CN106578386A - 麝香草酚的新应用 - Google Patents
麝香草酚的新应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106578386A CN106578386A CN201611187164.5A CN201611187164A CN106578386A CN 106578386 A CN106578386 A CN 106578386A CN 201611187164 A CN201611187164 A CN 201611187164A CN 106578386 A CN106578386 A CN 106578386A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- thymol
- yeast
- yeast cells
- feed additive
- cell wall
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- MGSRCZKZVOBKFT-UHFFFAOYSA-N thymol Chemical compound CC(C)C1=CC=C(C)C=C1O MGSRCZKZVOBKFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 162
- 239000005844 Thymol Substances 0.000 title claims abstract description 81
- 229960000790 thymol Drugs 0.000 title claims abstract description 81
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims abstract description 87
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 claims abstract description 27
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 17
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 24
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 11
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 33
- 229930195730 Aflatoxin Natural products 0.000 abstract description 19
- XWIYFDMXXLINPU-UHFFFAOYSA-N Aflatoxin G Chemical compound O=C1OCCC2=C1C(=O)OC1=C2C(OC)=CC2=C1C1C=COC1O2 XWIYFDMXXLINPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 19
- 239000005409 aflatoxin Substances 0.000 abstract description 19
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 18
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 abstract description 3
- 230000000050 nutritive effect Effects 0.000 abstract description 3
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 abstract description 3
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 abstract description 3
- 230000007547 defect Effects 0.000 abstract 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- FYGDTMLNYKFZSV-URKRLVJHSA-N (2s,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,4r,5r,6s)-4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-[(2r,4r,5r,6s)-4,5,6-trihydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1[C@@H](CO)O[C@@H](OC2[C@H](O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-URKRLVJHSA-N 0.000 description 10
- 229920002498 Beta-glucan Polymers 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 231100000678 Mycotoxin Toxicity 0.000 description 9
