pos	Capa	pos/neg
CD45	pos	Lambda	pos/neg
CD45RA	pos/alto	IL21-R	pos

Expressão de membrana de anticorpo [00156] As células Bcl-6 Bcl-XL transduzidas, negativas em EBV permaneceram positivas na expressão de BCR como determinado pela ligação de antígeno ou tingimento de Capa e Lambda (Figuras 3 e 4). Consequentemente, tais células são particularmente adequadas para isolar e/ou triar depois de um longo período de cultura quanto a uma especificidade desejada, por exemplo usando antígeno rotulado, porque tais células ligar-se-ão ao dito antígeno rotulado com seu BCR. Isto foi confirmado pela classificação de célula única de células B Bcl-6 e Bcl-XL duplamente transduzidas que ligam TT rotulado com PE usando o FACSAria. Depois de três semanas os clones classificados de célula única foram tingidos com marcadores apropriados e TT-PE em placas de 96 reservatórios e medidos quanto a ligação no FACS Canto (BD) (Figura 4). Em conclusão, nos casos onde a presença de um receptor de célula B nas células B é desejada, tal como por exemplo em ensaios de triagem, as células B são preferivelmente transduzidas com Bcl-6 e Bcl-XL e não infectadas com EBV.

Divisão celular e curvas de crescimento [00157] As células B transduzidas com Bcl-6 Bcl-XL dividem-se em

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88/105 média 0,6 vezes por dia. A taxa de divisão varia entre doadores e densidade de célula das culturas (Figura 5a). O clone D25 anti-RSV teve uma taxa de divisão de 0,47 vezes por dia (figura 5b). As células podem ser cultivadas nas densidades abaixo de 1 célula/96 reservatórios para propósitos de clonagem.

Secreção de anticorpo de células B Bcl-6 Bcl-XL [00158] As células B transduzidas com Bcl-6 Bcl-XL secretam em média de um pg/ml de anticorpos, que é o bastante para cultivar as quantidades necessárias para os testes pré-clínicos (Figura 6). Surpreendentemente o clone anti-RSV D25 produziu três vezes mais anticorpos comparado com as outras linhagens de célula testadas. Determinar o teor de EBV [00159] A RT-PCR de EBV em mRNA das linhagens de célula Bcl-6 Bcl-XL que foram cultivadas com IL-21 e sinalização de CD40L. Nas linhagens de célula obtidas com esta técnica de imortalização no transcrito de gene de EBV foram sempre detectadas (dados não mostrados).

Procedimento de seleção [00160] Devido à estabilidade no crescimento e expressão de BCR, estas células são bem adaptadas para isolar células B específicas de antígeno. Isto nos deu a oportunidade para usar diversos procedimentos de seleção e clonagem diferentes. Um é obter imediatamente células específicas de antígeno depois da introdução de Bcl-6 e Bcl-XL por FACS ou classificação de Pérola Magnética usando antígeno rotulado de interesse realçando deste modo a probabilidade de gerar clones múltiplos de célula B específicos de antígeno. Uma outra opção é cultivar células B de memória purificadas, volumosas transduzidas em Bcl-6 Bcl-XL (ou qualquer outra) em densidades de célula baixa (por exemplo 100 células/reservatório). Os sobrenadantes destas culturas a 100 c/r

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89/105 podem ser coletadas e testadas quanto a sua especificidade. As culturas a 100 célula/reservatório que são descobertas positivas quanto ao reconhecimento de antígeno, são depois subclonadas pelas culturas de diluição limitante para se obter linhagens de célula monoclonais. Usando ambos os métodos pode-se isolar mais de 40 clones de célula B que reconhecem o Toxóide do Tétano (TT). Assim estes clones foram selecionados na ligação de TT ao BCR no FACSAria ou foram selecionados pela triagem em ELISA de séries de culturas até que a linhagem de célula monoclonal anti-TT única foi isolada (não mostrado).

Seleção de anticorpos que neutralizam RSV [00161] A partir de B63 doador, 25 culturas de 100 célula/ reservatório completamente bloqueou a infecção pelo RSV e replicação. D10, uma das culturas de 100 célula/reservatório neutralizador produziu um anticorpo anti-RSV forte que foi clonado pela cultura de diluição limitante. Um dos anticorpos monoclonais, D25 foi usado para continuar os estudos. D25, um anticorpo monoclonal com uma lgG1 de cadeia pesada, como determinado pelo ELISA comercial (Sanquin, Amsterdam, não mostrado) e uma cadeia leve Capa (Figura 7), muito eficientemente bloqueou a infecção pelo RSV com um valor de IC50 entre 0,5 e 1,5 ng/ml (± 10 pM) ao passo que a IC50 do anticorpo anti-RSV padrão usado na clínica (palivizumab desenvolvido pela Medlmmune) é 0,453 pg/ml (3,02 nM) (H. Wu et al. 2005 J. Mol. Biol, e A. Mejias et al. 2005 Antimicrob. Agents Chemother.) (Figura 8).

Reconhecimento de Antígeno [00162] Além dos experimentos de neutralização, a ligação de D25 às células HEp2 infectadas pelo RSV foi determinada. As células HEp2 foram infectadas usando 0 protocolo de produção de vírus regular. As células HEp2 infectadas com RSV foram tripsinizadas e

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90/105 incubadas com 25 a 50 μΙ de sobrenadante de cultura. As células foram lavadas e tingidas com IgG-ΡΕ anti-ser humano de camundongo (BD ou Jackson) para detectar a ligação do anticorpo D25 às células infectadas. O anticorpo de controle de ELISA r-Biopharm foi usado como um controle interno. É mostrado na Figura 9a a ligação de D25 às células HEp2 intactas, infectadas com RSV.

