ES2575129T3 - Moléculas de unión específicas de VSR y medios para producirlas - Google Patents

Moléculas de unión específicas de VSR y medios para producirlas Download PDF

Info

Publication number
ES2575129T3
ES2575129T3 ES08766756.4T ES08766756T ES2575129T3 ES 2575129 T3 ES2575129 T3 ES 2575129T3 ES 08766756 T ES08766756 T ES 08766756T ES 2575129 T3 ES2575129 T3 ES 2575129T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
acid sequence
sequence
seq
amino acid
antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES08766756.4T
Other languages
English (en)
Inventor
Hergen Spits
Tim Beaumont
Etsuko YASUDA
Mark Jeroen KWAKKENBOS
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
MedImmune Ltd
Original Assignee
MedImmune Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by MedImmune Ltd filed Critical MedImmune Ltd
Application granted granted Critical
Publication of ES2575129T3 publication Critical patent/ES2575129T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1027—Paramyxoviridae, e.g. respiratory syncytial virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1036—Retroviridae, e.g. leukemia viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Un anticuerpo aislado o parte funcional del mismo que es capaz de unirse específicamente con el antígeno F del virus sincitial respiratorio (VSR), y en el que el anticuerpo o parte funcional del mismo comprende: a. una región determinante de complementariedad (CDR) 1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos NYIIN (SEQ ID NO: 1), una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos GIIPVLGTVHYAPKFQG (SEQ ID NO: 2), una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos ETALVVSTTYLPHYFDN (SEQ ID NO: 3), una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos QASQDIVNYLN (SEQ ID NO: 4), una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos VASNLET (SEQ ID NO: 5), y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos QQYDNLP (SEQ ID NO: 6); o b. una CDR 1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos GFSFSHYA (SEQ ID NO: 73), una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos ISYDGENT (SEQ ID NO: 74), una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos ARDRIVDDYYYYGMDV (SEQ ID NO: 75), una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos QDIKKY (SEQ ID NO: 76), una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos DAS y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos QQYDNLPPLT (SEQ ID NO: 77); o c. una CDR 1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos GFTFSSYN (SEQ ID NO: 80), una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos ISAGSSYI (SEQ ID NO: 81), una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos AREDYGPGNYYSPNWFDP (SEQ ID NO: 82), una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SSNIGAGYD (SEQ ID NO: 83), una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos GNT y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos HSYDRSLSG (SEQ ID NO: 84); o d. una CDR 1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos GFNFHNYG (SEQ ID NO: 87), una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos VWYDGSKK (SEQ ID NO: 88), una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos VRDKVGPTPYFDS (SEQ ID NO: 89), una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos NIGSET (SEQ ID NO: 90), una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos DDD, y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos QVWDRSNYHQV (SEQ ID NO: 91).