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 9
- 239000002636 mycotoxin Substances 0.000 description 9
- 241000228197 Aspergillus flavus Species 0.000 description 8
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 8
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 7
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000009514 concussion Effects 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 150000003601 thymols Chemical class 0.000 description 6
- 229920000057 Mannan Polymers 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 244000153234 Hibiscus abelmoschus Species 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 4
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 4
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 3
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical group CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000002734 clay mineral Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 235000019628 coolness Nutrition 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 2
- HNPSIPDUKPIQMN-UHFFFAOYSA-N dioxosilane;oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O HNPSIPDUKPIQMN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- OQUKIQWCVTZJAF-UHFFFAOYSA-N phenol;sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O.OC1=CC=CC=C1 OQUKIQWCVTZJAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241001269238 Data Species 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 241000207923 Lamiaceae Species 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 229910021536 Zeolite Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 229910000323 aluminium silicate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000440 bentonite Substances 0.000 description 1
- 229910000278 bentonite Inorganic materials 0.000 description 1
- SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N bentoquatam Chemical compound O.O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003969 blast cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000004042 decolorization Methods 0.000 description 1
- 230000033629 detection of yeast Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 235000018927 edible plant Nutrition 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 229930003658 monoterpene Natural products 0.000 description 1
- 150000002773 monoterpene derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000002577 monoterpenes Nutrition 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000001117 sulphuric acid Substances 0.000 description 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 1
- 208000006379 syphilis Diseases 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
- 239000000052 vinegar Substances 0.000 description 1
- 235000021419 vinegar Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000000341 volatile oil Substances 0.000 description 1
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 1
- 239000010457 zeolite Substances 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Fodder In General (AREA)
Abstract
本发明属于饲料添加剂领域，尤其涉及麝香草酚的新应用。本发明提供了麝香草酚在溶解酵母细胞壁并提高酵母细胞壁多糖含量中的新用途，本发明还提供了一种饲料添加剂包括麝香草酚和酵母细胞，所述饲料添加剂的制备方法为麝香草酚与酵母细胞混合培养。该发明解决了现有去除饲料中黄曲霉毒素的方法中降低饲料营养价值，污染环境，方法单一，工序复杂，成本较高的技术缺陷的技术缺陷。所得的饲料添加剂能高效吸附饲料中的黄曲霉素，而且绿色无污染。同时，制备所述饲料添加剂的方法具有工艺简单、成本低廉的优点。
Description
技术领域
本发明属于饲料添加剂领域，尤其涉及一种饲料添加剂及其制备方法。
背景技术
谷物与饲料中霉菌毒素的污染是一个全球性问题。据报道，全球至少25％的饲料受到已知霉菌毒素的污染，霉菌毒素不仅会直接对动物造成毒害，还会通过食物链从动物转移到人体中。有些毒素在动物体内通过代谢会产生一些毒素相关化合物，而这些化合物也会经过食物链对人体产生伤害。霉菌毒素一直是困扰世界的难题，科研工作者曾用过物理、化学、生物的方法去除或钝化饲料中的霉菌毒素，目前通用的物理方法是吸附法，采用无机粘土矿物如膨润土、沸石以及铝硅酸盐等，这些粘土矿物质虽然能一定程度吸附饲料的霉菌毒素，但存在很多缺点，添加比例高，降低配合饲料的营养价值；无法进行生物降解，造成严重的环境污染，同时也会吸附矿物质、维生素等营养元素。
目前，在饲料加工生产与使用中，采用的生物学方法是添加酵母细胞壁的方法来去除霉菌毒素，其中霉菌毒素大多为黄曲霉毒素。研究表明，酵母或酵母细胞壁成分具有吸附黄曲霉毒素的能力，其中β-葡聚糖、甘露聚糖是酵母细胞壁的活性成分之一，对黄曲霉毒素有一定的吸附能力。但是从酵母获得的酵母细胞壁含量较少，不能满足饲料加工生产的需求，同时，获得酵母细胞壁的方法工序繁多，成本较高，制约了其在饲料加工生产的应用。
综上所述，传统的去除饲料黄曲霉毒素的方法中污染环境，降低饲料营养价值，方法单一，工序复杂，成本较高的技术缺陷。因此，寻找一种高效、环保、工艺简单、成本低廉的去除饲料中黄曲霉毒素的物质是本领域技术人员亟待解决的技术问题。
发明内容
麝香草酚(Thymol)，别名百里酚，是一种单萜酚，主要存在于唇形科百里香属植物中，是百里香属植物挥发油的主要成分；麝香草酚是从可食用植物中提取出来的，安全性高，资源丰富据研究表明麝香草酚对食品中常见的细菌、酵母菌和霉菌有一定抑菌作用；毒副作用小、安全性高的天然植物防腐剂。本发明发现在酵母细胞中添加麝香草酚，可以使酵母细胞壁自行裂解，提高酵母细胞壁中的β-葡聚糖、甘露聚糖含量。因此本发明提供了麝香草酚在溶解酵母细胞壁、提高酵母细胞壁多糖含量的新用途。
本发明还提供了一种饲料添加剂，包括麝香草酚和酵母细胞。
作为优选，所述麝香草酚与所述酵母细胞的质量比为(4～5)：(3000～4500)。
进一步的，作为优选，所述麝香草酚的浓度为400-500μg/ml。
本发明还提供了所述饲料添加剂的制备方法，麝香草酚与酵母细胞混合培养。
作为优选，所述饲料添加剂的制备方法中所述酵母细胞由酵母的单克隆扩大培养得到。
作为优选，所述饲料添加剂的制备方法中所述麝香草酚的浓度为400-500μg/ml，所述酵母细胞的浓度为300-450mg/ml。
在一些实施例中，所述饲料添加剂的制备方法中所述麝香草酚的浓度为450μg/ml，所述酵母细胞的浓度为400mg/ml。
作为优选，所述饲料添加剂的制备方法中所述培养为30℃，培养4-8小时。
作为优选，所述饲料添加剂的制备方法中所述酵母为安琪酵母。
本发明还提供了所述饲料添加剂在饲料的抗菌及吸附黄曲霉素中的应用。
本发明的目的针对现有技术中仅使用酵母细胞壁吸附黄曲霉毒素的吸附效果差的不足，在酵母细胞中添加麝香草酚，不需破除酵母细胞壁，同时，还解决了普通的酵母细胞壁吸附黄曲霉毒素效果差的技术缺陷。在酵母细胞中添加麝香草酚，可以使酵母细胞壁自行裂解，提高酵母细胞壁中的β-葡聚糖、甘露聚糖含量，酵母细胞壁的多糖可以有效的吸附黄曲霉毒素、能有效降低饲料中的黄曲霉毒素，并且麝香草酚具有原料易得、价格低廉的特点。因此，本发明公开饲料添加剂是一种高效、环保的添加剂，所公开的饲料添加剂的制备方法具有工艺简单、成本低廉的优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示饲料添加剂对黄曲霉素AFB1的吸附去毒能力，1为第一组，2为第二组(添加麝香草酚和酵母细胞组)；