[00163] Visto que as proteínas de envelope (membrana) do RSV existem de duas proteínas a saber as proteínas G e F, a ligação de D25 foi testada contra as células infectadas com o vírus VSV pseudotipado com nenhuma ou as proteínas F do RSV ou G do RSV (gentilmente fornecidas por John K Rose). Como mostrado na figura 9b, D25 ligou-se fortemente às células EL-4 infectadas com a proteína VSV-F. Em uma tentativa para estudar o epítopo reconhecido pelo D25 versus palivizumab, as células EL-4 infectadas com a proteína VSV-F foram incubadas com quantidades crescentes de D25 ou palivizumab. As células foram lavadas e tingidas com uma mistura de 3 anticorpos anti-RSV-F de camundongo (Dako). Ao contrário do Palivizumab que mostrou competição quanto a ligação às células infectadas com VSV-F com o anticorpo anti-RSV-F de camundongo, a ligação D25 não foi afetada (dados não mostrados).

[00164] A Figura 9c mostra a ligação de Palivizumab (Synagis) e D25 em uma maneira dependente da concentração às células HEp2 infectadas. Visto que ambos os anticorpos ligam-se 1 para 1 à sua proteína alvo não existe nenhuma diferença na ligação às células HEp2 infectadas.

Frequência da ligação de antígeno do RSV vs clones de neutralização [00165] Foi calculado que a frequência de células B de memória específicas de antígeno que ligam RSV foi 17 % e a frequência de células específicas de antígeno que neutralizam RSV foi 6 %, como determinada para B63 doador. D25 liga-se a um epítopo

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91/105 conformacional que é diferente do epítopo reconhecido pelo palivizumab. Isto está ilustrado na figura 10 em que D25 não se liga aos epítopos desnaturados, lineares apresentados pelos lisados de células infectadas por RSV lisado revestidos em placas de ELISA enquanto que palivizumab não se liga à proteína desnaturada (F). Isolação e purificação de fragmentos de anticorpo [00166] A partir de várias linhagens de célula B incluindo o clone D25 altamente neutralizador de RSV foi-se capaz de cultivar volumes tão grandes quanto 500 ml. Estes sobrenadantes de cultura contêm pelo menos 2 gg/ml, portanto deve ser capazes de obter anticorpo suficientemente purificado para realizar estudos pré-clínicos (animal). A purificação é realizada usando o Kit de Purificação de Antígeno Montage (Millipore, Billerica, MA, USA) e colunas HP de Proteína A HiTrap (GE Healthcare, Diegem, Bélgica).

[00167] Além disso, as células 293T foram transfectadas com a cadeia pesada e leve de D25 que foram subclonadas em vetores de expressão de proteína pCDA3.1 usando lipofectamina LTX (Invitrogen). A quantidade de IgG que estava presente no sobrenadante foi de aproximadamente 22 gg/ml (volume total de 50 ml). Este derivado de anticorpo da sequência de nucleotídeo clonada do anticorpo expressado pela linhagem de célula B D25 também reconheceu células HEp2 infectadas (dados não mostrados). Sequência de Anticorpo [00168] A Figura 11a mostra a sequência de nucleotídeo e aminoácido das cadeias pesada e leve do clone B63D10-D25. Usando-se RT-PCR padrão e iniciadores específicos de anticorpo, as sequências da cadeia pesada (Vh1-69) e leve (Vkl 08/018) foram determinadas. A sequência de anticorpo inteira foi clonada pelo uso de vetores TOPO e depois controle de sequência, subclonada no vetor de expressão de proteína de mamífero pCDNA3.1 (Invitrogen). As Figuras

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11b e 11c representam as cadeias VH e VL4 do clone, os asteriscos indicam mutações comparadas com a sequência da linha germinativa do Vh1-69 que deve ter ocorrido durante a maturação por afinidade e outra seleção de célula B.

[00169] Para resumir, foi aqui mostrado a isolação, caracterização e cultura de longa duração de células B de memória humanas usando os transgenes Bcl-6 e Bcl-XL. Estes nos deram as ferramentas necessárias para isolar anticorpos com propriedades únicas, como o anticorpo monoclonal anti-RSV B63D10-B25. Visto que as células B são de uma origem humana, elas podem ser facilmente preparadas como um remédio terapêutico.

EXEMPLO 2 [00170] As cadeias pesada e leve de D25 foram clonadas em vetores de expressão padrão como descrito antes (‘sequência de anticorpo’ p44). Para criar uma construção de expressão que permitisse a expressão de proteína máxima as sequências de cadeias pesada e leve de D25 foram otimizadas no códon pela GENEART (Regensburg, Alemanha). Neste procedimento sítios de restrição adicionais foram criados para simplificar procedimentos de clonagem futuros mas o mais importante os códons de nucleotídeo que traduzem em sequências de aminoácido foram otimizados para a tradução máxima em proteína. Assim a sequência de nucleotídeo foi otimizada mas a sequência de aminoácido permaneceu inalterada. É mostrado no EXEMPLO 4 a capacidade de neutralização da D25 derivada de sobrenadante de célula B purificado, D25 recombinante e D25 otimizado na GENEART. Todos eficientemente neutralizam RSV.

[00171] As modificações da GENEART comparadas com a sequência D25 original são representadas na Figura 12.

