KR20080093022A - 테르펜-함유 조성물 및 이들을 제조하고 사용하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 테르펜 및 속이 빈 글루칸 입자 또는 세포벽 입자를 포함하는 조성물, 및 이러한 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 조성물은 테르펜 안정성 및 활성을 증가시키고, 테르펜을 위한 적절한 캐리어를 제공한다. 본 발명은 또한 의학, 수의학 및 농업 분야에서 그러한 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 테르펜 및 속이 빈 글루칸 입자 또는 세포벽 입자를 포함하는 조성물, 및 이러한 조성물의 제조 방법에 관한 것이다. 상기 조성물은 테르펜 안정성 및 활성을 증가시키고, 테르펜을 위한 적당한 캐리어를 제공한다. 또한 본 발명은 의학, 수의학 및 농업 분야에서 그러한 조성물의 사용 방법에 관한 것이다.
테르펜은 정유의 성분으로서, 자연에, 주로 식물에 널리 보급되어 있는 화학 조성물이다. 이들의 빌딩 블록은 하이드로카본 이소프렌{(C5H8)n}이다. 테르펜의 예로는 시트랄, 피넨, 네롤, b-이오논, 게라니올, 카르바크롤, 유게놀, 카르본, 테르페니올(terpeniol), 아네톨, 장뇌(camphor), 멘톨, 리모넨, 네롤리돌(nerolidol), 파네솔, 파이톨, 카로틴(비타민 A1), 스쿠알렌, 티몰, 토코트리에놀, 페릴릴 알코올, 보르네올, 미르센, 시멘(simene), 카렌, 테르페넨(terpenene), 및 리나로올이 있다.
타르펜은 Generally Recognized as Safe(GRAS)로 분류되고, 향신료 및 아로마 산업에서 수 년 동안 사용되어 왔다. 시트랄의 쥐에서의 LD50은 약 5g/㎏이며, 이는 이러한 화합물의 상대적인 안정성의 추가 표시이다. 더군다나, 테르펜은 일단 산소(예를 들어 공기)에 노출되면 약 28일의 비교적 짧은 수명을 갖는다. 테르펜은 CO2와 물로 분해될 것이다. 이러한 테르펜의 분해 또는 파괴는 본 발명의 조성물 및 방법의 안정성 및 친환경성을 증명한다.
테르펜은 암세포의 성장을 억제하고, 종양 크기를 줄이고, 콜레스테롤 레벨을 낮추고, 시험관 내에서(in vitro) 미생물에 대한 살균 효과를 갖는 것으로 알려져 있다. Owawunmi(Letters in Applied Microbiology, 1993, 9(3): 105-108)는 0.01% 초과 시트랄을 갖는 생장 매질(growth media)이 E.coli의 농도를 감소시켰고, 0.08%에서 살균 효과가 있다는 것을 보여주었다. 미국특허출원 제 5,673,468호는 살균 또는 소독 클리너로서 사용되는 송유(pine oil)를 주성분으로 하는 테르펜 제형을 기재하고 있다. 미국특허출원 제 5,849,956호는, 벼에서 발견된 테르펜이 항진균 활성을 갖는다는 것을 가르친다. 미국특허출원 제 5,939,050호는 시너지 효과를 보여준 2개 또는 3개의 테르펜의 조합을 갖는 구강 위생 항균성 제품을 기재하고 있다. 몇 개의 미국특허출원(미국특허출원 제 5,547,677호, 제 5,549,901호, 제 5,618,840호, 제 5,629,021호, 제 5,662,957호, 제 5,700,679호, 제 5,730,989호)은 항균성, 보조제 및 운반 특성을 지닌 특정 유형의 수중유(oil-in-water) 에멀션을 기재하고 있다.
테르펜은 효과적이고 비독성인 먹는 항-종양제로 알려져 있으며, 이는 여러 메커니즘의 작용을 통해 작용한다(Crowell 등의. Crit. Rev. Oncog., 1994, 5(1): 1-22; Crowell 등의. Adv. Exp. Med. Biof., 1996, 401:131-136). 테르펜 게라니올, 토코트리에놀, 페릴릴 알코올, b-이오논, 및 d-리모넨은 간의 HMG-CoA 환원효소 활성, 즉 콜레스테롤 합성의 비율 제한 단계를 억제하고, 동물의 콜레스테롤 레벨을 경감시켜준다(Elson 등의, J.Nutr., 1994, 124:607-614). D-리모넨 및 게라니올은 유방의 종양을 감소시켰고(Elegbede 등의, Carcinogenesis, 1984, 5(5):661-664; Elegbede 등의, J.Natl.Cancer Inst., 1986, 76(2):323-325; Karlson 등의, Anticancer Drugs, 1996, 7(4):422-429), 이식된 종양의 성장을 억제했다(Yu 등의, J.Agri.Food Chem., 1995, 43:2144-2147).
테르펜은 또한 시험관 내에서 박테리아 및 균류(Chaumont 등의, Ann.Pharm.Fr., 1992, 50(3): 156-166; Moleyar 등의, Int.J.Food Microbiol, 1992, 16(4):337-342; 및 Pattnaik 등의, Microbios, 1997, 89(358):39-46), 및 일부 내부 및 외부 기생충(Hooser 등의, J.Am.Vet.Med.Assoc., 1986, 189(8):905-908)의 생장을 억제하는 것으로 알려져 있다. 게라니올은, 칼륨 누출 속도를 향상시키고 막 유동성을 파괴시킴으로서, Candida albicans 및 Saccharomyces cerevisiae 계통의 생장을 억제하는 것으로 알려져 있다(Bard 등의, Lipids, 1998, 23(6):534-538). B-이오논은 포자 발아를 억제함에 의해 결정되는 항진균 활성, 및 한천배지(agar)의 생장 억제를 갖는다(Mikhlin 등의, A.Prikl.Biokhim.Mikrobiol, 1983, 19: 795-803; Salt 등의, Adam.Physiol.Molec.Plant Path, 1986, 28:287-297). 테프레논 게라닐게라닐아세톤은 H.pylori에 대해 항균 효과를 갖는다(Ishii, Int.J.Med.Microbiol.Virol.Parasitol.Infect.Dis., 1993, 280(1-2):239-243). 1% 의 장미 오일을 갖는 상업적인 제품인 로자놀(Rosanol)은 여러 가지의 박테리아(Pseudomonas, Staphylococus, E.coli, 및 H.pylori)의 생장을 억제하는 것으로 알려져 있다. 게라니올은 장미 오일의 활성 성분(75%)이다. 장미 오일 및 2㎎/ℓ 농도의 게라니올은 시험관 내에서 H.pylori의 생장을 억제한다. 약초로 만든 약(herbal medicines)으로부터의 일부 추출물은 H.pylori에 대해 억제 효과를 갖는 것으로 알려져 있으며, 가장 효과적인 것은 데커시놀 안젤레이트, 데커신, 마그놀롤, 베르베린, 신남산, 데커시놀, 및 갈산이다(Bae 등의, Biol.Pharm.Bull., 1998, 21(9)990-992). 캐슈 애플, 아나카딕산(anacardic acid) 및 (E)-2-헥세날(hexenal)의 추출물은 H.pylori에 대해 항균 효과를 나타냈다.
디테르펜, 즉 trichorabdal A(R.Trichocarpa로부터)는 H.pylori에 대해 매우 강한 항균 효과를 보여줬다(Kadota 등의, Zentralbl.Bakteriol, 1997, 287(1):63-67).
11개의 다른 테르펜 용액은 시험관 테스트에서 병원균 박테리아의 생장을 억제하는데 효과적이었다; 100ppm 내지 1000ppm 사이의 레벨이 효과적이었다. 테르펜은 1%의 폴리소르베이트 20을 갖는 물에 희석되었다(Kim 등의, J.Agric.Food Chem., 1995, 43:2839-2845).
미생물에 대한 테르펜의 작용의 다른 모드가 있을 수 있다; 테르펜은 (1) 세포막의 인지질 이중층을 방해할 수 있고 (2) 효소 시스템(HMG-환원효소)의 변종을 손상시키고, (3) 유전 물질을 파괴 또는 비활성화시킨다. 매우 기본적인 테르펜의 작용 모드, 예를 들어 콜레스테롤 차단으로 인해, 감염 병원균은 테르펜에 대해 저 항성을 갖지 않을 것으로 여겨진다.
그러나 테르펜의 사용에 있어서 많은 단점이 있다.
이러한 단점은:
- 테르펜은 액체여서, 다루기 힘들거나 특정 목적에 적합하지 않을 수 있다.
- 테르펜은 물에 그다지 섞이지 않고, 통상적으로, 수성 에멀션을 제조하기 위해, 세제, 계면활성제 또는 다른 유화제의 사용을 필요로 한다. 그러나 안정한 용액은 높은 전단 응력 하에 테르펜을 혼합함으로써 얻어질 수 있다.
- 건조 분말 테르펜 제형은 단지 통상적으로 테르펜의 낮은 백분율(w/w)을 함유한다.
- 테르펜은 수성 에멀션 시스템에서 산화되기 쉬워서, 장기간 저장에는 문제가 생긴다.
성분 운반 시스템을 제공하기 위해, 종래 기술은 분무 코팅, 압출 성형, 코아세르베이션(coacervation), 분자 캡슐화, 및 분무 건조/냉각으로 한정된다.
Baker's 이스트 세포벽은 Baker's 이스트 세포로부터 유도되고, 용해되지 않는 생물중합체 β-1,3-글루칸, β-1,6-글루칸, 만난(mannan), 키틴질로 이루어질 수 있다. Baker's 이스트 세포벽은 열린 공동을 둘러싸는 두께가 단지 0.2 - 0.3미크론인 외벽을 갖는, 통상적으로 직경이 2 - 4미크론인 마이크로스피어이다. 이러한 물질은, 통상적으로 중량의 5 - 25배가 되는 액체를 흡수하는 상당한 액체 보존 용량을 갖는다. 외벽은 충분히 다공성이어서, 크기로 최대 150,000돌턴의 페이로드(payloads)가 외벽을 통과할 수 있고, 구형 입자의 속이 빈 공동으로 흡수될 수 있다. Baker's 이스트 세포벽은, 열 안정성(예를 들어 121℃), 전단 응력 안정성, pH 안정성(예를 들어 pH 2 - 12), 및 높은 농도에서 상당한 점성을 갖지 않는다는 점을 포함한, 여러 가지 고유의 특성을 갖는다. 이들의 물리적 특성에 더하여, 이러한 조성물은, 심장 혈관 및 면역보강 건강 이익을 운반하는 천연이고 건강에 좋은 식이 섬유를 포함한다.
이스트 세포벽은 이스트 세포의 용해 가능한 성분으로부터 용해 가능하지 않은 입자의 분획의 추출 및 정화에 의해 이스트 셀로부터 제조된다. 균류 세포벽은 이스트 추출 제조의 불용성 부산물로부터 생성될 수 있다. 게다가, 이스트 세포는, 이스트 세포벽을 간섭하지 않으면서, 세포의 단백질 및 세포간의 부분을 침지하는(digest) 수산화물 수용액으로 처리될 수 있어서, 상당한 단백질 오염이 없는 이스트 세포벽 성분을 남기고, β(1-6) 및 β(1-3) 연결된 글루칸의 변경되지 않은 세포벽 구조를 실질적으로 갖는다. 모든 글루칸 입자 및 이들을 제조하는 방법의 보다 상세한 설명은 예를 들어 미국특허출원 제 4,810,646호 및 공동-계류중인 특허출원 제 166,929호, 제 297,752호 및 제 297,982호에서 James에 의해 기술되어 있다.
Novogen Research Pty Ltd.에게 양도된, 미국특허출원 제 6,242,594호는 알칼리 추출물, 산 추출물, 및 그런 다음 유기용매 및 최종 건조에 의한 추출물에 의해 이스트 글루칸 입자를 제조하는 방법을 기재하고 있다. AS Biotech-Mackzymal에게 양도된, US 5,401,727은 이스트 글루칸 입자를 얻는 방법, 및 수생 동물의 저항성을 향상시키기 위해, 그리고 백신(vaccination)을 위한 보조제로서 이들을 사용 하는 방법을 기재하고 있다. Alpha-Beta Technology Inc.에게 양도된, US 5,607,677은 여러 가지 약제의 운반을 위한 운반 패키지 및 보조제로서 속이 빈 글루칸 입자를 사용하는 방법을 기재하고 있다. 전술한 특허 및 명세서의 기술은 본 명세서에 참고문헌으로서 병합된다.
다른 유형의 이스트 및 균류 세포는 글루칸을 함유하지 않는 세포벽을 갖는다. 그러한 이스트 및 균류 세포의 세포벽은 세포벽 입자를 얻기 위해 앞서 언급된 기술과 유사한 기술에 의해 분리될 수 있다.
게다가, 많은 식물, 조류(algae), 박테리아 및 다른 미생물의 세포 또한 세포벽을 포함한다. 세포벽의 구조 및 조성은 미생물 간에 다르지만, 일반적으로 튼튼하고 비교적 비활성 구조이다. 이스트와 관련해 앞서 언급된 기술과 같은 종래의 기술을 통해 그러한 세포로부터 유도된 세포벽 입자를 얻을 수 있다.
본 발명자는, 테르펜이 흡수될 수 있고(taken up), 속이 빈 글루칸 입자 또는 세포벽 입자 내에 안정되게 캡슐화될 수 있다는 것을 발견했다. 그러한 입자로의 테르펜의 캡슐화는 테르펜과 함께 입자의 배양에 의해 달성될 수 있다.
본 발명에 따르면, 테르펜 성분을 캡슐화하는 속이 빈 글루칸 입자 또는 세포벽 입자를 포함하는 조성물이 제공된다.
본 명세서에서 사용되는 "속이 빈 글루칸 입자(hollow glucan particle)"라는 용어는 구조 성분으로서 글루칸을 포함하는 임의의 속이 빈 입자를 포함한다. 따라서 특히, 이 용어는 이스트 세포벽(정화된 또는 가공하지 않은 형태) 또는 속이 빈 전체 글루칸 입자를 포함한다. "세포벽 입자"라는 용어는 세포(정화된 또는 가공되지 않은 형태)의 벽을 포함하는 입자를 지칭하는데, 여기서 글루칸은 구조 성분이 아니다. 적합한 입자는 식물, 조류, 균류 또는 박테리아 세포의 세포벽을 포함한다. 세포벽 입자는 통상적으로, 세포벽 입자가 유도된 세포의 형태로 남아있어서, 속이 빈 글루칸 입자와 마찬가지로, 테르펜 성분을 캡슐화하기에 적합한 속이 빈 중앙 공동을 제공한다.
본 발명의 속이 빈 글루칸 입자 또는 세포벽 입자는 테르펜 성분을 안정적으로 캡슐화할 수 있다는 것이 필요하다. 일반적으로 이것은 속이 빈 글루칸 입자 또는 세포벽 입자가 테르펜 성분(통상적으로 테르펜 성분은 비교적 높은 농도로 존재함)에 의한 생장 동안에 이들의 구조를 유지할 수 있어야만 하는 것과, 테르펜 성분이 입자로 이동할 수 있어야만 하는 것을 의미한다. 속이 빈 글루칸 입자 및 세포벽 입자는 통상적으로 비교적 비활성인 물질로 형성되고 다공성이어서, 일반적으로 속이 빈 글루칸 입자 및 세포벽 입자는 테르펜 성분을 캡슐화할 수 있을 것으로 가정될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 박테리아, 바이러스, 미코플라즈마, 균류, 선충류 거미류 동물 및/또는 거미류의 거미류 동물을 포함하는 다양한 감염 병원균에 대해 효과적이다.
본 발명에 따른 조성물은 다음의 이점을 제공할 수 있다:
- 테르펜 페이로드(payload)를 최대로 하고;
- 캡슐화되지 않은 페이로드를 최소로 하고;
- 페이로드 안정성을 제어하고;
- 페이로드 방출 에너지 키네틱(kinetics)을 제어하고;
- 질량 및 균일성을 증가시키기 위해 액체 테르펜의 고형을 생성하고;
- 테르펜의 처리 및 적용이 간단하고;
- 테르펜의 냄새와 맛을 차단해준다.
특히 적당한 속이 빈 글루칸 입자 또는 세포벽 입자는 균류 세포벽, 바람직하게는 이스트 세포벽이다. 이스트 세포벽은, 이들이 유도된 이스트 세포의 3-차원 구조를 유지하는 이스트 세포의 조직 표본(preparations)이다. 따라서 이스트 세포벽은, 테르펜 성분이 이스트 세포벽 내에서 캡슐화되도록 속이 빈 구조를 갖는다. 이스트 세포벽은 적합하게는 Baker's 이스트 세포(미주리, 세인트 루이스에 있는 Sigma Chemical Corp로부터 구입 가능함)로부터 유도될 수 있다. 원하는 특성을 갖는 이스트 세포벽 입자는, Biorigin(브라질, 상파울로)로부터 상품명 Nutricell MOS 55로 얻어질 수 있다. 이러한 입자는 S.cerevisiae의 분무 건조된 추출물이다.
대안적인 입자는 상품명 SAF-Mannan(미네소타, 미니애폴리스에 있는 SAF Agri.) 및 Nutrex(위스콘신, 밀워키에 있는 Sensient Technologies)에 의해 알려진 입자들이다. 이러한 입자들은 이스트 추출 제조 공정으로부터의 불용성 폐기물 스트림(waste stream)인 속이 빈 글루칸 입자이다. 이스트 추출물의 제조 동안, 부분적으로 자기 분해된 이스트 세포의 용해 가능한 성분은 제거되고, 불용성 잔여물은 테르펜 하중을 위한 적합한 물질이다. 이러한 속이 빈 글루칸 입자는 약 25-35중량%의 베타 1,3-글루칸을 포함한다. 이러한 물질의 중요한 특성은, 이들이 10중량% 초과의 지질을 함유하고, 테르펜의 흡수에 매우 효과적인 점이다. 게다가, 폐기물 스트림 제품처럼, 이들은 속이 빈 글루칸 입자의 비교적 저렴한 소스이다.
더 높은 순도를 갖는 대안적인 속이 빈 글루칸 입자는 Nutricepts(미네소타, 번스빌에 있는 Nutricepts Inc.) 및 ASA Biotech에 의해 생산된 속이 빈 글루칸 입자이다. 이러한 입자는, 글루칸이 50-65중량%인 입자를 산출하는 세포벽의 외부 만노단백질(mannoprotein) 층을 제거할 뿐만 아니라 추가의 세포내 성분을 제거하며, 알칼리 추출되었다.
더 높은 순도의 속이 빈 글루칸 입자는 바이오폴리머 엔지니어링(Biopolymer Engineering)의 WGP 입자이다. 이러한 입자는 글루칸이 75-85중량%인 제품을 산출하는 추가 이스트 성분을 제거하는 산성 추출된다.
매우 높은 순도의 속이 빈 글루칸 입자는 알파-베타 테크놀로지(Alpha-beta Technology, Inc.)(메사추세츠, 우스터)의 Adjuvax™ 및 노보젠(Novogen)(코네티컷, 스탬퍼드)의 마이크로입자 글루칸이다. 이러한 입자는 잔여 지질을 제거한 추출된 유기 용매이고, 입자는 90중량% 초과의 글루칸을 포함한다.
일부 실시예에서, 높은 순도의 속이 빈 글루칸 입자 또는 세포벽 입자가 요구될 수 있는데, 예를 들어 가능한 오염물질의 엄격한 제어가 요구된다. 이러한 예에서, 더 높은 순도의 입자는 더 낮은 순도의 다른 제품보다 바람직할 것이다. 다른 실시예에 대하여, 더 낮은 순도의 입자는 경제적인 면에서 바람직할 것이다; 이러한 입자는 또한 테르펜을 흡수할 때 보다 효과적인 것으로 알려져 있다.
바람직하게는 속이 빈 글루칸 입자 또는 세포벽 입자는 1 또는 2중량%의 지질과 같은, 소량의 지질 함량을 갖는다. 소량의 지질 함량은 테르펜 성분을 캡슐화하는 입자의 능력을 증가시킬 수 있다. 바람직하게는 속이 빈 글루칸 입자 또는 세포벽 입자의 지질 함량이 5중량% 이상, 보다 바람직하게는 10중량% 이상이다.
선택적으로 본 발명의 테르펜 조성물은 계면활성제와 관련될 수 있다. 계면활성제는 비-이온성, 양이온성, 또는 음이온성일 수 있다. 예를 들어 적합한 계면활성제는 라우릴 황산나트륨(sodium lauryl sulphate), 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리글리세릴 에스테르, 폴리글리세릴 모노올레산염, 데카글리세릴 모노올레산염, 프로필렌 글리콜 디카프릴레이트(dicaprilate), 트리글리세롤 모노스테아르산염, 폴리옥시에틸렌소르비탄, 모노올레산염, Tween®, Span®20, Span®40, Span®60, Span®80, Brig 30 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 계면활성제는 에멀션에서 테르펜 성분을 유지하는 역할을 하고 또한 속이 빈 글루칸 입자 또는 세포벽 입자로의 테르펜 성분의 캡슐화를 보조한다.
본 발명의 테르펜 성분은 단일 테르펜 또는 테르펜의 혼합물을 포함할 수 있다. 테르펜의 혼합물은 시너지 효과를 초래할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "테르펜"이라는 용어는 분자식 (C5H8)n의 테르펜을 언급할 뿐만 아니라, 테르펜 알데히드 또는 테르펜 중합체와 같은 테르펜 유도체를 포함한다. 천연 및 합성 테르펜은 예를 들어 모노테르펜, 세스퀴테르펜, 디테르펜, 트리테르펜, 및 테트라테르펜이 포함될 수 있다. 게다가, 화합물 중 하나의 이름을 언급하는 것은 그 화합물의 다양한 이성질체를 포함할 것이다. 예를 들어, 시트랄이라는 용어는 시스-이성질체 시트랄-a(제라니알) 및 트랜스-이성질체 시트랄-b(네랄)를 포함한다.
테르펜은 또한 이들을 포함하는 추출물 또는 정유의 이름, 예를 들어 레몬그래스 오일(시트랄 함유)로 알려져 있다는 것이 주지되어야 한다.
미국 규정으로부터 면제되고, EPA 규정 40 C.F.R.Part 152(전체가 본 명세서에 참고문헌으로 병합됨) 에 등록된 테르펜은 본 발명에서 사용하기에 적합하다.
본 발명에서 사용하는 특히 적합한 테르펜은 시트랄, 피넨, 네롤, b-이오논, 게라니올, 카르바크롤, 유게놀, 카르본(예를 들어 L-카르본), 테르페니올, 아네톨, 장뇌, 멘톨, 티몰, 리모넨, 네롤리돌, 파네솔, 파이톨, 카로틴(비타민 A1), 스쿠알렌, 티몰, 토코트리에놀, 페릴릴 알코올, 보르네올, 미르센, 시멘, 카렌, 테르페넨, 리나로올 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것을 포함한다.
바람직하게 본 발명에서 사용된 테르펜은 일반적인 구조 C10H16을 갖는데, 이러한 부-그룹이 통상적으로 감염성 병원균에 대해 보다 효과적이기 때문이다.
보다 바람직하게는 테르펜 성분은 게라니올, 티몰, 시트랄, 카르본(예를 들어 L-카르본), 유게놀 및 b-이오논으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
테르펜 성분은 적합하게는 티몰을 포함할 수 있는데, 이러한 테르펜이 균류 식물 감염을 치료하거나 예방하는데 특히 효과적인 것으로 나타났기 때문이다.