图2示麝香草酚诱导酵母细胞流式细胞术检测图，(A)为ECD通道的流式结果图，(B为)PB450通道的流式结果图；
图3示麝香草酚诱导酵母细胞荧光显微镜检测图；
图4示麝香草酚诱导酵母细胞聚丙烯酰胺凝胶电泳检测图，(A)为SDS-PAGE检测可溶性蛋白质含量的变化，(B)为酵母细胞经麝香草酚处理后可溶性蛋白的相对含量；
图5示麝香草酚诱导酵母细胞β-葡聚糖含量测定图；
图6示麝香草酚对酵母细胞壁吸附黄曲霉毒素AFB1的影响，(A)为TLC检测细胞壁吸附AFB1含量的变化，(B)为酵母细胞壁吸附AFB1相对值；
图7示UV检测酵母细胞壁对麝香草酚的载药量的变化，其中T300为添加300μg/mL麝香草酚，T500为添加500μg/mL麝香草酚，Y+T300为添加酵母细胞+300μg/mL麝香草酚，Y+T500为添加酵母细胞+500μg/mL麝香草酚；
图8示含有经麝香草酚处理的酵母细胞壁的平板上生长的黄曲霉菌丝受到抑制图。
具体实施方式
本发明提供了一种饲料添加剂及其制备方法，用于解决现有技术中的技术缺陷。
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
其中，黄曲霉毒素溶液为市售，用PBS(pH 6.5 0.01M)稀释3倍得到B1溶液。本发明的实施例均运用SPSS 12.0数据处理系统，采用Duncan's新复极差法(DMRT)进行显著性分析。图表数据的结果均是三次实验数据的平均值±SD。采用Origin 8.5软件对实验数据分析处理。
实施例1 饲料添加剂对黄曲霉素AFB1的吸附去毒能力
基础饲料配方为贻贝粉15％，豆饼15％，麦麸45％，大麦10％，玉米15％。该基础饲料中不含真菌毒素。
取基础饲料，分两组。第一组在基础饲料中添加0.1mg/kg黄曲霉毒素B1(AFB1)后添加酵母细胞(终浓度为400mg/ml)，然后充分搅拌震荡4小时混合均匀。第二组在基础饲料中添加0.1mg/kg黄曲霉毒素B1(AFB1)后再添加麝香草酚和酵母细胞至麝香草酚终浓度为450μg/ml和酵母细胞终浓度为400mg/ml，然后充分搅拌震荡4小时混合均匀。然后分别检测两组饲料中AFB1含量，结果见图1。
其中，AFB1含量测定步骤如下：吸取一定量黄曲霉培养滤液，加三倍氯仿萃取，萃取液于60℃用氮吹仪吹干，吹干物质在甲醇中溶解，过0.22μm微孔滤膜，然后用HPLC测定。色谱柱：COSMOSIL 5C18-MS-II Packed Column(4.6mm I.D.×250mm)(上海泉岛公司)；柱温：22℃；进样量：10μL；检测波长：365nm；流动相：乙腈：甲醇：水(1:1:2，v/v/v)；流速：1mL/min。
图1结果显示与第一组相比，第二组中的AFB1含量显著降低，说明450μg/ml的麝香草酚和终浓度为400mg/ml酵母细胞的添加剂能有效的吸附AFB1。
另外，在基础饲料中添加黄曲霉毒素B1(AFB1)后再添加麝香草酚和酵母细胞至麝香草酚终浓度为400μg/ml和酵母细胞终浓度为300mg/ml，AFB1含量显著降低。
在基础饲料中添加黄曲霉毒素B1(AFB1)后再添加麝香草酚和酵母细胞至麝香草酚终浓度为500μg/ml和酵母细胞终浓度为450mg/ml，AFB1含量也显著降低。
实施例2 麝香草酚诱导酵母细胞流式细胞术检测
取少量的安琪酵母放入离心管(1.5ml)中，加入1ml的无菌水，涡旋震荡，在YPD固体培养基划线，培养24小时，挑取单克隆，将酵母的单克隆置于20ml的酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)液体培养基中，30℃、160r/min培养12小时；把培养后的菌液取1ml分别加入到序号为①～⑦的离心管中，①～⑦中分别加入0、0.5μl、1μl、2μl、3μl、4μl、5μl的麝香草酚，处理4h；把处理的样品，5000g离心2min后弃上清得沉淀，沉淀用PBS洗涤两次，去除PBS后加入1ml细胞染色缓冲液，加入8μl的Hoechst染色液和8μl的PI染色液，吹打2～3次混匀，4℃孵育20-30min后，离心去掉细胞染色缓冲液后用PBS洗涤一次。
每个样品用尼龙膜过滤加入到流式管中，上机，选择ECD和PB450两个通道进行测定。
图2结果显示，在ECD通道下，麝香草酚的浓度在300、400和500μg/ml时，峰有明显的右移；在PB450通道下，麝香草酚的浓度为200、300、400和500μg/ml，峰有明显的右移，说明麝香草酚在200μg/ml诱导酵母细胞的凋亡，在300μg/ml诱导酵母细胞的死亡。
实施例3 麝香草酚诱导酵母细胞荧光显微镜检测
取少量的安琪酵母放入离心管(1.5ml)中，加入1ml的无菌水，涡旋震荡，在YPD固体培养基划线，培养24小时，挑取单克隆，将酵母的单克隆置于20ml的酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)液体培养基中，30℃、160r/min培养12小时；把培养后的菌液取1ml分别加入到序号为①～⑦的离心管中，①～⑦中分别加入0、0.5μl、1μl、2μl、3μl、4μl、5μl的麝香草酚，处理4h；把处理的样品，5000g离心2min后弃上清得沉淀，沉淀用PBS洗涤两次，去除PBS后加入1ml细胞染色缓冲液，加入8μl的Hoechst染色液和8μl的PI染色液，吹打2～3次混匀，4℃孵育20-30min后，去掉细胞染色缓冲液后用PBS洗涤一次；每个样品取10μl加入到96孔板，在加990μl PBS(稀释100倍)进行荧光显微镜检测。其中Hoechst染色液和PI染色液均与细胞DNA结合，可以用做细胞凋亡和死亡的检测。