EXEMPLO 3 [00172] Em seguida aos experimentos de neutralização de RSV in

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93/105 vitro foi testado o anticorpo monoclonal D25 em modelos in vivo. Os modelos que foram descritos para os testes anti-RSV in vivo são camundongos BALB/c e ratos algodão (Sigmodon hispidus) (Mejias A et al., Antimicrobial Agents and chemotherapy 2004; p1811, Johnson S et al., JID 1997; p1215 e Wu H et al., JMB 2007: p652). O modelo de camundongo BALB/c é claramente o modelo mais fraco mas visto que os ratos de algodão são difíceis de capturar e manter, foi primeiro ajustado, adaptado os testes de D25 em camundongos BALB/c.

[00173] Protocolo: Anticorpos específicos de RSV em BALB/c, Dia 5 [00174] Planejamento Experimental:

Dia-1. Injeção I.P. de 100 μΙ de anticorpos

Dia 0. Infecção I.N. 1 x 10⁷ pfu de RSV A2 em 50 μΙ

Dia 1 a 5, checar o bem estar e o peso gerais dos camundongos

Dia 5, autópsia, coletar BAL, sangue e pulmões Drenar o sangue por intermédio de punção de veia Coletar 2,0 ml de BAL por intermédio de cânula traqueal Coletar os pulmões

Imediatamente iniciar TCIDso no material de BAL (1 ml) Congelar 1 ml de material de BAL (ELISA citocina/RT-PCR) -80° C

Realizar TCIDso no material desejado preparado (1 ml)

Congelar 1 ml do material desejado (ELISA citocina/RTPCR) -80° C

Coletar/girar o sangue para ELISA de hlgG em soro e armazenar a -80° C [00175] Os resultados são mostrados na Figura 13:

[00176] Um dia antes da inoculação de RSV (1 x 10⁷ partículas de RSV-A2) pela pulverização nasal, os animais foram injetados IP com quantidades diferentes de Synagis (Medlmmune), D25 purificado ou

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94/105 um anticorpo lgG1 Ctrl (Eureka) (Tabela 3). (Figura 13B) Os níveis de IgG humana foram determinados em soros de camundongos do dia 5 e a queda no nível sérico de anticorpo em 5 dias; a Tabela 4 mostra uma vista geral dos valores de meia vida. A Figura 13D representa os títulos virais encontrados nas lavagens pulmonares (BAL) no dia 5 em animais tratados e não tratados ao passo que a figura 13E representa os números de células T e B em sangue periférico de camundongos tratados e não tratados. A Figura 13F mostra a histologia dos pulmões com os brônquios e infiltração de (de modo normal principalmente eosinófilos) animais tratados e não tratados.

Conclusão/Resultado:

[00177] Uma estimativa da meia-vida de D25 é de 5 a 9 dias com base no cálculo (linear) que 60 e 30 pg de anticorpo foram injetados no dia 0 (2 e 1 mg/kg respectivamente) e no dia 5 33 ou 16 pg foram detectados (volume total dos camundongos 1,5). Quando foi iniciado com 0,5 mg/kg de injeção por animal no dO então os níveis de Ig caíram de 15 pg para 11 pg no dia 5, o que indicou uma meia vida de 9 dias (Tabela 4).

Tabela 4

mg/kg	total administrado dO (pg)	detectado no d5 (μο)	Meia-vida (dias)
2,0	60	33	5,6
1,0	30	16	5,4
0,5	15	11	9,4
[00178]	O título viral como	determinado pelo	ensaio de TCID50

mostra que nos animais de controle 1 x 10⁴ PFU pôde ser detectado ao passo que nenhum vírus foi detectado nos animais tratados com Synagis (2 mg/kg) ou D25 (2, 1 e 0,5 mg/kg).

[00179] Os animais tratados com Synagis ou D25 mantêm % mais alta de células T CD4 periféricas e células B B220. Os animais

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95/105 tratados com Synagis (2 mg/kg) têm % mais baixa de células T CD4 comparados com os animais tratados com D25. Embora isto possa não ser significante é importante observar que os animais tratados com uma dose baixa de D25 (1 e 0,5 mg/kg) mantêm níveis altos de células B e T quando comparadas com os animais tratados com controle.

[00180] Embora os dados de histologia (figura 13F) não sejam quantitativos está claro que Synagis e D25 reduzem o influxo de células imunes nos pulmões e em torno dos brônquios comparados ao controle. Quando D25 e Synagis são comparados, então os animais tratados com D25 parecem ter menos infiltração celular nos pulmões e em torno dos brônquios.

[00181] Para testar D25 nos Ratos Algodão, experimentos são ajustados para comparar animais pré-tratados com Synagis e D25 antes da inoculação com o vírus RSV-X no NVI (Bilthoven, Países Baixos).

EXEMPLO 4 [00182] Além de B63-D10-D25, foram isolados três novos anticorpos neutralizadores de RSV potentes (AM 14, AM 16 e AM23) a partir do mesmo doador (B63). As culturas de célula B volumosas de 100 células por reservatório que foram originalmente selecionadas para a neutralização de RSV e foram congeladas e armazenadas em nitrogênio líquido, foram descongeladas e o sobrenadante da cultura foi testado quanto a ligação às células HEp2 infectadas com RSV. Foi testado quanto a ligação às células Hep2 infectadas visto que é um marcador para o reconhecimento de anticorpo de proteínas de membrana do RSV nativas, oligoméricas como as proteínas F e G e podem servir como um bom prognosticador para a neutralização. Quando a ligação foi detectada, as células foram cultivadas em célula única e triadas quanto à ligação para obter clones. Todos os três

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96/105 anticorpos foram clonados no vetor GENEART que foi originalmente construído para D25. Além disso, como D25 todos reconheceram a proteína RSV-F (não mostrada). Depois da clonagem e expressão em células 293T a proteína recombinante foi purificada (as sequências de nucleotídeo e aminoácido são representadas na figura 14A, Be C). Os anticorpos foram testados quanto a neutralização contra vários isolados de RSV primários em células Vero e HEp2 (Figura 15). Todos os três anticorpos são do isótipo lgG1. AM14 tem uma cadeia leve Capa, enquanto AM16 e AM23 têm uma cadeia leve Lambda. Todos os três anticorpos, como D25, contêm hipermutações somáticas em seus domínios variáveis de anticorpo sugerindo que in vivo eles passaram pela maturação de afinidade durante uma reação de centro germinal, um processo que cria sequências de anticorpo únicas.

