CN106578386B - 麝香草酚的新应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于饲料添加剂领域，尤其涉及麝香草酚的新应用。本发明提供了麝香草酚在溶解酵母细胞壁并提高酵母细胞壁多糖含量中的新用途，本发明还提供了一种饲料添加剂包括麝香草酚和酵母细胞，所述饲料添加剂的制备方法为麝香草酚与酵母细胞混合培养。该发明解决了现有去除饲料中黄曲霉毒素的方法中降低饲料营养价值，污染环境，方法单一，工序复杂，成本较高的技术缺陷的技术缺陷。所得的饲料添加剂能高效吸附饲料中的黄曲霉素，而且绿色无污染。同时，制备所述饲料添加剂的方法具有工艺简单、成本低廉的优点。
Description
技术领域
本发明属于饲料添加剂领域，尤其涉及一种饲料添加剂及其制备方法。
背景技术
谷物与饲料中霉菌毒素的污染是一个全球性问题。据报道，全球至少25％的饲料受到已知霉菌毒素的污染，霉菌毒素不仅会直接对动物造成毒害，还会通过食物链从动物转移到人体中。有些毒素在动物体内通过代谢会产生一些毒素相关化合物，而这些化合物也会经过食物链对人体产生伤害。霉菌毒素一直是困扰世界的难题，科研工作者曾用过物理、化学、生物的方法去除或钝化饲料中的霉菌毒素，目前通用的物理方法是吸附法，采用无机粘土矿物如膨润土、沸石以及铝硅酸盐等，这些粘土矿物质虽然能一定程度吸附饲料的霉菌毒素，但存在很多缺点，添加比例高，降低配合饲料的营养价值；无法进行生物降解，造成严重的环境污染，同时也会吸附矿物质、维生素等营养元素。
目前，在饲料加工生产与使用中，采用的生物学方法是添加酵母细胞壁的方法来去除霉菌毒素，其中霉菌毒素大多为黄曲霉毒素。研究表明，酵母或酵母细胞壁成分具有吸附黄曲霉毒素的能力，其中β-葡聚糖、甘露聚糖是酵母细胞壁的活性成分之一，对黄曲霉毒素有一定的吸附能力。但是从酵母获得的酵母细胞壁含量较少，不能满足饲料加工生产的需求，同时，获得酵母细胞壁的方法工序繁多，成本较高，制约了其在饲料加工生产的应用。
综上所述，传统的去除饲料黄曲霉毒素的方法中污染环境，降低饲料营养价值，方法单一，工序复杂，成本较高的技术缺陷。因此，寻找一种高效、环保、工艺简单、成本低廉的去除饲料中黄曲霉毒素的物质是本领域技术人员亟待解决的技术问题。
发明内容
麝香草酚(Thymol)，别名百里酚，是一种单萜酚，主要存在于唇形科百里香属植物中，是百里香属植物挥发油的主要成分；麝香草酚是从可食用植物中提取出来的，安全性高，资源丰富据研究表明麝香草酚对食品中常见的细菌、酵母菌和霉菌有一定抑菌作用；毒副作用小、安全性高的天然植物防腐剂。本发明发现在酵母细胞中添加麝香草酚，可以使酵母细胞壁自行裂解，提高酵母细胞壁中的β-葡聚糖、甘露聚糖含量。因此本发明提供了麝香草酚在溶解酵母细胞壁、提高酵母细胞壁多糖含量的新用途。
本发明还提供了一种饲料添加剂，包括麝香草酚和酵母细胞。
作为优选，所述麝香草酚与所述酵母细胞的质量比为(4～5)：(3000～4500)。
进一步的，作为优选，所述麝香草酚的浓度为400-500μg/ml。
本发明还提供了所述饲料添加剂的制备方法，麝香草酚与酵母细胞混合培养。
作为优选，所述饲料添加剂的制备方法中所述酵母细胞由酵母的单克隆扩大培养得到。
作为优选，所述饲料添加剂的制备方法中所述麝香草酚的浓度为400-500μg/ml，所述酵母细胞的浓度为300-450mg/ml。
在一些实施例中，所述饲料添加剂的制备方法中所述麝香草酚的浓度为450μg/ml，所述酵母细胞的浓度为400mg/ml。
作为优选，所述饲料添加剂的制备方法中所述培养为30℃，培养4-8小时。
作为优选，所述饲料添加剂的制备方法中所述酵母为安琪酵母。
本发明还提供了所述饲料添加剂在饲料的抗菌及吸附黄曲霉素中的应用。
本发明的目的针对现有技术中仅使用酵母细胞壁吸附黄曲霉毒素的吸附效果差的不足，在酵母细胞中添加麝香草酚，不需破除酵母细胞壁，同时，还解决了普通的酵母细胞壁吸附黄曲霉毒素效果差的技术缺陷。在酵母细胞中添加麝香草酚，可以使酵母细胞壁自行裂解，提高酵母细胞壁中的β-葡聚糖、甘露聚糖含量，酵母细胞壁的多糖可以有效的吸附黄曲霉毒素、能有效降低饲料中的黄曲霉毒素，并且麝香草酚具有原料易得、价格低廉的特点。因此，本发明公开饲料添加剂是一种高效、环保的添加剂，所公开的饲料添加剂的制备方法具有工艺简单、成本低廉的优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示饲料添加剂对黄曲霉素AFB1的吸附去毒能力，1为第一组，2为第二组(添加麝香草酚和酵母细胞组)；
图2示麝香草酚诱导酵母细胞流式细胞术检测图，(A)为ECD通道的流式结果图，(B为)PB450通道的流式结果图；
图3示麝香草酚诱导酵母细胞荧光显微镜检测图；
图4示麝香草酚诱导酵母细胞聚丙烯酰胺凝胶电泳检测图，(A)为SDS-PAGE检测可溶性蛋白质含量的变化，(B)为酵母细胞经麝香草酚处理后可溶性蛋白的相对含量；
图5示麝香草酚诱导酵母细胞β-葡聚糖含量测定图；
图6示麝香草酚对酵母细胞壁吸附黄曲霉毒素AFB1的影响，(A)为TLC检测细胞壁吸附AFB1含量的变化，(B)为酵母细胞壁吸附AFB1相对值；
图7示UV检测酵母细胞壁对麝香草酚的载药量的变化，其中T300为添加300μg/mL麝香草酚，T500为添加500μg/mL麝香草酚，Y+T300为添加酵母细胞+300μg/mL麝香草酚，Y+T500为添加酵母细胞+500μg/mL麝香草酚；
图8示含有经麝香草酚处理的酵母细胞壁的平板上生长的黄曲霉菌丝受到抑制图。
具体实施方式
本发明提供了一种饲料添加剂及其制备方法，用于解决现有技术中的技术缺陷。
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
其中，黄曲霉毒素溶液为市售，用PBS(pH 6.5 0.01M)稀释3倍得到B1溶液。本发明的实施例均运用SPSS 12.0数据处理系统，采用Duncan's新复极差法(DMRT)进行显著性分析。图表数据的结果均是三次实验数据的平均值±SD。采用Origin 8.5软件对实验数据分析处理。
实施例1 饲料添加剂对黄曲霉素AFB1的吸附去毒能力
基础饲料配方为贻贝粉15％，豆饼15％，麦麸45％，大麦10％，玉米15％。该基础饲料中不含真菌毒素。
取基础饲料，分两组。第一组在基础饲料中添加0.1mg/kg黄曲霉毒素B1(AFB1)后添加酵母细胞(终浓度为400mg/ml)，然后充分搅拌震荡4小时混合均匀。第二组在基础饲料中添加0.1mg/kg黄曲霉毒素B1(AFB1)后再添加麝香草酚和酵母细胞至麝香草酚终浓度为450μg/ml和酵母细胞终浓度为400mg/ml，然后充分搅拌震荡4小时混合均匀。然后分别检测两组饲料中AFB1含量，结果见图1。
其中，AFB1含量测定步骤如下：吸取一定量黄曲霉培养滤液，加三倍氯仿萃取，萃取液于60℃用氮吹仪吹干，吹干物质在甲醇中溶解，过0.22μm微孔滤膜，然后用HPLC测定。色谱柱：COSMOSIL 5C18-MS-II Packed Column(4.6mm I.D.×250mm)(上海泉岛公司)；柱温：22℃；进样量：10μL；检测波长：365nm；流动相：乙腈：甲醇：水(1:1:2，v/v/v)；流速：1mL/min。
图1结果显示与第一组相比，第二组中的AFB1含量显著降低，说明450μg/ml的麝香草酚和终浓度为400mg/ml酵母细胞的添加剂能有效的吸附AFB1。
另外，在基础饲料中添加黄曲霉毒素B1(AFB1)后再添加麝香草酚和酵母细胞至麝香草酚终浓度为400μg/ml和酵母细胞终浓度为300mg/ml，AFB1含量显著降低。
在基础饲料中添加黄曲霉毒素B1(AFB1)后再添加麝香草酚和酵母细胞至麝香草酚终浓度为500μg/ml和酵母细胞终浓度为450mg/ml，AFB1含量也显著降低。
实施例2 麝香草酚诱导酵母细胞流式细胞术检测
取少量的安琪酵母放入离心管(1.5ml)中，加入1ml的无菌水，涡旋震荡，在YPD固体培养基划线，培养24小时，挑取单克隆，将酵母的单克隆置于20ml的酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)液体培养基中，30℃、160r/min培养12小时；把培养后的菌液取1ml分别加入到序号为①～⑦的离心管中，①～⑦中分别加入0、0.5μl、1μl、2μl、3μl、4μl、5μl的麝香草酚，处理4h；把处理的样品，5000g离心2min后弃上清得沉淀，沉淀用PBS洗涤两次，去除PBS后加入1ml细胞染色缓冲液，加入8μl的Hoechst染色液和8μl的PI染色液，吹打2～3次混匀，4℃孵育20-30min后，离心去掉细胞染色缓冲液后用PBS洗涤一次。
每个样品用尼龙膜过滤加入到流式管中，上机，选择ECD和PB450两个通道进行测定。
图2结果显示，在ECD通道下，麝香草酚的浓度在300、400和500μg/ml时，峰有明显的右移；在PB450通道下，麝香草酚的浓度为200、300、400和500μg/ml，峰有明显的右移，说明麝香草酚在200μg/ml诱导酵母细胞的凋亡，在300μg/ml诱导酵母细胞的死亡。
实施例3 麝香草酚诱导酵母细胞荧光显微镜检测
取少量的安琪酵母放入离心管(1.5ml)中，加入1ml的无菌水，涡旋震荡，在YPD固体培养基划线，培养24小时，挑取单克隆，将酵母的单克隆置于20ml的酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)液体培养基中，30℃、160r/min培养12小时；把培养后的菌液取1ml分别加入到序号为①～⑦的离心管中，①～⑦中分别加入0、0.5μl、1μl、2μl、3μl、4μl、5μl的麝香草酚，处理4h；把处理的样品，5000g离心2min后弃上清得沉淀，沉淀用PBS洗涤两次，去除PBS后加入1ml细胞染色缓冲液，加入8μl的Hoechst染色液和8μl的PI染色液，吹打2～3次混匀，4℃孵育20-30min后，去掉细胞染色缓冲液后用PBS洗涤一次；每个样品取10μl加入到96孔板，在加990μl PBS(稀释100倍)进行荧光显微镜检测。其中Hoechst染色液和PI染色液均与细胞DNA结合，可以用做细胞凋亡和死亡的检测。
其中，染料PI可以与双链核酸分子结合发出红色荧光，但是不能穿透细胞膜，对于具有完整细胞膜的正常细胞不能染色，因此经常被用来鉴定死亡细胞；染料Hoechst可以与DNA双链中的小沟结合，更倾向与于富含A/T的DNA链，可以穿过细胞膜，与活细胞的DNA结合。
如图3所示，酵母细胞经过麝香草酚处理后，随着麝香草酚的浓度的增加，通过荧光显微镜检测，酵母细胞发出强烈的红色荧光和蓝色荧光，这表明麝香草酚杀死了酵母细胞，导致酵母细胞裂解。
实施例4 麝香草酚诱导酵母细胞的聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳检测
取少量的安琪酵母放入离心管(1.5ml)中，加入1ml的无菌水，涡旋震荡，在YPD固体培养基划线，培养24小时，挑取单克隆，将酵母的单克隆置于到在20ml的YPD液体培养基，30℃，160r/min培养12小时。培养后的菌液取1ml分别加入到序号为①～⑦的离心管中，①～⑦中分别加入0、0.5μl、1μl、2μl、3μl、4μl、5μl的麝香草酚，30℃，200rpm/min处理4小时。把处理的样品，5000g离心2min后弃上清液，加入200μL PBS(0.2M)混匀，加30mg玻璃珠，进行细胞壁破碎。取16μl细胞壁破碎后样品的上清液与4μl5X样品缓冲液混合进行SDS-PAGE电泳(pH 6.8 1mol/L Tris-HCl 0.6mL，50％甘油5mL，10％SDS 2mL，β-巯基乙醇0.5mL，1％溴酚蓝1mL，双蒸水0.9mL)按4:1的体积比例混合，100℃煮沸5min，离心，冷却至室温后，上样20μL，分离胶为10％，浓缩胶为5％。开始电压控制在80V，进入分离胶后电压控制在120V，电泳时间3.5-4h。放置多功能脱色摇床染色(0.1％氨基黑10B的7％醋酸溶液)1h，在7％醋酸溶液中脱色，过夜，直至胶的背景颜色完全透明。其中蛋白含量相对值通过光密度软件Image-Pro Plus 6.0(Media Cybernetics,Inc.)计算测得。
如图4所示，随着麝香草酚的浓度增大，SDS-PAGE电泳条带减少且变淡，说明细胞的可溶性蛋白含量显著降低，其中高浓度麝香草酚(500μg/ml的麝香草酚)处理后可溶性蛋白含量仅为对照的2/5。说明麝香草酚进入酵母细胞，细胞裂解，内容物释放出来，蛋白质的量减少。
实施例5 麝香草酚诱导酵母细胞β-葡聚糖测定
取少量的安琪酵母放入离心管(1.5ml)中，加入1ml的无菌水，涡旋震荡，在YPD固体培养基划线，培养24小时，挑取单克隆，在25ml的YPD液体培养基，30℃，160r/min培养24小时，培养后的三角瓶中的菌液取10μl分别加入到序号分别为①～⑦的含有100ml的YPD液体培养基中，①～⑦中分别加入0、50、100、200、300、400、500μg/ml的麝香草酚，处理4小时。把每个处理条件中含有麝香草酚的菌液分成40ml、40ml、20ml的离心管中，5000rpm离心3min后弃上清，将沉淀在-20℃预冷24小时，再进行冷冻干燥24小时，把得出的安琪酵母的细胞壁在干燥的地方进行保藏。每个浓度的麝香草酚的酵母细胞壁取10mg，溶2ml 50％稀硫酸水解半小时，用苯酚硫酸法测β-葡聚糖的含量，在490nm测吸光值。
图5结果显示，经麝香草酚处理获得的酵母细胞壁，用苯酚硫酸法测其β-葡聚糖的含量，可以看出在麝香草酚400、500μg/ml浓度处理下，酵母细胞裂解，细胞壁β-葡聚糖的含量升高。
实施例6 麝香草酚诱导黄曲霉的薄层层析实验
酵母细胞及麝香草酚抑菌试验。步骤如下：在离心管(1.5ml)中分别加入酵母30mg，其中麝香草酚的浓度梯度分别为0、100、200、300、400、500μg/ml，编号为序号1～6，再加入200μl的黄曲霉毒素B1溶液，将处理后的样品进行37℃，1000rpm震荡培养1小时，然后10000g离心10min，取上清液进行薄层层析实验，展开剂是丙酮：氯仿＝1:9。在365nm紫外光下拍摄照片，得到抑制黄曲霉毒素产生效果。其中毒素吸附相对值通过光密度软件Image-Pro Plus 6.0(Media Cybernetics,Inc.)计算侧得。
图6结果表明酵母细胞经不同浓度的麝香草酚处理后，经薄层层析实验观察黄曲霉毒素的含量显著降低，其中高浓度麝香草酚(300、400、500μg/ml)处理后AFB1的相对值仅为对照的1/2。这就表明，酵母细胞经麝香草酚处理后，结合黄曲霉毒素的效果更加显著。
实施例7 酵母细胞壁经麝香草酚处理后的载药情况
样品前处理：挑取已活化的酵母单克隆于液体YPD培养基中在30℃，160r/min振荡培养至OD600＝2.0，分装于50mL的EP管中，5000r/min离心5min，以5mL的PBS洗酵母细胞两次，称得质量均为650mg。用3mL浓度分别为300μg/mL、500μg/mL的麝香草酚处理30s，5000r/min离心5min取上清，测定其在210-400nm波长范围内的紫外吸收光谱。
图7的结果显示麝香草酚在273nm处有最大吸收峰，随着浓度的增大其紫外吸收峰值逐渐增大。当添加酵母细胞后，麝香草酚的273nm的吸收峰值显著降低，说明酵母细胞壁可以吸附麝香草酚，对麝香草酚有一定的载药能力。
实施例8 黄曲霉菌抑制实验
取少量的安琪酵母放入离心管(1.5ml)中，加入1ml的无菌水，涡旋震荡，在YPD固体培养基划线，培养24小时，挑取单克隆，在25ml的YPD液体培养基，30℃，160r/min培养24小时，培养后的三角瓶中的菌液取10μl分别加入到序号分别为1、2、3的含有100ml的YPD液体培养基中，1、2、3中分别加入0、300、500μg/ml的麝香草酚，处理4小时。把每个处理条件中含有麝香草酚的菌液分成40ml、40ml、20ml的离心管中，5000rpm离心3min后弃上清，将沉淀在-20℃预冷24小时，再进行冷冻干燥24小时，把得出的安琪酵母的细胞壁在干燥的地方进行保藏。
把序号为1、2、3的酵母细胞壁以重量比为5％的比例溶入到沙氏固体培养基上，使用无菌打孔器打小孔，把黄曲霉的菌丝插入其中，在37℃下培养24小时观察菌丝长势。培养基完全凝固后，用0.1％的Triton×100收集新鲜的黄曲霉孢子，用血球计数板在显微镜下计数，稀释成孢子悬浮液浓度达到1×105CFU/mL。然后使制备好的孢子悬浮液稀释10倍和100倍，取10μL在制备好的含有酵母细胞壁的沙氏固体培养基中进行滴板实验。
如图8所示，酵母细胞与麝香草酚组合，可以使酵母细胞壁自行裂解，提高酵母细胞壁中的β-葡聚糖、甘露聚糖含量，提高酵母细胞壁吸附黄曲霉毒素的能力，麝香草酚浓度为500μg/ml时，说明饲料添加剂的麝香草酚与酵母细胞壁能对黄曲霉的菌丝的长势有明显的抑制作用。
综上所述，本发明解决了现有技术中去除饲料中黄曲霉毒素的方法中降低饲料营养价值，污染环境，方法单一，工序复杂，成本高的技术缺陷。本发明的目的在于提供了麝香草酚的新用途。针对现有技术中仅使用酵母细胞壁吸附黄曲霉毒素的吸附效果差的不足，在酵母细胞中添加麝香草酚，不需破除酵母细胞壁，同时，还解决了普通的酵母细胞壁吸附黄曲霉毒素效果差的技术缺陷。在酵母细胞中添加麝香草酚，可以使酵母细胞壁自行裂解，提高酵母细胞壁中的β-葡聚糖、甘露聚糖含量，酵母细胞壁的多糖可以有效的吸附黄曲霉毒素，能有效降低饲料中的黄曲霉毒素，并且麝香草酚具有原料易得、价格低廉的特点。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种饲料添加剂在吸附饲料中黄曲霉毒素的应用，其特征在于，所述饲料添加剂的制备方法为：麝香草酚与酵母细胞混合培养；
所述麝香草酚的浓度为400-500μg/ml；所述酵母细胞的浓度为300-450mg/ml；
所述培养为30℃，培养4-8小时。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述酵母细胞由酵母的单克隆扩大培养得到。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述酵母为安琪酵母。
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