其中，染料PI可以与双链核酸分子结合发出红色荧光，但是不能穿透细胞膜，对于具有完整细胞膜的正常细胞不能染色，因此经常被用来鉴定死亡细胞；染料Hoechst可以与DNA双链中的小沟结合，更倾向与于富含A/T的DNA链，可以穿过细胞膜，与活细胞的DNA结合。
如图3所示，酵母细胞经过麝香草酚处理后，随着麝香草酚的浓度的增加，通过荧光显微镜检测，酵母细胞发出强烈的红色荧光和蓝色荧光，这表明麝香草酚杀死了酵母细胞，导致酵母细胞裂解。
实施例4 麝香草酚诱导酵母细胞的聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳检测
取少量的安琪酵母放入离心管(1.5ml)中，加入1ml的无菌水，涡旋震荡，在YPD固体培养基划线，培养24小时，挑取单克隆，将酵母的单克隆置于到在20ml的YPD液体培养基，30℃，160r/min培养12小时。培养后的菌液取1ml分别加入到序号为①～⑦的离心管中，①～⑦中分别加入0、0.5μl、1μl、2μl、3μl、4μl、5μl的麝香草酚，30℃，200rpm/min处理4小时。把处理的样品，5000g离心2min后弃上清液，加入200μL PBS(0.2M)混匀，加30mg玻璃珠，进行细胞壁破碎。取16μl细胞壁破碎后样品的上清液与4μl5X样品缓冲液混合进行SDS-PAGE电泳(pH 6.8 1mol/L Tris-HCl 0.6mL，50％甘油5mL，10％SDS 2mL，β-巯基乙醇0.5mL，1％溴酚蓝1mL，双蒸水0.9mL)按4:1的体积比例混合，100℃煮沸5min，离心，冷却至室温后，上样20μL，分离胶为10％，浓缩胶为5％。开始电压控制在80V，进入分离胶后电压控制在120V，电泳时间3.5-4h。放置多功能脱色摇床染色(0.1％氨基黑10B的7％醋酸溶液)1h，在7％醋酸溶液中脱色，过夜，直至胶的背景颜色完全透明。其中蛋白含量相对值通过光密度软件Image-Pro Plus 6.0(Media Cybernetics,Inc.)计算测得。
如图4所示，随着麝香草酚的浓度增大，SDS-PAGE电泳条带减少且变淡，说明细胞的可溶性蛋白含量显著降低，其中高浓度麝香草酚(500μg/ml的麝香草酚)处理后可溶性蛋白含量仅为对照的2/5。说明麝香草酚进入酵母细胞，细胞裂解，内容物释放出来，蛋白质的量减少。
实施例5 麝香草酚诱导酵母细胞β-葡聚糖测定
取少量的安琪酵母放入离心管(1.5ml)中，加入1ml的无菌水，涡旋震荡，在YPD固体培养基划线，培养24小时，挑取单克隆，在25ml的YPD液体培养基，30℃，160r/min培养24小时，培养后的三角瓶中的菌液取10μl分别加入到序号分别为①～⑦的含有100ml的YPD液体培养基中，①～⑦中分别加入0、50、100、200、300、400、500μg/ml的麝香草酚，处理4小时。把每个处理条件中含有麝香草酚的菌液分成40ml、40ml、20ml的离心管中，5000rpm离心3min后弃上清，将沉淀在-20℃预冷24小时，再进行冷冻干燥24小时，把得出的安琪酵母的细胞壁在干燥的地方进行保藏。每个浓度的麝香草酚的酵母细胞壁取10mg，溶2ml 50％稀硫酸水解半小时，用苯酚硫酸法测β-葡聚糖的含量，在490nm测吸光值。
图5结果显示，经麝香草酚处理获得的酵母细胞壁，用苯酚硫酸法测其β-葡聚糖的含量，可以看出在麝香草酚400、500μg/ml浓度处理下，酵母细胞裂解，细胞壁β-葡聚糖的含量升高。
实施例6 麝香草酚诱导黄曲霉的薄层层析实验
酵母细胞及麝香草酚抑菌试验。步骤如下：在离心管(1.5ml)中分别加入酵母30mg，其中麝香草酚的浓度梯度分别为0、100、200、300、400、500μg/ml，编号为序号1～6，再加入200μl的黄曲霉毒素B1溶液，将处理后的样品进行37℃，1000rpm震荡培养1小时，然后10000g离心10min，取上清液进行薄层层析实验，展开剂是丙酮：氯仿＝1:9。在365nm紫外光下拍摄照片，得到抑制黄曲霉毒素产生效果。其中毒素吸附相对值通过光密度软件Image-Pro Plus 6.0(Media Cybernetics,Inc.)计算侧得。
图6结果表明酵母细胞经不同浓度的麝香草酚处理后，经薄层层析实验观察黄曲霉毒素的含量显著降低，其中高浓度麝香草酚(300、400、500μg/ml)处理后AFB1的相对值仅为对照的1/2。这就表明，酵母细胞经麝香草酚处理后，结合黄曲霉毒素的效果更加显著。
实施例7 酵母细胞壁经麝香草酚处理后的载药情况
样品前处理：挑取已活化的酵母单克隆于液体YPD培养基中在30℃，160r/min振荡培养至OD600＝2.0，分装于50mL的EP管中，5000r/min离心5min，以5mL的PBS洗酵母细胞两次，称得质量均为650mg。用3mL浓度分别为300μg/mL、500μg/mL的麝香草酚处理30s，5000r/min离心5min取上清，测定其在210-400nm波长范围内的紫外吸收光谱。
图7的结果显示麝香草酚在273nm处有最大吸收峰，随着浓度的增大其紫外吸收峰值逐渐增大。当添加酵母细胞后，麝香草酚的273nm的吸收峰值显著降低，说明酵母细胞壁可以吸附麝香草酚，对麝香草酚有一定的载药能力。
实施例8 黄曲霉菌抑制实验
取少量的安琪酵母放入离心管(1.5ml)中，加入1ml的无菌水，涡旋震荡，在YPD固体培养基划线，培养24小时，挑取单克隆，在25ml的YPD液体培养基，30℃，160r/min培养24小时，培养后的三角瓶中的菌液取10μl分别加入到序号分别为1、2、3的含有100ml的YPD液体培养基中，1、2、3中分别加入0、300、500μg/ml的麝香草酚，处理4小时。把每个处理条件中含有麝香草酚的菌液分成40ml、40ml、20ml的离心管中，5000rpm离心3min后弃上清，将沉淀在-20℃预冷24小时，再进行冷冻干燥24小时，把得出的安琪酵母的细胞壁在干燥的地方进行保藏。