[00183] Os resultados são mostrados nas Figuras 15-1 e 15-11: O ensaio de neutralização do vírus RS com sobrenadante de linhagem de célula B purificada derivado de D25 (sD25), D25 purificado recombinante (rD25), D25 otimizado com o códon GENEART recombinante (rD25 GA), AM14, AM16, AM23 (todos proteína recombinante purificada) e Synagis. A neutralização de anticorpo viral foi testada em duas linhagens de célula diferentes (Figura 15-1) células Vero e (Figura 15-11) Hep2 com anticorpos diferentes: A2 (A), X (B) e 2006/1 (C) são RSV subtipo A enquanto que o vírus Z (D) e 2007-2 (E) são subtipos B. 100TCID50 de cada vírus foi adicionado às diluições de anticorpo em série em DMEM/1 % de FCS e incubados por 1 hora a 37 graus antes que 100 μΙ de células Vero ou HEp2 (1 x 10⁶/ml) fossem adicionados. A mistura de anticorpo viral não foi retirada por lavagem. Depois de três dias o sobrenadante foi removido e as células foram fixadas com 80% de acetona por 10’ na temperatura ambiente. Depois da remoção da acetona, a camada de célula fixada foi secada e mantida a 4°C ou congelada a -20°C. Para tingir as células HEp2

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97/105 infectadas com RSV, as placas foram primeiro bloqueadas com 5 % de leite em pó em PBS 0,1 % de Tween 20, depois as placas foram lavadas 3 vezes antes de serem incubadas por 3 a 5 horas a 37° C com HRP anti-RSV de cabra policlonal (1:500, Biodesign, Saco, ME, US) e lavados extensivamente. Subsequentemente todos os reservatórios foram incubados com substrato de AEC por 30’ na temperatura ambiente. Os focos infectados mancharam de vermelho e podem ser observados pelo olho usando um microscópio de luz e podem ser contados.

Resultado/conclusão [00184] Todos os anticorpos neutralizam as cepas A e B do RSV (Tabela 5). No geral os anticorpos D25 diferentes neutralizam os vírus RSV eficientemente, embora variações inter-experimentais menores possam ser observadas. AM 14 é exatamente tão potente quanto D25 enquanto AM 16 é exatamente tão potente quanto Synagis. AM23 entretanto não neutraliza as cepas A de RSV muito eficientemente, enquanto é menos potente na neutralização de cepas B do RSV, embora ainda comparável ao Synagis.

Tabela 5 Valores de IC50 (ng/ml)

Linhagem célula usada	de Subtipo RSV	do sD25	rD25	rD25 GA	AM14	AM16	AM23
Vero	A	3,4	1,6	3,2	15,2	304,3	19,4
Vero	B	9,0	0,3	1,2	1,1	126,4	168,8
HEp2	A	3,3	2,1	5,3	21,5	285,6	25,0
HEp2	B	14,3	1,9	1,3	6,7	124,8	190,7

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O valor de IC50 para cada anticorpo no subtipo A do vírus RS em células Vero ou HEp2 foi calculado como a média de 50 % de neutralização em três cepas virais (A2, X e 2006-1). O valor de IC50 para cada anticorpo no subtipo B do virus RS em células Vero ou HEp2 foi calculado como a média de 50 % de neutralização em duas cepas virais (2007-2 e Z). Cada um dos ensaios de neutralização foi realizado em triplicada e repetidos duas vezes (também mostrado nas figuras 15A e B). sD25 = sobrenadante de cultura derivado de célula B purificado rD25 = D25 recombinante purificado rD25 GA = sobrenadante de células 293T com D25 recombinante otimizado no códon GENEART

EXEMPLO 5 [00185] Efeitos sinergísticos e de bloqueio dos anticorpos anti-RSV. [00186] Para analisar se D25, Synagis ou o novo conjunto de anticorpo AM interfere entre si quanto ao reconhecimento da proteína F do RSV, foram pré-incubadas células HEp2 infectadas com RSV com concentrações aumentadas de anticorpos não rotulados até que eles atingissem o platô de ligação máxima. Foi determinado para cada anticorpo a fase de platô na qual nenhum aumento na ligação foi detectado quando a quantidade de Ig foi aumentada, (não mostrado). Depois da lavagem, as amostras foram incubadas com uma dose padrão (3 pmol) de D25 rotulado com PE ou Synagis rotulado com APC. Esta dose também dá ligação máxima.

Resultado [00187] Como mostrado na Figura 16 Synagis e D25 rotulados mostram uma ligação reduzida às células HEp2 infectadas com RSV quando estas células foram pré-incubadas com Synagis ou D25não rotulados. Synagis mostra além disso uma leve redução na ligação induzida por AM16. A ligação de D25 é fortemente bloqueada pelo AM23 mas ao contrário a ligação de D25 é fortemente realçada depois da pré-incubação com AM 14. O que indica que o epítopo reconhecido pelo D25 normalmente não está ainda totalmente exposto mas a exposição é realçada depois da ligação de AM 14 ao seu epítopo

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99/105 nativo. O que demonstra que estes dois anticorpos podem funcionar juntos e realçar a neutralização.