또 다른 특히 적합한 테르펜은 많은 미생물에 대해 특수한 효능이 증명된 시트랄이다.
게라니올, 티몰 및 유게놀의 조합은 식물 감염에 대해 특수한 효능이 증명되었고, 따라서 이는 특히 적합한 테르펜 성분이다.
시트랄 단독 또는 티몰, 유게놀 및 시트랄의 조합은 진드기 횡행(infestations)에 대해 특수한 효능이 증명되었고, 따라서 특히 적합한 테르펜 성분이다.
식물 감염을 치료하는데 높은 효능을 나타낸 다른 테르펜 제형은 다음을 포함한다(백분율은 w/w):
- 100% 티몰;
- 50% 게라니올 및 50% 티몰;
- 50% 유게놀 및 50% 티몰;
- 33% 게라니올, 33% 유게놀 및 33% 티몰;
- 33% 유게놀, 33% 티몰 및 33% 시트랄;
- 25% 게라니올, 25% 유게놀, 25% 티몰 및 25% 시트랄;
- 20% 게라니올, 20% 유게놀, 20% 시트랄, 20% 티몰 및 20% L-카르본.
따라서 위의 제형 중 임의의 것을 포함하는 테르펜 성분은 본 발명에서 사용하기에 특히 적합하다.
일실시예에서, 테르펜 성분은 산소를 함유한 하나 이상의 테르펜을 포함한다. 시트랄, 예를 들어 시트랄 95는 산소화 C10H16 테르펜, 즉 C10H16O CAS 제 5392-40-5호(3,7-디메틸-2,6-옥타디엔-1-알)이다. 시트랄의 안정한 현탁액은 최대 약 2500ppm까지 형성될 수 있다. 시트랄은 약 500ppm까지 용액으로 만들어질 수 있다. 25ppt 시트랄의 시트랄과 결합한 속이 빈 글루칸 입자의 안정한 현탁액이 만들어질 수 있다.
본 발명의 조성물은 1 내지 99부피%의 테르펜, 0 내지 99부피%의 계면활성제 및 1 내지 99부피%의 속이 빈 글루칸 입자 또는 세포벽 입자를 포함할 수 있다. 보다 상세하게는 상기 조성물은 약 10중량% 내지 약 67중량%의 테르펜, 약 0.1-10%의 계면활성제 및 약 40-90%의 속이 빈 글루칸 입자 또는 세포벽 입자를 포함할 수 있다.
적합하게는, 본 발명의 조성물은 약 500 내지 약 10,000ppm의 속이 빈 글루칸 입자 또는 세포벽 입자를 포함하고, 여기서 입자는 약 1 내지 약 67%의 테르펜 성분을 포함한다. 바람직하게는 조성물이 약 1000 내지 약 2000ppm의 속이 빈 글루칸 입자 또는 세포벽 입자를 포함하고, 여기서 입자는 약 10 내지 약 50%의 테르펜 성분을 포함한다.
특정한 조성물은, 예를 들어 박테리아 및 균류에 대해, 최대 67%의 L-카르본, 최대 67%의 유게놀, 최대 67%의 시트랄, 최대 67%의 티몰 및 L-카르본, 최대 67%의 게라니올, 또는 최대 67%의 시트랄 및 L-카르본 및 유게놀, 및 1%의 Tween®80을 갖는, 물 또는 0.9% 표준 염수에 혼합된 테르펜을 캡슐화하는 속이 빈 글루칸 입자 또는 세포벽 입자를 포함할 수 있고; 곰팡이에 대해, 최대 67%의 시트랄 및 1%의 Tween®80을 갖는, 물 또는 0.9% 표준 염수에 혼합된 테르펜을 캡슐화하는 속이 빈 글루칸 입자 또는 세포벽 입자를 포함할 수 있고; 또는 미코플라즈마에 대해, 최대 67%의 시트랄, 최대 67%의 L-카르본 및 유게놀, 최대 67%의 유게놀, 최대 67%의 게라니올, 또는 최대 67%의 게라니올, 티몰, 및 1%의 Tween®80을 갖는, 물 또는 0.9% 표준 염수에 혼합된 테르펜을 캡슐화하는 속이 빈 글루칸 입자 또는 세포벽 입자를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법에서 유효 농도로서, 테르펜을 캡슐화하는 속이 빈 글루칸 입자 또는 세포벽 입자의 농도는 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 130, 140, 150, 160, 175, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1100, 1250, 1375, 1425, 1500, 1600, 1750, 또는 2000ppm이 사용될 수 있다. 훨씬 더 높은 농도{최대 25ppt(parts per thousand)}로 행해질 수 있고, 본 발명에서 유용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약 1ppm 내지 약 25ppt(25000ppm), 바람직하게는 100 내지 2000ppm, 예를 들어 250, 500, 1000, 2000ppm의 테르펜 성분을 포함할 수 있다.
테르펜, 계면활성제, 및 본 발명의 다른 성분은 쉽게 구입할 수 있거나, 합성 화학자에게 일반적으로 알려져 있는 기술을 사용하여 합성 가능하다.
안정성 및 규정의 이유로, 본 발명에서 사용된 테르펜은 적어도 식용 등급의 테르펜이다(미국 FDA 또는 미국 외의 동등한 국가 규정 조직에 의해 정의됨).
선택적으로 조성물은 테르펜 성분 이외의 다른 식용-등급 활성 화합물, 예를 들어 다른 항균제, 효소 등을 포함할 수 있다.
선택적으로, 조성물은 테르펜 성분 이외의 다른 추가 활성제, 예를 들어 항균제, 항진균제, 살충제, 항염제, 마취제 등을 포함할 수 있다. 적합한 작용제는 다음을 포함한다:
- 항진균제(Anti-fungal): 세포벽 가수분해 효소(속이 빈 글루칸 입자 또는 세포벽 입자를 분해하지 않는 것으로 가정함), 세포벽 합성 억제제, 표준 항진균제.
- 항균제(Anti-bacterial): 살균제, 세포벽 가수분해효소, 합성 억제제, 항생제.
- 살충제: 천연 살충제, 키티나아제(chitinase).
조성물은 테르펜의 산화를 줄이기 위해 산화방지제를 포함할 수 있다. 그러한 산화방지제의 예로는 로즈마리 오일, 비타민 C 또는 비타민 E일 수 있다.
본 발명의 조성물은 건조 분말 형태일 수 있다. 상기 조성물은 농업, 식품, 또는 약제학적으로 수용 가능한 캐리어 또는 액체, 고체 또는 겔과 같은 형태의 첨가제(excipient)와 결합하여 제공될 수 있다.
고체 조성물에 대하여, 적합한 캐리어는 약제학적 등급의 만니톨, 락토오스, 녹말, 마그네슘 스테아르산염, 나트륨 사카린, 탈크, 셀룰로오스, 글루코오스, 수크로오스, 탄산마그네슘 등을 포함한다. 적합하게는 제형은 정제(tablet) 또는 펠릿(pellet) 형태이다. 적합한 캐리어는 또한 인간 또는 동물 식품일 수 있다. 추가로, 종래의 농업의 캐리어 또한 사용될 수 있다.
조성물의 펠릿, 정제 또는 다른 고형은 바람직하게, 액체(예를 들어 물)로 위치되는 경우, 조성물의 분산을 촉진시켜주는 분산제를 함유할 수 있다. 적합한 분산제는 크산탄 고무(xanthan gum), 말토덱스트린, 알지네이트 등을 포함한다.
액체 조성물은 예를 들어, 용액 또는 현탁액을 형성하기 위해, 물, 염수(saline), 수성 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등에 조성물을 분산시켜 제조될 수 있다. 만일 원하는 경우, 이러한 조성물은, 습윤제 또는 유화제, pH 완충제(예를 들어 아세트산나트륨, 소르비탄 모노라우르산염, 트리에탄올아민 아세트산나트륨 또는 트리에탄올아민 올레산염)와 같은, 미량의 비-독성 보조 물질을 함유할 수 있다. 그러한 액체 조성물을 제조하는 방법은 당업자에게 알려져 있거나 명백할 것이다; 예를 들어 본 명세서에 참조용으로 병합된 Remington: The Science and Practice of Pharmacy; Lippincott, Williams & Wilkins; (2000년 12월 15일)를 참조. 또한 액체 조성물은 이들을 인간 또는 동물의 액체 식품 또는 음료 물질에 분산함으로써 제조될 수 있다. 추가로 적합한 액체 농업 첨가제가 사용될 수 있다.
구강 투여 정제 및 알갱이(granules)가 일반적으로 바람직하다. 정제는 결합제 및 윤활제를 함유할 수 있다. 미세한 분말 또는 알갱이는 희석제, 분산제 및/또는 계면활성제를 함유할 수 있고, 물 또는 시럽에 제공될 수 있다. 캡슐 또는 작은 주머니(sachets)는 보통 건조 상태의 조성물을 함유할 수 있다. 조성물의 비-수성 용액 또는 현탁액 또한 적합하고, 침강방지제(suspending agents)를 함유할 수 있다. 원하거나 필요한 경우, 향신료, 방부제, 침강방지제, 증점제(thickening agents), 또는 유화제가 함유될 수 있다. 물론 구강 운반 방식으로서 식품 또는 음료 물질을 사용하기에 적합해야 한다.
비경구 투여는 통상적으로 주사에 의한 것을 특징으로 한다. 주사 가능 물질(injectables)에 대하여, 일반적으로, 조성물에 사용되는 모든 물질 및 사용되는 임의의 첨가제는 약제학적 등급이어야 하는 점이 인정되어야 할 것이다. 주사 가능 물질은 액체 용액, 에멀션 또는 현탁액, 용해에 적합한 고체 형태, 주사에 적합한 액체에 혼합된 현탁액, 또는 에멀션으로서 종래의 형태로 제조될 수 있다. 비경구 투여에 대한 대안적인 접근 방법은, 분량의 일정한 레벨이 유지되도록, 느린 방출 또는 유지된 방출 시스템의 사용을 수반한다. 예를 들어, 본 명세서에 참조용으로 병합되어 있는, 미국특허출원 제 3,710,795호를 참조하라. 비경우 투여의 준비는 또한 완충제, 희석제 및 다른 적합한 첨가제를 함유할 수 있다. 비-수성 용매의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일(예를 들어 올리브 오일), 및 주사 가능한 유기 에스테르(예를 들어 에틸 올레산염)가 있다. 수성 캐리어는, 염수 및 완충된 매질을 포함하는, 물, 알코올/수성 용액, 에멀션, 또는 현탁액을 포함한다. 다른 비경구 전달 수단(vehicles)으로는 염화나트륨 용액, 링게르 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 젖산 염화 링게르; 또는 경화된 오일을 포함한다. 정맥주사의 사용을 위한 전달 수단은 유체 및 영양소 보충제, 전해질 보충제(예를 들어 링게르 덱스트로스를 주성분으로 하는 것) 등을 포함한다.
방부제 및 다른 첨가제 또한 존재할 수 있는데, 예를 들어 항균제, 산화방지제, 킬레이트제, 비활성 기체 등이 있다.
국소적인 투여를 위해, 액체, 현탁액, 로션, 크림, 겔, 연고, 드롭, 좌약, 스프레이 및 분말이 사용될 수 있다. 종래의 약제학적 캐리어, 물, 분말 또는 오일 성분, 증점제 등이 필요에 따라 사용될 수 있다.
본 발명은 추가로 테르펜 성분을 캡슐화하는 속이 빈 글루칸 입자 또는 세포벽 입자의 제조 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다;
a) 테르펜 성분을 제공하는 단계;
b) 속이 빈 글루칸 입자 또는 세포벽 입자를 제공하는 단계;
c) 테르펜 캡슐화를 위한 적합한 조건 하에, 상기 글루칸 입자 또는 세포벽 입자와 함께 테르펜 성분을 배양시키는 단계;
d) 테르펜 성분을 캡슐화하는 속이 빈 글루칸 입자 또는 세포벽 입자를 제거하는 단계.
선택적으로 위의 방법은 테르펜 성분을 캡슐화하는 상기 입자를 건조시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 건조 단계는 여러 가지 방법으로 달성될 수 있으며, 모두 잘 알려져 있는 공정인, 냉동 건조, 유동층(fluidised bed) 건조, 드럼 건조 또는 분무 건조가 언급될 수 있다.
위의 방법 중 단계 a)에서, 테르펜 성분은 적합하게는 수성 용매에 혼합된 현탁액으로서 제공되고, 선택적으로 계면활성제가 존재한다. 적합하게는 용매는 물이다. 적합한 계면활성제는 Tween-80(폴리옥시에틸렌소르비탄 모노올레산염)이고, 바람직하게 계면활성제는 총 반응 혼합물의 약 0.1 내지 10부피%, 보다 바람직하게는 약 1부피%의 농도로 존재한다. 대안적으로 테르펜 성분은 용매(예를 들어, 물)에 혼합된 순수한 용액으로서 제공될 수 있다. 물에 혼합된 테르펜의 순수한 용액은, 순수한 용액이 얻어질 때까지 높은 전단 응력에서 물에서 테르펜을 혼합함으로써 얻어질 수 있다. 공보 WO 03/020024는 물에 혼합된 테르펜의 순수한 용액을 형성하는 추가 상세를 제공한다.
위의 방법 중 단계 b)에서, 적합하게는 속이 빈 글루칸 입자 또는 세포벽 입자가 물 또는 다른 적당한 액체에 혼합된 현탁액으로서 제공된다. 적합하게는 상기 현탁액이 ㎖ 당 약 1 내지 1000㎎, 바람직하게는 200 내지 400㎎/㎖의 입자를 포함한다. 대안적으로 상기 입자는 건조 분말로서 제공되고, 테르펜-계면활성제 현탁액에 첨가될 수 있다.
대안적으로 상기 입자는 이들을 최소한으로 수화시키기 위해 충분하지만 과도하지 않은 액체에 제공된다. "하이드로다이나믹 부피(hydrodynamic volume)"(HV)는 상기 입자를 최소한으로 수화시키기 위해 필요로 하는 액체의 부피를 기재하기 위해 사용된다. 따라서 적합하게는 상기 입자가 HV로부터의 부피 범위, 및 HV의 1.5배의 부피(1.5HV)를 구비할 수 있다. 이것은 후속적인 건조 단계를 보다 효과적으로 만들어 준다. 또한 액체의 낮은 부피가 사용되는 경우(즉, 약 HV 내지 1.5HV), 또한 최종 제품을, 유동층 건조에 편리한, 펠릿 또는 누들(noodle) 형태로 사출 성형할 수 있게 해준다.
테르펜 성분이 실온에서 속이 빈 글루칸 입자 또는 세포벽 입자에 의해 캡슐화될 수 있다는 것이 발견되었다. 그러나 캡슐화의 비율은 37℃ 이상에서에서 증가하지만, 온도는 조성물의 임의의 성분의 끓는점 또는 변형 온도 밑에서 유지되어야 한다. 위의 방법 중 단계 c)에 대한 적합한 조건은 따라서 20 내지 37℃의 온도에서의 대기압이다. 특정한 캡슐화 반응에 대한 조건의 최적화는 일상적인 실험의 범위가 될 것이다.
본 발명은 추가로 미생물을 제거하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다;
a) 테르펜 성분을 캡슐화하는 속이 빈 글루칸 입자 또는 세포벽 입자를 포함하는 조성물과 상기 미생물을 접촉시키는 단계.
적합한 조성물은 위에서 보다 상세하게 정의된다.
본 발명은 환자의 감염을 예방하거나 치료하는 방법을 추가로 제공하며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다;
a) 테르펜 성분을 캡슐화하는 속이 빈 글루칸 입자 또는 세포벽 입자를 포함하는 조성물을, 치료에 효과적인 양으로, 상기 환자에게 투여하는 단계.
적합한 조성물은 위에서 보다 상세하게 정의된다.
환자의 감염은 감염 병원균에 의해 초래될 수 있다. 이러한 감염 병원균의 예는 Staphylococcus aureus, Aspergillius fumigatus, Mycoplasma iowae, Penicillium sp., 및 Mycoplasma pneumoniae를 포함하는데, 이들에 제한되지 않는다.
내부 투여에 대하여, 조성물은 경구로, 치구로(vaginally), 직장으로, 호흡에 의해, 또는 비경구 루트, 예를 들어 피내의, 피하의, 근육 내의, 복막 내의, 직장 내의, 동맥 내의, 림프 내의, 정맥 내의, 경막 내의(intrathecal), 및 기관 내의(intratracheal) 루트에 의해 투여될 수 있다.
외부 치료에 대하여, 조성물은 상처의 치료를 위해, 예를 들어 크림 또는 연고로서, 또는 건조 분말로서 국소적으로 적용될 수 있다.
위 방법에서 투여된 테르펜의 양은 원하는 결과(즉 감염의 예방 및/또는 치료)를 달성하기에 충분해야 하지만, 환자에게 심각한 독성을 유발하는 레벨은 아니어야 한다.
투여된 조성물의 양은 물론 투여 방식, 치료되는 환자(즉 이들의 체중, 이들의 나이, 상태, 성별 및 질병의 정도) 및 처방을 내리는 의사의 판단에 의존할 것이다. 복용량, 복용량 스케줄, 및 투여 루트가 다를 수 있다. 당업자는 이 기술 분야에서 일반적인 지식 및 아래에 주어진 예의 절차를 기반으로 하는 주어진 적용에 대해 항감염의 양을 쉽게 결정할 수 있을 것이다. 본 명세서에서 사용되는 "환자"라는 용어는, 치료가 적용되는, 인간 또는 동물인 임의의 개인을 나타낸다는 것이 주지되어야 한다. 따라서 환자는 애완동물(예를 들어 고양이, 개 등), 가축(예를 들어, 소, 말, 돼지, 양, 염소 등), 실험용 동물(예를 들어, 생쥐, 토끼, 쥐, 기니 돼지 등), 새 및 물고기일 수 있다. 적합하게는 그 주체가 포유동물 및 특히 영장류, 예를 들어 인간이다.
추가 양상에서 본 발명은 본 발명은 곤충 또는 거미류 동물을 제거하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다;
a) 테르펜 성분을 캡슐화하는 속이 빈 글루칸 입자 또는 세포벽 입자를 포함하는 조성물을 유효량으로 상기 곤충 또는 거미류 동물에게 투여하는 단계.
본 발명에 따라 제거될 수 있는 곤충은, 예를 들어 개미, 흰개미, 이(lice), 진딧물, 벼룩, 매미, 메뚜기 및 삽주벌레를 포함할 수 있다.
본 발명에 따라 제거될 수 있는 거미류 동물은 예를 들어 진드기류(mites), 거미 및 진드기(ticks)이다.
일실시예에서 본 발명은 식물에 침입하는(infest) 진드기, 예를 들어 점박이응애(two-spotted spider mites)를 제거하는 방법을 제공한다. 시트랄을 단독으로 또는 유게놀, 티몰 및 시트랄의 조합을 포함하는 조성물은 점박이응애를 제거하는데 특히 적합하다.
투여는 곤충 또는 거미류 동물에게 상기 조성물을 분무하거나 아니면 적용함으로써, 또는 곤충 또는 거미류 동물에 의해 섭취될 수 있는 식물의 잎에 분무함으로써 적절하게 할 수 있다. 대안적으로, 곤충 또는 거미류 동물이 침입되는 대상이 상기 조성물에 침지될 수 있다.
인간, 동물이 곤충 또는 거미류 동물에 의해 침입되는 경우, 상기 조성물은 예를 들어 샴푸 등의 형태로 투여될 수 있다.
직물, 예를 들어 옷이 곤충 또는 거미류 동물에 의해 침입되는 경우, 상기 조성물은 옷을 세탁하는 동안 투여될 수 있다. 예를 들어 조성물은 직물의 부분을 깨끗하게 하거나 더 부드럽게 해주는 조성물로서 투여될 수 있다.
추가 실시예에서, 본 발명은 식물의 감염 또는 침입을 치료하거나 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다;
a) 테르펜 성분을 캡슐화하는 속이 빈 글루칸 입자 또는 세포벽을 포함하는 조성물을 치료에 효과적인 양으로 식물 또는 그 식물 부근의 토양에 투여하는 단계.
적합한 조성물은 위에서 보다 상세하게 정의된다.
테르펜은 많은 식물 병원균을 제거하고 (WO 03/020024) 참조, 공동-계류중인 출원 US 60/538,627에 기술된 바와 같이 또한 식물 기생충인 선충류를 효과적으로 제거하는 것으로 알려져 있다. 그러나 현탁액 또는 용액에 단독으로 혼합된 테르펜은 토양 환경에서 다소 불안정하고 빠르게 분해되어, 효력을 잃는다.
속이 빈 글루칸 입자 또는 세포벽 입자에 테르펜 성분을 결합하면 테르펜 방출 및 분해 속도를 줄일 수 있어서, 토양에서의 테르펜의 작용 지속 기간을 증가시킨다.
적절하게는, 위의 방법으로 치료되거나 예방되는 식물의 감염은 선충류에 의한 감염이다.
치료되거나 예방될 수 있는 다른 식물 감염은 특히 식물의 표면에 영향을 주는 균류 식물 감염을 포함한다. 그러한 감염은 노균병(downy mildew), 맥류흰가루병(powdery mildew) 또는 보트리티스 번치 부패병(botrytis bunch rot)을 포함하고; 이러한 감염은 특히 포도나무에 영향을 준다.
일실시예에서, 식물 감염은 다음 중 하나 이상에 의해 초래될 수 있다:
Aspergillius fumigatus, Sclerotinia homeocarpa, Rhizoctonia solani, Colletotrichum graminicola Phytophtora infestans 또는 Penicillium sp.
예방되거나 치료될 수 있는 식물 침입은 곤충 또는 거미류 동물에 의한 침입을 포함한다. 치료될 수 있는 곤충 침입의 예는 파리, 진딧물, 개미, 매미, 메뚜기 및 삽주벌레에 의한 침입을 포함한다. 예방되거나 치료될 수 있는 거미류 동물에 의한 침입의 예는 초식성 진드기(점박이응애를 포함)를 포함한다.
본 발명에 따른 조성물은 진드기, 특히 점박이응애가 침입한 식물을 치료하는데 특히 효과적임을 보여주었다. 시트랄을 단독으로 또는 유게놀, 티몰 및 시트랄의 조합을 포함하는 조성물은 점박이응애를 제거하는데 특히 적합하다.
테르펜에 기반한 식물 치료의 이점은 수확 직전에 적용될 수 있다는 점이다.
많은 종래의 처리법은 치료된 영역에 다시 들어가기 전에 연장된 기간을 필요로 한다(일반적으로 3주). 이것은, 원하는 시간에 농작물을 수확하는 것을 불가능하게 하기 때문에, 수확 직전의 식물 질병의 발생은 종래의 처리법으로 처리될 수 없다는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물은 적합하게는 수확할 때까지 언제라도, 예를 들어 수확 21일 전, 수확 14일 전, 수확 7일 전, 또는 심지어 수확 3일 전 또는 그 이전에 적용될 수 있다.
캡슐화된 테르펜은 포도의 노균병, 맥류흰가루병 및 보트리티스 번치 부패병에서 특별한 효능을 보여줘서, 본 발명은 이러한 질병을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 추가로, 캡슐화된 테르펜은 점박이응애에 특히 효과적인 것으로 나타났으며, 따라서 본 발명은 또한 그러한 침입을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.