Description

5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
DESCRIPCION
Moleculas de union especlficas de VSR y medios para producirlas La invencion se refiere a los campos de biologla y medicina.
El Virus Sincitial Respiratorio Sincitial (VSR) es un virus de resfriado comun que pertenece a la familia de paramixovirus. El VSR es virulento, facilmente transmisible y la causa mas comun de enfermedad del tracto respiratorio inferior en ninos de menos de 2 anos de edad. Hasta el 98 % de los ninos que acuden a la guarderla se infectaran en una unica temporada de VSR. Entre 0,5 % y 3,2 % de los ninos con infeccion por VSR requieren hospitalizacion. Se han presentado en los Estados Unidos aproximadamente 90.000 admisiones en los hospitales y 4500 muertes al ano. Son factores de riesgo importantes para hospitalizacion debida a VSR nacimiento prematuro, enfermedad pulmonar cronica, enfermedad cardlaca congenita, inmunidad comprometida, y edad menor de 6 semanas en ninos por lo demas sanos. No esta disponible ningun tratamiento eficaz de bronquiolitis VSR positiva aparte de cuidados paliativos en forma de nutricion adecuada y terapia de oxlgeno. No se ha demostrado que terapias antivirales tales como ribavirina sean eficaces en la infeccion por VSR. Un anticuerpo monoclonal, palivizumab (tambien denominado Synagis), esta registrado para profilaxis contra infeccion por VSR. Palivizumab es un anticuerpo monoclonal modificado por ingenierla genetica (humanizado) para la protelna de fusion de VSR. Sin embargo, palivizumab no siempre es eficaz. Por lo tanto, existe la necesidad de la tecnica de anticuerpos y terapias alternativos contra VSR.
Es un objeto de la presente invencion proporcionar medios y metodos para contrarrestar y/o prevenir una enfermedad relacionada con VSR. Es un objeto adicional de la invencion proporcionar anticuerpos alternativos y/o mejorados contra VSR y proporcionar celulas estables capaces de producir anticuerpos contra VSR.
Por lo tanto la presente invencion proporciona los anticuerpos aislados de las reivindicaciones 1-3, las secuencias de acido nucleico aisladas de las reivindicaciones 4-5, la celula de la reivindicacion 6, el metodo de la reivindicacion 7, la composicion de la reivindicacion 8 y los anticuerpos, acidos nucleicos o composiciones de las reivindicaciones 911, para uso de la reivindicacion 9-11.
La presente invencion proporciona anticuerpos que son capaces de unirse especlficamente con VSR. Dichos anticuerpos tambien denominados en el presente documento “anticuerpos anti VSR” o “anticuerpos especlficos de VSR”, son capaces de unirse especlficamente con al menos un componente de VSR, tal como por ejemplo un epltopo de una protelna de VSR. La union no especlfica no esta abarcada por la expresion “union especlfica”. Los anticuerpos anti VSR de acuerdo con la presente invencion son particularmente adecuados para contrarrestar y/o al menos en parte prevenir una infeccion por VSR y/o efectos adversos de una infeccion por VSR. Un anticuerpo anti VSR particularmente preferido de acuerdo con la presente invencion es el anticuerpo designado “D25”, que tiene una region de cadena pesada y una region de cadena ligera como se representa en las Figuras 11A-D. Las secuencias de CDR de D25, que en particular contribuyen a las propiedades de union a antlgeno de D25, se representan en la Figura HD. El anticuerpo D25 parece tener caracterlsticas superiores en comparacion con el anticuerpo anti VSR registrado Palivizumab (Figura 8). Por ejemplo, D25 tiene un valor de CI50 de aproximadamente 0,4-1,5 ng/ml en un ensayo de neutralizacion in vitro en el que se infectan celulas HEp-2 con VSR, mientras que Palivizumab tiene un valor de CI50 de aproximadamente 453 ng/ml.
Un equivalente funcional de un anticuerpo se define en el presente documento como una parte funcional, derivado o analogo de un anticuerpo.
Una parte funcional de un anticuerpo se define como una parte que tiene al menos una propiedad igual que dicho anticuerpo en tipo, no necesariamente en cantidad. Dicha parte funcional es capaz de unirse con el mismo antlgeno que dicho anticuerpo, aunque no necesariamente en el mismo grado. Una parte funcional de un anticuerpo comprende preferentemente un anticuerpo de un unico dominio, un anticuerpo monocatenario, un fragmento variable monocatenario (scFv), un fragmento Fab o un fragmento F(ab')2.
Un derivado funcional de un anticuerpo se define como un anticuerpo que se ha alterado de modo que al menos una propiedad, preferentemente una propiedad de union a antlgeno, del compuesto resultante sea esencialmente del mismo tipo, no necesariamente de la misma cantidad. Se proporciona un derivado de muchas maneras, por ejemplo mediante sustitucion de aminoacidos conservativa, por lo que un resto de aminoacido se sustituye por otro resto con propiedades en general similares (tamano, hidrofobicidad, etc.), de modo que el funcionamiento general probablemente no se ve afectado gravemente.
Un experto en la materia tambien es capaz de generar compuestos analogos de un anticuerpo. Esto se realiza por ejemplo mediante exploracion de una biblioteca de peptidos o biblioteca de presentacion en fagos. Dicho analogo tiene esencialmente al menos una propiedad igual que dicho anticuerpo en tipo, no necesariamente en cantidad.
Como se conoce bien por el experto en la materia, una cadena pesada de un anticuerpo es la mayor de los dos tipos de cadenas que componen una molecula de inmunoglobulina. Una cadena pesada comprende dominios constantes
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
y un dominio variable, estando dicho dominio variable implicado en la union a antlgeno. Una cadena ligera de un anticuerpo es el menor de los dos tipos de cadenas que componen una molecula de inmunoglobulina. Una cadena ligera comprende un dominio constante y un dominio variable. El dominio variable esta, junto con el dominio variable de la cadena pesada, implicado en la union a antlgeno.
Las regiones determinantes de complementariedad (CDR) son las regiones hipervariables presentes en dominios variables de cadena pesada y dominios variables de cadena ligera. Las CDR de una cadena pesada y la cadena ligera conectada de un anticuerpo forman juntas el sitio de union al antlgeno.
Ahora que la presente invencion proporciona la informacion de que las secuencias de CDR representadas en la Figura 11 proporcionan caracterlsticas de union a VSR deseadas, las variantes pueden comprender al menos una secuencia de CDR alterada. Por ejemplo, se aplica sustitucion de aminoacidos conservativa. La sustitucion de aminoacidos conservativa implica sustitucion de un aminoacido con otro con propiedades generalmente similares (tamano, hidrofobicidad, etc.), de modo que el funcionamiento global probablemente no se ve afectado gravemente.
Tambien es posible cambiar al menos una secuencia de CDR representada en la Figura 11 para generar un anticuerpo variante, o un equivalente funcional del mismo, con al menos una propiedad alterada en comparacion con D25. Un anticuerpo o equivalente funcional puede comprender una secuencia de CDR que es al menos 70 % identica a una secuencia de CDR como se representa en la Figura 11, de modo que las caracterlsticas de union favorables de D25 se mantienen al menos en parte o incluso se mejoran. Una secuencia de CDR como se representa en la Figura 11 puede alterarse de modo que el anticuerpo resultante o equivalente funcional comprenda al menos una propiedad mejorada, tal como por ejemplo una afinidad, selectividad y/o estabilidad de union mejorada, en comparacion con D25. Estan disponibles en la tecnica diversos metodos para alterar una secuencia de aminoacidos. Por ejemplo, se sintetiza artificialmente una secuencia de cadena pesada o cadena ligera con una secuencia de CDR deseada. Preferentemente, una secuencia de acido nucleico que codifica una secuencia de CDR se muta, por ejemplo usando mutagenesis aleatoria, o dirigida.
Se desvela en el presente documento un anticuerpo aislado, sintetico o recombinante o un equivalente funcional del mismo que es capaz de unirse especlficamente con virus sincitial respiratorio y que comprende:
- una secuencia CDR1 de cadena pesada que comprende una secuencia que es al menos 70 % identica de la secuencia NYIIN y/o
- una secuencia de CDR2 de cadena pesada que comprende una secuencia que es al menos 75 % identica a la secuencia GIIPVLGTVHYAPKFQG y/o
- una secuencia de CDR3 de cadena pesada que comprende de una secuencia que es al menos 70 % identica a la secuencia ETALWSTTYLPH YFDN y/o
- una secuencia de CDR1 de cadena ligera que comprende una secuencia que es al menos 85 % identica a la secuencia QASQDIVNYLN y/o
- una secuencia de CDR2 de cadena ligera que comprende una secuencia que es al menos 70 % identica a la secuencia VASNLET.
Dicho anticuerpo tambien comprende una secuencia de CDR3 de cadena ligera que comprende una secuencia que es al menos 70 % identica de la secuencia QQYDNLP.
Un anticuerpo o un equivalente funcional puede comprender una secuencia de CDR que es al menos 75 %, mas preferentemente al menos 80 %, mas preferentemente al menos 85 %, mas preferentemente al menos 90 % identica a al menos una de las secuencias de CDR representadas en la Figura HD. Mas preferentemente, un anticuerpo o un equivalente funcional pueden comprender una secuencia de CDR que es al menos 95 % identica a al menos una de las secuencias de CDR representadas en la Figura HD. El anticuerpo particularmente preferido D25, descrito anteriormente, comprende secuencias de CDR que consisten en las secuencias de CDR representadas en la Figura HD. Una realizacion particularmente preferida de acuerdo con la invencion proporciona por lo tanto un anticuerpo aislado, sintetico o recombinante o un equivalente funcional del mismo que es capaz de unirse especlficamente con virus sincitial respiratorio y que comprende:
- una secuencia de CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia NYIIN,
- una secuencia de CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia GIIPVLGTVHYAPKFQG,
una secuencia de CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de ETALWSTTYLPHYFDN,
- una secuencia CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de QAS QD IVNYLN,
- una secuencia de CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia VASNLET y
una secuencia de CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia QQYDNLP.
Se desvela en el presente documento un anticuerpo o se proporciona un equivalente funcional que comprende las tres secuencias de CDR de cadena pesada y las tres secuencias de CDR de cadena ligera como se representa en la Figura HD, o secuencias que son al menos un 70 %, preferentemente al menos 80 %, mas preferentemente al
menos 85 % identicas a las mismas. Se desvela ademas un anticuerpo aislado, sintetico o recombinante o un
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
equivalente funcional del mismo que comprende una secuencia de CDR1 de cadena pesada que comprende una secuencia que es al menos 70 % identica a la secuencia NYIIN y una secuencia de CDR2 de cadena pesada que comprende una secuencia que es al menos 70 % identica a la secuencia GIIPVLGTVHYAPKFQG y una secuencia de CDR3 de cadena pesada que comprende una secuencia que es al menos 70 % identica a la secuencia ETALWSTTYLPHYFDN y una secuencia de CDR1 de cadena ligera que comprende una secuencia que es al menos 70 % identica a la secuencia QASQDIVNYLN y una secuencia de CDR2 de cadena ligera que comprende una secuencia que es al menos 70 % identica a la secuencia VASNLET, y una secuencia de CDR3 de cadena ligera que comprende una secuencia que es al menos 70 % identica a la secuencia QQYDNLP. Dicho anticuerpo o equivalente funcional preferentemente comprende secuencias de CDR que son al menos 75 %, mas preferentemente al menos 80 %, mas preferentemente al menos 85 %, mas preferentemente al menos 90 %, mas preferentemente al menos 95 % identicas a las secuencias de CDR de cadena pesada y las secuencias de CDR de cadena ligera como se representa en la Figura HD. Tambien se desvela un anticuerpo o equivalente funcional que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada mencionadas anteriormente as! como las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera anteriormente mencionadas.
Tambien se desvelan anticuerpos o equivalentes funcionales de los mismos que comprenden una secuencia de aminoacidos de cadena pesada variable que es al menos 70 % identica a la secuencia de cadena pesada como se representa en la Figura 11. Dichas secuencias de cadena pesada proporcionan propiedades de union a VSR deseadas, como se demuestra por el anticuerpo D25. Se desvela ademas por lo tanto un anticuerpo o un equivalente funcional del mismo, que tiene una secuencia de cadena pesada que comprende una secuencia que es al menos 70 % identica a la secuencia
QVQLVQSGAEVKKPGSSVMVSCQASGGPLRNYIINWLRQAPGQGPEWMGGIIPVLGTVHYAPKFQGRVTITADESTD TAYIHLISLRSEDTAMYYCATETALWSTTYLPHYFDNWGQGTLVTVSS. Ademas, secuencias de aminoacidos de cadena ligera variable que son al menos 70 % identicas a la secuencia de cadena ligera como se representa en la Figura 11 tambien proporcionan propiedades de union de VSR deseadas, como se demuestra por el anticuerpo D25. Tambien se desvela por lo tanto un anticuerpo, o un equivalente funcional del mismo que tiene una secuencia de cadena ligera que es al menos 70 % identica a la secuencia, DIQMTQSPSSLSAAVGDRVTITCQASQDIVNYLNWYQQKPGKAPKLLIYVASN LETGVPSRFSGSGSGTDFSLTISS- LQPEDVATYYCQQYDNLPLTFGGGTKVEIK RTV. Un anticuerpo o una parte funcional puede comprender una secuencia de cadena pesada variable y/o una secuencia de cadena ligera variable que es al menos 75 %, mas preferentemente al menos 80 %, mas preferentemente al menos 85 %, mas preferentemente al menos 90 %, mas preferentemente al menos 95 % identica a la secuencia de cadena pesada y/o la secuencia de cadena ligera como se representa en la Figura 11. Cuanto mayor sea la homologla, mas estrechamente se asemejara dicho anticuerpo o parte funcional al anticuerpo D25. Un anticuerpo o parte funcional puede comprender una cadena pesada as! como una cadena ligera que se asemeja a la cadena pesada y ligera de D25. Se desvela ademas por lo tanto un anticuerpo o parte funcional que comprende una secuencia de cadena pesada y una secuencia de cadena ligera que son al menos 70 %, mas preferentemente al menos 80 %, mas preferentemente al menos 85 %, mas preferentemente al menos 90 %, mas preferentemente al menos 95 % identicas a la secuencia de cadena pesada y la secuencia de cadena ligera como se representa en la Figura 11.
Una realizacion proporciona un anticuerpo que comprende una secuencia de cadena pesada que consiste en la secuencia de cadena pesada como se representa en la Figura 11, y una secuencia de cadena ligera que consiste en la secuencia de cadena ligera como se representa en la Figura 11. Como alternativa, como se conoce bien por los expertos en la materia, es posible generar una secuencia de cadena pesada o cadena ligera acortada manteniendo al mismo tiempo una propiedad de union de interes. Preferentemente, se genera dicha cadena pesada o cadena ligera acortada que tiene una region constante mas corta, en comparacion con la cadena pesada o ligera original. El dominio variable preferentemente se mantiene. Por ejemplo, se produce un fragmento Fab o fragmento F(ab')2 basado en una secuencia de cadena pesada o secuencia de cadena ligera representada en la Figura 11. Se desvela tambien por lo tanto un equivalente funcional de un anticuerpo que comprende al menos una parte funcional de una secuencia como se representa en la Figura 11. Una parte funcional puede tener una longitud de al menos 20 aminoacidos y puede comprender una secuencia que es al menos 70 % identica a la secuencia de CDRI de cadena pesada representada en la Figura HD, y/o una secuencia que es al menos 75 % identica a la secuencia de CDR2 de cadena pesada representada en la Figura HD y/o una secuencia que es al menos 70 % identica a la secuencia de CDR3 de cadena pesada representada en la Figura HD, y/o una secuencia que es al menos 85 % identica a la secuencia de CDR1 de cadena ligera representada en la Figura HD y/o una secuencia que es al menos 70 % identica a la secuencia de CDR2 de cadena ligera representada en la Figura HD. Preferentemente, dicha parte funcional puede comprender tambien una secuencia que es al menos 70 % identica a la secuencia de CDR3 de cadena ligera representada en la Figura HD.
Otro anticuerpo anti VSR particularmente preferido de acuerdo con la presente invencion es el anticuerpo designado “AM 14”, que tiene una region de cadena pesada y una region de cadena ligera como se representa en la Figura 14A. Las secuencias de CDR de AM14, que en particular contribuyen a las propiedades de union a antlgeno de AM14, tambien se representan en la Figura 14A.
Ahora que la presente invencion proporciona la informacion de que las secuencias de CDR representadas en la Figura 14A proporcionan caracterlsticas de union a VSR deseadas las variantes pueden comprender al menos una
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
secuencia de CDR alterada. Por ejemplo, se aplica sustitucion de aminoacidos conservativa. La sustitucion de aminoacidos conservativa implica sustitucion de un aminoacido con otro con propiedades en general similares (tamano, hidrofobicidad, etc.), de modo que el funcionamiento general probablemente no se ve afectado gravemente. Tambien es posible cambiar al menos una secuencia de CDR representada en la Figura 14A para generar un anticuerpo variante, o un equivalente funcional del mismo, con al menos una propiedad alterada en comparacion con AM14. Un anticuerpo o equivalente funcional puede comprender una secuencia de CDR que es al menos 70 % identica de una secuencia de CDR como se representa en la Figura 14A, de modo que las caracterlsticas de union favorables de AM14 se mantienen al menos en parte o incluso se mejoran. Una secuencia de CDR como se representa en la Figura 14A puede alterarse de modo que el anticuerpo resultante o equivalente funcional comprenda al menos una propiedad mejorada, tal como por ejemplo una afinidad, selectividad y/o estabilidad de union mejoradas, en comparacion con AM14.
Estan disponibles en la tecnica diversos metodos para alterar una secuencia de aminoacidos. Por ejemplo, se sintetiza artificialmente una secuencia de cadena pesada o cadena ligera con una secuencia de CDR deseada. Preferentemente, una secuencia de acido nucleico que codifica una secuencia de CDR se muta, por ejemplo usando mutagenesis aleatoria, o dirigida.
Se desvela en el presente documento un anticuerpo aislado, sintetico o recombinante o una parte, derivado y/o analogo funcional del mismo que es capaz de unirse especlficamente con el virus sincitial respiratorio y que comprende:
- una secuencia de CDR1 de cadena pesada que comprende una secuencia que es al menos 70 % identica d la secuencia GFSFSHYA, y/o
- una secuencia de CDR2 de cadena pesada que comprende una secuencia que es al menos 70 % identica a la secuencia ISYDGENT, y/o
- una secuencia de CDR3 de cadena pesada que comprende una secuencia que es al menos 70 % identica a la secuencia ARDRIVDDYYYYGMDV, y/o
- una secuencia de CDR1 de cadena ligera que comprende una secuencia que es al menos 70 % identica a la secuencia QDIKKY, y/o
- una secuencia de CDR2 de cadena ligera que comprende una secuencia que es al menos 70 % identica a la secuencia de DAS, y/o
- una secuencia de CDR3 de cadena ligera que comprende una secuencia que es al menos 70 % identica a la secuencia de NLPPLT QQYD.
Un anticuerpo o un equivalente funcional puede comprender una secuencia de CDR que es al menos 75 %, mas preferentemente al menos 80 %, mas preferentemente al menos 85 %, mas preferentemente al menos 90 % identica a al menos una de las secuencias de CDR representadas en la Figura 14A. Mas preferentemente, un anticuerpo o un equivalente funcional puede comprender una secuencia de CDR que es al menos 95 % identica a al menos una de las secuencias de CDR representadas en la Figura 14A. El anticuerpo particularmente preferido AM14, descrito anteriormente, comprende secuencias de CDR que consisten en las secuencias de CDR representadas en la Figura 14A. Una realizacion particularmente preferida de acuerdo con la invencion proporciona por lo tanto un anticuerpo aislado, sintetico o recombinante que es capaz de unirse especlficamente con el virus sincitial respiratorio y que comprende:
- una secuencia de CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de GFSFSHYA,
- una secuencia de CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de ISYDGENT,
- una secuencia de CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de ARDRIVDDYYYYGMDV,
- una secuencia de CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de QDIKKY,
- una secuencia de CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de DAS y
- una secuencia de CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de QQYD NLPPLT.
Se desvela en el presente documento un anticuerpo o equivalente funcional que comprende las tres secuencias de CDR de cadena pesada y las tres secuencias de CDR de cadena ligera como se representa en la Figura 14A, o secuencias que son al menos 70 % identicas a las mismas. Se desvela ademas por lo tanto un anticuerpo aislado, sintetico o recombinante o un equivalente funcional del mismo que comprende una secuencia de CDR1 de cadena pesada que comprende una secuencia que es al menos 70 % identica a la secuencia GFSFSHYA y una secuencia de CDR2 de cadena pesada que comprende una secuencia que es al menos 70 % identica a la secuencia ISYDGENT y una secuencia de CDR3 de cadena pesada que comprende una secuencia que es al menos 70 % identica a la secuencia ARDRIVDDYYYYGMDV y una secuencia de CDR1 de cadena ligera que comprende una secuencia que es al menos 70 % identica a la secuencia QDIKKY y una secuencia de CDR2 de cadena ligera que comprende una secuencia que es al menos 70 % identica a la secuencia de DAS, y una secuencia de CDR3 de cadena ligera que comprende una secuencia que es al menos 70 % identica a la secuencia QQYDNLPPLT. Dicho anticuerpo o equivalente funcional comprende preferentemente secuencias de CDR que son al menos 75 %, mas preferentemente al menos 80 %, mas preferentemente al menos 85 %, mas preferentemente al menos 90 %, mas preferentemente al menos 95 % identicas a las secuencias de CDR de cadena pesada y las secuencias de CDR de cadena ligera como se representan en la Figura 14A. Tambien se desvela un anticuerpo o equivalente funcional que
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada mencionadas anteriormente de la Figura 14A asi como las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera mencionadas anteriormente de la Figura 14A.
Tambien se desvelan anticuerpos o equivalentes funcionales de los mismos que comprenden una secuencia de aminoacidos de cadena pesada que es al menos 70 % identica a una secuencia de cadena pesada como se representa en la Figura 14A. Dichas secuencias de cadena pesada proporcionan propiedades de union a VSR deseadas, como se demuestra por el anticuerpo AM14. Tambien se desvela ademas un anticuerpo o un equivalente funcional del mismo, que tiene una secuencia de cadena pesada que comprende una secuencia que es al menos 70 % identica a la secuencia EVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFSFSHYAMHWVRQAPGKGLEWVAVIS YDGENTYYADSVKGRFSISRDNSKNTVSLQMNSLRPEDTALYYCARDRIVDD YYYYGMDVWGQGATVTVSS.
Ademas, las secuencias de aminoacidos de cadena ligera que son al menos 70 % identicas a una secuencia de cadena ligera como se representa en la Figura 14A tambien proporcionan propiedades de union a VSR deseadas, como se demuestra por el anticuerpo AM14. Por lo tanto tambien se desvela un anticuerpo, o un equivalente funcional del mismo que tiene una secuencia de cadena ligera que es al menos 70 % identica a la secuencia DIQMTQS PS SLSASVGDRVT I TCQASQDIKKYLNWYHQKPGKVPELLMHDASNLETGVPSRF SGRGSGTDFTLTI SSLQPEDI GTYYCQQYDNLPPLTFGGGTKVEIKRTV. Un anticuerpo o parte funcional puede comprender preferentemente una secuencia de cadena pesada variable y/o una secuencia de cadena ligera variable que es al menos 75 %, mas preferentemente al menos 80 %, mas preferentemente al menos 85 %, mas preferentemente al menos 90 %, mas preferentemente al menos 95 % identica a una secuencia de cadena pesada y/o una secuencia de cadena ligera como se representa en la Figura 14A. Cuanto mayor sea la homologia, mas estrechamente se asemejara dicho anticuerpo o parte funcional al anticuerpo AM14. Un anticuerpo o parte funcional acorde puede comprender una cadena pesada asi como cadena ligera que se asemeja a la cadena pesada y ligera de AM14. Se desvela ademas por lo tanto un anticuerpo o parte funcional que comprende una secuencia de cadena pesada y una secuencia de cadena ligera que son al menos 70 %, mas preferentemente al menos 80 %, mas preferentemente al menos 85 %, mas preferentemente al menos 90 %, mas preferentemente al menos 95 % identica a la secuencia de cadena pesada y la secuencia de cadena ligera como se representa en la Figura 14A.
Una realizacion proporciona un anticuerpo que comprende una secuencia de cadena pesada que consiste en la secuencia de cadena pesada como se representa en la Figura 14A, y una secuencia de cadena ligera que consiste en la secuencia de cadena ligera como se representa en la Figura 14a. Como alternativa, como se conoce bien por los expertos en la materia, es posible generar una secuencia de cadena pesada o cadena ligera acortada manteniendo al mismo tiempo una propiedad de union de interes. Preferentemente, se genera dicha cadena pesada o cadena ligera acortada que tiene una region constante mas corta, en comparacion con la cadena pesada o ligera original. El dominio variable preferentemente se mantiene. Por ejemplo, se produce un fragmento Fab o fragmento F(ab')2 basado en una secuencia de cadena pesada o secuencia de cadena ligera representada en la Figura 14A. Por lo tanto tambien se desvela un equivalente funcional de un anticuerpo que comprende al menos una parte funcional de una secuencia como se representa en la Figura 14A. Una parte funcional puede tener una longitud de al menos 20 aminoacidos y puede comprender una secuencia que es al menos 70 % identica a al menos una de las secuencias de CDR representadas en la Figura 14A.
Otro anticuerpo anti VSR particularmente preferido de acuerdo con la presente invencion es el anticuerpo designado “AM16”, que tiene una region de cadena pesada y una region de cadena ligera como se representa en la Figura 14B. Las secuencias de CDR de AM16, que en particular contribuyen a las propiedades de union a antigeno de AM16, tambien se representan en la Figura 14B.
Ahora que la presente invencion proporciona la informacion de que las secuencias de CDR representadas en la Figura 14B proporcionan caracteristicas de union a VSR deseadas, las variantes pueden comprender al menos una secuencia de CDR alterada. Por ejemplo, se aplica sustitucion de aminoacidos conservativa. La sustitucion de aminoacidos conservativa implica sustitucion de un aminoacido con otro con propiedades en general similares (tamano, hidrofobicidad, etc.), de modo que el funcionamiento general probablemente no se ve afectado gravemente.
Tambien es posible cambiar al menos una secuencia de CDR representada en la Figura 14B para generar un anticuerpo variante, o un equivalente funcional del mismo, con al menos una propiedad alterada en comparacion con AM16. Un anticuerpo o equivalente funcional puede comprender una secuencia de CDR que es al menos 70 % identica a una secuencia de CDR como se representa en la Figura 14B, de modo que las caracteristicas de union favorables de AM16 se mantienen al menos en parte o incluso se mejoran. Una secuencia de CDR como se representa en la Figura 14B puede alterarse de modo que el anticuerpo resultante o equivalente funcional comprende al menos una propiedad mejorada, tal como por ejemplo una afinidad, selectividad y/o estabilidad de union mejorada, en comparacion con AM16. Estan disponibles en la tecnica diversos metodos para alterar una secuencia de aminoacidos. Por ejemplo, se sintetiza artificialmente una secuencia de cadena pesada o cadena ligera con una secuencia de CDR deseada. Preferentemente, una secuencia de acido nucleico que codifica una secuencia de CDR se muta, por ejemplo usando mutagenesis aleatoria o dirigida.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Se desvela en el presente documento un anticuerpo aislado, sintetico o recombinante o una parte, derivado y/o analogo funcional del mismo que es capaz de unirse especificamente con el virus sincitial respiratorio y que comprende:
- una secuencia de CDR1 de cadena pesada que comprende una secuencia que es al menos 70 % identica a la secuencia GFTFSSYN, y/o
- una secuencia de CDR2 de cadena pesada que comprende una secuencia que es al menos 70 % identica a la secuencia ISAGSSYI, y/o
- una secuencia de CDR3 de cadena pesada que comprende una secuencia que es al menos 70 % identica a la secuencia AREDYGPGNYYSPNWFDP, y/o
- una secuencia de CDR1 de cadena ligera que comprende una secuencia que es al menos 70 % identica a la secuencia SSNIGAGYD, y/o
- una secuencia de CDR2 de cadena ligera que comprende una secuencia que es al menos 70 % identica a la secuencia GNT, y/o
- una secuencia de CDR3 de cadena ligera que comprende una secuencia que es al menos 70 % identica a la secuencia HSYDRSLSG.
Un anticuerpo o un equivalente funcional puede comprender una secuencia de CDR que es al menos 75 %, mas preferentemente al menos 80 %, mas preferentemente al menos 85 %, mas preferentemente al menos 90 % identica a al menos una de las secuencias de CDR representadas en la Figura 14B. Mas preferentemente, un anticuerpo o un equivalente funcional puede comprender una secuencia de CDR que es al menos 95 % identica a al menos una de las secuencias de CDR representadas en la Figura 14B. El anticuerpo particularmente preferido AM16, descrito anteriormente, comprende secuencias de CDR que consisten en las secuencias de CDR representadas en la Figura 14B. Una realizacion particularmente preferida de acuerdo con la invencion proporciona por lo tanto un anticuerpo aislado, sintetico o recombinante que es capaz de unirse especificamente con el virus sincitial respiratorio y que comprende:
- una secuencia de CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia GFTFSSYN y/o
- una secuencia de CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de ISAGSSYI,
- una secuencia de CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de AREDYGPGNYYSPNWFDP,
- una secuencia de CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de SSNIGAGYD,
- una secuencia de CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia GNT y
- una secuencia de CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de HSYDRSLSG.
Se desvela en el presente documento un anticuerpo o equivalente funcional que comprende las tres secuencias de CDR de cadena pesada y las tres secuencias de CDR de cadena ligera como se representa en la Figura 14B, o secuencias que son al menos 70 % identicas a las mismas. Se desvela ademas por lo tanto un anticuerpo aislado, sintetico o recombinante o un equivalente funcional del mismo que comprende una secuencia de CDR1 de cadena pesada que comprende una secuencia que es al menos 70 % identica a la secuencia GFTFSSYN y una secuencia de CDR2 de cadena pesada que comprende una secuencia que es al menos 70 % identica a la secuencia ISAGSSYI y una secuencia de CDR3 de cadena pesada que comprende una secuencia que es al menos 70 % identica a la secuencia AREDYGPGNYYSPNWFDP y una secuencia de CDR1 de cadena ligera que comprende una secuencia que es al menos 70 % identica a la SSNIGAGYD y una secuencia de CDR2 de cadena ligera que comprende una secuencia que es al menos 70 % identica a la secuencia GNT, y una secuencia de CDR3 de cadena ligera que comprende una secuencia que es al menos 70 % identica a la HSYDRSLSG. Dicho anticuerpo o equivalente funcional comprende preferentemente secuencias de CDR que son al menos 75 %, mas preferentemente al menos 80 %, mas preferentemente al menos 85 %, mas preferentemente al menos 90 %, mas preferentemente al menos 95 % identicas a las secuencias de CDR de cadena pesada mencionadas anteriormente y las secuencias de CDR de cadena ligera mencionadas anteriormente como se representa en la Figura 14B. Tambien se desvela un anticuerpo o equivalente funcional que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada mencionada anteriormente de la Figura 14B asi como las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera mencionadas anteriormente de la Figura 14B.
Tambien se desvelan anticuerpos o equivalentes funcionales de los mismos que comprenden una secuencia de aminoacidos de cadena pesada que es al menos 70 % identica a una secuencia de cadena pesada como se representa en la Figura 14B. Dichas secuencias de cadena pesada proporcionan propiedades de union a VSR deseadas, como se demuestra por el anticuerpo AM16. Se desvela ademas un anticuerpo o equivalente funcional del mismo, que tiene una secuencia de cadena pesada que comprende una secuencia que es al menos 70 % identica a la secuencia
EVQLVETGGGLAQPGGSLRLSCAASGFTFSSYNMNWVRQAPGKGLEWVSHISAGSSYIYYSD SVKGRFTVSRDNVRNSVYLQMNSLRAADTAVYYCAREDYGPGNYYSPNWFDPWGQGTLVTVS S. Ademas, las secuencias de aminoacidos de cadena ligera que son al menos 70 % identicas a una secuencia de cadena ligera como se representa en la Figura 14B tambien proporcionan propiedades de union a VSR deseadas, como se demuestra por el anticuerpo AM16. Tambien se desvela por lo tanto un anticuerpo, o un equivalente funcional del mismo que tiene una secuencia de cadena ligera que es al menos 70 % identica a la secuencia QSWTQPPSVSGAPGQRVT I SCTGS SSNI GAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNTNRPSGVS D
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
RFSGSKSGTSASLAI TGLQAEDEADYYCHSYDRSLSGS-VFGGGTKLTV. Un anticuerpo o parte funcional puede comprender una secuencia de cadena pesada variable y/o una secuencia de cadena ligera variable que es al menos 75 %, mas preferentemente al menos 80 %, mas preferentemente al menos 85 %, mas preferentemente al menos 90 %, mas preferentemente al menos 95 % identica a la secuencia de cadena pesada y/o la secuencia de cadena ligera como se representa en la Figura 14B. Cuanto mayor sea la homologla, mas estrechamente se asemejara dicho anticuerpo o parte funcional al anticuerpo AM16. Un anticuerpo o parte funcional puede comprender una cadena pesada as! como una cadena ligera que se asemeja a la cadena pesada y ligera de AM16. Se desvela ademas por lo tanto un anticuerpo o parte funcional que comprende una secuencia de cadena pesada y una secuencia de cadena ligera que son al menos 70 %, mas preferentemente al menos 80 %, mas preferentemente al menos 85 %, mas preferentemente al menos 90 %, mas preferentemente al menos 95 % identica a la secuencia de cadena pesada y la secuencia de cadena ligera como se representa en la Figura 14B.
Una realizacion proporciona un anticuerpo que comprende una secuencia de cadena pesada que consiste en la secuencia de cadena pesada como se representa en la Figura 14B, y una secuencia de cadena ligera que consiste en la secuencia de cadena ligera como se representa en la Figura 14b. Como alternativa, como se conoce bien por los expertos en la materia, es posible generar una secuencia de cadena pesada o cadena larga acortada manteniendo al mismo tiempo una propiedad de union de interes. Preferentemente, se genera dicha cadena pesada o cadena ligera acortada que tiene una region constante mas corta, en comparacion con la cadena pesada o ligera original. El dominio variable preferentemente se mantiene. Por ejemplo, se produce un fragmento Fab o fragmento F(ab')2 basado en una secuencia de cadena pesada o secuencia de cadena ligera representada en la Figura 14B. Se desvela tambien por lo tanto un equivalente funcional de un anticuerpo que comprende al menos una parte funcional de una secuencia como se representa en la Figura 14B. Una parte funcional puede tener una longitud de al menos 20 aminoacidos y puede comprender una secuencia que es al menos 70 % identica a al menos una de las secuencias de CDR representadas en la Figura 14B.
Otro anticuerpo anti VSR particularmente preferido de acuerdo con la presente invencion es el anticuerpo designado “AM23”, que tiene una region de cadena pesada y una region de cadena ligera como se representa en la Figura 14C. Las secuencias de CDR de AM23, que en particular contribuyen a las propiedades de union a antlgeno de AM23, tambien se representan en la Figura 14C.
Ahora que la presente invencion proporciona la informacion de que las secuencias de CDR representadas en la Figura 14C proporcionan caracterlsticas de union a VSR deseadas, las variantes pueden comprender al menos una secuencia de CDR alterada. Por ejemplo, se aplica sustitucion de aminoacidos conservativa. La sustitucion de aminoacidos conservativa implica sustitucion de un aminoacido con otro con propiedades en general similares (tamano, hidrofobicidad, etc.), de modo que el funcionamiento general probablemente no se vea afectado gravemente.
Tambien es posible cambiar al menos una secuencia de CDR representada en la Figura 14C para generar un anticuerpo variante, o un equivalente funcional del mismo, con al menos una propiedad alterada en comparacion con AM23. Un anticuerpo o equivalente funcional puede comprender una secuencia de CDR que es al menos 70 % identica a una secuencia de CDR como se representa en la Figura 14C, de modo que las caracterlsticas de union favorables de AM23 al menos se mantienen en parte o incluso se mejoran. Una secuencia de CDR como se representa en la Figura 14C puede alterarse de modo que el anticuerpo resultante o equivalente funcional comprenda al menos una propiedad mejorada, tal como por ejemplo una afinidad, selectividad y/o estabilidad de union mejorada, en comparacion con AM23. Estan disponibles en la tecnica diversos metodos para alterar una secuencia de aminoacidos. Por ejemplo, se sintetiza artificialmente una secuencia de cadena pesada o cadena ligera con una secuencia de CDR deseada. Preferentemente, una secuencia de acido nucleico que codifica una secuencia de CDR se muta, por ejemplo usando mutagenesis aleatoria, o dirigida.
Se desvela en el presente documento un anticuerpo aislado, sintetico o recombinante o una parte, derivado y/o analogo funcional del mismo que es capaz de unirse especlficamente con el virus sincitial respiratorio y que comprende:
- una secuencia de CDR1 de cadena pesada que comprende una secuencia que es al menos 70 % identica a la secuencia GFNFHNYG, y/o
- una secuencia de CDR2 de cadena pesada que comprende una secuencia que es al menos 70 % identica a la secuencia VWYDGSKK, y/o
- una secuencia de CDR3 de cadena pesada que comprende una secuencia que es al menos 70 % identica a la secuencia VRD KVGPTPYFD S, y/o
- una secuencia de CDR1 de cadena ligera que comprende una secuencia que es al menos 70 % identica a la secuencia NIGSET Y, y/o
- una secuencia de CDR2 de cadena ligera que comprende una secuencia que es al menos 70 % identica a la secuencia de DDD, y/o
- una secuencia de CDR3 de cadena ligera que comprende una secuencia que es al menos 70 % identica a la secuencia de QVWDRSNYH QV.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Un anticuerpo o un equivalente funcional puede comprender una secuencia de CDR que es al menos 75 %, mas preferentemente al menos 80 %, mas preferentemente al menos 85 %, mas preferentemente al menos 90 % identica a al menos una de las secuencias de CDR representadas en la Figura 14C. Mas preferentemente, un anticuerpo o un equivalente funcional puede comprender una secuencia de CDR que es al menos 95 % identica a al menos una de las secuencias de CDR representadas en la Figura 14C. El anticuerpo particularmente preferido AM23, descrito anteriormente, comprende secuencias de CDR que consisten en las secuencias de CDR representadas en la Figura 14C. Una realizacion particularmente preferida de acuerdo con la invencion proporciona por lo tanto un anticuerpo aislado, sintetico o recombinante que es capaz de unirse especlficamente con el virus sincitial respiratorio y que comprende:
- una secuencia de CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de GFNFHNYG,
- una secuencia de CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de VWYDGSKK,
- una secuencia de CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de VRDKVGPTPYFDS,
- una secuencia de CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de NIGSET,
- una secuencia de CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de DDD y
- una secuencia de CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de QVWDRSNYH QV.
Se desvela en el presente documento un anticuerpo o equivalente funcional que comprende las tres secuencias de CDR de cadena pesada y las tres secuencias de CDR de cadena ligera como se representa en la Figura 14C Se desvela ademas un anticuerpo aislado, sintetico o recombinante o un equivalente funcional del mismo que comprende una secuencia de CDR1 de cadena pesada que comprende una secuencia que es al menos 70 % identica a la secuencia GFNFHNYG y una secuencia de CDR2 de cadena pesada que comprende una secuencia que es al menos 70 % identica a la secuencia VWYDGSKK y una secuencia de CDR3 de cadena pesada que comprende una secuencia que es al menos 70 % identica a la secuencia VRDKVGPTPYFDS y una secuencia de CDR1 de cadena ligera que comprende una secuencia que es al menos 70 % identica a la secuencia NIGSET y una secuencia de CDR2 de cadena ligera que comprende una secuencia que es al menos 70 % identica a la secuencia de DDD y una secuencia de CDR3 de cadena ligera que comprende una secuencia que es al menos 70 % identica a la secuencia QVWDRSNYH QV. Dicho anticuerpo o equivalente funcional preferentemente comprende secuencias de CDR que son al menos 75 %, mas preferentemente al menos 80 %, mas preferentemente al menos 85 %, mas preferentemente al menos 90 %, mas preferentemente al menos 95 % identicas a las secuencias de CDR de cadena pesada mencionadas anteriormente y las secuencias de CDR de cadena ligera mencionadas anteriormente como se representa en la Figura 14C. Tambien se desvela un anticuerpo o equivalente funcional que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada mencionadas anteriormente de la Figura 14C as! como las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera mencionadas anteriormente de la Figura 14C.
Tambien se desvelan anticuerpos o equivalentes funcionales de los mismos que comprenden una secuencia de aminoacidos de cadena pesada que es al menos 70 % identica a una secuencia de cadena pesada como se representa en la Figura 14C. Dichas secuencias de cadena pesada proporcionan propiedades de union a VSR deseadas, como se demuestra por el anticuerpo AM23. Se desvela ademas un anticuerpo o un equivalente funcional del mismo, que tiene una secuencia de cadena pesada que comprende una secuencia que es al menos 70 % identica a la secuencia
EVQLVESGGNVVKPGTSLRLSCAATGFNFHNYGMNWVRQAPGKGLEWVAWWYDGSKKYYAD SVTGRFAI
SRDNSKNTLYLQMNSLRVEDTAVYYCVRDKVGPTPYFDSWGQGTLVTVS S. Ademas, las secuencias de aminoacidos de cadena ligera que son al menos 70 % identicas a una secuencia de cadena ligera como se representa en la Figura 14C tambien proporcionan propiedades de union a VSR deseadas, como se demuestra por el anticuerpo AM23. Se desvela por lo tanto un anticuerpo, o un equivalente funcional del mismo que tiene una secuencia de cadena ligera que es al menos 70 % identica a la secuencia SYVLTQPPSVSLAPGGTAAI TCGRNNIGSETVHWYQQK-PGQAPVLWYDDDDRPSGI PERFS GSNSGNTATLT I
SRVEAGDEADYYCQVWDRSNYHQVFGGGTKLTV. Un anticuerpo o parte funcional puede comprender una secuencia de cadena pesada variable o una secuencia de cadena ligera variable que es al menos 75 %, mas preferentemente al menos 80 %, mas preferentemente al menos 85 %, mas preferentemente al menos 90 %, mas preferentemente al menos 95 % identica a la secuencia de cadena pesada y/o la secuencia de cadena ligera como se representa en la Figura 14C. Cuanto mayor sea la homologla, mas estrechamente se asemejara dicho anticuerpo o parte funcional al anticuerpo AM23. Un anticuerpo o parte funcional puede comprender una cadena pesada as! como una cadena ligera que se asemeja a la cadena pesada y ligera de AM23. Se desvela ademas por lo tanto un anticuerpo o parte funcional que comprende una secuencia de cadena pesada y una secuencia de cadena ligera que son al menos 70 %, mas preferentemente al menos 80 %, mas preferentemente al menos 85 %, mas preferentemente al menos 90 %, mas preferentemente al menos 95 % identica a la secuencia de cadena pesada y la secuencia de cadena ligera como se representa en la Figura 14C.
Una realizacion proporciona un anticuerpo que comprende una secuencia de cadena pesada que consiste en la secuencia de cadena pesada como se representa en la Figura 14C, y una secuencia de cadena ligera que consiste en la secuencia de cadena ligera como se representa en la Figura 14C. Como alternativa, como se conoce bien por los expertos en la materia, es posible generar una secuencia de cadena pesada o cadena ligera acortada manteniendo al mismo tiempo una propiedad de union de interes. Preferentemente, se genera dicha cadena pesada o cadena ligera acortada que tiene una region constante mas corta, en comparacion con la cadena pesada o ligera