Descrição Resumida dos Desenhos

Figura 1.

[00188] Isolação de células B de memória humanas, positivas em IgG. PBMC isoladas da camada de células brancas usando a separação de densidade Ficoll (Amersham) foram incubadas com pérolas magnéticas anti-CD22 antes de serem isoladas usando colunas MACS (Miltenyi). As células positivas em CD22 foram depois incubadas com anticorpos contra CD19, CD27, IgM, IgD e IgA (BD) humanas. As células negativas para IgM, IgD e IgA e positivas para CD19 e CD27 foram classificadas usando a classificação de célula única de alta velocidade (FACSAria, BD).

Figura 2 [00189] Tingimento de CFSE. Células B de memória humanas frescas foram isoladas, rotuladas com CSFE e estimuladas por 36 horas com IL-21 antes de serem transduzidas com Bcl-6-IRES-NGFR. As células foram mantidas um adicional de 3 dias em IL-21 antes que o teor de CFSE fosse determinado. O corante CFSE é diluído com cada divisão de célula.

Figura 3 [00190] Um exemplo de células B humanas transduzidas com Bcl-6 e Bcl-XL ou apenas com Bcl-XL. As células foram mantidas em células L irradiadas que expressam CD40L e a citocina IL-21. É mostrado na esquerda a expressão de BCR como determinada pelo tingimento capa e lambda (93% das células positivas capa lambda são do isótipo IgG, não mostrado). Na direita é mostrada a expressão de CD38 nos eixos X e a expressão de CD20 nos eixos Y. O tingimento CD38^dü//CD20⁺ indica as células B de memória ou de centro germinal; os fingimentos CD38⁺CD20^_ indicam plasmoblastos.

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Figura 4 [00191] Isolação de células B imortalizadas, específicas de antígeno humanas. As células B de memória humanas foram isoladas como descrito na figura 1 e subsequentemente transduzidas com Bcl6-IRES-NGFR e Bcl-XL-IRES-GFP. As células que expressam NGFR, GFP e foram ligadas à Toxina do Tétano rotulada com PE foram isoladas usando o FACSAria. As células foram cultivadas em célula única em placas de fundo chato de 96 reservatórios na presença de células L irradiadas e IL-21 antes de serem selecionadas com base na ligação de TT-PE usando o FACS Canto (BD).

Figura 5 [00192] O crescimento de célula cumulativo e a taxa de divisão de clones 6XL de célula B. As células B de (A) dois clones anti-TT e (B) um clone anti-RSV (B63D10-D25) foram cultivadas na presença de IL21 e células L irradiadas.

Figura 6 [00193] As culturas frescas foram iniciadas com 200.000 células/24 reservatórios em 1,0 ml de IMDM com 8 % de FCS e pen/estrep. O FCS usado foi normal (HyClone) ou FCS IgG Bovino Ultrabaixo (Gibco). Depois de 3 dias o sobrenadante de cultura foi substituído e os números de célula foram ajustados a 200.000 células/ml. É mostrada a produção de IgG média em 3 dias medida em 3 pontos de tempo consecutivos a diferença não foi significante (valor p 0,2).

Figura 7 [00194] Para determinar o fenótipo de cadeia leve do clone D25 anti-RSV, a linha de célula B D25 foi tingida com anticorpos capaficoeritrina ou lambda-ficoeritrina (BD). Apenas os anticorpos capaficoeritrina ligou-se à linhagem de célula, mostrando que este anticorpo tem uma cadeia leve capa.

Figura 8

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101/105 [00195] A partir de B63 doador, culturas 100 células/reservatório foram cultivadas usando células B de memória humanas positivas em Bcl-6 Bcl-XL. Uma destas culturas, D10 mostrou forte neutralização. As linhagens de célula monoclonal derivadas de LD foram fabricadas, um D25 neutralizou o vírus RSV A-2 eficientemente. É aqui mostrado D25 comparado com palivizumab (synagis) e um anti-RSV de cabra policlonal. Não são mostrados os sobrenadantes de cultura irrelevantes de clones de célula B transduzidos com Bcl6 Bcl-XL cultivados com IL-21 e sinalização de CD40L que produzem altos níveis de anticorpos mas não bloquearam a infecção pelo RSV. O clone D25 foi usado para outra caracterização.

Figura 9 [00196] Na figura 9a: As células HEp2 foram semeadas de 10 a 12⁶células por frasco T175 (Nunc) em IMDM/5 % de FCS. No dia seguinte o meio foi substituído com 5 ml de meio com vírus RSV (1,0 MOI) e incubados por 45’ na temperatura ambiente antes que 20 ml de meio fresco fosse adicionado e as células fossem cultivadas durante a noite a 37°C. No dia seguinte o meio foi substituído com IMDM/1 % de FCS e cultivado durante a noite com uma tampa fechada a 37° C. No dia seguinte as células foram lavadas com PBS e tratadas com tripsina. Para tingir as células infectadas a incubação primária foi realizada com sobrenadante de cultura. A incubação secundária foi feita com IgG-PE anti-humano (BD). As células foram analisadas usando o LSRII (BD). Como um controle positivo o controle positivo do KIT de ELISA comercial da r-Biopharm foi usado.

[00197] Na figura 9b: As células EL-4 foram infectadas com vírus VSV pseudotipado com as proteínas F ou G do RSV (gentilmente fornecido por John Rose) e incubadas com sobrenadante de cultura de D25. As células foram lavadas e incubadas com IgG-ΡΕ anti-humana (Jackson) para detectar a ligação de D25 às células infectadas.

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Apenas a ligação de D25 às células infectadas com vírus VSV pseudotipado com a proteína F do RSV foi detectada.

[00198] A Figura 9c mostra a ligação de Palivizumab (Synagis) e D25 em uma maneira dependente da concentração às células HEp2 infectadas. É mostrada a intensidade de fluorescência média (MFI). Figura 10 [00199] Ligação de anti-RSV de cabra policlonal (pos ctrl), palivizumab (synagis) e D25 ao lisado de célula infectada com HEp2 revestido.

Figura 11 [00200] Análise de sequência do clone D25. A 11a mostra as sequências de nucleotídeo e aminoácido prognosticadas dos domínios de cadeia pesada e leve variáveis. As 11 b/c mostram a sequência de cadeia pesada e leve de D25 comparada com a linha germinativa prognosticada. Os asteriscos indicam mutações que provavelmente ocorreram durante a seleção e maturação por afinidade do clone de célula B in vivo.

Figura 12 [00201] Clonagem e expressão de anticorpos humanos recombinantes de linhagens de célula B transduzidas com BCL6 BCLxL. Isto já foi descrito para o anticorpo D25 (Figura 11). Aqui são representadas as modificações de nucleotídeo GENEART comparadas com a sequência de D25 original, observe que estas mutações não mudam a composição de aminoácido do anticorpo D25.

Figura 13 [00202] A inoculação de camundongos BALB/c com D25 derivado de sobrenadante de célula B purificada e Synagis. (A) Um dia antes da inoculação de RSV (1 x 10⁷ partículas de RSV-A2) pela pulverização nasal, os animais foram injetados com IP com quantidades diferentes de Synagis (Medlmmune), D25 purificado ou um anticorpo lgG1 ctrl

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103/105 (Eureka) (tabela 3). (B) Os níveis de IgG humana foram determinados em soros de camundongos do dia 5 e a queda nos níveis séricos de anticorpo em 5 dias (C); a tabela 4 mostra uma vista geral dos valores de meia-vida. A Figura 13D descreve os títulos virais encontrados em lavagens pulmonares (BAL) no dia 5 em animais tratados e não tratados ao passo que a figura 13E descreve números de célula T e B em sangue periférico de camundongos tratados e não tratados (F) mostra a histologia dos pulmões com brônquios e infiltração (de modo normal principalmente eosinófilos) de animais não tratados e tratados. Figura 14 [00203] Sequências de nucleotídeo e aminoácido de três novos anticorpos neutralizadores de RSV potentes (A) AM 14, (B) AM 16 e (C) AM23.

Figura 15 [00204] Ensaio de neutralização do vírus RS com D25 derivado de sobrenadante da linhagem de célula B purificada (sD25), D25 recombinante purificado (rD25), D25 otimizado no códon GENEART recombinante (rD25 GA), AM14, AM16, AM23 (todos proteína recombinante purificada) e Synagis. A neutralização do anticorpo viral foi testada em duas linhagens de célula diferentes (figura 15-1) células Vero e (figura 15-11) Hep2 com anticorpos diferentes A2 (A), X (B) e 2006/1 (C) são subtipos A do RSV enquanto que o vírus Z (D) e 20072 (E) são subtipos B. 100TCID50 de cada vírus foi adicionado às diluições de anticorpo em série em DMEM/1 % de FCS e incubadas por 1 hora a 37 graus antes que 100 μΙ de células Vero ou HEp2 (1 x 10⁶/ml) fossem adicionados.

Figura 16 [00205] Ligação relativa de uma quantidade fixa (3 pmol) de Synagis rotulado com APC e rD25 rotulado com PE às células HEp2 infectadas com RSV que foram pré-incubadas com concentrações

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104/105 crescentes dos anticorpos não rotulados indicados.

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Ye, B. H., Cattoretti, G., Shen, Q., Zhang, J., Hawe, N., de Waard, R., Leung, C., Nouri-Shirazi, M., Orazi, A., Chaganti, R. S., et al. (1997). The BCL-6 protooncogene controls germinal-centre formation and Th2type inflammation. Nat Genet 16, 161-170.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo isolado ou parte funcional do mesmo, caracterizados pelo fato de que se liga especificamente ao antígeno F do Vírus Sincicial Respiratório (RSV), em que o anticorpo ou parte funcional do mesmo compreende:

a. uma região determinante de complementariedade (CDR)

1 de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos NYIIN (SEQ ID NO: 1), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos GIIPVLGTVHYAPKFQG (SEQ ID NO: 2), uma CDR3 de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos ETALVVSTTYLPHYFDN (SEQ ID NO: 3), uma CDR1 de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos QASQDIVNYLN (SEQ ID NO: 4), uma CDR2 de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos VASNLET (SEQ ID NO: 5) e uma CDR3 de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos QQYDNLP (SEQ ID NO: 6);

b. uma CDR1 de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos GFSFSHYA (SEQ ID NO: 73), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos ISYDGENT (SEQ ID NO: 74), uma CDR3 de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos ARDRIVDDYYYYGMDV (SEQ ID NO: 75), uma CDR1 de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos QDIKKY (SEQ ID NO: 76), uma CDR2 de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos DAS e uma CDR3 de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos QQYDNLPPLT (SEQ ID NO: 77);

c. uma CDR1 de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos GFTFSSYN (SEQ ID NO: 80), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos ISAGSSYI (SEQ ID NO: 81), uma CDR3 de cadeia pesada que compreen-

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2/8 de a sequência de aminoácidos AREDYGPGNYYSPNWFDP (SEQ ID NO: 82), uma CDR1 de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos SSNIGAGYD (SEQ ID NO: 83), uma CDR2 de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos GNT e uma CDR3 de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos HSYDRSLSG (SEQ ID NO: 84); ou

d. uma CDR1 de cadeia pesada que compreende a sequência GFNFHNYG (SEQ ID NO: 87), uma CDR2 de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos VWYDGSKK (SEQ ID NO: 88), uma CDR3 de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos VRDKVGPTPYFDS (SEQ ID NO: 89), uma CDR1 de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos NIGSET (SEQ ID NO: 90), uma CDR2 de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos DDD e uma CDR3 de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos QVWDRSNYHQV (SEQ ID NO: 91).

2. Anticorpo ou parte funcional do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende:

a. uma sequência de cadeia pesada variável que compreende a sequência de aminoácidos QVQLVQSGAEVKKPGSSVMVSCQASGGPLRNYIINWLRQAPGQGPE WMGGIIPVLGTVHYAPKFQGRVTITADESTDTAYIHLISLRSEDTAMYY CATETALVVSTTYLPHYFDNWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 7);

b. uma sequência de cadeia leve variável que compreende a sequência de aminoácidos DIQMTQSPSSLSAAVGDRVTITCQASQDIVNYLNWYQQKPGKAPKLLIYVASNLETGVPSRFSGSGSGTDFSLTISSLQPEDVATYYCQQYDNLPLTFGGGTKVEIKRTV (SEQ ID NO: 8);

c. uma sequência de cadeia pesada variável que

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3/8 compreende a sequência de aminoácidos QVQLVQSGAEVKKPGSSVMVSCQASGGPLRNYIINWLRQAPGQGP EWMGGIIPVLGTVHYAPKFQGRVTITADESTDTAYIHLISLRSEDTAMY YCATETALVVSTTYLPHYFDNWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 7) e a sequência de cadeia leve variável que compreende uma sequência de aminoácidos

DIQMTQSPSSLSAAVGDRVTITCQASQDIVNYLNWYQQKPGKAPKLLI YVASNLETGVPSRFSGSGSGTDFSLTISSLQPEDVATYYCQQYDNLPL TFGGGTKVEIKRTV (SEQ ID NO: 8);

d. uma sequência de cadeia pesada variável que compreende a sequência de aminoácidos EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSHYAMHWVRQAPGKGL EWVAVISYDGENTYYADSVKGRFSISRDNSKNTVSLQMNSLRPEDTA LYYCARDRIVDDYYYYGMDVWGQGATVTVSS (SEQ ID NO: 78);

e. uma sequência de cadeia leve variável que compreende a sequência de aminoácidos DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDIKKYLNWYHQKPGKVPELL MHDASNLETGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQPEDIGTYYCQQYDNL PPLTFGGGTKVEIKRTV (SEQ ID NO:79);

f. uma sequência de cadeia pesada variável que compreende a sequência de aminoácidos EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSHYAMHWVRQAPGKGL EWVAVISYDGENTYYADSVKGRFSISRDNSKNTVSLQMNSLRPEDTA LYYCARDRIVDDYYYYGMDVWGQGATVTVSS (SEQ ID NO: 78) e uma sequência de cadeia leve variável que compreende a sequência de aminoácidos DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDIKKYLNWYHQKPGKVPELL MHDASNLETGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQPEDIGTYYCQQYDNL PPLTFGGGTKVEIKRTV (SEQ ID NO:79);

g. uma sequência de cadeia pesada variável que

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4/8 compreende a sequência de aminoácidos

EVQLVETGGGLAQPGGSLRLSCAASGFTFSSYNMNWVRQAPGKGL

EWVSHISAGSSYIYYSDSVKGRFTVSRDNVRNSVYLQMNSLRAADTA

VYYCAREDYGPGNYYSPNWFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:85);

h. uma sequência de cadeia leve variável que compreende a sequência de aminoácidos QSVVTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAP KLLIYGNTNRPSGVSDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCHSY DRSLSGSVFGGGTKLTV (SEQ ID NO:86);

i. uma sequência de cadeia pesada variável que compreende a sequência de aminoácidos EVQLVETGGGLAQPGGSLRLSCAASGFTFSSYNMNWVRQAPGKGL EWVSHISAGSSYIYYSDSVKGRFTVSRDNVRNSVYLQMNSLRAADTA VYYCAREDYGPGNYYSPNWFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:85) e a sequência de cadeia leve variável que compreende uma sequência de aminoácidos QSVVTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAP KLLIYGNTNRPSGVSDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCHSY DRSLSGSVFGGGTKLTV (SEQ ID NO:86);

j. uma sequência de cadeia pesada variável que compreende a sequência de aminoácidos EVQLVESGGNVVKPGTSLRLSCAATGFNFHNYGMNWVRQAPGKGL EWVAVVWYDGSKKYYADSVTGRFAISRDNSKNTLYLQMNSLRVEDT AVYYCVRDKVGPTPYFDSWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:92);

k. uma sequência de cadeia leve variável que compreende uma sequência de aminoácidos SYVLTQPPSVSLAPGGTAAITCGRNNIGSETVHWYQQKPGQAPVLVV YDDDDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDRS NYHQVFGGGTKLTV (SEQ ID NO:93); ou

l. uma sequência de cadeia pesada variável que

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5/8 compreende a sequência de aminoácidos EVQLVESGGNVVKPGTSLRLSCAATGFNFHNYGMNWVRQAPGKGL EWVAVVWYDGSKKYYADSVTGRFAISRDNSKNTLYLQMNSLRVEDT AVYYCVRDKVGPTPYFDSWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:92) e uma sequência de cadeia leve variável que compreende uma sequência de aminoácidos