把序号为1、2、3的酵母细胞壁以重量比为5％的比例溶入到沙氏固体培养基上，使用无菌打孔器打小孔，把黄曲霉的菌丝插入其中，在37℃下培养24小时观察菌丝长势。培养基完全凝固后，用0.1％的Triton×100收集新鲜的黄曲霉孢子，用血球计数板在显微镜下计数，稀释成孢子悬浮液浓度达到1×105CFU/mL。然后使制备好的孢子悬浮液稀释10倍和100倍，取10μL在制备好的含有酵母细胞壁的沙氏固体培养基中进行滴板实验。
如图8所示，酵母细胞与麝香草酚组合，可以使酵母细胞壁自行裂解，提高酵母细胞壁中的β-葡聚糖、甘露聚糖含量，提高酵母细胞壁吸附黄曲霉毒素的能力，麝香草酚浓度为500μg/ml时，说明饲料添加剂的麝香草酚与酵母细胞壁能对黄曲霉的菌丝的长势有明显的抑制作用。
综上所述，本发明解决了现有技术中去除饲料中黄曲霉毒素的方法中降低饲料营养价值，污染环境，方法单一，工序复杂，成本高的技术缺陷。本发明的目的在于提供了麝香草酚的新用途。针对现有技术中仅使用酵母细胞壁吸附黄曲霉毒素的吸附效果差的不足，在酵母细胞中添加麝香草酚，不需破除酵母细胞壁，同时，还解决了普通的酵母细胞壁吸附黄曲霉毒素效果差的技术缺陷。在酵母细胞中添加麝香草酚，可以使酵母细胞壁自行裂解，提高酵母细胞壁中的β-葡聚糖、甘露聚糖含量，酵母细胞壁的多糖可以有效的吸附黄曲霉毒素，能有效降低饲料中的黄曲霉毒素，并且麝香草酚具有原料易得、价格低廉的特点。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.麝香草酚在溶解酵母细胞壁、提高酵母细胞多糖含量中的应用。
2.一种饲料添加剂，其特征在于，包括麝香草酚和酵母细胞。
3.根据权利要求2所述的饲料添加剂，其特征在于，所述麝香草酚与所述酵母细胞的质量比为(4～5)：(3000～4500)。
4.根据权利要求2所述的饲料添加剂，其特征在于，所述麝香草酚的浓度为400-500μg/ml。
5.一种饲料添加剂的制备方法，其特征在于，麝香草酚与酵母细胞混合培养。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述酵母细胞由酵母的单克隆扩大培养得到。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述麝香草酚的浓度为400-500μg/ml，所述酵母细胞的浓度为300-450mg/ml。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述培养为30℃，培养4-8小时。
9.根据权利要求5所述的饲料添加剂制备方法，其特征在于，所述酵母为安琪酵母。
10.权利要求2或3所述的饲料添加剂和权利要求5至9任意一项所述的制备方法制得的饲料添加剂在饲料的抗菌及吸附黄曲霉素中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201611187164.5A CN106578386B (zh) | 2016-12-20 | 2016-12-20 | 麝香草酚的新应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201611187164.5A CN106578386B (zh) | 2016-12-20 | 2016-12-20 | 麝香草酚的新应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106578386A true CN106578386A (zh) | 2017-04-26 |
| CN106578386B CN106578386B (zh) | 2021-01-29 |
Family
ID=58600437
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201611187164.5A Active CN106578386B (zh) | 2016-12-20 | 2016-12-20 | 麝香草酚的新应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106578386B (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101171954A (zh) * | 2006-10-31 | 2008-05-07 | 日清丸红饲料株式会社 | 球虫病和梭状芽孢杆菌病的预防和/或治疗用饲料 |
| EP1954129A1 (en) * | 2005-11-30 | 2008-08-13 | Eden Research Plc | Terpene-containing compositions and methods of making and using them |
| CN103005210A (zh) * | 2012-12-25 | 2013-04-03 | 广州旺大饲料科技有限公司 | 一种可替代抗生素的猪饲料添加剂及其制备方法和应用 |
| CN104621361A (zh) * | 2015-03-13 | 2015-05-20 | 广东雅琪生物科技有限公司 | 一种含有酵母细胞多糖的饲料添加剂 |
| CN105594994A (zh) * | 2015-12-30 | 2016-05-25 | 浙江大飞龙动物保健品有限公司 | 一种防霉脱毒解毒混合型饲料添加剂 |
