KR20060070530A - 결합 구성체 및 이의 사용 방법 - Google Patents

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마르타 에스 하이든-레드베터
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트루비온 파마슈티칼스, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 동족 구조(예, 항원, 카운터수용체 등), 야생형 IgG, IgA 또는 Ig3 힌지 작용 영역(즉, 0개, 1개 또는 2개의 시스테인 잔기를 가지는 IgE CH2 영역 폴리펩티드 또는 돌연변이 IgG1 힌지 영역 폴리펩티드), 및 면역글로불린 CH2 및 CH3 도메인에 대한 결합 도메인을 특징으로 하며, 이황화-연결된 다량체을 형성하는 이들의 능력을 손상시키는, ADCC 및/또는 CDC를 폴리펩티드로서 우세하게 발생시킬 수 있는 신규한 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질에 관한 것이다. 융합 단백질은 재조합하여 고발현 수준으로 제조할 수 있다. 또한 본 발명은 융합 단백질의 세포 표면 형태, 융합 단백질의 면역치료 용도, 및 예컨대 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 면역치료 용도를 비롯한, 관련된 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

결합 구성체 및 이의 사용 방법{BINDING CONSTRUCTS AND METHODS FOR USE THEREOF}
본원이 우선권으로 주장하는 모든 출원건들은 본원에 전체적으로 참고 인용된다.
본 발명은 일반적으로 연구, 진단 및 치료, 예를 들어 면역치료를 위한 사용을 비롯한, 각종 용도들을 갖는 화합물에 관한 것이다. 본 발명의 화합물은 면역학적으로 활성인 단백질 및 단백질 접합물을 포함한다. 그러한 단백질은 재조합 또는 공학처리된 결합 단백질, 예컨대 예를 들어 단일쇄 Fv-면역글로불린 함유의 단일쇄 Fv-면역글로불린 융합 단백질 및 화합물을 포함할 수 있는, 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질을 포함한다. 본 발명은 또한, 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 핵산 구성체를 투여함으로써 개선, 완화 또는 경감되는 상태, 질병 및 장애, 예컨대 예를 들어 자가항체 생산 및/또는 염증을 특징으로 하는 질병을 비롯한, 악성 상태 및 B 세포 장애를 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
면역계는 신체의 많은 복잡한 시스템들 중에서도 가장 복합한 것들 중 하나이다. 많은 상이한 유형의 세포들로 구성되고 많은 상이한 종류의 분자들을 포함하는 광범위하고 복잡한 배열인 인간 면역계는, 신체가 외래 침입자, 예컨대 세균, 바이러스 및 기타 감염성 물질, 및 외래 물질, 예컨대 꽃가루에 반응하도록 한다. 일반적으로, 인간 면역계는 두 가지 부문, 즉 항체-매개 면역(소위 "체액" 또는 "순환" 면역으로도 칭해짐) 및 세포-매개 면역으로 나뉘고, 양자 모두는 임파구에 의해 작동된다. 임파구는 혈액 내에 순환하는 5가지 종류의 백혈세포(백혈구) 중 하나이다. 각기 상이한 기능을 수행하는 수개 종류의 임파구들이 있다. 가장 일반적인 유형의 임파구는 B 임파구(B 세포)이고, 이는 항체 및 T 임파구(T 세포) 생성의 원인이 될 수 있다. 면역계의 세포는 T 세포 및 B 세포뿐만 아니라, 자연살해(NK) 세포, 과립구(또는 다형핵(PMN) 백혈구), 대식세포 및 수지상 세포를 포함한다. 체액계는 T 세포로부터의 도움을 받는 B 세포에 의해 작동되고, 신체의 혈액 및 조직의 감염성 물질을 취급한다. 세포-매개 시스템은 T 세포에 의해 관리되고, 감염된 신체의 세포를 취급한다.
항원은 면역 반응을 자극하거나 유도하는, 주로 거대분자인 물질이다. 단일 미생물은 그것의 복잡한 거대분자의 구조로 인해, 다중 항원(예를 들어, 세포 벽 성분, 난관채, 편모 등의 표면 구조체, 또는 미생물에 의해 생성되는 독소 또는 효소 등의 세포외 단백질)으로 구성된다. 동물 바이러스의 엔벨로프 단백질 중 일부, 및 외피 단백질도 또한 주로 항원성이다. 숙주는 일반적으로 그것의 면역계의 성분과 접촉되는 항원에 특이적으로 반응할 수 있다. 항체-매개 면역 및 세포-매개 면역계 모두는 거의 모든 항원들에 대한 면역 반응에 도달되도록 하는 복잡한 상호작용과 관련된다. 즉, 면역계는 항체-매개 면역, 세포-매개 면역, 또는 양자 모두를 생산하도록 시스템을 자극하는 외래 물질(항원)을 인식할 수 있다.
면역계 복합체는 신체 전반에 걸쳐 산재된 다양한 상이한 세포 유형 및 기관에 의해 구성된다. 이는 1차 및 2차 림프계 기관을 포함한다. 1차 림프계 기관은 골수 및 흉선이다. 면역계의 모든 세포들은 혈액생성으로 칭해지는 공정에서 골수로부터 초기에 유래된다. 혈액생성 중에, 골수-유래 줄기 세포는 면역계의 성숙 세포("B" 세포) 또는 골수로부터 나와, 흉선("T" 세포)에서 성숙하는 세포의 전구체로 분화한다. 골수는 또한 적혈 세포, 혈소판 및 B 세포에 부가하여, 자연살해 세포, 과립구, 및 비성숙 흉선세포를 생산한다. 흉선의 기능은, 성숙 T 세포를 생산하는 것이다. 전(pro)-흉선세포로도 칭해지는 비성숙 흉선세포는 골수를 떠나, 흉선으로 이동하여, 거기에서 성숙한 후, 혈류로 방출된다. 면역계 복합체는 또한 2차 림프계 기관, 예컨대 비장, 임파절 등, 및 혈관과 분리된 순환계 시스템을 포함한다.
B 세포, T 세포, 대식세포, 수지상 세포, 자연살해 세포 및 적혈 세포로 이루어진 비장은 혈액의 면역학적 여과 기관이다. 이주성 대식세포 및 수지상 세포는 비장을 통과하는 혈액으로부터 항원을 포획한다. 이주성 대식세포 및 수지상 세포는 또한 혈류를 통해 항원이 비장에 도달하도록 한다. 대식세포 또는 수지상 세포가 항원을 적당한 B 또는 T 세포에 제시하여, B 세포가 활성화되어 다량의 항체를 생산할 때, 비장에서 면역 반응이 개시된다.
임파관 및 임파절은 임파를 운반하는 한 특별한 순환계의 부분이다. 임파는 백혈세포, 주로 임파구를 함유하는 투명 체액이다. 임파는 신체의 조직을 침액시킨 후, 임파관에서 수집된다. 임파절은 임파관의 네트워크를 점재하고(dot), 수입성 임파관이 임파-함유의 항원을 절에 도달하게 할 때, 임파를 위한 면역학적 여과 기관으로 기능한다. T 세포, B 세포, 수지상 세포 및 대식세포로 주로 구성된 임파절은 대부분의 조직에서 체액을 배출한다. 항원은 임파가 순환으로 돌아가기 전에 임파절에서 임파로부터 여과되어 나온다. 항원을 포획하는 대식세포 및 수지상 세포는 또한 이 외래 물질을 임파절에서 T 및 B 세포에 제시하여, 결과적으로 B 세포를 자극하여 거기에서 항체-분비 혈장 세포로 발달되도록 한다. 항체는 혈류로 들어가는 수출관에 의해 임파절을 떠난다. 임파구는 또한 수출관에 의해 절을 떠나, 림프계의 다른 부위로 이동하거나 혈액 순환에 들어갈 수 있다. 단일 임파구는 매 24시간 마다 1회씩 순환 혈액 및 림프계를 통해 한 순환을 완성한다.
편도, 아데노이드, 집합임파소절(Peyer's patches), 및 충수도 또한 림프계 조직이다. 집합임파소절(임파구의 주요부)은 편도와 유사하고, 신체 전반, 특히 소화관 및 호흡관의 점막 라이닝에서 발견된다. 집합임파소절 및 다른 임파 응집 난포의 포식성 세포의 기능은, 예를 들어 위벽을 지나 혈액으로 들어가는 부적당하게 소화된 식품 입자로부터 신체를 방어하는 것과, 바람직하지 못한 외래 침입자가 장에 있는 동안 그것을 공격하는 것이다.
B 세포의 주요 기능은 세균, 바이러스 및 종양 세포의 외래 단백질에 대한 반응에서 항체를 생산하는 것이다. T 세포는 주로 2가지 주요 군, 즉 세포독성 T 임파구("Tc" 세포 또는 CTL) 및 헬퍼 T 세포("Th" 세포 또는 T 헬퍼 세포)로 나뉘어 진다. CD4+ T 세포로도 칭해지는 Th 세포는 감염과 싸우는 다른 백혈세포를 활성화하는 분화된 인자의 분비에 의해 면역 반응을 보강하거나 강화하는 기능을 한다. 그것은 B 세포에 의해 항체의 생산을 증진시킨다. CD8+ T 세포로도 칭해지는 Tc 세포는 특정 종양 세포, 바이러스-감염 세포, 및 경우에 따라서는 기생충을 직접 사멸시킬 수 있다. Tc 세포는 또한 면역 반응의 하향-제어에도 중요하다. T 세포의 양 유형 모두는 종종 활성화가 일어나는 부위로서의 2차 림프계 기관(임파절 및 비장)의 의존하나, 그것은 또한 간, 폐, 혈액, 및 장 및 생식관을 비롯한, 신체의 다른 조직들에서도 발견된다.
종종 NK 세포로 칭해지는 자연살해 세포는 다른 한 유형의 임파구를 나타내고, Tc 세포 서브세트와 유사하다. 그것은 흑색종 및 임파종과 같은 특정 종양, 및 바이러스-감염 세포를 직접 사멸하는 작용자 세포로 기능한다. 그것은 세포독성 T 세포와 달리, 그 기능을 수행하기 전에 특이적 항원을 인식할 필요가 없기 때문에, "자연" 킬러(killer)로 일컬어진다. NK 세포는 Tc 세포와 달리, 림프계 기관에서 사전 활성화될 필요없이 그 표적을 사멸하나, Th 세포 분비에 의해 활성화된 NK 세포는 종양 또는 바이러스-감염 표적을 더욱 효과적으로 사멸할 것이다. NK 세포는 종양 세포를 표적으로 하고, 매우 다양한 감염성 미생물들로부터 보호한다. AIDS를 비롯한 수개의 면역결핍 질병들에서, 자연살해 세포 기능은 비정상적이다. 자연살해 세포는 또한 높은 수준의 영향력 있는 림포카인을 분비함으로써 면역 조절에 기여할 수도 있다.
일부 NK 세포는 IgG 항체의 Fc 부분에 대한 표면 수용체(FcγRIII, CD16로도 칭해짐)를 가진다. 그것은 표적 세포 상의 항원과 반응한 항체의 Fc 부분에 대한 수용체를 통해 표적 세포에 결합한다. 이 유형의 세포-매개 면역은 항체-의존성 세 포-매개 세포독성(ADCC)으로 칭해진다. NK 세포는 또한 다른 한 면역방어계의 보체의 C3 성분에 대한 수용체를 가져, 표적으로서 C3로 피막된 세포를 인식할 수 있다. ADCC는 예를 들어 원생동물 및 장내기생충에 의해 유발된 다양한 기생충 감염들에 대한 중요한 방어로 사료된다.
작은 임파구는 동일해 보일지라도, 그것들은 세포 표면 상에 담지된 분자에 의해 구별가능하다. 그러한 마커는 B 세포 및 T 세포를 구별할 뿐만 아니라, 상이하게 거동하는 각종 서브세트의 세포들을 구별한다. 예를 들어 모든 성숙 T 세포는 T3(또는 CD3)로 알려진 마커를 담지한다. 또한, 대부분의 헬퍼 T 세포들은, II류 주요 조직학적 상용성 복합체("MHC") 항원을 인식하는 분자인 T4(CD4) 마커를 담지한다. I류 MHC 항원을 인식하는 T8(CD8)로도 알려진 분자는 많은 억제자/세포독성 T 세포 상에 발견된다.
과립구 또는 다형핵 백혈구(PMN)로 집합적으로 칭해지는 백혈세포의 다른 한 군은 3가지 세포 유형들로 구성된다. 이 세포, 호중구, 호산구 및 호염기물은 신체로부터 세균 및 기생충을 제거하는데 중요하다. 호중구는 모세벽을 통과하여 감염된 조직으로 이동하여, 거기에서 침입자(예를 들어, 세균)를 사멸한 후, 나머지를 식세포작용에 의해 둘러싼다. 호산구는 세포독성이며, 침입자에 대해 그 과립의 내용물을 방출한다. 호염기물은 혈액을 떠나, 감염 또는 다른 염증의 부위에 축적하여, 그 과립의 내용물을 배출하며, 예를 들어 영역으로의 혈액 흐름을 증가시키는 다양한 매개자, 예컨대 히스타민, 세로토닌, 프로스타글란딘 및 류코트리엔을 방출한다. 호염기물에 의해 방출된 매개자는 또한 몇가지 알레르기 반응, 예컨대 건초 열, 및 벌레물림에 대한 과민성 반응에 중요한 역할을 한다.
단핵세포는 골수에서 혈액 순환으로 방출되는 대형 포식성 백혈세포이다. 단핵세포가 조직에 들어갈 때, 그것은 대식세포로 발달된다. 대식세포는 또한 신체에 들어가는 외래 물질(항원)을 둘러싸는 큰 포식성 세포, 및 신체의 사멸 세포 또는 사멸 중인 세포이다. 대식세포는 면역 반응의 제어에 중요하고, 외래 물질을 취해 소화하여, 이 항원을 T 세포 및 B 세포와 같은 면역계의 다른 세포에 제시하기 때문에 종종 스캐빈저(scavenger), 또는 항원-제시 세포(APC)로 칭해진다. 이는 면역 반응 개시에 있어 중요한 1차 단계들 중 하나이다. 자극을 받은 대식세포는 증가된 수준의 식세포작용을 나타내고, 또한 B 세포 및 T 세포를 활성화하는 것을 돕는 생성물인 인터류킨-1(IL-1)을 분비한다.
수지상 세포는 또한 골수에서 발생하여, APC로서 기능한다. 그것은 주로 림프계 기관, 예컨대 흉선, 임파절 및 비장의 구조적 구획에서 발견되나, 혈류 및 기타 조직에서도 발견된다. 수지상 세포는 항원을 포획하거나, 그것을 림프계 기관에 도달하게 하여 거기에서 면역 반응이 개시되는 것으로 판단된다.
병원체성 미생물에 대한 숙주 방어 및/또는 면역과 관련된 면역학적 시스템의 중요 특성은 특이성, 기억 및 내성을 포함한다. 예를 들어, 항체 또는 반응성 T 세포는 그 형성을 유도하는 항원과 특이적으로 반응하고; 다른 항원과는 반응하지 않을 것으로 이해된다. 일반적으로, 이 특이성은 교차 반응성도 가능할지라도, 효소-기질 특이성 또는 수용체-리간드 특이성과 동일한 차원의 것이다. 면역 반응의 특이성은 클론 선택에 의해 설명된다. 일차 면역 반응 중에, 특이적 항원은 특이적 임파구의 선재 클론을 선택하여, 그 활성화, 증식 및 분화를 자극한다. 또한, 일단 면역계가 특이적 유형의 항체 또는 반응성 T 세포를 생산하도록 반응하면, 더욱 많은 항체 또는 활성화된 T 세포들을 보다 급속히, 또한 보다 많은 양을 생산할 수 있는 것으로 이해되며, 이는 2차(또는 기억) 반응으로 칭해진다. 동물은 일반적으로 자체의(잠재적으로 항원성인) 성분에 대해 면역학적 반응을 겪지 않는 것으로 인지된다. 동물은 자체 가능히 항원성인 성분과 반응할 수 없거나 그 반응에 대해 내성이 있다고 일컬어진다. 이는 정상적 조건 하에서, "자기" 항원에 대한 면역 반응(자가면역 반응으로 칭해짐)이 일어나지 않도록 확실히 한다. 내성은 수많은 방식들로 발생되나, 본질적으로 면역계는 "자기" 성분과 "비-자기"(외래) 항원을 구분할 수 있고; "비-자기"와는 반응하나 "자기"와는 반응하지 않는다. 경우에 따라 동물들에서, 내성이 "파괴되어", 자가면역 질병을 초래할 수 있다.
항체-매개 및 세포-매개 면역 반응의 생물학적 활성은 상이하며, 감염 유형에 따라 서로 다양해진다. 항체-매개 면역과 관련된 수개의 부류 또는 유형의 항체들(및 각종 유형의 하위부류)이 있다. 특이적 항원에 대한 반응에서 생성되는 모든 부류의 항체들은 항원과 입체화학적으로 반응하나, 다른(상이한) 항원과는 반응하지 않는다. 숙주는 수천개의 상이한 항원들에 대한특이적 항체를 생산할 수 있는 유전적 능력을 가지나, 적당한(특이적) 항원성 자극이 있을 때까지는 그러하지 않다. 클론 선택으로 인해, 숙주는 상술한 바와 같이, 혈액(혈장), 임파, 및 많은 혈관외 조직에서 발견되는 항원과 반응할 상동적 항체만을 생산한다. B 임파구와 항원의 상호작용, 및 그것의 항체-분비 혈장 세포로의 분화 후에 항체-매개 면역 반 응이 일단 일어나면, 분비된 항체는 항원에 결합하고, 이는 다시 그것을 중화하거나 신체로부터 제거한다.
한편 세포-매개 면역은, "휴지 T 세포"(pT 세포)로서 전구체 형태로 존재하는 작용자 T 세포로 칭해지는 특이적 집단의 T-임파구의 의해 매개된다. 이 세포는 특이적 항원에 대한 수용체를 가지고 있고, 다른 세포의 표면 상에 이 항원을 인식한다. 그 항원에 의한 자극은 T 세포 활성화를 초래한다. 보다 큰 T 세포는 비유사분열성 사이클에 들어가, 이 유형의 면역의 원인이 될 수 있는 활성을 갖는 작용자 T 세포를 재생산하고 발달시킨다. 그것은 또한 기억 T 세포라 칭해지는 동일한 반응성 T 세포의 클론으로 발달된다. 상술한 바와 같이, 신체 내의 대부분의 T 세포들은 2개 서브세트들 중 하나에 속하고, CD4 및 CD8로 표시되는 2개 당단백질 중 하나 또는 다른 하나의 표면 상에서의 존재에 의해 구분된다. 이 분자들 중 어느 분자가 존재하는지가 T 세포가 결합할 수 있는 세포의 유형을 결정한다. CD8를 갖는 T 세포(CD8+ T 세포)는 항상 I류 MHC 단백질과 연합하여 항원을 인식하고, 통상적으로 세포독성 T 세포로 기능한다. 신체의 거의 모든 세포들이 I류 MHC 분자를 발현한다. CD4를 갖는 T 세포(CD4+ T 세포)는 항상 다른 세포의 표면 상의 II류 MHC 단백질과 연합하여 항원을 인식한다. 단지 분화된 항원-제시 세포는 수지상 세포, 포식성 세포, 예컨대 대식세포, 및 B 세포를 비롯한 II류 MHC 분자를 발현한다. CD4+ T 임파구는 일반적으로 T 헬퍼 세포로 기능한다.
Th1 세포 및 Th2 세포를 포함하는 T 헬퍼 세포는 항원과 반응하고, 림포카인 을 생산한다. Th1 및 Th2 세포는 그 림포카인 프로파일에 따라 구별될 수 있다. 모든 T 세포들과 같이, Th 세포는 흉선에서 생긴다. 그것에 항원-제시 수지상 세포에 의해 항원이 제시될 때, 그것은 증식하기 시작하여 활성화된다. 2종류의 수지상 세포, 즉 DC1 세포(단핵세포에서 분화) 및 DC2 세포(임파구에서 유래된 것으로 보임)가 있다.
Th1 세포(소낭성 구획에 세포내 존재하는 병원체 제거와 관련된 염증성 Th1 세포)는 DCl형 수지상 세포가 항원을 항원에 대한 T 세포 수용체(TCR)에 제시하여 인터류킨 12(IL-12)을 분비할 때, 생산된다. 이 측분비 자극은 Th1 세포를 활성화하여, 그 자체의 림포카인, 특히 종양-괴사 인자-베타(TNF-β)(임파독소로도 알려짐) 및 인터페론-감마(IFN-γ)를 분비한다. 이 림포카인은 대식세포를 자극하여, 그것이 식세포작용에 의해 둘러싼 세포를 사멸한다. 그것은 부위 생성 염증에 다른 백혈구를 보충한다. Th1 세포는 세포-매개 면역, 및 세포내 병원체, 예컨대 예를 들어 리스테리아(Listeria) 및 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)의 억제에 필수적이다.
Th2 세포(B 세포에 의한 항체 생산에 필요한 "진정한" 헬퍼 Th2 세포)는 DC2형 수지상 세포가 항원을 항원을 위한 T 세포 수용체, 추정컨대, 하나 이상의 측분비 자극제에 제시할 때 생성된다. Th2 세포에 의해 분비된 주요 림포카인은, B 세포에서 분류-스위칭을 자극하고, 그것의 IgE 항체 합성을 촉진하며, 더 많은 전(pre)-Th 세포들이 Th2 경로로 들어가도록 촉진하는 양성-피드백 장치로 작용하고, IL-12 수용체의 발현을 막음으로써 흉선 내의 전-Th 세포가 Th1 경로로 들어가는 것을 억제하는 인터류킨 4(IL-4)이다. IL-4는 또한 B 세포가 항체-분비 혈장 세포 및 기억 B 세포를 증식하거나 그것으로 분화하도록 한다. IL-4는 다른 세포는 제외한, 항원에 자체 결합한 부근에 있는 B 세포만을 활성화하여, 면역 반응의 특이성을 지탱한다. Th2 세포도 또한 인터류킨 5(IL-5, 호산구를 유인하고 활성화함), 인터류킨 10(IL-10, DC에 의해 IL-12 생산을 억제하고, 전(pre)-Th 세포의 Th1 세포로의 성숙을 방지함), 및 인터류킨 13(IL-13, 이 또한 IgE 항체의 합성을 촉진함)를 생산한다.
Th2 세포의 활성화도 또한 그것이 인터류킨 2(IL-2)의 생산을 시작하도록 하고, IL-2에 대한 막 수용체를 발현하도록 한다. 분비된 IL-2는 Th2 세포의 증식을 자동적으로 자극한다. 예를 들어, IL-2는(항원에 결합한) 다른 T 세포 상의 IL-2 수용체에 결합하여 그것의 증식을 자극한다. IL-2에 부가하여, 자극을 받은 Th2 세포는 또한 각종 측면의 면역 반응을 매개하는, IFN-γ 및 인터류킨 6(IL-6)을 생산한다. IFN-γ는 자연살해 세포를 그것의 완전 세포용해성 가능한 상태로 활성화하고, 대식세포의 활성제이며, 이에 따라 그것의 항종양 활성을 증가시킨다. 대식세포가 세포내 기생충에 의해 감염될 경우, 그것은 대식세포를 활성화하고, 이는 다시 기생충을 파괴한다. IFN-γ는 또한 세포독성 임파구의 항종양 활성을 강화하고, NK-세포의 비특이적 활성을 증가시키고, B 세포의 분화를 조절하고 면역글로불린의 분비를 증가시키는 인자들 중 하나이다. IL-6은 수개의 유형의 백혈구들을 자극하고, 거기에서 급성 상태의 단백질을 생산한다. 그것은 B 세포가 항체 형성(혈장) 세포로 분화하도록 유도하는데 있어 특히 중요하다. 이에 따라, Th2 세포는 B 세포 에 대한 도움을 제공하고, 항체-매개 면역에 필수적이다.
세포독성 T 임파구는 그것의 표면에서 신규 또는 외래 항원을 나타내는 세포(예를 들어, 바이러스-감염된 세포, 또는 종양 세포, 이식 조직 세포를 사멸할 수 있다. CD8+ CTL는 또한 2개 서브세트, 즉 Th1 세포와 같이 IFN-γ를 분비하는 Tcl, 및 Th2 세포와 같이 IL-4를 분비하는 Tc2로 나뉜다.
세포-매개 면역 반응은 또한 종양 세포의 파괴, 및 동물의 조직 이식 거부에 역할을 한다. 조직 이식에 있어 주요 문제는 거부반응으로서, 이는 종종 "외래" 세포에 대한 세포-매개 면역 반응에 기초한다(그 이유는 그것이 완전한 항원성 매치가 아니기 때문이다). 종양 세포는 정상 세포에서는 보이지 않는 특이적 항원을 함유하기 때문에, 그것은 또한 외래 물질로 인식될 수 있고, 세포-매개 면역의 힘에 의해 파괴될 수 있다. 종양 세포가 동물에 있어 정규적인 기반 하에 발달할 경우, 그것은 체크 시에 그것을 제거하거나 보류하는 세포-매개 면역일 수 있다. 나이가 들어감에 따라 인간의 많은 유형의 암(종양)들의 발생율의 증가는 약 25년 일어나는 면역계의 피크 효율의 감소와 상관 관계가 있을 수 있다.
세포-매개 면역의 발현과 관련된 세포 유형들의 개요는 다음과 같다. Tc 임파구는 I류 MHC와 연합하여 표면 상에 외래 항원을 갖는 세포를 사멸하고, 감염된 세포가 그 표면 상에 미생물 항원을 나타내는 한, 세포내 기생충(세균 또는 바이러스)을 하버링하는 세포를 사멸할 수 있다. Tc 세포는 종양 세포를 사멸하고, 이식 세포의 거부반응에 원인이 될 수 있다. Tc 세포는 표적 세포 상의 항원-I류 MHC 복합체를 인식하고, 그것과 접촉하며, 세포를 융해하는 표적 세포로 과립의 내용물을 직접적으로 방출할 수 있다. Th 임파구는 항체-분비 혈장 세포에서 B 세포의 발달에 대한 "헬퍼" 인자인 림포카인을 생산한다. 그것은 또한 작용자 T 임파구의 분화 및 대식세포의 활성을 자극하는 특정 림포카인을 생산한다. Th1 세포는 II류 MHC와 연합하여 대식세포 상에 항원을 인식하여, (IL-1에 의해) 활성화되어, 대식세포 및 NK 세포를 활성화하는 IFN-γ를 유도하는 림포카인을 생산한다. 이 세포는 지연형 과민증 반응을 유도하는 세포-매개 면역 반응의 각종 측면들을 매개한다. Th2 세포는 APC 상에 II류 MHC와 연합하여 항원을 인식한 후, 인터류킨, 및 특이적 B 세포 및 T 세포의 증식 및 활성을 자극하는 기타 물질을 생산한다. 대식세포는 T 세포 상호작용, 발달, 및 증식을 개시하는 항원-제시 세포로서 중요하다. 대식세포는 또한 세포-매개 면역 반응에서 생산되는 활성화된 IFN-γ에 의해 활성화되기 때문에, 세포-매개 면역의 발현에 관여한다. 활성화된 대식세포는 증가된 포식 가능성을 가지고, 염증을 유발하여 많은 세균 및 기타 세포를 파괴하는 가용성 물질을 방출한다. 자연살해 세포는 그것의 MHC 유형과 무관하게 신규 항원을 갖는 세포를 융해하고, 심지어 MHC 단백질을 갖지 않는 일부 세포를 융해하는 세포독성 세포이다. NK 세포는 MHC 유형과 무관하게, 또한 항원에 대한 이전 감작(노출)과 무관하여, 외래 항원(예를 들어, 종양 세포)을 나타내는 세포를 사멸하는 능력에 의해 정의된다. NK 세포는 IL-2 및 IFN-γ에 의해 활성화되고, 세포독성 T 임파구와 동일한 방식으로 세포를 융해할 수 있다. 일부 NK 세포는 IgG 항체의 Fc 도메인에 대한 수용체를 가지고 있어, 표적 세포의 표면 상의 IgG의 Fc 부분에 결합하여, 항체-의존성 세포-매개 세포독성을 통해 표적 세포를 사멸하는 세포용해성 성분을 방출할 수 있다.
세포 증식 및 분화에 영향을 주는 세포외 인자는 사이토킨으로 정의되었다. 이는, 세포-매개 면역의 발현과 관련된 각종 세포들의 분화, 증식 및 활성에 영향을 주는 T-임파구에 의해 생산되는 단백질인 림포카인을 포함한다. 일반적으로, 림포카인은 (1) 순환 백혈구 및 임파구를 면역학적 합체의 부위에 집중시키고; (2) B 세포 및 T 세포의 발달 및 증식을 자극하며; (3) 포식성 작용을 위해 대식세포를 자극하고 제조하고; (4) 자연살해 세포를 자극하며; (5) 항바이러스 커버 및 활성을 제공함으로써 기능한다. 각종 중요한 림포카인의 개요는 다음과 같다. 초기에 임파구 활성화 인자로 칭해진, IL-1은 주로 대식세포의 생산물이고, 각종 유형의 세포들에 다양한 영향을 미친다. 그것은 T 세포 및 B 세포의 성장 조절자로 작용하고, 간세포와 같은 다른 세포가 숙주 방어와 관련된 단백질을 생산하도록 유도한다. IL-1은 호중구를 위한 화학주성 구배를 형성하고, 고열을 일으키는 내인성 발열원으로 작용한다. 이에 따라, IL-1은 면역 반응 및 염증성 반응 모두에서 중요한 역할을 한다. IL-2는 T 세포의 증식을 자극하고, NK 세포를 활성화한다. IL-3은 줄기 세포의 증식 및 비만 세포의 분화를 제어한다. IL-4는 B 세포 증식 및 증진된 항체 합성을 유발한다. IL-6(인터페론-베타2, 혼성체 성장 인자, B-세포 분화 인자, 및 간세포 자극 인자로도 칭해짐)은 B 세포 분화 및 항체 생산, 및 T 세포 활성화, 성장 및 분화에 영향을 미치고, 아마도 감염 또는 상해에 의해 개시되는 염증성 및 면역 반응의 매개에 주요 역할을 가진다. IL-8는 호중구를 위한 화학주성 유인제이다. IL-13은 IL-4의 많은 성질들을 공유하고, 염증성 및 면역 반응의 강한 조절자이다. IFN-γ는 T 세포에 의해 생산되고, 림포카인으로 간주될 수 있다. 그 것은 경우에 따라 "면역 인터페론"으로 불리어진다(인터페론-알파는 "백혈구 인터페론"으로 칭해지고, 인터페론-베타는 "섬유아세포 인터페론"으로 칭해짐). IFN-γ는 감염된 세포에서의 바이러스성 단백질 합성의 억제를 비롯한 수개의 항바이러스 효과를 가진다. 그것은 또한 대식세포 및 NK 세포를 활성화하고, IL-1, IL-2, 및 항체 생산을 자극한다. 임파독소는 종양 괴사 인자를 포함한다. T 세포는 TNF-베타를 생산하고, 한편 TNF-알파는 T 세포 및 기타 유형의 세포에 의해 생산된다. TNF는(떨어져 있는) 종양 세포를 비롯한 세포를 사멸하는 기능을 한다. 모든 유형의 포식성 백색 세포들을 분화하고 분할하도록 유발하는 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GMCSF)를 비롯한 수개의 콜로니 자극 인자(CSF)가 있다.
B 세포 및 T 세포 상의 항원에 대한 막 수용체의 성질은 매우 잘 이해된다. 각 B 세포는 세포가 생산되도록 프로그래밍된 항체에 대해 특이적으로 상응하는 대략 105개 막-결합 항체 분자(IgD 또는 IgM)를 가진다(이 수용체는 BCR로 칭해짐). B 세포 상의 CD32(FcγRII)는 IgG의 Fc 영역에 대한 수용체이다. B 세포 상의 CD21 및 CD35는 보체 성분에 대한 수용체이다. 각 T 세포는 그 표면에 노출된 특이적 항원-결합 T 세포 수용체(TCR)의 약 105개 분자를 가진다. TCR은 항체와 유사하나 동일하지 않다. TCR이 상이한 2가지 유형의 T 세포, 즉 알파/베타(αβ) T 세포 및 감마/델타(γδ) T 세포가 있다. 알파/베타 T 세포의 TCR은 항원-제시 세포의 표면 상에 I류 MHC 분자로 표시되는 이분자 복합체에 결합한다. 상술한 바와 같이, 대부분의 Th 세포는 CD를 발현하고, 반면 대부분의 Tc 세포는 CD8을 발현한다.
BCR 및 TCR은 모두 그것이 총체적 막 단백질이고, 세포 표면에 노출된 수천개의 동일한 복사체들 내에 존재하며, 세포가 항원을 만나기 전에 제조되며, DNA의 세그먼트의 재조합에 의해 어셈블리된 유전자에 의해 코딩되고, 수용체의 표면 및 에피토프의 표면의 상보성, 및 항원 수용체의 에피토프에 대한 성공적 결합의 의존하고 다만 부가적인 신호가 동반될 경우 세포를 자극하여 Go를 남기고 세포 사이클 및 반복 체세포분열에 들어가서 동일한 항원 수용체를 갖는 세포의 클론, 즉 동일한 특이성의 세포의 클론의 발달을 야기하는, 에피토프(또는 항원성 결정자)라고 불리는 항원의 부분에 비공유 결합하는 독특한 결합 부위를 가진다는 점에서 유사하다. BCR 및 TCR은 구조, 그것을 코딩하는 유전자, 및 그것이 결합하는 에피토프의 유형의 면에서 상이하다.
항원이 상피 표면을 통과할 때 일차 면역 반응의 유도가 시작된다. 그것은 궁극적으로 대식세포 또는 특정 다른 부류의 항원 제시 세포, 예컨대 B 세포, 단핵세포, 수지상 세포, 랑게르한스 세포, 및 내피 세포와 접촉하게 된다. 항원, 예컨대 세균성 세포는 세포이물흡수에 의해 내면화되고, APC에 의해 "가공된" 후, 면역적격 임파구에 "제시되어", 면역학적 반응의 초기 단계를 개시한다. (예를 들어) 대식세포에 의한 가공은, 항원성 물질이 세포 표면 상에서 II류 MHC 분자와 연합하여 막 표면에 부착하도록 초래한다. 항원-II류 MHC 복합체는 T-헬퍼(Th2) 세포에 제시되어, 대식세포의 막 상에 II류 MHC 분자와 연합된 가공된 항원을 인식할 수 있다. 이 상호작용은 대식세포에 의해 분비된 IL-1의 자극과 함께 Th2 세포를 활성화할 것이다.
상기 나타낸 바와 같이, B 세포는 그 자체가 APC로서 거동한다. B 세포의 표면 상의 항체 수용체에 결합된 가교결합된 항원은 II류 MHC 분자와 함께, B 세포 막 상의 일부 항원의 내면화 및 발현을 유발한다. Th2 세포는 II류 MHC 분자와 함께 항원을 인식하여, B 세포를 자극하여 항체-분비 혈장 세포 및 기억 B 세포가 되도록 하는 각종 림포카인을 분비한다. 항원이 수용체를 가교결합시킬 수 없을 경우에도, 그것은 B 세포 의해 세포내 이입되어, 가공되며 II류 MHC와 연합하여 표면을 되돌아갈 수 있으며, 거기에서 그것은 B 세포 분화 및 증식을 개시하도록 활성화될 특이적 Th2 세포에 의해 인식될 수 있다. 어느 경우에서도, 전반적 B 세포 반응은 항체-매개 면역을 초래한다.
B 세포 표면 상의 항원 수용체는 유전적으로 그 생산이 프로그래밍된 특이적 유형의 항체인 것으로 사료된다. 그러므로, 독특한 항체 분자의 생산 능력을 특징으로 하는 B 세포의 하위 그룹이 수천개 있다. B 세포는 또한 대식세포의 표면 상의 상동적 항원, 또는 가용성 항원과 반응할 수 있다. B 세포는 항원과 결합하고, 동시에 부근 Th2 세포에 의해 생산된 IL-4에 의해 자극을 받고, B 세포는 자극을 받아, 성장하여 각기 동일한 항체 분자를 생산할 수 있는 동일한 B 세포의 클론을 형성하도록 분할한다. 활성화된 B 세포는 다량의 항체를 합성하여 분비하는 혈장 세포로 더 분화하여 기억 B 세포가 된다. 혈장 세포에 의해 생산되고 분비된 항체는 그 형성을 유도한 상동적 항원과 특이적으로 반응할 것이다. 많은 이 반응들은 숙주 방어를 초래하고, 병원체에 의한 재감염을 예방하게 된다. 기억 세포는 2차면역 반응에 역할을 한다. 혈장 세포는 비교적 수명이 짧으나(약 1 주), 이 기간 중 에 다량의 항체를 생산한다. 한편, 기억 세포는 비교적 수명이 길고, 후속하여 항원에 노출 시에 급속히 항체-생성 혈장 세포로 변환된다.
예를 들어. 세포독성 T 세포가 세포(주로 변경된 자기 세포, 단 가능히 이식된 조직 세포 또는 진핵 기생충)의 막 상에 I류 MHC와 연합된 가공된 항원을 인식할 때, 세포 매개 면역의 발생이 시작된다. Th2 세포에 의해 생산된 IL-2에 의한 자극 하에, Tc 세포는 활성화되어, 그 표면 상에 신규 외래 항원을 나타내는 세포를 융해할 수 있는 세포독성 T 임파구가 되며, 이는 세포-매개 면역의 일차적 표시이다. 항원-제시 대식세포 및 Th 세포 간의 상호작용은 대식세포를 자극하여, 세포 상에 국소적으로 작용하여, Th-세포를 자극하여 분화하여 그 자체의 사이토킨(이는 임파구로부터 생기기 때문에 림포카인으로 불릴 수 있음)을 생산하도록 하는 인터류킨-1를 생산하여 분비한다. 이 림포카인은 각종 기능들을 가진다. IL-4는 부근 B 세포에 대해 중간 효과를 가진다. IL-2는 상기한 바와 같이 T 세포에 대해 중간 효과를 가진다.
백혈구는 또한 세포-세포 및 세포-기질 상호작용을 매개하는 결합-촉진 수용체를 발현한다. 이 접착성 상호작용은 조혈 및 흉선세포 성숙의 제어, 백혈구의 조직 간 통과 및 이동의 주도 및 조절, 및 면역 및 비-면역 염증성 반응의 발달에 대해 중요하다. 수개 부류의 결합 수용체들이 규명되었다. 백혈구 인테그린 부류는 CD18로 표시되는 공통 베타 서브유닛을 공유하는 3개의 알파-베타 이종이량체성 막 당단백질을 포함한다. 각 3개의 원의 알파 서브유닛, 임파구 기능 연합된 항원-1(LFA-1), 대식세포 항원-1(Mac-1) 및 p150은 CD11a, b, 및 c로 각기 표시된다. 이 결합 분자는 백혈구의 면역 및 염증성 반응에 있어 중요한 역할을 한다. 백혈구 인테그린 부류는 이에 또한 인테그린 상위부류이며, 그것의 원은 진화적으로, 구조적으로 또한 기능적으로 관련이 있다. 백혈구에서 발견되는 다른 한 인테그린 하위부류는, "매우 늦은 활성화 항원 "VLA-1 및 VLA-2이 본래 T-세포 활성화가 늦는 것으로 나타나기 때문에, 소위 VLA 군이다. 이 부류의 원은 주로 세포외 기질 결합 수용체로 기능하고, 조혈 및 비-조혈 세포 모두에서 발견된다. 그것은 조직 기관, 임파구 재순환 및 T-세포 면역 반응을 비롯한 다양한 세포 기능들에서 역할을 한다. 다른 한 인테그린 하위부류인, 사이토어드헤신은 세포외 기질 단백질과 결합하는 내피 세포 및 혈소판 상의 수용체이다. 결합 수용체의 2차 부류는 면역글로불린 상위부류이며, 그것의 원은 T-세포 접착성 상호작용에 관여하는 CD2, LFA-3, 및 ICAM-1, 및 T 및 B 세포의 항원-특이적 수용체, CD4, CD8, 및 MHC I류 및 II 분자를 포함한다. 결합 수용체의 다른 한 인식 부류는 공통 렉틴 도메인을 특징으로 하는 셀렉틴이다. 쥐 회귀 수용체, MEL-14의 인간 동종체인 백혈구 결합 분자-1(LAM-1)는 백혈구에서 발현되고, 한편 내피 백혈구 결합 분자-1(ELAM-1) 및 과립 막 단백질(GMP-140)은 자극을 받은 내피 세포 및 활성화된 혈소판에서 발현된다.
면역 반응의 활성화는 사이토킨에 부가하여 물리적 세포-세포 접촉을 필요로 한다. 이에 따라, 예를 들어 B 및 T 세포 전구체의 발달은 간질 세포와의 친밀한 접촉을 필요로 한다. 3개 이상의 중요 세포-세포 접촉 이벤트가 면역 반응의 발생을 위해 필요하다. 첫 번째는 특이적 항원의 나이브 T 세포와의 초기 접촉이다. MHC 제시에 대한 요건으로 인해, 이는 절대 세포 접촉 이벤트이다. 정상적 상황 하 에서는, 중요 항원 제시 세포는 수지상 세포이다. MHC/펩티드-TCR 상호작용에 부가하여, 수지상 세포-T 세포 상호작용에 중요한 다른 비-항원 특이적 막 결합 리간드-수용체 쌍이 있다. 중요한 것은, 수지상 세포 상의 2개 리간드인 B7.1(CD80) 및 B7.2(CD86) 중 하나와의, T 세포 상의 CD28 분자의 연합이다. 이 분자는 부수적 분자라고 하고, CD28 분자는 필수적인 2차 신호를 T 세포에 전달하는 것으로 이해되어지며, 그 신호가 없을 경우 T 세포는 활성화되지 않는다.
두 번째 필수적 세포-세포 접촉은 활성화된 T 세포와 항원-특이적 B 세포 간의 접촉이다. 대부분의 항원들은 T 세포-의존성이고, 즉 항원에 대한 항체 반응은 절대적으로 T 세포 도움을 필요로 한다. 이 도움은 사이토킨 및 세포-세포 접촉에 의해 전달된다. 세포는 표면 Ig을 통해 특이적 항원을 결합시킨 후, 내면화하며, 그것을 II류 MHC 분자에 제시한다. 이는 그것이 특이적 항원으로부터의 헬퍼 에피토프에 대해 특이적인 T 세포에 의해 인식될 수 있도록 한다. 이 세포-세포 상호작용은 또한 B 세포 상의 B7에 대한 CD28 결합을 필요로 한다. 또한, T 세포 활성화 시에 발현이 유도되는, CD40 리간드 또는 CD154라 불리는 분자는 B 세포 상에서 CD40에 결합한다. CD40 가교결합은 B 세포 증식을 촉진하고, 배중심 B 세포의 세포사멸을 방지하고, 면역글로불린 이소타입 스위칭을 촉진한다. CD28-B7 및 CD40-CD40L 수용체 리간드 상호작용은 상호간의 활성화를 유발하는 B 및 T 세포 간의 교통에 필수적이다.
면역 반응에 필수적인 세 번째 세포-세포 상호작용은(배중심이라 불리는 림프계 기관에서 분화된 구조로 이동한) 활성화된 B 세포의, 소포 수지상 세포(FDC) 에 대한 결합이다. FDC는 긴 수명의 면역 복합체의 형태로 비변형된, 즉 가공되지 않은 항원을 고정하는 분화된 간질 세포이다. 다른 분자들 중, FDC는 CR2 수용체를 통해 배중심 B 세포에 결합하고 혈장 세포로의 분화를 자극하는 CD23이다.
일차 면역 반응이 숙주 방어로서 효과적으로 되기 전에 시간이 필요하다. 항원은 APC에 의해 인식되어 취해지며 소화되고 가공되어 제시되어야 한다. 몇 개의 선택 Th 세포는 항원과 반응하여 응답해야 하고; 기존 B 또는 T 임파구는 항원을 만나, 작용자 세포(혈장 세포 또는 Tc 세포)를 증식하여 분화해야 한다. 항체-매개 면역의 경우, 항체 수준은 그 숙주가 내성을 갖도록 효과적 생리학적 농도로 증강되어야 한다. 이 면역이 항체의 존재로 인해, 많은 개월수 또는 연수, 또는 심지어 평생 동안 지속될 수 있을지라도, 효과적 면역 수준에 도달하는데에는 수일 또는 수주가 소요될 수 있다. 자연적 감염에서, 접종물이 작고, 미생물 복제 동안 항원성 자극이 증가하더라도 처음 수일동안 단지 소량의 항체가 형성되고, 감염 후 약 1주 후까지 순환 항체가 검출될 수 없다.
2차 면역 반응의 유도와 관련하여, 미생물 항원에 대한 재노출(항원에 대한 2차 노출) 시에, 가속된 면역학적 반응, 즉 2차 또는 기억 반응이 있는 것으로 이해되어진다. 단지 1 내지 2일 후에, 보다 많은 양의 항체가 형성된다. 이는 일차 면역 반응 중에 형성된 특이적 기억 B 세포 또는 기억 T 세포의 활성에 기인한다. 이 기억 세포는 상동적 항원에 자극을 받을 때, 이미 항원을 보았던 것을 "기억"하고, 작용자 세포로 급속히 분할하고 분화할 수 있다. 기억 세포를 자극하여 매우 높은(효과적인) 수준의 지속 순환 항체를 생산하는 것은, 인간 및 애완동물에 "부 스터"형 백신접종을 제공하는 것의 기초이다. 이에 따라, 항원에 대한 1차 노출 후에, 면역 반응(혈청 중 특이적 항체의 농도에 따라 입증됨)은 수일간에 걸쳐 점차적으로 전개되어, 2 내지 3 주 내에 낮은 정체기(plateau)에 도달하며, 주로 비교적 짧은 시간 내에 감쇠되기 시작한다. 항원을 2차 시기에 만날 때, 2차(기억) 반응은 항체의 농도를 급속히 증가시켜, 보다 더 높은 수준의 혈청에 도달하며, 이는 비교적 긴 시간 동안 지속될 수 있다. 항체의 보호 수준은 1차 노출만으로 도달될 수 있으나, 주로 높은 수준의 보호 항체가 장기간에 걸쳐 확실히 지속되도록 하기 위해, 면역계를 항원성 자극을 반복할 필요가 있다.
면역글로불린 분자(Ig로 약칭됨)는, 쇄간 이황화 결합, 즉 이웃 시스테인 잔기의 술프히드릴기 간의 공유결합을 통해 거대분자의 복합체로 결합된, 2개의 동일한 중쇄 폴리펩티드(H2L2) 및 2개의 동일한 경쇄 폴리펩티드로 구성된 다량체성 단백질이다. 혈장 세포의 특이적 클론에 의해 각기 생성된 각종 부류의 인간 항체 단백질들이 있다. 5개 인간 면역글로불린 부류가 그것의 중쇄 조성을 기초로 하여 정의되고, IgG, IgM, IgA, IgE, 및 IgD로 칭해진다. IgG-류 및 IgA-류 항체는 하위부류, 즉 IgGI, IgG2, IgG3, 및 IgG4, 및 IgA1 및 IgA2로 더 나뉜다. 쇄내 이황화 결합은 동일한 폴리펩티드 쇄의 상이한 영역을 결합시키고, 이는 인접 아미노산과 함께 면역글로불린 도메인을 구성하는 루프의 형성을 초래한다. 아미노-말단의 부분("NH2-말단" 또는 "N-말단"으로도 불림)에서, 각 경쇄 및 각 중쇄는 항체 간에 아미노산 조성에 있어 상당한 다양성을 나타내는 단일 가변 영역을 가진다. 경쇄 가변 영역, VL은 중쇄의 가변 영역, VH와 연합하여, Fv라 불리는 면역글로불린의 항원 결합 부위를 형성한다.
가변 영역에 부가하여, 각 항체 쇄는 하나 이상의 불변 영역을 가진다. 경쇄는 단일 불변 영역 도메인을 가진다. 이에 따라, 경쇄는 하나의 가변 영역 및 하나의 불변 영역을 가진다. 중쇄는 수개의 불변 영역 도메인을 가진다. IgG, IgA, 및 IgD 항체 내의 중쇄는 CH1, CH2, 및 CH3로 표시되는 3개의 불변 영역 도메인을 가진다. IgM 및 IgE 항체 내의 중쇄는 4개의 불변 영역 도메인, 즉 CH1, CH2, CH3 및 CH4을 가진다. 이에 따라, 중쇄는 가변 영역, 및 3 또는 4개의 불변 영역을 가진다. 면역글로불린 구조 및 기능이 예를 들어, [Harlow 등 편저, Antibodies: A Laboratory Manual, 제14장, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (1988)]에서 고찰된다.
면역글로불린의 중쇄는 또한 3개의 기능성 영역들, 즉 Fd 영역(VH 및 CH1,즉 중쇄의 2개 N-말단의 도메인을 포함하는 단편), 힌지 영역, 및 Fc 영역(불변 영역에서 유래되고 펩신 소화 후에 형성된 "단편 결정화가능한 "영역)로 나뉠 수 있다. 경쇄와 조합하여 Fd 영역은 Fab("단편 항원-결합")을 형성한다. 각 Fab의 아미노 말단에서 항원이 입체화학적으로 항원-결합 영역과 반응할 것이므로, IgG 분자는 2가이며, 즉 그것은 2개의 항원 분자에 결합할 수 있다. Fc는 세포 상의 면역글로불린 수용체 및 보체 캐스캐이드의 초기 요소와 상호작용하는 도메인을 함유한다. 이에 따라, Fc 단편은 일반적으로 면역글로불린의 작용자 기능, 예컨대 보체 고정 및 Fc 수용체에 대한 결합의 원인이 되는 것으로 간주된다. 펩신은 경우에 따라 또한 중쇄의 3번째 불변 도메인(CH3) 전에 절단하여 큰 단편 F(abc) 및 작은 단편 pFcb를 제공한다. 이 용어는 또한 다른 면역글로불린의 유사 영역에 대해 사용된다. IgG, IgA, 및 IgD 부류 항체에서 발견되는 힌지 영역은 유연성 스페이서로 작용하여, Fab 부분이 공간에서 자유롭게 이동하도록 한다. 불변 영역과 대조적으로, 힌지 도메인은 구조적으로 다양하고, 면역글로불린 부류 및 하위부류 간에 서열 및 길이가 다양하다.
예를 들어, 힌지 영역의 길이 및 유연성은 IgG 하위부류들 간에 다양하다. IgG1의 힌지 영역은 보고에 따르면 아미노산 216-231을 포함하고, 그것은 자유로운 유연성을 가지므로, Fab 단편은 대칭축 주변을 회전하고, 두개의 중쇄간 이황화 연결기 중 첫 번째 것에 중심을 둔 구 내에서 이동한다. IgG2는 IgG1보다 짧은 힌지, 및 보고에 따르면 12개 아미노산 잔기 및 4개의 이황화 연결기를 가진다. IgG2의 힌지 영역은 글리신 잔기가 결핍되어 있고, 그것은 비교적 짧으며, 중쇄간 이황화 연결기에 의해 안정화된, 강건한 폴리-프롤린 이중 나선을 함유한다. 이 성질은 IgG2 분자의 유연성을 제한한다. IgG3은 그것의 독특한 확장된 힌지 영역(약 IgG1 힌지 길이의 4배)에 의해 다른 하위부류와 상이하고, 62개 아미노산(21개 프롤린 및 11개 시스테인)을 함유하며, 비유연성 폴리-프롤린 이중 나선을 형성하는 것으로 보고되어 있다. IgG3에서, Fab 단편은 Fc 단편에서 비교적 떨어져 있어, 분자에 보다 큰 유연성을 제공한다. IgG3 내의 신장된 힌지는 또한 다른 하위부류에 비해 보다 큰 분자량의 원인이 될 수 있다. IgG4의 힌지 영역은 IgG1의 힌지 영역보다 짧고, 그것의 유연성은 IgG1의 유연성 및 IgG2의 유연성의 중간이다. 힌지 영역의 유연성은 보고에 따르면 IgG3 > IgG1 > IgG4 > IgG2 순으로 감소한다. 4개 IgG 하위부류는 또한 그것의 작용자 기능에 대해 상호 상이하다. 이 차이는 가변 영역, Fab 단편, 및 불변 Fc 단편 사이의 상호작용에 대한 차이를 비롯하여 구조상의 차이와 관계가 있다. 그럼에도 불구하고, 예를 들어 CH2 영역 내의 글리코실화와 별도로, 이 지식에도 불구하고, 이 하위부류의 분자의 서열의 상이한 기능들, 예를 들어 ADCC, CDC, 및 기타 기능의 변화, 조절, 부가 또는 제거를 비롯한, 특성을 변화시키기 위한 수단 또는 방법에 대한 규칙 또는 규약이 정해져 있지 않다.
결정학적 연구에 따라, 면역글로불린 힌지 영역은 3가지 영역들, 즉 상부 힌지 영역, 코어 영역, 및 저부 힌지 영역으로 기능적으로 하위분류될 수 있다. [Shin 등의, 1992 Immunological Reviews 130: 87]을 참고한다. 상부 힌지 영역은 CH1의 카르복실 말단에서 비롯하여 이동을 제한하는 힌지 내의 1차 잔기, 일반적으로는 2개 중쇄 사이에 쇄간 이황화를 형성하는 1차 시스테인 잔기까지 포함한다. 상부 힌지 영역의 길이는 항체의 세그먼트 유연성과 상관 관계가 있다. 코어 힌지 영역은 중쇄간 이황화 연결기, 및 저부 힌지 영역은 CH2 도메인의 아미노 말단 끝을 결합하고, CH2 내에 잔기를 포함한다. Id. 인간 IgG1의 코어 힌지 영역은, 이황화 결합 형성에 의해 이량체화될 때 추축으로 작용하여 유연성을 부여하는 것으로 판단되는 환형 옥타펩티드를 초래하는 서열 Cys-Pro-Pro-Cys을 포함한다. 힌지 영역은 또한 수많은 구조적으로 구분되는 유형의 탄수화물 부착 부위를 포함하는, 하나 이상의 글리코실화 부위를 함유할 수 있다. 예를 들어, IgA1은 힌지 영역 내에 17개 아미노산 세그먼트 내에 5개 글리코실화 부위를 포함하고, 이는 분비성 면역글로불린에 대해 유리한 성질로 간주되는, 장 프로테아제에 대한 힌지 영역 폴리펩티드의 내성을 부여한다.
면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드 서열의 구조 및 유연성에 의해 허용되는 형상 변화는 또한 항체의 Fc 부분의 작용자 기능에 영향을 줄 수 있다. Fc 영역과 연합된 작용자 기능의 3가지 일반적 범주는 (1) 정통적 보체 캐스캐이드의 활성화, (2) 작용자 세포와의 상호작용, 및 (3) 면역글로불린의 구획화를 포함한다. 상이한 인간 IgG 하위부류는 보체를 고정하거나 보체 캐스캐이드의 단계들을 활성화하여 증폭시키는 상대 효능이 다양하다. 예컨대, [Kirschfink, 2001 Immunol. Rev. 180: 177; Chakraborti 등, 2000 Cell Signal 12: 607; Kohl 등, 1999 Mol. Immunol. 36: 893; Marsh 등, 1999 Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 8: 557; Speth 등, 1999 Wien Klin. Wochenschr. 111: 378]을 참고한다.
보체-의존성 세포독성(CDC)은 특이적 표적 세포, 예컨대 종양 세포의 클리어런스를 위한 중요한 메커니즘인 것으로 판단된다. CDC는 캐스캐이드 방식으로 서로에 의해 활성화되는 일련의 효소들로 구성되는 이벤트들의 스트림이다. 보체는 하기 4가지 주요 기능들에 의해 달성되는, 항원의 클리어런스에 중요한 역할을 한다: (1) 국소적 혈관확장; (2) 면역 세포, 특히 식세포(chemotaxis)의 유인; (3) 식세포작용(옵소닌화)을 위한 외래 유기체의 태깅; 및 (4) 막 공격 복합체(MAC 공격)에 의한 침입 유기체의 파괴. 중심 분자는 C3 단백질이다. 정통적 경로 또는 대안적 경로의 성분에 의해 2개 단편으로 분할되는 것은 효소이다. 항체, 특히 IgG 및 IgM 는 정통적 경로를 포함하고, 한편 대안적 경로는 지질다당류(LPS)와 같은 세균 생성물에 의해 비특이적으로 자극을 받는다. 요약컨대, C3 분할 생성물은 포식성 면역 세포에 대해 화학주성을 갖는 작은 펩티드 C3a를 포함하고, C5로부터의 C5a 단편의 방출을 초래함으로써 국소 혈관확장을 초래한다. C3의 다른 부분인 C3b는 외래 유기체의 표면 상의 항원을 피복하고, 파괴를 위해 유기체를 옵소닌화하는 작용을 한다. C3b는 또한 보체 시스템의 다른 성분과 반응하여, C5b, C6, C7, C8 및 C9로 구성된 MAC을 형성한다.
일반적으로, IgG1 및 IgG3는 가장 효과적으로 보체를 고정하고, IgG2는 덜 효과적이며, IgG4는 보체를 활성화하지 않는다. 보체 활성화는 캐스캐이드에서 1차 성분 C1의 서브유닛인 C1q이 항원-항체 복합체에 결합함으로써 개시된다. 칩에 대한 결합 부위가 항체의 CH2 도메인에 위치할지라도, 힌지 영역은 캐스캐이드를 활성화하는 항체의 능력에 영향을 준다. 예를 들어, 힌지 영역이 결핍되어 있는 재조합 면역글로불린은 보고에 따르면 보체를 활성화할 수 없다(Shin 등, 1992). 힌지 영역에 의해 부여되는 유연성이 없이, 항원에 결합된 항체의 Fab 부분은 C1q이 CH2에 결합하는데 필요한 형상을 채택할 수 없을 수 있다. 상기 문헌을 참고한다. 힌지 길이 및 세그먼트 유연성은 보체 활성화와 상관 관계가 있는 것으로 보고되었으나, 그 상관 관계는 절대적이지 않다. 예를 들어 IgG4와 같이 경질인 변경된 힌지 영역을 갖는 인간 IgG3 분자는 여전히 효과적으로 캐스캐이드를 활성화할 수 있다.
힌지 영역의 부재, 또는 기능성 힌지 영역의 결핍은, 면역 작용자 세포 상에서 Fc 수용체에 결합하는 특정 인간 IgG 면역글로불린의 능력에 영향을 줄 수 있 다. 면역글로불린의 Fc 수용체에 대한 결합은 항체-의존성 세포-매개 세포독성을 용이하게 하고, 이는 상기한 바와 같이 종양 세포의 제거를 위해 중요한 메커니즘인 것으로 추정된다. 인간 IgG Fc 수용체(FcR) 부류는 3개 군, 즉 높은 친화성으로 IgG를 결합시킬 수 있는 FcγRI(CD64), 및 보다 낮은 친화성의 수용체인 FcγRII(CD32) 및 FcγRIII(CD16)으로 나뉜다. 각각의 3개 수용체와 면역글로불린 간의 분자적 상호작용은 자세하게 정의되지는 않았으나, 실험적 증명은 CH2 도메인의 힌지 인접 영역 내의 잔기는 항체 및 Fc 수용체 간의 상호작용의 특이성에 있어 중요할 수 있음을 가리킨다. 힌지 영역이 결핍된 재조합 IgG3 키메라 항체 및 IgG1 골수종 단백질은 보고에 따르면 FcγRI에 결합할 수 없고, 이는 아마도 CH2에 대한 접근성이 감소되기 때문이다. [Shin 등, 1993 Intern. Rev. Immunol. 10: 177, 178-79]
통상적 항체의 H2L2 구조에 대한, 비통상적이고 명백히 진화적으로 관련이 없는 예외가 낙타류(낙타, 단봉낙타(dromedaries) 및 라마에서 발견되는 면역글로불린의 일부 이소타입에서 일어나고, [Hamers-Casterman 등, 1993 Nature 363: 446; Nguyen 등, 1998 J. Mol. Biol 275: 413), 너스 상어(Roux 등, 1998 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95: 11804), 및 점박이 은상어(Nguyen 등, "Heavy-chain antibodies in Camelidae; a case of evolutionary innovation", 2002 Immunogenetics 54(1): 39-47)]를 참고한다. 이 항체는 중쇄 가변 영역만을 이용하여 항원-결합 영역을 명백히 형성할 수 있고, 즉 이 기능성 항체는 단지 중쇄의 동종이량체("중쇄 항체" 또는 "HCAb"로 칭해짐)이다. 양 종류 모두에서, 이 가변 영 역은 종종 경쇄 가변 영역의 결핍에 대한 보상을 도울 수 있는 확장된 3차 상보성 결정 영역(CDR3)을 함유하고, 추정컨대 결합 부위의 안정화를 돕는 CDR 영역들 사이에 빈번한 이황화 결합이 있다. [Muyldermans 등, 1994 Prot. Engineer. 7: 1129; Roux 등, 1998]. 그러나, 중쇄-단독 "항체"의 정확한 기능은 알려지지 않았고, 그것이 형성되도록 하는 진화적 영향력이 규명되지 않았다. 예를 들어 [Nguyen 등, 2002, 이하 상술한 바와 동일함]를 참고한다. 낙타, 라마 및 알파카를 비롯한 낙타류도 또한 이 동물들에서 단지 대안적 항체 구조로 존재하는 것으로 나타나지 않는 통상적 H2L2 항체, 및 중쇄-단독 항체를 발현한다.
낙타류 중쇄-단독 면역글로불린의 가변 영역(VHH) 및 통상적(H2L2) 중쇄 가변 영역은 통상적 VH 및 VL 도메인 간의 계면에 관련될 수 있는 수개 위치들에서의 차이를 비롯한 아미노산 차이를 포함한다. [Nguyen 등, 1998 J. Mol. Biol 275: 413; Muyldermans 등, 1994 Prot. Engineer. 7: 1129]. 낙타류는 VHH 보고에 따르면 힌지, CH2, 및 CH3 도메인을 함유하고 CH1 도메인은 결핍되어 있는 IgG2 및 IgG3 불변 영역과 재조합된다. [Hamers-Casterman 등, 1993 Nature 363: 446]. 유리하게, VHH는 VH 위치와 구별되는 염색체 위치에 의해 코딩되고(Nguyen 등, 1998, 이하 상술한 바와 동일함), 이는 낙타류 B 세포가 항원 인식 및 분화의 복합체 메커니즘을 진화시켰음을 가리킨다. 이에 따라, 예를 들어 라마 IgG1는, VH가 힌지, CH1, CH2 및 CH3 도메인을 함유하는 불변 영역과 재조합하는 통상적(H2L2) 항체 이소타입이 고, 반면 라마 IgG2 및 IgG3는 CH1 도메인은 결핍되어 있고, 경쇄를 함유하지 않는 중쇄-단독 이소타입이다.
면역글로불린의 부류는 상이한 물리적 및 화학적 특성을 가지고, 독특한 생물학적 성질을 나타낸다. 그것의 합성은 면역 반응 및/또는 감염 과정 중에, 상이한 단계들에서 상이한 속도로 일어난다. 숙주 내성(면역)에 있어 그것의 중요성 및 기능은 상이하다.
약 150,000 달톤(150 kD)의 분자량을 갖는 단백질인 면역글로불린 G(IgG)는 혈청에서 보편적인 Ig이다. 그것은 임의의 주어진 시간에서 동물에서 발견되는 총 항체의 약 80%를 구성하고, 이는 총 혈청 항체의 75%이다. 그것은 혈류에서 나와 혈관외 공간으로 확산되어 나갈 수 있고, 그것은 거기에서 발견되는 가장 일반적인 Ig이다. 조직 체액 중 그것의 농도는 염증 중에 증가되고, 그것은 세균 세포외 독소 및 바이러스의 중화에 있어 특히 효과적이다. 그것은 또한 옵소닌화 능력 및 보체-고정 능력을 가진다. 모든 IgG1 항체 분자들의 Fc 영역의 폴리펩티드 조성물은 항체 특이성과 무관하게 비교적 불변이나; 상술한 바와 같이, Fab 영역은 항상 그것의 항원성 특이성에 따라 정확한 그것의 아미노산 서열이 상이하다. 분자의 Fc 부분의 특이적 아미노산 영역은 식세포 및 특정 다른 세포 상에서 수용체에 의해 인식되고, Fc 도메인은 항체-매개 면역의 발현을 위해 종종 필요한, 보체에 결합하여 그것을 활성화하는 펩티드 영역을 함유한다. IgG 분자가 2가이기 때문에, 그것은 항원 분자를 가교결합시킬 수 있고, 이는 항원의 석출 또는 교착을 초래할 수 있으며; IgG가 미생물 세포 또는 표면 상에서 항원에 결합할 경우, 그것의 Fc 영역 은 식세포에서 특이적 수용체에 의해 인식될 외인성 리간드를 제공할 수 있다. IgG 분자에 의해 피막된 미생물 세포 또는 바이러스는 식세포작용을 위해 옵소닌화되고, 옵소닌화된 병원체는 취해져 그것의 비-옵소닌화된 상대측에 비해 식세포에 의해 더욱 용이하게 파괴된다. IgG, 및 IgM 및 IgA는 세균 외독소를 비롯한 독소의 활성을 중화시킨다. 또한, 세포의 표면 상의 가교결합된 IgG 분자는 혈청으로부터의 보체에 결합하여 그것을 활성화하여, 반응의 캐스캐이드를 셋-오프시켜 세포의 파괴를 초래할 수 있다.
IgM는 감염 과정 중에 혈류에서 나타나는 1차 면역글로불린이다. 그것은 주로 혈류에 억류되고, 혈액-보유 병원체로부터의 보호를 제공한다. IgM는 약 10% 혈청 면역글로불린을 구성하고, (약 900 kD의 분자량을 갖는) 5개 면역글로불린 분자 쇄의 오량체가 Fc 도메인이 유사하도록 배치한다. 단량체성 서브유닛들 간의 공유결합에 부가하여, 엔타머는 J 쇄로 일컬어지는 15 kd 폴리펩티드에 의해 안정화된다. 그러므로, IgM는 10의 이론 "가"를 가진다(즉, 그것은 Fab 도메인에 10번 노출된다). 아마, IgM의 가장 중요한 역할은, 주어진 입상 항원에서의 효율로, 혈액-보유 병원체에 대한 면역 반응에서 처음 기능하는 능력이다. IgM은 또한 보체에 강하게 결합하고, 미생물 표면에 결합된 IgM 항체는 옵소닌으로 작용하여, 미생물을 식세포작용에 더 잘 영향받도록 한다. 보체 및 IgM의 존재 하에, 총 미생물 세포은 사멸되어 융해될 수 있다. 상술한 바와 같이, IgM은 또한 막투과 단량체로서 성숙 B 세포의 표면에 나타나고, 거기에서 그것은 항원에 결합 시에 B 세포를 활성화할 수 있는 항원 수용체로 기능한다.
림프계 발달 중의 면역글로불린 위치에서의 유전자 재배열은 다양한 항원 수용체들을 발현하는 B 임파구의 레퍼토리를 발생시킨다. 재배열-활성화 유전자("RAG") 재조합효소에 의해 촉매되는 유전자 재배열은 면역글로불린 V, D 및 J 유전자 세그먼트에 합체되어, IgM 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 재배열 면역 글로불린을 생산적으로 제공한다. 이 일차 레퍼토리에서의 IgM 항체의 다양성은 조합 메커니즘(특별한 항체에서 이용되는 V, D 및 J 유전자 세그먼트의 선택), 및 결합 다양성에 의해 달성된다. V, D 및 J 유전자 세그먼트의 결합은 다소 비정확하고, 뉴클레오티드는 비주형 방식으로 결합부에서 삽입될 수 있다. 그러므로 V-D-J 경계부에서 매우 높은 정도의 다양성이 수득된다. 이는 항체 인식에서 종종 중요한 역할을 하는 영역인, 항체의 3차 상보성 결정 영역의 구조적 다양성을 주요 방식으로 기여한다. IgM 항체의 이 일차 레퍼토리는 수백만가지 상이한 구조들을 포함한다. 이 레퍼토리의 크기는 임의의 유입 항원은 허용가능한 친화성으로 항원을 인식하는 항체를 만나기 쉬움을 의미한다. 고친화성 결합 부위는 대부분의 유입 항원들에 대해 이용가능하지 않을 수 있으나(레퍼토리가 충분히 크지 않음), 일차 레퍼토리에서의 이용가능한 IgM 항체의 친화성은 항원에 따라 다양할 것이다. 에피토프가 항원의 표면에서 고밀도로 되풀이되는 경우(예를 들어, 바이러스 또는 세균의 표면 상의 반복된 구조), IgM 항체는 그럼에도 불구하고, 항원성 에피토프와 면역글로불린 결합 부위 간의 개별적 상호작용의 낮은 친화성에도 불구하고, 유기체의 클리어런스를 매개해는데 효과적일 수 있다. 에피토프의 밀도는 IgM와의 다가 상호작용을 허용할 수 있고, 이에 따라 항원성 에피토프의 적당한 스페이싱이 일어날 수 있는 경우, 고친화성 상호작용을 초래한다. 그럼에도 불구하고, 효과적이고 특이적 반응을 확실히 하기 위해, 특히 항원 농도가 낮은 경우(신체가 매우 작은 수의 감염 바이러스 입자를 접할 때), 예를 들어 감염 유기체를 중화하는데 이용가능할 수 있는 것이 바람직할 것이다. 일차 레퍼토리의 크기는 그러한 고친화성 항체가 이 레퍼토리에 존재할 가능성으로부터 이동한다. 그러므로, 면역계는 2-단계 전략을 이용하여 작용한다. IgM 항체의 일차 레퍼토리는 유전자 재배열의 공정에 의해 발생되고, 초기 임파구 발달 중에 항원 인카운터 전에 일어난다. 그러나, 일단 외래 항원을 만날 경우, 적당한(알바이트 저친화성) 항체를 코딩하는 일차 레퍼토리 내의 그 B 세포는 선택적으로 확장되고, 지정 과다변이 및 항원-매개 선택이 반복하여 변경된다. 이는 생산된 항원-특이적 항체의 친화성이 상당히 성숙되도록 한다. 항원 촉발은 또한 이소타입 스위치 재조합을 주동한다. 이에 따라, 외부 항원 자극 및 임의의 모계 유래 면역글로불린의 부재 하에, 혈청은 유전자 재배열에 의해 발생된 다양한 변이화된 IgM 분자만을 함유할 것이다. 이 레퍼토리는 연속적 항원 노출의 결과로서 연령에 따라 이동하여, 보다 연령이 높은 동물의 혈청 면역글로불린의 대부분은 항원 선택의 결과로서 특이성이 발달한 변이화 IgG(및 IgA) 분자로 구성된다.
IgA는 혈청에서 약 160 kD의 H2L2 단량체로서 존재하고, 분비물에서는 약 400 kD의 H2L2 단량체의 이량체로서 존재한다. IgM의 경우, 중합(이량체화)은 J-쇄를 통해 이루어진다. IgA는 상이한 중쇄에 따라, 2개 하위부류, 즉 IgA1 및 IgA2를 가진다. IgA1는 골수에서 생성되어, 혈청 IgA의 대부분을 구성한다. IgA1 및 IgA2 모두는 GALT(위장 연결 림프계 조직)에서 합성되어, 점막 표면에 분비된다. IgA는 국소 합성되어 신체의 장액 분비물로 분비될 수 있기 때문에, 그것은 경우에 따라 분비성 항체 또는 sIgA로 칭해진다. 정량적으로, IgA는 IgG보다 큰 양으로 합성되나, 그것은 혈청에서 보다 짧은 반감기(6일)를 가지고, 분비성 생성물에서 소실된다. 혈청 내 IgA의 농도는 총 항체 중 약 15%이다. 이량체성 IgA의 분비는 분비성 성분으로 칭해지는 1OO kD 당단백질에 의해 매개된다. 그것은 외분비선을 통한 신체에서 점막 표면으로의 배출 능력의 원인이 되는, IgA 분자에 대한 분비성 조각의 부가이다. IgM은 유사하게 운송되어 분비성 항체의 작은 분율을 구성할 수 있다. 분비성 IgA는 신체의 위장 체액, 코 분비물 침, 눈물 및 다른 점액성 분비물에 존재하는 우세한 면역글로불린이다. IgA 항체는 신체의 점막 표면, 특히 호흡기, 장관 및 비뇨생식관의 감염에 대한 내성에 있어 중요하다. IgA는 미생물 부착 또는 초기 콜로니형성으로부터의 점막 표면의 보호 피막으로 작용한다. 그것은 또한 점막 표면 상의 독소 활성을 중화할 수 있다. 호흡기 점막에서 유래되는 단핵세포 및 호중구에서 발견되는 IgA-피복 미생물을 위한 Fc 수용체는, 폐, 적어도 병원체의 옵소닌화에서 역할을 할 수 있음을 제안한다. 분비성 IgA는 또한 우유, 즉 초유를 통해 수유모에서 신생아로 전달되고, 이는 많은 병원체, 특히 GI 관에 의해 들어가는 병원체에 수동 면역을 제공한다.
IgE는 약 190 kD의 면역글로불린으로, 총 혈청 면역글로불린의 약 0.002%에 해당한다. 그것은 호흡기 및 장 상피 아래에서 혈장 세포에 의해 생성된다. IgE의 대부분은 조직 세포, 특히 비만 세포에 결합된다. 감염 제제가 IgA 장벽을 투과하 는데 성공할 경우, IgE에 의해 관리되는 MALT(점막에 연결된 림프계 조직) 시스템인 다음 방어선에 도달하게 된다. IgE는 비만 세포 상에 특이적 IgE Fc 수용체에 대해 매우 단단히 결합된다. 항원과의 접촉은 비만 세포로부터 염증의 매개자를 방출시키고, 이는 효과적으로 보체, 식세포, T 세포 등에 대한 화학주성 인자를 비롯한, 면역 반응의 각종 제제를 보강한다. 이 반응의 공지 발현이 아토피성 알레르기(예를 들어, 두드러기, 천식, 건초열 등)의 중간 과민증 반응의 한 유형일지라도, MALT 반응은 염증성 반응을 증대하고 병원체의 거부반응을 용이하게 할 수 있기 때문에, 방어 메커니즘으로 작용할 수 있다.
IgD는 단량체성 형태로 IgG와 유사한 약 175 kd의 분자이다. IgD 항체는 B 임파구의 표면 상에 대부분 발견된다. 동일한 세포는 또한 IgM 항체를 담지할 수 있다. 상술한 바와 같이, IgD 및 IgM는 B 세포 활성화 및 억제의 조절을 위한 상호 작용 항원 수용체로 기능하는 것으로 사료된다. 이와 같이, IgD는 면역조절 기능을 가질 수 있다.
옵소닌화, 보체 활성화의, 및 ADCC에 부가하여, 항체는 입체 장애, 독소 중화, 교착 및 석출을 비롯한, 숙주 방어의 다른 기능들을 가진다. 입체 장애와 관련하여, 항체는 미생물의 표면에 결합하여 영향받기 쉬운 세포 또는 점막 표면에 부착하는 것을 막거나 방지할 수 있는 것으로 이해된다. 바이러스성 성분에 대한 항체는 영향받기 쉬운 숙주 세포에 대한 바이러스의 부착을 박고, 이에 의해 감염성을 감소시킬 수 있다. 분비성 IgA는 점막 표면에 대한 병원체의 부착을 막을 수 있다. 독소-중화 항체(항독소)는 가용성 세균 독소와 상호작용하여 독소의 그것의 특 이적 표적 세포 또는 기질과의 상호작용을 막을 수 있다. 항체는 또한 미생물 또는 가용성 항원의 표면과 결합하여 그것이 교착하거나 석출하도록 할 수 있다. 이는 입자의 덩어리가 크기면에서 더 크기 때문에 분리된 감염성 단위의 수를 감소시키고, 그것을 더욱 용이하게 포식되게 한다. 식세포는 중화된 독소의 덩어리 및 응집물을 제거할 수 있다.
항체는 치료에서의 용도를 위해 제안되었다. 인간 및 마우스를 비롯한 동물은, 항체가 실질적으로 모든 항원성 결정자를(그에 결합함으로써) 인식하여 유사한 에피토프들을 식별할 수 있도록 하는 능력을 가진다. 질병 유기체에 대한 보호의 기초를 제공할 뿐만 아니라, 항체가, 신체에서 발견되는 다른 유형의 분자들, 예컨대 정상 세포의 표면 상에 존재하는 수용체 또는 다른 단백질, 및 특유하게 암 세포의 표면 상에 존재하는 분자를 표적으로 하는 유인성 후보물질로 만든다. 이에 따라, 항체의 현저한 특이성은 그것을 유망한 인간 치료제로 만든다.
정맥내 감마글로불린과 같은 용도에 사용가능한 초기 항체 제제는, 세균(파상풍, 폐렴연쇄구균)를 파괴하고 감염된 개인의 혈액 내의 바이러스(A 및 B형 간염, 광견병, 사이토메갈로바이러스, 및 수두 바이러스(varicella zoster))를 중화하기 위해 생체내 사용된 동물 및 인간 항혈청을 포함한다. 가능히, 가장 중요한 초기 용도는 내독소의 사용이었다. 그러나, 임의의 항원에 대한 면역계의 반응이 심지어 가장 단순한 경우에도 "다클론성"이기 때문에, 즉 시스템이 결합 영역 및 작용자 영역 모두에서 광범위한 범위의 구조들의 항체를 제조하기 때문에, 인간 치료에 있어 항체 사용과 관련하여 문제들이 있다. 다클론 항체 치료는 또한 바람직 하지 못한 부정적 영향과 관련된다. 이 항체 제조의 다클론 성질에 부가하여, 오염 바이러스가 감염될 우려가 있었다. 혈청병 및 과민증도 또한 제한 인자로 간주되었다. 또한, 단일 항체-분비 세포를 단리하여 그것을 배양액에 두고자 할 경우에도, 모든 정상 체세포의 제한된 성장 가능성으로 인해 수세대 후에 사멸할 것이다.
1970년대 후반까지, 면역화 동물의 혈액 혈청으로부터 수득된 다클론 항체는 질병의 연구 또는 치료를 위한 항체의 소스만을 제공하였다. 특이적 항체의 단리는, Kohler 및 Milstein이 혈장 세포의 단일 클론에 의한 제조로 인해 모두 동일하게 되는 단일 특이성을 갖게 되고, 또한 무한정 성장할 수 있는 "단일클론 항체"의 제조 방법을 발견할 때까지 본질적으로 불가능하였다. 이 기술은 1975 공보(Nature 256: 495-97)에 기재되어 있고, Kohler 및 Milstein은 그 업적으로 인해 의학부문에서 1984년 노벨상을 수상하였다.
Kohler 및 Milstein의 단일클론 항체의 생산 기술의 첫 번째 단계는 관심 항원을 갖는 실험 동물을 면역화하는 것을 포함한다. 그 실험의 대부분에서, Kohler 및 Milstein는 마우스에게 양의 적혈 세포를 주입하였다. 마우스의 신체는 면역 반응을 개시하여 항원에 대한 특이적인 항체를 생산하기 시작한다. 이어서, 마우스의 비장을 제거하고, 관심 항체를 생산하는 B 세포를 단리한다. 이어서, 배양액 내에서 성장한 종양-생성 세포를 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 B 임파구와 융합시켜, "혼성체"를 생산한다. 융합으로 수득된 혼성체만이 살아남을 것이다. 비장 임파구는 제한된 수명을 가지므로, 골수종과 융합하지 않은 임의의 B 세포는 배양액에서 죽을 것이다. 부가적으로, B 세포의 항체-생성 측면이 결핍된 세포는 하이포자틴- 아미노프테린티미딘(HAT) 배지에서의 성장에 필요한 효소 HGPRT를 분비하지 않을 것이다. 세포가 성장하는 HAT 배지는 뉴클레오티드 합성 경로를 억제한다. HGPRT를 생산하는 세포는 이 경로를 우회하여 성장을 계속할 수 있다. 융합된 세포를 HAT 배지에 둠으로써, 진정한 혼성체를 단리할 수 있다. 이어서, 단리된 혼성체 세포를 원하는 항원에 대한 특이성에 대해 선별한다. 각 혼성체가 하나의 B 세포에서 비롯된 것이기 때문에, 그것은 하나의 항체의 복사체를 만든다. 항체 관심은 배양액에서 성장하여, 다량의 단일클론 항체를 생산하여, 이는 이어서 단리되어 추가 사용된다. 이 기술은 체세포 혼성화라고 불리고, (관심의 특정 항체의 불멸성 및 생산 모두에 대해 선택된) 수득된 혼성체는 무한정 배양될 수 있고, 즉 그것은 가능히 불멸 세포주이다.
단일클론 항체는 이제 진단 및 의료용 시약으로 널리 사용되고 있다. 그러나 그것의 인간 치료에의 도입은 훨씬 더 느렸다. 한 주요 난점은, 마우스 항체가 외래 물질로서 인간 면역계에 의해 "보여진다"는 것이다. 인간 환자는 그것에 대해 면역 반응을 일으키고 HAMA("인간 항마우스 항체")를 생산한다. 이는 치료 항체가 숙주로부터 급속히 제거되도록 할 뿐만 아니라, 신장에 손상을 야기하는 면역 복합체를 형성한다.
HAMA의 문제를 감소시키기 위한 시도로 2가지 접근법이 사용되었다. 첫 번째는 유전공학을 이용하여 마우스 단일클론 항체의 항원-결합 부분(가변 영역)이 인간 항체의 작용자 부분(불변 영역)에 융합된 키메라 항체를 생산하는 것이다. 두 번째 접근법에서는, 설치동물 항체를 상보성 결정 영역(CDR) 그라프팅 또는 "인간 화"로 알려진 기술을 통해 변경하였다. 이 방법에서, 중쇄의 3개 CDR 및 경쇄의 3개 CDR에 의해 형성된 항원 결합 부위가 설치동물 mAb를 분비하는 세포로부터 절단되어, 인간 항체의 골격을 코딩하는 DNA에 그라프팅된다. 설치동물 항체의 전체 가변 도메인이 아닌, 단지 항원-결합 부위 CDR만이 이식되기 때문에, 수득된 인간화 항체(제2 세대 "하이퍼키메라" 항체)가, 보고에 따르면, 제1 세대 키메라 항체에 비해 덜 면역원성이다. 이 방법은 "재형상화"로 알려진 변형을 포함하도록 더욱 향상되었다[Verhoeyen 등, "Reshaping human antibodies: grafting an anti-lysozyme activity", 1988 Science 239:1534-1536; Riechmann 등, "Reshaping human antibodies for therapy", 1988 Nature 332: 323-337; Tempest 등, "Reshaping human monoclonal antibody to inhibit respiratory syncitial virus infection in vivo", Bio/Technol 1991 9: 266-271), "하이퍼키메라화"(Queen 등, "A humanized antibody that binds to the human interleukin 2 receptor", 1989 Proc Natl Acad Sci USA 86: 10029-10033; Co 등, "Humanized antibodies for antiviral therapy", 1991 Proc Natl Acad Sci USA 88: 2869-2873; Co 등, "Chimeric and humanized antibodies with specificity for the CD33 antigen" 1992 J. Immunol. 148: 1149-1154), 및 "베니어링(veneering)"(Mark 등, "Derivation of therapeutically active humanized and veneered anti-CD18 antibodies", Metcalf BW, Dalton BJ 편저, Cellular adhesion: molecular definition to therapeutic potential. 뉴욕: Plenum Press, 1994: 291-312)].
상동성에 기초하는 재형상화 방법에서, 설치동물 가변 영역은 그것이 속하는 단백질 서열 하위군의 일치 서열과 비교된다. 유사하게, 골격을 수용하는 선택된 인간 불변 영역은 그것의 부류의 일치 서열과 비교된다. [Gussowal 등, "Humanization of monoclonal antibodies", 1991 Meth Enzymol 203:99-121]. 서열 분석은 친화성 성숙 절차 동안 변이를 겪었을 수 있고, 이에 따라 특유할 수 있는 잔기를 동정한다. 더욱 통상적인 인간 잔기의 혼입은 인간 어셉터 특이한 잔기를 대체함으로써 면역원성 문제를 감소시킨다고 일컬어진다. 또한, 재형상화 공정은 인간 및 설치동물 일치 서열이 비교되도록 하여, 임의의 계통적 "종" 차이를 규명하도록 한다고 일컬어진다. RSV19 항체는 이 절차를 이용함으로써 인간화되었다. [Taylor 등, "Humanized monoclonal antibody to respiratory syncitial virus", 1991 Lancet 337: 1411-1412; Tempest 등, "Reshaping a human monoclonal antibody to inhibit human respiratory syncitial virus infection in vivo", 1991 Bio/Technol 9: 266-271].
하이퍼키메라화(hyperchimerization)는 결합 활성의 재구성과 관련되기 쉬운 CDR 영역 외부의 잔기를 규명하는 한 대안 방법이다. 이 방법에서는, 인간 서열을 쥐 가변 영역 서열과 비교하여, 가장 높은 상동성을 갖는 것을 어셉터 골격으로 선택한다. 재형상화 절차에서와 같이, "특이한" 잔기를 더욱 통상적으로 발생하는 인간 잔기로 대체한다. CDR 서열과 상호작용할 수 있는 비-CDR 잔기를 규명한다. 마지막으로, 이 잔기들 중 어느 잔기가 가변 영역 골격에 포함되는 것인지를 결정한다. CD33 항원에 대한 인간화 항체는, 보고에 따르면, 이 방법에 의해 발달된다. [Co 등, "Chimeric and humanized antibodies with specificity for the CD33 antigen", 1992 J. Immunol. 148: 1149-154]. 또한 [Carter 등, "Humanization of an anti-pl85 HER2 antibody for human cancer therapy", 1992 Proc Natl Acad Sci USA 89: 4285-4289]도 참고한다.
단백질의 표시된 표면은 그것의 면역원성의 일차 결정자이다. 이에 따라, 인간화 쥐 항체는 인간 항체에서 통상적으로 발견되는 것들과 상이한 노출된 잔기를 대체함으로써 덜 면역원성으로 될 수 있다. 이 인간화 방법은 "베니어링"으로 칭해진다. 외부 잔기의 적당한 대체는 내부 도메인 또는 도메인 골격에 대한 영향이 거의 없거나 전혀 없을 수 있다. 베니어링은 2-단계 공정이다. 첫 번째 단계에서, 가장 상동적인 인간 가변 영역이 선택되고, 각 단일 잔기에 의해 상응하는 마우스 가변 영역과 비교된다. 2 번째 단계에서, 인간 동종체 내에 존재하는 잔기는 그것의 인간 동종체와 상이한 마우스 골격 잔기를 대체한다. 이 대체는 표면 상에 있고 적어도 부분적으로 노출된 잔기만을 포함한다.
그럼에도 불구하고, 인간 질병의 치료를 위한 면역글로불린 분자의 발달을 가져오는데 1/4 세기 동안의 단일클론 항체 기술 및 유전공학 방법에 대한 연구가 소요되었다. 실제로, 지난 5년까지 그것은 단일클론 항체가 확대되고 있는 부류의 치료제가 되지 못했다. [Glennie MJ 및 van de Winkel JG, Drug Discov Today 2003년 6월 1일; 8 (11): 503-10; Souriau C 및 Hudson PJ, "Recombinant antibodies for cancer diagnosis and therapy", 2003 Expert Opin Biol Ther. 3(2): 305-18]를 참고한다. 또한 [Pendley C 등, "Immunogenicity of therapeutic monoclonal antibodies", 2003 Curr Opin Mol Ther. 5 (2): 172-9]를 참고한다.
단일클론 항체의 배포된지 7년째인 1986년부터, 연간, 동일한 평균 1개 미만의 치료 항체가 시판되기 시작했다. 5개 쥐 단일클론 항체가 1986 내지 1995년의 10년간 인간 의약에 도입되었고, 이에는 기관 이식물의 급성 거부 반응을 방지하기 위해 1986년에 시판된, T 세포의 표면 상의 분자에 결합하는 "무로모납(muromonab)-CD3" (오르토클론(OrthoClone) OKT3
Figure 112006006498298-PCT00001
); 결장 암의 치료를 위해 1995년에 시판된 "에드레콜로맙(edrecolomab)"(파노렉스(Panorex)
Figure 112006006498298-PCT00002
); 및 비-호지킨씨 임파종에 사용하기 위해 2002년에 시판된 "이브리투모맙(ibritumomab)"(제발린(Zevalin)
Figure 112006006498298-PCT00003
이우세탄(yiuxetan))이 포함된다. 부가적으로, 하나의 단일클론 Fab, "아브시시맙(abciximab)"(레오프로(ReoPro)
Figure 112006006498298-PCT00004
)이 1995년에 시판되었다. 그것은, 정상적으로 피브리노겐에 의해 연결된 그 표면 상의 수용체에 결합함으로써 혈소판의 응집을 억제하고, 혈관형성술을 받은 환자에게 있어 관상 동맥이 다시 막히는 것을 방지하는데 도움이 될 수 있다. 3개 키메라 단일클론 항체가 또한 시판되었는데, 즉 " 대부분 B 세포들에서 발견되는 CD20 분자에 결합하여 B 세포 임파종을 치료하는데 사용되는 "리툭시맙"(리툭산(Rituxan)
Figure 112006006498298-PCT00005
)이 1997에 시판되었고; 이식 거부반응에 대해 1998년에 "바실릭시맙(basiliximab)"(시멀렉트(Simulect)
Figure 112006006498298-PCT00006
)이 시판되었으며; 류마티스성 관절염 및 크론씨병의 치료를 위해 1998년에, 종양 괴사 인자-알파(TNF-α)에 결합하는 "인플릭시맙(infliximab)"(레미케이드(Remicade)
Figure 112006006498298-PCT00007
)가 시판되었다. 부가적으로, 인간 혈소판의 당단백질(GP) IIb/IIIa 수용체에 결합하는 키메라 인간-쥐 단일클론 항체 7E3의 47.6 kD Fab 단편인 "아브시시맙 (abciximab)"(ReoPro
Figure 112006006498298-PCT00008
)은, 경피적 관상동맥 중재술을 받는 환자에게 있어 심장 허혈성 합병증의 방지를 위한 경피적 관상동맥 중재술에 대한 보조제로서 1995년에 시판되었다. 마지막으로, 7개 "인간화" 단일클론이 1997 내지 2003년에 시판되었으며, 즉 활성화된 T 세포의 표면에서 생성된 IL-2 수용체의 부분에 결합하는 "다클리주맙"(제나팍스(Zenapax)
Figure 112006006498298-PCT00009
)이 1997년에 시판되어, 이식된 신장의 급성 거부반응을 방지하는데 사용되며; "팔리비주맙(palivizumab)"(시나지스(Synagis)
Figure 112006006498298-PCT00010
)이 RSV를 위해 1998년에 시판되었으며; 유방암 세포에 발견되는 성장 인자 수용체인 HER-2에 결합하는 "트라스투주맙"(헤르셉틴(Herceptin)
Figure 112006006498298-PCT00011
)이 1998년에 시판되었고; 급성 골수성 백혈병(AML)에서 암 세포에 의해 발현되는나 골수의 재모집에 필요한 정상 줄기 세포에서는 발견되지 않는 세포-표면 분자인 CD33에 결합하는 단일클론 항체의 접합물인 "겜투주맙"(마일로타르그(Mylotarg)
Figure 112006006498298-PCT00012
)이 2000년에 시판되었으며; 백혈세포에서 발견되고, 만성 임파 백혈병의 일시적 경감을 일으키는 분자인 CD52에 결합하는 "알렘투주맙(alemtuzumab)"(맙캄파쓰(MabCampath)
Figure 112006006498298-PCT00013
)이 2001년에 시판되었고; 인간-유래 중쇄 및 경쇄 가변 영역, 및 인간 IgG:κ 불변 영역을 포함하는 인간 항TNF 단일클론인 "아달리무맙"(후미라(Humira)
Figure 112006006498298-PCT00014
(D2E7))이 류마티스성 관절염의 치료를 위해 2002년에 시판되었으며; IgE에 결합하여 그것이 비만 세포에 결합하는 것을 방지하는 "오말리주맙"(졸래어(Xolair)
Figure 112006006498298-PCT00015
)이 영구 대기중 항원에 대한 생체외 반응성 또는 양성 피부 테스트를 가지고, 그 증세가 흡입된 코르티코스테로이드로 부적당하게 억제되는 중간 내지 중증 지속성 천식을 앓는 12년 이상의 청소 년 및 성년의 치료를 위해 2003년에 승인되었다.
이에 따라, 단백질 공학처리는, 투여된 재조합 면역글로불린 폴리펩티드의 면역원성과 관련된 문제를 경감시키고, 항체 작용자 기능을 변경하고자 하는 노력으로 적용되었다. 그러나, 여전히 문제가 남아있다. 예를 들어, 리툭시맙 처리 환자의 대부분이 일반적으로 약 6 내지 12개월 내에 재발하고, 리툭시맙 주입 24 시간 내에 치사적 주입 반응이 보고되었다. 이 치사적 반응은 산소결핍, 폐침윤, 급성 호흡기 곤란 증후군, 심근경색증, 심실세동 또는 심폐소생술을 포함한 주입 반응 복합체를 따른다. 치사적 결과의 경우들의 투석세포용해를 필요로 하는 급성 신부전도 또한 심각한 점막 반응에서와 같이, 리툭시맙으로 처리한 종양 세포용해 증후군의 세팅에서 보고되었고, 일부는 치사적 성과가 있었다. 부가적으로, 리툭시맙은 분자가 크고 대략 150 kDa이며, 확산이 많은 종양 세포가 있는 림프계 조직에 제한되기 때문에, 정맥내 주사에는 고용량의 리툭시맙이 필요하다.
트라스투주맙 투여는 심실 기능장애 및 울혈성 심부전의 발달을 초래할 수 있고, 심장 기능장애의 발생율 및 심각도가 안트라사이클린 및 시클로포스파미드와 조합하여 트라스투주맙을 주입한 환자에게 특히 높은 것으로 보고되었다. 트라스투주맙 투여는 또한 심각한 과민증 반응(과민증 포함), 주입 반응 및 폐 이벤트를 초래할 수 있다.
다클리주맙 면역억제적 치료를 받은 환자는 임파 증식장애 및 기회 감염을 발달시킬 증가된 위험이 있고, 다클리주맙 사용이 다클리주맙-유도 면역억제 중에 먼저 생기는 항원과 반응하는 면역계의 능력에 장기 효과를 가질 것인지의 여부는 알려져 있지 않다.
심각한 간정맥폐쇄질환(VOD)을 비롯한 간독성도 또한 조합 화학치료 처방의 일부로서, 또한 간 질병 또는 조혈 줄기-세포 이식(HSCT) 이력이 있는 환자에게 있어, 단일제로서의 겜투주맙의 용도와 함께 보고되었다. HSCT 전 또는 후에 겜투주맙을 주입한 환자, 잠재적 간질병 또는 비정상적 간 기능을 갖는 환자, 및 다른 화학치료법과 조합하여 겜투주맙을 주입한 환자는 심각한 VOD를 발달시킬 증가된 위험에 처할 수 있다. 간 장애 및 VOD로 질환으로 인한 사망이 겜투주맙 주입 환자에 있어 보고되었고, 심지어 주의깊은 모니터링이 위험에 처한 모든 환자들을 규명하거나 간독성의 합병증을 예방할 수 없다는 것도 언급되었다.
간독성은 또한 알렘투주맙 주입 환자에게서도 보고되었다. 심각하고, 일부 드문 경우들에서는 치사적 범혈구감소증/골수형성부전, 자가면역 특발성 혈소판감소증, 및 자가면역 용혈성 빈혈이 알렘투주맙 치료를 받은 환자에게서 일어났다. 알렘투주맙은 또한 심각한 주입 반응 및 기회 감염을 초래할 수 있다.
아달리무맙 처리 환자들에 있어, 사망을 포함한 심각한 감염 및 패혈증이 임상적 증상의 격화 및/또는 탈수초 질병의 방사성 증명에서와 같이, 보고되었고, 임상적 시험에서 아달리무맙으로 처리된 환자는 일반적 집단에서 예상된 발생율보다 높은 임파종 발생율을 가졌다.
오말리주맙을 이용한 임상적 연구에 있어 심각한 역반응은 악성질환 및 과민증을 포함하였고, 여기에서 오말리주맙-처리 환자들 중 악성 질환의 관찰된 발생율(0.5%)은 대조군 환자들(0.2%)보다 수치적으로 높다.
전면역글로불린 치료와 관련된 각종 문제들을 해결하기 위한 노력으로, 보다 작은 면역글로불린 분자가 구성되었다. 단일쇄 면역글로불린 가변 영역 단편 폴리펩티드(scFv)는 짧은 링커 펩티드를 통해 면역글로불린 경쇄 가변 도메인에 결합된 면역글로불린 중쇄 가변 도메인으로 이루어진다. [Huston 등, 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-83]. 전면역글로불린에 비해 보다 작은 크기의 scFv 분자가 혈장으로부터의 보다 빠른 클리어런스를 초래할 수 있고, 보다 효과적으로 조직에 투과됨이 제시되었다. 예를 들어, [Jain, 1990 Cancer Res. 50: 814s-819s]를 참고한다. 항종양 scFv는 상응하는 키메라 항체에 비해, 보다 빠른 종양 투과 및 종양체 전반에 걸친 보다 많은 분포를 나타내는 것으로 보고되었다. [Yokota 등, Cancer Res. 52:3402-08 (1992)].
scFv 분자가 혈장치료에 대해 가질 수 있는 이점들에도 불구하고, 이 치료법에 대한 결점도 또한 존재한다. 예를 들어, scFv의 급속한 클리어런스는 최소한의 효과량이 표적 조직에 전달되는 것을 방지할 수 있다. 부가적으로, 환자에게 투여하기 위한 적당량의 scFv의 제조는 수율에 부정적 영향을 주는 scFv를 발현시키고 단리함에 있어 난점으로 인해 도전적 문제이다. 발현 도중에, scFv 분자는 안정성이 결핍되고, 종종 상이한 분자로부터의 가변 영역의 쌍편성으로 인해 응집한다. 또한, 포유동물 발현 시스템에서의 scFv 분자의 생산 수준은, 보고에 따르면 낮고. 이는 치료를 위한 scFv 분자의 효율적 제조 가능성을 제한할 수 있다. [Davis 등, 1990 J. Biol. Chem. 265: 10410-18; Traunecker 등, 1991 EMBO J. 10: 3655-59]. 생산 증대를 위한 수단 전략이 탐색되었고, 보고에 따르면 가변 영역에 대한 글리 코실화 부위의 첨가를 포함한다. 예를 들어, [미국 특허 No. 5,888,773; Jost 등, 1994 J. Biol. Chem. 269: 26267-73]를 참고한다. 치료를 위한 scFv의 사용에 있어 다른 한 결점은 작용자 기능의 결핍이다. 세포용해성 기능, ADCC, 및 보체 의존성-세포독성이 결핍된 scFv는 질병 치료를 위해 덜 효과적이거나 비효과적일 수 있다. scFv 기술의 발달이 12년 전에 시작하였으나, 치료를 위해 승인된 scFv 산물은 현재 없다.
대안적으로, scFv의, 다른 한 분자, 예컨대 독소로의 융합이 특이적 항원-결합 활성 및 독소를 표적 조직에 전달하는 작은 크기의 scFv를 이용할 수 있다는 것이 제안되었다. [Chaudary 등, 1989 Nature 339: 394; Batra 등, 1991 Mol. Cell. Biol. 11: 2200]. 이에 따라, 독소의 scFv로의 접합 또는 융합은 종종 강한 항원-특이적 분자를 제공하기 위한 대안적 전략으로 제공되나, 그러한 접합물 또는 키메라물을 투여하는 것은 그러한 제제의 독소 부분으로 인해 과다 및/또는 비-특이적 독성에 의해 제한될 수 있다. 독성 영향은 간 효소의 초생리학적 증가 및 혈관 누출 증후군, 및 기타 바람직하지 못한 영향을 포함할 수 있다. 또한, 면역독소는 자체적으로, 숙주에 투여 시에 매우 면역원성이고, 면역독소에 대해 발생된 숙주 항체는 개인의 반복 치료적 처리에 대한 가능한 유용성을 제한한다.
면역글로불린 불변 영역 폴리펩티드 서열이 존재하고, 비면역글로불린 서열이 항체 가변 영역을 치환하는 융합 단백질을 또한 조사하였다. 예를 들어, HIV에 의해 인식되는 T 세포 표면 단백질인 CD4는 면역글로불린 Fc 작용자 도메인에 재조합 융합되고, IL-2-IgG1 융합 단백질은, 보고에 따르면, IL-2 수용체를 갖는 세포 의 보체-매개 세포용해를 행한다. [Sensel 등, Chem. Immunol. 65: 129-158 (1997)]을 참고한다. 재조합 항체 기술의 모든 측면들에 대한 상세 정보, 및 광대한 도입을 교본 "재조합 항체(Recombinant Antibodies)"(John Wiley & Sons, NY, 1999)]에서 찾아볼 수 있다. 상세한 항체 공학처리 실험 프로토콜의 조합적 콜렉션을 [R. Kontermann 및 S. Dubel (편저), "The Antibody Engineering Lab Manual" (Springer Verlag, 하이델베르크/뉴욕, 2000)]에서 찾아볼 수 있다.
면역글로불린 치료의 일부 유형에 순응적인 것으로 사료되는 질병 및 장애는 암 및 면역계 장애를 포함한다. 암은 광범위한 질병들을 포함하고, 전 세계적으로 4명 개인 당 대략 한 명이 걸려 있다. 악성 세포의 급속하고도 제어되지 않는 증식은 혈액학적 악성질환을 비롯한 많은 유형의 암들의 한 특질이다. 혈액학적 악성 상태의 환자가 지난 이십여년간 암 치료의 진보로부터 이익을 받았고[Multani 등, 1998 J. Clin. Oncology 16: 3691-3710, 재발 기간이 증가되었으나, 대부분의 환자들은 여전히 재발되고 있고, 그 질병에 굴복한다. 세포독성 약물을 이용한 치료에 있어 장벽은 예를 들어 종양 세포 내성 및 화학치료의 높은 독성을 포함하고, 이는 많은 환자들에 있어 최적 투약을 방해한다.
그럼에도 불구하고, 환자는 악성 세포를 표적으로 하는, 즉 종양 세포에 대해 발현된 항원에 대한 면역 치료제로 치료를 받아왔다. 면역치료 표적으로 사용하기에 적당한 종양 세포 표면 항원의 선택에 있어, 그러한 표적 항원이 정상 조직에 의해 발현되지 않는 것이, 특히 그러한 조직의 보존이 숙주 생존에 중요한 경우에, 바람직하다. 혈액학적 악성질환의 경우, 악성 세포는 줄기 세포 또는 다른 필수적 인 세포의 표면에 발현되지 않은 많은 항원들을 발현한다. 혈액학적 기원의 정상 및 악성 세포 모두를 고갈시키는 치료 처방을 이용하는 혈액학적 악성 상태의 치료는, 선구물질로부터의 정상 세포의 재생이 치료가 끝난 후에 일어날 수 있을 경우에 허용가능하였다. 부가적으로, 표적 항원은 바람직하게 종양 세포의 모든 또는 실질적으로 모든 세포생존 집단에 대해 발현되고, 면역글로불린 치료로부터의 선택적 압력에도 불구하고 발현이 지속되는 것이 최적이다. 세포 표면 유전자형(예컨대, 한 특별한 항원결합부위)을 B 세포 악성질환의 치료 표적으로 선택하는 전략이, 항원이 높은 종양 선택도를 나타내는 경우에도, 변경된 표면 유전자형 발현과 함께, 종양 세포 변종의 과성장에 의해 제한되었다. [Meeker 등, 1985 N. Engl. J. Med. 312:1658-65]. 선택된 항원은 또한 면역글로불린이 그것에 결합한 후에 적절하게 교통하여야 한다. 면역글로불린이 항원에 결합한 후의 세포 표면 표적 항원의 배출 또는 내면화는 종양 세포가 파괴에서 벗어나도록 할 수 있고, 이에 따라 혈장치료의 효능이 제한된다. 마지막으로, 세포 활성화 신호를 전달하거나 유도하는 세포 표면 표적 항원으로의 면역글로불린의 결합은 종양 세포에서의 면역치료에서 향상된 기능성 반응을 초래할 수 있고, 성장 정지 및/또는 세포사멸을 초래할 수 있다. 이 성질들 모두가 중요하나, 면역글로불린이 표적 항원에 결합한 후의 세포사멸의 촉발이 또한 성공적 혈장치료를 달성함에 있어 한 중요한 인자일 수도 있다.
B 및 T 세포 악성질환의 혈장치료의 표적으로 시험된 항원은 Ig 유전자형(Brown 등, 1989 Blood 73: 651-61), CD19(Hekman 등, 1991 Cancer Immunol. Immunother. 32: 364-72), Vlasveld 등, 1995 Cancer Immunol. Immunother. 40: 37-47), CD20(Press 등, 1987 Blood 69: 584-91), Maloney 등, 1997 J. Clin. Oncol. 15: 3266-74), CD21(Scheinberg 등, 1990 J. Clin. Oncol. 8: 792-803), CD5(Dillman 등, 1986 J. Biol. Respn. Mod. 5:394-410), 및 CD52(CAMPATH)(Pawson 등, 1997 J. Clin. Oncol. 15:2667-72)을 포함한다. 이들 중, B 세포 임파종의 치료를 위한 보다 큰 이익이 CD20을 표적으로 하는 분자를 이용하여 얻어졌다. 항원의 생물학적 성질에 의해 다른 표적들이 제한되었다. 예를 들어, 표면 유전자형이 체세포 변이를 통해 변경될 수 있고, 종양 세포가 빠져나가도록 한다. CD5, CD21, 및 CD19는 단일클론 항체 결합 후에 급속히 내면화되고, 단일클론 항체가 독소 분자와 접합하지 않을 경우에 종양 세포가 파괴를 피하도록 한다. CD22는 B 세포 임파종의 서브셋에서만 발현됨으로써, 그 유용성이 제한되고, 한편 CD52는 T 세포 및 B 세포에서만 발현되므로, 결실에 의해 I 역생산적 면역억제를 발생시킬 수 있다.
보다 낮은 등급 또는 소낭 B 세포 임파종 환자를 키메라 CD20 단일클론 항체로 처리하면 환자에게 있어 부분적 또는 완전한 반응이 유도된다는 것이 보고되었다. [McLaughlin 등, 1996 Blood 88:90a(요약, 보충물 1); Maloney 등, 1997 Blood 90: 2188-95]. 그러나, 상기 언급된 바와 같이 종양 재발은 통상 6개월 내지 1년 내에 일어난다. 예를 들어 낮은 등급의 B 세포 임파종에 있어 더욱 지속적인 반응을 유도하고, 또한 높은 등급의 임파종 및 기타 B 세포 질병의 효과적 치료를 허용하기 위해, 혈장치료에 있어 더한 향상이 필요하다.
다른 한 접근법은, CD20에 대해 특이적인 단일클론 항체를 이용하여, B 세포 임파종에 대한 방사성 동위원소를 표적으로 하였다. 보고에 따르면, 치료 효능이 증가될지라도, 방사성활성의 항체의 생체내 긴 반감기와 관련된 독성이 또한 증가하고, 이는 경우에 따라 환자가 줄기 세포 구조를 받을 것을 필요로 한다. [Press 등, 1993 N. Eng J. Med. 329:1219-1224; Kaminski 등, 1993 N. Eng. J.c Med. 329:459-65]. CD20에 대한 단일클론 항체는 또한 프로테아제로부터 분리되어, 방사성 동위원소의 부착 전에 F(ab')2 또는 Fab 단편을 생성시켰다. 이는 종양으로의 방사성 동위원소 접합물의 투과를 향상시키고, 로고 반감기를 단축시키며, 이에 따라 정상 조직에 대한 독성을 감소시키는 것으로 보고되었다. 그러나, 이 분자는 보체 고정 및/또는 ADCC를 비롯한, 작용자 기능이 결핍되어 있다.
CD20은 단일클론 항체에 의해 동정된 1차 인간 B 세포주-특이적 표면 분자였다. 그것은, 세포질에 위치한 아미노 및 카르복시 말단 모두를 갖는 비-글리코실화된 소수성 35 kDa B 세포 막투과 인단백질이다. [Einfeld 등, 1988 EMBO J. 7: 711-17]. CD20은 모든 정상 성숙 B 세포에 의해 발현되나, 전구체 B 세포에 의해서는 발현되지 않는다. CD20에 대한 자연적 리간드는 동정되지 않았고, B 세포 생물학에 있어 CD20의 기능은 여전히 불완전하게 이해되고 있다.
항CD20 단일클론 항체는 B 세포의 생존력, 및 성장 및 성장에 영향을 미친다. [Clark 등, 1986 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4494-98]. CD20의 광대한 가교결합은 B 임파종 세포주에서 세포사멸을 유도할 수 있고[Shan 등, 1998 Blood 91: 1644-52], 또한 예를 들어 세포 기질의 티로신 인산화를 측정함으로써 검출되는 바와 같이, 세포 표면 상의 CD20의 가교결합은 신호 유도의 역학 성질의 정도를 증가시키고 증진하는 것으로 보고되었다. [Deans 등, 1993 J. Immunol. 146:846- 53]. 그러므로, 보체 및 ADCC 메커니즘에 의한 세포 결실에 부가하여, 생체내 CD20 단일클론 항체에 의한 Fc-수용체 결합은 CD20 가교결합에 의한 악성 B 세포의 세포사멸을 촉진할 수 있고, 이는 SCID 마우스 모델에서의 인간 임파종의 CD20 치료 효능이 CD20 단일클론 항체에 의한 Fc-수용체 결합에 의존할 수 있다는 이론에 부합한다. [Funakoshi 등, 1996 J. Immunotherapy 19: 93-101]. CD20 폴리펩티드에서의 다중 막 스패닝 도메인의 존재는(Einfeld 등, 1988 EMBO J. 7: 711-17; Stamenkovic 등, 1988 J. Exp. Med. 167: 1975-80; Tedder 등, 1988 J. Immunol. 141: 4388-4394), 항체 결합 후의 CD20 내면화를 방지하고, 이는 쥐 CD20 단일클론 항체인 1F5를 B 세포 환자에게 주입할 때, 악성 세포 및 부분적 임상적 반응의 상당한 결실을 초래하여, 악성질환의 치료에 대한 한 중요한 특성으로 인식되었다. [Press 등, 1987 Blood 69: 584-91].
정상 성숙 B 세포는 또한 CD20를 발현하기 때문에, 정상 B 세포는 항CD20 항체 치료에 의해 결실된다. [Reff, M. E. 등, 1994 Blood 83: 435-445]. 그러나, 치료가 완료된 후, 정상 B 세포는 CD20 음성 B 세포 전구체로부터 재생될 수 있고; 이에 따라 항CD20 치료법으로 치료받은 환자는 상당한 면역억제를 겪지 않는다. 정상 B 세포의 결실은 또한 자가항체의 부적당한 생산과 관련된 질병, 또는 B 세포가 역할을 하는 다른 질병에서 유익할 수 있다. 인간 IgG1 중쇄 및 인간 카파 경쇄 불변 영역에 융합된 마우스 기원의 마우스 기원의 중쇄 및 경쇄 가변 영역으로 구성된, CD20에 대해 특이적인 키메라 단일클론 항체는, 보고에 따르면, CD20에 대한 결합, 및 ADCC를 매개하고 보체를 고정하는 능력을 보유하였다. [Liu 등, 1987 J. Immunol. 139: 3521-26]. 상기 논의된 리툭시맙의 항종양 활성의 메커니즘은, 큰 크기의 리툭시맙이 분자가 악성 B 세포를 함유하는 림프계 조직으로 최적 확산하는 것을 막고, 이로써 이 항종양 활성을 제한하나, ADCC, 보체 고정, 및 악성 B 세포에서 세포사멸을 촉진하는 신호의 촉발을 비롯한, 수개 활성이 조합된 것으로 사료된다. 자가면역 질병은 그레이브스씨병 및 하시모토 갑상선염을 포함하는 자가면역 갑상선 질병을 포함한다. 단 미국에서만, 일부 형태의 자가면역 갑상선 질병을 앓는 사람들이 약 2천만명이 있다. 자가면역 갑상선 질병은, 갑상선을 자극하여 갑상선기능항진증(크레이브씨병)을 유발하거나, 갑상선을 파괴하여 갑상선기능저하증(하시모토 갑상선염)을 유발하는 자가항체의 생산으로부터 초래된다. 갑상선의 자극은 갑상선 자극 호르몬(TSH) 수용체에 결합하여 그것을 활성화하는 자가항체에 의해 유발된다. 갑상선의 파괴는 다른 갑상선 항원과 반응하는 자가항체에 의해 유발된다. 그레이브스씨병의 현 치료법은 수술, 방사선활성 요오드, 또는 항갑상선 약물 치료법을 포함한다. 항갑상선 약품이 상당한 부정적 영향을 가지고, 질병 재발율이 높기 때문에, 방사선활성 요오드가 널리 사용된다. 수술은 큰 갑상선종을 갖는 환자, 또는 갑상선 기능의 급속한 정상화가 필요한 경우에 준비된다. TSH 수용체를 자극하는데 원인이 될 수 있는 자가항체의 생산을 표적으로 하는 치료법이 없다. 하시모토 갑상선염의 현 치료법은 레보타이록신 나트륨이고, 그 치료법은 재발 가능성이 낮기 때문에 주로 평생 이루어진다. 억제적 치료법은 하시모토 갑상선염에 있어 갑상선종을 감축시키는 것으로 나타났으나, 질병 메커니즘을 표적으로 하는 자가항체 생산을 감소시키는 치료법은 알려져 있지 않다.
류마티스성 관절염(RA)은 관절의 염증을 특징으로 하고 부종, 통증, 및 기능 손실을 초래하는 만성 질병이다. RA는 미국에서 평가컨대 2백5십만명 사람들이 영향을 받고 있다. RA는 초기 감염 또는 상해, 비정상적 면역 반응, 및 유전적 인자를 비롯한 이벤트들의 조합에 의해 유발된다. 자가반응성 T 세포 및 B 세포가 RA에 존재하는 동안, 류마티스성 인자로 칭해지는, 관절에서 수집하는 높은 수준의 항체의 검출이 RA의 진단에 사용된다. RA의 현 치료법은 질병의 통증을 완화하고 진전을 늦추기 위한 많은 약품들을 포함한다. 그 질병을 치료할 수 있는 치료법은 발견하지 못했다. 약품은 비스테로이드성 항염증 약물(NSAIDS), 질병 개질 항류마티스성 약물(DMARDS)을 포함한다. NSAIDS는 양성 질병에 유용하나, 관절 파괴의 진전 및 심각한 RA의 쇠약을 방지하지 못한다. NSAIDS 및 DMARDS는 모두 상당한 부정적 영향과 관련된다. 단 하나의 신규 DMARD인 레플로노마이드만이 10년간 승인받아왔다. 레플로노마이드는 자가항체의 생산을 막고, 염증을 감소시키며, RA의 진전을 늦춘다. 그러나, 이 약물은 또한 구토, 설사, 탈모, 홍진 및 간 상해를 비롯한, 심각한 부정적 영향을 초래한다.
전신성 홍반성 낭창(SLE)은 신장, 피부 및 관절을 비롯한, 다수 기관들 내 혈관에 대한 재발 상해에 의해 유발되는 자가면역 질병이다. SLE는 미국에서 500,000명 이상에게 영향을 주는 것을 평가된다. SLE 환자에게 있어, T 세포 및 B 세포간의 부적절한 상호작용은 세포 핵을 공격하는 자가항체의 생산을 초래한다. 이는 항-이중나선 DNA 및 항-Sm 항체를 포함한다. 인지질에 결합하는 자가항체는 또한 SLE 환자들 중 약 절반에서 발견되고, 혈관 손상 및 낮은 혈액 계수의 원인이 될 수 있다. 면역 복합체는 SLE 환자의 신장, 혈관 및 관절에 축적되어, 거기에서 염증 및 조직 손상을 유발한다. 그 질병을 치료하는, SLE 치료가 발견되지 못했다. NSAIDS 및 DMARDS는 질병의 심각도에 따라 치료에 사용된다. 자가항체를 제거하기 위해 혈장 교환을 이용하는 혈장 반출술은 SLE 환자에게 있어 일시적 개선을 일으킬 수 있다. 자가항체가 SLE의 원인이 될 수 있다는 일반적 합치 의견이 있어, 면역계를 전구체로부터 신규 B 세포가 생성되도록 재설정하도록 하는, B 세포주를 결실시키는 신규 치료법은, SLE 환자에게 있어 장기 지속 이익에 대한 희망을 줄 것이다.
쇼그렌 증후군은 신체의 수분-생성 샘의 파괴를 특징으로 하는 자가면역 질병이다. 쇼그렌 증후군은 가장 널리 편재하는 자가면역 장애들 중 하나로서, 미국에서 평가컨대 4백만명이 앓고 있다. 쇼그렌 증후군 환자들 중 약 절반이 연결 조직 질병, 예컨대 RA를 가지고, 한편 다른 절반은 일차 쇼그렌 증후군을 가지고 다른 동시발생 자가면역 질병은 가지지 않는다. 항-핵 항체, 류마티스성 인자, 항-포드린, 및 항-무스카린 수용체를 비롯한 자가항체는 종종 쇼그렌 증후군 환자에게 존재한다. 통상적 치료법은 코르티코스테로이드를 포함하고, 부가적인 더욱 효과적인 치료법이 유익할 것이다.
면역 혈소판감소성 자반증(ITP)은 혈액 혈소판에 결합하는 자가항체에 의해 유발되고, 자신의 파괴를 유발한다. 약물은 ITP의 일부 경우들을 유발하고, 다른 것들은 감염, 임신, 또는 자가면역 질병, 예컨대 SLE와 관련된다. 모든 경우들의 약 절반이 "특발성"으로 분류되고, 이는 원인이 알려져 있지 않음을 의미한다. ITP 의 치료는 증상의 심각도에 의해 결정된다. 몇 가지 경우들에서, 대부분의 경우들에서, T 세포 결실을 위해, 코르티코스테로이드, 또는 면역 글로불린의 정맥내 주입을 비롯한, 면역억제적 약물이 제공되나, 치료법은 없다. 주로 증가된 수의 혈소판을 초래하는 다른 한 치료는 항체-피복 혈소판을 파괴하는 기관인 비장의 제거이다. 시클로스포린, 시클로포스파미드, 또는 아자티오프린을 비롯한, 더욱 강한 면역억제적 약물이 심각한 경우의 환자를 위해 사용된다. 환자의 혈장을 단백질 A 칼럼에 통과시킴에 의한 자가항체의 제거는 심각한 질병의 환자에게 있어 2차 라인 치료로 사용된다. 부가적인 더욱 효과적인 치료법이 요망된다.
다발성 경화증(MS)은 또한 자가면역 질병이다. 그것은 중추신경계의 염증, 및 뇌, 척수 및 신체에 있어 신경 세포 섬유를 격리하는 수초의 파괴를 특징으로 한다. MS의 원인은 알려져 있지 않으나, 자가면역 T 세포가 질병의 병원발생의 일차 기여자인 것으로 널리 믿어지고 있다. 그러나, 높은 수준의 항체가 MS 환자의 뇌척수액에 존재하고, 일부 이론은 항체 생산을 초래하는 B 세포 반응이 질병 매개에 중요함을 예측한다. MS 환자에 있어서는 B 세포 결실 치료법이 연구되지 않았고, MS에 대한 치료가 없다. 현 치료법은 코르티코스테로이드이고, 이는 공격의 기간 및 심각성을 감소시킬 수 있으나, 시간에 걸쳐 MS의 과정에 영향을 주지 않는다. MS에 대한 신규 생물학 인터페론(IFN) 치료법이 최근 승인되었으나, 부가적인 더욱 효과적인 치료법이 요망된다.
중증 근무력증(MG)은 자발적 근육 군의 나약함을 특징으로 하는 만성 자가면역 신경근육 장애이다. MG는 미국에서 약 40,000명에게 영향을 준다. MG는 신경근 육 결합부에서 발현되는 아세틸콜린 수용체에 결합하는 자가항체에 의해 유발된다. 자가항체는 아세틸콜린 수용체를 감소시키거나 차단하며, 신경에서 근육으로의 신호 전달을 방지한다. MG에 대한 치료가 알려져 있지 않다. 통상적 치료는 코르티코스테로이드, 시클로스포린, 시클로포스파미드, 또는 아자티오프린을 이용한 면역억제를 포함한다. 흉선의 수술적 제거는 종종 자가면역 반응을 더디게 하기 위해 사용된다. 혈액 중 자가항체 수준을 감소시키기 위해 사용되는 혈장 반출술은 MG에서 효과적이나, 자가항체의 생산이 계속되기 때문에 수명이 짧다. 혈장 반출술은 주로 수술 전에, 심각한 근육 나약성을 위해 준비된다. 신규의 효과적인 치료법이 유익할 것이다.
건선은 대략 5백만명에게 영향을 주고, 피부에서의 자가면역 염증을 특징으로 한다. 건선은 또한 30%로 관절염과 연합된다(건선성 관절염). 스테로이드, 자외선 레테노이드, 비타민 D 유도체, 시클로스포린, 메토트렉세이트를 비롯한 많은 치료들이 사용되었으나, 신규의 효과적인 치료법으로부터 건선이 이익을 얻을 수 있는 것이 일반적이다. 경피증은 계통적 경화증으로도 알려져 있는 연결 조직의 만성 자가면역 질병이다. 경피증은 콜라겐이 과다생산을 특징으로 하고, 피부의 비후화를 초래하고, 미국에서 대략 300,000명이 경피를 앓고 있으며, 이들은 또한 신규의 효과적인 치료법으로 이익을 받을 것이다.
B 세포 악성질환 및 장애를 비롯한 악성질환, 및 자가면역 질병, 장애, 및 상태, 및 기타 질병, 장애 및 상태를 치료하기 위한 향상된 조성물 및 방법에 대한 명백한 필요성이 있다. 본원에 기재되고 청구된 본 발명의 조성물 및 방법은, 그러 한 향상된 조성물 및 방법, 및 다른 이점을 제공한다.
발명의 개요
본 발명의 한 측면은, CH1 이외의, 면역글로불린 중쇄로부터의 하나 이상의 천연 또는 공학처리된 불변 영역, 예를 들어 IgG 및 IgA의 CH2 및 CH3 영역, 또는 IgE의 CH3 및 CH4 영역을 포함하는 영역에 융합되거나 그와 달리 연결된, 면역글로불린 힌지 또는 힌지-작용 영역 폴리펩티드에 융합되거나 그와 달리 연결된 결합 도메인 폴리펩티드를 포함하는 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질을 제공하는 것이다. 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질은, 힌지 영역 폴리펩티드에 융합되거나 그와 달리 연결된 천연 또는 공학처리된 면역글로불린 중쇄 CH2 불변 영역 폴리펩티드(또는 IgE로부터 전부 또는 부분 유도된 구축물의 경우에는 CH3), 및 CH2 불변 영역 폴리펩티드(또는 IgE로부터 전부 또는 부분 유도된 구축물의 경우에는 CH3)에 융합되거나 그와 달리 연결된 천연 또는 공학처리된 면역글로불린 중쇄 CH3 불변 영역 폴리펩티드(또는 IgE로부터 전부 또는 부분 유도된 구축물의 경우에는 CH4)를 포함하거나, 그것들로 본질적으로 구성되거나 구성된 영역을 추가로 포함한다. 그러한 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질은 항체 의존성 세포-매개 세포독성 및 보체 고정으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 면역학적 활성을 가질 수 있다. 그러한 결합 도메인 폴리펩티드는 또한 표적, 예를 들어 표적 항원에 결합하거나 특이적으로 결합할 수 있다.
특정 구현예들에서, 예를 들어 결합 도메인 폴리펩티드는 천연 또는 공학처리된 면역글로불린 경쇄 가변 영역 폴리펩티드 및/또는 천연 또는 공학처리된 면역 글로불린 중쇄 가변 영역 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 면역글로불린 가변 영역 폴리펩티드를 포함한다. 다른 특정 구현예들에서, 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질은 천연 또는 공학처리된 면역글로불린 중쇄 가변 영역 폴리펩티드를 포함하고, 여기에서 중쇄 가변 영역 폴리펩티드는, 아미노산 위치 9, 10, 11, 12, 108, 110, 및/또는 112 중 임의의 하나 이상에 상응하는 위치에 있는 아미노산(들)의 변이, 치환, 또는 결실을 포함하는 공학처리된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 폴리펩티드(또는 비-인간종으로부터의 공학처리된 면역글로불린 중쇄 가변 영역 폴리펩티드)이다. 중쇄 가변 영역에서 아미노산 위치 9, 10, 11, 12, 108, 110, 및/또는 112 중 하나 이상에 상응하는 위치에 있는 아미노산(들)의 변이, 치환, 또는 결실은 예를 들어 서열번호 _ 에 상응하는 구성체와 같은 구성체 내에 포함될 수 있다. 다른 특정 구현예들에서, 융합 단백질은 서열번호 _ 또는 서열번호 _ 로부터 선택된 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 특정 구현예들에서, 면역글로불린 가변 영역 폴리펩티드는 예를 들어 인간 면역글로불린으로부터 유래되고, 다른 특정 구현예들에서, 면역글로불린 가변 영역 폴리펩티드는 인간화 면역글로불린 폴리펩티드 서열을 포함한다. 특정 구현예들에서, 면역글로불린 가변 영역 폴리펩티드는 인간화의 여부와 상관없이, 쥐 면역글로불린으로부터 유래되거나, 예를 들어 쥐, 돼지, 원숭이 또는 낙타를 비롯한 다른 종의 면역글로불린으로부터 유래된다.
본 발명의 특정 구현예들에 따라, 결합 도메인 폴리펩티드는 (a) 하나 이상의 천연 또는 공학처리된 면역글로불린 경쇄 가변 영역 폴리펩티드; (b) 하나 이상 의 천연 또는 공학처리된 면역글로불린 중쇄 가변 영역 폴리펩티드; 및 (c) (a)의 폴리펩티드 및 (b)의 폴리펩티드에 융합되거나 그와 달리 연결된 하나 이상의 링커 폴리펩티드를 포함한다. 다른 특정 구현예들에서, 천연 또는 공학처리된 면역글로불린 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역 폴리펩티드는 인간 면역글로불린으로부터 유도되거나 구축되고, 다른 특정 구현예들에서, 링커 폴리펩티드는 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser[서열번호 _ ]을 포함하거나 가지는 하나 이상의 폴리펩티드를 포함한다. 다른 구현예들에서, 링커 폴리펩티드는 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser[서열번호 _ ]를 갖는 폴리펩티드의 2 또는 3개의 반복체를 포함한다. 다른 구현예들에서, 링커는 글리코실화 부위를 포함하고, 그 부위는 다른 특정 구현예들에서는 아스파라긴-연결 글리코실화 부위, 0-연결 글리코실화 부위, C-만노실화 부위, 글리피에이션(glypiation) 부위 또는 포스포글리케이션 부위이다. 다른 한 구현예들에서, 천연 또는 공학처리된 면역글로불린 중쇄 CH2 불변 영역 폴리펩티드 및 천연 또는 공학처리된 면역글로불린 중쇄 CH3 불변 영역 폴리펩티드 중 하나 이상은 IgG 또는 IgA 인간 면역글로불린 중쇄로부터 유래된다. 다른 한 구현예에서, 천연 또는 공학처리된 면역글로불린 중쇄 CH3 불변 영역 폴리펩티드 및 천연 또는 공학처리된 면역글로불린 중쇄 CH4 불변 영역 폴리펩티드 중 하나 이상은 IgE 인간 면역글로불린 중쇄로부터 유래된다.
면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드는 예를 들어 (1) 임의의 힌지 또는 힌지-작용 펩티드, 또는 자연 발생하는 폴리펩티드, 예를 들어 인간 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드, 예컨대 야생형 인간 IgG 힌지 또는 그것의 일부, 야생형 인간 IgA 힌지 또는 그것의 일부, 야생형 인간 IgD 힌지 또는 그것의 일부, 또는 야생형 인간 IgE 힌지-작용 영역, 즉, IgE CH2 또는 그것의 일부, 야생형 낙타류 힌지 영역 또는 그것의 일부(IgG1 라마 힌지 영역 또는 그것의 일부, IgG2 라마 힌지 영역 또는 그것의 일부, 및 IgG3 라마 힌지 영역 또는 그것의 일부 포함), 너스 상어 힌지 영역 또는 그것의 일부, 및/또는 점박이 은상어 힌지 영역 또는 그것의 일부; (2) 시스테인 잔기를 함유하지 않고 하나 이상의 시스테인 잔기를 갖는 야생형 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드로부터 유도되거나 구축된 변이화되거나, 그와 달리 변경되거나 공학처리된 힌지 영역 폴리펩티드; (3) 하나의 시스테인 잔기를 가지고 하나 이상의 시스테인 잔기를 갖는 야생형 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드로부터 유래된 변이화되거나, 그와 달리 변경되거나 공학처리된 힌지 영역 폴리펩티드; (4) 하나 이상의 글리코실화 부위, 예를 들어 아스파라긴-연결 글리코실화 부위, 0-연결 글리코실화 부위, C-만노실화 부위, 글리피에이션 부위 또는 포스포글리케이션 부위를 포함하거나 부가하는 변이화되거나, 그와 달리 변경되거나 공학처리된 힌지 영역 폴리펩티드; (5) 시스테인 잔기들의 수가 아미노산 치환 또는 결실에 의해 감소된 변이화되거나, 그와 달리 변경되거나 공학처리된 힌지 영역 폴리펩티드, 예를 들어 예컨대 0, 1 또는 2개의 시스테인 잔기를 갖는 변이화되거나, 그와 달리 변경되거나 공학처리된 IgG1 또는 IgG4 힌지 영역, 예컨대 0, 1, 2 또는 3개 시스테인 잔기를 갖는 변이화되거나, 그와 달리 변경되거나 공학처리된 IgG2 힌지 영역, 예컨대 0, 1, 2, 3 또는 4 내지 10개 시스테인 잔기를 갖는 변이화되거나, 그와 달리 변경되거나 공학처리된 IgG3 힌지 영역, 또는 0 또는 단 1 또는 2개 시스테인 잔기를 갖는 변이화되거나, 그와 달리 변경되거나 공학처리된 인간 IgA1 or IgA2 힌지 영역 폴리펩티드(예를 들어, "SCC" 힌지), 시스테인 잔기를 갖지 않는 변이화되거나, 그와 달리 변경되거나 공학처리된 IgD 힌지 영역, 또는 변이화되거나, 그와 달리 변경되거나 공학처리된 인간 IgE 힌지-작용 영역, 즉 0 또는 단지 1, 2, 3 또는 4개 시스테인 잔기를 갖는 IgE CH2 영역 폴리펩티드; 또는 (6) 연합 면역글로불린 도메인, 예컨대 예를 들어 CH1 도메인 및 CH2 도메인을 연결하는데 유용한 것으로 본원에 기재되거나 언급되거나, 혹은 그와 달리 공지되거나 후에 발견된 임의의 다른 연결 영역 분자 들 중 임의의 것을 포함하거나, 그것들로 본질적으로 구성되거나 구성될 수 있다. 예를 들어, 힌지 영역 폴리펩티드는 (i) 야생형 인간 IgG1 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드, 예를 들어 (ii) 3개 이상의 시스테인 잔기를 갖는 야생형 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드로부터 유도되거나 구축된 변이화되거나, 그와 달리 변경되거나 공학처리된 인간 IgG1 또는 다른 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드(여기에서, 상기 변이화된 인간 IgG1 또는 다른 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드는 2개 시스테인 잔기를 가지고, 야생형 힌지 영역의 첫 번째 시스테인은 변이화되지 않음), (iii) 3개 이상의 시스테인 잔기를 갖는 야생형 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드로부터 유도된 변이화되거나, 그와 달리 변경되거나 공학처리된 인간 IgG1 또는 다른 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드(여기에서, 상기 변이화된 인간 IgG1 또는 다른 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드는 1개 이하의 시스테인 잔기를 함유함), 및 (iv) 3개 이상의 시스테인 잔기를 갖는 야생형 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드로부터 유래된 변이화되거나, 그와 달리 변경되거나 공학처리된 인간 IgG1 또는 다른 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드(여기에서, 상기 변이화되거나, 그와 달리 변경되거나 공학처리된 인간 IgG1 또는 다른 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드는 시스테인 잔기를 가지지 않음)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 다른 구현예들에서, 예를 들어 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드는 변이화되거나, 그와 달리 변경되거나 공학처리된 힌지 영역 폴리펩티드이고, 야생형 인간 면역글로불린 G 또는 다른 야생형 힌지 영역 또는 힌지-작용 폴리펩티드에 비해, 감소된 이량체화 능력을 나타낸다.
면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드는 예를 들어 인간 IgG 또는 인간 IgA인 이소타입의 천연 또는 공학처리된 CH2 및 CH3 도메인일 수 있다. 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드는 또한 예를 들어 인간 IgE인 이소타입의 천연 또는 공학처리된 면역글로불린 중쇄 불변 영역 CH3 및 CH4 폴리펩티드일 수 있다.
다른 특정 구현예들에서, 표적 또는 표적 항원은, 예를 들어 CD19(B-임파구 항원 CD19, B-임파구 표면 항원 B4, 또는 Leu-12로도 칭해짐), CD20(B-임파구 항원 20, B-임파구 표면 항원 B1, Leu-16, 또는 Bp35로도 칭해짐), CD22(B-세포 수용체 CD22, Leu-14, B-임파구 세포 결합 분자, 또는 BL-CAM로도 칭해짐), CD37(백혈구 항원 CD37), CD40(B-세포 표면 항원 CD40, 종양 괴사 인자 수용체 상위부류 원 5, CD40L 수용체, 또는 Bp50로도 칭해짐), CD80(T 임파구 활성화 항원 CD80, 활성화 B7-1 항원, B7,B7-1, 또는 BB1로도 칭해짐), CD86(T 임파구 활성화 항원 CD86, 활성화 B7-2 항원, B70,FUN-1, 또는 BU63로도 칭해짐), CD137(종양 괴사 인자 수용체 상위부류 원 9로도 칭해짐), CD152(세포독성 T-임파구 단백질 4 또는 CTLA-4로도 칭해짐), CD45(백혈구 일반 항원, 또한 L-CA, T200, 및 EC 3.1.3.48), CD45RA(CD45의 아형, 및 나이브 또는 비성숙 임파구 상에 발현된 항원), CD45RB(CD45의 아형), CD45RO(CD45의 아형, 및 기억 B 및 T 세포 상에 발현된 통상적 백혈구 항원), L6(종양-관련 항원 L6, 막투과 4 상위부류 원 1, 막 성분 표면 마커 1, 또는 M3S1로도 칭해짐), CD2(T-세포 표면 항원 CD2, T-세포 표면 항원 T11/Leu-5, LFA-2, LFA-3 수용체, 적혈구 수용체, 또는 로제트 수용체로도 칭해짐), CD28(T-세포-특이적 동종이량체 표면 단백질 CD28, 또한 Tp44로도 칭해짐), CD30(임파구 활성화 항원 CD30, 또한 종양 괴사 인자 수용체 상위부류 원 8, CD30L 수용체, 또는 Ki-l로도 칭해짐), CD50(세포내 부착 분자-3(ICAM3), 또는 ICAM-R로도 칭해짐), CD54(세포내 부착 분자-1(ICAM1), 또는 주요군 라이노바이러스 수용체로도 칭해짐), B7-H1(활성화된 T 세포, B 세포, 및 골수성 세포에 의해 발현된 면역억제 수용체를 위한 리간드, PD-L1로도 칭해짐, 예컨대 [Dong 등, "B7-H1, a third member of the B7 family, co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion" 1999 Nat. Med. 5:1365-1369] 참고), CD134(종양 괴사 인자 수용체 상위부류 원 4,0X40, OX40L 수용체, ACT35 항원 또는 TAX-전사적 활성화 당단백질 1 수용체), 41BB(4-1BB 리간드 수용체, T-세포 항원 4-1BB, 또는 T-세포 항원 ILA), CD153(종양 괴사 인자 리간드 상위부류 8, CD30 리간드, 또는 CD30-L로도 칭해짐), CD154(종양 괴사 인자 리간드 상위부류 원 5, CD40 리간드, CD40-L, TNF-관련 활성화 단백질, TRAP, 또는 T 세포 항원 Gp39로도 칭해짐), ICOS(유도성 동시자극자), CD3(델타, 입실론, 감마, 에타 및/또는 제타 쇄 중 하나 이상, 단독 또는 조합), CD4(T-세포 표면 당 단백질 CD4, T-세포 표면 항원 T4/Leu-3로도 칭해짐), CD25(인터류킨-2 수용체 알파 쇄, IL-2 수용체 알파 서브유닛, p55, 또는 Tac 항원으로도 칭해짐), CD8α(T-세포 표면 당단백질 CD8 알파 쇄, T 임파구 분화 항원, T8/Leu-2, 및 Lyt-2로도 칭해짐), CD11b(인테그린 알파-M, 세포 표면 당단백질 MAC-1 알파 서브유닛, CR-3 알파 쇄, 백혈구 부착 수용체 Mo1. 또는 호중구 부착 수용체로도 칭해짐), CD14(단핵세포 분화 항원 CD14, 골수성 세포-특이성 류이신-풍부 당단백질 또는 LPS 수용체로도 칭해짐), CD56(신경 세포 부착 분자 1로도 칭해짐), 또는 CD69(조기 T-세포 활성화 항원 p60, Gp32/28, Leu-23, MLR-3, 활성화 유도자 분자, 또는 AIM로도 칭해짐), 및 TNF 인자(예를 들어 TNF-α)일 수 있다. 상기 열거된 구성 표적물/표적 항원은 단지 예시적인 것으로, 모두를 나타내는 것은 아니다.
다른 한 측면에서, 본 발명은 CD154 세포외 도메인, 또는 그것의 원하는 기능 부위를 포함하는 결합 구성체(또는 그러한 구성체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드)를 포함한다. 본 발명의 이 측면의 한 구현예에서, 예를 들어, 결합 구성체는 제2 결합 도메인에 융합되거나 그와 달리 연결된 CD154 세포외 도메인을 포함한다. 제2 결합 도메인은 예를 들어 하나 이상의 면역글로불린 가변 영역 폴리펩티드를 포함하거나, 그것으로 본질적으로 구성되거나 구성될 수 있다. 하나 이상의 면역글로불린 가변 영역 폴리펩티드는 천연 또는 공학처리된 scFv일 수 있다. 천연 또는 공학처리된 scFv는 본원에 개시되거나 기재된 천연 또는 공학처리된 scFv일 수 있다. 천연 또는 공학처리된 scFv를 비롯한 2차 결합 도메인은 예를 들어, 본원에 개시되거나 기재된 표적 항원들, 예를 들어 B7-H1, ICOS, L6, CD2, CD3,C D8, CD4, CD4, CD11b, CD14, CD19, CD20, CD22, CD25, CD28, CD30, CD37, CD40, CD45, CD50, CD54, CD56, CD69, CD80, CD86, CD134, CD137, CD152, CD153, 또는 CD154 중 임의의 것을 비제한적으로 포함하는, 임의의 표적에 결합하는 것일 수 있다.
다른 구체예에서, 결합 도메인 폴리펩티드는 CTLA-4 세포외 도메인, 또는 바람직한 그 기능성 부분을 포함하며, 추가 구체예에서는 CH2 불변 영역 폴리펩티드 및 CH3 불변 영역 폴리펩티드로부터 선택된 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드 중 적어도 하나가 천연 또는 조작된 사람 IgG1 불변 영역 폴리펩티드이다.
다른 추가 구체예에서 CH2 불변 영역 폴리펩티드 및 CH3 불변 영역 폴리펩티드로부터 선택된 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드 중 적어도 하나가 천연 또는 조작된 사람 IgA 불변 영역 폴리펩티드이다.
다른 추가 구체예에서 CH3 불변 영역 폴리펩티드 및 CH4 불변 영역 폴리펩티드로부터 선택된 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드 중 적어도 하나가 천연 또는 조작된 사람 IgE 불변 영역 폴리펩티드이다.
다른 구체예에서는, 본 발명은 (a) 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드에 융합되거나 연결된 결합 도메인 폴리펩티드; (b) 힌지 영역 폴리펩티드에 융합되거나 연결된 천연 또는 조작 면역글로불린 중쇄 CH2(또는 IgE Ch3) 불변 영역 폴리펩티드; 및 (c) CH2(또는 IgE CH3) 불변 영역 폴리펩티드에 융합되거나 연결된 천연 또는 조작 면역글로불린 중쇄 CH3(또는 IgE CH4) 불변 영역 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이것으로 구성되거나, 또는 이것으로 구성되는 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질을 제공하며, 상기에서 (1) 결합 도메인 폴리펩티드는 CD80 및 CD86으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 CTLA-4 리간드에 결합 또는 특이적 결합할 수 있는 CTLA-4 세포외 도메인, 또는 그 일부를 포함하며, (2) 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드는 상기 또는 여기서 개시된 대로 일 수 있으며, 예를 들어, 천연 또는 조작 사람 IgA 힌지 영역 폴리펩티드, 천연 또는 조작 사람 IgG1 힌지 영역 폴리펩티드, 및 천연 또는 조작 사람 IgE CH2 영역 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함하거나, 이것으로 본질적으로 구성 또는 이것으로 구성될 수 있으며, (3) 천연 또는 조작 사람 IgA 중쇄 CH2 불변 영역 폴리펩티드, 천연 또는 조작 사람 IgG1 중쇄 CH2 불변 영역 폴리펩티드, 및 천연 또는 조작 사람 IgE 중쇄 CH3 불변 영역 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함하거나, 이것으로 본질적으로 구성 또는 이것으로 구성되는 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드, (4) 천연 또는 조작 사람 IgA 중쇄 CH3 불변 영역 폴리펩티드, 천연 또는 조작 사람 IgG1 중쇄 CH3 불변 영역 폴리펩티드, 및 천연 또는 조작 사람 IgE 중쇄 CH4 불변 영역 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함하거나, 이것으로 본질적으로 구성 또는 이것으로 구성되는 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드, 및 (5) 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질은 항체 의존성 세포-매개 세포독성, CDC, 및 보체 고정으로 구성된 군으로부터 선택된 면역 활성 하나 이상을 유도할 수 있다. 추가 구체예에서, 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질은 항체 의존성 세포-매개 세포독성, CDC, 및 보체 고정으로 구성된 군으로부터 선택된 두 가지의 면역 활성을 유도할 수 있다.
다른 구체예에서 본 발명은 (a) 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드에 융합 되거나 연결된 결합 도메인 폴리펩티드(이때 상기 힌지 영역 폴리펩티드는 상기 또는 여기에서 개시된 대로일 수 있으며, 예를 들어, 천연 또는 조작 사람 IgE 힌지-작용성 영역, 즉 IgE CH2 영역 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이것으로 구성되거나 이것으로 구성될 수 있음); (b) 힌지 영역 폴리펩티드에 융합되거나 연결된 첫번째 천연 또는 조작 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드(이때 상기 천연 또는 조작 불변 영역 폴리펩티드는 천연 또는 조작 사람 IgE CH3 불변 영역 폴리펩티드를 포함하거나, 이것으로 본질적으로 구성 또는 이것으로 구성됨); 및 (c) 첫번째 천연 또는 조작 불변 영역 폴리펩티드에 융합되거나 연결된 두번째 천연 또는 조작 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드(이때, 상기 천연 또는 조작 두번째 불변 영역 폴리펩티드는 천연 또는 조작 사람 IgE CH4 불변 영역 폴리펩티드를 포함하거나, 이것으로 본질적으로 구성, 또는 이것으로 구성됨)를 포함, 이로 본질적으로 구성, 또는 구성되는 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질을 제공하며, 이때 (1) 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질은 항체 의존성 세포-매개 세포독성 및 알러지 반응 기작의 유도로부터 선택된 적어도 하나의 면역학적 활성을 유도할 수 있으며, (2) 결합 도메인 폴리펩티드는 항원에 결합 또는 특이적 결합할 수 있다. 추가 구체예에서 항원은 종양 항원이다.
일부 다른 구체예에서, 본 발명은 (a) 결합 도메인 폴리펩티드가 면역 효과인자 세포상에 존재하는 적어도 하나의 항원에 결합 또는 특이적으로 결합할 수 있으며 힌지 영역 폴리펩티드가 전술한 대로 또는 여기서와 같이 개시될 수 있으며 예를 들어, 천연 또는 조작 사람 IgA 힌지 영역 폴리펩티드, 천연 또는 조작 사람 IgG 힌지 영역 폴리펩티드 및 천연 또는 조작 사람 IgE 힌지-작용성 영역, 즉, IgE CH2 영역 폴리펩티드로 구성되는 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 포함하거나, 이것으로 본질적으로 구성, 또는 이것으로 구성될 수 있는, 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드에 융합 또는 연결된 결합 도메인 폴리펩티드; (b) 첫번째 천연 또는 조작 불변 영역 폴리펩티드가 천연 또는 조작 사람 IgA CH2 불변 영역 폴리펩티드, 천연 또는 조작 사람 IgG CH2 불변 영역 폴리펩티드, 및 천연 또는 조작 사람 IgE CH3 불변 영역 폴리펩티드로 구성되는 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 포함하거나, 이것으로 본질적으로 구성, 또는 이것으로 구성되는, 힌지 영역 폴리펩티드에 융합되거나 연결된 첫번째 천연 또는 조작 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드; (c) 두번째 불변 영역 폴리펩티드가 천연 또는 조작 사람 IgA CH3 불변 영역 폴리펩티드, 천연 또는 조작 사람 IgG CH3 불변 영역 폴리펩티드, 및 천연 또는 조작 사람 IgE CH4 불변 영역 폴리펩티드로 구성되는 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 포함하거나, 이것으로 본질적으로 구성, 또는 이것으로 구성되는, 첫번째 불변 영역 폴리펩티드에 융합되거나 연결된 두번째 천연 또는 조작 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드; 및 (d) 천연 또는 조작 혈장 막 고정 도메인 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이것으로 구성, 또는 이것으로 구성되는 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질을 제공한다. 이 구체예의 한 실시예에서, 혈장 막 고정 도메인 폴리펩티드는 천연 또는 조작 글리코실-포스파티딜이노시톨-연결을 통해 막에 연결된다. 추가 구체예에서, 혈장 막 고정 도메인 폴리펩티드는 천연 또는 조작 경막 도메인 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이것으로 구성, 또는 이것으로 구 성된다. 다른 추가 구체예에서, 막 고정 도메인 폴리펩티드는 천연 또는 조작 경막 도메인 폴리펩티드 및 천연 또는 조작 세포질 꼬리 폴리펩티드를 포함하거나, 이것으로 본질적으로 구성 또는 이것으로 구성된다. 다른 추가 구체예에서, 세포질 꼬리 폴리펩티드는 천연 또는 조작 어팝토시스 시그널링 폴리펩티드 서열을 포함하거나, 본질적으로 이것으로 구성, 또는 이것으로 구성되며, 이것은 다른 추가 구체예에서는 천연 또는 조작 수용체 사멸 도메인 폴리펩티드, 사멸 도메인, 또는 어느 하나의 기능성 부분으로부터 유래되거나 이것으로 구성된다. 추가 구체예에서, 천연 또는 조작 사멸 도메인 폴리펩티드는 예를 들어, ITIM 도메인(면역수용체 Tyr-계 억제 모티프), ITAM 도메인(면역수용체 Tyr-계 활성화 모티프), TRAF, RIP, CRADD, FADD(Fas-연합 사멸 도메인), TRADD(종양 괴사 인자 수용체 타입 1 연합 DEATH 도메인 단백질), RAIDD(RAID로 불림), CD95(종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 6, FASL 수용체, 어팝토시스-매개 표면 항원 FAS, FAS 및 Apo-1 항원으로도 불림), TNFR1, 및/또는 DR5(사멸 수용체 5)로부터 선택된 천연 또는 조작 폴리펩티드를 포함하거나, 이것으로로 본질적으로 구성, 또는 이것으로 구성된다. 다른 구체예에서, 천연 또는 조작된 어팝토시스 시그널링 폴리펩티드 서열은 예를 들어, 카스파제 8/FLICE/MACH/Mch5 및 카스파제 10/Flice2/Mch4를 비롯한 카스파제-3 또는 카스파제-8 또는 카스파제-10인 천연 또는 조작된 카스파제 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드 서열을 포함하거나, 이것으로 본질적으로 구성, 또는 이것으로 구성된다. 다른 구체예에서, 혈장 막 고정 도메인 폴리펩티드는 예를 들어, 천연 또는 조작 글리코실-포스파티딜이노시톨-연결 폴리펩티드 서열을 포함하거나, 본질 적으로 이것으로 구성, 또는 이것으로 구성된다. 다른 구체예에서, 면역 효과인자 세포상에 존재하는 항원은 예를 들어, CD2, CD16, CD28, CD30, CD32, CD40, CD50, CD54, CD64, CD80, CD86, B7-H1, CD134, CD137, CD152, CD153, CD154, ICOS, CD19, CD20, CD22, CD37, L6, CD3, CD4, CD25, CD8, CD11b, CD14, CD56, 또는 CD69이다. 다른 구체예에서, 사람 IgG는 천연 또는 조작 사람 IgG1이다. 이들 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질은 예를 들어, 항체 의존성 세포-매개 세포독성 및/또는 보체 고정 및/또는 CDC로부터 선택된 적어도 하나의 면역 활성을 유도할 수 있으며, 예를 들어, 표적 항원을 비롯한 표적에 결합 또는 특이적 결합할 수 있다. 다른 구체예에서, 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질은 예를 들어, 항체 의존성 세포-매개 세포독성 및/또는 보체 고정 및/또는 CDC로부터 선택된 두 가지의 면역 활성을 유도할 수 있으며, 표적에 결합 또는 특이적 결합할 수 있다. 면역 효과인자 세포는 예를 들어, 과립구, 비만 세포, 단핵구, 대식세포, 가지돌기세포, 호중구, 호산구, 호염기구, NK 세포, T 세포(Th1 세포, Th2 세포, Tc 세포, 기억 T 세포, 널(null) 세포, 및 큰 과립 림프구 등 포함), 및 B 세포를 포함한다. 본 발명의 이 구체예는 치료를 위한 그러한 단백질의 용도, 및 예를 들어, 생체내 및 엑스 비보 유전자 치료를 위한 그러한 벡터의 용도를 포함한다. 구조체 성분 및 표적의 상기 리스트는 제한적이 아니며 여기서 개시된 목적에 유용하거나 기능할 수 있는 임의의 바람직한 표적 또는 성분을 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명은 (2) 천연 또는 조작 CH2 불변 영역 폴리펩티드(또는 천연 또는 조작 IgE CH3 불변 영역 폴리펩티드)에 융합되거나 연결된 (1) 천 연 또는 조작 면역글로불린 힌지 영역 또는 힌지-작용성 영역(예, IgE CH2) 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이것으로 구성, 또는 이것으로 구성되는 첫번째 단백질 모티프를 갖는 단백질을 제공한다. 상기 첫번째 단백질 모티프는 하나 이상의 다른 그러한 첫번째 단백질 모티프에 융합되거나 연결되어 두번째 단백질 모티프를 형성하고, 두번째 단백질 모티프는 (3) 천연 또는 조작 CH3 불변 영역(또는 천연 또는 조작 IgE CH4 불변 영역)에 융합되거나 연결되어 세번째 단백질 모티프를 형성할 수 있다. 상기 첫번째, 두번째 또는 세번째 단백질 모티프는 예를 들어, 천연 또는 조작 경막 도메인 폴리펩티드, 및 천연 또는 조작 경막 도메인 폴리펩티드 및 천연 또는 조작 세포질 꼬리 폴리펩티드, 예, 천연 또는 조작 어팝토시스 시그널링 폴리펩티드 서열(천연 또는 조작 수용체 사멸 도메인 폴리펩티드, 사멸 도메인, 또는 그 기능성 부분에서 유래되거나 이로부터 구성됨)을 비롯한, 여기서 개시된 천연 또는 조작 혈장 막 고정 도메인 폴리펩티드 중 하나 이상에 융합되거나 연결될 수 있다. 따라서, 본 발명의 이 태양내의 단백질 또는 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 힌지-CH2-CH3-경막도메인-사멸 도메인 구조체일 수 있다. 그것은 또한, 예를 들어, (힌지-CH2)X-CH3-경막도메인-사멸도메인 구조체일 수 있으며, 이때 X는 2 내지 약 5이거나, 또는 원하는 길이 또는 Fc 수용체 결합 및/또는 보체 고정 기능을 이루는 데 필요할 수 있는 그러한 다른 수이다. 본 발명의 이 구체예는 또한 그러한 단백질을 암호하는 폴리뉴클레오티드, 그러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 그러한 폴리뉴클레오티드 및 벡터를 함유하는 숙주 세포를 포함한다. 본 발명의 이 구체예는 추가로 치료를 위한 그러한 단백질의 용도, 및 예를 들어, 생체 내 및 엑스 비보 유전자 치료를 위한 그러한 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터의 용도를 포함한다. 본 발명은 다른 구체예에서는, (a) 결합 도메인 폴리펩티드가 암세포 표면상에 존재하는 하나 이상의 항원에 결합 또는 특이적 결합할 수 있으며 힌지 영역 폴리펩티드가 상기 또는 여기서 개시한 대로일 수 있으며 예를 들어 천연 또는 조작 사람 IgA 힌지 영역 폴리펩티드, 천연 또는 조작 사람 IgG 힌지 영역 폴리펩티드 및 천연 또는 조작 사람 IgE 힌지-작용성 영역, 즉, IgE CH2 영역 폴리펩티드로 구성되는 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 포함하거나, 이것으로 본질적으로 구성, 또는 이것으로 구성될 수 있는, 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드에 융합 또는 연결된 결합 도메인 폴리펩티드; (b) 첫번째 불변 영역 폴리펩티드가 천연 또는 조작 사람 IgA CH2 불변 영역 폴리펩티드, 천연 또는 조작 사람 IgG CH2 불변 영역 폴리펩티드, 또는 천연 또는 조작 사람 IgE CH3 불변 영역 폴리펩티드인 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이것으로 구성 또는 이것으로 구성되는, 힌지 영역 폴리펩티드에 융합 또는 연결되는 첫번째 천연 또는 조작 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드; 및 (c) 두번째 불변 영역 폴리펩티드가 천연 또는 조작 사람 IgA CH3 불변 영역 폴리펩티드, 천연 또는 조작 사람 IgG CH3 불변 영역 폴리펩티드, 또는 천연 또는 조작 사람 IgE CH4 불변 영역 폴리펩티드인 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이것으로 구성, 또는 이것으로 구성되는, 첫번째 불변 영역 폴리펩티드에 융합 또는 연결되는 두번째 천연 또는 조작 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이것으로 구성, 또는 이것으로 구성되는 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질을 제공한다. 추가 구체예에서, 사람 IgG 폴 리펩티드는 천연 또는 조작 사람 IgG1 폴리펩티드이다.
다른 구체예에서 본 발명은 (a) 힌지 영역 폴리펩티드가 상기 또는 여기서 개시된 대로일 수 있으며 예를 들어, 야생형 또는 조작 사람 IgA 힌지 영역 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이것으로 구성, 또는 이것으로 구성되는, 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드에 융합되거나 연결된 결합 도메인 폴리펩티드; (b) 천연 또는 조작 CH2 불변 영역 폴리펩티드가 천연 또는 조작 사람 IgA CH2 불변 영역 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이것으로 구성, 또는 이것으로 구성되는, 힌지 영역 폴리펩티드에 융합되거나 연결된 천연 또는 조작 면역글로불린 중쇄 CH2 불변 영역 폴리펩티드; 및 (c) 천연 또는 조작 CH3 불변 영역 폴리펩티드가 (i) J 쇄와 연합할 수 있는 야생형 사람 IgA CH3 불변 영역 폴리펩티드 또는 다른 IgA 영역, 바람직하게는 사람 또는 인간화된 것, (ii) 예를 들어 J 쇄와 연합할 수 없는 돌연변이된, 변형된 또는 다르게 조작된 사람 IgA CH3 불변 영역 폴리펩티드인 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이것으로 구성 또는 이것으로 구성되는, 천연 또는 조작 CH2 불변 영역 폴리펩티드에 융합되거나 연결된 천연 또는 조작 면역글로불린 중쇄 CH3 불변 영역 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이것으로 구성, 또는 이것으로 구성되는 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질을 제공하며, 상기에서 (1) 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질은 항체 의존성 세포-매개 세포독성, CDC, 및 보체 고정으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 면역 활성을 가질 수 있으며, (2) 결합 도메인 폴리펩티드는 예를 들어 항원과 같은 표적에 결합 또는 특이적 결합할 수 있다. 일부 추가 구체예에서, J 쇄와 연합할 수 없는 돌 연변이된 사람 IgA CH3 불변 영역 폴리펩티드는 (i) 서열 번호 _에 개시된 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이것으로 구성 또는 이것으로 구성되는 폴리펩티드 또는 (ii) 서열 번호 _에 개시된 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이것으로 구성, 또는 이것으로 구성되는 폴리펩티드이다. 다른 구체예에서, IgA 힌지 영역 폴리펩티드는 천연 또는 조작 IgA1 힌지 영역 폴리펩티드 또는 천연 또는 조작된 IgA2 힌지 영역 폴리펩티드이다. 또 다른 구체예에서, IgA 힌지 영역 폴리펩티드는 예를 들어, 야생형 힌지 영역내의 시스테인 잔기 중 하나 이상의 변화, 치환, 또는 결실에 의해 야생형 IgA1 또는 IgA2 힌지 영역 폴리펩티드와 상이하다.
일부 다른 구체예에서 본 발명은 (a) 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드에 융합되거나 연결된 결합 도메인 폴리펩티드; (b) 천연 또는 조작 CH2 불변 영역 폴리펩티드가 천연 또는 조작 라마 IgG1 CH2 불변 영역 폴리펩티드, 천연 또는 조작 라마 IgG2 CH2 불변 영역 폴리펩티드, 또는 천연 또는 조작 라마 IgG3 CH2 불변 영역 폴리펩티드인 천연 또는 조작 라마 CH2 불변 영역 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이것으로 구성, 또는 이것으로 구성되는, 힌지 영역 폴리펩티드에 융합되거나 연결된 천연 또는 조작 면역글로불린 중쇄 CH2 불변 영역 폴리펩티드; 및 (c) 천연 또는 조작 CH3 불변 영역 폴리펩티드가 천연 또는 조작 라마 IgG1 CH3 불변 영역 폴리펩티드, 천연 또는 조작 라마 IgG2 CH3 불변 영역 폴리펩티드 및 천연 또는 조작 라마 IgG3 CH3 불변 영역 폴리펩티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 천연 또는 조작 라마 CH3 불변 영역 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이것으로 구성 또는 이것으로 구성되는, 천연 또는 조작 CH2 불변 영역 폴리펩티드에 융합되 거나 연결된 천연 또는 조작 면역글로불린 중쇄 CH3 불변 영역 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이것으로 구성, 또는 이것으로 구성되는 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질을 제공하며, 상기에서 (1) 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질은 항체 의존성 세포-매개 세포독성, 보체 고정, 및 CDC로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 면역 활성을 가질 수 있으며, (2) 결합 도메인 폴리펩티드는 예를 들어 표적 항원과 같은 표적에 결합 또는 특이적 결합할 수 있다. 추가 구체예에서, 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드, 천연 또는 조작 라마 CH2 불변 영역 폴리펩티드 및 천연 또는 조작 라마 CH3 불변 영역 폴리펩티드는 천연 또는 조작 라마 IgG1 폴리펩티드로부터 유래된 서열을 포함하며 융합 단백질은 천연 또는 조작 라마 IgG1 CH1 도메인을 포함하지 않는다. 일부 구체예에서 본 발명은 힌지 영역 폴리펩티드가 돌연변이되거나, 조작되거나, 또는 다르게 변형되어 일부 추가 구체예에서는 아스파라긴-연결된 당화 부위, O-연결된 당화 부위, C-만노실화 부위, 글리피화(glypiation) 부위 또는 포스포글리케이션(phosphoglycation) 부위인 당화 부위를 함유하는 전술한 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질 중 어느 것을 제공한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질을 포함하는, 상기 또는 여기서 개시된 결합 구조체 중 어느 것을 제공하며, 상기에서 결합 영역 또는 결합 도메인 폴리펩티드는 둘 이상의 결합 도메인 폴리펩티드 서열을 포함하며 이때 결합 도메인 폴리펩티드 서열의 각각은 항원과 같은 표적에 결합 또는 특이적으로 결합할 수 있으며, 상기 표적 또는 항원은 동일하거나 상이할 수 있 다. 천연, 더욱 바람직하게는 조작된, IgD 힌지는 본 발명의 이특이적 분자, 즉 둘 이상의 결합 도메인, 바람직하게는 둘을 가진 것의 결합 도메인 사이의 바람직한 연결 영역이다. 야생형 사람 IgD 힌지는 천연 IgD 구조에서 경쇄와 이황화 결합을 형성하는 하나의 시스테인을 갖는다. 예를 들어, 이특이적 분자의 결합 도메인 사이의 연결 영역으로 사용하기 위해 사람 IgD 힌지에서 이 시스테인을 돌연변이시키거나 결실시키는 것이 바람직하다. 원치않는 힌지 비가요성을 야기하지 않는, IgD에서의 다른 아미노산 변화 또는 결실 또는 변형은 본 발명의 범위내이다. 다른 종으로부터의 천연 또는 조작 IgD 힌지 영역은 또한 본 발명의 범위내이며, 비인간 종으로부터의 인간화된 천연 또는 조작 IgD 힌지도 그러하다. 본 발명은 또한 일부 구체예에서는, (a) 힌지 영역 폴리펩티드가 상기 또는 여기서 개시된 대로일 수 있으며 예를 들어 다른 힌지 영역 폴리펩티드 서열을 포함하거나, 본질적으로 이것으로 구성 또는 이것으로 구성되는, 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드에 융합되거나 연결된 결합 도메인 폴리펩티드; (b) 힌지 영역 폴리펩티드에 융합되거나 연결된 IgG 또는 IgA CH2 불변 영역 폴리펩티드(또는 IgE CH3 불변 영역 폴리펩티드)와 같은 첫번째 천연 또는 조작 면역글로불린 중쇄 불변 영역; 및 (c) 첫번째 불변 영역 폴리펩티드에 융합되거나 연결된 IgG 또는 IgA CH3 불변 영역 폴리펩티드(또는 IgE CH4 불변 영역 폴리펩티드)와 같은 두번째 천연 또는 조작 면역글로불린 중쇄 불변 영역을 포함하거나, 본질적으로 이들로 구성 또는 이들로 구성될 수 있는, 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질을 제공하며, 이때 (1) 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질은 항체 의존성 세포-매개 세포독성, CDC, 및 보체 고정으로 구성 된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 면역 활성을 가질 수 있으며, (2) 결합 도메인 폴리펩티드는 예를 들어 항원과 같은 표적에 결합 또는 특이적 결합할 수 있다.
다른 구체예에서는, (a) 결합 도메인 폴리펩티드가 암 세포 표면에 존재하는 항원과 같은 적어도 하나의 표적에 결합 또는 특이적으로 결합할 수 있으며 힌지 영역 폴리펩티드는 상기 또는 여기서 개시한 대로일 수 있으며, 예를 들어, 다른 힌지 영역을 포함하거나, 본질적으로 이것으로 구성 또는 이것으로 구성될 수 있는, 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드에 융합 또는 연결되는 결합 도메인 폴리펩티드; (b) 천연 또는 조작 불변 영역 폴리펩티드가 천연 또는 조작 사람 IgA CH2 불변 영역 폴리펩티드, 천연 또는 조작 사람 IgG CH2 불변 영역 폴리펩티드 및 천연 또는 조작 사람 IgE CH3 불변 영역 폴리펩티드로 구성되는 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이것으로 구성 또는 이것으로 구성되는, 힌지 영역 폴리펩티드에 융합 또는 연결되는 첫번째 천연 또는 조작 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드; 및 (c) 두번째 불변 영역 폴리펩티드가 천연 또는 조작 사람 IgA CH3 불변 영역 폴리펩티드, 천연 또는 조작 사람 IgG CH3 불변 영역 폴리펩티드 또는 천연 또는 조작 사람 IgE CH4 불변 영역 폴리펩티드인 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이것으로 구성 또는 이것으로 구성되는, 첫번째 불변 영역 폴리펩티드에 융합 또는 연결된 두번째 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이것으로 구성 또는 이것으로 구성되는 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질이 제공된다. 일부 추가 구체예에서 다른 힌지 영역 폴리펩티드 서열은 서열번호 _ 로부터 선택된 서열에 존재하는 적어도 10개의 연속적인 아 미노산의 폴리펩티드 서열을 포함하거나, 본질적으로 이것으로 구성 또는 이것으로 구성된다.
일부 구체예에서 본 발명은 예를 들어, 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질을 비롯한 본 발명의 상기 또는 여기서 개시된 폴리펩티드 또는 단백질 구조체 중 어느 하나를 암호하거나 함유하는, 분리되거나 정제되거나 순수한 폴리뉴클레오티드, 벡터, 및 분리된 형질전환되거나 형질감염된 세포를 비롯한, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터(클로닝 벡터 및 발현 벡터 포함) 또는 형질전환되거나 형질감염된 세포를 제공한다. 따라서, 다양한 구체예에서 본 발명은 프로모터에 작동적으로 연결된 임의의 그러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 클로닝 또는 발현 구조체를 제공한다.
다른 구체예에서 임의의 그러한 재조합 클로닝 또는 발현 구조체로 형질전환되거나 형질감염되거나 또는 이를 함유하는 숙주 세포가 제공된다. 숙주 세포는 예를 들어, 엑스 비보 유전자 치료를 비롯한 엑스 비보 세포 치료를 진행중인 대상의 세포를 포함한다.
관련 구체예에서 (a) 구조체, 예를 들어, 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질의 발현을 허용하는 조건하에서 여기서 개시되거나 제공된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 구조체, 예를 들어, 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질을 숙주 세포 또는 숙주 세포 배양물로부터 분리하는 단계를 포함하는, 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질을 비롯한, 본 발명의 폴리펩티드 또는 단백질 또는 다른 구조체를 생산하는 방법이 제공된다.
다른 구체예에서는, 상기 또는 여기서 개시된 본 발명의 폴리펩티드 또는 단백질 또는 다른 구조체 중 임의의 하나를(예, 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질 포함) 생리학적 허용성 담체와 함께 포함하는 약학 조성물이 제공된다.
다른 구체예에서 본 발명은 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드 또는 단백질 구조체(예, 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질 포함) 중 어느 하나를 암호하는 분리되거나, 정제되거나 또는 순수한 폴리뉴클레오티드를 생리학적 허용성 담체, 또는 예를 들어, 유전자 치료 전달 비히클 또는 벡터와 함께 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 여기서 개시되거나 청구된 약학 조성물의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, B 세포 질환 또는 악성 상태를 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 추가 구체예에서, 악성 상태 또는 B 세포 질환은 B 세포 림프종 또는 B 세포 백혈병 또는 자가항체 생산을 특징으로 하는 질병이며, 일부 다른 추가 구체예에서는 B 세포 질환은 예를 들어, 류마티스 관절염, 중증근육무력증, 그레이브 질병, 타입 I 당뇨병, 다발성 경화증 또는 자가면역 질병이다. 일부 다른 구체예에서 악성 상태는 예를 들어, 흑색종, 골수종, 신경아교종, 별아교세포종, 림프종, 백혈병, 암종, 또는 육종 등이다.
본 발명의 다른 태양에서는 (a) 힌지 영역 폴리펩티드가 여기서 개시된 대로이며, (i) 시스테인 잔기를 함유하지 않으며 하나 이상의 시스테인 잔기를 갖는 야생형 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드로부터 유래된, 돌연변이되거나, 조작되거 나 다르게 변형된 힌지 영역 폴리펩티드, (ii) 하나의 시스테인 잔기를 함유하며 둘 이상의 시스테인 잔기를 갖는 야생형 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드로부터 유래된 돌연변이되거나, 조작되거나 다르게 변형된 힌지 영역 폴리펩티드, (iii) 야생형 사람 IgA 힌지 영역 폴리펩티드, (iv) 시스테인 잔기를 함유하지 않는 돌연변이되거나, 조작되거나 다르게 변형된 사람 IgA 힌지 영역 폴리펩티드, (v) 시스테인 잔기 하나를 함유하는 돌연변이되거나, 조작되거나 다르게 변형된 사람 IgA 힌지 영역 폴리펩티드, 및 (vi) 시스테인 잔기 둘을 함유하는 돌연변이되거나, 조작되거나 다르게 변형된 사람 IgA 힌지 영역 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택될 수 있는, 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드에 융합되거나 연결된 결합 도메인 폴리펩티드; (b) 힌지 영역 폴리펩티드에 융합되거나 연결된 천연 또는 조작 면역글로불린 중쇄 CH2 불변 영역 폴리펩티드; 및 (c) CH2 불변 영역 폴리펩티드에 융합되거나 연결된 천연 또는 조작 면역글로불린 중쇄 CH3 불변 영역 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이들로 구성, 또는 이들로 구성되는 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질을 제공하며, 상기에서 (1) 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질은 항체 의존성 세포-매개 세포독성 및 보체 고정으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 면역 활성을 가질 수 있으며, (2) 결합 도메인 폴리펩티드는 항원에 결합 또는 특이적 결합할 수 있다. 한 구체예에서 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드는 예를 들어 돌연변이된 힌지 영역 폴리펩티드이며, 생성된 구조체는 야생형 사람 면역글로불린 G 힌지 영역 폴리펩티드를 함유하는 구조체에 비하여, 이량체화하는 능력이 감소된다. 다른 구체예에서 결합 도메인 폴리펩티드는 천연 또 는 조작 면역글로불린 경쇄 가변 영역 폴리펩티드 및/또는 천연 또는 조작 면역글로불린 중쇄 가변 영역 폴리펩티드인 적어도 하나의 천연 또는 조작 면역글로불린 가변 영역 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이들로 구성, 또는 이들로 구성된다. 추가 구체예에서, 천연 또는 조작 면역글로불린 가변 영역 폴리펩티드는 사람 면역글로불린에서 유래되며 예를 들어, 인간화될 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명은 (a) 적어도 하나의 천연 또는 조작 면역글로불린 경쇄 가변 영역 폴리펩티드; (b) 적어도 하나의 천연 또는 조작 면역글로불린 중쇄 가변 영역 폴리펩티드; 및 (c) (a)의 폴리펩티드 및 (b)의 폴리펩티드에 융합되거나 연결된 적어도 하나의 링커 펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이들로 구성, 또는 이들로 구성되는 결합 도메인 폴리펩티드를 포함하는 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질을 제공한다. 추가 구체예에서, 천연 또는 조작 면역글로불린 경쇄 가변 영역 및 천연 또는 조작 중쇄 가변 영역 폴리펩티드는 사람 면역글로불린으로부터 유래되며 예를 들어 인간화될 수 있다.
다른 구체예에서, 천연 또는 조작 면역글로불린 중쇄 CH2(또는 IgE CH3) 불변 영역 폴리펩티드 및 천연 또는 조작 면역글로불린 중쇄 CH3(또는 IgE CH4) 불변 영역 폴리펩티드 중 적어도 하나는 사람 면역글로불린 중쇄로부터 유래되거나 구성된다. 다른 구체예에서 천연 또는 조작 면역글로불린 중쇄 불변 영역 CH2 및 CH3 폴리펩티드는 사람 IgG 및 사람 IgA로부터 선택된 아이소타입이거나, 이로부터 유래되거나 제조되거나 구성된다. 다른 구체예에서, 표적, 예를 들어, 표적 항원은 CD16, CD19, CD20, CD37, CD40, CD45RO, CD80, CD86, CD137, CD152, 및 L6으로 구 성되는 군으로부터 선택된다. 상기한 융합 단백질 구조체의 일부 추가 구체예에서, 결합 도메인은 scFv를 포함, 본질적으로 이것으로 구성, 또는 이것으로 구성되며 scFv는 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser [서열 번호 _]를 갖거나 포함하는 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이것으로 구성, 또는 이것으로 구성되는 링커 폴리펩티드를 함유하며, 일부 다른 구체예에서는, 링커 폴리펩티드는 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser[서열 번호 _]을 갖는 폴리펩티드의 적어도 세개의 반복물을 포함하거나, 본질적으로 이것으로 구성, 또는 이것으로 구성된다. 일부 구체예에서, 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드는 천연 또는 조작 사람 IgG, IgA, IgD 힌지 영역 폴리펩티드, 또는 천연 또는 조작 IgE CH2 영역 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이것으로 구성, 또는 이것으로 구성된다. 일부 구체예에서, 결합 도메인 폴리펩티드는 천연 또는 조작 CD154 세포외 도메인을 포함하거나, 본질적으로 이것으로 구성, 또는 이것으로 구성된다. 일부 구쳬예에서, 결합 도메인 폴리펩티드는 천연 또는 조작 CD154 세포외 도메인 및 적어도 하나의 천연 또는 조작 면역글로불린 가변 영역 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이것으로 구성 또는 이것으로 구성된다.
다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 구조체, 예, 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질을 포함하는 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드 구조체 중 어느 것을 암호하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 관련 구체예에서 본 발명은 그러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 구조체를 제공하며, 일부 추가 구체예에서는 본 발명은 그러한 재조합 발현 구조체로 형질전환되거나 형질감염되거 나 또는 이를 함유하는 숙주 세포를 제공한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 (a) 예를 들어, 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질을 암호하는 구조체의 발현을 허용하는 조건하에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드 구조체로 형질전환되거나 형질감염되거나, 또는 이를 함유하도록 만들어진 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 숙주 세포 배양물로부터 상기 구조체, 예를 들어, 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질을 분리하는 단계를 포함하는, 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질과 같은 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드 구조체와 같은 본 발명의 구조체를 생산하는 방법을 제공한다.
여기서 개시되고 청구된 본 발명은 치료 및 진단 및 연구 목적을 비롯한 다른 목적에 유용한 신규 분자를 포함한다. 그러한 분자는 예를 들어, 항원 결합 또는 다른 결합 기능 및 하나 이상의 효과인자 기능을 갖는다. 본 발명의 DNA 구조체는 예를 들어 생체내 및 엑스 비보 유전자 치료를 비롯한 유전자 치료에 유용하다.
한 태양에서, 본 발명의 분자의 다양한 구조체는 "결합 영역", "꼬리" 영역 및 결합 영역과 꼬리 영역을 연결하는 "연결" 영역을 포함하는 분자를 포함한다.
본 발명의 분자내의 결합 영역은 예를 들어, 항원-결합 표적을 비롯한 원하는 표적을 위한 결합 도메인을 포함할 수 있다. 항원-결합 표적을 위한 결합 도메인은 예를 들어, 단일 쇄 Fv 및 scFv 도메인을 포함할 수도 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 분자는 경쇄 또는 중쇄 가변 영역 폴리펩티드일 수 있는 면역글로불린 가변 영역 폴리펩티드 적어도 하나를 갖는 결합 영역을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 분자는 적어도 하나의 그러한 경쇄 V-영역 및 하나의 그러 한 중쇄 V-영역 및 V-영역을 연결하는 적어도 하나의 링커 펩티드를 포함할 수 있다. 본 발명에 유용한 scFv는 또한 키메라 결합 또는 기타 도메인 또는 서열을 갖는 것을 포함한다. 본 발명에 유용한 다른 scFv는 또한 인간화된 결합 또는 기타 도메인 또는 서열을 갖는 것을 포함한다. 그러한 구체예에서, 비인간 공급원으로부터 유래된 면역글로불린 결합 또는 기타 서열의 모두 또는 일부는 인간화된 항체를 생성하기 위한 공지의 과정에 따라 "인간화"될 수 있으며, 즉, 사람 Ig 서열이 면역글로불린 서열내로 도입되어 사람 면역 시스템이 그러한 단백질을 외래로 받아들이는 정도를 감소시킨다.
전체로 또는 부분적으로, 쥐 또는 다른 scFv(사람 scFv 포함), 키메라 scFv, 또는 인간화 scFv로 포함되건 간에, 본 발명에 유용한 scFv의 예는 항-사람 CD20 scFv(예, "2H7" scFv), 항-사람 CD37 scFv(예, "G28-1" scFv), 항-사람 CD40 scFv(예, "G28-5" scFv 및 "40.2.220" scFv), 항-암종-연합 항원 scFv(예, "L6" scFv), 항-CTLA-4(CD152) scFv(예, "10A8" scFv), 항-사람 CD28 scFv(예, "2E12" scFv), 항-쥐 CD3 scFv(예, "500A2" scFv), 항-사람 CD3 scFv(예, G19-4 scFv), 항-쥐 4-1BB scFv(예, "1D8" scFv), 항-사람 4-1BB scFv(예, "5B9" scFv), 항-사람 CD45RO(예, "UCHL-1" scFv), 및 항-사람 CD16(예,"Fc2" scFv)를 포함한다.
본 발명에 유용한 scFv는 또한 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 키메라 및 인간화 scFv를 비롯한 scFv를 포함한다. 바람직한 아미노산 치환은 가변 중쇄(VH)에서 아미노산 위치 11에 있다. 그러한 치환은 여기서 "XXXVH11ZXX"로 불린다. 따라서, 예를 들어, 위치 VH11에서 정상적으로 발생하는 아미노산은 루이신이며, 세린 아미노산 잔기로 치환되는 경우, 상기 치환은 "L VH11S" 또는 "Leu VH11Ser"으로 확인된다. 본 발명의 다른 바람직한 구체예는 위치 VH11에서 정상적으로 발견되는 아미노산 잔기가 결실되는 scFv를 함유한 분자를 포함한다. 본 발명의 또 다른 바람직한 구체예는 위치 VH10 및/또는 VH11 및/또는 VH12에서 정상적으로 발견되는 아미노산 잔기가 치환되거나 결실되는 scFv를 함유하는 분자를 포함한다.
본 발명의 분자내의 다른 결합 영역은 당화 부위, 예를 들어, 단당류 또는 올리고당류와 같은 탄수화물 부의 공유적 부착을 위한 부위를 포함하는 도메인을 포함할 수 있다.
본 발명의 분자내의 또 다른 결합 영역은 항원을 비롯한 다른 분자에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한 단백질 또는 그 일부를 포함할 수 있는 폴리펩티드를 포함한다. 따라서, 결합 영역은 호르몬, 사이토카인, 케모카인 등; 그러한 폴리펩티드 리간드를 위한 세포 표면 또는 가용성 수용체; 렉틴; 특이적 백혈구 인테그린, 셀렉틴, 면역글로불린 유전자 수퍼패밀리 구성원, 세포간 부착 분자(ICAM-1, -2, -3) 등; 조직적합성 항원; 등을 포함하거나 이로부터 유래될 수 있다. 그러한 분자로부터 유래된 결합 영역은 대개 표적에의 결합에 필요하거나 이에 바람직한 분자의 부분을 포함할 것이다.
일부 구조체는 수용체 또는 수용체-결합 도메인을 포함하는 결합 영역을 포함한다. 표적에의 결합에 유용한 수용체 도메인은 예를 들어, CD154 세포외 도메 인, CTLA-4 세포외 도메인을 포함한다. 다른 예에서, 결합 도메인은 CD154 세포외 도메인을 포함하거나, 본질적으로 이것으로 구성, 또는 이것으로 구성되는 첫번째 부분 및 적어도 하나의 면역글로불린 가변 영역 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이것으로 구성, 또는 이것으로 구성되는 두번째 부분을 포함할 수 있으며, 상기 두번째 부분은 예를 들어, scFv 또는 VH를 포함한다. 결합 영역 또는 결합 도메인 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이것으로 구성, 또는 이것으로 구성될 수 있는 다른 세포 표면 수용체 또는 그 일부의 예는 예를 들어, HER1, HER2, HER3, HER4, 상피 성장 인자 수용체(EGFR), 혈관 내피 세포 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자 수용체, 인슐린형 성장 인자-I, 인슐린형 성장 인자-II, 트랜스페린 수용체, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 소낭 자극 호르몬 수용체(FSH-R), 레티노산 수용체, MUC-1, NY-ESO-1, Melan-A/MART-1, 티로시나제, Gp-100, MAGE, BAGE, GAGE, 구체적으로 SSX2 유전자에 의해 암호된 HOM-MEL-40 항원을 비롯한 수용체의 CTA 부류의 임의의 것, 암종배아 항원(CEA), 및 PyLT를 포함한다. 결합 영역 또는 결합 도메인 폴리펩티드의 공급원일 수 있는 추가의 세포 표면 수용체는 예를 들어, CD2, 4-1BB, 4-1BB 리간드, CD5, CD10, CD27, CD28, CD152/CTLA-4, CD40, 인터페론-γ(IFN-γ),인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-17(IL-17) 및 인터루킨-17 수용체(IL-17R)를 포함한다. 결합 영역 및/또는 결합 도메인 폴리펩티드의 공급원일 수 있는 또 다른 세포 표면 수용체는 예를 들어, CD59, CD48, CD58/LFA-3, CD72, CD70, CD80/B7.1, CD86/B7.2, B7-H1/B7-DC, IL-17, CD43, ICOS, CD3(예, 감마 서브유닛, 입실론 서브유닛, 델타 서브유닛), CD4, CD25, CD8, CD11b, CD14, CD56, CD69 및 VLA-4(α4β7)을 포함한다. 하기 세포 표면 수용체는 일반적으로 B 세포와 연합된다: CD19, CD20, CD22, CD30, CD153(CD30 리간드), CD37, CD50(ICAM-3), CD106(VCAM-1), CD54(ICAM-1), 인터루킨-12, CD134(OX40), CD137(41BB), CD83, 및 DEC-205. 이들 리스트는 제한적이지 않다. 상기한 것과 같은 결합 영역은 예를 들어 천연 또는 조작 IgD 힌지 영역 폴리펩티드에 의해, 바람직하게는 사람 또는 인간화된 천연 또는 조작 IgD 힌지 영역 폴리펩티드에 의해 연결될 수 있다. 본 발명은 따라서 세번째 분자, 예를 들어, 여기서 개시된 IgD 힌지 영역 폴리펩티드에 의해 연결된, 두 결합 영역, 예, scFv 및 세포 표면 수용체(또는 그 일부)를 포함하거나, 본질적으로 이들로 구성, 또는 이들로 구성되는 구조체를 추가로 제공한다.
여기서 개시되고 청구된 다양한 분자는 분자의 한 끝을 다른 끝에 연결하는 연결 영역을 포함한다. 그러한 연결 영역은 예를 들어, 자연 발생하는 임의의 힌지 펩티드 또는 폴리펩티드를 비롯한 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 연결 영역은 또한 예를 들어, 꼬리 영역과 결합 영역을 연결하는 데 유용한 임의의 인공 펩티드 또는 다른 분자(예, 비펩티드 분자, 부분적인 펩티드 분자, 및 펩티드모방체 등)를 포함할 수 있다. 이들은 예를 들어, CH1 및 CH2 영역내에 쇄내 면역글로불린-도메인 이황화 결합을 형성하는 아미노산 잔기 사이의 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드에 위치한 분자의 변형을 포함할 수 있다. 자연 발생하는 힌지 영역은 면역글로불린의 불변 영역 도메인, CH1과 CH2 사이에 위치한 것을 포함한다. 유용한 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드는 예를 들어, 사람 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드 및 라마 또는 기타 낙타 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드를 포 함한다. 다른 유용한 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드는 예를 들어, 수염 상어 및 점박이 은상어 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드를 포함한다. 사람 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드는 예를 들어, 야생형 사람 IgG1 힌지, 사람 IgG-유래 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드, 사람 IgG 힌지 또는 IgG-유래 면역글로불린 힌지 영역의 일부, 야생형 사람 IgA 힌지 영역 폴리펩티드, 사람 IgA-유래 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드, 사람 IgA 힌지 영역 폴리펩티드 또는 IgA-유래 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드의 일부, 야생형 사람 IgD 힌지 영역 폴리펩티드, 사람 IgD 유래 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드, 사람 IgD 힌지 영역 폴리펩티드 또는 IgD-유래 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드의 일부, 야생형 사람 IgE 힌지-작용성 영역, 즉, IgE CH2 영역 폴리펩티드(일반적으로 5 시스테인 잔기를 가짐), 사람 IgE-유래 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드, 사람 IgE 힌지-작용성 영역의 일부, 즉, IgE CH2 영역 폴리펩티드 또는 IgE-유래 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드 등을 포함한다. 힌지 기능을 갖는 것으로 간주되는 면역글로불린 폴리펩티드 쇄 영역"으로부터 유래"되거나 "그 일부 또는 단편"인 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산을 펩티드 연결내에 가지며, 예를 들어, 15-115 아미노산, 바람직하게는 95-110, 80-94, 60-80 또는 5-65 아미노산, 바람직하게는 10-50, 더욱 바람직하게는 15-35, 더욱 더 바람직하게는 18-32, 더욱 더 바람직하게는 20-30, 더욱 더 바람직하게는 21,22,23,24,25,26,27,28 또는 29 아미노산을 갖는다. 라마 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드는 예를 들어, IgG1 라마 힌지를 포함한다. 연결 영역은 면역글로불린 힌지 영역으로부터의 연속적인 아미노산의 스트레치를 포함할 수 있다. 예를 들어, 연결 영역은 사람 IgG 힌지, 사람 IgA 힌지, 사람 IgE 힌지, 낙타 힌지 영역, IgG1 라마 힌지 영역, 수염 상어 힌지 영역, 및 점박이 은상어 힌지 영역으로부터의 적어도 5 연속 힌지 영역 아미노산, 적어도 10 연속 힌지 영역 아미노산, 적어도 15 연속 힌지 영역 아미노산, 적어도 20 연속 힌지 영역 아미노산, 및 적어도 25 또는 그 이상의 연속 힌지 영역 아미노산을 포함할 수 있으며, 예를 들어, IgG1 힌지 영역, IgG2 힌지 영역, IgG3 힌지 영역, IgG3 힌지 영역 및 IgG4 힌지 영역을 포함한다.
그러한 연결 영역은 또한 예를 들어, 돌연변이되거나 또는 다르게는 변형되거나 조작된 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드를 포함한다. 돌연변이되거나 다르게 변형되거나 조작된 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드는 임의의 포함된 천연 또는 조작 CH2 및 CH3 도메인과 동일하거나 상이한 한 종, 면역글로불린 아이소타입 또는 클래스, 또는 면역글로불린 서브클래스의 면역글로불린에서 그 기원을 갖는 힌지 영역을 포함하거나, 본질적으로 이것으로 구성되거나 또는 이것으로 구성될 수 있다. 돌연변이되거나 다르게 변형되거나 조작된 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드는 예를 들어, 하나 이상의 시스테인 잔기를 함유하는 야생형 면역글로불린 힌지 영역, 예를 들어, 자연적으로 3 시스테인을 포함하는 야생형 사람 IgG 또는 IgA 힌지 영역으로부터 유래되거나 이로부터 구성되는 것을 포함한다. 그러한 폴리펩티드에서, 시스테인 잔기의 수는 예를 들어, 아미노산 치환 또는 결실 또는 절단에 의해 감소될 수 있다. 이들 폴리펩티드는 예를 들어, 0, 1, 또는 2 시스테 인 잔기를 함유하는 돌연변이된 사람 또는 기타 IgG1 또는 IgG4 힌지 영역 폴리펩티드, 및 0,1, 또는 2 시스테인 잔기를 함유하는 돌연변이된 사람 또는 기타 IgA1 또는 IgA2 힌지 영역 폴리펩티드를 포함한다. 돌연변이되거나 다르게 변형되거나 조작된 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드는 예를 들어, 셋 이상의 시스테인 잔기를 함유하는 야생형 면역글로불린 힌지 영역, 예를 들어, 야생형 사람 IgG2 힌지 영역(4 시스테인을 가짐) 또는 IgG4 힌지 영역(11 시스테인을 가짐)으로부터 유래되거나 구성되는 것을 포함한다. 돌연변이되거나 다르게 변형되거나 조작된 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드는 예를 들어, 일반적으로 5 시스테인 잔기를 함유하는 IgE CH2 야생형 면역글로불린 영역에서 유래되거나 구성되는 것을 포함한다. 그러한 폴리펩티드에서, 시스테인 잔기의 수는 예를 들어, 아미노산 치환 또는 결실 또는 절단에 의해 하나 이상의 시스테인 잔기만큼 감소될 수 있다. 힌지 영역내의 시스테인 잔기가 세린 또는 덜 극성, 덜 소수성, 보다 친수성 및/또는 중성인 하나 이상의 다른 아미노산으로 치환된 변형된 힌지 영역 폴리펩티드 또한 포함된다. 그러한 돌연변이된 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드는 예를 들어, 하나의 시스테인 잔기를 함유하며, 둘 이상의 시스테인 잔기를 갖는 야생형 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드로부터 유래되는 돌연변이된 힌지 영역 폴리펩티드를 포함하며, 예를 들어, 하나의 시스테인 잔기를 함유하고 야생형 사람 IgG 또는 IgA 영역 폴리펩티드로부터 유래되는 돌연변이된 사람 IgG 또는 IgA 힌지 영역 폴리펩티드를 포함한다. 연결 영역 폴리펩티드는 쇄간, 동종이량체 이황화 결합을 형성하는 그들의 능력이 손상되는 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드를 포함한다.
돌연변이된 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드는 또한 야생형 사람 면역글로불린 G 힌지 영역 폴리펩티드에 비하여 이량체화하는 능력이 감소된 돌연변이된 힌지 영역 폴리펩티드, 및 단량체 및 이량체 분자의 혼합물의 발현을 허용하는 돌연변이된 힌지 영역 폴리펩티드를 포함한다. 돌연변이된 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드는 또한 당화 부위를 함유하도록 조작된 힌지 영역 폴리펩티드를 포함한다. 당화 부위는 예를 들어, 아스파라긴-연결된 당화 부위, O-연결된 당화 부위, C-만노실화 부위, 글리피화 부위 및 포스포글리케이션 부위를 포함한다.
여기서 개시되고 청구된 본 발명의 분자에 유용한 특이적 연결 영역은 예를 들어, 하기 18 아미노산 서열, DQEPKSCDKTHTCPPCPA, DQEPKSSDKTHTSPPSPA, 및DLEPKSCDKTHTCPPCPA을 포함한다. 다른 특이적 연결 영역은 예를 들어, 여기서 "2H7 scFv(SSS-S) H WCH2 WCH3" 및 "2H7 scFv(CSS)H WCH2 WCH3"로 불리는 서열내의 돌연변이 힌지, 및 여기서 "2H7 scFv IgAH WCH2 WCH3"로 불리는 사람 IgA-유래 힌지를 포함한다.
본 발명의 분자내의 꼬리 영역은 중쇄 불변 영역 면역글로불린 서열을 포함할 수 있다. 꼬리 영역은 따라서, 예를 들어, 면역글로불린 중쇄 CH2 불변 영역 폴리펩티드 및 면역글로불린 중쇄 CH3 불변 영역 폴리펩티드 중 적어도 하나를 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 면역글로불린 중쇄 CH2 불변 영역 폴리펩티드와 면역글로불린 중쇄 CH3 불변 영역 폴리펩티드 중 적어도 하나는 사람 면역글로불린 중쇄로부터 유래될 수 있다. 따라서, 예를 들어, CH2 및/또는 CH3 폴리펩티드는 사람 IgG, 사람 IgA, 또는 사람 IgD 분자로부터 유래할 수 있다. 꼬리 영역은 또한 예를 들어, 면역글로불린 중쇄 CH3 불변 영역 폴리펩티드 및 면역글로불린 중쇄 CH4 불변 영역 폴리펩티드 중 적어도 하나를 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 면역글로불린 중쇄 CH3 불변 영역 폴리펩티드와 면역글로불린 중쇄 CH4 불변 영역 폴리펩티드 중 적어도 하나는 사람 면역글로불린 중쇄로부터 유래될 수 있다. 따라서, 예를 들어, CH3 및/또는 CH4 폴리펩티드는 사람 IgE로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 분자내에 포함된 면역글로불린 중쇄 CH2 영역 폴리펩티드는 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및/또는 IgG4 서브클래스로부터 올 수도 있다. 본 발명의 분자내에 포함된 면역글로불린 중쇄 CH3 영역 폴리펩티드는 또한, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및/또는 IgG4 서브클래스로부터 올 수도 있다. 추가로, 본 발명의 분자내에 포함된 면역글로불린 중쇄 CH2 영역 폴리펩티드 및 면역글로불린 중쇄 CH2 영역 폴리펩티드 둘다 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및/또는 IgG4 서브클래스로부터 올 수도 있다. 본 발명의 다른 분자에서, CH2 불변 영역 폴리펩티드 및 CH3 불변 영역 폴리펩티드로부터 선택된 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드 중 적어도 하나는 사람 IgA 불변 영역 폴리펩티드이다. 본 발명의 분자내에 포함된 면역글로불린 중쇄 CH2 영역 폴리펩티드는 예를 들어 IgA1 및/또는 IgA2 서브클래스에서 올 수 있다. 본 발명의 분자내에 포함된 면역글로불린 중쇄 CH3 영역 폴리펩티드는 또한 예를 들어, IgA1 및/또는 IgA2 서브클래스로부터 올 수 있다. 추가로, 본 발명의 분자내에 포함된 면역글로불린 중쇄 CH2 영역 폴리펩티드 및 면역글로불린 중쇄 CH2 영역 폴리펩티드 둘다 예를 들어, IgA1 및/또는 IgA2 서브클래스로부터 올 수 있다. 본 발명의 또 다른 분자에서, 꼬리 영역은 사람 IgA 및/또는 사람 IgE로부터 의 폴리펩티드를 포함하는 CH2 및/또는 CH3 불변 영역 폴리펩티드를 포함하거나 본질적으로 이것으로 구성될 수 있다. 다른 구체예에서, 예를 들어, 본 발명의 분자내의 꼬리 영역은 돌연변이된 면역글로불린 중쇄 CH2 및/또는 CH3 불변 영역 폴리펩티드를 포함할 수 있다(예, IgA CH3 불변 영역 폴리펩티드가 사람 기원인, J 쇄와 연합할 수 없는 돌연변이된 IgA CH3 불변 영역 폴리펩티드). 꼬리 영역은 또한 TNF 수퍼패밀리, 예를 들어 CD154로부터의 단백질의 세포외 부분을 포함하거나, 본질적으로 이것으로 구성, 또는 이것으로 구성될 수 있다.
사람에서 사용하기 위한 본 발명의 분자의 경우, 이들 영역은 일반적으로 그 분자에 대한 잠재적인 사람 면역 반응을 최소화하고 적절한 효과인자 기능을 제공하기 위해 실질적으로 또는 완전히 사람일 것이다. 본 발명의 일부 구체예에서, 예를 들어, 꼬리 영역은 J 쇄와 연합할 수 있거나 할 수 없는, 사람 IgG1 CH3 영역 서열, 야생형 IgA 중쇄 불변 영역 폴리펩티드 서열을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, CH1 도메인은 분자의 꼬리 영역에 포함되지 않으며, 결합 영역의 카르복시 말단은 직접 또는 간접적으로 꼬리 영역의 CH2 부분의 아미노 말단에 연결된다. 결합 영역은 예를 들어, 연결 영역 폴리펩티드 또는 다른 연결 분자를 통해 꼬리 영역에 간접적으로 연결될 수 있다.
본 발명은 또한 꼬리 영역내에 돌연변이된 CH2 및/또는 CH3 서열을 갖는 분자를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 분자는 CH2, CH3 및/또는 CH4 도메인내에 도입된 돌연변이 하나 이상을 갖는 돌연변이된 Fc 도메인을 포함할 수 있다. 본 발명의 일부 구체예에서, 분자는 사람 IgA CH3 불변 영역 폴리펩티드와 같은 IgA CH3 불변 영역 폴리펩티드를 포함할 수 있으며 여기서 C-말단으로부터의 둘 이상의 잔기는 결실되어 절단된 CH3 불변 영역 폴리펩티드를 생성한다. 본 발명의 다른 구체예에서, 분자는 4 또는 18 아미노산의 C-말단 결실을 포함하는, J 쇄와 연합할 수 없는 돌연변이된 사람 IgA CH3 불변 영역 폴리펩티드를 포함한다. 하지만, 본 발명은 그렇게 제한될 필요는 없으며, 돌연변이된 IgA CH3 불변 영역 폴리펩티드를 함유한 분자는 융합 단백질이 항원에 특이적으로 결합할 수 있으며 ADCC, CDC 또는 보체 고정과 같은 적어도 하나의 면역 활성을 가질 수 있다면, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21-25, 26-30 또는 그 이상의 아미노산의 결실을 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 쇄간 이황화 결합 형성을 막는 방식으로, 마지막에서 두번째 시스테인의 치환에 의해 또는 그 아미노산 잔기의 화학적 변형에 의해 J 쇄와 연합할 수 없는 돌연변이된 IgA CH3 불변 영역 폴리펩티드를 포함하는 꼬리 영역을 함유하는 분자를 포함한다.
본 발명의 다양한 분자는 예를 들어, (a) 적어도 하나의 면역글로불린 경쇄 가변 영역 폴리펩티드, (b) 적어도 하나의 면역글로불린 중쇄 가변 영역 폴리펩티드, 및 (a)의 폴리펩티드와 (b)의 폴리펩티드를 연결하는 적어도 하나의 링커 펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이들로 구성 또는 이들로 구성되는 결합 도메인 폴리펩티드를 갖는 결합 도메인 scFv-융합 단백질을 포함한다. 그러한 폴리펩티드는 예를 들어, 사람 면역글로불린 또는 비사람 면역글로불린으로부터 유래할 수 있다.
따라서, 한 태양에서, 본 발명은 표적 분자에 결합할 수 있는 결합 도메인 폴리펩티드를 포함하는 첫번째 폴리펩티드, 상기 첫번째 폴리펩티드에 부착된 가요 성 또는 다른 바람직한 링커를 포함하는 두번째 폴리펩티드, 두번째 폴리펩티드에 부착된, 꼬리 영역을 포함하는 세번째 폴리펩티드, 예를 들어, N-말단 절단된 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드(또는 그 일부)를 비롯한, 비천연 발생 단일 쇄 단백질 및/또는 VH 단백질 및/또는 VL 단백질 또는 전술한 어느 것의 바람직한 일부를 포함한다. 가요성 링커는 돌연변이되거나 다르게 변형되거나 조작된 면역글로불린 힌지 영역 또는 그 일부를 포함하거나, 본질적으로 이것으로 구성 또는 이것으로 구성될 수 있으며, 예를 들어, 야생형 면역글로불린 힌지 영역 또는 일부에 존재하는 시스테인 잔기의 수(예, IgG1 또는 IgG4의 경우 0, 1, 또는 2 시스테인)보다 적은 수의 시스테인 잔기를 함유하는 것이 있으며, 상기에서 비천연 발생 단일쇄 단백질은 적어도 하나의 면역 활성을 가질 수 있으며, 예를 들어, ADCC, CDC, 및/또는 보체 고정을 가질 수 있다. 단일쇄 단백질은 예를 들어, ADCC, CDC, 및/또는 보체 고정을 비롯한 두 면역 활성이 가능할 수 있다. 이 단백질은 단일쇄 Fv인 결합 도메인 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 추가로, 이 단백질은 단일쇄 Fv인 결합 도메인 폴리펩티드를 포함할 수 있으며 이때 단일쇄 Fv의 중쇄 가변 영역이 아미노산 위치 9, 10, 11, 12, 108, 110 및 112 중 하나 이상에서 아미노산 결실 또는 치환을 갖는다. 단백질은 또한 단일쇄 Fv인 결합 도메인 폴리펩티드를 포함할 수 있으며 이때 단일쇄 Fv의 경쇄 가변 영역은 아미노산 위치 12, 80, 81, 83, 105, 106, 및 107 중 하나 이상에서 아미노산 결실 또는 치환을 갖는다.
다른 태양에서, 본 발명은 단독으로 또는 임의의 다른 분자 또는 구조체와 함께, VH 영역의 아미노산 위치 9, 10, 11, 12, 108, 110 및 112 중 하나 이상에서 아미노산 결실 또는 치환을 갖는 VH 영역 또는 그 일부를 포함하거나, 본질적으로 이것으로 구성, 또는 이것으로 구성되는 비천연 발생 VH 단백질 또는 그 원하는 일부를 포함한다. 아미노산은 천연 발생 또는 비천연 발생 아미노산, 또는 임의의 다른 원하는 유용한 분자로 치환될 수 있다.
단독으로 또는 임의의 다른 분자 또는 구조체와 함께, VH 영역의 아미노산 위치 9, 10, 11, 12, 108, 110 및 112 중 하나 이상에서 아미노산 결실 또는 치환을 갖는 VH 영역 또는 그 일부를 포함, 본질적으로 이것으로 구성, 또는 이것으로 구성되는 VH 단백질 또는 그 원하는 일부의 용도가 개시되고 청구된다. 그러한 용도는 파아지 디스플레이, 효모 디스플레이, 및 리보솜 디스플레이 시스템 및 방법에서의 용도를 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 단독으로 또는 임의의 다른 분자 또는 구조체와 함께, VL 영역의 아미노산 위치 12, 80, 81, 83, 105, 106 및 107 중 하나 이상에서 아미노산 결실 또는 치환을 갖는 VL 영역 또는 그 일부를 포함하거나, 본질적으로 이것으로 구성, 또는 이것으로 구성되는 비천연 발생 VL 단백질 또는 그 원하는 일부를 포함한다. 아미노산은 천연 발생 또는 비천연 발생 아미노산, 또는 임의의 다른 원하는 유용한 분자로 치환될 수 있다.
단독으로 또는 임의의 다른 분자와 함께, VL 영역의 아미노산 위치 12, 80, 81, 83, 105, 106 및 107 중 하나 이상에서 아미노산 결실 또는 치환을 갖는 VL 영역 또는 그 일부를 포함하거나, 본질적으로 이것으로 구성, 또는 이것으로 구성되는 VL 단백질 또는 그 원하는 일부의 용도가 개시되고 청구된다. 그러한 용도는 파아지 디스플레이, 효모 디스플레이, 및 리보솜 디스플레이 시스템 및 방법에서의 용도를 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 (1) 아미노산 위치 9, 10, 11, 12, 108, 110 및 112 중 하나 이상에서 아미노산 결실 또는 치환을 갖는 VH 단백질 또는 그 일부, 및 (2) 단독의 또는 임의의 다른 분자와 조합된, 아미노산 위치 12, 80, 81, 83, 105, 106 및 107 중 하나 이상에서 아미노산 결실 또는 치환을 갖는 비천연 VL 단백질 또는 그 일부를 포함하거나, 본질적으로 이들로 구성, 또는 이들로 구성되는 분자를 포함한다. 아미노산은 천연 발생 또는 비천연 발생 아미노산, 또는 임의의 다른 원하는 유용한 분자로 치환될 수 있다.
(1) 아미노산 위치 9, 10, 11, 12, 108, 110 및 112 중 하나 이상에서 아미노산 결실 또는 치환을 갖는 VH 단백질 또는 그 일부, 및 (2) 단독의 또는 임의의 다른 분자와 조합된, 아미노산 위치 12, 80, 81, 83, 105, 106 및 107 중 하나 이상에서 아미노산 결실 또는 치환을 갖는 비천연 발생 VL 단백질 또는 그 일부를 포함하거나, 본질적으로 이들로 구성, 또는 이들로 구성되는 분자의 용도가 또한 개 시되고 청구된다. 그러한 용도는 파아지 디스플레이, 효모 디스플레이, 및 리보솜 디스플레이 시스템 및 방법에서의 용도를 포함한다.
본 발명은 또한 결합 도메인이 단일쇄 Fv이고 상기 단일쇄 Fv의 중쇄 가변 영역이 아미노산 위치 11에서 아미노산 치환을 갖는 분자 구조체를 포함한다. 단일쇄 Fv 중쇄 가변 영역의 위치 11에서의 아미노산을 위해 치환되는 아미노산은 세린, 트레오닌, 티로신, 아스파라긴, 글루타민, 아스파트산, 글루탐산, 라이신, 아르기닌, 및 히스티딘으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명은 따라서, 예를 들어, 결합 도메인이 단일쇄 Fv이고 상기 단일쇄 Fv의 중쇄 가변 영역이 아미노산 위치 11에서 세린 아미노산 치환을 갖는 구조체를 포함한다. 다른 아미노산 위치 변화, 치환 및 결실은 여기서 주목된다.
본 발명은 또한 예를 들어, 결합 도메인이 단일쇄 Fv이고 단일쇄 Fv의 중쇄 가변 영역의 위치 10 및/또는 11에서 아미노산이 결실된 구조체를 포함한다.
다른 태양에서, 본 발명은 결합 영역은 종양 또는 종양 연합 항원에 결합하는 구조체를 포함한다. 본 발명의 구조체의 결합 영역은 예를 들어, 암 세포 항원에 결합할 수 있다. 본 발명의 구조체가 결합하는 암세포 항원은 암세포 표면 항원 및 세포내 암세포 항원을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 결합 영역이 면역 효과인자 세포상의 항원에 결합하는 구조체를 포함한다.
다른 태양에서, 본 발명은 결합 영역이 예를 들어, CD19, CD20, CD22, CD37, CD40, CD80, 및 CD86으로 구성된 군으로부터 선택된 B 세포 항원을 비롯한 B 세포 항원에 결합하는 구조체를 포함한다. 그러한 B 세포 항원에 결합하는 본 발명의 구조체는 예를 들어, 단일쇄 Fv를 포함하는 결합 영역을 포함한다. 그러한 단일쇄 Fv 결합 영역의 예는 HD37 단일쇄 Fv, 2H7 단일쇄 Fv, G28-1 단일쇄 Fv, 및 4.4.220 단일쇄 Fv로 구성된 군으로부터 선택된 단일쇄 Fv를 포함하거나 본질적으로 이로 구성되는 분자를 포함한다. 다른 예는 CTLA-4의 세포외 도메인을 포함하거나, 본질적으로 이것으로 구성, 또는 이것으로 구성되는 결합 영역을 포함한다.
다른 태양에서, 본 발명은 결합 영역이 B 세포 분화 항원에 결합하는 구조체를 포함한다. B 세포 분화 항원은 예를 들어, CD19, CD20, CD21,CD22, CD23, CD37, CD40, CD45RO, CD80, CD86, 및 HLA 클래스II를 포함한다.
다른 태양에서, 본 발명은 결합 영역이 CD2, CD3, CD4, CD5, CD6,CD8,CD10, CD11b, CD14, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD28, CD30, CD37, CD40, CD43, CD50(ICAM3), CD54(ICAM1), CD56, CD69,CD80, CD86, CD134(OX40), CD137(41BB), CD152(CTLA-4), CD153(CD30 리간드), CD154(CD40 리간드), ICOS, L6,B7-H1, 및 HLA 클래스II로 구성된 군으로부터 선택된 표적에 결합하는 구조체를 포함한다.
본 발명은 또한 결합 영역, 꼬리 영역 및 연결 영역을 갖는 단백질 구조체를 포함하며, 이때 단백질 구조체는 용액에서 단량체 또는 실질적으로 단량체 형태로 존재할 수 있다.
본 발명은 또한 결합 영역, 꼬리 영역 및 연결 영역을 갖는 단백질 구조체를 포함하며, 이때 단백질 구조체는 상기 단백질 구조체 중 둘 이상을 포함하는 복합 체를 형성할 수 있으며 예를 들어 상기 복합체는 이량체이다.
다른 태양에서, 본 발명의 구조체는 항체 의존성 세포-매개 세포독성, 보체-의존성 세포독성(또는 보체-매개 용해), 보체 고정, 어팝토시스의 유도, 하나 이상의 생물학적 활성 시그널의 유도, 하나 이상의 면역 효과인자 세포의 유도, 세포 분화의 활성화, 세포 활성화, 하나 이상의 생물학적 활성 분자의 방출, 및 감염성 물질 또는 독소의 중화로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 면역 활성을 직접 또는 간접적으로 참여하거나 유도 또는 유발하거나 이를 도울 수 있다.
다른 태양에서, 본 발명의 결합 구조체는 단백질 키나제, 단백질 포스파타제, G-단백질, 시클릭 뉴클레오티드 또는 다른 2차 메신저, 이온 채널 및 분비 경로 성분으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 분자의 활성화 또는 억제에 의해 생물학적 활성 시그널을 유도할 수 있다. 그러한 생물학적 활성 분자는 예를 들어, 프로테아제이다.
다른 생물학적 활성 분자로는 예로서 모노카인, 림포카인, 케모카인, 성장 인자, 콜로니 자극 인자, 인터페론 및 인터류킨을 포함하여 예를 들어 사이토카인이 있다.
다른 태양에 있어서 본 발명의 제작물은 NK 세포, 단핵구, 대식 세포(macrophage), B 세포, T 세포, 비만 세포(mast cell), 호중구, 호산구 및 호염기구로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 면역 이펙터(effector) 세포를 유도할 수 있거나 이 유도에 참여할 수 있다.
다른 태양에 있어서 본 발명의 제작물은 항체 의존성 세포 매개 세포 독성 또는 하나 이상의 생물학적 활성 분자의 방출로 이어지는 하나 이상의 면역 이펙터 세포를 유도할 수 있거나 이 유도에 참여할 수 있다.
다른 태양에 있어서 본 발명의 제작물은 예를 들어 하나 이상의 신호 기전 또는 신호 분자의 활성화에 의해 표적 세포 내에서의 아폽토시스(apoptosis)에 참여할 수 있거나 이 아폽토시스를 개시할 수 있다.
다른 태양에 있어서 본 발명의 제작물은 세포 활성화를 유도할 수 있거나 이 유도에 참여할 수 있는데, 여기서, 상기 활성화는 세포의 전사 활성을 변화시킨다. 일 실시 형태에 있어서 세포의 전사 활성이 증가된다. 다른 실시 형태에 있어서 세포의 전사 활성이 감소된다.
다른 태양에 있어서, IgA 또는 IgE 분자로부터 유래되는 불변 영역을 포함하거나, 본질적으로 이로 구성되거나, 이로 구성되는 꼬리(tail) 영역을 갖는 본 발명의 제작물은 호중구 및/또는 비만 세포의 탈과립화를 유도할 수 있거나 이 유도에 참여할 수 있다.
다른 태양에 있어서 본 발명의 제작물은 예를 들어 박테리아, 바이러스, 기생충 또는 진균류인 감염성 물질의 중화를 촉진할 수 있거나 이 촉진에 참여할 수 있다.
다른 태양에 있어서 본 발명의 제작물은 내독소 및 외독소로 구성된 군으로부터 선택되는 독소의 중화를 촉진할 수 있거나 이 촉진에 참여할 수 있다. 이러한 독소는 예를 들어 탄저병 독소(anthrax toxin), 콜레라 독소, 디프테리아 독소, 백일해 독소, 이. 콜라이(E. coli) 열 불안정성 독소 LT, 이. 콜라이 열 안정성 독소 ST, 이질균 독소(shiga toxin), 슈도모나스(Pseudomonas) 내독소 A, 보툴리눔 독소, 파상풍 독소, 보르데텔라 페르투씨스(Bordetella pertussis) AC 독소, 및 바실루스 안트라시스(Bacillus anthracis) EF 독소로 구성된 군으로부터 선택되는 외독소를 포함한다. 다른 독소는 예를 들어 색시톡신(saxitoxin), 테트로도톡신(tetrodotoxin), 버섯 독소(아마톡신(amatoxin), 가이로미트린(gyromitrin), 오렐라닌(orellanine) 등), 아플라톡신(aflatoxin), 피롤리지딘 알칼로이드, 피토헤마글루티닌 및 그라야노톡신을 포함한다.
다른 태양에 있어서 본 발명의 제작물은 세포내 표적에 결합하여 예를 들어 세포 기능을 행할 수 있다(또는 세포 기능을 행하는 것에 참여할 수 있음). 이러한 제작물은 예를 들어 천연이거나 조작된(engineered) IgA CH2 도메인 영역 및 천연이거나 조작된 IgA CH3 도메인 영역을 포함하거나, 이들로 본질적으로 구성되거나, 이들로 구성된 꼬리 영역을 포함하는 제작물을 포함하는데, 상기 꼬리 영역은 J 쇄에 결합할 수 있다. 이러한 꼬리 영역은 예를 들어 2H7 scFv IgAH WIgACH2 WCH3 + JChain 제작물에서 발견된다. 이와 같이 본 발명은 예를 들어 "항-세포내 표적" 결합 도메인(예를 들어, 그리고 "항-세포내 표적" scFv), 연결 영역, 및 J 쇄에 결합할 수 있는 천연이거나 조작된 IgA 불변 영역(예를 들어 WIgACH2 WCH3)을 갖는 제작물을 포함한다.
또다른 태양에 있어서 본 발명의 제작물은 N-말단 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드가 면역글로불린 중쇄 IgG CH3 불변 영역 폴리펩티드에 부착된 IgG CH2 불변 영역 폴리펩티드를 포함하는 분자를 포함한다.
또다른 태양에 있어서 본 발명은 예를 들어 HPLC 및 비환원 겔로 측정되는 바와 같이 약 120 kD 미만, 또는 약 150 kD 미만이며 (a) 표적 세포 집단 내에서 세포에 결합할 수 있는 제1 단백질 또는 펩티드 분자, 및 (b) (i) Fc 수용체에 결합하고/하거나 (ii) 표적 세포의 아폽토시스를 유도하고/하거나 (iii) 보체를 고정시킬 수 있는 제2 단백질 또는 펩티드 분자로 본질적으로 구성되는 치료적 유효량의 단백질 분자를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 표적 세포 집단의 감소 방법을 포함하는데, 여기서, 상기 제1 단백질 또는 펩티드 분자는 상기 제2 단백질 또는 펩티드 분자에 직접 연결되거나, 선택적으로는 상기 제1 단백질 또는 펩티드 분자 및 상기 제2 단백질 또는 펩티드는 분자는 제3 단백질 또는 펩티드 분자(여기서, 상기 단백질 분자는 항체, TNF 패밀리 구성원 또는 TNF 수용체 패밀리의 구성원이 아니며, 박테리아 독소, 세포독성 약물, 또는 방사성 동위 원소와 콘쥬게이션되지 않음)에 의해 결합된다.
다른 태양에 있어서 본 발명은 또한 (i) 표적 분자에 결합할 수 있는 결합 도메인 폴리펩티드를 갖는 제1 폴리펩티드; (ii) 상기 제1 폴리펩티드의 C-말단에 부착된 연결 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드; 및 (iii) 상기 제2 폴리펩티드의 C-말단에 부착된 N-말단 절단형 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드를 포함하는 제3 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이로 구성되거나, 이로 구성되며, 하나 이상의 면역학적 활성을 가질 수 있는 단일쇄 단백질을 포함하되, 단, (a) 연결 영역 폴리펩티드가 시스테인 잔기를 전혀 갖지 않는 IgG 힌지 영역 폴리펩티드를 포함할 경우 결합 도메인 폴리펩티드 표적은 CD20 또는 L6이 아니거나, (b) 연결 영 역 폴리펩티드가 시스테인 잔기를 전혀 갖지 않는 IgG 힌지 영역 폴리펩티드를 포함할 경우, 단일쇄 단백질은 CD20에 결합할 수 있는 1F5 scFv가 아니다. 본 발명은 또한 (i) 표적 분자에 결합할 수 있는 결합 도메인 폴리펩티드를 갖는 제1 폴리펩티드; (ii) 상기 제1 폴리펩티드의 C-말단에 부착된 연결 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드; 및 (iii) 상기 제2 폴리펩티드의 C-말단에 부착된 N-말단 절단형 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드를 포함하는 제3 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이로 구성되거나, 이로 구성된 단일쇄 단백질을 포함하는데, 여기서, 상기 단일쇄 단백질은 표적 세포 상의, 또는 표적 세포 중의 표적 분자에 결합하고 생체내에서 표적 세포의 갯수를 감소시키고/시키거나 생체내에서 표적 세포 집단을 고갈시킬 수 있다. 본 발명은 또한 (i) 표적 분자에 결합할 수 있는 결합 도메인 폴리펩티드를 갖는 제1 폴리펩티드; (ii) 상기 제1 폴리펩티드의 C-말단에 부착된 연결 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드; 및 (iii) 상기 제2 폴리펩티드의 C-말단에 부착된 N-말단 절단형 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드를 포함하는 제3 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이로 구성되거나, 이로 구성된 단일쇄 단백질을 포함하는데, 여기서, 상기 단일쇄 단백질은 항체 의존성 세포 매개 세포 독성 및 보체 고정을 유도할 수 있다. 본 발명은 또한 (i) 표적 분자에 결합할 수 있는 결합 도메인 폴리펩티드를 갖는 제1 폴리펩티드; (ii) 상기 제1 폴리펩티드의 C-말단에 부착된 연결 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드; 및 (iii) 상기 제2 폴리펩티드의 C-말단에 부착된 N-말단 절단형 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드를 포함하는 제3 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이로 구성되거나, 이로 구성된 단일 쇄 단백질을 포함하는데, 여기서, 상기 단일쇄 단백질은 (1) 항체 의존성 세포 매개 세포 독성 및 보체 고정을 유도하며, (2) 표적 세포 상의, 또는 표적 세포 중의 표적 분자에 결합하고 생체내에서 표적 세포의 갯수를 감소시키고/시키거나 생체내에서 표적 세포 집단을 고갈시킬 수 있다. 본 발명은 또한 (i) 표적 분자에 결합할 수 있는 결합 도메인 폴리펩티드를 갖는 제1 폴리펩티드; (ii) 상기 제1 폴리펩티드의 C-말단에 부착된 연결 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드; 및 (iii) 상기 제2 폴리펩티드의 C-말단에 부착된 N-말단 절단형 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드를 포함하는 제3 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이로 구성되거나, 이로 구성된 단일쇄 단백질을 포함하는데, 여기서, 상기 연결 영역이 적어도 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기를 갖는 IgG 힌지 영역 폴리펩티드를 포함하며 상기 제1 시스테인은 상기 제2 시스테인에 대하여 N-말단이고 상기 제2 시스테인은 상기 제3 시스테인에 대하여 N-말단일 경우, 상기 제2 및 제3 시스테인 잔기 중 하나 또는 이들 둘 모두는 치환 또는 결실되고, 상기 단일쇄 단백질은 하나 이상의 면역학적 활성을 가질 수 있다. 본 발명은 또한 (i) 표적 분자에 결합할 수 있는 결합 도메인 폴리펩티드를 갖는 제1 폴리펩티드; (ii) 상기 제1 폴리펩티드의 C-말단에 부착된 연결 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드; 및 (iii) 상기 제2 폴리펩티드의 C-말단에 부착된 N-말단 절단형 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드를 포함하는 제3 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이로 구성되거나, 이로 구성된 단일쇄 단백질을 포함하는데, 여기서, 상기 연결 영역이 적어도 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기를 갖는 IgG 힌지 영역 폴리펩티드를 포함하며 상기 제1 시스테인은 상기 제2 시스 테인에 대하여 N-말단이고 상기 제2 시스테인은 상기 제3 시스테인에 대하여 N-말단일 경우, 상기 제2 및 제3 시스테인 잔기 중 하나 또는 이들 둘 모두는 치환 또는 결실되고, 상기 단일쇄 단백질은 (a) 항체 의존성 세포 매개 세포 독성 및 (b) 보체 고정으로부터 선택되는 하나 이상의 면역학적 활성을 유도할 수 있다. 본 발명은 또한 (i) 표적 분자에 결합할 수 있는 결합 도메인 폴리펩티드를 갖는 제1 폴리펩티드; (ii) 상기 제1 폴리펩티드의 C-말단에 부착된 연결 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드; 및 (iii) 상기 제2 폴리펩티드의 C-말단에 부착된 N-말단 절단형 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드를 포함하는 제3 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이로 구성되거나, 이로 구성된 단일쇄 단백질을 포함하는데, 여기서, 상기 연결 영역이 적어도 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기를 갖는 IgG 힌지 영역 폴리펩티드를 포함하며 상기 제1 시스테인은 상기 제2 시스테인에 대하여 N-말단이고 상기 제2 시스테인은 상기 제3 시스테인에 대하여 N-말단일 경우, 상기 제2 및 제3 시스테인 잔기 중 하나 또는 이들 둘 모두는 치환 또는 결실되고, 상기 단일쇄 단백질은 항체 의존성 세포 매개 세포 독성을 가질 수 있고 보체를 고정시킬 수 있다. 본 발명은 또한 (i) 표적 분자에 결합할 수 있는 결합 도메인 폴리펩티드를 갖는 제1 폴리펩티드; (ii) 상기 제1 폴리펩티드의 C-말단에 부착된 연결 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드; 및 (iii) 상기 제2 폴리펩티드의 C-말단에 부착된 N-말단 절단형 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드를 포함하는 제3 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이로 구성되거나, 이로 구성된 단일쇄 단백질을 포함하는데, 여기서, 상기 연결 영역이 적어도 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기를 갖는 IgG 힌지 영역 폴리펩티드를 포함하며 상기 제1 시스테인은 상기 제2 시스테인에 대하여 N-말단이고 상기 제2 시스테인은 상기 제3 시스테인에 대하여 N-말단일 경우, 상기 제2 및 제3 시스테인 잔기 중 하나 또는 이들 둘 모두는 치환 또는 결실되고, 상기 단일쇄 단백질은 표적 세포 상의, 또는 표적 세포 중의 표적 분자에 결합하고 생체내에서 표적 세포의 갯수를 감소시키고/시키거나 생체내에서 표적 세포 집단을 고갈시킬 수 있다. 본 발명은 또한 (i) 표적 분자에 결합할 수 있는 결합 도메인 폴리펩티드를 갖는 제1 폴리펩티드; (ii) 상기 제1 폴리펩티드의 C-말단에 부착된 연결 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드; 및 (iii) 상기 제2 폴리펩티드의 C-말단에 부착된 N-말단 절단형 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드를 포함하는 제3 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이로 구성되거나, 이로 구성된 단일쇄 단백질을 포함하는데, 여기서, 상기 연결 영역이 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기를 갖는 IgG 힌지 영역 폴리펩티드를 포함하며 상기 제1 시스테인은 상기 제2 시스테인에 대하여 N-말단이고 상기 제2 시스테인은 상기 제3 시스테인에 대하여 N-말단일 경우 상기 제2 및 제3 시스테인 잔기 중 하나 또는 이들 둘 모두는 치환 또는 결실되고, 상기 단일쇄 단백질은 항체 의존성 세포 매개 세포 독성 및 보체 고정으로부터 선택되는 하나 이상의 면역학적 활성을 유도할 수 있으며, 상기 단일쇄 단백질은 표적 세포 상의, 또는 표적 세포 중의 표적 분자에 결합하고 생체내에서 표적 세포의 갯수를 감소시키고/시키거나 생체내에서 표적 세포 집단을 고갈시킬 수 있다. 본 발명은 또한 (i) 표적 분자에 결합할 수 있는 결합 도메인 폴리펩티드를 갖는 제1 폴리펩티드; (ii) 상기 제1 폴리펩티드의 C-말단에 부착된 연결 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드; 및 (iii) 상기 제2 폴리펩티드의 C-말단에 부착된 N-말단 절단형 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드를 포함하는 제3 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이로 구성되거나, 이로 구성된 단일쇄 단백질을 포함하는데, 여기서, 상기 연결 영역이 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기를 갖는 IgG 힌지 영역 폴리펩티드를 포함하며 상기 제1 시스테인은 상기 제2 시스테인에 대하여 N-말단이고 상기 제2 시스테인은 상기 제3 시스테인에 대하여 N-말단일 경우 상기 제2 및 제3 시스테인 잔기 중 하나 또는 이들 둘 모두는 치환 또는 결실되고, 상기 단일쇄 단백질은 항체 의존성 세포 매개 세포 독성 및 보체 고정을 유도할 수 있으며, 상기 단일쇄 단백질은 표적 세포 상의, 또는 표적 세포 중의 표적 분자에 결합하고 생체내에서 표적 세포의 갯수를 감소시키고/시키거나 생체내에서 표적 세포 집단을 고갈시킬 수 있다. 본 발명은 또한 (i) 표적 분자에 결합할 수 있으며 중쇄 가변 영역(여기서, 중쇄 가변 영역의 제1 프레임워크(framework) 영역의 11 위치의 류신은 결실되거나 다른 아미노산으로 치환됨)을 포함하는 결합 도메인 폴리펩티드를 갖는 제1 폴리펩티드; (ii) 상기 제1 폴리펩티드의 C-말단에 부착된 연결 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드; 및 (iii) 상기 제2 폴리펩티드의 C-말단에 부착된 N-말단 절단형 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드를 포함하는 제3 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이로 구성되거나, 이로 구성된 단일쇄 단백질을 포함하는데, 여기서, 상기 단일쇄 단백질은 하나 이상의 면역학적 활성을 가질 수 있되, 단, 결합 도메인 폴리펩티드가 CD20에 결합할 수 있을 경우 상기 연결 영역은 3개의 시스테인 잔기(여기서, 상기 3개의 시스테인 잔기 중 하나 또는 2개는 다른 아미노산으로 치환 또는 대체됨)를 포함한다. 본 발명은 또한 (i) 표적 분자에 결합할 수 있으며 중쇄 가변 영역(여기서, 중쇄 가변 영역의 제1 프레임워크 영역의 11 위치의 류신은 결실되거나 다른 아미노산으로 치환됨)을 포함하는 결합 도메인 폴리펩티드를 갖는 제1 폴리펩티드; (ii) 상기 제1 폴리펩티드의 C-말단에 부착된 연결 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드; 및 (iii) 상기 제2 폴리펩티드의 C-말단에 부착된 N-말단 절단형 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드를 포함하는 제3 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이로 구성되거나, 이로 구성된 단일쇄 단백질을 포함하는데, 여기서, 상기 단일쇄 단백질은 하나 이상의 면역학적 활성을 가질 수 있되, 단, 결합 도메인 폴리펩티드가 CD20에 결합할 수 있을 경우 상기 연결 영역은 3개의 시스테인 잔기를 포함한다(여기서, 상기 3개의 시스테인 잔기 중 하나 또는 2개는 다른 아미노산으로 치환 또는 대체됨). 본 발명은 또한 (i) 표적 분자에 결합할 수 있으며 중쇄 가변 영역(여기서, 중쇄 가변 영역의 제1 프레임워크 영역의 11 위치의 류신은 결실되거나 다른 아미노산으로 치환됨)을 포함하는 결합 도메인 폴리펩티드를 갖는 제1 폴리펩티드; (ii) 상기 제1 폴리펩티드의 C-말단에 부착된 연결 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드; 및 (iii) 상기 제2 폴리펩티드의 C-말단에 부착된 N-말단 절단형 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드를 포함하는 제3 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이로 구성되거나, 이로 구성된 단일쇄 단백질을 포함하는데, 여기서, 상기 단일쇄 단백질은 하나 이상의 면역학적 활성을 유도할 수 있되, 단, 결합 도메인 폴리펩티드가 CD20에 결합할 수 있는 2H7 scFv이며 상기 연결 영역은 적어도 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기를 갖는 IgG 힌지 영역 폴리펩티 드를 포함하고 상기 제1 시스테인은 상기 제2 시스테인에 대하여 N-말단이며 상기 제2 시스테인은 상기 제3 시스테인에 대하여 N-말단일 경우, 상기 시스테인 잔기 중 하나 또는 2개는 치환 또는 결실된다. 본 발명은 또한 (i) 표적 세포 상의, 또는 표적 세포 중의 표적 분자에 결합할 수 있으며 중쇄 가변 영역(여기서, 중쇄 가변 영역의 제1 프레임워크 영역의 11 위치의 류신은 결실되거나 다른 아미노산으로 치환됨)을 포함하는 결합 도메인 폴리펩티드를 갖는 제1 폴리펩티드; (ii) 상기 제1 폴리펩티드에 부착된 연결 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드; 및 (iii) 상기 제2 폴리펩티드에 부착된 N-말단 절단형 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드를 포함하는 제3 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이로 구성되거나, 이로 구성된 단일쇄 단백질을 포함하는데, 여기서, 상기 단일쇄 단백질은 하나 이상의 면역학적 활성을 가질 수 있되, 단, 상기 단일쇄 단백질은 CD20에 결합할 수 있는 결합 도메인 폴리펩티드 및 (a) 3개의 시스테인 잔기를 갖는 IgG 힌지부 또는 (b) 시스테인 잔기를 치환한 3개의 세린(또는 유사 아미노산) 잔기를 포함하는 IgG 힌지부를 포함하는 연결 영역을 포함하지 않거나 본질적으로 이로 구성되지 않는다. 이러한 단일쇄 단백질의 다수의 가능한 변이 및 변이체가 존재한다. 예를 들어 결합 도메인 폴리펩티드는 자연 발생 및/또는 비-자연 발생 VH 및 VL 폴리펩티드를 포함하는 단일쇄 항체 또는 scFv일 수 있으며, 결합 도메인 폴리펩티드는 다수의 표적 중 임의의 표적에 결합할 수 있다. 비-자연 발생 VH 폴리펩티드는 그 예로서, 그리고 제한됨이 없이, 아미노산 위치 9, 10, 11, 12, 108, 110, 및/또는 112 중 임의의 하나 이상의 위치에 상응하는 위치에서의 아미노산(들)의 돌연변이, 치환 또는 결실을 포함하는 인간 중쇄 가변 영역 폴리펩티드를 포함한다. 비-자연 발생 VL 폴리펩티드는 그 예로서, 그리고 제한됨이 없이 아미노산 위치 12, 80, 81,83, 105, 106 및 107 중 임의의 하나 이상의 위치에 상응하는 위치에서의 아미노산(들)의 돌연변이, 치환 또는 결실을 포함하는 인간 경쇄 가변 영역 폴리펩티드를 포함한다. 표적은 그 예로서, 그리고 제한됨이 없이 CD19, CD20, CD28, CD30, CD37, CD40, L6, HER2, 상피 세포 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor, EGFR), 혈관 내피 세포 성장 인자(vascular endothelial cell growth factor, VEGF), 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor)(예를 들어 TNF-알파)와, 현재 공지되어 있거나 후에 밝혀질 수 있는, 본원에 기술되어 있거나 본원에서 언급되거나 그렇지 않을 경우 유용한 기타 표적을 포함한다. 추가로, 연결 영역 폴리펩티드는 자연 발생 및 비-자연 발생 둘 모두일 수 있는 임의의 다수의 분자일 수 있다. 연결 영역 폴리펩티드는 그 예로서, 그리고 제한됨이 없이 자연 발생 및 비-자연 발생 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드를 포함한다. 자연 발생 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드는 그 예로서, 그리고 제한됨이 없이 인간 IgG1 힌지 영역 폴리펩티드, 인간 IgA 힌지 영역 폴리펩티드, 인간 IgD 힌지 영역 폴리펩티드, 인간 IgE 힌지-작용 영역(예를 들어 IgE CH2), 카메리드(camelid) 면역글로불린 힌지 영역, 또는 현재 공지되어 있거나 후에 밝혀질 수 있는, 본원에 기술되어 있거나 본원에서 언급되거나 그렇지 않을 경우 유용한 임의의 기타 자연 발생 힌지 영역 펩티드와 같은 야생형 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드를 포함한다. 비-자연 발생 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드는 그 예로서, 그리고 제한됨이 없이 야생형의 시스테인 갯수보다 적은 갯수의 시스테인을 포함하는 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드를 포함하는 돌연변이된 자연 발생 면역글로불린 힌지부, 예를 들어 0개, 하나, 또는 2개의 시스테인을 포함하는 돌연변이된 자연 발생 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드, 및 본원에 기술되어 있거나 참고되거나 그렇지 않을 경우 유용하거나 연결 결합에 유용한 것으로 현재 공지되어 있거나 후에 밝혀질 임의의 기타 연결 영역 분자, 예를 들어 면역글로불린 도메인, 예를 들어 CH1 도메인 및 CH2 도메인을 포함한다. N-말단 절단형 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드는 단일쇄 단백질의 다른 부분을 포함하거나 포함하지 않는, 본원에 기술되어 있는 것과 같은 하나 이상의 이펙터 기능을 제공하는 자연 발생 및 비-자연 발생 N-말단 절단형 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드를 포함한다. 자연 발생 N-말단 절단형 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드는 그 예로서, 그리고 제한됨이 없이, 인간 IgG, 인간 IgA, 및 인간 IgE로부터 개별적으로 또는 함께 취해지는 CH2CH3 불변 영역 폴리펩티드를 포함하는 CH2CH3 불변 영역 폴리펩티드, 및 본원에 기술되어 있거나 참조되거나, 그렇지 않을 경우 유용한 것으로 현재 공지되어 있거나 후에 밝혀질 임의의 기타 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드를 포함한다. 비-자연 발생 N-말단 절단형 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드는 그 예로서, 그리고 제한됨이 없이, 본원에 기술되어 있거나 언급되거나, 그렇지 않을 경우 유용한 것으로 현재 공지되어 있거나 후에 밝혀질 임의의 돌연변이된 자연 발생 중쇄 불변 영역 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 다양하며 구체적인 제작물은 단지 그 예로서 하기를 포함한다:
1. 2H7 scFv VH L11S (CSC-S) H WCH2 WCH3
2. 2H7 scFv VH L11S IgE CH2 CH3 CH4
3. 2H7 scFv VH L11S mIgE CH2 CH3 CH4
4. 2H7 scFv VH L11S mIgAH WIgACH2 T4CH3
5. 2H7 scFv VH L11S (SSS-S) H K322S CH2 WCH3
6. 2H7 scFv VH L11S (CSS-S) H K322S CH2 WCH3
7. 2H7 scFv VH L11S (SSS-S) H P331S CH2 WCH3
8. 2HU scFv VH L11S (CSS-S) H P331S CH2 WCH3
9. 2H7 scFv VH L11S (SSS-S) H T256N CH2 WCH3
10. 2H7 scFv VH L11S (SSS-S) H RTPE/QNAK (255-258) CH2 WCH3
11. 2H7 scFv VH L11S (SSS-S) H K290Q CH2 WCH3
12. 2H7 scFv VH L11S (SSS-S) H A339P CH2 WCH3
13. G28-1 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3
14. G28-1 scFv IgAH WCH2 WCH3
15. G28-1 scFv VH L11S (SSS-S) H WCH2 WCH3
16. G28-1 scFv VH L11S (CSS-S) H WCH2 WCH3
17. G28-1 scFv VH L11S (CSC-S) H WCH2 WCH3
18. G28-1 scFv VH L11S (SSC-P) H WCH2 WCH3
19. CTLA4 (SSS-S) H P238SCH2 WCH32
20. CTLA4 (CCC-P) WH WCH2 WCH3
21. FC2-2 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3
22. FC2-2 scFv VH L11S (SSS-S) H WCH2 WCH3
23. UCHL-1 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3
24. UCHL-1 scFv VHL11S (SSS-S) H WCH2 WCH3
25. 5B9 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3
26. 5B9 scFv VH L11S (SSS-S) H WCH2 WCH3
27. 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3
28. 2H7 scFv (SSS-S) H P238SCH2 WCH3
29. 2H7 scFv IgAH WCH2 WCH3
30. 2H7 scFv IgAH WIgACH2 T4CH3
31. 2H7 scFv IgAH WIgACH2 WCH3 + JChain
32. 2H7 scFv (CCC-P) WH WCH2 WCH3
33. 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 F405YCH3
34. 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 F405ACH3
35. 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 Y407ACH3
36. 2H4 scFv (SSS-S) HWCH2 F405A, Y407ACH3
37. 2H7 scFv (CSS-S) H WCH2 WCH3
38. 2H7 scFv (SCS-S) H WCH2 WCH3
39. 2H7 scFv (SSC-P) H WCH2 WCH3
40. 2H7 scFv (CSC-S) H WCH2 WCH3
41. 2H7 scFv (CCS-P) H WCH2 WCH3
42. 2H7 scFv (SCC-P) H WCH2 WCH3
43. 2H7 scFv VH L11S (SSS-S) H WCH2 WCH3
44. 2H7 scFv VH L11S (CSS-S) H WCH2 WCH3
45. G28-1 scFv VH L11S (SCS-S) H WCH2 WCH3
46. G28-1 scFv VH L11S (CCS-P) H WCH2 WCH3
47. G28-1 scFv VH L11S (SCC-P) H WCH2 WCH3
48.G28-1 scFv VH L11S mIgE CH2 CH3 CH4
49. G28-1 scFv VH L11S mIgAH WIgACH2 T4CH3
50. G28-1 scFv VH L11S hIgE CH2 CH3 CH4
51. G28-1 scFv VH L11S hIgAH WIgACH2 T4CH3
52. HD37 scFv IgAH WCH2 WCH3
53. HD37 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3
54. HD37 scFv VH L11S (SSS-S) H WCH2 WCH3
55. L6 scFv IgAH WCH2 WCH3
56. L6 scFv VH L11S (SSS-S) H WCH2 WCH3
57. 2H7 scFv-라마(llama) IgG1
58. 2H7 scFv-라마 IgG2
59. 2H7 scFv-라마 IgG3
60. CD16-6 저 (ED) (SSS-S) H P238SCH2 WCH3
61. CD16-9 고 (ED) (SSS-S) H P238SCH2 WCH3
62. 2el2 scFv (SSS-s) H P238SCH2WCH3-hCD80TM/CT
63. 10A8 scFv (SSS-s) H P238SCH2WCH3-hCD80TM/CT
64. 40.2.36 scFv (SSS-s) H P238SCH2WCH3-hCD80TM/CT
65. 2H7 scFv (SSS-s) HP238SCH2WCH3-hCD80TM/CT
66. G19-4 scFv (SSS-s) HP238SCH2WCH3-hCD80TM/CT
67. 2el2 scFv (SSS-s) H WCH2WCH3-hCD80TM/CT
68. 2el2 scFv IgAH IgACH2T4CH3-hCD80TM/CT
69. 2el2 scFv IgECH2CH3CH4-hCD80TM/CT
70. 2el2 scFv (SSS-s) H P238SCH2WCH3-mFADD-TM/CT
71. 2el2 scFv (SSS-s) H WCH2WCH3-mFADD-TM/CT
72. 2el2 scFv (SSS-s) H WCH2WCH3-mcasp3-TM/CT
73. 2el2 scFv (SSS-s) H P238SCH2WCH3-mcasp3-TM/CT
74. 2el2 scFv (SSS-s) H WCH2WCH3-mcasp8--TM/CT
75. 2el2 scFv (SSS-s) HP238SCH2 WCH3-mcasp8-TM/CT
76. 2el2 scFv (SSS-s) H WCH2 WCH3-hcasp3-TM/CT
77. 2el2 scFv (SSS-s) H P238SCH2WCH3-hcasp3-TM/CT
78. 2e12 scFv (SSS-s) H WCH2WCH3-hcasp8-TM/CT
79. 2el2 scFv (SSS-s) H P238SCH2WCH3-hcasp8-TM/CT
80. 1D8 scFv--hIgG1 (SSS-s) HP238SCH2 WCH3-hCD80TM/CT
81. 1D8scFv--hIgG1 (SSS-s) H WCH2WCH3-hCD80TM/CT
82. 1D8 scFv--mIgAT4-hCD80TM/CT
83. 1D8 scFv--hIgE-hCD80TM/CT
84. 1D8 scFv--hIgG1 (SSS-s) H P238SCH2WCH3-mFADD-TM/CT
85. 1D8 scFv--hIgG1 (SSS-s) H WCH2WCH3-mFADD-TM/CT
86. 1D8 scFv--hIgG1 (SSS-s) H WCH2WCH3-mcasp3-TM/CT
87. 1D8 scFv--hIgG1 (SSS-s) H P238SCH2WCH3-mcasp3-TM/CT
88. 1D8 scFv--hIgG1 (SSS-s) H WCH2WCH3-mcasp8--TM/CT
89. 1D8 scFv--hIgG1 (SSS-s) H P238SCH2 WCH3-mcasp8-TM/CT
90. 1D8scFv--hIgG1 (SSS-s) H WCH2WCH3-hcasp3--TM/CT
91. 1D8scFv--hIgG1 (SSS-s) H P238SCH2WCH3-hcasp3-TM/CT
92. 1D8 scFv--hIgG1 (SSS-s) H WCH2 WCH3-hcasp8--TM/CT
93. 1D8 scFv--hIgG1 (SSS-s) H P238SCH2 WCH3-hcasp8-TM/CT L6 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3
94. 2H7 scFv CD154 (L2)
95. 2H7 scFv CD154 (S4)
96. CTLA4 IgAH IGACH2CH3
97. CTLA4 IgAH IgACH2 T4CH3
98. 2H7 scFv IgAH IgACH2CH3
99. 2H7 scFv IgAH IgAHCH2T18CH3
100. 2H&-40.2.220 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 (이특이성 항- ccd20-항-cd40)
101. 2H7 scFv IgAH IgACH2 T4CH3-hCD89 TM/CT
102. G19-4 scFv (CCC-P) WH WCH2 WCH3-hCD89 TM/CT
103. 2el2 scFv (CCC-P) WH WCH2 WCH3-hCD89 TM/CT
본 발명의 상기 및 기타 태양은 하기의 상세한 설명 및 첨부된 도면을 참고로 하면 더욱 더 자명해질 것이다. 본원에 나타낸 바와 같이 모든 참고 특허, 논문, 문헌, 및 본원에 개시되거나 확인되어 있는 기타 자료는 각각이 개별적으로 포함되는 것과 같이 전체 내용이 참고로 본원에 포함된다.
도 1에는 CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질인 2H7scFv-Ig의 DNA 및 추정 아미노산 서열 [서열 번호 _]이 도시되어 있다.
도 2에는 트랜스펙션된 안정한 CHO 세포주에 의한 2H7 scFv-Ig의 생성 수준 및 CD20을 발현하는 CHO 세포에의 정제된 2H7scFv Ig의 결합에 의한 표준 곡선의 생성이 도시되어 있다.
도 3에는 단리된 2H7scFv-Ig 단백질의 다수의 제제의 SDS-PAGE 분석이 도시되어 있다.
도 4에는 2H7scFv-Ig에 의한 보체 고정(도 4A) 및 항체 의존성 세포 독성의 매개(도 4B)가 도시되어 있다.
도 5에는 정상 B 세포의 성장에 대한 CD20 및 CD40의 동시 라이게이션의 영 향이 도시되어 있다.
도 6에는 B 림프양(lymphoblastoid) 세포주에 있어서의 CD95 발현 및 아폽토시스 유도에 대한 CD20 및 CD40의 동시 라이게이션의 영향이 도시되어 있다.
도 7에는 CD20 및 CD40에 특이적으로 결합할 수 있는 2H7scFv-CD154 L2(도 7A, 서열 번호 _) 및 2H7scFv-CD154 S4(도 7B, 서열 번호 _) 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질의 DNA 및 추정 아미노산 서열이 도시되어 있다.
도 8에는 플로우 이뮤노사이토플루오리메트리(flow immunocytofluorimetry)에 의한 CD20+ CHO 세포에의 2H7scFv-CD154 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질의 결합이 도시되어 있다.
도 9에는 세포에의 2H7scFv-CD154 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질의 결합 후 B 세포 세포주인 Ramos, BJAB, 및 T51에의 아넥신(Annexin) V의 결합이 도시되어 있다.
도 10에는 2H7scFv-CD154 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질의 결합 이후의 B 세포 세포주 T51의 증식에 대한 영향이 도시되어 있다.
도 11에는 하기의 CytoxB 또는 CytoxB 유도체: CytoxB-MHWTG1C(2H7 ScFv, 돌연변이체 힌지부, 야생형 인간 IgG1 Fc 도메인), CytoxB-MHMG1C(2H7 ScFv, 돌연변이체 힌지부, 돌연변이된 인간 IgG1 Fc 도메인) 및 CytoxB-IgAHWTHG1C(2H7 ScFv, 인간 IgA-유래된 힌지부 [서열 번호 _], 야생형 인간 IgG1 Fc 도메인)로 칭해지는 2H7 ScFv-Ig 융합 단백질 [서열 번호 _]의 구조의 개략도가 도시되어 있다. 화살표는 FcR 결합 및 ADCC 활성(굵은 화살표)과, 보체 고정(가는 화살표)에 기여하는 것 으로 생각되는 아미노산 잔기의 위치 번호를 나타낸다. 쇄간 이황화 결합은 존재하지 않음을 알기 바란다.
도 12에는 단리된 CytoxB 및 2H7scFv-CD154 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질의 SDS-PAGE 분석이 도시되어 있다.
도 13에는 CytoxB 유도체의 항체 의존성 세포 매개 세포 독성 활성이 도시되어 있다.
도 14에는 CytoxB 유도체의 보체 의존성 세포 독성이 도시되어 있다.
도 15에는 머카크(macaque) 혈액 샘플에서의 CytoxB-MHWTG1C의 혈청 반감기 결정이 도시되어 있다.
도 16에는 머카크 혈액 샘플에서의 혈중(circulating) CD40+ B 세포 수준에 대한 CytoxB-MHWTG1C의 영향이 도시되어 있다.
도 17에는 트랜스펙션된 포유류 세포주에 의한 HD37(CD19-특이적) ScFv-Ig의 생성 수준 및 CD19를 발현하는 세포에의 정제된 HD37 ScFv-Ig의 결합에 의한 표준 곡선의 생성이 도시되어 있다.
도 18에는 트랜스펙션된 안정한 CHO 세포주에 의한 L6(암종 항원) ScFv-Ig의 생성 수준 및 L6 항원을 발현하는 세포에의 정제된 L6 ScFv-Ig의 결합에 의한 표준 곡선의 생성이 도시되어 있다.
도 19에는 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질인 2H7ScFv-Ig, HD37 ScFv-Ig 및 G28-1(CD37-특이적) ScFv-Ig의 항체 의존성 세포 매개 세포 독성 활성이 도시되어 있다.
도 20에는 L6 ScFv-Ig 융합 단백질의 항체 의존성 세포 매개 세포 독성 활성이 도시되어 있다.
도 21에는 L6 ScFv-Ig 및 2H7 ScFv-Ig 융합 단백질의 SDS-PAGE 분석이 도시되어 있다.
도 22에는 G28-1 scFv-Ig 및 HD37 ScFv-Ig 융합 단백질의 SDS-PAGE 분석이 도시되어 있다.
도 23에는 라마 IgG1(서열 번호 _), IgG2(서열 번호 _), 및 IgG3(서열 번호 _)의 힌지부 및 CH2 도메인을 포함하는 인간 IgG1(서열 번호 _)의 면역글로불린 힌지부 및 CH2 도메인의 서열 정렬이 도시되어 있다.
도 24에는 10% SDS 폴리아크릴아미드 겔에서의 정제된 2H7 scFv 라마 IgG 융합 단백질의 이동이 도시되어 있다. 정제된 융합 단백질(샘플 당 5 ㎍)은 비환원 샘플 완충제(레인 2-5) 및 환원 샘플 완충제(레인 6-9) 중에 제조하였다. 레인 1: 분자량 마커(비환원); 레인 2 및 6: 2H7 scFv-라마 IgG1(서열 번호 _); 레인 3 및 7: 2H7 scFv-라마 IgG2(서열 번호 _); 레인 4 및 8: 2H7 scFv-라마 IgG3(서열 번호 _); 및 레인 5 및 9: 리툭시마브(Rituximab)(키메라 항-CD20 항체(인간 IgG1 불변 영역)).
도 25에는 플로우 이뮤노사이토플루오리메트리에 의해 탐지되는 CD20+ CHO 세포에의 2H7 scFv-라마 IgG1(서열 번호 _), 2H7 scFv-라마 IgG2(서열 번호 _), 및 2H7 scFv-라마 IgG3(서열 번호 _)의 결합이 도시되어 있다.
도 26에는 토끼 보체의 존재 하에서 BJAB 세포에 대한 2H7 scFv 라마 IgG 융 합 단백질, 2H7 scFv-라마 IgG1(서열 번호 _), 2H7 scFv-라마 IgG2(서열 번호 _), 및 2H7 scFv-라마 IgG3(서열 번호 _)와, 2H7 scFv 인간 IgG1(2H7 scFv IgG WTH WTCH2CH3)(서열 번호 _)의 CDC 활성이 도시되어 있다. 리툭시마브를 대조로 포함시켰다.
도 27에는 2H7 scFv 라마 IgG 융합 단백질, 2H7 scFv-라마 IgG1(서열 번호 _), 2H7 scFv-라마 IgG2(서열 번호 _), 및 2H7 scFv-라마 IgG3(서열 번호 _)의 항체 의존성 세포 매개 세포 독성 활성이 도시되어 있다. 이펙터 세포(인간 PBMC)를 3가지의 상이한 비인 1:25, 1:50, 및 1:100으로 표적 세포(BJAB 세포)와 조합하였다. 리툭시마브를 대조로 포함시켰다. 각각의 데이터 포인트는 3개의 개별 측정치를 나타낸다.
도 28에는 2H7 scFv 라마 IgG 융합 단백질, 2H7 scFv-라마IgG1(서열 번호 _), 2H7 scFv-라마 IgG2(서열 번호 _), 및 2H7 scFv-라마 IgG3(서열 번호 _)의 항체 의존성 세포 매개 세포 독성 활성이 도시되어 있다. 이펙터 세포(라마 PBMC)를 3가지의 상이한 비인 1:25, 1:50, 및 1:100으로 표적 세포(BJAB 세포)와 조합하였다. 리툭시마브를 대조로 포함시켰다. 각각의 데이터 포인트는 3개의 개별 측정치를 나타낸다.
도 29에는 세포 표면 상에서 scFv-Ig 융합 단백질을 발현하는 Reh 세포(급성 림프성 백혈병)의 보체 의존성 세포 독성 활성이 도시되어 있다. Reh 세포는 인간 CD80 막통과 및 세포질 꼬리 도메인에 융합된 인간 IgG1 야생형 힌지부-CH2CH3에 융합된, 인간 공동자극 분자, CD152, CD28, CD40, 및 CD20에 특이적인 scFv 항체를 코딩하는 제작물로 트랜스펙션시켰다. 보체 의존성 세포 독성 활성은 토끼 보체의 존재 및 부재(각각 C'를 더하거나 C'를 첨가하지 않음) 하에서 측정하였다. 데이터는 이중 샘플의 평균치를 나타낸다. Reh 항-hCD152 scFvIg: Reh 세포를 폴리뉴클레오티드 10A8 scFv IgG MTH (SSS) MT CH2CH3(서열 번호 _)으로 트랜스펙션시킴; Reh 항-hCD28 scFvIg: 2E12 scFv IgG MTH(SSS) MT CH2CH3(서열 번호 _); Reh 항-hCD40 scFv Ig: 4.2.220 scFv IgG MTH (SSS) MT CH2CH3(서열 번호 _); 및 Reh 항-hCD20 scFv Ig: 2H7 scFv IgG MTH (SSS) MT CH2CH3(서열 번호 _).
도 30에는 도 29에 있어서 기술되어 있는 바와 같이 인간 CD80 막통과 및 세포질 꼬리 도메인에 융합된 인간 돌연변이체 IgG1 힌지부 및 돌연변이체 CH2와 야생형 CH3에 융합된, 인간 공동자극 분자, CD152, CD28, CD40, 및 CD20에 특이적인, 그리고 쥐과 CD3에 특이적인 scFv 항체를 코딩하는 제작물로 트랜스펙션된 ReH 세포(폴리뉴클레오티드 500A2 scFv IgG MTH (SSS) MTCH2WTCH3(서열 번호 _)로 트랜스펙션된 Reh 세포를 나타내는 Reh 항-mCD3scFv)의 항체 의존성 세포 매개 세포 독성 활성이 도시되어 있다. 데이터는 사중 샘플의 평균치를 나타낸다.
도 31에는 이후의 도면에 도시되는 실험에 사용되는 면역글로불린 불변 영역 제작물이 열거되어 있다.
도 32에는 토끼 보체의 존재 및 부재(각각 C'을 더하거나 C'을 첨가하지 않음) 하에서 CTLA-4 Ig 융합 단백질, CTLA-4 IgG WTH (CCC) WTCH2CH3(서열 번호 _)(2 ㎍/ml) 및 CTLA-4 IgG MTH MTCH2WTCH3(서열 번호 _)(2 ㎍/ml)의 보체 의존성 세포 독성 활성이 도시되어 있다. 표적 세포는 Reh 세포와, CD80으로 트랜스펙션시 킨 Reh 세포(Reh CD80.10)였다.
도 33에는 CTLA-4 Ig 융합 단백질, CTLA-4 IgG WTH (CCC) WTCH2CH3(서열 번호 _)(2 ㎍/ml) 및 CTLA-4 IgG MTH MTCH2WTCH3(서열 번호 _)(2 ㎍/ml)의 항체 의존성 세포 매개 세포 독성 활성이 도시되어 있다. 이펙터 세포인 인간 PBMC를 표적 세포인 Reh 또는 Reh CD80.1에 지시된 비로 첨가하였다. 도 33A에는 Ig 융합 단백질의 부재 하에서의 Reh CD80.1 세포에서의 자연사의 수준이 도시되어 있다. 도 33B에는 CTLA-4 IgG MTH MTCH2WTCH3에 의해 매개되는 항체 의존성 세포 매개 세포 독성이 도시되어 있으며, 도 33C에는 CTLA-4 IgG WTH (CCC) WTCH2CH3에 의해 매개되는 항체 의존성 세포 매개 세포 독성이 도시되어 있다. 각각의 데이터 포인트는 4개의 샘플 웰에서 측정된 평균 특정 살해 퍼센트를 나타낸다.
도 34에는 플로우 이뮤노사이토플루오리메트리에 의한 (CD20+) CHO 세포에의 2H7 (항-CD20) scFv Ig 융합 단백질의 결합이 도시되어 있다.
도 35에는 2H7 scFv IgG 및 IgA 융합 단백질의 면역블롯이 도시되어 있다. COS 세포는 다양한 2H7 scFv Ig 융합 단백질 제작물로 일시적으로 트랜스펙션시켰다. 발현된 폴리펩티드는 단백질 A로 면역 침전시키고, 비환원 SDS 폴리아크릴아미드 겔에서 분리하고, 이어서 폴리비닐 플루오라이드 막으로 옮겼다. 단백질은 항-인간 IgG (Fc 특이적) 서양 고추냉이 퍼옥시다제 콘쥬게이트를 사용하여 검출하였다. 레인 1: 단지 벡터; 레인 2: 2H7 scFv IgG WTH (CCC) WTCH2CH3(서열 번호 _); 레인 3: 2H7 scFv IgG MTH (CSS) WTCH2CH3(서열 번호 _); 레인 4: 2H7 scFv IgG MTH (SCS) WTCH2CH3(서열 번호 _); 레인 5: 2H7 scFv IgAH IgG WTCH2CH3(서열 번호 _); 및 레인 6: 2H7 scFv IgG MTH (SSS) WTCH2CH3(서열 번호 _).
도 36에는 플로우 이뮤노사이토플루오리메트리에 의한 (CD20+) CHO 세포에의 2H7 scFv IgAH IgACH2CH3 폴리펩티드(서열 번호 _) 및 2H7 scFv IgAH IgAT4(서열 번호 _)의 결합이 도시되어 있다. 폴리펩티드 공급원은 일시적으로 트랜스펙션된 COS 세포로부터 유래되는 배양 상청액이었다. 2H7 scFv IgAH IgACH2CH3을 코딩하는 서열을 포함하는 플라스미드로 트랜스펙션된 COS 세포는 인간 J 쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드로 공동 트랜스펙션시켰다.
도 37에는 이펙터 세포의 공급원으로 전혈을 사용한 BJAB 표적 세포에 대한 항-CD20 (2H7) scFv Ig 융합 단백질의 항체 의존성 세포 매개 세포 독성 활성이 도시되어 있다. 정제된 2H7 scFv Ig 융합 단백질은 역가를 측정하고 51Cr-표지 BJAB 세포(5 x 104) 및 전혈(1:4의 최종 희석)과 합하였다. 각각의 데이터 포인트는 4개의 샘플 웰에서 측정된 특이적 살해의 평균 퍼센트를 나타낸다.
도 38에는 0.25, 0.125 및 0.625 희석의 전혈에서 51Cr-표지 BJAB 세포에 대한 2H7 scFv Ig 융합 단백질(5 ㎍/ml)의 항체 의존성 세포 매개 세포 독성 활성이 도시되어 있다. 각각의 데이터 포인트는 4개의 샘플 웰에서 측정된 특이적 살해의 평균 퍼센트를 나타낸다.
도 39에는 인간 PBMC가 이펙터 세포의 공급원일 경우(도 39A) 및 인간 전혈이 이펙터 세포의 공급원일 경우(도 39B) 2H7 scFv IgG MTH (SSS) WTCH2CH3(5 ㎍/ml) 및 2H7 scFv IgAH IgACH2CH3(5 ㎍/ml)의 항체 의존성 세포 매개 세포 독성 활 성을 비교한 것이 도시되어 있다.
도 40에는 2H7 scFv IgG 융합 단백질의 면역블롯이 도시되어 있다. COS 세포를 다양한 2H7 scFv Ig 융합 단백질 제작물로 일시적으로 트랜스펙션시켰다. 발현 폴리펩티드를 함유하는 배양 상청액을 비환원 SDS 폴리아크릴아미드 겔에서 분리하고, 이어서 폴리비닐 플루오라이드 막으로 옮겼다. 단백질을 항-인간 IgG (Fc 특이적) 서양 고추냉이 퍼옥시다제 콘쥬게이트를 사용하여 검출하였다. 레인 1-5: 각각 레인 당 40 ng, 20 ng, 10 ng/ 5 ng, 및 2. 5 ng의 정제 2H7 scFv IgG MTH (SSS) WTCH2CH3. 배양 상청액을 레인 6-9에서 분리하였다. 레인 6-9. 레인 6: 2H7 scFv IgG WTH (CCC) WTCH2CH3; 레인 7: 2H7 scFv IgG MTH (CSS) WTCH2CH3; 레인 8: 2H7 scFv IgG MTH (SCS) WTCH2CH3; 및 레인 9: 2H7 scFvHER11 IgG MTH (SSS) WTCH2CH3. 마커 단백질의 분자량(kDal)은 면역블롯의 좌측에 나타내어져 있다.
도 41에는 플로우 이뮤노플루오리메트리에 의한 K1735 흑색종 세포 상에서의 1D8 (항-쥐과 4-1BB) scFv IgG WTH WTCH2CH3-CD80 융합 단백질의 세포 표면 발현이 도시되어 있다(도 41A). scFv 융합 단백질은 피코에리트린-콘쥬게이션된 F(ab')2 염소 항-인간 IgG로 검출하였다. 도 41B에는 야생형 K1735 흑색종 세포(K1735-WT) 또는 1D8 scFv IgG WTH WTCH2CH3-CD80으로 트랜스펙션된 K1735 세포(K1735-1D8)를 이용한 피하 주사로 이식된 나이브(naive) C3H 생쥐에서의 종양의 성장이 도시되어 있다. 종양 성장은 종양의 크기를 측정함으로써 모니터링하였다. 도 41C에는 단일클론 항체를 복강내 주사하여 CD8+, CD4+, 또는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 둘 모두를 제거한 나이브 C3H 생쥐에 있어서 이 동물에 K1735-1D8 세포를 이식하기 이전의 종양 성장의 동력학적 특성이 도시되어 있다.
도 42에는 면역원으로 K1735-1D8을 사용하여 확립한 K1735-WT 종양의 치료법이 도시되어 있다. 생쥐에 K1735-WT 종양을 이식한지 6일 후 하나의 군(5마리의 동물)은 반대측(contralateral side)에서 K1735-1D8 세포(○) 또는 조사된 K1735-WT 세포(■)를 피하 주사하였다. 대조군의 생쥐는 PBS를 수여받았다(□). 처리는 화살표로 나타낸 날에 반복하였다.
도 43에는 2 x 106개의 K1735-WT 세포(■)를 피하 주사한 동물에 있어서의 종양의 성장 및 2 x 106개의 K1735-WT 세포 + 2 x 105개의 K1735-1D8 세포(△)를 피하 주사한 동물에 있어서의 종양의 성장이 도시되어 있다.
도 44에는 항-인간 IgG에 대하여 반복된 라운드의 패닝(panning) 후 단리한 1D8 scFv IgG WTH WTCH2CH3-CD80으로 트랜스펙션시킨 항원104 쥐과 육종 종양 세포의 유세포 분류 분석이 도시되어 있다. 1D8 scFv IgG WTH WTCH2CH3-CD80을 발현하는 트랜스펙션된 세포는 플루오로이소티오시아네이트(FITC)-콘쥬게이션된 염소 항-인간 IgG(흑색으로 도시됨)로 검출하였다. 미트랜스펙션 세포는 회색으로 도시되어 있다.
도 45에는 10% SDS-PAGE 겔에서의 다양한 2H7 scFv Ig 융합 단백질의 이동이 도시되어 있다. 2H7은 항-CD20 scFv이며 40.2.220은 항-CD40 scFv이었다. 레인 1: Bio-Rad의 예비 염색된 분자량 표준물; 레인 2: 항-CD20 scFv IgG MTH (SSS) MTCH2WTCH3; 레인 3: 항-CD20 scFv IgG MTH (SSS) WTCH2CH3; 레인 4: 2H7 scFv IgAH IgG WTCH2CH3; 레인 5: 항-CD20-항-CD40 scFv IgG MTH (SSS) MTCH2WTCH3; 레인 6: 리툭시마브; 레인 7: Novex Multimark(등록상표) 분자량 표준물.
도 46에는 돌연변이 CH2 도메인 또는 야생형 CH2 도메인을 포함하는 2H7 Ig 융합 단백질의 항체 의존성 세포 매개 세포 독성 분석에서 측정된 이펙터 기능이 도시되어 있다. 2H7 scFv IgG MTH (SSS) MTCH2WTCH3(마름모)에 의한 인간 PBMC 이펙터 세포의 존재 하에서의 BJAB 표적 세포의 특이적 살해 퍼센트를 2H7 scFv IgG MTH (SSS) WTCH2CH3(정사각형) 및 2H7 scFv IgAH IgG WTCH2CH3(삼각형)과 리툭시마브(원)와 비교하였다.
도 47에는 플로우 이뮤노사이토플루오리메트리를 사용하여 선형 형광성 동등치(linear fluorecent equivalent, LFE)를 측정함으로써 Reh 세포(도 47A) 및 T51 임파구양 세포(도 47B) 상에서의 항-인간 CD3 scFv IgG WTH WTCH2CH3-CD80(서열 번호 _) 융합 단백질의 세포 표면 발현이 도시되어 있다.
도 48에는 미트랜스펙션 Reh 및 T51 세포의 특이적 살해 퍼센트와, 인간 CD80 막통과 및 세포질 꼬리 도메인에 융합된 인간 IgG1 야생형 힌지부-CH2-CH3에 융합된 인간 CD3에 특이적인 scFv 항체 (항-인간 CD3 scFv IgG WTH WTCH2CH3-CD80(서열 번호 _))을 코딩하는 제작물로 트랜스펙션된 Reh 세포(Reh 항-hCD3)(도 48A) 및 T51 세포(T51 항-hCD3)(도 48B)의 특이적 살해 퍼센트가 도시되어 있다. 인간 PBMC(이펙터 세포)는 지시된 비로 BJAB 표적 세포와 합하였다.
도 49에는 항-쥐과 CD137 (4-1BB) 단일클론 항체인 5B9, 및 5B9 scFv IgG 융합 단백질(5B9 scFv IgG MTH (SSS) WTCH2CH3(서열 번호 _)의 자극된 인간 PBMC에의 결합이 도시되어 있다. 5B9 scFv IgG 융합 단백질의 결합은 FITC 콘쥬게이션된 염소 항-인간 IgG를 사용하여 플로우 이뮤노사이토플루오리메트리로 검출하였다. 5B9 단일클론 항체의 결합은 FITC 콘쥬게이션된 염소 항-생쥐 IgG로 검출하였다.
도 50에는 CHO 세포주에서의 2H7 LVH11S scFv WCH2 WCH3("CytoxB scFv Ig"; 서열 번호 _)의 발현에 대한 LVH11S 돌연변이의 영향이 도시되어 있다.
도 51에는 CHO 세포에 있어서 일시적으로 트랜스펙션시 2H7 LVH11S scFv WCH2 WCH3(서열 번호 _)의 발현을 조사하는 반정량적 SDS-PAGE 분석이 도시되어 있다. 레인 2-5는 다양한 양의 2H7 LVH11S scFv WCH2 WCH3이다. 레인 6-10은 2H7 LVH11S scFv WCH2 WCH3을 발현하는 5개의 상이한 클론으로부터 유래되는 10㎕ 샘플이다.
도 52에는 G28-1 LVH11S scFv Ig 제작물(서열 번호 _)과 G28-1 야생형 scFv Ig 결합 도메인 융합 단백질 제작물(서열 번호 _) 사이의 결합능에서의 차이가 도시되어 있는데, 상기 제작물 둘 모두는 일시적으로 트랜스펙션된 COS 세포로부터 수득된다. Ramos 세포에의 결합은 유세포 분석법을 사용하여 측정하였다. 데이터는 VH11S 단백질의 CD37+ Ramos 세포에의 결합이 유의하게 증가한다는 것을 예시한다.
도 53에는 COS에 있어서 G28-1 야생형 scFv Ig 제작물에 비하여 G28-1 LVH11S scFv Ig 제작물(서열 번호 _)의 발현 수준이 증가됨이 도시되어 있다. 단백질 수준은 면역블롯 분석법을 사용하여 비교하였다. 둘 모두의 면역블롯 겔에서 레 인 1-4에서 본 발명의 정제된 G28-1 scFv Ig (SSS-S) H WCH2 WCH3 제작물의 양을 정량화하였다. 첫번째 면역블롯의 레인 5-9는 각각 G28-1 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3으로 트랜스펙션된 5개의 상이한 클론을 나타내며, 반면 두번째 면역블롯의 레인 5-9는 G28-1 LVH11S scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3으로 트랜스펙션된 5개의 상이한 클론을 나타낸다. 면역블롯은 LVH11S 형태가 G28-1 scFv Ig 제작물이 매우 높은 수준으로 발현되게 한다는 것을 예시한다.
도 54에는 유세포 분석법에 의해 CD20 발현 CHO 세포(CD20+ CHO)에 힌지부가 변경된 2H7 scFv Ig 유도체(서열 번호 _,__,__,__,__,__,__,__)가 결합하는 것이 도시되어 있으며, 도 54는 이러한 변경된 연결 영역의 힌지부의 제작물((SSS-S), (CSS-S), (SCS-S) 및 (CSC-S) 힌지 영역을 포함)이 CD20에의 결합 기능을 유지한다는 것을 나타낸다.
도 55에는 Bjab 표적에 대한 다양한 제작물의 항체 의존성 세포 매개 세포 독성의 매개 능력이 도시되어 있다: (A) (CSS-S), (SCS-S), (CSC-S), 및 (SSS-S) 힌지부를 포함하는 연결 영역을 포함하는 본 발명의 2H7 scFv Ig 제작물(서열 번호 _,__,__,__,__,__,__,__) 및 (B) 다양한 연결 영역 및 꼬리 영역을 갖는 본 발명의 2H7 scFv 제작물(서열 번호 _,__,__,__,__,__). 특이적 살해 퍼센트는 세제에 의해 유도되는 총 살해율과 비교한다. 대조는 이펙터가 첨가되고 PBMC 이펙터에 결합하지 않는 IgA-유래 꼬리 영역 및 IgA 힌지부 연결 영역을 포함하는 2H7을 포함하는 표적 세포에서 자연 살해형이다.
도 56에는 다양한 힌지 영역(예를 들어 (CSC-S), (SSS-S), (SCS-S), 및 (CSS-S))을 갖는 연결 영역을 포함하는 본 발명의 다양한 2H7 scFv Ig 제작물(서열 번호 _,__,__,__,__,__)의 Ramos 세포에서의 보체 활성 매개 능력이 도시되어 있다. 특이적 살해 퍼센트는 단지 보체만의 대조에 대하여 측정하며, 100% 살해율은 세포의 세제에의 노출에 의해 측정하였다.
도 57에는 이뮤노사이토플루오리메트리를 사용하여 상이한 꼬리 영역을 포함하는 본 발명의 2H7 scFv Ig 제작물(서열 번호 _,__,__)이 CD20+ CHO에 결합하는 것이 도시되어 있다. 상이한 단백질은 항-IgG, 항-IgA, 및 항-IgE에 콘쥬게이션된 FITC를 사용하여 검출하였다.
도 58A에는 유세포 분석법으로 CD20+ CHO 세포에서 소수성 전하 유도 크로마토그래피(HCIC)를 사용하여 정제하고 상이한 pH인 4.0 및 3.5에서 용출시킨 2H7 VH L11S scFv IgECH2CH3CH4의 결합이 도시되어 있는데, 이것에 의하면 pH 4.0 또는 3.5에서 용출시키는지에 상관없이 단백질이 CD20에 결합함이 나타났다. 도 58B는 Bjab 표적 세포에서 본 발명의 상기 2H7 VH L11S scFv IgE 제작물이 예를 들어 ADCC를 매개하는 능력을 도시하는 데이터 그래프이다.
도 59에는 유세포 분석법에 의한 G28-1 VH L11S mIgECH2CH3CH4(서열 번호 _)의 (A) Bjab 및 Ramos 표적 세포 및 (B) CD20+ CHO 세포에의 결합능이 도시되어 있다.
도 60에는 본 발명의 다양한 단백질 제작물 (A) 2H7 scFv (SSS-S) H (P238S) CH2 WCH3(서열 번호 _) (B) 2H7 scFv (CSS-S) H WCH2 WCH3,(서열 번호 _) (C) 2H7 scFv (SCS-S) H WCH2 WCH3,(서열 번호 _) 및 (D) 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 (Y407A) CH3(서열 번호 _)의 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 프로필이 도시되어 있는데, 이것에 의하면 제작물 A는 100 kD 및 75 kD의 외관상의 분자량 형태를 가지며, 제작물 B, C 및 D에서 보여지는 바와 같이 소정의 변화의 도입에 의해 주된 75 kD의 분자량 형태가 수득된다는 것이 나타났다.
도 61에는 본 발명의 다양한 단백질 제작물 (A) 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3,(서열 번호 _) (B) 2H7 scFv (CSC- S) H WCH2 WCH3,(서열 번호 _) (C) 2H7 scFv (CCC-P)H WCH2 WCH3,(서열 번호 _) 및 (D) 2H7 scFv IgAH WCH2 WCH3(서열 번호 _)의 HPLC 프로필이 도시되어 있는데, 이것에 의하면 제작물 A는 100 kD 및 75 kD의 외관상의 분자량 형태를 가지며, 제작물 B 및 C에서 보여지는 바와 같이 소정의 변화의 도입에 의해 주된 75 kD의 분자량 형태가 수득되고, 반면 제작물 D(IgA 꼬리 영역을 가짐)는 150 kD의 외관상의 분자량을 가진다는 것이 나타났다. 실시예 40을 참고한다.
도 62에는 본 발명의 여러 단백질 제작물 (A) 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3,(서열 번호 _) (B) 2H7 scFv (SCS- S) H WCH2 WCH3,(서열 번호 _) (C) 2H7 scFv IgA 3TCH2 WCH3,(서열 번호 _) 및 (D) 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 (F405A Y407A) CH3(서열 번호 _)의 HPLC 프로필이 도시되어 있는데, 이것에 의하면 제작물 A는 100 kD 및 75 kD에서의 외관상 분자량을 갖는 2가지 형태를 가지며, 제작물 B는 75 kD의 외관상 분자량을 갖는 주된 형태를 갖는 반면, T4 돌연변이를 갖는 제작물 C는 대략 600 kD의 외관상 분자량을 갖는 3종의 형태를 생성하고 CH3 영역에 서 이중 점 돌연변이를 갖는 제작물 D는 44 kD 미만의 외관상 분자량을 갖는 주된 형태를 생성한다는 것이 나타났다. 본원에서 T4 돌연변이는 CH3 영역으로부터의 4개의 아미노산의 절단을 나타낸다. 실시예 40을 참고한다.
도 63에서는 유세포 분석법에 의한, CH3 영역에 F405A 및 Y407A 변경이 있거나 없는 2H7 VH L11S scFv Ig 제작물(서열 번호 _, __)에 의한 CD20+ CHO 세포에의 결합에 대한 영향이 비교되어 있는데, 이것에 의하면 상기 이중 아미노산 변화에서 결합능이 손실된다는 것이 나타났다. 실시예 41을 참고한다.
도 64에는 유세포 분석법에 의한 FITC 콘쥬게이션된 2H7 VH L11S scFv Ig 유도체(서열 번호 _, __, __)의 CH20+ CHO 세포에의 결합능이 도시되어 있는데, 이것에 의하면 이 제작물은 형광성 마커에 콘쥬게이션될 경우 결합능이 손실되지 않는다. 실시예 41을 참고한다.
도 65에는 비환원 SDS-PAGE 분석으로 본 발명의 다양한 정제된 2H7 VH L11S scFv Ig 제작물(서열 번호 _,__,__,__,__,__) 10 ㎍(레인 당)을 조사하는 것이 도시되어 있는데, 이것에 의하면 레인 1의 표준 분자량 마커를 참조로 한 각각의 제작물에 있어서의 외관상 분자량이 나타났다. 실시예 41을 참고한다.
도 66에서는 4개의 상이한 인간 IgG 영역, hIgG1, hIgG2, hIgG3, hIgG4, hIgG4, 및 하나의 쥐 영역 rIgG2b의 CH2 도메인 서열이 비교되어 있다. ADCC 및 CDC에 영향을 주는 점 돌연변이가 화살표로 나타내어져 있다. 실시예 52를 참고한다.
도 67에는 CHO 및 일시적으로 트랜스펙션된 Lec 13 CHO 세포에 있어서 ADCC를 매개하는 다양한 2H7 VH L11S scFv Ig 제작물(서열 번호 _,__)의 능력이 도시되어 있는데, 이것에 의하면 Lec 13 CHO 세포에서 발현되는 제작물의 특이적 살해율은 통상적인 CHO 세포에서 발현되는 동일한 제작물에 비하여 20% 증가된다는 것이 나타났다. 실시예 42를 참고한다.
도 68에는 용해성 CD 16 (ED) (SSS-S) H P283S CH2 WCH3(서열 번호 _,__)의 고 친화성 및 저 친화성의 대립유전자의 환원 및 비환원 SDS-PAGE 분석 결과가 도시되어 있다. 실시예 43을 참고한다.
도 69에는 고 친화성 및 저 친화성 CD16 융합 단백질(서열 번호 _,__)의 2H7 VH L11S scFv (CSC-S) WCH2 WCH3(서열 번호 _) 또는 2H7 VH L11S scFv (SSS-S) WCH2 WCH3(서열 번호 _)에의 상이한 결합능이 도시되어 있으며, 도 69에 의하면 P238S CH2 제작물을 사용하면 고 친화성 및 저 친화성 대립유전자 결합이 손실된다는 것이 나타났다. 실시예 43을 참고한다.
도 70에는 (A) 자가 결부성(self-association)이 제거된 돌연변이된 꼬리를 포함하는 FITC 콘쥬게이션된 CD16 세포외 도메인 Ig 융합 단백질을 사용하여 Fc 수용체 결합에 있어서의 변화를 탐지하기 위하여 사용되는 분석법 및 B) 제작물의 세포 표면 발현을 이용한 포유류 표시(display) 시스템의 다이아그램이 도시되어 있다. 실시예 44를 참고한다.
도 71에는 Bjab 및 Ramos 세포에 있어서 다양한 mAb(서열 번호 _,__,__,__,__,__) 및 본 발명의 scFv Ig 제작물(서열 번호 _,__,__,__,__,__)에 의한 아폽토시스의 유도가 도시되어 있다. 실시예 45를 참고한다.
도 72에는 Ramos 세포에 있어서 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 및 2H7 scFv (SSS-S) H P238CH2 WCH3 제작물이 caspase 3의 활성화에 의해 매개되는 아폽토시스를 유도하는 능력이 도시되어 있다. 그 결과에 의하면 상기 조건 하에서 둘 모두의 제작물이 CD20에 결합하며 아폽토시스를 유도한다는 것이 나타났다.
도 73에는 CD20+ Bjab 표적 세포에 있어서 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 및 2H7 scFv (SSS-S) H P238CH2 WCH3 제작물이 CDC 활성을 매개하는 능력이 도시되어 있다. 그 결과에 의하면 둘 모두의 제작물은 CDC를 매개하는 능력이 있음이 나타났다.
도 74에는 Bjab 표적 세포에 있어서 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 및 2H7 scFv (SSS-S) H P238CH2 WCH3 제작물이 ADCC를 매개하는 능력이 비교되어 있다. 그 결과에 의하면 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 제작물은 매우 효과적이었으며 높은 수준의 특이적 살해를 유도한 반면, 2H7 scFv (SSS-S) H P238CH2 WCH3 제작물은 ADCC의 매개에 있어서 효과적이지 못함이 나타났다.
도 75에는 CD20+ CHO 세포에 있어서 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 및 2H7 scFv (SSS-S) H P238CH2 WCH3 제작물이 용해성 CD16(고 친화성 및 저 친화성 형태)에 결합하는 능력이 비교되어 있다. 그 결과에 의하면 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3은 CD16(둘 모두의 형태)에 결합할 수 있으며, 반면 2H7 scFv (SSS-S) H P238CH2 WCH3은 CD16(어느 한 형태)에 결합할 수 없다는 것이 나타났다.
도 76에는 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 및 2H7 scFv (SSS-S) HP238CH2 WCH3 제작물이 CD64+ U937 세포에 결합하는 능력이 비교되어 있다. 그 결과에 의하면 둘 모두의 제작물은 FcγRI에 대하여 고 친화성을 가지며, P238S 돌연변이는 FcγRIII에의 결합을 선택적으로 감소시킨다는 것이 나타났다.
도 77에는 B 세포 고갈에 대한 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 및 2H7 scFv (SSS-S) H P238CH2 WCH3 제작물의 영향을 측정하기 위한 머카크에서의 생체내 실험 결과가 도시되어 있다. 이 제작물은 1주일 간격으로 투여되며 B 세포는 일반 혈액 검사(complete blood count) 및 2색 (two-color) 유세포 분석법을 사용하여 -7, 0, 1, 3, 7, 8, 10, 14, 28 및 43일에 측정하였다. 그 결과에 의하면 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 제작물은 B 세포를 급속하고 완전하게 고갈시켰는데, 이는 두번째 주사 후 28일까지 지속되었다. 역으로, 2H7 scFv (SSS-S) H P238CH2 WCH3 제작물은 첫번째 2주 후에 B 세포를 약 50%로 서서히 감소시켰지만, B 세포는 이 직후에는 통상적인 수준으로 급속하게 되돌아가기 시작하였다. 이는 CD16 상호 작용에 의해 매개되는 ADCC가 급속하며 지속되는 B 세포 고갈에 필요할 가능성이 있음을 시사한다.
도 78에는 G28-1 VL11S scFv (SSS) H WCH2 WCH3 및 G28-1VL11S scFv (SSC) H WCH2 WCH3 제작물의 SEC 프로필이 도시되어 있다. SSS 힌지부를 포함하는 제작물은 대략 75-100 Kd에서 균일한 단일 피크를 생성하였으며, 반면 SSC 힌지부를 포함하는 제작물은 200 Kd보다 큰 것을 포함하는 보다 작은 형태 및 기타 이종 형태를 생성하였다.
도 79에는 하기의 B 세포 림프종 세포에 있어서 G28-1 VL11S scFv (SSS) H WCH2 WCH3 및 G28-1 VL11S scFv (SSC) H WCH2 WCH3 제작물의 결합 능력이 도시되어 있다: Bjab, Ramos, WIL-2, Namalwa 및 Raji. (a)에서의 결과에 의하면 G28-1 VL11S scFv (SSS) H WCH2 WCH3은 Bjab 및 Ramos 세포에 결합하며, WIL-2 세포에 온화하게 결합하며 Namalwa 및 Raji 세포에 보다 낮은 수준으로 결합한다는 것이 나타났다. (b)에서의 결과에 의하면 G28-1 VL1lS scFv (SSC) H WCH2 WCH3은 Bjab 세포에 결합하며, Ramos 및 WIL-2 세포에 온화하게 결합하며 Namalwa 및 Raji 세포에 보다 낮은 수준으로 결합한다는 것이 나타났다.
도 80에는 G28-1 VL11S scFv (SSS) HWCH2. WCH3 및 G28-1 VL11S scFv (SSC) H WCH2 WCH3 제작물과 함께 하룻밤 인큐베이션한 Ramos 세포에 있어서의 아넥신 및 v-프로피듐 요오다이드 결합이 도시되어 있다. 그 결과에 의하면 둘 모두의 제작물이 아폽토시스를 유도하였지만 (SSC) 힌지부를 포함하는 제작물이 (SSS) 힌지부를 포함하는 제작물보다 더 많은 아폽토시스를 유도한다는 것이 나타났다.
도 81에는 G28-1 VL11S scFv (SSS) H WCH2 WCH3 및 G28-1 VL11S scFv (SSC) H WCH2 WCH3 제작물의 Ramos 세포 증식 억제 능력이 도시되어 있다. 그 결과에 의하면 둘 모두의 제작물이 증식을 억제한다는 것이 나타났다.
도 82에는 Ramos B 세포에 있어서 G28-1 VL11S scFv (SSS) H WCH2 WCH3 및 G28-1 VL11S scFv (SSC) H WCH2 WCH3과 2H7 scFv (CSS) H WCH2 WCH3 제작물이 단독으로 또는 상이한 조합으로 아폽토시스를 유도하는 능력이 도시되어 있다. 이 실험에 예시된 결과에 의하면 둘 모두의 G28-1 제작물이 2H7 제작물보다 효율적임이 나 타났다. 결과에 의하면 G28-1 VL11S scFv (SSS) H WCH2 WCH3 제작물이 G28-1 VL11S scFv (SSC) H WCH2 WCH3 제작물보다 효율적이라는 것도 나타났다. 그러나 아폽토시스의 양은 2H7 및 G28-1 제작물이 조합되어 사용될 경우 가장 컸다.
도 83에는 Ramos B 세포에 있어서 G28-1 VL11S scFv (SSS) H WCH2 WCH3, G28-1 VL11S scFv (SSC) H WCH2 WCH3 및 2H7 scFv (CSS) H WCH2 WCH3 제작물이 CDC를 매개하는 능력이 비교되어 있다. 그 결과에 의하면 모든 제작물이 CDC를 매개한다는 것이 나타났다. 2H7 제작물이 가장 효율적이었으며, 이어서 G28-1 VL11S scFv (SSC) H WCH2 WCH3, 이어서 G28-1 VL11S scFv (SSS) H WCH2 WCH3이 효율적이었다.
도 84에는 Ramos B 세포에 있어서 G28-1 VL11S scFv (SSS) H WCH2 WCH3, G28-1 VL11S scFv (SSC) H WCH2 WCH3 및 2H7 scFv (CSS) H WCH2 WCH3 제작물이 ADCC를 매개하는 능력이 비교되어 있다. 그 결과에 의하면 G28-1 VL11S scFv (SSS) H WCH2 WCH3 및 G28-1 VL11S scFv (SSC) H WCH2 WCH3 제작물이 ADCC를 매개할 수 있었으며, 반면 2H7 scFv (CSS) H WCH2 WCH3 제작물의 ADCC 매개 능력은 보다 낮았지만 천연 살해 수준보다는 훨씬 더 높다는 것이 나타났다.
본 발명은 예를 들어 진단 및 연구 목적을 비롯한 다른 목적 뿐만 아니라 치료제로서도 유용한 신규한 분자에 관한 것이다. 이러한 분자는 예를 들어 항원 결합 또는 기타 결합 기능(들)과, 예를 들어 하나 이상의 이펙터 기능을 가진다. 본 발명은 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질을 포함하는 분자 제작물, 및 관련 조성물과 방법을 포함하는데, 이는 면역치료 및 면역진단 용도와 연구 방법에서 유용하며, 종래 기술의 항원-특이적 화합물 및 폴리펩티드에 비하여 소정의 이점을 제공한다. 융합 단백질을 포함하는 본 발명의 제작물은 바람직하게는 관련 부분에서 하기의 융합되거나 그렇지 않을 경우 연결된 도메인 또는 영역을 포함하는 단일 폴리펩티드 쇄이다: 결합 영역 제작물, 예를 들어 결합 도메인 또는 폴리펩티드, 예를 들어 천연이거나 조작된 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드를 포함하는 연결 영역 제작물, 및 예를 들어 천연이거나 조작된 면역글로불린 중쇄 CH2 불변 영역 폴리펩티드 및 천연이거나 조작된 면역글로불린 중쇄 CH3 불변 영역 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이로 구성되거나, 이로 구성될 수 있는 제작물을 포함하는 꼬리 영역 제작물. 유전자 요법에 특히 유용한 소정 실시 형태에 따르면, 융합 단백질을 포함하는 본 발명의 제작물은 천연 또는 조작 원형질 막 앵커(anchor) 도메인을 더 포함할 수 있다. 소정의 다른 바람직한 실시 형태에 따르면 융합 단백질을 포함하는 본 발명의 제작물은 천연이거나 조작된 면역글로불린 중쇄 CH4 불변 영역 폴리펩티드를 갖는 꼬리 영역을 더 포함할 수 있다. 특히 바람직한 실시 형태에 있어서, 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질을 포함하는 제작물이 포함되는 폴리펩티드 도메인과 같은 결합 영역은 인간 유전자 서열의 산물인 폴리펩티드이거나, 이 폴리펩티드로부터 유래되지만 본 발명은 그렇게 한정될 필요는 없으며 본 발명은 실제 본원에 제공된 바와 같이 유전자 조작 및/또는 돌연변이 폴리펩티드를 포함하여 임의의 천연 또는 인공 공급원으로부터 유래되는 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질을 포함하는 제작물에 관한 것일 수 있다.
본 발명은 부분적으로는 본원에 기술되어 있는 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질을 포함하는 신규한 제작물이 면역학적 활성을 가질 수 있다는 놀라운 관찰 결과에 관한 것이다. 더 구체적으로는 이 단백질은, 본원에 기술되어 있는 바와 같이, 구조가 하기와 같은 이펙터 활성을 촉진할 수 있거나 하기와 같은 활성을 촉진할 것으로 기대되지 않음에도 불구하고 예를 들어 항체 의존성 세포 매개 세포 독성(예를 들어 적절한 조건 하에서 세포 표면 상에서의 항원 결합 이후 적절한 Fc 수용체를 보유하는 세포 독성 이펙터 세포, 예를 들어 FcRγIII를 보유하는 자연 살해 세포의 개입 및 유도) 및/또는 보체 의존성 세포 독성에 있어서의 보체 고정(예를 들어 세포 표면 상에서의 항원 결합 이후 혈액 보체 캐스케이드(cascade)의 구성 요소인 세포용해(cytolytic) 단백질의 모집 및 활성화)를 포함하는 잘 알려진 면역학적 이펙터 활성에 있어서의 참여 능력을 유지한다. ADCC 및 CDC의 개관에 대해서는 예를 들어 문헌[Carter, 2001 Nat. Rev.Canc. 1: 118]; 문헌[Sulica et al., 2001 Int. Rev. Immunol. 20: 371]; 문헌[Maloney et al., 2002 Semin. Oncol. 29: 2; 문헌[Sondel et al., 2001 Hematol Oncol Clin North Am 15 (4): 703-21]; 문헌[Maloney 2001 Anticanc. Drugs 12 Suppl. 2: 1-4]를 참고한다. 대안적인 경로에 의한 보체의 IgA 활성화는 예를 들어 문헌[Schneiderman et al., 1990 J. Immunol. 145: 233.]에 기술되어 있다. 이하에 더욱 상세하게 기술되어 있는 바와 같이 ADCC, 보체 고정, 및 CDC는 예를 들어 면역글로불린 중쇄 영역을 포함하며 본원에 기술되어 있는 구조를 갖는 융합 단백질을 포함하는 제작물, 특히 예를 들어 쇄간 단일이량체성 이황화 결합을 형성하는 능력에 있어서 위협을 받는 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드를 포함하는 면역글로불린 융합 단백질에 있어서의 기대되지 않은 기능이다.
본 발명에 의해 주어지는 다른 이점은 예를 들어 종래 기술의 단일쇄 항체 제작물로 일상적으로 달성되는 것보다 일반적으로 더 큰 상당한 양으로 생성될 수 있는, 결합 도메인-면역글로불린 융합 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 제작물이다. 바람직한 실시 형태에 있어서 결합 도메인-면역글로불린 융합 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 제작물은 포유류 또는 기타 원하는 유용한 발현 시스템에서 재조합적으로 발현되는데, 이는 생체내에서 (예를 들어 생리학적 조건 하에서) 안정한 폴리펩티드를 제공하는 이점을 제공한다. 비제한적 이론에 따르면 이러한 안정성은 부분적으로는 번역후 변형, 구체적으로는 글리코실화로부터 유래될 수 있다. 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질 제작물을 포함하는 본 발명의 제작물의 재조합적 포유류 발현을 통한 제조는 배양 상청액 1 리터 당 50 mg 초과의 단백질의 수준으로 증식 억제(static) 세포 배양에서 달성되었으며 이러한 배양물에서 10-50 mg/리터로 일상적으로 관찰되어, 바람직하게는 10-50 mg/리터 이상이 증식 억제 배양 조건 하에서 제조될 수 있으며, 또한 기술적으로 허용되는 증대(scale-up) 방법, 예를 들어 "유가식(fed batch)" (증식 비억제) 제조법을 사용하여 전적이거나 부분적인 본 발명의 단백질 제작물의 생성 증강이 고려되는데, 여기서 특정 단백질 생성물에 따라 5-500 mg/ℓ 이상, 몇몇 경우에 있어서 0.5-1 gm/ℓ 이상의 수율이 수득된다.
결합 도메인 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 제작물은 예를 들어 생물학적 동족 분자 또는 하나보다 많은 분자의 복합체 또는 그러한 분자의 안정하거나 일시적일 수 있는 어셈블리 또는 집합체(aggregate)를 특이적으로 인식하며 이것에 결합하는 능력을 보유하는 임의의 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 분자는 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 아미노산 또는 그의 유도체; 지질, 지방산 등, 또는 그의 유도체; 탄수화물, 당류 등 또는 그의 유도체; 핵산, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 퓨린, 피리미딘 또는 관련 분자, 또는 그의 유도체 등; 또는 임의의 그의 조합, 예를 들어 당단백질, 당펩티드, 당지질, 리포단백질, 단백지질; 또는 생물학적 샘플에 존재할 수 있는 임의의 기타 생물학적 분자를 포함한다. 생물학적 샘플은 예를 들어 혈액 샘플, 생검 표본, 조직 이식체, 기관 배양물, 생물학적 유체 또는 대상 또는 생물학적 공급원으로부터 유래되는 임의의 기타 조직 또는 세포 또는 기타 제제를 수득함으로써 제공될 수 있다. 대상 또는 생물학적 공급원은 예를 들어 인간 또는 인간외(non-human) 동물, 일차 세포 배양물 또는 염색체 통합 또는 에피좀 재조합 핵산 서열, 불멸화되거나 불멸화가능한 세포주, 체세포 하이브리드 세포주, 분화되거나 분화가능한 세포주, 형질전환된 세포주 등을 포함할 수 있는 유전자 조작된 세포주를 포함하지만 그에 한정되지는 않는 배양 적응된 세포주일 수 있다. 본 발명의 소정의 바람직한 실시 형태에 있어서 대상 또는 생물학적 공급원은 악성 질환, 질병 또는 병 또는 B 세포 질환을 포함하여 질환, 질병 또는 병에 걸린 것으로 의심되거나 그렇게 될 위험성이 있는 것으로 의심될 수 있으며, 이는 소정의 추가의 실시 형태에 있어서 자가면역 질환일 수 있고, 본 발명의 소정의 다른 실시 형태에 있어서 대상 또는 생물학적 공급원은 그러한 질환, 질병 또는 병의 위험성 또는 존재가 없는 것으로 공지되어 있을 수도 있다.
예를 들어 결합 도메인 폴리펩티드를 포함하는 결합 영역은 본원에서 때로 "항원"으로 칭해지지만 본 발명의 개시 내용에 따라 본 발명, 예를 들어 융합 단백질이 결합하거나 특이적으로 결합하는 것이 바람직한 임의의 생물학적 표적 또는 기타 분자를 포함하려는 것인 목적하는 표적 구조체인 생물학적 분자 또는 기타 분자에 있어서의 임의의 자연 발생, 합성, 반합성 및/또는 재조합적 생성 결합 파트너일 수 있다. 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질을 포함하는 본 발명의 제작물은 이들이 본원에 제공되어 있는 항원과 같은 원하는 표적 분자에 원하는 수준으로, 예를 들어 약 104 M-1 이상, 바람직하게는 약 105 M-1 이상, 더 바람직하게는 약 106 M-1 이상, 더욱 더 바람직하게는 약 107 M-1 이상의 Ka로 결합한다면, 특이적 결합을 포함하여 원하는 정도로 결합할 수 있거나 "면역 특이적"인 것으로 정의된다. 약 107 M-1보다 훨씬 더 큰 친화성, 예를 들어 약 107 M-1, 약 108 M-1, 및 약 109 M-1과, 약 1010 M-1 이상의 친화성이 더욱 더 바람직하다. 본 발명에 따른 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질의 친화성은 통상적인 기술, 예를 들어 문헌[Scatchard et al., 1949 Ann. N.Y. Acad. Sci. 51: 660]에 기술되어 있는 것을 이용하여 손쉽게 결정할 수 있다. 목적으로 하는 표적 항원에의 융합 단백질의 결합력의 상기와 같은 결정은 또한 다른 단백질 또는 폴리펩티드와 특이적으로 상호 작용하는 단백질을 동정 및 수득하는 임의의 다수의 공지된 방법, 예를 들어 효모 2-하이브리드(two-hybrid) 스크리닝 시스템, 예를 들어 미국 특허 제5,283,173호 및 미국 특허 제5,468,614호 또는 그 동등물에 기술되어 있는 것을 이용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 제작물의 바람직한 실시 형태, 예를 들어 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질은 예를 들어 하나 이상의 천연이거나 조작된 면역글로불린 가변 영역 폴리펩티드, 예를 들어 천연이거나 조작된 중쇄 및/또는 천연이거나 조작된 경쇄 V-영역의 전부 또는 일부 또는 단편을 포함할 수 있는 결합 영역 또는 결합 도메인을 포함하되, 단, 이는 항원 또는 목적으로 하는 다른 원하는 표적 구조체에 원하는 수준의 결합력 및 선택성으로 결합하거나 특이적으로 결합할 수 있다. 다른 바람직한 실시 형태에 있어서 결합 영역 또는 결합 도메인은 예를 들어 하나 이상의 천연이거나 조작된 면역글로불린 경쇄 V-영역의 전부 또는 일부 및 하나 이상의 천연이거나 조작된 면역글로불린 중쇄 V-영역의 전부 또는 일부와, 이 V-영역에 융합되거나 그렇지 않을 경우 연결된 링커를 포함할 수 있는 scFv 및 단일쇄 면역글로불린-유래 Fv 생성물을 포함하거나, 본질적으로 이로 구성되거나, 이로 구성되며, 이러한 제작물의 제조 및 시험은 본원에 더욱 더 상세하게 기술되어 있다. 다른 제조 및 시험 방법이 당업계에 잘 알려져 있다.
본원에 기술되어 있는 바와 같이, 그리고 당업계에 공지되어 있는 바와 같이 면역글로불린은 구성원이 고도의 서열 보존성을 나타내는 유전자 패밀리의 산물을 포함한다. 2개 이상의 면역글로불린 또는 면역글로불린 도메인 또는 영역 또는 그의 일부(예를 들어 VH 도메인, VL 도메인, 힌지 영역, CH2 불변 영역, CH3 불변 영역)의 아미노산 서열이 정렬 및 분석될 수 있다. 서로에게 상응하는 서열의 일부는 예를 들어 서열 상동성으로 동정될 수 있다. 서열 상동성의 결정은 임의의 다수의 서열 정렬 및 분석 툴(tool)로 결정할 수 있는데, 이 툴은 당업계의 숙련자에게 잘 알려진 컴퓨터 알고리즘, 예를 들어 Align 또는 BLAST 알고리즘(문헌[Altschul, 1991 J. Mol. Biol. 219: 555-565]; 문헌[Henikoff and Henikoff, 1992 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919])을 포함하며, 상기 알고리즘은 NCBI 웹사이트(http://www/ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST)에서 이용가능하다. 디폴트(default) 파라미터가 사용될 수 있다.
예를 들어 특정 면역글로불린 참조 서열의 일부 및 목적으로 하는 임의의 하나 이상의 추가의 면역글로불린 서열의 일부가 참조 서열과 비교될 수 있다. "상응하는" 서열, 영역, 단편 등은 문헌[Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed. Bethesda, MD: Public Health Service, National Institutes of Health (1991))]에 따른 면역글로불린 아미노산 위치의 넘버링(numbering)에 있어서의 관행에 기초하여 확인할 수 있다. 예를 들어 이 관행에 따르면 목적으로 하는 면역글로불린 서열이 속하는 면역글로불린 패밀리는 이 면역글로불린 패밀리의 특정 넘버링 시스템의 확인을 위하여 가변 영역 폴리펩티드 서열의 불변 아미노산 잔기의 보존에 기초하여 결정되며, 이어서 목적 서열(들)은 이러한 서열(들)을 포함하는 개개의 아미노산에 서열 위치 번호를 할당하기 위하여 정렬될 수 있다. 서열 중 적어도 약 1000개, 더 바람직하게는 약 700-950개, 더 바람직하게는 약 350-700개, 더욱 더 바람직하게는 약 100-350개, 더욱 더 바람직하게는 약 80-100개, 약 70-80개, 약 60-70개, 약 50-60개, 약 40-50개 또는 약 30-40개의 연속 아미노산의 주어진 아미노산 서열에 있어서 바람직하게는 적어도 약 70%, 더 바람직하게는 적어도 약 80%-85% 또는 약 86%-89%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 90%, 약 92%, 약 94%, 약 96%, 약 98% 또는 약 99%의 아미노산이 문헌[Kabat (1991)]에 의해 또는 예를 들어 상기한 것과 같은 서열 정렬 툴을 이용하여 공용 데이터베이스(예를 들어 Genbank, SwissProt 등)로부터 생성할 수 있는 것과 같은 관련 면역글로불린 서열의 유사한 일람표에 개시되어 있는 것과 같은 참조 서열의 상응하는 위치에 위치한 아미노산과 동일하다. 소정의 바람직한 실시 형태에 있어서, 목적으로 하는 면역글로불린 서열 또는 그의 영역, 일부, 유도체 또는 단편의 상응하는 참조 서열에 대한 동일성은 약 95%보다 크며, 소정의 바람직한 실시 형태에 있어서 이러한 목적 서열은 다만 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10의 아미노산 위치에서 상응하는 참조물과 상이할 수 있다.
예를 들어 소정의 실시 형태에 있어서 본 발명은 관련 부분에서 예를 들어 쥐과 VH-유래 서열을 포함하는, 예를 들어 서열 번호 _의 아미노산 위치 9, 10, 11, 12, 108, 110, 111, 및 112 중 하나 이상의 위치에 상응하는 위치(들)의 아미노산에서의 돌연변이, 변경 또는 결실을 포함하는 인간 또는 기타 종의 면역글로불린 중쇄 가변 영역 폴리펩티드를 포함하는, 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질을 포함하는 제작물에 관한 것이다. 예를 들어 위치 11을 포함하는 비교적 제한된 번호의 면역글로불린 VH 서열 위치에서 포유류 종 세포주에 걸쳐서 분석되는 압도적인 대부분의 VH 서열에서 아미노산 보존이 관찰된다(예를 들어 Leu11, Val37, Gly44, Leu45, Trp47; 문헌[Nguyen et al., 1998 J. Mol.Bio 275: 413]). 그러한 다양한 아미노산 잔기들, 및 그에 따른 이들의 측쇄는 가변 도메인(VH)의 표면에 위치한다. 이들은 CH1(예를 들어 Leu11) 및 VL 도메인(예를 들어 Val37, Gly44, Leu45, 및 Trp47)의 잔기와 접촉할 수 있으며, 경쇄의 부재 하에서는 이 단백질의 안정성 및 용해성에 기여할 수 있다(예를 들어 문헌[Chothia et al., 1985 J. Mol. Biol. 186:651]; 문헌[Muyldermans et al., 1994 Prot. Engineer. 7: 1129]; 문헌[Desmyter et al., 1996 Nat. Struct. Biol. 3: 803]; 문헌[Davies et al., 1994 FEBS Lett. 339: 285] 참조). 예를 들어 소정의 실시 형태에 있어서 본 발명은 또한 관련 부분에서 아미노산 위치 12, 80, 81, 82, 83, 105, 106, 107 및 108 중 하나 이상의 위치에 상응하는 위치(들)의 아미노산에서의 돌연변이, 변경 또는 결실을 포함하는 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 폴리펩티드, 또는 다른 종으로부터 유래되는 면역글로불린 경쇄 가변 영역 폴리펩티드를 포함하는, 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질을 포함하는 제작물에 관한 것이다. 예를 들어 또다른 소정의 실시 형태에 있어서 본 발명은 관련 부분에서 (1) 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 폴리펩티드, 또는 아미노산 위치 9, 10, 11, 12, 108, 110, 111, 및 112 중 하나 이상의 위치에 상응하는 위치(들)의 아미노산에서의 돌연변이, 변경 또는 결실을 갖는 상기 중쇄 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 구성되거나, 이로 구성된 다른 종으로부터 유래되는 면역글로불린 경쇄 가변 영역 폴리펩티드, 및 (2) 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 폴리펩티드, 또는 아미노산 위치 12, 80, 81, 82,83, 105, 106, 107 및 108 중 하나 이상의 위치에 상응하는 위치(들)에서의 돌연변이, 변경 또는 결실을 갖는 상기 경쇄 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 구성되거나, 이로 구성된 다른 종으로부터 유래되는 면역글로불린 경쇄 가변 영역 폴리펩티드를 포함하는, 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질을 포함하는 제작물에 관한 것이다.
다른 예로서, 예를 들어 상기에 인용된 것과 같은 면역글로불린 서열 일람표 및 데이터베이스를 참조로 하면, 2개 이상의 면역글로불린 서열의 서로에 대한 관련성은 원래의 동물의 종, 특정 면역글로불린 또는 면역글로불린 영역의 폴리펩티드의 서열의 종류 및 아류(이소타입(isotype))의 확인을 가능하게 하는 방식으로 손쉽게, 그리고 부당한 실험 없이 확립될 수 있다. 천연이거나 조작된 VH 및/또는 VL 및/또는 단일쇄 가변 영역(sFv) 서열 또는 기타 천연이거나 조작된 V 영역 유래의 서열 등을 포함하는 임의의 면역글로불린 가변 영역 폴리펩티드 서열이 결합 영역 또는 결합 도메인으로 사용될 수 있다. 조작된 서열은 예를 들어 중쇄 가변 영역 서열 또는 scFv의 아미노산 위치 9, 10, 11, 12, 108, 110, 111, 및 112 중 하나 이상의 위치에 상응하는 위치(들)의 아미노산에서의 돌연변이, 변경 또는 결실, 및/또는 경쇄 가변 영역 서열 또는 scFv의 아미노산 위치 12, 80, 81, 82, 83, 105, 106, 107 및 108 중 하나 이상의 위치에 상응하는 위치(들)에서의 돌연변이, 변경 또는 결실을 포함하는, 예를 들어 임의의 종, 바람직하게는 인간 또는 생쥐로부터 유래되는 면역글로불린 서열을 포함한다.
바람직한 다양한 실시 형태는 예를 들어 쥐과 또는 기타 설치류 항체와 같은 단일클론 항체, 또는 염소, 토끼, 말, 소, 카메리드(camelid) 또는 트랜스제닉 동물을 포함하는 기타 종과 같은 다른 공급원으로부터 유래되는 단일클론 항체를 포함하는 항체와, 또한 인간 또는 인간화된 항체 또는 단일클론 항체를 포함하는 항체로부터 유래되는, 예를 들어 천연이거나 조작된 면역글로불린 V 영역 폴리펩티드 서열을 포함한다. 비제한적 예는 본원에 참조되고/되거나 이하의 실시예에 더욱 더 상세하게 기술되어 있는 것과 같은 단일클론 항체, 예를 들어 CD20-결합 또는 특이적 쥐과 단일클론 항체(예를 들어 2H7), 1F5 항체가 아닌 다른 CD20-결합 또는 특이적 쥐과 단일클론 항체, 단일클론 항체 L6(탄수화물-한정된 에피토프에 대하여 특이적이며 American Type Culture Collection, Manassas, VA로부터 하이브리도마 HB8677로 입수가능함)과, CD28(예를 들어 항체 2E12), CD40, CD80, CD137(예를 들어 CD137의 쥐과 상동체를 인식하는 단일클론 항체 1D8, 41BB 또는 단일클론 항체 5B9) 및 CD152(CTLA-4)에 결합하거나 이들에 대하여 특이적인 단일클론 항체로부터 유래되는 가변 영역 폴리펩티드 서열을 포함한다.
결합 도메인 폴리펩티드를 포함하는 다른 결합 영역은 비-면역글로불린을 포함하는 본원에 제공되어 있는 항원에 결합하거나 특이적으로 결합하는 능력을 유지하는 임의의 단백질 또는 그의 일부를 포함할 수 있다. 따라서 본 발명에서는 폴리펩티드 리간드, 예를 들어 호르몬, 사이토카인, 케모카인 등; 이러한 폴리펩티드 리간드의 세포 표면 또는 용해성 수용체; 레시틴; 세포내 유착 수용체, 예를 들어 특정 백혈구 인테그린, 셀렉틴, 면역글로불린 유전자 수퍼패밀리 구성원, 세포내 유착 분자(ICAM-1, -2, -3) 등; 조직 적합성 항원 등으로부터 유래되는 결합 영역 또는 결합 도메인 폴리펩티드를 포함하는, 융합 단백질을 포함하는 제작물이 고려된다.
결합 영역의 제조에 있어서 또는 결합 영역으로서 유용하거나, 결합 도메인 폴리펩티드를 제공할 수 있으며 또한 예를 들어 바람직하게는 본 발명의 결합 도메인-Ig 융합 단백질을 포함하는 제작물이 결합하는 표적 분자 또는 항원으로 선택될 수 있는 세포 표면 수용체의 예는 하기 등을 포함한다: HER1 (예를 들어 GenBank 등록 번호 U48722, SEG_HEGFREXS, K03193), HER2 (문헌[Yoshino et al., 1994 J. Immunol. 152:2393]; 문헌[Disis et al., 1994 Canc. Res. 54: 16]; 또한 예를 들어 GenBank 등록 번호 X03363, M17730, SEG_HUMHER20 참고), HER3 (예를 들어 GenBank 등록 번호 U29339, M34309), HER4 (문헌[Plowman et al., 1993 Nature 366: 473]; 또한 예를 들어 GenBank 등록 번호 L07868, T64105 참고), 상피 세포 성장 인자 수용체(EGFR) (예를 들어 GenBank 등록 번호 U48722, SEG_HEGFREXS, KO3193), 혈관 내피 세포 성장 인자 (예를 들어 GenBank 번호 M32977), 혈관 내피 세포 성장 인자 수용체(VEGF) (예를 들어 GenBank 등록 번호 AF022375, 1680143, U48801, X62568), 인슐린 유사 성장 인자-I (예를 들어 GenBank 등록 번호 X00173, X56774, X56773, X06043, 또한 유럽 특허 제GB 2241703호 참고), 인슐린 유사 성장 인자-II (예를 들어 GenBank 등록 번호 X03562, X00910, SEG_HUMGFIA, SEG_HUMGFI2, M17863, M17862), 트랜스페린 수용체 (문헌[Trowbridge and Omary, 1981 Proc. Nat. Acad. USA 78: 3039]; 또한 예를 들어 GenBank 등록 번호 X01060, M11507 참고), 에스트로겐 수용체 (예를 들어 GenBank 등록 번호 M38651, X03635, X99101, U47678, M12674), 프로게스테론 수용체 (예를 들어 GenBank 등록 번호 X51730, X69068, M15716), 여포 자극 호르몬 수용체(FSH-R) (예를 들어 GenBank 등록 번호 Z34260, M65085), 레틴산 수용체 (예를 들어 GenBank 등록 번호 L12060, M60909, X77664, X57280, X07282, X06538), MUC-1 (문헌[Barnes et al., 1989 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86: 7159]; 또한 예를 들어 GenBank 등록 번호 SEG_MUSMUCIO, M65132, M64928를 참고) NY-ESO-1 (예를 들어 GenBank 등록 번호AJ003149, U87459), NA 17-A (예를 들어 유럽 특허 제WO 96/140039호), Melan-A/MART-1 (문헌[Kawakami et al., 1994 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91: 3515]; 또한 GenBank 등록 번호 U06654, U06452 참고), 티로시나제 (문헌[Topalian et al., 1994 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91: 9461]; 또한 GenBank 등록 번호 M26729, SEG_HUMTYRO 참고, 또한 문헌[Weber et al., J Clin. Invest (1998) 102: 1258] 참고), Gp-100 (문헌[Kawakami et al., 1994 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91: 3515]; 또한 예를 들어 GenBank 등록 번호 S73003 참고, 또한 유럽 특허 제EP668350호; 문헌[Adema et al., 1994 J.Biol. Cliem. 269: 20126] 참고), MAGE (문헌[van den Bruggen et al., 1991 Scieface 254: 1643] 참고; 또한 예를 들어 GenBank 등록 번호 U93163, AF064589, U66083, D32077, D32076, D32075, U10694, U10693, U10691, U10690, U10689, U10688, U10687, U10686, U10685, L18877, U10340, U10339, L18920, U03735, M77481 참고), BAGE (예를 들어 GenBank 등록 번호 U19180; 또한 미국 특허 제5,683,886호 및 동 제5,571,711호 참고), GAGE (예를 들어 GenBank 등록 번호 AF055475, AF055474, AF055473, U19147, U19146, U19145, U19144, U19143, U19142), 특히 SSX2 유전자에 의해 코딩되는 HOM-MEL-40 항원을 포함하는 임의의 CTA류의 수용체 (예를 들어 GenBank 등록 번호 X86175, U90842, U90841, X86174), 암태아성 항원 (CEA, 문헌[Gold and Freedman, 1985 J. Exp. Med. 121: 439]; 또한 예를 들어 GenBank 등록 번호 SEG_HUMCEA, M59710, M59255, M29540 참고), 및 PyLT (예를 들어 GenBank 등록 번호 J02289,J02038).
결합 영역 또는 결합 도메인 폴리펩티드 또는 그의 일부의 공급원일 수 있거나, 표적 항원을 포함하는 표적일 수 있는 추가의 세포 표면 수용체는 하기 등을 포함한다: CD2 (예를 들어 GenBank 등록 번호 Y00023, SEG_HUMCD2, M16336, M16445, SEG~MUSCD2, M14362), 4-1BB (CDw137, 문헌[Kwon et al., 1989 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86: 1963]), 4-1BB 리간드 (문헌[Goodwin et al., 1993 Eur. J. Immunol. 23: 2361]; 문헌[Melero et al., 1998 Eur. J. Immunol. 3: 116]), CD5 (예를 들어 GenBank 등록 번호 X78985, X89405), CD10 (예를 들어 GenBank 등록 번호 M81591, X76732) CD27 (예를 들어 GenBank 등록 번호 M63928, L24495, L08096), CD28 (문헌[June et al., 1990 Immunol. Today 11: 211]; 또한 예를 들어 GenBank 등록 번호 J02988, SEG~HUMCD28, M34563 참고), CD152/CTLA-4 (예를 들어 GenBank 등록 번호 L15006, X05719, SEGHUMIGCTL), CD40 (예를 들어 GenBank 등록 번호 M83312, SEG_MUSC040A0, Y10507, X67878, X96710, U15637, L07414), 인터페론-γ (IFN-γ; 예를 들어 문헌[Farrar et al. 1993 Ann. Rev. Immunol. 11: 571] 및 상기 문헌에 인용된 참고 문헌, 문헌[Gray et al. 1982 Nature 295: 503], 문헌[Rinderknecht et al. 1984 J. Biol. Chem. 259: 6790], 문헌[DeGrado et al. 1982 Nature 300:379] 참고), 인터류킨-4 (IL-4; 예를 들어 문헌[53rd Forum in Immunology, 1993 Research in Immunol. 144: 553-643]; 문헌[Banchereau et al., 1994 in The Cytokine Handbook, 2nd ed., A. Thomson, ed., Academic Press, NY, p.99]; 문헌[Keegan et al., 1994 J Leukocyt. Biol.. 55: 272] 및 상기 문헌에 인용된 참고 문헌 참고), 인터류킨-17 (IL-17) (예를 들어 GenBank 등록 번호 U32659, U43088) 및 인터류킨-17 수용체(IL-17R) (예를 들어 GenBank 등록 번호 U31993, U58917). 전술한 것에도 불구하고, 본 발명은 미국 특허 제5,807,734호 또는 미국 특허 제5,795,572호에 개시되어 있는 모든 면역글로불린 융합 단백질을 명확하게 포함하지 않는다.
결합 영역 또는 결합 도메인 폴리펩티드 또는 그의 일부의 공급원일 수 있거나, 표적 항원을 포함하는 표적 또는 결합 부위로 기능할 수 있는 추가의 세포 표면 수용체는 하기 등을 포함한다: CD59 (예를 들어 GenBank 등록 번호SEG_HUMCD590, M95708, M34671), CD48 (예를 들어 GenBank 등록 번호 M59904), CD58/LFA-3 (예를 들어 GenBank 등록 번호 A25933, Y00636, E12817; 또한 일본 특허 제1997075090-A호 참고), CD72 (예를 들어 GenBank 등록 번호 AA311036, S40777, L35772), CD70 (예를 들어 GenBank 등록 번호 Y13636,S69339), CD80/B7.1 (문헌[Freeman et al., 1989 J. Immunol. 43: 2714]; 문헌[Freeman et al., 1991 J. Exp. Med. 174: 625]; 또한 예를 들어 GenBank 등록 번호 U33208, I683379 참고), CD86/B7.2 (문헌[Freeman et al., 1993 J Exp. Med. 178: 2185], 문헌[Boriello et al., 1995 J. Immunol. 155: 5490]; 또한 예를 들어 GenBank 등록 번호 AF099105, SEG_MMB72G, U39466, U04343, SEGHSB725, L25606, L25259 참고), B7-H1/B7-DC (예를 들어 Genbank 등록 번호 NM014143, AF177937, AF317088; 문헌[Dong et al., 2002 Nat. Med. Jun 24 [epub ahead of print], PMID 12091876]; 문헌[Tseng et al., 2001 J. Exp. Med. 193: 839]; 문헌[Tamura et al., 2001 Blood 97: 1809]; 문헌[Dong et al., 1999 Nat. Med. 5: 1365]), CD40 리간드 (예를 들어 GenBank 등록 번호 SEG_HUMCD40L, X67878, X65453, L07414), IL-17 (예를 들어 GenBank 등록 번호 U32659, U43088), CD43 (예를 들어 GenBank 등록 번호 X52075, J04536), ICOS (예를 들어 Genbank 등록 번호 AH011568), CD3 (예를 들어 Genbank 등록 번호 NM-000073 (감마 서브유닛), NM-000733 (입실론 서브유닛), X73617 (델타 서브유닛), CD4 (예를 들어 Genbank 등록 번호 NM000616), CD25 (예를 들어 Genbank 등록 번호 NM000417), CD8 (예를 들어 Genbank 등록 번호 M12828), CD11b (예를 들어 Genbank 등록 번호 J03925), CD14 (예를 들어 Genbank 등록 번호 XM~039364), CD56 (예를 들어 Genbank 등록 번호 U63041), CD69 (예를 들어 Genbank 등록 번호 NM001781) 및 VLA-4(α4β7) (예를 들어 GenBank 등록 번호 L12002, X16983, L20788, U97031, L24913, M68892, M95632). 하기 세포 표면 수용체는 B 세포와 일반적으로 결부된다: CD19 (예를 들어 GenBank 등록 번호 SEG_HUMCD19W0, M84371, SEG_MUSCD19W, M62542), CD20 (예를 들어 GenBank 등록 번호 SEG_HUMCD20, M62541), CD22 (예를 들어 GenBank 등록 번호1680629, Y10210, X59350, U62631, X52782, L16928), CD30 (예를 들어 Genbank 등록 번호 M83554, D86042), CD153 (CD30 리간드, 예를 들어 GenBank 등록 번호 L09753, M83554), CD37 (예를 들어 GenBank 등록 번호 SEG_MMCD37X, X14046, X53517), CD50 (ICAM-3, 예를 들어 GenBank 등록 번호 NM002162), CD106(VCAM-1) (예를 들어 GenBank 등록 번호 X53051, X67783, SEG_MMVCAM1C, 또한 미국 특허 제5,596,090호 참고), CD54 (ICAM-1) (예를 들어 GenBank 등록 번호 X84737, S82847, X06990, J03132, SEG_MUSICAMO), 인터류킨-12 (예를 들어 문헌[Reiter et al, 1993 Crit. Rev. Immunol. 13: 1] 및 상기 문헌에 인용된 참고 문헌 참고), CD134 (OX40, 예를 들어 GenBank 등록 번호 AJ277151), CD137 (41BB, 예를 들어 GenBank 등록 번호 L12964, NM_001561), CD83 (예를 들어 GenBank 등록 번호 AF001036, AL021918), DEC-205 (예를 들어 GenBank 등록 번호 AF011333, U19271).
결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질을 포함하는 본 발명의 제작물은 소정의 특히 바람직한 실시 형태에 따르면 하나 이상의 표적, 예를 들어 표적 항원 또는 면역 이펙터 세포 상에 존재하는 기타 결합 부위에 결합하거나 특이적으로 결합할 수 있는, 예를 들어 결합 도메인 폴리펩티드와 같은 결합 도메인을 포함한다. 비제한적 이론에 따르면, 예를 들어 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질을 포함하는 이러한 제작물은 치료적 정황에 있어서 원하는 면역 이펙터 세포의 기능(들)을 유리하게 모집할 수 있는데, 여기서, 상이한 특수 면역 기능을 갖는 면역 이펙터 세포는 결합 도메인 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 제작물이 특이적으로 결합할 수 있는 본원에 기술된 다수의 항원을 포함하는 매우 다양한 세포 표면 항원의 차별적 발현을 기초로 하여 서로로부터 확인 또는 구별될 수 있다는 것이 잘 알려져 있다. 본 발명에서 알 수 있듯이 면역 이펙터 세포는 면역계 기능의 구성 요소인 활성을 직접 매개할 수 있는 임의의 세포를 포함하는데, 이 세포는 그러한 능력을 자연적으로 또는 유전자 조작의 결과로서 갖는 세포를 포함한다.
소정 실시 형태에 있어서 면역 이펙터 세포는 면역글로불린 또는 기타 펩티드 결합 분자의 세포 표면 수용체, 예를 들어 면역글로불린 불변 영역의 수용체를 포함하며, 이는 "Fc 수용체" ("FcR")로 보통 칭해지는 수용체류를 포함한다. 한정된 서브세트의 면역글로불린 중쇄 이소타입과 상호 작용하는 특정 능력을 갖거나 Fc 도메인과 다양한 친화성으로 상호 작용하고/하거나 소정 조건 하에서 한정된 서브세트의 면역 이펙터 세포 상에서 발현될 수 있는 FcR을 포함하는 다수의 FcR이 구조적 및/또는 기능적으로 특성화되었으며 당업계에 잘 알려져 있다 (예를 들어 문헌[Kijimoto- Ochichai et al., 2002 Cell Mol. Life Sci. 59: 648]; 문헌[Davis et al., 2002 Curr. Top. Microbiol. Immunol. 266: 85]; 문헌[Pawankar, 2001 Curr. Opin. Allerg. Clin. Immunol. 1: 3]; 문헌[Radaev et al., 2002 Mol. Immunol. 38: 1073]; 문헌[Wurzburg et al., 2002 Mol. Immunol. 38: 1063]; 문헌[Sulica et al., 2001 Int. Rev. Immunol. 20: 371]; 문헌[Underhill et al., 2002 Ann. Rev. Immunol. 20: 825]; 문헌[Coggeshall, 2002 Curr. Dir. Autoinana. 5: 1]; 문헌[Mimura et al., 2001 Adv. Exp. Med. Biol. 495: 49]; 문헌[Baumann et al., 2001 Adv. Exp. Med. Biol. 495: 219]; 문헌[Santoso et al., 2001 Ital. Heart J. 2: 811]; 문헌[Novak et al., 2001 Curr. Opin. Immunol. 13: 721]; 문헌[Fossati et al., 2001 Eur. J Clin. Invest. 31: 821]).
ADCC를 매개할 수 있는 세포가 본 발명에 따른 면역 이펙터 세포의 바람직한 예이다. 다른 바람직한 예는 자연 살해 세포, 종양 침윤 T 림프구 (TIL), 세포 독성 T 림프구, 및 과립구 세포, 예를 들어 알러지 응답 기전을 포함하는 세포를 포함한다. 따라서 면역 이펙터 세포는 골수계 및 림프계 내의 다양한 분화 단계의, 하나 이상의 유형의 기능성 세포 표면 FcR을 발현할 수 있는(그러나 반드시 발현할 필요는 없는) 세포를 포함하는 조혈 세포 기원의 세포, 예를 들어 T 림프구, B 림프구, NK 세포, 단핵구, 대식 세포, 수지상 세포, 호중구, 호염기구, 호산구, 비만 세포, 혈소판, 적혈구, 및 전구세포, 선구세포 (예를 들어 조혈모세포)와, 이러한 세포의 휴지(quiescent), 활성화 및 성숙 형태를 포함하지만 그에 한정되는 것은 아니다. 다른 면역 이펙터 세포는 면역 기능을 매개할 수 있는 비-조혈 세포 기원의 세포, 예를 들어 내피 세포, 각질 세포, 섬유아세포, 파골 세포, 상피 세포 및 기타 세포를 포함할 수 있다. 면역 이펙터 세포는 또한 세포 독성 또는 성장 억제(cytostatic) 사건, 또는 세포내 이입(endocytic), 포식(phagocytic), 또는 피노사이토틱(pinocytotic) 사건을 매개하거나, 아폽토시스 유도를 행하거나, 미생물 감염의 미생물학적 면역 또는 중화를 행하는 세포, 또는 알러지 반응, 염증 반응, 과민 반응 및/또는 자가면역 반응을 매개하는 세포를 포함할 수 있다.
알러지 응답 기전은 당업계에 잘 알려져 있으며 항원(예를 들어 알러겐)-특이적 성분, 예를 들어 면역글로불린(예를 들어 IgE)와, 알러겐-면역글로불린(예를 들어 IgE) 조우에 대한 후유증을 포함하는 매개체 및 세포를 포함한다(예를 들어 문헌[Ott et al., 2000 J. Allerg. Clin. Immunol 106: 429]; 문헌[Barnes, 2000 J Allerg. Clin. Immunol. 106: 5]; 문헌[Togias, 2000 J. Allerg. Clin. Immunol. 105: S599]; 문헌[Akdis et al., 2000 Int. Arch. Allerg. Immunol. 121: 261]; 문헌[Beach, 2000 Occup. Med. 15: 455]). 특히 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질을 포함하며 FcR과 상호 작용하는 본 발명의 제작물에 관해서는, 본 발명의 소정 실시 형태에서 예를 들어 IgE-특이적 FcR 또는 그의 일부를 포함하는 알러지 응답 기전을 유도할 수 있는 것을 포함하는 하나 이상의 IgE-유래 도메인을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 제작물이 고려되는데, IgE-특이적 FcR은 상기에 나타내거나 인용 논문에서 기술 또는 확인된 것을 포함한다. 특정 이론 또는 기전에 의해 제한되고자 함이 없이, 그리고 본원에 개시되어 있는 바와 같이 융합 단백질을 포함하는 본 발명의 제작물은 IgE 중쇄 Fc 도메인 폴리펩티드의 일부, 예를 들어 세포 표면 단백질(예를 들어 원형질막 앵커 도메인을 포함함) 또는 용해성 또는 그렇지 않을 경우 세포에 결합되지 않은 단백질(예를 들어 원형질막 앵커 도메인을 포함하지 않음)로서 제공 또는 발현될 수 있는 천연이거나 조작된 IgE CH3 및 CH4 도메인을 포함할 수 있다. 또한 비제한적 이론에 따르면 알러지 응답 기전의 모집 및 유도(예를 들어 FcR-입실론 발현 면역 이펙터 세포)는 본원에 기술되어 있는 바와 같이 IgE Fc 도메인 또는 그의 일부의 존재(예를 들어 FcR 가교 결합에 의해 알러지 기전을 유발(triggering)할 수 있는 것) 및 결합 영역, 예를 들어 결합 도메인이 결합하거나 특이적으로 결합하는 항체와 같은 표적의 존재 중 어느 하나 또는 이들 둘 모두의 결과로서 일어날 수 있다. 따라서 본 발명에서는 본원에 기술되어 있거나 언급된 것을 포함하여 악성 병 또는 B 세포 질병의 치료와 같은, 이제까지 알려지지 않은 정황에서의 알러지 응답 기전의 유도가 활용된다.
면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드는 인공 펩티드로서, 또는 유전자 조작의 결과로서 자연적으로 나타나며 예를 들어 CH1 및 CH2 영역에서 쇄내 면역글로불린-도메인 이황화 결합을 형성하는 데에 책임이 있는 아미노산 잔기들 사이의 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드에 위치하는 임의의 힌지 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명에서 사용하기 위한 힌지 영역 폴리펩티드는 또한 돌연변이되거나 그렇지 않을 경우 변경된 힌지 영역 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 따라서 예를 들어 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드는 본원에 기술되어 있는 것을 포함하는, 힌지 기능을 갖는 것으로 고전적으로 간주되는 면역글로불린 폴리펩티드 쇄 영역의 일부 또는 단편 (즉, 펩티드 결합체 중의 하나 이상의 아미노산, 일반적으로 약 15-115개의 아미노산, 바람직하게는 약 95-110개, 약 80-94개, 약 60-80개, 또는 약 5-65개의 아미노산, 바람직하게는 약 10-50개, 더 바람직하게는 약 15-35개, 더욱 더 바람직하게는 약 18-32개, 더욱 더 바람직하게는 약 20-30개, 더욱 더 바람직하게는 약 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개 또는 29개의 아미노산)으로부터 유래될 수 있거나 이러한 일부 또는 단편일 수 있지만, 본 발명에서 사용하기 위한 힌지 영역 폴리펩티드는 반드시 그렇게 한정될 필요는 없으며 (당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 다양할 수 있는 특정 도메인에 대한 특정 잔기의 할당에 있어서의 구조적 기준에 따라) IgG, IgA 및 IgD의 경우 CH1 도메인 및/또는 CH2 도메인과 같은 인접 면역글로불린 도메인 (또는 IgE의 경우 CH1 도메인 및/또는 CH3 도메인과 같은 인접 면역글로불린 도메인), 또는 소정의 인공적으로 조작된 면역글로불린 제작물의 경우 면역글로불린 가변 영역 도메인에 위치하는 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.
야생형 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드는 면역글로불린, 예를 들어 인간 면역글로불린의 불변 영역 도메인, CH1 및 CH2 사이 (또는 IgE와 같은 소정 유형의 면역글로불린의 CH1 및 CH3 영역 사이)에 위치하는 임의의 공지되거나 후에 밝혀질 자연 발생 힌지 영역을 포함한다. 하나의 유형의 연결 영역의 제작에서의 사용을 위해서는, 야생형 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드는 바람직하게는 인간 IgG, IgA 또는 IgD 면역글로불린으로부터 유래되는 힌지 영역 (또는 IgE 면역글로불린의 CH2 영역)을 포함하는, 바람직하게는 인간 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드, 더 바람직하게는 예를 들어 본원에 기술되어 있는 야생형 또는 돌연변이 인간 IgG1 이소타입으로부터 유래되는 힌지 영역 폴리펩티드이다.
당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 면역글로불린 아미노산 서열에 있어서의 매우 큰 총체적인 다양성에도 불구하고, 면역글로불린 일차 구조는, 명확하게는 시스테인 잔기의 술프히드릴기에 의해 다른 이용가능한 술프히드릴기와의 이황화 결합 형성 잠재력을 제공하는 시스테인 잔기의 출현과 관련하여 특히 면역글로불린 폴리펩티드 쇄의 일부에서 고도의 서열 보존을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 정황에 있어서 연결 영역으로 사용하기 위한 야생형 면역글로불린 힌지 영역은 하나 이상의 고도로 보존된 (예를 들어 통계학적으로 유의한 방식으로 집단에서 우세함) 시스테인 잔기를 그 특징으로 하는 것을 포함하며, 소정의 바람직한 실시 형태에 있어서 연결 영역은 자연 발생 시스테인의 갯수보다 적은 갯수의 시스테인, 예를 들어 IgG1 및 IgG4 힌지 영역의 경우 0개, 하나 또는 2개의 시스테인 잔기(들)을 포함하며, 그러한 야생형 힌지 영역으로부터 (또는 이를 사용하여) 유래되거나 제작되는 것으로부터 선택될 수 있는 돌연변이 힌지 영역 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다.
연결 영역이 힌지 영역 폴리펩티드이며 힌지 영역 폴리펩티드는 야생형 힌지 영역 서열로부터 (또는 이를 사용하여) 유래되거나 제작되는 돌연변이되거나 조작되거나 그렇지 않을 경우 변경된 인간 IgG1 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드인 소정의 바람직한 실시 형태에 있어서, 야생형 인간 IgG1 힌지 영역 폴리펩티드 서열은, 각각 야생형 힌지 영역의 제1 시스테인, 야생형 힌지 영역의 제2 시스테인 및 야생형 힌지 영역의 제3 시스테인으로 칭해지며 이 폴리펩티드의 N-말단으로부터 C-말단을 향하여 힌지 영역 서열을 따라 진행되는 3개의 비-인접 시스테인 잔기를 포함한다는 것을 알 수 있다. 이는 본원에서 "CCC" 힌지부 (또는 "WTH", 즉, 야생형 힌지부)로 칭해질 수 있다. 돌연변이되거나 조작된 힌지 영역의 예는 "XXX" 힌지부 (또는 예를 들어 자연 발생 시스테인 대신 3개의 아미노산 또는 기타 분자를 포함하는 돌연변이체 또는 조작된 힌지부를 나타내는 "MH-XXX", 예를 들어 자연 발생 시스테인 대신 3개의 세린 잔기를 포함하는 돌연변이체 힌지부를 나타내는 "MH-SSS")로 칭해질 수 있는, 시스테인을 전혀 포함하지 않는 것을 포함한다. "돌연변이체"라는 용어는 상이한 분자(들)가 자연 발생 잔기의 위치에 존재하거나 어떠한 분자도 이 위치에 존재하지 않는다는 사실만을 나타내며 이러한 치환, 변경 또는 결실을 실시하는 임의의 특정 방법을 나타내는 것은 아님을 알 것이다. 따라서 본 발명의 소정 실시 형태에 있어서 연결 영역은 힌지 영역 폴리펩티드이며 힌지 영역 폴리펩티드는 2개의 시스테인 잔기를 포함하고 예를 들어 야생형 힌지 영역의 제1 시스테인은 변화되거나 결실되지 않은 돌연변이된 인간 IgG1 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드이다. 이는 "MH-CXX" 힌지부, 예를 들어 "MH-CSC" 힌지부로 칭해질 수 있는데 이 경우 시스테인 잔기는 세린 잔기로 대체된다. 본 발명의 다른 소정의 실시 형태에 있어서 돌연변이된 인간 IgG1 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드는 다만 하나의 시스테인 잔기를 포함하며 예를 들어 "MH-CSS" 힌지부 또는 "MH-SSC" 힌지부 또는 "MH-CSC" 힌지부를 포함하고 다른 소정의 실시 형태에 있어서는 돌연변이된 인간 IgG1 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드는 예를 들어 "MH-SSS" 힌지부와 같이 시스테인 잔기를 전혀 포함하지 않는다.
결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질을 포함하는 본 발명의 제작물은 미국 특허 제5,892,019호에 개시된 융합 단백질을 명백하게 고려하지 않는다. 미국 특허 제5,892,019호에는 IgG1 힌지 영역의 제1 시스테인 잔기가 변화되거나 결실되었지만 야생형 IgG1 힌지 영역 서열의 제2 및 제3 IgG1 힌지 영역 시스테인 잔기는 보유하는 인간 IgG1 힌지 영역이 언급되어 있다. 상기 특허에는 야생형 IgG1 힌지 영역의 제1 시스테인 잔기가, 상기 특허에 기술된 폴리펩티드의 이량체로의 적당한 어셈블리에서의 제1 시스테인 잔기에 의한 간섭을 방지하기 위하여 대체된다는 것이 명시되어 있다. 상기 특허는 IgG1 힌지 영역의 제2 및 제3 시스테인이, 2개의 중쇄 불변 영역 사이의 쇄간 이황화 결합을 제공하여 이량체 형성을 촉진하여 이 분자가 ADCC 매개 능력과 같은 이펙터 기능을 포함하거나 가지도록 하기 위하여 유지될 것을 필요로 한다.
이와는 반대로, 그리고 본원에 기술되어 있는 바와 같이, 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질을 포함하는 본 발명의 제작물은, 예를 들어 이들 중 다양한 것들이 ADCC, CDC 및/또는 보체 고정을 할 수 있으며, 그렇게 제한되지는 않고, 관련 부분에서 예를 들어 (i) 야생형 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드, 예를 들어 야생형 인간 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드, 예를 들어 인간 IgG1 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드, (ii) 돌연변이되거나 그렇지 않을 경우 변경된 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드, 예를 들어 돌연변이되거나 그렇지 않을 경우 변경된 인간 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드, 예를 들어 3개 이상의 시스테인 잔기를 갖는 야생형 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드 또는 핵산 서열로부터 (또는 이를 사용하여) 유래 또는 제작되거나, 유래되었거나 제작된, 예를 들어 돌연변이되거나 그렇지 않을 경우 변경된 인간 IgG1 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드 (여기서, 돌연변이되거나 그렇지 않을 경우 변경된 인간 IgG1 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드는 2개의 시스테인 잔기를 포함하며, 야생형 힌지 영역의 제1 시스테인은 돌연변이되거나 결실되지 않음), (iii) 돌연변이되거나 그렇지 않을 경우 변경된 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드, 예를 들어 돌연변이되거나 그렇지 않을 경우 변경된 인간 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드, 예를 들어 3개 이상의 시스테인 잔기를 갖는 야생형 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드 또는 핵산 서열로부터 (또는 이를 사용하여) 유래 또는 제작되거나, 유래되었거나 제작된, 예를 들어 돌연변이되거나 그렇지 않을 경우 변경된 인간 IgG1 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드 (여기서, 돌연변이되거나 그렇지 않을 경우 변경된 인간 IgG1 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드는 다만 하나의 시스테인 잔기를 포함함), 또는 (iv) 돌연변이되거나 그렇지 않을 경우 변경된 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드, 예를 들어 돌연변이되거나 그렇지 않을 경우 변경된 인간 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드, 예를 들어 3개 이상의 시스테인 잔기를 갖는 야생형 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드 또는 핵산 서열로부터 (또는 이를 사용하여) 유래 또는 제작되거나, 유래되었거나 제작된, 예를 들어 돌연변이되거나 그렇지 않을 경우 변경된 인간 IgG1 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드 (여기서, 돌연변이되거나 그렇지 않을 경우 변경된 (예를 들어 아미노산 변화 또는 결실에 의해) 인간 IgG1 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드는 시스테인 잔기를 전혀 포함하지 않음)를 포함할 수 있다. 본 발명은 본원에 기술되어 있는, 융합 단백질을 포함하는 본 제작물이, IgG1 힌지 영역의 쇄간 이황화 결합을 통하여 이량체화되는 능력이 하나, 2개 또는 3개의 힌지 영역의 시스테인 잔기의 제거 또는 대체에 의해, 그리고 심지어 예를 들어 IgG1 힌지 영역의 제1 시스테인이 돌연변이되거나 그렇지 않을 경우 변경되거나 결실되지 않은 제작물에 있어서도 제거되거나 위태롭게 된다는 것에도 불구하고 ADCC 및/또는 CDC 및/또는 보체 고정을 매개하는 능력을 보유한다는 것과 결부된 예기치 못한 이점을 제공한다.
연결 영역은 돌연변이되거나 그렇지 않을 경우 변경된 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드를 포함할 수 있으며, 상기 폴리펩티드는 그 자신이 어떠한 종, 면역글로불린 이소타입 또는 종류, 또는 꼬리 영역, 예를 들어 CH2 및 CH3 도메인 (또는 IgE CH3 및 CH4 도메인)을 포함하거나, 본질적으로 이로 구성되거나, 이로 구성된 꼬리 영역의 면역글로불린 아류와는 다른 면역글로불린 아류의 면역글로불린이 그 기원인 힌지 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어 본 발명의 소정의 실시 형태에 있어서, 제작물, 예를 들어 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질은, 야생형 인간 IgA 힌지 영역 폴리펩티드, 또는 본원에 기술되어 있는 바와 같이, 0개 또는 단지 1개 또는 그 이상의 시스테인 잔기 (그러나 야생형의 시스테인 갯수보다는 적음)를 포함하는 돌연변이되거나 그렇지 않을 경우 변경된 인간 IgA 힌지 영역 폴리펩티드, 또는 야생형 인간 IgG 힌지부, 예를 들어 IgG1 힌지 영역 폴리펩티드, 또는 야생형 인간 IgE 힌지-작용 영역, 즉, IgE CH2 영역 폴리펩티드, 또는 본원에 또한 기술되어 있는 바와 같이, 0개, 하나 또는 2개의 시스테인 잔기를 포함하도록 돌연변이되거나 그렇지 않을 경우 변경되거나 돌연변이된, 또는 그렇지 않을 경우 변경된 IgG1 힌지 영역 폴리펩티드와 같은 돌연변이되거나 그렇지 않을 경우 변경된 인간 IgG 힌지부를 포함하거나, 본질적으로 이로 구성되거나, 이로 구성된 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드에 융합되거나 그렇지 않을 경우 연결된 결합 도메인 폴리펩티드와 같은 결합 영역을 포함할 수 있다. 이러한 힌지 영역 폴리펩티드는 상이한 Ig 이소타입 또는 종류, 예를 들어 IgA 또는 IgD 또는 IgG 아류로부터 유래되는 면역글로불린 중쇄 CH2 영역 폴리펩티드 (또는 IgE 아류로부터 유래되는 CH3 영역)을 포함하거나, 본질적으로 이로 구성되거나, 이로 구성된 꼬리 영역에 융합되거나 그렇지 않을 경우 연결될 수 있는데, 소정의 바람직한 실시 형태에 있어서 상기 아류는 IgG1 또는 IgA 또는 IgE 아류이며 소정의 다른 바람직한 실시 형태에 있어서 이는 IgG2, IgG3 또는 IgG4 아류들 중 임의의 하나의 아류일 수 있다.
예를 들어, 그리고 본원에 더욱 더 상세하게 기술되어 있는 바와 같이, 본 발명의 소정의 실시 형태에 있어서 연결 영역은 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드가 되도록 선택될 수 있으며, 상기 힌지 영역 폴리펩티드는 자연적으로 3개의 시스테인을 포함하는 야생형 인간 IgA 힌지 영역으로부터 유래되거나 유래된 것이며, 여기서, 선택된 힌지 영역 폴리펩티드는 완전 및/또는 자연 발생 힌지 영역에 비하여 단지 하나 또는 2개의 시스테인 잔기가 남아있도록 절단되거나 그렇지 않을 경우 변경 또는 치환된다 (예를 들어 서열 번호 35-36). 이와 유사하게, 본 발명의 소정의 다른 실시 형태에 있어서, 제작물은 아미노산 치환 또는 결실에 의해 시스테인 잔기의 갯수가 감소된 돌연변이되거나 그렇지 않을 경우 변경된 힌지 영역 폴리펩티드, 예를 들어 본원에 기술되어 있는 바와 같이 0개, 하나 또는 2개의 시스테인 잔기를 포함하는 돌연변이되거나 그렇지 않을 경우 변경된 IgG1 힌지 영역, 또는 0개의 시스테인 잔기를 포함하는 IgD 힌지 영역을 포함하는 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드에 융합되거나 그렇지 않을 경우 연결된 결합 도메인 폴리펩티드를 포함하는 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질일 수 있다.
이와 같이 돌연변이되거나 그렇지 않을 경우 변경된 힌지 영역 폴리펩티드는 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 야생형 면역글로불린 힌지 영역으로부터 (또는 이를 사용하여) 유래 또는 제작될 수 있다. 소정 실시 형태에 있어서 돌연변이되거나 그렇지 않을 경우 변경된 힌지 영역 폴리펩티드는 0개 또는 단지 하나의 시스테인 잔기를 포함할 수 있는데, 여기서, 돌연변이되거나 그렇지 않을 경우 변경된 힌지 영역 폴리펩티드는 각각 하나 이상 또는 2개 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 야생형 면역글로불린 힌지 영역으로부터 유래되거나 유래된 것이다. 돌연변이되거나 그렇지 않을 경우 변경된 힌지 영역 폴리펩티드에 있어서 야생형 면역글로불린 힌지 영역의 시스테인 잔기는 바람직하게는 결실되거나 이황화 결합을 형성할 수 없는 아미노산으로 치환된다. 본 발명의 일 실시 형태에 있어서 돌연변이되거나 그렇지 않을 경우 변경된 힌지 영역 폴리펩티드는 4종의 인간 IgG 이소타입 아류, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 중 임의의 것을 포함할 수 있는 인간 IgG 야생형 힌지 영역 폴리펩티드로부터 유래되거나 유래된 것이다. 소정의 바람직한 실시 형태에 있어서, 돌연변이되거나 그렇지 않을 경우 변경된 힌지 영역 폴리펩티드는 인간 IgA 또는 IgD 야생형 힌지 영역 폴리펩티드로부터 (또는 이를 사용하여) 유래되거나 유래된 것이다. 예로서, 인간 IgG1 또는 IgA 야생형 힌지 영역 폴리펩티드로부터 유래되거나 유래된 돌연변이되거나 그렇지 않을 경우 변경된 힌지 영역 폴리펩티드는 야생형 면역글로불린 힌지 영역 중의 3개의 시스테인 잔기 중 2개의 잔기에서의 돌연변이, 변경 또는 결실, 또는 3개 모두의 시스테인 잔기에서의 돌연변이, 변경 또는 결실을 포함할 수 있다.
특히 바람직한 본 발명의 실시 형태에 따라 돌연변이 유발 또는 임의의 기타 기술에 의해 제거되거나 변경되며 야생형 면역글로불린 힌지 영역에 존재하는 시스테인 잔기는 쇄간 이황화 결합을 형성하거나 이 결합을 형성할 수 있는 시스테인 잔기를 포함한다. 특정 이론 또는 작용 기전에 한정되고자 함이 없이, 본 발명에서는 쇄간 이황화 가교의 형성에 연루되는 것으로 생각되는 상기와 같은 힌지 영역 시스테인 잔기의 돌연변이, 결실 또는 기타 변경이, 놀랍게도 융합 단백질 또는 기타 제작물이 ADCC 및/또는 CDC를 촉진하고/하거나 보체를 고정시키는 능력을 제거하거나 바람직하지 못하게 위태롭게 하지는 않으면서, 본 발명의 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질이 쇄간 이황화 결합 형성을 통하여 이량체화되는 (또는 보다 고도한 올리고머를 형성하는) 능력을 감소시킨다고 생각된다. 특히 ADCC를 매개하는 Fc 수용체(예를 들어 FcRIII, CD16)는 면역글로불린 Fc 도메인에 대하여 낮은 친화성을 나타내는데, 이는 FcR에 대한 Fc의 기능적 결합이 통상적인 항체의 중쇄의 이량체 구조에 의한 Fc-FcR 복합체의 친화성 안정화, 및/또는 통상적인 항체 Fc 구조에 의한 FcR 집합 및 가교 결합을 필요로 한다는 견해를 지지하는 것이다 (문헌[Sonderman et al., 2000 Nature 406: 267]; 문헌[Radaev et al., 2001 J. Biol. Cllem. 276: 16469]; 문헌[Radaev et al., 2001 J. Biol. Chem. 276: 16478]; 문헌[Koolwijk et al., 1989 J. Immunol. 143: 1656]; 문헌[Kato et al., 2000 Immunol. Today 21: 310]. 따라서 예를 들어 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질을 포함하는 본 발명의 제작물은 예기치 않게도 하나 이상의 면역학적 활성은 유지하면서도 단일쇄 면역글로불린 융합 단백질을 포함하는 단일쇄 제작물과 결부된 이점을 제공한다. 이와 유사하게, 보체를 고정하는 능력은 일반적으로 Fc를 포함하는 것과 같은 중쇄 불변 영역과 관련하여 이량체인 면역글로불린과 결부되며, 반면, 예를 들어 본원에 기술되어 있는 바와 같이 힌지 영역 시스테인 잔기의 대체 또는 결실로 인하여 또는 다른 구조적 변형으로 인하여 쇄간 이황화 결합을 형성하는 능력이 위태롭게 되거나 제거되었을 수 있는, 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질을 포함하는 본 발명의 다양한 제작물은 예기치 않은 보체 고정 능력을 나타낸다.
추가로, 예를 들어 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질을 포함하는 제작물이 하나 이상의 인간 IgE 힌지-작용 영역, 즉, IgE CH2 영역 폴리펩티드, 인간 IgE CH3 불변 영역 폴리펩티드, 및 인간 IgE CH4 불변 영역 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이로 구성되거나, 이로 구성된 꼬리 영역 및 연결 영역을 포함할 수 있는 본 발명의 소정 실시 형태에 따르면, 융합 단백질을 포함하는 본 발명의 제작물은 예기치 않게도 ADCC를 매개하고/하거나 알러지 응답 기전을 유도하는 면역학적 활성을 유지한다.
결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질과 같은 본 발명의 제작물의 소정 실시 형태에 따라 연결 영역으로 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드를 선택하는 것은 임의의 면역글로불린 힌지 영역 서열 그 자체로부터 반드시 유래될 필요는 없는 폴리펩티드 서열을 포함하는 "대안적인 힌지 영역" 폴리펩티드 서열의 사용과 관련될 수 있다. 대신, 대안적인 힌지 영역은, 약 10개 이상의 연속 아미노산 또는 분자, 그리고 소정 실시 형태에 있어서는 서열 번호 _-__의 서열 중 임의의 하나의 서열로부터 선택되는 서열에 존재하는 적어도 약 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21-25, 26-30, 31-50, 51-60, 71-80, 81-90, 또는 91-110개의 아미노산 또는 분자의 아미노산 서열, 또는 기타 분자 서열, 예를 들어 CD2 (예를 들어 Genbank 등록 번호 NM_001767), CD4 (예를 들어 Genbank 등록 번호 NM_000616), CD5 (예를 들어 Genbank 등록 번호 BC027901), CD6 (예를 들어 Genbank 등록 번호 NM_006725), CD7 (예를 들어 Genbank 등록 번호 XM_046782, BC009293, NM006137) 또는 CD8 (예를 들어 Genbank 등록 번호 M12828)와 같은 면역글로불린 유전자 수퍼패밀리 구성원, 또는 기타 Ig 수퍼패밀리 구성원의 쇄내 이황화-생성 면역글로불린 유사 루프 도메인들 사이에 위치하는 영역으로부터 유래되거나 유래된 것인 폴리펩티드 서열을 포함하는 힌지 영역 폴리펩티드를 나타낸다. 비제한적 예로서, 예를 들어 연결 영역으로 사용되는 대안적인 힌지 영역은 본원에 제공되어 있는 바와 같이 글리코실화 부위를 제공할 수 있거나, 융합 단백질의 "인간화" 정도를 향상시키기 위하여 인간 유전자-유래된 폴리펩티드 서열을 제공할 수 있거나, 융합 단백질과 같은 본 발명의 제작물이 다량체 또는 올리고머 또는 집합체 등을 형성하는 능력을 제거하거나 감소시키는 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 본원에 기술된 것을 포함하는, 소정의 대안적인 힌지 영역 폴리펩티드 서열은 실제 면역글로불린 그 자체는 아닌 면역글로불린 유전자 수퍼패밀리 구성원의 폴리펩티드 서열로부터 (또는 이를 사용하여) 유래되거나 제작될 수 있다. 예를 들어, 그리고 비제한적 이론에 따르면, 면역글로불린 유전자 수퍼패밀리 구성원 단백질의 쇄내 이황화-생성된 면역글로불린 루프 도메인 사이에 위치하는 소정 폴리펩티드 서열이 본원에 제공되어 있는 대안적인 힌지 영역 폴리펩티드로서 전적으로 또는 부분적으로 사용될 수 있거나, 이러한 사용을 위하여 더 변형될 수 있다.