식물 감염의 예방은 질병 예방의 수단으로서 캡슐화된 테르펜으로 식물을 규칙적으로 치료함으로써 달성될 수 있다.
적합하게는 본 발명의 조성물이 분무에 의해 적용될 수 있다. 이것은 식물의 표면에 영향을 주는 식물 감염을 치료하는데 특히 적합하다. 분무를 위해, 물에 혼합된 2g/ℓ의 조성물을 포함하는 조제약(preparation)이 사용될 수 있다. 2 내지 4g/ℓ의 농도가 특히 효과적이며, 필요에 따라 4g/ℓ보다 큰 농도가 사용될 수 있다. 분명하게는 사용된 조성물의 농도가 병원균을 유발하는 질병을 제거하거나 억제하는데 충분한 농도로 사용되지만, 식물을 손상시킬 만큼 높은 농도로 치료되지 않는 것이 중요하다.
식물에 분무하는 경우, 식물을 덮기 위해서는 500L/Ha 이상의 비율이 적합하다. 바람직하게는 900 L/Ha 이상의 비율, 보다 바람직하게는 1200 L/Ha 이상의 비율이 우수한 커버를 보장하기 위해 사용된다. 포도나무가 치료되어야 하는 곳에서는, 적합하게는 1200 L/Ha의 비율이 효과적인 것으로 입증되었다.
본 발명의 조성물은 대안적으로 관개를 통해 적용될 수 있다. 이것은 특히 선충류 또는 다른 토양 병원균 또는 기생충을 치료하는데 적합하다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 테르펜 성분을 캡슐화하는 속이 빈 글루칸 입자 또는 세포벽 입자를 포함하는 조성물을 살충제 또는 거미 살충제(arachnicide)(즉, 거미류 동물을 죽일 수 있는 조성물)로서, 특히 살비제(acaricide)로서 사용하는 방법을 제공한다.
다른 실시예에서, 본 발명은 살충제 또는 거미 살충제, 특히 살비제를 위해 테르펜 성분을 캡슐화하는 속이 빈 글루칸 입자 또는 세포벽 입자를 포함하는 조성물의 사용 방법을 제공한다.
다른 실시예에서, 본 발명은 또한 환자 또는 식물의 감염의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 테르펜 성분을 캡슐화하는 속이 빈 글루칸 입자 또는 세포벽 입자를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다. 적합한 조성물은 앞에서 보다 상세하게 정의된다.
다른 실시예에서, 본 발명은 미생물에 의해 초래된 감염의 치료를 위한 약의 제조에서 테르펜 성분을 캡슐화하는 속이 빈 글루칸 입자 또는 세포벽 입자를 포함하는 조성물의 사용 방법을 제공한다. 적합한 조성물은 앞에서 보다 상세하게 정의된다.
이제 본 발명은 다음의 비제한적인 예시 및 도면을 참고하여 더 기술될 것이다.
도 1은 속이 빈 이스트 세포벽의 광 현미경 사진을 나타낸 도면.
도 2는 L-카르본을 캡슐화하는 이스트 세포벽의 광 현미경 사진을 나타낸 도면.
도 3은 시트랄을 캡슐화하는 이스트 세포벽의 광 현미경 사진을 나타낸 도면.
도 4는 테르펜 에멀션의 광 현미경 사진을 나타낸 도면.
도 5는 하이드로다이나믹 부피(HV) 물에 있는 이스트 세포벽의 광 현미경 사진을 나타낸 도면.
도 6은 물의 하이드로다이나믹 부피(HV)의 5배인 테르펜을 캡슐화하는 이스트 세포벽의 광 현미경 사진을 나타낸 도면.
도 7은 물의 HV의 테르펜을 캡슐화하는 이스트 세포벽의 광 현미경 사진을 나타낸 도면.
도 8은 물의 5% 더해진 HV의 테르펜을 캡슐화하는 이스트 세포벽의 광 현미경 사진을 나타낸 도면.
도 9은 물의 10% 더해진 HV의 테르펜을 캡슐화하는 이스트 세포벽의 광 현미경 사진을 나타낸 도면.
도 10은 물의 20% 더해진 HV의 테르펜을 캡슐화하는 이스트 세포벽의 광 현미경 사진을 나타낸 도면.
도 11은 물의 30% 더해진 HV의 테르펜을 캡슐화하는 이스트 세포벽의 광 현미경 사진을 나타낸 도면.
도 12은 물의 40% 더해진 HV의 테르펜을 캡슐화하는 이스트 세포벽의 광 현미경 사진을 나타낸 도면.
도 13은 크산탄 고무를 함유하지 않는 경우, 테르펜 성분을 캡슐화하는 건조된 속이 빈 글루칸 입자의 분산을 도시한 광 현미경 사진을 나타낸 도면.
도 14는 1% 크산탄 고무를 0.07g 함유하는 도 13의 광 현미경 사진을 나타낸 도면.
도 15는 1% 크산탄 고무를 0.14g 함유하는 도 13의 광 현미경 사진을 나타낸 도면.
도 16은 1% 크산탄 고무를 0.28g 함유하는 도 13의 광 현미경 사진을 나타낸 도면.
도 17는 1% 크산탄 고무를 0.55g 함유하는 도 13의 광 현미경 사진을 나타낸 도면.
도 18는 1% 크산탄 고무를 1.1g 함유하는 도 13의 광 현미경 사진을 나타낸 도면.
도 19는 1% 크산탄 고무를 2.2g 함유하는 도 13의 광 현미경 사진을 나타낸 도면.
도 20는 1% 크산탄 고무를 4.4g 함유하는 도 13의 광 현미경 사진을 나타낸 도면.
도 21은 위치(18 및 20)에서 처리 영역의 개략적인 표시를 도시한 도면.
도 22는 위치(18 및 20)에서 처리 영역의 개략적인 표시를 도시한 도면.
도 23은 위치(7)에서 처리 영역의 개략적인 표시를 도시한 도면.
도 24는 캡슐화된 테르펜 제형 대 캡슐화되지 않은 테르펜 제형의 비교를 보여주는 그래프를 도시한 도면.
도 26a 내지 도 26d는 토마토 식물의 4개의 복제(replicates)에서 진드기 질병 등급을 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 27은 YP-4로 처리된 식물과 대조구 사이의 비교를 보여주는 사진.
다음의 예는 당업자가 본 발명을 수행하고 실행할 수 있도록 제공된다. 이러한 예는 단지 예시적이며 본 발명의 범위를 제한하도록 의도되지 않는다. 만일 달리 표시되지 않는다면, 비율은 표시되는 바와 같이 부피비 또는 중량비이고, 온도 는 섭씨온도(℃) 또는 상온이고, 압력은 대기압이거나 그와 비슷한 환경이다. 조성물, 및 이들을 제조하거나 사용하기 위한 조건(예를 들어, 성분의 농도, 원하는 용매, 용매 혼합물, 온도, 압력, 및 도 3에 기재된 카르본으로부터 얻어진 결과를 최적화하기 위해 사용될 수 있는 다른 범위 및 조건)의 수많은 변화 및 조합이 있다. 이들을 최적화하기 위해 요구되는 것은 단지 논리적이고 일상적인 실험이다.
예 1 - Baker's 이스트 입자 및 정화된 이스트 글루칸 입자에 채워지는(loading) 테르펜의 증명
다음의 프로토콜은, 테르펜이 이스트 세포벽 및 다른 속이 빈 글루칸 입자에 채워질 수 있는 것을 증명하기 위해 수행되었다.
시트랄 및 L-카르본의 에멀션은 테르펜 150㎕과 물에 혼합된 10% Tween 80 100㎕ 및 물 250㎕를 혼합시켜 제조되었다.
뉴저지 브랜치버그의 사보리 시스템 인터내셔널(Savory Systems International, Inc.)의, Baker's 이스트 입자(YP) 또는 Levacan™이스트 글루칸 입자(YGP)는 250㎎/㎖ 현탁액을 형성하기 위해 물과 혼합되었다.
YP 또는 YGP 현탁액 500㎕와 테르펜 에멀션 250㎕이 함께 혼합되었고, 일정한 교반(agitation)하에 밤새 배양되었다. YP 또는 YGP 현탁액 500㎕와 물 500㎕이 대조구로서 사용되었다. 입자는 그런 다음 외부 에멀션이 없어질 때까지 물로 세척되었다. 입자 조제약은 그런 다음 건조될 때까지 냉동되고 냉동 건조되었다.
상기 입자는 그런 다음 다시 수화되고, 광 현미경으로 조사되었다.
그 결과는 도 1 내지 4에 도시된다.
도 1은 중심에 어두운 영역을 갖는 구형 구조를 도시하는데, 이들은 속이 빈 글루칸 입자이다. 도 2 및 도 3은 광 착색된 내부를 갖는 팽창한 외형을 갖는 구형 구조를 도시하는데, 이들은 중심 공동에 테르펜이 캡슐화 되어있는 입자이다 - 도 2에 시트랄 및 도 3에 L-카르본. 도 2 및 도 3에서, 유리 테르펜의 작은 얼룩(blobs)은 또한 예를 들어 도 2의 상단에서, 중간의 바로 좌측에서 볼 수 있다. 도 4는 물에 현탁된 테르펜의 작은 기포(blebs)로서 테르펜 에멀션을 도시한다.
예 2 - Baker's 이스트 세포벽(YP)에서 시트랄 및 L-카르본의 최대 채워지는(loading) 레벨의 결정
다음의 프로토콜은 YP에 채워지는 테르펜의 최대량을 결정하기 위해 수행되었다.
- L-카르본 및 시트랄 에멀션은 0.3㎖의 물을 갖는 4,5g의 혼합된 테르펜을 초음파 처리하여(sonicating) 제조되었다.
- 10% Tween-80 용액은 40.5㎖의 물에 혼합된 4.5g의 Tween-80을 초음파 처리하여 제조되었다.
- YP 현탁액은 20㎎/㎖의 현탁액을 형성하기 위해 물과 YP를 섞어서 제조되었다.
- 캡슐화 반응은 표 1에 기재된 바와 같이 설정되었다.
시트랄 또는 L-카르본-물 에멀션은 실온에서 밤새 YP 및 Tween 80 계면활성제와 혼합되었다. 시료는 10분간 14,000 ×g로 원심분리 되었고, 물 층 위에 떠있는 유리 테르펜의 출현이 기록되었다. 그 결과는 표 1의 우측에 분류된 칼럼인 유 리 테르펜에 도시된다.
"유리 테르펜"이라는 표현은 원심분리된 반응 혼합물에 있는 보이는 존재의 테르펜을 말한다. 유리 테르펜의 부재는 입자에 의한 테르펜의 완전한 흡수를 나타낸다. 유리 테르펜의 부재에 의해 증명되듯이, 입자에 의해 흡수된 테르펜의 가장 큰 부피는 흡수된 테르펜 에멀션의 최대 부피로서 기록되었다.
결과에서 볼 수 있는 바와 같이, YP는 10㎎의 YP 당 적어도 16.5㎕의 L-카르본 테르펜 에멀션 또는 적어도 5㎕의 시트랄 에멀션을 흡수 및 캡슐화할 수 있다.
예 3 - 계면활성제로 채워진 개선된 테르펜의 증명 및 최적의 Tween-80:테르펜 비의 결정
다음의 프로토콜은 계면활성제의 존재가 테르펜 채움을 개선시킴을 증명하고, YP 테르펜 채움 반응을 위해 필요한 Tween-80 계면활성제의 최소 레벨을 결정하기 위해 수행되었다.
- L-카르본 및 시트랄 에멀션은 0.3㎖의 물을 가진 4.5g의 테르펜을 초음파 처리하여 제조되었다.
- 10% Tween-80 용액은 40.5㎖의 물에 혼합된 4.5g의 Tween-80을 초음파 처리하여 제조되었다.
- Baker's YP 현탁액은 250㎎/㎖ 현탁액을 형성하기 위해 YP와 물을 혼합하여 제조되었다.
채움 반응은 아래의 표 2에 나타낸 바와 같이 설정되었다.
시트랄 또는 L-카르본-물 에멀션은, 실온에서 밤새 0-10부피%의 Tween 80 계면활성제를 갖는 YP와 혼합되었다. 시료는 10분간 14,000 ×g로 원심분리 되었고, 물 층 위에 부유하는 유리 테르펜의 출현이 기록되었다. 그 결과는 표 2의 우측에 분류된 칼럼인 유리 테르펜에 나타낸다.
"유리 테르펜"이라는 표현은 원심분리된 반응 혼합물에 있는 테르펜의 보이는 존재를 말한다. 유리 테르펜의 부재는 입자에 의한 테르펜의 완전한 흡수를 나타낸다. 유리 테르펜의 부재에 의해 증명되듯이, YP에 의해 흡수된 테르펜의 가장 큰 부피는 흡수된 테르펜 에멀션의 최대 부피로서 기록되었다.
결과에서 볼 수 있는 바와 같이, 농도가 1%인 Tween-80(즉 1000㎕의 반응 혼합물 중에 100㎕의 10% Tween-80)은 위의 반응에서 테르펜의 흡수를 완성시키기에 충분하다. 2%의 Tween-80은 결과에서 어떠한 개선도 보이지 않았지만, 0.33% 농도의 유리 테르펜이 관측되었다. 이것은 다음을 나타낸다:
테르펜이 계면활성제를 함유하지 않은 YP 입자로 흡수되지만, 계면활성제의 존재는 테르펜의 흡수를 상당히 증가시킨다.
농도가 약 1%인 Tween-80은 YP 입자의 테르펜 페이로드를 최대화시키면서 적당한 채움을 보장하기 때문에, YP 채움에 대해 최적화된다.
예 4 - 높은 Baker's 이스트 세포벽 입자(YP) 레벨에서 최대 테르펜 채움 및 캡슐화의 증명
다음의 프로토콜은 높은 YP 레벨에서 YP에 채워질 수 있는 테르펜의 최대량을 결정하기 위해 수행되었다.
- L-카르본 및 시트랄 에멀션은 3㎖의 1% Tween을 갖는 4.5g의 테르펜을 초음파 처리하여 제조되었다.
- 5% Tween-80 용액은 9.5㎖의 물에 혼합된 0.5g의 Tween-80을 초음파 처리하여 제조되었다.
- YP 현탁액은 250㎎/㎖ 현탁액을 형성하기 위해 YP를 물과 혼합시켜서 제조되었다.
- 캡슐화 반응은 표 3에 도시된 바와 같이 설정되었다.
시트랄 또는 L-카르본-물 에멀션은 YP 및 Tween-80 계면활성제와 실온에서 밤새 혼합되었다. 시료는 10분간 14,000 ×g로 원심분리 되었고, 물 층 위에 부유하는 유리 테르펜의 출현이 기록되었다. 그 결과는 표 3의 우측에 분류된 칼럼인 유리 테르펜에 나타낸다.
"유리 테르펜"이라는 표현은 원심분리된 반응 혼합물에 있는 테르펜의 보이는 존재를 말한다. 유리 테르펜의 부재는 YP에 의한 테르펜의 완전한 흡수를 나타낸다. 유리 테르펜의 부재에 의해 증명되듯이, YP에 의해 흡수된 테르펜의 가장 큰 부피는 흡수된 테르펜 에멀션의 최대 부피로서 기록되었다.
표 3의 결과에서 볼 수 있듯이, YP는 높은 YP 농도에서 테르펜을 흡수하고 캡슐화할 수 있다. YP는 125㎎의 YP 당 적어도 112.5㎕의 L-카르본 테르펜 에멀션 또는 적어도 75㎕의 시트랄 에멀션을 흡수했고 캡슐화했다. 이것은 테르펜 캡슐화 반응이 테스트된 범위 내에서 YP 농도에 무관하다는 것을 증명한다.
예 5 - 테르펜 흡수를 위한 시판되는 입자의 선별
다음의 프로토콜은 상이한 유형의 입자의 채움 특성을 분석하기 위해 수행되었다. 연구된 입자는 Baker's Yeast Cell Wall Particles(미주리, 세인트루이스에 있는 Sigma chemical Corp.), Nutrex™Walls(위스콘신, 밀워키에 있는 Sensient Technologies), SAF-Mannan™(미네소타, 미니애폴리스에 있는 SAF Agri.), Nutricept Walls™(미네소타, 번스빌에 있는 Nutricept Inc.™), Levacan™(뉴저지, 브랜치버그에 있는 Savory Systems International, Inc.) 및 WGP™(메사추세츠, 워세스터에 있는 Alpha-beta Technology, Inc.)였다.
L-카르본 및 시트랄 에멀션은 7g의 테르펜 + 3㎖의 3.3% Tween-80을 초음파 처리하여 제조되었다.
표 4는 ㎎ 당 이스트 입자의 수, 및 패킹된(packed) 고체의 중량/부피 비와 함께 순도를 비교한다.
표 4로부터, ㎎ 당 입자의 수가 순도와 반비례한다고 결론 내릴 수 있다. 따라서 WGP의 ㎎ 당 입자의 수는 Baker's YP보다 거의 10배 높다.
YP 현탁액은 다음과 같이 제조되었다:
- Baker's 이스트 세포벽 입자 현탁액(YP)은 250㎎ YP/㎖ 1% Tween-80을 혼합하여 제조되었다.
- Nutrex 현탁액은 163㎎ Nutrex YGP/㎖ 1% Tween-80을 혼합하여 제조되었다.
- SAF Mannan 현탁액은 234㎎ Biospringer YGP/㎖ 1% Tween-80을 혼합하여 제조되었다.
- Nutricepts 현탁액은 99㎎ Nutricepts YGP/㎖ 1% Tween-80을 혼합하여 제조되었다.
- Levacan 현탁액은 217㎎ Lev YGP/㎖ 1% Tween-80을 혼합하여 제조되었다.
- WGP 현탁액은 121㎎ WGP YGP/㎖ 1% Tween-80을 혼합하여 제조되었다.
위의 입자의 패킹된 부피는 동일하며, 이것은 동일한 수의 입자가 분석되었다는 것을 의미한다.
채움 반응은 표 5에 나타낸 바와 같이 설정되었고, 밤새 배양되도록 두었다. 시료는 10분간 14,000 ×g로 원심분리 되었고, 물 층 위에 부유하는 유리 테르펜과, 펠릿의 캡슐화된 테르펜의 칼라의 출현이 기록되었다. 그 결과는 표 5의 두 개의 우측 칼럼에 나타낸다. 유리 테르펜의 부재에 의해 증명되듯이, 입자에 의해 흡수된 테르펜의 가장 큰 부피는 흡수된 테르펜 에멀션의 부피로서 기록되었다.
결과로부터, 다음의 결론에 도달하였다:
- 지질 함량이 낮은 정화된 입자는 테르펜을 흡수하는데 있어서 덜 효과적이었다.
- 순도가 낮은 입자는 테르펜을 흡수하는데 있어서 보다 효과적이었다.
- 시트랄의 노란색 분해 생성물은 SAF-Mannan™에서 캡슐화되는 경우 형성되지 않았다.
- 테스트된 단일 테르펜 레벨에서 성질상의 채움에 기초하여, SAF-Mannan™가 최고로 나타났고, Nutrex™이 2위, 그리고 Baker's가 3위였다.
예 6 - 다양한 유형의 입자에 채워지는 테르펜의 키네틱 에너지 및 상이한 배양 온도
다음의 프로토콜은 이스트 입자의 다양한 유형의 채움 키네틱(loading kinetics)을 비교하기 위해 채택되었다.
L-카르본 및 시트랄 에멀션은 3㎖의 3.3% Tween-80을 갖는 7g의 테르펜을 초음파 처리함으로써 제조되었다.
1% Tween-80 용액은 10㎖의 물에 혼합된 1㎖의 10% Tween-80을 초음파 처리함으로써 제조되었다.
- Baker's YP는 20㎖의 1% Tween-80에 5g의 Baker's YP를 혼합하여 제조되었다.
- Nutrex™YGP 현탁액은 20㎖의 1% Tween-80에 2g의 Nutrex™YGP를 혼합하여 제조되었다.
- SAF Mannan™현탁액은 20㎖의 1% Tween-80에 2g의 SAF Mannan™를 혼합하여 제조되었다.
채움 반응은 표 6에서와 같이 설정되었다.
상기 반응은 1, 3, 6, 9 및 24시간 동안 실온 또는 37℃에서 배양되었다. 배양 이후에 시료는 10분간 14,000 ×g로 원심분리 되었고, 물 층 위에 부유하는 유리 테르펜의 출현이 기록되었다. 그 결과는 표 6의 두 개의 우측의 칼럼에 도시된다. 유리 테르펜의 부재에 의해 증명되듯이, 상기 입자에 의해 흡수된 테르펜의 가장 큰 부피는 흡수된 테르펜 에멀션의 부피로서 기록되었다. 캡슐화된 펠릿의 착색은 24동안 저장되었다.
표 6에 나타낸 결과 및 다른 관찰로부터, 다음의 결론이 나올 수 있었다.
- 테르펜 채움 반응은 1 내지 3시간 걸린다.
- 테르펜 채움은 실온보다는 37℃에서 더 빠르게 발생한다.
- SAF Mannan™은 두 가지 이유로 인해 바람직한 입자인 것 같다.
- 두 가지 테르펜 모두를 더 빠르고 더 완벽하게 흡수한다.
- 시트랄이 채워지는 경우, 시트랄 분해의 특성인 노란색 착색의 부재에 의해 증명되듯이, 시트랄은 37℃에서 24시간 후에도 안정하게 남아있다,
예 7 - 단일 테르펜 및 입자 채움을 위한 테르펜 조합의 범위의 선별
다음의 프로토콜은 Baker's YP 대 SAF Mannan™의 채움 효력을 비교하기 위해 채택되었다.
테르펜 에멀션은 다음과 같이 제조되었다:
- L-카르본 - 1.5㎖의 3.3% Tween-80에 혼합된 4.5g의 L-카르본.
- 시트랄 - 1.5㎖의 3.3% Tween-80에 혼합된 4.5g의 시트랄.
- 티몰/L-카르본 혼합물(T/L) - 1.5㎖의 3.3% Tween-80에 혼합된 2.25g의 티몰과 2.25g의 L-카르본.
- 유게놀 - 1.5㎖의 3.3% Tween-80에 혼합된 4.5g의 유게놀.
- 게라니올 - 1.5㎖의 3.3% Tween-80에 혼합된 4.5g의 게라니올.
- 시트랄/L-카르본/유게놀 혼합물(C/L/E) - 1.5㎖의 3.3% Tween-80에 혼합된 1.5g의 시트랄, 1.5g의 L-카르본, 1.5g의 유게놀.
0.75:0.3:0.05의 비율인 테르펜:물:계면활성제로 이루어진 에멀션이 이러한 실험을 위해 사용되었다.
테르펜 에멀션은, 표 7 및 8에 나타낸 바와 같이, 이들의 부피를 증가시키면서, 250㎎/㎖의 Baker's YP 또는 250㎎/㎖의 SAF Mannan™와 실온에서 밤새 혼합되었다. 시료는 10분간 14,000 ×g로 원심분리 되었고, 수층 위에 부유하는 유리 테르펜의 출현이 기록되었다. 유리 테르펜의 부재에 의해 증명되듯이, Baker's YP 또는 SAF Mannan™에 의해 흡수된 테르펜 에멀션의 가장 큰 부피는 흡수된 테르펜 에멀션의 부피로 기록되었다. 펠릿에서의 캡슐화된 테르펜의 색상이 기록되었다. 표 7 및 8의 결과는 모든 단일 테르펜 및 테르펜 조합이 Baker's YP 또는 SAF Mannan 입자 모두에 효과적으로 채워지는 것을 보여준다.
전환 = 상부에서의 상 전환된-고형 플로팅(phase inverted-solids floating on top)
- no free oil; W = 흰색; Y = 노란색.
이 결과로부터, 다음의 관찰이 나왔다 :
- 모든 테르펜은 Baker's YP 및 SAF Mannan에 채워지는 것으로 보였다.
- SAF Mannan은 Baker's YP보다 더 큰 테르펜 채움 용량을 갖는다.
- 두 가지 및 세 가지 테르펜의 혼합물 또한 효과적으로 채워지는 것으로 보인다.
- 테르펜 유게놀은, 이들이 펠릿과 결합되었기 때문에, 입자 및 물보다 더 높은 밀도를 갖는다.
- SAF Mannan에 대하여, 더 높은 채움 레벨 및 더 가벼운 입자는 시트랄 및 게라니올에 대해 수층의 표면상에 부유하는 채워진 입자를 초래한다.
- 시트랄은 SAF Mannan에 의한 산화로부터 보호되었지만, Baker's YP에 의한 산화로부터는 보호되지 못했다.
각각의 입자 유형에 대한 대략적인 최대 채움이 결정되었고 아래의 표 9 및 10에 도시된다. 채워진 백분율은 존재하는 입자의 양에 대한 채워진 테르펜의 양의 비(중량 대 중량)를 나타낸다.
예 8 - 수성 에멀션 및 캡슐화된 테르펜 제형에서의 테르펜 안정성의 측정
테르펜 안정성은, 노란색으로 착색된 산화 생성물의 형성에 대한 시트랄 제형의 관찰에 의해 평가되었다. 표 5-8에서 우측의 칼럼에 나타낸 바와 같이, 시트랄 에멀션 및 시트랄 캡슐화된 Baker's YP는 시간이 지남에 따라 점점 노란색으로 변했다. 그러나 SAF Mannan™에서의 시트랄 캡슐화는, 시간이 지남에 따라 노란색의 감소 또는 부재에 의해 증명되듯이, 시트랄 안정도를 증가시켰다.
예 9 - 최소의 물에 혼합된 테르펜의 채움
다음의 프로토콜은, 테르펜 채움 및 YP로의 캡슐화가, 유동층 건조제로의 채워진 제형의 직접적인 사출 성형을 허용하는 매우 높은 이스트 입자(YP) 고체에서 수행될 수 있는 가능성을 평가하기 위해 수행되었다. SAF Mannan™ 입자를 완전히 수화시키기 위한 최소량의 물은 고체(g) 당 3.53g의 물로 결정되었다. 이것은 하이드로다이나믹 부피(HV) 또는 입자의 물 흡수 용량을 한정한다. 입자를 수화시키는 이러한 레벨의 물에서, 틱소트리피한(thixotropic), 즉 마요네즈처럼 전단 응력이 약한, 굳은 도우(dough)의 경도(consistency)를 갖는다. 상기 HV의 최대 40%의 물의 첨가는 두꺼운 유동 가능한 페이스트를 초래한다. 위의 시료에 사용되었던 표준 반응은 3 X HV 물에서 수행되었다.
일련의 테르펜(L-카르본) 채움 반응은, 입자:테르펜:Tween(1:0.44:0.04)의 비를 일정하게 유지하면서, 그리고 HV(3.53g)로부터 HV + 40%의 물(4.92g)로 시스템에서의 물의 양을 변화시키면서 수행되었다. 제어는 3 X HV의 물, 단지 입자 및 단지 테르펜 반응을 사용하는 표준 채움 시스템이었다. 밤새 배양한 이후에, 혼합물 시료는 유리 테르펜 및 입자로의 테르펜 흡수의 증거에 대해, 그리고 15분에 걸쳐서 전환된 튜브에서의 유동을 평가함으로써 물질 유동 특성에 대해 현미경에 의해 평가되었다. 게다가 프리 오일의 존재는, 입자의 완전한 분산, 및 입자로 캡슐화된 테르펜을 침전시키기 위한 원심분리를 얻기 위해 와동시키면서, 5 X HV와의 반응 혼합물을 수화시킴으로써 평가되었다. 결과는 표 11 및 도 7 내지 12에 도시된다. 도 7 내지 12는 다음 튜브의 채움 결과를 나타낸다:
도 7 - 튜브 3
도 8 - 튜브 5
도 9 - 튜브 6
도 10 - 튜브 8
도 11 - 튜브 10
도 12 - 튜브 11
표 11 및 도 7 내지 12에 도시된 결과는, 테르펜 채움 및 입자로의 캡슐화가 측정된 모든 물의 비에서 발생했음을 입증한다. 놀랍게도, 채움 반응이 입자를 수화시키기 위한 물의 최소량을 사용하는 굳은 도우의 경도에 의한 반응에서 일어난 경우에서조차 동등한 채움이 발생했다. 유리 테르펜의 부재는, 단지 테르펜 대조구와 비교되어, 상청액(supernatants)의 혼탁도의 눈에띄는 감소에 의해 증명되는 것처럼, 상청액에 있는 테르펜의 낮은 레벨에서, 현미경으로 관찰되었다(도 7 내지 12).
이러한 결과는 속이 빈 글루칸 입자로의 테르펜을 채우기 위한 조건에 대한 우리의 이해를 확장시킨다. 채움 공정 동안 입자를 수화시키기 위해 최소량의 물을 사용하는 유연성은, 반응 혼합물이 표준 식품등급 침투 표면 도우 믹서를 사용하는 전성이 있는 도우와 같은 경도인 조건 하에서 테르펜의 채움을 허용할 것이다. 최종 매우 고체인 테르펜 채워진 혼합물의 경도는 유동 층 건조를 위한 누들 및 펠릿을 형성하기 위해 직접 사출 성형에 적합하다.
이러한 방식으로 제품을 대형화하기 위한 적합한 설비가 요구될 것이다:
- 가울린 균질기(Gaulin homogeniser), 또는 적합한 테르펜 에멀션을 생성하기 위한 동등물.
- 침투 표면 도우 혼합 탱크.
- 사출성형기
- 유동 층 건조기.
예 10 - 재-수화되는 경우 테르펜 성분 분산을 캡슐화하는 건조된 속이 빈 글루칸 입자에서 분산을 돕기 위한 하이드로콜로이드제의 측정
다음의 프로토콜은, 수화되는 경우 분산시키기 위한, 테르펜 제형을 캡슐화하는 건조된 속이 빈 글루칸 입자를 증가시키는 세포 사이의 하이드로콜로이드의 효과를 측정하기 위해 채택되었다.
SAF Mannan™ 입자
0.1% Tween80
L-카르본
크산탄 고무 - 0.1% Tween80에 혼합된 1%(w/v)
물에 혼합된 건조된 속이 빈 글루칸 입자 캡슐화의 L-카르본 분산제에 대한 증가하는 크산탄 고무 레벨의 효과는, 표 12에 나타낸 바와 같이 0-1% 크산탄 고무를 함유하는 1g의 SAF Mannan 및 4.4g 0.1% Tween80을 갖는 1.1g의 L-카르본 에멀션(L-카르본:물:계면활성제의 비는 0.75:0.3:0.05)을 배양함으로써, SAF Mannan로의 L-카르본 에멀션에 의해 평가되었다.
표 12 및 도 13 내지 20의 결과는, 테르펜이 캡슐화된 입자의 건조 동안 고분자량인 하이드로콜로이드의 함유가 균일한 현탁액으로의 미세입자의 수화 및 분산에 도움을 준다는 것을 보여준다. 그러한 하이드로콜로이드제의 다른 예는 말토덱스트린, 알지네이트 등이 있다.
또한 채워진 테르펜의 안정성을 증가시키고 테르펜의 억제된 방출을 제공하기 위해서, 펠릿 코팅을 포함하는 것이 바람직할 수 있다.
예 11 - 테르펜 에멀션, 즉 신선한 Baker's YP 및 SAF Mannan 캡슐화된 테르펜, 및 냉동-건조된 Baker's YP 및 SAF Mannan 캡슐화된 테르펜의
S.aureus
에 대한 최소 억제 농도(MIC)의 측정
신선한 것 대 냉동건조된 속이 빈 글루칸 입자 캡슐화된 테르펜 제형의 MIC를 비교하기 위해 수행된 프로토콜의 결과는 아래의 표 13에 도시된다. 단일 테르펜 에멀션 또한 테스트되었고, 그 결과는 비교로서 도시된다.
위의 결과로부터 도출된 결론은 다음과 같은다:
- 속이 빈 글루칸 입자로의 테르펜 채움은 테르펜 MIC를 향상시키는 것으로 보인다. 일반적으로 신선한(fresh) 테르펜 에멀션은 캡슐화된 제형보다 ~ 4 - 375배 미만의 효능이 있다.
- SAF Mannan™에서의 채워진 테르펜은 Baker's YP보다 약간 더 잘 수행한다.
- 신선하게 채워진 테르펜 조성물은 냉동 건조된 조성물보다 약간 더 잘 수행된다(냉동건조 동안 조성물의 건조로부터 테르펜의 약간의 증발이 있을 수 있음).
- 수성 에멀션에서의 테르펜은 적어도 3주간 안정하다.
예 12 - 시험적인(pilot) 식물 규모에서
S.aureus
에 대한 캡슐화된 테르펜의 효능
항균제 분석은 S.aureus에 대해 시험적인 식물 규모에서 생성된 캡슐화된 테르펜 및 혼합물에 의해 수행되었다. 신선하고 냉동 건조된 캡슐화된 테르펜 시료 모두 강한 항균성 활성을 입증했다. 그 결과는 아래의 표 14에 요약된다.
테르펜은 2.5Kg 규모에서 SAF Mannan™으로 캡슐화되었다. 세 개의 테르펜 혼합물(게라니올, 275g; 유게놀, 385g; 및 티몰, 440g)이 100g의 Tween-80 및 8L의 물과 함께 용해되었고 균질화되었다. SAF Mannan™(2.5kg)은 균질한 현탁액을 형성하기 위해 첨가되었다. 상기 현탁액은 입자 크기를 감소시키기 위해 가울린 균질기(Gaulin homogenizer)를 통과했고, 그 균질물은 실온에서 밤새 배양되었다. 캡슐화된 테르펜의 시료는 제거되었고, 실온엔서 저장되었다. 남아있는 캡슐화된 테르펜은 그런 다음 접시(trays)에서 냉동되고 냉동 건조되었다. 냉동 건조된 캡슐화된 테르펜 분말은 분쇄되었고 실온에 저장되었다.
시험적인 식물 규모에서, 신선하고 냉동 건조된 시료 모두 w/w 테르펜 주성분과 동일한 효과가 있었다.
큰 규모의 제조 결과에 기초하여, S.aureus에 대한 냉동 건조된 제형의 예상된 유효량은 200ppm{상기 제형은 ~ 50% 테르펜(w/w)을 함유함} 또는 0.2g/L 물이다.
예 13 - 미코박테리아에 대한 캡슐화된 테르펜의 효능
테르펜 에멀션은 다음과 같이 제조되었다:
1. 시트랄 - 1.5㎖의 3.3% Tween-80에 혼합된 4.5g의 시트랄.
2. L-카르본/유게놀 - 1.5㎖의 3.3% Tween-80에 혼합된 2.25g의 L-카르본 및 2.25g의 유게놀.
3. 유게놀 - 1.5㎖의 3.3% Tween-80에 혼합된 4.5g의 유게놀.
4. 게라니올 - 1.5㎖의 3.3% Tween-80에 혼합된 4.5g의 게라니올.
5. 게라니올/티몰 혼합물 - 1.5㎖의 3.3% Tween-80에 혼합된 2.25g의 게라니올 및 2.25g의 티몰.
6. 대조구 에멀션 - 6㎖의 1% Tween-80.
SAF Mannan™(2.5g)은 3㎖의 각각의 에멀션 및 7㎖의 1% Tween 80과 혼합되었고, 테르펜 및 테르펜 혼합물을 캡슐화하기 위해 밤새 배양되었다. 캡슐화된 테르펜 제형은 냉동되었고 냉동건조되었으며, 분말은 미세한 분말로 분쇄되었다. 캡슐화된 테르펜(25㎎/㎖)의 현탁액 및 캡슐화되지 않은 테르펜 에멀션이 미코박테리아에 대한 항균 활성에 대해 분석되었다. 그 결과는 표 15에 나타낸다.
예 14 - 캡슐화된 테르펜의 선충류 활성
시트랄을 캡슐화하는 이스트 세포벽의 조제약은 앞서 기술된 절차에 따라 제조되었다. 속이 빈 글루칸 입자는 17.5%의 시트랄을 함유했고, 상기 입자는 테스트 조제약에 1000ppm의 농도로 존재했다. 이것은 테르펜이 효과적으로 175ppm의 농도로 존재한다는 것을 의미한다.
1.0㎖의 테스트 조제약은 뿌리혹선충(root-knot nematodes)을 함유하는 0.1 내지 0.15㎖의 물에 첨가되었다. 1.0 물이 대조구로서 선충류에 첨가되었다.
앞서 기술한 바와 같이 관찰이 행해졌고, 24 및 48 시간 이후에 제거 속도가 분석되었다(즉 치사율). 아래의 표 16에 도시된 결과는 2세트의 생성물의 평균이다.
그 결과는 속이 빈 글루칸 입자 캡슐화된 테르펜이, 단지 175ppm의 시트랄 농도에 해당하는, 1000ppm의 입자 농도에서 뿌리혹선충에 효과적임을 입증한다.
따라서 테르펜을 캡슐화하는 속이 빈 글루칸 입자는, 살선충제(nematicides)로서, 용액에 혼합되어 있거나 계면활성제를 갖는 테르펜만큼 효과적인 것으로 보인다. 용액에 혼합되어 있거나 계면활성제를 갖는 테르펜에 대한 경우와 같이, 속이 빈 글루칸 입자 내의 테르펜 농도가 더 높아질수록, 또는 입자의 농도가 높아질수록, 훨씬 더 높은 치사율을 초래하는 것으로 예상될 수 있다.
예 15 - 캡슐화되거나 캡슐화되지 않은 균류 특성
다음의 프로토콜은, 여러 가지 테르펜 조성물의 살균 특성을 분석하기 위해, 그리고 캡슐화된 조성물 및 캡슐화되지 않은 조성물의 효능을 비교하기 위해 수행되었다.
상이한 테르펜 제형의 항-진균 특성의 분석
마이크로타이터(microtitre) 플레이트 분석이 상이한 병원성 유기물에 대한 테르펜 화합물의 범위의 최소 억제 농도(MIC)를 분석하기 위해 사용되었다. 각각의 유기물에 대해 사용된 분석은 뒤에서 상세하게 설명되지만, 중요한 일반적인 특징은 다음과 같다.
분석은 정지 상태(생장 억제)와 제거(죽이는 것) 활성 사이를 구별하기 위해 두 개의 배양 기간을 사용한다. 제 1 배양 기간은 생장 억제의 평가를 허용하지만, 그저 생장의 예방과 세포의 죽음을 구별할 수 없다. 제 2 배양 기간의 목적은, 테르펜에 대한 노출에서 살아남은 임의의 정지해 있거나 억제된 세포가 증식할 수 있는 충분한 시간 및 영양소를 허용하는 것이다. 정진균(fungistatic) 영향에 의해 억제되었던 임의의 세포는 제 2 배양 기간 동안 반응하고 생장할 수 있는 반면에, 테르펜에 대한 노출에 의해 죽었던 세포들은 신선한 매질에서도 자라지 못할 것이다.
초기 선별 실험은 총 31개의 상이한 테르펜 제형(표 17)을 사용하여 수행되었다. 이러한 실험은 매우 활성인 테르펜 제형의 서브셋(subset)을 사용하여 반복되었다(표 18).
글루칸 입자 내에서 캡슐화된 2:1:2의 비인 테르펜 게라니올, 유게놀 및 티모의 조합 또한 테스트되었고; 이러한 시료는 YP-GET로서 언급될 수 있다. 캡슐화되지 않은 동일한 비의 게라니올, 유게놀 및 티몰 조합이 캡슐화된 형태와 비교를 위해 테스트되었다.
Saccharomyces cerevisiae
를 사용한 MIC 분석
S.cerevisiae(YPD 생장 매질에서의 5 ×105세포/㎖)가 100㎕ 시료(aliquots) 로 96-웰(well) 마이크로타이터 플레이트의 각각의 웰에 첨가되었다. 플레이트 당 적어도 하나의 칼럼은 단지-세포만 있는 대조구로서 설계되었고, 이 웰에는 테르펜도 첨가되지 않았다. 상이한 테르펜 제형의 시료(100㎕)는 남아있는 칼럼의 첫번째 열에 첨가되었고, 연속적인 2-배 희석은 하나의 열로부터 총 7번에 걸쳐 다음 열로 100㎕를 이동함으로써 수행되었다. 최종적으로, 모든 웰이 동일한 부피를 함유하는 것을 보장하기 위해, 마지막 열로부터 100㎕가 버려졌다. 마이크로타이터 플레이트는 30℃에서 밤새 정적으로 배양되었다.
배양 이후에, 플레이트는 생장 억제에 대해 기록되었다(혼탁의 부족에 의해 입증됨). 생장 억제(≥75%)는 현미경에 의해 시각적으로 확인되었다.
일단 각각의 제형에 대해 MIC가 결정되고나서, 마이크로타이터 플레이트는 원심분리되고, 사용된 매질은 혼탁하지 않은 웰로부터 제거되었다. 세포는 신선한 매질(100㎕)에서 다시 현탁되었고(resuspended), 플레이트는 30℃에서 밤새 재-배양되었다. 생장 억제의 평가는 앞에서와 같이 수행되었다.
혼합된 접종물(inoculum)을 사용한 MIC 분석
상이한 테르펜 제형은 S.cerevisiae에 대해 기술된 바와 같이, 96-웰 마이크로타이터 플레이트에서 연속적으로 희석되었다. 그런 다음 용융된 YPD 한천배지가, 5㎕의 혼합된 접종물(곰팡이 난 포도 잎으로부터 5 ×104세포/㎖의 농도로 제조됨) 함께 웰에 첨가되었다. 플레이트는 실온에서 24시간 동안 정적으로 배양되었고, 포자 생장은 현미경에 의해 시각적으로 평가되었다.
고체 매질의 사용으로 인해, 신선한 매질에서의 제 2 배양 기간은 수행되지 않을 수 있다.
Colletotrichum graminicola
를 사용한 MIC 분석
상이한 테르펜 제형은 S.cerevisiae에 대해 기술한 것처럼, 96-웰 마이크로타이터 플레이트에서 연속적으로 희석되었다. C.graminicola(300포자/웰)은 희석된 테르펜에 첨가되었고, 플레이트는 실온에서 48시간 동안 정적으로 배양되었다. 포자 발생 및 생장은 현미경에 의해 시각적으로 평가되었다.
일단 각각의 제형에 대해 MIC가 결정되고나서, 마이크로타이터 플레이트는 원심분리되었고, 사용된 매질은 생장-억제된 웰로부터 제거되었다. 포자는 신선한 매질(100㎕)에 다시 현탁되었고, 플레이트는 실온에서 밤새 재-배양되었다. 생장 억제의 평가는 앞에서와 같이 수행되었다.
NT, 테스트되지 않음; YP-GET, 이스트-캡슐화된 GET 제형.
a 테르펜 조합은 달리 지시되지 않는 경우 1:1(w/w) 비로 혼합되었다.
b 테르펜 함량에 의해 산출된 MICs
NT, 테스트되지 않음; YP-GET, 이스트-캡슐화된 GET 제형.
주의: 시료는 복제되어 분석되었다. 만일 복제 시료 사이에 상이한 값이 얻어지는 경우, 더 높은 값이 제공되었다. 어떠한 복제 시료도 2배 이상의 희석액에 의해 다르지 않았다.
a 테르펜 조합은 달리 지시되지 않는 경우 1:1(w/w) 비로 혼합되었다.
b 1 ×104세포/㎖ 보통의 현탁액.
c 테르펜 함량에 의해 산출된 MICs.
혼합된 접종물
혼합된 접종물(inoculum)을 사용하는 것은 많은 문제가 있다. 조제약 사이의 포자 함량의 다양성은 불충분한 분석 재현성을 초래하고, 오염 유기물의 증가는 포자 발아의 기록을 방해한다. 단일세포로 된 이스트 종은 특히 포자 생장을 방해한다는 점에서 특히 문제가 된다. 비록 정확한 데이터가 이러한 평가로부터 얻어질 수 없을지라도, 테르펜의 억제 효과는 관찰되었다.
포자의 동질화는, 많은 수의 포자가 사용되기 때문에, 초기 선별 평가 동안 보다는 반복 평가의 기록 동안에 보다 쉽다(약 50/웰 대 약 10/웰). 따라서, 반복 평가 동안 얻어진 데이터는 MIC의 보다 확실한 평가를 제공할 수 있다.
Colletotrichum graminicola
선별 평가와 비교하여 반복 평가로부터 얻어진 일반적으로 더 높은 MIC 값은 다음과 같은 이유 때문이다:
- 1주간 테르펜 용액의 사용
- 초기 선별 평가에서 사용된 것보다 더 높은 생존능력을 가지며, 따라서 제거하기 보다 어려운, 새롭게 제조된 포자를 사용.
유리 에멀션으로서 테르펜 제형과, 속이 빈 글루칸 입자로 캡슐화되는 경우 동일한 테르펜 제형과의 비교:
Saccharomyces cerevisiae
MIC 분석
YPD 생장 매질(100㎕)이 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 각각의 웰에 첨가되었고, 상이한 테르펜 제형의 시료가 제 1 열에 첨가되었으며, 이러한 열에 200㎕의 총 부피가 제공되었다. 하나의 칼럼은 단지-세포만 있는 대조구로서 지정되고, 테르펜은 이러한 웰에 첨가되지 않았다. 연속적인 2-배 희석은 하나의 열로부터 그 다음의 열로 총 7번에 걸쳐 100㎕를 옮기면서 수행되었다. 최종적으로, 100㎕는, 모든 웰이 동일한 부피를 함유하는 것을 보장하기 위해 마지막 열로부터 버려졌다. S.cerevisiae(YPD 생장 매질에서 5 ×105세포/㎖)은 그런 다음 각각의 웰에 100㎖ 시료로 첨가되었고, 620㎚(A620)에서의 흡수가 마이크로타이터 플레이트 리더를 사용하여 각각의 웰에 대해 측정되었다. 마이크로타이터 플레이트는 30℃에서 밤새 정적으로 배양되었다.
배양에 이어서, A620은 다시 측정되었고, 플레이트는 생장 억제(≥75%)에 대해 기록되었다. 생장 억제는 현미경에 의해 시각적으로 확인되었다.
유리 테르펜 에멀션에 대하여, 일단 각각의 제형에 대해 MIC가 결정되고 나면, 마이크로타이터 플레이트가 원심분리 되었고, 사용된 매질은 생장-억제 웰로부터 제거되었다. 세포는 신선한 매질(100㎕)에서 재-현탁되었고, 플레이트는 30℃에서 밤새 재-배양되었다. 생장 억제의 평가는 앞에서와 같이 수행되었다.
MIC 및 살진균 MIC 결과값은 표 19에 요약된다.
NT, 테스트되지 않음; YP-GET, 이스트-캡슐화된 GET 제형; YP-ETC, 이스트-캡슐화된 ETC 제형.
a 테르펜 조합은 달리 지시되지 않으면 1:1(w/w)의 비로 혼합되었다.
b 달리 지시되지 않으면 이스트-캡슐화된 제형.
c 테르펜 함량에 의해 산출된 MIC
d 캡슐화되지 않은 에멀션 제형.
테르펜 에멀션 및 이스트-캡슐화된 테르펜 모두에 대해서, MICs는 일반적으로 ≤125ppm이고, 최대 활성 제형은 ~ 60ppm의 생장을 억제한다. 테르펜 에멀션에 대해 얻어진 MIC 값은 이스트-캡슐화된 제형에 대해 얻어진 값과 유사하다. 다른 값이 얻어지는 경우, 이들은 단지 약 2-배 희석만큼 다르다.
다양한 유리 테르펜 에멀션은 생장 억제 MIC에서 살진균성이 있었고, 대부분은 2배 더 높은 희석에서 살진균 활성을 보여준다. 이러한 결과는, 글루칸 입자로 캡슐화된 테르펜이 캡슐화되지 않은 형태만큼 진균류를 제거하는데 적어도 효과적임을 입증한다. 게다가 사용된 캡슐화된 조성물은 4℃에서 45일간 저장되고 부-최적의 테르펜 함량인 ~ 4%(w/w)를 갖기 때문에, 효능이 감소할 수 있다.
살진균 활성을 결정하기 위한 평가는, 웰의 바닥에 세포의 펠릿을 생성함으로써 생장 매질의 임의의 잔여 테르펜으로부터 미생물 세포를 분리하고자 하는, 원심분리 단계를 포함한다. 이러한 펠릿은 그런 다음 신선한 매질에 재-현탁되고, 테르펜의 부재 하에 제 2 시간 동안 배양된다. 그러나 원심분리 단계는 미생물 세포와 이스트 입자를 구별할 수 없어서, 이스트-캡슐화된 테르펜이 사용되는 경우, 세포 펠릿은 또한 테르펜-채워진 이스트 입자를 함유할 것이다. 결과적으로, 이스트 입자 및 미생물 세포 둘 다 신선한 매질에서 재-현탁된다.
이러한 방법론적인 문제는, 다음의 이유로 인해, 앞서 기술된 실험에서 얻어진 결과에 영향을 주는 것으로 고려되지 않는다.
- 이전의 실험에서, 테르펜 에멀션은 테르펜-채워진 이스트 입자 대신에 사용되었고, 살진균 활성은 뚜렷하게 나타났다.
- 캡슐화된 테르펜은 확산에 의해 방출되고, 캡슐화된 테르펜의 농도와 매질 주변에 방출된 테르펜의 농도 사이의 평형은 빠르게 달성된다. 따라서 원심분리 및 신선한 매질에서의 재-현탁 이후에, 생장 매질에서의 방출된 테르펜의 농도는 생장 억제 활성을 필요로 하는 것보다 낮을 것이다.
- 살진균 MIC 웰의 내용물이 고체 한천배지 생장 매질 위를 덮는 경우 생장은 없다. 고체 생장 매질 위를 덮는 경우, 한천배지 플레이트의 큰 부피 전체에 임의의 잔여 테르펜의 확산은 생장 억제를 일으키는 농도보다 매우 낮은 국소적인 테르펜 농도를 초래한다. 살진균 MIC 웰의 내용물로부터 생장의 부족은 따라서 초기 살진균 활성으로 인한 것임에 틀림없다. 대조적으로, MIC가 살진균 MIC보다 더 낮게 얻어지고 MIC 웰의 내용물이 고체 한천배지 생장 매질 위에 덮여지는 경우, 정진균 효과를 나타내는, 생장이 관측된다.
예 16 - 현장 실험을 위한 캡슐화된 테르펜 조성물의 제조
다음의 프로토콜의 목적은 후속적인 현장 실험을 위해 속이 빈 글루칸 입자에 테르펜 조성물을 캡슐화시키는 것이다.
재료 :
티몰{알파-감마사(Alpha-Gamma Corporation)에 의해 공급}
유게놀(알파-감마사에 의해 공급)
게라니올(알파-감마사에 의해 공급)
1% Tween-80(알파-감마사에 의해 공급)
이스트 세포벽 입자
크산탄 고무.
이스트 세포벽 입자는 바이오리진(Biorigin)(브라질, 상파올로)의 상표명 Nutricell MOS 55이고, Acucareira Quata S.A, Usina Quata, Quata - Sao Paolo - Brazil - Zip Code 19780 000에 의해 제조되었다. 입자는 S.cerevisiae의 분무 건조된 세포벽 추출물이고 황갈색에 대한 밝은 베이지의 자유 유동 분말이다.
프로토콜 : 다음의 프로토콜은 1㎏의 입자에 적합하지만, 더 큰 제품을 위해 간단하게 확대될 수 있다.
- 테르펜 혼합물의 제조 - 375g의 게라니올 + 525g의 유게놀 + 600g의 티몰을 섞고, 유리 플라스크에서 휘저어줘라.
- 2갤런의 흰색 버킷에서 62g의 Tween 80을 6.2ℓ의 물에 혼합하여 6.2ℓ의 1% Tween 80을 제조. 용액을 형성하기 위해 혼합하라.
- Tween 용액에 6.2g의 크산탄 고무를 첨가하고 용해되도록 휘저어라.
- 하얀색 버킷에서 폴리트론 믹서(polytron mixer)를 사용하여, 1.5㎏의 테르펜 혼합물 + 6.2ℓ의 1% Tween 80/0.1% 크산탄 고무를 섞어서 테르펜 에멀션을 제조하라.
- 1,000g의 이스트 세포벽 입자를 첨가해라 - 균일한 현탁액을 형성하기 위해 페인트 믹서를 사용하여 섞어라.
- 얇은 마요네즈와 같은 경도를 형성하기 위해 혼합하면서 이스트 세포벽 입자에 단계 4의 테르펜 에멀션을 첨가해라.
- 캔에 테르펜 혼합물을 부은 다음 밤새 배양시켜라.
결론 : 속이 빈 글루칸 입자로 캡슐화된 게라니올, 유게놀 및 티몰은 페이스트로 얻어졌다. 페이스트는 종래의 분무 건조 기술에 의해 건조 분말로 쉽게 변환되었다. 페이스트는 다음의 프로토콜에서 언급된 "액체" 조성물이고, "분말"은 분무 건조된 형태이다.
예 17 - 노균병에 대한 캡슐화된 테르펜 조성물의 현장 실험
포도에서, 노균병은 균류인 Plasmopara viticola에 의해 생기며, 이는 전 세계의 포도밭을 감염시키고 작물 생산량 및 와인 품질에 관하여 포도-재배자를 망연자실케 하는 손실을 초래할 수 있다. 상기 균류는 과일 및 포도나무의 모든 초록색 부분을 공격하여, 잎은 시들고 꽃과 열매는 썩게 된다. 질병은, 짙은, 흰색-회색, 면과 같은 균류의 생장(growth)이 잎 병변(lesions)의 하부를 덮는, 잎의 상단 표면상의 불균일하게 엷은 노란색 또는 노란색-초록색 점(spots)으로서 명백해진다. 열매는 또한 솜털 같은 생장으로 덮여질 수 있고, 감염 시기에 따라, 갈색으로 변하고 부드럽거나 전혀 부드럽지 않을 수 있다. 노균병은 바람 및 비에 의한 포자의 분산을 통해 퍼지게 되며, 감염을 위해 습윤한 조건을 필요로 한다. 특히 습도가 높은 환경에서 문제가 된다. 예방적인 조치는, 살진균제의 조기 적용 이후에 적당한 간격으로 적용을 반복하는 질병의 관리를 필요로 한다. 저항은 일부 치료에 대해 발생하고, 비록 저항의 개발은 상이한 살진균제의 사용을 교대로 함으로써 최소한으로 할 수 있지만, 여전히 문제가 되고 있다.
이러한 실험의 목적은, 포도의 노균병을 예방하기 위해, 액체 또는 분말(분무 건조됨) 제형으로서 공급된 예 16의 캡슐화된 테르펜 제형(YGP-GET)의 효능을 연구하는 것이다.
4개의 인접한 블록(각각 0.1ha 포함)이 Kir-Yianni 포도밭의 위치 20에서 취급되었다.
Kir-Yianni는 300m의 고도에 있는 35ha의 포도밭이다. 북쪽 및 서쪽의 혼합된 오크 숲에 의해 경계가 정해지고, 남쪽과 동쪽의 과수원 및 포도밭이 내려다보인다.
4개의 블록 모두 테르펜 제형의 적용 이전에 복합 제품으로 처리되었다. 2004년 6월 26일에, 4개의 블록 중 2개의 블록은 테르펜 분말 제형이 0.5g/ℓ 또는 2g/ℓ의 양으로 분무되었다(도 21의 개략적인 설명을 참조). 세 번째 블록은 종래의 수화성 황을 더한 보르도 혼합물(Bordeaux mix plus wettable sulphur)로 처리되었고, 나머지 블록은 처리되지 않은 채로 남겨두었다. 각각의 블록의 포도나무는 다음의 주에 걸쳐서 노균병의 증세에 대해 조사되었다.
추가적인 4개의 인접한 블록(각각 0.1ha 포함)이 Kir-Yianni 포도밭의 위치 18에서 취급되었다. 4개의 블록 모두 테르펜 제형의 적용에 앞서서 복합 제품으로 처리되었다. 2004년 6월 26일에, 4개의 블록 중 2개의 블록은 테르펜 액체 제형이 1g/ℓ 또는 4g/ℓ의 양으로 분무되었다(도 21)(주의: 1g의 테르펜 액체 제형의 부피는 1㎖임). 2004년 6월 28일에, 나머지 2개의 블록 중 하나는 처리되지 않은 채로 남겨두고, 다른 하나는, 종래의 노균병 치료약인 Mikal®로 분무되었다. 각각의 블록의 포도나무는 다음의 주에 걸쳐서 노균병의 증세에 대해 조사되었다.
두 개의 위치 모두에 대하여, 테르펜 생성물이 1200ℓ/ha의 양으로 적용되었다.
포도의 다음의 생장 단계가 기록되었다:
- 2004년 3월 26일, 발아
- 2004년 6월 1일, 개화
- 2004년 8월 6일, 베레종(veraison)
본 연구 적용은 베레종 이전에 일어났다.
2004 생장기는 예외적으로 늦어졌으며, 전반적으로 비가 내렸다. 노균병으로부터의 질병 고난(Disease pressure)이 매우 높았고, 보트리티스(botrytis) 레벨이 증가했고, 분말 노균병 고난은 보통이었다. 분말 및 액체 YGP-GET 제형 모두 실온에서 저장되었다. 특별한 저장 조건은 사용되지 않았다.
콤퍼레이터 제품의 상세
분말 제형 실험: 그리스의 Moscholios Chemicals SA에 의해 포장된, 이탈리아의 Manica Spa에 의해 제조된 보르도 혼합물; 수화성 황.
액체 제형 실험: 그리스의 Bayer Hellas SA에 의해 분배된, Bayer CropScience에 의해 제조된 Mikal®(포스틸-알 50%, 폴펫 25%)
콤퍼레이터(comparator) 제품은 다음과 같이 적용되었다:
발아 이전에 15g/ℓ분량으로 한 번 적용한 다음, 6.5g/ℓ분량으로 일 년에 두 번 이상 적용한다. 세 가지 응용 모두에 있어서 1000ℓ/ha의 분무량이 사용되었다.
분말 제형 실험: 보르도 혼합물(2g/ℓ) 및 수화성 황(2.2g/ℓ)이 2004년 6월 26일에 적용되었다.
액체 제형 실험: Mikal(3.2g/ℓ)이 2004년 6월 28일에 적용되었다.
포도나무는 노균병의 증상에 대하여 시각적으로 조사되었다. 질병의 시작은 하나의 잎 당 평균 두 개의 오일 점에 의해 표시되었다. 추가의 점의 출현을 예방하는 치료법은 노균병에 대하여 효과적인 예방을 제공하는 것으로 고려되었다.
결과
YGP-GET 분말 제형(분무 건조됨)
종래의 치료제인 보르도 혼합물은 노균병에 대해 우수한 예방을 제공했다. 노균병의 가벼운 증상은 대조구 포도나무에서 관측되었다. 0.5g/ℓ의 테르펜 제품 농도는 예방되었고, 2g/ℓ의 테르펜 제품 농도는 대조구보다 단지 약간 더 예방되었다. 주의: 이러한 위치에서의 질병 고난은 최근의 살충제 처리로 인해 매우 낮았다.
분말 제형이 매우 미세하여 공기 중에 분산되기 때문에, 이들을 용해하는데 어려움이 있었다. 이것은 제품의 효능에 나쁜 영향을 줄 수 있다.
YGP-GET 액체 제형
4g/ℓ의 분량으로 투여되는 경우, 테르펜 제품은 노출된 캐노피 상에서 노균병에 대해 우수한 예방을 제공했다. 1g/ℓ의 투여량에 의해서는 예방이 제공되지 않았다. 대조구 블록에서 노균병의 심각한 증상이 관찰되었다.
액체 제형은 사용하기 쉽고 향도 좋다.
토론
노균병은 작물 생산량 및 와인 품질에 있어서 이들의 영향으로 인해 포도-재배자에게 손실을 초래할 수 있다. 질병의 관리는, 일단 질병이 발생하면, 감염이 빠르게 퍼질 수 있기 때문에 예방에 관심을 기울여야 한다. 분말 제형으로 분무된 위치에서, YGP-GET는 낮은 투여량(0.5g/ℓ)에서 효능을 나타내지 않았고, 2g/ℓ의 분량은 종래의 치료제보다 덜 효과적이었다. 이러한 위치에서, 최근의 살충제 적용은 낮은 질병 고난을 초래했고, 테르펜 치료의 명백한 효능을 제한할 수 있었다. 그러나 2g/ℓ 미만의 테르펜 제품의 투여량은 부적합한 것으로 고려되었다.
액체 제형이 분무된 위치에서, 노출된 캐노피의 우수한 예방이 4g/ℓ의 높은 분량 레벨에 의해 제공되었다. 이러한 위치에서의 지나치게 생장하는 생장은 외부의 보다 효과적인 치료를 초래했으며, 어린 가지는 내부 캐노피에서의 오래된 생장과 비교했다. 테르펜 제품에 의한 완전한 잎의 적용 범위는, 처리가 식물 전체에 침투되지 않기 때문에 유리하다. 종래의 체계적인 처리제에 대해 사용되는 부피에 걸쳐서 약 30%의 증가는 테르펜 처리를 사용하여 우수한 적용 범위를 달성할 것으로 추측된다.
결론:
YGP-GET 액체 제형의 잎의 적용은 4g/ℓ의 농도에서 노균병을 제어하는데 매우 효과적이었다. 더 낮은 농도인 0.5g/ℓ(분말) 및 1g/ℓ(액체)는 효과적이지 못하다.
예 18 - 맥류흰가루병(powdery Mildew)에 대한 캡슐화된 테르펜 조성물의 현장 실험
포도의 맥류흰가루병은 균류 Uncinula necator에 의해 생기고, 포도나무 생장, 과일 품질 및 포도나무의 월동성의 감소를 초래한다. 와인 포도에 있어서, 열매 중 단지 3%의 감염 레벨이 와인 품질에 영향을 줄 수 있다. 질병은 잎상의 분말 백색 코팅으로 커지는 균류 생장인 작은 하얀색-회색 반점(patches)을 특징으로 한다. 균류 생장은 또한 열매에도 생겨 열매가 갈라질 수 있다. 따뜻하고 축축한 상태를 필요로 하는 노균병과는 달리, 맥류흰가루병은, 축축하지만 비가 내리지 않은 조건을 갖춘 그늘진 영역을 좋아하기 때문에, 건조한 생장기에 문제가 될 수 있다. 맥류흰가루병의 관리를 위해, 살진균제의 초기 적용 이후에 적당한 간격으로 적용을 반복하는 예방 조치가 권고된다.
이러한 연구는 포도의 맥류흰가루병의 예방을 위한 YGP-GET 조성물의 적용의 효능을 연구하기 위한 것이다.
3개의 인접한 블록(각각 0.1ha 포함)은 Kir-Yianni 포도밭의 위치 18에서 취급되었다. 2004년 7월 19일에, 3개의 블록 중 하나는 1회 2㎖/ℓ로 YGP-GET 액체 제형으로 분무되었고, 하나는 처리되지 않은 채로 남겨두었다. 남아있는 블록은 종래의 치료제인 Equesion(2.5g/ℓ), Alliete(0.9g/ℓ) 및 Punch(0.075㎖/ℓ)로 분무되었다(도 22 참고). 각각의 블록에서의 포도나무는 다음 주에 걸쳐서 맥류흰가루병의 증세에 대해 조사되었다.
추가적인 3개의 인접한 블록(각각 0.1ha 포함)은 Kir-Yianni 포도밭의 위치 20에 취급되었다. 2004년 7월 20일에, 3개의 블록 중 하나는 1회 2㎖/ℓ로 YGP-GET 액체 제형으로 분무되었고, 나머지 두 개의 블록은 처리되지 않은 채로 남겨두었다(도 22 참조). 각각의 블록에서 포도나무는 다음 주에 걸쳐서 맥류흰가루병의 증세가 조사되었다.
두 개의 위치 모두에서, 블록은 테르펜 제품의 적용 이전에 복합 제품으로 미리 처리되었다.
모든 테르펜 치료는 완전한 적용 범위를 보장하기 위해 1200ℓ/ha의 양으로 적용되었다.
포도의 다음의 생장 단계가 기록되었다.
- 2004년 3월 26, 발아
- 2004년 6월 1일, 개화
- 2004년 8월 6일, 베레종
연구의 적용은 베레종 이전에 이루어졌다.
2004 생장기는 예외적으로 늦어졌으며 전반적으로 비가 내렸다. 노균병으로 인한 질병 고난은 매우 높았으며, 포도 레벨이 올라갔으며, 맥류흰가루병 압력은 경감되었다.
콤퍼레이터 제품의 상세
위치 20에는 콤퍼레이터 제품이 사용되지 않았다. 위치 18에서 사용된 콤퍼레이터 치료제는 아래에 설명된다.
Punch®(flusilazole 40%), 듀퐁사(DuPont).
2004년 7월 19일에, 제조업자의 지시에 따라 맥류흰가루병에 대한 예방적인 치료제로서, Punch가 1회 0.075㎖/ℓ로 적용되었다.
추가 제품의 상세
추가 제품은 위치 20에서 사용되지 않았다. 위치 18에서 사용된 추가 제품은 아래에 설명된다.
Equesion 시스템(famoxadone 22.5% + cymoxanil 30%)
Alliete{포세틸-알(fosetyl-al 80%}
2004년 7월 19일에, Equesion(2.5g/ℓ) 및 Alliete(0.9g/ℓ)가 노균병에 대한 예방적인 치료제로서 적용되었다. 분량은 제조업자의 지시에 따라 결정되었다.
콤퍼레이터 및 추가 제품은 통합된 해충 관리 스케쥴에 있는 종래 처리제를 나타낸다.
포도나무는 맥류흰가루병의 증상에 대해 시각적으로 조사되었다.
결과:
위치 18
대조구 블록에서 꽃자루 및 줄기의 약 20%가 검게 변했으며, 이는 맥류흰가루병으로부터의 적당한 감염을 보여준다. 종래의 치료제 블록과 테르펜-처리된 블록 모두에서, 줄기와 다발 모두 초록색이었으며, 이는 적합한 예방이 제공되었음을 보여준다.
위치 20
맥류흰가루병의 증거는 블록 어디에서도 관찰되지 않았다.
추가 관찰
생장기가 끝날 무렵에는, 위치 18 및 20에서의 블록이 통상적으로 포도밭의 나머지 부분보다 질병으로 인한 스트레스를 덜 보여줬다.
맥류흰가루병 감염은 포도나무 생장, 과일 품질 및 포도나무의 월동성(winter hardiness)이 감소하기 때문에 재배자에게 상당한 손실을 초래한다. 더군다나, 와인 품질은 열매의 3%만큼 작은 감염 레벨에 의해 영향을 받을 수 있다. 질병의 관리는, 일단 질병이 발생하면, 감염이 빠르게 퍼질 수 있기 때문에, 예방에 관심을 기울여야 한다. 이러한 연구에서, 테르펜 제품 YGP-GET의 적용은 위치 18에서 맥류흰가루병 감염을 효과적으로 예방했으며, 테르펜 제품에 의해 나타난 제어는 종래의 치료에 의해 제공된 제어와 동등하다. 그러나 위치 20으로부터의 결과는, 맥류흰가루병 감염의 결핍으로 인해 결론에 이르지 못했다. 이러한 감염의 결핍은 낮은 질병 고난을 초래하는, 연구 이전의 살충제의 광범위한 적용 때문인 것 같다.
위치 18 및 20에서의 질병으로 인한 스트레스의 더 낮은 레벨은, 이러한 위치에 적용된 초기 테르펜 치료제가 오랜 시간동안 감염을 제어하는데 유리할 수 있다는 것을 암시한다.
결론:
YGP-GET는, 종래의 치료제에 의해 제공된 제어 레벨과 동일하게, 맥류흰가루병을 효과적으로 예방했다.
예 18 - 맥류흰가루병에 대한 캡슐화된 테르펜 조성물의 추가 현장 실험
본 연구는 추가로 Grimson Seedless 테이블 포도(table grapes)에서 맥류흰가루병의 치료를 위한 YGP-GET의 효능을 연구하는 것을 목적으로 한다. Tsigaras 포도밭(Kir-Yianni 포도밭의 남쪽 약 80㎞)의 0.1ha 소구획은 2004년 7월 1일에 Cisteine의 적용 동안 부주의하게 처리되지 않은 채로 남겨두었다. 이러한 소구획의 포도나무는 결과적으로 잎, 줄기 및 포도에 맥류흰가루병의 증상이 심각하게 나타났다. 2004년 7월 12일에, 처리되지 않은 소구획은 1200ℓ/ha의 비로 3㎖/ℓ의 YGP-GET 액체 제형이 분무되었고, 나머지 포도밭은 콤퍼레이터 제품인 Rogana가 분무되었다. 포도나무는 24시간 후에 맥류흰가루병의 증상에 대해 평가되었다.
포도나무는 높은 라이어 트렐리스(lyre trellis) 시스템으로 훈련되었다.
콤퍼레이터 제품의 상세
BASF(그리스, 아테네의 BASF Agro Hellas S.A.)에 의해 제조된 Rogana(fenbuconazol 5%, binocap 16%)
2004년 7월 12일에, Rogana는 맥류흰가루병에 대한 치료제로서 Tsigaras 포도밭에 적용되었다. 분량은 제조업자의 지시에 따라 결정되었다.
포도나무는 맥류흰가루병의 증상에 대해 시각적으로 조사되었다.
결과
YGP-GET의 적용 이전에, 맥류흰가루병의 심각한 증상이 명백했다. YGP-GET 적용 후 단지 24시간 뒤에, 맥류흰가루병의 흰색 과분(bloom)이 검정색으로 변했으며, 이는 항진균성 활성에 효과적임을 보여준다. 이러한 시기에 질병이 효과적으로 중단되었기 때문에, 처리제는 더 이상 적용되지 않았다. YGP-GET는 종래의 처리제와 동일한 효능을 보여줬다.
결론:
이러한 연구에서, 정착된 맥류흰가루병 감염이 YGP-GET를 사용하여 빠르고 효과적으로 치료되었다. 적용 후 단지 24시간 뒤에, 이전의 심각한 맥류흰가루병 감염은, 종래의 치료제와 동일한 효능을 지닌 테르펜 제품의 적용에 의해 중단되었다.
이러한 연구로부터 얻어진 예비의 데이터는 YGP-GET가 정착된 균류 감염을 처리하고, 또한 예방적인 능력을 나타내는데 효과적일 수 있다는 것을 암시한다.
예 19 - 맥류흰가루병에 대한 캡슐화된 테르펜 조성물의 추가 현장 실험
배경 및 이론적 설명
현재 실험에 있어서, YGP-GET의 사용은 Tasmanian 포도밭(오스트레일리아, Richmond TAS 7025, Box 187, Hathaway Trading Pty Ltd, Frogmore Creek Vineyard)의 유기 제품을 사용하는 대조구 맥류흰가루병에 대한 실험 프로그램의 부분으로서 연구되었다. 이러한 연구의 목적은 Chardonnay 포도나무의 맥류흰가루병의 유기 대조구에서 YGP-GET의 적용의 단-기간 효능을 연구하기 위한 것이다.
이러한 실험에서, 포도나무(Chardonnay 품종)는, 2005년 2월 7일에, 테르펜 제품인 YGP-GET로 처리되거나, 처리되지 않은 채로 남겨두었다(대조구). 비록 이전의 유기 처리제에 의해 작물 단계는 대략 E-L 33-34이었다(전-베레종).
YGP-GET(4㎖/ℓ)(액체 제형)은 이전에 우유로 처리되었던 6개의 Chardonnay 소구획에 분무되었다. 6개의 Chardonnay 소구획은 처리되지 않은 대조구 역할을 했지만, 이전에 오일/유장으로 처리되었었다. 소구획 당 포도나무의 수는 보통 7개였다.
이 프로토콜에서 사용된 YGP-GET의 조성물의 상세는 표 20에 주어진다.
맥류흰가루병의 심각성은 테르펜 처리 3일 전에, 그리고 처리 3일 후에 다시 평가되었다. 각각의 소구획에서, 20개의 포도송이가 무작위로 선택되었고(패널 면 당 10송이), 질병 심각성은 활성 흰가루병 병균 군체로 덮여진 송이의 백분율 영역으로서 측정되었다. 재배자가 후속적으로 황 및 야채 오일-주성분 분무 보조제(Synertrol Horti Oil)로 전체 실험 영역을 분무했기 때문에, 더 이상의 평가가 불가능했다.
처리될 식물의 수/영역
테스트 제품: 이전에 우유로 처리되었던 6개 Chardonnay 소구획(약 42그루의 포도나무)에 적용될 YGP-GET(4㎖/ℓ).
대조구: 대조구로서 사용될 6개 Chardonnay 소구획(총 약 42그루의 포도나무)에 치료제가 적용되지 않았지만, 이전에 오일/유장으로 처리되었었다.
배양 방법
블록 B2에 있는 Vitis vinifera(Chardonnay) 포도나무: 아치형 줄기로 위치시킨 직립 새싹
배양 배열
공간: 헥타르 당 3,200 포도나무에 대하여, 열 사이의 간격이 2.5m이고, 포도나무(열 내의) 사이의 간격이 1.25m임. 열 배향은 남북이었다.
캐노피 밀도(Canopy density)
Chardonnay 포도나무의 전-실험 캐노피 밀도를 특징으로 하기 위해 포인트-쿼드라트(point-quadrat) 방법이 사용되었다(표 21). 측정은 2005년 1월 13일에, 이전에 황으로 처리되었거나 처리되지 않고 남겨두었던 Chardonnay 소구획 내에서 캐노피의 대표적인 구역을 선택함으로써 행해졌다. 각각의 이전 처리의 6개의 소구획 각각에서 10번의 측정이 행해졌다(즉 황-처리된 소구획에 대해 총 60번의 측정 및 처리되지 않은 대조구 소구획에 대해 60번의 측정). 게다가, 3개의 직립의 새싹(소구획 당)의 길이 및 마디 수가 측정되었다.
NA, 해당 없음
일반적인 조건
실험 물질에 의한 이러한 소구획의 이전의 처리는 처리되지 않은 대조구와 비교하여 맥류흰가루병을 억제했다. 그러나 맥류흰가루병의 레벨은, 비록 우유- 및 오일/유장-처리된 소구획 모두와 동등하지만, 상업적으로 수용가능하지 않은 것으로 고려되었다.
적용 방법, 분량 및 투여 계획
YGP-GET 처리제(4㎖/ℓ)가 2005년 2월 7일에 실용적인 차량의 편평한 트레이 위에 장착된 호스 릴(hoss reel) 및 펌프에 연결된 권총으로 적용되었다. 이러한 분무는 1500-1600kPa(200-230psi)의 펌프 압력으로 추진되어, 약 63㎖/초로 운반한다. 종래의 치료제에 대한 표준 분무 부피(약 900ℓ/ha)가 사용되었다.
활성 흰가루병 병균 군체로 덮여진 포도송이의 영역(%)으로 측정된, 맥류흰가루병의 심각성은 각각의 소구획 내에서 무작위로 선택된 20 송이에 대해 평가되었다(패널 면 당 10 송이). 질병 심각성은 YGP-GET 치료제의 적용 3일 전인 2005년 2월 4일에, 그리고 테르펜 적용 3일 후인 2005년 2월 10일에 다시 평가되었다.
데이터는 평균 분구(separations)를 얻기 위해 아크사인(arcsin) 변환을 사용하여 변형되었다.
결과
처리 이전에, 테르펜(20.4%)으로 처리된 6개의 소구획에 있는 Chardonnay 포도송이의 맥류흰가루병의 평균 심각성은 6개의 대조구 소구획의 평균 심각성과 유사했다(23.2%; 표 22). 이러한 데이터의 아크사인 변환에 기초한 통계학적인 분석은, 처리 이전의 질병 심각성에서 중요한 차이가 없다는 것을 발견했다 (표 23).
처리 3일 후, 그러나, 맥류흰가루병의 평균 심각성은 YGP-GET-처리된 송이에 대해 23.8% 대 대조구에 대해 37.8%였다(표 22). 이러한 데이터의 아크사인 변환은 테르펜-처리된 포도송이를 위한 통계상 중요한 차이를 보여주었으며, 이는 활성 흰가루병 병균 군체로 덮여진 더 작은 영역을 갖는다(P=0.058; 표 23).
토론:
맥류흰가루병이 있는 포도나무의 감염은, 과일 및 와인의 품질뿐만 아니라, 포도나무의 생장 및 내한성에 해로운 영향을 통해 재배자에게 상당한 손실을 초래할 수 있다. 체계적으로 관리되는 포도밭에서는, 재배자가 황 원소와 같은 치료제의 대체물을 찾고 있다.
이러한 연구는 오스트레일리아, 타스마니아에 있는 유기 재배의 포도밭에서 맥류흰가루병을 제어하는 액체 제형으로서 캡슐화된 테르펜 제형(4㎖/ℓ)의 효능을 연구했다. 테르펜 적용 이전에 다른 실험의 치료제가 3주 이내로 사용되는 동안, 맥류흰가루병 감염의 레벨은 여전히 상업적으로 수용 가능하지 못한 것으로 여겨졌다. YGP-GET로 Chardonnay 포도나무를 처리하고 3일이 지난 후, 처리된 포도의 맥류흰가루병의 심각성이 처리되지 않은 대조구의 심각성보다 상당히 낮았다. 전- 및 후-처리 평가 사이의 6일간 처리되지 않은 대조구에서 감염의 심각성이 악화되는 동안, 처리된 포도나무에서는 일정하게 유지되었다. 따라서 YGP-GET는 처리 이전에 맥류흰가루병 병균의 포자를 형성하는 정착된 군체를 가진 포도송이의 질병 증가율을 늦춰주는 것으로 여겨진다. 아마, 현존하는 군체들은 어느 정도로 계속해서 포자를 형성했지만, 군체 팽창은 억제되었다. 재배자가 후속적으로 전체 실험 영역에 황을 분무했기 때문에, 더 긴-기간의 효능 측정은 불가능했다.
이러한 결과는 포도나무에서 맥류흰가루병을 제어하는 YGP-GET의 효능을 증명해준다.
예 20 - 보트리티스(botrytis)에 대한 캡슐화된 테르펜 조성물의 현장 실험
포도의 보트리티스 송이 부패병(botrytis bunch rot)은, 과일 생산량에 심각한 손실을 일으킬 수 있는 일반 균류인, 회색곰팡이균(Botrytis cinerea)에 의해 초래된다. 열매는 감염의 주된 위치이지만, 질병은 또한 꽃 및 잎에도 영향을 줄 수 있다. 초기에는, 감염된 열매가 부드럽고 축축해 보이며, 높은 습기 및 수분의 조건하에 회색 균류 생장으로 덮여지게 될 수 있다. 시간이 지나면, 감염된 열매는 시들어서 떨어진다. 보트리티스는 공기 순환이 잘 되지 않는 습한 상태를 선호하고, 갈라지고 손상된 열매는 특히 감염이 퍼지기 쉽다. 보트리티스를 위한 관리 전략은 우수한 공기 순환의 조장, 상처의 예방 및 생장기 동안 적합한 시기에 살진균제의 적용을 포함한다.
이러한 연구의 목적은 포도의 보트리티스 감염의 치료에서 YGP-GET의 영향을 연구하는 것이다.
2004년 10월 중순에 Kir-yianni 포도밭에서 보트리티스의 출현은(Teldor®의 적용 3주 후), 관련된 재-진입 시기 제한이 계획된 수확을 방해하기 때문에, 종래의 농화학적인 방법으로 처리될 수 없었다. 두 개의 인접한 0.1ha의 소구획은 따라서 포도밭의 위치 7에서 취급되었으며, 2004년 10월 12일에, 이러한 소구획 중 하나는 4㎖/ℓ YGP-GET 액체 제형으로 처리되었고, 다른 소구획은 처리되지 않은 채로 두었다(도 23 참조). 작물은 3일 후에 수확되었고, 감염된 열매의 비율은 각각의 소구획에 대해 결정되었다(총 생산량의 중량%). 그런 다음 처리된 소구획 및 처리되지 않은 소구획 모두로부터 감염되지 않은 열매는 발효 탱크에서 혼합되었다.
위치 7은 테르펜 제형의 적용에 앞서서 복합 제품으로 처리되었으나 여전히 보트리티스 감염은 나타나지 않았다.
포도나무는 1200ℓ/ha의 비로 4㎖/ℓ의 YGP-GET 액체 제형의 단독적인 적용이 제공되었다.
다음의 포도 생장 단계가 기록되었다:
- 2004년 3월 26일, 발아
- 2004년 6월 1일, 개화
- 2004년 8월 6일, 베레종
- 2004년 10월 15일, 수확
수확 3일 전에 연구 적용이 행해졌다.
2004 생장기는 예외적으로 늦어졌고, 전반적으로 비가 내렸다. 노균병으로부터의 질병 고난은 매우 높았고, 맥류흰가루병 고난은 경감되었으며, 보트리티스 레벨은 증가했다.
YGP-GET는 수확 이전의 살충제 시기 제한으로 인해 처리될 수 없었던 보트리티스 감염에 대한 이들의 잠재적인 효능을 평가하기 위해 적용되었다.
테르펜 제품 적용에 적당한 위치의 시각적인 평가는 보트리티스 감염의 증거를 보여줬다. 수확 이후에, 열매는 컨베이어 벨트에 진열되었고, 감염된 열매는 으깨기(crushing) 이전에 감염되지 않은 열매와 수동적으로 분리되었다. 감염된 열매의 비율은 각각의 소구획에 대해 총 생산량의 백분율(중량비)로 산출되었다.
결과
YGP-GET 적용에 적당한 위치의 시각적인 평가는 보트리티스 감염의 증거를 보여줬다. 수확(YGP-GET 적용 3일 후) 이후에, 감염된 열매의 비율은 처리된 소구획 및 처리되지 않은 소구획에서 각각 13% 및 23%이었다. 테스트된 영역은 통계학적 중요성을 평가하기에 충분하지 않았으나, YGP-GET 처리는 질병의 전파를 분명히 느리게 해주었다.
발효는 처리되지 않은 소구획 및 테르펜-처리된 소구획으로부터 감염되지 않은 열매의 혼합에 의해 영향을 받지 않았다.
토론
보트리티스를 위한 종래의 치료제는, 작물 생산량 및 품질에 대한 상당한 손상이 발생하는 시간을 남겨두어, 수확 3주 이전에 중단되어야 한다. 수확 까지 사용될 수 있는 치료제, 또는 종래의 제품보다 수확에 더 근접하여 계속될 수 있는 치료제의 개발은 작물 생산량 및 와인 품질에 있어서 상당한 개선을 초래하고, 재배자에게 상당히 이로웠다. 이러한 연구에서, 테르펜 제품 YGP-GET에 의한 처리는 단지 수확 3일 이전에 정착된 보트리티스 감염의 전파를 시각적으로 늦춰줘서, 처리되지 않은 소구획에서보다 테르펜-처리된 소구획에서 감염된 열매의 비율이 더 낮았다. 더군다나, 수확 근처에서 YGP-GET의 사용에도 불구하고, 발효는 처리된 포도 및 처리되지 않은 포도의 조합에 의해 영향을 받지 않았다.
이러한 결과는 YGP-GET가 정착된 보트리티스 감염의 영향을 감소시키는데 효과적이고, 후속적인 발효에 유해한 영향을 주지 않으면서 수확 근처에서 사용될 수 있음을 암시한다.
예 21 - 정착된 노균병의 치료를 위한 캡슐화된 테르펜의 측정 및 포도 품질의 후속적인 측정
YGP-GET의 실험은 250리터 당 1000g의 비로 조성물을 적용하면서 2004년 8월 25일에 수행되었다.
100% 감염되어 노균병으로 인해 상당한 잎 손상을 겪고 있는 Cabernet Sauvignon의 포도밭이 분무되었다. 임의의 남아있는 잎들은 잎의 상단에 노란 점, 그리고 잎의 밑면에 솜털 모양의 생장에 의해 명백한 노균병의 점(노균병의 전형적인 표시)으로 감염되었다. 대부분의 잎은 상당한 감염을 나타내는 거의 전체적으로 노란색이었다. 이러한 잎 손상 및 감염은 통상적으로 포도의 성숙을 지연시키고, 많은 경우에 있어서, 포도는 와인제조를 위해 완전히 익지 못했다.
포도나무에서 이따금 완전히 익지 않은(직경이 ~1㎝이고 형태는 타원형인 단단하고 짙은 초록색의 열매) 송이의 관찰은, 포도나무가 베레종 이전에 감염되기 쉽고, 개화 또는 그 이전에 감염되기 쉬운 것을 보여주었다. 이른 구리(보르도 또는 기본 황산구리) 적용은 사용되지 않았다. 이러한 포도밭은, Cabernet Sauvignon으로부터 작물이 생산되지 않았다는 점에서, 이전의 수확에서 심하게 감염되었다. 지난해의 잎 손상은, 노균병균을 제거하기 위한 시도에서 칼륨 Bi-탄산염 처리, 및 후속적으로 더 긴 기간의 체계적인 예방를 위한 Stilbourin 적용에도 불구하고 100%였다.
2004년 9월 19일에, 이러한 실험에서 처리된 포도를 따고 으깨고, 다음의 관찰이 곰팡이에 대해 행해졌다(표 24).
이러한 결과는 처리된 포도나무의 포도가 처리되지 않은 포도나무의 포도보다 잘 익은 것을 보여준다. 포도 그 자체의 관찰은, 처리되지 않은 포도가 베레종 직후의 포도를 나타내며, 평균적으로 색상이 더 밝았고, 일부는 투명한 분홍색/보라색/녹색인 반면에, 처리된 포도가 예를 들어 완전히 또는 거의 완전히 익은 포도이며, 평균적으로 짙은 보라색이고 불투명한 것을 나타냈다.
이러한 포도의 맛은 처리된 포도가 예를 들어 익은 Cabernet Sauvignon의 풍부한 과일 맛을 갖는 반면에, 처리되지 않은 포도는 풍부한 과일 맛을 갖지 않는 것을 나타냈다. 처리되지 않은 포도는 우수한 와인제조를 위해 적합하지 않은 높은 말산/타르타르산 비를 나타내는 그린애플 신 맛을 갖는다.
이러한 포도는, 이러한 포도의 차이점을 증명하기 위해, 그리고 와인제조를 위한 처리된 포도의 적합성을 증명하기 위해 이러한 포도로부터 와인 생산 준비를 위해, 으깨졌고 가지가 제거되었다(destemmed). 포도 재배자는 이러한 처리가 와인의 맛에 영향을 줄 것이라고 염려하지만, 나의 제안으로는, 그 재배자는 YGP-GET의 적용 1일 후의 처리된 포도의 맛을 보았고, 오래 끌지 않는(lingering) 맛 또는 아로마를 찾을 수 없었다.
처리된 포도와 처리되지 않은 포도의 차이는 곰팡이의 색으로 추가 증명된다. 처리되지 않은 포도의 주스는 밝은 초록색/착색되지 않은(다소 화이트 와인 곰팡이처럼) 반면에, 처리된 포도의 곰팡이는 으깬 직후에 예를 들어 잘 익은 Cabernet Sauvignon의 분홍색이었다.
이러한 결과는, YGP-GET가 적어도 짧은 기간 내에, 노균병 재-감염을 없애고 막아주면서 늦은 여름 포도밭 처리에 효과가 있음을 보여준다.
노균병을 제어하는 YGP-GET의 장기간 효능에 대한 추가 연구가 유용하지만, 제공된 결과는 YGP-GET가 유용한 처리라는 것을 보여줬다.
늦게 발병한 노균병은 작물을 완전히 파괴시킬 수 있고, 현재 수확 직전에 적용될 수 있고 예방을 제공하는 능력을 유지하는 효과적인 처리제는 없다. YGP-GET의 큰 장점은 빠른 제거를 제공하고 다른 접촉성 살진균제보다 오랜 시간에 걸쳐서 이러한 효능을 유지하는 능력이다.
시장에는 노균병에 대해 확립된 업적을 갖는 많은 항진균제가 있지만, 이들은 모두 작물이 수확될 수 있기 전에 적용 후의 얼마간의 시간을 필요로 한다. 이러한 처리제(황 함유 제품)는 만일 온도가 85℉(29.4℃) 넘게 올라가는 경우 사용될 수 없다. 구리 함유 살진균제의 약해는 또한 포도의 품종에 따라 중요하다. 접촉성 살진균제는 오랜 기간의 영향을 갖지 않아서, 더 긴 활성의 살진균제의 두 번째 적용이 종종 필요하지만, 관련된 규정에 의해 제한될 수 있다(예를 들어 PHI 또는 REI).
노균병에 대한 많은 종래의 처리제는, 재배자가 Mancozeb(66일의 PHI를 가짐; 그러면 재배자는 피크 성숙에서 그의 포도를 수확할 수 없음)와 같은 것을 적용할 것인지를 염려하여 처리제를 적용하지 못하는 것을 의미하는, 제한된 재-진입(REI 및 또는 PHI)을 갖는다.
노균병은 미시시피의 동쪽에서 생산되는 많은 질 나쁜 와인의 주된 원인으로서 관련된다. YGP-GET는 작용된 포도가 적당하게 익게 해주고, 이러한 빠른 생장 산업에서 피크 성숙에서 딸 수 있게 해준다.
유리하게는 YGP-GET는 다양한 "유기"체{많은 자기-지정된 것(self-appointed)}에 의한 승인에 적당해야 하며, 이러한 제품은 "유기" 지침 하에 생장된 포도의 사용에 적합하다. 이것은 미국 및 전 세계에서 빠르게 생장하는 시장 부분에서 또 다른 분야를 열어준다.
예 22 - 시험관 내에서의 캡슐화된 및 캡슐화되지 않은 테르펜의 살진균성 특성의 평가
추가 테스트는 예 15에 언급된 31개의 캡슐화되지 않은 테르펜 조제약 및 글루칸 입자에 캡슐화된 조제약 16 및 22를 평가하기 위해 수행되었다.
이러한 분석을 수행하기 위해, 20,000개의 포자가 1/3 깊이의 감자 덱스트로스 배양액(potato dextrose broth: PDB)에 배치되었고, 선택된 테르펜 제형의 충분한 양이 10 내지 1000ppm의 농도를 제공하기 위해 첨가되었다. 이러한 테스트 물질은 Botrytis cinerea(B.c)가 담긴 분리된 살균된 뚜껑달린 에펜도르프 튜브에 배치되었고, 24시간 동안 배양된 다음 포자는 원심분리에 의해 회수되고, 테르펜 용액은 버려졌다. 포자/바이오매스는 증류수로 헹궈졌고, 다시 원심분리한 다음 1/3 깊이의 PDB 300㎕에 다시 혼합시키고 96개의 웰 플레이트로 옮겼다. 균사체(mycelia)로 생장한 살아남은 포자의 광학 밀도는 시간이 지남에 따라 측정되었다. 살진균 활성은, 균사체 생장의 부재에 의한 증거로서, 테르펜 노출 24시간 후에 20,000개의 포자를 모두 죽이는 것으로 정의된다.
그 결과는 특정 제형이 본 테스트 조건 하에(도시되지 않음) 통계학적으로 중요한 레벨의 살진균성이 없음을 암시한다. 이들은:
1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 27, 28, 29, 30이었다. 조성물의 상세는 예 15(표 17)을 참조해라.
가장 효과적인 화합물의 최소 억제 농도는 표 26에 기재된다.
* 다른 테스트에서, 생장이 없는 가장 낮은 농도는 500 또는 750ppm이었다.
물에 혼합된 화합물과 속이 빈 글루칸 입자로 캡슐화된 화합물의 비교 테스트
속이 빈 글루칸 입자로 캡슐화된 제형 16(게라니올, 유게놀 및 티몰) 및 제형 22(유게놀, 티몰 및 시트랄)의 시료가 앞에 기술된 기술에 따라 제조되었다. 그런 다음 살진균성 특성은, 캡슐화되지 않은 제형에 대해 앞서 기술된 프로토콜을 사용하여, 캡슐화된 제형과 캡슐화되지 않은 제형에 대해 평가되었다.
그 결과는 도 24에 도시된 바와 같이, 물에 현탁된 테르펜과 비교했을 때, 캡슐화된 테르펜 제형과는 매우 달랐다.
최소 유효한 농도는 아래의 표 26에 도시된다.
따라서, 물질 16 및 22의 결과는 수성 현탁액에서의 경우와 글루칸 입자로의 캡슐화에서 테스트되는 경우가 매우 달랐다.(주의: 나중에 언급되는 것처럼, 물에 현탁된 테르펜의 결과에서 일부 변화가 있었고, 앞에서 언급된 실험은 이러한 예이다). MIC 값은 여러 번의 실험으로부터의 혼합이다. 중요하게는, 캡슐화된 테르펜 제형의 결과는 수성 테르펜 현탁액과 관련된 변화의 문제를 겪지 않는다. 물에 현탁된 테르펜의 5번 및 YPs의 3번 분리된 테스트가 있었다.