-
2016
- 2016-12-20 CN CN201611187164.5A patent/CN106578386B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1954129A1 (en) * | 2005-11-30 | 2008-08-13 | Eden Research Plc | Terpene-containing compositions and methods of making and using them |
| CN101171954A (zh) * | 2006-10-31 | 2008-05-07 | 日清丸红饲料株式会社 | 球虫病和梭状芽孢杆菌病的预防和/或治疗用饲料 |
| CN103005210A (zh) * | 2012-12-25 | 2013-04-03 | 广州旺大饲料科技有限公司 | 一种可替代抗生素的猪饲料添加剂及其制备方法和应用 |
| CN104621361A (zh) * | 2015-03-13 | 2015-05-20 | 广东雅琪生物科技有限公司 | 一种含有酵母细胞多糖的饲料添加剂 |
| CN105594994A (zh) * | 2015-12-30 | 2016-05-25 | 浙江大飞龙动物保健品有限公司 | 一种防霉脱毒解毒混合型饲料添加剂 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| BENNIS,S ET AL: "Surface alteration of Saccharomyces cerevisiae induced by thymol and eugenol", 《LETTERS IN APPLIED MICROBIOLOGY》 * |
| KIM JH ET AL: "Augmenting the Activity of Monoterpenoid Phenols against Fungal Pathogens Using 2-Hydroxy-4-methoxybenzaldehyde that Target Cell Wall Integrity", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR SCIENCES》 * |
| 易本驰等: "《养猪科学用药指南》", 31 July 2014, 河南科学技术出版社 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN106578386B (zh) | 2021-01-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102242069B (zh) | 一种蝉拟青霉菌株及其应用 | |
| CN103145780A (zh) | 一种蓝莓花色苷的制备方法与所制备的蓝莓花色苷的应用 | |
| CN104342390A (zh) | 一种苜蓿中华根瘤菌株及其组合物与应用 | |
| CN103952362A (zh) | 一株对多种植物病原菌具抑菌活性的柑橘内生放线菌 | |
| CN105274028A (zh) | 高效降解黄曲霉毒素b1和赭曲霉毒素a的溶杆菌及其应用 | |
| CN101591618B (zh) | 一种细小炭角菌菌株及其液体发酵培养方法和应用 | |
| CN101037460A (zh) | 栀子苷的分离纯化方法 | |
| CN105255774A (zh) | 降解黄曲霉毒素b1和赭曲霉毒素a的藤黄单胞菌及其应用 | |
| CN105255775A (zh) | 高效降解黄曲霉毒素b1的土壤单胞菌及其应用 | |
| CN105255759A (zh) | 一株黄曲霉毒素和赭曲霉毒素双功能降解菌及其应用 | |
| CN102925511A (zh) | 星形孢菌素的制备方法 | |
| CN103374537B (zh) | 一种制备恩拉霉素的方法及其生产菌株 | |
| CN105663244B (zh) | 一种具有细菌群体感应淬灭活性的无花果叶提取物的用途 | |
| CN106721523A (zh) | 一种应用于大菱鲆养殖的微生态制剂 | |
| CN103789243B (zh) | 一株短小芽孢杆菌及其应用 | |
| CN104273125B (zh) | 6-戊烷基-2氢-吡喃-2-酮在防治植物卵菌病害中的应用 | |
| CN103695342B (zh) | 一株具有溶藻活性的芽孢杆菌及其应用 | |
| CN106578386A (zh) | 麝香草酚的新应用 | |
| CN103421857B (zh) | 一种单端孢霉烯b族毒素的合成方法 | |
| RU2381245C1 (ru) | Способ получения концентрированного красителя | |
| CN103937687B (zh) | 不产黄曲霉毒素的黄曲霉混合菌株及其应用 | |
| CN108624509B (zh) | 一种蝉花人工培养过程中固体培养基的循环利用方法 | |
| CN102911874B (zh) | 一种红色糖多孢菌及其应用 | |
| CN107873734A (zh) | 一种生物防霉剂及其制备方法 | |
| CN103509745B (zh) | 一株寡养单胞菌及其在蓝藻水华控制中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |