ES2444465T3

ES2444465T3 - Medios y procedimientos para influenciar la estabilidad de las células productoras de anticuerpos

Info

Publication number: ES2444465T3
Application number: ES06824300T
Authority: ES
Inventors: Hergen Spits; Ferenc Alexander Scheeren; Tim Beaumont; Sean Andrew Diehl
Original assignee: AIMM Therapeutics BV; Academisch Medisch Centrum Bij de Universiteit van Amsterdam; Academisch Medisch Centrum
Current assignee: AIMM Therapeutics BV; Academisch Medisch Centrum Bij de Universiteit van Amsterdam; Academisch Medisch Centrum
Priority date: 2005-12-09
Filing date: 2006-12-08
Publication date: 2014-02-25
Anticipated expiration: 2026-12-08
Also published as: FI1974017T4; PT2540820T; EP3327117A1; JP5753339B2; BR122021001906B1; WO2007067046A1; BRPI0619579A2; HUE037580T2; PT1974017E; CA3015416A1; US10273454B2; AU2014202709B2; BRPI0619579B1; AU2006323315A1; NZ600075A; EP1974017B1; NZ592159A; AU2006323315B2; EP1974017B2; DK2540820T3

Abstract

Un procedimiento para aumentar el ciclo de vida de replicación de una célula productora de anticuerpos, quecomprende aumentar o mantener la cantidad del producto de expresión BCL6 y Blimp-1 en comparación con unlinfocito B de memoria o un linfocito B no expuesto previamente dentro de dicha célula productora de anticuerpos - proporcionar dicha célula productora de anticuerpos con un compuesto capaz de potenciar la expresión deBCL6 y/o cultivar dicha célula productora de anticuerpos en presencia de un compuesto capaz de potenciar laexpresión de BCL6, y - proporcionar dicha célula productora de anticuerpos con un compuesto capaz de aumentar la expresión deBlimp-1 y/o cultivar dicha célula productora de anticuerpos en presencia de un compuesto capaz de incrementarla expresión de Blimp-1.

Description

Medios y procedimientos para influenciar la estabilidad de las células productoras de anticuerpos

La invención se refiere al campo de la biología celular.

Los cultivos celulares ex vivo son importantes herramientas en las actuales aplicaciones biológicas y médicas. Una importante aplicación es cultivar las células productoras de anticuerpos con el fin de cosechar anticuerpos, preferentemente anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales (AcMo) representan múltiples copias idénticas de una única molécula de anticuerpo cuyas copias se unen a los antígenos con la misma afinidad y estimulan las mismas funciones efectoras. Entre los beneficios de los AcMo está su especificidad por el mismo epítopo en un antígeno. Esta especificidad confiere determinadas ventajas clínicas en los AcMo en más tratamientos convencionales al tiempo que ofrece a los pacientes una opción terapéutica eficaz y bien tolerada con efectos secundarios generalmente bajos. Además, los mass son útiles para investigación biológica y médica.

La capacidad proliferativa de la mayoría de las células primarias en cultivo está limitada por la inducción de senescencia. Este estado de parada del crecimiento irreversible se caracteriza por la expresión de una serie de marcadores asociados con la senescencia, tales como la beta-galactosidasa asociada con la senescencia, el inhibidor del activador del plasminógeno 1 (PAI= 1), p19ARF, p53, p21CIP1 y p16INK4A. Con el fin de proporcionar una línea celular proliferante, las células a menudo se unen a células cancerosas con el fin de producir células de hibridoma. Las células de hibridoma resultantes son capaces de dividirse indefinidamente y de crecer bien en los cultivos celulares. Los hibridomas individuales con una característica deseada se pueden seleccionar para un fin dado.

Con el fin de obtener directamente anticuerpos monoclonales humanos con una especificidad deseada, sería inconveniente aislar un linfocito B capaz de producir dicho anticuerpo y cultivar el linfocito B ex vivo. No obstante, la tecnología de los hibridomas con linfocitos B humanos no ha tenido éxito porque los hibridomas resultantes son inestables. Se han realizado muchos intentos para cultivar ex vivo linfocitos B. Está bien documentado que los linfocitos B humanos no expuestos previamente y de memoria se pueden cultivar durante un periodo de tiempo limitado tras el engarce de CD40 en presencia de citocinas, incluidas IL-2, IL-4 e IL-10 (Banchereau et al., 1991) y se cree que este sistema imita la respuesta in vivo de los linfocitos B frente los linfocitos T colaboradores que expresan CD40L al antígeno afín. En ausencia de unión a CD40, la IL-10 sola o combinada con IL-2 induce diferenciación en células productoras de anticuerpos (Malisan et al., 1996). Los mecanismos de regulación de la supervivencia y la proliferación de los linfocitos B maduros cultivados en estas condiciones solo se conocen parcialmente.

La interacción de CD40 sobre los linfocitos B tiene múltiples efectos, incluida la protección contra la apoptosis, la inhibición (parcial) de la diferenciación y la inducción de la respuesta de los linfocitos B a las citocinas. La expresión de un gran número de inhibidores del ciclo celular disminuyó mediante la interacción de CD40, incluidos Rb-1 y Rb-2 (Dadgostar et al., 2002) y es probable que la regulación por disminución de dichos genes libere a los linfocitos B en reposo de la quiescencia. Aunque la activación de CD40 conduce a una breve respuesta proliferativa, las citocinas son un instrumento a la hora de mantener la progresión del ciclo celular de los linfocitos B activados. La IL-2 y la IL-4 son las citocinas más eficaces que estimulan una continua progresión del ciclo celular de CD40 o de linfocitos B estimulados por Ig en superficie. En cualquier caso, los cultivos de linfocitos B en los artículos mencionados anteriormente solo son estables durante un periodo de tiempo limitado.

Otro enfoque para inmortalizar los linfocitos B es la transformación del virus de Epstein-Barr virus (EBV). No obstante, la frecuencia de los linfocitos B que son transformados por el EBV es baja y, por tanto, los intentos para generar linfocitos B transformados con el VEB que producen los anticuerpos deseados han tenido poco éxito. Recientemente, Traggiai et al han notificado un procedimiento para una transformación más eficiente del virus de Epstein-Barr de los linfocitos B que aumentó la frecuencia de linfocitos B transformados. Con este procedimiento, los linfocitos B obtenidos de un paciente que se recuperó de una infección por coronavirus que produce el síndrome respiratorio agudo grave (SRAG-CoV) se transformaron con el EBV y se aislaron clones de linfocitos B transformados que producen anticuerpos monoclonales específicos del SRAG y otras proteínas (Traggiai et al, 2004).

Otro enfoque más para inmortalizar los linfocitos B se describe en la solicitud de patente WO 03/052083. Esta solicitud describe un procedimiento de estabilizar linfocitos B en el que los linfocitos B humanos se transducen con un transductor de la señal activo de forma constitutiva de la activación y la transcripción (CA-STAT). Se observó un ciclo de vida prolongado de los linfocitos B. No obstante, los linfocitos B en replicación no fueron capaces de producir anticuerpos al mismo tiempo. Los anticuerpos se pudieron obtener deteniendo la replicación de las células, de modo que se produjo la diferenciación terminal. Las células diferenciadas terminalmente produjeron anticuerpos durante un tiempo restringido, tras el cual las células diferenciadas murieron. No obstante, los linfocitos B en replicación del documento WO 03/052083 pierden su capacidad de desarrollarse en células productoras de anticuerpos después de cultivar 1,5-2 meses o más, haciendo que estos cultivos de linfocitos B sean inadecuados para la producción de anticuerpos.

Aunque se han descrito varios enfoques para cultivar las células productoras de anticuerpos, todavía existe la necesidad de medios y procedimientos para influir sobre la estabilidad de las células productoras de anticuerpos. Es un objeto de la presente invención proporcionar dichos medios y procedimientos.

De acuerdo con lo anterior, la invención proporciona un procedimiento para influir sobre la estabilidad de una célula productora de anticuerpos, que comprende, directa o indirectamente, influir sobre la cantidad de los productos de expresión BCL6 y Blimp-1 dentro de dicha célula productora de anticuerpos. Las cantidades de ambos productos de expresión BCL6 y Blimp-1 dentro de dicha célula productora de anticuerpos están reguladas, ya que ambos productos de expresión están implicados en la estabilidad de una célula productora de anticuerpos. La estabilidad de una célula productora de anticuerpos se define como la capacidad de dicha célula productora de anticuerpos para permanecer en determinada etapa del desarrollo (opcionalmente después de haber llevado a dicha célula a dicha etapa). Diferentes etapas del desarrollo de una célula implican al menos una característica diferente de dicha célula. Por ejemplo, se sabe que un linfocito B de memoria se diferencia tras la estimulación en una célula plasmáticas secretora de anticuerpos mediante una etapa que algunos investigadores denominan plasmablastos. Un linfocito B de memoria, un plasmablasto y una célula plasmática son diferentes etapas del desarrollo de un linfocito B, en el que el linfocito B tiene diferentes características. Un linfocito B de memoria exhibe baja proliferación y secreción de anticuerpos. Un plasmablasto exhibe una proliferación más alta y niveles más altos de secreción de anticuerpos en comparación con un linfocito B de memoria, mientras que una célula plasmática secreta niveles altos de anticuerpos pero no es capaz de proliferar. Estas tres etapas del desarrollo también se caracterizan por diferencias en los marcadores de superficie celular, como se muestra en la Tabla 1.

Con un procedimiento de la invención, ha sido posible regular el ciclo de vida replicativo de una célula productora de anticuerpos. Un ciclo de vida replicativo de una célula productora de anticuerpos se define en el presente documento como el ciclo de vida en el que un linfocito B y sus células progenie son capaces de replicarse al tiempo que mantienen su capacidad de producir anticuerpos y/o de desarrollarse en una célula que produce un anticuerpo. El ciclo de vida replicativo de una célula productora de anticuerpos se acorta, por ejemplo, forzando el paso de una célula productora de anticuerpos a otra etapa de desarrollo. En una realización, el ciclo de vida replicativo de una célula productora de anticuerpos se acorta forzando el paso de dicha célula a la diferenciación terminal. Esta se caracteriza por un incremento de la producción de anticuerpos y la detención del ciclo celular. Durante la diferenciación terminal, las células dejan de proliferar y, en última instancia, mueren. No obstante, preferentemente, el ciclo de vida replicativo de una célula productora de anticuerpos se prolonga, lo que significa que dicha célula productora de anticuerpos no se diferenciará terminalmente, o hará solo después de un periodo más largo de tiempo en comparación con el mismo tipo de células productoras de anticuerpos que actualmente se usan, y continuarán proliferando in vitro. De acuerdo con la invención es posible regular la cantidad del producto de expresión BCL6 y Blimp-1 en una célula productora de anticuerpos en una medida tal que la célula productora de anticuerpos se lleva, y/o se mantienen, a un estado del desarrollo predeterminado en el que las células continúan proliferando. Por tanto, con un procedimiento de la invención se ha hecho posible aumentar el ciclo de vida replicativo de una célula productora de anticuerpos, dado que es posible mantener un linfocito B en determinada etapa del desarrollo en la que se produce la replicación. En los presentes cultivos de linfocitos B ex vivo, el ciclo de vida replicativo es solo de unas pocas semanas a dos meses. Después de este tiempo, las células cultivadas pierden su capacidad para replicarse, su capacidad para producir anticuerpos y/o su capacidad para desarrollarse en una célula que produce anticuerpos. Con un procedimiento de acuerdo con la presente invención, se ha hecho posible prolongar el ciclo de vida replicativo de las células productoras de anticuerpos, de modo que se generan cultivos ex vivo que comprenden células que son capaces de replicarse y producir anticuerpos (o desarrollarse en células que producen anticuerpos).

Una célula productora de anticuerpos se define como una célula que es capaz de producir y/o secretar anticuerpos o una parte funcional, derivado y/o análogo de los mismos y/o célula que es capaz de desarrollarse en una célula que es capaz de producir y/ secretar anticuerpos o una parte funcional, derivado y/ análogo de los mismos. Preferentemente, dicha célula productora de anticuerpos comprende un linfocito B y/o célula plasmática derivada de linfocito B. Un linfocito B se denomina, en el presente documento, una célula productora de anticuerpos, incluso cuando el linfocito B está en un estado en el que la producción de anticuerpos es baja o no está presente en absoluto, tal como un linfocito B no expuesto previamente o un linfocito B de memoria, activado o no, porque dichas células son capaces de desarrollarse en células que producen anticuerpos, tales como un plasmablasto y/o célula plasmática. Dicha célula productora de anticuerpos comprende, preferentemente, una célula de mamífero. Ejemplos no limitantes incluyen células productoras de anticuerpos derivadas de un individuo humano, roedor, conejo, llama, cerdo, vaca, cabra, caballo, simio, gorila. Preferentemente, dicha célula productora de anticuerpos comprende una célula humana, una célula de conejo y/o una célula de llama.

Una parte funcional de un anticuerpo se define como una parte que tiene, al menos, una propiedad igual que dicho anticuerpo en cuanto a clase, no necesariamente en cantidad. Dicha parte funcional es, preferentemente, capaz de unirse a un mismo antígeno que dicho anticuerpo, aunque no necesariamente en la misma medida. Una parte funcional de un anticuerpo comprende, preferentemente, un anticuerpo de un solo dominio, un anticuerpo de una SOLCA cadena y/o un fragmento Fab. Un derivado o análogo funcional de un anticuerpo se define como un anticuerpo que se ha alterado de modo que al menos una propiedad, preferentemente una propiedad de unión a antígeno, del compuesto resultante es, esencialmente, el mismo en cuanto a clase, no necesariamente en cantidad.

BCL6 codifica un represor de la transcripción que se requiere para el desarrollo de linfocitos B y linfocitos T normales y su maduración, y que es necesario para la formación de centros germinales. (Ye, 1997). BCL6 se expresa mucho en linfocitos B de centros germinales, mientras que apenas se expresa en células plasmáticas. BCL6 inhibe la diferenciación de los linfocitos B activados en células plasmáticas. El represor de la transcripción, la proteína de maduración inducida por linfocitos B tipo 1 (Blimp-1) es necesaria para el desarrollo de un linfocito B en una célula plasmática. La variante humana de la Blimp-1 se denomina Prdm1. Como se usa en el presente documento, cualquier referencia a Blimp-1 incluye una referencia a Prdm1. Blimp-1 dirige la diferenciación celular. BCL6 y Blimp1 reprimen la expresión del otro; por tanto, en una situación natural cuando una alcanza un nivel de expresión más alto que la otra, se obliga la etapa de diferenciación. En el cuerpo humano, la diferenciación de las células plasmáticas a partir de linfocitos B activados de memoria o no expuestos previamente implica la regulación por disminución de BCL6 y la regulación por aumento de Blimp-1. En las células del centro germinal, la expresión de BCL6 es alta y la expresión de Blimp-1 es baja. En las células de memoria en reposo, la expresión de BCL6 y Blimp1 es baja. Las señales que desencadenan la diferenciación producen una regulación por aumento de Blimp-1 y esta Blimp-1 contrarresta la expresión de BCL6. La etapa en la que se expresan tanto BCL6 como Blimp-1 es corta y se denomina plasmablasto. Con niveles progresivamente crecientes de Blimp-1, se extingue la expresión de BCL6, lo que tiene como resultado una célula plasmática.

En un procedimiento de acuerdo con la invención, BCL6 y Blimp-1 se coexpresan en una célula productora de anticuerpos (lo que significa que tanto BCL6 y Blimp-1 se expresan en una célula productora de anticuerpos), lo que tiene como resultado una célula productora de anticuerpos que es capaz de proliferar cuando se proporciona una señal adecuada. Se ha descubierto que la coexpresión de BCL6 y Blimp-1 tiene como resultado una célula productora de anticuerpos que es capaz de proliferar y producir anticuerpos. BCL6 y Blimp-1 se coexpresan, preferentemente, en un linfocito B, preferentemente un linfocito B humano. La coexpresión de BCL6 y Blimp-1 en un linfocito B tiene como resultado la estabilización de dicho linfocito B en una etapa similar al plasmablasto. Los plasmablastos, como las células plasmáticas, son capaces de secretar anticuerpos. No obstante, los plasmablastos todavía son capaces de proliferar, mientras que las células plasmáticas han perdido su capacidad para proliferar. Por consiguiente, las células plasmáticas no son adecuadas para cultivar líneas de células productoras de anticuerpos. Aunque los plasmablastos ejercen características productoras de anticuerpos y de proliferación altamente favorables, todavía no se han usado para la producción de anticuerpos a largo plazo, ya que no ha sido posible estabilizar los plasmablastos hasta la presente invención.

Con un procedimiento de la invención se ha podido, entre otras cosas, convertir un linfocito B no expuesto previamente o un linfocito B de memoria en una célula de tipo plasmablasto y estabilizar dicha célula para que no se produzca su rápida diferenciación en una célula plasmática. Esto es lo contrario al desarrollo natural de las células plasmáticas, en las que la expresión en un linfocito B de memoria tiene como resultado un rápido desarrollo en una célula plasmática, inhibiendo de este modo la expresión de BCL6 de forma que la célula plasmática resultante apenas expresa BCL6. Por tanto, la presente invención implica la coexpresión tanto de BCL6 como de Blimp-1 en un linfocito B, lo que tiene como resultado una célula que es capaz tanto de proliferar como de producir anticuerpos. Preferentemente se genera un cultivo estable de linfocitos B. Los cultivos ex vivo a largo plazo y estables de células productoras de anticuerpos ahora se han convertido en posibles. Estos linfocitos B productores de anticuerpos que coexpresan BCL6 y Blimp-1 pueden además estabilizarse mediante la adición del gen antiapoptótico Bcl-xL. Con la introducción de Bcl-xL, ahora es posible cultivar plasmablastos en condiciones de densidad celular baja. Por tanto, la invención también proporciona un procedimiento para cultivar plasmablastos en condiciones de baja densidad celular, que comprende proporcionar una célula productora de anticuerpos con niveles de expresión de BCL6, Blimp1 y Bcl-xL con cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento.

La cantidad del producto de expresión BCL6 (preferentemente una proteína BCL6) en una célula productora de anticuerpos se regula de varias formas. En una realización se proporciona una célula productora de anticuerpos con un compuesto capaz de influir directa o indirectamente sobre la expresión de BCL6. Una célula productora de anticuerpos se proporciona, preferentemente, con un compuesto capaz de potenciar la expresión de BCL6, con el fin de contrarrestar la regulación por disminución de BCL6 durante la expresión de Blimp-1. Dicho compuesto comprende, preferentemente, la proteína transductora de señales de activación y transcripción de proteína 5 de la transcripción (STAT5) o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma y/o una secuencia de ácido nucleico que la codifica. La STAT5 es un transductor de señales capaz de potenciar la expresión de BCL6. Existen dos formas conocidas de STAT5, STAT5a y STAT5b, que están codificadas por dos genes diferentes unidos en tándem. La administración y/o activación de STAT5 tiene como resultado niveles potenciados de BCL6. Por tanto, la regulación por disminución de BCL6 por Blimp-1 se compensa, al menos en parte, por la regulación por aumento de la expresión de BCL6 por STAT5 o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma. Por consiguiente, STAT5

o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma es capaz de influir directamente sobre la expresión de BCL6. También es posible influir indirectamente sobre la expresión de BCL6. Esto se realiza, por ejemplo, regulando la cantidad de un compuesto que a su vez es capaz de activar directa o indirectamente la STAT5 y/o de regular la expresión de STAT5. Por consiguiente, en una realización, la expresión y/o la actividad de STAT5 endógena y/o exógena aumenta. Por ejemplo, es posible potenciar indirectamente la expresión de BCL6 mediante cultivo de una célula productora de anticuerpos en presencia de interleucina (IL) 2 y/o IL-4 que es capaz de activar la STAT5.

Preferentemente, se proporciona una célula productora de anticuerpos con una secuencia de ácido nucleico que codifica STAT5 o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma, en la que dicha secuencia de ácido

nucleico es activa de forma constitutiva, lo que significa que STAT5 se expresa de forma continua, con independencia de la presencia de reguladores (endógenos). En el caso de que la expresión endógena de STAT5 sea baja, o esté ausente, preferentemente se aplica una secuencia de ácido nucleico activa constitutivamente y exógena que codifica STAT5 o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma, lo que tiene como resultado una concentración de STAT5 o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma, que es suficiente para potenciar la expresión de BCL6. Lo más preferentemente, se proporciona una célula productora de anticuerpos con una secuencia de ácido nucleico que codifica un compuesto que comprende STAT5 o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma, preferentemente una proteína de fusión, cuya actividad está regulada por un inductor exógeno del represor, de modo que la extensión de la activación de la expresión de BCL6 se regula a voluntad. Otro sistema que permite la inducción de BCL-6 se proporciona mediante un sistema Tet-on en el que la adición de tetraciclina y/o derivados de tetraciclina inducen actividad de un transactivador que indujo la transcripción del gen de BCL6, seguida por la síntesis de la proteína BCL. En una realización preferida, se proporciona una célula productora de anticuerpos con una secuencia de ácido nucleico que codifica un receptor de estrógenos (ER) y STAT5 como una proteína de fusión ER-STAT5. Esta proteína de fusión es inactiva porque forma un complejo con las proteínas del choque térmico en el citosol. De este modo, la STAT5 es incapaz de alcanzar el núcleo y no se potencia la expresión de BCL6. Tras la administración del inductor exógeno 4-hidroxi-tamoxifeno (4HT), la proteína de fusión ER-STAT5 se disocia de las proteínas del choque térmico, de modo que la STAT5 puede entrar en el núcleo y activar la expresión de BCL6.

Adicionalmente, o como alternativa, la expresión de BCL6 en una célula productora de anticuerpos se potencia cultivando dicha célula productora de anticuerpos en presencia de un compuesto capaz de potenciar directa o indirectamente la expresión de BCL6.

Por tanto, una realización proporciona un procedimiento de acuerdo con la invención, que comprende:

-: proporcionar dicha célula productora de anticuerpos con un compuesto capaz de potenciar directa o

indirectamente la expresión de BCL6; y/o -cultivar dicha célula productora de anticuerpos en presencia de un compuesto capaz de potenciar directa o

indirectamente la expresión de BCL6. dicho compuesto capaz de potenciar directamente la expresión de BCL6

comprende, preferentemente, STAT5 o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma. Por tanto, se

proporciona un procedimiento de acuerdo con la invención, que comprende proporcionar dicha célula productora

de anticuerpos con STAT5 o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma, o con una secuencia de

ácido nucleico que codifica STAT5, o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma. En una realización,

dicha célula productora de anticuerpos se cultiva tras la introducción de una secuencia de ácido nucleico que

codifica STAT5 o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma. Dicha secuencia de ácido nucleico se

introduce, por ejemplo, en dicha célula mediante transfección y/o transferencia génica mediada por virus. En la

técnica están disponibles muchos procedimientos alternativos para introducir una secuencia de ácido nucleico

en una célula que no necesitan más explicación.

Con un compuesto capaz de potenciar directa o indirectamente la expresión de BCL6, es posible potenciar la expresión de BCL6 endógena. No obstante, en una realización preferida, se proporciona una célula productora de anticuerpos con una secuencia de ácido nucleico que codifica BCL6 o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma. De este modo, es posible regular una concentración de BCL6 en una célula productora de anticuerpos con independencia de la expresión de BCL6 endógena. Por tanto, aún cuando la expresión de BCL6 endógena sea baja o esté ausente, causado, por ejemplo, por Blimp-1, una secuencia de ácido nucleico exógena que codifica BCL6 o una parte funcional, derivado y/o análogo del mismo sigue siendo capaz de producir una concentración de BCL6 que sea suficiente para influir sobre la estabilidad de una célula productora de anticuerpos. Por tanto, también se proporciona un procedimiento de acuerdo con la invención que comprende proporcionar una célula productora de anticuerpos con una secuencia de ácido nucleico que codifica BCL6 o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma. Preferentemente, dicha célula productora de anticuerpos se proporciona con una secuencia de ácido nucleico activa de forma constitutiva que codifica BCL6 o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma, de modo que la expresión de BCL6 se mantiene incluso cuando la expresión de BCL6 endógena de dicha célula se inhibe mediante un represor endógeno tal como Blimp-1. Lo más preferentemente, la expresión de dicha secuencia de ácido nucleico que codifica BCL6 o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma, está regulada por un inductor exógeno del represor, de modo que la extensión de la expresión de BCL6 se regula a voluntad. Por ejemplo, se usa un sistema promotor inducible tal como un sistema Tet-on o Tet-off.

En otra realización preferida, la invención proporciona un procedimiento en el que la cantidad de BCL6 está regulada de forma indirecta proporcionando una célula productora de anticuerpos con una secuencia de ácido nucleico que codifica E47 o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma. E47 codifica un factor de transcripción que pertenece a una familia de proteínas hélice-bucle-hélice denominadas proteínas E. Existen cuatro proteínas E, E12, E47, E2-2 y HEB, que participan en el desarrollo de los linfocitos. E12 y E47 están codificadas por un gen denominado E2A, que se corta y empalma de forma diferente. El inhibidor de proteínas Id2 e Id3, y ABF-1 pueden inhibir las proteínas E (Mathas S., 2006). Las proteínas E se han descrito como supresores tumorales y han mostrado que su sobreexpresión induce apoptosis. Una de las dianas específicas de 47 son los genes Socs1 y Socs3. Estos genes Socs se conocen como reguladores negativos de STAT5b y, por consiguiente, indirectamente de BCL6. En otras palabras, la expresión de E47 en un linfocito B potencia la expresión de Blimp-1, que tiene como

resultado la diferenciación de los linfocitos B hacia un fenotipo productor de anticuerpos (célula plasmática).

La cantidad de expresión de Blimp-1 en una célula productora de anticuerpos también se regula de varias formas. En una realización se proporciona una célula productora de anticuerpos con un compuesto capaz de influir directa o indirectamente sobre la expresión de Blimp-1. Adicionalmente, o como alternativa, una célula productora de anticuerpos se cultiva en presencia de un compuesto capaz de influir directa o indirectamente sobre la expresión de Blimp-1. Por tanto, también se proporciona un procedimiento de acuerdo con la invención que comprende proporcionar dicha célula productora de anticuerpos con un compuesto capaz de influir directa o indirectamente sobre la expresión de Blimp-1. También se proporciona un procedimiento de acuerdo con la invención que comprende cultivar dicha célula productora de anticuerpos en presencia de un compuesto capaz de influir directa o indirectamente sobre la expresión de Blimp-1. Preferentemente, se usa un compuesto que es capaz de potenciar la expresión de Blimp-1 con el fin de contrarrestar la regulación por disminución de Blimp-1 durante la expresión de BCL6. Dicho compuesto comprende, lo más preferentemente, IL21.

En una realización preferida, dicho compuesto capaz de influir directa o indirectamente sobre la expresión de Blimp1 comprende una proteína transductora de señales de activación y transcripción 3 (STAT3) o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma y/o una secuencia de ácido nucleico que la codifica. STAT3 es un transductor de señales que está implicado en el desarrollo y diferenciación de linfocitos B. STAT3 es capaz de regular por aumento la expresión de Blimp-1. Por tanto, además se proporciona un procedimiento de acuerdo con la invención en el que dicho compuesto capaz de influir directa o indirectamente sobre la expresión de Blimp-1 comprende STAT3 o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma, o una secuencia de ácido nucleico que codifica STAT3, o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma. Lo más preferentemente, la expresión de dicha secuencia de ácido nucleico que codifica STAT3 o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma está regulada por un inductor exógeno del represor, de modo que la extensión de STAT3 se regula a voluntad. Por ejemplo, se usa un sistema promotor inducible tal como, por ejemplo, un sistema Tet-on o Tet-off. En una realización, una proteína de fusión que comprende STAT3, un derivado o análogo, y ER se i introduce en dicha célula, lo que permite la regulación de la expresión de STAT3 por el hidroxitamoxifeno.

Dado que STAT3 es capaz de influir sobre la expresión de Blimp-1, también es posible regular de forma indirecta la expresión de Blimp-1 administrando un compuesto capaz de regular de forma indirecta o directa la actividad y/o la expresión de STAT3. En una realización se proporciona una célula productora de anticuerpos con un compuesto que es capaz de potenciar la actividad de STAT3, de modo que la expresión de Blimp-1 está potenciada indirectamente también. Por tanto, también se proporciona un procedimiento de acuerdo con la invención, en el que se proporciona una célula productora de anticuerpos con un compuesto capaz de potenciar directa o indirectamente la actividad de STAT3.

Por tanto, en una realización se proporciona una célula productora de anticuerpos con un compuesto capaz de activar directa o indirectamente STAT3 con el fin de potenciar la expresión de Blimp-1.

La STAT3 se activa de diversos modos. Preferentemente, STAT3 se activa proporcionando una célula productora de anticuerpos con una citocina. Las citocinas, estando implicadas de forma natural en la diferenciación de los linfocitos B, son muy eficaces en la regulación de las proteínas STAT. Activadotes muy eficaces de STAT3 son IL-21 e IL-6, aunque se sabe que IL-2, IL-7, IL-10, IL-15 e IL-27 también activan la STAT3. Además, los receptores de tipo Toll (TLR), que están implicados en la inmunidad innata, también son capaces de activar la STAT3. Por tanto, una realización proporciona un procedimiento de la invención, en el que dicho compuesto capaz de influir directa o indirectamente sobre la expresión de Blimp-1, comprende IL-21, IL-2, IL-6, IL-7, IL-10, IL-15 y/o IL-27. Lo más preferentemente, se usa la IL-21, ya que la IL-21 es particularmente adecuada para influir sobre la estabilidad de una célula productora de anticuerpos. La IL-21 es capaz de regular por aumento la expresión de Blimp-1, incluso cuando la expresión de Blimp-1 está contrarrestada por BCL6.

Adicionalmente, o como alternativa, se usa una Janus quinasa (JAK) mutada con el fin de activar la STAT3.

De forma natural, una JAK es capaz de fosforilar la STAT3 después de que ha sido activada por al menos una citocina. Una Janus quinasa mutada capaz de activar la STAT3, con independencia de la presencia de citocinas, es particularmente adecuada en un procedimiento de acuerdo con la presente invención.

Como ya se ha explicado con anterioridad, un compuesto capaz de potenciar la expresión de Blimp-1 en una realización comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica STAT3 o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma. La presencia de una secuencia de ácido nucleico exógena que codifica STAT3 o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma permite una presencia continua de STAT3 o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma, incluso cuando la expresión de STAT3 endógena es muy baja o está ausente.

También es posible disminuir la expresión y/o la actividad de STAT5 con el fin de regular por aumento Blimp-1. Si la cantidad y/o la actividad de STAT5 han disminuido, la activación de la expresión de BCL6 disminuye también, lo que tiene como resultado una menor cantidad del producto de expresión BCL6. Dado que BCL6 y Blimp-1 contrarrestan la expresión una de otra, una cantidad disminuida del producto de expresión BCL6 tiene como resultado una mayor cantidad del producto de expresión Blimp-1. Los compuestos capaces de regular por disminución la actividad de

STAT5 son capaces de regular por aumento de forma indirecta Blimp-1. Dichos compuestos, por ejemplo, comprenden miembros del supresor de las proteínas de señalización de citocinas (SOCS). En una realización, la cantidad del producto de expresión Blimp-1 en una célula productora de anticuerpos está regulada por aumento al proporcionar dicha célula con una proteína SOCS y/o activando una proteína SOCS dentro de dicha célula.

En una realización preferida, la expresión y/o actividad de STAT5 disminuye cuando dicha célula productora de anticuerpos se proporciona con una secuencia de ácido nucleico que codifica E47 o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma. Por tanto, la expresión de E47 en los linfocitos B que expresan niveles altos de STAT5b interviene con diferenciación y proliferación, es decir el bloqueo de STAT5 a través de E47 y SOCS tiene como resultado una disminución de los niveles de BCL6 y, posteriormente, un aumento de los niveles de Blimp-1. Los niveles regulados por aumento de Blimp-1 tienen como resultado una disminución de la proliferación y una diferenciación de la célula implicada hacia una célula productora de anticuerpos. En otras palabras, la expresión de E47 en un linfocito B potencia la expresión de Blimp-1, que tiene como resultado la diferenciación de los linfocitos B hacia un fenotipo productor de anticuerpos (célula plasmática).

Mediante al menos una parte funcional de una proteína STAT5, una proteína STAT3 y/o BCL6 se quiere decir una molécula proteinácea que tiene la misma capacidad, en cuanto a la clase, no necesariamente la cantidad, de influir sobre la estabilidad de una célula protectora de anticuerpos en comparación con una proteína STAT5, una proteína STAT3 y/o BCL6, respectivamente. Una parte funcional de una proteína STAT5 o una proteína STATS está, por ejemplo, desprovista de aminoácidos que no están implicados, o lo están muy poco, en dicha capacidad. Un derivado de una proteína STAT5, una proteína STAT3 y/o BCL6 se define como una proteína que se ha alterado de modo que la capacidad de dicha proteína para influir sobre la estabilidad de una célula productora de anticuerpos es esencialmente la misma en cuanto a clase, no necesariamente en cantidad. Se proporciona un derivado de muchas formas, por ejemplo mediante sustitución conservadora de aminoácidos en la que un aminoácido es sustituido por otro aminoácido con propiedades generalmente similares (tamaño, hidrofobicidad etc.), de un modo tal que es probable que el funcionamiento global no se vea gravemente afectado. Por ejemplo, un derivado comprende una proteína de fusión, tal como una proteína de fusión STAT5-ER cuya actividad depende de la presencia de 4hidroxitamoxifeno (4HT). Un análogo de una proteína STAT5, una proteína STAT3 y/o BCL6 se define como una molécula que tiene la misma capacidad de influir sobre la estabilidad de una célula productora de anticuerpos en cuanto a clase, no necesariamente en cantidad. Dicho análogo no necesariamente deriva de dicha proteína STAT5, proteína STAT3 y/o BCL6.

Una realización preferida proporciona un procedimiento de acuerdo con la invención, en el que dicha célula productora de anticuerpos se proporciona con un agente de inmortalización adicional, preferentemente un agente transformante, tal como EBV. Con un agente de inmortalización adicional, se potencia la estabilidad, proliferación y/o producción de anticuerpos de una célula productora de anticuerpos de acuerdo con la invención. Un agente transformante es un agente capaz de modificar al menos parte del genoma de una célula. Dicho agente transformante comprende, preferentemente, ácido nucleico capaz de incorporarse en el genoma de una célula.

En una realización preferida, una célula productora de anticuerpos, preferentemente un linfocito B, se proporciona con el virus de Epstein-Barr (EBV). La infección de una célula productora de anticuerpos de la invención con EBV tiene como resultado un incremento de la estabilidad, proliferación y/o producción de anticuerpos de dicha célula. En una realización particularmente preferida, una célula productora de anticuerpos, preferentemente un linfocito B, se cultiva en presencia de IL-21 y se proporciona con EBV. Esto tiene como resultado una mejora de la proliferación y/o de la producción de anticuerpos en comparación con el mismo tipo de células productoras de anticuerpos sin IL-21 y/o EBV. Dicha célula productora de anticuerpos se cultiva, preferentemente, en presencia de IL-21 antes de infectarse con EBV. Por tanto, se proporciona un procedimiento para aumentar la estabilidad de una célula productora de anticuerpos, que comprende cultivar dicha célula en presencia de IL-21 y proporcionar dicha célula con EBV.

De acuerdo con la presente invención, IL-21 es particularmente adecuada para mejorar la estabilidad de una célula de anticuerpos. Realizaciones preferidas comprenden cultivar células productoras de anticuerpos, preferentemente linfocitos B, en presencia de IL-21, las células productoras de anticuerpos se proporcionan adicionalmente con un compuesto capaz de potenciar de forma directa o indirecta la expresión de BCL6, con una secuencia de ácido nucleico que codifica BCL6 o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma, y/o con una secuencia de ácido nucleico que codifica STAT5 o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma. Dicha célula productora de anticuerpos está infectada, preferentemente, con EBV. Por ejemplo, una célula productora de anticuerpos que está infectada de forma natural con EBV se usa en un procedimiento de acuerdo con la invención. Como alternativa, o adicionalmente, se proporciona una célula productora de anticuerpos con EBV.

En una realización preferida, dicha célula productora de anticuerpos se cultiva en presencia de IL-21 antes de que dicha célula productora de anticuerpos se proporcione con un compuesto capaz de potenciar de forma directa o indirecta la expresión de BCL6, con una secuencia de ácido nucleico que codifica BCL6 o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma, y/o con una secuencia de ácido nucleico que codifica STAT5 o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma. Se prefiere cultivar células productoras de anticuerpos, preferentemente linfocitos B, en presencia de IL-21 antes de influir sobre la cantidad del producto de expresión BCL6 y/o Blimp-1 dentro de dicha célula, dado que en estas realizaciones la estabilidad, la proliferación y/o la producción

de anticuerpos está particularmente bien mejorada.

En una realización preferida, la invención proporciona además un procedimiento para influir sobre la estabilidad de una célula productora de anticuerpos como se describe más adelante en el presente documento, que comprende, directa o indirectamente, aumentar la cantidad del producto de expresión Bcl-xL 1 dentro de dicha célula productora de anticuerpos. Esto se consigue, por ejemplo, proporcionando a dicha célula productora de anticuerpos una secuencia de ácido nucleico que codifica Bcl-xL o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma o mediante secuencias de ácido nucleico que codifican otros genes antiapoptóticos incluyendo, entre otros, Bcl-2. En otra realización más, esto se consigue proporcionando dicha célula productora de anticuerpos con un compuesto capaz de potenciar de forma directa o indirecta la expresión de Bcl-xL, preferentemente dicho compuesto comprende estimulación de APRIL, BAFF, CD40, BCR, citocinas, factores de crecimiento o efectores cadena abajo como JNK y AKT (PKB).

Bcl-xL es un miembro de la familia antiapoptótica de Bcl-2, las proteínas Bcl2 interaccionan con, y contrarrestan, los denominados miembros de la familia que solo tienen el dominio de homología 3 de Bcl-2, tales como Bax, Bak, Bim, y Bad, que inducen la liberación del citocromo c tras los estímulos intrínsecos de muerte (Boise, L. H., 1993). Por tanto, la protección de la integridad de la membrana mitocondrial a través de proteínas como Bcl-xL es crucial para la supervivencia celular.

La activación de STAT5 ha mostrado que protege a las células de la muerte celular. STAT5 ha mostrado que regula la expresión de Bcl-xL, de modo que avala un papel antiapoptótico para STAT5. STAT5 regula positivamente la expresión de Bcl-xL a través de elementos de unión a STAT dentro del promotor de Bcl-xL. In vivo, la expresión de Bcl-xL está ausente en la médula ósea de ratones doblemente deficientes en STAT5A/B. Además, la supervivencia de los eritroblastos mediada por STAT5 depende de la regulación por aumento de Bcl-xL. Recientemente, la sobreexpresión transgénica de Bcl-xL en linfocitos B de ratón ha mostrado que estimula la supervivencia de los linfocitos B y los focos de células plasmáticas no malignas.

Un procedimiento de acuerdo con la invención es particularmente adecuado para producir un cultivo de células productoras de anticuerpos que comprende células productoras de anticuerpos que son capaces de proliferar y secretar anticuerpos. En una realización, se usa un linfocito B de memoria con el fin de producir un cultivo de linfocitos B ex vivo. Como alternativa, o adicionalmente, se usa un linfocito B no expuesto previamente. Dicho linfocito B de memoria y/o linfocito B no expuesto previamente es, preferentemente, humano, de modo que se producen anticuerpos humanos. Preferentemente, se usa un linfocito B de memoria con una especificidad deseada. Esto significa que un linfocito B de memoria que es capaz de desarrollarse en una célula secretora de anticuerpos, de modo que los anticuerpos tienen una especificidad deseada contra un antígeno de interés. Dicho antígeno de interés comprende, por ejemplo, un antígeno derivado de patógenos, un antígeno derivado de tumor y/o un autoantígeno. En una realización, los linfocitos B se aíslan de una muestra de sangre periférica, una muestra de sangre de cordón y/o una muestra de amígdala, usando procedimientos conocidos en la técnica. Los linfocitos B de memoria, por ejemplo, se aíslan mediante selección del marcador de linfocitos B CD19 y la (posterior) selección por IgG y/o CD27 de superficie celular. En un linfocito B del centro germinal, la expresión de BCL6 es alta mientras que la expresión de Blimp-1 es baja. El desarrollo natural en una célula secretora de anticuerpos implica la regulación por aumento de la expresión de Blimp-1. Dado que Blimp-1 reprime la expresión de BCL6, la regulación por aumento de Blimp-1 tiene como resultado la regulación por disminución de BCL6 en una situación natural. No obstante, en la presente invención, la expresión de Blimp-1 está regulada por aumento mientras que la expresión de BCL6 se mantiene, al menos en parte. Esto tiene como resultado una célula productora de anticuerpos, en la que BCL6 y Blimp-1 se coexpresan. Dicha célula productora de anticuerpos es capaz de proliferar y secretar anticuerpos y, por tanto, es adecuada para usar en un cultivo de linfocitos B ex vivo. En una realización preferida, dicha célula productora de anticuerpos se protege mediante la apoptosis mediante Bcl-xL. Dicha célula productora de anticuerpos está infectada, preferentemente, con EBV. En una realización, se usa una célula productora de anticuerpos infectada de forma natural con EBV. Como alternativa, o adicionalmente, se proporciona una célula productora de anticuerpos con EBV. Una célula productora de anticuerpos de acuerdo con la presente invención proporciona la ventaja de que es estable y no sufre diferenciación terminal durante un periodo prolongado. Dicha célula productora de anticuerpos de acuerdo con la invención es estable durante al menos una semana, preferentemente durante al menos un mes, más preferentemente durante al menos tres meses, lo más preferentemente durante al menos seis meses. Un linfocito B de acuerdo con la invención se cultiva preferentemente en presencia de CD40L, ya que la replicación de la mayoría de los linfocitos B se ve favorecida por CD40L.

En una realización, la expresión de BCL6 se mantiene a esencialmente el mismo nivel, o a un nivel más alto, en comparación con un linfocito B del centro germinal ya que una expresión significativa de BCL6, junto con la expresión de Blimp-1, tiene como resultado una célula productora de anticuerpos con propiedades de producción de anticuerpos y proliferación preferidas y/o estabilidad. En una realización preferida, dicha expresión de BCL6 y expresión de Blimp-1 se acompañan de la expresión de Bcl-xL, lo que tiene como resultado propiedades de proliferación y de producción de anticuerpos y/o estabilidad todavía más preferidas.

Por tanto, una realización proporciona un procedimiento para producir una célula productora de anticuerpos que es estable durante al menos una semana, preferentemente durante al menos un mes, más preferentemente durante al menos tres meses, más preferentemente durante al menos seis meses, comprendiendo el procedimiento:

-: proporcionar un linfocito B de memoria y un linfocito B no expuesto previamente; -incrementar un nivel de expresión de Blimp-1 en dicha célula; y -incrementar y/o mantener un nivel de expresión de BCL6 en dicha célula. También se proporciona un

procedimiento ex vivo para producir una célula productora de anticuerpos que comprende incrementar un nivel

de expresión de Blimp-1 en un linfocito B de memoria o un linfocito B no expuesto previamente e incrementar

y/o mantener un nivel de expresión de BCL6 en dicha célula. Preferentemente, dichos niveles de expresión de

BCL6 y Blimp-1 se producen y/o mantienen, esencialmente al mismo nivel, o a un nivel superior, en

comparación con un plasmablasto. En una realización, dicho linfocito B está infectado con EBV (natural y/o

artificialmente) y/o transducido con Bcl-xL. Lo más preferentemente, se usa un linfocito B de memoria. Dicho

linfocito B de memora tiene, preferentemente, una especificidad por un antígeno derivado de patógenos, un

antígeno derivado de tumor y/o un autoantígeno.

La expresión de Blimp-1 y la expresión de BCL6 están influidas de varias formas, como ya se ha descrito anteriormente en el presente documento. Por ejemplo, la expresión de Blimp-1 se potencia en un linfocito B de memoria y/o un linfocito B no expuesto previamente proporcionando a dicho linfocito B capaz de potenciar directa o indirectamente la expresión de Blimp-1, tal como una secuencia de ácido nucleico que codifica Blimp-1 o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma, y/o una secuencia de ácido nucleico que codifica STAT3 o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma. Preferentemente, la expresión de dicho ácido nucleico está regulada por un inductor exógeno del represor, de modo que la extensión de Blimp-1 se regula a voluntad.

Como alternativa, o adicionalmente, un linfocito B de memoria y/o un linfocito B no expuesto previamente se cultiva en presencia de un compuesto capaz de potenciar directa o indirectamente la expresión de Blimp-1, tal como, por ejemplo, IL-21, IL-2, IL-6, IL-7, IL-10, IL-15, IL-27, o una Janus quinasa mutada. Preferentemente, la IL-21 se usa porque esta citocina es particularmente adecuada para potenciar la expresión de Blimp-1 y estabilizar una célula productora de anticuerpos con un procedimiento de acuerdo con la presente invención. En una realización, se proporciona a un linfocito B una proteína SOCS o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma, o una secuencia de ácido nucleico que codifica la misma, ya que una proteína SOCS o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma es capaz de potenciar indirectamente la expresión de Blimp-1. En otra realización alternativa o adicional, se proporciona a un linfocito B E47 o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma, o un ácido nucleico que codifica la misma. Como ya se ha indicado anteriormente, como resultado de un mayor nivel de E47 o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma, la función de la proteína Socs se potencia y la expresión de Blimp-1 aumenta de forma indirecta. La expresión de Blimp-1 tiene como resultado la regulación por disminución de BCL6 endógena. Por tanto, a dicho linfocito B de memoria también se proporciona un compuesto capaz de mantener la expresión de BCL6, que tiene como resultado la coexpresión de BCL6 y Blimp-1. Dicho compuesto es capaz, preferentemente, de inducir yo mantener la expresión de BCL6 esencialmente al mismo nivel o a un nivel mayor en comparación con un plasmablasto. Un ejemplo preferido de dicho compuesto es una secuencia de ácido nucleico que codifica BCL6 o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma.

Es posible proporcionar directamente a un linfocito B un compuesto capaz de potenciar directa o indirectamente la expresión de BCL6, por ejemplo mediante transducción con una secuencia de ácido nucleico. En una realización, la expresión de BCL6 en un linfocito B se mantiene y/o potencia cultivando un linfocito B de memoria en presencia de un compuesto que es capaz de potenciar directa o indirectamente la expresión de BCL6 y/o que es capaz de mantener la expresión de BCL6 a esencialmente el mismo nivel, o a un nivel mayor, en comparación con un linfocito B del centro germinal.

En una realización preferida, la expresión de Blimp-1 se regula por aumento en un linfocito B, preferentemente cultivando dicho linfocito B en presencia de un compuesto capaz de activar STAT3 y/o Blimp-1. Dicho compuesto comprende, preferentemente, IL-21. Dicho linfocito B comprende, preferentemente, un linfocito B de memoria. Después de esto, la expresión de BCL6 se potencia, preferentemente. La regulación por aumento de Blimp-1 en una primera etapa, seguida de la regulación por aumento de BCL6, ha mostrado que tiene como resultado linfocitos B particularmente estables capaces de replicarse y producir anticuerpos. En una realización de la invención, la expresión de Blimp-1 todavía está regulada por aumento, mientras que la expresión de BCL6 se potencia. No obstante, como alternativa, la expresión de Blimp-1 no está regulada por aumento, mientras que la expresión de BCL6 se potencia. De este modo, la capacidad de replicación de un linfocito B está particularmente potenciada. Por tanto, una capacidad productora de anticuerpos de un linfocito B se potencia, preferentemente, en primer lugar, mediante regulación por aumento la expresión y/o la actividad de Blimp-1. Posteriormente, una capacidad de replicación de dicho linfocito B se potencia, preferentemente, mediante regulación por aumento la expresión y/o la actividad de BCL6. Preferentemente, el linfocito B se cultiva en presencia de un compuesto capaz de potenciar la expresión de Blimp-1 y/o la actividad, hasta que la replicación aumenta significativamente. Posteriormente, dicho linfocito B se cultiva, preferentemente, de nuevo en presencia de un potenciador de la expresión y/o la actividad de Blimp-1, de modo que se mantiene la producción de anticuerpos. Como se muestra en los ejemplos, es posible regular Blimp-1 y BCL6 de varias formas, lo que tiene como resultado la coexpresión de Blimp-1 y BCL6 en un linfocito B, en el que el linfocito B es capaz de replicar y producir anticuerpos. En una realización preferida, dicho linfocito B está infectado con EBV (natural y/o artificialmente) y/o transducido con Bcl-xL.

En una realización preferida, la expresión de Blimp-1 se regula por aumento en un linfocito B, preferentemente un linfocito B, cultivando dicho linfocito B en presencia de un compuesto capaz de activar la STAT3. Dicho compuesto

comprende, preferentemente, IL-21. De acuerdo con una realización, a dicho linfocito B se proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica BCL6 o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma. Dichos linfocitos B se cultivan, preferentemente, durante unos días en presencia de dicho compuesto capaz de activar la STAT3 con el fin de potenciar la replicación. Después, dichas células se cultivan de nuevo preferentemente con, y/o se proporciona, un compuesto capaz de activar la STAT3.

En los ejemplos, se muestra una realización particularmente preferida, en la que los linfocitos B se cultivan primero en presencia de IL-21. Posteriormente, a los linfocitos B se proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica BCL6. Los linfocitos B se cultivan en ausencia de IL-21 y en presencia de IL-2 e IL-4 durante unos días con el fin de permitir la expresión de BCL6, tras lo cual se administra IL-21 de nuevo al cultivo con el fin de potenciar la replicación y la producción de anticuerpos. Se obtienen linfocitos B, en los que BCL6 y Blimp-1 se coexpresan, de modo que los linfocitos B son capaces de replicarse y producir anticuerpos en un cultivo ex vivo durante al menos 6 meses. En una realización preferida, dichos linfocitos B se infectan con EBV. Se prefiere un cultivo de linfocitos B de acuerdo con la invención, ya que los linfocitos B son capaces de replicarse y producir anticuerpos en un cultivo ex vivo durante un periodo de tiempo más largo en comparación con los cultivos de linfocitos T actuales.

En otra realización preferida, se usa una secuencia de ácido nucleico que codifica STAT5, o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma con el fin de potenciar la expresión de BCL6.

Los intentos de la técnica anterior para usar STAT5 para obtener un cultivo de linfocitos B estable capaz de producir anticuerpos, tales como los descritos en el documento WO 03/052083, fallaron porque los linfocitos B pierden su capacidad de desarrollarse en células productoras de anticuerpos en 2 meses. No obstante, la presente invención proporciona la información de que STAT5 es, de hecho, adecuada para producir un cultivo de linfocitos B productores de anticuerpos estable su la expresión de Blimp-1 está regulada por aumento también en los linfocitos

B. Preferentemente, la expresión de Blimp-1 en un linfocito B se potencia, tras lo cual se potencia la expresión de BCL5 mediante STAT5 o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma.

En una realización preferida, la expresión de Blimp-1 se regula por aumento en un linfocito B, preferentemente un linfocito B, cultivando dicho linfocito B en presencia de un compuesto capaz de activar la STAT3. Dicho compuesto comprende, preferentemente, IL-21. Dicho linfocito B comprende, preferentemente, un linfocito B de memoria. Posteriormente, dicho linfocito B se proporciona con una secuencia de ácido nucleico que codifica STAT5 o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma. Dicha secuencia de ácido nucleico codifica, preferentemente, un compuesto que comprende STAT5 o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma, cuya actividad depende de la presencia o ausencia de un regulador exógeno. Más preferentemente, dicho linfocito B se proporciona con una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión STAT5-ER cuya actividad depende de la presencia de 4-hidroxitamoxifeno (4HT). En los linfocitos B resultantes, que son capaces de replicarse y de producir anticuerpos, se coexpresan Blimp-1 y BCL6. Una vez que se ha producido un cultivo que comprende linfocitos B de acuerdo con la invención, es posible regular además la capacidad de replicación y de producción de anticuerpos de los linfocitos B regulando la expresión de BCL6 y Blimp-1. La cantidad del producto de expresión BCL6 y Blimp-1 se regula a voluntad durante el cultivo adicional. Por ejemplo, cuando la producción de anticuerpos de las células disminuye, la actividad de STAT5 disminuye preferentemente (preferentemente privando al cultivo celular de 4hidroxitamoxifeno), mientras que dichos linfocitos B se cultivan en presencia de un compuesto capaz de activar (la expresión de) STAT3 y/o Blimp-1. Preferentemente, las células se cultivan durante un tiempo (normalmente unos días) en presencia de I—21 y en ausencia de 4-hidroxitamoxifeno. Cuando se ha potenciado la producción de anticuerpos, el cultivo se continúa preferentemente en presencia de hidroxitamoxifeno y en ausencia de dicho compuesto capaz de activar STAT3 con el fin de potenciar la replicación y para garantizar que la expresión de Blimp1 no anula completamente la expresión de BCL6.

En una realización, la replicación y la producción de anticuerpos se potencian por la infección de EBV. Por tanto, después de proporciona el linfocito B con STAT5, preferentemente está infectado por EBV. Se obtienen linfocitos B estables que secretan niveles altos de anticuerpos.

En los ejemplos, se muestra una realización particularmente preferida, en la que los linfocitos B se cultivan primero en presencia de IL-21 durante unos días. La expresión de Blimp-1 se induce y los linfocitos B se diferencian en células productoras de anticuerpos. Posteriormente, los linfocitos B se proporcionan con una secuencia de ácido nucleico que codifica STAT5-ER. Los linfocitos T se cultivan en presencia de IL-21 durante aproximadamente 1-50 días, preferentemente aproximadamente 1-30 días, más preferentemente aproximadamente 1,5 – 21 días, lo más preferentemente aproximadamente 1-5 días, en la que los linfocitos B se cultivan en ausencia de IL-21 y en presencia de 4-HT, IL-2 e IL-4 con el fin de activar la STAT5, Durante este periodo, la expresión de BCL6 se potencia con el fin de mantener un equilibrio en el que se coexpresan BCL6 y Blimp-1. Por último, tras la inmortalización y expansión, la IL-21 se administra de nuevo al cultivo y se retira el 4HT con el fin de aumentar la expresión de Blimp-1. Dicho equilibrio en el que BCL6 y Blimp-1 se coexpresan se mantiene variando la cantidad de IL-21 y 4-HTA en el medio de cultivo de modo que se mantienen la expresión de BCL6 y la expresión de Blimp-1. Se obtienen linfocitos B estables, que son capaces de replicarse y producir anticuerpos en un cultivo ex vivo durante al menos 6 meses.

Por tanto, un procedimiento de la invención permite una sutil regulación de la capacidad de replicación y la capacidad de producir anticuerpos de los linfocitos B cultivados ex vivo. Cuando se desea regulación por aumento de la producción de anticuerpos se favorece la expresión de Blimp-1 sobre la expresión de BCL6. Cuando se desea regulación por aumento de la replicación se favorece la expresión de BCL6 sobre la expresión de Blimp-1. Un procedimiento de la invención permite el mantenimiento de un equilibrio en el que se coexpresan BCL6 y Blimp-1, lo que tiene como resultado células productoras de anticuerpos que son capaces de replicarse y producir anticuerpos ex vivo. En una realización, dichos linfocitos B se infectan con EBV después de establecido el equilibrio, con el fin de aumentar adicionalmente y estabilizar la producción de anticuerpos.

Además, la invención divulga adicionalmente que la regulación del equilibrio mencionado también se obtiene con una proteína E (por ejemplo, E47). La expresión de E47 en los linfocitos B que expresan niveles altos de STAT5b interviene con diferenciación y proliferación, es decir el bloqueo de STAT5 a través de E47 y SOCS tiene como resultado una disminución de los niveles de BCL6 y, posteriormente, un aumento de los niveles de Blimp-1. Los niveles regulados por aumento de Blimp-1 tienen como resultado una disminución de la proliferación y una diferenciación de la célula implicada hacia una célula productora de anticuerpos. En otras palabras, la expresión de E47 en un linfocito B potencia la expresión de Blimp-1, que tiene como resultado la diferenciación de los linfocitos B hacia un fenotipo productor de anticuerpos (célula plasmática).

La invención describe además la estabilización del crecimiento de las células productoras de anticuerpos con Bcl-xL.

Por tanto, la invención proporciona un procedimiento para producir una célula productora de anticuerpos que es estable durante al menos una semana, preferentemente durante al menos un mes, más preferentemente durante al menos tres meses, más preferentemente durante al menos seis meses, comprendiendo el procedimiento:

-: proporcionar a un linfocito B un compuesto capaz de potenciar directa o indirectamente la expresión de Blimp-1

y/o cultivar un linfocito B en presencia de un compuesto capaz de potenciar directa o indirectamente la

expresión de Blimp-1; y -proporcionar a dicho linfocito B un compuesto capaz de potenciar directa o indirectamente la expresión de BCL6

o un compuesto capaz de mantener la expresión de BCL6 esencialmente a un nivel más alto en comparación con un linfocito B del centro germinal.

Como alternativa, o adicionalmente, dicho linfocito B se cultiva en presencia de un compuesto capaz de potenciar directa o indirectamente la expresión de Blimp-1, en presencia de un compuesto capaz de potenciar directa o indirectamente la expresión de BCL6 y/o en presencia de un compuesto capaz de mantener la expresión de BCL6 esencialmente al mismo nivel o a un nivel mayor en comparación con un linfocito B de memoria natural.

Dicho compuesto que es capaz de potenciar directa o indirectamente la expresión de BCL6 y/o mantener la expresión de BCL6 a un nivel más alto en comparación con un linfocito B de memoria natural, preferentemente comprende:

-: una secuencia de ácido nucleico que codifica BCL6 o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma, y/o -una secuencia de ácido nucleico que codifica STAT5 o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma,

y/o -un compuesto capaz de activar directa o indirectamente la STAT5, y/o -un compuesto capaz de potenciar directa o indirectamente la expresión de STAT5.

Preferentemente, primero se proporciona a un linfocito B un compuesto capaz de potenciar directa o indirectamente la expresión de Blimp-1 y/o cultivarlo en presencia de un compuesto capaz de potenciar directa o indirectamente la expresión de Blimp-1; antes de aumentar la expresión de BCL6 y/o la actividad de BCL6 de dicho linfocito B.

Como ya se ha explicado anteriormente en el presente documento, dicho compuesto capaz de potenciar directa o indirectamente la expresión de Blimp-1 comprende IL-21, IL-2, IL-6, IL-7, IL-10, IL-15, IL-27, una proteína SOCS, la proteína E E47, E12, E2-2 o HEB, una Janus quinasa mutada y/o una secuencia de ácido nucleico que codifica STAT3 o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma. Lo más preferentemente se usa IL-21. Si se usa una secuencia de ácido nucleico que codifica BCL6, STAT5 y/o STAT3 y/o Bcl-xL, o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma de BCL6, STAT5 y/o STAT3 y Bcl-xL, la expresión de dicha secuencia de ácido nucleico está regulada, preferentemente, por un activado y/o represor que es inducible por un compuesto exógeno. De este modo, la expresión de dicha secuencia de ácido nucleico se regula determinando la cantidad de compuesto exógeno que se administra.

En una realización preferida adicional, se proporciona a una célula productora de anticuerpos un agente de inmortalización con el fin de aumentar la estabilidad, proliferación y/o producción de anticuerpos de dicha célula. Como ya se ha explicado anteriormente, dicho agente de inmortalización comprende, preferentemente, un agente de transformación. En una realización particularmente preferida, un linfocito B se infecta con EBV. Dicho linfocito B se cultiva, preferentemente, en presencia de IL-21. Como se muestra en los ejemplos, los linfocitos B infectados con EBV y cultivados en presencia de IL-21 muestran una fuerte proliferación y una producción de anticuerpos potenciada. Dichos linfocitos B se cultivan preferentemente en presencia de IL-21 antes de infectarse con EBV. No obstante, también es posible aislar linfocitos B infectados por EBV, preferentemente linfocitos B infectados de forma

natural por EBV y cultivarlos en presencia de IL-21. Por tanto, también se proporciona un procedimiento para influir sobre la estabilidad de un linfocito B que comprende cultivar dicho linfocito B en presencia de IL-21 e infectar dicho linfocito B con EBV. En el presente documento también se proporciona un procedimiento para influir sobre la estabilidad de un linfocito B infectado por EBV, que comprende cultivar dicho linfocito B infectado por EBV en presencia de IL-21. En una realización, se cultiva un linfocito B en presencia de IL-21, infectado por EBV y cultivado después en ausencia de IL-21.

Una realización comprende influir sobre la cantidad del producto de expresión BCL6 y el producto de expresión Blimp-1 además de la infección POR EBV. Preferentemente, una célula productora de anticuerpos, preferentemente un linfocito B, se infecta con EBV mientras que BCL6 y Blimp-1 se coexpresan en dicha célula productora de anticuerpos. En una realización preferida, se proporciona a un linfocito B BCL6 y/o un compuesto capaz de potenciar directa o indirectamente la expresión de BCL6, y EBV. Dicho compuesto capaz de potenciar directa o indirectamente la expresión de BCL6 preferentemente comprende STAT5. En otra realización preferida, se proporciona a un linfocito B que ya está infectado (de forma natural) por EBV BCL6 y/o un compuesto capaz de potenciar directa o indirectamente la expresión de BCL6, preferentemente STAT5. Dichos linfocitos B se cultivan preferentemente en presencia de IL-21.

Por tanto, también se proporciona un procedimiento de acuerdo con la invención, que comprende proporcionar un linfocito B; cultivar, preferentemente, dicho linfocito B en presencia de IL-21; proporcionar a dicho linfocito B BCL6 y/o STAT5 o una parte funcional, derivado y/o análogo del mismo; proporcionar dicho linfocito B con el virus de Epstein Barr; y cultiva dicho linfocito B ex vivo. En el presente documento también se proporciona un procedimiento que comprende proporcionar un linfocito B infectado por el EBV; cultivar, preferentemente, dicho linfocito B en presencia de IL-21; proporcionar a dicho linfocito B BCL6 y/o STAT5 o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma; y cultivar dicho linfocito B ex vivo. Se producen linfocitos B que muestran una fuerte proliferación y producción de anticuerpos.

En una realización se analiza en una pluralidad de linfocitos B una especificidad por un antígeno dado. Esto se realiza usando cualquier procedimiento conocido en la técnica, por ejemplo un ELISA. Posteriormente, se selecciona al menos un linfocito B con una especificidad por un antígeno dado. Esto se realiza, por ejemplo, incubando linfocitos B con un antígeno marcado y aislando dichos linfocitos B usando procedimientos conocidos en la técnica. Los linfocitos B seleccionados se cultivan, preferentemente, en presencia de IL-21. De acuerdo con esta realización, las células seleccionadas se proporcionan con BCL6 y/o STAT5 exógenas, o una parte funcional, derivado y/o análogo de las mismas, con el fin de inducir, mantener y/o mejorar la presencia y/o la cantidad de producto de expresión BCL6. Posteriormente, se selecciona al menos un linfocito B que comprende BCL6 y/o STAT5 o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma. Dicho linfocito B seleccionado se infecta con el virus de Epstein-Barr. Esta realización es particularmente adecuada para seleccionar y cultivar linfocitos B con una especificidad dada que derivan de un grupo de linfocitos B. Por ejemplo, los linfocitos B humanos se recolectan mediante selección de CD19, que es un marcador de linfocitos B, y se incuba con un antígeno de interés. De este modo, se seleccionan linfocitos B humanos con una especificidad deseada y se cultivan después ex vivo. Dichos linfocitos B se cultivan, preferentemente, en presencia de IL-21 en al menos una etapa del periodo de cultivo. En una realización preferida, dicho linfocito B se cultiva en presencia de IL-21 antes de introducir en dicho linfocito B BCL6 y/o STAT5, o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma. En otra realización preferida más, dicho linfocito B se proporciona además con Bcl-xL o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma.

Aunque el EBV estimula la proliferación y producción de anticuerpos, la infección por EBV de una célula productora de anticuerpos no siempre se prefiere. Por ejemplo, si se desea un control estricto de las propiedades y características genéricas de una célula productora de anticuerpos, se puede elegir no utilizar la infección por EBV porque la infección por EBV implica incorporación de secuencias de ácido nucleico desconocidas en el genoma de una célula. Además, un linfocito B infectado por EBV pierde su expresión en superficie del receptor de linfocitos B (BCR). Esto puede ser indeseado, por ejemplo cuando se pretende aislar y/o someter a los linfocitos B a detección selectiva de una especificidad deseada después de un periodo de cultivo prolongado. Dicho procedimiento de aislamiento y/o detección selectiva suele implicar la unión de linfocitos B con una especificidad deseada a un antígeno de interés con su BCR. Por tanto, los linfocitos B infectados por EBV con una expresión de BCR significativamente reducida son menos adecuados para dichos procedimientos de aislamiento/detección selectiva. Por consiguiente, en los casos en los que se desea la presencia de un receptor de linfocitos B sobre los linfocitos B, tal como, por ejemplo, en ensayos de detección selectiva, preferentemente, los linfocitos B no son infectados por EBV, o lo son en una etapa posterior.

Una realización proporciona un procedimiento de acuerdo con la invención que además comprende seleccionar y/o aislar un anticuerpo o una parte funcional, derivado y/o análogo de interés. En una realización se seleccionan y/o se aíslan células productoras de IgM y células productoras de IgG. Preferentemente, se selecciona y/o se aísla una célula productora de IgG.

Las células productoras de anticuerpos generadas con un procedimiento de acuerdo con la invención son adecuadas para producir anticuerpos contra un antígeno de interés. No obstante, en una realización preferida, los genes que codifican las cadenas pesada y/o ligera de Ig se aíslan de dicha célula y se expresan en una segunda célula, tal como, por ejemplo, células de una línea celular de ovario de hámster chino (CHO). Dicha segunda célula,

también denominada en el presente documento célula productora, se adapta, preferentemente, a la producción de anticuerpos comerciales. La proliferación de dichas células productoras tiene como resultado una línea celular productora capaz de producir anticuerpos. Preferentemente, dicha línea celular productora es adecuada para producir compuestos para usar en seres humanos. Por tanto, dicha línea celular productora está libre, preferentemente, de agentes patogénicos tales como microorganismos patogénicos.

Preferentemente, se usa un procedimiento de acuerdo con la invención para generar una célula productora de anticuerpos que es estable durante al menos una semana, preferentemente durante al menos un mes, más preferentemente durante al menos tres meses, lo más preferentemente durante al menos seis meses, de modo que la producción de anticuerpos comerciales se ha hecho posible. Una realización preferida proporciona un procedimiento de acuerdo con la invención, en el que se produce una célula productora de anticuerpos que es capaz de producir anticuerpos contra un antígeno de interés. Dicho antígeno de interés comprende un antígeno derivado de patógenos, un antígeno derivado de tumor y/o un autoantígeno. Más preferentemente, se produce una línea celular estable capaz de producir anticuerpos monoclonales. Esto se realiza, preferentemente, usando linfocitos B de memoria que se han aislado, por ejemplo, de una muestra mediante selección de CD19 (marcador de linfocitos B) e IgG de superficie celular y/o CD27 (para marcar linfocitos de memoria). Además, una célula productora de anticuerpos capaz de unirse específicamente a un antígeno de interés se selecciona, por ejemplo, en un ensayo de unión usando dicho antígeno de interés. Posteriormente, de acuerdo con esta realización preferida, Blimp-1 y BCL6 se coexpresan en dicha célula productora de anticuerpos, lo que tiene como resultado un cultivo de células capaz de unirse específicamente a dicho antígeno de interés. Preferentemente, dicha célula productora de anticuerpos está infectada con EBV. En otra realización preferida más, dicho linfocito B se proporciona además con Bcl-xL o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma.

Si solo se usa un linfocito de memoria se obtiene una línea celular de acuerdo con la invención que produce anticuerpos monoclonales. También es posible generar una línea celular productora de anticuerpos monoclonales a partir de varios linfocitos B capaces de producir anticuerpos contra diferentes antígenos. Después de producirse un cultivo de linfocitos B estables con un procedimiento de acuerdo con la invención, se aísla un linfocito B capaz de producir anticuerpos contra un antígeno de interés específico y al menos una parte funcional de un gen que codifica la cadena pesada y/o la cadena ligera de Ig de dicho linfocito B se expresa en una segunda línea celular. Preferentemente, al menos una parte funcional del gen que codifica la cadena pesada de Ig y al menos una parte funcional del gen que codifica la cadena ligera de Ig de dicho linfocito B se expresan en una segunda línea celular.

En una realización, una célula productora de anticuerpos, preferentemente aunque no necesariamente un linfocito B de memoria, que se ha obtenido de un individuo que se ha expuesto previamente a un antígeno de interés, se usa en un procedimiento de acuerdo con la invención. De este modo, se ha hecho posible producir anticuerpos humanos de interés ex vivo.

La invención proporciona además una célula productora de anticuerpos que es estable durante al menos una semana, preferentemente durante al menos un mes, más preferentemente durante al menos tres meses, más preferentemente durante al menos seis meses, lo que significa que una célula productora de anticuerpos de acuerdo con la presente invención es capaz de replicarse y de producir anticuerpos o es capaz de replicarse y de desarrollarse en una célula que produce anticuerpos, durante dichos periodos de tiempo. Las células productoras de anticuerpos de acuerdo con la invención comprenden, entre otras cosas, células productoras de IgM y células productoras de otros isotipos de inmunoglobulina como IgG, IgA, IgE. Una célula productora de anticuerpos de acuerdo con la invención es particularmente adecuada para usar en una línea celular productora de anticuerpos. Las células productoras de anticuerpos de acuerdo con la invención se cultivan, preferentemente, ex vivo y los anticuerpos producidos por dichas células se recogen, preferentemente, para su uso posterior. Como alternativa, o adicionalmente, los genes que codifican los anticuerpos de dichas células se aíslan para su uso posterior. Los anticuerpos o partes funcionales, derivados yo análogos de los mismos producidos con un procedimiento de acuerdo con la invención son útiles para una amplia variedad de aplicaciones, tales como, por ejemplo, aplicaciones terapéuticas, profilácticas y diagnósticas, así como para fines de investigación y experimentos ex vivo. Por ejemplo, se realiza un ensayo de detección selectiva en el que los anticuerpos o partes funcionales, derivados y/o análogos de acuerdo con la invención se incuban con una muestra con el fin de determinar si está presente un antígeno de interés.

Una célula productora de anticuerpos de acuerdo con la invención comprende, preferentemente, una célula de mamífero, más preferentemente una célula humana, una célula murina, una célula de conejo y/o una célula de llama. En una realización particularmente preferida, dicha célula productora de anticuerpos comprende una célula humana productora de anticuerpos humanos, porque los anticuerpos humanos son particularmente adecuados para aplicaciones terapéuticas y/o profilácticas en individuos humanos.

Una célula productora de anticuerpos de acuerdo con la invención comprende, preferentemente, un compuesto exógeno que es capaz de influir directa o indirectamente sobre la expresión de BCL6 y un compuesto exógeno que es capaz de influir directa o indirectamente sobre la expresión de Blimp-1. Una célula productora de anticuerpos de acuerdo con la invención comprende, preferentemente, un compuesto exógeno que es capaz de potenciar directa o indirectamente la expresión de BCL6 y un compuesto exógeno que es capaz de potenciar directa o indirectamente la expresión de Blimp-1, porque la coexpresión de BCL6 y Blimp-1 tiene como resultado una célula productora de

anticuerpos preferida de acuerdo con la invención que es capaz de proliferar y de producir anticuerpos.

Como se ha explicado anteriormente en el presente documento, la expresión de BCL6 se potencia de varias formas. La expresión de BCL6 se regula por aumento, preferentemente, usando una secuencia de ácido nucleico que codifica BCL6 y/o STAT5 o un una parte funcional, derivado y/o análogo de BCL6 y/o STAT5. Por tanto, también se proporciona una célula productora de anticuerpos de acuerdo con la invención, que comprende una secuencia de ácido nucleico exógena que codifica BCL6 o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma, y/o una secuencia de ácido nucleico exógena que codifica STAT5, o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma.

Además, la expresión de Blimp-1 se potencia de varias formas. Preferentemente, se usa una secuencia de ácido nucleico que codifica STAT3 o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma. Por tanto, la invención proporciona además una célula productora de anticuerpos de acuerdo con la invención que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica STAT3 o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma.

En una realización, dicha secuencia de ácido nucleico que codifica BCL6, STAT5, STAT3 y/o Bcl-xL y/o una parte funcional, derivado y/o análogo de BCL6, STAT5 y/o STAT3 y/o Bcl-xL es constitutivamente activa, de modo que BCL6, STAT5, STAT3 y/o una parte funcional, derivado y/o análogo de las mismas permanece presente en una célula productora de anticuerpos de acuerdo con la invención, incluso cuando los genes de BCL6, STAT5 y/o STAT3 y/o Bcl-xL están reguladas por disminución mediante compuestos endógenos. Lo más preferentemente, la expresión de dicha secuencia de ácido nucleico que codifica BCL6, STAT5, STAT3 y/o Bcl-xL, o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma de BCL6, STAT5 y/o STAT3 y/o Bcl-xL, está regulada por un activador y/o represor que es inducible por un compuesto exógeno, de modo que la cantidad de BCL6, STAT5, STAT3 y/o Bcl-xL o una parte funcional, derivado y/o análogo de las mismas está regulada a voluntad regulando la cantidad de compuesto exógeno que se administra, Si se usa una secuencia de ácido nucleico que codifica BCL6, STAT5 y/o STAT3 y/o Bcl-xL, o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma de BCL6, STAT5 y/o STAT3 y Bcl-xL, la expresión de dicha secuencia de ácido nucleico está regulada, preferentemente, por un activado y/o represor que es inducible por un compuesto exógeno.

Como se ha explicado anteriormente, en varias realizaciones, las células productoras de anticuerpos de acuerdo con la presente invención están infectadas por el EBV. Por tanto, la invención proporciona también una célula productora de anticuerpos que comprende:

1) un agente de inmortalización, preferentemente un agente transformante, más preferentemente el virus de Epstein Barr; y

2) un compuesto que es capaz de influir directa o indirectamente sobre la cantidad del producto de expresión BCL6 en dicha célula y un compuesto que es capaz de influir directa o indirectamente sobre la cantidad del producto de expresión Blimp-1 en dicha célula. En una realización se proporciona una célula productora de anticuerpos con BCL6 y/o STAT5 y posteriormente se infecta con EBV. Por tanto, también se proporciona una célula productora de anticuerpos que comprende el virus de Epstein Barr y BCL6 exógena o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma. También se proporciona una célula productora de anticuerpos que comprende el virus de Epstein Barr y STAT5 exógena o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma. Dicha célula productora de anticuerpos es, preferentemente, un linfocito B. Como se demuestra en los ejemplos, los linfocitos B proporcionados con BCL6/STAT5 y EBV muestran una proliferación y producción de anticuerpos particularmente fuertes.

Una célula productora de anticuerpos de acuerdo con la presente invención con una estabilidad mayor es particularmente adecuada para la producción de una línea celular ex vivo. Por tanto, la invención proporciona también un procedimiento para producir una línea celular productora de anticuerpos que comprende:

-: obtener una célula productora de anticuerpos estable con un procedimiento de acuerdo con la invención, y -cultivar dicha célula productora de anticuerpos ex vivo.

Preferentemente se genera una línea de linfocitos B. Lo más preferentemente, se genera una línea celular estable que comprende linfocitos B capaces de producir anticuerpos dirigidos específicamente contra un antígeno de interés. Esto se realiza preferentemente obteniendo un linfocito B que es capaz de desarrollarse en una célula que produce anticuerpos contra un antígeno de interés, tal como, por ejemplo, un antígeno derivado de patógenos, un antígeno derivado de tumor y/o un autoantígeno. La cantidad del producto de expresión BCL6 y Blimp-1 se regula posteriormente, En una realización preferida, dicho linfocito B está infectado por el EBV. Dicho linfocito B se obtiene, preferentemente, de un individuo que se ha expuesto a un antígeno de interés. Preferentemente, dicho individuo comprende un mamífero, más preferentemente un individuo humano, un conejo, un roedor y/o una llama. En una realización particularmente preferida, dicho individuo es un individuo humano.

Por tanto, la invención proporciona un procedimiento de acuerdo con la invención, que comprende:

-: obtener un linfocito B de un individuo, preferentemente un individuo humano, que se ha expuesto a un antígeno

de interés. -producir una célula productora de anticuerpos que es estable durante al menos una semana, preferentemente

durante al menos un mes, más preferentemente durante al menos tres meses, más preferentemente durante al

menos seis meses, usando dicho linfocito B obtenido de dicho individuo en un procedimiento de acuerdo con la

invención, y -cultivar dicha célula productora de anticuerpos ex vivo.

Una aplicación importante es la producción de anticuerpos que son capaces de unirse específicamente a un antígeno de interés. Una realización de la invención proporciona un procedimiento para producir anticuerpos capaces de unirse específicamente a un antígeno de interés, comprendiendo el procedimiento:

-: obtener un linfocito B capaz de diferenciarse en un linfocito B, de modo que el linfocito B produce anticuerpos

capaces de unirse específicamente a dicho antígeno de interés. -producir una célula productora de anticuerpos que es estable durante al menos una semana, preferentemente

menos seis meses, usando dicho linfocito B en un procedimiento de acuerdo con la invención, y -obtener anticuerpos producidos por dicha célula productora de anticuerpos.

Dicha célula productora de anticuerpos se cultiva además, preferentemente, ex vivo con el fin de proporcionar una línea celular estable capaz de producir anticuerpos específicamente dirigidos hacia un antígeno de interés. Más preferentemente, al menos una parte funcional de un gen que codifica la cadena pesada y/o la cadena ligera de Ig de dicho linfocito B se expresa en una segunda línea celular. Dicha segunda célula se usa, preferentemente, para producir una línea celular comercialmente adecuada.

La invención se explica adicionalmente en los ejemplos siguientes. Estos ejemplos no limitan el alcance de la invención, sino que simplemente sirven para aclarar la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1

Procedimientos

Los linfocitos B de memoria humanos se purifican en sangre periférica o de amígdalas primero mediante selección positiva de linfocitos B con perlas CD19 MACS® (Miltenyi Biotech). Después, los linfocitos B de memoria se seleccionan mediante tinción de superficie y clasificación de las células según IgG. Los linfocitos B IgG+ se cultivan con células L de fibroblasto de ratón que expresan CD40L en presencia de IL-21 de ratón o humana durante de 36 a 48 horas. Después, las células se transfieren a placas de cultivo tisular recubiertas con Retronectin® (Takara, Shiga, Japón), en las que se transducen con un retrovirus que codifica BCL6-IRES-GFP humanas durante 16 horas a 37ºC. Después, las células transducidas se cultivan en células CD40L-L en presencia de IL-2 humana e UL-4 humana. Tras aproximadamente 3-4 semanas, las células GFP+ (es decir, células BCL6+) alcanzan un 100% del cultivo tras lo cual las células BCL6+ se cultivan con IL-2 e IL-4 o con IL-21 humana o de ratón. Usando citometría de flujo, los inventores monitorizan la expresión de GFP, CD19, CD38, CD20, MHC de clase II, CD27 (BD Biosciences), y otros marcadores usando anticuerpos marcados. Los inventores monitorizan el crecimiento mediante recuento celular y la producción de Ig se monitoriza mediante detección enzimática con ELISA de Ig en el sobrenadante del cultivo (Dako, Glostrup, Dinamarca). La expresión génica se monitoriza mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR, Invitrogen, Breda, Países Bajos).

Resultados

La introducción de BCL6 en los linfocitos B de memoria tiene como resultado un ciclo de vida considerablemente extendido sobre los linfocitos B normales en cultivo (meses frente a ! 3 semanas). Estas células mantienen CD19, Ig de superficie, MHC de clase II, y expresan niveles intermedios de CD38 y CD20, lo que sugiere un fenotipo de célula de memoria (no mostrado). El cultivo de estas células sobre las células CD40L-L en presencia de IL-21 tiene como resultado una ventaja significativa sobre el crecimiento Figura 1) y adquisición de un fenotipo de superficie celular de tipo plasmablasto (CD38hiCD20+, Figura 2). Es importante el hecho de que las células cultivadas con IL-21 secretan un 300% más de IgG en comparación con las células cultivadas en IL-2 e IL-4. En conjunto, estos datos muestran que el cultivo en IL-21 estimula el desarrollo de plasmablastos en una población de linfocitos B inmortalizados, que exhiben un mayor crecimiento y producción de anticuerpos.

Ejemplo 2

Un modelo no limitante de una realización de la presente invención se represente en la Figura 4.

En el cuerpo humano, la diferenciación de las células plasmáticas a partir de linfocitos B de memoria implica la regulación por disminución de BCL6 y la regulación por aumento de Blimp-1. En las células de memoria, la expresión de BCL6 es alta y la expresión de Blimp-1 es baja. Las señales que desencadenan la diferenciación producen una regulación por aumento de Blimp-1 y esta Blimp-1 contrarresta la expresión de BCL6. Esta etapa es corta y se denomina plasmablasto. Con niveles progresivamente crecientes de Blimp-1, se extingue la expresión de BCL6, lo que tiene como resultado una célula plasmática.

En una realización de la invención, la expresión de BCL6 se “cierra”, por ejemplo, por la expresión estable mediada por un casete de expresión retroviral integrado en el ADN de los linfocitos B. Después, con niveles de BCL6 mantenidos, los inventores “cambiaron” a la expresión de Blimp-1, por ejemplo mediante el uso de una citocina que activa la STAT3, tal como la IL-21 (figura 3). Esta combinación, mediante la modulación de la transcripción clave, tiene como resultado un crecimiento estable de las células que secretan anticuerpos y tienen características del fenotipo de un plasmablasto.

Tabla 1: Marcadores de superficie celular de los linfocitos B de memoria, plasmablastos y células plasmáticas

Memoria Plasmablastos Célula plasmática

CD38 + ++ ++ CD20 ++ - CD27 ++ - CD19 +++ -

CD138 --+ proliferación Baja Alta ninguna Secreción de Ig Baja Intermedia Alta

Tabla 2 Memoria Plasmablastos Célula plasmática

BCL6 +++ Blimp-1 -+ ++

Ejemplo 3

Materiales y procedimientos

Mantenimiento y aislamiento de linfocitos B humanos

Usando procedimientos estándar, los linfocitos B humanos CD19 positivos se aislaron de capas leucocíticas del banco de sangre (otras fuentes pueden ser heparina fresca o sangre ACD o un órgano linfoide, por ejemplo amígdalas o bazo). En resumen, se aislaron las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) totales usando una separación por gradiente de densidades en Ficoll (Amersham, Buckinghamshire, EE.UU.). Se usaron perlas marcadas con CD19 para seleccionar de forma positiva linfocitos B mediante la técnica de clasificación celular MACS (Miltenyi, Auburn, CA, EE.UU.). Después, las células se tiñeron con combinaciones adecuadas de anticuerpos monoclonales (AcMo) frente a CD19, CD27, IgG, IgM, CD3 (Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ, EE.UU.) y toxoide del tétanos marcado con ficoeritrina (PE) (proporcionado por A. Radbruch, Berlín, Alemania) o cualquier otra célula marcada con el antígeno se clasificaron usando FACSAria (BD) Las células clasificadas se lavaron y cultivaron (1,5 a 2x105 células/ml) en células L que expresan CD40L irradiadas (5x104 células/ml; proporcionadas por DR. J. Banchereau, Schering Plough France, Dardilly Francia) en medio mínimo esencial D modificado de Iscove (IMDM) que contiene 8% de suero bovino fetal (FCS) y penicilina/estreptomicina. A menos que se mencione otra cosa, estas células L que expresan CD40L están siempre presentes en los cultivos.

Transducción y regulación de STAT5b constitutiva activa de ratón en linfocitos B

Los linfocitos B purificados se sensibilizaron para someterlas a transducción con el gen caSTAT5b. Se usaron dos protocolos de sensibilización: (1) los linfocitos B purificados se cultivaron durante 3 días con interleucina (IL) 2 (20 U/ml, Chiron, Emeryville, CA, EE.UU.), seguido de un cultivo de 24 horas con IL-2 e IL-4 (10 ng/ml, R&D, Minneapolis, MN, EE.UU.) o (2) los linfocitos B purificados se cultivaron durante 36 horas con IL-21 de ratón recombinante (50 ng/ml, R&D). Después, las células se sembraron en placas tratadas con fragmentos de fibronectina humana recombinante CH-296 (Hanenberg H., Nat., Med. 1996; RetroNectin, Takara, Japón) y con seroalbúmina (Corning Life Sciences, Corning, NY, EE.UU.) en ausencia de células L, con las citocinas IL-2/4 o IL

21. Por último, se transdujeron las células con el gen caSTAT5b (descrito por Ariyoshi K., JBC, 2000 y obtenido de

T. Kitamura, IMSUT, Tokyo, Japón) fusionado con el receptor de estrógenos (ER, suministrado por H. Kurata, DNAX Institute, Palo Alto, CA, USA). La actividad del producto de fusión caSTAT5b-ER se puede controlar con la hormona hidroxitamoxifeno (4HT, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.). La transducción se realizó usando un retrovirus como se ha descrito anteriormente (Heemskerk M.H., JEM, 1997; Heemskerk M.H., Cell Immunol 1999; Scheeren F.A., Nat Immunol, 2005). La eficiencia de la transducción se determinó mediante la tinción con anticuerpo de un mutante truncado de señalización incompetente de receptor del factor decrecimiento neural (ΔNGFR, suministrado por C. Bonini, St. Raphael Hospital, Milán, Italia). Por tanto, el sobrecrecimiento de los linfocitos B que contienen el gen caSTAT5b depende de la presencia de 4HT y estas células se pueden detectar mediante tinción de anticuerpos para NGFR (Chromaprobe, Maryland Heights, MO, EE.UU.).

Desarrollo de 100% de las líneas de linfocitos B positivas para caSTAT5b que secretan anticuerpos

Los inventores han desarrollado una línea de linfocitos B que produce anticuerpos monoclonales y es 100% positiva para caSTAT5b (=NGFR). Esto se consiguió diferenciando los linfocitos B de una memoria en un fenotipo productor de anticuerpos y transluciendo con la construcción caSTA5b-ER-IRES-NGFR. La acción de caSTAT5b hace que los linfocitos B diferenciados sean insensibles a la muerte celular. La diferenciación de los linfocitos B se induce en las primeras 2 a 3 semanas tras el aislamiento (figura 5) usando una mezcla de citocinas (IL-2, 4, 21 o combinaciones de estas citocinas y CD40L). El punto de tiempo en el que se activa caSTAT5b añadiendo 4HT afecta al fenotipo global de los cultivos. Esto es porque caSTAT5b bloquea la célula para cambiar su fenotipo, por ejemplo bloquea la diferenciación posterior. Por tanto, cuanto más tiempo se mantiene el 4HT, más linfocitos B se diferenciarán en células productoras de anticuerpos o en un tipo de célula que crece, preferentemente, en estas condiciones de cultivo (sugerencias para los tipos celulares son: linfocitos B no expuestos previamente, foliculares, de memoria, productoras de anticuerpos, plasmablastos, células plasmáticas, zona marginal, perisinusoidales o transicionales, muchas de estas subpoblaciones de linfocitos B solo se han determinado en ratones). Cuando hay 4HT en el medio de cultivo, los linfocitos B positivos para caSTA5b-ER-IRES-NGFR pueden sobrevivir durante largos periodos de tiempo (Tabla 2).

Tabla 2. Visión general de cultivos de linfocitos B humanos transducidos con caSTAT5b-ER-IRES-NGFR. Se obtuvieron PBMC tras aislamiento por gradiente en Ficoll de capas leucocíticas derivadas de bancos de sangre y después se clasificaron mediante clasificación celular CD19 MACS y CD27 o mediante FACSAria. Después, los linfocitos B purificados se cultivaron en presencia de células L con las citocinas indicadas antes de su transducción con un retrovirus que contiene la construcción génica caSTAT5b-ER-IRES-NGFR.

Donante: Aisla miento Trans ducción Tiempo de cultivo

Fecha: Subtipo Protocolo Tiempo con IL-21

B12: CD19+TT+ IL-2 IL-4 4 sem

B15: CD19+TT+ IL-21 36 h

B16: CD 19+TT+ IL-21 20 d

B18: CD19+CD27+ y TT+ IL-2 IL-4 y IL-21 Serie de tiempo (36 h a 20 d)

B19: CD19+CD27+ y TT+ IL-2 IL-4 y IL-21 Serie de tiempo (36 h a20d)

B20: CD19+TT+ IL-21 36 h

B21: CD 19+TT+ IL-21 36 h

B22 / B23 / B24: CD19+CD27+ IgM-y TT+ IL-21 5 d

B25 /B26: CD19+CD27+ IgM IL-21 7 d

B27 / B28: CD19+CD27+ IL-21 7 d

B29 / B30: CD19+CD27+ IL-21 42 h

Desarrollo de cultivos de linfocitos B clonales derivados de una sola célula

El sobrecrecimiento de los linfocitos B positivos para caSTA5b-ER-IRES-NGFR generalmente dura aproximadamente 4 semanas, tras las cuales se pueden obtener cultivos clonales realizando cultivos de dilución límite (DL) o clasificación de una sola célula usando citometría de flujo (FACSAria). Estos cultivos consisten en 2.500 a 5.000 células L, concentraciones normales de IL-2 e IL-4 y 1, 5 o 10 linfocitos B/96 pocillos cuando se realiza la DL con 100% de células NGFR+ y 10, 100 y 1.000 células/96 pocillos cuando las células NGFR+ se clasifican en 96 pocillos usando el FACSAria.

Reestimulación de la producción de anticuerpos de cultivos de linfocitos B positivos para caSTAT5b-ER

Los cultivos de linfocitos B positivos para caSTAT5b-ER-IRES-NGFR poli, oligo o monoclonales negativos o con baja producción de anticuerpos se lavaron extensamente antes de que los cultivos (1) se preparan de 4HT, IL-2 e IL4 antes de cultivarse con IL-21, después tras 4-10 días de analizar los sobrenadantes para determinar la producción de IgM y de IgG o (2) se privaran de 4HT durante 10 días durante el cultivo con IL-2 e IL-4 y, después, el día 10 se sustituyó la IL-2 y la IL-4 por IL-21. Después, se analiza la producción de IgM y de IgG en los sobrenadantes a diferentes puntos de tiempo.

Resultados

Diferenciación y proliferación de linfocitos B; las IL-2 e IL-4. Protocolo de IL-21. Los cultivos de linfocitos B tratados con IL-21 mostraron respuestas proliferativas potenciadas en las primeras 2-3 semanas en comparación con IL-2 e IL-4 (figura 6a). No obstante, al contrario de los cultivos de IL-2 e IL-4, la estimulación continua con IL-21 tuvo como resultado una disminución de proliferación y muerte celular, incluso en presencia de STAT5b activa (figura 6b). Sugerir que la IL-21 en última instancia tenía que sustituirse por IL-2 e IL-4. Para estudiar esto con más detalle se realizó un experimento con series de tiempos realizado con linfocitos B de memoria CD19+CD27+ en los que se sustituyó IL-2 e IL-4 tras 36 horas o 5, 10, 15 y 20 días. También se muestra en la figura 7 que la mayoría de los cultivos podrían mantenerse después de la retirada de IL-21, incluso cultivos que habían recibido IL-21 durante 20 días.

Producción de anticuerpos por cultivos de linfocitos B humanos totales reforzados por IL-21

Es interesante el hecho de que, al contrario que los cultivos de IL-2 e IL-4, los cultivos reforzados con IL-21 pudieron producir anticuerpos durante un periodo de tiempo relativamente largo (IgG e IgM medidas mediante ELISA, Dako, Glostrup, Dinamarca) (figura 8a y 8b, respectivamente). Es importante el hecho de que los cultivos de linfocitos B de memoria policlonales de los donantes B18 y B19 se obtuvieron clones de una sola célula mediante cultivo de DL (tabla 3).

Tabla 3. Frecuencia de los clones que se aislaron de linfocitos B CD19+CD27+NGFR+ clasificados. Las células se clasificaron en 96 pocillos como 1.000, 100, 10 o 1 célula por pocillo. Los pocillos contenían 5.000 células L que expresan CD40L, IL-2 e IL-4. De ¼ a ½ del medio se sustituyó dos veces a la semana con citocinas frescas y 2.500 células L.

Donante: B18 B19

Pocillo positivo: Nº total de pocillos Pocillo positivo Nº total de pocillos

1.000 c/p: 8 9 8 10

100 c/p: 21 48 19 48

10 c/p: 6 48 2 48

1 c/p: 1 96 6 96

La mayoría de los cultivos clonales produjeron IgM, mientras que solo algunos produjeron IgG (figura 9). Además, dos cultivos clonales produjeron el clon 7 y el clon 8 de IgM e IgG). Queda pendiente de determinar si estos clones eran de hecho clonales o si se había producido un cambio de clase. En este último caso, debería encontrarse una región VDJ de BCR en los fragmentos génicos de IgG o IgM en este cultivo.

Producción de anticuerpos de cultivos de linfocitos B específicos del toxoide del tétanos reforzados con IL-21

Después, los inventores analizaron su podían aislar linfocitos B productores de anticuerpo específicos del toxoide del tétanos (TT). En resumen, se llevó a cabo el siguiente protocolo:

PARTE 1

(1): Los linfocitos B CD27+TT+ se clasificaron (la recuperación dependía del donante y varió de 10.000-1.000 células).

(2): se cultivaron con IL-21 durante 36 horas.

(3): se transdujeron con caSTA5b-ER-IRES-NGFR,

(4): y se cultivaron durante tiempos variables con IL-21 (36 h a 3 semanas) tras lo cual se sustituyó la IL-21 por IL-2, IL-4 y 4HT.

PARTE 2

(5) cuando los cultivos fueron 100% de NGFR+, se clonaron mediante dilución limitante (DL)

Tras de 2 a 3 meses de cultivo, los cultivos de linfocitos B policlonales específicos de α-TT 100% NGFR+ se obtuvieron de al menos 7 donantes diferentes (PARTE 1). Se comprobó que todos los donantes eran positivos en un ELISA de anticuerpos específicos de α-TT-IgG (biopharm, Darmstadt, Alemania). Como se muestra en la figura 10a, los niveles de α-TT IgG fueron relativamente bajos. Dado que la inmortalización de los linfocitos B de memoria tuvo como resultado números elevados de células productoras de IgM (Figura 9), ello indica que la mayoría de los cultivos TT son positivos para IgM. Como se muestra en la figura 10b, cinco de siete donantes producían IgM, lo que sugiere que los anticuerpos anti-TT son de origen en IgM y, por tanto, no se detectan en el ELISA de α-TT IgG.

Esto dejó que los inventores desarrollaran un ELISA de α-TT IgM basado en el ELISA de α-TT IgG de r-biopharm. La única diferencia está en la última etapa, a continuación se añade un anticuerpo IgM-HRP α-humano en lugar de una IgG-HRP anti-humana.

Después, de los cultivos TT policlonales, los clones de linfocitos B específicos de α-TT se obtuvieron con cultivos DL (PARTE 2). Estos cultivos de DL se iniciaron con linfocitos B específicos de α-TT policlonales 100% NGFR+ de los cuatro donantes (tabla 4). Los clones del donante B16 produjeron principalmente IgG, mientras que B18 y B19 produjeron IgM y B15 produjo tanto IgG como IgM (no mostrado). Después, los sobrenadantes de estos clones se analizaron en un ELISA dIgG TT o IgM (Figura 11). Además del donante 15, todos los donantes mostraron unión a TT, aunque solo 5 clones produjeron títulos de anticuerpos anti-TT relativamente altos.

Tabla 4. Cultivo de dilución límite de linfocitos B específicos de TT 100% NGFR+. Se indica el número total de clones aislados y en qué condiciones se aislaron, 1, 5 o 10 células/pocillo. Se usó una placa de 96 pocillos para cada condición (1, 5 o 10 células/pocillo). Los pocillos contenían 2.500 células L que expresan CD40L, IL-2 e IL-4. De ¼ a ½ del medio se sustituyó dos veces a la semana con citocinas frescas y 2.500 células L.

Donante Número de clones positivos de 96 pocillos

Nº Total: De 1 c/p De 5 c/p De 10 c/p

B15: 12 2 10 -

B16: 14 - 7 7

B18: 10 10 - -

B1911 1 3 7

Reestimulación de la producción de anticuerpos de cultivos de linfocitos B específicos del toxoide del tétanos potenciados con IL-21

Los inventores pudieron generar cultivos de linfocitos B poli y monoclonales productores de IgM e IgG usando IL-21 como estímulo. No obstante, la producción de anticuerpos no era estable. No obstante, para su sorpresa, estos cultivos tratados con IL-21 se pudieron reestimular para producir anticuerpos IgG e IgM (figura 12a y 12b, respectivamente). Esto se consiguió mediante la retirada de 4HT y estimulación simultánea con IL-21. Usando este protocolo, la producción total de anticuerpos aumentó de 2 a 1000 veces para IgM, y de 2 a 25 veces para IgG. Se comprobó que varios de los sobrenadantes de cultivos monoclonales reestimulados eran positivos en el ELISA del tétanos para IgG e IgM (figura 13).

Cabe destacar que no se pudo reestimular los cultivos de linfocitos B caSTAT5b o caSTAT5b-ER B que no se habían tratado con IL-21 antes de la transducción de caSTAT5b y la posterior expansión para producir anticuerpos en ninguna condición (véase la solicitud de patente WO 03/052083; no mostrado en el presente documento).

Ejemplo 4

Materiales y procedimientos

Los procedimientos detallados sobre:

∀ Mantenimiento y aislamiento de linfocitos B humanos; ∀ Transducción y regulación de STAT5b constitutiva activa de ratón en linfocitos B; ∀ Desarrollo de 100% de las líneas de linfocitos B positivas para caSTAT5b que secretan anticuerpos; ∀ Desarrollo de cultivos de linfocitos B clonales derivados de una sola célula; y ∀ Reestimulación de la producción de anticuerpos de cultivos de linfocitos B positivos para caSTAT5b-ER

se describen en el Ejemplo 3.

Producción de anticuerpos en cultivos de linfocitos B que contienen IL-21 que están infectados por EBV y expresan BCL6-IRES-NGFR o caSTAT5-ER-IRES-NGFR

Los linfocitos B CD19+CD27+ primarios purificados (linfocitos B) se estimularon durante 36 horas con IL-21 y se irradiaron las células L que expresan CD40L (células L) irradiadas antes de transducirlas con BCL6-IRES-NGFR o caSTAT5b-ER-IRES-NGFR. Tras la transducción, las células transducidas con CBL6 se cultivaron con IL-21 y las células transducidas con caSTAT5b-ER se cultivaron con IL-2 e IL-4. Las células transducidas fueron positivas para NGFR en 2 a 3 días y después se clasificaron en un FACSAria. Las células clasificadas como NGFR se cultivaron después a densidades celulares de 100 a 5.000 células/96 pocillos (cultivos minivoluminosos, MBC). Los MBC de BCL6/IL-21 proliferaron mucho en comparación con los cultivos caSTAT5b-ER. En estos cultivos se analizó la producción de anticuerpos, se expandieron a 24 pocillos y se congelaron (células viables, sedimentos celulares y sobrenadante). Los cultivos caSTAT5b-ER se expandieron dividieron en dos de 96 pocillos paralelos. Un pocillo se cultivó con IL-2, IL-4 y 4HT y el otro pocillo se cultivó con IL-21 y sin 4HT.

RT-PCR

Para analizar si la respuesta proliferativa estaba relacionada con la presencia de EBV se realizó una RT-PCR de EBV. El ARN se aisló de sedimentos descongelados usando el kit RNeasy mini kit (Qiagen). El ARN se sometió a

transcripción inversa en un volumen de 20 μl que contenían 5 tampones de primera hebra, dNTP 500 μM, 25 μg/l de oligo(dT) y 200 U de superscript II RT (Life Technologies). Una porción de la solución de ADNc (1 μl) se amplificó mediante PCR en una solución de 50μl que contiene Tris-HCl 20 mM, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, dNTP 5 mM, 2,5 U de Taq ADN polimerasa (Life Technologies) y 30 pmol de cada cebador. Las condiciones de la PCR fueron las siguientes: Una etapa de desnaturalización de 7 minutos a 94ºC, seguido de 30 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 62ºC (HPRT1), 52ºC (LMP-1) y a 58ºC (EBNA1/2) y 30 segundos a 72ºC y una extensión final de 7 minutos a 72 ºC. Los oligonucleótidos usados para RT-PCR fueron los siguientes: HPRT1 directo (5'-TATGGACAGGACTGAACGTCTTGC-3') y HPRT1 inverso (5'-GACACAAACATGATTCAAATCCCTGA-3'); LMP-1 directo: (5'-GCGACTCTGCTGGAAATGAT-3') y LMP-1 inverso (5'-GACATGGTAATGCCTAGAAG-3'); EBNA1/2 directo (5'-AGCAAGAAGAGGAGGTGGTAAG-3') y EBNA1/2 inverso (5'-GGCTCAA.AGTGGTCTCTAATGC-3').

Además de la RT-PCR, los inventores realizaron una PCR directamente con el sedimento celular y ADN del sobrenadante, que se aisló usando el kit de aislamiento QIAmp (Qiagen).

Cultivos de EBV

Para estudiar el papel del EBV en el sistema de los inventores con más detalle, los inventores prepararon experimentos para determinar la proliferación y la producción de anticuerpos en células no transducidas y transducidas con caSTAT5b-ER-IRES-NGFR que se obtuvieron de cultivos con o sin EBV natural.

Primera preparación experimental

Tabla 5: Preparación experimental

Tabla 5 en resumen:

BCL6

1: BCL6 IL-21

2: BCL6 IL-21 EBV

3: IL-21 EBV

MBC de BCL6 con IL-21 y células L (cultivos Ce2-B9 y Ce2-G9) MBC de BCL6 con IL-21 y células L y EBV (cultivos Be3-F3 y Be2-G9) MBC de EBV con IL-21 y células L (cultivos B28 y B29) Los cultivos con IL-2 e IL-4 también se incluyeron. A intervalos semanales se determinaron los niveles de

anticuerpos y números celulares (Tabla 7). El estado EBV de los cultivos se muestra en la Figura 14.

Segunda preparación experimental Tabla 6: Preparación experimental caSTAT5b-ER

1: 4HT IL-2 e IL-4

2: Sin 4HT IL-21

3: Sin 4HT IL-21 EBV

Tabla 6. MBC de caSTAT5b-ER se cultivaron en 4HT, células L, IL-2 e IL-4 en 96 pocillos a 1.000 c/p. Cuando la densidad celular fue lo bastante alta se crearon suficientes cultivos paralelos. Una parte se mantuvo en 4HT, células L, IL-2 e IL-4, mientras que la otra parte se cambió a IL-21, células L pero sin 4HT. La producción de anticuerpos se determinó mediante ELISA (DAKO). La infección por EBV se determinó mediante PCR de LMP1 (Figura 16).

Resultados

Infección por EBV de cultivos BCL6, determinado mediante PCR

Se descubrió que la IL-21 inducía una fuerte proliferación y diferenciación de linfocitos B, que los inventores analizaron en dos donantes en combinación con la transducción de BCL6 (Tabla 5). De hecho, los inventores encontraron un fuerte sobrecrecimiento de linfocitos B en condiciones de cultivo en las que los inventores cultivaron los linfocitos B a densidades de 1.000 y 100 c/p (Tabla 7). No obstante, en un donante, en base al fenotipo mediante microscopia óptica, el color del sobrenadante del cultivo y la enorme expansión celular, se sospechó que casi todos los cultivos estaban infectados por el EBV. De hecho, se descubrió que este donante (B29) estaba infectado por EBV (Figura 14). El sobrecrecimiento masivo de las células infectadas por EBV demuestra que la combinación de BCL6 e IL-21 da una ventaja de crecimiento para las células infectadas por EBV especialmente dado que se piensa que la frecuencia que los linfocitos B infectados por EBV in vivo es relativamente baja. En contraste con el donante B29, el donante 30 era negativo para el EBV, a excepción de una banda de LMP1 débil y relativamente pequeña en la muestra Ce2-F2 (Figura 14).

Proliferación de cultivos de BCL6 en presencia o ausencia de EBV, IL-2, IL-4 e IL-21

Para estudiar el papel de EBV, BCL6, IL-2, IL-4 e IL-21 sobre el crecimiento celular se compararon las cinéticas de la proliferación (véase en la tabla 5 la preparación del experimento). Las muestras se seleccionaron en base a las reacciones de PCR de LMP-1 EBV (Figura 14). El estado del EBV se confirmó mediante la capacidad de las células infectadas por EBV para crecer en ausencia de células L. Las muestras de BCL6 cultivadas con IL-2 e IL-4 mostraron una baja capacidad de proliferación y no se pudieron mantener (Tabla 7). Todas las muestras cultivadas en medio que contiene IL-21 mostraron una fuerte proliferación. IL-2 e IL-4 solo pudieron inducir una fuerte proliferación cuando las células se infectaron con EBV solo, no en combinación con BCL6.

Tabla 7: Proliferación de BCL6 B

Tabla 7. Proliferación de linfocitos B transducidos o no transducidos con y sin EBV o con y sin IL-2 IL-4 o IL-21; todas las muestras contenían células L.

Células

Condiciones del cultivo Citocinas añadidas IL-21 IL-2 IL-4

BCL6 ++ BCL6/EBV +++ + EBV +++ +++

Determinación de la producción de anticuerpos por cultivos de BCL6 en ausencia o presencia de EBV, IL-2, IL-4 e IL-21

La producción de anticuerpos IgG se determinó en los cultivos a largo plazo como se describe en la tabla 5. Los niveles de producción de anticuerpos indicados son la producción madia de anticuerpos de seis a diez mediciones diferentes en el tiempo de dos donantes (figura 15). Claramente se muestra que los cultivos de BCL6/EBV/IL-21 producen significativamente más IgC que los cultivos de BCL6/IL-21. Por tanto, el EBV potencia significativamente la producción de anticuerpos de los linfocitos B transducidos con BCL6.

Por tanto, la combinación de IL-21 y EBV tiene como resultado niveles altos de producción de anticuerpos tanto en ausencia como en presencia de BCL6.

Determinar la expresión del receptor de linfocitos B (BCR) tras el cultivo a largo plazo de células transducidas con BCL6 e infectadas con EBV

Se ha descrito que las células infectadas con EBV pierden su expresión de BCR. Por tanto, los linfocitos B en cultivos que contienen IL-21 (descritos en la tabla 5) se tiñeron para NGFR, CD19, Kappa en Lambda.

Las células transducidas con BCL6 negativas para EBV permanecieron positivos para le expresión de BCR determinado mediante tinción con Kappa y Lambda. Por tanto, dichas células son particularmente adecuadas para aislar y/o seleccionar después de un periodo de cultivo largo para una especificidad deseada, por ejemplo usando antígeno marcado, porque dichas células se unirán a dicho antígeno marcado con su BCR. No obstante, cuando había EBV presente, la expresión de BCR se perdió o disminuyó. Dado que los cultivos de BCL6/IL-21 producían cantidades relativamente bajas de anticuerpo en comparación con las células infectadas por EBV pero mantienen expresión en superficie de BCR, se demuestra que estas células permanecen en un fenotipo pre-plasmablasto mientras que las células infectadas por EBV, que producen cantidades altas de anticuerpo, se diferencias o se han diferenciado hacia un fenotipo mejor descrito como plasmablasto.

En conclusión, en los casos en los que se desea la presencia de un receptor de linfocitos B sobre los linfocitos B, tal como, por ejemplo, en ensayos de detección selectiva, preferentemente, los linfocitos B no son infectados por EBV,

o lo son en una etapa posterior.

Infección por EBV de cultivos caSTAT5b-ER, determinado mediante PCR

En paralelo a las transducciones de BCL6 se realizaron transducciones usando caSTAT5b-ER. Sorprendentemente, en contraste con los cultivos de BCL6, que estaban todos infectados por EBV, los cultivos de caSTAT5b-ER del mismo donante (B29) parecían mantener la distribución natural (porcentaje) de las células infectadas por EBV. Varios cultivos tenían claros signos de infección por EBV y se comprobó mediante LMP1 PCR y, de hecho, se descubrió que eran positivos. Uno de los signos de que los cultivos de caSTAT5b-ER eran positivos para EBV era la capacidad del MBC para sobrevivir cuando fueron tratados con IL-21 en ausencia de 4HT. Estos linfocitos B privados de 4HT carecen de la forma activa de caSTAT5b y normalmente mueren en 2-3 semanas.

Proliferación y producción de anticuerpos por los linfocitos B transducidos con caSTAT5b-ER en condiciones diferentes

Citocinas IL-2 IL-4 IL-2 IL-4 IL-21 IL-21 IL-21

Ejemplo 5 Procedimientos

Para estudiar el papel del EBV en los experimentos del sistema caSTAT5b-ER se realizaron como se ha descrito en la tabla 6. En la tabla 6 se presenta una visión general esquemática de la respuesta de los linfocitos B transducidos caSTAT5b-ER. caSTAT5b-ER activa mediante la presencia de 4HT bloquea la diferenciación de linfocitos B con independencia de qué citocinas estaban presentes o incluso si los linfocitos B estaban infectados por el EBV. Por tanto, los cultivos de caSTAT5b-ER infectados por EBV y mantenidos en in IL-2 IL-4 o IL-21 pero con 4HT no producen anticuerpos. La retirada de 4HT tiene como resultado una diferenciación y la posterior producción de anticuerpos. Preferentemente, la IL-21 se añade durante y/o después de la retirada de 4HT. No obstante, estas células mueren en última instancia, ya que caSTAT5b es inactiva y, por tanto, solo se producirán anticuerpos durante un periodo restringido. Por tanto, si no hay EBV presente, la IL-21 se sustituye, en última instancia, por al menos otro agente estimulante del crecimiento, tal como, por ejemplo IL-2 e IL-4, ya descritos en el Ejemplo 3.

El EBV y la IL-21 juntos en ausencia de 4HT son dos estímulos fuertes que inducen la proliferación a largo plazo y niveles elevados de producción de anticuerpos (Figura 18). Por tanto, esta combinación se prefiere.

Tabla 8: Proliferación, supervivencia y producción de anticuerpos de linfocitos B caSTAT5b-ER

EBV 4HT proliferación Supervivencia Producción

-: ++ pos neg + + ++ pos neg + + ++ pos neg --++ neg Intermedia + -++ pos Alta

Los linfocitos B BCL6-IRES-YFP se transdujeron con STAT3/ER-IRES-GFP usando procedimientos estándar y se expandieron en células L con IL-2 e IL-4 como se ha descrito en la sección Procedimientos del ejemplo 1. La expresión de STAT3 se reguló mediante la presencia o ausencia de tamoxifeno (4HT). Las células positivas para YFP y GFP se clasificaron y se cultivaron números iguales. La expresión génica de BLIMP1 se monitorizó mediante RT-PCR y la producción de anticuerpos se determinó en cultivos con y sin 4HT.

Resultados

La adición de 4HT a las células tuvo como resultado un incremento del número celular, un incremento de la expresión de Blimp-1. Además, la producción de IgG potenciada se midió como se muestra en la figura 19a-c.

Ejemplo 6

Los linfocitos B positivos para CD19 se transdujeron con YFP-IRES-YFP (cYFP); BCL6-IRES-YFP (BCL6-YFP) o Bcl-xL-GFP (Bcl-xL-GFP) control. Después, las células se mantuvieron con CD40L e IL-4 y el porcentaje de células positivas para YFP y GFP sencillas y dobles se determinó en el tiempo mediante FACS en cultivos a granel sin clasificar.

La división celular y la expansión acumulada se determinaron en células positivas sencillas y dobles en presencia de IL-4 e IL-21.

Para comprobar la expresión génica y la coinfección con EBV, el análisis RT-PCR de la expresión de ARNm de BclxL, BCL6, LMP1, y EBNA1 se realizó en cultivos de cultivos a granel transducidos con BCL6 sencillo y transducidos con BCL6/Bcl-xL-doble.

Resultados

Las figuras 20-23 muestran que los linfocitos B transducidos dobles que contienen BCL6 y Bcl-xL tenían una tasa de expansión acumulada más alta y, de hecho, también fueron las células dominantes para crecer en los cultivos de linfocitos B de memoria a granel. Los inventores también demostraron que estas células sometidas a transducción doble se dividieron dos veces más rápido en comparación con las células sometidas a transducción sencilla. En el presente documento se muestran los niveles de producción de anticuerpos (IgG e IgM), que fueron iguales ente los cultivos de BCL6 y BCL6/Bcl-xL cuando se cultivan con IL-4 o IL-21.

Ejemplo 7

La línea celular de Hodgkin L591, que es positiva para STAT5 fosforilada en tirosina, se cultivó con independencia de las células L (estimulación con CD40) y citocinas. Las células L591 se transdujeron mediante lentivirus que contiene E47-IRES-GFP o virus control con GFP únicamente (los procedimientos se describen con más detalle en el ejemplo 1). Las células transducidas se clasificaron y el crecimiento celular se siguió en el tiempo.

Resultados

La Figura 24 muestra que las células L591 dejan de dividirse rápidamente cuando se expresa E47. Esto sugiere el efecto de E47, que a través de sus dianas cadena abajo (además de otros Socs1, Socs3, Id2, Eto2 y Xbpl) induce diferenciación de linfocitos B hacia un fenotipo de linfocito B productora de anticuerpos. La diferenciación inducida por E47 también podría indicar que los efectos de STAT5 se anula que E47 afecta directa o indirectamente a la cantidad y la acción de STAT5 funcional. Por tanto, en base a los datos con la línea celular de Hodgkin L591, los inventores indican que los cultivos de linfocitos B positivos para STAT5b/ER se mantienen en las células L con 4HT e IL-2 e IL-4 o IL-21, se pueden inducir para diferenciar hacia células productoras de anticuerpos cuando E47 está activa.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Crecimiento potenciado de células BCL6+ cultivadas con IL-21. Linfocitos B de memoria BCL6+ 100% puras se cultivaron en presencia de IL-2 e IL-4 (condiciones de cultivo convencionales) o con IL-21 solo. Se muestra la expansión total de células vivas durante 17 días de cultivo con IL-21.

Figura 2. Inmortalización de plasmablastos de las células BCL6 con IL-21. Los linfocitos B de memoria se transdujeron co un retrovirus que expresan BCL6-GFP y se cultivaron con IL-2 e IL-4 (para prevenir la diferenciación) o con IL-21 durante 14 días. Se muestra la tinción en superficie para CD38 y CD20 de GFP+ (es decir, BCL6+). La IL-21 induce un incremento por 8 de la cantidad de linfocitos B con un fenotipo de plasmablasto.

Figura 3. La IL-21 regula por aumento BLIMP1 e linfocitos B BCL6+. Se cultivaron BCL6-ΔNGFR+ 100% puras con IL-2 e IL-4 o IL-21 durante 24 días. El ADNc se generó de ARN total y se determinaron los niveles de ARNm de BLIMP1 y HPRT (control de carga) mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa.

Figura 4. Modelo no limitante de una realización de acuerdo con la presente invención.

Figura 5.

Visión general del esquema del cultivo ideal, véanse más detalles en la sección de materiales y procedimientos del Ejemplo 3.

Figura 6

Dinámica de crecimiento del linfocito B estimulado por IL-2 e IL-4 frente a IL-21. (a) linfocitos B de memoria de sangre periférica (PB) derivados de dos donantes (B18 y B19) se estimularon con IL-21 o IL-2 e IL-4. Las células se transdujeron con caSTAT5b-ER-IRES-NGFR el día 2 para cultivos tratados con L-21 y el día 5 para los tratados con IL-2 e IL-4; 4HT se añadió el día 13. (b) De los 4 donantes de linfocitos B específicos del toxoide del tétanos se clasificaron de PB (los números de células variaron de 1.000-10.000). Las células se cultivaron en 96 pocillos con IL-21 y se transdujeron con caSTAT5b-ER-IRES-NGFR el día 2. El día 4 se añadió 4HT y la IL-21 se sustituyó con IL-2, IL-4 y 4HT después de 7 días (B14 y B15) o se sustituyó después de 20 días (B16 y B17). Las células se contaron a mano y se excluyeron las células muertas.

Figura 7

El porcentaje de células transducidas con caSTAT5b-ER-IRES-NGFR se determinó usando el LSR II (BD). De dos donantes ((B18 y B19) se realizaron experimentos con series de tiempo con IL-2 e IL-4 frente a IL-21. De cada donante, ¼ de las células se transdujeron usando el protocolo de IL-2 e IL-4, el % restante se transdujo usando IL-21. Directamente después de la transducción de IL-21 (36 h), un tercio del cultivo de IL-21 se cambió a IL-2 e IL-4. Esto se repitió el día 5, 10 y 20 del cultivo con IL-21.

Figura 8

La producción total de anticuerpos de IgG e IgM humanos por linfocitos B de memoria de PB transducidos con caSTAT5b-ER-IRES-NGFR, como se describe en las figuras 6 y 7. (a) Se muestra la producción media de IgG de los donantes B18 y B19. Los linfocitos B se transdujeron usando IL-2 e IL-4 frente al protocolo con IL-21. La producción de IgG indicó que los símbolos abiertos representan todos los cultivos tratados con IL-21 con independencia de cuándo se pasaron a IL-2 e IL-4. (b) La producción de IgM en las muestras como se ha descrito anteriormente, obsérvese que la escala de tiempo es diferente.

Figura 9

Producción de anticuerpos de los clones de linfocitos B derivados de los linfocitos B de memoria de los

donantes B18 y B19 transducidos con caSTAT5b-ER-IRES-NGFR Para el cultivo de DL se usaron cultivos de diez días de edad derivados de linfocitos B estimulados con IL-21 (estimulados durante 36 horas). Se obtuvieron doce clones; 5 de y 7 de B19. La producción de IgG es la meda de tres puntos de tiempo; la producción de IgM es la media de dos puntos de tiempo.

Figura 10

ELISA de IgG del toxoide del tétanos en sobrenadante de linfocitos B humanas clasificadas por el toxoide del tétanos positivas para caSTA5b-ER-IRES-NGFR 100% policlonales. (a) De 7 donantes se obtuvieron cultivos clonados de proliferación rápida. Se muestra la producción media de anticuerpos TT de al menos 3 mediciones diferentes por donante. Cada vez que se determinó la DO relativa (en general, un incremento relativo de > 2-3 veces el fondo se asume positivo). (b) Para determinar si los cultivos negativos en el ELISA de IgG de TT podrían producir IgM, se analizaron las mismas 7 muestras donantes en un ELISA de IgM total.

Figura 11

ELISA anti-toxoide del tétanos. Se determinó la unión de los anticuerpos específicos de α-TT IgG e IgM mediante ELISA. Se analizaron los sobrenadantes de cultivos de linfocitos B clonales NGFR positivos 100% derivados de los donantes B15, B16, B18 y B19. Dos veces el fondo se fijaron como un valor positivo.

Figura 12

Producción total de IgG e IgM tras la reestipulación de los cultivos de linfocitos B clonales (a) del donante B16 que produce IgG y (b) donante B19 que produce IgM. La producción se midió en sobrenadante de cultivos cultivados con IL-2, IL-4 y en presencia y ausencia de 4HT o con IL-21 y en presencia o ausencia de 4HT. Los cultivos que contienen IL-2 e IL-4 no mostraron un incremento de la secreción de anticuerpos (no mostrado). Solo se muestran los cultivos que respondieron a la reestimulación (10 de 14 IgG y 8 de 9 clones de IgM respondieron).

Figura 13

Los anticuerpos secretados por cultivos reestimulados con IL-21 y privados de 4HT, como se describe en la leyenda de la figura 8, se analizaron para determinar la especificidad del antígeno. Los sobrenadantes derivados de cultivos RR clonales B16 donantes reestimulados se analizaron en el ELISA α-TT IgG (a), los sobrenadantes derivados de los cultivos donantes B19 se analizaron en el ELISA del IgM (b). Se muestra el incremento relativo en la unión de los anticuerpos en comparación con el control negativo, las muestras B1910B7 y 10E1 se cortaron a 30 para su visibilidad; los valores fueron de 96 y 121, respectivamente.

Figura 14

Se realizó la RT-PCR de LMP1 en ARN aislado de sedimentos celulares congelados de cultivos indicados. Se muestran 15 cultivos que se seleccionaron al azar y se analizó la infección por EBV Codificación de la muestra: B indica donante B29, C indica el donante B30 y ambos se cultivaron a 1.000 c/pocillo (e3) o 100 c/w (e2). Todos los cultivos se transdujeron con BCL6 a excepción de B28 UTD (sin traducir) y B29 UTD; las células JY se usaron como controles positivos.

Figura 15

La producción de anticuerpos IgG (ng/ml) por cultivos de BCL6 y EBV como se describe en la tabla 5. Para cada condición, la media de dos muestras se muestra en cada una, que consisten de un seguimiento longitudinal de hasta 6-10 puntos de tiempo. Un asterisco indica muestras que son significativamente diferentes (p < 0.05, prueba t de student no pareada). Las muestras cultivadas co IL-2 e IL-4 son una combinación de EBV y cultivos positivos y negativos longitudinales de BCL6

Figura 16

Tinción con kappa-FITC y lambda-PE en células positivas para CD19 y NGFR Un linfocito B es positivo para Kappa o Lambda. Las muestras se midieron usando un LSRII (BD) y ase analizaron usando el software FlowJo.

Figura 17

Se muestra una PCR de LMP1 representativa con ADN aislado de pellas celulares congeladas B25 1.000 c/p. las células transducidas con caSTAT5b y se sospechó que eran positivas para EBV en base al color del medio de cultivo, la cinética de crecimiento y el fenotipo, como se observa mediante microscopia óptica. Todos los demás cultivos eran negativos para EBV.

Figura 18

Producción media de IgG (ng/ml) en linfocitos B caSTAT5b-ER cultivados sin 4HT, con IL-2 IL-4 o IL-21 y con o sin EBV. El incremento de la producción de anticuerpos en presencia de IL-21 fue significativo en comparación con los cultivos de IL-2 e IL-4 (p < 0,05). El incremento de la producción de anticuerpos en cultivos infectados por EBV que contienen IL-21, los cultivos infectados por el EBV fue significativo en comparación con los cultivos sin EBV (p < 0,05), prueba no paramétrica de Mann-Whitney).

Figura 19

Células (A-C) BCL6-IRES-YFP+ se transdujeron con STAT3ER-IRES-GFP y se expandieron en células CD40L L con IL-2 e IL-4. Las células positivas para BCL6 / STAT3ER se clasificaron mediante FACS y números iguales

se cultivaron en ausencia de citocinas, pero en presencia o ausencia de 4HT (1 μM) durante 4 días. (A) Número de células vivas tras 4 días. (B) RT-`PCR semicuantitativa para la expresión de BLIMP1 y HPRT1 en células BCL6-YFP+ / STAT3ER-GFP+ (C) producción de IgG en células BCL6-YFP+ STAT3ER-GFP+ tratadas durante 4 días ± 4HT.