캡슐화된 테르펜 제형은 물과 섞이기 쉽고, 테르펜 제형의 수성 매질로의 느린 방출을 제공한다. 이것은 테르펜에 대한 포자의 더 긴 노출 시간을 초래한다.
테스트 매질에서 현탁액에 혼합된 캡슐화되지 않은 테르펜 제형을 모니터하는 문제가 생겼는데, 이는 이것에 관련한 결과에 영향을 줄 수 있다.
예 23 - 진드기류에 대한 캡슐화된 조성물의 효능
점박이응애(two-spotted spider mites)는 토마토를 포함한 다양한 식물을 먹이로 한다. 본 연구의 목적은 점박이응애(TSSM, Tetranychus urticae) 및 토마토의 잎의 질병(보트리티스)에 대한 두 개의 YP-테르펜 혼합물의 효능을 결정하기 위해 상업적인 온실에서 실험을 예비로 수행하는 것이었다. 자연적으로 발생하는 점박이응애 집단이 사용되었다.
YP-4(시트랄) 및 YP-22(티몰, 유게놀, 시트랄)(16% 테르펜 제형)이 사용되었다.
3월 28일에, 68개의 토마토 식물(Lycopersicon esculentum var. Trust)의 2열이 자연의 토양을 덮은 검정색 플라스틱 뿌리 덮개(mulch) 위에 6개의 본잎 단계에서 옮겨 심어졌고; 실험은 토마토 품종으로서, 'Boa'와 같은 다른 품종보다 TSSM에 보다 걸리기 쉬운 'Trust'를 사용하여 수행되었다. 식물 간격은 행간에서 12-인치였다. 협력하는 재배자는 식물을 가지치기 하고, 단일 생장 포인트에 수직으로 울타리를 둘렀다. 처리 당 두 개의 식물의 블록은 기가 세워졌고, 4개의 복제를 가진 2열로 무작위화되었다. 처리되지 않은 두 개의 식물은 모든 블록과 분리되었다. 테르펜 제형 YP-4 및 YP-22는 다음의 날: 5월 11(주의: 이러한 예에서 모든 날짜는 2005년에 있음), 6월 2일과 15일, 및 7월 1일과 18일에 잎이 축축하도록 4㎖/ℓ의 비로 적용되었다: 대조구 처리는 동일한 날짜에 잎이 축축할 때까지 처리되었다.
생산량 데이터(과일의 수 및 중량), 질병 발병률 및 TSSM에 의한 잎의 손상 백분율이 5월 27일에 시작하여 실험 종료인 7월 29일까지 매 1-2주마다 기록되었다.
평방센티미터 당 진드기의 수는 또한 7월 25일에 측정되었다. 잎의 시료는 땅에서 약 1.5미터(하부), 그리고 땅에서 약 2.5미터(상부)의 각각 식물로부터 취해졌다. 잎은 건조를 피하기 위해 수분 종이 백에 배치되었다. 각각의 잎의 밑면은 현미경으로 조사되었고 계산이 행해졌다. 살아있는 진드기(활발하게 움직이고 활동이 없는)의 총 개수가 결정되었다. 정지한 상태의 진드기는 죽은 진드기와 쉽게 식별되는 특징적인 자세로 눈에 띈다. 암컷과 수컷 사이 또는 성숙한 진드기와 미성숙한 진드기 사이의 차이점은 없었다.
이러한 실험은 일부에서 두 가지 요인에 의해 복잡해졌다. 첫 째는, 대부분의 토마토 온실 생산에서 오래된 잎이 식물이 자람에 따라 제거된다. 이것은 진드기 집단을 감소시켜주는데, 이유는 진드기의 실질적인 양이 이러한 오래된 잎과 함께 제거되기 때문이다. 이러한 오래된 잎은 테스트의 엄격함을 증가시키기 위한 측정으로서 식물에 의도적으로 남겨졌다.
두 번째는, 4번째 복제에서 YP-22로 처리된 식물 중 하나인 실험 중 하나의 식물이 식물의 심각한 기형을 초래하는 바이러스로 감염되었다. 또한 진드기에 대한 매우 매력적이고 진드기 복제에 도움이 되는 놀라운 결과를 가졌다. 이것은 이러한 식물 주위를 둘러싼 진드기의 엄청난 집단의 무리를 초래했다. 식물은 6월 25일 실험에서 제거되었지만, 이러한 바이러스 감염 식물로부터 유도된 진드기의 매우 높은 레벨이 시간이 지남에 따라 인접한 소구획까지 퍼져서 그 결과물을 왜곡했다.
매우 큰 진드기 집단은 임의의 제품에 의해 제어될 수 없었다. 진드기 집단은 당황했지만 매우 빠르게 원래대로 돌아왔다. 이러한 이유로 인해, 본 명세서에 기록된 데이터는 렙-바이-렙(rep-by-rep) 원칙에 따라 시간이 지남에 따른 결과를 도시한다.
초기 균류 질병
실험 초기에는, 발생한 균류 질병의 낮은 레벨인 것으로 보였으며, 가능하게는 Botrytis cinerea이다. 이러한 질병은 진드기에 의한 손상에 압도되어 더 이상의 등급을 매길 수 없을 때까지 평가되었다. 그 결과는 도 25에 아래에 도시된다.
진드기 손상 등급
바이러스 식물 문제점을 제공하면서, 이러한 토론은 다음의 요약에 따라, 개개의 복제에 의한 결과에 주목해야 할 것이다. 진드기 손상 등급의 결과는 도 26a-d에 도시된다. 복제 1(도 26a)은, 실험의 전체 과정에 걸쳐서 평가하는 점박이응애(TSSM) 손상을 실질적으로 감소시키는 YP-22에 의해, 본 발명자가 원하는 만큼 매우 많은 결과를 제공한다. 처리는 5월 11일에 시작되고, 6월 15일에 첫 번째 TSSM 평가에서의 차이가 바람직하다. 복제 2(도 26b)는 실험 초기의 TSSM 손상이 매우 낮다는 사실을 제외하고는 유사한 시간 진행을 따랐다. 복제 4(도 26d)는 다음에 토론될 것이다; 이들의 결과는 복제 3(도 26c)에 영향을 준다. 6월 23일까지, TSSM 등급은 다른 복제와 일치하지만 7월 1일까지 상당히 증가했고, YP-22로 처리될 때 가장 컸다. 이것은 바이러스-감염된 식물이 YP-22로 처리된 식물이기 때문에 의심할 여지가 없다. 이러한 바이러스 감염은, 매우 매력적이기 때문에 또는 마구 퍼지는 진드기 분열 증식을 허용하기 때문에, 또는 둘 다에 의해, 진드기 군체를 급격하게 증가시켰다. 어떠한 등급에서도, 진드기 군체는 매우 커지게 되었다. 진드기 군체는 YP-22-처리된 바이러스 감염된 식물로부터 이러한 복제 내에서의 다른 식물로 빠르게 퍼졌고, 7월 11일까지, 모든 TSSM 등급이 복제 4에서 매우 높았다. 나머지의 집과 실험으로 횡행하는 것을 예방하기 위하여, 복제 4의 식물이 이 시기 이후에 버려졌다. 복제 3에서는, 7월 1일까지 TSSM 등급이 오르기 시작했고, 이후에는 빠르게 오르기 시작했다. 따라서 확실히 복제 3은, 복제 4에서 단일 식물에서 생긴 진드기로부터 점점 높은 고난을 받았다. 임의의 처리제는 바이러스-감염된 식물에서 생기는 폭발적인 군체 증가를 억제할 수 없는 것 같았다.
도 27은 YP-4로 처리된 식물과 대조구 사이의 비교를 보여주는 사진이다. 캡슐화된 테르펜 조성물인 YP-4가 보다 더 건강하고 보다 더 생산적인 식물을 초래하는 것을 명백하게 볼 수 있다.
진드기의 수
진드기는 각각 지면에서 약 1.5미터(하부) 및 지면에서 약 2.5미터(상부)에 있는 식물로부터 얻어진 잎의 밑면에서 현미경에 의해 계산되었다. 그 결과는 표 36에 도시된다.
이러한 데이터는 우수한 진드기 제어를 나타낸다. 이러한 해충에 대해 예상될 수 있는 바와 같이, 진드기의 수/대조구 식물의 잎에서 큰 변화가 있었다. 그러나 두 개의 처리제, 특히 YP-22에 의한 최대 수는 실질적으로 대조구보다 낮다.
진드기는 이러한 연구에서 특히 YP-22에 의해 제어되었다. 그러나 매우 높은 진드기 고난이 발생하는 경우, YP-22가 적합한 제어를 제공하기에는 불충분했다. 진드기 구충제는 이러한 연구의 부분에서 매우 높은 진드기 군체로 인해 우수한 제어를 제공하지 못할 것 같다. 또한 매 2주마다 물질을 적용하고, 진드기가 우수한 회복 능력을 지니기 때문에, YP 테스트 물질은 잔여 활성을 갖는다; 이것은 거의 명확하게 캡슐화의 결과로서 제공되는 것으로 주지된다.
그 결과는, 사용될 제형, 적용 비율 및 적용 회수가 최적화되지 않았기 때문에 매우 권고된다. 테르펜 혼합물, 적용 비율 및 적용 회수를 최적화시킴으로서 효능을 향상시킬 수 있다는 것에는 의심할 여지가 없다. 그러한 최적화는 달성하기 위한 시행착오의 문제일 수 있다.
추가로, 효능을 증가시키기 위해 사용될 수 있는 적어도 두 가지 유형의 보조제가 있다. 실웨트(Silwet)는, 탱크 혼합물로서 살충제에 첨가된, 유기기를 함유한 규소(organosilicone) 계면활성제이다. 좋은 데이터는, 이러한 물질이 진드기 구충제의 활성을 증가시키는 것을 보여준다(참조문은 요청에 따라 제공 가능함). 이것은 모든 식물에 사용될 수 있고, 이용될 준비가 되어 있다. 본 발명자는 또한 유사한 물질이 생물학적 방제 작용제로 균류 질병 제어의 효능을 향상시키는 것을 보여주는 데이터를 갖는다. 대안적으로, Stirrup은 살충제의 적용을 위해 진드기를 끌어내어 물질의 흡수를 향상시키는 페로몬 제품이다.
예 24 - 시험관 내에서 맥류흰가루병 대조구에 대한 캡슐화된 테르펜의 측정
본 연구는 가장 효과적인 테르펜 혼합물 및 이들이 맥류흰가루병 병균에 관한 활성이 있는 레벨을 결정하기 위해 수행되었다.
이스트 세포벽으로 캡슐화된 31개의 테르펜 또는 테르펜 혼합물(YP-테르펜)이 평가되었다; 특정 조성물에 관해 사용된 코드는 예 15의 표 17에 기술된다.
프로토콜 개발은 유기물의 기본 생태에 의해 수행되었다. 균류는 필수 병원균이고, 포도의 잎을 제외한 다른 곳에서는 배양될 수 없다. 따라서 본 발명자는 식물에 접종하고(inoculate){'리슬링(Riesling)' 묘목}, 풍부한 포자 형성을 갖는 감염된 잎을 세척함으로써 분생자(conidia)를 수확했다.
Reuveni(2001; Can.J.Plant Pathol. 23:52-59)에 의해 사용된 방법의 변형이 사용되었다. Uncinula necator로 감염된 하나 내지 두 개의 잎이 살균된 50㎖ 플라스틱 튜브에 놓여졌다. Tween-20(7.5㎖, 0.0005%)가 튜브에 첨가되었고, 잎은 30초간 강하게 와동되었다(vortexed). 분생자는 페트로프-하우저(Petroff-Hauser) 카운팅 챔버를 사용하여 계산되었고, 1-2 ×10-5분생자/㎖로 조정되었다.
YP-테르펜은 4000ppm의 용액을 사용하여 희석되었다. 반응은 600㎕의 실리콘화된 에펜도르프(eppendorf) 튜브에서 일어나고, 최종 반응 부피는 60㎕였다. YP-테르펜은 최종 농도가 100, 250, 500, 750 또는 1000ppm인 테르펜을 제공하기 위해 튜브에서 희석되었다. 40㎕의 분생자 현탁액이 각각의 튜브에 첨가되었고, 각각의 튜브는 짧게 와동되었다. 물 및 테스트 물질 32(테르펜이 없는 단지 입자)가 대조구로서 포함되었다. 테스트 물질 및 분생자는, 테르펜의 부재 하에 포자 발생에 나쁜 영향을 주지 않으면서 포자의 억제를 위한 충분한 접촉 시간을 제공하기 위해, 1 내지 1.5시간 동안 배양되었다. 이러한 짧은 침지(immersion)는, 한천배지 표면상의 테르펜 혼합물이 빠르게 휘발되거나 물에 흡수되기 때문에, 테르펜과의 적합한 접촉 시간을 허용하기 위하여 필수적이다.
유리 현미경 슬라이드는 750㎕의 1.5% 물 한천배지로 코팅되었다. 유리 슬라이드는 각각 축축한 압지(blotter)를 포함하는 발아 박스에 위치되었다. 분생자 및 테르펜 혼합물은 한천배지 바로 위에 직접 위치시키는 시도가 수행되는 경우, 가능하게는 적당한 접촉 시간으로 인해, 테르펜에 약간의 영향이 있었다. 각각의 박스 위에 뚜껑이 놓여지고, 물질은 벤치탑(benchtop) 위의 실온에서 48시간 동안 배양되도록 하였다. 일부 실험에서, 다른 레벨의 테르펜을 가진 슬라이드는 동일한 박스 내에 함유되었다. 이러한 기술은 높은 레벨의 테르펜을 갖는 슬라이드로부터의 휘발이 물질의 낮은 레벨을 갖는 슬라이드 상의 분생자를 억제했기 때문에 틀린 결과를 허용하는 것으로 알려져 있다. 따라서 최종 데이터는 동일한 테스트 물질의 단지 하나 또는 두 개의 레벨을 포함하는 박스에서 슬라이드로부터 나왔다.
48시간 후에 슬라이드는 광 현미경을 사용하여 조사되었다. 상-콘트라스트(phase-contrast)의 다양한 세팅이 각각의 분생자의 날카로운 윤곽을 얻기 위해 사용되었다. YPs는 분생자보다 여러 배 더 작아서 두 개는 쉽게 구별되었다. 적어도 100개의 포자는 점 당 발아에 대해 평가되었고; 만일 관찰 가능한 포자의 수가 100개 미만인 경우, 발견된 모든 포자가 계산되었다. 적어도 10개가 발아된 분생자의 세균(germ) 튜브 길이는, 비록 이후에 이러한 데이터가 매우 유용한 것으로 밝혀지지는 않았지만, 마찬가지로 측정되었다.
또한 본 발명자는 분생자의 작은 퍼센트가 이미, 이들이 잎의 세척시에 발아된 것을 발견했다. 이것은 맥류흰가루병 병균의 분생자가 발아에 물을 필요로 하지 않아서 언제든지 발아할 수 있기 때문인 것으로 예상된다. 따라서 본 발명자는 살진균성 활성에 대한 우리의 한계(cutoff)를 최대 4% 발아로 설정했는데, 이유는 이것이 0시간 물 대조구에서 흔히 관찰된 레벨이었기 때문이다. 맥류흰가루병 감염의 시기는 또한 일부 변형을 초래했다. 3주보다 긴 감염은 대조구에서 전반적인 발아의 낮은 레벨을 제공했고(한천배지 슬라이드의 물 대조구에서 36%), 반면에 짧은 감염은 훨씬 더 높은 발아 레벨을 제공했다(약 70%). 본 발명자는 모든 테스트 물질을 여러 번 관찰했고, 데이터는 억제가 발생한 레벨에서 선택되었다. 테스트 당 3개의 복제가 사용되었다.
결과:
물질의 농도는 테르펜이 100 내지 1000ppm의 범위였다. 모든 테스트 물질은 적어도 테스트된 가장 높은 농도에서 살진균성이 있었다. 살진균성 효능의 4개의 등급은 31개의 제형에 대해 설립되었다. 테르펜 제형 및 이들의 그룹이, 최소 억제 분량을 기본으로(살진균제), 아래에 주어진다.
그룹 A(>100ppm, <250ppm): 7, 10, 22 및 30
그룹 B(>250, <500): 1, 2, 3, 7, 8, 13, 14, 16, 19, 20, 23-29 및 31
그룹 C(>500, <750): 4, 6, 9, 11, 15, 18 및 21
그룹 D(>750, <1000): 5, 12 및 17
살진균제 분량은 현미경 관측에 의해 결정되는 방식으로 반응 48시간 후에 맥류흰가루병 병균 분생자의 발아에 기초하여 산출되었다. 맥류흰가루병 병균 분생자가 대조구에서 24시간 이내에 발아했기 때문에, 48시간 이내에 발아가 발생하지 않으면, 본 발명자는 포자가 죽었다고 생각했다. 드문 경우이지만, 본 발명자는 72시간 이상 동안 계속해서 관찰했고, 추가 정보는 얻어지지 않았다.
예 25 - 시험관 내에서 노균병 병균 대조구에 대한 캡슐화된 테르펜의 측정
본 연구는 가장 효과적인 테르펜 혼합물 및 이들이 노균병 병균에 대해 활성인 레벨을 결정하기 위해 수행되었다.
포도의 노균병의 원인 병원체인, Plasmopara viticola가 모든 연구에서 사용되었다. 이것은 코넬에서 동업자로부터 얻어진 넓은 유형의 병원균 계통이었다. 유기물은 '리슬링' 씨앗으로부터 얻어진 묘목의 잎에 유지되었다.
프로토콜 개발은 유기물의 기초 생태에 의해 수행되었다. 균류는 필수 병원균이고, 포도의 잎을 제외한 다른 곳에서는 배양될 수 없다. 따라서 본 발명자는 식물에 접종하고('리슬링' 묘목), 감염된 잎을 물로 조심히 세척하여 포자낭을 수확했다. 본 발명자는 원래 커버 슬립을 구비한 유리 슬라이드 위에서 포자낭을 관찰함으로써 분석을 수행하려고 했었다. 그러나 본 발명자는 시간이 지남에 따라 슬라이드를 보기를 원했는데, 이러한 방법은 전혀 이것을 허용하지 않았다. 사용된 부피는 적당한 평가를 위해 너무 작았고, 포자낭은 종종 커버 슬립의 압력으로부터 분해되고, 유주자(zoospores)는 방출 이후에 매우 빠르게 포낭으로 싸일 것이다. 하강 슬라이드를 사용하는 Reuveni(2001; Can.J.Plant Pathol. 23:52-59)에 의해 사용된 방법의 변형이 사용되었다. 이러한 슬라이드는 커버 슬립을 필요로 하지 않으며, 유주자는 많은 시간 동안 운동성(motile)이 남아 있고, 사용된 부피는 시간이 지남에 따라 복잡한 평가를 허용하였다.
모든 실험에 대하여, Plasmopara viticola로 감염된 1-3개의 잎으로부터의 포자낭은 비커 안으로 증류수로 서서히 세척되었고 페트로프-하우저 카운팅 챔버를 사용하여 계산되었다. 포자낭의 농도는 적어도 1 ×105/㎖였다.
YP-테르펜은 4000ppm의 작용 용액으로 희석되었다. 반응은 600㎕의 실리콘화된 에펜도르프 튜브에서 일어났고, 최종 반응 부피는 100㎕였다. YP-테르펜은 10, 50, 100, 250 및 500ppm의 테르펜의 최종 농도를 제공하기 위해 튜브에서 희석되었다. 75㎕의 포자낭 현탁액이 각각의 튜브에 첨가되었고, 현탁액을 위 아래로 피펫으로 계량하면서(pipetting) 서서히 혼합했다. 물 및 테스트 물질 32(테르펜이 없이 단지 YP)이 대조구로서 포함되었다.
분석 #1 - 닫힌 튜브
효능(후속적인 8시간 동안 관찰된 유주자의 운동성이 없음)의 올바른 범위를 측정하기 위해, 10, 50 및 100ppm의 테르펜에서 모든 31개의 테스트 물질에 대해 예비 평가가 수행되었다. 일단 포자낭이 발아하는 것이 관찰되고 유주자가 대조구에서 관찰되면(0.5 - 1시간 이후에), 15㎕가 동시에 튜브로부터 유리 하강 슬라이드로 이동되었고, 광 현미경을 사용하여 즉시 관찰되었다. 만일 운동성이 있는 유주자가 관찰되는 경우, 이 농도는 더 이상 관찰되지 않았다. 슬라이드는 깨끗하게 닦아졌다. 매 2-3시간마다, 공정이 튜브로부터 새로운 테스트 물질을 가지고 반복되었다. 8시간 후반 무렵, 첫 번째 100개의 포자낭의 발아 백분율이 결정되었다. 시료는 실온에 두고, 다음날 다시 관찰되었다. 살진균성 활성에 대한 기준은 (a) 0시간 대조구(10% 이하)보다 크지 않은 포자낭 발아 및 (b) 운동성이 없는 유주자이다. 1.8% 내지 6.7%의 범위의 유효한 분량에서 포자낭 발아의 백분율은 물(87%) 및 YP-32(76%)의 대조구와 비교되었다.
이러한 분석에서, 포자낭은 밀봉된 용기에서 테스트 물질과 계속해서 접해있었다.
분석 #2 - 1시간 배양
앞서 기술된 분석 시스템은, 포자낭 발아 및 운동성 유주자의 없는 것은 폐쇄된 튜브에서 물질이 존재하고, 테스트 물질이 테스트 용액에 계속해서 침지되기 때문에, 살균(즉, 치명적인) 농도에 대한 정확한 데이터를 제공하지 않을 수 있다. 본 발명자는 원심분리가 포자낭 및 유주자에겐 치명적이기 때문에, 용액에 용해되어 있는 물질로부터 세포를 제거할 수는 없다. 따라서 폐쇄된 에펜도르프 튜브에서 배양 1시간 후에, 테스트 혼합물(40㎕)이 하강 슬라이드로 이동되었다. 이러한 얇은 층에서, 테르펜은 공기 중으로 휘발될 것으로 예상되고, 따라서 살균 농도는 보다 정확하게 결정된다.
슬라이드는 각각 축축한 압지를 포함하는 발아 박스에 저장되었다. 매 2시간 마다 슬라이드는 운동성 유주자에 대해 조사되었다. 24시간 후 운동성 유주자가 관찰되지 않는 농도는 이러한 분석의 MIC로 고려되었다.
결론:
분석 간에, 그러나 전체적으로 차이나는 테스트 물질의 농도는 테르펜이 10 내지 500ppm의 범위였다. 모든 테스트 물질은 두 개의 분석 모두에서 적어도 테스트된 가장 높은 농도에서 효과적이었다. 최소 유효한 농도(MICs)의 세 가지 등급이 각각의 테스트에 대한 31개의 테르펜에 대해 설립되었다. 각각의 테스트 물질에 대한 MIC는 운동성 유주자가 없는 농도이다.
테스트 숫자를 사용하여 기록된 그룹은 다음과 같다:
분석 #1 - MICs - 폐쇄된 튜브(테르펜 현탁액에 일정한 침지)
그룹 A(<50ppm) : 3, 7, 11, 14, 17, 19, 25 및 26
그룹 B(>50, <100) : 1, 4, 8, 10, 13, 16, 20, 22, 23, 27, 28, 30 및 31
그룹 C(>100, <250) : 2, 5, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24 및 29
분석 #2 - MICs - 한 시간 배양(얇은 층으로부터 휘발에 의해 흩어진 테르펜)
그룹 A(<100ppm) : 4
그룹 B(>100, <250) : 3, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20 및 22-31
그룹 C(>250, <500) : 1, 2, 5, 6, 9, 12, 15, 18 및 21
31개의 YP-테르펜 테스트 물질은 Plasmopara viticola의 포자낭으로부터 운동성 유주자의 방출을 억제하는 이들의 능력에 대해 평가되었다. 두 개의 분석이 수행되었다. 첫 번째 테스트에서 본 발명자는 폐쇄된 튜브에서 배양된 물질로부터 포자낭 발아 및 유주자 운동성 모두를 조사했다; 두 번째 테스트에서 본 발명자는 단지 1시간 동안의 폐쇄된 튜브에서의 배양 후에 하강 슬라이드에서 단지 유주자 운동성만을 평가했다.
운동성 유주자가 없는 것은 테스트 물질의 효능을 결정하기 위한 가장 명확한 방법이어서, 결정적인 기준으로서 사용되었다. 유주자 운동성은 이러한 병원균에 의한 감염에는 결정적이다. 포자낭 발아의 억제는 노균병을 제어하기 위한 첫 번째 단계이다: 만일 포자낭이 본래대로 남아있는 경우, 유주자는 방출되지 않을 것이다. 포자낭 발아에 대한 우리의 데이터는 비록 발아가 0%이 아니지만 위의 MICs를 지지한다. 일부 포자낭은 이들을 잎으로부터 수확할 때 이미 발아되었다. 0시간에서(유주자가 발견되지 않음) 발아 백분율은 6% 내지 16%였다.
첫 번째 분석에서, 테르펜은 이상적인 테스트 조건 하에 유주자의 방출을 제어했다. 틀림없이, 테스트 물질은 노균병 병원체에 대해 살진균 효과를 갖는다. 그러나 분석 #2는 더 나은 치명성 테스트를 제공하며, 이는 또한 테르펜이 휘발에 의해 흩어지는 경우 식물 잎에서도 일어날 것이다. 함께 수행된 두 가지 분석은 포도 노균병 병원균을 제어하기 위한 YP-테르펜 물질의 시험관 내의 능력의 완전한 평가를 제공한다.
예 26 - 시험관 내의 회색곰팡이균(
Botrytis cinerea)
대조구에 대한 캡슐화된 테르펜의 측정
이스트 세포벽으로 캡슐화된 15개의 테르펜 또는 테르펜 혼합물이 평가되었다. 테스트된 제형은 L-카르본을 포함하지 않았다.
Botrytis cinerea는 모든 연구에서 사용되었다. 계통 동정(strain identification)으로는 B36이 있고, 코넬 대학으로부터 얻어졌다. 유기물은 25℃에서 V8 한천배지 위에 유지되었다.
이 연구에 대한 프로토콜은 이전에 B.cinerea에 대해 사용된 또 다른 프로토콜 레사주린(resazurin)(Alamar Blue) 분석의 양상을 결합한다. 레사주린의 존재는 이스트 입자에 존재하는 테르펜의 살진균 레벨을 측정하는 것을 허용한다.
회색곰팡이균의 포자는 물에서 수확되었고, 1 ×105포자/㎖의 농도로 조절되었다. YP 테르펜은 최종 농도가 100, 250 또는 500ppm이 되도록 살균된 1.5㎖의 에펜도르프 튜브에서 희석되었다. 50㎕의 포자 현탁액 및 375㎕의 1/3 세기 PDB가 튜브에 첨가되었다. 현탁액은 짧게 와동되었고, 실온에서 24시간 동안 배양되었다. 각각의 튜브의 내부는 그런 다음 벽으로부터 균사(hyphae)를 방출하기 위해 살균된 이쑤시개를 사용하여 잘게 부셨다.
정진균(fungistatic) 분석:
24시간 후에, 테스트 현탁액의 두 개의 분리된 시료가 제거되었고 30㎕의 1/3 세기 PDB 및 20㎕의 250ppm 레사주린과 함께 마이크로타이터 플레이트 웰에 배치시켰다. 이러한 혼합물은 16-20 시간 동안 밤새 배양되었다. 그런 다음 시각적인 관찰이 행해졌다. 테스트 혼합물이 보라색으로 남아있는 YP 및 포자 현탁액의 이러한 농도는 정진균성이 있는 것으로 고려되었다. 로사주린 현탁액은 보라색이지만, 생물학적 활성에 의해 환원되는 경우 용액은 분홍색, 그런 다음 투명하게 된다.
살진균성 분석:
테스트 현탁액의 두 개의 시료를 제거한 후에, 튜브는 10분간 3000rpm으로 원심분리 되었고, 상청액(supernatant)은 버려졌다. YPs, 보트리티스 포자 및 임의의 발아된 균사를 포함하는 침전물은 400㎕의 물로 세척되었다. 튜브는 다시 원심분리 되었고, 펠릿은 400㎕의 살균된 1/3 PDB에 재-현탁되었다. 각각의 튜브에, 150㎕의 250ppm 레사주린이 첨가되었다. 튜브는 와동되었고 16-20시간 동안 밤새 실온에서 배양되었다. 시각적인 평가가 행해졌고, 테스트 혼합물이 보라색으로 남아있는 포자 현탁액 및 YP의 농도가 살진균성이 있는 것으로 여겨졌다.
72시간 후에, 튜브의 시각적인 평가가 다시 행해졌고, 보라색 시료는 살진균성이 있는 것으로 여겨졌다.
각각의 웰 또는 튜브는 착색 등급이 지정되었다. 착색 변화가 일어나지 않으면 4등급; 투명한 웰은 0등급으로 매겨졌다. 3 이상의 등급은 고정된 것으로 여겨졌고(착색 변화가 거의 없거나 없음), 단지 4 등급(변화가 없음)만이 살진균성이 있는 것으로 고려되었다.
각각의 농도에서 각각의 테스트 재료의 3번의 복제가 각각의 실험에 대해 사용되었고, 각각의 실험은 두 번씩 행해졌다.
결과:
정진균성 테스트 - 모든 테스트 물질은 적어도 테스트된 가장 높은 농도에서 정진균성이 있었다. 효능에 대한 기준은 대조구에 비해 적어도 75% 생장 억제였다. 효능의 범위는 15개의 테르펜에 대해 설립되었고 아래에 주어진다.
그룹 A(<100ppm): 3, 7, 10, 16, 19 및 26
그룹 B(>100, <250): 1, 2, 6, 11, 13, 17 및 22
그룹 C(>250, <500): 4 및 8
살진균성 테스트 - 살진균성 테스트에 대한 색상 변화의 시각적인 평가는 두 번: 한 번은 16-20시간 후에, 그리고 또 한 번은 72시간 후에 측정되었다. 20시간 후에, 모든 테스트 물질은 적어도 테스트된 가장 높은 농도에서 살진균성이 있었다. 그러나 72시간 이후에는 단지 소수의 시료만이 여전히 살진균성이 있었다. 매 시간 각각의 테르펜에 대한 효능의 범위는 아래에 주어진다.
16-20시간 이후:
그룹 A(>100, <250): 2, 3, 6, 7, 10, 13, 16, 17, 19, 22 및 26
그룹 B(>250, <500): 1, 4, 8 및 11
72시간 이후:
그룹 A(>100, <250): 7
그룹 B(>250, <500): 1, 3, 10, 13, 16, 19, 22 및 26
그룹 C(>500):2, 4, 6, 8, 11 및 17
복합물 등급
효능의 각각의 범위는 등급으로 지정되었다(그룹 A=1, B=2 및 C=3). 다음의 표(표 28 내지 30)는 각각의 테스트에 대한 등급 및 각각의 YP 테르펜에 대한 전체 등급을 도시한다. 숫자가 작아질수록, 효능은 좋아진다.
가장 효과적인 8번 테스트 물질은 단독으로 또는 혼합 성분으로서 티몰(T)을 갖는다.
토론:
이전의 시험관 내의 연구에서, L-카르본을 함유하는 YP 테르펜 테스트 물질은 중요한 식물 병원균을 제어하는데 최소의 효과를 제공했다. 이러한 성분을 함유하는 16번 테스트 물질은 따라서 제외되었다.
레사주린은 표시 염료(indicator dye)로서 포함되었다. Botrytis가 레사주린을 분해하기 때문에, 보라색으로부터 분홍색으로의 색 변화가 발생한다. 정진균성 분석을 위해, 시료는 96-웰 마이크로타이터 플레이트로 옮겨졌고, 색 변화의 시각적인 평가 이전에 16-20시간 동안 레사주린과 반응했다. 원심분리 및 세척 이후에, 튜브에 남아있는 물질은 살진균성 평가를 제공하기 위해 레사주린과 반응되었다.
테스트 물질 YP-7은 각각의 테스트에서 가장 효과적인 시료였다. YP-7은 시험관 내에서 맥류흰가루병 병균을 제어하는데 가장 효과적인 물질이다.
결론:
모든 YP 테스트 물질은 적어도 500ppm에서 Botrytis cinerea에 대해 정진균성이 있다. 16-20시간 후에, 모든 물질은 적어도 500ppm에서 살진균성이 있는 것으로 여겨졌다. 그러나 72시간 후에는, 단지 10번 테스트 물질만이 여전히 살진균성이 있는 것으로 고려되었다.
가장 효과적으로는 250 내지 500ppm에서 살진균성이 있다.
예 27 - 시험관 내에서 식물 박테리아의 대조구에 대한 캡슐화된 테르펜의 측정
테스트된 3개의 박테리아는 모두 프로테오박테리아이고, 그램 음성(Gram-negative)이었다. 이들은 주로 지질다당질로 이루어진 외막을 갖는다. Erwinia amylovora는 장내세균과에 속한다. 이러한 과의 다른 박테리아는 Salmonella spp., Escherichia coli, 및 Serratia marcescens를 포함한다. Pseudomonas syringae는 Pseudomonadaceae 과에 속한다. 이러한 과의 다른 중요한 멤버는 Pseudomonas aeruginosa(기회감염 병원균)를 포함한다. Xanthomonas campestris pv. phaseoli와 밀접하게 관련된 것으로는 벼 또는 당근을 감염시키는 여러 가지 중요한 병원형(pathovars)이 있다. Pseudomonas 및 Xanthomonas가 매우 밀접하게 관련되어 있다.
20세기 동안, 횡행한 식물 물질의 도입은 유럽, 중앙아시아, 및 뉴질랜드에 E.amylovora를 정착시키는 역할을 했는데, E.amylovora는 사과 및 배에 부란병을 초래한다. 1995년에, 부란병은 전 세계에서 가장 큰 배 생산 지역인 북부 이탈리아의 포강 계곡에서 처음으로 관측되었다. 1995년 이후, 이탈리아 정부는 E.amylovora를 박멸하기 위해 500,000그루의 배나무를 파괴했다(http://www.apsnet.org/education/LessonsPlantPath/FireBlight/HISTORY.HTM).
일반적인 콩 및 헤일로 마름병(halo blight)은 마르고 꼬투리째 먹는 콩의 경제적으로 가장 중요하고 널리 퍼진 질병 중 하나이다. 미국, 캐나다 및 콜롬비아는 이러한 콩의 가장 큰 재배자 중 일부이다. 대부분의 관리 전략은 단지 증명된 무-병원균 씨앗을 심고, 작물을 돌려짓기하고(rotating) 화학적 분무를 주마다 처리하는 것을 수반한다. (http://www.jpgenetics.com/commonbean.asp)
방법론:
Erwinia amylovora{계통 Ea273; 사과의 부란병}, Pseudomonas syringae pv. phaseolicola{계통 Pph MF; 콩의 헤일로 마름병} 및 Xanthomonas campestris pv. phaseoli{계통 Xph XPW; 콩의 일반적인 마름병)이 이러한 연구에서 사용되었다. 이러한 계통은 코넬 대학으로부터 얻어졌다.
배양균 - 3개의 박테리아 모두 28℃에서 LB(Luria-Bertani) 플레이트(Sambrook 등, 1989) 상에서 배양되었다. 개시 배양균(50㎖ LB broth)은 플레이트로부터 접종되었고 밤새 재배되었다(170rpm, 28℃). 1㎖의 개시 배양균은 새로운 50㎖의 LB 배양액 플라스크로 옮겨졌고 고정상에 도달될 때까지 동일한 조건 하에서 재배되었다. 배양균은 광학 밀도(OD)에 대해 620㎚에서 읽어졌고 그런 다음 105-106세포/㎖를 제공하여 LB 배양액으로 희석되었다. 이렇게 희석된 물질은 마이크로타이터 플레이트 분석에서 웰에 접종시키기 위해 사용되었다.
박테리아-억제(Bacteriostatic) 분석:
플레이트 분석은 생장 매질로서 LB 배양액을 사용하여 수행되었다. YP-테르펜 테스트 물질은 7.8 내지 1000ppm의 범위를 제공하기 위해 플레이트에서 희석되었다(Al 테르펜). 희석된 박테리아는 200㎕의 최종 웰 부피를 제공하기 위해 각각의 웰에 첨가되었다. 대조구 웰은 어떤 YP-테르펜도 함유하지 않았다. 플레이트는 초기 측정(초기 OD)을 위해 620㎚에서 읽어졌고, 2일 동안 28℃에서 배양되었다.
2일 후에, 플레이트는 다시 620㎚에서 읽어졌다(최종 OD). 최종 OD에서 초기 OD를 뺀 것은(델타OD) 시간이 지남에 따른 생장의 변화를 제공한다. 효능의 기준은 대조구에 대해 적어도 75% 생장 억제가 있었다. 따라서 테스트 웰에서의 델타 OD는 박테리아를 제어하는데 효과적이라고 여겨지도록 대조구 웰에서의 생장이 25% 미만이어야 한다.
살균성 분석:
살균성 분석이 완성된 이후에, 플레이트는 10분간 2000rpm으로 원심분리 되었다. 상청액은 제거되었고, 100㎕의 신선한 LB 배양액이 각각의 웰에 첨가되었다. 플레이트는 620㎚에서 읽어졌고(초기 OD), 3-4일간 28℃에서 배양되었고 다시 620㎚에서 읽어졌다(최종 OD). 유효한 농도는 대조구에 비해 적어도 75%의 생장 억제를 제공했다.
두 개의 복제는 각각의 YP-테르펜을 위해 사용되었고, 두 개의 분석(억제 및 살균)은 각각의 박테리아에 대해 3번 수행되었다.
결과:
박테리아 억제 분석 - 3개의 박테리아 모두에 대하여, 모든 테스트 물질이 적어도 테스트된 가장 높은 농도에서 박테리아를 억제했다. 분석은 48시간 진행되었다. 효능에 대한 기준은 대조구에 비해 적어도 75%의 생장 억제가 있었다. 효능의 범위는 31개의 테르펜에 대해 확립되었고 아래에 제공된다.
살균성 분석 - 많은 테르펜 제형이 테스트된 가장 높은 농도에서 박테리아를 죽이는데 효과적이지 못했다. 효능의 범위는 31개테르펜에 대해 확립되었고, 아래의 표 32에 제공되었다.
각각의 테스트에서, Erwinia는 YP-테르펜 제형에 가장 민감한 병원균이고, 다음으로 Xanthomonas 및 그런 다음 Pseudomonas에 민감한 병원균이다.
등급은 각각의 박테리아에 대한 각각의 분석에 대해 각각의 YP-테르펜에 대해 할당되었다. 등급 숫자가 낮을수록, 테스트 물질의 효능은 더 좋다. 억제 및 제거 등급은 곱해져서, 조합 점수를 제공한다. 이러한 수는 YP-테르펜이 각각의 박테리아를 얼마나 잘 제어하는지를 보여준다. 3개의 조합 점수(각각의 박테리아 당 하나)는 복합 점수를 제공하기 위해 합해졌고, 이는 3개의 박테리아 모두에 대한 YP-테르펜 효능을 나타낸다. 표 33은 각각의 테스트 물질의 조성에 따른 복합(전체) 점수에 기초한 효능의 순서대로 YP-테르펜을 나열한 것이다.
토론:
이러한 박테리아를 각각 제어하는 가장 좋은 8번 YP-테르펜 제형은 티몰을 함유한다. L-카르본을 함유하는 대부분의 조합은 이러한 박테리아를 제어하는데 매우 불충분하다.
예 23 내지 26의 결과 요약
캡슐화된 테르펜의 특정 조합은 특정 유형의 식물 병원균에 대해 특별한 효능을 보여줬다. 이러한 조합에서 다음이 관찰되었다:
- 모든 유기물에 대하여, 가장 효과적인 조성물은 7(게라니올 및 티몰), 10(유게놀 및 티몰), 및 13(티몰 및 시트랄)이며, 이것 두 개는 밀접하다.
- 7(게라니올 및 티몰)은 전반적으로 균류/난균류의 제어에 대해 가장 효과적이다.
- 13(티몰 및 시트랄)은 전반적으로 박테리아에 대해 가장 효과적이다.
- 조합 10(유게놀 및 티몰)은 균류 및 박테리아 모두에 대해 매우 효과적이다.
- 그 다음의 효능 그룹은 3(티몰), 19(게라니올, 티몰 및 시트랄), 및 22(유게놀, 티몰, 및 시트랄)이다.
- 4위를 차지한 그룹은 16(게라니올, 유게놀, 및 티몰) 및 26(게라니올, 유게놀, 티몰 및 시트랄)로 이루어진다.
- 특히 노균병 병균에 대하여, 4(C)가 매우 효과적이지만, 그 외의 것에 대해서는 상위권에 있지 못했다.
이러한 결과는 4개의 테르펜인 시트랄, 유게놀, 게라니올 및 티몰이 단독으로 또는 혼합하여, 특히 이스트 글루칸 입자에 캡슐화한 경우, 강한 항균성 및 항진균성 활성을 나타내는 것을 보여준다. 대부분의 경우에서 티몰의 존재가 중요하다.
표 34 내지 36는 다양한 제형의 성능의 등급을 요약한다.
* 72시간 제거(cidal) 데이터에 기초함
상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 테르펜 및 속이 빈 글루칸 입자 또는 세포벽 입자를 포함하는 조성물, 및 이러한 조성물의 제조 방법, 및 의학, 수의학 및 농업 분야에서 그러한 조성물의 사용 방법에 사용된다.
Claims (28)
- 곤충 또는 거미류 동물(arachnid)을 제거하는 방법으로서,a) 테르펜 성분을 캡슐화하는 속이 빈 글루칸 입자 또는 세포벽 입자를 포함하는 조성물을 유효량으로 상기 곤충 또는 거미류 동물에 투여하는 단계를 포함하는, 곤충 또는 거미류 동물을 제거하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 곤충은 개미, 흰개미, 이, 진딧물, 벼룩, 매미, 메뚜기 및 삽주벌레로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 곤충 또는 거미류 동물을 제거하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 거미류 동물은 진드기류(mites), 거미 및 진드기(ticks)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 곤충 또는 거미류 동물을 제거하는 방법.
- 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 식물에 기생하는(infest) 진드기 또는 곤충에 투여되는, 곤충 또는 거미류 동물을 제거하는 방법.
- 제 4항에 있어서, 진드기는 점박이응애(two-spotted spider mites)인, 곤충 또는 거미류 동물을 제거하는 방법.
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 테르펜 성분은 시트랄을 단독으로 포함하거나, 유게놀, 티몰 및 시트랄의 조합을 포함하는, 곤충 또는 거미류 동물을 제거하는 방법.
- 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 곤충 또는 거미류 동물에 조성물을 분무함으로써 아니면 적용함으로써 투여되는, 곤충 또는 거미류 동물을 제거하는 방법.
- 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 곤충 또는 거미류 동물에 의해 섭취될 수 있는 식물의 잎에 분무함으로써 아니면 적용함으로써 투여되는, 곤충 또는 거미류 동물을 제거하는 방법.
- 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은, 곤충 또는 거미류 동물에 의해 섭취되는 대상을 조성물에 침지시킴으로써 그 대상에 투여되는, 곤충 또는 거미류 동물을 제거하는 방법.
- 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 샴푸 등의 형태로 투여되는, 곤충 또는 거미류 동물을 제거하는 방법.
- 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 직물에 투여되는, 곤충 또는 거미류 동물을 제거하는 방법.
- 제 11항에 있어서, 조성물은 직물의 세척 동안 투여되는, 곤충 또는 거미류 동물을 제거하는 방법.
- 식물에 대한 침입(infestation)을 치료하거나 예방하는 방법으로서,a) 테르펜 성분을 캡슐화하는 속이 빈 글루칸 입자 또는 세포벽 입자를 포함하는 조성물을 치료에 효과적인 양으로 식물 또는 식물 부근의 토양에 투여하는 단계를 포함하는, 식물에 대한 침입을 치료하거나 예방하는 방법.
- 제 13항에 있어서, 침입은 곤충 또는 거미류 동물에 의한, 식물에 대한 침입을 치료하거나 예방하는 방법.
- 제 14항에 있어서, 거미류 동물은 초식성 진드기인, 식물에 대한 침입을 치료하거나 예방하는 방법.
- 제 15항에 있어서, 초식성 진드기는 점박이응애인, 식물에 대한 침입을 치료하거나 예방하는 방법.
- 제 14항에 있어서, 곤충은 파리, 진딧물, 개미, 매미, 메뚜기 및 삽주벌레로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 식물에 대한 침입을 치료하거나 예방하는 방법.
- 제 13 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 테르펜 성분은 시트랄로 이루어지는, 식물에 대한 침입을 치료하거나 예방하는 방법.
- 제 13항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 테르펜 성분은 유게놀, 티몰 및 시트랄의 조합을 포함하는, 식물에 대한 침입을 치료하거나 예방하는 방법.
- 제 13항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 식물의 수확 직전에 적용되는, 식물에 대한 침입을 치료하거나 예방하는 방법.
- 제 20항에 있어서, 조성물은 수확 21일 전 또는 이내에 적용되는, 식물에 대한 침입을 치료하거나 예방하는 방법.
- 제 13항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 질병 예방의 수단으로서 규칙적으로 적용되는, 식물에 대한 침입을 치료하거나 예방하는 방법.
- 제 13항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 분무에 의해 적용 되는, 식물에 대한 침입을 치료하거나 예방하는 방법.
- 제 13항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 관개에 의해 적용되는, 식물에 대한 침입을 치료하거나 예방하는 방법.
- 살충제 또는 거미 살충제(arachnicide)로서, 테르펜 성분을 캡슐화하는 속이 빈 글루칸 입자 또는 세포벽 입자를 포함하는 조성물을 사용하는 방법.
- 제 25항에 있어서,살비제(acaricide)로서 사용하는, 조성물을 사용하는 방법.
- 살충제 또는 거미 살충제의 제조에서, 테르펜 성분을 캡슐화하는 속이 빈 글루칸 입자 또는 세포벽 입자를 포함하는 조성물을 사용하는 방법.
- 제 27항에 있어서,살비제의 제조에서 사용하는, 조성물을 사용하는 방법.
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