BRPI0619579A2

BRPI0619579A2 - métodos para influenciar a estabilidade de uma célula produtora de anticorpo e para produzir uma célula produtora de anticorpo, célula produtora de anticorpo, e, métodos para produzir linhagem de células b e para produzir anticorpos

Info

Publication number: BRPI0619579A2
Application number: BRPI0619579-2A
Authority: BR
Inventors: Hergen Spits; Ferene Alexander Scheeren; Tim Beaumont; Sean Andrew Diehl
Original assignee: Amc Amsterdam; Aimm Therapeutics Bv
Priority date: 2005-12-09
Filing date: 2006-12-08
Publication date: 2011-10-04
Also published as: FI1974017T4; HUE037580T2; US20170306293A1; EP1974017B1; PT2540820T; NZ592159A; EP2540820A1; BR122021001906B1; US20160060598A1; US20100113745A1; BRPI0619579B1; EP1974017A1; PL2540820T3; DK2540820T3; CA2633157C; AU2014202709B2; ES2660899T3; NZ600075A; EP3327117A1; JP2013099358A

Abstract

MéTODOS PARA INFLUENCIAR A ESTABILIDADE DE UMA CéLULA PRODUTORA DE ANTICORPO E PARA PRODUZIR UMA CéLULA PRODUTORA DE ANTICORPO, CéLULA PRODUTORA DE ANTICORPO, E, MéTODOS PARA PRODUZIR LINHAGEM DE CéLULAS B E PARA PRODUZIR ANTICORPOS. A invenção provê um método para influenciar a estabilidade de uma célula produtora de anticorpo, compreendendo influenciar direta ou indiretamente a quantidade de produto de expressão de BCL6 e/ou Blimp 1 dentro da referida célula produtora de anticorpo. As células e linhagens de células de células produzindo anticorpos estáveis são também providas, assim como métodos para produzir anticorpos usando tais células e/ou linhagens de células.

Description

"MÉTODOS PARA INFLUENCIAR A ESTABILIDADE DE UMA CÉLULA PRODUTORA DE ANTICORPO E PARA PRODUZIR UMA CÉLULA PRODUTORA DE ANTICORPO, CÉLULA PRODUTORA DE ANTICORPO, E, MÉTODOS PARA PRODUZIR LINHAGEM DE CÉLULAS B E PARA PRODUZIR ANTICORPOS"

A invenção se refere ao campo de biologia celular.

Culturas de célula ex vivo são ferramentas importantes em aplicações biológicas e médicas atuais. Uma aplicação importante é a cultura de células que produzem anticorpo de forma a coletar anticorpos, de preferência anticorpos monoclonais. Anticorpos monoclonais (mAbs) representam múltiplas cópias idênticas de uma única molécula de anticorpo, cópias as quais se ligam a antígenos com a mesma afinidade e promovem as mesmas funções efetuadoras. Dentre os benefícios dos mAbs, está sua especificidade pelo menos epítopo sobre um antígeno. Essa especificidade confere determinadas vantagens clínicas aos mAbs com relação a tratamentos mais convencionais, ao mesmo tempo em que oferece aos pacientes uma opção de terapia eficaz, bem tolerada com efeitos colaterais geralmente baixos. Além disso, mAbs são úteis para pesquisa biológica e médica.

A capacidade proliferativa da maioria das células primárias em cultura está limitada pela indução de senescência. Esse estado de interrupção de crescimento irreversível é caracterizado por expressão de uma série de marcadores senescência-associados, tais como beta-galactosidase senescência-associada, inibidor de ativador de plasminogênio 1 (PAI-1), P^arf, p53, p2Icipi e P^ink4a. De forma a proporcionar uma linhagem de célula em proliferação, freqüentemente as células são fundidas à células cancerígenas de modo a produzir células de hibridoma. As células de hibridoma resultantes são capazes de se dividir indefinidamente e crescem bem em cultura de célula. Hibridomas individuais com uma característica desejada podem, então, ser selecionados para uma determinadas finalidade. De forma a obter diretamente anticorpos monoclonais humanos com uma especificidade desejada, seria conveniente isolar uma célula B capaz de produzir tal anticorpo e cultivar a célula B ex vivo. Contudo, a tecnologia de hibridoma com células B humanas não tem obtido muito sucesso porque os hibridomas resultantes são instáveis. Muitas tentativas para cultura ex vivo de células B foram feitas. E bem documentado que células B de memória e primitivas humanas podem ser cultivadas durante um período limitado após encaixe de CD40 na presença de citocinas, incluindo IL-2, IL-4 e IL-IO (Banchereau e colaboradores, 1991) e acredita-se que esse sistema imita a resposta in vivo de células B com relação à células T auxiliares expressando CD40L produzidas por antígeno cognato. Na ausência de ligação ao CD40, a IL-IO apenas ou em combinação com IL-2, induz à diferenciação em células que produzem anticorpo (Malisan e colaboradores, 1996). Os mecanismos de regulação de sobrevivência e proliferação de células B maduras cultivadas sob essas condições são apenas parcialmente conhecidos.

O encaixe de CD40 sobre células B tem múltiplos efeitos, incluindo proteção contra apoptose, inibição (parcial) de diferenciação e indução de responsividade à citocina por células Β. A expressão de um grande número de inibidores do ciclo celular foi diminuída através de encaixe de CD40, incluindo Rb-I e Rb-2 (Dadgostar e colaboradores, 2002) e é provável que sub-regulação de tais genes libere células B em repouso da quiescência. Embora o disparo de CD40 leve a uma breve resposta proliferativa, citocinas servem de instrumento na sustentação de progressão do ciclo celular de células B disparadas. IL-2 e IL-4 são as citocinas mais eficientes que promovem progressão contínua do ciclo celular de células B estimuladas por Ig na superfície ou CD40. Ainda, as culturas de células B descritas nos papers mencionados acima são estáveis apenas durante um período limitado.

Outra abordagem para imortalização de células B é transformação com o vírus de Epstein-Barr (EBV). Contudo, a freqüência de células B que são transformadas pelo EBV é baixa e, portanto, tentativas para gerar células transformadas por EBV que produzem anticorpos desejados têm obtido pouco sucesso. Recentemente, Traggiai e colaboradores reportaram um método para transformação mais eficiente de células B humanas com vírus de Epstein-Barr que aumentou a freqüência de células B que foram transformadas. Com esse método, células B obtidas de um paciente que se recuperava de uma infecção grave por coronavírus da síndrome respiratória aguda (SARS-CoV) foram transformadas com EBV e clones de célula B transformada que produzem anticorpos monoclonais específicos para SARS e outras proteínas virais foram isolados (Traggiai e colaboradores, 2004).

Ainda outra abordagem para imortalização de células B é descrita no pedido de patente WO 03/052083. Esse pedido descreve um método para estabilização de células B, em que células B humanas são transduzidas com um transdutor de sinal de ativação e transcrição (CA-STAT) constitutivamente ativo. Uma expectativa de vida prolongada de células B foi observada. Células B em replicação, contudo, não foram capazes de produzir anticorpo ao mesmo tempo. Anticorpos puderam ser obtidos interrompendo a replicação das células, desse modo, levando à diferenciação terminal. As células terminalmente diferenciadas produziram anticorpo durante um tempo restrito, após o que as células diferenciadas morreram. Contudo, as células B em replicação do WO 03/052083 perdem sua capacidade de se desenvolver em células que produzem anticorpo após cultura de 1,5-2 meses ou mais, tornando essas culturas de célula B inadequadas para a produção de anticorpo.

Embora várias abordagens para a cultura de células que produzem anticorpo tenham sido descritas, ainda há uma necessidade por meios e métodos para influenciar a estabilidade de células que produzem anticorpo. E um objetivo da presente invenção proporcionar tais meios e métodos. Conseqüentemente, a invenção proporciona um método para influenciar a estabilidade de uma célula que produz anticorpo compreendendo influência, direta ou indireta, da quantidade de produto da expressão de BCL6 e/ou Blimp-I dentro da referida célula que produz anticorpo. De preferência, as quantidades de produtos da expressão de BCL6 e Blimp-I dentro da referida célula que produz anticorpo são reguladas, uma vez que ambos os produtos da expressão estão envolvidos na estabilidade de uma célula que produz anticorpo. A estabilidade de uma célula que produz anticorpo é definida como a capacidade da referida célula que produz anticorpo de permanecer em um determinado estágio de desenvolvimento (opcionalmente após a referida célula ter sido mantida no referido estágio). Diferentes estágios de desenvolvimento de uma célula envolvem pelo menos uma característica diferente da referida célula. Por exemplo, uma célula B de memória é conhecida por se diferenciar quando de estimulação em uma célula plasmática que secreta anticorpo via um estágio o qual alguns pesquisadores chamam de um plasmablasto. Uma célula B de memória, um plasmablasto e uma célula plasmática são diferentes estágios de desenvolvimento de uma célula B, em que a célula B tem diferentes características. Uma célula B de memória exibe baixa proliferação e secreção de anticorpo. Um plasmablasto exibe maior proliferação e maiores níveis de secreção de anticorpo quando comparado com uma célula B de memória, enquanto que uma célula plasmática secreta altos níveis de anticorpo, mas não é capaz de proliferar. Esses três estágios de desenvolvimento também são caracterizados por diferenças em marcadores na superfície celular, conforme mostrado na Tabela 1.

Com um método da invenção, se tornou possível regular a expectativa de vida replicativa de uma célula que produz anticorpo. Uma expectativa de vida replicativa de uma célula que produz anticorpo é definida aqui como o período de tempo em que uma célula B e sua prole são capazes de se replicar enquanto mantêm sua capacidade de produzir anticorpo e/ou se desenvolver em uma célula que produz anticorpo. A expectativa de vida replicativa de uma célula que produz anticorpo é, por exemplo, reduzida forçando uma célula que produz anticorpo a entrar em outro estágio de desenvolvimento. Em uma modalidade, a expectativa de vida replicativa de uma célula que produz anticorpo é reduzida forçando a referida célula à diferenciação terminal. Isso é caracterizado por produção aumentada de anticorpo e interrupção do ciclo celular. Durante diferenciação terminal, as células param de proliferar e eventualmente morrem. De preferência, contudo, a expectativa de vida replicativa de uma célula que produz anticorpo é prolongada, significando que a referida célula que produz anticorpo não diferencia terminalmente - ou apenas após um período mais longo quando comparado com o mesmo tipo de células que produzem anticorpo que são usadas atualmente — e continua a proliferar in vitro. De acordo com a invenção, é possível regular a quantidade de produto da expressão de BCL6 e/ou Blimp-I em uma célula que produz anticorpo a tal ponto que a célula que produz anticorpo é levada a e/ou mantida em um estágio de desenvolvimento predeterminado no qual as células continuam a proliferar. Com um método da invenção, portanto, foi possível aumentar a expectativa de vida replicativa de uma célula que produz anticorpo, uma vez que é possível manter uma célula B em um determinado estágio de desenvolvimento em que replicação ocorre. Em culturas de célula B ex vivo atuais, a expectativa de vida replicativa é de apenas umas poucas semanas a dois meses. Após esse tempo, as células cultivadas perdem sua capacidade de replicação, sua capacidade de produzir anticorpo e/ou sua capacidade de se desenvolver em uma célula que produz anticorpo. Com um método de acordo com a presente invenção, contudo, se tornou possível prolongar a expectativa de vida replicativa de células que produzem anticorpo, de modo que culturas ex vivo são geradas compreendendo células que são capazes de replicação e produção de anticorpo (ou se desenvolver em células que produzem anticorpo).

Uma célula que produz anticorpo é definida como uma célula, célula a qual é capaz de produzir e/ou secretar anticorpo ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo e/ou célula a qual é capaz de se desenvolver em uma célula a qual é capaz de produzir e/ou secretar anticorpo ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo. De preferência, a referida célula que produz anticorpo compreende uma célula B e/ou uma célula plasmática derivada de célula B. Uma célula B é denominada aqui uma célula que produz anticorpo, mesmo quando a célula B está em um estágio em que a produção de anticorpo é baixa ou não está presente em geral, tal como uma célula B primitiva ou uma célula B de memória, sendo ativada ou não, porque tais células são capazes de se desenvolver em células que produzem anticorpo, tal como um plasmablasto e/ou célula plasmática. A referida célula que produz anticorpo compreende, de preferência, uma célula de mamífero. Exemplos não limitativos incluem células que produzem anticorpo derivadas de um ser humano, roedor, coelho, lhama, porco, vaca, cabra, cavalo, macaco, gorila. De preferência, a referida célula que produz anticorpo compreende uma célula humana, uma célula de murino, uma célula de coelho e/ou uma célula de lhama.

Uma parte funcional de um anticorpo é definida como uma parte a qual tem pelo menos a mesma propriedade que o referido anticorpo quanto ao tipo, não necessariamente em quantidade. A referida parte funcional é, de preferência, capaz de ligação ao mesmo antígeno que o referido anticorpo, embora não necessariamente ate o mesmo ponto. Uma parte funcional de um anticorpo compreende, de preferência, um anticorpo com um único domínio, um anticorpo com cadeia simples e/ou um fragmento Fab. Um derivado funcional ou análogo de um anticorpo é definido como um anticorpo o qual tenha sido alterado, de modo que pelo menos uma propriedade - de preferência uma propriedade de ligação a antígeno - do composto resultante seja essencial ao mesmo quanto ao tipo, não necessariamente em quantidade.

BCL6 codifica um repressor transcricional o qual é requerido para desenvolvimento e maturação normais de células B e células Teo qual é requerido para a formação de centros germinais (Ye, 1997). BCL6 é altamente expresso em células B centrais, enquanto que ele dificilmente é expresso em células plasmáticas. BCL6 inibe a diferenciação de células B ativadas em células plasmáticas. A proteína-1 de maturação induzida por linfócito B de repressor transcricional (Blimp-I) é requerida para o desenvolvimento de uma célula B em uma célula plasmática. A variante humana de Blimp-I é denominada Prdml. Conforme usado aqui, qualquer referência à Blimp-I inclui uma referência à Prdml. A Blimp-I aciona a diferenciação de células plasmáticas. BLC6 e Blimp-I reprimem a expressão um do outro; assim, em uma situação natural onde um atinge um maior nível de expressão do que o outro, o estágio de diferenciação é forçado. No corpo humano, a diferenciação de células plasmáticas em células B de memória ou primitivas ativadas envolve sub-regulação de BCL6 e super-regulação de Blimp-I. Em células centrais germinais, a expressão de BCL6 é alta e a expressão de Blimp-I é baixa. Em células de memória em repouso, a expressão de BCL6 e Blimp-I é baixa. Sinais que disparam a diferenciação causam uma super-regulação de Blimp-I e essa Blimp-I contra-atua a expressão de BCL6. O estágio onde BCL6 e Blimp-I são expressos é de vida curta e é denominado um plasmablasto. Com aumento progressivo dos níveis de Blimp-1, a expressão de BCL6 é extinta, resultando em uma célula plasmática.

Uma modalidade proporciona um método de acordo com a invenção, em que BCL6 e Blimp-I são co-expressos em uma célula que produz anticorpo (significando que BCL6 e Blimp-I são expressos em uma célula que produz anticorpo), resultando em uma célula que produz anticorpo que é capaz de proliferação quando um sinal apropriado é proporcionado. Descobriu-se que a co-expressão de BCL6 e Blimp-I resulta em uma célula que produz anticorpo a qual é capaz de proliferar e produzir anticorpo. BCL6 e Blimp-I são, de preferência, co-expressos em uma célula B, de preferência uma célula B humana. Co-expressão de BCL6 e Blimp-I em uma célula B resulta em estabilização da referida célula B em um estágio semelhante a plasmablasto. Plasmablastos, assim como células plasmáticas, são capazes de secretar anticorpo. Contudo, plasmablastos ainda são capazes de proliferação, enquanto que células plasmáticas perderam sua capacidade de proliferação. Células plasmáticas, portanto, são inadequadas para cultura de linhagens de células que produzem anticorpo. Embora plasmablastos exerçam características de proliferação e produção de anticorpo altamente favoráveis, eles ainda não foram usados para a produção de anticorpo a longo prazo, uma vez que não foi possível estabilizar os plasmablastos até a presente invenção.