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
original. El dominio variable preferentemente se mantiene. Por ejemplo, se produce un fragmento Fab o fragmento F(ab')2 basado en una secuencia de cadena pesada o secuencia de cadena ligera representada en la Figura 14C. Tambien se desvela por lo tanto un equivalente funcional de un anticuerpo que comprende al menos una parte funcional de una secuencia como se representa en la Figura 14C. Una parte funcional puede tener una longitud de al menos 20 aminoacidos y puede comprender una secuencia que es al menos 70 % identica a al menos una de las secuencias de CDR representadas en la Figura 14C.
La presente invencion proporciona anticuerpos especlficos de VSR como se define en las reivindicaciones que tienen propiedades mejoradas en comparacion con anticuerpos de la tecnica anterior. Los inventores han conseguido generar anticuerpos especlficos de VSR con valores de CI50 bajos. Dichos anticuerpos tienen una afinidad particularmente alta o fuerte por VSR y son por lo tanto particularmente adecuados para contrarrestar y/o al menos en parte prevenir una infeccion por vSr y/o efectos adversos de una infeccion por VSR. Una divulgacion proporciona un anticuerpo que tiene un valor de CI50 de menos de 10 ng/ml en un ensayo de neutralization in vitro en el que se infectan celulas HEp-2 con VSR, y un equivalente funcional de dicho anticuerpo. Dicho anticuerpo o equivalente funcional preferentemente tiene un valor de CI50 de menos de 5 ng/ml, mas preferentemente menos de 2 ng/ml. El anticuerpo preferido D25 tiene un valor de CI50 de aproximadamente 0,5-1,5 ng/ml en el ensayo de neutralizacion in vitro descrito en los ejemplos (vease Figura 8).
Un anticuerpo de acuerdo con la invencion es preferentemente un anticuerpo humano. El uso de anticuerpos humanos para terapia humana reduce la probabilidad de efectos secundarios debido a una reaction inmunologica en un individuo humano contra secuencias no humanas. En otra realization preferida un anticuerpo o parte funcional, derivado o analogo de acuerdo con la invencion es un anticuerpo quimerico. De esta manera, pueden incluirse secuencias de interes, tales como por ejemplo un sitio de union de interes, en un anticuerpo o equivalente funcional de acuerdo con la invencion.
La invencion proporciona ademas una secuencia de acido nucleico aislada, sintetica o recombinante, que codifica un anticuerpo de acuerdo con la invencion. Dicho acido nucleico se alsla por ejemplo de un linfocito B que es capaz de producir un anticuerpo de acuerdo con la invencion, como se perfila en mas detalle posteriormente. Una secuencia de acido nucleico desvelada en el presente documento puede comprender una secuencia que es al menos 70 % homologa de al menos una parte funcional de una secuencia de acido nucleico como se representa en la Figura 11, Figura 12, Figura 14A, Figura 14B y/o Figura 14B. Dicha secuencia de acido nucleico puede comprender una secuencia que es al menos 75 %, mas preferentemente al menos 80 %, mas preferentemente al menos 85 %, mas preferentemente al menos 90 %, mas preferentemente al menos 95 % homologa de al menos una parte funcional de una secuencia de acido nucleico como se representa en la Figura 11, Figura 12, Figura 14A, Figura 14B y/o Figura 14B. Dicha parte funcional tiene una longitud de al menos 30 nucleotidos, preferentemente al menos 50 nucleotidos, mas preferentemente al menos 75 nucleotidos. Dicha parte funcional puede codificar al menos una secuencia de acido nucleico como se representa en la Figura HD, Figura 12, Figura 14A, Figura 14B y/o Figura 14B. Dicha secuencia es preferentemente una secuencia de CDR.
Un anticuerpo de acuerdo con la invencion es particularmente adecuado para uso como una medicina o agente profilactico. Tambien se proporciona por lo tanto con la presente un anticuerpo de acuerdo con la invencion, para su uso como un medicamento y/o agente profilactico. En una realizacion particularmente preferida dicho anticuerpo comprende anticuerpo D25, AM14, AM16 y/o AM23. Dicho medicamento o agente profilactico se usa preferentemente para contrarrestar o al menos prevenir en parte infeccion por VSR o para contrarrestar o al menos prevenir en parte efectos adversos de una infeccion por VSR. Se desvela tambien por lo tanto un uso de un anticuerpo, parte funcional, derivado o analogo de acuerdo con la invencion para la preparation de un medicamento y/o un agente profilactico para al menos en parte tratar y/o prevenir un trastorno relacionado con VSR, as! como un metodo para al menos en parte tratar o prevenir un trastorno relacionado con VSR, comprendiendo el metodo administrar a un individuo que lo necesite una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo o equivalente funcional de acuerdo con la invencion. Dicho anticuerpo comprende preferentemente el anticuerpo D25, AM14, AM16 y/o AM23.
Para contrarrestar VSR, un anticuerpo de acuerdo con la invencion puede administrarse a un individuo antes de que haya tenido lugar una infeccion por VSR. Como alternativa, un anticuerpo de acuerdo con la invencion puede administrarse cuando un individuo ya esta infectado por VSR. Dicho anticuerpo puede administrarse a individuos con un riesgo aumentado de trastornos relacionados con VSR, tales como por ejemplo ninos con nacimiento prematuro, individuos con enfermedad pulmonar cronica, enfermedad cardlaca congenita y/o inmunidad comprometida, y ninos con una edad menor de 6 semanas. Ademas los ancianos tienen un riesgo aumentado de trastornos relacionados con VSR. Los anticuerpos de acuerdo con la invencion pueden administrarse por via oral o por una o mas inyecciones. Los intervalos de dosis de anticuerpos de acuerdo con la invencion para usar en las aplicaciones terapeuticas como se ha descrito anteriormente en el presente documento se disenan basandose en estudios de dosis creciente en la cllnica en ensayos cllnicos para los que existen requisitos de protocolo rigurosos. Las dosis tlpicas son entre 0,1 y 10 mg por kg de peso corporal. Para aplicacion terapeutica, los anticuerpos de acuerdo con la invencion se combinan tlpicamente con un vehlculo, adyuvante, diluyente y/o excipiente farmaceuticamente aceptable. Los ejemplos de vehlculos adecuados comprenden por ejemplo hemocianina de lapa californiana (KLH), albumina de suero (por ejemplo BSA o RSA) y ovoalbumina. Muchos adyuvantes adecuados, basados en aceite y
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
basados en agua, se conocen por los expertos en la materia. En una realization, dicho adyuvante comprende Specol. En otra realizacion, dicho vehiculo adecuado comprende una solution como por ejemplo solution salina.
En otra realizacion mas se usa un acido nucleico que codifica un anticuerpo de acuerdo con la invention. Tras la administration de dicho acido nucleico, se producen anticuerpos o equivalentes funcionales por la maquinaria del hospedador. Los anticuerpos o equivalentes funcionales producidos son capaces de prevenir y/o contrarrestar la infection por VSR y/o los efectos adversos de una infection por VSR. Tambien se proporciona por lo tanto con la presente una secuencia de acido nucleico, de acuerdo con la invencion para su uso como un medicamento y/o agente profilactico. Dicho acido nucleico se usa preferentemente para contrarrestar el VSR. Se desvela ademas por lo tanto un uso de una secuencia de acido nucleico, parte, derivado y/o analogo funcional de acuerdo con la invencion para la preparation de un medicamento y/o agente profilactico para al menos en parte tratar y/o prevenir un trastorno relacionado con VSR.
Por al menos una parte funcional de un acido nucleico se entiende una parte de dicho acido nucleico, de al menos 30 pares de bases de longitud, preferentemente menos 50 pares de bases de longitud, mas preferentemente al menos 100 pares de bases de longitud, que comprende al menos una caracteristica de expresion (en tipo no necesariamente en cantidad) como un acido nucleico de la invencion. Dicha parte funcional codifica al menos una secuencia de aminoacidos que comprende una secuencia que es al menos 70 % identica a una secuencia de CDR como se representa en la Figura HD, Figura 14A, Figura 14B y/o Figura 14C.
La invencion proporciona ademas una celula productora de anticuerpos aislada capaz de producir un anticuerpo, de acuerdo con la invencion. Se perfilan modos posibles (pero no limitantes) de obtener dichas celulas productoras de anticuerpos en detalle en los ejemplos. Los inventores han desarrollado y usado un nuevo metodo para mejorar la estabilidad de celulas productoras de anticuerpos especificos de VSR. Usando este metodo, se generan celulas productoras de anticuerpos especificos de VSR que son estables durante al menos seis meses. Tambien se desvela por lo tanto con la presente una celula productora de anticuerpos especificos de VSR de acuerdo con la invencion, que es estable durante al menos nueve semanas, preferentemente durante al menos tres meses, mas preferentemente durante al menos seis meses.
Los presentes inventores han usado su information de que la estabilidad de una celula productora de anticuerpos especificos de VSR esta influida por la cantidad de producto de expresion de BCL6 y/o Blimp-1 dentro de dicha celula productora de anticuerpos. La cantidad de producto de expresion de BCL6 y/o Blimp-1 esta influida directa o indirectamente. Preferentemente las cantidades de productos de expresion tanto de BCL6 como de Blimp-1 dentro de dicha celula productora de anticuerpos estan reguladas, ya que ambos productos de expresion estan implicados en la estabilidad de una celula productora de anticuerpos. La estabilidad de una celula productora de anticuerpos se define como la capacidad de dicha celula productora de anticuerpos para permanecer en un cierto estadio del desarrollo (preferentemente despues de que dicha celula se ha llevado a dicho estadio). Los diferentes estadios del desarrollo de una celula implican al menos una caracteristica diferente de dicha celula. Por ejemplo, se sabe que un linfocito B de memoria se diferencia tras la estimulacion en una celula plasmatica secretora de anticuerpo mediante un estadio que algunos investigadores denominan un plasmablasto. Un linfocito B de memoria, un plasmablasto y una celula plasmatica son diferentes estados del desarrollo de un linfocito B, en los que el linfocito B tiene caracteristicas diferentes. Un linfocito B de memoria muestra baja proliferation y secretion de anticuerpos. Un plasmablasto muestra tanto mayores niveles de proliferacion como mayores niveles de secrecion de anticuerpos en comparacion con un linfocito B de memoria, mientras que una celula plasmatica secreta altos niveles de anticuerpo pero no es capaz de proliferar. Con los metodos desvelados en el presente documento ha sido posible regular la vida util replicativa de una celula productora de anticuerpos. Una vida util replicativa de una celula productora de anticuerpos se define en el presente documento como el periodo de tiempo en el que un linfocito B y sus celulas descendientes son capaces de replicar manteniendo al mismo tiempo su capacidad para producir anticuerpos y/o desarrollarse a una celula que produce anticuerpo. Preferentemente la vida util replicativa de una celula productora de anticuerpos se prolonga, lo que significa que dicha celula productora de anticuerpos no se diferenciara de forma terminal, o solamente despues de un periodo mayor en comparacion con el mismo tipo de celulas productoras de anticuerpos que se usan en la actualidad, y continuan proliferando in vitro. De acuerdo con los inventores es posible regular la cantidad de producto de expresion de BCL6 y/o Blimp-1 en una celula productora de anticuerpos en tal grado que la celula productora de anticuerpos se lleve a y/o se mantenga en un estadio del desarrollo predeterminado en el que las celulas continuan proliferando. Con el metodo desvelado de los inventores ha sido por lo tanto posible aumentar la vida util replicativa de una celula productora de anticuerpos ya que es posible mantener un linfocito B en un cierto estadio del desarrollo en el que se produce replication. Se hace referencia al documento PCT/NL2006/000625, presentado por el mismo solicitante. Se desvelan en el presente documento medios y metodos para producir celulas productoras de anticuerpos especificas de VSR estables.
Una celula productora de anticuerpos se define como una celula que es capaz de producir y/o secretar anticuerpo o un equivalente funcional del mismo, y/o siendo dicha celula capaz de desarrollarse a una celula que es capaz de producir y/o secretar anticuerpo o un equivalente funcional del mismo. Una celula productora de anticuerpos especificos de VSR se define en el presente documento como una celula capaz de producir y/o secretar anticuerpos o equivalentes funcionales de los mismos que son capaces de unirse especificamente con VSR y/o un componente de VSR, tal como por ejemplo un epitopo de la proteina F (fusion) de VSR, la proteina G (union) de VSR o la
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
protelna SH (hidrofoba pequena) de VSR. Preferentemente, dicha celula productora de anticuerpos especificos de VSR comprende un linfocito B y/o una celula plasmatica derivada de linfocitos B. Un linfocito B se denomina en el presente documento una celula productora de anticuerpos, incluso cuando el linfocito B esta en un estadio en el que la produccion de anticuerpos es baja o no esta presente en absoluto, tal como un linfocito B no tratado previamente o un linfocito B de memoria, que se activa o no, porque dichas celulas son capaces de desarrollarse a celulas que producen anticuerpo, tales como un plasmablasto y/o una celula plasmatica.
Una celula productora de anticuerpos especificos de VSR preferentemente comprende una celula de mamlfero. Los ejemplos no limitantes incluyen celulas productoras de anticuerpos derivadas de un individuo humano, roedor, conejo, llama, cerdo, vaca, cabra, caballo, simio, gorila. Preferentemente, dicha celula productora de anticuerpos comprende una celula humana, una celula murina, una celula de conejo y/o una celula de llama.
BCL6 codifica un represor transcripcional que se requiere para el desarrollo y maduracion de linfocitos B y linfocitos T normales y que se requiera para la formacion de centros germinales. (Ye, 1997). BCL6 esta altamente expresado en linfocitos B de centro germinal mientras que apenas se expresa en celulas plasmaticas. BCL6 inhibe la diferenciacion de linfocitos B activados en celulas plasmaticas. Se requiere el represor transcripcional protelna de maduracion inducida por linfocitos B 1 (Blimp-1) para el desarrollo de un linfocito B en una celula plasmatica. La variante humana de Blimp-1 se denomina Prdml. Como se usa en el presente documento, cualquier referencia a Blimp-1 incluye una referencia a Prdml. Blimp-1 conduce la diferenciacion de celulas plasmaticas. BCL6 y Blimp-1 reprimen la expresion del otro; por lo tanto en una situation natural en la que uno alcanza un nivel de expresion mayor que el otro, se impone el estadio de diferenciacion. En el cuerpo humano, la diferenciacion de celulas plasmaticas de linfocitos B sin tratamiento previo o de memoria activadas implica regulation negativa de BCL6 y regulation positiva de Blimp-1. En celulas de centro germinal la expresion de BCL6 es alta y la expresion de Blimp-1 es baja. En celulas de memoria en reposo la expresion de BCL6 y Blimp-1 son bajas. Las senales que desencadenan diferenciacion provocan una regulacion positiva de Blimp-1, y este Blimp-1 contrarresta la expresion de BCL6. El estadio en el que tanto BCL6 como Blimp-1 se expresan es de vida corta y se denomina un plasmablasto. Con niveles de Blimp-1 progresivamente crecientes, la expresion de BCL6 se extingue, dando como resultado una celula plasmatica.
Puede proporcionarse una celula productora de anticuerpos especificos de VSR en la que BCL6 y Blimp-1 se coexpresan (lo que significa que tanto BCL6 como Blimp-1 se expresan en dicha celula productora de anticuerpos durante al menos 1 dia, preferentemente al menos una semana, mas preferentemente al menos seis semanas, mas preferentemente al menos tres meses. Dicha celula productora de anticuerpos especificos de VSR es capaz de proliferar cuando se proporciona una senal apropiada. Se ha descubierto que la coexpresion de BCL6 y Blimp-1 da como resultado una celula productora de anticuerpos que es capaz de proliferar y producir anticuerpo. BCL6 y Blimp-1 se coexpresan preferentemente en un linfocito B, preferentemente un linfocito B humano. La coexpresion de BCL6 y Blimp-1 en un linfocito B da como resultado estabilizacion de dicho linfocito B en un estadio de tipo plasmablasto. Los plasmablastos, como celulas plasmaticas, son capaces de secretar anticuerpo. Sin embargo, los plasmablastos aun son capaces de proliferar, mientras que las celulas plasmaticas han perdido su capacidad de proliferar. Las celulas plasmaticas son por lo tanto inadecuadas para cultivar lineas celulares productoras de anticuerpo.
Una celula productora de anticuerpos especificos de VSR puede comprender una secuencia de acido nucleico exogena que codifica BCL6 o una parte, derivado y/o analogo funcional del mismo. Un acido nucleico exogeno se define en el presente documento como una secuencia de acido nucleico que no pertenece de forma natural al genoma de una celula. Con dicha molecula de acido nucleico exogena es posible regular una concentration de BCL6 en una celula productora de anticuerpos independientemente de la expresion de BCL6 endogeno. Por lo tanto, incluso si la expresion de BCL6 endogeno es baja o esta ausente, por ejemplo provocado por Blimp-1, una secuencia de acido nucleico exogena que codifica BCL6 o una parte, derivado y/o analogo funcional del mismo aun es capaz de producir una concentracion de BCL6 que es suficiente para influir en la estabilidad de una celula productora de anticuerpos. Preferentemente, dicha secuencia de acido nucleico que codifica BCL6 o una parte, derivado y/o analogo funcional del mismo esta constitutivamente activa, de modo que la expresion de BCL6 se mantiene incluso cuando la expresion de BCL6 endogena de dicha celula se inhibe por un represor endogeno tal como Blimp-1. Mas preferentemente, la expresion de dicha secuencia de acido nucleico que codifica BCL6 o una parte, derivado y/o analogo funcional del mismo esta regulada por un inductor exogeno de represor, de modo que el alcance de la expresion de BCL6 se regula a voluntad.
Preferentemente, como se perfila posteriormente en mas detalle, una celula productora de anticuerpos especificos de VSR puede comprender una secuencia de acido nucleico exogena que codifica Bcl-xL o una parte, derivado y/o analogo funcional del mismo. Si Bcl-xL o una parte, derivado y/o analogo funcional del mismo esta presente, es posible cultivar plasmablastos en condiciones de baja densidad celular. La expresion de dicha secuencia de acido nucleico que codifica Bcl-xL o una parte, derivado y/o analogo funcional del mismo se regula preferentemente por un inductor exogeno de represor, de modo que el alcance de la expresion de Bcl-xL esta regulado a voluntad. Se desvela en el presente documento una celula productora de anticuerpos especificos de VSR que comprende: - una secuencia de acido nucleico exogena que codifica BCL6 o una parte, derivado y/o analogo funcional del mismo y/o - una secuencia de acido nucleico exogena que codifica Bcl-xL o una parte, derivado y/o analogo funcional del mismo.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Dicha celula productora de anticuerpos especificos de VSR preferentemente comprende tanto una secuencia de acido nucleico exogena que codifica BCL6 o una parte, derivado y/o analogo funcional del mismo, como una secuencia de acido nucleico exogena que codifica Bcl-xL, o una parte, derivado y/o analogo funcional del mismo. Preferentemente, la expresion de dicha secuencia de acido nucleico que codifica BCL6, Bcl-xL o una parte, derivado y/o analogo funcional de BCL6 o Bcl-xL esta regulada por un activador y/o represor que es inducible por un compuesto exogeno. Por ejemplo, se usa un sistema de promotor inducible tal como sistema de Tet-on o Tet-off.
Una celula productora de anticuerpos especificos de VSR estable puede generarse coexpresando BCL6 y Blimp-1 en una celula productora de anticuerpos especificos de VSR. Una celula productora de anticuerpos especificos de VSR se obtiene preferentemente de un individuo que se ha expuesto a VSR. Se conocen bien en la tecnica metodos para aislar celulas productoras de anticuerpos. Por ejemplo, se incuban compuestos derivados de VSR que se marcan con un marcador y/o una etiqueta con una muestra de un individuo que ha expuesto a VSR, comprendiendo dicha muestra celulas productoras de anticuerpos. Se aislan celulas productoras de anticuerpos especificos de VSR que reconocen los compuestos derivados de VSR marcados mientras que las celulas no unidas se retiran por lavados. Las celulas productoras de anticuerpos especificas de VSR resultantes se estabilizan posteriormente coexpresando BCL6 asi como Blimp-1.
Las celulas productoras de anticuerpos totales de un donante expuesto a VSR pueden estabilizarse en primer lugar y despues aislarse celulas que reconocen el compuesto derivado de VSR marcado. Como alternativa las celulas productoras de anticuerpos se equipan con un marcador (fluorescente) cadena abajo de su receptor de linfocitos B (BCR, forma expresada en membrana del anticuerpo) que senaliza cuando la celula productora de anticuerpos se une con un antigeno no marcado/no etiquetado mediante el BCR. Se seleccionan celulas productoras de anticuerpos en las que el marcador esta activado y se estabilizan posteriormente coexpresando BCL6 asi como Blimp-1. Cuando no hay compuestos derivados de antigenos disponibles pero cuando hay ensayos disponibles para explorar con respecto a anticuerpos unicos, pueden estabilizarse celulas productoras de anticuerpos totales/en conjunto coexpresando BCL6 asi como Blimp-1 y, opcionalmente, tambien Bcl-XL. En consecuencia, se cultivan celulas a densidades bajas, preferentemente entre 10 y 100 celulas por 96 pocillos, en presencia de celulas L (cultivos de volumen mini, MBC). Pueden usarse sobrenadantes de cultivo directamente en ensayos de exploracion, como ELISA, transferencia de Western o ensayos funcionales como ELISPOT, ensayos de neutralizacion o ensayos de migracion celular. Pueden seleccionarse MBC y, para obtener lineas celulares monoclonales de la celula productora de anticuerpos de interes, se forman previamente cultivos de dilucion limitante y, preferentemente 2-3 semanas despues, se exploran sobrenadantes de esos cultivos de nuevo en el ensayo preferido.
Como se conoce bien por los expertos en la materia, estan disponibles en la tecnica muchos metodos alternativos. Los metodos mencionados anteriormente son no limitantes.
Se desvela ademas por lo tanto un metodo para producir una celula productora de anticuerpos, que es estable durante al menos tres meses y que es capaz de producir anticuerpos especificos de VSR o equivalentes funcionales de los mismos, comprendiendo el metodo:
- aumentar un nivel de expresion de Blimp-1 en una celula que es capaz de producir anticuerpos especificos de VSR o equivalentes funcionales de los mismos; y
- aumentar y/o mantener un nivel de expresion de BCL6 en dicha celula.
Se ha hecho posible convertir un linfocito B especifico de VSR en una celula de tipo plasmablasto y estabilizar dicha celula, de modo que no se produzca diferenciacion rapida en una celula plasmatica. Esto es contrario al desarrollo natural de celulas plasmaticas, en las que la expresion de Blimp-1 en un linfocito B de memoria da como resultado desarrollo rapido en una celula plasmatica, inhibiendo de este modo la expresion de BCL6 de modo que la celula plasmatica resultante apenas exprese BCL6. Una realizacion de la divulgacion implica por lo tanto la coexpresion tanto de BCL6 como de Blimp-1 en un linfocito B especifico de VSR, dando como resultado una celula que es capaz tanto de proliferar como de producir anticuerpos. El nivel de expresion de BCL6 en dicho linfocito B especifico de VSR se lleva preferentemente, y se mantiene a esencialmente el mismo nivel o a un nivel mayor en comparacion con un plasmablasto. De este modo se genera un cultivo estable de linfocitos B especificos de VSR, permaneciendo dichas celulas capaces de producir anticuerpos especificos de VSR. Estos linfocitos B especificos de VSR que coexpresan BCL6 y Blimp-1 se estabilizan adicionalmente, preferentemente mediante la adicion del gen antiapoptotico Bcl-xL. Con la introduction de Bcl-xL es posible ahora cultivar plasmablastos en condiciones de baja densidad celular. Por lo tanto, la invention tambien proporciona un metodo para cultivar plasmablastos en condiciones de baja densidad celular que comprende generar una celula productora de anticuerpos especificos de VSR con niveles de expresion de BCL6, Blimp-1 y Bcl-xL con cualquiera de los metodos descritos en el presente documento.
La cantidad de producto de expresion de BCL6 (preferentemente una proteina BCL6) en una celula productora de anticuerpos especificos de VSR esta regulada de diversas maneras.
Una celula productora de anticuerpos puede desvelarse con un compuesto capaz de influir directa o indirectamente en la expresion de BCL6. Una celula productora de anticuerpos se desvela preferentemente con un compuesto
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
capaz de potenciar la expresion de BCL6, para contrarrestar la regulacion negativa de BCL6 durante la expresion de Blimp-1. Dicho compuesto preferentemente comprende una proteina transductora de senal de activacion y transcripcion 5 (STAT5) o una parte, derivado y/o analogo funcional de la misma, y/o una secuencia de acido nucleico que la codifica. STAT5 es un transductor de senal capaz de potenciar la expresion de BCL6. Hay dos formas conocidas de STAT5, STAT5a y STAT5b, que se codifican por dos genes diferentes, unidos en tandem. La administracion y/o activacion de STAT5 da como resultado niveles de BCL6 potenciados. Por lo tanto, la regulacion negativa de BCL6 por Blimp-1 esta al menos en parte compensada por la expresion de regulacion positiva de BCL6 por STAT5 o una parte, derivado y/o analogo funcional del mismo. Por lo tanto, STAT5 o una parte, derivado y/o analogo funcional del mismo es capaz de influir directamente en la expresion de BCL6. Tambien es posible influir indirectamente en la expresion de BCL6. Esto se realiza por ejemplo regulando la cantidad de un compuesto que a su vez es capaz de activar directa o indirectamente STAT5 y/o regular la expresion de STAT5. Por lo tanto la expresion y/o actividad de STAT5 endogeno y/o exogeno aumenta. Es por lo tanto posible potenciar indirectamente la expresion de BCL6 cultivando una celula productora de anticuerpos en presencia de interleucina (IL) 2 y/o IL 4 que son capaces de activar STAT5.
Una celula productora de anticuerpos especificos de VSR puede comprender una secuencia de acido nucleico que codifica STAT5 o una parte, derivado y/o analogo funcional del mismo, en el que dicha secuencia de acido nucleico esta constitutivamente activa, lo que significa que STAT5 se expresa continuamente, independientemente de la presencia de reguladores (endogenos). En el caso de que la expresion de STAT5 endogeno sea baja, o este ausente, se aplica preferentemente una secuencia de acido nucleico constitutivamente activa exogena que codifica STAT5 o una parte, derivado y/o analogo funcional del mismo dando como resultado una concentracion de STAT5 o una parte, derivado y/o analogo funcional del mismo que es suficiente para potenciar la expresion de BCL6. Mas preferentemente, una celula productora de anticuerpos especificos de VSR puede comprender una secuencia de acido nucleico que codifica un compuesto que comprende STAT5 o una parte, derivado y/o analogo funcional del mismo, preferentemente una proteina de fusion, cuya actividad se regula por un inductor exogeno de represor, de modo que el alcance de la activacion de expresion de BCL6 esta regulado a voluntad. Otro sistema que permite la induccion de BCL-6 se proporciona por un sistema Tet-on en el que la adicion de tetraciclina y/o derivados de tetraciclina inducen la actividad de un transactivador que induce la transcripcion del gen de BCL6 seguido de sintesis de proteina BCL. En una realization preferida de la divulgation, una celula productora de anticuerpos puede comprender una secuencia de acido nucleico que codifica un receptor de estrogenos (ER) y STAT5 como una proteina de fusion ER-STAT5. Esta proteina de fusion esta inactiva porque forma un complejo con proteinas de choque termico en el citosol. De esta manera, STAT5 es incapaz de alcanzar el nucleo y no se potencia la expresion de BCL6. Tras la administracion del inductor exogeno 4 hidroxi-tamoxifeno (4HT), la proteina de fusion ER-STAT5 se disocia de las proteinas de choque termico, de modo que STAT5 es capaz de entrar en el nucleo y activar la expresion de BCL6.
Adicionalmente, o como alternativa, la expresion de BCL6 en una celula productora de anticuerpos especificos de VSR se potencia cultivando dicha celula productora de anticuerpos en presencia de un compuesto capaz de potenciar directa o indirectamente la expresion de BCL6.
Se desvela en el presente documento un metodo para producir una celula productora de anticuerpos especificos de VSR que comprende:
- proporcionar una celula productora de anticuerpos especificos de VSR con un compuesto capaz de potenciar directa o indirectamente la expresion de BCL6; y/o
- cultivar una celula productora de anticuerpos especificos de VSR en presencia de un compuesto capaz de potenciar directa o indirectamente la expresion de BCL6. Dicho compuesto capaz de potenciar directa o indirectamente la expresion de BCL6 comprende preferentemente STAT5 o una parte, derivado y/o analogo funcional del mismo.
Se desvela por lo tanto un metodo que comprende proporcionar dicha celula productora de anticuerpos especificos de VSR con STAT5 o una parte, derivado y/o analogo funcional del mismo, o con una secuencia de acido nucleico que codifica STAT5 o una parte, derivado y/o analogo funcional del mismo. Dicha celula productora de anticuerpos puede cultivarse despues de la introduction de una secuencia de acido nucleico que codifica STAT5 o una parte, derivado y/o analogo funcional del mismo en dicha celula. Dicha secuencia de acido nucleico se introduce por ejemplo en dicha celula por transfection y/o transferencia genica mediada por virus. Estan disponibles en la tecnica muchos metodos alternativos para introducir una secuencia de acido nucleico en una celula que no necesita mas explication en el presente documento.
Con un compuesto capaz de potenciar directa o indirectamente la expresion de BCL6 es posible potenciar la expresion de BCL6 endogeno. Sin embargo una celula productora de anticuerpos puede comprender una secuencia de acido nucleico que codifica BCL6 o una parte, derivado y/o analogo funcional del mismo. Como se explica en el presente documento anteriormente, se prefiere un acido nucleico exogeno que codifica BCL6 porque esto permite la regulacion de una concentracion de BCL6 dentro de una celula independientemente de la expresion de BCL6 endogeno. Por lo tanto, incluso si la expresion de BCL6 endogeno es baja o esta ausente, por ejemplo provocado por Blimp-1, una secuencia de acido nucleico exogena que codifica BCL6 o una parte, derivado y/o analogo
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
funcional del mismo aun es capaz de producir una concentracion de BCL6 que es suficiente para influir en la estabilidad de una celula productora de anticuerpos. Tambien se desvela por lo tanto un metodo que comprende proporcionar una celula productora de anticuerpos especlficos de VSR con una secuencia de acido nucleico que codifica BCL6 o una parte, derivado y/o analogo funcional del mismo. Preferentemente, dicha celula productora de anticuerpos se proporciona con una secuencia de acido nucleico constitutivamente activa que codifica BCL6 o una parte, derivado y/o analogo funcional del mismo, de modo que la expresion de BCL6 se mantiene incluso cuando la expresion de BCL6 endogeno de dicha celula se inhibe por un represor endogeno tal como Blimp-1. Mas preferentemente, la expresion de dicha secuencia de acido nucleico que codifica BCL6 o una parte, derivado y/o analogo funcional del mismo esta regulada por un inductor exogeno de represor, de modo que el alcance de la expresion de BCL6 esta regulado a voluntad. Por ejemplo, se usa un sistema de promotor inducible tal como un sistema Tet-on o Tet-off, como ya se ha descrito.
Tambien se desvela un metodo en el que la cantidad de BCL6 esta indirectamente regulada por la provision de una celula productora de anticuerpos especlficos de VSR con una secuencia de acido nucleico que codifica E47 o una parte, derivado y/o analogo funcional del mismo. E47 codifica un factor de transcripcion que pertenece a una familia de protelnas de helice-bucle-helice, concretamente protelnas E. Hay cuatro protelnas E, E12, E47, E2-2 y HEB, que estan implicadas en el desarrollo de linfocitos. E12 y E47 estan codificadas por un gen, denominado E2A, que se corta y empalma de forma diferente. Las protelnas E puede inhibirse por el inhibidor de protelna E ld2 y Id3, y por ABF-I (Mathas S., 2006). Se han descrito protelnas E como supresores tumorales y se ha mostrado que la sobreexpresion induce apoptosis. Una de las dianas especlficas de E47 son los genes de Socsl y Socs3. Estos genes de Socs se conocen como reguladores negativos de STAT [deltajb y por lo tanto indirectamente de BCL6. En otras palabras, la expresion de E47 dentro de un linfocito B potencia la expresion de Blimp-1 que da como resultado diferenciacion de linfocitos B a un fenotipo productor de anticuerpos (celula plasmatica).
La cantidad de expresion de Blimp-1 en una celula productora de anticuerpos especlficos de VSR tambien esta regulada de diversas formas. Una celula productora de anticuerpos especlficos de VSR se proporciona con un compuesto capaz de influir directa o indirectamente en la expresion de Blimp-1. Adicionalmente, o como alternativa, una celula productora de anticuerpos se cultiva en presencia de un compuesto capaz de influir directa o indirectamente en la expresion de Blimp-1. Se desvela ademas por lo tanto un metodo que comprende proporcionar una celula productora de anticuerpos especlficos de VSR con un compuesto capaz de influir directa o indirectamente en la expresion de Blimp-1. Se desvela ademas un metodo que comprende cultivar dicha celula productora de anticuerpos en presencia de un compuesto capaz de influir directa o indirectamente en la expresion de Blimp-1. Puede usarse un compuesto que es capaz de potenciar la expresion de Blimp-1 para contrarrestar la regulacion negativa de Blimp-1 durante la expresion de BCL6. Dicho compuesto comprende mas preferentemente IL-21.
Dicho compuesto capaz de influir directa o indirectamente en la expresion de Blimp-1 puede comprender una protelna transductora de senal de activacion y transcripcion 3 (STAT3) o una parte, derivado y/o analogo funcional de la misma, y/o una secuencia de acido nucleico que la codifica. STAT3 es un transductor de senal que esta implicado en el desarrollo y diferenciacion de linfocitos B. STAT3 es capaz de regular positivamente la expresion de Blimp-1. Se desvela ademas por lo tanto un metodo en el que dicho compuesto capaz de influir directa o indirectamente en la expresion de Blimp-1 comprende STAT3 o una parte, derivado y/o analogo funcional del mismo, o una secuencia de acido nucleico que codifica STAT3 o una parte, derivado y/o analogo funcional del mismo. Mas preferentemente, la expresion de dicha secuencia de acido nucleico que codifica STAT3 o una parte, derivado y/o analogo funcional del mismo esta regulada positivamente por un inductor exogeno de represor, de modo que el alcance de la expresion de STAT3 esta regulada a voluntad. Por ejemplo, se usa un sistema de promotor inducible tal como por ejemplo un sistema Tet-on o Tet-off. Puede introducirse un producto de fusion que comprende STAT3, un derivado o analogo, y ER en dicha celula permitiendo la regulacion de la expresion de STAT3 por hidroxitamoxifeno.
Ya que STAT3 es capaz de influir en la expresion de Blimp-1, tambien es posible regular indirectamente la expresion de Blimp-1 administrando un compuesto capaz de regular directa o indirectamente la actividad y/o expresion de STAT3. Puede proporcionarse una celula productora de anticuerpos con un compuesto que es capaz de potenciar la actividad de STAT3, de modo que la expresion de Blimp-1 tambien esta potenciada indirectamente. Se proporciona ademas por lo tanto un metodo en el que se proporciona una celula productora de anticuerpos con un compuesto capaz de potenciar directa o indirectamente la actividad de STAT3.
Se puede proporcionar una celula productora de anticuerpos con un compuesto capaz de activar directa o indirectamente STAT3, para potenciar la expresion de Blimp-1.
Se activa STAT3 de diversas maneras. Preferentemente, se activa STAT3 proporcionando una celula productora de anticuerpos con una citocina. Las citocinas, que estan implicadas de forma natural en la diferenciacion de linfocitos B, son muy eficaces en la regulacion de protelnas STAT. Son activadores muy eficaces de STAT3 IL-21 e IL-6, pero tambien se sable que IL-2, IL-7, IL-10, IL-15 e IL-27 activan STAT3. Ademas, los receptores de tipo Toll (TLR) que estan implicados en la inmunidad innata tambien son capaces de activar STAT3. Una realizacion de la presente divulgacion proporciona por lo tanto un metodo en el que dicho compuesto capaz de influir directa o indirectamente en la expresion de Blimp-1 comprende IL-21, IL-2, IL-6, IL-7, IL-10, iL-15 y/o IL -27. Mas preferentemente se usa IL-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
21, ya que IL-21 es particularmente adecuado para influir en la estabilidad de una celula productora de anticuerpos. IL-21 es capaz de regular positivamente la expresion de Blimp-1 incluso cuando la expresion de Blimp-1 esta contrarrestada por BCL6.
Adicionalmente o como alternativa se usa una quinasa Janus (JAK) mutada para activar STAT3. De forma natural, una JAK es capaz de fosforilar STAT3 despues de haberse activado en si misma por al menos una citocina. Una quinasa Janus capaz de activar STAT3, independiente de la presencia de citocinas, es particularmente adecuada en un metodo desvelado en el presente documento.
Como ya se ha explicado antes, un compuesto capaz de potenciar la expresion de Blimp-1 puede comprender una secuencia de acido nucleico que codifica STAT3 o una parte, derivado y/o analogo funcional del mismo. La presencia funcional de una secuencia de acido nucleico exogena que codifica STAT3 o una parte, derivado y/o analogo funcional del mismo permite una presencia continua de STAT3 o una parte, derivado y/o analogo funcional del mismo incluso cuando la expresion de STAT3 endogeno es muy baja o esta ausente.
Tambien es posible reducir la expresion y/o actividad de STAT5 para regular positivamente Blimp-1. Si la cantidad y/o actividad de STAT5 se reduce, la activacion de la expresion de BCL6 tambien se reduce, lo que da como resultado una cantidad reducida de producto de expresion de BCL6. Ya que BCL6 y Blimp-1 contrarrestan cada uno la expresion del otro, una cantidad reducida de producto de expresion de BCL6 da como resultado una cantidad aumentada de producto de expresion de Blimp-1. Los compuestos capaces de regular negativamente la actividad de STAT5 son por lo tanto capaces de regular positivamente de forma indirecta Blimp-1. Dichos compuestos comprenden por ejemplo miembros de las protelna supresoras de la senalizacion de citocinas (SOCS). La cantidad de producto de expresion de Blimp-1 en una celula productora de anticuerpos especlficos de VSR puede por lo tanto regularse positivamente proporcionando dicha celula con una protelna SOCS, y/o activando una protelna SOCS dentro de dicha celula.
La expresion y/o actividad de STAT5 puede reducirse cuando se proporciona una celula productora de anticuerpos especlficos de VSR con una secuencia de acido nucleico que codifica E47 o una parte, derivado y/o analogo funcional del mismo. La expresion de E47 dentro de linfocitos B que expresan altos niveles de sTaT [deltajb interviene en la diferenciacion y proliferacion, es decir bloqueo de STAT5 mediante E47 y SOCS da como resultado niveles de BCL6 y posteriormente niveles de Blimp-1 aumentados. Los niveles regulados positivamente de Blimp-1 dan como resultado una proliferacion reducida y en una diferenciacion de la celula implicada hacia una celula productora de anticuerpos. En otras palabras, la expresion de E47 dentro de un linfocito B potencia la expresion de Blimp-1 lo que da como resultado una diferenciacion de linfocitos B hacia un fenotipo productor de anticuerpos (celula plasmatica).
Por al menos una parte funcional de una protelna STAT5, una protelna STAT3, Bcl-xL y/o BCL6 se entiende una molecula proteica que tiene la misma capacidad, en tipo, no necesariamente en cantidad, de influir en la estabilidad de una celula productora de anticuerpos en comparacion con una protelna STAT5, una protelna STAT3, Bcl-xL y/o BCL6, respectivamente. Una parte funcional de una protelna STAT5 o una protelna STAT3 esta por ejemplo desprovista de aminoacidos que no estan implicados, o lo estan muy poco, en dicha capacidad. Un derivado de una protelna STAT5, una protelna STAT3, Bcl-xL y/o BCL6 se define como una protelna que se ha alterado de modo que la capacidad de dicha protelna para influir en la estabilidad de una celula productora de anticuerpos es esencialmente igual en tipo, no necesariamente en cantidad. Se proporciona un derivado de muchas maneras, por ejemplo mediante sustitucion de aminoacidos conservativa en la que un aminoacido se sustituye por otro aminoacido con propiedades en general similares (tamano, hidrofobicidad, etc.), de modo que el funcionamiento general probablemente no se ve afectado gravemente. Un derivado comprende por ejemplo una protelna de fusion, tal como una protelna de fusion STAT5-ER o STAT3-ER cuya actividad depende de la presencia de 4 hidroxi-tamoxifeno (4HT). Un analogo de una protelna STAT5, una protelna STAT3, Bcl-xL y/o BCL6 se define como una molecula que tiene la misma capacidad de influir en la estabilidad de una celula productora de anticuerpos en tipo, no necesariamente en cantidad. Dicho analogo no deriva necesariamente de dicha protelna STAT5, protelna STAT3, Bcl-xL y/o BCL6.
Dicha celula productora de anticuerpos especlficos de VSR puede cultivarse en presencia de IL-21 antes de que dicha celula productora de anticuerpos se proporcione con una secuencia de acido nucleico que codifica BCL6 o una parte, derivado y/o analogo funcional del mismo. Se prefiere cultivar celulas productoras de anticuerpos especlficos de VSR, preferentemente linfocitos B, en presencia de IL-21 antes de que dicha celula se proporcione con una secuencia de acido nucleico que codifique BCL6 o una parte, derivado y/o analogo funcional del mismo, porque la estabilidad, proliferacion y/o produccion de anticuerpos esta particularmente bien mejorada.
La divulgacion proporciona un metodo para influir en la estabilidad de una celula productora de anticuerpos especlficos de VSR como se describe en el presente documento, que comprende ademas aumentar directa o indirectamente la cantidad de producto de expresion de Bcl-xL dentro de dicha celula productora de anticuerpos. Esto se consigue por ejemplo proporcionando dicha celula productora de anticuerpos con una secuencia de acido nucleico que codifica Bcl-xL o una parte, derivado y/o analogo funcional del mismo o con secuencias de acido nucleico que codifican otros agentes antiapoptoticos incluyendo pero sin limitation Bcl-2. En otra realization mas de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
la presente divulgacion esto se consigue proporcionando dicha celula productora de anticuerpos con un compuesto capaz de potenciar directa o indirectamente la expresion de Bcl-xL, preferentemente dicho compuesto comprende APRIL, BAFF, CD40, estimulacion de BCR, citocinas, factores de crecimiento o efectores corriente abajo como JNK y AKT (PKB).
Bcl-XL es un miembro de la familia de Bcl-2 antiapoptotica, las protelnas Bcl2 interaccionan con y contrarrestan miembros de la familia de solamente dominio de homologla con Bcl-2 3 (BH3) tales como Bax, Bak, Bim y Bad, que inducen la liberacion de citocromo c despues de estlmulos de muerte intrlnsecos (Boise, L. H, 1993). Por lo tanto, la proteccion de la integridad de la membrana mitocondrial mediante protelnas como Bcl-xL es crltica para la supervivencia celular.
Se ha mostrado que la activacion de STAT5 protege celulas de la muerte celular. Se ha mostrado que STAT5 regula la expresion de Bcl-xL, lo que apoya un papel antiapoptotico para STAT5. STAT5 regula positivamente la expresion de Bcl-xL mediante elementos de union a STAT dentro del promotor de Bcl-xL. In vivo, la expresion de Bcl-xL esta ausente en medula osea de ratones doblemente deficientes para STAT5A/B. Ademas, la supervivencia de eritroblastos mediada por STAT5 depende de la regulacion positiva de Bcl-xL. Recientemente, se ha mostrado que la sobreexpresion transgenica de Bcl-xL en linfocitos B de raton promueve la supervivencia de linfocitos B y focos de celulas plasmaticas no malignas.