SYVLTQPPSVSLAPGGTAAITCGRNNIGSETVHWYQQKPGQAPVLVV YDDDDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDRSN YHQVFGGGTKLTV (SEQ ID NO:93)

3. Anticorpo ou parte funcional do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a parte funcional do mesmo é um anticorpo de domínio único, um anticorpo de cadeia única, um fragmento variável de cadeia única (scFv), um fragmento Fab ou um fragmento F(ab')2.

4. Vetor caracterizado pelo fato de que compreende um ácido nucleico isolado, o ácido nucleico isolado caracterizado pelo fato de que codifica o anticorpo ou parte funcional do mesmo como definido na reivindicação 1 ou 2.

5. Vetor de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a sequência de ácido nucleico compreende:

a. uma sequência de nucleotídeos de cadeia pesada que compreende a sequência de nucleotideos na Figura 11A (SEQ ID NO: 9) ou Figura 12 (SEQ ID NO: 140);

b. uma sequência de nucleotideos de cadeia leve que compreende a sequência de nucleotideos na Figura 11A (SEQ ID NO: 10) ou Figura 12 (SEQ ID NO: 142);

c. uma sequência de nucleotideos de cadeia pesada que compreende a sequência de nucleotideos na Figura 11A (SEQ ID NO: 9) ou Figura 12 (SEQ ID NO: 140) e uma sequência de nucleotideos de cadeia leve que compreende a sequência de nucleotideos na Figu

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6/8 ra 11A (SEQ ID NO: 10) ou Figura 12 (SEQ ID NO: 142);

d. uma sequência de nucleotídeos de cadeia pesada que compreende a sequência de nucleotideos na Figura 14A (SEQ ID NO: 101);

e. uma sequência de nucleotideos de cadeia leve que compreende a sequência de nucleotideos na Figura 14A (SEQ ID NO: 108);

f. uma sequência de nucleotideos de cadeia pesada que compreende a sequência de nucleotideos na Figura 14A (SEQ ID NO: 101) e uma sequência de nucleotideos de cadeia leve que compreende a sequência de nucleotideos na Figura 14A (SEQ ID NO: 108);

g. uma sequência de nucleotideos de cadeia pesada que compreende a sequência de nucleotideos na Figura 14B (SEQ ID NO: 116);

h. uma sequência de nucleotideos de cadeia leve que compreende a sequência de nucleotideos na Figura 14B (SEQ ID NO: 123);

i. uma sequência de nucleotideos de cadeia pesada que compreende a sequência de nucleotideos na Figura 14B (SEQ ID NO: 116) e uma sequência de nucleotideos de cadeia leve que compreende a sequência de nucleotideos na Figura 14B (SEQ ID NO: 123);

j. uma sequência de nucleotideos de cadeia pesada que compreende a sequência de nucleotideos na Figura 14C (SEQ ID NO: 131);

k. uma sequência de nucleotideos de cadeia leve que compreende a sequência de nucleotideos na Figura 14C (SEQ ID NO: 138); ou

l. uma sequência de nucleotideos de cadeia pesada que compreende a sequência de nucleotideos na Figura 14C (SEQ ID NO: 131) e uma sequência de nucleotideos de cadeia leve que compreen

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7/8 de a sequência de nucleotídeos na Figura 14C (SEQ ID NO: 138).

6. Método para produzir um anticorpo ou uma parte funcional do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar a célula engenheirada que expressa a sequência de ácidos nucléicos como definida na reivindicação 4 ou 5 sob condições nas quais dita sequência de ácidos nucleicos é expressa.

7. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo ou parte funcional do mesmo como definido na reivindicação 1, 2 ou 3, e um carregador, diluente e/ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis.
8. Uso de um anticorpo ou parte funcional do mesmo como definido nas reivindicações 1, 2 ou 3 ou de um vetor como definido nas reivindicações 4 e 5, ou de uma composição como definida na reivindicação 7, caracterizado por ser na preparação de um medicamento para tratar infecção por RSV.
9. Método para produzir uma célula produtora de anticorpo, que é estável por pelo menos três meses e que é capaz de produzir anticorpos específicos de RSV, caracterizado pelo fato de que compreende:

a. engenheirar uma célula B capaz de produzir um anticorpo específico de RSV para co-expressar Blimp-1 e BCL6; ou

b. engenheirar uma célula B capaz de produzir um anticorpo específico de RSV para co-expressar Blimp-1, BCL6 e Bcl-xL;

c. cultivar uma célula B capaz de produzir um anticorpo específico de RSV em IL-21 e engenheirar a célula B para co-expressar Blimp-1 e BCL6;

d. cultivar uma célula B capaz de produzir um anticorpo específico de RSV em IL-21 e engenheirar a célula B para co-expressar Blimp-1, BCL6 e Bcl-xL.
10. Método para produzir um anticorpo capaz de se ligar

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8/8 especificamente a RSV, caracterizado pelo fato de que compreende:

a. produzir uma célula produtora de anticorpo de acordo com o método da reivindicação 9; e

b. obter o anticorpo produzido pela dita célula produtora de anticorpo.