Com um método da invenção, dentre outras coisas, se tornou possível converter uma célula B primitiva ou célula B de memória em uma célula semelhante a plasmablasto e estabilizar a referida célula, de modo que diferenciação rápida em uma célula plasmática não ocorre. Isso é contrário ao desenvolvimento natural de células plasmáticas, em que expressão de Blimp-1 em uma célula B de memória resulta em desenvolvimento rápido em uma célula plasmática, desse modo, inibindo a expressão de BCL6, de modo que a célula plasmática resultante dificilmente expressa BCL6. Uma modalidade da presente invenção, assim, envolve co-expressão de BCL6 e Blimp-1 em uma célula B, resultando em uma célula que é capaz de proliferar e produzir anticorpo. De preferência, uma cultura estável de células B é gerada. Culturas ex vivo estáveis a longo prazo de células que produzem anticorpo agora se tornarão possíveis. Essas células B que produzem anticorpo que co-expressam BCL6 e Blimp-1 podem ainda ser estabilizadas através da adição do gene anti-apoptótico Bcl-xL. Com a introdução de Bcl-xL, é agora possível crescer plasmablastos sob condições de baixa densidade celular. Conseqüentemente, a invenção também proporciona um método para cultura de plasmablasto sob condições de baixa densidade celular compreendendo fornecimento de uma célula que produz anticorpo com níveis de expressão de BCL6, Blimp-I e Bcl-xL com qualquer um dos métodos descritos aqui.

A quantidade de produto da expressão de BCL6 (de preferência uma proteína de BCL6) em uma célula que produz anticorpo é regulada através de uma variedade de formas. Em uma modalidade, uma célula que produz anticorpo é fornecida com um composto capaz de influenciar direta ou indiretamente a expressão de BCL6. Uma célula que produz anticorpo é, de preferência, fornecida com um composto capaz de intensificar a expressão de BCL6, de forma a contra-atuar a sub-regulação de BCL6 durante expressão de Blimp-1. Tal composto compreende, de preferência, uma proteína Transdutora de Sinal de Ativação e Transcrição 5 (STAT5) ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma e/ou uma seqüência de ácido nucleico de codificação para o mesmo. A STAT5 é um transdutor de sinal capaz de intensificar a expressão de BCL6. Existem duas formas de STAT5, STAT5a e STAT5b, as quais são codificadas por dois genes diferentes aleatoriamente ligados. A administração e/ou ativação de STAT5 resulta em níveis intensificados de BCL6. Conseqüentemente, sub- regulação de BCL6 pela Blimp-I é, pelo menos em parte, compensada pela super-regulação de expressão de BCL6 por STAT5 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma. Conseqüentemente, a STAT 5 ou uma parte funcional, derivado ou análogo da mesma é capaz de influenciar diretamente a expressão de BCL6. Isso é feito, por exemplo, através de regulação da quantidade de um composto o qual, por sua vez é capaz de ativação direta ou indireta de STAT5 e/ou regulação da expressão de STAT5. Conseqüentemente, em uma modalidade, a expressão e/ou atividade de STAT5 endógena e/ou exógena é aumentada. Por exemplo, é possível intensificar indiretamente a expressão de BCL6 através de cultura de uma célula que produz anticorpo na presença de interleucina (IL) 2 e/ou IL 4, as quais são capazes de ativação de STAT5.

De preferência, uma célula que produz anticorpo é fornecida com uma seqüência de ácido nucleico que codifica STAT5 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma, em que a referida seqüência de ácido nucleico é constitutivamente ativa, significando que a STAT5 é continuamente expressa, independente da presença de reguladores (endógenos). No caso em que a expressão de STAT5 endógena é baixa ou está ausente, uma seqüência de ácido nucleico constitutivamente ativa exógena que codifica STAT5 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma é, de preferência, aplicada, resultando em uma concentração de STAT5 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma a qual é suficiente para intensificar a expressão de BCL6. Mais preferivelmente, uma célula que produz anticorpo é fornecida com uma seqüência de ácido nucleico que codifica um composto compreendendo STAT5 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma, de preferência uma proteína de fusão, cuja atividade é regulada por um indutor de repressor exógeno, de modo que a extensão de ativação de expressão de BCL6 é regulada também. Outro sistema que permite a indução de BCL6 é proporcionado através de um sistema Tet-on no qual a adição de tetraciclina e/ou derivados de tetraciclina induz à atividade de um transativador que induziu à transcrição do gene de BCL6, seguido por síntese de proteína BCL. Em uma modalidade preferida, uma célula que produz anticorpo é proporcionada com uma seqüência de ácido nucleico que codifica um receptor de estrogênio (ER) e STAT5 como uma proteína de fusão ET-STAT5. Essa proteína de fusão é inativa porque ela forma um complexo com proteínas de choque térmico no citosol. Dessa forma, STAT5 é incapaz de atingir o núcleo e a expressão de BCL6 não é intensificada. Quando de administração do indutor exógeno 4 hidróxi- tamoxifeno (4HT), a proteína de fusão ER-STAT5 se dissocia das proteínas de choque térmico, de modo que a STAT5 é capaz de entrar no núcleo e ativar a expressão de BCL6.

Adicional ou alternativamente, expressão de BCL6 em uma célula que produz anticorpo é intensificada através de cultura da referida célula que produz anticorpo na presença de um composto capaz de intensificar, direta ou indiretamente, a expressão de BCL6.

Uma modalidade, portanto, proporciona um método de acordo com a invenção compreendendo:

- fornecimento, à referida célula que produz anticorpo, de um composto capaz de intensificar, direta ou indiretamente, a expressão de BCL6; e/ou

- cultura da referida célula que produz anticorpo na presença de um composto capaz de intensificar, direta ou indiretamente, a expressão de BCL6. O referido composto capaz de intensificar, direta ou indiretamente, a expressão de BCL6 compreende, de preferência, STAT5 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma. Portanto, é proporcionado um método de acordo com a invenção compreendendo fornecimento, à referida célula que produz anticorpo, de STAT5 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma ou uma seqüência de ácido nucleico que codifica STAT5 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma. Em uma modalidade, a referida célula que produz anticorpo é cultivada após introdução de uma seqüência de ácido nucleico que codifica STAT5 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma na referida célula. A referida seqüência de ácido nucleico é, por exemplo, introduzida na referida célula através de transfecção e/ou transferência de gene vírus-mediada. Muitos métodos alternativos para introdução de uma seqüência de ácido nucleico em uma célula estão disponíveis na técnica, os quais não precisam ser explicados aqui. Com um composto capaz de intensificar, direta ou indiretamente, a expressão de BCL6, é possível intensificar a expressão de BCL6 endógeno. Em uma modalidade preferida, contudo, a uma célula que produz anticorpo é fornecida uma seqüência de ácido nucleico que codifica BCL6 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo. Dessa forma, é possível regular a concentração de BCL6 na célula que produz anticorpo independentemente de expressão de BCL6 endógeno. Conseqüentemente, mesmo se expressão de BCL6 endógeno é baixa ou está ausente, por exemplo, causada pela Blimp-1, uma seqüência de ácido nucleico exógena que codifica BCL6 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo ainda é capaz de produzir uma concentração de BCL6 a qual é suficiente para influenciar a estabilidade de uma célula que produz anticorpo. Também proporcionado, portanto, é um método de acordo com a invenção compreendendo fornecimento, à referida célula que produz anticorpo, de uma seqüência de ácido nucleico que codifica BCL6 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo. De preferência, à referida célula que produz anticorpo é fornecida uma seqüência de ácido nucleico constitutivamente ativa que codifica BCL6 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo, de modo que a expressão de BCL6 é mantida mesmo quando expressão de BCL6 endógeno da referida célula é inibida por um repressor endógeno, ta como Blimp-1. Mais preferivelmente, a expressão da referida seqüência de ácido nucleico que codifica BCL6 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo é regulada por um indutor de repressor exógeno, de modo que a extensão de expressão de BCL6 é regulada também. Por exemplo, um sistema promotor induzível é usado, tal como um sistema Tet-on ou Tet-off.

Em outra modalidade preferida, a invenção proporciona um método em que a quantidade de BCL6 é indiretamente regulada através de fornecimento, a uma célula que produz anticorpo, de uma seqüência de ácido nucleico que codifica E47 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma. E47 codifica um fator de transcrição que pertence a uma família de proteínas com hélice-elo-hélice denominadas Ε-proteínas. Existem quatro E- proteínas, E12, E47, E2-2 e HEB, as quais estão envolvidas no desenvolvimento de linfócito. El2 e E47 são codificadas por um gene, denominado E2A, o qual sofre emenda diferentemente. Ε-proteínas podem ser inibidas pelo inibidor de E proteína Id2 e Id3 e pela ABF-I (Mathas S., 2006). E proteínas foram descritas como supressores de tumor e foi mostrado que a super-expressão induz à apoptose. Um dos alvos específicos da E47 são os genes Socsl e Socs3. Os genes Socs são conhecidos como reguladores negativos de STAT5b e, assim, indiretamente, de BCL6. Em outras palavras, expressão de E47 dentro de uma célula B intensifica a expressão de Blimp-1, a qual resulta em diferenciação de célula B com relação a um fenótipo que produz anticorpo (célula plasmática).

A quantidade de expressão de Blimp-I em uma célula que produz anticorpo também é regulada em uma variedade de formas. Em uma modalidade, a uma célula que produz anticorpo é fornecido um composto capaz de influenciar, direta ou indiretamente, a expressão de Blimp-1. Adicional ou alternativamente, uma célula que produz anticorpo é cultivada na presença de um composto capaz de influenciar, direta ou indiretamente, a expressão de Blimp-1. Ainda proporcionado, portanto, é um método de acordo com a invenção compreendendo fornecimento, à referida célula que produz anticorpo, de um composto capaz de influenciar, direta ou indiretamente, a expressão de Blimp-1. Ainda proporcionado é um método de acordo com a invenção compreendendo cultura da referida célula que produz anticorpo na presença de um composto capaz de influenciar, direta ou indiretamente, a expressão de Blimp-1. De preferência, é usado um composto que é capaz de intensificar a expressão de Blimp-1 de forma a contra-atuar a sub-regulação de Blimp-I durante expressão de BCL6. O referido composto compreende, mais preferivelmente, IL21.

Em uma modalidade preferida, o referido composto capaz de influenciar, direta ou indiretamente, a expressão de Blimp-I compreende uma proteína Transdutora de Sinal de Ativação e Transcrição 3 (STAT3) ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma e/ou uma seqüência de ácido nucleico que codifica a mesma. STAT3 é um transdutor de sinal o qual está envolvido no desenvolvimento e diferenciação de células B. STAT3 é capaz de super-regular a expressão de Blimp-1. Ainda proporcionado é, portanto, um método de acordo com a invenção em que o referido composto capaz de influenciar, direta ou indiretamente, a expressão de Blimp-I compreende STAT3 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma ou uma seqüência de ácido nucleico que codifica STAT3 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma. Mais preferivelmente, expressão da referida seqüência de ácido nucleico que codifica STAT3 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma é regulada por um indutor de repressor endógeno, de modo que a extensão de expressão de STAT3 é regulada também. Por exemplo, um sistema promotor induzível é usado tal como, por exemplo, um sistema Tet-on ou Tet-off. Em uma modalidade, um produto de fusão compreendendo STAT3, um derivado ou análogo e ER é introduzido na referida célula permitindo a regulação de expressão de STAT3 através de hidróxi-tamoxifeno.

Uma vez que a STAT3 é capaz de influenciar a expressão de Blimp-1, também é possível regular indiretamente a expressão de Blimp-I através de administração de um composto capaz de regular, direta ou indiretamente, a atividade e/ou expressão de STAT3. Em uma modalidade, a uma célula que produz anticorpo é fornecido um composto que é capaz de intensificar a atividade de STAT3, de modo que a expressão de Blimp-I é indiretamente intensificada também. Ainda proporcionado, portanto, é um método de acordo com a invenção em que a uma célula que produz anticorpo é fornecido um composto capaz de intensificar, direta ou indiretamente, a atividade de STAT3.

Conseqüentemente, em uma modalidade, a uma célula que produz anticorpo é fornecido um composto capaz de ativar, direta ou indiretamente, a ativação de STAT3, de forma a intensificar a expressão de Blimp-1.

STAT3 é ativada em uma variedade de formas. De preferência, STAT3 é ativada através de fornecimento, a uma célula que produz anticorpo, de uma citocina. Citocinas, estando naturalmente envolvidas na diferenciação de células B, são muito eficazes na regulação de proteínas STAT. Ativadores muito eficazes de STAT3 são IL-21 e IL-6, mas também IL-2, IL-7, IL-10, IL-15 e IL-27 são conhecidas por ativar STAT3. Além disso, receptores Toll- semelhantes (TLRs), os quais estão envolvidos em imunidade inata, também são capazes de ativação de STAT3. Uma modalidade, portanto, proporciona um método da invenção em que o referido composto capaz de influenciar, direta ou indiretamente, a expressão de Blimp-I compreende IL-21, IL-2, IL- 6, IL-7, IL-10, IL-15 e/ou IL-27. Mais preferivelmente, IL-21 é usada, uma vez que a IL-21 é particularmente adequada para influenciar a estabilidade de uma célula que produz anticorpo. IL-21 é capaz de super-regular a expressão de Blimp-I mesmo quando a expressão de Blimp-I é contra-atuada por BCL6.

Adicional ou alternativamente, uma quinase de Janus com mutação (JAK) é usada de forma a ativar STAT3.

Naturalmente, uma JAK é capaz de fosforilar STAT3 após ela ter sido, em si, ativada por pelo menos uma citocina. Uma quinase de Janus com mutação capaz de ativação de STAT3, independente da presença de citocinas, é particularmente adequada em um método de acordo com a presente invenção.

Conforme já explicado antes, um composto capaz de intensificação da expressão de Blimp-1, em uma modalidade, compreende uma seqüência de ácido nucleico que codifica STAT3 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma. A presença de uma seqüência de ácido nucleico exógena que codifica STAT3 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma permite a presença contínua de STAT3 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma ainda que a expressão de STAT3 endógena seja muito baixa ou esteja ausente.

Também é possível diminuir a expressão e/ou atividade de STAT5 de forma a super-regular a Blimp-1. Se a quantidade e/ou atividade de STAT5 é diminuída, ativação de expressão de BCL6 é diminuída também, resultando em uma quantidade diminuída de produto da expressão de BCL6. Uma vez que BCL6 e Blimp-I contra-atuam a expressão um do outro, uma quantidade diminuída de produto da expressão de BCL6 resulta em uma quantidade aumentada de produto da expressão de Blimp-1. Compostos capazes de super-regular a atividade de STAT5 são, assim, capazes de super- regular indiretamente a Blimp-1. Tais compostos, por exemplo, compreendem membros do supressor de proteínas de sinalização à citocina (SOCS). Em uma modalidade, a quantidade de produto da expressão de Blimp-1 em uma célula que produz anticorpo é, portanto, super-regulada através de fornecimento, à referida célula, de uma proteína SOCS e/ou através de ativação de uma proteína SOCS dentro da referida célula.

Em uma modalidade preferida, a expressão e/ou atividade de STAT5 é diminuída quando, à referida célula que produz anticorpo, é fornecida uma seqüência de ácido nucleico que codifica E47 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma. Portanto, expressão de E47 dentro de células B expressando altos níveis de STAT5 intervém na diferenciação e proliferação, isto é, bloqueio de STAT5 via E47 e SOCS resulta em níveis diminuídos de BCL6 e, subseqüentemente, em níveis aumentados de Blimp-1. Níveis super-regulados de Blimp-I resultam em uma proliferação diminuída e em uma diferenciação da célula envolvida com relação a uma célula que produz anticorpo. Em outras palavras, expressão de E47 dentro de uma célula B intensifica a expressão de Blimp-1, o que resulta em diferenciação de células B com relação a um fenótipo que produz anticorpo (célula plasmática).

Por pelo menos uma parte funcional de uma proteína STAT5, uma proteína STAT3 e/ou BCL6 entenda-se uma molécula proteinácea que tem a mesma capacidade - quanto ao tipo, não necessariamente em quantidade - de influenciar a estabilidade de uma célula que produz anticorpo, quando comparado com uma proteína STAT5, uma proteína STAT3 e/ou BCL6, respectivamente. Uma parte funcional de uma proteína STAT5 ou uma proteína STAT3 é, por exemplo, desprovida de aminoácidos que não estão, ou estão apenas muito pouco, envolvidos na referida capacidade. Um derivado de uma proteína STAT5, uma proteína STAT3 e/ou BCL6 é definido como uma proteína a qual foi alterada, de modo que a capacidade da referida proteína de influenciar a estabilidade de uma célula que produz anticorpo é essencialmente a mesma com relação ao tipo, não necessariamente em quantidade. Um derivado é fornecido de muitas formas, por exemplo, através de substituição conservativa de aminoácido, em que um aminoácido é substituído por outro aminoácido com propriedades geralmente similares (tamanho, hidrofobicidade, etc.), de modo que o funcionamento global provavelmente não é gravemente afetado. Um derivado, por exemplo, compreende uma proteína de fusão, tal como uma proteína de fusão STAT5- ER, cuja atividade depende da presença de 4 hidróxi-tamoxifeno (4HT). Um análogo de uma proteína STAT5, uma proteína STAT3 e/ou BCL6 é definido como uma molécula tendo a mesma capacidade de influenciar a estabilidade de uma célula que produz anticorpo quanto ao tipo, não necessariamente em quantidade. O referido análogo não é necessariamente derivado da referida proteína STAT5, proteína STAT3 e/ou BCL6. Uma modalidade preferida proporciona um método de acordo com a invenção em que, à referida célula que produz anticorpo, é fornecido um agente de imortalização adicional, de preferência um agente de transformação, tal como EBV. Com um agente de imortalização adicional, a estabilidade, proliferação e/ou produção de anticorpo de uma célula que produz anticorpo de acordo com a invenção é intensificada. Um agente de transformação é um agente capaz de modificar pelo menos parte do genoma de uma célula. O referido agente de transformação compreende, de preferência, um ácido nucleico capaz de ser incorporado no genoma de uma célula.