Un metodo de la presente divulgacion es particularmente adecuado para producir un cultivo celular que comprende celulas productoras de anticuerpos especlficos de VSR que pueden usarse para producir un cultivo de linfocitos B ex vivo. Dichos linfocito B de memoria es preferentemente humano de modos que se producen anticuerpos humanos. Dicho linfocito B preferentemente se origina de un individuo, habiendose expuesto previamente dicho individuo a virus sincitial respiratorio. Pueden aislarse linfocitos B especlficos de VSR de una muestra de sangre periferica y/o una muestra de amlgdala, usando metodos conocidos en la tecnica. Los linfocitos B de memoria se alslan por ejemplo por seleccion (clasificacion con perlas magneticas) con respecto al marcador de linfocitos B CD19 y/o cD22 y seleccion (posterior) con respecto a IgG de superficie celular y/o CD27 y/o mediante seleccion negativa con respecto a IgM, IgD y/o IgA. En un linfocito B de centro germinal, la expresion de BCL6 es alta mientras que la expresion de Blimp-1 es baja. El desarrollo natural a una celula secretora de anticuerpos implica la regulacion positiva de la expresion de Blimp-1. Ya que Blimp-1 reprime la expresion de BCL6, la regulacion positiva de Blimp-1 da como resultado regulacion negativa de BCL6 en una situacion natural. Sin embargo, la expresion de Blimp-1 esta regulada positivamente mientras que la expresion de BCL6 se mantiene al menos en parte. Esto da como resultado una celula productora de anticuerpos especlficos de VSR en la que BCL6 y Blimp-1 se coexpresan. Dicha celula productora de anticuerpos especlficos de VSR es capaz de proliferar y secretar anticuerpos anti VSR y es por lo tanto adecuada para su uso en un cultivo de linfocitos B ex vivo. Dicha celula productora de anticuerpos puede protegerse por apoptosis por Bcl-xL. Una celula productora de anticuerpos especlficos de VSR proporciona la ventaja de que es estable y no experimenta diferenciacion terminal durante un perlodo prolongado. Dicha celula productora de anticuerpos es estable durante al menos una semana, preferentemente durante al menos un mes, mas preferentemente durante al menos tres meses, mas preferentemente durante al menos seis meses. Un linfocito B se cultiva preferentemente en presencia de CD40L ya que la replicacion de la mayorla de linfocitos B esta favorecida por CD40L.
La expresion de BCL6 puede mantenerse esencialmente al mismo nivel, o a un nivel mayor, en comparacion con un linfocito B de centro germinal ya que una expresion de BCL6 significativa, junto con expresion de Blimp-1, da como resultado una celula productora de anticuerpos con proliferacion y propiedades de produccion de anticuerpos y/o estabilidad preferidas. Dicha expresion de BCL6 y/o expresion de Blimp-1 pueden acompanarse de expresion de Bcl-xL, dando como resultado proliferacion y propiedades de produccion de anticuerpos y/o estabilidad aun mas preferidas.
Se desvela en el presente documento un metodo para producir una celula productora de anticuerpos especlficos de VSR que es estable durante al menos una semana, preferentemente durante al menos un mes, mas preferentemente durante al menos tres meses, mas preferentemente durante al menos seis meses, comprendiendo el metodo:
- proporcionar un linfocito B de memoria especlfico de VSR;
- aumentar un nivel de expresion de Blimp-1 en dicha celula; y
- aumentar y/o mantener un nivel de expresion de BCL6 en dicha celula. Tambien se proporciona un metodo ex vivo para producir una celula productora de anticuerpos especlficos de VSR que comprende aumentar un nivel de expresion de Blimp-1 en un linfocito B de memoria especlfico de VSR y aumentar y/o mantener un nivel de expresion de BCL6 en dicha celula. Dichos niveles de expresion de BCL6 y Blimp-1 se llevan preferentemente y/o se mantienen esencialmente en el mismo nivel, o en un nivel mayor, en comparacion con un plasmablasto. Dicho linfocito B puede transducirse con BCL6 y Bcl-xL. Se proporciona ademas por lo tanto un metodo para producir una celula productora de anticuerpos especlficos de VSR que es estable durante al menos tres meses, que comprende:
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
- proporcionar un linfocito B capaz de producir anticuerpos especificos de VSR con BCL6, o una parte, derivado y/o analogo funcional del mismo; y
- proporcionar dicho linfocito B con Bcl-xL o una parte, derivado y/o analogo funcional del mismo; y
- cultivar dicho linfocito B.
Dicho linfocito B se proporciona preferentemente con una secuencia de acido nucleico que codifica BCL6, o una parte, derivado y/o analogo funcional del mismo, y con una secuencia de acido nucleico Bcl-xL o una parte, derivado y/o analogo funcional del mismo.
Dicho linfocito B se cultiva preferentemente en presencia de un compuesto capaz de potenciar la expresion de Blimp-1, tal como por ejemplo IL-21, IL-2, lL-6, 11-7, IL-10, IL-15, IL-27 o una quinasa Janus mutada. Preferentemente, IL-21 se usa porque esta citocina es particularmente adecuada para potenciar la expresion de Blimp-1 y estabilizar una celula productora de anticuerpos con un metodo desvelado en el presente documento. Ademas, para potenciar la eficacia de transduccion, dicho linfocito B se cultiva preferentemente en presencia de IL- 21 antes de que dicho linfocito B se transduzca con una secuencia de acido nucleico que codifique BCL6 y/o Bcl-xL, o una parte, derivado y/o analogo funcional del mismo.
Dicho linfocito B se proporciona con una protelna SOCS o una parte, derivado y/o analogo funcional de la misma, o un acido nucleico que la codifica, ya que una protelna SOCS o una parte, derivado y/o analogo funcional de la misma es capaz de potenciar indirectamente la expresion de Blimp-1. En otra realizacion alternativa o adicional de la presente divulgacion, dicho linfocito B se proporciona con E47 o una parte, derivado y/o analogo funcional del mismo, o un acido nucleico que lo codifica. Como ya se ha perfilado anteriormente, como resultado de un nivel aumentado de E47 o una parte, derivado y/o analogo funcional del mismo, la funcion de la protelna de Socs se potencia y la expresion de Blimp-1 se aumenta indirectamente.
En los ejemplos se muestran realizaciones particularmente preferidas de la divulgacion. De acuerdo con una realizacion particularmente preferida de la divulgacion, los linfocitos B especificos de VSR se cultivan en primer lugar en presencia de IL-21. Posteriormente los linfocitos B se someten a una reaccion de transduccion usando un acido nucleico que codifica BCL6 y un acido nucleico que codifica Bcl-xL. Preferentemente se usa transduccion de espin. Mas preferentemente, los linfocitos B y virus que comprenden al menos un acido nucleico de interes se mezclan, cuando despues la mezcla se centrifuga para conseguir una eficacia de transduccion alta. Despues de la transduccion, los linfocitos B se cultivan en ausencia de 11-21 y en presencia de 11-4 y celulas L durante 3-5 dias para permitir la expresion de BCL6. Posteriormente, los linfocitos B pueden someterse de nuevo a una reaccion de transduccion usando un acido nucleico que codifica BCL6 y un acido nucleico que codifica Bcl-xL. A continuacion, los linfocitos B se cultivan de nuevo en ausencia de 11-21 y en presencia de 11-4 y celulas L durante 3-5 dias para permitir la expresion de BCL6. Posteriormente, se aislan celulas que expresan BCL6 y Bcl-xL y se administra IL-21 de nuevo al cultivo para potenciar la replicacion y la production de anticuerpos. Los anticuerpos que se secretan por celulas que expresan Bcl-6, Blimp 1 y Bcl-xL en el sobrenadante de cultivo se exploran preferentemente con respecto a una capacidad/actividad/reactividad neutralizante in vitro a VSR. Se seleccionan ademas preferentemente celulas productoras de anticuerpos que producen esos anticuerpos, por ejemplo mediante cultivo de dilution limitante. Se obtienen por lo tanto linfocitos B especificos de VSR estables en los que se coexpresan BCL6 y Blimp-1. Dichos linfocitos B son capaces de replicar y producir anticuerpos en un cultivo in vitro durante al menos seis meses.
Se desvela en el presente documento un metodo que comprende ademas seleccionar y/o aislar un anticuerpo especifico de VSR o equivalente funcional del mismo. Pueden seleccionarse y/o aislarse celulas productoras de IgM y celulas productoras de IgG. Preferentemente se selecciona y/o aisla una celula productora de IgG.
Las celulas productoras de anticuerpos especificos de VSR generadas con un metodo desvelado en el presente documento son adecuadas para producir anticuerpos contra VSR. Sin embargo, los genes que codifican las cadenas pesadas y/o ligeras de Ig se aislan de dicha celula y se expresan en una segunda celula, tal como por ejemplo celulas de una linea celular de ovario de hamster chino (CHO) o celulas 293 (T). Dicha segunda celula, tambien denominada en el presente documento una celula productora, se adapta preferentemente a la produccion de anticuerpos comerciales. La proliferation de dicha celula productora da como resultado una linea celular productora capaz de producir anticuerpos especificos de VSR. Preferentemente, dicha linea celular productora es adecuada para producir compuestos para su uso en seres humanos. Por lo tanto, dicha linea celular productora esta preferentemente libre de agentes patogenos tales como microorganismos patogenos.
Se usa preferentemente un metodo desvelado en el presente documento para generar una celula productora de anticuerpos que es estable durante al menos una semana, preferentemente al menos un mes, mas preferentemente al menos tres meses, mas preferentemente al menos seis meses de modo que se ha hecho posible la produccion de anticuerpo comercial Mas preferentemente se produce una linea celular estable capaz de producir anticuerpos monoclonales. Esta se realiza preferentemente usando linfocitos B de memoria que se han aislado por ejemplo de una muestra por selection con respecto a CD19 y/o CD22 (marcador de linfocitos B) e IgG de superficie celular y/o CD27 (para marcar celulas de memoria) y/o mediante seleccion negativa con respecto a IgM, IgD y/o IgA. Ademas, una celula productora de anticuerpos especificos de VSR se selecciona por ejemplo en un ensayo de union usando
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
VSR o un componente derivado de VSR, tal como por ejemplo la protelna F, protelna G y/o protelna SH de VSR. Posteriormente, Blimp-1 y BCL6 pueden coexpresarse en dicha celula productora de anticuerpos especlficos de VSR, dando como resultado un cultivo de celulas capaces de unirse especlficamente a (un componente de) VSR. En otra realizacion preferida mas de la divulgacion, dicho linfocito B se proporciona adicionalmente con Bcl-xL o una parte, derivado y/o analogo funcional del mismo.
Si solamente se usa una celula de memoria, se obtiene una llnea celular que produce anticuerpos monoclonales. Tambien es posible generar una llnea celular productora de anticuerpos monoclonales que comienza con linfocitos B capaces de producir anticuerpos contra el VSR. Despues de haberse producido un cultivo de linfocitos B estable con un metodo desvelado en el presente documento, se alsla un linfocito B capaz de producir anticuerpos contra un antlgeno especlfico de VSR y al menos una parte funcional de un gen que codifica la cadena pesada y/o cadena ligera de Ig de dicho linfocito B se expresa preferentemente en una segunda llnea celular. Preferentemente al menos una parte funcional del gen que codifica la cadena pesada de Ig y al menos una parte funcional del gen que codifica la cadena ligera de Ig de dicho linfocito B se expresan en una segunda llnea celular.
Puede usarse en un metodo de la presente divulgacion una celula productora de anticuerpos, preferentemente pero no necesariamente un linfocito B de memoria, que se ha obtenido a partir de un individuo que se ha expuesto previamente a VSR. De esta manera, ha sido posible producir anticuerpos humanos de interes ex vivo.
Se desvela ademas por lo tanto un metodo para producir anticuerpos que son capaces de unirse especlficamente con y/o neutralizar virus sincitial respiratorio, comprendiendo el metodo:
- producir una celula productora de anticuerpos capaz de producir anticuerpos especlficos de VSR con un metodo de acuerdo con la invencion; y
- obtener anticuerpos producidos por dicha celula productora de anticuerpos.
Tambien se proporciona un anticuerpo aislado o recombinante, como se define en las reivindicaciones as! como una celula productora de anticuerpos aislados o recombinantes, como se define en las reivindicaciones que puede obtenerse por un metodo de acuerdo con la invencion, como se define en las reivindicaciones. Dicho anticuerpo comprende preferentemente anticuerpo D25, AM14, AM16 y/o AM23.
Una vez que se ha obtenido una celula productora de anticuerpos especlficos de VSR de acuerdo con la invencion como se define en las reivindicaciones, preferentemente se alsla y/o se genera artificialmente una parte funcional de un gen que codifica la cadena pesada y cadena ligera de Ig de dicha celula. Se proporciona una secuencia de acido nucleico que comprende al menos una parte funcional de una secuencia de acido nucleico como se representa en la Figura 11, Figura 12, Figura 14A, Figura 14B o Figura 14C. Dicha parte funcional comprende al menos una secuencia de acido nucleico como se representa en la Figura 11D, Figura 12, Figura 14A, Figura 14B y/o Figura 14C. Dicha parte funcional codifica las CDR como se representan en Figura HD, Figura 12, Figura 14A, Figura 14B o Figura 14C.
Se desvela ademas una secuencia de acido nucleico aislada, sintetica o recombinante que comprende una secuencia de cadena pesada que es al menos 70 %, preferentemente al menos 80 %, mas preferentemente al menos 90 % homologa de al menos parte de la secuencia CAGGTGCAGCTGGTACAGTCTGGGGCTGAAGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGATGGTCTC CTGCCAGGCCTCTGGAGGCCCCCTCAGAA, ACTATATTATCAAC,
TGGCTACGACAGGCCCCTGGACAAGGCCCTGAGTGGATGGGA, GGGATCATTCCTGTCTTGGGTACAGTACACTACGCACCGAAGTTCCAGGGC, AGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACAGACACAGCCT ACATCCAT CT GAT CAGCCT GAG AT CT GAGGACACGGCCAT GT ATT ACT GT GCGACG,
GAAACAGCTCTGGTTGTATCTACTACCTACCTACCACACTACTTTGACAAC,
TGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAG, y/o
CAGGTGCAGCTGGTACAGTCTGGGGCTGAAGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGATGGTCTC CTGCCAGGCCTCTGGAGGCCCCCTCAGAAACTATATTATCAACTGGCTACGACAGGCCCCTG GACAAGGCCCTGAGTGGATGGGAGGGATCATTCCTGTCTTGGGTACAGTACACTACGCACCG AAGTTCCAGGGCAGAGT CACGATT ACCGCGGACGAATCCACAGACACAGCCT ACATCCAT CT GAT CAGCCTGAGAT CT GAGGACACGGCCAT GT ATTACT GT GCGACGGAAACAGCT CT GGTT G T AT CT ACT ACCT ACCT ACCACACT ACTTT GACAACT GGGGCCAGGGAACCCTGGT CACCGT C TCCTCAG,
teniendo dicha parte al menos 15 nucleotidos. Dicha secuencia de cadena pesada deriva preferentemente del anticuerpo D25. Dicha secuencia de cadena pesada preferentemente puede comprender una secuencia que es al menos 70 %, preferentemente al menos 80 %, mas preferentemente al menos 90 % homologa de una secuencia como se representa en la Figura HD. Tambien se desvela con la presente una secuencia de acido nucleico aislada, sintetica o recombinante que comprende una secuencia de cadena pesada que consiste en cualquiera de las secuencias de cadena pesada mencionadas anteriormente.
Tambien se desvela una secuencia de acido nucleico aislada, sintetica o recombinante que comprende una secuencia de cadena ligera que es al menos 70 %, preferentemente al menos 80 %, mas preferentemente al menos
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
90 % homologa de al menos una parte de la secuencia
GACATCCAGAT GACCCAGT CTCCATCCTCCCTGTCTGCAGCT GT AGGAGACAGAGT CACCAT CACTTGC,
CAGGCGAGTCAGGACATTGTCAACTATTTAAAT,
TGGTAT CAACAGAAACCAGGGAAAGCCCCT AAGCTCCT GAT CT AC, GTT GCATCCAATTT GGAGACA,
GGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTTAGTCTCACCATCAGCAG
CCT GCAGCCT GAAGAT GTT GCAACATATT ATT GT, CAACAATATGATAATCTCCCA,
CT CACATTCGGCGGAGGGACCAAGGTT GAGAT CAAAAGA y/o
GACATCCAGAT GACCCAGT CTCCATCCTCCCTGTCTGCAGCT GT AGGAGACAGAGT CACCAT
CACTTGCCAGGCGAGTCAGGACATTGTCAACTATTTAAATTGGTATCAACAGAAACCAGGGA
AAGCCCCTAAGCTCCTGATCTACGTTGCATCCAATTTGGAGACAGGGGTCCCATCAAGGTTC
AGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTTAGTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGT
TGCAACATATTATTGT CAACAAT AT GAT AAT CTCCCACTCACATTCGGCGGAGGGAC CAAG G
TTGAGATCAAAAGA, teniendo dicha parte al menos 15 nucleotidos. Dicha secuencia de cadena ligera
preferentemente deriva del anticuerpo D25.
Dicha secuencia de cadena ligera preferentemente comprende una secuencia que es al menos 70 %, preferentemente al menos 80 %, mas preferentemente al menos 90 % homologa de una secuencia como se representa en la Figura HD. Tambien se desvela con la presente una secuencia de acido nucleico aislada, sintetica o recombinante que comprende una secuencia de cadena pesada que consiste en cualquiera de las secuencias de cadena ligera mencionadas anteriormente.
Se desvela ademas una secuencia de acido nucleico aislada, sintetica o recombinante que comprende una secuencia de cadena pesada que es al menos 70 %, preferentemente al menos 80 %, mas preferentemente al menos 90 % homologa de al menos parte de la secuencia GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTC CTGTGCGGCCTCT, GGATT CAGCTT CAGT CACT ATGCC,
ATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGGCAGTT,
AT AT CTT AT GAT GGAGAAAATACA,
TATTACGCAGACTCCGT GAAG GGCCGATTCTCCATCTC CAGAGACAATT CCAAGAACACAGT GTCTCTGCAAATGAACAGCCTGAGACCTGAGGACACGGCTCTATATTACTGT,
GCGAGAGACCGCAT AGTGGACGACT ACT ACT ACT ACGGT AT GGACGTC,
TGGGGCCAAGGGGCCACGGTCACCGTCTCCTCAG y/o
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTC CTGTGCGGCCTCTGGATTCAGCTTCAGTCACTATGCCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAG G CAAG GGACTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCTTATGATG GAGAAAAT ACATATTACGCAGAC TCCGT GAAGGGCCGATT CTCCAT CTCCAGAGACAATTCCAAGAACACAGT GT CT CTGCAAAT GAACAGCCTGAGACCT GAGGACACGGCT CT AT ATT ACT GT GCGAGAGACCGCAT AGT GGACG ACTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGGCCACGGTCACCGTCTCCTCA, teniendo dicha parte al menos 15 nucleotidos. Dicha secuencia de cadena pesada preferentemente deriva del anticuerpo AM14. Tambien se desvela con la presente una secuencia de acido nucleico aislada, sintetica o recombinante que comprende una secuencia de cadena pesada que consiste en cualquiera de las secuencias de cadena pesada mencionadas anteriormente.
Tambien se desvela una secuencia de acido nucleico aislada, sintetica o recombinante que comprende una secuencia de cadena ligera que es al menos 70 %, preferentemente al menos 80 %, mas preferentemente al menos 90 % homologa de al menos una parte de la secuencia
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCAT CACTTGCCAGGCGAGT, CAGGACATTAAGAAGTAT,
TT AAATT GGT AT CAT CAGAAACCAGGGAAAGTCCCT GAGCTCCTGAT GCAC, GATGCATCC,
AATTT G GAAACAG GGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGGGGATCTGGGACAGATTTTACTCT CACCATTAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGGAACATATTACTGT,
CAACAGTATGATAATCTGCCTCCGCTCACT, TTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGAT CAAAC y/o
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCAT CACTTGCCAGGCGAGTCAGGACATTAAGAAGTATTTAAATTGGTATCATCAGAAACCAGGGA AAGTCCCTGAGCTCCTGATGCACGATGCATC CAATTT G GAAACAG GGGTCCCATCAAGGTTC AGTGGCAGGGGATCTGGGACAGATTTTACTCTCACCATTAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATAT TGGAACATATTACTGTCAACAGTATGATAATCTGCCTCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCA AGGTGGAGATCAAACGAACTGTG, teniendo dicha parte al menos 15 nucleotidos. Dicha secuencia de cadena ligera deriva preferentemente del anticuerpo AM14.
Tambien se desvela con la presente una secuencia de acido nucleico aislada, sintetica o recombinante que comprende una secuencia de cadena pesada que consiste en cualquiera de las secuencias de cadena ligera mencionadas anteriormente.
Se desvela ademas una secuencia de acido nucleico aislada, sintetica o recombinante que comprende una secuencia de cadena pesada que es al menos 70 %, preferentemente al menos 80 %, mas preferentemente al
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
menos 90 % homologa de al menos parte de la secuencia
GAGGTGCAGCTGGTGGAGACCGGGGGAGGCCTGGCCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTC
CT GT GCAGCCTCT, GGATTCACATTCAGTAGTTATAAC,
ATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCACAC,
ATTAGTGCGGGTAGTAGTTACATA,
T ACT ACT CAGACT CAGTGAAGGGCCGATT CACCGTCTCCAGAGACAACGT CAGGAACT CAGT AT AT CT GCAAAT GAACAGCCT GAGAGCCGCTGACACGGCT GT GTATT ACT GT, GCGAGAGAGGATTATGGTCCGGGAAATTATTATAGTCCTAACTGGTTCGACCCC,
TGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAG y/o
GAGGTGCAGCTGGTGGAGACCGGGGGAGGCCTGGCCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTC CT GT GCAGCCTCTGGATT CACATT CAGT AGTT AT AACAT GAACT GGGTCCGCCAGGCTCCAG GGAAGGGGCT GGAGTGGGT CT CACACATT AGT GCGGGT AGT AGTT ACAT AT ACT ACT CAGAC TCAGTGAAGGGCCGATTCACCGTCTCCAGAGACAACGTCAGGAACTCAGTATATCTGCAAAT GAACAGCCTGAGAGCCGCTGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAGGATTATGGTCCGG GAAATTATTATAGTCCTAACTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCC TCA, teniendo dicha parte al menos 15 nucleotidos. Dicha secuencia de cadena pesada deriva preferentemente del anticuerpo AM16. Tambien se desvela con la presente una secuencia de acido nucleico aislada, sintetica o recombinante que comprende una secuencia de cadena pesada que consiste en cualquiera de las secuencias de cadena pesada mencionadas anteriormente.
Tambien se desvela una secuencia de acido nucleico aislada, sintetica o recombinante que comprende una secuencia de cadena ligera que es al menos 70 %, preferentemente al menos 80 %, mas preferentemente al menos 90 % homologa de al menos parte de la secuencia de
CAGTCTGTCGTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGAGTCACCATCTC CTGCACTGGGAGC, AGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGAT,
GTACACT GGTACCAGCAGCTTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCT CAT CT AT, GGCAACACT,
AATCGGCCCTCAGGGGTCTCCGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCT GGCCATCACTGGACTCCAGGCT GAGGAT GAGGCT GATT ATT ACT GC, CACTCCT AT GACAGAAGCCTGAGT GGT, TCAGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAG y/o
CAGTCTGTCGTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGAGTCACCATCTC CTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTACACTGGTACCAGCAGCTTC CAGGAACAGCCCCCAAACTCCT CAT CT AT GGCAACACTAATCGGCCCT CAGGGGT CTCCGAC CGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGACTCCAGGCTGA GGAT GAGGCT GATT ATTACTGCCACTCCT AT GACAGAAGCCT GAGTGGTT CAGT ATTCGGCG GAGGGACCAAGCTGACCGTC, teniendo dicha parte al menos 15 nucleotidos. Dicha secuencia de cadena ligera deriva preferentemente del anticuerpo AM16. Tambien se desvela con la presente una secuencia de acido nucleico aislada, sintetica o recombinante que comprende una secuencia de cadena pesada que consiste en cualquiera de las secuencias de cadena ligera mencionadas anteriormente.
Se desvela ademas una secuencia de acido nucleico aislada, sintetica o recombinante que comprende una
secuencia de cadena pesada que es al menos 70 %, preferentemente al menos 80 %, mas preferentemente al
menos 90 % homologa de al menos parte de la secuencia
CAGGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAAATGTGGTCAAGCCTGGGACGTCCCTGAGACTGTC
CT GT GCAGCGACT, GGATTCAACTTCCATAACTACGGC,
ATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCGGTT,
GTTT GGT AT GAT GGAAGTAAGAAA,
TACTATGCAGACTCCGTGACGGGCCGATTCGCCATCTC CAGAGACAATT CCAAGAACACTCT GTATCT GCAAAT GAACAGCCT GAGAGTCGAGGACACGGCT GTTT ATT ATT GT, GT GAGAGAT AAAGT GGGAC-
CGACTCCCTACTTTGACTCC, TGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTATCCTCAG y/o
GAGGTGCAGCT GGT GGAGTCTGGGGGAAAT GTGGTCAAGCCT GGGACGTCCCT GAGACT GTC CT GT GCAGCGACT GGATT CAACTTCCAT AACT ACGGCAT GAACT GGGTCCGCCAGGCTCCAG GCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCGGTTGTTTGGTATGATGGAAGTAAGAAATACTATGCAGAC TCCGTGACGGGCCGATTCGCCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACTCTGTATCTGCAAAT GAACAGCCTGAGAGTCGAGGACACGGCT GTTT ATT ATT GT GT GAGAGATAAAGTGGGACCGA CTCCCTACTTTGACTCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGT, teniendo dicha parte al menos 15 nucleotidos. Dicha secuencia de cadena pesada deriva preferentemente del anticuerpo AM23. Tambien se desvela con la presente una secuencia de acido nucleico aislada, sintetica o recombinante que comprende una secuencia de cadena pesada que consiste en cualquiera de las secuencias de cadena pesada anteriormente mencionadas.
Tambien se desvela una secuencia de acido nucleico aislada, sintetica o recombinante que comprende una secuencia de cadena ligera que es al menos 70 %, preferentemente al menos 80 %, preferentemente al menos 90 % homologa de al menos parte de la secuencia
TCCTATGTGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCACTGGCCCCAGGAGGGACGGCCGCGATCAC CTGTGGAAGAAAC, AACATTGGAAGTGAAACT,
GTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCTGTGCTGGTCGTCTAT, GATGATGAC,
GACCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACGGCCACCCT
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
GACCATCAGCAGGGTCGAGGCCGGGGATGAGGCCGACTATTACTGT,
CAGGTGTGGGATAGGAGTAATTATCATCAGGTA, TTCGGCGGAGGGACCAAGTTGACCGTCCTAG y/o
TCCTATGTGCTGACTCAGCCCCCCTCGGTGTCACTGGCCCCAGGAGGGACGGCCGCGATCAC CT GT GGAAGAAACAACATT GGAAGT GAAACT GT GCACT GGT ACCAGCAGAAGCCAGGCCAGG CCCCTGTGCTGGTCGTCTATGATGATGACGACCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCT GGCTCCAACTCTGGGAACACGGCCACCCTGACCATCAGCAGGGTCGAGGCCGGGGATGAGGC CGACTATTACTGTCAGGTGTGGGATAGGAGTAATTATCATCAGGTATTCGGCGGAGGGACCA AGCTGACCGTC, teniendo dicha parte al menos 15 nucleotidos. Dicha secuencia de cadena ligera deriva preferentemente del anticuerpo AM23. Tambien se desvela con la presente una secuencia de acido nucleico aislada, sintetica o recombinante que comprende una secuencia de cadena pesada que consiste en cualquiera de las secuencias de cadena pesada anteriormente mencionadas.
Tambien se desvela una secuencia de acido nucleico que codifica una secuencia de aminoacidos que es al menos 70 %, preferentemente al menos 80 %, mas preferentemente al menos 90 % identica a al menos una parte funcional de una secuencia de aminoacidos como se representa en la Figura 11, Figura 14A, Figura 14B y/o Figura 14C, teniendo dicha parte al menos 5 restos de aminoacidos. Dicha secuencia de acido nucleico puede codificar una secuencia de aminoacidos que es al menos 80 % identica a la secuencia de CDR de cadena pesada 1, 2 y/o 3 y/o secuencia de CDR de cadena ligera 1 o 2 representada en la Figura 11D. Dicha secuencia de acido nucleico puede codificar una secuencia de aminoacidos que es al menos 80 % identica a al menos una de las secuencias de CDR representadas en la Figura 14A, en la Figura 14B y/o en la Figura 14C. Dicha secuencia de acido nucleico puede codificar una secuencia de aminoacidos que es al menos 70 % identica a una secuencia de cadena pesada representada en la Figura 11A, a una secuencia de cadena pesada representada en la Figura 14A, a una secuencia de cadena pesada representada en la Figura 11B, a una secuencia de cadena pesada representada en la Figura 14C, a una secuencia de cadena ligera representada en la Figura 11A, a una secuencia de cadena ligera representada en la Figura 14A, a una secuencia de cadena ligera representada en la Figura 14B y/o a una secuencia de cadena ligera representada en la Figura 14C.
Se desvela ademas por lo tanto una secuencia de acido nucleico aislada, sintetica o recombinante que comprende una secuencia que codifica una secuencia de aminoacidos que es al menos 70 %, preferentemente al menos 80 %, mas preferentemente al menos 85 % identica a una secuencia de aminoacidos como se representa en la Figura 11A-D. Dicha secuencia de acido nucleico puede codificar una secuencia de aminoacidos que es al menos 80 % identica a la secuencia de CDR de cadena pesada 1, 2 y/o 3 y/o la secuencia de CDR de cadena ligera 1 o 2 como se representa en la Figura 11A-D. Una realizacion desvela una secuencia de acido nucleico aislada, sintetica o recombinante que comprende una secuencia que codifica una secuencia de aminoacidos que es al menos 70 % identica a la secuencia de aminoacidos NYIIN, y/o al menos 75 % identica a la secuencia GIIPVLGTVHYAPKFQG y/o al menos 70 % identica a la secuencia ETAl WSTTYLPH YFD N, y/o al menos 85 % identica a la secuencia QASQDIVNYLN, y/o al menos 70 % identica a la secuencia VASNLET, y/o al menos 70 % identica a la secuencia
qvqlvqsgaevkkpgssvmvscqasggplrnyiinwlrqapgqgpewmggii pvlgtvhyapkfqgrvtitadest-
DTAYIHLISLRSEDTAMYYCATETALWST TYLPHYFDN WGQGTLVTVSS, y/o al menos 70 % identica a la secuencia DIQMTQSPSSLSAAVGDRVTITCQASQDIVNYLNWYQQKPGKAPKLLIYVASN
LETGVPSRFSGSGSGTDFSLTISSLQPEDVATYYCQQYDNLPLTFGGGTKVEIK RTV. Una secuencia de acido nucleico desvelada en el presente documento puede ser al menos 80 %, mas preferentemente al menos 85 %, mas preferentemente al menos 90 %, mas preferentemente al menos 95 % homologa de cualquiera de las secuencias enumeradas anteriormente.
Se desvela ademas una secuencia de acido nucleico aislada, sintetica o recombinante que comprende una secuencia que codifica una secuencia de aminoacidos que es al menos 70 %, preferentemente al menos 80 %, mas preferentemente al menos 85 % identica a una secuencia de aminoacidos como se representa en la Figura 14A-C. Dicha secuencia de acido nucleico puede codificar una secuencia de aminoacidos que es al menos 70 % identica a una secuencia de CDR como se representa en la Figura 14A, 14B y/o 14C. Una secuencia de acido nucleico aislada, sintetica o recombinante puede comprender una secuencia que codifica una secuencia de aminoacidos que es al menos 70 % identica a una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en: GFSFShYa,
isydgent, ARDRIVDDYYYYGMDV, QDIKKY, DAS, QQYDNLPPLT,
evqlvesgggwqpgrslrlscaasgfsfshyamhwvrqapgkglewvavis
ydgentyyadsvkgrfsisrdnskntvslqmnslrpedtalyycardrivdd yyyygmdvwgqgatvtvss, diqmtqspsslsasvgdrvtitcqasqdikkylnwyhqkpgkvpellmhdasnletgvpsrf sgrgsgtdftltisslqpedigtyycqqydnlppltfgggtkveikrtv, gftfssyn, isagssyi,
aredygpgnyyspnwfdp, ssnigagyd, gnt, hsydrslsg,
evqlvetggglaqpggslrlscaasgftfssynmnwvrqapgkglewvshi sags syiyys d svkgrftvsrdnvrnsvylqmnslraadtavyycaredygpgnyyspn-wfdpwgqgtlvtvs s,
QSVVTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNTNRPSGVSD
rfsgsksgtsaslaitglqaedeadyychsydrslsgsvfgggtkltv, gfnfhnyg, vwydgskk,
VRDKVGPTPYFDS, NIGSET, DDD, QVWDRSNYHQV, EVQ LVESGGNWKPGTSLRLSCAATGFNFHNY
gmnwvrqapgkglewva wwydgskkyyad svtgrfai
SRDNSKNTLYLQMNSLRVEDTAVYYCVRDKVGPTPYFDSWGQGTLVTVSS, y S YVLTQPPSVS LAPGGTAAI TCGRNNI GSETVHWYQQKPGQAPVL WYDDDDRPSGI PERFS GSNSGNTATLT I
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
SRVEAGDEADYYCQVWDRSNYHQVFGGGTKLTV. Una secuencia de acido nucleico desvelada en el presente documento puede ser al menos 80 %, mas preferentemente al menos 85 %, mas preferentemente al menos 90 %, mas preferentemente al menos 95 % homologa de cualquiera de las secuencias enumeradas anteriormente.
Como ya se ha explicado en el presente documento anteriormente, las secuencias de acido nucleico de acuerdo con la presente invencion como se define en las reivindicaciones son particularmente adecuadas para expresar un anticuerpo de acuerdo con la invencion, preferentemente D25, AM14, AM16, AM23 en un sistema de expresion de acido nucleico. Una secuencia de acido nucleico de acuerdo con la presente invencion como se define en las reivindicaciones se expresa preferentemente en una celula, mas preferentemente en una celula productora adaptada para la produccion de anticuerpos.
La invencion se explica ademas en los siguientes ejemplos. Estos ejemplos no limitan el alcance de la invencion, sino que sirven unicamente para clarificar la invencion.
Ejemplos
Materiales y metodos
Mantenimiento y aislamiento de linfocitos B humanos
Usando procedimientos convencionales, se aislaron linfocitos B humanos CD19 positivos a partir de capa leucocltica derivada de banco de sangre (otras fuentes pueden ser sangre nueva con un factor anticoagulacion, o un organo linfoide por ejemplo amlgdala o bazo). Brevemente, se aislaron celulas mononucleares de sangre periferica totales (PBMC) usando separacion por densidad de Ficoll (Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido). Se usaron perlas marcadas con CD22 para seleccionar positivamente linfocitos B por tecnica de clasificacion celular de MACS como se describe por el fabricante (Miltenyi, Utrecht, Palses Bajos). Las celulas se tineron posteriormente con combinaciones apropiadas de anticuerpos monoclonales (mAb) para CD19, CD27, IgD, IgM e IgA (Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ, Estados Unidos). Los linfocitos B de memoria que son positivos para CD19 y CD27 y negativos para IgM, IgA e IgD se clasificaron despues usando el FACSAria (BD) (Figura 1). Ademas de linfocitos B de memoria, pueden aislarse otros subconjuntos de linfocitos B, como linfocitos B sin tratamiento previo, foliculares, de memoria, productores de anticuerpos, centroblastos, centrocitos, de centro germinal, plasmablastos, celulas plasmaticas, de zona germinal, perisinusoidales o transicionales (muchos de esos subconjuntos solamente se han determinado en ratones) usando marcadores apropiados.
Cultivo celular
Las celulas clasificadas se lavaron y se cultivaron en placas de 24 pocillos (1,5 a 2x105 celulas/ml) en celulas L que expresan CD40L irradiadas con 80 Gray (5x104 celulas/ml; proporcionadas por el Dr. J. Banchereau, Schering Plough Francia, Dardilly Francia), en medio completo (Medio Esencial Mlnimo D Modificado por Iscove que contiene suero de ternero fetal al 8 % (FCS) y penicilina/Estreptomicina). A no ser que se mencione de otro modo, estas celulas L que expresan CD40L siempre estan presentes en los cultivos en combinacion con FCS 8 %. Para preparar el linfocito B para transduccion retroviral se cultivaron celulas durante 36 horas en presencia de IL-21 de raton (50 ng/ml, R&D, Minneapolis, MN, Estados Unidos). Despues de la transduccion las celulas se cultivan preferentemente en presencia de IL-21, sin embargo las celulas responden a IL-4, IL-15 e IL-10 (sin excluir otras citocinas). Por ejemplo, la expansion de linfocitos B inducida por IL-4 es menor en comparacion con IL-21 y pueden requerirse niveles menores de division celular en algunos experimentos.
Construcciones retrovirales y produccion de retrovirus recombinante
Se han descrito previamente mutantes activos constitutivos de STAT5a y b. Se obtuvo ADN que codificaba estos mutantes y STAT5b de tipo silvestre de T. Kitamura (IMSUT, Tokio, Japon). Se identifico Bcl-6 en una exploracion de rescate de senescencia en fibroblastos murinos como un inhibidor de senalizacion de p19ARF-p53 antiproliferativa. Bcl-XL se identifico como un factor antiapoptosis, que se proporciono amablemente por el Dr. Korsmeyer (Instituto Medico Howard Hughes, Boston, Estados Unidos). Estos ADN se ligaron al vector LZRS-enlazador-IRES-GFP (o IRES-YFP o IRES-NGFR) que se habla descrito previamente (Heemskerk et al., 1997; Heemskerk et al., 1999). En lugar del marcador de IRES-GFP (protelna verde fluorescente) tambien se uso un IRES-YFP (Protelna Amarilla Fluorescente) o un IRES-NGFR (receptor del factor de crecimiento nervioso). NGFR es un mutante incompetente para senalizacion del NGFR, proporcionado amablemente por el Dr. C. Bonini. Se uso un anticuerpo monoclonal contra NGFR (Chromaprobe, Mountain View, CA, Estados Unidos o Miltenyi) para visualizar celulas que expresan NGFR.
Para la produccion de retrovirus recombinante, los plasmidos retrovirales se transfectaron en una llnea celular productora anfotropica sin virus auxiliar Phoenix-A, un derivado de la llnea celular de rinon embrionario humano 293 (Kinsella y Nolan, 1996) (un amable regalo del Dr. G. Nolan, Universidad de Stanford, Palo Alto, CA), usando Fugene-6 (Roche Diagnostics Palses Bajos, Almere, Palses Bajos) de acuerdo con protocolos del fabricante. Dos dlas despues se inicio la seleccion de celulas transfectadas mediante la adicion de puromicina 2 pg/ml (Becton
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Dickinson Clontech Laboratories, Palo Alto, CA). De diez a 14 dlas despues de la transfeccion se sembraron 6 x 106 celulas por cada placa de Petri de 10 cm (Becton Dickinson Discovery Labware, Bedford, MA) en 10 ml de medio completo sin puromicina. Al dla siguiente el medio se renovo y al dla siguiente se recogio el sobrenadante retroviral, se centrifugo y se congelo en allcuotas sin celulas a -70 °C. Este enfoque proporciona una produccion retroviral reproducible rapida, a gran escala y de alta titulacion de mas de 3 x 106 partlculas infecciosas de virus/ml.
Transduccion retroviral
Se analizo el procedimiento de transduccion de fragmentos de fibronectina humana recombinante CH-296 (RetroNectin™; Takara, Otsu, Japon) como se ha descrito previamente (Heemskerk et al., 1997; Heemskerk et al., 1999). Se recubrieron placas de 24 pocillos tratadas con cultivo no tisular (Costar, Badhoevedorp, Palses Bajos) con 0,3 ml de fragmento de fibronectina humana recombinante CH-296 30 gg/ml a temperatura ambiente durante 2 horas o durante una noche a 4 °C. Cuando se usaron placas de cultivo no tisular de diferentes tamanos, los reactivos se usaron proporcionalmente. Se retiro la solucion de CH-296, seguido de incubacion con albumina de suero humano (HSA) 2 % en solucion salina tamponada con fosfato (PBS) durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguido de lavado una vez con PBS. Se sembraron en placas 5x105 linfocitos B, que se prepararon para transduccion retroviral en 0,25 ml de RPMI sin FCS y celulas L y se mezclan con 0,25 ml de sobrenadante retroviral descongelado. Para la transduccion doble de Bcl-6 Bcl-XL se mezclaron 125 gl de Bcl-6-IRES-NGFR (o IRES-YFP) (Shvarts A. et al. Genes Dev., 2002) y 125 gl de Bcl-XL-IRES-GFP (proporcionado por S. Korsmeyer, Instituto Medico Howard Hughes, Hospital Infantil, Boston, Estados Unidos) y se anadieron a las celulas. El cultivo se centrifugo posteriormente a 1800 rpm a 25 °C durante 60 minutos y se incubo durante 6 horas a 37 °C. A continuacion se retiraron 0,25 ml de sobrenadante y se anadieron 0,25 ml de sobrenadante retroviral nuevo. El cultivo se centrifugo de nuevo a 1800 rpm a 25 °C durante 60 minutos y se incubo a 37 °C durante una noche. Al dla siguiente las celulas se transfirieron a placa tratada con cultivo tisular de 24 pocillos (Costar) y se cultivo durante 3-5 dlas en condiciones normales en presencia de IL-4 humano (50 ng/ml) o IL-21 de raton (50 ng/ml, R&D, Minneapolis, MN, Estados Unidos). La eficacia de transduccion se determino mediante tincion con anticuerpos de un mutante incompetente para senalizacion, truncado, del receptor de factor de crecimiento nervioso (ANGFR, proporcionado por C. Bonini, Hospital de San Rafael, Milan, Italia) o (co)expresion de GFP y/o YFP. Las celulas que contienen el transgen o los transgenes de interes se seleccionan despues para experimentos adicionales.
Citometrla de flujo
Se usaron anticuerpos contra las moleculas humanas IgD, IgG, CD3, CD19, CD20, CD27, CD38, CD40, CD45, CD56, CD70, CD80, CD86, HLA-DR (BD) directamente marcadas con FITC, PE, PERCP, PE-Cy5, APC o APC-Cy7 e IgM, cadena ligera kappa, cadena ligera lambda, CD138, marcados directamente con PE (DAKO) para analisis de citometrla de flujo. Las celulas tenidas se analizaron usando un LSRII (BD) y los datos de FACS se procesaron con software informatico FlowJo (Tree Star, Inc).
Experimento de proliferacion
Se aislaron linfocitos B sin tratamiento previo y de memoria a partir de PBMC nuevos en el FACSAria: linfocitos B sin tratamiento previo: CD19-PE-Cy7 pos, CD27-APC neg, linfocitos B de Memoria IgD-PE pos: CD19-PE-Cy7 pos, CD27 APC pos, IgD-PE neg, IgA-FITC neg. Las celulas se lavaron en PBS y se resuspendieron en 0,5 ml de RPMI (37 °C) sin FCS. Se anadio una cantidad igual de IMDM que contenla carboxifluoresceln succinimidil ester (CFSE) 2 gM a la mezcla celular y se incubo durante 7 minutos a 37 °C. Se detuvo el marcaje positivo de las celulas mediante lavado de la celula con FCS frlo. Las celulas se resuspendieron en 500 gl de iMdM-FCS 8 % y se cultivaron con celulas L y en ausencia o presencia de IL-21. Se usaron celulas no marcadas como control. Despues de 36 horas (inmediatamente antes de la transduccion), se analizo una proporcion de celulas con respecto a su contenido de CFSE. Las celulas restantes se transdujeron por espln con Bcl-6-IRES-NGFR, se cultivaron durante 3 dlas, y se analizaron con respecto a su contenido de CFSE usando el LSRII. Los datos se analizaron usando un softWare FlowJo (Treestar)
Aislamiento de linfocitos B humanos especlficos de antlgeno usando clasificacion celular individual de alta velocidad
Ademas del metodo de aislamiento de linfocitos B de memoria descrito anteriormente que comienza con MBC (es decir cultivos de 100 celulas/pocillo), los linfocitos B de memoria humanos tambien pueden incubarse con un antlgeno marcado con fluorescente y clasificarse basandose en el reconocimiento de antlgenos. Un ejemplo es el aislamiento de linfocitos B que se unen con toxoide del tetanos marcado con ficoeritrina (PE) (proporcionado por A. Radbruch, Berlin, Alemania) (Figura 4). Las celulas se cultivaron a 1 celula/pocillo y se comprobaron con respecto a union con TT. A pesar de eso puede usarse cualquier otro antlgeno marcado.
Determinacion de la expresion del receptor de linfocitos B (BCR) despues de cultivo a largo plazo de celulas transducidas con Bcl-6 y Bcl-XL
Se sabe que los linfocitos B que se diferencian durante el cultivo in vitro pierden su expresion en membrana de BCR, que tambien se observa en linfocitos B transformados con VEB. Por lo tanto los linfocitos B transducidos con Bcl-6 y
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Bcl-XL y cultivados en presencia de IL-21 se tineron con respecto a GFP, NGFR, CD19, Kappa y/o Lambda o IgG o con toxoide del tetanos marcado. Para mostrar la utilidad de la expresion de BCR se clasificaron celulas de union a TT-PE (Radbruch) usando el FACSAria (BD) a 1 celula/pocillo en placas de 96 pocillos, que se sembraron con celulas L y medio de cultivo que contenla IL-21. Despues de tres semanas se comprobo la union con toxoide del tetanos de clones en crecimiento usando el FACS Canto (BD). Por lo tanto las celulas se recogieron y se tineron en placas de 96 pocillos con GFP, NGFR, CD19 y TT-PE.
Desarrollo de llneas de linfocitos B dobles positivos para Bcl-6 y Bcl-XL que segregan anticuerpos
Se crearon llneas de linfocitos B que producen anticuerpos monoclonales y son 100 % dobles positivas para Bcl-6 y Bcl-XL. En primer lugar esto se consiguio induciendo la proliferation y diferenciacion usando IL-21. Entre tanto estas celulas se transducen con los retrovirus Bcl-6-IRES-NGFR y Bcl-XL-IRES-GFP. Las celulas se mantienen en IL-4 durante 3-4 dlas. Las celulas que se transducen con uno o ambos retrovirus expresan despues el transgen y por lo tanto expresaran la protelna NGFR o GFP. La expresion de NGFR y/o GFP puede visualizarse usando el LSRII (BD). Si es necesario, las celulas pueden transducirse de nuevo para obtener mayores numeros de celulas que expresan ambos transgenes. Independientemente de una segunda transduction las celulas que expresan ambos transgenes se clasifican usando el FACS Aria (BD) y se cultivan a una densidad celular que varla de 10-500 celulas/pocillo en placas de 96 pocillos en presencia de IL-21 y de 2500 a 5000 celulas L/pocillo. Estos cultivos de volumen mini (MBC) secretan cantidades relativamente grandes de anticuerpo en el sobrenadante de cultivo ya el dla 5, lo que despues puede usarse para fines de exploration. La exploration puede basarse en tecnicas disponibles para el antlgeno de interes por ejemplo ELISA/EIA/RIA, transferencia de Western o ensayos funcionales directos como experimentos de neutralization de bloqueo de citocinas. Despues de la exploracion y selection del MBC que reconocen el antlgeno de interes (TT y VSR en los experimentos de los inventores), las celulas se subclonan a 0,5-1 celula/pocillo en 96 pocillos en presencia de IL-21. La subclonacion normalmente tarda 2-3 semanas y puede realizarse mediante cultivos en dilution limitante (DL) o clasificacion de celulas individuales usando citometrla de flujo (FACSAria).
Reserva de virus VSR A-2 y llnea celular HEp2
El virus VSR A-2 (proporcionado amablemente por G. van Bleek, WKZ, Utrecht) y la llnea celular HEp2 (Clinical Laboratory, AMC, Amsterdam), se cultivaron en cantidades grandes y se congelaron en nitrogeno llquido.
La llnea celular HEp2 adherente se cultivo en medio normal en frascos Falcon T175 antes de congelarse las allcuotas.
Para obtener una reserva de VSR de alto tltulo, se sembraron celulas HEp2 y se cultivaron hasta alcanzar 50-60 % de confluencia. Se anadio a la reserva de VSR original (dilucion 1/20 del volumen total 5 ml) durante 45 minutos a TA en las celulas HEp2. Se anadieron 15 ml de medio nuevo y las celulas se dejaron durante una noche a 37 °C, CO2 5 % con la tapa abierta. Al dla siguiente se retiro cuidadosamente el sobrenadante de cultivo y se anadieron 15 ml de medio que contenla FCS 1 %. Las celulas se dejaron durante 24 a 36 horas a 37 °C, CO2 5 % con la tapa cerrada. Cuando eran claramente visibles sincitios inducidos por VSR y la mayorla de los sincitios aun estaban intactos, el medio se recogio, se filtro (0,22 pm) y se centrifugo a 1450 rpm a TA antes de congelarse instantaneamente las muestras y almacenarse en nitrogeno llquido. Puede obtenerse una segunda recogida anadiendo inmediatamente nuevo medio que contiene FCS 1 % y congelando este lote 4-6 horas despues.