Figura 20

A. Los linfocitos B positivos para CD19 se transdujeron con YFP-IRES-YFP (cYFP); BCL6-IRES-YFP (BCL6-YFP) o BclXL-GFP (Bcl-xL-GFP). Después, las células se mantuvieron con CD40L e IL-4 y el porcentaje de células positivas para YFP o GFP se determinó en el tiempo mediante FACS. Todos los datos representados en A y B derivan de la selección de CD19+CD3.

B. Cultivos a granel sin clasificar de linfocitos B sometidos a transducción doble con Bcl-xL-IRES-GFP y BCL6IRES-YFP en CD49L e IL-4. Las células positivas sometidas a transducción individual con GFP+, YFP+, y doble con GFP/YFP se determinaron mediante FACS.

Figura 21.

La IL-21 aumentó la proliferación de los linfocitos B transducidos con Bcl-xL, BCL6, o sometidos a transducción doble con Bcl-xL+BCL6.

El día 17 después de la transducción y mantenimiento en CD40L e IL-4, los cultivos se dividieron y cultivaron en CD40L en presencia de IL-4 o IL-21. Se determinó el número absoluto de células transducidas y la expansión acumulada se calculó en células sometidas a transducción sencilla (A) o en células sometidas a transducción doble (B).

Figura 22.

Los cultivos a largo plazo son análisis EBV-RT-PCR de la expresión de ARNm de EBNA1, Bcl-xL, BCL6, LMP1 en cultivos de 66 días de células transducidas con BCL6 (Calle 1) y cultivos a granel de células sometidas a transducción doble con BCL6/Bcl-xL. Se usó 1 μl de una reacción con ADNc realizada en ausencia de reacción con transcriptasa inversa (-RT) como control negativo de la contaminación del ADN genómico. Controles positivos: Linfocitos B transducidos con Bcl-xL, STAT5-ER con 4-HT; BCL6, LMP1 y EBNA1, linfocitos B de Raji humanos.

Figura 23.

Tiempo de duplicación de células sometidas a transducción doble con Bcl-xL, BCL6 y Bcl-xL-BCL6. En base al número de linfocitos B (GFP+,YFP+) transducidos, el tiempo de duplicación entre los días 51-59 de cultivo se calculó en células transducidas con Bcl-xL-, y BCL6 en transducciones sencillas así como en cultivos a granel sometidos a transducción doble con Bcl-xL+BCL6.

Figura 24

L591, una línea celular de Hodgkin se sometió a transducción mediante un lentivirus que contenía E47-IRES-GFP. Las células positivas para GFP se clasificaron y cultivaron con independencia de las células L (estimulación de CD40) y citocinas. Los números celulares se determinaron en el tiempo.

Referencias

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Boise, L. H., M. Gonzalez-Garcia, C. E. Postema, L. Ding, T. Lindsten, L. A. Turka, X. Mao, G. Nunez, and C. B. Thompson. (1993). Bcl-x, a bcl-2-related gene that functions as a dominant regulator of apoptotic cell death. Cell

74:597.

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Malisan, F. , Briere, F. , Bridon, J.M. , Harindranath, N. , Mills, F. C. , Max, E. E. , Banchereau, J. , Martinez-Valdez, H. (1996). Interleukin-10 induces immunoglobulin G isotype switch recombination in human CD40activated naive B lymphocytes, J.Exp.Med. 183, 937-47.

Mathas S, Janz M, Hummel F, Hummel M, Wollert-Wulf B, Lusatis S, Anagnostopoulos I, Lietz A, Sigvardsson M, Jundt F, Johrens K, Bommert K, Stein H, Dorken B (2006). Intrinsic inhibition of transcription factor E2A by HLH proteins ABF-1 and Id2 mediates reprogramming of neoplastic B cells in Hodgkin lymphoma. Nat Immunol. 7, 207-215.

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Ye, B. H., Cattoretti, G., Shen, Q. , Zhang, J. , Hawe, N. , de Waard, R. , Leung, C. , Nouri-Shirazi, M. , Orazi, A., Chaganti, R. S., et al. (1997). The BCL-6 proto-oncogene controls germinal-centre formation and Th2-type inflammation. Nat Genet 16, 161-170.

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un procedimiento para aumentar el ciclo de vida de replicación de una célula productora de anticuerpos, que comprende aumentar o mantener la cantidad del producto de expresión BCL6 y Blimp-1 en comparación con un linfocito B de memoria o un linfocito B no expuesto previamente dentro de dicha célula productora de anticuerpos

-proporcionar dicha célula productora de anticuerpos con un compuesto capaz de potenciar la expresión de BCL6 y/o cultivar dicha célula productora de anticuerpos en presencia de un compuesto capaz de potenciar la expresión de BCL6, y -proporcionar dicha célula productora de anticuerpos con un compuesto capaz de aumentar la expresión de Blimp-1 y/o cultivar dicha célula productora de anticuerpos en presencia de un compuesto capaz de incrementar la expresión de Blimp-1.
2.

Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende proporcionar dicha célula productora de anticuerpos con una secuencia de ácido nucleico que codifica BCL6 o una parte funcional o derivado funcional de la misma capaz de aumentar el ciclo de vida de replicación de una célula productora de anticuerpos.
3.

Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que comprende proporcionar dicha célula productora de anticuerpos con STAT5 o una parte funcional o derivado funcional capaz de aumentar el ciclo de vida de replicación de una célula productora de anticuerpos.
4.

Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende proporcionar dicha célula productora de anticuerpos con una secuencia de ácido nucleico que codifica STAT5 o una parte funcional o derivado funcional de la misma capaz de aumentar el ciclo de vida de replicación de una célula productora de anticuerpos y/o en el que dicha célula productora de anticuerpos se cultiva en presencia de STAT5 o una parte funcional o derivado funcional de la misma capaz de aumentar el ciclo de vida de replicación de una célula productora de anticuerpos.
5.

Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicho compuesto capaz de aumentar la expresión de Blimp-1 comprende:

-STAT3 o una parte funcional o derivado funcional de la misma capaz de aumentar por regulación la expresión de Blimp-1 y/o -un compuesto capaz de potenciar la expresión de STAT3.
6.

Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que dicho compuesto capaz de aumentar la expresión de Blimp-1 comprende IL-21, IL-6, IL-7, IL-10, IL-15, IL-27, una proteína SOCS, una de las proteínas E47, E12, E2-2 o HEB, una Janus quinasa mutada y/o una secuencia de ácido nucleico que codifica STAT3 o una parte funcional o derivado funcional de la misma capaz de aumentar por regulación la expresión de r Blimp 1.
7.

Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende proporcionar dicha célula productora de anticuerpos con un agente de inmortalización adicional.
8.

Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicho agente de inmortalización comprende un agente transformante.
9.

Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, en el que dicho agente de inmortalización comprende el virus de Epstein-Barr.
10.

Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en el que dicha célula productora de anticuerpos se cultiva en presencia de IL-21 antes de proporcionar a dicha célula productora de anticuerpos una secuencia de ácido nucleico que codifica BCL6 o una parte funcional o derivado funcional de la misma capaz de aumentar el ciclo de vida de replicación de una célula productora de anticuerpos y/o una secuencia de ácido nucleico que codifica STAT5 o una parte funcional o derivado funcional de la misma capaz de aumentar el ciclo de vida de replicación de una célula productora de anticuerpos.
11.

Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que dicha célula productora de anticuerpos se cultiva en presencia de IL-21 y está provista del virus de Epstein-Barr.
12.

Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, que además comprende aumentar la cantidad del producto de expresión Bcl-xL dentro de dicha célula productora de anticuerpos.
13.

Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, que comprende proporcionar dicha célula productora de anticuerpos con una secuencia de ácido nucleico que codifica Bcl-xL o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma capaz de aumentar el ciclo de vida de replicación de una célula productora de anticuerpos.
14.

Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, que comprende proporcionar dicha célula productora de anticuerpos con un compuesto capaz de potenciar la expresión de Bcl-xL.
15.

Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, en el que dicho compuesto comprende estimulación con APRIL, BAFF, CD40, BCR, citocinas, factores de crecimiento o efectores cadena abajo como JNK y AKT (PKB).
16.

Un procedimiento para producir una célula productora de anticuerpos que es capaz de replicarse durante al menos una semana, comprendiendo el procedimiento:

5 -incrementar un nivel de expresión de Blimp-1 en un linfocito B en comparación con un linfocito B de memoria o linfocito B de memoria, proporcionando dicho linfocito B con un compuesto capaz de incrementar la expresión de Blimp -1 y/o cultivando dicho linfocito B en presencia de un compuesto capaz de incrementar la expresión de Blimp-1; y

10 -incrementar y/o mantener un nivel de expresión de BCL6 en comparación con un linfocito B de memoria o linfocito B no expuesto previamente, proporcionando dicho linfocito B con un compuesto capaz de potenciar la expresión de BCL6 y/o cultivando dicho linfocito B en presencia de un compuesto capaz de potenciar la expresión de BCL6.
17. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 16, en el que el nivel de expresión de BCL6 en dicha célula

15 se consigue y/o se mantiene esencialmente al mismo nivel, o a un nivel superior, en comparación con un plasmablasto.
18. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 16 o 17, que comprende:

-

proporcionar dicho linfocito B con un compuesto capaz de potenciar la expresión de Blimp-1 y/o cultivar dicho linfocito B en presencia de un compuesto capaz de potenciar la expresión de Blimp-1; y

20 -proporcionar dicho linfocito B con una secuencia de ácido nucleico que codifica BCL6 o una parte funcional o derivado funcional de la misma capaz de aumentar el ciclo de vida de replicación de una célula productora de anticuerpos y/o una secuencia de ácido nucleico que codifica STAT5 o una parte funcional o derivado funcional de la misma capaz de aumentar el ciclo de vida de replicación de una célula productora de anticuerpos, y/o -cultivar dicho linfocito B en presencia de STAT5 o una parte funcional o derivado funcional de la misma capaz

25 de aumentar el ciclo de vida de replicación de una célula productora de anticuerpos.
19. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 18, en el que dicho compuesto capaz de potenciar la expresión de Blimp-1 comprende IL-21, IL-6, IL-7, IL-10, IL-15, IL-27, una proteína SOCS, las proteínas E E47, E12, E2-2 o HEB, una Janus quinasa mutada y/o una secuencia de ácido nucleico que codifica STAT3 o una parte funcional o derivado funcional de la misma capaz de aumentar por regulación la expresión de r Blimp 1.

30 20. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 16-19, que además comprende aumentar un nivel de expresión de Bcl-xL dentro de dicha célula.
21.

Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 20, que comprende proporcionar dicho linfocito B con un compuesto capaz de potenciar la expresión de Bcl-xL.
22.

Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 21, en el que dicho compuesto capaz de potenciar la

35 expresión de Bcl-xL comprende un ácido nucleico que codifica Bcl-xL o una parte funcional o derivado funcional de la misma capaz de aumentar el ciclo de vida de replicación de una célula productora de anticuerpos.
23. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 21, en el que dicho compuesto capaz de potenciar la expresión de Bcl-xL comprende estimulación con APRIL, BAFF, CD40, BCR, citocinas, factores de crecimiento o efectores cadena abajo como JNK y AKT (PKB).

40 24. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2-23, en el que la expresión de dicha secuencia de ácido nucleico que codifica BCL6, STAT5, STAT3, Bcl-xL, o una parte funcional, derivado funcional y/o análogo funcional de BCL6, STAT5 y/o STAT3 y/o Bcl-xL está regulada por un activador y/o represor que es inducible por un compuesto exógeno.
25. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 16 -24, que comprende:

45 -incrementar un nivel de expresión de Blimp-1 en un linfocito B; -proporcionar dicho linfocito B con BCL6 y/o STAT5, o una parte funcional o derivado funcional de las mismas capaz de aumentar el ciclo de vida de replicación de una célula productora de anticuerpos; -proporcionar dicho linfocito B con el virus de Epstein-Barr; y -cultivar dicho linfocito B.

50 26. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 25, que comprende:

-analizar en una pluralidad de linfocitos B una especificidad por un antígeno dado; -seleccionar al menos un linfocito B con una especificidad por dicho antígeno dado; -incrementar un nivel de expresión de Blimp-1 en dicha célula; -proporcionar dicho linfocito B seleccionado con BCL6 y/o STAT5 exógenas, o una parte funcional o derivado

funcional de las mismas capaz de aumentar el ciclo de vida de replicación de una célula productora de anticuerpos; -seleccionar un linfocito B que comprende BCL6 y/o STAT5 exógenas, o una parte funcional o derivado funcional de las mismas capaz de aumentar el ciclo de vida de replicación de una célula productora de anticuerpos; y -proporcionar dicho linfocito B con el virus de Epstein-Barr.
27.

Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 25 o 26, en el que dicho linfocito B se cultiva en presencia de IL-21.
28.

Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 25-27, en el que dicho linfocito B se cultiva en presencia de IL-21 antes de introducir en dicho linfocito B BCL6 y/o STAT5, o una parte funcional o derivado funcional de las mismas capaz de aumentar el ciclo de vida de replicación de una célula productora de anticuerpos.
29.

Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 25-28, que comprende además proporcionar dicho linfocito B con Bcl-xL o una parte funcional o derivado funcional de la misma capaz de aumentar el ciclo de vida de replicación de una célula productora de anticuerpos.
30.

Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-29, en el que se cultiva una célula productora de anticuerpos que es capaz de replicarse durante al menos tres meses.
31.

Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-30, en el que dicha célula productora de anticuerpos es capaz de producir anticuerpos contra un antígeno de interés.
32.

Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 31, en el que dicha célula productora de anticuerpos se ha obtenido de un individuo en el que el individuo ha estado expuesto previamente a dicho antígeno de interés.
33.

Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-32, que además comprende expresar un gen de dicho linfocito B que codifica la cadena pesada de Ig y/o la cadena ligera de Ig en una segunda célula.
34.

Una célula productora de anticuerpos que es capaz de replicarse durante al menos nueve semanas, en la que se coexpresan BCL6 and Blimp-1.
35.

Una célula productora de anticuerpos que es capaz de replicarse durante al menos nueve semanas y que comprende un compuesto que aumenta o mantiene la cantidad del producto de expresión Blimp-1 y que comprende una secuencia de ácido nucleico exógena que codifica BCL6 o una parte funcional o derivado funcional de la misma capaz de aumentar el ciclo de vida de replicación de una célula productora de anticuerpos y/o una secuencia de ácido nucleico exógena que codifica STAT5 o una parte funcional o derivado funcional de la misma capaz de aumentar el ciclo de vida de replicación de una célula productora de anticuerpos.
36.

Una célula productora de anticuerpos de acuerdo con la reivindicación 35, que comprende una secuencia de ácido nucleico exógena que codifica Bcl-xL o una parte funcional o derivado funcional de la misma capaz de aumentar el ciclo de vida de replicación de una célula productora de anticuerpos.
37.

Una célula productora de anticuerpos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 34-36, que comprende un compuesto que aumenta o mantiene la expresión de Blimp-1.
38.

Una célula productora de anticuerpos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 34-37, que comprende una secuencia de ácido nucleico exógena que codifica STAT3 o una parte funcional o derivado funcional de la misma capaz de regular por aumento la expresión de Blimp-1.
39.

Una célula productora de anticuerpos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 34-38, en la que la expresión de dicha secuencia de ácido nucleico que codifica BCL6, STAT5, STAT3, Bcl-xL, o una parte funcional o derivado funcional de BCL6, STAT5 y/o STAT3 y/o Bcl-xLy/o está regulada por un activador y/o represor que es inducible por un compuesto exógeno.
40.

Una célula productora de anticuerpos que comprende:

-un agente de inmortalización, preferentemente un agente transformante, más preferentemente el virus de Epstein Barr; y -un compuesto que aumenta o mantiene la cantidad del producto de expresión Blimp-1 en dicha célula y -BCL6 exógena o una parte funcional o derivado funcional de la misma que aumenta el ciclo de vida de replicación de una célula productora de anticuerpos o STA5 exógena o una parte funcional o derivado funcional de la misma que aumenta el ciclo de vida de replicación de una célula productora de anticuerpos.
41.

Una célula productora de anticuerpos de acuerdo con la reivindicación 40, que comprende:

-un compuesto que aumenta o mantiene la cantidad del producto de expresión Bcl-xL en dicha célula.
42.

Un procedimiento para producir una línea de linfocitos B, que comprende:

-

obtener una célula productora de anticuerpos con un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-33, y -cultivar dicha célula productora de anticuerpos ex vivo.

5 43. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 42, que comprende:

-

producir una célula productora de anticuerpos que es capaz de replicarse durante al menos una semana usando un linfocito B de memoria y/o un linfocito B no expuesto previamente de un individuo que ha estado expuesto a un antígeno de interés en un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 133, y

10 -cultivar dicha célula productora de anticuerpos ex vivo.
44. Un procedimiento para obtener anticuerpos, que comprende:

-

obtener una célula productora de anticuerpos con un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-33; -cultivar dicha célula productora de anticuerpos ex vivo, y

15 -cosechar los anticuerpos producidos por dicha célula productora de anticuerpos.
45. Un procedimiento para producir anticuerpos capaces de unirse específicamente a un antígeno de interés, comprendiendo el procedimiento:

-

producir una célula productora de anticuerpos que es capaz de replicarse durante al menos una semana usando un linfocito B de memoria capaz de diferenciarse en un linfocito B, en el que el linfocito B produce

20 anticuerpos capaces de unirse específicamente a dicho antígeno de interés en un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-33, y -obtener anticuerpos producidos por dicha célula productora de anticuerpos.
46. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 45, que comprende cultivar adicionalmente dicha célula productora de anticuerpos ex vivo.