Em uma modalidade preferida, a uma célula que produz anticorpo, de preferência uma célula B, é fornecido um vírus de Epstein-Barr (EBV). Infecção de uma célula que produz anticorpo da invenção com EBV resulta em estabilidade, proliferação e/ou produção aumentada de anticorpo da referida célula. Em uma modalidade particularmente preferida, uma célula que produz anticorpo, de preferência uma célula B, é cultivada na presença de IL-21 e fornecido EBV. Isso resulta em proliferação e/ou produção aperfeiçoada de anticorpo, quando comparado com o mesmo tipo de células que produzem anticorpo sem IL-21 e/ou EBV. A referida célula que produz anticorpo é, de preferência, cultivada na presença de IL-21 antes de ser infectada com EBV. Portanto, é proporcionado um método para aumento da estabilidade de uma célula que produz anticorpo compreendendo cultura da referida célula na presença de IL-21 e fornecimento, à referida célula, de EBV.

Conseqüentemente na presente invenção, IL-21 é particularmente adequada para melhorar a estabilidade de uma célula que produz anticorpo. Modalidades preferidas compreendem cultura de células que produzem anticorpo, de preferência células B, na presença de IL-21, à células que produzem anticorpo as quais é fornecido, além disso, um composto capaz de intensificar, direta ou indiretamente, a expressão de BCL6, uma seqüência de ácido nucleico que codifica BCL6 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo e/ou uma seqüência de ácido nucleico que codifica STAT5 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma. A referida célula que produz anticorpo é, de preferência, infectada com EBV. Por exemplo, uma célula que produz anticorpo que é naturalmente infectada com EBV é usada em um método de acordo com a invenção. Alternativa ou adicionalmente, a uma célula que produz anticorpo é fornecido EBV.

Em uma modalidade preferida, a referida célula que produz anticorpo é cultivada na presença de IL-21 antes que seja fornecido à referida célula que produz anticorpo um composto capaz de intensificar, direta ou indiretamente, a expressão de BCL6, com uma seqüência de ácido nucleico que codifica BCL6 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo e/ou com uma seqüência de ácido nucleico que codifica STAT5 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma. Cultura de células que produzem anticorpo, de preferência células B, na presença de IL-21 antes que a quantidade de produto da expressão de BCL6 e/ou Blimp-I dentro da referida célula seja influenciada é preferida porque, nessas modalidades, a estabilidade, proliferação e/ou produção de anticorpo é particularmente bem aperfeiçoada.

Em uma modalidade preferida, a invenção ainda proporciona um método para influenciar a estabilidade de uma célula que produz anticorpo conforme descrito aqui ainda compreendendo aumentar, direta ou indiretamente, a quantidade de produção da expressão de Bcl-xL dentro da referida célula que produz anticorpo. Isso é, por exemplo, realizado através de fornecido, à referida célula que produz anticorpo, de uma seqüência de ácido nucleico que codifica Bcl-xL ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo ou através de seqüências de ácido nucleico que codificam outros genes anti-apoptóticos incluindo, mas não limitado a, Bcl-2. Em ainda outra modalidade, isso é realizado através de fornecimento, à referida célula que produz anticorpo, um composto capaz de intensificar, direta ou indiretamente, a expressão de Bcl-xL, de preferência o referido composto compreende estimulação de APRIL, BAFF, CD40, BCR, citocinas, fatores de crescimento ou efetuadores a jusante, tais como JNK e AKT (PKB).

Bcl-xL é um membro da família anti-apoptótica Bcl-2, Bcl2- proteínas interagem com e contra-atuam apenas membros da família do assim denominado domínio 3 de homologia à Bcl-2 (BH3), tais como Bax, Bak, Bim e Bad, os quais induzem à liberação de citocromo c após estimulo de morte intrínseco (Boise, L. H., 1993). Assim, proteção de integridade da membrana através de proteínas tal como Bcl-xL é crítica para a sobrevivência celular.

Foi mostrado que a ativação de STAT5 protege as células de morte celular. Foi mostrado que a STAT5 regula a expressão de Bcl-xL, sustentando um papel anti-apoptótico para STAT5. STAT5 regula positivamente a expressão de Bcl-xL através de elementos de ligação à STAT dentro do promotor de Bcl-xL. In vivo, a expressão de Bcl-xL está ausente na medula óssea de camundongos duplamente deficientes em STAT5A/B. Além disso, a sobrevivência de eritroblasto STAT5-mediada é dependente de super- regulação de Bcl-xL. Recentemente, foi mostrado que a super-expressão transgênica de Bcl-xL em células B de camundongo promove a sobrevivência de células B e focos de células plasmáticas não malignas.

Um método de acordo com a invenção é particularmente adequado para a produção de uma cultura de célula que produz anticorpo compreendendo células que produzem anticorpo que são capazes de proliferar e secretar anticorpo. Em uma modalidade, uma célula B de memória é usada de forma a produzir uma cultura de célula B ex vivo. Alternativa ou adicionalmente, uma célula B nativa é usada. A referida célula B de memória e/ou célula B nativa é, de preferência, humana, de modo que anticorpos humanos são produzidos. De preferência, uma célula B de memória é usada com uma especificidade desejada. Isso significa que uma célula B de memória é usada a qual é capaz de se desenvolver em uma célula que produz anticorpo, anticorpos os quais têm uma especificidade desejada contra um antígeno de interesse. O referido antígeno de interesse compreende, por exemplo, um antígeno derivado de patógeno, um antígeno derivado de tumor e/ou um auto- antígeno. Em uma modalidade, células B são isoladas de uma amostra de sangue periférico, uma amostra de sangue do cordão e/ou uma amostra de tonsila, usando métodos conhecidos na técnica. Células B de memória são, por exemplo, isoladas através de seleção pelo marcador de célula B CD 19 e (subseqüente) seleção por IgG na superfície celular e/ou CD27. Em uma célula B de centro germinativo, expressão de BCL6 é alta, enquanto que expressão de Blimp-I é baixa. Desenvolvimento natural em uma célula que secreta anticorpo envolve super-regulação de expressão de Blimp-1. Uma vez que Blimp-I reprime a expressão de BCL6, a super-regulação de Blimp-I resulta em sub-regulação de BCL6 em uma situação natural. Em uma modalidade preferida da presente invenção, contudo, expressão de Blimp-I é super-regulada, enquanto que expressão de BCL6 é, pelo menos em parte, mantida. Isso resulta em uma célula que produz anticorpo em que BCL6 e Blimp-1 são co-expressos. A referida célula que produz anticorpo é capaz de proliferação e secreção de anticorpo e, portanto, é adequada para uso em uma cultura de célula B ex vivo. Em uma modalidade mais preferida, a referida célula que produz anticorpo é protegida de apoptose através de Bcl-xL. A referida célula que produz anticorpo é, de preferência, infectada com EBV. Em uma modalidade, uma célula que produz anticorpo que é naturalmente infectada com EBV é usada. Alternativa ou adicionalmente, a uma célula que produz anticorpo é fornecido EBV. Uma célula que produz anticorpo de acordo com a presente invenção proporciona a vantagem de que ela é estável e não sofre diferenciação terminal durante um período prolongado. A referida célula que produz anticorpo de acordo com a invenção é estável durante pelo menos uma semana, de preferência durante pelo menos um mês, mais preferivelmente durante pelo menos três meses, ainda mais preferivelmente durante pelo menos seis meses. Uma célula B de acordo com a invenção é, de preferência, cultivada na presença de CD40L, uma vez que replicação da maioria das células B é favorecida por CD40L.

Em uma modalidade, expressão de BCL6 é mantida essencialmente no mesmo nível ou em um nível maior quando comparado com uma célula B de centro germinativo, uma vez que uma expressão significativa de BCL6, junto com expressão de Blimp-1, resulta em uma célula que produz anticorpo com propriedades preferidas de proliferação e produção de anticorpo e/ou estabilidade. Em uma modalidade preferida, a referida expressão de BCL6 e/ou expressão de BCL6 são obtidas através de expressão de Bcl-xL, resultando em propriedades ainda mais preferidas de proliferação e produção de anticorpo e/ou estabilidade.

Uma modalidade, portanto, proporciona um método para produção de uma célula que produz anticorpo a qual é estável durante pelo menos uma semana, de preferência durante pelo menos um mês, mais preferivelmente durante pelo menos três meses, mais preferivelmente durante pelo menos seis meses, o método compreendendo:

- fornecimento de uma célula B de memória ou uma célula B nativa;

- aumento do nível de expressão de Blimp-I na referida célula; e

- aumento e/ou manutenção do nível de expressão de BCL6 na referida célula. Um método ex vivo para a produção de uma célula que produz anticorpo compreendendo aumento no nível de expressão de Blimp-I em uma célula B de memória ou uma célula B nativa e aumento e/ou manutenção do nível de expressão de BCL6 na referida célula também é proporcionado. Os referidos níveis de expressão de BCL6 e Blimp-I são, de preferência, levado a e/ou mantidos essencialmente no mesmo nível ou em um nível maior quando comparado com um plasmablasto. Em uma modalidade, a referida célula B é infectada com EBV (natural e/ou artificialmente) e/ou transduzida com Bcl- xL. Mais preferivelmente, uma célula B de memória é usada. A referida célula B tem, de preferência, uma especificidade por um antígeno patógeno- derivado, um antígeno tumor-derivado e/ou um auto-antígeno.

Expressão de BCL6 e expressão de Blimp-I são influenciadas de várias formas, conforme já descrito aqui antes. Por exemplo, expressão de Blimp-I é intensificada em uma célula B de memória e/ou uma célula B nativa através de fornecimento, à referida célula B, de um composto capaz de intensificar, direta ou indiretamente, a expressão de Blimp-1, tal como uma seqüência de ácido nucleico que codifica Blimp-I ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma. De preferência, expressão do referido ácido nucleico é regulada por um indutor de repressor endógeno, de modo que a extensão de expressão de Blimp-1 é regulada também.

Alternativa ou adicionalmente, uma célula B de memória e/ou uma célula B nativa é cultivada na presença de um composto capaz de intensificar, direta ou indiretamente, a expressão de Blimp-I tal como, por exemplo, IL-21, IL-2, IL-6,11-7, IL-10, IL-15, IL-27 ou uma quinase de Janus com mutação. De preferência, IL-21 é usada porque essa citocina é particularmente adequada para intensificação de expressão de Blimp-I e estabilização de uma célula que produz anticorpo com um método de acordo com a presente invenção. Em uma modalidade, a uma célula B é fornecida uma proteína SOCS ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma ou um ácido nucleico que codifica a mesma, uma vez que uma proteína SOCS ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma é capaz de intensificar indiretamente a expressão de Blimp-1. Em outra modalidade alternativa ou adicional, a uma célula B é fornecida E47 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma ou um ácido nucleico que codifica a mesma. Conforme já esboçado anteriormente, como um resultado de um nível aumentado de E47 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma, a função da proteína Socs é intensificada e expressão de Blimp-I é indiretamente aumentada. Expressão de Blimp-I resulta em sub-regulação de BCL6 endógeno. Portanto, à referida célula B de memória é, de preferência, também fornecido um composto capaz de manter a expressão de BCL6, resultando em co-expressão de BCL6 e Blimp-1. O referido composto é, de preferência, capaz de indução e/ou manutenção de expressão de BCL6 essencialmente no mesmo nível ou em um nível maior quando comparado com um plasmablasto. Um exemplo preferido de tal composto é uma seqüência de ácido nucleico que codifica BCL6 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma.

E possível fornecer diretamente a uma célula B um composto capaz de intensificar, direta ou indiretamente, a expressão de BCL6, por exemplo, através de transdução com uma seqüência de ácido nucleico. Em uma modalidade, expressão de BCL6 em uma célula B é mantida e/ou intensificada através de cultura de uma célula B de memória na presença de um composto o qual é capaz de intensificar, direta ou indiretamente, a expressão de BCL6 e/ou o qual é capaz de manter expressão de BCL6 essencialmente no mesmo nível ou em um nível maior quando comparado com uma célula B de centro germinativo.

Em uma modalidade preferida, expressão de Blimp-I é super- regulada em uma célula B, de preferência através de cultura da referida célula B na presença de um composto capaz de ativação de STAT3 e/ou Blimp-1. O referido composto compreende, de preferência, IL-21. A referida célula B compreende, de preferência, uma célula B de memória. Após isso, expressão de BCL6 é, de preferência, intensificada. Foi demonstrado que super- regulação de Blimp-I em um primeiro estágio, seguido por super-regulação de BCL6, resulta em células B particularmente estáveis capazes de replicação e produção de anticorpo. Em uma modalidade da invenção, expressão de Blimp-I ainda é super-regulada, enquanto que expressão de BCL6 é intensificada. Alternativamente, contudo, expressão de Blimp-I não é super- regulada, enquanto que expressão de BCL6 é intensificada. Dessa forma, a capacidade de replicação de uma célula B é particularmente intensificada. Conseqüentemente, a capacidade de produção de anticorpo de uma célula B é, de preferência, primeiramente intensificada, através de super-regulação de expressão e/ou atividade de Blimp-1. Subseqüentemente, a capacidade de replicação da referida célula B é, de preferência, intensificada, através de super-regulação de expressão e/ou atividade de BCL6. A célula B é, de preferência, cultivada na ausência de um composto capaz de intensificação de expressão e/ou atividade de Blimp-1, até que a replicação seja significativamente aumentada. Subseqüentemente, a referida célula B é, de preferência, cultivada novamente na presença de um intensificador de expressão e/ou atividade de Blimp-1, de modo que a produção de anticorpo seja mantida. Conforme é mostrado nos exemplos, é possível regular a Blimp- 1 e BCL6 de várias formas, resultando em co-expressão de Blimp-I e BCL6 em uma célula B, célula B a qual é capaz de replicação e produção de anticorpo. Em uma modalidade preferida, a referida célula B é infectada com EBV (natural e/ou artificialmente) e/ou transduzida com Bcl-xL.

Em uma modalidade preferida, expressão de Blimp-I é super- regulada em uma célula B, de preferência uma célula B de memória, através de cultura da referida célula B na presença de um composto capaz de ativação de STAT3. O referido composto compreende, de preferência, IL-21. De acordo com uma modalidade, à referida célula B é subseqüentemente fornecida uma seqüência de ácido nucleico que codifica BCL6 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma. As referidas células B são, de preferência, cultivadas durante uns poucos dias na ausência do referido composto capaz de ativação de STAT3 de forma a intensificar a replicação. Subseqüentemente, as referidas células são, de preferência, cultivadas novamente com - e/ou é fornecido - um composto capaz de ativação de STAT3.

Nos Exemplos, uma modalidade particularmente preferida é mostrada, em que células B são primeiramente cultivadas na presença de IL- 21. Subseqüentemente, às células B é fornecida uma seqüência de ácido nucleico que codifica BCL6. As células B são cultivadas na ausência de IL-21 e na presença de IL-2 e IL-4 durante uns poucos dias de forma a permitir expressão de BCL6, após o que IL-21 é administrada novamente à cultura de forma a intensificar a replicação e produção de anticorpo. Células B estáveis são obtidas, em que BCL6 e Blimp-I são co-expressos, células B as quais são capazes de replicação e produção de anticorpo em uma cultura ex vivo durante pelo menos 6 meses. Em uma modalidade preferida, as referidas células B são infectadas com EBV. Uma cultura de célula B de acordo com a invenção é preferida, uma vez que as células B são capazes de replicação e produção de anticorpo em uma cultura ex vivo durante um período de tempo mais longo quando comparado com as culturas atuais de células B.

Em outra modalidade preferida, uma seqüência de ácido nucleico que codifica STAT5 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma é usada de forma a intensificar a expressão de BCL6.

Tentativas na técnica anterior de usar STAT5 de forma a obter uma cultura de célula B estável capaz de produzir anticorpos, tal como descrito no WO 03/052083, falharam porque as células B perdem sua capacidade de se desenvolver em células que produzem anticorpo dentro de 2 meses. A presente invenção, contudo, proporciona o "insight" de que STAT5 é, na verdade, adequada para a produção de uma cultura de célula que produz anticorpo estável se expressão de Blimp-I é super-regulada nas células B também. De preferência, expressão de Blimp-I em uma célula B é intensificada, após o que expressão de BCL6 é intensificada pela STAT5 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma.

Em uma modalidade, expressão de Blimp-I é super-regulada em uma célula B, de preferência através de cultura da referida célula B na presença de um composto capaz de ativação de STAT3. O referido composto compreende, de preferência, IL-21. A referida célula B compreende, de preferência, uma célula B de memória. Subseqüentemente, à referida célula B é fornecida uma seqüência de ácido nucleico que codifica STAT5 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma. A referida seqüência de ácido nucleico codifica, de preferência, um composto compreendendo STAT5 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma, cuja atividade depende da presença ou ausência de um regulador exógeno. Mais preferivelmente, à referida célula B é fornecida uma seqüência de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão STAT5-ER cuja atividade depende da presença de 4 hidróxi-tamoxifeno (4HT). Nas células B resultante, as quais são capazes de replicação e produção de anticorpo, Blimp-I e BCL6 são co-expressos. Uma vez que uma cultura compreendendo células B de acordo com a invenção tenha sido produzida, é possível regular adicionalmente a capacidade de replicação e produção de anticorpo das células B através de regulação de expressão de BCL6 e Blimp-1. A quantidade de produto da expressão de BCL6 e Blimp-I é regulada também durante cultura adicional. Por exemplo, quando a produção de anticorpo das células diminui, a atividade de STAT5 é, de preferência, diminuída (de preferência através de privação de 4 hidróxi-tamoxifeno da cultura de célula) enquanto as referidas células B são cultivadas na presença de um composto capaz de ativação (expressão de) STAT3 e/ou Blimp-1. De preferência, as células são cultivadas um pouco (tipicamente cerca de uns poucos dias) na presença de IL-21 e na ausência de 4 hidróxi-tamoxifeno. Quando a produção de anticorpo foi intensificada, a cultura é, de preferência, continuada na presença de 4 hidróxi-tamoxifeno e na ausência do referido composto capaz de ativação de STAT3 de forma a intensificar a replicação e certificar-se de que expressão de Blimp-1 não elimina completamente a expressão de BCL6.

Em uma modalidade, a replicação e produção de anticorpo são intensificadas através de infecção com EBV. Conseqüentemente, após ter sido fornecida STAT5 à referida célula B, ela é, de preferência, infectada com EBV. Células B estáveis são obtidas, as quais secretam altos níveis de anticorpo.

Nos Exemplos, uma modalidade particularmente preferida é mostrada, em que células B são primeiramente cultivadas na presença de IL- 21 durante uns poucos dias. Expressão de Blimp-1 é induzida e as células B se diferenciam em células que produzem anticorpo. Subseqüentemente, às células B é fornecida uma seqüência de ácido nucleico que codifica STAT5- ER. As células B são cultivadas na presença de IL-21 durante cerca de 1-50 dias, de preferência cerca de 1-30 dias, mais preferivelmente cerca de 1,5-21 dias, mais preferivelmente cerca de 1-5 dias onde, após as células B serem cultivadas na ausência de IL-21 e na presença de 4-HT, IL-2 e IL-4 de forma a ativar STAT5. Durante esse período, expressão de BCL6 é intensificada de forma a manter um equilíbrio, em que BCL6 e Blimp-I são co-expressos. Finalmente, após imortalização e expansão, IL-21 é administrada novamente à cultura e 4HT é retirado de forma a aumentar a expressão de Blimp-1. O referido equilíbrio, em que Blimp-1 e BCL6 são co-expressos, é mantido variando a quantidade de IL-21 e 4-HT no meio de cultura, de modo que expressão de BCL6 e expressão de Blimp-I sejam mantidas. Células B estáveis são obtidas, as quais são capazes de replicação e produção de anticorpo em uma cultura ex vivo durante pelo menos 6 meses.

Conseqüentemente, um método da invenção permite a regulação sutil da capacidade de replicação e capacidade de produção de anticorpo de células B cultivadas ex vivo. Quando super-regulação de produção de anticorpo é desejada, expressão de Blimp-I é favorecida com relação à expressão de BCL6. Quando super-regulação de replicação é desejada, expressão de BCL6 é favorecida com relação à expressão de Blimp- 1. Um método da invenção permite manutenção de um equilíbrio em que BCL6 e Blimp-I são co-expressos, resultando em células que produzem anticorpo as quais são capazes de replicação e produção de anticorpo ex vivo. Em uma modalidade, as referidas células B são infectadas com EBV após o referido equilíbrio ter sido estabelecido, de forma a aumentar e estabilizar adicionalmente a produção de anticorpo.

Além disso, a invenção ainda divulga que regulação do equilíbrio mencionado é também obtida por uma E proteína (por exemplo, E47). A expressão de E47 dentro de células B expressando altos níveis de STAT5b intervém na diferenciação e proliferação, isto é, bloqueio de STAT5 via E47 e SOCS resulta em níveis diminuídos de BCL6 e, subseqüentemente, em níveis aumentados de Blimp-1. Níveis super-regulados de Blimp-I resultam em uma proliferação diminuída e em uma diferenciação da célula envolvida com relação a uma célula que produz anticorpo. Em outras palavras, expressão de E47 dentro de uma célula B intensifica a expressão de Blimp-1, o que resulta em diferenciação da célula B com relação a um fenótipo que produz anticorpo (célula plasmática).

A invenção ainda descreve a estabilização do crescimento de células que produzem anticorpo com Bcl-xL.

A invenção, portanto, proporciona um método para produção de uma célula que produz anticorpo a qual é estável durante pelo menos uma semana, de preferência pelo menos um mês, mais preferivelmente pelo menos três meses, ainda mais preferivelmente pelo menos seis meses, o método compreendendo:

- fornecimento, a uma célula B, de um composto capaz de intensificar, direta ou indiretamente, a expressão de Blimp-I e/ou cultura de uma célula B na presença de um composto capaz de intensificar, direta ou indiretamente, a expressão de Blimp-1; e

- fornecimento, à referida célula B, de um composto capaz de intensificar, direta ou indiretamente, a expressão de BCL6 ou um composto capaz de manter a expressão de BCL6 em um nível essencialmente maior quando comparado com uma célula B de centro germinativo.

Alternativa ou adicionalmente, a referida célula B é cultivada na presença de um composto capaz de intensificar, direta ou indiretamente, a expressão de Blimp-I na presença de um composto capaz de intensificar, direta ou indiretamente, a expressão de BCL6 e/ou na presença de um composto capaz de manter a expressão de BCL6 essencialmente no mesmo nível ou em um nível maior, quando comparado com uma célula B de memória natural.

O referido composto o qual é capaz de intensificar, direta ou indiretamente, a expressão de BCL6 e/ou manter a expressão de BCL6 em um nível maior, quando comparado com uma célula B de memória natural, compreende, de preferência:

- uma seqüência de ácido nucleico que codifica BCL6 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma e/ou

- uma seqüência de ácido nucleico que codifica STAT5 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma e/ou

- um composto capaz de ativar, direta ou indiretamente, STAT5 e/ou

- um composto capaz de intensificar, direta ou indiretamente, expressão de STAT5.

A uma célula B é, de preferência, primeiramente fornecido um composto capaz de intensificar, direta ou indiretamente, a expressão de Blimp-I e/ou cultivada na presença de um composto capaz de intensificar, direta ou indiretamente, a expressão de Blimp-1, antes que expressão de BCL6 e/ou atividade de BCL6 da referida célula B seja aumentada.

Conforme já explicado aqui acima, o referido composto capaz de intensificar direta ou indiretamente a expressão de Blimp-I compreende, de preferência, IL-21, IL-2, IL-6,11-7, IL-10, IL-15, IL-27, uma proteína SOCS, Ε-proteína E47, E12, E2-2 ou HEB, uma quinase de Janus com mutação e/ou uma seqüência de ácido nucleico que codifica STAT3 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma. Mais preferivelmente, IL- 21 é usada. Se uso é feito de uma seqüência de ácido nucleico que codifica BCL6, STAT5 e/ou STAT3 e/ou Bcl-xL ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo BCL6, STAT5 e/ou STAT3 e/ou Bcl-xL, expressão da referida seqüência de ácido nucleico é, de preferência, regulada por um ativador e/ou repressor que é induzível por um composto exógeno. Dessa forma, expressão da referida seqüência de ácido nucleico é regulada determinando-se a quantidade de composto exógeno que é administrado.

Em uma outra modalidade preferida, a uma célula que produz anticorpo é fornecido um agente de imortalização de forma a aumentar a estabilidade, proliferação e/ou produção de anticorpo da referida célula. Conforme já explicado antes, o referido agente de imortalização compreende, de preferência, um agente de transformação. Em uma modalidade particularmente preferida, uma célula B é infectada com EBV. A referida célula B é, de preferência, cultivada na presença de IL-21. Conforme mostrado nos Exemplos, células B infectadas com EBV e cultivadas na presença de IL-21 mostram forte proliferação e produção intensificada de anticorpo. As referidas células B são, de preferência, cultivadas na presença de IL-21 antes de serem infectadas com EBV. Contudo, também é possível isolar células B infectadas com EBV, de preferência células B que são naturalmente infectadas com EBV e cultivar as mesmas na presença de IL-21. Ainda proporcionado, portanto, é um método para influenciar a estabilidade de uma célula B compreendendo cultura da referida célula B na presença de IL-21 e infecção da referida célula B com EBV. Um método para influenciar a estabilidade de uma célula B EBV-infectada compreendendo cultura da referida célula B EBV-infectada na presença de IL-21 é também proporcionado com o mesmo. Em uma modalidade, uma célula B é cultivada na presença de IL-21, infectada com EBV e subseqüentemente cultivada na ausência de IL-21.

Uma modalidade compreende influencia da quantidade de produto da expressão de BCL6 e/ou produto da expressão de Blimp-I além de infecção com EBV. De preferência, uma célula que produz anticorpo, de preferência uma célula B, é infectada com EBV enquanto BCL6 e Blimp-I são co-expressos na referida célula que produz anticorpo. Em uma modalidade preferida, a uma célula B é fornecido BCL6 e/ou um composto capaz de intensificar, direta ou indiretamente, a expressão de BCL6 e EBV. O referido composto capaz de intensificar, direta ou indiretamente, a expressão de BCL6 compreende, de preferência, STAT5. Em outra modalidade preferida, a uma célula B a qual já está infectada (naturalmente) infectada por EBV é fornecido BCL6 e/ou um composto capaz de intensificar, direta ou indiretamente, a expressão de BCL6, de preferência STAT5. As referidas células B são, de preferência, cultivadas na presença de IL-21.

Ainda proporcionado, portanto, é um método de acordo com a invenção compreendendo fornecimento de uma célula B; de preferência cultura da referida célula B na presença de IL-21; fornecimento, à referida célula B, de BCL6 e/ou STAT5 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma; fornecimento, à referida célula B, do vírus de Epstein- Barr; e cultura da referida célula B ex vivo. Um método compreendendo fornecimento de uma célula B EBV-infectada; de preferência cultura da referida célula B na presença de IL-21; fornecimento, à referida célula B5 de BCL6 e/ou STAT5 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma; e cultura da referida célula B ex vivo é também proporcionado com o mesmo. Células B são produzidas as quais mostram forte proliferação e produção de anticorpo.

Em uma modalidade, uma pluralidade de células B é testada com relação à especificidade por um determinado antígeno. Isso é feito usando qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, um ELISA. Subseqüentemente, pelo menos uma célula B com uma especificidade por um determinado antígeno é selecionada. Isso é, por exemplo, realizado através de incubação de células B com um antígeno rotulado e isolamento das referidas células B usando métodos conhecidos na técnica. Células B selecionadas são, de preferência, cultivadas na presença de IL-21. De acordo com essa modalidade, à células selecionadas é fornecido BCL6 e/ou STAT5 exógena ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma de forma a induzir, manter e/ou melhorar a presença e/ou quantidade de produto da expressão de BCL6. Pelo menos uma célula B compreendendo BCL6 e/ou STAT5 exógena ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma é subseqüentemente selecionada. A referida célula B selecionada é infectada com vírus de Epstein- Barr. Essa modalidade é particularmente adequada para seleção e cultura de células B com uma determinada especificidade, as quais são derivadas de um reservatório de células B. Por exemplo, células B humanas são coletadas através de seleção por CD 19, a qual é um marcador de célula B, e incubadas com um antígeno de interesse. Dessa forma, células B humanas com uma especificidade desejada são selecionadas e ainda cultivadas ex vivo. As referidas células B são, de preferência, cultivadas na presença de IL-21 em pelo menos um estágio do período de cultura. Em uma modalidade, a referida célula B é cultivada na presença de IL-21 antes que BCL6 e/ou STAT5 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma seja introduzida na referida célula B. Em ainda outra modalidade preferida, à referida célula B é ainda fornecido Bcl-xL ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma.

Mesmo embora o EBV promova a proliferação e produção de anticorpo, a infecção com EBV de uma célula que produz anticorpo nem sempre é preferida. Por exemplo, se controle rigoroso das propriedades e características genéticas de uma célula que produz anticorpo é desejado, pode-se escolher não usar infecção com EBV porque a infecção com EBV envolve incorporação de seqüências de ácido nucleico desconhecidas no genoma de uma célula. Além disso, uma célula B infectada com EBV perde sua expressão na superfície do receptor de célula B (BCR). Isso pode ser indesejado, por exemplo, quando células B se destinam a serem isoladas e/ou selecionadas com relação a uma especificidade desejada após um longo período de cultura. Tal método de isolamento e/ou seleção usualmente envolve ligação de células B com uma especificidade desejada a um antígeno de interesse com seu BCR. Células B infectadas com EBV, com expressão de BCR significativamente reduzida, são, portanto, menos adequadas para tais métodos de isolamento/seleção. Conseqüentemente, em casos onde a presença de um receptor de célula B sobre as células B é desejado tal como, por exemplo, em ensaios de seleção, as células B não são, de preferência, infectadas com EBV ou somente em um estágio posterior.

Uma modalidade proporciona um método de acordo com a invenção compreendendo seleção e/ou isolamento de um anticorpo ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo de interesse. Em uma modalidade, células que produzem IgM e células que produzem IgG são selecionadas e/ou isoladas. De preferência, uma célula que produz IgG é selecionada e/ou isolada.

Células que produzem anticorpo geradas com um método de acordo com a invenção são adequadas para a produção de anticorpo contra um antígeno de interesse. Em uma modalidade preferida, contudo, os genes que codificam as cadeias pesada e/ou leve de Ig são isolados da referida célula e expressos em uma segunda célula tal como, por exemplo, células de uma linhagem de célula de ovário de hamster Chinês (CHO). A referida segunda célula, também denominada aqui uma célula produtora, é, de preferência, adaptada à produção comercial de anticorpo. Proliferação da referida célula produtora resulta em uma linhagem de célula produtora capaz de produzir anticorpo. De preferência, a referida linhagem de célula produtora é adequada para produção de compostos para uso em seres humanos. Conseqüentemente, a referida linhagem de célula produtora é, de preferência, isenta de agentes patogênicos, tais como microorganismos patogênicos.

Um método de acordo com a invenção é, de preferência, usado para a geração de uma célula que produz anticorpo que é estável durante pelo menos uma semana, de preferência pelo menos um mês, mais preferivelmente pelo menos três meses, ainda mais preferivelmente pelo menos seis meses, de modo que produção comercial de anticorpo se torne possível. Uma modalidade preferida proporciona um método de acordo com a invenção em que uma célula que produz anticorpo é produzida a qual é capaz de produzir anticorpos contra um antígeno de interesse. O referido antígeno de interesse compreende, de preferência, um antígeno derivado de patógeno, um antígeno derivado de tumor e/ou um auto-antígeno. Mais preferivelmente, uma linhagem de célula estável capaz de produzir anticorpos monoclonais é produzida. Isso é, de preferência, realizado usando células B de memória que, por exemplo, tenham sido isoladas de uma amostra através de seleção com CD 19 (marcador de célula B) e IgG e/ou CD27 na superfície celular (para marcar células de memória). Além disso, uma célula que produz anticorpo capaz de se ligar especificamente a um antígeno de interesse é, por exemplo, selecionada em um ensaio de ligação usando o referido antígeno de interesse. Subseqüentemente, de acordo com essa modalidade preferida, BCL6 e Blimp- 1 são co-expressos na referida célula que produz anticorpo, resultando em uma cultura de células capazes de ligação específica ao referido antígeno de interesse. De preferência, a referida célula que produz anticorpo é infectada com EBV. Em ainda outra modalidade preferida, à referida célula B é ainda fornecido Bcl-xL ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo.

Se apenas uma célula de memória é usada, uma linhagem de célula de acordo com a invenção que produz anticorpos monoclonais é obtida. Também é possível gerar uma linhagem de célula que produz anticorpo monoclonal começando com várias células B capazes de produzir anticorpo contra diferentes antígenos. Após uma cultura de célula B estável ter sido produzida com um método de acordo com a invenção, uma célula B capaz de produzir anticorpos contra um antígeno de interesse específico é isolada e pelo menos uma parte funcional de um gene que codifica a cadeia pesada e/ou a cadeia leve de Ig da referida célula B é expressa em uma segunda linhagem de célula. De preferência, pelo menos uma parte funcional do gene que codifica a cadeia pesada de Ig e pelo menos uma parte funcional do gene que codifica a cadeia leve de Ig da referida célula B são expressas em uma segunda linhagem de célula.

Em uma modalidade, uma célula que produz anticorpo, de preferência, mas não necessariamente, uma célula B de memória, que tenha sido obtida de um indivíduo o qual foi previamente exposto a um antígeno de interesse, é usada em um método de acordo com a invenção. Dessa forma, se torna possível produzir anticorpo humanos de interesse ex vivo.

A invenção, além disso, proporciona uma célula que produz anticorpo a qual é estável durante pelo menos uma semana, de preferência durante pelo menos um mês, mais preferivelmente durante pelo menos três meses, mais preferivelmente durante pelo menos seis meses, significando que uma célula que produz anticorpo de acordo com a presente invenção é capaz de replicação e produção de anticorpo ou capaz de replicação e desenvolvimento em uma célula que produz anticorpo, durante os referidos períodos de tempo. Células que produzem anticorpo de acordo com a invenção compreendem, dentre outras coisas, células que produzem IgM e células que produzem outros isotipos de imunoglobulina, tais como IgG, IgA, IgE. Uma célula que produz anticorpo de acordo com a invenção é particularmente adequada para uso em uma linhagem de célula que produz anticorpo. Células que produzem anticorpo de acordo com a invenção são, de preferência, cultivadas ex vivo e os anticorpos produzidos pelas referidas células são, de preferência, coletados para outro uso. Alternativa ou adicionalmente, os genes que codificam anticorpo das referidas células são isolados para uso adicional. Anticorpos ou partes funcionais, derivados e/ou análogos dos mesmos produzidos com um método de acordo com a invenção são úteis para uma ampla variedade de aplicações tais como, por exemplo, aplicações terapêuticas, profiláticas e diagnosticas, bem como para fins de pesquisa e experimentos ex vivo. Por exemplo, um ensaio de seleção é realizado, em que anticorpos ou partes funcionais, derivados e/ou análogos dos mesmos de acordo com a invenção são incubados com uma amostra de forma a determinar se um antígeno de interesse está presente.

Uma célula que produz anticorpo de acordo com a invenção compreende, de preferência, uma célula de mamífero, mais preferivelmente uma célula humana, uma célula de murino, uma célula de coelho e/ou uma célula de lhama. Em uma modalidade particularmente preferida, a referida célula que produz anticorpo compreende uma célula humana que produz anticorpo humano porque anticorpos humanos são particularmente adequados para aplicações terapêuticas e/ou profiláticas em seres humanos.

Uma célula que produz anticorpo de acordo com a invenção compreende, de preferência, um composto exógeno o qual é capaz de influenciar, direta ou indiretamente, a expressão de BCL6 e/ou um composto exógeno o qual é capaz de influenciar, direta ou indiretamente, a expressão de Blimp-1. uma célula que produz anticorpo de acordo com a invenção compreende, de preferência, um composto exógeno o qual é capaz de intensificar, direta ou indiretamente, a expressão de BCL6 e um composto exógeno o qual é capaz de intensificar, direta ou indiretamente, a expressão de Blimp-I porque co-expressão de BCL6 e Blimp-I resulta em uma célula que produz anticorpo preferida de acordo com a invenção a qual é capaz de proliferar e produzir anticorpo.

Conforme explicado aqui antes, expressão de BCL6 é intensificada em uma variedade de formas. Expressão de BCL6 é, de preferência, super-regulada usando uma seqüência de ácido nucleico que codifica BCL6 e/ou STAT5 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo de BCL6 e/ou STAT5. Ainda proporcionada, portanto, é uma célula que produz anticorpo de acordo com a invenção compreendendo uma seqüência de ácido nucleico exógena que codifica BCL6 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo e/ou uma seqüência de ácido nucleico exógena que codifica STAT5 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma.

Além disso, expressão de Blimp-I é intensificada em uma variedade de formas. De preferência, uma seqüência de ácido nucleico que codifica STAT3 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma é usada. A invenção, portanto, ainda proporciona uma célula que produz anticorpo de acordo com a invenção compreendendo uma seqüência de ácido nucleico exógena que codifica STAT3 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma.

Em uma modalidade, a referida seqüência de ácido nucleico que codifica BCL6, STAT5, STAT3 e/ou Bcl-xL e/ou uma parte funciona, derivado e/ou análogo de BCL6, STAT5 e/ou STAT3 e/ou Bcl-xL é constitutivamente ativa, de modo que BCL6, STAT5, STAT3 e/ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo dos mesmos permanece presente em uma célula que produz anticorpo de acordo com a invenção, mesmo quando genes endógenos de BCL6, STAT5 e/ou STAT3 e/ou Bcl-xL são sub-regulados por compostos endógenos. Mais preferivelmente, a expressão da referida seqüência de ácido nucleico que codifica BCL6, STAT5, STAT3 e/ou Bcl-xL ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo de BCL6, STAT5 e/ou STAT3 e/ou Bcl-xL é regulada por um ativador e/ou repressor que é induzível por um composto exógeno, de modo que a quantidade de BCL6, STAT5, STAT3 e/ou Bcl-xL ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma é regulada também através de regulação da quantidade de composto exógeno que é administrado. Uma modalidade, portanto, proporciona uma célula que produz anticorpo de acordo com a invenção em que expressão da referida seqüência de ácido nucleico que codifica BCL6, STAT5, STAT3 e/ou Bcl-xL ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo de BCL6, STAT5 e/ou STAT3 e/ou Bcl-xL é regulada por um ativador e/ou repressor que é induzível por um composto exógeno.

Conforme explicado antes, em várias modalidades células que produzem anticorpo de acordo com a presente invenção são infectadas com o EBV. A invenção, portanto, ainda proporciona uma célula que produz anticorpo compreendendo:

1) um agente de imortalização, de preferência um agente de transformação, mais preferivelmente um vírus de Epstein-Barr; e

2) um composto o qual é capaz de influenciar, direta ou indiretamente, a quantidade de produto da expressão de BCL6 na referida célula e/ou um composto o qual é capaz de influenciar, direta ou indiretamente, a quantidade de produto da expressão de Blimp-I na referida célula. Em uma modalidade, a uma célula que produz anticorpo é fornecido BCL6 e/ou STAT5 e, subseqüentemente, infectada com EBV. Ainda proporcionada é, portanto, uma célula que produz anticorpo compreendendo vírus de Epstein-Barr e BCL6 exógeno ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo. Uma célula que produz anticorpo compreendendo vírus de Epstein-Barr e STAT5 exógena ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo da mesma é também proporcionada. A referida célula que produz anticorpo é, de preferência, uma célula B. Conforme demonstrado nos exemplos, células B às quais são fornecidos BCL6/STAT5 e EBV mostram proliferação e produção de anticorpo particularmente fortes.

Uma célula que produz anticorpo de acordo com a presente invenção com uma estabilidade aumentada é particularmente adequada para a produção de uma linhagem de célula ex vivo. A invenção, portanto, ainda proporciona um método para produção de uma linhagem de célula que produz anticorpo compreendendo:

- obtenção de uma célula que produz anticorpo estável com um método de acordo com a invenção e

- cultura da referida célula que produz anticorpo ex vivo.

De preferência, uma linhagem de célula B é gerada. Mais preferivelmente, uma linhagem de célula estável compreendendo células B capazes de produzir anticorpos especificamente dirigidos contra um antígeno de interesse é gerada. Isso é, de preferência, feito através de obtenção de uma célula B a qual é capaz de se desenvolver em uma célula a qual produz anticorpos contra um antígeno de interesse tal como, por exemplo, um antígeno derivado de patógeno, um antígeno derivado de tumor e/ou um auto- antígeno. A quantidade de expressão de BCL6 e/ou Blimp-I na referida célula é subseqüentemente regulada. Em uma modalidade, a referida célula B é infectada com EBV. A referida célula B é, de preferência, obtida a partir um indivíduo que tenha sido exposto a um antígeno de interesse. O referido indivíduo compreende, de preferência, um mamífero, mais preferivelmente um ser humano, um coelho, um roedor e/ou um lhama. Em uma modalidade particularmente preferida, o referido indivíduo é um ser humano.

A invenção, portanto, proporciona um método de acordo com a invenção compreendendo:

- obtenção de uma célula B de um indivíduo, de preferência um ser humano, que tenha sido exposto a um antígeno de interesse, - produção de uma célula que produz anticorpo que é estável durante pelo menos uma semana, de preferência pelo menos um mês, mais preferivelmente pelo menos três meses, mais preferivelmente pelo menos seis meses usando a referida célula B obtida do referido indivíduo em um método de acordo com a invenção e

- cultura da referida célula que produz anticorpo ex vivo.

Uma aplicação importante é a produção de anticorpos que são capazes de se ligar especificamente a um antígeno de interesse. Uma modalidade da invenção, portanto, proporciona um método para a produção de anticorpos capazes de se ligar especificamente a um antígeno de interesse, o método compreendendo:

- obtenção de uma célula B capaz de se diferenciar em uma célula B, célula B a qual produz anticorpos capazes de se ligar especificamente ao referido antígeno de interesse,

- produção de uma célula que produz anticorpo que é estável durante pelo menos uma semana, de preferência pelo menos um mês, mais preferivelmente pelo menos três meses, mais preferivelmente pelo menos seis meses usando a referida célula B em um método de acordo com a invenção e

- obtenção de anticorpos produzidos pela referida célula que produz anticorpo.

A referida célula que produz anticorpo é, de preferência, ainda cultivada ex vivo de forma a proporcionar uma linhagem de célula estável capaz de produzir anticorpos os quais são especificamente dirigidos a um antígeno de interesse. Mais preferivelmente, pelo menos uma parte funcional de um gene que codifica a cadeia pesada e/ou cadeia leve de Ig da referida célula B é expressa em uma segunda célula. A referida segunda célula é, de preferência, usada de forma a produzir uma linhagem de célula comercialmente adequada.

A invenção é ainda explicada nos exemplos a seguir. Esses exemplos não limitam o escopo da invenção, mas servem meramente para esclarecer a invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Métodos

Células B de memória humanas são purificadas de sangue periférico ou tonsila primeiro através de seleção positiva por células B com glóbulos de CD 19 MACS® (Miltenyi Biotech). Células B de memória são, então, selecionadas através de coloração da superfície e seleção de células com relação à IgG. Células B IgG+ são, então, cultivadas com células L de fibroblasto de camundongo expressando CD40L na presença de IL-21 de camundongo ou humana durante 36 a 48 horas. As células são, então, transferidas para lâminas de cultura tecidual revestidas com Retronectin® (Takara, Shiga, Japão), onde elas foram transduzidas com um retrovírus que codifica BCL6-IRES-GFP humana durante 16 h a 37°C. As células transduzidas são, então, cultivadas sobre células CD40L-L na presença de IL- 2 humana e IL-4 humana. Após aproximadamente 3-4 semanas, as células GFP+ (isto é, células BCL6+) atingem 100% da cultura, após o que células BCL6+ são cultivadas com IL-2 e IL-4 ou com IL-21 humana ou de camundongo. Usando citometria de fluxo, nós monitoramos a expressão de GFP, CD19, CD38, CD20, classe II do MHC, CD27 (BD Biosciences) e outros marcadores usando anticorpos rotulados. Nós monitoramos o crescimento através de contagem de célula e a produção de Ig é monitorada através de detecção por ELISA enzimático de Ig no sobrenadante de cultura (Dako, Glostrup, Dinamarca). A expressão de gene é monitorada através de reação em cadeia de polimerase com transcriptase reversa (RT-PCR, Invitrogen, Breda, Países Baixos).

Resultados

A introdução de BCL6 em células B de memória resulta em uma expectativa de vida grandemente aumentada com relação à células B normais em cultura (meses vs. ~3 semanas). Essas células mantêm CD 19, Ig na superfície, classe II do MHC e expressam níveis intermediários de CD38 e CD20, sugerindo um fenótipo de célula de memória (não mostrado). Cultura dessas células sobre células CD40L-L na presença de IL-21 resulta em uma vantagem significativa no crescimento (Figura 1) e aquisição de um fenotipo de superfície celular semelhante a plasmablasto (CD38hlCD20+, Figura 2). De modo importante, células cultivadas com IL-21 secretam 300% mais IgG comparado com células cultivadas com IL-2 e IL-4. Juntos, esses dados mostram que cultura com IL-21 promove o desenvolvimento de plasmablasto em uma população de células B imortalizadas, exibindo crescimento e produção de anticorpo intensificados. Exemplo 2

Um modelo não limitativo de uma modalidade da presente invenção é representado na Figura 4.

No corpo humano, diferenciação de células plasmáticas de células B de memória envolve sub-regulação de BCL6 e super-regulação de Blimp-1. Em células de memória, a expressão de BCL6 é alta e a expressão de Blimp-I é baixa. Sinais que disparam a diferenciação causam uma super- regulação de Blimp-I e essa Blimp-I contra-atua a expressão de BCL6. Esse estágio tem curta duração e é denominado o plasmablasto. Com aumento progressivo dos níveis de Blimp-1, expressão de BCL6 é extinta, resultando em uma célula plasmática.

Em uma modalidade da invenção, a expressão de BCL6 é "travada", por exemplo, em virtude da expressão estável mediada por um cassete de expressão retroviral integrado no DNA das células B. Então, com os níveis de BCL6 mantidos, nós "ligamos" a expressão de Blimp-1, por exemplo, usando uma citocina que ativa STAT3, tal como IL-21 (Figura 3). Essa combinação, através de modulação de transcrição chave, resulta em crescimento estável de células que secretam anticorpo e têm características de fenotipo de um plasmablasto.

Tabela 1: Marcadores na superfície celular de células B de memória, plasmablastos e células plasmáticas

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Exemplo 3

Materiais e Métodos

Manutenção e isolamento de células B humanas

Usando procedimentos padrões, células B humanas CD 19 positivas foram isoladas da camada leucocitária derivada de um banco de sangue (outras fontes podem ser heparina fresca ou sangue ACD ou um órgão linfóide, por exemplo, tonsila ou baço). Em resumo, células mononucleares de sangue periférico total (PBMC) foram isoladas usando separação de densidade de Ficoll (Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido). Glóbulos rotulados com CD 19 foram usados para selecionar positivamente células B através da técnica de seleção de células MACS (Miltenyi, Auburn, CA, EUA). As células foram subseqüentemente coradas com combinações apropriadas de anticorpos monoclonais (mAbs) à CD 19, CD27, IgG, IgM, CD3 (Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ, EUA) e Toxóide do

Tétano rotulado com ficoeritrina (PE) (fornecido por A. Radbruch, Berlin, Alemanha) ou qualquer outro antígeno rotulado. Células foram, então, selecionadas usando o FACSAria (BD). Células selecionadas foram lavadas e cultivadas (1,5 a 2 χ 10^5 células/ml) sobre células L expressando CD40L irradiadas (5 x 10"4 células/ml; fornecidas por DR. J. Banchereau, Schering Plough France5 Dardilly, França) em Meio Essencial Mínimo D Modificado de Iscobe (IMDM) contendo 8% de soro fetal de bezerro (FCS) e Penicilina/Estreptomicina. A menos que de outro modo mencionado, essas células L expressando CD40L estão sempre presentes nas culturas.

Transdução e regulação de STAT5b ativa constitutiva de camundongo em células B

Células B purificadas foram produzidas para se tornar transduzidas com o gene caSTAT5b. Dois protocolos de produção foram usados: (1) células B purificadas foram cultivadas durante 3 dias com interleucina (IL) 2 (20 U/ml, Chiron, Emeryville, CA, EUA), seguido por uma cultura de 24 horas com IL-2 e IL-4 (10 ng/ml, R&D, Minneapolis, MN5 EUA) ou (2) células B purificadas foram cultivadas durante 36 horas com IL- 21 recombinante de camundongo (50 ng/ml, R&D). Subseqüentemente, as células foram colocadas sobre fragmentos de fibronectina humana recombinante CH-296 (Hanenberg H., Nat., Med. 1996; RetroNectin Takara, Japão) e lâminas tratadas com albumina de soro humano (Corning Life Sciences, Corning, NY5 EUA) na ausência de células L, com as citocinas IL- 2/4 ou IL-21. Por fim, as células foram transduzidas com o gene caSTAT5b (descrito por Ariyoshi K., JBC, 2000 e obtido de T. Kitamura, IMSUT, Tóquio, Japão) fundida ao receptor de estrogênio (ER, fornecido por H. Kurata, DNAX Institute, Palo Alto, CA, EUA). A atividade do produto da fusão caSTAT5b-ER pode ser controlada pelo hormônio hidróxi-tamoxifeno (4HT, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). A transdução foi realizada usando um retrovírus conforme descrito previamente (Heemskerk M.H., JEM, 1997; Heemskerk M.H., Cell Immunol. 1999; Scheeren F.A., Nat Immunol, 2005). A eficiência de transdução foi determinada através de coloração com anticorpo de um mutante truncado, sinalização-incompetente de Receptor de Fator de Crescimento de Nervo (ANGFR, fornecido por C. Bonini, St. Raphael Hospital, Milão, Itália). Assim, crescimento de células B que contêm o gene caSTAT5b depende da presença de 4HT e essas células podem ser detectadas através de coloração com anticorpo para NGFR (Chromaprobe, Maryland Heights, MO, EUA).

Desenvolvimento de linhagens de célula B 100% % caSTATSb positivas que secretam anticorpos

Nós desenvolvemos uma linhagem de célula B que produz anticorpos monoclonais e é 100% caSTAT5b (=NGFR) positiva. Isso foi obtido através de diferenciação de células B de um fenotipo de memória para um que produz anticorpo e transdução com a estrutura caSTA5b-ER-IRES- NGFR. A ação de caSTAT5b torna as células B diferenciadas insensíveis à morte celular. Diferenciação de células B é induzida nas primeiras 2 a 3 semanas após isolamento (Figura 5) usando uma mistura de citocina (IL-2, 4, 21 ou combinações dessas citocinas e CD40L). O ponto de tempo em que caSTAT5b é ativado através da adição de 4HT afeta o fenotipo global das culturas. Isso é porque caSTAT5b impede que a célula troque seu fenotipo, por exemplo, bloqueia a diferenciação adicional. Assim, quanto mais tempo 4HT é mantido, mais células B se diferenciarão em células que produzem anticorpo ou em um tipo de célula que cresce, de preferência, sob essas condições de cultura (sugestões para tipos de célula são: células B primitiva, foliculares, de memória, que produzem anticorpo, plasmablasto, célula plasmática, zona marginal, peri-sinusoidais ou transitórias - muitos desses subconjuntos de célula B foram determinados apenas em camundongos). Quando 4HT está presente no meio de cultura, células B caSTA5b-ER-IRES- NGFR positivas podem sobreviver durante longos períodos (Tabela 2). Tabela 2. Visão geral de culturas de célula B humanas transduzidas com caSTAT5b-ER-IRES-NGFR. PBMC foram obtidas após isolamento em gradiente de Ficoll de camadas leucocitárias derivadas de um banco de sangue e subseqüentemente selecionadas através de MACS de CD 19 e CD27 ou através de seleção de célula por FACSAria. Células B purificadas foram, entoa, cultivadas na presença de células L com citocinas indicadas antes de serem transduzidas com um retrovírus contendo a estrutura genética caSTAT5b-ER-IRES-NGFR.

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Desenvolvimento de culturas de célula B clonais derivadas de uma única célula

O crescimento de células B caSTA5b-ER-IRES-NGFR positivas geralmente leva cerca de 4 semanas, após o que culturas clonais podem ser obtidas realizando culturas com diluição limitativa (LD) ou seleção de uma única célula usando citometria de fluxo (o FACSAria). Essas culturas consistem de 2500 a 5000 células L, concentrações normais de IL-2 e IL-5 e 1, 5 ou 10 células B/96 cavidades quando a LD é realizada com células 100% NGFR+ e 10, 100 e 1000 células/96 cavidades quando células NGFR+ são selecionadas em 96 cavidades usando o FACSAria. Re-estimulação de produção de anticorpo de culturas de célula B caSTAT5b- ER positivas

Culturas de célula B caSTAT5b-ER-IRES-NGFR positivas poli-, oligo- ou monoclonais que eram negativas ou com baixa produção de anticorpo foram lavadas extensivamente antes que as culturas fossem (1) privadas de 4HT, IL-2 e IL-4 antes de serem cultivadas com IL-21, então, após 4-10 dias, os sobrenadantes foram testadas com relação à produção de IgM e IgG ou (2) privadas de 4HT durante 10 dias enquanto cultivadas com IL-2 e IL-4 e, então, no dia 10, IL-2 e IL-4 foram substituídas por IL-21. Então, em diferentes pontos de tempo, os sobrenadantes são testados com relação à produção de IgM e IgG. Resultados

Diferenciação e proliferação de célula Β; o protocolo com IL-2 e IL-4 vs. IL- 21

Culturas de célula B tratadas com IL-21 mostraram respostas proliferativas intensificadas dentro das primeiras 2-3 semanas comparado com IL-2 e IL-4 (Figura 6a). Contudo, diferente das culturas com IL-2 e IL-4, estimulação contínua com IL-21 resultou em proliferação e morte celular diminuídas, mesmo na presença de STAT5b ativo (Figura 6b), sugerindo que a IL-21 eventualmente tinha de ser substituída por IL-2 e IL-4. Para estudar isso em maiores detalhes, experimentos em série de tempo foram realizados com células B de memória CD19+CD27+, nas quais IL-21 foi substituída por IL-2 e IL-4 após 36 horas ou 5, 10, 15 e 20 dias. Conforme mostrado na Figura 7, a maioria das culturas pôde ser mantida após retirada de IL-21, mesmo culturas que receberam IL-21 durante 20 dias.

Produção de anticorpo através de culturas de célula B de memória humana total reforçada com IL-21

De modo interessante, em contraste às culturas com IL-2 e IL- 4, as culturas reforçadas com IL-21 foram capazes de produzir anticorpos durante um período relativamente longo (IgG e IgM, conforme medido através de ELISA, Dako, Glostrup, Dinamarca) (Figuras 8a e 8b, respectivamente). De modo importante, das culturas de células B de memória policlonais de doadores B18 e B19, clones de uma única célula foram obtidos através de cultura LD (Tabela 3).

Tabela 3. Freqüência de clones que foram isolados de células B selecionadas com CD19+CD27+NGFR+. As células foram selecionadas em 96 cavidades a 1000, 100, 10 ou 1 célula por cavidade. As cavidades continham 5000 células L expressando CD40L-5, IL-2 e IL-4. 1A a '/2 do meio foi substituído duas vezes por semana por citocinas frescas e 2500 células L.

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A maioria das culturas clonais produziram IgM5 enquanto que apenas algumas produziram IgG (Figura 9). Além disso, duas culturas clonais produziram IgM e IgG5 clone 7 e clone 8). Se esses clones são na verdade clonais ou se troca de classe ocorreu ainda precisa ser determinado. No último caso, uma região VDJ de BCR pôde ser encontrada nos fragmentos genéticos de IgM e IgG nessa cultura.

Produção de anticorpo de culturas de célula B específicas ao Toxóide do Tétano reforçadas com IL-21

Em seguida, nós testamos se poderíamos isolar células B que produzem anticorpos específicos ao Toxóide do Tétano (TT). Em resumo, o seguinte protocolo foi realizado: PARTE 1

(1) Células B CD27+TT+ foram selecionadas (recuperação foi doador- dependente e oscilava de 10000-1000 células), (2) cultivadas com IL-21 durante 36 h, (3) transduzidas com caSTA5b-ER-IRES-NGFR,

(4) e cultivadas durante tempos variáveis com IL-21 (36 h a 3 semanas), após o que IL-21 foi substituída por IL-2, IL-4 e 4HT.

PARTE 2

(5) quando as culturas eram 100% NGFR+, elas foram clonadas através de diluição limitativa (LD).

Após 2 a 3 meses de cultura, culturas de células B policlonais 100% NGFR+, α-ΤΤ-específicas foram obtidas a partir de pelo menos 7 doadores diferentes (PARTE 1). Todos os doadores foram testados positivos em um ELISA de anticorpo α-ΤΤ-IgG específico (r-biopharm, Darmstadt, Alemanha). Conforme mostrado na Figura 10a, os níveis de IgG α-TT eram relativamente baixo. Uma vez que imortalização de células B de memória resultou em altos números de culturas que produzem IgM (Figura 9), isso indica que a maioria das culturas de TT são IgM-positivas. Conforme mostrado na Figura 10b, cinco de sete doadores estavam produzindo IgM, sugerindo que os anticorpos anti-TT são originários de IgM e, assim, não detectados por nosso ELISA de IgG α-TT. Isso nos levou a desenvolver um ELISA de IgG α-TT baseado no ELISA de IgG de TT r-biopharm. A única diferença está na etapa final, agora um anticorpo IgM-HRP α-humano, ao invés de um IgG-HRP anti-humano, é adicionado.

Em seguida, das culturas de TT policlonais, clones de célula B α-TT específicos foram derivados através de culturas LD (PARTE 2). Essas culturas LD foram iniciadas com células B α-ΤΤ-específicas policlonais 100% NGFR+ de quatro doadores (Tabela 4). Clones do doador B16 produziram principalmente IgG5 enquanto que B18 e B19 produziram IgM e B15 produziu IgG e IgM (não mostrado). Subseqüentemente, os sobrenadantes desses clones foram testados no ELISA de IgG TT e IgM TT (figura 11). Além do doador 15, todos os doadores mostraram ligação ao TT, embora apenas 5 clones tenham produzido titulações relativamente altas de anticorpo anti-TT.

Tabela 4. Cultura em diluição limitativa de células B TT-específicas 100% NGFR+. É indicado o número total de clones isolados e sob quais condições eles foram isolados, 1, 5 ou 10 célula/cavidade. Uma lâmina com 96 cavidades foi usada para cada condição (1, 5 ou 10 células/cavidade). Cavidades continham 2500 células L expressando CD40L, IL-2 e IL-4. 1A a Vi do meio foi substituído duas vezes por semana por citocinas frescas e 2500 células L.

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Re-estimulação de produção de anticorpo de culturas de célula B específicas ao Toxóide do Tétano reforçadas com IL-21

Nós fomos capazes de gerar culturas de célula B poli- e monoclonais que produzem IgM e IgG usando IL-21 como um estímulo. Todavia, a produção de anticorpo não era estável. Para nossa surpresa, contudo, essas culturas tratadas com IL-21 puderam ser re-estimuladas para produzir anticorpos de IgG e IgM (Figuras 12a e 12b, respectivamente). Isso foi obtido através de retirada de 4HT e, simultaneamente, estimulação com IL-21. Usando esse protocolo, a produção total de anticorpo aumentou 2 a 1000 vezes para IgM e 2 a 25 vezes para IgG. Vários dos sobrenadantes de culturas monoclonais re-estimulados não foram testados positivos no ELISA de IgG e IgM de tétano (Figura 13).

Importante é notar que culturas de célula B caSTAT5b ou caSTAT5b que não tinham sido tratadas com IL-21 antes de transdução com caSTAT5b e subseqüente expansão não puderam ser re-estimuladas para produzir anticorpos sob quaisquer condições (veja pedido de patente WO 03/052083; não mostrado aqui). Exemplo 4 Materiais e Métodos

Os métodos detalhados com relação a:

• manutenção e isolamento de células B humanas;

• transdução e regulação de STAT5 ativo constitutivo de camundongo em células B;

• desenvolvimento de linhagens de células B 100% caSTATSb positivas que secretam anticorpos;

• desenvolvimento de culturas de células B clonais derivadas de uma única célula; e

• re-estimulação da produção de anticorpo de culturas de células B caSTA5b-ER positivas

são descritos no Exemplo 3.

Produção de anticorpo em culturas de célula B contendo IL-21 que são infectadas com EBV e expressam BCL6-IRES-NGFR ou caSTAT5-ER-IRES- NGFR

Células B CD19+CD27+ primárias purificadas (células B) foram estimuladas durante 36 h com IL-21 e células L expressando CD40L irradiadas (células L) antes de serem transduzidas com BCL6-IRES-NGFR ou caSTAT5b-ER-IRES-NGFR. Após transdução, células transduzidas com BCL6 foram cultivadas com IL-21 e células transduzidas com caSTAT5b-ER foram cultivadas com IL-2 e IL-4. Células transduzidas se tornaram NGFR positivas dentro de 2 a 3 dias e foram subseqüentemente selecionadas sobre um FACSAria. Células selecionadas com NGFR foram, então, cultivadas em densidades celulares de 100 a 5000 células/96 cavidades (culturas mini densas, MBC). As MBC de BCL6/IL-21 proliferaram fortemente comparado com culturas de caSTAT5b-ER. Essas culturas foram testadas com relação à produção de anticorpo, expandidas para 24 cavidades e congeladas (células viáveis, pelota de célula e sobrenadante). As culturas de caSTAT5b-ER foram expandidas e divididas em duas cavidades paralelas. Uma cavidade foi cultivada com IL-2, IL-4 e 4HT e a outra cavidade foi cultivada com IL-21 e sem 4HT. RT-PCR

Para testar se a forte resposta proliferativa estava relacionada à presença de EBV, uma RT-PCR de EBV foi realizada. RNA total foi isolado de pelotas congeladas usando o mini kit RNeasy (Qiagen). RNA foi transcrito inversamente em um volume de 20 ul contendo tampão de primeira fita, dNTPs a 500 μΜ, 25 μg/l de oligo(dT) e 200 U de Superscript II RT (Life Technologies). Uma porção da solução de cDNA (1 ul) foi amplificada através de PCR em uma solução de 50 μΐ contendo Tris-HCl a 20 mM, KCl a 50 mM, MgCl2 a 1,5 mM, dNTPs a 5 mM, 2,5 U de Taq DNA polimerase (Life Technologies) e 30 pmoles de cada iniciador. As condições de PCR foram como segue: uma etapa de desnaturação de 7 minutos a 94°C, seguido por 30 ciclos de 30 s a 94°C, 30 s a 62°C (HPRT1), 52°C (LMP-I) e 58°C (EBNA1/2) e 30 s a 72°C e uma extensão final de 7 minutos a 72°C. Os oligonucleotídeos usados para RT-PCR foram como segue: HPRTl dianteiro (5 '-TATGGACAGGACTGAACGTCTTGC-3') e HPRTl reverso (5'- GAC AC AAAC ATG ATTC AAATCCCTG A-3'); LMP-I dianteiro: (5'- GCGACTCTGCTGGAAATGAT-3') e LMP-I reverso (5'- GAC ATGGT AATGCCTAGAAG-3'; EBNA1/2 dianteiro (5'- AGC AAGAAGAGG AGGTGGT AAG-3') e EBNA1/2 reverso (5'- GGCTCAAAGTGGTCTCTAATGC-3').

Além da RT-PCR, nós realizamos uma PCR diretamente sobre a pelota de célula e o DNA do sobrenadante que foi isolado usando o kit de isolamento QIAmp (Qiagen). Culturas de EBV

Para estudar o papel do EBV em nosso sistema em maiores detalhes, nós ajustamos experimentos para determinar a proliferação e produção de anticorpo em células não transduzidas, transduzidas com BCL6- IRES-NGFR e caSTAT5b-ER-IRES-NGFR que foram obtidas de culturas com ou sem EBV que ocorre naturalmente.

Primeiro ajuste experimental

Tabela 5: Ajuste experimental

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Tabela 5 em resumo:

MBC de BCL6 com IL-21 e células L (culturas Ce2-B9 e Ce2-G9) MBC de BCL6 com IL-21, células L e EBV(culturas Be3-F3 e Be2-G9) MBC de EBV com IL-21 e células L (culturas B28 e B29) Culturas com IL-2 e IL-4 também foram incluídas. Em intervalos semanais, os níveis de anticorpo e números de células foram determinados (Tabela 7). O estado de EBV das culturas é mostrado na Figura 14. Segundo ajuste experimental

Tabela 6: Ajuste experimental caSTAT5b-ER

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Tabela 6. MBC de caSTAT5b-ER foram cultivadas sobre 4HT, células L, IL- 2 e IL-4 em 96 cavidades a 1000 células/cavidade. Quando a densidade celular estava alta o bastante, culturas paralelas foram criadas. Uma parte foi mantida sobre 4HT, células L, IL-2 e IL-4, enquanto que a outra parte foi troca para IL-21, células L, mas não 4HT. A produção de anticorpo foi determinada através de ELISA (DAKO). Infecção com EBV foi determinada através de PCR de LMP1 (figura 16).

Resultados

Infecção por EBV de culturas de BCL6, determinada através de PCR

Descobriu-se IL-21 induziu a uma forte proliferação e diferenciação de células B, a qual nós testamos em dois doadores em combinação com a transdução de BCL6 (Tabela 5). Na verdade, nós encontramos forte crescimento de células B em condições de cultura nas quais nós cultivamos células B em densidades de 1000 e 100 células/cavidade (Tabela 7). Contudo, em um doador, quase todas as culturas foram suspeitas de estarem infectadas com EBV baseado no fenotipo através de microscopia luminosa, cor do sobrenadante de cultura e expansão enorme de célula. Na verdade, esse doador (B29) voltou a ser infectado com EBV (Figura 14). O crescimento maciço de células infectadas com EBV demonstra que a combinação de BCL6 e IL-21 proporciona uma vantagem de crescimento para células infectadas com EBV, especialmente uma vez que se acredita que a freqüência de células B infectadas com EBV in vivo é relativamente baixa. Em contraste ao doador B29, o doador B30 era EBV negativo, exceto quando a uma banda de LMPl fraca e relativamente pequena na amostra Ce2-F2 (Figura 14).

Proliferação de culturas de BCL6 na presença ou ausência de EBV, IL-2IL-4 eIL-21

Para estudar o papel de EBV, BCL6, IL-2, IL-4 e IL-21 sobre o crescimento celular, a cinética de proliferação foi comparada (veja Tabela 5, ajuste experimental). Amostras foram selecionadas baseado em reações de PCR de EBV de LMP-I (Figura 14). O estado do EBV foi confirmado pela capacidade de células infectadas de EBV de crescer na ausência de células L. As amostras de BCL6 cultivadas com IL-2 e IL-4 mostraram uma baixa capacidade proliferativa e não puderam ser mantidas (Tabela 7). Todas as amostras cultivadas em meio contendo IL-21 mostraram forte proliferação. IL-2 e IL-4 puderam induzir a uma forte proliferação apenas quando as células foram infectadas com EBV apenas, não em combinação com BCL6. Tabela 7: Proliferação de células B BCL6

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Tabela 7. Proliferação de células B transduzidas com BCL6 e não transduzidas com e sem EBV ou com e sem IL-2, IL-4 ou IL-21; todas as amostras continham células L

Determinação da produção de anticorpo por culturas de BCL6 na ausência ou presença de EBV, IL-2, IL-4 e IL-21

A produção de anticorpo IgG foi determinada de culturas a longo prazo, conforme descrito na Tabela 5. Os níveis de produção indicados são a produção média de anticorpo de seis a dez diferentes medições no tempo de dois doadores (Figura 15). E claramente mostrado que as culturas de BCL6/EBV/IL-21 produzem significativamente mais IgG do que as culturas de BCL6/IL-21. Conseqüentemente, EBV intensifica significativamente a produção de anticorpo de células B transduzidas com BCL6. Assim, a combinação de IL-21 e EBV resulta em altos níveis de produção de anticorpo, na ausência, bem como na presença de BCL6.

Determinação se a expressão de receptor de célula B (BCR) altera a cultura a longo prazo de células transduzidas com BCL6 e infectadas com EBV

Foi descrito que células infectadas com EBV perdem sua expressão de BCR. Portanto, células B em culturas contendo IL-21 (descritas na Tabela 5) foram coradas para NGFR, CD 19, Capa e Lambda. As células EBV negativas, transduzidas com BCL6 permaneceram com expressão de BCR positiva conforme determinado através de coloração com Capa e Lambda. Conseqüentemente, tais células são particularmente adequadas para isolamento e/ou seleção após um longo período de cultura para uma especificidade desejada, por exemplo, usando antígeno rotulado, porque tais células se ligarão ao referido antígeno rotulado com seu BCR. Contudo, quando EBV estava presente, expressão de BCR foi perdida ou diminuída. Uma vez que as culturas de BCL6/IL-21 produziram quantidades relativamente menores de anticorpo, quando comparado com as células infectadas com EBV, mas mantiveram a expressão de BCR na superfície, isso demonstra que essas células permanecem em um fenotipo de pré- plasmablasto, enquanto que as células infectadas com EBV, as quais produzem altas quantidades de anticorpo, diferenciam ou se diferenciaram com relação a um fenotipo melhor, descrito como plasmablasto. Em conclusão, em casos onde a presença de um receptor de célula B sobre células B é desejado tal como, por exemplo, em ensaios de seleção, as células B não são, de preferência, infectadas com EBV ou infectadas em um estágio posterior.

Infecção com EBVde culturas caSTAT5b-ER, determinada através de PCR

Paralelo às transduções com BCL6, transduções usando caSTAT5b-ER foram realizadas. Visivelmente, em contraste às culturas de BCL6, as quais se tornaram todas infectadas com EBV, as culturas caSTAT5b-ER do mesmo doador (B29) parecem manter a distribuição natural (percentual) de células infectadas com EBV. Várias culturas tinham sinais claros de infecção por EBV e foram verificadas através de PCR de LMPl e, na verdade, descobriu-se que eram positivas. Um dos sinais de que as culturas caSTAT5b-ER eram positivas foi a capacidade da MBC de sobreviver quando tratada com IL-21 na ausência de 4HT. Essas células B privadas de 4HT carecem da forma ativa de caSTAT5b e normalmente morrem dentro de 2 a 3 semanas.

Proliferação e produção de anticorpo por células B transduzidas com caSTAT5b-ER sob diferentes condições

Para estudar o papel do EBV no sistema caSTAT5b-ER, experimentos foram realizados conforme descrito na Tabela 6. Na tabela 8, uma visão geral esquemática é apresentada da resposta de células B transduzidas com caSTAT5b-ER. caSTAT5b-ER ativo pela presença de 4HT bloqueia a diferenciação de célula B, a despeito de quais citocinas estão presentes ou mesmo se células B foram infectadas com EBV. Portanto, culturas caSTAT5b-ER que são infectadas com EBV e mantidas em IL-2, IL- 4 ou IL-21, mas com 4HT, não produzem anticorpo. Retirada de 4HT resulta em diferenciação e subseqüente produção de anticorpo. De preferência, IL-21 é adicionada durante e/ou após retirada de 4HT. Contudo, essas células, por fim, morrem, uma vez que caSTAT5b é inativo e, assim, anticorpos serão produzidos apenas durante um período restrito. Conseqüentemente, se nenhum EBV está presente, IL-21 é eventualmente substituída por pelo menos um outro agente de estimulação de crescimento tal como, por exemplo, IL-2 e IL-4, conforme já descrito no Exemplo 3.

EBV e IL-21 juntos na ausência de 4HT são dois fortes estímulos os quais induzem à proliferação a longo prazo e altos níveis de produção de anticorpo (Figura 18). Essa combinação, portanto, é preferida.

Tabela 8: Proliferação, sobrevivência e produção de anticorpo de células B caSTAT5b-ER

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Exemplo 5

Métodos

Células BCL6-IRES-YFP positivas foram transduzidas com STAT3/ER-IRES-GFP usando procedimentos padrões e expandidas sobre células L com IL-2 e IL-4, conforme descrito na seção Métodos do Exemplo 1. A expressão de STAT3 foi regulada através da presença ou ausência de tamoxifeno (4HT). Células YFP e GFP positivas foram selecionadas e números iguais foram cultivados. Expressão do gene BLIMPl foi monitorada através de RT-PCR e a produção de anticorpo foi determinada em culturas com e sem 4HT. Resultados

A adição de 4HT às células resultou em números aumentados de célula, expressão aumentada de Blimp-1. Além disso, produção intensificada de IgG foi medida, conforme é mostrado nas Figuras 19a-c. Exemplo 6

Células B CD 19 positivas foram transduzidas com YFP- IRES-YFP (cYFP) de controle; BCL6-IRES-YFP (BCL6-YFP) ou Bcl-xL- GFP (Bcl-xL-GFP). As células foram, então, mantidas sobre CD40L e IL-4 e o percentual de células YFP e GFP única e duplamente positivas foi determinado com o tempo através de FACS em culturas densas não selecionadas. A divisão celular e expansão cumulativa foram determinadas em células única e duplamente positivas na presença de IL-4 ou IL-21.

Para verificar a expressão de gene e co-infecção com EBV, análise por RT-PCR de expressão de mRNA de Bcl-xL, BCL6, LMPl e EBNAl foi realizada em culturas de culturas densas unicamente transduzidas com BCL6 e duplamente transduzidas com BCL6/Bcl-xL. Resultados

As Figuras 20-23 mostram que as células B duplamente transduzidas contendo BCL6 e Bcl-xL tinham uma maior taxa de expansão cumulativa e, na verdade, também eram as células dominantes que cresceram em culturas densas de células B de memória. Nós também mostramos que essas células duplamente transduzidas se dividiram duas vezes mais rápido comparado com as células unicamente transduzidas. Não são mostrados aqui os níveis de produção de anticorpo (IgG e IgM), os quais eram iguais entre as culturas de BCL6 e BCL6/Bcl-xL quando cultivadas com IL-4 ou IL-21. Exemplo 7

A linhagem de célula de Hodgkin L591, a qual é positiva para STAT5 fosforilada por tirosina, foi cultivada independente de células L (estimulação com CD40) e citocinas. As células L591 foram transduzidas através de lentivírus contendo E47-IRES-GFP ou vírus de controle com GFP apenas (os métodos são descritos em maiores detalhes no Exemplo 1). As células transduzidas foram selecionadas e o crescimento celular foi acompanhado com o tempo. Resultados

A Figura 24 mostra que células L591 param rapidamente a divisão quando E47 é expressa. Isso é sugestivo do efeito de E47 a qual, via seus alvos a jusante (além de outros, Socs 1, Socs3, Id2, Eto2 e Xbp 1), induz à diferenciação de células B com relação a um fenotipo de célula que produz anticorpo. A diferenciação induzida por E47 também poderia indicar que os efeitos de STAT5 são eliminados ou que E47 afeta, direta ou indiretamente, a quantidade e ação de STAT5 funcional. Assim, baseado nos dados com a linhagem de célula de Hodgkin L591, nós afirmamos que culturas de células B STAT5b/ER positivas que são mantidas sobre células L com 4HT e IL-2 e IL-4 ou IL-21, podem ser induzidas a diferenciar em células que produzem anticorpo quando a E47 está ativa. Breve descrição dos desenhos

Figura 1. Crescimento intensificado de células BCL6+ cultivadas com IL-21. Células B de memória 100% BCL6+ puras foram cultivadas na presença de IL-2 e IL-4 (condições de cultura convencionais) ou com IL-21 apenas. A expansão total de células vivas durante 17 dias de cultura com IL-21 é mostrada.

Figura 2. Imortalização de plasmablasto de células BCL6- positivas com IL-21. Células B de memória foram transduzidas com um retrovírus expressando BCL6-GFP e cultivadas com IL-2 e IL-4 (para impedir a diferenciação) ou com IL-21 durante 14 dias. A coloração da superfície para CD38 e CD20 de células GFP+ (isto é, BCL6+) é mostrada. IL-21 induz a um aumento de 8 vezes na quantidade de células B com um fenótipo de plasmablasto.

Figura 3. IL-21 super-regula a Blimp-I em células B.

Células B 100% BCL6-ANGFR+ puras foram cultivadas com IL-2 e IL-4 ou com IL-21 durante 24 dias. cDNA foi gerado a partir de RNA total e os níveis de mRNA de BLIMPl e HPRT (controle de carga) foram determinados através de reação em cadeia de polimerase com transcriptase reversa.

Figura 4. Modelo não limitativo de uma modalidade de acordo com a presente invenção.

Figura 5. Visão geral de um esquema de cultura ideal; veja, para maiores detalhes, a seção material e métodos do Exemplo 3.

Figura 6. Dinâmica de crescimento de células B estimuladas com IL-2 e IL-4 vs. IL-21, (a) células B de memória de sangue periférico (PB) derivadas de dois doadores (BI8 e B19) foram estimuladas com IL-21 ou IL-2 e IL-4. As células foram transduzidas com caSTAT5b-ER-IRES- NGFR no dia 2 para culturas tratadas com a IL-21 e no dia 5 para culturas tratadas com IL-2 e IL-4; 4HT foi adicionado no dia 13. (b) De 4 doadores, células B específicas ao Toxóide do Tétano foram escolhidas de PB (os números de células oscilavam de 1000-10.000). As células foram cultivadas em 96 cavidades com IL-21 e transduzidas com caSTAT5b-ER-IRES-NGFR no dia 2. 4HT foi adicionado no dia 4 e IL-21 foi substituída por IL-2, IL-4 e 4HT após 7 dias (BI4 e B15) ou foi substituída após 20 dias (BI6 e B17). As células foram contadas manualmente e as células mortas foram excluídas.

Figura 7. O percentual de células transduzidas com caSTAT5b-ER-IRES-NGFR foi determinado usando o LSR II (BD). De dois doadores (BI8 e B19), experimentos em uma série de tempos com IL-2 e IL-4 vs. IL-21 foram realizados. De cada doador, 1A das células foram transduzidas usando o protocolo com IL-2 e IL-4, o% restante foi transduzido usando IL- 21. Diretamente após a transdução de IL-21 (36 h), um terço da cultura de IL- 21 foi trocado para IL-2 e IL-4. Isso foi repetido nos dias 5, 10 e 20 da cultura deIL-21.

Figura 8. A produção total de anticorpo IgG e IgM humano por PB transduzida com caSTAT5b-ER-IRES-NGFR derivado de células B de memória, conforme descrito nas Figuras 6 e 7. (a) Produção média de IgG dos doadores B18eB19é mostrada. Células B foram transduzidas usando o protocolo com IL-2 e IL-4 vs. IL-21. A produção de IgG indicada com os símbolos abertos representa todas as culturas que tinham sido tratadas com IL-21, a despeito de quando elas foram trocadas para EL-2 e IL-4. (b) Produção de IgM em amostras conforme descrito acima; note que a escala de tempo é diferente.

Figura 9. Produção de anticorpo de clones de célula B derivadas de células B de memória de doadores B18 e B19 transduzidas com caSTAT5b-ER-IRES-NGFR. Culturas de dez dias de idade que foram derivadas de células B estimuladas com IL-21 (estimuladas durante 36 h) foram usadas para cultura LD. Doze clones foram obtidos; 5 de B18 e 7 de B19. A produção de IgG é a média de três pontos de tempo; a produção de IgM é a média de dois pontos de tempo.

Figura 10. ELISA de IgG ao Toxóide do Tétano sobre o sobrenadante de células B humanas selecionadas com Toxóide do Tétano, 100% caSTA5b-ER-IRES-NGFR-positivas, (a) de 7 doadores, culturas clonais de proliferação rápida foram derivadas. E mostrada a produção média de anticorpo ao TT de pelo menos 3 medições diferentes por doador. A cada momento, a OD relativa foi determinada (geralmente um aumento relativo de > 2 a 3 vezes na base é aceito como positivo), (b) para determinar se culturas negativas para o ELISA de IgG TT poderiam estar produzindo IgM, amostras dos mesmos 7 doadores foram testadas em um ELISA total de IgM.

Figura 11. ELISA anti-Toxóide do Tétano. A ligação de anticorpos α-TT específicos para IgG e IgM foi determinada. Sobrenadantes de culturas de células B clonais 100% NGFR-positivas derivadas dos doadores B15,B16, B18eB19 foram testadas. Duas vezes a base foi ajustado como positivo.

Figura 12. Produção total de IgG e IgM após re-estimulação de culturas de células B clonais (a) doador B16, o qual produz IgG e (b) doador B19, o qual produz IgM. A produção foi medida no sobrenadante de culturas que foram cultivadas com IL-2, IL-4 e na presença ou ausência de 4HT ou com IL-21 e na presença ou ausência de 4HT. Culturas contendo IL-2 e IL-4 não mostram um aumento na secreção de anticorpo (não mostrado). Apenas culturas que respondem à re-estimulação são mostradas (10 de 15 clones de IgG e 8 e 9 clones de IgM responderam).

Figura 13. Anticorpos secretados por culturas re-estimuladas com IL-21 e privadas de 4HT, conforme descrito na legenda da Figura 8, foram testadas com relação à sua especificidade por antígeno. Os sobrenadantes derivados das culturas clonais de TT do doador B16 re- estimuladas foram testadas em um ELISA de IgG α-TT, (a) os sobrenadantes derivados de culturas do doador B19 foram testados no ELISA de IgM (b). E mostrado o aumento relativo na ligação a anticorpo comparado com o controle negativo, amostras B19-10B7 e IOEl foram cortadas em 30 para visibilidade; os valores foram de 96 e 121, respectivamente.

Figura 14. RT-PCR de LMPl foi realizada sobre RNA isolado de pelotas de célula congeladas de culturas indicadas. São mostradas culturas as quais foram aleatoriamente selecionadas e testadas com relação à infecção por EBV. Código de amostra: B indica o doador B29, C indica o doador B30 e ambos foram cultivados a 1000 célula/cavidade (e3) ou 100 célula/cavidade (e2). Todas as culturas foram transduzidas com BCL6, exceto quanto a B28 UTD (não transduzida) e B29 UTD; células JY foram usadas como controles positivos.

Figura 15. Produção de anticorpo IgG (ng/ml) por culturas de BCL6 e EBV conforme descrito na tabela 5. Para cada condição, a média de duas amostras é mostrada, cada uma das quais consiste de um acompanhamento longitudinal de 6 a 10 pontos de tempo. Um asterisco indica que as amostras são significativamente diferentes (p < 0,05, teste t de Student não emparelhado). As amostras cultivadas com IL-2 e IL-4 são uma combinação de culturas EBV- e BCL6-positivas e negativas de acompanhamento longitudinal.

Figura 16. Coloração com Capa-FITC e Lambda-PE sobre células CD 19- e NGFR-positivas. Uma célula B é positiva para Capa ou Lambda. Amostras foram medidas usando um LSRII (BD) e analisadas usando o software FlowJo.

Figura 17. É mostrada uma PCR de LMPl representativa realizada sobre DNA isolado de pelotas de células congeladas do doador B25 a 1000 célula/cavidade MBC transduzidas com caSTAT5b e suspeitas de serem EBV-positivas baseado na cor do meio de cultura, cinética de crescimento e fenótipo, conforme observado através de microscopia luminosa. Todas as outras culturas eram EBV-negativas.

Figura 18. Produção média de IgG (ng/ml) em células B caSTAT5b-ER cultivadas sem 4HT, com IL-2, IL-4 ou IL-21 e com ou sem EBV. O aumento na produção de anticorpo na presença de IL-21 foi significativo comparado com culturas com IL-2 e IL-4 (p < 0,05). O aumento na produção de anticorpo em culturas contendo IL-21 infectadas com EBV foi significativo comparado com culturas sem EBV (p < 0,05), Mann-Whitney não paramétrico.

Figura 19. (A-C) Células BCL6-IRES-YFP+ foram transduzidas com STAT3ER-IRES-GFP e expandidas sobre células L CD40L com IL-2 e IL-4. Células BCL6 / STAT3ER-positivas foram selecionadas através de FACS e números iguais foram cultivados na ausência de citocinas, mas na presença ou ausência de 4HT (1 μΜ) durante 4 dias. (A) Números de células vivas após 4 dias. (B) RT-PCR semi-quantitativa para expressão de BLIMP1 e HPRTl em células BCL6-YFP+ / STAT3ER-GFP+. (C) Produção de IgG em células BCL6-YFP+ STAT3ER-GFP+ tratadas durante 4 dias ± 4HT.

Figura 20. A. Células B CD 19+ foram transduzidas com controle YFP-IRES-YFP (cYFP); BCL6-IRES-YFP (BCL6-YFP) ou BclXL- GFP (Bcl-xL-GFP). As células foram mantidas sobre CD40L e IL-4 e o percentual de YFP- ou GFP-positivas foi determinado com o tempo através de FACS. Todos os dados representados em AeB são derivados de ativação com CD19+CD3\ B. Culturas densas não selecionadas de células B duplamente transduzidas com Bcl-xL-IRES-GFP e BCL6-IRES-YFP sobre CD40L e IL-4. Células GFP+, YFP+ e duplamente positivas GFPArFP foram determinadas através de FACS.

Figura 21. Proliferação aumentada de IL-21 de células B transduzidas com Bcl-xL, BCL6 ou células duplamente transduzidas Bcl- xL+BCL6. No dia 17, após transdução e manutenção sobre CD40L e IL-4, as culturas foram divididas e cultivadas sobre CD40L na presença de IL-4 ou IL- 21. O número absoluto de células transduzidas foi determinado e a expansão cumulativa foi calculada em células unicamente transduzidas (A) ou em células duplamente transduzidas (B).

Figura 22. Culturas a longo prazo são EBV- através de análise por RT-PCR de expressão de mRNA de Bcl-xL, BCL6, LMPl e EBNAl em culturas de 66 dias de células transduzidas com BCL6 (Fileira 1) e culturas densas duplamente transduzidas com BCL6/Bcl-xL (Fileira 2). 1 μl de uma reação de cDNA realizada na ausência de reação com transcriptase reversa (- RT) foi usado como um controle negativo para contaminação por DNA genômico. Controles positivos: células B transduzidas com Bcl-xL, STAT5- ER cultivadas com 4HT; BCL6, LMPl e EBNAl, células B de Raji humanas.

Figura 23. Tempo de duplicação de células transduzidas com Bcl-xL, BCL6 e duplamente transduzidas com Bcl-xL-BCL6. Baseado no número de células B transduzidas (GFP+,YFP+), o tempo de duplicação entre os dias 51-59 de cultura foi calculado em células Bcl-xL- e BCL6- transduzidas em transduções simples, bem como em culturas densas duplamente transduzidas com Bcl-xL+BCL6.

Figura 24. L591, uma linhagem de célula de Hodgkin, foi transduzida através de lentivírus contendo E47-IRES-GFP. Células GFP- positivas foram selecionadas e cultivadas independente de células L (estimulação com CD40) e citocinas. Os números de célula foram determinados com o tempo.

Referências

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Claims

1. Método para influenciar a estabilidade de uma célula produtora de anticorpo, caracterizado pelo fato de compreender influenciar direta ou indiretamente a quantidade de produto de expressão de BCL6 e/ou Blimp-I dentro da referida célula produtora de anticorpo.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ciclo de vida replicativo de referida célula produtora de anticorpo é aumentado.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que BCL6 e Blimp-I são co-expressados em uma célula produtora de anticorpo.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1- -3, caracterizado pelo fato de compreender: - prover referida célula produtora de anticorpo com um composto capaz de melhorar direta ou indiretamente a expressão de BCL6; e/ou - cultivar referida célula produtora de anticorpo na presença de um composto capaz de melhorar direta ou indiretamente a expressão de BCL6.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -4, caracterizado pelo fato de compreender prover referida célula produtora de anticorpo com uma seqüência de ácido nucleico codificando BCL6 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -5, caracterizado pelo fato de que referido composto capaz de melhorar direta ou indiretamente a expressão de BCL6 compreende STAT5 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -6, caracterizado pelo fato de compreender prover referida célula produtora de anticorpo com uma seqüência de ácido nucleico codificando STAT5 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo, e/ou em que referida célula produtora de anticorpo é cultivada na presença de STAT5 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -7, caracterizado pelo fato de compreender: - prover referida célula produtora de anticorpo com um composto capaz de influenciar direta ou indiretamente a expressão de Blimp- 1, e/ou - cultivar referida célula produtora de anticorpo na presença de um composto capaz de influenciar direta ou indiretamente a expressão de Blimp-1.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que referido composto capaz de influenciar direta ou indiretamente a expressão de Blimp-1 compreende: - STAT3 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo, e/ou - um composto capaz de ativar direta ou indiretamente STAT3 e/ou - um composto capaz de melhorar direta ou indiretamente a expressão de STAT3.

10. Método de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que referido composto capaz de influenciar direta ou indiretamente a expressão de Blimp-1 compreende IL-21, IL-2, IL-6, IL-7, IL-10, IL-15, IL-27, uma proteína SOCS, uma das proteínas Ε, E47, E12, E2- -2 ou HEB, uma Janus quinase mudada e/ou uma seqüência de ácido nucleico codificando STAT3 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de compreender prover referida célula produtora de anticorpo com um agente imortalizante adicional.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que referido agente imortalizante compreende um agente transformante.

13. Método de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que referido agente imortalizante compreende vírus Epstein-Barr.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações -11 a 13, caracterizado pelo fato de que referida célula produtora de anticorpo é cultivada na presença de IL-21 antes da referida célula produtora de anticorpo ser provida com um composto capaz de melhorar direta ou indiretamente a expressão de BCL6, uma seqüência de ácido nucleico codificando BCL6 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo, e/ou uma seqüência de ácido nucleico codificando STAT5 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que referida célula produtora de anticorpo é cultivada na presença de IL-21 e provida com vírus Epstein-Barr.

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de ainda compreender aumentar direta ou indiretamente a quantidade de produto de expressão de Bcl-xL dentro da referida célula produtora de anticorpo.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de compreender prover referida célula produtora de anticorpo com uma seqüência de ácido nucleico codificando Bcl-xL ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo.

18. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de compreender prover referida célula produtora de anticorpo com um composto capaz de melhorar direta ou indiretamente a expressão de BCl- xL, preferivelmente o referido composto compreende estimulação de APRIL, BAFF, CD40, BCR, citocinas, fatores de crescimento efetuadores a montante como JNK e AKT (PKB).

19. Método para produzir uma célula produtora de anticorpo que é estável durante pelo menos uma semana, preferivelmente durante pelo menos um mês, mais preferivelmente durante pelo menos três meses, mais preferivelmente durante pelo menos seis meses, caracterizado pelo fato de compreender: - prover uma célula B; - aumentar um nível de expressão de Blimp-I na referida célula; e - aumentar e/ou manter um nível de expressão de BCL6 na referida célula.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o nível de expressão de BCL6 na referida célula é levado a, e/ou mantido em, essencialmente o mesmo nível ou em um nível maior como comparado com um plasmablasto.

21. Método de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizado pelo fato de compreender: - prover referida célula B com um composto capaz de melhorar direta ou indiretamente a expressão de Blimp-I e/ou cultivar referida célula B de memória na presença de um composto capaz de melhorar direta ou indiretamente a expressão de Blimp-1, e - prover referida célula B com um composto capaz de melhorar direta ou indiretamente a expressão de BCL6 e/ou - cultivar referida célula B na presença de um composto capaz de melhorar direta ou indiretamente a expressão de BCL6.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que referido composto capaz de melhorar direta ou indiretamente a expressão de Blimp-I compreende IL-21, IL-2, IL-6, IL-7, IL-10, IL-15, IL- -27, uma proteína SOCS, uma das proteínas Ε, E47, E12, E2-2 ou HEB, uma Janus quinase mudada e/ou uma seqüência de ácido nucleico codificando STAT3 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo.

23. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que referido composto capaz de melhorar direta ou indiretamente a expressão de BCL6 compreende: - uma seqüência de ácido nucleico codificando BCL6 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo, e/ou - uma seqüência de ácido nucleico codificando STAT5 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo, e/ou - um composto capaz de ativar direta ou indiretamente STAT5, e/ou - um composto capaz de melhorar direta ou indiretamente a expressão de STAT5.

24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 23, caracterizado pelo fato de ainda compreender aumentar um nível de expressão de Bcl-xL na referida célula.

25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de compreender prover referida célula B com um composto capaz de melhorar direta ou indiretamente a expressão de Bcl-xL.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que referido composto capaz de melhorar direta ou indiretamente a expressão de Bcl-xL compreende um ácido nucleico codificando Bcl-xL ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo.

27. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que referido composto capaz de melhorar direta ou indiretamente a expressão de Bcl-xL compreende estimulação de APRIL, BAFF, CD40, BCR5 citocinas, fatores de crescimento efetuadores a montante como JNK e AKT (PKB).

28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 27, caracterizado pelo fato de que a expressão de referida seqüência de ácido nucleico codificando BCL6, STAT5, STAT3, Bcl-xL ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo de BACL6, STAT5 e/ou STAT3 e/ou Bcl-xL é regulada por um ativador e/ou repressor que é indutível por um composto exógeno.

29. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 28, caracterizado pelo fato de compreender: - prover uma célula B; - prover referida célula B com BCL6 e/ou STAT5, ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo; - prover referida célula B com vírus Epstein Barr, e - cultivar referida célula B.

30. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de compreender: - testar uma pluralidade de células B para uma especificidade para um dado antígeno; - selecionar pelo menos uma célula B com uma especificidade para referido dado antígeno; - prover referida célula B selecionada com BCL6 e/ou STAT5 exógeno, ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo; - selecionar uma célula B compreendendo BCL6 e/ou STAT5 exógeno, ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo; e - prover referida célula B selecionada com vírus Epstein Barr.

31. Método de acordo com a reivindicação 29 ou 30, caracterizado pelo fato de que referida célula B é cultivada na presença de IL- -21.

32. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações -29 a 31, caracterizado pelo fato de que referida célula B é cultivada na presença de IL-21 antes de BCL6 e/ou STAT5, ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo, ser introduzido na referida célula B.

33. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações -29 a 32, caracterizado pelo fato de ainda compreender referida célula B com Bcl-xL ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo.

34. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1- -33, caracterizado pelo fato de que uma célula produtora de anticorpo é cultivada que é estável durante pelo menos uma semana, preferivelmente pelo menos um mês, mais preferivelmente durante pelo menos três meses, mais preferivelmente pelo menos seis meses.

35. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 34, caracterizado pelo fato de que referida célula produtora de anticorpo é capaz de produzir anticorpos contra um antígeno de interesse.

36. Método de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que referida célula produtora de anticorpo foi obtida a partir de um indivíduo, referido indivíduo tendo sido previamente exposto ao referido antígeno de interesse.

37. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36, caracterizado pelo fato de ainda compreender expressar um gene de referida célula B codificando a cadeia pesada de Ig e/ou a cadeia leve de Ig em uma segunda célula.

38. Célula produtora de anticorpo, caracterizada pelo fato de ser estável durante pelo menos nove semanas, preferivelmente durante pelo menos três meses, mais preferivelmente durante pelo menos seis meses.

39. Célula produtora de anticorpo de acordo com a reivindicação 38, caracterizada pelo fato de compreender um composto que é capaz de influenciar direta ou indiretamente expressão de BCL6.

40. Célula produtora de anticorpo de acordo com a reivindicação 38 ou 39, caracterizada pelo fato de compreender uma seqüência de ácido nucleico exógena codificando BCL6 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo, e/ou uma seqüência de ácido nucleico exógena codificando STAT5 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo, e opcionalmente uma seqüência de ácido nucleico exógena codificando Bcl-xL, ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo.

41. Célula produtora de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 40, caracterizada pelo fato de compreender um composto que é capaz de influenciar direta ou indiretamente a expressão de Blimp-1.

42. Célula produtora de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 41, caracterizada pelo fato de compreender uma seqüência de ácido nucleico exógena codificando STAT3 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo.

43. Célula produtora de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 42, caracterizada pelo fato de que a expressão de referida seqüência de ácido nucleico codificando BCL6, STAT5, STAT3, Bcl-xL ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo de BACL6, STAT5 e/ou STAT3 e/ou Bcl-xL é regulada por um ativador e/ou repressor que é indutível por um composto exógeno.

44. Célula produtora de anticorpo, caracterizada pelo fato de compreender: - um agente imortalizante, preferivelmente um agente transformante, mais preferivelmente vírus Epstein Barr, e - um composto que é capaz de influenciar direta ou indiretamente a quantidade de produto de expressão de BCL6 na referida célula e/ou um composto que é capaz de influenciar direta ou indiretamente a quantidade de produto de expressão de Blimp-I na referida célula e/ou um composto que é capaz de influenciar direta ou indiretamente a quantidade de produto de expressão de Bcl-xL na referida célula.

45. Célula produtora de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 44, caracterizada pelo fato de compreender vírus Epstein Barr e BCL6 exógeno, ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo.

46. Célula produtora de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 45, caracterizada pelo fato de compreender vírus Epstein Barr e STAT5 exógeno, ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do mesmo.

47. Método para produzir linhagem de células B, caracterizado pelo fato de compreender: - obter uma célula produtora de anticorpo estável com um método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 37, e - cultivar referida célula produtora de anticorpo ex vivo.

48. Método de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de compreender: - obter uma célula B de memória e/ou uma célula B nativa de um indivíduo que foi exposto a um antígeno de interesse, - produzir uma célula produtora de anticorpo que é estável durante pelo menos uma semana, preferivelmente pelo menos nove semanas, mais preferivelmente pelo menos três meses, mais preferivelmente pelo menos seis meses, usando referida célula B obtida a partir do referido indivíduo em um método como definido qualquer uma das reivindicações 1 a -29, e - cultivar referida célula produtora de anticorpo ex vivo.

49. Método de acordo com a reivindicação 47 ou 48, caracterizado pelo fato de ainda compreender coletar anticorpos produzidos pela referida célula produtora de anticorpo.

50. Método para produzir anticorpos capazes de especificamente ligar um antígeno de interesse, caracterizado pelo fato de compreender: - obter uma célula B de memória e/ou uma célula B nativa capaz de se diferenciar em uma célula B, cuja célula B produz anticorpos capazes de especificamente ligar referido antígeno de interesse, - produzir uma célula produtora de anticorpo que é estável durante pelo menos uma semana, preferivelmente pelo menos nove semanas, mais preferivelmente pelo menos três meses, mais preferivelmente pelo menos seis meses usando referida célula B em um método como definido em qualquer uma das reivindicação 1 a 37, e - obter anticorpos produzidos pela referida célula produtora de anticorpo.

51. Método de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de ainda compreender cultivar referida célula produtora de anticorpo ex vivo.