Lisado de VSR para ELISA
Las celulas HEp2 que se hablan infectado con VSR A-2 para obtener reservas de virus se usaron para aislar protelnas de VSR. En primer lugar las celulas se lavaron cuidadosamente con PBS y se tripsinizaron. Se retiro por lavado la tripsina (Gibco) y el sedimento celular se liso con octilglucosido 1 % (sedimento celular de un matraz T175 se trato con 2 ml de octilglucosido). La suspension se homogeneizo con jeringa y aguja (10 veces arriba y abajo), se incubo durante 1 hora en hielo y despues se dializo frente a 2 l de tampon de TBS pH 7,4, durante una noche a 4 °C. Se obtuvo sobrenadante despues de sedimentar por centrifugation los residuos celulares. El contenido de protelnas se determino a 3,6 mg/ml y se uso a 20 pg/ml (50 pl) en ELISA.
Determination de DICT50 y UFP de reservas de VSR
Para determinar la DICT50, se sembraron 104 HEp2 en placas de 96 pocillos y se infectaron con una dilucion en serie de 2 o 10 etapas de virus VSR en 4-plo. 2-3 dlas despues se retiro el sobrenadante de cultivo y las celulas se fijaron con acetona 80 % durante 10 minutos a TA. Despues de retirar la acetona, la capa celular fija se seco y se mantuvo a 4 °C o se congelo a -20 °C. Para tenir celulas HEp2 con VSR las placas se bloquearon en primer lugar con leche en polvo al 5 % en PBS Tween 20 0,1 %. Despues las placas se lavaron 3 veces antes de incubarse durante 3-5 horas a 37 °C con anti VSR-HRP de cabra policlonal (1:500, Biodesign, Saco, ME, Estados Unidos) y se lavaron exhaustivamente. A continuation los pocillos se incubaron con sustrato de AEC durante 30 minutos a TA. Los focos infectados se tinen de rojo y pueden observarse a la vista usando un microscopio optico y pueden contarse. Se uso software Excel convencional para determinar la DICT50.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Para determinar la cantidad de unidades formadoras de placas (UFP) del virus, se incubaron 1x105/ml de celulas HEp2 en placas de 24 pocillos con diluciones en serie 10 veces (10-3 - 10-7) de reserva de virus VSR en medio con FCS 1 % a 37 °C durante 45 minutos (200 pl) antes de cubrirse las celulas y virus con 0,5 ml de agar seaplaque 0,25 % calentado con la mano (Biozyme). La capa de agarosa evita la propagacion del virus a celulas no infectadas a traves del medio de cultivo. Por lo tanto el virus puede infectar solamente celulas adyacentes, que con el tiempo se destruyen por el virus que crea placas en la monocapa de celulas HEp2. Esas placas pueden visualizarse mejor tinendo las celulas fijas (etanol 96 % - acido acetico 100 % - formalina 10 % 6:2:1) con solucion de violeta cristal 1 %. Las placas se recuentan (por al menos dos personas diferentes) y puede determinarse el valor de UFP.
Seleccion de anticuerpos neutralizantes de virus sincitial respiratorio (VSR)
Para obtener clones de linfocitos B anti virus sincitial respiratorio (VSR), se aislaron celulas de sangre periferica (PBMC) de dos donantes de capas leucoclticas derivadas del banco de sangre (donante B62 y B63). Antes de clasificar celulas CD19posIgMnegIgDnegIgAnegCD27pos usando el FACSAria (BD) (Figura 1), se aislaron celulas CD22+ usando perlas MACS y columnas (Miltenyi). Solamente si se menciona de otro modo, las celulas se cultivaron con celulas L. Las celulas se cultivaron durante 36 horas en presencia de IL-21 antes de transducirse con Bcl-6-IRES- NGFR solamente. Despues de 12 horas las celulas se recogieron y se cultivaron durante 3 dlas en presencia de IL-4 antes de clasificarse las celulas que expresaban NGFR usando perlas MACS (Miltenyi) y se transdujeron inmediatamente con Bcl-XL-IRES-GFP. Los linfocitos B que no se unlan con las perlas MACS se lavaron y se transdujeron con Bcl-6 y Bcl-XL al mismo tiempo. Despues de 12 horas las celulas se recogieron, se agruparon y se cultivaron durante 3 dlas en presencia de IL-4 antes de clasificarse en expresion de GFP y NGFR en el FACSAria. Las celulas se lavaron y se cultivaron a una densidad de 100 celulas/pocillo en placas de 96 pocillos (Costar) en presencia de IL-21.
Los cultivos celulares doblemente transducidos con Bcl-6 y Bcl-XL se exploraron con respecto a union con VSR usando un ELISA de lisado de celulas HEp2 infectadas por VSR y se ensayaron en paralelo usando un experimento de microneutralizacion de VSR. Brevemente, se sembraron 104 celulas HEp2 en placas de 96 pocillos de fondo plano (Costar) en medio completo. Al dla siguiente el medio se reemplazo durante 1 hora a TA con la mezcla de virus VSR y sobrenadante de cultivo celular que se ha preincubado durante 30 minutos a 37 °C. El volumen total es de 25 pl y la concentracion final de VSR es de 0,1 MOI. Despues de 1 hora la mezcla de sobrenadante del virus se diluye 9 veces con PBS y se reemplaza con 100 pl de IMDM/FCS 5 %. Despues de 2 dlas las celulas se fijan con acetona al 80 % y se tinen con anti VSR-HRP policlonal (Biodesign). Usando H2O2 y AEC las celulas infectadas con VSR desarrollan una tincion roja. Usando microscopla optica las celulas infectadas pueden observarse y contarse si es necesario. Como control para neutralizacion de VSR se usa un anti VSR policlonal de cabra (Abcam, Cambridge, MA).
RT-PCR y clonacion de regiones VH y VL
Se aislo ARN total de ~5x105 linfocitos B con el mini kit RNeasy® (Qiagen, Venlo, Palses Bajos). Se transcribieron de forma inversa 250 ng de ARN total en un volumen de 20 pl que contenla tampon de primera cadena 1X, dNTP 500 pM, 250 ng de hexameros aleatorios, DTT 5 mM, 40 U de RNasina (Promega) y 200 U de SuperScript III RT (Invitrogen). El ADNc se diluyo 10X en agua Ultrapura y se sometieron 2,5 pl de ADNc a PCR en una solucion de 50 pl que contenla Tris-HCL 20 mM, KCl 50 mM, MgCl2 2,5 mM, dNTP 250 pM, 1 U de ADN polimerasa AmpliTaq Gold (Applied Biosystems Inc.) y 25 pmoles de cada cebador. Las condiciones de PCR fueron las siguientes: 8 minutos de etapa de desnaturalizacion a 96 °C seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 96 °C, 30 segundos a 60 °C, 1 min a 72 °C y una extension final de 10 minutos a 72 °C.
Se procesaron productos de PCR en geles de agarosa, se purificaron y se clonaron en el vector de clonacion pCR2.1 TA de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Se realizo analisis de secuencia usando qulmica de BigDye Terminator (Applied Biosystems Inc.) y software Vector-NTI (Invitrogen).
Para descartar mutaciones inducidas por transcriptasa inversa y/o ADN polimerasa, se realizaron varias conversiones de ADNc y reacciones de PCR y se clonaron individualmente y se analizo la secuencia. Se determinaron las secuencias consenso con software Vector-NTI Contig Express.
Para expresion de anticuerpos de protelnas recombinantes en celulas 293T se generaron construcciones de cadena pesada y ligera de longitud completa en pcDNA3.1(+)Zeo (Invitrogen). El vector de expresion de cadena pesada se construyo por amplificacion por PCR de la secuencia llder de cadena pesada y region Vh del clon D25 introduciendo un sitio 5'-NheI y un sitio 3'-XhoI. La region constante IgG1 (CH1-bisagra-CH2-CH3) se amplifico a partir del mismo ADNc introduciendo al mismo tiempo un sitio 5'-XhoI y un 3'-NotI. El vector de expresion de cadena pesada de longitud completa se obtuvo por ligamiento de tres puntos en pcDNA3.1(+)Zeo digerido con NheI/NotI. La construccion de expresion de cadena ligera de longitud completa se genero mediante amplificacion por PCR de la secuencia llder de cadena ligera, region VL y region constante de cadena ligera con cebadores introduciendo un sitio 5'-NheI y 3'-NotI. Este ultimo producto se clono en pcDNA3.1(+)Zeo digerido con NheI/NotI para obtener un vector de expresion de cadena ligera de longitud completa.
Se realizo analisis de secuencia para confirmar la correccion de las construcciones de expresion.
Se realizo transfeccion doble transitoria (Fugene-6, Roche, Alemania o Lipofectamine LTX, Invitrogen) de celulas 293T con vectores de expresion de cadena tanto pesada como ligera para producir anticuerpo monoclonal 5 recombinante. Se realizo una tincion de FACS con el sobrenadante de cultivo resultante (48 horas) en celulas Hep2 infectadas por VSR para mostrar la union funcional del anticuerpo con la protelna F de VSR.
10
Los oligonucleotidos usados para amplificaciones por PCR fueron: regiones VH:
VH1-Dir
VH1B-Dir
VH2A-Dir
VH2B-Dir
VH3-Dir
VH3B-Dir
VH4-Dir
VH5-Dir
VH6- Dir
Cgamma-Inv
5' -AAAT CGATACCACCATGGACTGGACCTGGAGG-3'
5' -AAAT CGATACCACCATGGACTGGACCTGGAGM-3'
5' - AAAT CGATACCACCATGGACACACTTTGCTMCAC-3' 5'-AAATCGATACCACCAT GGACAT ACTTT GTTCCAAC-3' 5'-AAATCGATACCACCAT GGAGTTT GGGCTGAGC-3'
5 '-AAATCGATACCACCATGGARYTKKGRCTBHGC-3'
5'-AAATCGATACCACCATGAAACACCTGTGGTTCTT-3'
5'-AAATCGATACCACCATGGGGTCAACCGCCATC-3'
5'-AAATCGATACCACCATGTCTGTCTCCTTCCTC-3'
5'-GGGTCTAGACAGGCAGCCCAGGGCCGCTGTGC-3'
regiones Vkappa:
Vk1 -Dir 5 ' - AAAT CGATACCACCATGGACATGAGGGTCCCY-3'
Vk1 B-Dir 5' - AAAT CGATACCACCATGGACATGAGRGTCCYY-3'
Vk2-Dir 5 '-AAATCGATACCACCATGAGGCTCCCTGCTCAG-3'
Vk3-Dir 5 '-AAATCGATACCACCATGGAARCCCCAGCGCA-3'
Vk4-Dir 5 '-AAATCGATACCACCATGGTGTTGCAGACCCAG-3'
Ck-Inv 5'-GATCGCGGCCGCTTATCAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT-3'
15 regiones Vlambda:
Vllaecb 5'-AAATCGATACCACCATGGCCTGGTCCCCTCTCCTCC-3'
Vl1g 5'-AAATCGATACCACCATGGCCGGCTTCCCTCTCCTCC-3'
Vl2/10 5'-AAATCGATACCACCATGGCCTGGGCTCTGCTCCTCC-3'
Vl3jpah 5'-AAATCGATACCACCATGGCCTGGACCGCTCTCCTGC-3'
V15/7 5'-AAATCGATACCACCATGGCCTGGACTCCTCTCCTTC-3'
V16/9 5'-AAATCGATACCACCATGGCCTGGGCTCCTCTCCTTC-3'
Vl3rm 5'-AAATCGATACCACCATGGCCTGGATCCCTCTCCTCC-3'
Vl3l 5'-AAATCGATACCACCATGGCCTGGACCCCTCTCTGGC-3'
Vl3e 5'-AAATCGATACCACCATGGCCTGGGCCACACTCCTGC-3'
Vl4c 5'-AAATCGATACCACCATGGCCTGGGTCTCCTTCTACC-3'
Vl8a 5'-AAATCGATACCACCATGGCCTGGATGATGCTTCTCC-3'
C12/7 5'-GATCGCGGCCGCTTATCAWGARCATTCTGYAGGGGCCACTG-3'
Los oligonucleotidos usados para construcciones de vectores de expresion fueron:
20 Vector de expresion de cadena pesada:
VH1-L-NheI:
JH4/5-XhoI:
CHfw-Xhol:
CHrev-Notl:
5'-GCGGCTAGCCACCATGGACTGGACCTGGAGG-3'
5'-GCGCTCGAGACGGTGACCAGGGTTCCCTG-3'
5'-CGCGCTCGAGTGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC-3'
5'-GATCGCGGCCGCTTATCATTTACCCGGRGACAGGGAGAGGC-3'
Vector de expresion de cadena ligera:
25
VK1-L-Nhel: 5'-GCGGCTAGCCACCATGGACATGAGGGTCCCY-3'
CK-Notl: 5'-GATCGCGGCCGCTTATCAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT-3'
RT-PCR de VEB
Para ensayar si la respuesta proliferativa fuerte estaba relacionada con la presencia de VEB, se realizo una RT-PCR 30 de VEB. El procedimiento de RT se ha descrito anteriormente. Las condiciones de PCR fueron las siguientes: una etapa de desnaturalizacion de 7 minutos a 94 °C seguido de 30 ciclos de 30 s a 94 °C, 30 s a 62 °C (HPRT1), 52 °C (LMP-1) y 58 °C (EBNA1/2) y 30 s a 72 °C, y una extension final de 7 minutos a 72 °C. Los oligonucleotidos usados
5
10
15
20
25
30
35
40
para RT-PCR fueron los siguientes: HPRT1 directo (5'-TATGGACAGGACTGAACGTCTTGC-3') y HPRT1 inverso (5'-GACACAAACATGATTCAAATCCCTGA-3'); LMP-1 directo: (5'-GCGACTCTGCTGGAAATGAT-3') y LMP-1 inverso (5'-GACAT GGT AAT GCCT AGAAG-3'); EBNA1/2 directo (5'-AGCAAGAAGAGGAGGTGGTAAG-3') y EBNA1/2 inverso (5'-GGCTCAAAGTGGTCTCTAATGC-3').
Ademas de la RT-PCR se realizo una PCR directamente en sedimento celular y ADN sobrenadante que se aislo usando el kit de aislamiento QIAmp (Qiagen).
EJEMPLO 1
Resultados
Fenotipo de linfocitos B
El uso de linfocitos B de memoria humanos como la plataforma para aislar medicinas terapeuticas se basa en la capacidad para cultivar y ensayar estas celulas durante un periodo de tiempo relativamente largo. Los linfocitos B humanos pueden cultivarse y mantenerse en una situacion de laboratorio sin embargo no el suficiente tiempo para expandir, seleccionar y clonar llneas de linfocitos B individuales frente a un antlgeno de interes. Se desarrollaron tecnicas de inmortalizacion basadas en modificaciones geneticas de linfocitos B humanos. Se estudiaron dianas cadena abajo de STAT5. Entre otras una diana es Bcl-6. Bcl-6 inhibe la diferenciacion de linfocitos B en celulas plasmaticas que se detienen en proliferacion. La sobreexpresion de Bcl-6 mantiene Blimp1 en equilibrio, un factor de transcripcion cuya expresion esta potenciada fuertemente por la estimulacion de linfocitos B con IL-21 (actua mediante STAT3). Blimp1 es necesario para inducir el desarrollo de celulas productoras de Ig (CD20-CD38+) mientras que Bcl-6 puede evitar esto (las celulas mantienen la expresion de CD20, el denominado fenotipo de centro germinal).
Para estudiar el posible sesgado de ciertas poblaciones celulares dentro del compartimento de linfocitos B, el marcaje con CFSE antes de la estimulacion de linfocitos B humanos de memoria y sin tratamiento previo nuevos revelo que todas las celulas comienzan a dividirse y que todas las poblaciones de linfocitos B se transducen igualmente (Figura 2 ). Se muestran linfocitos B de memoria transducidos con Bcl-6 y se cultivan en presencia de IL- 21 e IL-4. Se transdujeron linfocitos B sin tratamiento previo a un nivel menor y las velocidades de division fueron menores a las 36 horas pero fueron identicas a linfocitos B de memoria despues de otros 3 dlas de cultivo (datos no mostrados).
A continuacion se mostro que Bcl-6, junto con Bcl-XL (diana corriente abajo antiapoptotica de STAT5), la senalizacion de CD40L y en presencia de IL-21, mantienen linfocitos B de memoria IgG humanos en el fenotipo CD20+CD38dull durante perlodos de tiempo largos (>3 meses) (Figura 3). Ademas, los linfocitos B Bcl-6 Bcl-XL tienen un fenotipo correspondiente a linfocitos B activados (vease Tabla 1, ejemplificado por tincion con FACS de 3 clones de linfocitos B TT+), ya que estas celulas tienen alta expresion de CD80, CD86 y HLA-DR, determinado en tres clones de linfocitos B Bcl-6 Bcl-XL diferentes cultivados con IL-21 y senalizacion de CD40L.
tincion
resultado tincion resultado
CD2
neg CD69 neg
CD5
neg CD70 pos
CD7
neg CD71 pos
CD10
pos CD73 neg
CD20
pos CD80 pos/alto
CD21
pos CD86 pos
CD22
pos CD95 pos/alto
CD23
neg/5 % pos CD126 neg
CD24
neg CD132 (gamma comun) pos
CD25
pos CD138 neg/2 %pos
CD27
neg/bajo CD154 (CD40L) 8 %pos
CD28
neg ICOSL pos
CD30
pos(56-74 %) IgM neg
CD38
pos/intermedio IgG pos
CD40
pos HLA-DR pos(alto)
CD44
pos Kappa pos/neg
CD45
pos Lambda pos/neg
CD45RA
pos/alto IL21-R pos
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Expresion en membrana de anticuerpos
Las celulas negativas para VEB, transducidas con Bcl-6 Bcl-XL permanecieron positivas para expresion de BCR como se determino por union a antlgeno o tincion con Kappa o Lambda (Figura 3 y 4). Por lo tanto, dichas celulas son particularmente adecuadas para aislar y/o explorar despues de un perlodo de cultivo largo con respecto a una especificidad deseada, por ejemplo usando antlgeno marcado, debido a que dichas celulas se uniran con dicho antlgeno marcado con su BCR. Esto se confirmo mediante clasificacion de celulas individuales de linfocitos B doblemente transducidos con Bcl-6 y Bcl-XL que se unen con TT marcado con PE usando el FACSAria. Despues de tres semanas se tineron clones clasificados para celulas individuales con marcadores apropiados y TT-PE en placas de 96 pocillos y se midieron con respecto a union en el FACS Canto (BD) (Figura 4). En conclusion, en casos en los que se desee la presencia de un receptor de linfocitos B en linfocitos B, tal como por ejemplo en ensayos de exploracion, los linfocitos B se transducen preferentemente con Bcl-6 y Bcl-XL y no se infectan con VEB.
Division celular y curvas de crecimiento
Los linfocitos B transducidos con Bcl-6 Bcl-XL se dividen en promedio 0,6 veces al dla. La velocidad de division varla entre donantes y la densidad celular de los cultivos (Figura 5a). El clon anti VSR D25 tiene una velocidad de division de 0,47 veces al dla (Figura 5b). Las celulas pueden cultivarse a densidades por debajo de 1 celula/96 pocillos para fines de clonacion.
Secrecion de anticuerpos de linfocitos B Bcl-6 Bcl-XL
Los linfocitos B transducidos con Bcl-6 Bcl-XL secretan de promedio un pg/ml de anticuerpos, lo que es suficiente para que crezcan cantidades necesarias para ensayos precllnicos (Figura 6). Sorprendentemente el clon D25 anti VSR produjo tres veces mas anticuerpos en comparacion con las otras llneas celulares ensayadas.
Determinacion del contenido de VEB
RT-PCR de VEB en ARNm de llneas celulares Bcl-6 Bcl-XL que se cultivaron con IL-21 y senalizacion de CD40L. En las llneas celulares obtenidas con esta tecnica de inmortalizacion no se ha detectado nunca un transcrito genico de VEB (datos no mostrados).
Procedimiento de seleccion
Debido a la estabilidad en el crecimiento y expresion del BCR, estas celulas son adecuadas para aislar linfocitos B especlficos de antlgeno. Proporciono a los inventores la oportunidad de usar varios procedimientos de seleccion y clonacion diferentes. Uno es obtener inmediatamente celulas especlficas de antlgeno despues de introduccion de Bcl-6 y Bcl-XL por FACS o clasificacion de perlas magneticas usando antlgeno marcado de interes potenciando de este modo la probabilidad de generar multiples clones de linfocitos B especlficos de antlgeno. Otra opcion es cultivar linfocitos B de memoria transducidos, Bcl-6 Bcl-XL a granel, purificados (o cualquier otro) a densidades celulares bajas (por ejemplo 100 celulas/pocillo). Pueden recogerse sobrenadantes de estos cultivos de 100c/p y ensayarse con respecto a su especificidad. Los cultivos de 100 celulas/pocillo que resultan ser positivos para reconocimiento de antlgenos, se subclonan despues por cultivos de dilucion limitante para obtener llneas celulares monoclonales. Usando ambos metodos se pudieron aislar mas de 40 clones de linfocitos B que reconoclan toxoide del tetanos (TT). Por tanto estos clones se seleccionaron con union de TT con el BCR en el FACSAria o se seleccionaron por exploracion de ELISA de una serie de cultivos hasta que se aislo la llnea celular monoclonal anti TT individual (no mostrado).
Seleccion de anticuerpos neutralizantes de VSR
A partir del donante B63, 25 cultivos de 100 celulas/pocillo bloquearon completamente la infeccion y replicacion de VSR. D10, uno de los cultivos de 100 celulas/pocillo neutralizantes produjo un fuerte anticuerpo anti-VSR que se clono por cultivo en dilucion limitante. Uno de los anticuerpos monoclonales, D25 se uso para continuar los estudios. D25, un anticuerpo monoclonal con una cadena pesada de IgG1, como se determino por ELISA comercial (Sanquin, Amsterdam, no mostrado) y una cadena ligera Kappa (Figura 7), bloqueo muy eficazmente la infeccion por VSR con un valor de CI50 de entre 0,5 y 1,5 ng/ml (± 10 pM) mientras que la CI50 del anticuerpo anti-VSR convencional usado en la cllnica (palivizumab desarrollado por MedImmune) es de 0,453 mg/ml (3,02 nM) (H. Wu et al. 2005 J.Mol.Biol. y A. Mejias et al. 2005 Antimicrob. Agents Chemother.) (Figura 8).
Reconocimiento de antlgenos
Ademas de los experimentos de neutralization, se determino la union de D25 con celulas HEp2 infectadas por VSR. Se infectaron celulas HEp2 usando el protocolo de production de virus regular. Las celulas HEp2 infectadas con VSR se tripsinizaron y se incubaron con 25-50 ml de sobrenadante de cultivo. Las celulas se lavaron y se tineron con IgG-PE de raton anti-humano (BD o Jackson) para detectar la union del anticuerpo D25 con las celulas infectadas.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Se uso el anticuerpo de control de ELISA r-Biopharm como un control interno. Se muestra en la figura 9a la union de D25 con celulas HEp2 infectadas por VSR intactas.
Ya que la protelna de envoltura (membrana) del VSR existe de dos protelnas, concretamente la protelna G y F, la union de D25 se ensayo frente a celulas infectadas con el virus VSR pseudotipado sin protelna o con la protelna F de VSR o G de VSR (amablemente proporcionadas por John K Rose). Como se muestra en la figura 9b, D25 se unio fuertemente a celulas EL-4 infectadas con la protelna F de VSV. En un intento de estudiar el epltopo reconocido por D25 frente a palivizumab, se incubaron celulas EL-4 infectadas con protelna F de VSV con cantidades crecientes de D25 o palivizumab. Las celulas se lavaron y se tineron con una mezcla de 3 anticuerpos anti-F-VSR de raton (Dako). A diferencia de Palivizumab que mostro competicion por la union con celulas VSV-F infectadas con el anticuerpo de raton anti-F-VSR, la union de D25 no se vio afectada (datos no mostrados).
La Figura 9c muestra la union de Palivizumab (Synagis) y D25 de una manera dependiente de la concentracion con celulas HEp2 infectadas. Ya que ambos anticuerpos se unen 1 a 1 con su protelna diana no hay diferencia en la union con celulas HEp2 infectadas.
Frecuencia de union a antlgeno de VSR frente a controles neutralizantes
Se calculo que la frecuencia de linfocitos B de memoria especlficos de antlgeno que se unen con VSR era del 17 % y la frecuencia de celulas especlficas de antlgeno que neutralizaron VSR era del 6 %, como se determino para el donante B63. D25 se une con un epltopo conformacional que es diferente del epltopo reconocido por palivizumab. Esto se ilustra en la figura 10 en la que D25 no se une con epltopos lineales desnaturalizados presentados por lisado celular infectado por VSR lisado aplicado en placas de ELISA mientras que palivizumab si se une a protelna desnaturalizada (F).
Aislamiento y purificacion de fragmentos de anticuerpo
A partir de varias llneas de linfocitos B incluyendo el clon altamente neutralizante de VSR D25 los inventores fueron capaces de cultivar volumenes de hasta 500 ml. Estos sobrenadantes de cultivo contienen al menos 2 ml/ml, por lo tanto los inventores deberlan ser capaces de obtener suficiente anticuerpo purificado para realizar estudios pre- cllnicos (animales). La purificacion se realiza usando Kit de Purificacion de Antlgeno de Montaje (Millipore, Billerica, MA, Estados Unidos) y columnas HiTrap de Protelna A HP (GE Healthcare, Diegem, Belgica).
Ademas, se transfectaron celulas 293T con la cadena pesada y ligera de D25 que se subclono en vectores de expresion de protelnas pCDA3.1 usando lipofectamine LTX (Invitrogen). La cantidad de IgG que estaba presente en el sobrenadante era de aproximadamente 22 mg/ml (volumen total 50 ml). Este anticuerpo derivado de la secuencia de nucleotidos clonada del anticuerpo expresado por la llnea de linfocitos B D25 reconocio tambien celulas de HEp2 infectadas (datos no mostrados).
Secuencia de anticuerpos
La Figura 11a muestra la secuencia de nucleotidos y aminoacidos de cadena pesada y ligera del clon B63D10-D25. Usando RT-PCR convencional y cebadores especlficos de anticuerpo, se determinaron las secuencias de cadena pesada (Vh1-69) y ligera (Vkl O8/018). La secuencia de anticuerpos completa se clono usando vectores TOPO y despues de control de secuencia, se subclonaron en el vector de expresion de protelnas de mamlferos pCDNA3.1 (Invitrogen). Las Figuras 11b y 11c representan la cadena VH y VL4 del clon, Astricks indica mutaciones comparadas con la secuencia de llnea germinal del Vh1-69 que deben haber sucedido durante la maduracion de afinidad y seleccion de linfocitos B adicional.
Resumiendo, se muestra aqul el aislamiento, la caracterizacion y el cultivo a largo plazo de linfocitos B de memoria humana usando los transgenes Bcl-6 y Bcl-XL. Proporcionan la herramienta necesaria para aislar anticuerpos con propiedades unicas, como el anticuerpo monoclonal anti-VSR B63D10-B25. Ya que los linfocitos B son de origen humano, pueden utilizarse facilmente como una medicina terapeutica.
EJEMPLO 2
Las cadenas pesada y ligera de D25 se clonaron en vectores de expresion convencionales como se ha descrito anteriormente (“secuencia de anticuerpo” p44). Para crear una construccion de expresion que permite una expresion de protelna maxima las secuencias de cadena pesada y ligera D25 se optimizaron con respecto a sus codones por GENEART (Regensburg, Alemania). En este procedimiento se crearon sitios de restriccion adicionales para simplificar los procedimientos de clonacion futuros pero lo que es mas importante los codones de nucleotidos que se traducen a secuencias de aminoacidos se optimizaron para traduccion maxima a protelna. Por lo tanto la secuencia de nucleotidos se optimizo pero la secuencia de aminoacidos permanecio sin cambios. Se muestra en el EJEMPLO 4 la capacidad neutralizante de D25 derivado de sobrenadante de linfocitos B purificado, D25 recombinante y D25 optimizado por GENEART. Todos neutralizan eficazmente VSR.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Las modificaciones de GENEART en comparacion con la secuencia de D25 original se representan en la Figura 12. EJEMPLO 3
A continuacion de los experimentos de neutralizacion de VSR in vitro se ensayo el anticuerpo monoclonal D25 en modelos in vivo. Los modelos que se han descrito para ensayos anti-VSR in vivo son ratones BALB/c y ratas algodoneras (Sigmodon hispidus) (Mejias A et al., Antimicrobial Agents and chemotherapy 2004; p1811, Johnson S et al., JID 1997; p1215 y Wu H et al., JMB 2007: p652). El modelo de raton BALB/c es claramente el modelo mas debil pero ya que las ratas algodoneras son diflciles de obtener y mantener, se establecieron en primer lugar ensayos de D25 en ratones BALB/c.
Protocolo: anticuerpos especlficos de VSR en BALB/c, Dla 5 Diseno experimental:
Dla -1. Inyeccion I.P. de 100 ml de anticuerpos
Dla 0. Infeccion I.N: de 1x107 ufp de VSR A2 en 50 ml
Dias 1 a 5, comprobacion de bienestar general y pesado de los ratones
Dla 5, autopsia, recogida de BAL, sangre y pulmones
Extraccion de sangre mediante puncion venosa
Recogida de 2,0 ml de BAL mediante canula traqueal
Recogida de los pulmones
Comenzar inmediatamente DICT50 en material de BAL (1 ml)
Congelar 1 ml de material de BAL (ELISA de citocina/RT-PCR) -80 °C Realizar DICT50 en material largo preparado (1 ml)
Congelar 1 ml de material largo (ELISA de citocina/RT-PCR) -80 °C Recoger/centrifugar sangre para ELISA de hIgG en suero en almacenamiento a -80 °C
Los resultados se muestran en la Figura 13:
(A) Un dla antes de la exposicion a VSR (1x107 partlculas de VSR-A2) por pulverizacion nasal, se inyecto IP a los animales diferentes cantidades de Synagis (MedImmune), D25 purificado o un anticuerpo de control IgG1 (Eureka) (Tabla 3). (Figura 13B) Los niveles de IgG humanos se determinaron en sueros de ratones desde el dla 5 y el descenso en los niveles de anticuerpo en suero en 5 dlas; la Tabla 4 muestra una vision de conjunto de los valores de semividas. La Figura 13D representa tltulos de virus hallados en lavados pulmonares (BAL) el dla 5 en animales tratados y no tratados mientras que la figura 13E representa numeros de linfocitos T y B en sangre periferica de ratones tratados y no tratados. La Figura 13F muestra la histologla de los pulmones con bronquios e infiltracion de (normalmente principalmente eosinofilos) animales no tratados y tratados.
Conclusion/resultados:
Una estimacion de la semivida de D25 es de 5 a 9 dlas basandose en el calculo (lineal) de que se inyectaron 60 y 30 mg de anticuerpo el dla 0 (2 y 1 mg/kg respectivamente) y el dla 5 se detectaron 33 o 16 mg (volumen total de ratones 1,5). Cuando se inicio con inyeccion de 0,5 mg/kg por animal el d0 entonces los niveles de Ig descendieron desde 15 mg a 11 mg el dla 5, lo que indicarla una semivida de 9 dlas (Tabla 4).
Tabla 4
mg/kg total administrado d0 (mg) detectado el d5 (mg) semivida (dlas)
2
0 60 33 5,6
1
0 30 16 5,4
0
5 15 11 9,4
El tltulo del virus como determino el ensayo de DICT50 muestra que en animales de control pueden detectarse 1x104 UFP mientras que no se detecto virus en los animales tratados con Synagis (2 mg/kg) o D25 (2, 1 y 0,5 mg/kg).
Los animales tratados con Synagis o D25 mantuvieron mayor % de linfocitos T CD4 perifericos y linfocitos B B220. Los animales tratados con Synagis (2 mg/kg) tienen menor % de linfocitos T CD4 en comparacion con animales tratados con D25. Aunque esto puede no ser significativo es importante observar que los animales tratados con una dosis baja de D25 (1 y 0,5 mg/kg) mantienen altos niveles de linfocitos B y T en comparacion con animales tratados con control.
Aunque los datos de histologla (figura 13F) no son cuantitativos esta claro que Synagis y D25 reducen el flujo de entrada de celulas inmunitarias en los pulmones y en torno a los bronquios en comparacion con el control. Cuando
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
se comparan D25 y Synagis, entonces los animales tratados con D25 parecen tener menos infiltracion celular a los pulmones y alrededor de los bronquios.
Para ensayar D25 en las ratas algodoneras, se preparan experimentos para comparar animales pretratados con Synagis y D25 antes de la exposicion con el virus VSR-X en el NVI (Bilthoven, Palses Bajos).
EJEMPLO 4
Ademas de B63-D10-D25, se aislaron tres nuevos anticuerpos neutralizantes de VSR potentes (AM14, AM16 y AM23) del mismo donante (B63). Se descongelaron 100 celulas por pocillo de cultivos de linfocitos B a granel que se seleccionaron originalmente para neutralizacion de VSR y se congelaron y almacenaron en nitrogeno llquido, y se ensayo el sobrenadante de cultivo con respecto a union con celulas HEp2 infectadas por VSR. Se ensayo con respecto a union con celulas Hep2 infectadas ya que ese es un marcador para reconocimiento de anticuerpos de protelnas de membrana de VSR nativas, oligomericas, como protelna F y G y puede actuar como un buen predictor de neutralizacion. Cuando se detecto union, las celulas se cultivaron en celulas individuales y se exploraron con respecto a union para obtener clones. Los tres anticuerpos se clonaron en el vector de GENEARt que se construyo originalmente para D25. Ademas como D25 todos reconocen la protelna F de VSR (no mostrado). Despues de clonacion y expresion en celulas 293T se purifico protelna recombinante (las secuencias de nucleotidos y aminoacidos se representan en la figura 14A, B y C). Los anticuerpos se ensayaron con respecto a neutralizacion frente a varios aislados de VSR primarios en celulas Vero y Hep2 (Figura 15). Los tres anticuerpos son del isotipo IgG1. AM14 tiene una cadena ligera Kappa, mientras que AM16 y AM23 tienen una cadena ligera Lambda. Los tres anticuerpos, como D25, contienen hipermutaciones somaticas en sus dominios variables de anticuerpo lo que sugiere que han experimento in vivo maduracion de afinidad durante una reaccion de centro germinal, un proceso que crea secuencias de anticuerpos unicas.
Los resultados se muestran en las Figuras 15-I y 15-II: ensayo de neutralizacion de virus RS con D25 derivado de sobrenadante de llnea de linfocitos B purificada (sD25), d25 purificado recombinante (rD25), D25 con codones optimizados por GENEART recombinante (rD25 GA), AM14, AM16, AM23 (todos protelnas recombinantes purificadas) y Synagis. Se ensayo la neutralizacion por anticuerpos de virus en dos llneas celulares diferentes (Figura 15-I) Vero y (Figura 15-II) celulas Hep2 con diferentes anticuerpos: A2 (A), X (B) y 2006/1 (C) son VSR de subtipo A mientras que el virus Z (D) y 2007-2 (E) son subtipo B. Se anadio 100DICT50 de cada virus a diluciones de anticuerpos en serie en DMEM/FCS 1 % y se incubo durante 1 hora a 37 grados antes de anadirse 100 ml de celulas Vero o Hep2 (1x106/ml). La mezcla de anticuerpos del virus no se retiro por lavado. Despues de tres dlas se retiro el sobrenadante y las celulas se fijaron con acetona al 80 % durante 10 minutos a TA. Despues de la retirada de la acetona, la capa celular fija se seco y se mantuvo a 4 °C o se congelo a -20 °C. Para tenir celulas HEp2 infectadas por VSR, las placas se bloquearon en primer lugar con leche en polvo al 5 % en PBS Tween 20 0,1 %, despues las placas se lavaron 3 veces antes de incubarse durante 3-5 horas a 37 °C con anti-VSR-HRP de cabra policlonal (1:500, Biodesign, Saco, ME, Estados Unidos) y se lavo exhaustivamente. Posteriormente todos los pocillos se incubaron con sustrato de AEC durante 30 minutos a TA. Los focos infectados se tinen de rojo y pueden observarse a la vista usando un microscopio optico y pueden contarse.
Resultado/conclusion
Todos los anticuerpos neutralizan las cepas de VSR A y B (Tabla 5). En general los diferentes anticuerpos D25 neutralizan los virus VSR eficazmente, aunque pueden verse variaciones entre experimentos menores. AM14 es tan potente como D25 mientras que AM16 es tan potente como Synagis. AM23 sin embargo neutraliza las cepas de VSR A de forma muy eficaz, mientras que es menos potente en la neutralizacion de cepas de VSR B, aunque aun es comparable con Synagis.
Tabla 5 Valores de CI50 (ng/ml)
Llnea celular usada
Subtipo de VSR sD25 rD25 rD25 GA AM14 AM16 AM23
Vero
A 3,4 1,6 3,2 15,2 304,3 19,4
Vero
B 9,0 0,3 1,2 1,1 126,4 168,8
HEp2
A 3,3 2,1 5,3 21,5 285,6 25,0
HEp2
B 14,3 1,9 1,3 6,7 124,8 190,7
El valor de CI50 para cada anticuerpo en el virus de RS subtipo A en celulas Vero o HEp2 se calculo como el
promedio de neutralizacion al 50 % en tres cepas de virus (A2, X y 2006-1). El valor de CI50 para cada anticuerpo
en virus de RS de subtipo B en celulas Vero o HEp2 se calculo como el promedio de neutralizacion al 50 % en dos
cepas de virus (2007-2 y Z). Cada uno de los ensayos de neutralizacion se realizo por triplicado y se repitio dos
veces (tambien mostrado en la figura 15A y B).
sD25 = sobrenadante de cultivo derivado de linfocitos B purificado
rD25 = D25 recombinante purificado
rD25 GA = sobrenadante de celulas 293T con D25 recombinante con codones optimizados por GENEART________
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
EJEMPLO 5
Efectos sinergicos y de bloqueo de anticuerpos anti-VSR.
Para analizar si D25, Synagis o el nuevo conjunto de anticuerpos AM interfieren entre si para el reconocimiento de la proteina F de VSR, se pre-incubaron celulas HEp2 infectadas por VSR con concentraciones crecientes de anticuerpos no marcados hasta que alcanzaron la meseta de union maxima. Se determino para cada anticuerpo la fase de meseta en la que no se detecto aumento de la union cuando se aumento la cantidad de Ig (no mostrado). Despues de lavar, las muestras se incubaron con una dosis convencional (3 pmol) de D25 marcado con PE o Synagis marcado con APC. Esta dosis proporciona tambien union maxima.
Resultado
Como se muestra en la Figura 16 Synagis y D25 marcado muestran una union reducida con celulas HEp2 infectadas por VSR, cuando estas celulas se pre-incubaron con Synagis o D25 no marcado. Synagis muestra ademas una ligera reduccion de la union inducida por AM16. La union de D25 esta bloqueada fuertemente por AM23 pero por el contrario la union de D25 esta fuertemente potenciada despues de pre-incubacion con AM14. Eso indica que el epitopo reconocido por D25 normalmente no esta siquiera completamente expuesto sino que la exposicion se potencia despues de la union de AM14 con su epitopo nativo. Eso demuestra que estos dos anticuerpos pueden trabajar juntos y potenciar la neutralizacion.
Breve descripcion de los dibujos
Figura 1.
Aislamiento de linfocitos B de memoria, humanos, positivos para IgG. Se incubaron PBMC aisladas de capa leucocitica usando separacion de densidad de Ficoll (Amersham) con perlas magneticas anti-CD22 antes de aislarse usando columnas MACS (Miltenyi). Se incubaron despues celulas positivas para CD22 con anticuerpos contra CD19, CD27, IgM, IgD e IgA humanos (BD). Se clasificaron celulas negativas para IgM, IgD e IgA y positivas para CD19 y CD27 usando clasificacion de celulas individuales de alta velocidad (FACSAria, BD).
Figura 2
Tincion con CFSE. Se aislaron linfocitos B de memoria humanos nuevos, se marcaron con CSFE y se estimularon durante 36 h con IL-21 antes de transducirse con Bcl-6-IRES-NGFR. Las celulas se mantuvieron durante 3 dias adicionales en IL-21 antes de determinarse el contenido de CFSE. El colorante de CFSE se diluye con cada division celular.
Figura 3
Un ejemplo de linfocitos B humanos transducidos con Bcl-6 y Bcl-XL o Bcl-XL solamente. Las celulas se mantuvieron con celulas L irradiadas que expresaban CD40L y la citocina IL-21. Se muestra a la izquierda la expresion de BCR como se determina por tincion kappa y lambda (93 % de las celulas positivas para kappa lambda son del isotipo IgG, no mostrado). A la derecha se muestra la expresion de CD38 en los ejes X y la expresion de CD20 en los ejes Y. La tincion de CD38dullCD20+ indica linfocitos B de centro germinal o de memoria; la tincion CD38+CD20- indica plasmablastos.
Figura 4
Aislamiento de linfocitos B humanos inmortalizados, especificos de antigeno. Se aislaron linfocitos B de memoria humanos como se describe en la figura 1 y se transdujeron posteriormente con Bcl-6-IRES-NGFR y Bcl-XL- IRES-GFP. Se aislaron celulas que expresaban nGfR, GFP y se unieron con Toxina del Tetanos marcada con PE usando el FACSAria. Las celulas se cultivaron por celulas individuales en placas de fondo plano de 96 pocillos en presencia de celulas L irradiadas e IL-21 antes de seleccionarse basandose en union de TT-PE usando el FACS Canto (BD).
Figura 5
Velocidad de crecimiento y division celular acumulativa de clones de linfocitos B 6XL. Se cultivaron linfocitos B de (A) dos clones anti-TT (B) y un clon anti-VSR (B63D10-D25) en presencia de IL-21 y celulas L irradiadas.
Figura 6
Se iniciaron cultivos nuevos con 200.000 celulas/24 pocillos en 1,0 ml de IMDM con FCS 8 % y pen/strep. El FCS usado fue normal (HyClone) o FCS IgG Bovino Ultrabajo (Gibco). Despues de 3 dias el sobrenadante de cultivo se reemplazo y los numeros de celulas se ajustaron a 200.000 celulas/ml. Se muestra el promedio de produccion de IgG en 3 dias medido en 3 puntos temporales consecutivos. La diferencia no fue significativa (p valor 0,2).
Figura 7
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Para determinar el fenotipo de cadena ligera del clon D25 anti-VSR, se tino la ilnea de linfocitos B D25 con anticuerpos de kappa-ficoeritrina o lambda-ficoeritrina (BD). Solamente los anticuerpos de kappa-ficoeritrina se unieron con la llnea celular, lo que muestra que este anticuerpo tiene una cadena ligera kappa.
Figura 8
A partir del donante B63, se cultivaron cultivos de 100 celulas/pocillo usando linfocitos B de memoria humanos positivos para Bcl-6 Bcl-XL. Uno de esos cultivos, D10 mostro fuerte neutralizacion. Se prepararon llneas celulares monoclonales derivadas de LD, un D25 neutralizo el virus VSR A-2 eficazmente. Se muestra aqul D25 en comparacion con palivizumab (synagis) y anti-VSR policlonal de cabra. No se muestran sobrenadantes de cultivo relevantes de clones de linfocitos B transducidos con Bcl6 Bcl-XL cultivados con IL-21 y senalizacion de CD40L que producen altos niveles de anticuerpos pero no bloquean la infeccion por VSR. El clon D25 se uso para caracterizacion adicional.
Figura 9
En la figura 9a: se sembraron celulas HEp2 a 10-12x106 celulas por matraz T175 (Nunc) en IMDM/FCS al 5 %. Al dla siguiente el medio se reemplazo con 5 ml de medio con virus VSR (1,0 MOI) y se incubo durante 45 minutos a TA antes de anadir 20 ml de medio nuevo y las celulas se cultivaron durante una noche a 37 °C. Al dla siguiente el medio se reemplazo con IMDM/FCS al 1 % y se cultivo durante una noche con una tapa cerrada a 37 °C. Al dla siguiente las celulas se lavaron con PBS y se trataron con tripsina. Para tenir celulas infectadas se realizo la incubacion primaria con sobrenadante de cultivo. La incubacion secundaria se realizo con IgG-PE anti-humano (BD). Las celulas se analizaron usando el LSRII (BD). Como control positivo se uso el control positivo del KIT de ELISA comercial de r-Biopharm.
En la figura 9b: se infectaron celulas EL-4 con virus VSV pseudotipado con protelna F o G de VSR (amablemente proporcionada por John Rose) y se incubo con sobrenadante de cultivo D25. Las celulas se lavaron y se incubaron con IgG-PE anti-humano (Jackson) para detectar la union de D25 con las celulas infectadas. Solamente se detecto union de D25 con las celulas infectadas por el virus VSV pseudotipadas con la protelna F de VSR. La figura 9c muestra la union de Palivizumab (Synagis) y D25 de una manera dependiente de la concentracion con celulas HEp2 infectadas. Se muestra la intensidad de fluorescencia media (IFM).
Figura 10
Union de anti-VSR de cabra policlonal (control positivo), palivizumab (synagis) y D25 con lisado de celulas HEp2 infectadas recubiertas.
Figura 11
Analisis de secuencia del clon D25. 11a muestra la secuencia de nucleotidos y de aminoacidos predicha de los dominios de cadena pesada y ligera variables. 11b/c muestran la secuencia de cadena pesada y ligera de D25 en comparacion con la llnea germinal predicha. Los asteriscos indican mutaciones que se producen probablemente durante la seleccion y maduracion de afinidad del clon de linfocitos B in vivo.
Figura 12
Clonacion y expresion de anticuerpos humanos recombinantes de llneas de linfocitos B transducidas con BCL6 BCL-xL. Esto ya se ha descrito para el anticuerpo D25 (Figura 11). Se representan aqul las modificaciones de nucleotidos de GENEART en comparacion con la secuencia de D25 original, observese que estas mutaciones no cambian la composicion de aminoacidos del anticuerpo D25.
Figura 13
Exposition de ratones BALB/c con D25 y Synagis derivados de sobrenadante de linfocitos B, purificados. (A) Un dla antes de la exposicion a VSR (1x107 partlculas de VSR-A2) por pulverization nasal, se inyecto IP a los animales diferentes cantidades de Synagis (MedImmune), D25 purificado o un anticuerpo de control IgG1 (Eureka) (tabla 3). (B) los niveles de IgG humanos se determinaron en sueros de ratones desde el dla 5 y el descenso en los niveles del anticuerpo en suero en 5 dlas (C); la tabla 4 muestra una vision de conjunto de los valores de semivida. La figura 13D representa tltulos de virus hallados en lavados pulmonares (BAL) el dla 5 en animales tratados y no tratados mientras que la figura 13E representa los numeros de linfocitos T y B en sangre periferica de ratones tratados y no tratados. (F) muestra la histologla de los pulmones con bronquios e infiltration de (normalmente principalmente eosinofilos) animales tratados y no tratados.
Figura 14
Secuencias de nucleotidos y aminoacidos de tres nuevos anticuerpos neutralizantes de VSR potentes (A) AM14, (B) AM16 y (C) AM23.
Figura 15
Ensayo de neutralizacion de virus de SR con D25 derivado de sobrenadante de llnea de linfocitos B purificado (D25), D25 purificado recombinante (rD25), D25 con codones optimizados por GENEART recombinante (rD25 GA), AM14, AM16, AM23 (todos protelnas purificadas recombinantes) y Synagis. Se ensayo la neutralizacion de anticuerpos de virus en dos llneas celulares diferentes (figura 15-I) Vero y (figura 15-II) celulas HEp2 con diferentes anticuerpos A2 (A), X (B) y 2006/1 (C) son VSR de subtipo A mientras que el virus Z (D) 2007-2 (e) son
5
10
15
20
25
30
35
40
45
subtipo B. Se anadio 100DICT50 de cada virus a diluciones de anticuerpos en serie en DMEM/FCS al 1 % y se incubaron durante 1 hora a 37 grados antes de anadirse 100 ml de celulas Vero o HEp2 (1x106/ml).
Figura 16
Union relativa de una cantidad fija (3 pmol) de Synagis marcado con APC y rD25 marcado con PE a celulas HEp2 infectadas por VSR que se pre-incubaron con concentraciones crecientes de los anticuerpos no marcados indicados.
Referencias
Banchereau, J., de Paoli, P., Valle, A., Garcia, E., Rousset, F., (1991). Long term human B cell lines dependent on interleukin-4 and antibody to CD40, Science 251, 70-2.
Boise, L. H., M. Gonzalez-Garcia, C. E. Postema, L. Ding, T. Lindsten, L. A. Turka, X. Mao, G. Nunez, y C. B. Thompson. (1993). Bcl-x, a bcl-2-related gene that functions as a dominant regulator of apoptotic cell death. Cell 74:597.
Dadgostar, H., Zarnegar, B., Hoffmann, A., Qin, X. F., Truong, U., Rao, G., Baltimore, D., y Cheng, G. (2002). Cooperation of multiple signaling pathways in CD40-regulated gene expression in B lymphocytes. Proc.Natl.Acad.Sci USA 99, 1497-1502.
Heemskerk et al, 1997: J.Exp.Med. Vol 186, paginas 1597-1602 Heemskerk et al, 1999: Cell Immunol. Vol 195, paginas 10-17 Kinsella y Nolan, 1996: Hum. Gene Ther. Vol 7 paginas 1405-1413
Malisan, F., Briere, F., Bridon, J.M., Harindranath, N., Mills, F. C., Max, E. E., Banchereau, J., Martinez-Valdez, H. (1996). Interleukin-10 induces immunoglobulin G isotype switch recombination in human CD40-activated naive B lymphocytes, J.Exp.Med. 183, 937-47.
Mathas S, Janz M, Hummel F, Hummel M, Wollert-Wulf B, Lusatis S, Anagnostopoulos I, Lietz A, Sigvardsson M, Jundt F, Johrens K, Bommert K, Stein H, Dorken B (2006). Intrinsic inhibition of transcription factor E2A by HLH proteins ABF-1 and Id2 mediates reprogramming of neoplastic B cells in Hodgkin lymphoma. Nat Immunol. 7, 207215.
Mejias A et al., Antimicrobial Agents and chemotherapy 2004; p1811, Johnson S et al., JID 1997; p1215 Wu H et al., JMB 2007: p652
Shvarts A. et al, 2002: Genes Dev. Vol 16, paginas 681-686
Traggiai, E., Becker, S., Subbarao, K., Kolesnikova, L., Uematsu, Y., Gismondo, M.R., Murphy, B.R., Rappuoli, R., Lanzavecchia, A. (2004). An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nature Medicine Volume 10, n.° 8, 871-875.
Ye, B. H., Cattoretti, G., Shen, Q., Zhang, J., Hawe, N., de Waard, R., Leung, C., Nouri-Shirazi, M., Orazi, A., Chaganti, R. S., et al. (1997). The BCL-6 proto-oncogene controls germinal-centre formation and Th2-type inflammation. Nat Genet 16, 161-170.

Claims (11)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    REIVINDICACIONES
    1. Un anticuerpo aislado o parte funcional del mismo que es capaz de unirse especlficamente con el antlgeno F del virus sincitial respiratorio (VSR), y en el que el anticuerpo o parte funcional del mismo comprende:
    a. una region determinante de complementariedad (CDR) 1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos NYIIN (SEQ ID NO: 1), una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos GIIPVLGTVHYAPKFQG (SEQ ID NO: 2), una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos ETALVVSTTYLPHYFDN (SeQ ID NO: 3), una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos QASQDIVNYLN (SEQ ID NO: 4), una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos VASNLET (SEQ ID NO: 5), y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos QQYDNLP (SEQ ID NO: 6); o
    b. una CDR 1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos GFSFSHYA (SEQ ID NO: 73), una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos ISYDGENT (SEQ ID NO: 74), una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos ARDRIVDDYYYYGMDV (SEQ ID NO: 75), una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos QDIKKY (SEQ ID NO: 76), una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos DAS y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos QQYDNLPPLT (SEQ ID NO: 77); o
    c. una CDR 1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos GFTFSSYN (SEQ ID NO: 80), una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos ISAGSSYI (SEQ ID NO: 81), una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos AREDYGPGNYYSPNWFDP (SEQ ID NO: 82), una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos SSNIGAGYD (SEQ ID NO: 83), una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos GNT y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos HSYDRSLSG (SEQ ID NO: 84); o
    d. una CDR 1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos GFNFHNYG (SEQ ID NO: 87), una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos VWYDGSKK (SEQ ID NO: 88), una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos VRDKVGPTPYFDS (SEQ ID NO: 89), una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos NIGSET (SEQ ID NO: 90), una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos DDD, y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos QVWDRSNYHQV (SEQ ID NO: 91).
  2. 2. El anticuerpo o parte funcional del mismo de la reivindicacion 1, en el que el anticuerpo comprende una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoacidos QVQLVQSGAEVKKPGSSVMVSCQASGGPLRNYIINWLRQAPGQGPEWMGGIIPVLG
    TVHYAPKFQGRVTITADESTDTAYIHLISLRSEDTAMYYCATETA LVVSTTYLPHYFDN WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 7) y/o una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoacidos DIQMTQSPSSLSAAVGDRVTITCQASQDIVNYLNWYQQKPGKAPKLLIYVASNLETG VPSRFSGSGSGTDFSLTISSLQPEDVATYYCQQYDNLPLTFGGGT KVEIKRTV (SEQ ID NO: 8).
  3. 3. El anticuerpo o parte funcional del mismo de la reivindicacion 1, en el que la parte funcional del mismo es un anticuerpo de un unico dominio, un anticuerpo monocatenario, un fragmento variable monocatenario (scFv), un fragmento Fab o un fragmento F(ab')2.
  4. 4. Un acido nucleico aislado que codifica el anticuerpo o parte funcional del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
  5. 5. La secuencia de acido nucleico aislada de la reivindicacion 4, en la que la secuencia de acido nucleico comprende secuencias de nucleotidos de cadena pesada y ligera seleccionadas del grupo que consiste en:
    (i) SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10;
    (ii) SEQ ID NO: 139 y SEQ ID NO: 141; y
    (iii) SEQ ID NO: 140 y SEQ ID NO: 142.
  6. 6. Una celula que expresa la secuencia de acido nucleico de la reivindicacion 4 o 5.
  7. 7. Un metodo para producir un anticuerpo o una parte funcional del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, comprendiendo los metodos cultivar en la celula de la reivindicacion 6 in vitro, y obtener anticuerpos o partes funcionales de los mismos producidos por las celulas.
  8. 8. Una composicion que comprende el anticuerpo o parte funcional de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, y un vehlculo, diluyente y/o excipiente farmaceuticamente aceptable.
  9. 9. El anticuerpo o una parte funcional de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o la composicion de la reivindicacion 8, o la secuencia de acido nucleico de la reivindicacion 4 o 5 para uso en el tratamiento o prevencion de un trastorno relacionado con VSR, o para prevenir o contrarrestar los efectos adversos de una infeccion por VSR en un sujeto humano.
  10. 10. Uso del anticuerpo o una parte funcional de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o la composicion de la reivindicacion 8, o la secuencia de acido nucleico de la reivindicacion 4 o 5 en la preparacion de un medicamento para tratar o prevenir un trastorno relacionado con VSR, o prevenir o contrarrestar los efectos adversos de una infeccion por VSR en un sujeto humano.
    5
  11. 11. El anticuerpo o una parte funcional, composicion o la secuencia de acido nucleico de la reivindicacion 9 para uso de la reivindicacion 9, o el uso de la reivindicacion 10, en el que el sujeto humano tiene una enfermedad pulmonar cronica, enfermedad cardlaca congenita o inmunidad comprometida, o el sujeto humano es un nino de menos de 6 semanas de edad o un sujeto anciano, opcionalmente en el que el anticuerpo o parte funcional del mismo se formula
    10 para la administration a una dosificacion de 0,1 a 10 mg/kg del peso corporal del sujeto humano.
ES08766756.4T 2007-06-01 2008-05-30 Moléculas de unión específicas de VSR y medios para producirlas Active ES2575129T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP07109472 2007-06-01
EP07109472A EP1997830A1 (en) 2007-06-01 2007-06-01 RSV specific binding molecules and means for producing them
PCT/NL2008/050333 WO2008147196A2 (en) 2007-06-01 2008-05-30 Rsv-specific binding molecules and means for producing them

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2575129T3 true ES2575129T3 (es) 2016-06-24

Family

ID=38578633

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES08766756.4T Active ES2575129T3 (es) 2007-06-01 2008-05-30 Moléculas de unión específicas de VSR y medios para producirlas

Country Status (23)

Country Link
US (5) US8562996B2 (es)
EP (3) EP1997830A1 (es)
JP (4) JP5450395B2 (es)
KR (2) KR101599556B1 (es)
CN (2) CN104961825A (es)
AU (1) AU2008257801B8 (es)
BR (1) BRPI0812878C1 (es)
CA (2) CA2689290C (es)
CY (1) CY1117767T1 (es)
DK (1) DK2170952T3 (es)
ES (1) ES2575129T3 (es)
HK (1) HK1146073A1 (es)
HR (1) HRP20160632T1 (es)
HU (1) HUE029225T2 (es)
IL (1) IL202288A (es)
MX (2) MX2009012843A (es)
NZ (3) NZ621824A (es)
PL (1) PL2170952T3 (es)
PT (1) PT2170952E (es)
RU (2) RU2628095C2 (es)
SI (1) SI2170952T1 (es)
WO (1) WO2008147196A2 (es)
ZA (1) ZA200908320B (es)

Families Citing this family (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT1355919E (pt) 2000-12-12 2011-03-02 Medimmune Llc Moléculas com semivida longa, composições que as contêm e suas utilizações
CA2633157C (en) 2005-12-09 2018-10-09 Academisch Medisch Centrum Bij De Universiteit Van Amsterdam Means and methods for influencing the stability of antibody producing cells
WO2007067032A1 (en) 2005-12-09 2007-06-14 Academisch Medisch Cemtrum Bij De Universiteit Van Amsterdam Means and methods for influencing the stability of cells
EP1997830A1 (en) 2007-06-01 2008-12-03 AIMM Therapeutics B.V. RSV specific binding molecules and means for producing them
WO2009042589A1 (en) * 2007-09-24 2009-04-02 Vanderbilt University Monoclonal antibodies to respiratory syncytial virus and uses thereof
WO2010068722A1 (en) 2008-12-12 2010-06-17 Medimmune, Llc Crystals and structure of a human igg fc variant with enhanced fcrn binding
AU2015200208B2 (en) * 2009-07-15 2016-10-20 Kling Biotherapeutics B.V. Means and methods for producing high affinity antibodies
EP2454283B1 (en) * 2009-07-15 2018-03-14 AIMM Therapeutics B.V. Means and methods for producing high affinity antibodies
US8568726B2 (en) 2009-10-06 2013-10-29 Medimmune Limited RSV specific binding molecule
KR101789343B1 (ko) * 2009-10-06 2017-10-23 메드임뮨 리미티드 Ｒｓｖ-특이적 결합 분자
CN104628850B (zh) * 2009-10-06 2020-07-28 医学免疫有限公司 Rsv-特异性结合分子
NZ603488A (en) * 2010-07-09 2015-02-27 Crucell Holland Bv Anti-human respiratory syncytial virus (rsv) antibodies and methods of use
NZ611600A (en) * 2010-12-02 2015-02-27 Aimm Therapeutics Bv Means and methods for producing high affinity antibodies
EP3628689A1 (en) 2010-12-17 2020-04-01 Neurimmune Holding AG Human anti-sod1 antibodies
US9475862B2 (en) * 2011-11-07 2016-10-25 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing GP41 antibodies and their use
WO2013095091A2 (en) 2011-11-17 2013-06-27 Aimm Therapeutics B.V. Rsv g protein specific antibodies
BR112014023063A2 (pt) * 2012-03-20 2017-07-18 Corti Davide anticorpos que neutralizam rsv, mpv e pvm e usos dos mesmos
US10017739B2 (en) 2012-09-06 2018-07-10 Duke University Methods of expanding and assessing B cells and using expanded B cells to treat disease
PL2950886T3 (pl) 2013-02-01 2020-06-01 Medimmune, Llc Epitopy białka F syncytialnego wirusa oddechowego
US9738689B2 (en) 2013-03-13 2017-08-22 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Prefusion RSV F proteins and their use
RU2761631C2 (ru) 2013-03-13 2021-12-13 Дзе Юнайтед Стэйтс Оф Америка, Эс Репрезентед Бай Дзе Секретэри, Департмент Оф Хелт Энд Хьюман Сервисиз Белки rsv в предшествующей слиянию конформации и их применение
TWI659968B (zh) 2013-03-14 2019-05-21 再生元醫藥公司 針對呼吸道融合病毒ｆ蛋白質的人類抗體及其使用方法
US9060975B2 (en) 2013-03-14 2015-06-23 Mucosis Bv Heat-stable respiratory syncytial virus F protein oligomers and their use in immunological compositions
AU2014231357B2 (en) * 2013-03-15 2018-06-14 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Epitope of RSV fusion protein and antibody identifying same
WO2015010792A1 (en) * 2013-07-24 2015-01-29 Humabs Biomed Sa Antibodies that potently neutralize rsv and uses thereof
WO2015037992A1 (en) 2013-09-11 2015-03-19 Aimm Therapeutics B.V. Parechovirus specific antibodies
EP3572425A1 (en) 2013-12-17 2019-11-27 AIMM Therapeutics B.V. Means and methods for counteracting myeloproliferative or lymphoproliferative disorders
EP3741390A1 (en) 2014-01-15 2020-11-25 Medlmmune, LLC Rsv-specific antibodies and functional parts thereof
DK3099709T3 (da) 2014-01-31 2020-02-03 Aimm Therapeutics Bv Midler og fremgangsmåder til fremstilling af stabile antistoffer
EP2974739A1 (en) 2014-07-15 2016-01-20 Novartis AG RSVF trimerization domains
US9340604B1 (en) * 2014-10-29 2016-05-17 Aridis Pharmaceuticals, Inc. Human monoclonal antibody specific for the F protein of respiratory syncytial virus (RSV)
JP5996707B2 (ja) * 2015-04-15 2016-09-21 メディミューン リミテド Ｒｓｖ特異的結合分子
EP3124042A1 (en) 2015-07-28 2017-02-01 VIB, vzw Immunoglobulin single variable domain antibody against rsv prefusion f protein
MX2017016590A (es) 2015-06-18 2018-11-09 Vib Vzw Dominios variables simples de inmunoglobulina contra proteina f de rsv.
AU2016281424B2 (en) 2015-06-24 2020-12-24 Kling Biotherapeutics B.V. AML antigens and uses thereof
KR20230074843A (ko) 2015-08-19 2023-05-31 화이자 인코포레이티드 조직 인자 경로 억제제 항체 및 그의 용도
JO3555B1 (ar) 2015-10-29 2020-07-05 Merck Sharp & Dohme جسم مضاد يبطل فعالية فيروس الالتهاب الرئوي البشري
RU2723039C2 (ru) 2015-12-23 2020-06-08 Пфайзер Инк. Мутанты белка f rsv
EP3436064A1 (en) 2016-03-29 2019-02-06 The U.S.A. As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Substitutions-modified prefusion rsv f proteins and their use
IL293585B2 (en) 2016-10-21 2023-11-01 Adimab Llc Respiratory syncytial virus antibodies and methods for their production and use
JP2020503843A (ja) 2016-10-21 2020-02-06 アディマブ， エルエルシー 抗呼吸器合胞体ウイルス抗体、及び、それらの生成及び使用の方法
US11479600B2 (en) 2016-10-21 2022-10-25 Adimab, Llc Anti-respiratory syncytial virus antibodies, and methods of their generation and use
WO2018109220A2 (en) 2016-12-16 2018-06-21 Institute For Research In Biomedicine Novel recombinant prefusion rsv f proteins and uses thereof
TW202228779A (zh) 2017-03-01 2022-08-01 英商梅迪繆思有限公司 抗rsv單株抗體配製物
JP2021511356A (ja) 2018-01-29 2021-05-06 メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーションＭｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ． 安定化ｒｓｖ ｆタンパク質およびその使用
WO2019178521A1 (en) 2018-03-16 2019-09-19 University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Compositions and methods for vaccination against respiratory syncitial virus infection
EP3773708A2 (en) 2018-04-03 2021-02-17 Sanofi Antigenic epstein barr virus polypeptides
CN112512564A (zh) 2018-04-03 2021-03-16 赛诺菲 铁蛋白蛋白
CN112512567A (zh) 2018-04-03 2021-03-16 赛诺菲 抗原性呼吸道合胞病毒多肽
US20220195016A1 (en) * 2019-04-18 2022-06-23 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Biological and synthetic molecules inhibiting respiratory syncytial virus infection
JP2022060169A (ja) 2020-10-02 2022-04-14 ファイザー・インク Ｒｓｖ ｆタンパク質生産のための細胞培養工程
WO2024069420A2 (en) 2022-09-29 2024-04-04 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising an rsv f protein trimer
WO2024089633A1 (en) 2022-10-27 2024-05-02 Pfizer Inc. Rna molecules encoding rsv-f and vaccines containing them
WO2024089634A1 (en) 2022-10-27 2024-05-02 Pfizer Inc. Immunogenic compositions against influenza and rsv

Family Cites Families (161)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0043272B1 (en) * 1980-07-01 1984-06-13 National Research Development Corporation Production of viral antigens
DE3235924T1 (de) * 1981-03-06 1983-05-05 Celltech Ltd., Slough, Berkshire Monoklonaler antikoerper
US4526934A (en) * 1982-03-19 1985-07-02 Bridgestone Tire Company Limited Branched styrene-butadiene copolymers and pneumatic tires using the same
ATE37983T1 (de) 1982-04-22 1988-11-15 Ici Plc Mittel mit verzoegerter freigabe.
US5340926A (en) * 1983-03-25 1994-08-23 Celltech, Limited Process for the recovery of recombinantly produced protein from insoluble aggregate
JPS60100516A (ja) * 1983-11-04 1985-06-04 Takeda Chem Ind Ltd 徐放型マイクロカプセルの製造法
US5332805A (en) * 1984-02-03 1994-07-26 Celltech Limited Process for the recovery of recombinantly produced chymosin from insoluble aggregate
US5128326A (en) * 1984-12-06 1992-07-07 Biomatrix, Inc. Drug delivery systems based on hyaluronans derivatives thereof and their salts and methods of producing same
FR2590674B1 (fr) * 1985-11-25 1989-03-03 Inst Nat Sante Rech Med Nouveaux reactifs de diagnostic
US5149650A (en) * 1986-01-14 1992-09-22 University Of North Carolina At Chapel Hill Vaccines for human respiratory virus
US4717766A (en) * 1986-01-27 1988-01-05 Miles Laboratories, Inc. Method of preparing high titer anti-respiratory syncytial virus intravenous immune globulin
US4659563A (en) * 1986-01-27 1987-04-21 Miles Laboratories, Inc. High titer anti-respiratory syncytial virus intravenous immune globulin
US5271927A (en) 1986-02-13 1993-12-21 Celltech Limited Antibody conjugates with macrocyclic ligands
US5468606A (en) 1989-09-18 1995-11-21 Biostar, Inc. Devices for detection of an analyte based upon light interference
AU600575B2 (en) * 1987-03-18 1990-08-16 Sb2, Inc. Altered antibodies
US4800078A (en) 1987-05-28 1989-01-24 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Immunotherapeutic method of treating respiratory disease by intranasal administration of Igb
GB8719041D0 (en) * 1987-08-12 1987-09-16 Parker D Conjugate compounds
GB8720833D0 (en) * 1987-09-04 1987-10-14 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5223254A (en) * 1987-09-29 1993-06-29 Praxis Biologics, Inc. Respiratory syncytial virus: vaccines
ATE85622T1 (de) * 1987-12-23 1993-02-15 Upjohn Co Chimarenglykoproteine, enthaltend immunogene segmente des humanen respiratorischen synzytialvirus.
JP3095168B2 (ja) 1988-02-05 2000-10-03 エル． モリソン，シェリー ドメイン‐変性不変部を有する抗体
US5183657A (en) * 1988-03-11 1993-02-02 Celltech Limited Antibodies for use in antilymphocyte antibody therapy
JPH01268646A (ja) 1988-04-20 1989-10-26 Meiji Milk Prod Co Ltd 抗腫瘍剤
US5137804A (en) * 1988-05-10 1992-08-11 E. I. Du Pont De Nemours And Company Assay device and immunoassay
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
AU634186B2 (en) 1988-11-11 1993-02-18 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5354554A (en) 1989-02-10 1994-10-11 Celltech Limited Crosslinked antibodies and processes for their preparation
US6093872A (en) 1989-05-05 2000-07-25 Systemix, Inc. Extended human hematopoiesis in a heterologous host
FR2650598B1 (fr) 1989-08-03 1994-06-03 Rhone Poulenc Sante Derives de l'albumine a fonction therapeutique
US5332567A (en) * 1989-08-24 1994-07-26 Immunomedics Detection and treatment of infections with immunoconjugates
US5518725A (en) * 1989-09-25 1996-05-21 University Of Utah Research Foundation Vaccine compositions and method for induction of mucosal immune response via systemic vaccination
AU6430190A (en) 1989-10-10 1991-05-16 Pitman-Moore, Inc. Sustained release composition for macromolecular proteins
EP0550436A1 (en) 1989-11-06 1993-07-14 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Protein microspheres and methods of using them
GB8928874D0 (en) * 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5279935A (en) * 1990-03-01 1994-01-18 Becton, Dickinson And Company Method of immunossay including deactivation of endogenous alkaline phosphatase
ES2090332T3 (es) * 1990-05-03 1996-10-16 Systemix Inc Tejido linfoide humano en un hospedador inmunocomprometido.
GB9020282D0 (en) 1990-09-17 1990-10-31 Gorman Scott D Altered antibodies and their preparation
ES2113428T3 (es) * 1991-04-22 1998-05-01 Massachusetts Health Res Proceso de tamizado de muestras de plasma para determinar titulos de anticuerpos efectivos contra los virus respiratorios.
JPH06507404A (ja) * 1991-05-01 1994-08-25 ヘンリー　エム．ジャクソン　ファウンデイション　フォー　ザ　アドバンスメント　オブ　ミリタリー　メディスン 感染性の呼吸性疾患の治療方法
CA2044940A1 (en) 1991-06-10 1992-12-11 Inder M. Verma Transdominant negative proto-oncogene
WO1993005796A1 (en) 1991-09-19 1993-04-01 The Scripps Research Institute Method for producing human antibodies in a non-human animal, and animals therefor
US5240694A (en) * 1991-09-23 1993-08-31 University Of Virginia Combined antiviral and antimediator treatment of common colds
US5418136A (en) * 1991-10-01 1995-05-23 Biostar, Inc. Devices for detection of an analyte based upon light interference
EP0614530B1 (en) * 1991-11-15 1998-03-04 Cornell Research Foundation, Inc. Indirect immunoassay for dioxinlike compounds
US5824307A (en) 1991-12-23 1998-10-20 Medimmune, Inc. Human-murine chimeric antibodies against respiratory syncytial virus
US20020102257A1 (en) * 1998-09-21 2002-08-01 Leslie Sid Johnson Human-murine chimeric antibodies against respiratory syncytial virus
US5667988A (en) * 1992-01-27 1997-09-16 The Scripps Research Institute Methods for producing antibody libraries using universal or randomized immunoglobulin light chains
FR2686901A1 (fr) 1992-01-31 1993-08-06 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides antithrombotiques, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
US5912015A (en) * 1992-03-12 1999-06-15 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Modulated release from biocompatible polymers
WO1993019197A1 (en) 1992-03-20 1993-09-30 Immunet Human monoclonal antibodies and methods for human monoclonal antibody production
GB9207479D0 (en) 1992-04-06 1992-05-20 Scotgen Ltd Novel antibodies for treatment and prevention of respiratory syncytial virus infection in animals and man
CA2144043C (en) * 1992-09-16 2005-01-18 Dennis R. Burton Human neutralizing monoclonal antibodies to respiratory syncytial virus
US6685942B1 (en) * 1993-12-10 2004-02-03 The Scripps Research Institute Human neutralizing monoclonal antibodies to respiratory syncytial virus
CA2153661A1 (en) * 1993-01-12 1994-07-21 Anthony George Gristina Methods and compositions for the direct concentrated delivery of passive immunity
US5934272A (en) * 1993-01-29 1999-08-10 Aradigm Corporation Device and method of creating aerosolized mist of respiratory drug
US5424189A (en) * 1993-03-05 1995-06-13 Kansas State University Research Foundation Bovine respiratory syncytial virus detection and primers
AU676340B2 (en) 1993-05-25 1997-03-06 Wyeth Holdings Corporation Adjuvants for vaccines against respiratory syncytial virus
EP0714409A1 (en) 1993-06-16 1996-06-05 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
CA2167835A1 (en) 1993-07-30 1995-02-09 Richard A. Weltzin Monoclonal iga antibody against respiratory syncytial virus
US5506209A (en) * 1994-05-26 1996-04-09 Abbott Laboratories Product for inhibition of infection of mammalian cells by respiratory syncytial virus
US5538952A (en) * 1994-05-26 1996-07-23 Abbott Laboratories Inhibition of infection of mammalian cells by respiratory syncytial virus
US5538733A (en) * 1994-07-07 1996-07-23 Willmar Poultry Company, Inc. Method of priming an immune response in a one-day old animal
US5792456A (en) 1994-08-04 1998-08-11 Bristol-Myers Squibb Company Mutant BR96 antibodies reactive with human carcinomas
US5786464C1 (en) 1994-09-19 2012-04-24 Gen Hospital Corp Overexpression of mammalian and viral proteins
ATE252894T1 (de) 1995-01-05 2003-11-15 Univ Michigan Oberflächen-modifizierte nanopartikel und verfahren für ihre herstellung und verwendung
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6019968A (en) * 1995-04-14 2000-02-01 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use
US5811524A (en) * 1995-06-07 1998-09-22 Idec Pharmaceuticals Corporation Neutralizing high affinity human monoclonal antibodies specific to RSV F-protein and methods for their manufacture and therapeutic use thereof
CA2230494A1 (en) * 1995-08-31 1997-03-06 Alkermes Controlled Therapeutics Inc. Composition for sustained release of an agent
WO1997010846A1 (en) * 1995-09-18 1997-03-27 Intracel Corporation Neutralizing monoclonal antibodies to respiratory syncytial virus
ATE508733T1 (de) 1996-03-04 2011-05-15 Penn State Res Found Materialien und verfahren zur steigerung der zellulären internalisierung
EP0904107B1 (en) 1996-03-18 2004-10-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
US5874064A (en) 1996-05-24 1999-02-23 Massachusetts Institute Of Technology Aerodynamically light particles for pulmonary drug delivery
US5985309A (en) 1996-05-24 1999-11-16 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of particles for inhalation
US5855913A (en) * 1997-01-16 1999-01-05 Massachusetts Instite Of Technology Particles incorporating surfactants for pulmonary drug delivery
US6114148C1 (en) 1996-09-20 2012-05-01 Gen Hospital Corp High level expression of proteins
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
FR2758331B1 (fr) 1997-01-14 1999-03-05 Univ Bourgogne Nouveaux moyens pour le diagnostic, la prevention et le traitement vis-a-vis de contaminations ou d'infections par des virus a tropisme muqueux
ES2236832T3 (es) 1997-01-16 2005-07-16 Massachusetts Institute Of Technology Preparacion de particulas para inhalacion.
US6590079B2 (en) 1997-01-30 2003-07-08 Ixsys, Incorporated Anti-αvβ3 recombinant human antibodies, nucleic acids encoding same
EP0971696B1 (en) 1997-02-06 2010-06-09 Merck Sharp & Dohme Corp. Thimerosal-free preservatives for vaccines
US6117980A (en) 1997-02-21 2000-09-12 Genentech, Inc. Humanized anti-IL-8 monoclonal antibodies
US6277375B1 (en) * 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US5989463A (en) 1997-09-24 1999-11-23 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Methods for fabricating polymer-based controlled release devices
SE512663C2 (sv) 1997-10-23 2000-04-17 Biogram Ab Inkapslingsförfarande för aktiv substans i en bionedbrytbar polymer
DE69833459T2 (de) 1997-12-01 2006-08-17 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Antikörper, sowie fv moleküle, und immunkonjugate mit hoher bindungsaffinität für mesothelin und methoden für deren verwendung
US6194551B1 (en) * 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
ES2532910T3 (es) 1998-04-02 2015-04-01 Genentech, Inc. Variantes de anticuerpos y fragmentos de los mismos
US6528624B1 (en) * 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
AU747231B2 (en) 1998-06-24 2002-05-09 Alkermes, Inc. Large porous particles emitted from an inhaler
US6572856B1 (en) * 1998-09-10 2003-06-03 The University Of Virginia Patent Foundation Methods for the prevention and treatment of cancer using anti-C3b(i) antibodies
ATE384792T1 (de) 1998-11-18 2008-02-15 Genentech Inc Antikörpervarianten mit höheren bindungsaffinitäten im vergleich zu parentalen antikörpern
US7553487B2 (en) * 1998-12-14 2009-06-30 Genetics Institute, Llc Method and compositions for treating asthma
US6737056B1 (en) * 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
ES2694002T3 (es) 1999-01-15 2018-12-17 Genentech, Inc. Polipéptido que comprende una región Fc de IgG1 humana variante
AR022952A1 (es) 1999-03-19 2002-09-04 Smithkline Beecham Corp ANTICUERPO MONOCLONAL DE ROEDOR ESPECIFICAMENTE NEUTRALIZANTE PARA LA INTERLEUQUINA-18 HUMANA , UN FRAGMENTO FAB NEUTRALIZANTE o FRAGMENTO F(AB')2, UNA REGION DE COMPLEMENTARIEDAD DE CADENA LIGERA DE INMONOGLOBULINA(CDR), UNA MOLECULA DE ACIDO NUCLEICO, COMPOSICION FARMACEUTICA QUE LO COMPRENDE, EL
US7090973B1 (en) * 1999-04-09 2006-08-15 Oscient Pharmaceuticals Corporation Nucleic acid sequences relating to Bacteroides fragilis for diagnostics and therapeutics
CO5280147A1 (es) * 1999-05-18 2003-05-30 Smithkline Beecham Corp Anticuerpo humano monoclonal
DK1180123T3 (da) 1999-05-27 2008-10-13 Us Gov Health & Human Serv Immunkonjugater, der har höj bindingsaffinitet
JP4992068B2 (ja) 2000-01-27 2012-08-08 メディミューン，エルエルシー 超高親和性中和抗体
US7229619B1 (en) * 2000-11-28 2007-06-12 Medimmune, Inc. Methods of administering/dosing anti-RSV antibodies for prophylaxis and treatment
WO2002043660A2 (en) 2000-11-28 2002-06-06 Mediummune, Inc Methods of administering/dosing anti-rsv antibodies for prophylaxis and treatment
US20010034062A1 (en) 2000-02-09 2001-10-25 Scott Koenig Antibody gene therapy with adeno-associated viral vectors
JP5179689B2 (ja) 2000-02-11 2013-04-10 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 抗体ベース融合タンパク質の循環系内半減期の増強
EP2341075A1 (en) 2000-03-01 2011-07-06 MedImmune, LLC Antibodies binding to the f protein of a respiratory syncytial virus (rsv)
WO2001064248A1 (en) * 2000-03-02 2001-09-07 Medimmune, Inc. Methods of enhancing activity of vaccines and vaccine compositions
AU2001266557A1 (en) 2000-04-12 2001-10-23 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
EP1272526A4 (en) * 2000-04-13 2004-10-13 Univ Rockefeller REINFORCING ANTIBODY-IMMUNE RESPONSE
ES2338098T3 (es) * 2000-05-03 2010-05-04 Medimmune, Llc Terapia de combinacion de enfermedades respiratorias usando anticuerpos y agentes antiinflamatorios.
EP1278545A1 (en) * 2000-05-03 2003-01-29 Medimmune, Inc. Combination therapy of respiratory diseases using antibodies
ES2244515T3 (es) * 2000-05-03 2005-12-16 Ipv Inheidener Produktions- Und Vertriebsgesellschaft Mbh Contenedor termico.
AU2001263443A1 (en) * 2000-05-25 2001-12-03 Med Immune, Inc. F-protein epitope-based vaccine for respiratory syncytial virus infection
EP1336410A4 (en) 2000-08-04 2005-10-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd PROTEIN INJECTION PREPARATIONS
US6565888B1 (en) * 2000-08-23 2003-05-20 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Methods and compositions for the targeted delivery of biologically active agents
JP2004529610A (ja) * 2000-10-13 2004-09-30 ユーエイビー リサーチ ファンデーション ヒト抗上皮増殖因子受容体一本鎖抗体
US7179900B2 (en) * 2000-11-28 2007-02-20 Medimmune, Inc. Methods of administering/dosing anti-RSV antibodies for prophylaxis and treatment
US6855493B2 (en) * 2000-11-28 2005-02-15 Medimmune, Inc. Methods of administering/dosing anti-RSV antibodies for prophylaxis and treatment
US6818216B2 (en) * 2000-11-28 2004-11-16 Medimmune, Inc. Anti-RSV antibodies
PT1355919E (pt) * 2000-12-12 2011-03-02 Medimmune Llc Moléculas com semivida longa, composições que as contêm e suas utilizações
US7658921B2 (en) * 2000-12-12 2010-02-09 Medimmune, Llc Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
ATE484522T1 (de) * 2001-04-24 2010-10-15 Bayer Corp Menschliche antikörper gegen timp-1
AR039067A1 (es) * 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
EP1458855B1 (en) * 2001-12-18 2012-04-25 Cancer Research Technology Limited Method for the generation of proliferating and differentiating cell lines
US6911321B2 (en) 2001-12-19 2005-06-28 Genentech, Inc. Non-human primate Fc receptors and methods of use
US20040002587A1 (en) * 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
MXPA04009418A (es) 2002-03-29 2005-06-08 Schering Corp Anticuerpos monoclonales humanos par interleucina-5, y metodos y composiciones que comprenden los mismos.
AU2003240822A1 (en) * 2002-05-30 2003-12-19 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that specifically bind to neurokinin b
US7425618B2 (en) * 2002-06-14 2008-09-16 Medimmune, Inc. Stabilized anti-respiratory syncytial virus (RSV) antibody formulations
US7132100B2 (en) 2002-06-14 2006-11-07 Medimmune, Inc. Stabilized liquid anti-RSV antibody formulations
AU2003251791B2 (en) 2002-07-03 2009-07-23 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions, methods and kits relating to anti-platelet autoantibodies and inhibitors thereof
JP2005533861A (ja) 2002-07-25 2005-11-10 メデュームン，インコーポレーテッド 抗ＲＳＶ、抗ｈＭＰＶ、および抗ＰＩＶ抗体を使用するＲＳＶ、ｈＭＰＶ、およびＰＩＶの治療法と予防法
DK1534335T4 (en) 2002-08-14 2015-10-05 Macrogenics Inc FCGAMMARIIB-SPECIFIC ANTIBODIES AND PROCEDURES FOR USE THEREOF
KR100960560B1 (ko) 2002-09-27 2010-06-03 젠코어 인코포레이티드 최적화된 Ｆｃ 변이체 및 그의 제조 방법
AU2003282667A1 (en) 2002-10-03 2004-04-23 Large Scale Biology Corporation Multimeric protein engineering
SI1562972T1 (sl) 2002-10-15 2010-12-31 Facet Biotech Corp ALTERACIJA FcRn VEZANIH AFINITET ALI SERUMSKIH RAZPOLOVNIH DOB ANTITELESC Z MUTAGENEZO
AU2003295411A1 (en) 2002-11-07 2004-06-03 Celltech R & D Human monoclonal antibodies to heparanase
US7696334B1 (en) * 2002-12-05 2010-04-13 Rosetta Genomics, Ltd. Bioinformatically detectable human herpesvirus 5 regulatory gene
GB0306618D0 (en) 2003-03-22 2003-04-30 Univ Newcastle Antibody
AU2005214988A1 (en) 2004-02-17 2005-09-01 Absalus, Inc. Super-humanized antibodies against respiratory syncytial virus
US7700720B2 (en) * 2004-09-21 2010-04-20 Medimmune, Llc Antibodies against and methods for producing vaccines for respiratory syncytial virus
US20060083741A1 (en) 2004-10-08 2006-04-20 Hoffman Rebecca S Treatment of respiratory syncytial virus (RSV) infection
WO2006050166A2 (en) * 2004-10-29 2006-05-11 Medimmune, Inc. Methods of preventing and treating rsv infections and related conditions
US7423128B2 (en) * 2004-11-03 2008-09-09 Amgen Fremont Inc. Anti-properdin antibodies, and methods for making and using same
EP1824886B1 (en) 2004-11-17 2010-12-22 Amgen Inc. Fully human monoclonal antibodies to il-13
AU2005318171B2 (en) 2004-12-20 2011-09-29 Crucell Holland B.V. Binding molecules capable of neutralizing West Nile virus and uses thereof
RU2394839C2 (ru) 2004-12-21 2010-07-20 Астразенека Аб Антитела против ангиопоэтина-2 и их применение
JP2008539241A (ja) 2005-04-25 2008-11-13 ファイザー インコーポレイティッド ミオスタチンに対する抗体
KR20080025174A (ko) 2005-06-23 2008-03-19 메디뮨 인코포레이티드 응집 및 단편화 프로파일이 최적화된 항체 제제
CA2633157C (en) * 2005-12-09 2018-10-09 Academisch Medisch Centrum Bij De Universiteit Van Amsterdam Means and methods for influencing the stability of antibody producing cells
AR056857A1 (es) * 2005-12-30 2007-10-24 U3 Pharma Ag Anticuerpos dirigidos hacia her-3 (receptor del factor de crecimiento epidérmico humano-3) y sus usos
EP1997830A1 (en) 2007-06-01 2008-12-03 AIMM Therapeutics B.V. RSV specific binding molecules and means for producing them
KR20100049568A (ko) 2007-06-26 2010-05-12 메디뮨 엘엘씨 Ｒｓｖ 감염 및 관련 병증의 치료 방법
MX2010002044A (es) 2007-09-07 2010-03-18 Symphogen As Metodos para produccion recombinante de anticuerpos anti-virus sincitial respiratorio (anti-rsv).
WO2009114815A1 (en) 2008-03-13 2009-09-17 Dyax Corp Libraries of genetic packages comprising novel hc cdr3 designs
KR101789343B1 (ko) 2009-10-06 2017-10-23 메드임뮨 리미티드 Ｒｓｖ-특이적 결합 분자
US8568726B2 (en) * 2009-10-06 2013-10-29 Medimmune Limited RSV specific binding molecule
PL2950886T3 (pl) 2013-02-01 2020-06-01 Medimmune, Llc Epitopy białka F syncytialnego wirusa oddechowego
EP3741390A1 (en) 2014-01-15 2020-11-25 Medlmmune, LLC Rsv-specific antibodies and functional parts thereof

Also Published As

Publication number Publication date
WO2008147196A2 (en) 2008-12-04
US9321831B2 (en) 2016-04-26
BRPI0812878C1 (pt) 2021-05-25
BRPI0812878A2 (pt) 2015-03-31
AU2008257801B2 (en) 2014-08-14
US8562996B2 (en) 2013-10-22
EP2170952B1 (en) 2016-03-09
US20180327484A1 (en) 2018-11-15
KR101599556B1 (ko) 2016-03-04
MX350375B (es) 2017-09-05
US20140377279A9 (en) 2014-12-25
NZ581512A (en) 2012-10-26
JP2018196380A (ja) 2018-12-13
JP5450395B2 (ja) 2014-03-26
EP1997830A1 (en) 2008-12-03
US20200325213A1 (en) 2020-10-15
JP2017019836A (ja) 2017-01-26
PL2170952T3 (pl) 2016-10-31
US20100239593A1 (en) 2010-09-23
US20140072575A1 (en) 2014-03-13
BRPI0812878B8 (pt) 2020-04-22
CA2689290C (en) 2017-01-17
CA2689290A1 (en) 2008-12-04
RU2628095C2 (ru) 2017-08-14
AU2008257801B8 (en) 2014-09-11
IL202288A0 (en) 2010-06-16
CN101778866B (zh) 2014-11-26
CN101778866A (zh) 2010-07-14
CY1117767T1 (el) 2017-05-17
KR101652652B1 (ko) 2016-08-30
NZ712667A (en) 2017-01-27
CN104961825A (zh) 2015-10-07
KR20150036796A (ko) 2015-04-07
KR20100028592A (ko) 2010-03-12
RU2014125126A (ru) 2015-09-20
EP2578600A3 (en) 2013-07-31
US10730931B2 (en) 2020-08-04
SI2170952T1 (sl) 2016-08-31
RU2009148886A (ru) 2011-07-20
US20160244509A1 (en) 2016-08-25
ZA200908320B (en) 2010-08-25
MX2009012843A (es) 2010-04-21
HUE029225T2 (en) 2017-02-28
JP2014079251A (ja) 2014-05-08
HRP20160632T1 (hr) 2016-07-15
WO2008147196A3 (en) 2009-02-05
HK1146073A1 (en) 2011-05-13
CA2950515A1 (en) 2008-12-04
US10059757B2 (en) 2018-08-28
BRPI0812878B1 (pt) 2020-01-21
JP2010528601A (ja) 2010-08-26
EP2578600A2 (en) 2013-04-10
AU2008257801A1 (en) 2008-12-04
IL202288A (en) 2016-10-31
EP2170952A2 (en) 2010-04-07
AU2008257801A8 (en) 2014-09-11
PT2170952E (pt) 2016-06-16
RU2527067C2 (ru) 2014-08-27
DK2170952T3 (en) 2016-06-20
NZ621824A (en) 2016-02-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2575129T3 (es) Moléculas de unión específicas de VSR y medios para producirlas
US20210277094A9 (en) Rsv-specific binding molecule
ES2444465T3 (es) Medios y procedimientos para influenciar la estabilidad de las células productoras de anticuerpos
AU2014262169B2 (en) Rsv-specific binding molecules and means for producing them
Lukens et al. Human antibodies specific for the RSV F prefusion protein are prevalent in vivoand efficiently reduce respiratory tract infection by RSV