상기에서 알 수 있는 바와 같이 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질을 포함하는 본 발명의 제작물은, 비제한적 이론에 따르면, 쇄간 이황화 결합 형성을 통하여 이량체화되는 능력이 위태로워지는 것으로 생각되며, 또한 이론에 따르면, 이 특성은, 전적으로 또는 부분적으로, 융합 단백질 제작물과 같은 제작물의 제작에 포함시키기 위하여 선택되는 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드에 존재하는 시스테인 잔기의 갯수의 감소의 결과물이다. 폴리펩티드가 이량체화하는 상대적인 능력에 대한 측정은 충분히 관련 기술 분야의 지식 이내인데, 여기서, 임의의 갯수의 확립된 방법을 적용하여 단백질 이량체화를 검출할 수 있다 (예를 들어 문헌[Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, 1987 Springer-Verlag, New York] 참고). 예를 들어 분자 크기를 기초로 하여 단백질을 분리하는 생화학적 분리 기술 (예를 들어 겔 전기영동, 겔 여과 크로마토그래피, 분석용 초원심분리 등) 및/또는 술프히드릴-활성제의 도입 ((예를 들어 요오도아세트아미드, N-에틸말레이미드) 또는 이황화 환원제 (예를 들어 2-머캅토에탄올, 디티오트레이톨)의 도입 전후의 단백질의 물리화학적 특성의 비교, 또는 기타 동등한 방법이 모두 폴리펩티드 이량체화 또는 올리고머화의 정도의 결정 또는 이황화 결합의 그러한 잠재적인 4차 구조에의 가능한 기여도의 결정을 위하여 이용될 수 있다. 소정 실시 형태에 있어서, 본 발명은 본원에 제공되어 있는 바와 같이 야생형 인간 면역글로불린 G 힌지 영역 폴리펩티드에 비하여, 감소된 (즉, 예를 들어 적절한 IgG-유래 대조에 비하여 통계학적으로 유의한 방식으로 감소된) 이량체화 능력을 나타내는 제작물, 예를 들어 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질에 관한 것이다. 당기술에 친숙한 이들이라면 특정 융합 단백질이 그러한 감소된 이량체화 능력을 나타내는지를 손쉽게 결정할 수 있다.
예를 들어 면역글로불린 융합 단백질의 제조를 위한 방법 및 조성물은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어 단일 코딩 폴리뉴클레오티드의 산물이지만 본 발명에 따른 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질을 포함하는 제작물은 아닌 재조합 단백질을 보고하고 있는 미국 특허 제5,892,019호를 참고한다.
제작물에 있어서, 예를 들어 인간에서 사용하려는 본 발명의 면역글로불린 융합 단백질에 있어서, 임의의 포함된 Ig 불변 영역은 일반적으로 인간 서열 기원의 것이거나 인간화되어, 잠재적인 항-인간 면역 응답을 최소화하고 적절한 및/또는 원하는 이펙터 기능을 제공한다. 항체 불변 영역을 코딩하는 서열의 조작은 Morrison 및 Oi의 PCT 공보 제WO 89/07142호에서 언급된다. 특히 바람직한 실시 형태에 있어서 꼬리 영역은 CH1 도메인 (IgE의 경우 CH1 및 CH2 도메인)이 결실되거나 결실된 것인 면역글로불린 중쇄 불변 영역 및 결합 도메인의 카르복실 말단으로부터 제조되거나, 결합 도메인이 2개의 면역글로불린 가변 영역 폴리펩티드를 포함하는 경우 두번째 (즉, C-말단에 보다 근접한) 가변 영역은 힌지부 또는 변경된 영역과 같은 하나 이상의 연결 영역을 통하여 CH2의 아미노 말단에 결합된다. 2종의 예시적인 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질의 구조를 도시하는 개략도가 도 11에 도시되어 있다. 특히 바람직한 실시 형태에 있어서, 쇄간 이황화 결합이 전혀 존재하지 않으며 다른 실시 형태에 있어서는 야생형 힌지 영역 폴리펩티드가 대신 존재할 경우 존재하는 결합의 갯수에 비하여 제한된 갯수의 쇄간 이황화 결합이 존재할 수도 있다. 다른 실시 형태에 있어서, 본 발명의 제작물, 예를 들어 융합 단백질은 야생형 인간 IgG 힌지 영역 폴리펩티드에 비하여 이량체화하는 능력이 감소된 돌연변이되거나 그렇지 않을 경우 변경된 힌지 영역 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이로 구성되거나, 이로 구성된다. 이와 같이, 그러한 단일쇄 제작물, 예를 들어 면역글로불린 융합 단백질을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자는 결합 영역, 예를 들어 표적 항원과 같은 표적에 대하여 특이적이거나 그렇지 않을 경우 원하는 결합 친화성 및 선택성을 제공하는 도메인을 가진다.
본 발명은 또한 예를 들어 소정 실시 형태에 있어서 예를 들어 분자 "도메인 교환" 범례에 따라 복수개의 유전자 공급원으로부터 유래되거나 그로부터 제조되는 융합되거나 그렇지 않을 경우 연결된 폴리펩티드 서열 또는 그의 일부를 포함하는 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질을 포함하는 제작물을 고려한다. 당기술에 친숙한 이들이라면 예를 들어 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질과 같은 제작물로의 어셈블리를 위한 그러한 폴리펩티드 서열의 선택이 예를 들어 각각의 그러한 서열의 구조적 및/또는 기능적 특성에 기초하여 각각의 구성 요소의 폴리펩티드 서열의 적절한 일부의 결정을 포함할 수 있음을 알 것이다 (예를 들어 문헌[Carayannopoulos et al., 1996 J. Exp. Med. 183: 1579]; 문헌[Harlow et al., Eds., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (1988)] 참고). 따라서 융합 단백질과 같은 제작물이 포함하거나 이 제작물이 제조되는 구성 요소 폴리펩티드 서열은 온전하거나 전장의 결합 도메인, 면역글로불린, 링커 및/또는 원형질막 앵커 도메인 폴리펩티드 서열, 또는 그의 절단된 버전 또는 변이체, 예를 들어 본원에 제공된 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 이러한 실시 형태 및 관련 실시 형태에 따르면 본 발명의 제작물, 예를 들어 융합 단백질이 포함할 수 있는 임의의 2개 이상의 후보 구성 요소 폴리펩티드는 독립적인 공급원, 예를 들어 상이한 알로타입 (allotype), 이소타입, 아류, 종류, 또는 원래의 종 (예를 들어 제노타입 (xenotype))의 면역글로불린 서열로부터 유래되거나 제조된다. 따라서, 비제한적 예로서, 결합 도메인 폴리펩티드 (또는 그의 구성 폴리펩티드, 예를 들어 하나 이상의 가변 영역 폴리펩티드 및/또는 링커 폴리펩티드), 힌지 영역 폴리펩티드, 면역글로불린 중쇄 CH2 및 CH3 불변 영역 폴리펩티드 및 선택적으로 IgM 또는 IgE 중쇄로부터 수득될 수 있는 면역글로불린 중쇄 CH4 불변 영역 폴리펩티드와, 원형질막 앵커 도메인 폴리펩티드는 모두 예를 들어 특유한 유전자 공급원으로부터 개별적으로 수득되며 본원에 기술되어 있는 방법에 따라 그리고 잘 알려진 기술을 사용하여 키메라 또는 융합 단백질로 조작될 수 있다.
따라서, 본 발명의 제작물, 예를 들어 본 발명의 소정 형태에 따른 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질은 또한 그에 따라 관련 부분에 있어서 야생형 IgA CH3 불변 영역 폴리펩티드이거나, 또는 대안적으로는 J 쇄와 결부될 수 없는 돌연변이되거나 그렇지 않을 경우 변경되거나 치환되거나 절단된 IgA CH3 불변 영역 폴리펩티드이거나, J 쇄와 원하지 않는 정도로 결부되지 않는 면역글로불린 중쇄 CH3 불변 영역 폴리펩티드를 포함할 수 있으며; 바람직하게는 제작물의 꼬리 영역 부분에 사용되는 IgA CH3 불변 영역 폴리펩티드는 인간 기원의 것이거나 인간화된 것이다. 간략한 배경 기술로서, IgA 분자는 J 쇄 폴리펩티드 (예를 들어 Genbank 등록 번호 XM_059628, M12378, M12759; 문헌[Johansen et al., 1999 Eur. J. Immunol. 29: 1701])를 통한 이황화-결합 중합체 (예를 들어 이량체)로의 IgA의 집합 및 막통과 분비 성분 (secretory component, SC; 문헌[Johansen et al., 2000 Sc. J. Immunol. 52: 240]; 또한 예를 들어 문헌[Sorensen et al., 2000 Int. Immunol 12: 19]; 문헌[Yoo et al., 1999 J. Biol. Chem. 274: 33771]; 문헌[Yoo et al., 2002 J. Immunol. Meth. 261: 1]; 문헌[Corthesy, 2002 Trends Biotechnol. 20: 65]; 문헌[Symersky et al., 2000 Mol. Immunol. 37: 133]; 문헌[Crottetet al., 1999 Biochem. J. 341: 299] 참고)으로 공지되어 있으며, 중합체성 면역글로불린의 수용체로 작용하는 다른 단백질과의 그렇게 형성된 복합체의 상호 작용을 포함하는 기전에 의해 분비액 내로 방출되는 것이 공지되어 있다. IgA Fc 도메인과 J 쇄 사이의 쇄간 이황화 결합 형성은 IgA 중쇄 불변 영역 CH3 도메인 폴리펩티드의 일부를 형성하는 18-아미노산의 C-말단 연장체 중의 끝에서 두번째의 시스테인 잔기를 통하여 매개된다 (Yoo et al., 1999; Sorensenet al., 2000). 따라서 본 발명의 제작물, 예를 들어 융합 단백질을 포함하는 제작물의 소정 실시 형태는 J 쇄와 결부될 수 있는 야생형 IgA 중쇄 불변 영역 폴리펩티드 서열의 포함을 고려한다. 그러나 본 발명의 다른 소정의 실시 형태는 J 쇄와 결부될 수 없는 돌연변이되거나 그렇지 않을 경우 변경, 치환 또는 절단된 IgA CH3 불변 영역 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 고려한다. 이러한 실시 형태에 따르면, 예를 들어 IgA CH3 불변 영역 폴리펩티드, 예를 들어 인간 IgA CH3 불변 영역 폴리펩티드의 C-말단으로부터 유래되는 2개 이상의 잔기는 결실되어 본원에 제공되어 있는 절단된 CH3 불변 영역 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 그리고 본원에 더욱 상세하게 기술되어 있는 바와 같이 J 쇄와 결부될 수 없는 돌연변이된 인간 IgA CH3 불변 영역 폴리펩티드는 4 또는 18개의 아미노산의 그러한 C-말단 결실을 포함한다. 그러나 본 발명은, 본 제작물, 예를 들어 융합 단백질이 본원에 제공되어 있는 바와 같이 항원에 특이적으로 결합할 수 있고 하나 이상의 면역학적 활성을 가질 수 있기만 하다면, 그렇게 한정될 필요는 없어서, 돌연변이된 IgA CH3 불변 영역 폴리펩티드가 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21-25, 26-30 또는 그보다 많은 아미노산의 결실을 포함할 수 있다. 대안적으로는 본 발명은 또한 끝에서 두번째의 시스테인의 대체에 의해, 또는 상기 아미노산 잔기의 화학적 변형에 의해, 원하지 않는 수준의 쇄간 이황화 결합 또는 다량체 형성을 방지 또는 억제하는 방식으로 J 쇄와 결부될 수 없는 돌연변이된 IgA CH3 불변 영역 폴리펩티드를 포함하는 꼬리 영역을 갖는 제작물, 예를 들어 융합 단백질을 고려한다. 제작물, 예를 들어 융합 단백질이 J 쇄와 결부될 수 있는지를 결정하는 방법은 당기술에 친숙한 이들에게 공지되어 있으며 본원에 기술되거나 언급되어 있다.
또한 본원에 기술되어 있는 바와 같이, 그리고 당업계에 공지된 절차에 따라, 본 제작물, 예를 들어 융합 단백질은 예를 들어 ADCC 또는 CDC 분석에서 면역학적 활성에 대하여 관례대로 더 시험될 수 있다. 예시적 예로서, 이러한 실시 형태에 따른 제작물, 예를 들어 융합 단백질은 천연이거나 조작된 인간 중쇄 불변 영역 폴리펩티드 서열, 천연이거나 조작된 인간 IgA-유래 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드 서열, 천연이거나 조작된 인간 IgG1 면역글로불린 중쇄 CH2 불변 영역 폴리펩티드 서열, 천연이거나 조작된 인간 IgG2 면역글로불린 중쇄 CH3 불변 영역 폴리펩티드 서열, 및 선택적으로는 천연이거나 조작된 인간 IgE 면역글로불린 중쇄 CH4 불변 영역 폴리펩티드 서열 및/또는 아폽토시스를 신호화할 수 있거나 그렇지 않을 경우 아폽토시스를 촉진할 수 있는 세포질 꼬리 폴리펩티드를 포함하는 천연이거나 조작된 인간 TNF-α 수용체 제1형 (TNFR1) 원형질막 앵커 도메인 폴리펩티드 서열로부터 (또는 이를 사용하여) 유래되거나 제작된 결합 도메인 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 따라서 본 발명은 제작물, 예를 들어 융합 단백질에 존재하는 2개 이상의 폴리펩티드 서열의 유전자 기원이 독립적인 본 발명에 따른 이러한 실시 형태 및 기타 실시 형태를 고려한다.
상기에서 알 수 있는 바와 같이, 소정 실시 형태에 있어서 제작물, 예를 들어 결합 단백질-면역글로불린 융합 단백질은 하나 이상의 천연이거나 조작된 면역글로불린 가변 영역 폴리펩티드를 포함하는데, 상기 가변 영역 폴리펩티드는 천연이거나 조작된 경쇄 또는 천연이거나 조작된 중쇄 가변 영역 폴리펩티드일 수 있으며, 소정 실시 형태에 있어서 융합 단백질은 하나 이상의 그러한 천연이거나 조작된 경쇄 V-영역 및 하나의 그러한 천연이거나 조작된 중쇄 V-영역과 천연이거나 조작된 V-영역들 각각에 융합되거나 그렇지 않을 경우 연결된 하나 이상의 링커 펩티드를 포함한다. 그러한 결합 도메인, 예를 들어 단일쇄 Fv 도메인의 제작은 당업계에 공지되어 있으며 하기의 실시예에 더욱 더 상세하게 기술되어 있고, 예를 들어 본원에 인용된 다양한 문헌에 기술되어 있으며, (예를 들어 결합 영역, 예를 들어 단일쇄 Fv 폴리펩티드를 포함하는 결합 도메인의 생성을 위한) 중쇄-유래 및 경쇄-유래 V 영역 각각에 융합되거나 그렇지 않을 경우 연결될 수 있는 링커 폴리펩티드 및 단일쇄 가변 영역의 선택 및 어셈블리도 당업계에 공지되어 있으며 본원에 기술되어 있다. 예를 들어 미국 특허 제5,869,620호, 동 제4,704,692호 및 동 제4,946,778호를 참고한다. 소정 실시 형태에 있어서 인간외 공급원으로부터 유래되는 면역글로불린 서열 모두 또는 그 일부(들)는 인간화 항체의 생성을 위한 인지된 절차에 따라 "인간화"될 수 있는데, 즉, 인간 면역계가 그러한 단백질을 외래 물질로서 인지하는 정도의 감소를 위하여 인간 Ig 서열이 도입된 면역글로불린 서열일 수 있다 (예를 들어 미국 특허 제5,693,762호; 동 제5,585,089호; 동 제4,816,567호; 동 제5,225,539호; 동 제5,530,101호; 및 상기 특허에 인용된 문헌 참고).
본원에 기술되어 있는 바와 같이 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질을 포함하는 본 발명의 제작물은 소정 실시 형태에 따르면 바람직하게는 글리코실화 부위, 예를 들어 탄수화물 부분, 예를 들어 단당류 또는 올리고당류의 공유 결합에 의한 부착 부위를 포함할 수 있다. 폴리펩티드 글리코실화를 위한 기질을 제공하는 아미노산 서열, 예를 들어 N-(아스파라긴) 결합 글리코실화 부위를 위한 고전적인 Asn-X-Ser/Thr 부위를 포함하는 폴리펩티드 서열, 또는 O-결합 글리코실화를 위한 적합한 기질인 Ser 또는 Thr 잔기를 포함하는 서열, 또는 C-만노실화, 글리피에이션 (glypiation)/글리코실포스파티딜이노시톨 변형 또는 포스포글리케이션 (phosphoglycation)을 기꺼이 따르는 서열을 포함하는 서열의 혼입은 관련 기술의 범주 이내인데, 이들 모두는 당기술에서 확립된 기준에 따라 확인될 수 있다 (예를 들어 문헌[Spiro, 2002 Glybiology 12: 43R]). 특정 이론 또는 기전에 의해 제한되고자 함이 없이, 특정 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질과 같은 글리코실화 제작물은, 동일하거나 고도로 유사한 아미노산 서열을 갖지만 글리코실 부분은 결여된, 융합 단백질을 포함하는 제작물에 비하여, 용해도 개선, 용액 중의 안정성 증강, 생리학적 안정성 증강, 생체내 생체 분포를 포함하는 생체 이용률 개선, 및 프로테아제에 대한 탁월한 내성 (이 모두 통계학적으로 유의한 방식으로) 중 하나 이상과 결부된 속성을 보유하는 것이 유익할 수 있다. 소정의 바람직한 실시 형태에 있어서 본 발명의 제작물, 예를 들어 융합 단백질 제작물은 본원에 제공된 바와 같이 링커에 존재하는 글리코실화 부위를 포함할 수 있으며, 소정의 다른 바람직한 실시 형태에 있어서 본 발명의 제작물, 예를 들어 융합 단백질은 본원에 제공되어 있는 바와 같이 힌지 영역 폴리펩티드 서열과 같은 연결 영역에 존재하는 글리코실화 부위를 포함한다.
본 발명의 소정의 바람직한 실시 형태, 예를 들어 유전자 요법 용도에 유용하거나 표시 시스템 또는 분석에 유용한 것, 예를 들어 스크리닝 분석(라이브러리 표시 시스템 및 라이브러리 스크리닝 분석 포함)에 있어서, 제작물, 예를 들어 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질은 세포 표면에 위치화되도록 숙주 세포에 의해 발현될 수 있는 단백질 또는 당단백질이다. 세포 표면에 위치화되는 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질과 같은 제작물은, 예시적인 것으로서 제한됨이 없이 분비 신호 서열, 리더 서열, 원형질막 앵커 도메인 폴리펩티드 및 막통과 도메인, 예를 들어 소수성 막통과 도메인 (예를 들어 문헌[Heuck et al., 2002 Cell Biochem. Biophys. 36: 89]; 문헌[Sadlish et al., 2002 Biochem J. 364: 777]; 문헌[Phoenix et al., 2002 Mol. Membr. Biol. 19: 1]; Minke et al., 2002 Physiol. Rev. 84: 429]) 또는 글리코실포스파티딜이노시톨 부착 부위 ("글리피에이션" 부위, 예를 들어 문헌[Chatterjee et al., 2001 Cell Mol. Life Sci. 58: 1969]; 문헌[Hooper, 2001 Proteomics 1: 748]; 문헌[Spiro, 2002 Glycobiol. 12: 43R]), 세포 표면 수용체 결합 도메인, 세포외 매트릭스 결합 도메인, 또는 전적으로 또는 부분적으로 세포 표면에 적어도 원하는 일부의 융합 단백질 집단이 위치화되도록 하는 임의의 다른 구조 상의 특징을 포함하여 융합 단백질을 세포 표면으로 인도하는 자연적으로 존재하거나 인공적으로 도입되는 구조 상의 특징에 의해 그렇게 할 수 있다(예를 들어 문헌[Nelson et al. 2001 Trend's Cell Biol. 11: 483]; 문헌[Ammon et al., 2002 Arch. Physiol. Biochem. 110: 137]; 문헌[Kasai et al., 2001 J. Cell Sci. 114: 3115]; 문헌[Watsonet al., 2001 Am. J. Physiol. Cell Physiol. 281: C215]; 문헌[Chatterjee et al., 200 J. Biol. Chem. 275: 24013]). 특히 바람직한 것은 원형질막 이중층의 내부를 형성하는 인지질 지방 아실 꼬리와 에너지 면에서 유리한 상호 작용을 할 수 있는 소수성 영역을 포함하는 막 스패닝 도메인을 일반적으로 포함하는, 막통과 폴리펩티드 도메인을 포함하는 원형질막 앵커 도메인을 포함하는 융합 단백질 제작물이다. 이러한 특징은 당업계의 숙련자에게 공지되어 있으며, 당업계의 숙련자라면 유전자 조작에 의해 본 발명의 발현 제작물 내로 이 특징들을 코딩하는 핵산 서열을 도입하는 방법, 및 생성물의 세포 표면 위치화를 검증하기 위한 그러한 제작물의 일상적인 시험법에 또한 친숙할 것이다.
추가의 소정의 실시 형태에 따르면, 원형질막 앵커 도메인 폴리펩티드는 그러한 막통과 도메인 폴리펩티드를 포함하며 세포질 꼬리 폴리펩티드를 또한 포함하는데, 상기 세포질 꼬리 폴리펩티드는 원형질막의 세포질 면에 접촉하고/하거나 시토졸 또는 기타 세포질 성분과 접촉 상태로 존재하는 폴리펩티드 서열의 영역 또는 일부를 나타낸다. 원형질막 막통과 단백질의 세포내 부분을 포함하는 다수의 세포질 꼬리 폴리펩티드가 공지되어 있으며, 생물학적 신호 전달 (예를 들어 단백질 키나제, 단백질 포스파타제, G-단백질, 시클릭 뉴클레오티드 및 기타 이차 메신저, 이온 채널, 분비 경로의 활성화 또는 억제), 생물학적 활성 매개체 방출, 하나 이상의 세포 골격 성분과의 안정하거나 역동적인 결부, 세포 분화, 세포 활성화, 유사 분열, 세포 증식 억제 (cytostasis), 아폽토시스 등을 포함하는 별개의 기능이 다수의 그러한 폴리펩티드에 있어서 확인되었다 (예를 들어 문헌[Maher et al., 2002 Immunol. Cell Biol. 80: 131]; 문헌[El Far et al., 2002 Biochem. J 365: 329]; 문헌[Teng et al., 2002 Genomic Biol. 2REVIEWS: 3012]; 문헌[Simons et al., 2001 Cell Signal 13: 855]; 문헌[Furie et al., 2001 Thromb. Haemost. 86: 214]; 문헌[Gaffen, 2001 Cytokine 14: 63]; 문헌[Dittel, 2000 Arch. Immmunol. Ther. Exp. (Warsz.) 48: 381]; 문헌[Parnes et al., 2000 Immunol. Rev. 176: 75]; 문헌[Moretta et al., 2000 Semin. Immunol. 12: 129]; 문헌[Ben Ze'ev, 1999 Ann. N. Y. Acad. Sci. 886: 37]; 문헌[Marsters et al., Recent Prog Horm. Res. 54: 225]).
도 70에는 예를 들어 이 실시예에 있어서 세포인 CHO 세포에 의해 발현되는 CD20에 부착되는 2H7 scFv-결합 도메인 제작물에의 플루오레세인-콘쥬게이션된 FcRIII (CD16) 용해성 융합 단백질의 결합이 도시되어 있다. 본 발명의 제작물, 예를 들어 scFv-결합 도메인 제작물에의 CD16 결합은 표적화되거나 부위 특이적인 돌연변이, 치환, 결실 또는 기타 변경을 포함하는, scFv-결합 도메인 제작물을 포함하는 본 발명의 변경된 제작물에의 CD16의 결합에 있어서의 변화를 검출 및/또는 정량화하기 위하여 사용될 수 있는 스크리닝 툴의 일례를 제공한다. CD16 결합 특성에 있어서의 변화에는 예를 들어 CD16 고친화성 단백질 (158V) 또는 CD16 저 친화성 단백질 (158F) 중 어느 하나 또는 이들 둘 모두의 결합에 있어서의 변화가 반영될 수 있다.
이러한 스크리닝 방법의 일례의 개략도가 도 70의 두번째 도면에 다이아그램화되어 있는데, 여기서, scFv-결합 도메인 제작물은 포유류 세포의 세포 표면 상에서 표시된다. 이 실시예의 scFv-결합 도메인 분자는 막통과 도메인 앵커로 기능하는 분자를 통하여 세포 표면 상에서 표시된다. 이 분자는 예를 들어 단일 scFv-결합 도메인 제작물을 나타낼 수 있거나 이러한 분자의 라이브러리로서 포유류 세포 집단 내로 도입될 수 있다. 이어서 변경된 결합 특성을 갖는 트랜스펙션된 세포는 예를 들어 선택 조건의 엄격도의 변경 및 결합 프로브로서 CD16 융합 단백질의 사용에 의해 다른 세포로부터 가려지거나, 분류되거나 그렇지 않을 경우 단리될 수 있다. 예를 들어 CD 16 고 친화성 대립유전자 (158V) 또는 CD16 저 친화성 대립유전자 (158F) 중 어느 하나 또는 이들 둘 모두에 대하여 결합성이 변경된 scFv-Ig 분자를 발현하는 세포를 단리할 수 있다.
이 표시 시스템을 사용하여 예를 들어 랜덤화된 올리고뉴클레오티드로 대체된 CH2 서열의 짧은 스트레치, 또는 예를 들어 합성 아미노산을 포함하여 천연 또는 비천연의 모든 가능한 아미노산의 치환을 포함하는 단일 잔기의 랜덤화를 포함하는 돌연변이되거나 그렇지 않을 경우 변경된 꼬리 영역을 포함하는 본 발명의 제작물의 라이브러리를 생성할 수 있다. 일단 이러한 라이브러리가 제작되면, 이는 적절한 세포, 예를 들어 COS 세포 내로 당업계에 공지된 방법에 의해 트랜스펙션될 수 있다. 이어서 트랜스펙션체는 예를 들어 표지된 CD16 제작물에 결합될 수 있으며, 다수의 알렐로타입 (allelotype)/이소폼 (isoform)에 대한 상대적이거나 원하는 결합 특성에 기초하여 가려지거나 분류될 수 있다. 원하는 세포는 수확될 수 있으며, DNA, 예를 들어 플라스미드 DNA가 단리되고 이어서 예를 들어 박테리아를 형질전환시킬 수 있다. 이러한 공정은 원하는 단일 클론이 포유류 숙주 세포로부터 단리될 때까지 다수회 되풀이하여 반복될 수 있다. 문헌[Seed B and Aruffo A, Pro. Natl Acad Sci USA 1987 84: 3365-3369]; 문헌[Aruffo A and Seed B, Pro. Natl Acad Sci USA 1987 84: 8573-8577]을 참고한다.
이러한 유형의 스크리닝 시스템의 하나의 사용은 예를 들어 꼬리 영역, 또는 다수의 환자 아군에 있어서 scFv-결합 도메인 제작물에 의해 매개되는 이펙터 기능의 개선을 위하여 고 친화성 및 저 친화성 CD16 대립유전자 둘 모두에 동일하게 잘 결합하는 꼬리 영역을 갖는 본 발명의 제작물의 동정 및/또는 단리를 위한 것이다. 꼬리 영역, 또는 다른 Fc 수용체에 대한 결합 특성이 변경된 꼬리 영역을 갖는 본 발명의 제작물은 또한 그러한 표시 시스템, 예를 들어 기술되어 있는 표시 시스템을 사용하여 선발할 수 있다. 단백질을 글리코실화하지 않는 다른 표시 시스템, 예를 들어 박테리오파지 또는 효모를 이용하는 것은 Ig계 꼬리 영역, 또는 FcR 결합 특성이 변경된 Ig계 꼬리 영역을 갖는 본 발명의 제작물의 선발에 있어서는 일반적으로 요망되지 않는다. 예를 들어 대부분의 비-포유류 시스템은 단백질을 글리코실화하지 않는다.
적절한 분자의 제작물 내로의 혼입에 의해, 예를 들어 막통과 도메인 또는 GPI 앵커 신호의 혼입에 의해 포유류 세포의 표면 상에서 발현되는 본 발명의 제작물, 예를 들어 scFv-결합 도메인 제작물의 발현은 또한 예를 들어 본 발명의 제작물, 예를 들어 보다 높은 수준 또는 기타 원하는 수준으로 생성되는 변경된 scFv-결합 도메인 분자의 선발에 유용한 다른 표시 시스템에서 그 유용성을 가진다. 그러한 일 실시 형태에 있어서, 글리코실화 단백질의 생성에 유용한 세포, 예를 들어 포유류 세포, 예를 들어 COS 세포는 세포 표면으로의 발현을 인도하는 플라스미드 형태의 scFv-결합 도메인 제작물의 라이브러리로 트랜스펙션시킨다. 가장 높거나 기타 원하는 수준의 scFv-결합 도메인 분자를 발현하는 COS 세포와 같은 세포는 당업계에 공지된 기술 (예를 들어 가려내기, 살균성 세포 분류, 자성 비드 분리법 등)에 의해 선발하며, DNA, 예를 들어 플라스미드 DNA는 다른 세포, 예를 들어 박테리아의 형질전환을 위하여 단리한다. 1회 이상의 라운드의 선발 후 높은 수준 또는 기타 원하는 수준으로 발현될 수 있는 scFv-결합 도메인 분자를 코딩하는 단일 클론이 단리된다. 이어서 단리된 클론은 변경시켜 막 앵커를 제거하고 적절한 세포 시스템, 예를 들어 포유류 세포 시스템에서 발현시키는데, 여기서, scFv-결합 도메인 제작물은 예를 들어 배양액 내로의 원하는 수준의 분비에 의해 제조된다. 특정 기전 또는 이론에 의해 제한됨이 없이, 이는 신호 펩티드를 위한 세포 표면 당단백질 및 당단백질 분비와 발현을 위한 골지(golgi)를 통한 프로세싱에 대한 일반적인 요건으로부터 생기는 것으로 생각된다. 따라서, 세포 표면 상에서의 발현 수준이 개선된 분자의 선발에 의해 분비 단백질 수준이 개선된 분자를 또한 동정하게 된다.
본 발명의 제작물이 이용되는 이러한 표시 시스템은 또한 제작물 내의 결합 도메인의 친화성 변이체의 스크리닝 및/또는 동정 및/또는 단리에 사용될 수 있다.
예를 들어 특히 바람직한 것은 (1) 예를 들어 VH 영역 서열(scFv 또는 기타 제작물 내의 VH 영역 서열을 포함함)의 아미노산 위치 9, 10, 11, 12, 108, 110, 111, 및 112 중 하나 이상의 위치에 상응하는 위치(들)의 아미노산에서의 돌연변이, 변경 또는 결실을 포함하는, 천연이거나 조작된 VH 및/또는 VL 및/또는 단일쇄 가변 영역 (scFv) 서열을 포함하는 면역글로불린 가변 영역 폴리펩티드 서열, 및/또는 (2) 예를 들어 경쇄 가변 영역 서열(scFv 또는 기타 제작물 내의 VL 영역 서열을 포함함)의 아미노산 위치 12, 80, 81, 82, 83, 105, 106, 107 및 108 중 하나 이상의 위치에 상응하는 위치(들)에서의 돌연변이, 변경 또는 결실을 포함하는, 천연이거나 조작된 VH 및/또는 VL 및/또는 단일쇄 가변 영역 (scFv) 서열을 포함하는 면역글로불린 가변 영역 폴리펩티드 서열을 포함하는 제작물을 포함하거나 사용하는 표시 및/또는 스크리닝 시스템이다. 특히 바람직한 것은 아미노산 위치 11에 상응하는 위치(들)의 아미노산에서의 돌연변이, 변경 또는 결실을 포함하는 조작된 VH 서열을 포함하는 제작물(예를 들어 sFv 또는 scFv-함유 제작물 내에 포함된 면역글로불린-유래 서열 및 기타 서열을 포함하는 하나 이상의 다른 서열과 결부되거나 결부되지 않을 수 있음)을 포함하거나 사용하는 표시 및/또는 스크리닝 시스템이다. VH11 아미노산은, 치환될 경우 본원에 기술되어 있는 다른 아미노산, 또는 원하는 다른 분자로 치환될 수 있다.
예를 들어 다수의 유전자 치료 방법 및 관련된 제작물 전달 기술 중 하나 이상에 의한 것을 포함하는, 본원에 제공되어 있는 악성 병 또는 B 세포 질병(들)의 치료에 있어서 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질을 포함하는 본 발명의 제작물을 사용하는 다른 방법의 정황에 있어서, 본 발명은 제작물, 예를 들어 원형질막 앵커 도메인 폴리펩티드를 포함하는 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질이 세포 표면에서 발현되며 (또는 발현될 수 있으며) 아폽토시스 신호화 폴리펩티드 서열을 포함하는 세포질 꼬리 폴리펩티드를 더 포함할 수 있는 소정 실시 형태도 고려한다. 다수의 아폽토시스 신호화 폴리펩티드 서열이 예를 들어 문헌[When Cells Die: A Comprehensive Evaluation of Apoptosis and Programmed Cell Death (R. A. Lockshin et al., Eds., 1998 John Wiley & Sons, New York]에 개관되어 있는 바와 같이 당업계에 공지되어 있으며, 또한 예를 들어 문헌[Green et al.,1998 Science 281: 1309] 및 상기 문헌에 인용된 참고 문헌; 문헌[Ferreira et al., 2002 Clin. Canc. Res. 8: 2024]; 문헌[Gurumurthy et al., 2001 Cancer Metastas. Rev. 20: 225]; 문헌[Kanduc et al., 2002 Int. J. Oncol. 21: 165]을 참고한다. 일반적으로 아폽토시스 신호화 폴리펩티드 서열은 수용체 살해 도메인 폴리펩티드, 예를 들어 FADD (예를 들어 Genbank 등록 번호 U24231, U43184, AF009616, AF009617, NM_012115), TRADD (예를 들어 Genbank 등록 번호 NM_003789), RAIDD (예를 들어 Genbank 등록 번호 U87229), CD95 (FAS/Apo-l; 예를 들어 Genbank 등록 번호 X89101, NM_003824, AF344850, AF344856), TNF-α-수용체-1 (TNFR1, 예를 들어 Genbank 등록 번호 S63368, AF040257), DR5 (예를 들어 Genbank 등록 번호AF020501, AF016268, AF012535), ITIM 도메인 (예를 들어 Genbank 등록 번호 AF081675, BC015731, NM_006840, NM_006844, NM_006847, XM_017977; 예를 들어 문헌[Billadeau et al., 2002 J Clin.. Invest. 109: 161] 참고), ITAM 도메인 (예를 들어 Genbank 등록 번호 NM_005843, NM_003473, BC030586; 예를 들어 문헌[Billadeau et al., 2002] 참고), 또는 당업계에 공지된 기타 아폽토시스-결부 수용체 살해 도메인 폴리펩티드, 예를 들어 TNFR2 (예를 들어 Genbank 등록 번호 L49431, L49432), 카스파제(caspase)/프로카스파제(procaspase)-3 (예를 들어 Genbank 등록 번호 XM_54686), 카스파제/프로카스파제-8 (예를 들어 AF380342, NM_004208, NM_001228, NM_033355, NM_033356, NM_033357, NM_033358), 카스파제/프로카스파제-2 (예를 들어 Genbank 등록 번호 AF314174, AF314175) 등의 전부 또는 일부를 포함하거나 이로부터 유래 또는 제작된다.
아폽토시스를 겪는 것으로 의심되는 생물학적 샘플 중 세포에 있어서 아폽토시스 상태를 나타내는 형태학적 변화, 투과성 변화 또는 기타 변화를 조사할 수 있다. 예를 들어 예시적인 것으로서, 그리고 제한됨이 없이, 다수의 세포 유형에서의 아폽토시스는 원형질막 수포화(blebbing), 세포 형상 변화, 기질 점착 특성의 손실 또는 예를 들어 광학 현미경 검사법의 사용에 의해 당업계의 숙련자에 의해 손쉽게 검출될 수 있는 기타 형태학적 변화와 같은 형태학적 외양의 변경을 야기할 수 있다. 다른 예로서, 아폽토시스를 겪는 세포는 염색체의 단편화 및 붕해를 나타낼 수 있는데, 이는 현미경 검사에 의해 및/또는 형광 염료를 포함하는 당업계에 공지된 DNA-특이적 또는 염색질-특이적 염료의 사용을 통하여 명백해질 수 있다. 이러한 세포는 또한 긴요한 염료(예를 들어 프로피듐 요오다이드, 트립판 블루)의 사용을 통하여 또는 세포외 환경으로의 락테이트 데히드로게나제 누출의 검출에 의해 손쉽게 검출될 수 있는 바와 같이 원형질막 투과성 특성의 변경을 나타낼 수 있다. 형태학적 기준, 원형질막 투과성 변경, 및 관련 변화로 아폽토시스성 세포를 검출하는 상기 및 기타 수단은 당기술에 친숙한 이들에게는 자명할 것이다.
세포 표면에서 발현되는 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질과 같은 제작물이 막통과 도메인과 아폽토시스 신호화 폴리펩티드를 포함하는 세포질 꼬리를 포함하는 본 발명의 다른 실시 형태에 있어서, 생물학적 샘플 중 세포는 예를 들어 PS-특이적 단백질 아넥신에 의한 외부 소엽체 결합의 측정에 의해 검출될 수 있는, 원형질막의 내부 소엽체에서 외부 소엽체로의 세포막 포스파티딜세린 (PS)의 전좌에 대하여 분석할 수 있다. 문헌[Martin et al.,J. Exp. Med. 182: 1545, 1995]; 문헌[Fadok et al., J. Immunol 148: 2207, 1992]. 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질과 같은 제작물이 세포 표면에서 발현되며 아폽토시스 신호화 폴리펩티드를 갖는 원형질막 앵커 도메인을 포함하는 실시 형태를 포함하며 또한 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질과 같은 제작물이 막 앵커 도메인이 결여되어 있으며 아폽토시스를 유도할 수 있는 용해성 단백질인 실시 형태를 포함하는 본 발명의 또다른 관련 실시 형태에 있어서, 아폽토겐 (apoptogen)에 대한 세포 응답은 카스파제로 공지된 아폽토시스-활성화 프로테아제 패밀리의 임의의 구성원에 있어서의 특이적 프로테아제 활성의 유도에 대한 분석에 의해 결정된다 (예를 들어 문헌[Green et al., 1998 Science 281: 1309] 참고). 당업계의 숙련자라면 예를 들어 특이적으로 인식되는 단백질 기질의 카스파제-매개 절단의 결정에 의해 카스파제 활성을 측정하는 방법에 손쉽게 친숙해질 것이다. 이러한 기질은 예를 들어 폴리-(ADP-리보스) 폴리머라제 (PARP) 또는 기타 자연 발생 또는 합성 펩티드 및 당업계에 공지되어 있는 카스파제에 의해 절단되는 단백질을 포함할 수 있다 (예를 들어 문헌[Ellerby et al., 1997 J. Neurosci. 17: 6165] 참고). 합성 펩티드 Z-Tyr-Val-Ala-Asp-AFC(서열 번호 _;) (여기서, "Z"는 벤조일 카르보닐 부분을 나타내며 AFC는 7-아미노-4-트리플루오로메틸쿠마린을 나타냄) (문헌[Kluck et al., 1997 Science 275: 1132]; 문헌[Nicholson et al., 1995 Nature 376: 37])는 하나의 그러한 기질이다. 기질의 다른 비제한적 예는 핵 단백질, 예를 들어 U1-70 kDa 및 DNA-PKcs를 포함한다 (문헌[Rosen and Casciola-Rosen, 1997 J. Cell. Biochem. 64: 50]; 문헌[Cohen, 1997 Biochem. J. 326: 1]). 세포 아폽토시스는 또한 아폽토시스성 세포의 미토콘드리아로부터 탈출한 시토크롬 c의 측정에 의해 탐지할 수 있다(예를 들어 문헌[Liu et al., Cell 86: 147, 1996]). 그러한 사이토크롬 c 검출은 분광 광도계에 의해, 면역 화학적으로 도는 특정 단백질의 존재를 결정하는 다른 잘 확립된 방법에 의해 수행할 수 있다. 당업계의 숙련자라면 아폽토시스를 정량화하는 다른 적합한 기술이 존재할 수 있음을 손쉽게 알 것이다.
원형질막 앵커 도메인 및/또는 세포질 꼬리 폴리펩티드를 포함하는 제작물 (예를 들어 아폽토시스 신호화 서열을 포함함)을 포함하는, 유전자 요법 용도에 유용한 제작물의 특히 바람직한 실시 형태는 (1) 예를 들어 VH 영역 서열(scFv 또는 기타 제작물 내의 VH 영역 서열을 포함함)의 아미노산 위치 9, 10, 11, 12, 108, 110, 111, 및 112 중 하나 이상의 위치에 상응하는 위치(들)의 아미노산에서의 돌연변이, 변경 또는 결실을 포함하는, 천연이거나 조작된 VH 및/또는 VL 및/또는 단일쇄 가변 영역 (scFv) 서열을 포함하는 면역글로불린 가변 영역 폴리펩티드 서열, 및/또는 (2) 예를 들어 경쇄 가변 영역 서열(scFv 또는 기타 제작물 내의 VL 영역 서열을 포함함)의 아미노산 위치 12, 80, 81, 82, 83, 105, 106, 107 및 108 중 하나 이상의 위치에 상응하는 위치(들)에서의 돌연변이, 변경 또는 결실을 포함하는, 천연이거나 조작된 VH 및/또는 VL 및/또는 단일쇄 가변 영역 (scFv) 서열을 포함하는 면역글로불린 가변 영역 폴리펩티드 서열을 포함하는 제작물이다. 특히 바람직한 것은 아미노산 위치 11에 상응하는 위치(들)의 아미노산에서의 돌연변이, 변경 또는 결실을 포함하는 조작된 VH 서열을 포함하는 제작물(예를 들어 sFv 또는 scFv-함유 제작물 내에 포함된 면역글로불린-유래 서열 및 기타 서열을 포함하는 하나 이상의 다른 서열과 결부되거나 결부되지 않을 수 있음)이다. VH11 아미노산은, 치환될 경우 본원에 기술되어 있는 다른 아미노산, 또는 원하는 다른 분자로 치환될 수 있다.
본원에 제공되어 있는 바와 같이 예를 들어 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질과 같은 제작물이 일단 고안되었으면, 제작물 (여기서, 이것 또는 이것의 관련 부분은 폴리펩티드임)을 코딩하는 DNA를 포함하는 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 부분적으로 또는 전적으로 문헌[Sinha et al., Nucleic Acids Res., 12: 4539-4557 (1984)]에 기술되어 있는 올리고뉴클레오티드 합성법을 통하여 합성하며; 예를 들어 문헌[Innis, Ed., PCR Protocols, Academic Press (1990)] 및 또한 문헌[Better et al. J. Biol. Chem. 267: 16712-16118 (1992)]에 기술되어 있는 바와 같이 PCR을 통하여 어셈블링하고; 예를 들어 문헌[Ausubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1989)] 및 또한 문헌[Robinson et al., Hum. Antibod. Hybridomas, 2: 84-93 (1991)]에 기술되어 있는 표준 절차를 통하여 클로닝 및 발현시키고; 예를 들어 문헌[Harlow et al., Eds., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (1988)] 및 문헌[Munson et al., Anal. Biochem., 107: 220-239 (1980)]에 기술되어 있는 바와 같이 원하는 활성, 예를 들어 표적에의 결합, 또는 특이적 항원 결합 활성에 대하여 시험할 수 있다.
Fv 영역의 단일 폴리펩티드 쇄 결합 분자, 단일쇄 Fv 분자의 제법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어 미국 특허 제4,946,778호를 참고한다. 본 발명에 있어서 본 발명의 제작물에 포함될 수 있는 단일쇄 Fv-유사 분자는 중쇄 또는 경쇄의 첫번째 가변 영역, 이어서 각각 상응하는 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역에 대한 하나 이상의 링커의 코딩에 의해 합성할 수 있다. 두 가변 영역들 사이의 다양한 적절한 링커(들)의 선택은 미국 특허 제4,946,778호 (또한 예를 들어 문헌[Huston et al., 1993 Int. Rev. Immunol. 10:195]을 참고)에 기술되어 있다. 본원에 기술되어 있는 예시적인 링커로는 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3이 있지만 이는 임의의 원하는 길이의 것일 수 있다. 링커를 사용하여 자연적으로 집합되지만 화학적으로는 별개인 중쇄 및 경쇄를 예를 들어 단일 폴리펩티드 쇄의 아미노 말단 항원 결합 부분으로 전환시키는데, 여기서, 이 항원 결합 부분은 2개의 폴리펩티드 쇄로 만들어진 원래의 구조와 유사하거나, 그렇지 않을 경우 표적, 예를 들어 표적 항원에 결합하는 능력을 갖는 구조로 폴딩된다. scFv를 결합 영역으로서, 천연이거나 조작된 면역글로불린 힌지부를 연결 여역으로서, 그리고 하나 이상의 천연이거나 조작된 중쇄 불변 영역을 결합 영역으로서 포함하는 제작물에 있어서, 링커를 코딩하는 서열에 의해 결합된, 천연이거나 조작된 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 원할 경우 천연이거나 조작된 항체 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 결합된다. 불변 영역은, 이량체 또는 기타 다량체 형성 또는 집합화에 유리하지 않은 천연이거나 조작된 불변 영역이 바람직하기는 하지만, 생성된 폴리펩티드가 쇄간 이황화 결합을 형성하여 이량체를 형성하게 하며 원하는 이펙터 기능, 예를 들어 ADCC, CDC를 매개하거나 보체를 고정하는 능력을 포함하는 것일 수 있다. 인간에서 사용하려는 면역글로불린-유사 분자와 같은 본 발명의 제작물에 있어서, 불변 영역 및/또는 원하는 불변 영역 기능(들)을 갖는 포함된 서열은 일반적으로 인간의 서열이거나 실질적으로 인간의 서열이거나 인간화되어 잠재적인 항-인간 면역 응답을 최소화하고 적절하거나 원하는 이펙터 기능을 제공한다. 항체 불변 영역을 코딩하는 서열의 조작은 Morrison 및 Oi의 PCT 공보 제WO 89/07142호에 언급되어 있다. 바람직한 실시 형태에 있어서 CH1 도메인은 천연이거나 조작된 면역글로불린 불변 영역(들) (예를 들어 천연이거나 조작된 CH2 및. 또는 CH3 불변 영역(들), 또는 천연이거나 조작된 CH2 및또는 CH3 및/또는 CH4 불변 영역(들)을 포함하거나, 본질적으로 이로 구성되거나, 이로 구성된 꼬리 영역으로부터 전적으로 또는 부분적으로 결실되며, 결합 영역의 카르복실 말단, 예를 들어 결합 도메인 폴리펩티드, 예를 들어 면역글로불린 가변 영역 폴리펩티드는 연결 영역, 예를 들어 본원에 제공되어 있는 천연이거나 조작된 힌지 영역 폴리펩티드를 통하여 예를 들어 CH2의 아미노 말단에 결합된다.
상기에 기술되어 있는 바와 같이, 본 발명은 본원에 제공되어 있는 바와 같이 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질을 포함하는 본 발명의 제작물의 발현을 인도할 수 있는 재조합 발현 제작물을 제공한다. 본원에 언급된 다양한 아미노산 서열에 나타나는 아미노산은 잘 알려진 3-문자 또는 1-문자 약어에 따라 확인된다. 본원에 언급된 다양한 DNA 서열 또는 그의 단편에 나타나는 뉴클레오티드는 당업계에서 일상적으로 사용되는 표준 1-문자 명칭으로 나타내어진다. 주어진 아미노산 서열은 또한 유사하지만 변화된 아미노산 서열, 예를 들어 단지 사소한 변화, 예를 들어 예시적인 것으로서, 그리고 제한됨이 없이, 공유 결합적 화학적 변형, 삽입, 결실 및 치환을 갖는 것을 포함할 수 있는데, 상기 치환은 비-자연-발생 아미노산을 이용한 치환 또는 보존성 치환을 더 포함할 수 있다. 서로와 유사한 아미노산 서열은 상당한 서열 상동성 영역을 공유할 수 있다. 유사한 방식에 있어서, 뉴클레오티드 서열은 단지 사소한 변화, 예를 들어 예시적인 것으로서, 그리고 제한됨이 없이, 유전자 암호의 축퇴성으로 인한 사일런트 (silent) 돌연변이를 더 포함할 수 있는, 공유 결합적 화학적 변형, 삽입, 결실 및 치환을 갖는 실질적으로 유사한 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 서로와 유사한 뉴클레오티드 서열은 상당한 서열 상동성 영역을 공유할 수 있다.
대상에 있어서 악성 병이 존재한다는 것은 당업계에 공지되어 있으며 진단 및 분류 기준이 확립된 신생 세포, 종양 세포, 비-접촉 억제 세포 또는 발암성으로 형질전환된 세포 등을 포함하여 대상에 있어서 이형성(dysplastic), 암성 및/또는 형질전환 세포가 존재한다는 것을 나타낸다(예를 들어 흑색종, 암종, 예를 들어 선암, 편평세포암, 소세포암, 귀리 세포암 등, 육종, 예를 들어 연골육종, 골육종 등). 본 발명에 의해 고려되는 바람직한 실시 형태에 있어서, 예를 들어 이러한 암 세포는 악성 조혈 세포, 예를 들어 형질전환된 림프 계열 세포, 특히 B 세포 림프종 등이며, 암세포는 또한 소정의 바람직한 실시 형태에 있어서 암종 세포와 같은 상피 세포일 수 있다. 본 발명에서는 또한 B 세포 질병이 고려되는데, 이는 B 세포에 영향을 주는 소정의 악성 병(예를 들어 B 세포 림프종)을 포함할 수 있지만 그렇게 한정하려는 것은 아니며, 이는 또한 자가 면역 질환, 특히 예를 들어 자가 항체 생성을 그 특징으로 하는 질환, 질병 및 병을 포함하려는 것이다.
자가 항체는 자가 항원과 반응하는 항체이다. 자가 항체는 여러 자가면역 질환(즉, 숙주 면역계가 부적절한 항-"자기" 면역 반응을 생성하는 질환, 질병 또는 병)에서 검출되는데, 여기서 이들은 질환 활성에 연루된다. 다양한 자가면역 질환의 현재의 치료법은 계속적인 투여를 필요로 하며, 특이성이 결여되어 있고 상당한 부작용을 야기하는 면역 억제약을 포함한다. 최소의 독성으로 자가 항체 생성을 제거할 수 있는 새로운 접근법은 다수의 사람에게 영향을 주는 질환 스펙트럼에 대한 충족되지 않은 의학적 필요성에 대처한다. 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질을 포함하는 본 발명의 제작물은 예를 들어 림프 조직 내로의 침투 개선을 위하여 고안된다. B 림프구의 고갈은 자가 항체 생성 사이클을 방해하며, 골수에서 새로운 B 림프구가 전구체로부터 생성될 때 면역계가 재세팅되도록 한다.
비제한적 이론에 따르면 유익한 효과가 B 세포 고갈 요법으로부터 생긴다고 생각되는 다수의 질환, 질병 및 병이 확인되었다. 이러한 질환, 질병 및 병은 그레이브스병(Grave's disease), 하시모토병(Hashimoto's disease), 류머티즘성 관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 쇼그렌 증후군(Sjogrens Syndrome), 면역성 혈소판 감소성 자반증, 다발성 경화증, 중증 근무력증(myasthenia gravis), 피부 경화증, 건선, 크론병 및 궤양성 대장염을 포함하는 염증성 장질환을 포함하지만 그에 한정되는 것은 아니다. 크론병 및 궤양성 대장염을 포함하는 염증성 장질환은 소화계의 자가면역 질환이다.
본 발명은 또한 본 발명의 제작물, 예를 들어 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드, 특히 유전자 요법 상의 용도를 위하여 예를 들어 그러한 폴리펩티드의 단편, 유사체 및 유도체로 발현될 수 있는 그러한 단백질을 코딩하는 재조합 제작물을 투여하는 방법에 관한 것이다.
예를 들어 결합 도메인-면역글로불린 융합 폴리펩티드 또는 융합 단백질을 포함하는 본 발명의 제작물을 나타낼 경우 "단편", "유도체" 및 "유사체"라는 용어는 그러한 폴리펩티드와 본질적으로 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 결합 도메인-면역글로불린 융합 폴리펩티드 또는 융합 단백질과 같은 임의의 제작물을 나타낸다. 따라서 유사체는 제작물의 프로(pro)- 또는 프리프로(prepro) 형태, 예를 들어 프로-단백질 부분의 절단에 의해 활성화되어 활성 제작물, 예를 들어 결합 도메인-면역글로불린 융합 폴리펩티드를 생성할 수 있는 프로-단백질을 포함한다.
본 발명의 제작물, 예를 들어 본원에서 언급된 cDNA에 의해 코딩되는 결합 도메인-면역글로불린 융합 폴리펩티드 또는 융합 단백질을 포함하는 결합 도메인-면역글로불린 융합 폴리펩티드 또는 융합 단백질의 단편, 유도체 또는 유사체는 (i) 아미노산 잔기들 중 하나 이상이 보존 또는 비-보존 아미노산 잔기(바람직하게는 보존된 아미노산 잔기)로 치환되며 이러한 치환된 아미노산 잔기는 유전자 암호에 의해 코딩되는 것일 수 있거나 그러한 것일 수 없는 것, 또는 (ii) 아미노산 잔기들 중 하나 이상이 치환기를 포함하는 것, 또는 (iii) 결합 도메인-면역글로불린 융합 폴리펩티드 또는 프로단백질 서열과 같은 제작물을 포함하는 제작물의 검출 또는 특이적인 기능 변경에 이용되는 아미노산을 포함하는 추가의 아미노산이 제작물, 예를 들어 결합 도메인-면역글로불린 융합 폴리펩티드에 융합되거나 그렇지 않을 경우 연결된 것일 수 있다. 이러한 단편, 유도체 및 유사체는 본원의 교시 내용으로부터 당업계의 숙련자의 범위 내인 것으로 생각된다.
폴리펩티드 제작물을 포함하는 본 발명의 제작물은 예를 들어 당업계에 공지된 서열과 동일하거나 유사한 결합 도메인 폴리펩티드 아미노산 서열, 또는 그의 단편 또는 일부와 같은 결합 영역을 갖는 결합 도메인-면역글로불린 융합 폴리펩티드 및 융합 단백질을 포함한다. 추가의 예시를 위한 예로서, 그리고 제한됨이 없이, 인간 CD154 분자의 세포외 도메인 [서열 번호 _]이, 그러한 폴리펩티드의 일부 및/또는 보고된 폴리펩티드에 대한 유사성이 적어도 약 70%(바람직하게는 동일성이 70%보다 큼), 더 바람직하게는 적어도 약 90%(더 바람직하게는 동일성이 90%보다 큼), 더욱 더 바람직하게는 보고된 폴리펩티드 및 그러한 폴리펩티드의 일부에 대한 유사성이 적어도 약 95% (더욱 더 바람직하게는 동일성이 95%보다 큼)인 폴리펩티드가 그러하듯이 본 발명에 따른 사용에 고려되는데, 여기서, 결합 도메인-면역글로불린 융합 폴리펩티드의 그러한 일부는 예를 들어 약 30개 이상의 아미노산, 더 바람직하게는 약 50개 이상의 아미노산을 포함한다. 세포외 도메인은 예를 들어 세포 표면 분자의 일부를 포함하며, 특히 바람직한 실시 형태에 있어서 내재성 막 단백질(integral membrane protein)이거나 원형질막 스패닝 막통과 도메인(plasma membrane spanning transmembrane domain)을 포함하는 세포 표면 분자는, 이 분자가 세포 표면에서, 바람직하게는 이러한 분자의 세포외 도메인의 일부가 세포외 환경(extracellular milieu)으로도 알려져 있는 세포의 외부 환경에 노출되는 방식으로 발현될 경우 원형질막 인지질 이중층의 외부 소엽체(leaflet)를 넘어 연장되도록 제작된다. 세포 표면 분자의 일부가 세포외 도메인을 포함하는지를 결정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 실험에 의한 결정(예를 들어 원형질막을 투과할 수 없는 단백질 분해 효소 또는 지방 분해 효소와 같은 제제에 의해 이 분자가 구조적으로 변경될 수 있는지를 평가하는 분자의 직접적 또는 간접적 표지법) 또는 이 분자의 구조에 기초한 위상(topological) 예측법(예를 들어 폴리펩티드의 아미노산 서열의 분석) 또는 기타 방법을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이 "아미노산"은 중앙 탄소 원자 (알파(α)-탄소 원자)가 수소 원자, 카르복실산기 (본원에서 이것의 탄소 원자는 "카르복실 탄소 원자"로 칭함), 아미노기 (본원에서 이것의 질소 원자는 "아미노 질소 원자"로 칭함), 및 측쇄기, R에 결합된 구조를 갖는 분자이다. 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 내로 혼입될 경우 아미노산은 하나의 아미노산을 다른 것에 결합시키는 탈수 반응에서 그의 아미노 및 카르복실산기 중 하나 이상의 원자를 손실한다. 그 결과, 단백질 내로 혼입될 경우 아미노산은 "아미노산 잔기"로도 칭해질 수 있다. 자연 발생 단백질의 경우 아미노산 잔기의 R 기에 의해, 단백질 중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 생물학적 시스템에서 단백질 내로의 혼입 후 (예를 들어 글리코실화에 의해, 및/또는 흔히 단백질 등의 폴딩된 형태(folded conformation)의 안정화에 중요한 역할을 하는 이황화 공유 결합을 생성하는, 2개의 인접하지 않은 시스테인 아미노산 잔기의 티올 측쇄의 산화를 통한 시스틴의 형성에 의해) 유도체화되거나 변형될 수 있기는 하지만, 일반적으로 단백질이 합성되는 20개의 아미노산이 구별된다. 당업계의 숙련자라면 알 수 있듯이, 비-자연 발생 아미노산이 단백질, 특히 고체 상태 합성 방법 및 기타 자동 합성 방법을 포함하는 합성 방법에 의해 제조되는 것 내로 또한 혼입될 수 있다. 이러한 아미노산의 예는 일반적으로 제한됨이 없이 α-아미노 이소부트리스산, 4-아미노 부티르산, L-아미노 부티르산, 6-아미노 헥산산, 2-아미노 이소부티르산, 3-아미노 프로피온산, 오르니틴, 노르렌신, 노르발린, 히드록스프롤린, 사르코신, 시트랄린, 시스테익산, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 페닐릴라이신, 시클로헥실알라닌, β-알라닌, 플루오로-아미노산, 디자이너(designer) 아미노산 (예를 들어 β-메틸 아미노산, α-메틸 아미노산, Nα-메틸 아미노산) 및 아미노산 유사체를 포함한다. 또한 (2개의 수소 원자가 α 탄소 원자에 결합된 글리신을 제외하고, 단백질의 합성을 위하여 생물학적 시스템에 의해 사용되는 20개의 아미노산의 경우가 그러하듯이), α-탄소 원자가 4개의 상이한 기를 가질 경우, D 및 L로 나타내어지는 각각의 아미노산의 2종의 상이한 이성질체 형태가 존재한다. 포유류에 있어서는 L-아미노산만이 자연 발생 폴리펩티드 내로 혼입된다. 본 발명은 하나 이상의 D- 및 L-아미노산이 혼입된 단백질과, 단지 D- 또는 L-아미노산 잔기로 이루어진 단백질을 고려한다.
본원에서 하기의 약어가 하기의 아미노산 (및 그 잔기)에 대하여 사용될 수 있다: 알라닌 (Ala, A); 아르기닌 (Arg, R); 아스파라긴 (Asn, N); 아스파르트산 (Asp, D); 시스테인 (Cys, C); 글리신 (Gly, G); 글루탐산 (Glu, E); 글루타민 (Gln, Q); 히스티딘 (His, H); 이소류신 (Ile, I); 류신 (Leu, L); 라이신 (Lys, K); 메티오닌 (Met, M); 페닐알라닌 (Phe, F); 프롤린 (Pro, P); 세린 (Ser, S); 트레오닌 (Thr, T); 트립토판 (Trp, W); 티로신 (Tyr, Y); 및 발린 (Val, V). 비극성(소수성) 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함한다. 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, ㅅ시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양으로 하전된 (염기성) 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음으로 하전된 (산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다.
"단백질"은 펩티드 결합을 통하여 결합된 2개 이상의 개개의 아미노산 (자연 발생이거나 그렇지 않을 수 있음)의 임의의 중합체를 나타내며 하나의 아미노산 (또는 아미노산 잔기)의 α-탄소에 결합된 카르복실산기의 카르복실 탄소 원자가 인접한 아미노산의 α-탄소에 결합된 아미노기의 아미노 질소 원자에 공유 결합되게 될 때 생긴다. "단백질"이라는 용어는 그의 의미 내에 "폴리펩티드" 및 "펩티드" (이는 본원에서 때로 서로 바꾸어서 사용될 수 있음)라는 용어를 포함하는 것으로 이해된다. 또한 다수의 폴리펩티드 서브유닛 또는 기타 성분을 포함하는 단백질도 본원에서 사용되는 "단백질"의 의미 내에 포함되는 것으로 이해된다. 이와 유사하게는, 단백질, 펩티드 및 폴리펩티드의 단편도 본 발명의 점주 이내이며 본원에서 "단백질"로 칭해질 수 있다.
생물학적 시스템 (이들은 무세포 시스템을 포함하는 생체내 또는 시험관내 시스템임)에 있어서, 주어진 단백질의 특정 아미노산 서열 (즉, 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 쓸 경우, 폴리펩티드의 "일차 구조")은 mRNA의 코딩 부분의 뉴클레오티드 서열에 의해 결정되는데, 상기 뉴클레오티드 서열은 다시 유전자 정보, 일반적으로 게놈 DNA (이는 본 발명의 목적상 세포 기관 DNA, 예를 들어 미토콘드리아 DNA 및 엽록체 DNA를 포함하는 것으로 이해됨)에 의해 특정된다. 물론, 특정 유기체의 게놈을 구성하는 임의의 유형의 핵산 (예를 들어 대부분의 동물 및 식물의 경우 이중 가닥 DNA, 몇몇 바이러스의 경우 단일 가닥 또는 이중 가닥 RNA 등)이 특정 유기체의 유전자 산물(들)을 코딩하는 것으로 이해된다. 메신저 RNA는 리보좀 상에서 번역되는데, 리보좀은 자유 아미노산의 중합을 촉매하며, 자유 아미노산의 특정 신원은 후에 초기 (nascent) 폴리펩티드로 번역되는 mRNA의 특정 코돈(mRNA와 관련하여, mRNA의 코딩 영역 중의 3개의 인접한 A, G, C 또는 U 리보뉴클레오티드)에 의해 특정된다 . 재조합 DNA 기술에 의해 생 유기체에서 자연적으로 제조할 경우와 동일한 일차 서열을 갖는 단백질 및 폴리펩티드 (예를 들어 인간 인슐린, 인간 성장 호르몬, 에리트로포이에틴, 과립구 콜로니 자극 인자 등)의 대규모 합성이 가능해졌다. 또한 이러한 기술에 의해 상기 및 기타 단백질의 유사체의 합성이 가능해졌는데, 이 유사체는 천연 단백질에 비하여 하나 이상의 아미노산 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함할 수 있다. 재조합 DNA 기술에 의해 전적으로 신규한 단백질의 합성도 가능하다.
비-생물학적 시스템(예를 들어 고체 상태 합성법을 이용하는 것)에 있어서 단백질의 일차 구조 (이는 또한 이황화 (시스틴) 결합 위치를 포함함)는 사용자에 의해 결정될 수 있다. 그 결과, 일차 구조가 생물학적으로 제조된 단백질의 일차 구조와 중복되는 폴리펩티드가, 이러한 단백질의 유사체가 그러할 수 있듯이, 성취될 수 있다. 또한 비-자연 발생 아미노산이 혼입된 단백질이 그러할 수 있듯이 완전히 신규한 폴리펩티드도 합성될 수 있다.
당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 두 폴리펩티드 사이의 "유사성"은 하나의 폴리펩티드의 아미노산 서열 (그 안의 보존된 아미노산 치환체를 포함함)을 제2 폴리펩티드의 서열과 비교함으로써 결정할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 단편 또는 일부를 사용하여 본 발명의 전장 핵산을 합성할 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이 "동일성 %"는 2개 이상의 폴리펩티드를 정렬하고 그의 서열을, 예를 들어 미국 국립 보건원(National Institutes of Health)/NCBI 데이터베이스 (Bethesda, MD; www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST/nph-newblast 참고)에 의해 제공되는 디폴트 가중 사항에 따라 서열 갭 및 서열 미스매치 상의 가중치를 가하는 갭형 (gapped) BLAST 알고리즘 (예를 들어 문헌[Altschul et al., 1997 Nucl. Ac. Res.. 25: 3389]; 문헌[Altschul et al., 1990 J. Mol. Biol., 215: 403-410])을 사용하여 분석할 경우 상응하는 아미노산 잔기 위치에 위치해 있는 동일한 아미노산의 퍼센트를 나타낸다. 다른 정렬 방법은 BLITZ (MPsrch) (문헌[Sturrock & Collins, 1993]), 및 FASTA (문헌[Pearson and Lipman, 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85: 2444-2448])를 포함한다.
"단리된"이라는 용어는 자연 발생 물질의 경우, 이 물질이 그의 자연적인 환경 또는 원래의 환경으로부터 옮겨지거나 옮겨진 것을 의미하거나, 이 물질이 그의 자연적인 환경 또는 원래 환경과 더이상 결부되어 있지 않다는 것을 의미한다. 예를 들어 생 동물에 존재하는 자연 발생 핵산 또는 단백질 또는 폴리펩티드는 단리되지 않지만, 천연 시스템 중에 공동 존재하는 물질의 일부 또는 이 물질 전부로부터 분리된 동일한 핵산 또는 폴리펩티드는 단리된다. 이러한 핵산은 벡터의 일부일 수 있고/있거나 이러한 핵산 또는 폴리펩티드는 조성물의 일부로서 이러한 벡터 또는 조성물이 그의 자연적인 환경의 일부가 아니라는 점에서 여전히 단리될 수 있다. 비-자연 발생 물질, 예를 들어 재조합 방법으로 제조된 본 발명의 제작물의 경우 "단리된"이라는 용어는 제조 동안 보통 수반되는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 없는 물질, 예를 들어 원하는 정도로, 바람직하게는 예를 들어 당업계에 공지된 기술로 측정시 약 80% 이상 순수하도록, 더 바람직하게는 약 90% 이상 순수하도록, 더욱 더 바람직하게는 약 95% 이상 순수하도록 정제된 단백질 및 펩티드를 포함한다.
"유전자"라는 용어는 폴리펩티드 쇄의 생성에 연루되는 DNA 절편을 의미하며, 이는 또한 폴리펩티드 코딩 영역에 선행하거나 이 영역 후의 영역, 예를 들어 "리더 및 트레일러(trailer)"와, 개개의 관련 코딩 절편들(엑손) 사이의 개재 서열(인트론)을 포함할 수 있다.
본원에 기술되어 있는 바와 같이, 본 발명은 예를 들어 예시적인 것으로서 제한됨이 없이 융합 단백질의 검출, 기능 변경, 단리 및/또는 정제를 가능하게 하는 추가의 기능성 폴리펩티드 서열에 융합되거나 그렇지 않을 경우 연결된, 예를 들어 결합 도메인 폴리펩티드 서열의 발현을 제공하기 위하여 추가의 천연이거나 조작된 면역글로불린 도메인 코딩 서열에 프레임에 맞게 융합되거나 그렇지 않을 경우 연결된, 예를 들어 결합 도메인 코딩 서열과 같은 결합 영역 코딩 서열을 갖는 핵산에 의해 전적으로 또는 부분적으로 코딩될 수 있는, 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질을 포함하는 제작물을 제공한다. 이러한 융합 단백질은 예를 들어 (그리고 상기되어 있는 바와 같이) 이황화 결합 형성에 있어서의 참여를 위한 술프히드릴기의 이용가능성의 저하에 의해, 그리고 ADCC 및/또는 CDC를 강화시키고/시키거나 보체를 고정하는 능력의 부여에 의해 융합 생성물의 거동에 영향을 주는 추가의 면역글로불린-유래 폴리펩티드 서열을 포함함으로써 결합 도메인의 기능 변경을 가능하게 할 수 있다.
폴리펩티드의 변형은 당업계의 숙련자에게 공지된 임의의 수단으로 행할 수 있다. 본 발명에서 바람직한 방법은 예를 들어 융합 단백질을 코딩하는 DNA의 변형 및 변형된 DNA의 발현에 의존적이다. 본 발명의 제작물 중 하나, 예를 들어 본원에 논의되어 있는 결합 도메인-면역글로불린 융합체 중 하나를 코딩하는 DNA는 예를 들어 이하에 기술되어 있는 것을 포함하는 표준 방법을 사용하여 변경 또는 돌연변이화할 수 있다. 예를 들어 결실 또는 대체되지 않을 경우 다량체 형성을 돕거나 특정 분자 배좌를 촉진할 수 있는 시스테인 잔기, 예를 들어 집합체 형성에 책임이 있거나 참여하는 시스테인 잔기는 폴리펩티드로부터 결실되거나 대체될 수 있다. 필요할 경우, 예를 들어 집합체 형성에 기여하는 시스테인 잔기의 신원(identity)은 시스테인 잔기를 결실시키고/시키거나 대체하고 생리학적으로 허용가능한 완충제 및 염을 함유하는 용액에서 생성된 단백질이 집합화하는지를 확인함으로써 경험적으로 결정할 수 있다. 또한, 예를 들어 결합 도메인-면역글로불린 융합체의 단편이 제작 및 사용될 수 있다. 상기에서 알 수 있는 바와 같이 다수의 후보 결합 도메인-면역글로불린 융합체의 반대 수용체(counterreceptor)/리간드 결합 도메인은 당업계의 숙련자가 본 발명의 발현 제작물의 코딩 산물에의 포함을 위한 적절한 폴리펩티드 도메인을 손쉽게 선택할 수 있도록 기술되어 있다.
아미노산의 보존 치환은 잘 알려져 있으며 일반적으로 생성되는 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질 분자의 생물학적 활성을 변경함이 없이 행해질 수 있다. 예를 들어 이러한 치환은 일반적으로 극성 잔기, 하전된 잔기, 소수성 잔기, 작은 잔기 등의 군 내에서의 상호 교환에 의해 이루어진다. 필요할 경우 이러한 치환은 단지 생물학적인 시험관내 분석에서 적절한 세포 표면 수용체에 결합하거나, 적절한 항원 또는 원하는 표적 분자에 결합하는 능력에 대하여 생성된 변형 단백질을 시험함으로써 경험적으로 측정할 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 제공되어 있는 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질 코딩 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 당기술에 친숙한 이들이라면 손쉽게 알 수 있는 바와 같이, 서열들간의 동일성이 적어도 약 70%, 바람직하게는 적어도 약 80-85%, 더 바람직하게는 적어도 약 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%라면, 그의 상보체를 포함하여 본 발명의 제작물에 혼성화되는 핵산에 관한 것이다.
특히 본 발명은 예를 들어 엄격한 조건 하에서 본원에 언급된 결합 도메인-면역글로불린 융합체 코딩 핵산에 혼성화되는 핵산에 관한 것이다. 본원에 사용되는 바와 같이 명기된 엄격도의 조건 하에서의 "혼성화"는 2개의 단일 가닥 핵산 분자들 사이에 형성되는 혼성체의 안정성을 설명하기 위하여 사용된다. 혼성화의 엄격도는 일반적으로 이러한 혼성체가 어닐링 및 세척되는 온도와 이온 강도의 조건으로 표현된다. "엄격한 조건"이라는 용어는 폴리뉴클레오티드 사이에 혼성화가 일어나게 하는 조건을 나타낸다. 엄격한 조건은 염의 농도, 유기 용매(예를 들어 포름아미드)의 농도, 온도, 및 당업계에 잘 알려져 있는 기타 조건으로 정의될 수 있다. 특히, 엄격도는 염의 농도의 감소, 유기 용매(예를 들어 포름아미드)의 농도의 증가, 또는 혼성화 온도의 상승에 의해 증가시킬 수 있다. 예를 들어 엄격한 염 농도는 보통 약 750 mM NaCl 및 75 mM 시트르산삼나트륨보다 낮은 농도, 바람직하게는 약 500 mM NaCl 및 50 mM 시트르산삼나트륨보다 낮은 농도, 가장 바람직하게는 약 250 mM NaCl 및 25 mM 시트르산삼나트륨보다 낮은 농도이다. 낮은 엄격도의 혼성화는 유기 용매, 예를 들어 포름아미드의 부재 하에 얻어질 수 있으며, 반면 높은 엄격도의 혼성화는 유기 용매(예를 들어 약 35% 이상의 포름아미드, 가장 바람직하게는 약 50% 이상의 포름아미드)의 존재 하에서 얻어질 수 있다. 엄격한 온도 조건은 보통 약 30℃ 이상의 온도, 더 바람직하게는 37℃ 이상의 온도, 가장 바람직하게는 약 42℃ 이상의 온도를 포함한다. 다양한 추가의 파라미터, 예를 들어 혼성화 시간, 세제, 예를 들어 소듐 도데실 술페이트(SDS)의 농도, 및 캐리어 (carrier) DNA의 포함 또는 배제가 당업계의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 다양한 수준의 엄격도는 필요한 상기의 다양한 조건의 조합에 의해 달성되며 당업계의 기술 이내이다. 다른 전형적인 "높은", "중간 정도의" 및 "낮은" 엄격도는 하기 조건 또는 그에 동등한 조건을 포함한다: 높은 엄격도: 0.1 x SSPE 또는 SSC, 0.1% SDS, 65℃; 중간 정도의 엄격도: 0.2 x SSPE 또는 SSC, 0.1% SDS, 50℃; 및 낮은 엄격도: 1.0 x SSPE 또는 SSC, 0.1% SDS, 50℃. 당업계의 숙련자에게 공지되어 있는 바와 같이 혼성화 조건의 엄격도에 있어서의 변화는 예비 혼성화, 혼성화 및 세척 단계에 사용되는 시간, 온도 및또는 용액의 농도의 변경으로 성취될 수 있으며, 적합한 조건은 부분적으로는 사용되는 프로브와, 블로팅되는 프로밴드(proband) 핵산 샘플의 특정 뉴클레오티드 서열에 따라서도 달라질 수 있다. 따라서 적합하게 엄격한 조건은 원하는 선택성의 프로브를 동정하는 부당한 실험 없이, 소정의 다른 프로밴드 서열에는 혼성화하지 않으면서 하나 이상의 소정의 프로밴드 서열에는 혼성화하는 능력에 기초하여 손쉽게 선택할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이 바람직한 "엄격한 조건"은 일반적으로 서열들 사이의 동일성이 적어도 약 90-95%, 더 바람직하게는 적어도 약 97%일 경우에만 발생하는 혼성화를 나타낸다. 예를 들어 바람직한 실시 형태에 있어서 본원에서 언급되는 결합 도메인-면역글로불린 융합체 코딩 핵산에 혼성화되는 핵산 제작물은 예를 들어 cDNA에 의해 코딩되는 결합 도메인-면역글로불린 융합 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 코딩한다.
본원에서 폴리뉴클레오티드로도 칭해지는 본 발명의 핵산은 RNA, 예를 들어 mRNA의 형태, 또는 cDNA (특정 메신저 RNA에 상보성인 DNA 분자인 "상보성 DNA"로도 불림), 게놈 DNA 및 합성 DNA를 포함하는 DNA의 형태로 존재할 수 있다. DNA는 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있으며, 단일 가닥일 경우 코딩 가닥 또는 비코딩 (안티-센스) 가닥일 수 있다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 본 발명의 제작물, 예를 들어 결합 도메인-면역글로불린 융합 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 서열은 당업계에 공지되거나 일부에 대하여 본원에 기술되어 있는 코딩 서열과 동일한 일부를 포함할 수 있거나, 유전 암호의 중복성(redundancy) 또는 축퇴성(degeneracy)의 결과로서, 결합 도메인-면역글로불린 융합 폴리펩티드의 전부 또는 일부를 포함하는 동일한 제작물 또는 그의 일부를 코딩하는 상이한 코딩 서열일 수 있다.
본 발명의 제작물, 예를 들어 결합 도메인-면역글로불린 융합 폴리펩티드를 코딩하는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 핵산은 단지 이 제작물, 예를 들어 결합 도메인-면역글로불린 융합 폴리펩티드의 코딩 서열; 제작물, 예를 들어 결합 도메인-면역글로불린 융합 폴리펩티드의 코딩 서열 및 추가의 코딩 서열; 제작물, 예를 들어 결합 도메인 면역글로불린 융합 폴리펩티드(및 선택적으로 추가의 코딩 서열)의 코딩 서열 및 비-코딩 서열, 예를 들어 인트론 또는 비코딩 서열인 결합 도메인-면역글로불린 융합 폴리펩티드 또는 그의 일부(들)의 코딩 서열의 5' 및/또는 3'의 비코딩 서열 - 이는, 예를 들어 조절되거나 조절가능한 프로모터, 인핸서, 기타 전사 조절 서열, 리프레서 결합 서열, 번역 조절 서열 또는 임의의 기타 조절 핵산 서열일 수 있는 하나 이상의 조절 핵산 서열을 더 포함할 수 있지만 반드시 그에 한정될 필요는 없음 - 을 포함할 수 있지만 그에 한정되지는 않는다. 따라서, 제작물, 예를 들어 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질을 "코딩하는 핵산" 또는 "코딩하는 폴리뉴클레오티드"라는 용어는 예를 들어 단지 결합 도메인-면역글로불린 융합 폴리펩티드의 코딩 서열을 포함하는 핵산과, 추가의 코딩 및/또는 비코딩 서열(들)을 포함하는 핵산을 포함한다.
본원에 기술되어 있는 바와 같이 사용하기 위한 핵산 및 올리고뉴클레오티드는 당업계의 숙련자에게 공지되어 있는 임의의 방법으로 합성할 수 있다 (예를 들어 WO 93/01286, 미국 특허 출원 제07/723,454호; 미국 특허 제5,218,088호; 미국 특허 제5,175,269호; 미국 특허 제5,109,124호 참고). 다양한 올리고뉴클레오티드 및 핵산 서열의 확인도 당업계에 공지된 방법을 포함한다. 예를 들어 클로닝에 유용한 올리고뉴클레오티드의 바람직한 특성, 길이 및 기타 특징이 잘 알려져 있다. 소정의 실시 형태에 있어서, 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 술폰, 술페이트, 케틸, 포스포로디티오에이트, 포스포르아미데이트, 포스페이트 에스테르와 같은 결합체, 및 안티센스 용도에 유용한 것으로 입증된 기타 결합체를 포함함으로써 숙주 세포의 내인성 핵산 분해 효소 (nucleolytic enzyme)에 의한 분해를 견디어 내는 합성 올리고뉴클레오티드 및 핵산의 서열이 고안된다. 예를 들어 문헌[Agrwal et al., Tetrehedron Lett. 28: 3539-3542 (1987)]; 문헌[Miller et al., J. Am. Chem. Soc. 93: 6657-6665 (1971); 문헌[Stec et al., Tetrehedron Lett. 26: 2191-2194 (1985)]; 문헌[Moody et al., Nucl. Acids Res. 12: 4769-4782 (1989)]; 문헌[Uznanski et al., Nucl. Acids Res. (1989); 문헌[Letsinger et al., Tetrahedron 40: 137-143 (1984)]; 문헌[Eckstein, Anne. Rev. Biochem. 54: 367-402 (1985)]; 문헌[Eckstein, Trends Biol. Sci. 14: 97-100 (1989)]; 문헌[Stein In: Oligodeoxynucleotides. Antisense Inhibitors of Gene Expression, Cohen, Ed, Macmillan Press, London, pp. 97-117 (1989)]; 문헌[Jager et al., Biochemistry 27: 7237-7246 (1988)]을 참고한다.
일 양태에 따르면, 본 발명은 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질과 같은 본 발명의 작제물에 사용되는 절두형 성분(예컨대, 결합 도메인 폴리펩타이드, 힌지 영역 폴리펩타이드, 링커 등)을 제공한다. 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 이러한 절두형 성분을 가진 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질과 같은 본 발명의 작제물을 암호하는 핵산을 제공한다. 절두형 분자는 당해 분자의 전장보다 적은 길이의 형태를 함유하는 모든 분자일 수 있다. 본 발명에 의해 제공되는 절두형 분자는 절두형 생물학적 중합체를 포함할 수 있는 것으로서, 본 발명의 바람직한 양태에 따르면 이러한 절두형 분자는 절두형 핵산 분자 또는 절두형 폴리펩타이드일 수 있다. 절두형 핵산 분자는 공지되거나 기술된 핵산 분자의 전장 미만의 뉴클레오티드 서열을 보유한 것이며, 여기서 공지되거나 기술된 핵산 분자는 당업자가 전장 분자로 간주할 수 있는 것이라면 자연 발생이거나 합성이거나 또는 재조합의 핵산 분자이어도 좋다. 즉, 유전자 서열에 대응하는 절두형 핵산 분자는 예컨대, 암호 서열, 비암호 서열, 프로모터, 인헨서 및 다른 조절 서열, 인접 서열 등과 이 유전자의 일부인 것으로 확인되는 기타 다른 기능성 및 비기능성 서열을 함유하는 전장 미만의 유전자를 함유하는 것이다. 다른 예에 따르면, mRNA 서열에 대응하는 절두형 핵산 분자는 다양한 해독 및 미해독 영역뿐만 아니라 다른 기능성 및 비기능성 서열을 함유할 수 있는 전장 미만의 mRNA 전사체를 함유한다.
다른 바람직한 양태에 따르면, 절두형 분자는 특정 단백질 또는 폴리펩타이드 성분의 전장 미만의 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "결실"은 당업자가 이해하는 통상적인 의미인 것으로서, 본 명세서에 제시된 절두형 분자에서와 마찬가지로 대응하는 전장 분자에 비해 말단 또는 비말단 영역으로부터 서열의 하나 이상의 부분이 결실된 분자를 의미할 수 있다. 핵산 분자 또는 폴리펩타이드와 같은 선형 생물학적 중합체인 절두형 분자는 분자의 어느 한쪽 말단에서의 하나 이상의 결실 및/또는 분자의 비말단 영역에서의 하나 이상의 결실을 갖는 것이며, 이러한 결실은 약 1 내지 1500개의 근접 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기, 바람직하게는 약 1 내지 500개의 근접 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 및 더욱 바람직하게는 약 1 내지 300개의 근접 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 결실, 예컨대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31-40, 41-50, 51-74, 75-100, 101-150, 151-200, 201-250 또는 251-299개의 근접 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 결실일 수 있다. 특히 바람직한 특정 양태에서, 절두형 핵산 분자는 약 270 내지 330개 근접 뉴클레오티드의 결실이 있을 수 있다. 더욱 바람직한 특정 양태에서 절두형 폴리펩타이드 분자는 예컨대, 약 80 내지 14개 근접 아미노산의 결실이 있을 수 있다.
또한, 본 발명은 결합 도메인-면역글로불린 융합 폴리펩타이드와 같은 본 발명에 따른 작제물의 단편, 유사체 및/또는 유도체를 암호하는, 본 명세서에 언급된 핵산의 변형체에 관한 것이다. 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질과 같은 본 발명의 작제물을 암호하는 핵산의 변형체는 본 발명에 포함되는 핵산 서열 중 하나 이상의 부분의 자연 발생의 대립유전자 변형체 또는 상기 서열 또는 서열 일부의 비자연 발생의 변형체, 예컨대 서열 변화를 위해 당업계에 공지된 방법 등을 이용하여 분자 조작에 의해 변화된 서열 등일 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 대립유전자 변형체는 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 결실 또는 첨가 중 적어도 하나가 있을 수 있는 핵산 서열의 대체 형태로서, 이러한 형태 중 어떠한 형태든지 암호화된 결합 도메인-면역글로불린 융합 폴리펩타이드의 기능을 실질적으로 또는 불필요하게 변경시키지 않는다.
결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질과 같은 본 발명에 따른 작제물의 변형체 및 유도체는 결합 도메인-면역글로불린 융합 폴리펩타이드 또는 이의 임의의 일부를 암호하는 뉴클레오티드 서열의 돌연변이를 통해 수득할 수 있다. 천연 아미노산 서열의 변경은 다양한 임의의 상법에 따라 수행할 수 있다. 돌연변이는 예컨대, 천연 서열의 단편에 결찰시킬 수 있는 제한 부위가 인접해 있는, 돌연변이 서열을 함유한 올리고뉴클레오티드를 합성하여 특정 유전자위치에 도입시킬 수 있다. 결찰 후, 수득되는 재구성된 서열은 목적한 아미노산 삽입, 치환 또는 결실이 있는 유사체를 암호한다.
또 다른 방법으로서, 변경된 유전자의 제공에는 소정 코돈이 치환, 결실 또는 삽입에 의해 변경될 수 있는 올리고뉴클레오티드-지시성 부위-특이적 돌연변이유발법이 이용될 수 있다. 이러한 변경을 일으키는 방법의 예는 다음과 같은 문헌들에 개시되어 있다[Walder et al., 1986 Gene 42 : 133 ; Bauer et al., 1985 Gene 37 : 73 ; Craik, January 1985 BioTechniques 12-19 ; Smith et al., January 1985 Genetic Engineering : Principles and Methods BioTechniques 12-19 ; Costa GL, et al.,"Site-directed mutagenesis using a rapid PCR-based method,"1996 Methods Mol Biol. 57 : 239-48 ; Rashtchian A.,"Novel methods for cloning and engineering genes using the polymerase chain reaction,"1995 Curr Opin Biotechraol. 6 (1) : 30-6 ; Sharon J, et al., "Oligonucleotide-directed mutagenesis of antibody combining sites,"1993 lizt Rev Inziizunol. 10 (2-3) : 113-27 ; Kunkel, 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. (JSA 82 : 488 ; Kunkel et al., 1987 Methods in Enzymol. 154 : 367; 및 미국 특허 4,518,584 및 4,737,462].
일 예로서, DNA의 변형은 단백질을 암호하는 DNA의 부위 지시성 돌연변이유발과 함께 프라이머를 이용한 DNA 증폭법의 이용으로 DNA 주형에 변경을 도입 및 증폭시켜 수행할 수 있으며, 그 예에는 중첩 신장에 의한 PCR 접목(SOD)이 있다. 부위 지시성 돌연변이유발은 일반적으로 널리 알려지고 시중에서 입수용이한 M13 파지 벡터와 같은 일본쇄 및 이본쇄 형태의 파지 벡터를 사용하여 실시한다. 일본쇄 파지의 복제 오리진을 함유하는 다른 적합한 벡터를 사용할 수도 있다(예컨대, Veira et al., 1987 Meth. Enzymol. 15:3). 일반적으로, 부위 지시성 돌연변이유발은 당해의 단백질(예컨대, 소정의 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질 전체 또는 일부 성분)을 암호하는 일본쇄 벡터를 제조하여 수행한다. 일본쇄 벡터의 DNA에 대한 상동성 영역 안에 원하는 돌연변이를 함유하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 벡터에 어닐링한 다음, 대장균(E.coli) DNA 폴리머라제 I(클리나우 단편)과 같은 DNA 폴리머라제를 첨가하는데, 이 DNA 폴리머라제는 프라이머로서 이본쇄 영역을 사용하여, 한 가닥은 변경된 서열을 암호하고 다른 가닥은 원 서열을 암호하는 이종이본쇄를 생산한다. 이러한 이종이본쇄를 적당한 세균 세포로 도입시키고 원하는 돌연변이를 포함하는 클론을 선발한다. 결과적으로 변경된 DNA 분자를 적당한 숙주 세포에서 재조합 발현하여 변형된 단백질을 수득한다.
아미노산 잔기 또는 서열의 첨가 또는 치환이나, 말단 또는 내부 잔기 또는 서열의 결실에 관한 코드를 포함하는 동등한 DNA 작제물 역시 본 발명에 포함된다. 예컨대, 전술한 바와 같이 생물학적 활성에 바람직하지 않거나 필수적이 아닌 Cys 잔기를 암호하는 서열은 Cys 잔기를 다른 아미노산으로 치환시키거나 결실시키는 변경을 통해, 예컨대 합성 또는 복원 시 부정확하거나 바람직하지 않은 분자내 이황화 가교의 형성을 방지할 수 있다.
"숙주 세포" 또는 "재조합 숙주 세포"는 발현 벡터와 같은 벡터를 함유하는 세포, 또는 당해 단백질을 발현하도록 재조합 기술로 조작된 세포이다. 숙주 유기체는 시험관내 및 생체내 발현 등으로 본 발명의 작제물의 재조합 생산, 예컨대 본 발명의 재조합 작제물에 의해 암호화된 결합 도메인-면역글로불린 융합 산물이 생산될 수 있는 유기체를 포함하며, 그 예에는 박테리아(예컨대, 대장균), 효모(예컨대, 사카로마이세스 세레비지애 및 피키아 파스토리스), 곤충 세포 및 포유동물 세포가 있다. 즉, 숙주 세포는 본 명세서에 제시된 조성물의 생산에 필요한 작제, 전파, 발현 등의 단계에 유용한 유기체를 포함할 수 있다. 숙주는 본 명세서에 기술된 바와 같이 면역 반응이 일어나는 검체를 포함한다. 글리코실화된 단백질을 생산하는 본 발명의 작제물 생산에 현재 바람직한 숙주 유기체는 글리코실화된 단백질의 발현 및 회수를 허용하는 포유동물 세포 또는 다른 세포 시스템이다. 다른 세포주에는 순계 뮤린 균주 및 뮤린 세포주와 사람 세포 및 사람 세포주가 있다.
본 발명의 목적한 작제물, 예컨대 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질을 암호하는 DNA 작제물은 적당한 숙주에서 발현하기 위해 플라스미드와 같은 벡터로 도입시킨다. 바람직한 양태에서, 숙주는 포유동물 숙주, 예컨대 포유동물 세포주이다. 리간드 또는 핵산 결합 도메인을 암호하는 서열은 특정 숙주에서 발현을 위해 코돈 최적화된 것이 바람직하다. 따라서, 예컨대 작제물이 사람 결합 도메인-면역글로불린 융합체이고 박테리아에서 발현된다면, 코돈은 박테리아 용도로 최적화될 수 있다. 작은 암호 영역의 경우, 유전자는 단일 올리고뉴클레오티드로 합성할 수 있다. 큰 단백질의 경우에는 복수 올리고뉴클레오티드의 접목, 돌연변이유발 또는 다른 당업자에게 공지된 기술을 사용할 수 있다. 프로모터 및 오퍼레이터와 같은 조절 영역인, 플라스미드 또는 다른 벡터 중의 뉴클레오티드 서열은 전사를 위해 서로 작동적으로 결합된다. 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질을 암호하는 뉴클레오티드 서열은 추가로 분비 시그널을 암호하는 DNA를 포함할 수 있고, 그 결과 펩타이드는 전구체 단백질이 수득된다. 결과적으로 가공된 단백질은 원형질 공간 또는 발효 배지에서 회수될 수 있다.
바람직한 양태에서, DNA 플라스미드는 전사 종결인자 서열을 추가로 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 "전사 종결인자 영역"은 전사 종결을 신호하는 서열이다. 전체 전사 종결인자는 단백질 암호 유전자로부터 수득할 수 있으며, 상기 단백질 암호 유전자는 삽입된 결합 도메인-면역글로불린 융합체 암호 유전자 또는 프로모터의 근원과 동일하거나 상이한 것일 수 있다. 전사 종결인자는 본 명세서에 기술된 발현 시스템의 선택적 성분이나, 바람직한 양태에 사용된다.
본 명세서에 사용된 플라스미드 또는 다른 벡터는 당해의 단백질 또는 폴리펩타이드를 암호하는 DNA와 작동적으로 결합된 프로모터를 포함하고, 플라스미드의 목적 용도(예컨대, 결합 도메인-면역글로불린 융합 암호 서열을 함유하는 백신의 투여)에 따라 전술한 바와 같은 적당한 숙주(예컨대, 박테리아, 뮤린 또는 사람)에서 단백질을 발현하도록 설계된다. 본 발명에서의 단백질 및 폴리펩타이드의 발현에 적당한 프로모터는 다양하게 입수할 수 있고 당업계에 공지되어 있다. 조절성 영역에 결합되어 있는 유도형 프로모터 또는 구성형 프로모터가 바람직하다. 이러한 프로모터에는 예컨대 T7 파지 프로모터 및 다른 T7계 파지 프로모터, 예컨대 T3, T5 및 SP6 프로모터, 대장균 유래의 trp, lpp 및 lac 프로모터, 예컨대 lacUV5; 바큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템의 P10 또는 폴리헤드린 유전자 프로모터(예컨대 미국 특허 5,243,041, 5,242,687, 5,266,317, 4,745,051 및 5,169,784) 및 다른 진핵생물 발현 시스템 유래의 유도형 프로모터가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 단백질 발현을 위해, 이러한 프로모터는 lac 오페론과 같은 조절 영역과 작동적 결합으로 플라스미드에 삽입되어야 한다.
바람직한 프로모터 영역은 포유동물 세포에서 유도형이고 기능성인 것이다. 박테리아 발현에 적당한 유도형 프로모터 및 프로모터 영역의 예에는 이소프로필 β-D-티오갈락토피라노사이드에 반응성인 대장균 lac 오퍼레이터(IPTG; Nakamura et al., 1979 Cell 18: 1109-1117); 중금속(예, 아연) 유도에 반응성인 메탈로티오네인 프로모터 금속 조절 인자(미국 특허 4,870,009 참조); IPTG에 반응성인 파지 T7lac 프로모터(예컨대, 미국 특허 4,952,496; Studier et al., 1990 Meth. Enzymol. 185: 60-89) 및 TAC 프로모터가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 사용되는 발현 숙주 시스템에 따라서 플라스미드는 숙주에서 기능성인 선택성 마커 유전자(들)를 선택적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 선택성 마커 유전자에는 형질전환된 박테리아 세포가 동정될 수 있고 대다수의 미형질전환된 세포 중에서 선택적으로 증식할 수 있게 하는 표현형을 박테리아에 부여하는 임의의 유전자를 포함한다. 박테리아 숙주에 적당한 선택성 마커 유전자에는 앰피실린 내성 유전자(Ampr), 테트라사이클린 내성 유전자(Tcr) 및 카나마이신 내성 유전자(Kanr)가 있다. 카나마이신 내성 유전자는 현재 박테리아 발현에 바람직한 것이다.
다양한 발현 시스템 중에서, 플라스미드 또는 다른 벡터는 추가로 작동적으로 결합된 단백질의 분비 시그널을 암호하는 DNA를 포함할 수 있다. 사용하기에 적당한 분비 시그널은 다양하게 입수할 수 있고 당업계에 공지되어 있다. 대장균에서 기능성인 원핵생물 및 진핵생물 분비 시그널이 이용될 수 있다. 발현 시스템에 따라서 현재 바람직한 분비 시그널은 다음과 같은 대장균 유전자에 의해 암호화된 시그널을 포함할 수 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다: ompA, ompT, ompF, ompC, 베타-락타마제 및 알칼리성 포스파타제 등(von Heijne, J.Mol.Biol. 184:99-105, 1985). 또한, 박테리아 pelB 유전자 분비 시그널(Lei et al., J.Bacteriol. 169:4379, 1987), pho A 분비 시그널 및 곤충 세포에서 기능성인 cek2도 이용할 수 있다. 특정 발현 시스템에서 가장 바람직한 분비 시그널은 대장균 ompA 분비 시그널이다. 당업자에게 공지된 기타 다른 원핵생물 및 진핵생물 분비 시그널 역시 이용할 수 있다(예컨대, von Heijne, J.Mol.Biol. 184: 99-105, 1985). 당업자는 본 명세서에 기술된 방법을 사용하여 효모, 곤충 또는 포유동물 세포 등에서 기능성이어서 이들 세포로부터 단백질을 분비시키는 분비 시그널로 치환시킬 수 있다.
대장균 세포의 형질전환에 바람직한 플라스미드에는 pET 발현 벡터(예컨대, pET-lla, pET-12a-c, pET-15b; 미국 특허 4,952,496 참조; Novagen(Madison, WI)에서 입수용이함)가 있다. 다른 바람직한 플라스미드에는 tac 프로모터를 함유하는 pKK 플라스미드, 구체적으로 pKK 223-3가 있다(Brosius et al., 1984 Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 6929; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology; 미국 특허 5,122,463, 5,173,403, 5,187,153, 5,204,254, 5,212,058, 5,212,286, 5,215,907, 5,220,013, 5,223,483 및 5,229,279). 플라스미드 pKK는 앰피실린 내성 유전자가 카나마이신 내성 유전자로 치환되어 변형된 바 있다(파마시아에서 입수용이함; pUC4K로부터 수득됨, 예컨대, Vieira et al.(1982 Gene 19 : 259-268 ; 및 미국 특허 4,719,179). 또한, 바큘로바이러스 벡터, 예컨대 pBlueBac(pVETL 및 이의 유도체로 불림), 구체적으로 pBlueBac III(예컨대, 미국 특허 5,278,050, 5,244,805, 5,243,041, 5,242,687, 5,266,317, 4,745,051 및 5,169,784; Invitrogen(San Diego)로부터 입수용이함)은 곤충 세포에서 상기 폴리펩타이드를 발현시키는데 사용할 수 있다. 다른 플라스미드에는 pIN-IIIompA 플라스미드(미국 특허 4,575,013; Duffaud et al., Meth. Enz. 153 : 492-507, 1987 참조), 예컨대 pIN-IIIompA2가 있다.
바람직하게는, 하나 이상의 DNA 분자가 박테리아 세포에서 복제된다면 바람직한 숙주는 대장균이다. 이러한 시스템에서 바람직한 DNA 분자는 추가로 박테리아 복제 오리진을 포함하여, 박테리아의 세대간에 DNA 분자가 유지될 수 있다. 이러한 방식으로 다량의 DNA 분자가 박테리아의 복제를 통해 생산될 수 있다. 이러한 발현 시스템에서 바람직한 박테리아 복제 오리진에는 fl-ori 및 co1 E1 복제 오리진이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 시스템의 바람직한 숙주는 유도성 프로모터(예컨대, lacUV 프로모터, 미국 특허 4,952,496 참조)에 작동가능하게 결합된 T7 RNA 폴리머라제를 암호하는 DNA의 염색체 카피를 포함한다. 이러한 숙주에는 용원균인 대장균 균주 HMS174(DE3)pLysS, BL21(DE3)pLysS, HMS174(DE3) 및 BL21(DE3)이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. pLys 균주는 T7 RNA 폴리머라제의 자연 억제제인 T7 리소자임을 낮은 농도로 제공한다.
제공되는 DNA 분자는 억제인자 단백질을 암호하는 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 억제인자 단백질은 억제인자 단백질이 결합하는 뉴클레오티드의 서열을 함유하는 프로모터의 전사를 억제할 수 있다. 상기 프로모터는 세포의 생리적 상태를 변경시켜 활성화될 수 있다. 예를 들어, 이러한 변경은 증식 배지에 오퍼레이터 또는 조절 단백질이나 다른 DNA 영역과 상호작용하는 능력을 억제하는 분자를 첨가하거나, 또는 증식 배지의 온도를 변경시켜 수행할 수 있다. 바람직한 억제인자 단백질에는 IPTG 유도에 반응성인 대장균 lacI 억제인자, 온도 민감성인 λcI857 억제인자 등이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 대장균 lacI 억제인자가 바람직하다.
일반적으로, 본 발명의 재조합 작제물은 전사 및 해독에 필수적인 인자를 추가로 함유할 것이다. 구체적으로, 이러한 인자는 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질을 암호하는 핵산 서열을 함유한 재조합 발현 작제물을 숙주 세포 또는 유기체에서 발현시키고자 하는 경우에 바람직하다. 본 발명의 특정 양태에 따르면, 세포 결합 도메인-면역글로불린 융합체 암호화 유전자의 세포 종류에 바람직한 발현 또는 세포 종류에 특이적인 발현은 프로모터 조절 하에 상기 유전자를 배치함으로써 성취할 수 있다. 프로모터의 선택은 형질전환될 세포 종류 및 필요한 조절의 정도 또는 종류에 따라 달라질 것이다. 프로모터는 구성형 또는 활성형일 수 있고, 추가로 세포 종류 특이적, 조직 특이적, 개별 세포 특이적, 사건 특이적, 시간 특이적 또는 유도형일 수 있다. 세포 종류 특이적 프로모터 및 사건 특이적 프로모터가 바람직하다. 구성형 또는 비특이적 프로모터의 예에는 SV40 전위 프로모터(미국 특허 5,118,627), SV40 후위 프로모터(미국 특허 5,118,627), CMV 전위 유전자 프로모터(미국 특허 5,168,062) 및 아데노바이러스 프로모터가 있다. 바이러스 프로모터외에도, 세포 프로모터 역시 본 발명의 구성 중에 사용될 수 있다. 구체적으로, 소위 하우스키핑(housekeeping) 유전자의 세포 프로모터가 유용하다. 하지만, 바이러스 프로모터가 바람직한데, 그 이유는 세포 프로모터보다 더 강력한 프로모터이기 때문이다. 프로모터 영역은 고등 진핵생물을 비롯한 다수의 진핵생물의 유전자에서 확인되어 있는 바, 특정 숙주에 사용하기에 적당한 프로모터는 당업자라면 쉽게 선택하여 사용할 수 있을 것이다.
유도형 프로모터 역시 사용될 수 있다. 이러한 프로모터에는 덱사메타손에 의한 유도성인 MMTV LTR(PCT WO 91/13160); 중금속에 의한 유도성인 메탈로티오네인 프로모터; 및 cAMP에 의한 유도성인 cAMP 반응 인자를 가진 프로모터가 있다. 유도형 프로모터를 사용할 때, 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질을 암호하는 핵산 서열은 당해 발명의 발현 작제물에 의해 세포로 전달되어, 유도제가 첨가될 때까지 침묵 상태를 유지할 것이다. 이는 유전자 산물의 생산 시기에 대한 조절을 추가로 할 수 있게 한다.
사건 종류 특이적 프로모터는 사전 발생 시, 예컨대 종양 형성 또는 바이러스 감염 시 활성이거나 상승조절된다. HIV LTR은 사건 특이적 프로모터의 공지된 예이다. 이러한 프로모터는 바이러스 감염 시 발생되는 tat 유전자 산물이 존재하지 않는다면 불활성이다. 일부 사건형 프로모터는 또한 조직 특이적이다.
또한, 특정 세포 유전자와 통합 조절되는 프로모터를 사용할 수도 있다. 예컨대, 통합 발현되는 유전자의 프로모터는 본 발명의 특정 결합 작제물의 발현 시, 예컨대 하나 이상의 추가 내인성 또는 외인성 도입 유전자의 발현과 함께 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질 암호 유전자가 필요할 때 사용할 수 있다. 이러한 종류의 프로모터는 면역계의 특정 조직 내의 면역 반응의 유도와 관련된 유전자 발현 패턴을 알아서 상기 특정 조직내의 면역능력 세포가 활성화되거나 달리 보강되어 면역반응에 참여할 수 있을 때 특히 유용하다.
프로모터 외에도, 억제인자 서열, 음성 조절인자 또는 조직 특이적 침묵인자(silencer)는 치료 전략의 일부로서 일시적 면역약화된 숙주와 같은 특정 상황에서 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질 암호 유전자의 비특이적 발현을 감소시키기 위해 삽입시킬 수 있다. 다중 억제인자 성분을 프로모터 영역에 삽입할 수 있다. 전사 억제는 억제인자의 배향 또는 프로모터와의 거리에 무관하다. 억제인자 서열의 한 종류는 격리인자(insulator) 서열이다. 이러한 서열은 전사를 억제하고(Dunaway et al., 1997 Mol Cell Biol 17 : 182-9 ; Gdula et al., 1996 Proc Natl Acad Sci USA 93 : 9378-83, Chan et al., 1996 J Virol 70 : 5312-28 ; Scott and Geyer, 1995 EMBO J 14 : 6258-67 ; Kalos and Fournier, 1995 Mol Cell Biol 15 : 198-207 ; Chung et al., 1993 Cell 74 : 505-14), 불필요한 배경 전사를 정지시킬 것이다.
억제인자 성분은 또한 타입 II(연골) 콜라겐, 콜린 아세틸트란스퍼라제, 알부민(Hu et al., 1992 J. Cell Growth Differ. 3(9): 577-588), 포스포글리세레이트 키나제(PGK-2)(Misuno et al., 1992 Gene 119(2): 293-297)의 유전자들에 대한 프로모터 영역과 6-포스포프럭토-2-키나제/프럭토스-2,6-비스포스파타제 유전자(Lemaigre et al., Mol.Cell Biol. 11(2):1099-1106)에서도 발견되었다. 더욱이, 음성 조절 인자 Tse-1은 다수의 간 특이적 유전자에서 동정되었고, 간세포의 유전자를 활성화하는 cAMP 반응 인자(CRE) 매개 유도를 차단하는 것으로 밝혀져 있다(Boshart et al., 1990 Cell 61(5): 905-916).
바람직한 양태에 따르면, 목적 산물의 발현을 증가시키는 인자가 작제물에 혼입된다. 이러한 인자에는 내부 리조솜 결합 부위(IRES; Wang and Siddiqui, 1995 Curr. Top. Microbiol. Immunol 203 : 99 ; Ehrenfeld and Semler, 1995 Curr. Top. Microbiol. Immunol. 203 : 65 ; Rees et al., 1996 Biotechniques 20 : 102 ; Sugimoto et al., 1994 Biotechnology 12 : 694)가 있다. IRES는 해독 효율을 증가시킨다. 또한, 다른 서열들도 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 유전자에서, 특히 5' 말단에 있는 서열은 전사 및/또는 해독을 억제한다. 이러한 서열은 일반적으로 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 팔린드롬이다. 이러한 임의의 서열은 전달되는 핵산에서 일반적으로 결실된다. 전사체 또는 해독된 산물의 발현 농도는 발현에 영향을 미치는 서열의 확인을 위해 분석한다. 전사체 농도는 임의의 공지된 방법, 노던 블롯 하이브리드화, RNase 프로브 보호 등으로 분석할 수 있다. 단백질 농도는 ELISA, 웨스턴 블롯, 면역세포화학 또는 다른 공지의 기술을 비롯한 임의의 공지 방법으로 분석할 수 있다.
다른 인자도 본 발명의 작제물, 예컨대 본 발명의 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질 암호 작제물에 혼입될 수 있다. 바람직한 양태에 따르면, 작제물은 폴리아데닐화 서열을 비롯한 전사 종결인자 서열, 접목 공급체 및 수용체 부위, 및 인헨서를 포함한다. 포유동물 세포 또는 다른 진핵생물 세포에서 상기 작제물을 발현 및 유지시키는 데 유용한 다른 인자도 혼입될 수 있다(예컨대, 복제 오리진). 이러한 작제물은 박테이라 세포에서 생산되는 것이 편리하기 때문에, 박테리아의 전파에 필요하거나 전파를 증강시키는 인자가 혼입된다. 이러한 인자에는 복제 오리진, 선택성 마커 등이 있다.
본 명세서에 제공된 바와 같이, 유전자요법을 위해 세포로 전달하는 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질과 같은 본 발명의 작제물을 암호하는 핵산 발현의 추가 조절 수준은 2종 이상의 차동 조절되는 핵산 작제물을 동시에 전달함으로써 제공될 수 있다. 이러한 복수 핵산 작제물 접근법의 이용은 면역 반응의 통합 조절, 예컨대 세포 종류 및/또는 다른 발현 암호화 성분의 존재에 따라 좌우되는 시공적 통합 등을 허용될 수 있다. 이와 마찬가지로, 당업자는 복수의 조절 유전자 발현 수준이 프로모터, 인헨서 및 기타 다른 공지된 유전자 조절 인자의 선발을 통해서도 달성될 수 있음을 잘 알고 있을 것이다.
또한, 본 발명은 벡터, 및 본 발명의 핵산을 포함하는 공지의 벡터로 제조된 작제물, 구체적으로 본 명세서에 제시된 바와 같은 본 발명의 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질 및 폴리펩타이드 등을 암호하는 임의의 핵산을 포함하는, 유전자 요법에 유용한 전달 작제물을 비롯하여 다양한 공지의 임의의 작제물을 포함한 "재조합 발현 작제물"; 본 발명의 벡터 및/또는 다른 작제물로 유전자 조작된 숙주 세포 및 본 발명의 결합 도메인-면역글로불린 융합 폴리펩타이드 및 융합 단백질 등을 암호하는 핵산 서열, 또는 이의 단편이나 변형체를 재조합 기술을 통해 포함하는 발현 작제물 또는 다른 작제물을 투여하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다양한 작제물, 예컨대 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질은 사실상 모든 숙주 세포, 예컨대 유전자요법에 사용하기 위한 경우의 생체내 숙주 세포에서, 작제물의 성질(예컨대, 전술한 바와 같이 프로모터의 종류), 및 필요한 숙주 세포의 성질(예컨대, 유사분열후 말기 분화된 것인지 또는 능동적으로 분열중인 것인지 여부에 관계 없이; 예컨대 발현 작제물이 숙주 세포에서 에피좀으로서 형성되는지 또는 숙주 세포 게놈으로 통합되는지 여부에 관계없이)에 따라서 적당한 프로모터의 조절 하에서 발현될 수 있다.
원색생물 및 진핵생물 숙주와 함께 사용하기에 적당한 클로닝 및 발현 벡터에 대해서는, 예컨대 문헌[Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY(1989)]에 기술되어 있으며, 여기에 정리된 바와 같이, 본 발명의 특히 바람직한 양태에서 재조합 발현은 당해 발명의 재조합 발현 작제물로 형질전환 또는 형질감염된 포유동물 세포에서 수행한다. 이에 대해 다음과 같은 문헌을 참조할 수 있다: Machida, CA.,"Viral Vectors for Gene Therapy : Methods and Protocols" ; Wolff, JA,"Gene Therapeutics : Methods and Applications of Direct Gene Transfer" (Birkhauser 1994) ; Stein, U and Walther, W (eds. P, "Gene Therapy of Cancer : Methods and Protocols" (Humana Press 2000) ; Robbins, PD (ed.),"Gene Therapy Protocols" (Humana Press 1997) ; Morgan, JR (ed.),"Gene Therapy Protocols" (Humana Press 2002) ; Meager, A (ed.),"Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations : From Laboratory to Clinic" (John Wiley & Sons Inc. 1999) ; MacHida, CA and Constant, JG,"Viral Vectors for Gene Therapy : Methods and Protocols" (Humana Press 2002) ;"New Methods Of Gene Therapy For Genetic Metabolic Diseases NIH Guide,"Volume 22, Number 35, October 1, 1993. 또한, 백신을 비롯한 유전자 요법에 관한 다음과 같은 최신 미국 특허도 참조할 수 있다: 미국 특허 6,384,210 ("Solvent for biopolymer synthesis, solvent microdroplets and methods of use"); 6,384,203("Family of immunoregulators designated leukocyte immunoglobulin-like receptors (LIR)"); 6,384,202("Cell-specific active compounds regulated by the cell cycle"); 6,384,018("Polynucleotide tuberculosis vaccine"); 6,383,814("Cationic amphiphiles for intracellular delivery of therapeutic molecules"); 6,383,811("Polyampholytes for delivering polyions to a cell") ; 6,383,795("Efficient purification of adenovirus"); 6,383,794("Methods of producing high titer recombinant adeno-associated virus"); 6,383,785("Self-enhancing, pharmacologically controllable expression systems") ; 6,383,753("Yeast mammalian regulators of cell proliferation"); 6,383,746("Functional promoter for CCR5"); 6,383,743("Method for serial analysis of gene expression"); 6,383,738("Herpes simplex virus ORF P is a repressor of viral protein synthesis"); 6,383,737("Human oxalyl-CoA Decarboxylase"); 6,383,733("Methods of screening for pharmacologically active compounds for the treatment of tumour diseases"); 6,383,522("Toxicity reduced composition containing an anti-neoplastic agent and a shark cartilage extract"); 6,383,512("Vesicular complexes and methods of making and using the same"); 6,383,481("Method for transplantation of hemopoietic stem cells"); 6,383,478("Polymeric encapsulation system promoting angiogenesis"); 6,383,138 ("Method for transdermal sampling of analytes"); 6,380,382("Gene encoding a protein having diagnostic, preventive, therapeutic, and other uses"); 6,380,371("Endoglycan : a novel protein having selectin ligand and chemokine presentation activity"); 6,380,369("Human DNA mismatch repair proteins"); 6,380,362("Polynucleotides, polypeptides expressed by the polynucleotides and methods for their use"); 6,380,170("Nucleic acid construct for the cell cycle regulated expression of structural genes"); 6,380,169("Metal complex containing oligonucleoside cleavage compounds and therapies"); 6,379,967 ("Herpesvirus saimiri as viral vector"); 6,379,966("Intravascular delivery of non-viral nucleic acid protease proteins, and uses thereof').
일반적으로, 발현 작제물은 예컨대 플라스미드 벡터 유래이다. 이의 바람직한 1가지 작제물은 앰피실린 내성 유전자, 폴리아데닐화 시그널 및 T7 프로모터 부위를 암호하는 핵산 서열을 가진 변형된 pNASS 벡터(Clontech, Palo Alto, CA)이다. 다른 적당한 포유동물 발현 벡터도 공지되어 있다(예컨대, Ausubel et al., 1995 ; Sambrook et al., 상기 문헌 설명 참조; 예컨대 인비트론(Invitrogen, San Diego, CA); 노바겐(Novagen, Madison, WI); 파마시아(Pharmacia, Piscataway, NJ) 등의 카탈로그 참조). 현재 바람직한 작제물은 적당한 조절 제어 하에 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 암호 서열을 함유하여, 적당한 선발제(예컨대, 메토트렉세이트)의 적용 후 유전자 증폭으로부터 초래되는, 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질의 증강된 생산 수준을 조장하도록 제조할 수 있다.
일반적으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포의 형질전환을 허용하는 복제 오리진과 선발 마커, 및 전술한 바와 같이 하류 구조 서열의 전사를 유도하는 고도 발현성 유전자 유래의 프로모터를 포함할 것이다. 이종성 구조 서열은 해독 개시 및 종결 서열과 적당한 상태로 조합된다. 즉, 예컨대 본 명세서에 제시된 바와 같은 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질 암호성 핵산은 숙주 세포에서 결합 도메인-면역글로불린 융합 폴리펩타이드의 발현을 위해 재조합 발현 작제물로서 다양한 벡터 작제물 중 어느 하나에 포함될 수 있다. 특정 바람직한 양태에 따르면, 작제물은 생체내 투여되는 제제에 포함된다. 이러한 벡터 및 작제물은 염색체, 비염색체 및 합성 DNA 서열, 예컨대 SV40의 유도체; 박테리아 플라스미드; 파지 DNA; 효모 플라스미드; 플라스미드와 파지 DNA의 조합 유래의 벡터, 바이러스 DNA, 예컨대 백시니아, 아데노바이러스, 계두 바이러스 및 거짓광견병 바이러스, 또는 하기 기술되는 바와 같은 복제 결손형 레트로바이러스를 포함한다. 하지만, 재조합 발현 작제물의 제조를 위해 임의의 다른 벡터도 사용할 수 있으며, 바람직한 양태에서 이러한 벡터는 숙주에서 복제할 수 있고 존속가능한 것이다.
적당한 DNA 서열은 다양한 절차 등을 통해 벡터로 삽입될 수 있다. 일반적으로, DNA 서열은 당업계에 공지된 절차에 의해 적당한 제한 효소 부위로 삽입된다. 클로닝, DNA 분리, 증폭 및 정제와 DNA 리가제, DNA 폴리머라제, 제한 효소 등을 수반하는 효소 반응 및 다양한 분리 기술에 대한 표준 기술은 당업계에 공지되어 있고 일반적으로 이용되고 있다. 다수의 표준 기술이 다음과 같은 문헌에 기술되어 있다: Ausubel et al. (1993 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., Boston, MA) ; Sambrook et al. (1989 Molecular Cloning, Second Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY) ; Maniatis et al. (1982 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY) ; Glover (Ed.) (1985 DNA Cloning Vol. I and II, IRL Press, Oxford, UK) ; Hames and Higgins (Eds.), (1985 Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UK) 등.
발현 벡터의 DNA 서열은 mRNA 합성을 유도하는 적어도 하나의 적당한 발현 조절 서열(예컨대, 구성형 프로모터 또는 조절형 프로모터)에 작동적으로 결합된다. 이러한 발현 조절 서열의 대표적인 예에는 진핵생물 세포 또는 이들의 바이러스(전술한 바와 같다)의 프로모터가 포함된다. 프로모터 영역은 CAT(클로람페니콜 트란스퍼라제) 벡터 또는 선발 마커를 보유한 다른 벡터를 사용하여 임의의 바람직한 유전자 중에서 선발할 수 있다. 진핵생물 프로모터에는 CMV 인접 전위, HSV 티미딘 키나제, 전위 및 후위 SV40, 레트로바이러스 유래의 LTR 및 마우스 메탈로티오네인-I이 포함된다. 적당한 벡터 및 프로모터의 선발은 당업계의 통상의 기술 수준으로 알려져 있고, 적어도 하나의 프로모터 또는 조절 프로모터가 결합 도메인-면역글로불린 융합 폴리펩타이드를 암호하는 핵산에 작동가능하게 결합되어 있는 특히 바람직한 특정 재조합 발현 작제물의 제조에 대해서는 본 명세서에 기술되어 있다.
본 발명에 속하는 단백질 및 폴리펩타이드를 암호하는 DNA의 고등 진핵생물에 의해 전사는 벡터에 인헨서 서열의 삽입을 통해 증가시킬 수 있다. 인헨서는 전사를 증가시키는 프로모터에 작용하는 보통 약 10 내지 300bp인 DNA의 시스 작용성 인자이다. 그 예에는, 복제 오리진의 후위 측 100 내지 270bp에 있는 SV40 인헨서, 사이토메갈로바이러스 전위 프로모터 인헨서, 복제 오리진의 후위 측에 있는 폴리오마 인헨서 및 아데노바이러스 인헨서가 있다.
유전자 요법은 유전자 물질을 사용하여 질병을 치료하는 방법이다. 이 방법은 세포 및/또는 조직에 새로운 유전자를 첨가하거나 결손 유전자를 치환하는 전략을 포함하며, 암치료, 대사 장애 보정 및 면역요법 분야에 사용하기 위해 개발되고 있는 중이다. 본 발명의 유전자 요법은 본 명세서에 제시된 질병, 장애 및/또는 질환의 치료를 위하여 별도의 담체 또는 전달 매개체 또는 작제물과 존재 여부에 관계없이 본 발명의 다양한 작제물을 사용하는 것을 포함한다. 이러한 작제물은 또한 본 명세서에 제시된 질병, 장애 및/또는 질환의 치료 또는 예방을 위한 백신으로서 사용될 수 있다. DNA 백신은 예컨대 병원균 또는 종양 세포에 대한 면역계를 자극하기 위하여 면역원성 단백질 및 핵산 결정인자를 암호하는 폴리뉴클레오티드를 이용한다. 이러한 전략은 후천적 또는 선천적 면역성을 자극하거나, 또는 시토킨 발현을 통해 면역 기능의 변형을 수반할 수 있다. 생체내 유전자 요법은 사람 질병을 보유한 환자 또는 동물 모델로 유전자 물질을 직접 주사하는 것을 수반한다. 백신 및 면역 제어는 전신 치료법이다. 조직 특이적 생체내 요법의 경우, 예컨대 암 치료를 목표로 하는 요법의 경우에는 국소 유전자 전달 및/또는 발현/표적화 시스템이 바람직하다. 특정 조직을 표적화 하기 위해 다양한 유전자 요법 벡터가 설계되었고, 특정 조직을 물리적으로 표적화하기 위해 카테터 기반 기술의 이용 등과 같은 절차가 개발되었으며, 이들 모두는 본 발명에서 예상되는 기술들이다. 유전자 요법에 대한 생체외 접근법 역시 본 명세서에서 예상되는 것으로서, 환자 자신의 세포의 분리, 유전자 변형, 증식 및 재투여를 수반한다. 그 예에는 암치료를 위한 골수 이식 또는 림프계 선조 세포의 유전자 자극이 포함된다. 생체외 유전자 요법은 접근이 용이하고 유전자 전달 과정 동안 배양물에서 생존할 수 있는 세포(예컨대, 혈액 또는 피부 세포)의 치료에 적용되는 것이 바람직하다.
유용한 유전자 요법 벡터에는 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노관련 바이러스(AAV) 벡터, 단순헤르페스 바이러스(Hsv)벡터, 및 레트로바이러스 벡터가 포함된다. 유전자 요법은 또한 "나출형 DNA", 리포솜 기반 전달, 지질 기반 전달(양전하 지질에 부착된 DNA를 포함한다) 및 전기침투(electroporation)를 이용하여 수행할 수도 있다.
본 명세서에 제시된 바와 같이, 유전자 요법 양태를 비롯한 이에 국한되지 않는 특정 양태에 따르면, 벡터는 바이러스 벡터, 예컨대 레트로바이러스 벡터일 수 있다(Miller et al., 1989 BioTechniques 7 : 980 ; Coffin and Varmus, 1996 Retroviruses, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY). 예컨대, 레트로바이러스 플라스미드 벡터가 유래될 수 있는 레트로바이러스에는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스, 비장 괴사 바이러스, 레트로바이러스류(예컨대, 루스 육종 바이러스, 하비 육종 바이러스, 조류 백혈증 바이러스, 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스, 사람 면역결핍 바이러스, 아데노바이러스, 골수증식 육종 바이러스 및 유방암 바이러스)가 포함되며, 이에 국한되는 것은 아니다.
레트로바이러스는 복제하여 DNA 중간체를 통해 숙주 세포의 게놈으로 통합될 수 있는 RNA 바이러스이다. 여기서, DNA 중간체, 또는 프로바이러스는 숙주 세포 DNA로 안정적으로 통합될 수 있다. 본 발명의 특정 양태에 따르면, 발현 작제물은 정상 레트로바이러스 RNA 대신에 이종 단백질을 암호하는 이종 유전자가 혼입되어 있는 레트로바이러스를 포함할 수 있다. 레트로바이러스 RNA가 감염과 동시에 숙주 세포로 유입될 때, 이종 유전자 역시 세포로 도입되고, 그 다음 레트로바이러스 게놈의 일부일지라도 숙주 세포 DNA 중으로 통합될 수 있다. 숙주 내에서 이러한 이종 유전자의 발현은 이종 단백질을 발현시킨다.
유전자 요법용으로 개발된 대부분의 레트로바이러스 벡터 시스템은 뮤린 레트로바이러스를 기반으로 한다. 이러한 레트로바이러스는 2가지 형태, 비리온으로 불리는 유리 바이러스 입자 또는 숙주 세포 DNA로 통합된 프로바이러스로서 존재한다. 바이러스의 비리온 형태는 레트로바이러스의 구조적인 효소 단백질(역전사효소 포함), 바이러스 게놈의 2개의 RNA 카피, 및 바이러스 엔벨로프 당단백질을 함유하는 근원 세포 혈장 막의 일부를 함유한다. 레트로바이러스 게놈은 4개의 주요 영역으로 구성되어 있다: 전사 개시 및 종결에 필수적인 시스작용성 인자를 함유하고 암호 유전자의 5' 및 3' 양쪽에 위치하는 장말단 반복체(LTR), 및 3개의 암호 유전자인 gag, pol 및 env. 이러한 3개의 유전자 gag, pol 및 env는 각각 내부 바이러스 구조, 효소 단백질(예컨대, 인테그라제), 및 바이러스의 감염성 및 숙주 범위 특이성을 부여하는 엔벨로프 당단백질(gp70 및 p15e로 지칭됨) 뿐만 아니라 미측정의 기능을 가진 "R" 펩타이드를 암호한다.
본 발명에 의해 제공되는 바와 같은 발현 작제물에 레트로바이러스의 사용을 비롯하여 레트로바이러스의 사용에 관한 안전성 문제로 인하여, 별도의 패키징 세포주 및 벡터 생산 세포주를 개발했다. 간략히 설명하면, 이 방법은 2가지 성분, 즉 레트로바이러스 벡터와 패키징 세포주(PCL)를 이용한다. 레트로바이러스 벡터는 장말단 반복체(LTR), 전달될 이종 DNA 및 포장 서열(y)을 함유한다. 이러한 레트로바이러스 벡터는 구조 단백질 및 엔벨로프 단백질을 암호하는 유전자가 벡터 게놈에 포함되어 있지 않기 때문에 스스로 복제할 수 없다. PCL은 gag, pol 및 env 단백질을 암호하는 유전자를 함유하지만 패키징 시그널 "y"는 함유하지 않는다. 즉, PCL은 스스로 빈 비리온 입자만을 형성할 수 있다. 이러한 일반적 방법에서, 레트로바이러스 벡터는 PCL에 도입되어 벡터 생산 세포주(VCL)를 생산한다. 이러한 VCL은 레트로바이러스 벡터(이종) 게놈만을 함유하는 비리온 입자를 제조하고, 따라서 치료용으로 안전한 레트로바이러스 벡터인 것으로 종래 간주된 바 있다.
"레트로바이러스 벡터 작제물"은 본 발명의 바람직한 양태에 따라 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질 암호 핵산 서열과 같은 당해 서열 또는 유전자의 발현을 유도할 수 있는 조합체를 의미한다. 간략히 설명하면, 레트로바이러스 벡터 작제물은 5' LTR, tRNA 결합 부위, 패키징 시그널, 제2 가닥 DNA 합성 오리진 및 3' LTR을 포함해야 한다. 이러한 벡터 작제물에는 다양한 이종 서열, 예컨대 단백질(예컨대, 세포독성 단백질, 질병 관련 항원, 면역 보조 분자 또는 치환 유전자)을 암호하는 서열, 또는 분자 자체가 유용한 서열(예컨대, 리보자임 또는 안티센스 서열) 등이 포함될 수 있다.
본 발명의 레트로바이러스 벡터 작제물은 다양한 레트로바이러스, 예컨대 B형, C형 및 D형 레트로바이러스뿐만 아니라 스푸마바이러스(spumavirus) 및 렌티바이러스(예컨대, RNA Tumor Viruses, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 1985 참조) 등으로부터 쉽게 작제될 수 있다. 이러한 레트로바이러스들은 미국 모식균 배양 수집소("ATCC"; Rockville, Maryland)와 같은 기탁 기관이나 수집 기관에서 쉽게 입수하거나 또는 통용되는 기술을 사용하여 공지의 근원으로부터 분리할 수도 있다. 전술한 임의의 레트로바이러스는 본 명세서에 제시된 상세한 설명과 표준 재조합 기술(Sambrook et al, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 ; Kunkle, 1985 PNAS 82 : 488)을 통해 본 발명의 레트로바이러스 벡터 작제물, 패키징 세포 또는 생산자 세포를 조합 또는 작제하는 데 쉽게 이용될 수 있다.
바이러스 벡터에 사용하기에 적당한 프로모터는 일반적으로 레트로바이러스 LTR; SV40 프로모터; 및 문헌[Miller et al., 1989 Biotechniques 7:980-990]에 기술된 바와 같은 사람 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 또는 임의의 다른 프로모터(예컨대, 히스톤, pol III 및 β-액틴 프로모터 등을 이에 국한함이 없이 포함하는 진핵생물 세포 프로모터 등의 세포 프로모터)를 포함할 수 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다. 이용될 수 있는 다른 바이러스 프로모터에는 아데노바이러스 프로모터, 티미딘 키나제(TK) 프로모터 및 B19 파르보바이러스 프로모터가 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다. 적당한 프로모터의 선발은 본 명세서에 포함된 교시로부터 당업자라면 쉽게 수행할 수 있고, 전술한 바와 같은 프로모터 또는 조절 프로모터 중에서 선택할 수 있다.
전술한 바와 같이, 레트로바이러스 플라스미드 벡터는 패키징 세포주를 형질도입시켜 생산자 세포주를 형성하는 데 이용된다. 형질감염될 수 있는 패키징 세포의 예에는 PE501, PA317, ψ-2, ψ-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, ψCRE, ψCRIP, GP+E-86, GP+envAm12, 및 DAN 세포주(Miller, Human Gene Therapy, 1:5-14(1990)에 기술되어 있음)가 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 벡터는 당업계에 공지된 임의의 방법을 통해 패키징 세포를 형질도입시킬 수 있다. 이러한 방법에는, 전기침투, 리포좀의 사용 및 CaPO4 침전법이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 대체예로서, 레트로바이러스 플라스미드 벡터는 리포좀에 캡슐화되거나 또는 지질에 커플링된 후 숙주로 투여될 수 있다.
생산자 세포주는 결합 도메인-면역글로불린 융합 폴리펩타이드 또는 융합 단백질을 암호하는 핵산 서열을 포함한 감염성 레트로바이러스 벡터 입자를 생산한다. 이러한 레트로바이러스 벡터 입자는 그 다음 진핵생물 세포를 시험관내 또는 생체내에서 형질도입시키는 데 사용될 수 있다. 형질도입된 진핵생물 세포는 결합 도메인-면역글로불린 융합 폴리펩타이드 또는 융합 단백질을 암호하는 핵산 서열을 발현할 것이다. 형질도입될 수 있는 진핵생물 세포에는 배아 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 간세포, 섬유아세포, 혈행 말초 혈액 단핵 및 다형핵 세포, 예컨대 골수단핵구 세포, 림프구, 근육모세포, 조직 대식세포, 수지상 세포, 쿠퍼 세포, 림프절 및 비장의 림프계 및 세망내피 세포, 각질세포, 내피세포 및 기관지 상피세포 등을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.
재조합 결합 도메인-면역글로불린 융합 발현 작제물 등의 제조에 바이러스 벡터를 사용한 본 발명의 일 양태의 다른 예로서, 바람직한 일 양태에 따르면 결합 도메인-면역글로불린 융합 폴리펩타이드 또는 융합 단백질의 발현을 유도하는 재조합 바이러스 작제물에 의해 형질도입된 숙주 세포는 바이러스 발아 동안 바이러스 입자에 의해 혼입되는 숙주 세포막의 일부에서 유래되는 발현된 결합 도메인-면역글로불린 융합 폴리펩타이드 또는 융합 단백질을 함유하는 바이러스 입자를 생산할 수 있다.
다른 관점으로서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 핵산 작제물, 예컨대 재조합 결합 도메인-면역글로불린 융합 발현 작제물을 함유하는 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 예컨대 클로닝 벡터, 셔틀 벡터 또는 발현 작제물일 수 있는 본 발명의 벡터 및/또는 발현 작제물로 유전자 조작(형질도입, 형질전환 또는 형질감염)된다. 이러한 벡터 또는 작제물은 예컨대 플라스미드, 바이러스 입자, 파지 등의 형태일 수 있다. 유전자조작된 숙주 세포는 프로모터 활성화, 형질전환체 선발 또는 결합 도메인-면역글로불린 융합 폴리펩타이드 또는 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질을 암호하는 유전자와 같은 특정 유전자의 증폭에 적당하게 변형된 통상의 영양 배지에서 배양될 수 있다. 온도, pH 등과 같이 발현에 대해 선발되는 특정 숙주 세포의 배양 조건은 당업자라면 쉽게 알 수 있을 것이다.
본 발명의 작제물의 생산 또는 발현에 사용되는 숙주 세포는 예컨대 포유동물 세포와 같은 고등 진핵생물 세포이거나 또는 효모 세포와 같은 하등 진핵생물 세포, 또는 박테리아 세포와 같은 원핵생물 세포일 수 있다. 본 발명에 따른 적당한 숙주 세포의 대표적인 예에는 대장균, 스트렙토마이세스, 살모넬라 티피뮤리엄과 같은 박테리아 세포, 효모와 같은 진균 세포; 드로소필란 S2 및 스포도프테라 Sf9와 같은 곤충 세포; CHO, COS 또는 293 세포와 같은 동물 세포; 아데노바이러스; 식물 세포, 또는 시험관내 전파를 위해 미리 조작되거나 또는 이와 같이 새로 확립된 임의의 적당한 세포 등이 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다. 적당한 숙주의 선발은 본 명세서의 교시로부터 당업자라면 쉽게 수행할 수 있을 것이다.
또한, 재조합 단백질의 발현에는 다양한 포유동물 세포 배양물 시스템도 이용할 수 있다. 포유동물 발현 시스템의 예에는 원숭이 신장 섬유아세포의 COS-7 세포주(Gluzman, 1981 Cell 23: 175), 및 C127, 3T3, CHO, HeLa 및 BHK 세포주와 같은 융합성 벡터를 발현할 수 있는 다른 세포주가 포함된다. 포유동물 발현 벡터는 복제 오리진, 적당한 프로모터 및 인헨서, 및 추가로 임의의 필요한 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 접목 공급체 및 수용체 부위, 전사 종결 서열, 및 5' 인접 비전사 서열(예컨대, 결합 도메인-면역글로불린 융합 발현 작제물의 제조에 관하여 본 명세서에 기술된 바와 같은 서열)을 포함할 것이다. SV40 접목 유래의 DNA 서열 및 폴리아데닐화 부위는 필요한 비전사 유전 인자를 제공하는 데 사용될 수 있다. 이러한 작제물의 숙주 세포로의 도입은 당업자에게 익숙한 다양한 방법을 통해 수행될 수 있으며, 그 예로는 인산칼슘 침전법, DEAD-덱스트란 매개 형질감염 또는 전기침투(Davis et al., 1986 Basic Methods in Molecular Biology) 등이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 발명의 작제물, 예컨대 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질, 또는 본 명세서에 기술된 것과 같은 상기 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 조성물(예컨대, 무엇보다도 유전자 요법을 위해 생체내 또는 시험관내의 숙주 세포에서 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질의 발현을 허용하기에 충분한 조건 및 시간 동안 투여되는 것)은 공지의 방법에 따라 투여용 약학 조성물로 조제될 수 있다. 약학 조성물은 일반적으로 하나 이상의 재조합 발현 작제물 및/또는 이러한 작제물의 발현 산물을 약학적 허용성 담체, 부형제 또는 희석제와 함께 함유한다. 이러한 담체는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용체에 대해 비독성인 것이다. 핵산 기반 제제이거나 또는 당해 발명의 재조합 작제물의 발현 산물을 함유하는 제제인 경우에, 약 0.01㎍/kg 내지 약 100mg/kg(체중)이, 예컨대 통상적으로 피내, 피하, 근육내 또는 정맥내 경로를 통해 또는 기타 다른 경로를 통해 투여될 수 있다. 바람직한 투여량은 예컨대 약 1㎍/kg 내지 약 1mg/kg이고, 특히 약 5㎍/kg 내지 약 200㎍/kg 범위가 더욱 바람직하다. 투여 횟수 및 빈도는 숙주의 반응에 따라 달라진다는 것은 당업자에게 자명한 것이다. 치료용의 "약학적 허용성 담체"는 약제 분야에 공지되어 있고, 예컨대 문헌[Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985)]에 기술되어 있다. 예를 들어, 생리적 pH의 멸균 식염수 및 인산염 완충 식염수가 사용될 수 있다. 이러한 약학 조성물에는 보존제, 안정제, 염료 및 심지어 향미제가 제공될 수도 있다. 예를 들어, 벤조산나트륨, 소르브산 및 p-하이드록시벤조산의 에스테르가 보존제로서 첨가될 수 있다(동일 문헌, 1449). 또한, 산화방지제 및 현탁제가 사용될 수도 있다(동일 문헌).
"약학적 허용성 염"은 본 발명의 화합물과 유기산 또는 무기산(산 부가 염), 또는 유기 염기 또는 무기 염기(염기 부가 염)의 조합으로부터 유래되는 본 발명의 화합물의 염을 의미한다. 본 발명의 화합물은 유리 염기 또는 염 형태 중 하나로 사용될 수 있고, 이러한 형태 모두 본 발명의 범위에 속하는 것으로 간주될 수 있다.
본 발명의 하나 이상의 핵산 작제물, 예컨대 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질 암호 작제물(또는 이의 발현 산물)을 함유하는 약학 조성물은 환자에게 투여될 수 있는 임의의 형태일 수 있다. 예를 들어, 조성물은 고체, 액체 또는 기체(에어로졸) 형태일 수 있다. 통상적인 투여 경로에는 경구, 국소, 비경구(예, 설하 또는 협측), 설하, 직장, 질내 및 비내 경로를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 본 명세서에 사용된 비경구란 용어에는 피하 주사, 정맥내, 근육내, 흉골내, 해면내, 경막내, 외이도내, 요도내 주사 또는 주입 기술을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 약학 조성물은 환자에게 투여 시 조성물에 함유된 활성 성분이 생체이용될 수 있도록 조제한다. 환자에게 투여될 수 있는 조성물은 1종 이상의 투여량 단위 형태일 수 있으며, 예를 들어 정제는 단일 투여량 단위일 수 있고, 본 발명의 1종 이상의 화합물을 에어로졸 형태로 함유하는 용기는 복수의 투여량 단위를 보유할 수 있다.
경구 투여 시, 부형제 및/또는 결합제가 첨가될 수 있다. 그 예에는 슈크로스, 카올린, 글리세린, 전분 덱스트린, 알긴산나트륨, 카르복시메틸셀룰로스 및 에틸셀룰로스가 있다. 착색제 및/또는 향미제가 첨가될 수도 있다. 코팅 피막이 이용될 수도 있다.
조성물은 액체 형태로서, 예컨대 엘릭시르, 시럽, 용액제, 유상액제 또는 현탁액제일 수 있다. 액체는 2가지 예로서 경구 투여용 또는 주사 투여용으로 사용될 수 있다. 경구 투여용인 경우, 바람직한 조성물은 하나 이상의 결합 도메인-면역글로불린 융합 작제물 또는 발현 산물외에, 하나 이상의 감미제, 보존제, 염료/착삭제 및 향미 증강제를 함유할 수 있다. 주사 투여 조성물에는 예컨대 계면활성제, 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 완충액, 안정제 및 등장제 중 하나 이상이 함유될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 액체 약학 조성물은 용액제, 현탁액제 형태 또는 기타 다른 유사 형태의 여부에 관계없이 다음과 같은 하나 이상의 보강제를 함유할 수 있다: 멸균 희석제, 예컨대 주사용 수, 식염수 용액, 바람직하게는 생리 식염수, 링거액, 등장성 염화나트륨, 고정용 오일, 예컨대 합성 모노글리세라이드 및 디글리세라이드(용매 또는 현탁 매질로서 작용할 수 있다), 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 용매; 항균제, 예컨대 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 중아황산나트륨; 킬레이트화제, 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충제, 예컨대 아세트산염, 구연산염, 또는 인산염, 및 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같은 장성 조정제. 비경구 제제는 앰플, 일회용 주사기 또는 유리나 플라스틱으로 제조된 분할 용량 바이엘로 포장될 수 있다. 생리적 식염수가 바람직한 보강제이다. 주사용 약학 조성물은 멸균성인 것이 바람직하다.
또한, 제제에 또 다른 성분이 포함되는 것이 바람직할 수 있는데, 그 예에는 전달 매개체, 예컨대 알루미늄 염, 유중수 에멀젼, 생체분해성 오일 매개체, 수중유 에멀젼, 생체분해성 마이크로캡슐, 및 리포좀이 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 매개체에 유용한 면역자극 물질(보강제)의 예에는 N-아세틸뮤라밀-L-알라닌-D-이소글루타민(MDP), 리포폴리사카라이드(LPS), 글루칸, IL-12, GM-CSF, 감마 인터페론 및 IL-15가 있다.
당업자에게 공지된 임의의 적당한 담체는 본 발명의 약학 조성물에 이용할 수 있지만, 담체의 종류는 투여 방식 및 지속 방출 여부에 따라 달라질 수 있다. 피하 주사와 같은 비경구 투여 시, 담체는 물, 식염수, 알코올, 지방, 왁스 또는 완충액을 함유하는 것이 바람직하다. 경구 투여 시, 전술한 임의의 담체, 또는 고체 담체, 예컨대 만니톨, 락토스, 전분, 스테아린산 마그네슘, 사카린 나트륨, 탈컴, 셀룰로스, 글루코스, 슈크로스 및 탄산마그네슘 등이 이용될 수 있다. 생체분해성 미소구(예컨대, 폴리락틱 갈락타이드)도 본 발명의 약학 조성물의 담체로서 이용될 수 있다. 적당한 생체분해성 미소구에 대해서는 미국 특허 4,897,268 및 5,075,109에 개시되어 있다. 이와 관련하여, 미소구는 약 25 마이크론보다 큰 것이 바람직하다.
약학 조성물은 또한 완충액과 같은 희석제, 아스코르브산과 같은 항산화제, 저분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩타이드, 단백질, 아미노산, 글루코스, 슈크로스 또는 덱스트린을 함유하는 탄수화물, 킬레이트제, 예컨대 EDTA, 글루타치온 및 다른 안정화제 및 부형제를 포함할 수 있다. 중성 완충성 식염수 또는 비특이적 혈청 알부민이 혼합된 식염수는 적당한 희석제의 예이다. 산물은 희석제로서 적당한 부형제 용액(예컨대, 슈크로스)을 사용하여 동결건조물로서 제조되는 것이 바람직하다.
전술한 바와 같이, 본 발명은 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질을 암호하는 핵산 분자를 전달할 수 있는 조성물을 포함한다. 이러한 조성물은 재조합 바이러스 벡터(예컨대, 레트로바이러스(WO 90/07936, WO 91/02805, WO 93/25234, WO 93/25698, 및 WO 94/03622 참조), 아데노바이러스(Berkner, 1988 Biotechniques 6 : 616-627; Li et al., 1993 Hum. Gene tiller. 4: 403-409; Vincent et al., Nat. Genet. 5 : 130-134; 및 Kolls et al., 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 215-219), 수두 바이러스(미국 특허 4,769,330; 미국 특허 5,017,487; 및 WO 89/01973 참조), 다양이온 분자에 결합된 재조합 발현 작제물 핵산 분자(WO 93/03709 참조), 및 리포좀에 결합된 핵산(Wang et al., 1987 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 : 7851 참조)이 포함된다. 특정 양태에서, DNA는 사멸 또는 불활성화된 아데노바이러스에 결합될 수 있다(Curiel et al., 1992 Hum. Gene Ther. 3: 147-154; Cotton et al., 1992 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 : 6094). 다른 적당한 조성물에는 DNA-리간드(Wu et al., 1989 J : Biol. Chem. 264 : 16985-16987 참조) 및 지질-DNA 조합물(Felgner et al., 1989 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 : 7413- 7417 참조)도 있다.
직접적인 생체내 절차 외에도, 생체외 절차를 사용하여 세포를 숙주로부터 분리한 뒤, 변형시킨 다음 동일하거나 상이한 숙주 동물로 투여할 수 있다. 이러한 생체외 상황에서 조직 세포로 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질과 같은 본 발명의 작제물 또는 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질 암호화 핵산 분자의 도입에는 전술한 조성물 중 임의의 조성물을 이용할 수 있다는 것은 자명한 것이다. 바이러스적, 물리적 및 화학적 흡수 방법의 프로토콜은 당업계에 공지되어 있다.
따라서, 본 발명은 B 세포 장애 또는 악성 질환의 환자를 치료하거나 또는 이러한 환자 유래의 세포 배양물을 처리하는 데 유용하다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "환자"란 용어는 임의의 온혈 동물, 바람직하게는 사람을 의미한다. 환자는 암이나 악성 질환, 예컨대 B 세포 림프종을 앓고 있거나 또는 정상인(즉, 검출가능한 질병 및 감염이 없는)일 수 있다. "세포 배양물"은 생체외 처리를 받을 수 있는 모든 제조물, 예컨대 면역능력 세포 또는 면역계의 세포 분리물(예컨대, T 세포, 대식세포, 단핵구, B 세포 및 수지상 세포 등을 포함하며, 이에 국한되는 것은 아니다)을 함유하는 제조물을 포함한다. 이러한 세포는 당업자에게 공지된 다양한 임의의 기술을 이용하여 분리할 수 있다(예컨대, 피콜-하이파크 밀도 원심분리). 세포는 B 세포 장애 또는 악성 질환을 앓고 있는 환자로부터 분리한 다음, 치료 후 환자에게 재도입시킬 수 있다.
비경구 또는 경구 투여를 위한 액체 조성물은 본 발명의 작제물, 예컨대 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질 암호화 작제물 또는 발현된 산물의 일정량을 함유하여 적당한 투여량을 제공할 수 있다. 일반적으로, 이러한 양은 조성물의 적어도 0.01wt%의 결합 도메인-면역글로불린 융합 작제물 또는 발현 산물이다. 경구 투여용인 경우, 이 양은 조성물의 0.1 내지 약 70중량% 사이일 수 있다. 바람직한 경구 조성물은 약 4 내지 약 50%의 결합 도메인-면역글로불린 융합 작제물 또는 발현된 산물을 함유한다. 발마직한 조성물 및 제제는 예컨대 비경구 투여량 단위가 0.01 내지 1중량%의 활성 화합물을 함유하도록 제조된 것이다.
약학 조성물은 국소 투여용일 수 있는데, 이 경우에 담체는 용액, 유상액, 연고 또는 겔 베이스를 적당하게 포함할 수 있다. 베이스는 예를 들어 바셀린, 라놀린, 폴리에틸렌 글리콜, 밀납, 광유, 물과 알코올 같은 희석제 및 유화제 및 안정제 중에서 하나 이상을 함유할 수 있다. 점증제는 국소 투여용 약학 조성물에 첨가될 수 있다. 경피 투여용의 경우, 조성물은 경피 패치 또는 이온삼투요법 장치를 포함할 수 있다. 국조 제제는 본 발명의 작제물, 예컨대 결합 도메인-면역글로불린 융합 작제물 또는 발현 산물을 약 0.1 내지 약 10w/v%(중량/단위 부피)의 양으로 함유할 수 있다.
조성물은 직장 투여용으로, 예컨대 직장에서 용해되어 약물을 방출하는 좌약 형태일 수 있다. 직장 투여용 조성물은 적당한 비자극 부형제로서 유성 베이스를 함유할 수 있다. 이러한 베이스에는 라놀린, 코코아 버터 및 폴리에틸렌 글리콜이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 발명의 방법에서 결합 도메인-면역글로불린 융합 암호 작제물 또는 발현 산물과 같은 본 발명의 작제물은 삽입물, 비드, 시간 맞춰진 방출 제제, 패치 또는 급속 방출 제제 등의 사용을 통해 투여될 수 있다.
본 발명의 작제물, 예컨대 본 발명의 항원 결합 작제물은 다른 화합물과 함께 또는 다른 화합물과 동시에, 또는 다른 화합물과 거의 동시에 동물이나 환자에게 투여 또는 공동 투여될 수 있다. 일 관점에서, 하나 이상의 항원 결합 작제물을 비롯한 하나 이상의 작제물은 하나 이상의 화학치료용 화합물, 예컨대 알킬화제, 뉴클레오사이드 유사체 등과 함께 동물이나 환자에게 투여된다. 본 발명의 하나 이상의 항원 결합 작제물을 비롯한 하나 이상의 작제물과 하나 이상의 화학치료제의 투여 또는 공동 투여는 동물이나 환자의 종양이나 암을 치료하는 데 사용될 수 있다. 암의 예에는 두경부 암, 유방암, 결장직장 암, 위암, 간암, 방광암, 경부암, 자궁내막암, 폐암(비-소세포), 난소암, 췌장암, 전립선암, 융모막암종(폐암); 털모양 세포 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 급성 림프세포 백혈병(유방 및 방광), 급성 골수 백혈병, 수막 백혈병, 만성 골수 백혈병, 적백혈병이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 더욱 일반적으로, 치료되는 암에는 비호지킨 림프종(골원성 육종, 성인 연조직 육종), T 세포 림프종, 만성 림프세포 백혈병, 지연 성장성 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종 및 난소암이 있다.
본 발명의 하나 이상의 작제물, 예컨대 하나 이상의 항원 결합 작제물과 공동 투여될 수 있는 알킬화제의 예에는 메클로레타민, 클로람부실, 이포스파미드, 멜파란, 부설판, 카무스틴, 로무스틴, 프로카바진, 다카다진, 시스플라틴, 카보플라틴, 미토마이신 C, 사이클로포스파미드, 이소스파미드, 헥사메틸멜라민, 티오테파 및 다카바진, 및 이의 유사체가 있다. 클로람부실의 합성에 관한 미국 특허 3,046,301, 이포스파미드의 합성에 관한 미국 특허 3,732,340, 사이클로포스파미드의 합성에 관한 미국 특허 3,018,302, 멜파란의 합성에 관한 미국 특허 3,032,584, 및 사이클로포스파미드, 클로람부실, 멜파란, 이포스파미드, 프로카바진, 헥사메틸멜라민, 시스플라틴 및 카보플라틴의 임상적 측면에 관한 브라운월드 등의 문헌(Braunwald et al.,"Harrison's Principles of Internal Medicine,"15th Ed., McGraw-Hill, New York, NY, pp. 536-544 (2001))을 참조할 수 있다. 뉴클레오사이드 유사체의 예에는 플루다라빈, 펜토스타틴, 메토트렉세이트, 플루오로우라실, 플루오로데옥시우리딘, CB3717, 아자시티딘, 시타라빈, 플록스우리딘, 머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 클라드리빈 및 이의 유사체가 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다. 일 예는 CD20에 결합하는 항원 결합 작제물과 같은 작제물의 조합이다. 이러한 작제물은 약제민감제로서 작용하며, 화학요법제와 함께 사용되어, 항종양 또는 항암 효과를 달성하는데 필요한 화학요법제의 양을 감소시킨다. 그 예에 대해서는, 펜토스사틴의 합성에 관한 미국 특허 3,923,785, 메토트렉세이트의 합성에 관한 미국 특허 4,080,325, 플루오로우라실의 합성에 관한 미국 특허 2,802,005, 및 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 시토신 아라비노사이드, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌 및 플루다라빈 포스페이트의 임상적 측면에 관한 브라운월드 등의 문헌(Braunwald et al.,"Harrison's Principles of Internal Medicine,"15th Ed., McGraw-Hill, New York, NY, pp. 536-544 (2001))을 참조할 수 있다.
다른 관점으로서, 본 발명의 하나 이상의 작제물, 예컨대 하나 이상의 항원 결합 작제물은 세포 중에서 핵산과 상호작용할 수 있는 화합물 또는 토포이소머라제 II를 억제하는 화합물과 투여 또는 공동 투여될 수 있다. 이러한 화합물에는 예컨대 독소루비신, 에피루비신, 에토포사이드, 테니포사이드, 미토산트론 및 이의 유사체가 있다. 일 예로서, 이러한 조합은 고용량의 화학요법 및 자가조직의 줄기세포 지지체(HDC-ASCT)와 함께 말초 혈액 선조 세포(PBSC)의 종양 세포 불순물을 감소시키는 치료에 사용된다(미국 특허 6,586,428, Geroni et al. 참조).
다른 관점에서, 본 발명의 하나 이상의 작제물, 예컨대 하나 이상의 항원 결합 작제물은 치료 약물과 함께 투여 또는 공동 투여될 수 있다. 그 예에는, 시험관내에서 종양 세포에 의한 종양 괴사 인자, TNF-α의 방출을 자극하고, 대식세포의 활성화를 자극하는 것으로 추정되는 비룰리진(로러스 세러퓨틱스사)이 있다. 이 제제는 본 발명의 하나 이상의 작제물, 예컨대 하나 이상의 항원 결합 작제물과 함께, 암세포 아폽토시스를 증가시키고 췌장암, 악성 흑색종, 카포시 육종(KS), 페암, 유방암, 자궁, 난소 및 경부 암을 비롯한 각종 암을 치료하는데 사용될 수 있다. 또 다른 예는 NK 세포 및 단핵구를 활성화시키고 ADCC를 증강시키는 것으로 추정되는 CpG7909(콜레이 파마슈티컬 그룹 사)가 있다. 이 약물은 본 발명의 암 또는 종양 특이적 작제물, 예컨대 항CD20 작제물과 같은 항원 결합 작제물과 함께 비호지킨 림프종 및 기타 다른 암을 치료하는데 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 하나 이상의 작제물, 예컨대 하나 이상의 항원 결합 작제물은 혈관형성 억제제와 조합되어 항종양 효과를 증가시킬 수 있다. 혈관형성은 새로운 혈관의 증식이다. 이 과정은 종양을 증식 및 전이시킨다. 혈관형성 억제는 전이를 방지하여 종양 세포의 확산을 차단할 수 있다. 혈관형성 억제제에는 안지오스타틴, 엔도스타틴, 트롬보스폰딘, 혈소판 인자 4, 연골 유래 억제제(CDI), 레티노이드, 인터류킨-12, 메탈로프로테이나제 1, 2 및 3의 조직 억제제(TIMP-1, TIMP-2 및 TIMP-3) 및 항VEGF(혈관 내피세포 성장 인자) 및 IFN-α와 같은 혈관형성 시그널링 캐스캐이드를 차단하는 단백질이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 혈관형성 억제제는 종양 특이 작제물, 예컨대 본 발명의 ADCC 및/또는 보체 고정화 또는 화학요법-접합 항원 결합을 매개할 수 있는 항원 결합 작제물과 함께 다양한 종류의 암, 예컨대 폐암 및 유방암과 같은 고형 종양 암을 퇴치하기 위해 투여 또는 공동 투여될 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명의 하나 이상의 작제물, 예컨대 하나 이상의 항원 결합 작제물은 질병 변형 항류마티스제(DMAR제)와 함께 류마티스성 관절염, 건선, 궤양성 대장염, 전신홍반루푸스(SLE), 크론병, 강직 척추염, 및 각종 염증 질환 과정의 치료를 위해 투여 또는 공동 투여될 수 있다. 이러한 치료에서, 본 발명의 작제물, 예컨대 항원 결합 작제물은 일반적으로 아자티오프린, 사이클로스포린, 금, 하이드록시클로로퀸, 메토트렉세이트, 페니칼라민, 설파살라진 등과 같은 화합물과 함께 투여된다.
다른 관점에서, 본 발명의 하나 이상의 작제물, 예컨대 하나 이상의 항원 결합 작제물은 인터류킨-1의 생물학적 효과에 반대작용하는 제제 또는 화합물, 예컨대 인터류킨-1 억제제 및 인터류킨-1 수용체 길항물질과 함께 투여 또는 공동 투여될 수 있다. 인터류킨-1은 류마티스성 관절염(RA), 염증 발생 및 관절 파괴에 일 역할을 하는 것으로 생각된다. 또한, IL-1 억제제는 본 발명의 작제물, 예컨대 항원 결합 작제물과 함께 관절염, 염증성 장 질환, 패혈증 및 감염 쇼크, 허혈 손상, 재관류, 허혈 뇌 손상, 예컨대 뇌성마비 및 다발성 경화증 등의 치료에 사용될 수 있다. (미국 특허 6,159,460, Thompson et al. 참조). 다른 관점에서, 본 발명의 하나 이상의 작제물, 예컨대 하나 이상의 항원 결합 작제물은 하나 이상의 글루코코르티코이드, 예컨대 메틸프레드니실론, 덱사메타손, 하이드로코르티손 등과 함께 동물 또는 환자에게 투여 또는 공동 투여될 수 있다. 글루코코르티코이드는 ADCC 및 CDC에 관계없이 아폽토시스를 유도하고 증식을 억제하는 데 사용되어 왔다. 이러한 화합물은 암세포의 아폽토시스를 유도할 수 있는 본 발명의 작제물, 예컨대 항원 결합 작제물과 조합될 수 있다. 일 예에는 B 세포에서 아폽토시스를 유도하는 데 사용될 수 있는 항CD20 및 항CD40 항원 결합 작제물이 있으며, 이는 글루코코르티코이드와 함께 B 세포 비호지킨 림프종(NHL)을 치료하는데 사용될 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명의 하나 이상의 작제물, 예컨대 하나 이상의 항원 결합 작제물은 p38 억제제 또는 길항물질과 함께 투여 또는 공동 투여될 수 있다. p38 분열촉진물질-활성화된 단백질 키나제 경로는 류마티스성 관절염의 진행에 수단이 되는 다수의 세포 과정에 관련되어 있다. 예를 들어, 백혈구세포의 활성화 및 침윤뿐만 아니라 염증성 시토킨의 생산은 p38에 의존적인 과정이다.
다른 관점에서, 본 발명의 하나 이상의 작제물, 예컨대 하나 이상의 항원 결합 작제물은 B 세포의 분화 및 증식을 촉진하는 화합물과 함께 투여 또는 공동 투여된다. 인터류킨-4(IL-4) 및 인터류킨-6(IL-6)과 같은 시토킨은 다른 생물학적 활성 외에도 활성화된 B 림프구에 의해 항체 합성 및 분비를 자극하는 것으로 밝혀져 있다. 본 발명의 특정 관점에 따르면, CD20을 인식하여 결합하는 항원 결합 작제물과 같은 작제물은 인터류킨-4(IL-4) 및 인터류킨-6(IL-6) 중 하나 이상과 공동 투여된다.
다른 관점에서, 본 발명의 하나 이상의 작제물, 예컨대 하나 이상의 항원 결합 작제물은 인터류킨-2(IL-2)와 함께 투여되거나 공동 투여될 수 있다. 인터류킨-2(IL-2)는 CD4+ T-헬퍼 세포, CD8 세포독성 세포, 항체 생산성 B 세포, 자연 킬러 세포(NK) 및 단핵구/대식세포와 같은 작동세포의 생산을 증가시키는 림포킨이다. IL-2는 T 세포 생산을 돕고, 그 후 더 많은 IL-2가 분비된다("자가분비 루프"). IL-2는 또한 항체 의존 세포 매개 세포독성(ADCC) 및 본 발명의 작제물과 결합된 면역요법을 증대시키는 데 사용될 수 있다. 일 예로서, 본 발명의 항CD20 작제물 및 IL-2는 재발 또는 불응성 소포 비호지킨 림프종 환자의 치료에 사용된다. 다른 예에서, IL-2는 T 세포 복구를 돕기 위해 HIV 면역요법제와 함께 투여 또는 공동투여된다.
다른 관점에서, 본 발명의 하나 이상의 작제물, 예컨대 하나 이상의 항원 결합 작제물은 인터류킨-12(IL-12)와 함께 투여 또는 공동 투여될 수 있다. IL-12는 세포용해성 T 세포 반응을 증강시키고, 헬퍼 T 세포의 발생을 촉진하고, 자연 킬러(NK) 세포의 활성을 증가시키며 T 세포 및 NK 세포에서 IFN-γ 분비를 유도하는 것으로 알려져 있다. IL-12는 또한 아폽토시스를 매개하는 다수의 헬퍼 및 작동 세포를 증가시킨다. 본 발명의 다른 관점에서, 하나 이상의 작제물, 예컨대 하나 이상의 항원 결합 작제물은 종양 또는 암에 걸린 동물 또는 환자의 치료에 IL-12와 함께 투여 또는 공동 투여된다. 그 예에는, B 세포 비호지킨 림프종(NHL) 환자의 치료에 사용되는 IL-2와 조합된, CD20에 결합하는 본 발명의 작제물, 예컨대 항원-결합 작제물이 있다.
또한, 본 발명의 하나 이상의 작제물, 예컨대 하나 이상의 항원 결합 작제물은 이러한 본 발명의 항원 결합 작제물의 효능을 증가시키는 면역제어제와 조합될 수 있다. 면역제어제에는 콜로니 자극 인자(CSF), 종양 괴사 인자(TNF) 및 인터페론(IFN)이 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다.
CSF는 과립백혈구-대식세포 CSF(GM-CSF), 과립백혈구-CSF(G-CSF) 및 대식세포 CSF(M-CSF)를 포함할 수 있다. GM-CSF는 호중구, 대식세포, 단핵구 및 호산구의 발생을 조절하는 것으로 추정되고 있다. G-CSF는 호중구 생산 및 M-CSF 생산을 유도하는 것으로 밝혀져 있다. M-CSF는 대식세포 및 단핵구를 자극하는 것으로 밝혀져 있다. 암 환자에서 호중성백혈구감소증을 치료하는데 있어 CSF는 오래 전부터 사용되어 왔다. 일 예로서, 본 발명의 작제물, 예컨대 항원 결합 작제물은 골수 이식 및 화학요법 후 환자의 호중성백혈구감소증을 가속적으로 복구시키기 위하여 CM-CSF, G-CSF 또는 이의 조합물과 함께 사용될 수 있다. 호중구는 박테리아, 진균 및 기생충과 미생물과 싸우는데 주요 역할을 한다. 호중성백혈구감소증 환자는 특히 박테리아 감염 및 만연한 진균 감염에 민감하다. 다른 예로서, 본 발명의 작제물, 예컨대 항원 결합 작제물은 GM-CSF 처리된 호중구, 단핵구 및 대식세포와 조합되어 박테리아, 진균 등, 예컨대 무서운 폐포자충에 대항하는 활성을 증가시키는 데 사용될 수 있다.
IFN의 일 예는 인터페론 알파(IFN-α)이다. IFN-α는 신체가 암이나 바이러스 감염에 대해 반응할 때 면역 반응의 일부로서 몇 가지 백혈구 세포 종류에 의해 자연적으로 만들어진다. 공격에는 2가지 주요 방식이 있는데, 하나는 암세포의 증식 및 확산을 방해하는 것이고, 다른 하나는 암세포를 공격하는 킬러 T 세포 및 다른 세포의 생산을 증가시키는 것이다. 인터페론은 또한 면역계의 더욱 양호한 표적이 되도록 하는 화학적 시그널을 암세포가 제공하도록 조장하는 것으로 추정되고 있으며, 최근에는 여러 종류의 암, 특히 신장암, 흑색종, 다발성 골수종 및 몇몇 종류의 백혈병에 사용되고 있다. 또한, 간염과 같은 바이러스 감염의 치료에도 사용되고 있다. 예컨대 인터페론-알파2a는 ADCC를 증가시키고, 본 발명의 하나 이상의 작제물, 예컨대 항원 결합 작제물과 조합되어, 작제물에 의한 ADCC 활성의 효능을 증가시키는 데 사용될 수 있다. 다른 예로서, 본 발명의 하나 이상의 작제물, 예컨대 하나 이상의 항원 결합 작제물은, B 세포 및 골수 혈장 세포(BMPC) 상의 항CD20 항원의 수를 증가시키는 것으로 밝혀져 있는 인터페론-감마(IFN-γ)와 함께 동물이나 환자에게 투여 또는 공동 투여된다. 이는, 특히 B 세포 및 골수 혈장 세포(BMPC)에서 CD20 발현이 감소되어 있는 다발성 골수종 환자의 치료에 유용하다. 따라서, 본 발명의 작제물, 예컨대 항원 결합 작제물, 특히 CD20 결합 작제물에 의한 다발성 골수종 환자의 치료는 IFN-γ와 함께 공동 투여되어 유용하게 수행될 수 있다.
TNF는 항암성이 있는 자연 화학물질의 한 종류이다. TNF의 일 예는 TNF-α이다. TNF-α는 또한 IFN-감마 및 IL-12와 상승 작용을 하는 것으로 밝혀져 있다. 다른 예에서, TNF는 본 발명의 하나 이상의 종양 특이적 작제물, 예컨대 하나 이상의 항원 결합 작제물과 함께 투여 또는 공동 투여될 수 있고, 그 예에는 IFN-감마, IL-12 또는 이의 다양한 조합과 함께 본 발명의 화학요법-접합된 항원 결합 작제물을 포함한다. TNF는 또한 염증 조절 분자인 것으로 공지되어 있다. TNF-알파 항체 또는 길항물질은 본 발명의 항-T 세포 작제물, 예컨대 항원 결합 작제물과 조합되어 류마티스성 관절염, 건선, 궤양성 대장염, 전신홍반루푸스(SLE), 크론병, 강직 척추염, 및 각종 염증성 질병 과정을 갖고 있는 환자의 치료에 사용될 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명의 하나 이상의 작제물, 예컨대 하나 이상의 항원 결합 작제물은 본 발명의 다른 항체 또는 항원 결합 작제물과 함께 투여 또는 공동 투여될 수 있다. 일 예는 CD22, CD19 또는 이의 조합에 결합할 수 있는 작제물과 본 발명의 작제물, 예컨대 CD20에 결합할 수 있는 본 발명의 항원 결합 작제물의 조합이다. 이러한 조합은 무통성 및 공격성 형태의 B 세포 림프종, 및 급성 및 만성 형태의 림프 백혈병의 치료제로서 효과적이다. (미국 특허 6,306,393, Goldberg 참조) 다른 예로서, 본 발명의 작제물, 예컨대 항원 결합 작제물은 아폽토시스 매개 작용을 돕는 본 발명의 항원 결합 작제물과 같은 다른 작제물과 공동 투여된다. 그 예에는 본 발명의 하나 이상의 작제물, 예컨대 CD28, CD3, CD20 또는 이의 조합에 결합할 수 있는 본 발명의 하나 이상의 항원 결합 작제물의 조합이 있다. 항-CD28 및 CD3의 조합은 T 세포의 지속 증식 방법을 제공한다. 미국 특허 6,352,694(June et al.)를 참조한다. 이러한 지속적인 T 세포 증식은 면역 의존 세포독성, 특히 항CD20과 관련된 세포독성의 효능을 증가시킨다.
다른 관점에서, 본 발명의 작제물, 예컨대 항원 결합 작제물은 하나 이상의 T 세포 조절 분자와 함께 투여 또는 공동 투여된다. 그 예에는 인터류킨-12(IL-12)와의 조합이 있다. IL-12 시토킨은 세포 매개 면역성을 자극하고, 혈관형성억제 활성이 있으며, 다양한 종양 모델에서 유의적인 항종양 효과를 나타낸다. IL-12는 또한 인터페론-감마(IFN-γ)의 생산을 자극하는 것으로 밝혀져 있다. 따라서, 본 발명의 하나 이상의 작제물, 예컨대 하나 이상의 항원 결합 작제물, 특히 CD20 결합 작제물을 이용한 다발성 골수종 환자의 치료는 IL-12와 함께 공동 투여될 때 더욱 효과적일 것으로 예상된다. 다른 예에서, 본 발명의 하나 이상의 작제물, 예컨대 하나 이상의 항원 결합 작제물은 T-세포 활성의 억제조절을 방해하여 항종양 면역 반응을 증가시키는 CTLA-4에 결합할 수 있는 다른 단백질의 본 발명의 결합-도메인 작제물과 함께 투여 또는 공동 투여될 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명의 하나 이상의 작제물, 예컨대 하나 이상의 항원 결합 작제물은 유전자 요법과 함께 사용될 수 있다. 일 예에서, 화학요법-본 발명의 접합 작제물은 Bcl-2 안티센스 올리고뉴클레오티드와 함께 투여 또는 공동 투여된다. Bcl-2는 항암 요법에 대한 종양 저항성과 관련이 있는 것으로서, 화학요법 유도성 세포사를 차단하는 것으로 추정되고 있다. 다른 예에서, 본 발명의 하나 이상의 작제물, 예컨대 하나 이상의 항원 결합 작제물은 "자살 유전자"를 전달하는 아데노바이러스와 함께 투여 또는 공동 투여된다. 아데노바이러스는 유전자를 종양 세포에 직접 삽입하여, 이 종양 세포를 다른 무효 약물에도 민감하게 만든다. 그 다음, 약물 치료는 건강한 세포는 건드리지 않고 종양 세포를 파괴한다. 하지만, 일단 치료가 완결된 후 치료를 피한 산재성 암세포는 재발되어 전이될 수 있다. 유전자 요법과 하나 이상의 작제물, 예컨대 하나 이상의 항원 결합 작제물의 조합은 산재성 암세포의 사멸을 돕고 암의 재발을 최소화할 것이다.
이와 유사한 조합은 종양을 외과적으로 제거하는 고식(비근치) 수술에 사용할 수 있다. 이러한 예에서, 본 발명의 하나 이상의 작제물, 예컨대 하나 이상의 항원 결합 작제물은 수술 동안 제거되지 않은 임의의 암 세포를 사멸시켜 재발 가능성을 감소시키고 면역 반응을 증가시키기 위한 목적으로 종양의 외과적 적출 전과 후에 투여될 수 있다.
또 다른 관점은 암 또는 항원 백신과 T 세포 조절인자 분자의 조합에 관한 것이다. 예를 들어, 작제물의 결합 부, 예컨대 항원 결합 부는 암세포 또는 항원, 또는 암세포 또는 항원 유래의 단백질 단편에 특이적일 수 있다. 이것은 특정 종양 또는 항원에 대한 면역 반응의 매개를 도울 수 있다. 이러한 작제물은 T 세포 조절인자와 조합되어 면역 반응의 효능을 증가시킬 수 있다.
다른 예에서, 본 발명의 하나 이상의 작제물, 예컨대 하나 이상의 항원 결합 작제물은 레티노이드와 함께 투여 또는 공동 투여된다. 레티노이드에는 비타민 A 및 이의 유도체가 포함되며, 이들은 세포의 분열을 정지시키고 분화를 유도하는 능력이 있다. 비타민 A는 본 발명의 항암 작제물, 예컨대 항원 결합 작제물과 조합되어 각종 형태의 암을 퇴치하는데 사용된다.
본 명세서에 사용된 "결합 작제물" 및 "항원 결합 작제물"이란 용어는 예컨대 항원과 같은 표적에 결합할 수 있는, 유전자조작된 폴리펩타이드, 재조합 폴리펩타이드, 합성, 반합성 또는 다른 융합 단백질 등을 의미할 수 있다. 본 발명의 항원 결합 작제물은 항체 또는 관련 면역글로불린형 작제물이 사용될 수 있는 다양한 용도의 분야를 비롯한 각종 분야에 이용될 수 있다. 본 발명의 작제물, 예컨대 항원 결합 작제물은 치료, 진단, 연구 및 기타 다른 목적의 생체내 및 시험관내 실험에 사용될 수 있다. 이러한 용도에는 다음과 같은 것이다.
본 발명의 작제물, 예컨대 항원 결합 작제물은 면역조직화학 분야에 사용될 수 있다. 예를 들어, 조직의 특정 항원이나 항원 그룹의 면역위치결정(immunolocalization)에 사용될 수 있다. 조직은 고정 후 당해의 항원 결합 작제물과 항온배양될 수 있다. 이러한 작제물은 그 다음 양고추냉이 퍼옥시다제 또는 베타-갈락토시다제와 같은 화학 반응을 제공하는 효소 또는 금 입자 등의 라벨이 커플링된 본 발명의 제2 항체 또는 결합 작제물을 이용하여 위치결정할 수 있다. 제2 항체 또는 결합 작제물은 예컨대 제1 결합 작제물의 일부에 대하여 반응성인 것으로 흔히 제조된다. 즉, 예컨대 제1 결합 작제물에 사람 꼬리 부분이 있다면, 제2 항체 또는 결합 작제물은 예컨대 베타-갈락토시다제가 결합된 토끼 항마우스 항체 또는 항원 결합 작제물일 수 있다. 또는, 본 발명의 항체 또는 결합 작제물은 정제된 다음 형광 항체 또는 결합 작제물을 생산하는 다른 분자와 접합될 수 있다.
본 발명의 작제물, 예컨대 항원 결합 작제물은 또한 면역전자 현미경 등을 이용하여 세포내 물질의 위치를 검출하거나 또는 세포 표면에 있는 항원 또는 항원들의 위치를 검출하는 데 사용될 수 있다. 이 때, 페리틴 또는 콜로이드성 금과 같은 전자 농후 물질이 항원 결합 작제물에 접합될 수 있다. 항원/결합 작제물 복합체의 위치 검출에는 주사 전자 현미경을 사용할 수 있다.
본 발명의 작제물, 예컨대 항원 결합 작제물은 또한 각종 면역분석 형식, 예컨대 방사선면역분석 형식 또는 효소 결합된 면역흡착 분석(ELISA) 형식 중 하나를 이용하여 항원이나 항원들의 존재를 정량분석하는 데 사용할 수 있다. 이러한 접근법에는 다양한 변법들이 있으나, 모두 유사한 개념을 기본으로 한다. 예를 들어, 항원이 고체 지지체 또는 표면에 결합될 수 있거나 용액 중에 있다면, 본 발명의 특정 항원 결합 작제물과 반응시켜 검출할 수 있다. 작제물의 존재 또는 양은 제1 항체에 직접 라벨을 혼입시켜 작제물을, 예컨대 본 발명의 제2 항체 또는 제2 항원 결합 작제물 중 어느 하나와 반응시킴으로써 검출 또는 정량할 수 있다. 또는, 예컨대 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드를 첨가되는 항원 및 고체 표면에 결합시킬 수 있다. 그 다음, 이러한 항원에 특징적인 에피토프를 인식하는 본 발명의 제2 항체 또는 항원 결합 폴리펩타이드를 첨가하고 검출할 수 있다. 이러한 기술은 보통 "샌드위치 분석"으로 불리며, 무엇보다도 높은 배경 또는 비특이적 반응의 문제점을 해소하기 위해 흔히 사용되는 방법이다.
본 발명의 결합 작제물은 특정 에피토프 또는 에피토프들에 대한 높은 친화성/친화성들 및/또는 선택성/선택성들을 갖고 있을 수 있기 때문에, 단백질 또는 항원 정제 등에서 친화성 시약으로도 사용될 수 있다. 이러한 방법의 일 예에서, 본 발명의 항원 결합 작제물은 세파덱스 수지 또는 여지 등의 적당한 지지체에 고정된다. 이와 같이 고정된 작제물은 표적 단백질(들) 또는 항원(들)을 함유하는 시료 또는 상기 단백질 또는 항원이 있을 것으로 의심되는 시료에 노출시킨다. 그 다음, 지지체를 불필요한 물질 제거를 위해 적당한 완충액으로 세정한다. 이러한 지지체를, 결합 단백질 또는 항원을 방출시킬 수 있는 다른 완충액으로 세정한다.
본 발명의 특정 결합 작제물은 높은 친화성 및 선택성으로 단백질 또는 다른 항원에 결합할 수 있기 때문에 특정 반응에서 특정 효소 또는 다른 거대분자의 중요성에 대한 기준으로 사용될 수 있다. 본 발명의 항원 결합 작제물이 용액 중의 반응을 방해할 수 있다면, 이는 그 작제물이 그 반응에 수반되는 단백질 또는 다른 항원 물질에 특이적으로 결합할 수 있음을 의미한다.
본 발명의 작제물, 예컨대 항원 결합 작제물은 또한 수용체 차단인자 또는 억제인자 또는 길항물질로서 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 작제물, 예컨대 항원 결합 작제물은 단백질의 기능을 동정 및 연구하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 항원 결합 작제물이 특정 단백질과 반응한다면, 예컨대 그 단백질을 예컨대 용액으로부터 후속적으로 침전시킬 수 있다. 침전은 일반적으로 제1 복합체를 함께 결합시키는 본 발명의 제2 항체 또는 항원 결합 작제물을 사용하여 수행한다. 또는, 상기 용액을, 예컨대 용액으로부터 쉽게 분리할 수 있도록, 예컨대 비드에 부착시킨, 단백질 A 또는 예컨대 작제물에 따라 항Fc 항체와 반응시킴으로써 복합체를 분리할 수 있다.
본 발명의 작제물, 예컨대 항원 결합 작제물은 DNA 결합 단백질과 같은 특정 핵산 결합 단백질의 동정에 겔-변위(gel-shift) 실험과 함께 사용될 수도 있다. 예를 들어, DNA 결합 단백질은 특정 올리고뉴클레오티드에 높은 친화성으로 결합하는 능력을 통해 분석할 수 있다. 단백질과 결합된 올리고뉴클레오티드의 이동성은 유리 올리고뉴클레오티드의 이동성보다 상당히 상이하며, 보통 겔 변위로 불리는 겔 이동 패턴 및 시그널을 제공한다. 결합 분석법에 작제물의 첨가는 2가지 효과 중 어느 하나를 나타낼 수 있다. 작제물이 DNA 결합에 관여하지 않는 단백질 영역에 결합한다면 이동성이 훨씬 느린 복합체를 형성할 수 있고 이동성의 큰 변위(초변위)로서 검출된다. 또는, 작제물이 DNA를 인식하는데 관여하는 단백질 영역에 결합한다면 그 결합은 붕괴시켜서 변위를 제거할 수 있다. 어떠한 경우든지, 이러한 실험의 데이터는 예컨대 DNA-결합 단백질을 동정하는 기준으로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 작제물, 예컨대 항원 결합 작제물은 예컨대 SDS-PAGE에 의한 분별 후 웨스턴 블롯팅으로 단백질을 검출하는 데 사용하는 것이 가능하다. 분별된 단백질을 일단 니트로셀룰로스 시트와 같은 막으로 전이시킨 다음, 블롯에 고정된 단백질을 특이적으로 인식하거나, 또는 바람직한 선택성 정도로 인식하는 본 발명의 특정 항원 결합 작제물에 노출시킨다. 이러한 접근법은 특히 실험 동안 단백질 이동성이 변화하는 경우 매우 유용하다. 예를 들어, 인산염 또는 탄산염의 혼입 또는 단백질의 절단은 이후 웨스턴 분석에 의해 간단하게 측정될 수 있는 이동성의 변화를 초래한다. 이러한 접근법은 적당한 대조군과 함께 실험 조작에 따른 단백질의 과다 여부를 측정하는데 사용될 수 있다.
SDS 겔 및 면역침전의 조합은 또한 매우 효과적일 수 있다. 특정 단백질이 용액에서 면역침전될 수 있다면, 상청액 및 침전 분획 모두가 SDS 겔에서 분리되어 본 발명의 항원 결합 작제물로 조사될 수 있다.
때로, 한 단백질에 대해 지향성인 본 발명의 결합 작제물은 제1 단백질과 상호작용하는 제2 단백질을 침전시킬 것이다. 제1 단백질 뿐만 아니라 제2 단백질도 겔 염색에 의해 또는 자동방사선술에 의해 관찰될 수 있다. 이러한 관계는 흔히 단백질이 복합체의 일부로서 작용하고, 또한 단백질이 다른 증거(예컨대, 2 하이브리드 스크린 또는 억제인자 돌연변이)를 바탕으로 상호작용하는 것으로 가정된 두 단백질의 물리적 상호작용을 증명하는 데 사용될 수 있는 1차적인 표시이다. 이러한 접근법은 몇 가지 최대로 효과적인 방식으로 웨스턴 블롯팅 분석과 함께 사용될 수 있다.
즉, 예컨대 본 발명의 항원 결합 작제물은 시그널 도입 및 단백질 가공 등의 연구에 면역침전 및 웨스턴 블롯의 조합으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 면역침전된 단백질을 그 다음 이 단백질에 결합하는 본 발명의 다른 항체 또는 항원 결합 작제물을 사용하여 웨스턴 분석하여 조사할 수 있다. 가장 유용한 것은, 단백질에 존재할 수 있는 특정 구조 결정인자에 대해 지향성인 것이다. 즉, 단백분해 가공을 거치는 단백질의 일정 영역에 대하여 지향성인 본 발명의 항체 또는 항원 결합 작제물은 단백분해 가공을 추적하는데 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 인산화된 펩타이드를 인식하는 본 발명의 작제물 또는 항원 결합 작제물의 혼합물(예컨대, 항 PY(인산화된 타이로신))은 침전 후 단백질의 인산화 정도를 추적하는 데 사용되거나 또는 그 반대로 사용될 수도 있다. 글리코실화 반응 역시 탄수화물 에피토프에 대해 지향성인 본 발명의 항원 결합 작제물(또는 렉틴, 즉 탄수화물을 인식하는 단백질)에 의해 추적될 수 있다. 이와 마찬가지로, 본 발명의 일부 항원 결합 작제물은 예컨대 인산화 후 티로신 또는 세린 잔기를 인식하지만 인산염의 부재 시 에피토프에 결합하지 않는(또는 검출가능하게 결합하지 않는) 인산화된 에피토프를 특이적으로 인식하는 것으로 제조될 수 있다. 이러한 접근법은 특정 단백질의 인산화 상태를 측정하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, CREB(cAMP 반응 인자 결합 단백질)의 인산화는 세린 133의 인산화에 의존적인 방식으로 에피토프를 특이적으로 인식하는 항체에 의해 추적될 수 있다.
본 발명의 작제물, 예컨대 항원 결합 작재물은 또한 특정 에피토프를 발현하거나 또는 제공하는, 또는 특정 친화성 또는 발현 특성이 있는 후보 폴리뉴클레오티드를 분리하기 위한 발현 라이브러리의 선별에 사용될 수도 있다.
또한, 세포 표면에 결합하는 본 발명의 작제물, 예컨대 항원 결합 작제물은 마커로서 사용되어 이 마커를 발현하는 세포의 분획을 유동 세포측정법으로 정량분석하는 데 이용될 수 있다. 본 발명의 여러 항원 결합 작제물/형광 염료 조합이 사용되는 경우에는, 예컨대 여러 항원을 발현하는 세포의 분획을 측정할 수 있다.
항이디오타입 항체, 즉 다른 항체의 결합 도메인에 대한 항체와 같이 작용하는 본 발명의 항원 결합 작제물을 비롯한 작제물은 항원의 구조를 모방하는데 필요하거나 유용한 다수의 임의의 방법에 사용될 수 있다. 이러한 용도에는, 예컨대 암 백신(예, 분자 보강제를 혼입시킨 본 발명의 항원 결합 작제물), 수용체에 대한 프로브, 수용체 작용물질, 수용체 길항물질, 수용체 차단인자 또는 억제인자 등으로서의 용도가 포함된다.
다른 관점에서, 본 발명의 작제물, 예컨대 항원 결합 작제물은 이중특이성이어서, 동일하거나 상이한 세포 종류에 존재할 수 있는 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다.
본 발명의 작제물, 예컨대 항원 결합 작제물의 생체내 용도에는 자가면역 질환을 비롯한 B 세포 장애뿐만 아니라 암을 비롯한 각종 질병에 대한 단독 요법 또는 하나 이상의 다른 치료법과의 조합 요법이 있다. 몇몇 경우에, 본 발명의 작제물은 환자에게 투여된다. 다른 경우에, 본 발명의 작제물은 당업계에 공지된 기술로 다른 분자, 예컨대 표적의 영상화를 돕는 형광 분자 또는 표적 사멸을 돕는 치료 약물 및/또는 독소에 커플링될 수 있다.
예컨대, 라벨링 분자 또는 원자는 영상화를 돕거나 또는 확인 시약으로서 본 발명의 항원 결합 작제물에 접합되거나, 또는 다른 방식으로 결합될 수 있다. 그 예에는 효소 라벨, 방사선동위원소 또는 방사능 화합물 또는 인자, 형광성 화합물 또는 금속, 화학발광 화합물 및 생물발광 화합물이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 즉, 본 발명의 결합 작제물 또는 항원 결합 작제물은 약물에 접합되어 특정 약물을 표적화할 수 있고, 약물이 표적에 도달하는 즉시 효능을 증가시킬 수 있다. 이는 전신 독성 및 부작용을 감소시키면서 약물 요법을 용이하게 한다. 이에 따라 전신 투여가 허용되지 않을 수 있는 약물의 사용이 가능해진다. 투여량은 약물의 효력 및 담체 작제물의 효능에 따라 달라질 것이다. 생체내 용도의 또 다른 예에는 독소를 본 발명의 폴리펩타이드에 화학적 결합 또는 접합시켜, 예컨대 "면역접합체" 또는 "면역독소"로 불리기도 하는 분자를 형성시키는 본 발명의 결합 작제물 또는 항원 결합 작제물의 용도가 있다. 일반적으로, 이러한 독소는 하나 이상의 방사선동위원소(예컨대, 요오드-131, 이트륨-90, 레늄-186, 구리-67 및/또는 비스무스-212), 자연 독소, 화학요법제, 생물학적 반응 변형제, 또는 표적 세포의 손상 또는 사멸을 보조하거나, 표적 세포 복제를 억제하거나 표적 세포에서 필요한 세포 기능을 붕괴시키는데 효과적인 임의의 다른 물질을 포함할 수 있다.
면역독소의 독소 부는 다양한 근원에서 유래한 것일 수 있다. 독소는 보통 식물 또는 박테리아에서 유래하는 것이지만, 사람 기원의 독소 또는 합성 독소 역시 사용될 수 있다. 박테리아 또는 식물 유래의 독소로는 아브린, α-사르신, 디프테리아 독소, 리신, 사포린 및 슈도모나스 외독소가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 포유동물 효의 예에는 리보뉴클레아제(RNAse) 및 데옥시리보뉴클레아제가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 본 발명의 하나 이상의 작제물과 함께 사용될 수 있는 다양한 면역독소는 당업계에 기술되어 있다. 예컨대, 미국 특허 4,753,894, Frankel et al.; 미국 특허 6,099,842, Pastan et al.; Nevelle, et al., 1982 Immunol Rev. 62 : 75-91; Pastan et al., 1992 Ann Rev Biochem 61 : 331-354; Chaudary et al., 1989 Nature 339 : 394; 및 Batra et al., 1991 Mol. Cell. Biol. 11 : 2200를 참조할 수 있다. 본 명세서에 기술된 변형 독소 및 다양한 문헌들에 기술된 독소들 역시 본 발명의 범위에 포함될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 면역독소 및 다른 치료 제제는 특정 질병, 장애 또는 질환의 치료 또는 예방, 예컨대 종양 및 악성 암의 치료, 자가면역 질병, 알러지 및 염증 등의 치료에 치료요법적으로 효과적인 농도로 투여한다. 이러한 유효 투여량 및 투여 방식은 치료받는 동물 또는 환자, 치료되는 질병 또는 질환, 면역접합체 또는 면역독소의 강도 및 접합체의 효능에 따라 달라질 수 있다. 이러한 목표를 달성하기 위하여 면역독소는 당업계에 공지된 다양한 유효 제제 및 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 일반적으로, 면역독소는 정맥내 주사 또는 복강내 주사 중 어느 하나의 주사를 통해 투여한다. 이러한 투여를 수행하는 방법은 당업자라면 잘 알고 있다. 다른 관점에서, 본 발명은 점막을 따라 투과할 수 있는 에어로졸, 크림 또는 패치와 같은 국소 또는 경구 투여 조성물을 포함한다.
포뮬란트는 치료받는 환자에게 투여하기 전의 본 발명의 면역접합체 또는 면역독소에 첨가할 수 있다. 액체 제제는 가장 일반적인 제형이나 다른 제제도 본 발명의 범위에 속한다. 포뮬란트에는 예컨대 오일, 중합체, 비타민, 탄수화물, 아미노산, 염, 완충액, 알부민, 계면활성제 또는 장확장성 약물 등이 포함될 수 있다. 탄수화물에는 모노, 디, 또는 폴리사카라이드와 같은 당 또는 당 알코올, 또는 수용성 글루칸이 포함될 수 있다. 사카라이드 또는 글루칸에는 예컨대 프럭토스, 덱스트로스, 락토스, 글루코스, 만노스, 솔보스, 자일로스, 말토스, 슈크로스, 덱스트란, 풀루란, 덱스트린, 알파 및 베타 사이클로덱스트린, 가용성 전분, 하이드록시에틸 전분 및 카르복시메틸셀룰로스, 또는 이의 혼합물이 있다. "당 알코올"은 -OH 기를 가진 C4 내지 C8 탄수화물로서 정의될 수 있으며, 그 예에는 갈락티톨, 이노시톨, 만니톨, 자일리톨, 소르비톨, 글리세롤 및 아라비톨이 있다. 이러한 당 또는 당 알코올은 각각 또는 조합으로 사용될 수 있다. 사용되는 양에는 당 또는 당 알코올이 수성 제제에 용해되는 한 일정한 제한은 없다. 일 관점에서, 당 또는 당 알코올 농도는 0.5w/v% 내지 15w/v% 범위, 전형적으로 1.0w/v% 내지 7.0w/v% 범위, 더욱 전형적으로 2.0 내지 6.0w/v% 범위이다.
예시적인 아미노산에는 카미틴, 아르기닌 및 베타인의 좌선성(L) 형태가 포함되나, 다른 아미노산이 첨가될 수도 있다. 통용되는 중합체에는 평균 분자량이 예컨대 2000 내지 3000 사이인 폴리비닐피롤리돈(PVP), 또는 평균 분자량이 예컨대 3000 내지 5000 사이인 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 있다. 완충액은 동결건조 전 또는 복원 후 용액의 pH 변화를 최소화하기 위하여 조성물에 사용될 수 있다. 모든 생리학적 완충액이 사용될 수 있으나, 구연산염, 인산염, 숙신산염 및 글루탐산염 완충액 또는 이의 혼합물이 더욱이 일반적으로 사용된다. 농도는 예컨대 0.01 내지 0.3 몰 범위일 수 있다. 이보다 높거나 낮은 농도가 사용되어도 좋다.
본 발명의 면역독소는 예컨대 혈행 반감기를 증가시키기 위하여 중합체에 공유 접합을 통해 화학적으로 변형될 수 있다. 중합체의 예 및 중합체를 펩타이드에 부착시키는 방법에 대해서는 미국 특허 4,766,107, Katre et al.; 4,179,337, Davis et al.; 4,495,285, Shimizu et al.; 및 4,609,546, Hiratani를 참조한다.
다음 실시예는 예시하기 위한 것으로, 제한하는 것이 아니다.
실시예 1
2H7 가변 영역의 클로닝 및 2H7scFv-Ig의 작제 및 서열분석
본 실시예는 모노클론 항체 2H7의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 암호하는 cDNA 분자의 클로닝을 예시한 것이다. 본 실시예는 또한 2H7scFv-Ig의 작제, 서열분석 및 발현에 대해 예시한다.
CD20에 특이적으로 결합된 2H7 모노클론 항체를 발현하는 세포는 수거 후, 글루타민, 피루베이트, DMEM 비필수 아미노산 및 페니실린-스트렙토마이신 보충된 RPMI 1640 배지(Invitrogen/Life Technologies, Gaithersburg, MD)에서 수일 동안 대수기 증식 상태로 유지시켰다. 이러한 세포를 원심분리에 의해 배양 배지로부터 펠렛화하고, 2x107 세포를 사용하여 RNA를 제조했다. RNA는 파밍겐(San Diego, CA) 총 RNA 분리 키트(Catalog # 45520K)를 이 키트에 첨부된 제조자의 지침서에 따라 사용하여 2H7 생산 하이브리도마 세포로부터 분리했다. 총 RNA 1㎍을 주형으로 사용하여 역전사를 통해 cDNA를 제조했다. RNA와 300ng의 랜덤 프라이머를 합하여 72℃에서 10분 동안 변성시킨 뒤 효소를 첨가했다. 효소와 함께 제공되는 5X 제2 가닥 완충액 및 0.1M DTT의 존재하에 총 부피 25㎕ 중의 RNA + 프라이머 혼합물에 슈퍼스크립트 II 역전사효소(Life Technologies)를 첨가했다. 역전사 반응은 42℃에서 1시간 동안 진행시켰다.
랜덤 프라이밍된 역전사효소 반응에서 생성된 2H7 cDNA와 V 영역 특이적 프라이머를 사용하여 2H7 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변 영역을 PCR로 증폭시켰다. V 영역 특이적 프라이머는 공지의 서열(진뱅크 수탁 번호 M17954(VL) 및 M17953(VH))을 가이드로서 사용하여 설계했다. 2개의 가변쇄는 융합성 말단 서열로 설계하여, 증폭 및 제한 효소 분해 후 두 V 영역의 결찰에 의해 scFv가 조립될 수 있게 했다.
두 V 영역 사이에 삽입될 (Gly4Ser)3 펩타이드 링커는 2H7의 VL에 대한 안티센스 프라이머에 초과 뉴클레오티드를 첨가하여 혼입시켰다. 또한, 두 V 영역 사이에 접합부로 SacI 제한 부위를 제공했다. HinIII 제한 부위 및 경쇄 리더 펩타이드를 포함하는, 2H7 VL 증폭에 사용된 센스 프라이머는 다음과 같다: 5'-gtc aag ctt gcc gcc atg gat ttt caa gtg cag att ttt cag c-3'(서열 번호 _). 안티센스 프라이머는 다음과 같다: 5'-gtc gtc gag ctc cca cct cct cca gat cca cca ccg ccc gag cca ccg cca cct ttc agc tcc agc ttg gtc cc-3'(서열 번호 _). V 영역의 리딩 프레임은 진한 밑줄 친 코돈으로 표시했다. HindIII 및 SacI 부위는 밑줄 친 이탤릭체로 표시했다.
VH 도메인은 리더 펩타이드 없이 증폭시켰고, VL에 융합을 위해 5' SacI 제한 부위를 포함시키고, 사람 IgG1 Fc 도메인 및 CD30의 절두 형태, CD154를 비롯한 각종 꼬리에 융합을 위해 3' 말단에 BclI 제한 부위를 포함시켰다. 센스 프라이머는 다음과 같다: 5'-gct gct gag ctc tca ggc tta tct aca gca agt ctg g-3'(서열 번호 _). SacI 부위는 밑줄 친 이탤릭체로 표시했고, VH 도메인의 제1 아미노산의 코돈에 대한 리딩 프레임은 밑줄친 진한 글씨체로 표시했다. 안티센스 프라이머는 다음과 같다: 5'-gtt gtc tga tca gag acg gtg ace gtg gtc cc-3'(서열 번호 _). BclI 부위는 밑줄 친 이탤릭체로 표시하고, VH 도메인 서열의 마지막 세린은 밑줄 친 진한 글씨체로 표시했다.
scFv-Ig는 제한 효소 HindIII 및 BclI으로 분해시킨 사람 IgG1 힌지, CH2 및 CH3 영역을 함유하는 pUC19에 상기 2H7 scFv HindIII-BclI 단편을 삽입하여 조립했다. 결찰 후, 결찰 산물을 가지고 DH5α 박테리아를 형질전환시켰다. 양성 클론은 확인 부위로서 2H7의 VL-VH 접합부에 SacI 부위를 사용하여 적당하게 삽입된 단편에 대해 선별했다. 2H7scFv-Ig cDNA는 96℃에서 10초간 변성, 50℃에서 30초간 어닐링 및 72℃에서 3분간 연장 반응으로 이루어진 25 주기 프로그램을 이용하는 PE 9700 열순환장치(thermocycler)에서 순환 서열분석으로 처리했다. 서열분석 프라이머로는 pUC 순방향 프라이머 및 역방향 프라이머와 IgG 불변 영역 부의 사람 CH2 도메인에 어닐링된 내부 프라이머를 사용했다. 서열분석 반응은 Big Dye Terminator Ready Sequencing Mix(PE-Applied Biosystems, Foster City, CA)를 제조자의 지침에 따라 사용하여 수행했다. 이어서, 시료를 Centrisep 컬럼(Catalog # CS-901, Princeton Separations, Adelphia, N.J.)을 사용하여 정제하고, 용출물을 Savant 진공 건조기로 건조한 뒤, Template Suppression Reagent(PE-ABI)에서 변성시킨 다음 ABI310 Genetic Analyzer(PE-Applied Biosystems)로 분석했다. 서열을 수정하고, 해독한 다음 Vector Nti 버전 6.0(Informax, North Bethesda, MD)을 사용하여 분석했다. 도 1은 2H7scFv-Ig 작제물의 cDNA 및 추정된 아미노산 서열을 나타낸다.
실시예 2
안정된 CHO 세포주에서의 2H7 ScFv-Ig의 발현
본 실시예는 진핵생물 세포주에서의 2H7scFv-Ig의 발현 및 SDS-PAGE 및 기능 분석을 통한 ADCC 및 보체 고정화 등의 발현된 2H7scFv-Ig의 특성 분석을 예시한 것이다.
정확한 서열의 2H7scFv-Ig HindIII-XbaI(약 1.6kb) 단편을 포유동물 발현 벡터 pD18에 삽입하고, 양성 클론 유래의 DNA를 QIAGEN 플라스미드 제조 키트(QIAGEN, Valencia, CA)를 사용하여 증폭시켰다. 그 다음, 재조합 플라스미드 DNA(100㎍)를 비필수 영역에서 AscI 분해로 선형화하고, 페놀 추출로 정제한 뒤, 조직 배양 배지 Excell 302(Catalog # 14312-79P, JRH Biosciences, Lenexa, KS)에 재현탁시켰다. 형질감염용 세포 CHO DG44 세포를 대수기에서 유지시키고, 각 형질감염 반응을 위해 107 세포를 수거했다. 전기침투를 위해 총 부피 0.8ml의 CHO 세포에 선형화된 DNA를 첨가했다.
2H7 scFv-Ig 융합 단백질(서열 10)의 안정된 생산은 CMV 프로모터의 조절 하에 2H7 scFv-Ig cDNA를 함유하는 선택성이며 증폭성인 플라스미드 pD18을 중국 햄스터 난소(CHO) 세포(모든 세포주는 별다른 표시가 없는 한 미국 모식균 배양 수집소(Manassa, VA)에서 입수했다)에 전기침투시켜 달성했다. 2H7 발현 카세트는 약 1.6kb HindIII-XbaI 단편으로서 벡터 다중 클로닝 부위에 CMV 프로모터의 후위에 서브클로닝했다. pD18 벡터는 이 플라스미드에 대한 선발 압력을 가하기 위하여 약독화된 프로모터를 이용하여 DHFR 선발용 마커를 암호하는 pcDNA3의 변형된 형태이다. 플라스미드 DNA는 Qiagen 맥시프렙 키트를 시용하여 제조했고, 정제된 플라스 미드는 고유 AscI 부위에서 선형화한 뒤 페놀 추출하고 에탄올 침전시켰다. 연어 정자 DNA(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)를 담체 DNA로서 첨가하고, 플라스미드 및 담체 DNA를 각각 100㎍씩 사용하여 전기침투를 통해 107 CHO DG44 세포를 형질감염시켰다. 세포를 글루타민(4mM), 피루베이트, 재조합 인슐린, 페니실린-스트렙토마이신 및 2X DMEM 비필수 아미노산(모두 Life Technologies 제품, Gaithersburg, MD)을 함유하는 Excell 302 배지(JRH Biosciences)(이하, "Excell 302 완전" 배지라 한다)에서 대수기까지 증식시켰다. 또한, 형질감염되지 않은 세포에 대한 배지에는 HT(100X 용액의 하이포크산틴 및 티미딘으로부터 희석한 것)(Invitrogen/Life Technologies)를 첨가했다. 선발 하에 형질감염용 배지에는 선발제로서 50nM 내지 5μM 범위의 다양한 농도의 메토트렉세이트(Sigma-Aldrich)를 첨가했다. 전기침투는 275 볼트, 950μF에서 수행했다. 형질감염된 세포는 비선발 배지에서 하룻밤 동안 회복시킨 후, 125 세포/웰 내지 2000 세포/웰 범위의 다양한 연속 희석물로 96웰 평면 바닥 평판(Costar)에서 선발 평판배양했다. 세포 클로닝을 위한 배양 배지는 100nM 메토트렉세이트를 함유하는 Excell 302 완전 배지였다. 클론의 성장이 충분한 즉시, 모 웰의 배양 상청액으로부터 일련의 희석물에 대하여 CD20-CHO 형질감염 세포에 대한 결합성을 조사하여 선별했다. 융합 단백질의 생산이 가장 많은 클론을 T25 및 그 다음 T75 플라스크까지 증대시켜 2H7scFvIg의 동결보전 및 증량 생산에 적당한 수의 세포를 제공했다. 생산 수준은 메토트렉세이드 함유 배양 배지에서 점진적 증폭을 통해 3 클론 유래의 배양물에서 추가로 증가시켰다. 각 세포의 연속 계대에서, Excell 302 완전 배지의 메토트렉세이트 농도는 DHFR 플라스미드를 증폭시킨 세포만이 생존할 수 있도록 증가시켰다.
2H7scFv-Ig을 발현하는 CHO 세포의 상청액을 수거하고, 0.2㎛ PES 익스프레스 필터(Nalgene, Rochester, NY)를 통해 여과한 뒤, Protein A-아가로스(IPA 300 가교 아가로스) 컬럼(Repligen, Needham, MA) 상으로 통과시켰다. 이 컬럼을 PBS로 세척한 뒤, 결합된 단백질을 0.1M 구연산염 완충액(pH 3.0)을 사용하여 용출시켰다. 분획을 수거하여, 용출된 단백질을 1M Tris(pH 8.0)로 중화한 다음, PBS에서 하룻밤 동안 투석했다. 정제된 2H7scFv-Ig(서열 번호 _)의 농도는 280nm에서 흡광도를 통해 측정했다. 흡광 계수는 Vector Nti 버전 6.0 소프트웨어 패키지(Informax, North Bethesda, MD)에서 단백질 분석 기구에 의해 1.77로 측정되었다. 이 프로그램은 흡광 계수의 계산에 아미노산 조성물 데이터를 이용한다.
형질감염된 안정된 CHO 세포에 의한 2H7scFv-Ig 생산 수준은 유동 세포측정법으로 분석했다. 정제된 2H7scFv-Ig에 대한 정제된 2H7scFv-Ig을 CD20 발현 CHO 세포(CD20 CHO)에 결합하게 한 뒤, 플루오레세인 접합된 항사람 IgG 제2 단계 시약(카달로그 번호 H10101 및 H10501, CalTag, Burlingame, CA)을 사용하여 유동 세포측정법으로 분석했다. 도 2(상단)는 CD20 CHO에 대한 2H7scFv-Ig 결합을 적정하여 수득한 표준 곡선을 도시한 것이다. 2H7scFv-Ig의 각 농도마다 플루오레세인 시그널의 평균 휘도를 직선 단위로 도시했다. 2H7scFv-Ig을 발현하는 안정된 CHO 세포 클론을 함유한 T 플라스크로부터 수거한 상청액을 그 다음 CD20 CHO에 결합시키고, 그 결합을 유동 세포측정법으로 분석했다. 상청액에 함유된 2H7scFv-Ig에 의한 플루오레세인 시그널을 측정하고, 상기 표준 곡선으로부터 상청액 중의 2H7scFv-Ig 농도를 계산했다(도 2, 하단).
정제된 2H7scFv-Ig(서열 번호 _)은 SDS-폴리아크릴아마이드 겔에서 전기영동을 통해 분석했다. 각각의 단백질 A 아가로스 컬럼 통과로 정제한 2H7scFv-Ig 시료를 이황화 결합의 환원 없이 SDS 시료 완충액에서 비등 가열한 뒤, SDS 10% Tris-BIS 겔(카달로그 # NP0301, Novex, Carlsbad, CA)에 적용했다. 각 정제 배취 20㎍을 겔 위에 적재했다. 전기영동 후 쿠마시 블루 염색(Pierce Gel Code Blue Stain Reagent, 카달로그 #24590, Pierce, Rockford, IL)하고 증류수로 탈색하여 단백질을 가시화했다. 동일 겔 상에 분자량 마커도 포함시켰다(Kaleidoscope Prestained Standards, Catalog # 161-0324, Bio-Rad, Hercules, CA). 결과는 도 3에 제시했다. 각 레인 상의 숫자는 각 정제 배취를 나타낸다. 크기 마커의 분자량(킬로달톤)은 도면의 좌측에 표시했다. 대체 시료 제조 조건을 이용한 추가 실험으로서, DTT 또는 2-머캅토에탄올을 함유하는 SDS 시료 완충액에서 단백질의 비등 가열에 의한 이황화 결합의 환원은 2H7scFv-Ig의 응집을 유발한다는 것을 알 수 있었다.
임의의 다른 면역학적 변수는 당업계에 공지된 통상의 분석법을 사용하여 모니터할 수 있다. 이러한 방법으로는 예컨대 항체 으존적 세포 매개 세포독성(ADCC) 분석법, 제2 시험관내 항체 반응, 공지의 마커 항원 시스템을 이용한 다양한 말초 혈액 또는 림프계 단핵세포 아집단의 유동 면역세포형광 분석법, 면역조직화학 또는 다른 관련분석법을 포함할 수 있다. 이러한 분석법 및 기타 다른 분석법에 대해서는 예컨대 문헌[Rose et al. (Eds.), Manual of Clinical Laboratory Immunology, 5th Ed., 1997 American Society of Microbiology, Washington, DC]을 참조할 수 있다.
보체 존재 하에 CD20 양성 세포를 사멸시키는 2H7scFv-Ig의 능력은 B 세포주 Ramos 및 Bjab를 사용하여 검사했다. 토끼 보체(Pel-Freez, Rogers, AK)는 1/10의 최종 희석률로 본 분석에 사용했다. 정제된 2H7scFv-Ig은 B 세포 및 보체와 37℃에서 45분 동안 항온배양한 뒤, 트립판 블루 배제실험으로 생세포 및 사세포를 계수했다. 도 4A의 결과는 토끼 보체의 존재 하에 2H7scFv-Ig이 CD20을 발현하는 B 세포를 용해시킨다는 것을 보여주고 있다.
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 존재 하에 CD20 양성 세포를 사멸시키는 2H7scFv-Ig의 능력은 100:1 비의 PBMC 대 Bjab 세포를 사용한 4시간 분석에서 라벨링된 Bjab 세포 유래의 51Cr 방출을 측정하여 검사했다. 도 4B에 제시된 결과는 51Cr 방출이 PBMC 또는 2H7scFv-Ig 각각의 존재 보다 PBMC와 2H7scFv-Ig 모두의 존재 하에서 더욱 많았기 때문에 2H7scFv-Ig이 항체 의존적 세포 세포독성(ADCC)을 매개할 수 있음을 보여주었다.
실시예 3
정상 B 세포의 증식, CD95 발현 및 아폽토시스 유도에 미치는 CD20 및 CD40의 동시 결합 효과
본 실시예는 세포 표면에서 발현되는 CD20 및 CD40의 가교 결합이 세포 증식에 미치는 효과에 대하여 예시한 것이다.
농후한 휴지기 B 세포를 Percoll 단계 구배로 사람 편도선에서 분리하고, E-로제팅으로 T 세포를 제거했다. 휴지기의 농후한 편도선 B 세포의 증식은 4일 실험 의 마지막 12시간 동안 3[H]-티미딘 흡수를 통해 측정했다. 증식은 4반복 배양물에서 측정하여 평균과 표준 편차를 표시했다. 뮤린 항-사람 CD20 모노클론 항체 1F5(항CD20)는 단독으로 사용하거나 항뮤린 κ 모노클론 항체 187.1(항CD20XL)과 가교결합했다. CD40 활성화는 뮤린 CD8과 융합시킨 가용성 사람 CD154(CD154)를 사용하여 수행했고(Hollenbaugh et al., EMBO J. 11: 4212-21(1992)), CD40 가교 결합은 항뮤린 CD8 모노클론 항체 53-6(CD154XL)을 사용하여 수행했다. 이러한 절차는 세포 표면에 존재하는 CD20 및 CD40을 동시적으로 가교 결합시켰다. 그 결과는 도 5에 제시했다.
B 림프종 세포주인 Ramos 세포에 대한 CD20 및 CD40 가교결합의 효과를 조사했다. Ramos 세포를 CD20(1F5) 및 CD40(G28-5)에 특이적으로 결합하는 뮤린 모노클론 항체를 이용한 처리(염소 항마우스 IgG(GAM)) 및/또는 가교 결합(+GAM) 18시간 후 CD95(Fas) 발현 및 아폽토시스율에 대한 분석했다. 대조군 세포는 CD3에 특이적인 비결합성 이소타입 대조군(64.1)으로 처리했다.
처리한 Ramos 세포를 수거하고, FITC-항CD95와 항온배양한 다음 유동 세포측정법으로 분석하여 CD20 또는 CD40 가교결합 후 세포 표면에 존재하는 Fas의 상대적 발현 수준을 측정했다. 데이터는 표시된 자극으로 처리 후 세포의 평균 형광도로서 플로팅했다(도 6A).
동일 실험으로 처리한 Ramos 세포를 수거하여 어넥신(Annexin) V 결합성을 측정하여 처리된 배양물의 아폽토시스율을 수득했다. 아폽토시스는 1F5 및 G28-5를 이용한 CD20 및 CD40의 가교 결합 및 그 다음 GAM의 가교 결합 18시간 후 어넥신 V 결합성으로 측정했다. 어넥신 V 결합성은 FITC-Annexin V 키트(Catalog # PN-IM2376, Immunotech, Marseille, France)를 사용하여 측정했다. 어넥신 V 결합성은 세포가 아폽토시스로 진행되는 과정의 초기 현상으로 알려져 있다. 아폽토시스 또는 프로그램된 세포사는 자살에 의해 세포사를 유도하는 이화반응 캐스캐이드를 특징으로 하는 과정이다. 아폽토시스의 초기 단계에서 세포가 형태를 변화시키고 DNA를 가수분해하기 전에 세포막의 보전성은 유지하지만 세포는 막 인지질의 비대칭을 상실하여 음전하성 인지질, 예컨대 포스파타딜세린을 세포 표면에 노출시킨다. 칼슘 및 인지질 결합 단백질인 어넥신 V는 포스파티딜세린에 우선적으로 높은 친화성으로 결합한다. FAS 수용체(CD95) 발현에 미치는 CD20 및 CD40 모두의 가교결합 효과를 입증하는 결과는 도 6B에 제시했다. 세포에 대한 어넥신 V 결합에 미치는 CD20 및 CD40 모두의 가교결합의 효과는 도 6B에 제시했다.
실시예 4
2H7 ScFv-CD154 융합 단백질의 작제 및 특성분석
CD20 및 CD40에 결합할 수 있는 분자를 작제하기 위하여, 2H7 scFv를 암호하는 cDNA를 CD40 리간드인 CD154를 암호하는 cDNA와 융합시켰다. HindIII-BclI 단편에서 암호화된 2H7 scFv cDNA를 2H7 scFvIg 작제물로부터 분리한 뒤, pD18 벡터에, 사람 CD154의 세포외 도메인을 암호하는 BamHI-XbaI cDNA 단편과 함께 삽입시켰다. 세포외 도메인은 다른 타입 II 막 단백질과 마찬가지로, CD154의 카르복시 말단에서 암호화된다.
사람 CD154의 세포외 도메인은 PHA(파이토헤마글루티닌)로 활성화된 사람 T 림프구 유래의 RNA와 랜덤 프라이머로 만들어진 cDNA를 사용하여 PCR 증폭시켰다. 프라이머 세트에는 CD154의 세포외 도메인 안의 2개의 다른 위치에서 융합 접합부를 형성시키는 2개의 다른 5' 또는 센스 프라이머를 사용했다. 2개의 다른 융합 접합부는 모두 BamHI-XbaI 단편으로서 작제되는, CD154의 세포외 도메인 아미노산 108(Glu)-261(Leu)+(Glu)을 함유하는 짧은 절두형 형태(S4 형태) 및 아미노산 48(Arg)-261(Leu)+(Glu)을 함유하는 긴 완전 형태(L2 형태)가 형성되도록 설계했다. 2개의 다른 절두형 세포외 도메인을 2H7scFv에 융합시키는 센스 프라이머는 클로닝을 위한 BamHI 부위를 포함한다. CD154 cDNA의 S4 형태에 대한 센스 프라이머는 서열 11 또는 CD154ABM108로 명명하고 다음과 같은 서열의 34량체를 암호한다: 5'-gtt gtc gga tcc aga aaa cag ctt tga aat gca a-3'. 이에 반해 안티센스 프라이머는 서열 12 또는 CD154XBA로 명명하고 다음과 같은 서열의 44량체를 암호한다: 5'-gtt gtt tct aga tta tca etc gag ttt gag taa gcc aaa gga cg-3'.
아미노산 48(Arg)-261(Leu)+(Glu)를 암호하는 CD154 세포외 도메인의 긴 형태(L2)를 증폭시키는데 사용되는 올리고뉴클레오티드 프라이머는 다음과 같다: CD154BAM48(서열 13)으로 명명한 센스 프라이머는 다음과 같은 서열의 35량체를 암호화했다: 5'-gtt gtc gga tcc aag aag gtt gga caa gat aga ag-3'. CD154XBA(서열 번호 _)로 명명한 안티센스 프라이머는 다음과 같은 44량체를 암호화했다: 5'-gtt gtt tct aga tta tea etc gag ttt gag taa gcc aaa gga cg-3'. 다른 PCR 반응 조건은 2H7 scFv의 증폭에 사용된 조건과 동일했다(실시예 1 참조). PCR 단편은 PCR 퀵 키트(QIAGEN, San Diego, CA)로 정제하고, 20㎕ ddH2O에 용출시킨 뒤, 40㎕ 반응 부 피에서 BamHI 및 XbaI(Roche) 제한효소로 37℃에서 3시간 동안 분해했다. 단편을 겔 정제하고, 제조자의 지침(QIAGEN)에 따라 QIAEX 키트를 사용하여 정제한 뒤, HindIII+XbaI으로 절단한 pD18 발현 벡터에 2H7 HindIII-BclI 단편과 함께 결찰시켰다. 결찰 반응물을 이용하여 DH5-α 약품 허용성 박테리아를 형질전환시키고, 100㎍/ml 앰피실린을 함유하는 LB 평판에 평판배양했다. 형질전환체를 37℃에서 하룻밤 동안 증식시키고, 분리한 콜로니를 100㎍/ml 앰피실린 함유 루리아 액체배지의 3ml 액체 배양액에 접종했다. 클론을 미니플라스미드 제조(QIAGEN) 후 2H7 scFv 및 CD154 세포외 도메인 단편 모두의 삽입 여부에 대하여 선별했다.
2H7scFv-CD154 작제물 cDNA는 96℃에서 10초간 변성, 50℃에서 5초간 어닐링 및 60℃에서 4분간 연장 반응으로 이루어진 25 주기 프로그램을 이용하는 PE 9700 열순환장치(thermocycler)에서 순환 서열분석으로 처리했다. 서열분석 프라이머로는 pUC 순방향 프라이머(서열 번호 _; 5'-gtctatataagcagagctctggc-3') 및 pD18 역방향 프라이머(서열 번호 _; 5'-cgaggctgatcaggagctctagca-3')를 사용했다. 또한, 사람 CD154 서열(서열 번호 _: 5'-ccgcaatttgaggattctgatcacc-3')과 상동성이 있는 내부 프라이머를 사용했다. 서열분석 반응물에는 프라이머 3.2pmol, 약 20ng DNA 주형 및 서열분석 혼합물 8㎕가 포함되어 있다. 서열분석 반응은 Big Dye Terminator Ready Sequencing Mix(PE-Applied Biosystems, Foster City, CA)를 제조자의 지침에 따라 사용하여 수행했다. 이어서, 시료를 Centrisep 컬럼(Catalog # CS-901, Princeton Separations, Adelphia, N.J.)을 사용하여 정제했다. 용출물은 Savant 진공 건조기로 건조한 뒤, 20㎕ Template Suppression Reagent(ABI)에서 95 ℃에서 2분 동안 변성시킨 다음, ABI310 Genetic Analyzer(PE-Applied Biosystems)로 분석했다. 서열을 수정하고, 해독한 다음 Vector Nti 버전 6.0(Informax, North Bethesda, MD)을 사용하여 분석했다. 2H7scFv-CD154 L2 cDNA 서열 및 이의 추정된 아미노산 서열은 도 7A에 나타내고, 2H7scFv-CD154 S4 cDNA 서열 및 이의 추정된 아미노산 서열은 도 7B에 나타냈다.
2H7 scFv-CD154 융합 단백질(서열 및 )의 CD20 및 CD40에 대한 동시 결합 활성은 유동 세포측정법으로 측정했다. 이 분석에는 CD20을 발현하는 CHO 세포 표적을 사용했다. 2H7 scFv-CD154 발현 플라스미드로 형질감염된 세포의 상청액과 CD20 CHO 세포의 45분 항온배양 후, CD20 CHO 세포를 2회 세척하고 PBS/2% FBS에서 비오틴 접합된 CD40-Ig 융합 단백질과 항온배양했다. 45분 후, 세포를 2회 세척하고 PBS/2%FBS 중에서 1:100으로 피코에리트린(PE) 표지된 스트렙트아비딘과 항온배양했다. 추가 30분 더 항온배양한 후, 세포를 2X 세척하고 유동 세포측정법으로 분석했다. 그 결과는 2H7 scFv-CD154 분자가 세포 표면 상의 CD20에 결합할 수 있고 용액으로부터 비오틴 접합된 CD40을 포착할 수 있음을 보여주었다(도 8).
B 림프종 및 림프모세포계 세포주의 증식 및 생육성에 미치는 2H7scFv-CD154의 효과를 측정하기 위하여, 이러한 세포들을 2H7scFv-CD154 L2(서열 번호 _)와 12시간 동안 항온배양한 뒤 어넥신 V 결합성에 대하여 조사했다. 어넥신 V 결합성은 FITC-어넥신 V 키트(Immunotech, Marseille, France, 카탈로그 # PN-IM2376)를 사용하여 측정했다. B 세포주는 1ml 배양액으로서 2H7scFv-CD154 융합 단백질의 분비 형태를 발현하는 세포의 농축 투석된 상청액의 희석물과 항온배양했다. 그 결과는 도 9에 제시했다.
2H7scFv-CD154 존재 하의 Ramos B 림프종 세포주의 증식 속도는 24시간 배양의 마지막 6시간 동안 3H-티미딘의 흡수를 통해 조사했다. 세포 증식에 미치는 2H7scFv-CD154의 효과는 도 10에 도시했다.
실시예 5
CytoxB 항체 유도체의 작제 및 특성규명
CytoxB 항체는 2H7 scFv-IgG 폴리펩타이드를 사용하여 제조했다. 2H7 scFv(실시예 1 참조)는 사람 IgG1 Fc 도메인에 변경된 힌지 도메인을 통해 결합시켰다(도 11 참조). 힌지 영역의 시스테인 잔기는 부위 지향성 돌연변이유발 및 당업계에 공지된 기타 다른 방법을 통해 세린 잔기로 치환시켰다. 이러한 돌연변이 힌지를 야생형 Fc 도메인에 융합시켜 CytoxB-MHWTG1C로 명명한 한 작제물을 제조하거나, 또는 CH2 도메인에 추가 돌연변이를 도입시킨 돌연변이된 Fc 도메인(CytoxB-MHMG1C)에 융합시켰다. 작동인자(effector) 기능과 관련있는 CH2 중의 아미노산 잔기는 도 11에 제시했다. 이러한 잔기들의 하나 이상의 잔기의 돌연변이는 FcR 결합 및 작동인자 기능의 매개를 감소시킬 수 있다. 본 실시예에서는 Fc 수용체 결합에 중요한 것으로 당업계에 공지되어 있는 류신 잔기 234는 2H7 scFv 융합 단백질 CytoxB-[MG1H/Mg1C]에서는 돌연변이되어 있었다. 다른 작제물에서는 사람 IgG1 힌지 영역은 야생형 사람 Fc 도메인에 융합된 사람 IgA 힌지 일부(CytoxB-IgAHWTHG1C)로 치환되어 있었다(도 11 참조). 이와 같이 돌연변이된 힌지 영역은 사람 IgG1 CH2 및 CH3 도메인의 기능성 성질을 보유하는 단량체 및 이량체 분자의 혼합물을 발현시켰다. 이러한 분자의 합성 재조합 cDNA 발현 카세트를 작제하고, 폴리펩타이드를 실시예 2에 기술된 방법에 따라 CHODG44 세포에서 발현시켰다.
CytoxB-scFvIg 분자의 정제된 융합 단백질 유도체는 실시예 2에 기술된 방법에 따라 SDS-PAGE로 분석했다. 폴리아크릴아마이드 겔은 비환원 및 환원 조건 모두에서 진행시켰다. 각 겔에 2개의 다른 분자량 마커 세트인 BioRad 사전염색된 마커(BioRad, Hercules, CA) 및 Novex Multimark 분자량 마커를 적재했다. 여러 작제물과 Rituximab™의 이동 패턴은 도 12에 제시했다.
ADCC를 매개하는 여러 CytoxB-scFvIg 분자 유도체들의 능력은 표적으로 Bjab B 림프종 세포를 사용하고 작동 세포로서 갓 제조한 사람 PBMC를 사용하여 측정했다(실시예 2 참조). 작동세포 대 표적세포 비는 70:1, 35:1 및 18:1로서, 웰당 Bjab 세포의 수는 일정하게 유지시키는 반면, PBMC의 수는 변화시켰다. Bjab 세포는 51Cr로 2시간 동안 라벨링하고, 평면 바닥의 96웰 평판의 각 웰에 5x104 세포/웰의 세포 밀도로 분할했다. 다양한 희석율의 PBMC에 정제된 융합 단백질 또는 리투시마브(rituximab)를 10㎍/ml 농도로 첨가했다. PBMC 또는 융합 단백질의 첨가 없이 자발적인 방출을 측정했고, 최대 방출량은 적당한 웰에 세정제(1% NP-40)의 첨가로 측정했다. 반응액을 4시간 동안 항온배양하고, 배양 상청액 100㎕을 Lumaplate(Packard Instruments)에 수거한 뒤, 하룻밤동안 건조시킨 다음 방출된 cpm을 계수했다. 그 결과는 도 13에 제시했다.
CytoxB 유도체의 보체 의존적 세포독성(CDC) 활성도 측정했다. 이 반응은 실시예 2에 기술된 바와 실질적으로 유사하게 수행했다. 그 결과는 도 14에 각 융합 단백질의 농도에서의 총 세포에 대한 사세포의 백분율로서 제시했다.
실시예 6
마카크 대상의 생체내 연구
CytoxB 유도체의 1차 생체내 연구는 비인간 영장류에서 수행했다. 도 15는 원숭이에서의 CytoxB의 혈청 반감기를 분석한 데이터를 도시한 것이다. 측정은 6mg/kg의 용량을 각 원숭이에게 화살표로 표시한 날에 투여한 후 2마리의 다른 마카크(J99231 및 K99334)에서 수득한 혈청 시료를 가지고 수행했다. 각 시료마다 존재하는 2H7scFvIg 농도는, CD20 CHO 세포에 대한 정제된 CytoxB-(MHWTG1C)-Ig 융합 단백질의 결합을 통해 작도한 표준 곡선과 비교하여 추정했다(실시예 2 참조). 데이터는 도 15의 하단 패널에 표로 정리했다.
마카크의 혈행 CD40+ 세포 수준에 미치는 CytoxB-(MHWTG1C)Ig 융합 단백질의 효과를 조사했다. 전체 혈액 계수는 도 16에 표시된 각 날짜에 수행했다. 또한, FACS(형광 활성화 세포 분류기) 분석은 세포 집단 중의 B 세포를 검출하는 CD40 특이적 플루오레세인 접합 항체를 사용하여 말초 혈액 림프구에 대하여 수행했다. 그 다음, 양성 세포 백분율을 사용하여 원 시료에 존재하는 B 세포의 수를 계산했다. 그 데이터를 주사 후 표시된 날짜에 측정한 혈액 1㎕당 B세포(x1000)로서 도시했다(도 16).
실시예 7
항CD19 scFv-Ig 융합 단백질의 작제 및 발현
항CD19 scFv-Ig 융합 단백질은 실시예 1, 2 및 5에 제시된 방법과 당업계의 표준 방법에 따라 작제하고, 진핵 세포를 형질감염시킨 뒤, 발현시켰다. 가변 중쇄 영여과 가변 경쇄 영역은 CD19에 특이적으로 결합하는 항체 HD37을 생산하는 하이브리도마 세포에서 분리한 RNA로부터 클로닝했다. HD37scFv-IgAHWTG1C 및 HD37scFv-IgMHWTG1C의 발현 수준을 측정하고, 정제된 HD37 scFvIg을 사용하여 작도된 표준 곡선과 비교했다. 그 결과는 도 17에 제시했다.
실시예 8
항L6 scFv-Ig 융합 단백질의 작제 및 발현
scFv-Ig 융합 단백질은 항암종 모노클론 항체 L6 유래의 가변 영역을 사용하여 작제했다. 융합 단백질은 실시예 1, 2 및 5에 기술된 방법 및 당업계의 표준 방법에 따라 작제, 진핵세포 형질감염 및 발현시켰다. L6 scFv-IgAH WCH2 CH3 및 L6 scFv-(SSS-S)H WCH2 WCH3의 발현 수준을 측정하고 정제된 L6 scFvIg을 사용하여 작도한 표준 곡선과 비교했다. 그 결과를 도 18에 제시했다.
실시예 9
다양한 scFv-Ig 융합 단백질의 특성규명
앞서 기술한 scFv-Ig 융합 단백질 외에, G28-1(항CD37) scFv-Ig 융합 단백질을 실시예 1 및 5에 기술된 바와 거의 유사하게 실시하여 제조했다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 당업계에 공지된 방법에 따라 클로닝했다. 2H7-MHWTG1C, 2H7-IgAHWTG1C, G28-1-MHWTG1C, G28-1 IgAHWTG1C, HD37-MHWTG1C 및 HD37-IgAHWTG1C의 ADCC 활성은 전술한 방법에 따라 측정했다(실시예 2 참조). 결과는 도 19에 제시했따. L6scFv-IgAHWTG1C 및 L6scFv-IgMHWTG1C의 ADCC 활성은 2981 사람 폐 암종 세포 주를 사용하여 측정했다. 그 결과는 도 20에 제시했다. 뮤린 L6 모노클론 항체는 ADCC 활성이 없는 것으로 알려져 있다.
정제된 단백질은 환원 및 비환원 조건 모두에서 SDS-PAGE로 분석했다. 시료는 실시예 2 및 5에 기술된 바와 실질적으로 유사하게 제조하고 겔 이동시켰다. L6 및 2H7 scFv-Ig 융합 단백질에 대한 결과는 도 21에 제시하고, G28-1 및 HD37 scFv-Ig 융합 단백질에 대한 결과는 도 22에 제시했다.
실시예 10
항CD20 scFv-라마 Ig 융합 단백질의 작제 및 발현
본 실시예는 라마 IgG1, IgG2 및 IgG3 불변 영역 도메인의 클로닝 및 이러한 세 불변 영역과 항CD20 scFv와의 면역글로불린 융합 단백질의 작제에 대해 예시한 것이다.
라마 IgG1, IgG2 및 IgG3 면역글로불린의 불변 영역을 클로닝하여, 항CD20 일본쇄 Fv, 2H7 scFv를 함유하는 포유동물 벡터 작제물에 삽입했다. 총 RNA는 라마 혈액(Triple J Farms, Bellingham, WA) 유래의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 림프구를 TRIzol®(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)에서 제조자의 지침에 따라 용해시켜 분리했다. 총 RNA 1㎍을 주형으로 사용하여 역전사를 통해 cDNA를 제조했다. RNA와 20ng 랜덤 프라이머를 혼합하여 72℃에서 10분 동안 변성시킨 뒤, 효소를 첨가했다. 효소와 함께 제공되는 5X 제2 가닥 완충액 및 0.1M DTT의 존재하에 총 부피 25㎕ 중의 RNA + 프라이머 혼합물에 슈퍼스크립트 II 역전사효소(Invitrogen Life Technologies)를 첨가했다. 역전사 반응은 42℃에서 1시간 동안 진행시켰다. cDNA는 서열 특이적 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭시켰다. 5' 프라이머는 카멜리드의 VHH 및 VH 도메인에 대한 공개 서열에 따라 설계했다. 3개 이소타입 모두의 증폭에 사용한 3' 프라이머는 가이드로서 포유동물 CH3 도메인 서열을 사용하여 설계했다. 다음과 같은 특이적 프라이머를 사용했다. Bcl 및 XbaI 부위는 밑줄 친 이탤릭체 서열로 표시했다.
라마 IgG1 불변 영역에 대한 5' 프라이머
LLG1-5'bgl: 5'-gtt gt t gat c aa gaa cca cat gga gga tgc acg tg-3'
(서열 번호 _)
라마 IgG2 불변 영역에 대한 5'-프라이머
LLG2-5'bgl : 5'-gtt gt t gat c aa gaa ccc aag aca cca aaa cc-3'
(서열 번호 _)
라마 IgG3 불변 영역에 대한 5'-프라이머
LLG3-5'bgl : 5'-gtt gt t gat c aa gcg cac cac age gaa gac ccc-3'
(서열 번호 _)
라마 IgG1, IgG2 및 IgG3 불변 영역에 대한 3' 프라이머
LLG123-3'X: 5'-gtt gtt tct aga tta cta ttt acc cga aga ctg ggt gat gga-3'
(서열 번호 _)
예상 크기의 PCR 단편은 TOPO® 클로닝 벡터(Invitrogen Life Technologies)에 클로닐한 다음 서열분석했다. 센스 서열분석 프라이머, LL서열의 서열은 5'-ctg aga tcg agt tca gct g-3'(서열 번호 _), 안티센스 프라이머 LLseqAS의 서열은 5'-cct cct ttg gct ttg tct c-3'(서열 번호 _)이었다. 서열분석은 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행했다. 도 23은 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 함유하는 3개의 이소타입 라마 불변 영역의 아미노산 서열과 사람 IgG1 힌지, CH2 및 CH3 도메인의 아미노산 서열을 비교한 것이다.
서열을 확인하 후, 증폭된 PCR 산물은 제한효소 BclI 및 Xba1로 절단하여 융합성 제한 부위를 제조했다. 절단된 단편을 그 다음 겔 정제하고, DNA를 QIAquick 겔 추출 키트(QIAGEN, Valencia, CA)를 사용하여 용출시켰다. 2H7scFv-Ig pD18 포유동물 발현 벡터 작제물(실시예 2 참조)을 BclI 및 XbaI으로 분해하여 사람 IgG 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 제거했다. pD18 벡터는 감쇠된 DHFR 유전자(포유동물 발현의 선발성 마커로서 작용한다)를 함유하는 pCDNA3의 변형 유도체이다(Hayden et al., Tissue Antigens 48 : 242-54 (1996)). 정제된 라마 IgG1, IgG2 및 IgG3 불변 영역 PCR 산물은 T4 DNA 리가제(Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN)를 이용하여 제조자의 지침에 따라 실온에서 하룻밤동안 반응시켜 이중 절단된 2H7 scFv-pD18 벡터에 결찰시켰다. 결찰 후, 결찰 산물을 가지고 대장균 DH5α 박테리아(BD Biosciences, Palo Alto, CA)를 형질전환시킨 뒤, 표준 분자생물학법 및 제조자의 지침에 따라 평판배양했다. 분리된 콜로니를 선택하여 정확한 삽입체 함유 형질전환체에 대하여 선별했다.
암호화된 폴리펩타이드를 발현시키기 위하여, 양성 클론 유래의 플라스미드 DNA로 DEAE-덱스트란을 이용하여 COS-7 세포를 일시적으로 형질감염시켰다(Hayden et al., Ther Immufaol. 1: 3-15(1994)). COS-7 세포는 150mm 평판 당 약 3x106 세포로 접종하고, 세포가 약 75% 융합성이 될 때까지 하룻밤동안 증식시켰다. 그 다음, 세포를 무혈청 DMEM(Invitrogen Life Technologies, Grand Island, NY)으로 1회 세척했다. 400 pg/ml DEAE-덱스트란, 0.l mM 클로로퀸, 및 5 ㎍/ml의 DNA 작제물을 함유하는 형질감염 상청액(10ml)을 세포에 첨가하고, 그 다음 37℃에서 3 내지 4시간 동안 항온배양했다. 항온배양 후, 세포를 1x PBS중의 10% 디메틸 설폭사이드(DMSO) 10ml로 실온에서 2분 동안 펄싱(pulsing)했다. 그 다음, 다시 세포를 완전 보충된 DMEM/10% FBS(1% L-글루타민, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 1% 피루브산나트륨, 1% MEM 필수 아미노산)(Invitrogen Life Technologies)로 첨가했다. 24시간 후, 배지를 무혈청 완전 보충 DMEM(Invitrogen Life Technologies)으로 교체하고, 3 내지 4일마다 배지를 교환하면서 21일까지 세포를 생육시켰다.
Ig-융합 단백질은 COS 세포 배양물 상청액을 단백질 A 아가로스((Repligen, Cambridge, MA)컬럼을 통해 통과시켜 정제했다. 배양 상청액을 적용한 후, 단백질 A 컬럼을 그 다음 1x PBS(Invitrogen Life Technologies)로 세척했다. 결합된 Ig-융합 단백질은 0.1M 구연산(pH 2.8)로 용출시키고, 수거한 분획을 Tris 염기(pH 10.85)로 즉시 중화시켰다. 단백질을 함유하는 분획을 광학 밀도(A280) 측정으로 확인한 뒤, 모아서 1x PBS(Invitrogen Life Technologies)에 대해 투석한 다음, 0.2㎛ 필터를 통해 여과했다.
정제된 Ig-융합 단백질은 SDS-PAGE로 분석했다. 2H7 scFv-라마 IgG1, 2H7 scFv-라마 IgG2, 2H7 scFv-라마 IgG3, 및 Rituxan®(Rituximab, 항CD20 항체, Genentech, Inc. 및 IDEC Pharmaceuticals Corp.)(5㎍ 단백질)를 2x NuPAGE® SDS 시료 완충액(Invitrogen Life Technologies)(비환원 시료) 25㎕와 혼합했다. 또한, 각 단백질의 시료를 5% 2-머캅토에탄올(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 함유하는 환원 시료 완충액에도 제조했다. 분자량 마커(Invitrogen Life Technologies)는 비환원 완충액 중의 겔에만 적용했다. 단백질은 NuPAGE® 10% Bis-Tris 겔(Invitrogen Life Technologies)에서 분별했다. 전기영동(약 1시간) 후, 겔을 각각 5분씩 증류수(Invitrogen Life Technologies)로 3회 세척하고, 그 다음 Bio-Safe Coommassie Stain(BioRad, Hercules, CA) 50ml에서 실온에서 하룻밤동안 염색시켰다. 증류수로 세척한 후, 겔을 사진촬영했다. 각 Ig-융합 단백질의 이동 패턴은 도 24에 제시했다.
CD20을 발현하는 세포에 결합하는 2H scFv-라마 Ig 융합 단백질의 능력은 유동 세포측정법으로 확인했다. 정제된 2H7 scFv-라마 IgG1, 2H7 scFv-라마 IgG2 및 2H7 scFv-라마 IgG3 25㎍/ml에서 시작하는 일련의 희석물을 제조하고 CD20-형질감염된(CD20+) CHO 세포(S. Skov 박사 실험실, Institute of Medical Microbiology and Immunology, Copenhagen Denmark에서 입수)와 얼음 상의 1% FBS lx PBS 배지(Invitrogen Life Technologies)에서 1시간 동안 항온배양했다. 항온배양 후, 세포를 원심분리하고, 1x PBS 중의 1% FBS로 세척했다. 결합된 2H7 scFv-라마 Ig을 검출하기 위해, 세포를 얼음 상에서 플루오레세인 접합된 염소 항-카멜리드 IgG(중쇄 및 경쇄)(1:100)(Triple J Farms)와 1시간 동안 항온배양했다. 이 세포를 그 다음 원심분리하고 1% FBS-1x PBS에 재현탁시킨 뒤, Coulter Epics XL 세포 분류기(Beckman Coulter, Miami, FL)를 사용하여 분석했다. 데이터(최대 휘도%)는 도 25에 제시했다.
실시예 11
항CD20 scFv-라마 Ig 융합 단백질의 작동인자 기능
본 실시예는 보체 의존적 세포독성(CDC) 및 항체 의존적 세포 매개의 세포독성(ADCC)을 매개하는 항CD20 라마 IgG1, IgG2 및 IgG3 융합 단백질의 능력을 증명하는 것이다.
보체 존재하에 CD20 양성 세포를 사멸시키는 2H7 scFv-라마 IgG 융합 단백질의 능력은 BJAB 사람 B 세포주를 사용하여 검사했다. 토끼 보체는 3 내지 4주령의 토끼(Pel-Freez, Brown Deer, WI)로부터 수득했다. BJAB 세포(2 x 106 세포/ml)를 토끼 보체(최종 희석률 1:10) 및 정제된 2H7 Ig 융합 단백질과 혼합했다. 2H7 scFv-라마 IgG1, 2H7 scFv-라마 IgG2, 2H7 scFv-라마 IgG3 및 2H7 scFv-사람 IgG1 야생형 힌지-CH2-CH3 (실시예 1)을 초기 농도 30㎍/ml에서 시작하여 1:3 연속 희석율로 첨가했다. 37℃에서 1시간 후, 세포 생육성은 혈구세포계(Bright-line, Horsham, PA)를 사용하여 트립판 블루 배제(0.4%)(Invitrogen Life Technologies) 실험으로 생세포 및 사세포를 계수하여 측정했다. 사멸율%은 사세포수를 총세포수(사세포+생세포)로 나누어 계산했다. 도 26에 제시한 데이터는 모든 Ig 융합 단백질이 CDC 활성이 있음을 보여준다.
2H7 scFv-라마 IgG 융합 단백질의 ADCC 활성은 표적 세포로서 BJAB 세포를 사용하고 작동인자 세포로서 사람 또는 라마 말초혈액 단핵 세포(PBMC)를 사용하여 측정했다. BJAB 세포를 15% FBS를 함유하는 완전 보충 IMDM(Invitrogen Life Technologies)에서 51Cr(100μCi)(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)와 약 2시간 동안 예비배양했다. 이 세포를 예비배양 기간 동안 간헐적으로 혼합했다. 새로운 휴지기의 사람 PBMC는 Lymphocyte Separation Media(LSM)(ICN Pharmaceuticals, New York, NY)를 사용하여 전 혈액으로부터 정제했다. PBMC를 라벨링된 BJAB 세포(96웰 조직 배양판의 1웰당 5 x 104 세포)와 25:1, 50:1 및 100:1의 비율로 혼합했다. 각 혼합물에 정제된 2H7 scFv-라마 IgG1, 2H7 scFv-라마 lgG2, 2H7 scFv-라마 IgG3, Rituximab 10㎍/ml를 첨가하거나 또는 어떠한 항CD20 항체도 첨가하지 않았다. 이러한 혼합물을 37℃에서 6시간 동안 배양했다. 용해된 세포로부터 방출되는 51Cr을 함유하는 각 반응액의 상청액을 LumaPlate-96 필터 평판(Packard, Meiden, CT)에 주입하고, 하룻밤동안 건조했다. 51Cr 양은 TopCount NXT 평판 판독기(Packard)로 측정했다. 도 27은 2H7 scFv-라마 IgG2 융합 단백질이 ADCC 매개에 있어서 가장 효과적인 라마 융합 단백질임을 보여준다. 각 데이터 점은 3반복 웰 측정값의 평균을 나타낸다.
ADCC 활성은 작동인자 세포의 급원에 따라 영향을 받았다. 라마 PBMC는 LSM을 사용하여 라마 혈액(Triple J Fanns)으로부터 분리했다. 라마 작동인자 세포는 사람 작동인자 세포를 이용한 ADCC 분석법에서 기술한 바와 같이 BJAB 표적 세포에 동일 비율로 첨가했다. 이러한 세포들을 10㎍/ml의 정제된 2H7 scFv-라마 IgG1, 2H7 scFv-라마 IgG2, 2H7 scFv-라마 IgG3, Rituximab와 혼합하거나 또는 항CD20 항체를 첨가하지 않았다. 그 결과는 도 28에 제시했다.
실시예 12
세포 표면에서 발현되는 scFv Ig 융합 단백질의 작제 및 특성규명
본 실시예는 공동자극성 수용체에 결합하는 scFv로 구성된 유전자 조작된 세포 표면 수용체의 이소성 표면 발현에 대한 레트로바이러스 형질감염 시스템을 예시한 것이다. 또한, 본 실시예는 표적 세포에서 발현되는 다양한 scFv Ig 융합 단백질의 작동인자 기능을 증명한다.
중쇄 및 경쇄 가변 영역은 다양한 공동자극성 수용체에 대해 특이적인 뮤린 모노클론 항체로부터 클로닝하고 일본쇄 Fv 작제물은 실시예 1에 기술된 바와 거의 유사하게 제조했다. 항체로는 2H7, 항사람 CD20; 40.2.220, 항사람 CD40; 2E12, 항사람 CD28; 10A8, 항사람 CD152(항 CTLA-4); 및 500A2, 항뮤린 CD3을 사용했다. 각 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 면역글로불린 유전자를 클로닝하는 표준 방법에 따라 그리고 실시예 1에 기술된 바와 같이 클로닝했다. 일본쇄 Fv 작제물은 40.2.220, 2E12, 10A8 및 500A2의 각 VL 영역 뉴클레오티드 서열(각각 서열 번호 _)과 40.2.220, 2E12, 10A8 및 500A2의 각 VH 영역 뉴클레오티드 서열(각각 서열 번호 _) 사이에 (gly4ser)3 펩타이드 링커를 암호하는 뉴클레오티드 서열을 삽입시켜 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조했다. 40.2.220, 2E12, 10A8 및 500A2의 VL의 폴리펩타이드 서열은 각각 서열 _에 제시했고, 40.2.220, 2E12, 10A8 및 500A2의 VH의 폴리펩타이드 서열은 각각 서열 _에 제시했다. 그 다음, 각 scFv 폴리뉴클레오티드(40.2.220, 2E12, 10A8 및 500A2의 각 서열 _)를 사람 IgG1 돌연변이 힌지(CCC→SSS) 및 돌연변이 CH2(잔기 238에 있는 프롤린의 세린으로의 돌연변이(238은 EU 명명법에 따라 번호를 매긴 것이다, Ward et al., 1995 Therap. Immunol. 2: 77-94; Kabat 등에 따라서는 잔기 251이다) 및 야생형 CH3 도메인에 실시예 5 및 11에 기술된 방법에 따라 융합시켰다. 각 scFv 돌연변이 IgG1 융합 폴리뉴클레오티드 서열을 사람 CD80의 경막 도메인 및 세포질 꼬리를 암호하는 서열(서열_)에 정확한 프레임으로 융합시켜, 이러한 융합 단백질이 형질감염 세포에서 발현될 때 scFv Ig 융합 단백질의 표면 발현에 대한 앵커로서 CD80을 사용했다. 이러한 scFv-IgG-CD80 융합 단백질(40.2.220, 2E12, 10A8 및 500A2-scFv-IgG-CD80 각각에 대한 서열 _)을 암호하는 cDNA를 레트로바이러스 벡터 pLNCX(BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA)에 표준 분자생물학 절차 및 공급자의 지침에 따라 삽입했다. scFv0Ig-CD80 cDNA는 5' LTR-네오마이신 내성 유전자-CMV 프로모터 서열과 3' LTR 서열 사이에 삽입했다. 이러한 레트로바이러스 작제물을 사용하여 급성 림프구 백혈병 세포주(ATCC CRL-8286) Reh를 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 세포 표면에 scFv-Ig 융합 단백질을 발현하는 클론의 선발을 위해 선별했다.
이와 같이 형질감염된 Reh 세포에 대하여 CDC 및 ADCC 분석을 실시하여, 세포 표면 상에서의 scFv-Ig 폴리펩타이드의 발현이 작동 세포 기능을 증가시키는지의 여부를 측정했다. 항사람 CD152 scFv-돌연변이체 IgG-CD80(서열_); Reh 항사람 CD28 scFv-돌연변이체 IgG-CD80(서열_); Reh 항사람 CD40 scFv-돌연변이체 IgG- CD80(서열_); Reh 항사람 CD20 scFv-돌연변이체 IgG-CD80(서열_)을 발현하는 Reh 세포를 사람 PBMC(실시예 11 참조) 및 토끼 보체(10㎍/ml)와 37℃에서 1시간 동안 혼합했다. 미형질감염된 Reh 세포를 대조군으로 사용했다. 세포의 생육성은 트립판 블루 배제 실험으로 측정하고, 사세포율을 계산했다(실시예 11 참조). 도 29는 종양 세포의 세포 표면에서 발현될 때 보체 의존적 세포독성을 매개하는 scFv-IgG-CD80 융합 단백질의 효과를 제시한 것이다.
CDC 분석에서 검사된 것과 동일한 형질감염된 Reh 세포와 항뮤린 CD3-scFv-Ig-CD80을 암호하는 폴리뉴클레오티드 작제물(서열_)로 형질감염된 Reh 세포를 ADCC 활성에 대해 분석했다(실시예 11 참조). 미형질감염 및 형질감염된 Reh 세포를 51Cr(100μCi)(Amersham)으로 37℃에서 2시간 동안 예비라벨링시켰다. 사람 PBMC를 작동 세포로서 사용하고 Reh 표적 세포(96웰 평판의 각 웰에 5 x 104 세포씩)에 5:1, 2.5:1 및 1.25:1의 비율로 첨가했다. 37℃에서 5시간 후, 배양 상청액을 수거하고 실시예 11에 기술된 바와 같이 분석했다. 특이적 사멸율%은 다음과 같은 수학식에 따라 계산했다: ((실험 방출량 - 자발적 방출량)/(최대 방출량 - 자발적 방출량)) x 100. 수득된 데이터는 도 30에 제시했다. 각 데이터 점은 4반복 시료의 평균값을 나타낸다.
전술한 바와 동일한 절차를 사용하고, sFv 급원으로서 다음과 같은 모노클론 항체를 사용할 때 다른 결합 도메인에 의해서 동일한 결과가 수득되었다: CD20에 대해 1F5(진뱅크 AY 058907 및 AY 058906); CD40에 대해 2.36 및 G28.5; CD28에 대 해 9.3.
항체 결합 도메인의 세포 표면 발현은 항체 scFv를 IgA 힌지 및 불변 영역과 IgE 힌지 작용 영역, 즉 IgE CH2 및 불변 영역에 융합시켜 수행했다. 항4-1BB scFv, 5B9(항 사람 4-1BB) scFv, 및 CD80 경막 및 세포질 도메인과 IgE Fc 영역에 융합된 IgAH IgA T4(4개의 말단 CH3 잔기가 결실됨)에 융합된 2e12(항사람 CD40)는 서열 _에 제시했다. 암호화된 폴리펩타이드는 서열 _에 제시했다.
실시예 13
사람 Ig 힌지-CH2-CH3 돌연변이체 및 2H7 가변 영역 돌연변이체의 작제 및 서열분석
본 실시예는 돌연변이 사람 IgG1 및 IgA 불변 영역을 암호하는 scFv 융합 단백질의 작제에 대한 것이다. 또한, 본 실시예는 가변 중쇄 영역에 하나의 점 돌연변이가 있는 2H7 scFv 돌연변이체의 작제에 관한 것이다. 돌연변이는 본 명세서에 기술되고 분자생물학 분야에도 공지되어 있는 방법에 따라 가변 영역 및 불변 영역 도메인에 도입시켰다. 도 31에는 Ig 불변 영역 작제물의 명칭을 제시했다.
2H7 scFv 사람 IgG1 힌지-CH2-CH3 융합 단백질의 사람 IgG1 힌지 영역은 전체 면역글로불린에서 두 중쇄 분자 사이의 이황화 결합의 형성에 관여하는 시스테인 잔기를 치환시키는 돌연변이로 처리했다. 제1 돌연변이체인, 3개의 시스테인 잔기 모두가 세린 잔기로 돌연변이된(MTH(SSS)) 사람 IgG1 힌지 영역이 융합된 2H7 scFv는 실시예 5에 기술된 바와 같이 제조했으며(실시예 5에서는 CytoxB-MHWTG1C(야생형 IgG1 CH2 및 CH3 도메인을 함유한다)로 명명함)(여기서는 2H7 scFv MTH(SSS) WTCH2CH3이라 명명함), 서열_에 제시된 바와 같은 폴리펩타이드를 암호하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열_)을 함유한다. 이러한 돌연변이체를 암호하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열_)을 주형으로 사용하여 처음 2개의 시스테인 잔기가 세린 잔기(IgG MTH(SSC))로 치환된 돌연변이 힌지 영역을 제조했다. 세 번째 세린 잔기가 시스테인으로 치환되는 올리고뉴클레오티드를 설계했으며, 그 서열은 다음과 같다: 5'-gtt gtt gat cag gag ccc aaa tct tct gac aaa act cac aca tct cca ccg tgc cca gca cct g-3'(HuIgGMHncs3, 서열 번호 _). 제2 돌연변이체는 제1 및 제3 시스테인 잔기가 세린 잔기로 치환된 돌연변이체 힌지를 보유하도록 제조했다(IgG MTH(SCS)). 이러한 돌연변이체를 제조하는 올리고뉴클레오티드의 서열은 다음과 같다: 5'-gtt gtt gat cag gag ccc aaa tct tct gac aaa act cac aca tgc cca ccg-3' (HuIgGMHncs2, 서열 번호 _). 제3 돌연변이체는 주형으로서 IgG MTH(SSS) 돌연변이체와 다음과 같은 서열의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 제2 및 제3 위치에 시스테인 잔기를 치환시켜 제조했다(IgG MTH(CSS)): 5'-gtt gtt gat cag gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac-3' (HuIgGMHncsl, 서열 번호 _).
힌지 영역에 돌연변이를 도입시키는 올리고뉴클레오티드를, 주형 및 XbaI 부위(밑줄 친 이탤릭체 부분)를 함유하는 3' 올리고뉴클레오티드(5'-gtt gtt tct aga tca ttt acc cgg aga cag gga gag gct ctt ctg cgt gta g-3'(서열 번호 _))와 혼합하여 돌연변이 힌지-야생형(WT)-CH2-CH3 서열을 PCR로 증폭시켰다. IgG MTH CSS 및 IgG MTH SCS 돌연변이 서열은 94℃에서 변성 프로필, 52℃에서 30초간의 어닐링, 및 72℃에서 30초간의 연장 단계로 구성된 25 주기 동안 증폭시켰다. IgG MTH SSC 돌연변이 서열은 약간 다른 조건인 94℃에서 변성 프로필, 45℃ 30초간의 어닐링 및 72℃ 45초간의 연장 단계 하에서 증폭시켰다. 증폭된 폴리뉴클레오티드를 TOPO® 클로닝 벡터(Invitrogen Life Technologies)에 삽입하고, 그 다음 실시예 1에 기술된 바와 같이 서열분석하여 돌연변이 존재를 확인했다. 2H7 scFv를 함유하는 pD18 벡터는 실시예 10에 기술된 바와 거의 같이 절단하여 불변 영역 서열을 제거했다. 이와 같이 절단된 벡터 DNA에 돌연변이 힌지-야생형 CH2-CH3 영역을 프레임대로 삽입하여, 2H7 scFv MTH(CSS) WTCH2CH3 암호화 DNA(서열_); 2H7 scFv MTH(SCS) WTCH2CH3 암호화 DNA(서열 _); 및 2H7 scFv MTH(SSC) WTCH2CH3 암호화 DNA(서열 _)를 함유하는 벡터를 수득했다.
중쇄 가변 영역의 제1 프레임워크 영역에서의 위치 11에 있는 류신의 세린으로의 돌연변이(번호는 문헌(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Bethesda, MD : Public Health Service, National Institutes of Health (1991))에 따라 매긴 것임)는 상기 2H7 scFv MTH(SSS)WTCH2CH3 융합 단백질(서열 _)에 형성시켰다. 야생형 류신 잔기는 다음과 같은 올리고뉴클레오티드 Vhser11을 사용하여 부위 지향성 돌연변이유발에 의해 세린으로 치환시켰다: 5'-gga ggt ggg age tct cag get tat cta cag cag tct ggg get gag teg gtg agg cc-3'(서열 번호 _) (이 서열 또는 이 서열을 암호하는 아미노산 서열은 경우에 따라 당해 발명의 특정 청구 양태에서 배제되어도 무방하다). PCR을 위한 3' 프라이머는 huIgG1-3'로서 서열은 다음과 같다: 5'-gtc tct aga cta tca ttt acc cgg aga cag-3'(서열 번호 _)(XbaI 부위는 밑줄친 이탤릭체 부분이다). PCR 증폭 후, 단편을 TOPO® 클로닝 벡터에 삽입하고, 서열분석하여 VH11 류신에서 세린으로의 돌연변의 존재를 확인했다. 2H7 scFv-IgG MTH(SSS) WTCH2CH3 암호화 DNA는 PSL1180 클로닝 벡터(Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ)에 셔틀 이동시켰다. 결과적으로 수득되는 작제물 PSL1180-2H7 scFv-IgG MTH(SSS) WTCH2CH3을 Sac 및 XbaI으로 절단하여 야생형 VH 도메인 및 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 제거했다. VH11 돌연변이를 함유하는 PCR 산물은 Sca 및 XbaI로 절단한 뒤, 표준 분자생물학 절차에 따라 절단한 PSL1180 작제물에 삽입했다. 이러한 작제물을 HindIII 및 XbaI로 절단하고, 포유동물 발현 벡터 pD18(실시예 1 및 실시예 10에 기술된 방법 참조)에 삽입했다. 이러한 돌연변이체를 2H7 scFv VH11SER IgG MTH(SSS) WTCH2CH3(도 31)으로 명명했다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 _에 제시했고, 암호화된 폴리펩타이드 서열은 서열 _에 제시했다(이러한 서열들은 당해 발명의 특정 청구 양태에서 배제되어도 무방하다).
IgA 불변 영역 도메인을 함유하는 4개의 작제물을 제조했다. 제1 작제물에는 사람 IgG1 CH2 및 CH3에 융합된 야생형 IgA 힌지를 첨가했다(IgAH IgG WTCH2CH3)(도 31). 이어서 순차 PCR 증폭을 수행하여 2H7 scFv 작제물의 사람 IgG1 힌지를 IgA 힌지를 암호하는 뉴클레오티드 서열로 치환시켰다. 1차 PCR 반응에 사용한 5' 올리고뉴클레오티드 프라이머(huIgA/Gchim5)의 서열은 다음과 같다:5'-cca tet ccc tca act cca cct acc cca tct ccc tca tgc gca cct gaa ctc ctg-3'(서열 번호 _). IgA 특이 힌지 서열을 더 많이 첨가하고 BclI 제한효소 부위(밑줄친 이탤릭체 부위)를 추가하기 위한 2차 PCR 반응에 사용한 프라이머(huIgAhg-5')의 서열은 다음 과 같다: 5'-gtt gt t gat ca g cca gtt ccc tca act cca cct acc cca tct ccc caa ct-3'(서열 번호 _). 두 증폭 단계의 3' 프라이머로는 다음과 같은 서열의 huIgG1-3'를 사용했다: 5'-gtc tct aga cta tca ttt acc cgg aga cag-3'(서열 번호 _). PCR 산물의 서열은 전술한 바와 같이 TOPO® 클로닝으로 확인했다. 겔 정제된 단편을 BclI 및 XbaI으로 절단한 뒤, 모든 IgG1 불변 영역 도메인을 제거하기 위해 BclI 및 XbaI으로 절단시킨 2H7 scFv-pD18 벡터에 삽입했다. 결찰은 실시예 10에 기술된 바와 같이 수행하여 2H7 scFv IgA 힌지-IgG1 CH2-CH3 폴리펩타이드(서열 번호 _)을 암호하는 뉴클레오티드 서열(서열 번호 _)을 함유한 포유동물 발현 벡터를 제공했다.
제2 pD18 포유동물 발현 벡터는 야생형 IgA 힌지, CH2 및 CH3 도메인(서열_)에 융합된 2H7 scFv를 암호하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열 _)를 제공하여 작제했다. 사람 IgA 불변 영역 서열은 실시예 10에 대부분 기술된 바와 같이, 랜덤 프라이머를 사용하여 사람 편도선에서 분리한 총 RNA를 역전사시킨 뒤, 이 cDNA를 서열 특이적 프라이머를 사용하여 CPR 증폭하여 수득했다. IgA-CH2-CH3 폴리펩타이드(IgAH IgACH2CH3, 도 31)(서열 번호 _)를 암호하는 사람 IgA 힌지-CH2-CH3 뉴클레오티드 서열(서열 번호 _)은 5' 올리고뉴클레오티드 huIgAhg-5'(서열 번호 _(전술한 서열과 같다)) 및 다음과 같은 서열의 3' 올리고뉴클레오티드 huIgA3'를 사용하여 증폭시켰다: 5'-gtt gtt tct aga tta tca gta gca ggt gcc gtc cac ctc cgc cat gac aac-3'(서열 번호 _). 형질감염된 포유동물 세포로부터 2H7 IgA 힌지-IgA CH2-CH3 폴리펩타이드의 분비는 이황화 결합을 통해 2개의 IgA CH3 도메인에 공유 결합 하는 사람 J 쇄의 공동발현을 필요로 했다. 편도선 B 세포로부터 총 RNA를 분리하고 전술한 바와 같이 역전사하여 cDNA를 수득했다. J 쇄를 암호하는 뉴클레오티드 서열의 PCR 증폭은 J 쇄 특이적 프라이머를 사용하여 수행했다. 5' PCR 프라이머 HUJCH5nl의 서열은 5'-gtt gtt aga tct caa gaa gat gaa agg att gtt ctt-3'(서열 _)이고, 3' 프라이머 HUJCH3의 서열은 5'-gtt gtt tct aga tta gtc agg ata gca ggc atc tgg-3'(서열 번호 _)이었다. cDNA는 TOPO®에 클로닝하여 실시예 10에 기술된 바와 같이 서열분석했다. 그 다음, J 쇄 암호화 cDNA(서열 번호 _)를 2H7 scFv IgA 힌지-CH2-CH3 작제물과의 공동형질감염을 위해 pD18 및 pCDNA3-Hygro(+)(Invitrogen Life Technology) 벡터에 삽입시켰다. J 쇄의 추정 아미노산 서열은 서열_에 제시했다.
J 쇄의 부재하에 scFv IgA 불변 영역 작제물의 분비는 J 쇄와 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기를 포함한 4개의 카르복시 말단 아미노산(GTCY, 서열 _)이 결실된 절두형 CH3 도메인(IgAH IgA-T4, 도 31)을 조작하여 수행했다. CH3에 결실부가 있는 IgA 힌지-CH2-CH3 뉴클레오티드 서열(서열 번호 _)은 서열 5'-gtt gt t gat ca g cca gtt ccc tca act cca cct acc cca tct ccc tca act-3'(서열 번호 _)(밑줄친 이탤릭체 부위는 BclI 부위이다)의 5' PCR 프라이머(huIgAhg-5') 및 서열 5'-gtt gtt tct aga tta tca gtc cac ctc cgc cat gac aac aga cac-3'(서열 번호 _)의 3' PCR 프라이머(HUIGA3T1)를 사용하여 제조했다. 이와 같이 돌연변이된 IgA 불변 영역 뉴클레오티드 서열은 2H7 IgAH IgA-T4 폴리뉴클레오티드(서열 번호 _)를 암호하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열 번호 _)을 함유하는 전술한 2H7 scFv-Ig 작 제물(실시예 1 및 본 실시예 참조)의 제조에 대해서 설명한 바와 같이 2H7 scFv pD18 벡터에 삽입했다.
제4 작제물은 IgA CH3의 카르복시 말단에서 14개 부가 아미노산(대부분 소수성 잔기이다)이 결실된 2H7 scFv-IgA 불변 영역 융합 단백질을 암호하는 것으로 제조했다. PTHVNVSVVMAEVD(서열 번호 _)을 암호하는 뉴클레오티드 서열의 결실을 조작하기 위하여 주형으로서 2H7 scFv-IgAH IgA-T4 암호화 폴리뉴클레오티드를 사용했다. 5' 올리고뉴클레오티드 프라이머의 서열은 다음과 같다: 5'-gtt gt t gat ca g cca gtt ccc tca act cca cct acc cca tct ccc tca act- 3'(서열 번호 _)(밑줄친 이탤릭체 부위는 BclI 부위이다). 3' 올리고뉴클레오티드 서열은 다음과 같다: 5'-gtt gtt tct aga tta tca ttt acc cgc caa gcg gtc gat ggt ctt-3'(서열 번호 _). 결실된 IgA CH3 영역은 상기 올리고뉴클레오티드를 사용하여 사람 편도선에서 분리한 RNA 유래의 IgA 불변 영역을 증폭시켜, cDNA에 18개 아미노산에 대한 결실된 카르복시 말단 암호화 영역을 형성시켰다. IgAH IgA-T18 불변 영역은 전술한 바와 같이 2H7 IgAH IgA-T18 폴리뉴클레오티드(서열 번호 _)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열 번호 _)을 함유하는 2H7 scFv pD18 벡터에 삽입시켰다.
실시예 14
CTLA-4 IgG 융합 단백질의 이펙터 기능
본 실시예는 CDC 및 ADCC 분석에서 CTLA-4 Ig 융합 단백질의 이펙터 기능을 비교한 것이다.
2개의 CTLA-4 IgG 융합 단백질을 제작하였다. 하나의 융합 단백질은 인간 야 생형 힌지, CH2, 및 CH3 도메인에 융합된 CTLA-4의 세포외 도메인을 포함하고, CTLA-4 IgG WTH (CCC) WTCH2CH3(서열 번호 _)로 명명된다. CTLA-4 IgG WTH (CCC) WTCH2CH3(서열 번호 _)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 pD18 포유류 발현 벡터는, 실시예 1 및 10에 개시된 방법에 따라 IgG WTH (CCC) WTCH2CH3를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열 번호 _)에 CTLA-4의 세포외 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열 번호 _) (미국 특허 5,844,095호 참조)을 프레임 내에서 융합시켜 제조하였다. 세포외 도메인 뉴클레오티드 서열은 3' 말단에서 BclI 제한 효소 부위와, oncoM 리더 펩티드(서열 번호 _)를 코딩하는 리더 펩티드 뉴클레오티드 서열(서열 번호 _)을 포함한다. CTLA-4 IgG MTH (SSS) MTCH2WTCH3라 명명되는 제2의 CTLA-4 IgG 융합 단백질은, 모든 3개의 시스테인 잔기가 세린 잔기로 치환된 돌연변이 IgG 힌지에 융합된 CTLA-4의 세포외 도메인(+ oncoM 리더 펩티드 서열)을 포함하였다. 힌지 영역은, 이소타입 위치 238(EU 번호매김, Ward 등, 상기 문헌 참조, (상기 Kabat 등의 문헌에 따른 번호 매김을 사용한 경우 위치 251; IgG1 CH1의 제1 잔기로부터 시작하는 번호매김에 따르면 위치 209; 즉, 야생형 IgG1 CH2의 PAPELLDGPS(서열 번호 _)가 PAPELLDGSS(서열 번호 _)로 변형됨)에서 돌연변이를 가지는 돌연변이 IgG1 CH2 도메인에 융합되어 있으며, 이것은 IgG1 야생형 CH3에 융합되어 있다(미국 특허 5,844,095호). CTLA-4 IgG MTH (SSS) MTCH2WTCH3 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 _의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 추정 아미노산 서열은 서열 번호 _에 제시된 서열을 포함한다. 또한, CTLA-4 융합 단백질은 리더 펩티드(서열 번호 _) 없이 CTLA-4 세포외 막을 코딩하는 서열을 사용하여 제조하였다.
CDC 활성을 측정하기 위해서, 정제된 CTLA-4 IgG WTH (CCC) WTCH2CH3 (2 ㎍/㎖) 또는 CTLA-4 IgG MTH (SSS) MTCH2WTCH3(2 ㎍/㎖)를, 토끼 보체(10 ㎍/㎖)의 존재 또는 부재 하에, Reh 세포(실시예 12 참조), 및 CD80이 세포 표면에서 발현되도록 동시자극 분자 CD80으로 형질감염시킨 Reh 세포(Reh CD80.10; Doty 등 1998 J.Immunol 161:2700; Doty 등 1996 J. Immunol. 157:3270 참조)에 첨가하였다. 실시예 10에 개시된 방법에 따라 일시 형질감염된 COS 세포의 배양 상청액으로부터 정제된 CTLA Ig 융합 단백질을 제조하였다. 분석은 실시예 11 및 12에 개시된 바와 실질적으로 동일하게 수행하였다. 도 32에 제시된 데이터는, 보체 및 CTLA-4 IgG WTH (CCC) WTCH2CH3 융합 단백질의 존재 하에 CD80 형질감염된 Reh 세포만이 죽었다는 것을 보여준다.
정제된 CTLA-4 Ig 융합 단백질을 ADCC 분석에서 테스트하였다. 이펙터 세포로서 작용하는 인간 PBMC를 1.25:1, 2.5:1, 5.0:1 및 10:1의 비율로 Reh 또는 Reh CD80.1 표적 세포에 첨가하였다. 세포를 표지하고, 실시예 11 및 12에 개시된 바와 실질적으로 동일하게 분석을 실시하였다. 결과는 도 33에 제시되어 있다. 각 데이터 점은 각각의 이펙터:표적 세포 비율에서 4회 독립 배양 웰의 평균값을 나타낸다. 이 데이터는, CTLA-4 IgG WTH(CCC) WTCH2CH3만이 Reh CD80.10 세포의 유의적인 ADCC를 매개한다는 것을 보여준다.
실시예 15
CTLA-4 IgA 융합 단백질의 이펙터 기능
CTLA-4 IgA 융합 단백질을, IgG 융합 단백질에 대해 개시된 바와 같이 제조 하였다(실시예 1, 13 및 14 참조). CTLA-4 세포외 도메인 뉴클레오티드 서열(서열 번호 _)을, IgAH IgACH2CH3를 코딩하는 뉴클레오티드(서열 번호 _)에 오픈 리딩 프레임 내에서 융합시켜 CTLA-4 IgAH IgACH2CH3 융합 단백질(서열 번호 _)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열 번호 _)을 얻었다. 융합 단백질을 COS 세포로 일시적으로 형질감염시키거나(실시예 10 참조), 또는 CHO 세포에서 안정하게 발현시킨다(실시예 1 참조). CTLA-4 IgAH IgACH2CH3 융합 단백질의 분비를 위해서는 인간 J 쇄(서열 번호 _)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열 번호 _)을 포함하는 구성체로 동시형질감염시켜야 한다. CTLA-4 IgAH IgACH2CH3 융합 단백질을 실시예 10 및 14에 개시된 바와 같이 분리한다. J 쇄의 존재 없이 CTLA-4 IgA 구성체를 발현하기 위해서, CTLA-4 IgAH IgA-T4 구성체를 제조하고 포유류 세포 내로 형질감염시킨다. 야생형 IgA 힌지-CH2CH3에 융합된 CTLA-4 세포외 단편에 대해 개시된 바와 유사한 방식으로, CTLA-4 세포외 도메인 뉴클레오티드 서열(서열 번호 _)을, IgAH IgA-T4 폴리펩티드(서열 번호 _)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열 번호 _)에 오픈 리딩 프레임 내에서 융합시켜 CTLA-4 IgAH IgA-T4 폴리펩티드(서열 번호 _)를 코딩하는 서열 번호 _를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 실시예 14에 개시된 바와 같이 CDC 및 ADCC로 각 구성체의 효과기 기능을 평가한다.
실시예 16
항-CD20 scFv 인간 Ig 융합 단백질의 CD20 발현 CHO 세포에의 결합
본 실시예는 2H7 scFv Ig 융합 단백질의 CD20 발현 CHO 세포에의 결합을 개시한다. 이 분석은 유세포 분석법으로 실시하였다. 2H7 scFv IgG WTH (CCC) WTCH2CH3(서열 번호 _); 2H7 scFv IgG MTH (CSS) WTCH2CH3(서열 번호 _); 2H7 scFv IgG MTH (SCS) WTCH2CH3(서열 번호 _); 및 2H7 scFv VHSER11 WTH WTCH2CH3(서열 번호 _)를 발현하는 일시 형질감염된 COS 세포로부터 배양 상청액을 수거하고, 일련의 2배 희석물을 준비하였다. 정제된 2H7 scFv IgG MTH (SSC) WTCH2CH3(서열 번호 _)의 일련의 2배 희석물을 5 ㎍/㎖ 농도에서 시작하여 준비하였다. 배양 상청액과 정제된 융합 단백질 샘플을 얼음 위에서 1 시간 동안 (CD20+) CHO 세포와 함께 항온처리하였다. 세포를 2회 세척한 다음 40분 동안 1:100 FITC-접합된 염소 항-인간 IgG(CalTag)와 함께 항온처리하였다. 세포를 세척하여 비결합 접합체를 제거하고, 쿨터 에픽스 XL 세포 분류기를 사용하여 유세포 분석을 실시하였다. 결과는 도 34에 제시되어 있다.
실시예 17
항-CD20 scFv 인간 IgG 및 IgA 융합 단백질의 면역블롯 분석
본 실시에는 형질감염된 세포 배양 상청액으로부터 면역침전시킨 2H7 scFv IgG 및 2H7 scFv IgA 융합 단백질의 면역블롯 분석을 개시한다.
실질적으로 실시예 10에 개시된 방법에 따라 2H7 scFv IgG WTH (CCC) WTCH2CH3(서열 번호 _); 2H7 scFv IgG MTH (CSS) WTCH2CH3(서열 번호 _); 2H7 scFv IgG MTH (SCS) WTCH2CH3(서열 번호 _); 2H7 scFv IgA H IgG WTCH2CH3(서열 번호 _); 및 scFv IgG MTH (SSS) WTCH2CH3(서열 번호 _)에 대한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드로 COS 세포를 일시 형질감염시켰다. 세포를 벡터만으로 형질감염시켰다. 37℃에서 48∼72 시간 후에, 세포 배양 상청액을 수거하고, 4℃에서 1 시간 동안 단백질 A-아가로스 비드(레플리겐)와 합하였다. 비드를 원심분리하고 TNEN[20 mM 트리스 염기, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 및 0.05% NP-40, pH8.0]으로 수회 세척하였다. 면역침전물을 2 x NuPAGE(등록상표) SDS 샘플 완충액(인비트로젠 라이프 테크놀로지즈) (비환원형 샘플)과 합하였다. NuPAGE(등록상표) 10% 비스-트리스 겔(인비트로젠 라이프 테크놀러지즈) 상에서 단백질을 분류하였다. 전기 영동(약 1 시간) 후에, 반건조 블롯터(미국 워싱톤주 먼로의 엘라드 인스트루먼테이션)를 사용하여 겔로부터 임모빌론 P 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 막위로 단백질을 옮겼다. PVDF 막을 5% 무지방 밀크를 함유하는 PBS 중에서 차단한 다음 HRP-접합된 염소 항-인간 IgG(Fc 특이적) (CalTag)로 프로빙하였다. PBS 중에서 면역블롯을 수회 세척한 다음, ECL(아머샴 바이오사이언스)를 사용하여 블롯을 전개하였다. 결과는 도 35에 제시되어 있다.
실시예 18
항-CD20 scFv 인간 IgA 융합 단백질의 CD20+ CHO 세포에의 결합
본 실시예는 (CD20+) CHO 세포에 대한 2H7 scFv IgAH IgACH2CH3(서열 번호 _) 및 2H7 scFv IgAH IgAT4(서열 번호 _) 융합 단백질의 결합의 면역유세포분석을 개시한다.
2H7 scFv IgAH IgACH2CH3 폴리펩티드(서열 번호 _)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열 번호 _)을 포함하는 플라스미드 DNA와, 인간 J 쇄 폴리펩티드(서열 번호 _)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열 번호 _)을 포함하는 별개의 플라스미드로 실시예 10에 개시된 바와 같이 COS 세포를 일시 동시형질감염시켰다. 또 한, CH3의 카르복시 말단에서 4개의 아미노산이 결실된 2H7 scFv IgA 융합 단백질(2H7 scFvIgAH IgA-T4, 서열 번호 _)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열 번호 _)로 COS 세포를 형질감염시켰다. 형질감염은 실시예 10에 개시된 바와 같이 실시하였다. 형질감염된 COS 세포로부터 얻은 배양 상청액을 (CD20+) CHO 세포와 합하고(실시예 1 참조), 얼음 위에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 세포를 PBS-2% FBS로 2회 세척한 다음 40분 동안 FITC-접합된 염소 항-인간 IgA 쇄(CalTag) (1:100)와 합하였다. 세포를 다시 세척한 다음 쿨터 에픽스 XL 세포 분류기를 사용한 유세포 분석으로 분석하였다. 도 36은, 절두된 CH3 카르복시 말단을 가지는 2H7 IgA 융합 단백질인 2H7 scFv IgAH IgAT4(서열 번호 _)의 분비에 J로의 동시 형질감염은 필요하지 않다는 것을 보여준다.
실시예 19
항-CD20 scFv 인간 IgA 융합 단백질의 이펙터 기능
본 실시예는 CD20을 발현하는 세포에 대한 2H7 IgG 및 IgA 융합 단백질의 ADCC 활성을 예시한다. BJAB 세포를 37℃에서 2 시간 동안 51Cr(100 μCi) (아머샴)로 사전표지하였다. 새로운 휴지 인간 전혈로부터 이펙터 세포를 얻었으며, 이를 동부피의 알저버 용액에서 희석하여 응고를 방지하였다. 2H7 scFv IgG MTH (SSS) WTCH2CH3(서열 번호 _); 2H7 scFv IgG MTH (SCS) WTCH2CH3(서열 번호 _); 2H7 scFv IgG WTH (CCC) WTCH2CH3(서열 번호 _); 및 2H7 scFv IgAH IgACH2CH3(서열 번호 _) 융합 단백질을 실시예 10에 개시된 바와 같이 단백질 A 크로마토그래피에 의해 일시 형질감염된 COS 세포 상청액(100∼200 ㎖)으로부터 정제하였다. 2H7 scFv IgAH IgACH2CH3를 코딩하는 플라스미드로 형질감염된 COS 세포를 실시예 18에 개시된 바와 같이 인간 J 쇄를 코딩하는 플라스미드로 동시형질감염시켰다. 5 ㎍/㎖에서 출발한 정제된 2H7 Ig 융합 단백질의 일련의 2배 희석물을 전혈(알저버 용액 중에 1:1로 희석된 전혈 100 ㎕, 최종 희석율 1:4)의 존재 하에 표지된 BJAB 세포(96웰 조직 배양판의 웰당 5 x 104 세포)에 첨가하고, 37℃에서 5 시간 동안 항온처리하였다. 배양 상청액을 수거하고, 실시예 11에 개시된 바와 같이 분석하였다. 하기 식에 따라 특이적 사멸율(%)을 계산하였다: ((실험 방출값 - 자발 방출값)/(최대 방출값 - 자발 방출값)) x 100. 데이터는 도 37에 제시되어 있다. 각 데이터점은 4중 샘플의 평균값을 나타낸다.
제2 ADCC 분석에서, 표지된 BJAB 표적 세포의 수는 각 샘플 내에서 일정하게 유지되며, 0.25, 0.125 및 0.0625의 희석율로 전혈을 첨가하였다. 5 ㎍/㎖의 농도로 정제된 2H7 IgG 및 IgA 융합 단백질을 첨가하였다. BJAB 세포, 전혈 및 융합 단백질을 항온처리하고, 상청액을 수거하고, 상기 개시된 바와 같이 특이적 사멸율을 계산하였다. 2H7 융합 단백질 각각에 대한 특이적 사멸율은 도 38에 제시된 바와 같다.
정제된 2H7 scFv IgG MTH (SSS) WTCH2CH3 (5 ㎍/㎖) 및 정제된 2H7 scFv IgAH IgACH2CH3 (5 ㎍/㎖)의 ADCC 활성을 상이한 이펙터 세포군의 존재 하에 비교하였다. 실시예 11 및 12에 개시된 바와 같이 전혈로부터 PBMC를 분리하였다. PBMC를 50:1, 25:1 및 12.5:1의 비율로 표지된 BJAB 표적 세포 (96웰 조직 배양판의 웰 당 5 x 104)와 합하였다. 분석을 실시하고 상기 개시된 바와 같이 데이터를 분석하였다. 도 39A는, PBMC가 이펙터 세포로서 작용하는 경우 2H7 scFv IgG MTH (SSS) WTCH2CH3 융합 단백질만이 ADCC 활성을 가진다는 것을 보여준다. 도 39B는 전혈이 (도 38에 예시된 바와 같이) 이펙터 세포원인 경우 2H7 scFv IgG MTH (SSS) WTCH2CH3 및 2H7 scFv IgAH IgACH2CH3가 모두 ADCC 활성을 나타낸다는 것을 보여준다.
실시예 20
2H7 scFv VH11Ser IgG MTH (SSS) WTCH2CH3 융합 단백질의 발현 수준
본 실시예는 2H7 scFv VH11Ser IgG MTH (SSS) WTCH2CH3 융합 단백질(서열 번호 _)의 발현 수준을 가변 중쇄 도메인 내에 돌연변이를 포함하지 않는 다른 2H7 scFv IgG 구성체와 비교한다. 뉴클레오티드 서열 2H7 scFv IgG MTH (SSS) WTCH2CH3(서열 번호 _); 2H7 scFv IgG MTH (CSS) WTCH2CH3(서열 번호 _); 2H7 scFv IgG MTH (SCS) WTCH2CH3(서열 번호 _); 2H7 scFv IgG WTH (CCC) WTCH2CH3(서열 번호 _); 및 2H7 scFvVHSER11 IgG MTH (SSS) WTCH2CH3를 포함하는 포유류 발현 벡터 pD18(실시예 1 및 13 참조)을 실시예 10에 개시된 바와 COS 세포로 일시 형질감염시켰다. 37℃에서 72 시간 후에, 배양 상청액을 수거하고, 각 상청액 1 ㎕를 비환원성 샘플 완충액(실시예 10에 개시된 방법 참조)과 합하였다. 정제된 2H7 scFv IgG MTH (SSS) WTCH2CH3 (40 ng, 20 ng, 10 ng/ 5 ng, 및 2.5 ng)의 배양 상청액 샘플 및 분액을 10% 비스-트리스(MOPS) NuPAGE(등록상표) (인비트로젠 라이프 테크놀러지즈) 겔 상에서 분류하였다. Multimark 단백질 표준물(인비트로젠 라이프 테 크놀로지즈)을 겔 상에서 분리하였다. 단백질을 PDVF 막으로 전달하고, 실시예 17에 개시된 바와 같이 면역블롯팅하였다. 면역블롯은 도 40에 제시되어 있다. 윈도우 소프트웨어용 ScionImage를 사용한 블롯의 밀도측정 분석으로 융합 단백질의 양을 정량하고, 표준 곡선과 비교하였다. 2H7 scFv IgG WTH (CCC) WTCH2CH3 구성체는 약 12 ng/㎕를 또는 12 ㎍/㎖를, 2H7 scFv IgG MTH (CSS) WTCH2CH3는 약 10 ng/㎕ 또는 10 ㎍/㎖를, 2H7 scFv IgG MTH (SCS) WTCH2CH3 구성체는 약 1 ng/㎕ 또는 1 ㎍/㎖를, 2H7 scFv VHER11 IgG MTH (SSS) WTCH2CH3 구성체는 약 30 ng/㎍ 또는 30 ㎍/㎖를 생성하였다. 본 발명의 특정 구체예에서, 2H7 scFv VHSER11 IgG MTH (SSS) WTCH2CH3의 아미노산 서열, 또는 2H7 scFv VHSER11 IgG MTH (SSS) WTCH2CH3를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 본 발명의 특정 구체예로부터 경우에 따라 배제할 수 있다. 유사하게, 2H7 scFv VHSER11 IgG WTH (CCC) WTCH2CH3의 아미노산 서열, 또는 2H7 scFv VHSER11 IgG WTH (CCC) WTCH2CH3를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 본 발명의 특정 구체예로부터 경우에 따라 배제할 수 있다. 또한, 가변 중쇄 도메인내의 위치 11에서 류신의 세린으로의 아미노산 치환, 또는 가변 중쇄 도메인내의 위치 11에서 류신의 세린으로의 아미노산 치환을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 본 발명의 특정 구체예로부터 경우에 따라 배제할 수 있다.
실시예 21
돌연변이 CH3 도메인을 가지는 2H7 scFv IgG 융합 단백질의 제작
2H7 IgG 융합 단백질의 CH3 도메인으로 아미노산 돌연변이를 도입하였다. 2H7 scFv IgG MTH (SSS) WTCH2CH3(서열 번호 _)를 포함하는 pD18 벡터를 BclI 및 XbaI로 분해하여 MTH WTCH2CH3(서열 번호 _) 단편을 제거한 다음, BclI 및 XbaI로 이중 분해된 pShuttle 벡터 (미국 캘리포니아주 팔로 알토의 BD 바이오사이언스 클론테크)로 서브클로닝하였다. 앰피실린 내성 유전자는 클로닝 절차에 필요한 XmnI 부위를 가지기 때문에 카나마이신 내성 벡터에서 서브클로닝을 실시하였다. 하기의 치환을 가지는 5개의 구성체를 제조하였다: (1) 올리고뉴클레오티드 CH3Y405를 사용하여 위치 405(Kabat 등의 상기 문헌에 따른 번호매김)에서의 페닐알라닌을 티로신으로 치환; (2) 올리고뉴클레오티드 CH3A405를 사용하여 위치 405에서의 페닐알라닌을 알라닌 잔기로 치환; (3) 올리고뉴클레오티드 CH3A407를 사용하여 위치 407에서의 티로신 잔기를 알라닌으로 치환; (4) 올리고뉴클레오티드 CH3Y405A407를 사용하여 위치 405 및 407에서의 야생형 아미노산을 각각 티로신 및 알라닌으로 치환; (5) 올리고뉴클레오티드 CH3A405A407를 사용하여 위치 405 및 407에서의 야생형 아미노산을 알라닌으로 치환하였다. 이 올리고뉴클레오티드는 CH3 도메인의 일부의 PCR 증폭을 위한 3' 프라이머였다. 각 3' 올리고뉴클레오티드를 위한 뉴클레오티드 서열은 다음과 같았다.
CH3Y405: 5'-gtt gtt gaa gac gtt ccc ctg ctg cca cct gct ctt gtc cac ggt gag ctt gct gta gag gta gaa gga gcc-3'(서열 번호 _)
CH3A405: 5'-gtt gtt gaa gac gtt ccc ctg ctg cca cct gct ctt gtc cac ggt gag ctt gct gta gag ggc gaa gga gcc-3'(서열 번호 _)
CH3A407: 5'-gtt gtt gaa gac gtt ccc ctg ctg cca cct gct ctt gtc cac ggt gag ctt gct ggc gag gaa gaa gga gcc-3'(서열 번호 _)
CH3Y405A407: 5'-gtt gtt gaa gac gtt ccc ctg ctg cca cct gct ctt gtc cac ggt gag ctt gct ggc gag gta gaa gga gcc-3'(서열 번호 _)
CH3A405A407: 5'-gtt gtt gaa gac gtt ccc ctg ctg cca cct gct ctt gtc cac ggt gag ctt gct ggc gag ggc gaa gga gcc-3'(서열 번호 _)
주형은 돌연변이 힌지 MHWTCH2CH3 인간 IgG1이었다. 5' PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머는 huIgGMHWC [서열 번호 _]였다. 증폭 산물을 TOPO(등록상표) 클로닝하고 실시예 1 및 10에 개시된 바와 같이 서열결정하였다. 정확한 서열을 가진 클론으로부터의 DNA를 BclI 및 XmmI로 분해하고 MTH WTCH2CH3 서열을 포함하는 pShuttle로 옮기고, 다시 동일한 제한 효소로 분해하였다. BclI 및 XbaI로 분해하여 돌연변이된 IgG 서열을 제거하고, BclI 및 XbaI로 다시 분해한 2H7 scFv를 포함하는 pD18 벡터로 삽입하였다. 돌연변이된 CH3 도메인, MTCH3 Y405, MTCH3 A405, MTCH3 A407, MTCH3 Y405A407, 및 MTCH3 A405A407에 대한 폴리뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호 _에 개시되어 있으며, 각각에 대한 폴리펩티드 서열은 각각 서열 번호 _에 개시되어 있다. 각각의 2H7 scFv MTH WTCH2 MTCH3 Y405, 2H7 scFv MTH WTCH2 MTCH3 A405, scFv MTH WTCH2 MTCH3 A407, scFv MTH WTCH2 MTCH3 Y405A407, 및 scFv MTH WTCH2 MTCH3 A405A407에 대한 폴리뉴클레오티드 서열과 추정 아미노산 서열은 각각 서열 번호 _에 제시되어 있다.
실시예 22
힌지 돌연변이를 가지는 2H7 scFv IgG 융합 단백질의 제작
IgG1 힌지 영역 내의 제3 시스테인 잔기가 세린 잔기로 치환된 2H7 scFv IgG 융합 단백질을 구성하였다. 돌연변이 도입을 위한 주형은 2H7 scFv WTH WTCH2CH3(서열 번호 _)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다. 돌연변이를 도입하기 위한 올리고뉴클레오티드는 서열 5'-gtt gtt gat cag gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgt cca ccg tcc cca gca cct-3'를 가지는 5' PCR 프라이머 올리고뉴클레오티드 HIgGMHcys3였다. 힌지 영역에 돌연변이를 도입하는 올리고뉴클레오티드를 주형 및 XbaI 부위 (밑줄로 표시된 이탤릭체) (5'-gtt gtt tct aga tca ttt acc cgg aga cag gga gag gct ctt ctg cgt gta g-3'(서열 번호 _))를 함유하는 3' 올리고뉴클레오티드와 조합하여 돌연변이 힌지 야생형 (WT)-CH2-CH3 서열을 PCR로 증폭하였다. 94℃의 변성, 30초간 50℃에서의 어닐링 및 30초간 72℃의 신장을 30 사이클 실시하여 IgG MTH CCS 돌연변이 서열을 증폭시켰다. 증폭된 폴리뉴클레오티드를 TOPO(등록상표) 클로닝 벡터(인비트로젠 라이프 테크놀로지즈)로 삽입한 다음 실시예 1에 개시된 바와 같이 서열 결정하여 돌연변이의 존재를 확인하였다. 2H7 scFv를 함유하는 pD18 벡터를 분해하여 실질적으로 실시예 10에 개시된 바와 같이 불변부 서열을 제거하였다. 돌연변이 힌지 야생형 CH2-CH3 영역을 분해 벡터 DNA로 프레임 내에 삽입하여 2H7 scFv MTH (CCS) WTCH2CH3를 코딩하는 DNA(서열 번호 _)를 포함하는 벡터를 얻었다. 추정 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _에 제시되어 있다.
실시예 23
항-CD20 IgE 융합 단백질의 제작
발현된 폴리펩티드가 알러지 반응 기전을 유도할 수 있도록 결합 도메인을 IgE 불변부 서열에 융합시킨다. 항-CD40 항체인 40.2.220(서열 번호 _)의 단일쇄 Fv 뉴클레오티드 서열을, 다른 scFv 면역글로불린 불변부 구성체에 대해 개시된 방법에 따라 IgE CH2-CH3-CH4에 융합시킨다(실시예 1, 5, 10 및 13 참조). IgE CH2-CH3-CH4 도메인을 PCR 증폭시키기 위해서, 서열 5'-gtt gtt gat cac gtc tgc tcc agg gac ttc acc cc-3'을 가지는 5'올리고뉴클레오티드 프라이머인 hIgE5Bcl과 서열 5'-gtt gtt tct aga tta act ttt acc ggg att tac aga cac cgc tcg ctg g-3'를 가지는 3' 올리고뉴클레오티드 프라이머인 hIgE3stop을 사용한다.
실시예 12에 개시된 동시자극 수용체에 결합하는 scFv를 포함하는 유전자 조작된 세포 표면 수용체의 이소(ectopic) 표면 발현에 대한 레트로바이러스 형질감염 시스템을 사용하여 40.2.220 scFv IgE 융합 단백질을 구성한다. 융합 단백질이 형질감염된 세포에서 발현되는 경우 CD80이 scFv Ig 융합 단백질의 표면 발현을 위한 앵커를 제공하도록 40.2.220 scFv IgE 융합 폴리뉴클레오티드 서열을 인간 CD80의 경막 도메인 및 세포질 꼬리를 코딩하는 서열(서열 번호 _)에 프레임 내에서 융합시킨다. 항-CD40 scFv-IgE-CD80 융합 단백질(서열 번호 _)을 코딩하는 cDNA를 표준 분자 생물학 절차 및 판매자 지시 사항에 따라서 레트로바이러스 벡터 pLNCX (BD 바이오사이언시스 클론테크)로 삽입한다. 40.2.220 scFv-Ig-CD80 cDNA를 5' LTR-네오마이신 내성 유전자-CMV 프로모터 서열과 3' LTR 서열 사이에 삽입한다. 레트로바이러스 구성체를 암종 세포주로 형질감염시키고, 형질감염된 세포를 스크리닝하여 세포 표면에서 40.2.220 scFv-Ig-CD80 융합 단백질을 발현하는 클론을 선별한다.
실시예 24
세포 표면에서 발현되는 IgA-T4 돌연변이의 제작
실시예 12에 개시된 동시자극 수용체에 결합하는 scFv를 포함하는 유전자 조작된 세포 표면 수용체의 이소 표면 발현을 위한 레트로바이러스 형질감염 시스템을 이용하여 2H7 scFv IgA 힌지 IgA-T4-CD80 융합 단백질을 구성한다. 융합 단백질이 형질감염된 세포에서 발현되는 경우 CD80이 scFv Ig 융합 단백질의 표면 발현을 위한 앵커를 제공하도록 2H7 scFv IgAH IgA-T4 융합 폴리뉴클레오티드 서열(서열 번호 _)을 인간 CD80의 경막 도메인 및 세포질 꼬리를 코딩하는 서열(서열 번호 _)에 프레임 내에서 융합시킨다. 2H7 scFv IgAH IgA-T4-CD80 융합 단백질을 코딩하는 cDNA(서열 번호 _)를 표준 분자 생물학 절차 및 판매자 지시에 따라서 레트로바이러스 벡터 pLNCX(BD 바이오사이언시스 클론테크)로 삽입한다. 2H7 scFv IgAH IgA-T4-CD80 cDNA를 5' LTR-네오마이신 내성 유전자-CMV 프로모터 서열과 3' LTR 서열 사이에 삽입한다. 레트로바이러스 구성체를 급성 림프구 백혈병 세포주(ATCC CRL-8286)인 Reh로 형질감염시킨다. 형질감염된 세포를 스크리닝하여 세포 표면에서 2H7 scFv-Ig 융합 단백질을 발현하는 클론을 선별한다.
실시예 25
종양 세포의 세포 표면에서 발현된 항-4-1BB scFv Ig-CD80 융합 단백질의 특성 및 시험관내에서 종양 세포의 성장
본 실시예는 CD80 경막 및 세포질 도메인에 융합된 IgG 야생형 힌지 및 CH2 및 CH3 도메인을 가지는 항-쥐 4-1BB(CD137) scFv 융합 단백질의 구성을 개시한다. 본 실시예는 형질감염된 종양 세포를 마이스 내로 이식한 경우 항-4-1BB scFv IgG CD80 폴리펩티드의 세포 표면 발현 효과를 예시한다.
래트 항-4-1BB (CD137) 모노클로날 항체(1D8)의 중쇄 및 경쇄 가변부를 클로닝하고, 단일쇄 Fv 구성체를 실질적으로 실시예 1에 개시된 바와 같이 제조하였다. 각 항체의 중쇄 및 경쇄 가변부를, 실시예 1에 개시된 바와 같이 면역글로불린 유전자에 대한 표준 방법에 따라 클로닝하였다. 단일쇄 Fv 구성체는, 1D8의 VL 영역 뉴클레오티드 서열(서열 번호 _) 및 1D8의 VH 영역 뉴클레오티드 서열(서열 번호 _) 사이에 (gly4ser)3 펩티드 링커를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 삽입하여 실시예 1에 개시된 바와 같이 제조하였다. 1D8 VL에 대한 폴리펩니드 서열은 서열 번호 _에 제시되어 있고, VH 도메인에 대한 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _에 제시되어 있다. 그 다음 scFv 폴리뉴클레오티드(서열 번호 _)를 실시예 1에 개시된 방법에 따라 인간 IgG1 야생형 힌지-CH2-CH3 도메인에 융합시켰다. 융합 단백질이 형질감염된 세포에서 발현되는 경우 CD80이 scFv Ig 융합 단백질의 표면 발현을 위한 앵커를 제공하도록, 실질적으로 실시예 12에 개시된 바와 같이 scFv IgG1 융합 폴리뉴클레오티드 서열(서열 번호 _)을 인간 CD80의 경막 도메인 및 세포질 꼬리를 코딩하는 서열에 프레임 내에서 융합시켰다. 그 다음 scFv-IgG-CD80 융합 단백질을 코딩하는 cDNA를 표준 분자 생물학 절차 및 판매자 지시 사항에 따라서 레트로바이러스 벡터 pLNCX (BD 바이오사이언시스 클론테크)로 삽입하였다. scFv-Ig-CD80 cDNA를 5' LTR-네오마이신 내성 유전자-CMV 프로모터 서열과 3'LTR 서열 사이에 삽입하였다.
미국 워싱톤주 시애틀 PNRI의 I. Hellstrom 박사가 제공한 흑색종 세포주인 K1735의 전이성 M2 클론으로 레트로바이러스 구성체를 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 스크리닝하여 세포 표면에서 scFv-Ig 융합 단백질을 발현하는 클론을 선별하였다. 1D8 scFv IgG-CD80 구성체가 종양 세포의 세포 표면에서 발현되는 것을 입증하기 위해서, 면역유세포분석법으로 형질감염된 세포를 분석하였다. 얼음 위에서 피코에리트린-접합된 F(ab')2 염소 항-인간 IgG 내에서 1 시간 동안 형질감염된 세포(K1735-1D8)를 항온처리하였다. 그 다음, 세포를 세척하여 미결합 접합체를 제거하고, 쿨터 에픽스 XL 세포 분류기를 사용하여 유세포 분석을 실시하였다. 결과는 도 41A에 제시되어 있다.
K1735-1D8 형질감염된 세포의 성장을 생체 내에서 조사하였다. K1735-WT 세포는, 나이브(naive) C3H 마우스에게 피하 이식한 경우 계속 성장하였다. 동일 용량의 K1735-1D8 세포가 대략 30 mm2 표면적의 종양을 초기에 형성하지만, 도 41B에서 확인되는 바와 같이 종양은 7일 정도에 퇴화되기 시작하여 20일까지는 사라졌다. 인간 항-CD28 scFv 구성체인 비결합 scFv를 코딩하는 유사하게 구성된 벡터로 형질감염된 종양 세포는 형질감염되지 않은 종양 세포에서와 같이 성장하였다. 외래 단백질, 즉 인간 IgG1 불변부 또는 래트 가변부의 존재는 형질감염된 K1735-WT 세포를 면역원성으로 만들지 않았다; C3H 마우스 내의 K1735-1D8 세포의 성장은 K1735-WT 세포(비형질감염)의 것과 동일하였다.
K1735-1D8 종양의 퇴화에 있어서 CD4+ 및 CD8+ T 림프구와 NK 세포의 역할을 조사하기 위해서, 모노클로날 항체(모노클로날 항체, 통상적으로 0.1 ㎖ 부피로 50 ㎍)를 나이브 마우스에게 복강내(i.p.) 주사하여 CD8+, CD4+ 또는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 둘다를 제거하거나, 또는 항-아시알로-GM1 토끼 항체를 주사하여 NK 세포를 제거하였다. 12일 후에, 동일하게 처리된 마우스로부터 얻은 비장 세포의 유세포 분석 결과 표적화된 T 세포군이 고갈된 것으로 확인되면, K1735-1D8 세포를 각 T-세포 고갈된 그룹에게 피하 이식하였다. K1735-1D8는 항-CD8 MAb 또는 대조군 래트 IgG를 주사한 마우스에서 유사한 성장 역학을 나타낸 반면에, CD4+ T 세포의 제거는 K1735-WT와 동일한 역학을 나타내는 K1735-1D8의 성장을 초래하였다. CD8+ T 세포의 존재 또는 부재와 무관하게, CD4+ T 세포 제거 후에 종양 성장을 억제하지 못한다는 것이 관찰되었다. K1735-1D8은 모든 NK 고갈 마우스에서 증식하였지만, CD4-고갈 그룹에서보다는 서서히 증식하였다. 결과는 도 41C에 제시되어 있다.
실시예 26
항-4-1BB scFv IgG-CD80 융합 단백질을 발현하는 종양 세포의 치료 효과
본 실시예는 세포 표면에서 항-CD137 scFv를 발현하는 K1735-1D8 형질감염된 종양 세포의, 확립된 비형질감염 야생형 종양의 거부를 매개하기 위해 마우스에서 충분한 면역 반응을 형성하는 능력을 조사한다. C3H 마우스에 K1735-WT 종양(2 x 106 세포/동물)을 이식하고, 약 6일간 성장시켰다. 확립된 30 mm2 표면적의 K1735-WT 종양을 가지는 마우스를 사용하여 실험을 실시하였다. 반대 측에서 K1735-1D8 또는 조사된 K1735-WT 세포를 피하 주사하여 마우스를 예방접종하였다. 도 42에 제시된 시점에서 동일한 주사를 반복하였다. 한 그룹의 동물에게는 K1735-1D8 세포를 주 4회 주사하였다. 동일한 계획에 따라, 또 다른 그룹에게 조사된(12,000 rad) K1735-WT 세포를 제공하고, 제3 그룹에게는 PBS를 주사하였다. 데이터는 도 42에 플롯되어 있다. WT 종양은 모든 대조군 마우스와 조사된 K1735-WT 세포를 수용한 모든 마우스에서 계속 성장하였다. 대조적으로, K1735-1D8로 면역화시켜 처리한 5 마리의 마우스 중 4 마리에서 종양이 퇴화되었다. 3개월 후에 실험이 끝났을 때 이 동물에는 종양이 없었고 독성의 증후도 없었다. 5번째 마우스에서는, 마우스가 K1735-1D8 세포를 투여받는 동안에는 종양 결절 크기가 감소하였지만, 치료가 끝난 후에는 다시 종양이 커졌다.
5 마우스/그룹을 이용한 또 다른 실험에서, 마우스에게 3 x 105 K1735-WT 세포를 정맥내(i.v.) 주사하여 폐 전이를 개시하였다. 3일 후에, K1735-1D8 세포를 피하 이식하였다. 이 절차를 1개월간 1주 1회 반복하고; 대조군 마우스에게 PBS를 주사하였다. K1735-WT 세포를 수용한 후 37일째 대조군의 마우스 중 한 마리가 죽었을 때 실험을 종료하였다. 이 때, 대조군 마우스 각각의 폐는 > 500개 전이성 병소를 나타내었다. 대조적으로, 면역화된 마우스의 폐에는 10개 미만의 전이성 병소가 존재하였다.
제3 실험에서, K1735-WT 세포와 K1735-1D8 세포의 혼합물을 면역적격 동계 C3H 마우스에게 주사하였다. K1735-WT 세포 단독으로 또는 2 x 106 K1735-WT 세포 및 2 x 105 K1735-1D8 세포의 혼합물을 마우스에게 피하 주사하였다. 종양 성장은 5일 간격을 두고 모니터링하였다.
실시예 27
육종 세포의 세포 표면 상에서 안티-4-1BB scFv IgG-CD80 융합 단백질의 발현
본 실시예는 뮤린 육종 세포주를 안티-CD137 scFv IgG-CD80 구성체로 트랜스펙션 처리함으로써 제2 유형의 종양 세포의 세포 표면 상에서 안티-CD137 scFv의 발현을 입증하기 위한 것이다.
1D8 scFv IgG WITH WTCH2CH3-CD80 폴리뉴클레이티드(서열 번호 _)는 표준 분자 생물학 방법에 따른 제한 효소 분해 및 결찰 단계를 이용하여 pLNCX 벡터에서 pCDNA3-hygro 벡터 내로 전이시켰다. 구성체를 HindIII + Cla1로 절단하며, sFv 단편을 Klenow(Roche)로 채우고, 블런트-엔디드(blunt-ended) 단편을 pcDNA3의 EcoR5 부위 내로 결찰하였다. Ag104 뮤린 육종 종양 세포는 1D8 scFv IgG CD80 융합 단백질을 함유하는 pCDNA3-hygro 벡터로 트랜스펙션 처리하였다. 하이그로마이신 내성 클론은 FITC 안티-인간 IgG 항체를 사용하여 트랜스젠(trnsgene)의 발현을 검출하는 유세포 분석기(flow cytometry)에 의해 스크리닝하였다. 내성 클론의 대략 15%만이 초기에 검출가능한 융합 단백질을 보유하였다. 유세포 분석기에 의해 확인된 양성 세포는 표준 방법에 따른 부동화 안티-인간 IgG(10 ㎍/ml)로 코팅된 박편 상에서 반복적으로 팬닝하였다. 이 팬닝(panning)은 37℃에서 30 분 동안 코팅된 평판 상에서 세포를 항온처리함으로써 수행하였다. 이어서, 평판을 베르센(versene) 또는 PBS 중에서 2-3x 세척하였다. 각각 회수 후, 세포를 FACS에 의한 IgG 발현에 대하여 시험하였다. 도 44의 막대그래프는 안티-인간 IgG(검정색)에 대한 패닝의 4회후 염색 패턴을 나타내었다. 트랜스펙션 미처리된 세포는 염색하였고, 희색으로 나타내었다. 집단내 모든 세포는 양성이었다.
실시예 28
IgG1 CH2 도메인에서 돌연변이를 지닌 이중특이 scFv Ig 융합 단백질 및 scFv Ig 융합 단백질의 구성화 및 특성화
안티-CD20(2H7) scFv IgG 융합 단백질은 잔기(전술한 문헌(Ward et al.)에 따른 위치 번호 238)에서 프롤린이 세린에 의해 치환되어 있는 돌연변이체 힌지(MT(SSS)) 및 돌연변이체 CH2 도메인을 보유하도록 구성하였다. 뉴클레오티드(서열 번호 _)를 암호화하는 2H7 scFv IgG MTH (SSS) MTCH2WTCH3은 기본적으로 실시예 1, 5 및 13에서 설명되어 있는 방법에 따라 구성하였다. 또한, IgG 돌연변이체 힌지-돌연변이체 CH2-야생형 CH3 도메인도 안티-CD20(2H7)-안티-CD40(40.2.220) 이중특이 scFv에 융합하였다. 폴리뉴클레오티드 서열을 암호화하는 안티-CD20-안티-CD40 scFv IgG MTH(SSS) MTCH2WTCH3을 서열 번호 _로 나타내었고, 암호화된 폴리펩티드는 서열 번호 _로 나타내었다.
COS 세포는 실시예 10에서 설명한 바와 같이 2H7 scFv IgG MTH (SSS) MTCH2WTCH3(서열 번호 _); 안티-CD20-안티-CD40 scFv IgG MTH (SSS) MTCH2WTCH3(서열 번호 _); 2H7 scFv IgG MTH (SSS) WTCH2CH3(서열 번호 _); 및 2H7 scFv IgAH IgG WTCH2CH3(서열 번호 _)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 사용하여 일시적 트랜스펙션 처리하였다. 배양 상청액을 수집하고, 융합 단백질을 단백질 A 크로마토그래피로 정제하였다(실시예 10 참조). 정제된 폴리펩티드는 실시예 10에서 설명한 방법에 따라 SDS-PAGE로 분획하였다. 또한, Rituximab(안티- CD20 모노클로날 항체); 및 Bio-Rad 예비염색된 분자량 표준물질(Bio-Rad, Hercules, CA), 및 Multimark(등록상표) 분자량 표준물질(Invitrogen Life Technologies)도 겔에 도포하였다. 그 결과들을 도 45에 제시하였다.
CH2 도메인에서 돌연변이를 함유하는 2H7 scFv Ig 융합 단백질은 ADCC 측정검사에서 야생형 CH2 도메인을 갖는 융합 단백질을 비교하였다. 이 측정검사는 실시예 11 및 19에서 설명한 바와 같이 기본적으로 수행하였다. 새로운 정지 상태에 있는 PBMC(작용 세포(effector cell))를 51Cr-표지화된 BJAB 세포(표적 세포)에 도 46에 나타낸 비율로 첨가하였다. 정제된 2H7 scFv IgG MTH (SSS) MTCH2WTCH3, 2H7 scFv IgG MTH (SSS) WTCH2CH3, 2H7 scFv IgAH IgG WTCH2CH3, 및 Rituximab를 각각 10 ㎍/ml로 작용/표적 세포 혼합물에 첨가하고, 37℃에서 5 시간 동안 항온처리하였다. 상청액을 수거하고, 방출된 크롬의 양을 실시예 11 및 19에서 설명한 바와 같이 측정하였다. 각각의 융합 단백질에 의한 특이적 치사율(%)을 도 46에 제시하였다.
실시예 29
안티-인간 CD3 scFv IgG 융합 단백질의 종양 세포 표면 발현
안티-인간 CD3 scFv Ig CD80 융합 단백질은 기본적으로 실시예 1 및 12에서 설명되어 있는 바와 같이 제조하였다. 융합 단백질은 야생형 IgG1 힌지(서열 번호 _)에 융합된 안티-인간 CD3 scFv, 및 CD80 경막 및 세포질 도메인(서열 번호 _)에 융합된 야생형 CH2(서열 번호 _) 및 CH3(서열 번호 _) 도메인을 포함하여 안티-CD3 scFv의 세포 표면 발현을 가능하게 하였다. 폴리펩티드(SEQ ID NO--)를 암호화하는 안티-인간 CD3 scFv IgG WTH WTCH2CH3-CD80 폴리뉴클레오티드(서열 번호 _)를 Reh 세포 및 T51 세포(림프아구성 세포주) 내로 트랜스펙션 처리하였다. 안티-인간 CD3 scFv IgG 융합 단백질의 발현은 FITC 결합체 형성된 염소(goat) 안티-인간 IgG을 사용하는 유세포 분석기로 검출하였다(실시예 4, 10, 16, 18에 설명된 방법 참조). 도 47a는 Reh 세포의 세포 표면 상에서 안티-인간 CD3 융합 단백질의 발현을 예시한 것이고, 도 47b는 T41 세포 상에서 융합 단백질의 발현을 예시한 것이다.
ADCC 측정검사는 세포 표면 상에서 scFv-Ig 폴리펩티드의 발현이 작용 세포 기능을 증대시키는지의 여부를 측정하기 위해서 트랜스펙션 처리된 Reh 및 T51 세포로 수행하였다. 트랜스펙션 미처리된 Reh 세포 및 트랜스펙션 처리된 Reh 세포와 트랜스펙션 미처리된 T51 세포 및 트랜스팩션 처리된 T51 세포는 37℃에서 2 시간 동안 51Cr(100 μCi)(Amersharm)로 예비 표지화하였다. 인간 PBMC는 작용 세포로서 기능을 하였으며, 표적 세포(96 웰 평판의 웰 당 5 × 104 세포)에 20:1, 10:1 및 2.5:1의 비율로 첨가하였다. 37℃에서 4 시간 후, 배양 상청액을 수거하고, 실시예 11 및 12에서 설명한 바와 같이 분석하였다. 특이적 치사율(%)을 실시예 12에서 설명한 바와 같이 계산하였다. 그 결과를 도 48에 제시하였다.
실시예 30
세포 표면 상에서 안티-CD28 scFv를 발현하는 종양 세포에서 사이토킨 발현의 유도
본 실시예는 안티-인간 CD28 scFv IgG-CD80 융합 단백질로 트랜스펙션 처리 된 종양 세포와 동시 배양되어 있는 자극된 림프구에서 사이토킨 mRNA 유도에 미치는 세포 표면 발현된 scFv의 효과를 설명하기 위한 것이다.
실시간 PCR 분석은 PBMC 작용 세포에 의한 사이토킨 생성에 미치는 표면 발현된 scFAv의 효과를 측정하기 위해서 Reh, Reh-안티-CD28(2el2)(2el2 scFv IgG WTH WHTCH3CH2-CD80의 구성 및 Reh 세포의 트랜스펙션에 대한 실시예 12 참조), 및 Reh-CD80(실시예 14 참조)로 자극된 인간 PBMC로부터 유래한 RNA 샘플 상에서 수행하였다. 실시간 PCR 측정검사의 경우에는 SYBR Green(QIAGEN)(Morrison et al., Biotechniques 24:954-8, 960, 962 (1998))를 이용하고, 각각의 증폭 주기 후 PCR 생성물의 형성을 측정하는 ABI PRISM(등록상표) 7000 Sequence Detection System(Applied Biosystems, Foster City, CA)로 측정하였다. 세포를 배양액으로부터 수거하고, 전체 RNA는 세포 용해물을 균질화하는 QIA 슈레더 컬럼 정제 시스템, 및 RNA를 정제하는 RNeasy(등록상표) 미니-컬럼을 포함하는 QIAGEN RNA 키트를 이용하여 제조하였다. cDNA는 각 세포 유형 및 Superscript II Reverse Transcriptase(Life Technologies)로부터 얻은 RNA의 동일량을 이용하여 역전사시켰다. 이어서, SYBR Green 실시간 PCR 분석은 사이토킨 유전자 생성물에 특이적인 주형 및 프라이머 쌍으로서 제조된 cDNA를 사용하여 수행하였다. 증폭된 PCR 생성물의 평균 길이는 150~250 염기쌍의 범위였다. IFNγ, TNFα, GM-CSF, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-15, ICOSL, CD80 및 CD86을 비롯한 많은 활성화 반응 분자에 대한 cDNA 레벨을 측정검사하였다. GAPDH, β-액틴, 및 CD3□를 비롯한 구성적으로 발현된 유전자에 대한 대조 기준 cDNA를 각각의 측정검사에서 측정하였 다. 특이적 mRNA의 가장 유의적인 유도는 IFNγ의 경우에 관찰되었고, 보다 적당한 유도는 CTLA-4 및 ICOS의 경우에 관찰되었다.
실시예 31
안티-인간 4-1BB 항체의 클로닝 및 안티-인간 4-1BB scFv Ig 융합 단백질의 구성
마우스 안티-인간 모노클로날 항체를 발현하는 하이브리도마 세포주(designated 5B9)는 로버트 미틀러 박사(Dr. Robert Mittler, Emory University Vaccine Center, Atlanta, GA)로부터 얻었다. 가변적인 중쇄 및 경쇄 영역은 면역글로불린 유전자를 클로닝하기 위한 공지된 방법에 따라 그리고 본 명세서에 설명되어 있는 바와 같이 클로닝하였다. 세포를 IMDM/15% FBS(Invitrogen Life Technologies) 배지에서 수일 동안 성장시켰다. 대수적 성장 상태의 세포를 배양액으로부터 수거하고, 전체 RNA는 세포 용해물을 균질화하는 QIA 슈레더 컬럼 정제 시스템 및 제조업자의 지침서에 따라 RNA를 정제하기 위한 RNeasy(등록상표) 미니-컬럼을 포함하는 QIAGEN RNA 키트를 이용하여 제조하였다. cDNA는 랜덤 헥사머 프라이머 및 Superscript II Reverse Transcriptase(Invitrogen Life Technologies)를 사용하여 역전사시켰다.
cDNA는 말단 트랜스퍼라제 및 dGTP를 사용하여 앵커-꼬리 처리하였다. 이어서, PCR은 앵커-꼬리 상보적 프라이머, 및 마우스 Ck(VL의 증폭의 경우) 또는 적당한 아이소타입(isotype) 마우스 CH1(VH의 증폭의 경우)의 일정한 영역의 안티센스 가닥에 특이적으로 어닐링된 프라이머를 사용하여 수행하였다. 증폭된 가변적인 영 역 단편을 TOPO(등록상표)(Invitrogen Life Technologies)로 클로닝하고, 이어서 정확한 크기의 인서트를 지닌 클론을 서열화하였다. 각각의 가변적인 도메인에 대한 공통 서열(consensus sequence)은 4개 이상의 독립적인 클론의 서열로부터 결정하였다. 5B9 VL 및 VH 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _ 및 서열 번호 _로 각각 나타내었고, 유래된 아미노산 서열은 서열 번호 _ 및 서열 번호 _로 나타내었다. scFv는 경쇄 가변적 영역과 및 중쇄 가변적 영역 사이에 삽입된 합성 (Gly4Ser)3 링커 도메인을 함유하는 중복 프라이머를 사용하여 소잉 PCR 방법(sewing PCR method)으로 구성하였다(실시예 1 참조). 5B9 scFv 폴리펩티드(서열 번호 _)는 서열 번호 _를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화하였다.
5B9 scFv 폴리뉴클레오티드 서열은 실시예 5, 10 및 13에서 설명한 방법에 따라 인간 IgG1 돌연변이체 힌지 및 야생형 CH2 및 CH3(MTH (SSS) WTCH2CH3, 서열 번호 _)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열로 프레임 내에 융합하였다. COS 세포는 5B9 scFv IgG MTH (SSS) WTCH2CH3 폴리뉴클레오티드 서열(서열 번호 _)을 포함하는 벡터로 일시적 트랜스펙션 처리하였다. 상청액을 수집하고, 5B9 scFv IgG MTH(SSS) WTCH2CH3 폴리뉴클레오티드(서열 번호 _)의 결합을 실시예 4, 10, 16 및 18에서 기본적으로 설명한 바와 같이 플로우 면역세포형광측정계(flow immunocytofluorimetry)로 측정하였다. 또한, 5B9 하이브리도마 세포주로부터 유래한 배양 상청액도 결합 측정검사(binding assay)에 포함시켰다. 새로운 PBMC는 활성화 T 세포의 표면 상에서 CD137의 발현을 유도하는 결합 실험을 수행하기 전에 4 일 동안 부동화 안티-CD3의 존재 하에 항온처리하였다. 자극된 PBMC를 세척하고, 5B9 scFv IgG 융합 단백질 또는 5B9 뮤린 모노클로날 항체를 각각 함유하는 COS 또는 하이브리도마 배양 상청액으로 얼음 상에서 1 시간 동안 항온 처리하였다. 5B9 scFv IgG 융합 단백질 또는 5B9 뮤린 모노클로날 항체의 결합을 안티-인간 IgG 또는 안티-마우스 IgG로 각각 검출하였다. 그 결과를 도 49에 제시하였다.
실시예 32
힌지 돌연변이를 지닌 2H7 scFv IgG 융합 단백질의 구성
2H7 scFv IgG 융합 단백질은 MTH(SCC) 및 MTH(CSC)를 제공하기 위해서 제1 시스테인 잔기, 및 세린 잔기로 치환된 IgG1 힌지 영역내 제2 시스테인 잔기로 구성하였다. 돌연변이를 도입하기 위한 주형은 2H7 scFv WTH WTCH2CH3(서열 번호 _)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드였다. 돌연변이를 도입하는 올리고뉴클레오티드는 5' PCR 프라이머 올리고뉴클레오티드 HIgGMHcysl(SEQ ID NO--): 및 HIgGMHcys2(서열 번호 _)였다. 구성체는 서열 번호 _에서 설명한 바와 같이 제조하였다. 돌연변이체의 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 공정은 서열 번호 _로 제시하였고, 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공하였다.
실시예 33
2H7 V H L11S scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3의 구성
문헌(Kabat et al., sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Bethesda, MD: Public Health Service, National Institutes of Health (1991))에 따라 번호 매길 경우 중쇄 가변적 영역내 위치 11에서 류신에서 세린으로의 변화를 2H7 scFv MTH (SSS) WTCH2CH3 융합 단백질(서열 번호 _) 내로 도입하 였다. 야생형 류신 잔기는 올리고뉴클레오티드 Vhserl.l.: 5'-gga ggt ggg agc tct cag gct tat cta cag cag tct ggg gct gag tcg gtg agg cc-3'(서열 번호 _)을 사용하여 부위 유도된 돌연변이생성(site-directed mutagenesis)에 의해 세린으로 치환시켰다. PCR을 위한 3'-프라이머는 서열 5'-gtc tct aga cta tca ttt acc cgg aga cag-3'(서열 번호 _)(밑줄 그어 있고 이탤릭체로 표시된 XbaI 부위)을 보유한 huIgG1-3'였다. PCR 증폭 후, 단편을 TOPO(등록상표) 클로닝 벡터 내로 삽입하고, 서열화하여 VH11 류신에서 세린으로의 돌연변이를 확인하였다. DNA를 암호화하는 2H7 scFv-IgG (SSS-S) H WCH2 WCH3을 PSL1180 클로닝 벡터(Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ) 내로 좌우 이동시켰다. 구성체 PSL1180-2H7 scFv-IgG (SSS-S) H WCH2 WCH3을 Sac 및 XbaI로 분해하여 야생형 VH 도메인 및 연결 영역과 CH2 및 CH3 도메인을 제거하였다. VH11 돌연변이체를 포함하는 PCR 생성물은 Sac 및 XbaI로 분해한 후, 분해된 PSL1180 구성체 내로 표준 분자 생물 절차에 따라 삽입하였다. 이어서, 구성체를 Hind III 및 XbaI로 분해하고, 포유류 발현 벡터 pD18 내로 삽입하였다(실시예 1 및 10에 설명된 방법 참조). 돌연변이체는 2H7 scFv VH L11S IgG (SSS-S) H WCH2 WCH3으로 명명하였다. 폴리뉴클레오티드 서열을 서열 번호 _로 제공하였고, 암호화된 폴리펩티드 서열을 서열 번호 _로 제공하였다.
실시예 34
안정한 CHO 주에서 2H7 scFv VHL11S (SSS-S) H WCH2 WCH3의 발현
CHO DG44 세포는 2H7 VHL11S scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3을 암호화하는 선형화된 발현 플라스미드의 대략 150 마이크로그램으로 전자 유전자 이식법 (electroporation)으로 트렌스펙션 처리하였다. 배양액을 125 내지 2000 범위인 웰당 다양한 세포수로 96 웰의 평평한 바텀 조직 배양 평판에서 100 nM 메토트렉세이트를 함유하는 선택 배지 중에서 플레이팅 처리하였다. 메토트렉세이트 내성 클론을 선택하고, 배양 상청액은 도 1의 경우에 설명한 것과 유사한 CD20CHO 결합 측정검사(binding assay)를 이용하여 융합 단백질의 가장 높은 발현체(expressor)에 대하여 스크리닝하였다. 클론은 메토트렉세이트의 용량을 서서히 증가시킬 때 초기 선택 후 증폭하였다. 세포는 농도를 다음의 보다 높은 용량으로 조정하기 전에 보다 높은 농도로 2회 계대배양으로 계대배양하였다. 클론은 1 마이크몰 메토트렉세이트의 최종 농도로 증폭하였다.
도 50b는 2H7 VHL11S scFv (SSS-S) H WCH2WCH3의 생성 레벨을 예시하기 위한 것이다. 이러한 분자를 발현하고 정지상 T25 박편에서 성장하는 증폭된 CHO 세포로부터 유래한 소모된 상청액은 유세포 분석기에 의해 CD20 CHO 세포에 대한 정량적인 결합에 대하여 시험하였다. 활성은 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의한 상청액으로부터 정제된 동일 분자를 사용하는 표준 곡선의 발생시킴으로써 단백질 농도로 전환시켰다(도 50a 참조). 정제된 단백질의 농도는 제조합 단백질(벡터 NTI)의 아미노산 조성에 의해 제공된 소멸 계수를 이용하여 A280으로 결정하였다. 생성의 레벨이 시험된 용량들 간에 변하기 하지만, 복수의 클론이 1 mg/ml를 생성하였다. 이러한 레벨의 단백질 발현은 VH내 아미노산 변화를 제외하고는 동일 분자보다 10배 이상 더 높았다.
도 51은 SDS-PAGE 상에서 반정량적 분석에 의해 2H7 VH L11S scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3의 생성 레벨을 예시하기 위한 것이다. 이러한 분자를 발현하고 정지상 T25 박편 내에서 성장하는 증폭된 CHO 세포로부터 유래한 소모된 상청액의 마이크로리터를 10 마이크로리터 2X 비환원 SDS 샘플 버퍼와 혼합하고, SDS-PAGE 겔 상에서 실시하였으며, 쿠마시에 블루(coomassie blue)로 염색하였다.
실시예 35
G28-1 scFv Ig 구성체의 구성 및 결합 성능
G28-1(안티-CD37) scFv의 구성은 제조업자의 지침서에 따라 Trizol (Invitrogen) 시약을 이용하여 G28-1 하이브리도마로부터 단리된 전체 RNA를 사용하여 수행하였다. cDNA는 실시예 1에서 2H7 클로닝에 대하여 전술한 프로토콜 및 랜덤 프라이머를 사용하여 제조하였다. scFv의 가변적인 도메인은 다음의 2가지 방법 중 하나를 이용하여 클로닝하였다. 제1 방법은 문헌(Ig-Prime Kit Mouse Ig-Primer Set, Novagen)에 설명된 방법 및 프라이머를 이용하여 경쇄 또는 중쇄의 일정 영역에 특이적인 단일 3' 프라이머 및 각각의 V 영역 유전자 부류에 특이적인 축퇴 5' 올리고뉴클레오티드의 부류를 이용하였다. 제2 접근법은 문헌(Gilliland LK et al, Tissue Antigens 47 : 1-20 (1995))에 설명된 앵커-테일링 방법 및 프라이머를 이용하였다. 양자의 경우에서는 PCR 증폭된 생성물을 TOPO 클로닝 벡터(Invitrogen) 내로 클로닝하였다. 클론을 EcoRI로 분해하고, 적당한 크기의 인서트를 위해 스크리닝하였다. 양성 클론을 실시예 1에서 앞서 설명한 바와 같이 분해하였다.
이어서, 각 V 영역에 특이적인 프라이머, 리더 서열을 지닌 것과 리더 서열 을 지니지 않는 것을 설계하였다. 또한, 프라이머는 프라이머 말단에서 소정의 링커 및/또는 제한 부위를 포함하도록 설계도 하였다. PCR 반응은 다음의 프로필: 94℃, 30 초; 55℃, 30 초; 72℃, 30 초를 수행하고, 이어서 72℃에서 8 분 동안 최종 연장을 수행하는 25 주기 프로그램을 이용하여 TOPO 클로닝된 DNA 상에서 수행하였다. PCR 생성물을 겔 정제하고, 단편을 QIAQUICK 겔 추출 키트(QIAGEN, Valencia, CA)를 사용하여 회수하였다. 단편을 1:50 희석하고, 1 마이크로리터를 실시예 1에 설명된 방법에 따라 SEWING PCR 반응에 사용하였다. G28-1 scFav에 대한 VL 도메인의 제2 PCR 반응에 다음의 올리고뉴클레오티드를 사용하였다.
리더 서열을 지니지 않고 SalI 부위를 지닌 5' 프라이머:
5'- GTTGTTGTCGACATCCAGATGACTCAGTC TCCA-3'(서열 번호 _)
HindIII 부위 및 리더 서열을 지닌 5' 프라이머:
5'- GTCAAGCTTGCCGCCATGGTATCCACAGCTCAGTTCCTTGG-3'(서열 번호 _)
3' 프라이머:
5'- GCCACCCGACCCACCACCGCCCGAGCCACCGCCACCTTTGATCTCCAGTTCGGTGCC-3'(서열 번호 _)
VH 도메인에 사용된 프라이머를 나타나면 다음과 같다.
5' 센스 프라이머:
TCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCGTCAGCGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGA-3'(서열 번호 _)
BclI 부위를 지닌 3' 안티센스 프라이머:
5'- TCAGTGCTGATCAGAAGAGACGGTGACTGAGGTTCCTTG-3'(SEQ ID NO--).
중쇄 가변적인 영역내 위치 11에서 류신에서 세린으로의 변화(Kabat numbering)를 부위 유도된 돌연변이생성에 의해 G28-1 scFv 내로 도입하였다. G28-1 scFv로부터 유래한 야생형 형태는 상기 설명한 바와 같이 소잉/중복 PCR로 초기 구성하여 VL 도메인과 VH 도메인 사이에 (gly4ser)3 링커를 삽입하였다. 그러나, Sac I 도메인을 가변적인 도메인의 그러한 융합의 일부로서 도입하지 않았으며, 따라서 대안으로 류신 11 부근의 거의 제한 부위(HaeII 및 PvuII)를 사용하여 VL+ 돌연변이된 VH 도메인을 합성하였다. 이들 부위, 및 L에서 S로의 변화, 이어서 야생형 염기쌍을 포함하는 DNA 서열 중 하나를 함유하도롤 설계하였다. 이러한 방법에서 몇가지 시도들이 실패하였는데, 부위 유도된 돌연변이생성의 Genetailor(Invitrogen) 방법을 이용하는 대안적인 접급 방법을 이용하여 소정의 돌연변이를 도입하였다. 돌연변이생성은 제조업자의 지침서에 따라 수행하였다. 요약하건대, 절차는 플라스미드 DNA의 DNA 메틸라제에 의한 메틸화, 2개의 중복 프라이머와의 돌연변이생성 반응에서 DNA의 증폭(그 중 하나가 표적 돌연변이를 함유함), 모든 메틸화된 DNA를 분해하고 비메틸화되어 있는 돌연변이된 증폭 생성물만을 잔류케 하는 플라스미드의 야생형 E. coli로의 형질전환을 포함하였다. 양자의 프라이머는 (돌연변이생성 생성물의 효율적인 말단 연결에 대하여, 15-20개 뉴클레오티드의 5' 말단에서 중복 영역을 지니고 있으면서, 돌연변이생성 프라이머 상의 돌연변이 부위를 포함하지 않는) 길이상 대략 30개 뉴클레오티드였다. 돌연변이생 성 반응에 대한 주형은 야생형 G28-1 scFvIg 구성체를 함유하는 플라스미드 100 ng이였고, G28-1 VH 돌연변이생성에 사용된 프라이머는 다음과 같았다.
순방향 프라이머: 5'-GCAGCAGTCTGGACCTGAGTCGGAAAAGCCTG-3'(서열 번호 _)
역방향 프라이머: 5'-CTCAGGTCCAGACTGCTGCAGCTGGACCGC-3'(서열 번호 _)
PCR 반응은 15 ng 메틸화 주형, 상기 프라이머 및 전술한 바와 같은 통상적인 반응 성분을 이용하여 수행하였다. 하기 프로필, 즉 94℃, 30 초; 55℃, 30 초; 68℃, 8 분, 이어서 최종 68℃ 10 분 동안 연장 단계를 지닌 사용한 20 주기 프로그램을 증폭에 사용하였다. PCR 생성물을 야생형 박테리아 내로 형질전환시키고, 콜로니를 서열화로 스크리닝하였다. 단지 소정의 돌연변이만을 지닌 클론을 단리하고, 플라스미드를 전술한 실시예 33에서 설명한 바와 같이 제조하였다. 돌연변이체는 G28-1 scFv VHL11S (SSS-S) H WCH2 WCH3으로 명명하였다. 폴리뉴클레오티드 서열을 서열 번호 _로 제공하였고, 암호화된 폴리펩티드 서열을 서열 번호 _로 제공하였다.
G28-1 융합 단백질의 발현 레벨은 실시예 17에서 설명한 방법에 따라 면역블롯 분석(immunoblot analysis)을 이용하여 확인하였다. 도 53은 돌연변이 없이 G28-1 융합 단백질에 비하여 VHL11S 돌연변이체 G28-1 융합 단백질의 다량 증가를 예시한 것이다.
The G28-1 scFv Ig 융합 단백질은 실시예 10에서 설명한 방법에 따라 COS 세포에서 일시적 트랜스펙션 처리하고 발현시켰다. 도 52는 CD37를 결합할 수 있는 COS 상청액으로부터 유래한 G28-1 scFv Ig 융합 단백질의 성능을 예시한 것이다. Ramos 및 BJAB 세포는 모두 인간 CD37 세포를 발현시키므로, 기능성 활성에 대한 G28-1 상청액을 스크리닝하는데 사용하였다. CD37+ Ramos 세포에 대한 G28-1 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 및 G28-1 scFv VHL11S (SSS-S) H WCH2 WCH3의 결합은 실시예 2에 설명된 방법에 따라 유세포 분석기에 의해 측정하였다. 그래프 상에 각 점들은 5회 반복 트랜스펙션의 평균을 나타내었다. 그래프는 G28-1 scFv VHL11S (SSS-S) H WCH2 WCH3이 CD37+ Rarnos 세포를 결합할 수 있다는 것을 예시하여 보여준다.
추가의 구성체는 상이한 연결 영역으로 구성하였다. pD18 G28-1 scFv VHL11S (SSS-S) H WCH2 WCH3 벡터를 BclI 및 XbaI로 분해하여 연결 영역, CH2 및 CH3을 제거하였다. 이들 영역을 실시예 13에 설명한 방법에 따라 각각의 상이한 연결 영역, CH2 및 CH3으로 치환하였다. 새로운 구성체는 G28-1 scFv VHL11S (CSS-S) H WH2 WH3(서열 번호 _), G28-1 scFv VHL11S (CSC-S) H WH2 WH3(서열 번호 _), G28-1 scFv VHL11S (CSS-S) H WH2 WH3(서열 번호 _), G28-1 scFv VHL11S (SSC-P) H WH2 WH3(서열 번호 _), G28-1 scFv VHL11S (SCS-S) H WH2 WH3(서열 번호 _), G28-1 scFv VHL11S (CCS-P) H WH2 WH3(서열 번호 _), 및 G28-1 scFv VHLI IS(SCC-P) H WH2 WH3(서열 번호 _)로 명명하였다.
또한, G28-1 scFv도 IgA 연결 영역, CH2, CH3 및 IgE CH2, CH3, CH4에 부착하였다. pD18 G28-1 scFv VHL11S (SSS-S) H WCH2 WCH3 플라스미드는 상기 방법을 이용하여 분해하여 연결 영역 CH2 및 CH3을 제거하였다. IgA 영역은 실시예 13에 설명된 방법을 이용하여 삽입하였다. 구성체는 G28-1 scFv VHL11S IgAH IgACH2 T4CH3(서열 번호 _)로 명명하였다. IgE CH2 CH3 CH4 영역은 실시예 39에서 설명한 방법을 이용하여 상기 분해된 D18 벡터 내로 삽입하였다. 구성체는 G28-1 scFv VHL11S IgECH2 CH3 CH4(서열 번호 _)로 명명하였다.
실시예 36
2H7 scFv Ig 돌연변이체 융합 단백질의 특성화
도 54는 CD20+ CHO 세포에 대한 정제된 2H7 scFv Ig 구성체의 결합 성능을 예시한 것이다. 단백질을 실시예 2에 설명된 방법에 따라 안정한 CHO 세포 내로 트랜스펙션 처리하였다. 결합은 실시예 2에 설명된 방법에 따라 유세포 분석기를 사용하여 측정하였다. 도 54의 그래프는 이러한 단백질이 변경된 연결 영역에 의한 CD 20에 대한 결합 기능을 보유한다는 점을 예시하여 보여준다. 비교 결과는 변경된 연결 영역의 각 유형을 지닌 2H7 scFv VHL11S 돌연변이체 각각에서 얻었다(결과를 생략함).
ADCC를 통한 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 존재 하에서 CD20 양성 세포를 치사시킬 수 있는 돌연변이된 연결 영역을 지닌 2H7 scFv-Ig 구성체의 영역은 PBMC 세포 대 BJAB 세포의 비율 100:1를 사용하는 4 시간 측정검사에서 표지화된 BJAB 세포로부터 51Cr의 방출을 측정함으로써 시험하였다. 도 55에 나타낸 결과는 2H7 scFv-Ig 돌연변이체가 항체 의존성 세포 세포독성(ADCC)을 매개할 수 있다는 것을 보여주는데, 그 이유는 51Cr 방출이 PBMC 또는 2H7 scFv-Ig 단독의 존재 하에서보다 PBMC 및 2H7 scFv-Ig 모두의 존재하에서 유의적으로 훨씬 더 컸기 때문이다. 비교 결과는 변경된 연결 영역의 각 유형을 지닌 2H7 scFv VHL11S 돌연변이체의 각각에 서 얻었다(결과를 생략함).
보체의 존재 하에서 CD20 양성 세포를 치사시킬 수 있는 2H7 scFv-Ig 돌연변이체 융합 단백질의 성능은 B 세포주 Ramos 표적 세포를 사용하여 시험하였다. 래빗 보체는 Pel-Freez(Rogers, AK)로부터 구입하였고, 최종 농도 1/10으로 측정검사에서 사용하였다. 정제된 2H7 scFv-Ig을 B 세포 및 보체로 37℃에서 45분 동안 항온 처리하고, 이어서 트립판 블루 배제법에 의해 산 세포 및 죽은 세포를 계수하였다. 도 56의 결과는 래빗 보체의 존재 하에서 2H7 scFv-Ig 돌연변이체가 CD20을 발현하는 B 세포를 용해하였다는 것을 보여준다.
실시예 37
IgA, IgG, 및 IgE 2H7 scFv 구성체의 비교 결합
Ig 구성체 IgA, IgG 및 IgE의 결합 성능은 각각의 Ig 꼬리에 특이적인 상업적으로 이용가능한 (Caltag) 제2 단계를 이용하고, 실시예 2에서 설명한 방법에 따라 유세포 분석기를 사용하여 측정하였다. 도 57에서 결과는 모든 IgE 구성체가 IgG 및 IgA의 결합 성능에 필적할 정도로 CD20+ CHO 세포를 결합시킬 수 있었다는 보여준다. 또한, 이들 결과는 IgE 구성체가 IgA 및 IgG 제2 단계가 아니라 IgE 제2 단계로 검출하였다.
실시예 38
2H7 VH L11S IgE 구성체의 구성 및 특성화
IgE 꼬리 RNA는 QIAGEN QIA 슈레더 균질화 및 RNA 미니-키트를 사용하여 SKO-007 세포(ATCC)로부터 단리하였다. 랜덤 프라이머 처리된 cDNA는 통상적인 프 로토콜에 따라 발생시켰는데, 4 마이크로리터 RNA를 QIAGEN 컬럼으로부터 용리시켰다. CH1 내지 CH4(대략 1.2 kb)로 개시하는 인간 IgE는 5 마이크로리터 cDNA의 PCR 증폭에 의해 단리하였는데, 증폭 프로필, 즉 94℃, 60초; 72℃, 2 분의 주기로 35회를 실시하였고, 다음과 같은 프라이머를 사용하였다.
5' 프라이머:
5-'ggatccacccgctgctgcaaaaacattccctccaatgccacctccgtgac-3'(서열 번호 _)
3' 프라이머:
5'-tcatttaccgggatttacagacaccgctcgctggacggtctgtgaggggctcgctgc-3'(SEQ ID D NO:--)
PCR 단편을 PCR 2.1-TOPO 벡터 내로 결찰시키고, 형질전환체를 실시예 1에 설명된 방법에 따라 EcoRI에 의한 분해로 정확한 크기의 인서트에 대하여 스크리닝하였다. 정확한 서열을 지닌 클론 중 하나를 주형으로 사용하여 용해성 또는 세포 표면(ORF) 형태로서 서브클로닝하기 위해 부착된 적당한 제한 부위를 지닌 CH2-CH4 도메인을 증폭시켰다. 하기 프라이머를 증폭 프로필, 즉 94℃, 60 초; 55℃, 60 초; 72℃, 2 분의 주기로 실시한 35회 주기와 함께 이용하여 대략 950 bp의 단편을 증폭시켰다.
5' 프라이머: (IgE의 CH2 도메인의 5' 말단에 BclI를 부착시킨다),
5'-gttgttgatcacgtctgctccagggacttcacc-3'(서열 번호 _)
3' 프라이머: (IgE의 CH4의 3' 말단에 정지 코돈 및 XbaI를 부착시킨다)
5'-gttgtttctagattatcatttaccaggatttacagacaccgctcgctg-3'(서열 번호 _)
3'-프라이머: (정지 코돈 없이 CH4의 3' 말단에 SfuI 및 BamHI를 부착시킨다)
5'-gttgttttcgaaggatccgctttaccagatttacagacaccgctcgctg-3'(서열 번호 _)
정지 코돈을 갖는 IgE CH2CH3CH4 꼬리를 BclI 및 XbaI로 이화시키고 2H7 VHL11S scFv를 함유하는 pD18 벡터로 삽입하였다. 이 구조체는 2H7 IgECH2CH3CH4로 명시하였다. 폴리누클레오티드 서열은 서열 번호 _에 제공되어 있고, 암호화된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _에 제공되어 있다. 정지 코돈을 갖지 않는 IgECH2CH3CH4 꼬리(ORF)을 BclI 및 SfuI로 이화시키고 2H7 VHL11S scFv를 함유하는 pD18 벡터로 삽입하였다. 이 구조체는 2H7 IgECH2CH3CH4(ORF)로 명시하였다. 폴리누클레오티드 서열은 서열 번호 _에 제공되어 있고, 암호화된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _에 제공되어 있다.
인간의 IgE도 또한 CH1 및 CH2 도메인을 둘다 소실한 단편으로서 증폭시켰는데, CH3 및 CH4 도메인만이 인간의 IgG1 힌지에 부착되었다. 중첩 5' 올리고누클레오티드를 사용하는 순차 PCR 반응을 사용하여 IgG1 힌지를 인간 IgE의 CH3 도메인에 부착시켰다.
PCR 반응의 제1 단계를 위한 프라이머:
5' 프라이머: 5'-actcacacatccccaccgtccccagcatccaacccgagaggggtgagc-3'(서열 번호 _)
PCR 반응의 제2 단계를 위한 프라이머:
5'프라이머: 5'-tctgatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccg-3'(서열 번호 _)
3' 프라이머: 5'-gttgtttctagattatcatttaccaggatttacagacaccgctcgctg-3'(서열 번호 _)
PCR 생성물을 EcoRI로 이화시키고 실시예 1에 개시된 방법에 따라 시퀀싱하였다. 양성 클론을 2H7 VHL11S scFv (SSS-S) H를 함유하는 pD18 플라스미드내로 삽입하였다. 이 구조체는 2H7 VHL11S scFv (SSS-S) H IgE CH3CH4로 명시하였다. 폴리누클레오티드 서열은 서열 번호 _에 제공되어 있고, 암호화된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _에 제공되어 있다.
기본적으로 실시예 2에 따라 유세포 분석기를 사용하여 2H7 scFv VHL11S IgECH2 CH3 CH4의 결합력을 측정하였다. 단백질을 MEP HyperCel, (Cipergen, Catalog # 12035-010, Lot# 200920/0271) 크로마토그래피 수지 및 소수성 전하 유도 크로마토그래피(HCIC)를 사용하여 정제하였다. HCIC 흡수제는 세포 배양액 상청액을 포함하는 여러가지 공급원으로부터 얻은 모노클로날 및 폴리클로날의 포획 및 정제를 위한 고용량, 고선택도의 흡착제이다. 칼럼은 10 ml 비이드 부피의 MEP Hypercel로 팩킹하고 0.1% NaN3을 함유하는 PBS, pH 7.4로 평형을 맞추었다. 약 1 리터의 2H7 scFv VHL11S IgE CH2CH3CH4 CHO 배양액 상청액을 칼럼 상에서 실행하였다. pH 3-6의 일련의 시트레이트 완충액을 제조하여 융합 단백질을 용출시켰다. 칼럼을 PBS 중에서 세정하였다. 단백질을 pH 6, 5, 및 4의 15개 1 ml 분획으로 용출시켰다. 최종 15 ml의 분획을 pH 3.5에서 수거하였다. 각 분획으로부터의 분취량을 A280 분석하고 SDS-PAGE에 가하여 A280 판독을 기준으로 약 10㎍/웰로 로딩하였다. 이들 두 분석 결과는, 단백질 벌크가 고 pH에서 시트레이트 완충액에 용출되지 않았으나 pH 4에서 용출되었고 pH 3.5의 후용출 세정액은 유의적인 양의 단백질을 함유함을 나타내었다.
FITC-공액 염소-항-인간 IgE를 사용하는 실시예 2에 개시된 방법에 따라 유세포 분석기를 사용하여 이들 2H7 VHL11S IgE 정제 단백질의 CD20+ CHO 세포 결합력을 측정하였다. 도 58A는 양 정제 단백질이 CD20+ CHO 세포에 결합할 수 있음을 나타낸다.
실시예 2에 개시된 방법에 따라, 이들 2H7 VHL11S IgE 정제 단백질의, PMBC 이펙터를 갖는 BJAB 표적 세포에 대한 ADCC 중개력을 측정하였다. 도 58B는 양 단백질이 동일한 수준에서 ADCC를 중개할 수 있음을 나타낸다.
실시예 39
마우스 IGA 및 IGE 꼬리 부위를 갖는 scFv VH L11S 돌연변이의 구조 및 결합력
실시예 38에서 인간 IgE 꼬리를 클론하는 데 사용한 동일한 방법을 사용하여 뮤린 비장 RNA로부터 뮤린 IgA를 클로닝하였다. PCR 반응은 35 싸이클 동안 94C 60 초; 52C 60초; 72C 2분 증폭 프로파일로 수행하였다. CH1-CH4 부위를 클론하는 데 사용되는 PCR 프라이머는 하기와 같았다:
5'프라이머: 5'-atctgttctcctcctactactcctcctccacct-3'(서열 번호 _)
3'프라이머: 5'-tcagtagcagatgccatctccctctgacatgatgacagacacgct-3'(서열 번호 _)
CH1 부위를 제거하는 데 사용되는 PCR 프라이머:
5'프라이머: 5'-gttgttgatcacatctgttctcctcctactactcctcctccacct-3'(서열 번호 _)
정지 코돈, Ig 꼬리 말단의 XbaI 부위 및 CH3 영역에서 T4 돌연변이를 갖는 3'프라이머:
5'-gttgtttctagattatcaatctccctctgacatgatgacagacac-3'(서열 번호 _)
ORF, SfuI 및 BamHI 부위, 및 CH3 영역에서 T4 돌연변이를 갖는 3' 프라이머:
5'-gttcttcgaaggatccgcatctccctctgacatgatgac-3'(서열 번호 _)
정지 코돈을 포함하는 마우스 IgACH2 T4CH3 꼬리를 Bc1I 및 XbaI로 이화시키고, 2H7 VHL11S scFv 및 IgAH를 함유하는 pD18 벡터에 삽입하였다. 이 구조체는 이화된 2H7 VHL11S scFv IgAH mIgACH2 T4CH3이었다. 폴리누클레오티드 서열은 서열 번호 _에 제공되어 있고, 암호화된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _에 제공되어 있다.
정지 코돈(ORF)이 없는 마우스 IgACH2 T4CH3 꼬리를 BclI 및 SfuI로 이화시키고 2H7 VHL11S scFv 및 IgAH를 함유하는 pD18 벡터로 삽입하였다. 이 구조체를 2H7 VHL11S scFv IgAH mIgACH2 T4CH3 (ORF)로 이화시켰다. 폴리누클레오티드 서열은 서열 번호 _에 제공되어 있고, 암호화된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _에 제공되어 있다.
뮤린 IgE를 기본적으로 실시예 38에 개시된 방법에 따른 뮤린 IgE La2 (ATCC) RNA로 클로닝하였다. PCR 반응은 35 싸이클 동안 94C 60 초; 52C 60초; 72C 2분 증폭 프로파일로 수행하였다. CH1-CH4 부위를 클로닝하는 데 사용되는 초기 PCR 프라이머는 하기와 같았다:
5' 프라이머: 5'-tctatcaggaaccctcagctctaccccttgaagccctg-3'(서열 번호 _)
3' 프라이머: 5'-gttgtttctagattatcaggatggacggagggaggtgttaccaaggct-3'(서열 번호 _)
CH1 영역을 제거하기 위한 PCR 프라이머:
5' 프라이머: 5'-gttgttgatcacgttcgacctgtcaacatcactgagcccacc-3'(서열 번호 _)
정지 코돈 및 XbaI 부위를 갖는 3'프라이머:
5'-gttgtttctagattatcaggatggacggagggaggtgtaccaaggct-3'(서열 번호 _)
3' 프라이머 ORF, SfuI 및 Bam HI:
5'-gttgttttcgaaggatccgcggatggacggagggaggtgtta-3'(서열 번호 _)
정지 코돈(ORF)이 있는 마우스 IgE CH2CH3CH4 꼬리를 BclI 및 XbaI로 이화시키고 2H7 VHL11S scFv를 함유하는 pD18 벡터로 삽입하였다. 이 구조체를 2H7 VHL11S mIgECH2CH3CH4로 이화시켰다. 폴리누클레오티드 서열은 서열 번호 _에 제공되어 있고, 암호화된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _에 제공되어 있다.
정지 코돈(ORF)이 없는 마우스 IgE CH2CH3CH4 꼬리를 BclI 및 SfuI로 이화시키고 2H7 VHL11S scFv를 함유하는 pD18 벡터로 삽입하였다. 이 구조체를 2H7 VHL11S scFv mIgECH2CH3CH4 (ORF)로 이화시켰다. 폴리누클레오티드 서열은 서열 번 호 _에 제공되어 있고, 암호화된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _에 제공되어 있다.
CD20+ CHO 세포에 대한 2H7 VH L11S mIgE 및 mIgA(마우스 꼬리 영역 포함)의 결합력도 시판 IgE 및 IgA 제2 단계 시약(Caltag)을 사용하여 실시예 2에 개시된 방업에 따라 유세포 분석기로 측정하였다. 도 59의 각 점은 제2 단계만의 결합을 차감하여 보정한 휘도를 갖는 군집의 평균을 나타낸다. 이 도면은 이들 구조체가 CD20+ CHO 세포 결합력을 가짐을 나타낸다.
실시예 40
2H7 SCFV IG 돌연변이 융합 단백질의 HPLC 프로필
CH3 영역 및 연결이 변화된 정제된 2H7 scFv-Ig 돌연변이 융합 단백질의 HPLC 분석. 각 단백질을 세포감염된 COS 또는 CHO 세포의 상청액으로부터 단백질 A 친화 크로마토그래피로 정제하였다. 25∼50 ㎍의 각 샘플을 TSK-GEL G3000SWXL 30 cm 칼럼(독일 슈투트가르트 소재의 Tosoh Biosep사 제품) 상에서 PBS 중에서 1 ml/분으로 돌렸다. 각 프로필의 시작에 가까운 화살표는 샘플 주입점을 나타낸다. 겔 여과 표준(Bio-Rad)은 트리오글로불린(670 kDa), 감마 글로불린(158 kDa), 오발부민(44 kDa), 미오글로빈(12.5 kDa), 및 비타민 B-12(1.35 kDa)를 포함하였다. 표준을 각 실험의 시작 및 끝에 실행하였다. 표준의 이동 위치는 도시되어 있으며 실험 간에 많이 변화되지 않았다.(도 60-62)
실시예 41
2H7 VH L11S 돌연변이 융합 단백질의 결합력
CH3 돌연변이의 결합 효과를 비돌연변이 CH3 융합 단백질과 비교하였다. 구 조체를 COS 세포로 세포감염하고 실시예 2에 개시된 단백질 A 칼럼 정제 기술을 사용하여 상청액으로부터 정제하였다. 도 63은 실시예 2에 개시된 방법에 따른 유세포 분석기를 사용하여 CH3 돌연변이가 결합에 미치는 차등 효과를 나타낸다. 이 도면은 이중점 돌연변이가 CH3 영역에 도입될 때 약간의 결합력이 손실됨을 보여준다.
플루오레신 이소티오시아네이트(FITC) 공액된 2H7 VH L11S 돌연변이 융합 단백질의 결합은 유세포 분석기를 사용하여 측정하였다. FITC의 1 mg/ml 용액을 DMSO에서 제조하였다. 융합 단백질을 야간에 4C 및 2 리터 부피의 pH 9.3 중탄산염 완충액에서 투석하였다. 공액 전에 단백질의 농도를 1∼5 mg/ml로 조절하였다. 일련의 팔콘 5 ml 튜브를, FITC의 단백질 비율이 15-60, 최소 20 및 40이 되도록 설정하였다. 공액 반응물을 광으로터 보호하여 30분간 37C에서 항온처리하였다. 플루오레신으로 표지된 단백질을 PBS, 0.5 MNaCI, 및 1% NaN3로 평형을 맞춘 2 ml의 Sephadex G-25 칼럼 상에서 유리 플루오레신으로부터 분리하였다. 플루오레신 표지된 단백질을 먼저 칼럼으로부터 용출시키고 5 ml 튜브에 수거하였다. 표지도는 280 및 494 nm에서 희석 공액체의 흡수를 측정하고 Molecular Probes사(미국 오레건주 유진 소재)가 기술 제공하는 방식을 사용하여 결정하였다. 데이터를 FITC:단백질 비율에 대하여 보정하였다. 도 64는 이들 구조체가 형광 마커와 공액될 때 결합력을 잃지 않음을 나타낸다.
정제된 2H7 VH L11S 구조체를 실시예 2에 개시된 방법에 따라 비감소 SDS 겔 상에서 실행하였다. 이동 패턴은 도 65에 도시되어 있다.
실시예 42
LEC13 CHO 세포에서 2H7 scFv VH L11S (CSC-S) H WCH2 WCH3의 특성화
2H7 scFv VHL11S (CSC-S) H WCH2 WCH3을 과도적으로 일시적으로 세포감염시키고 Lec13 CHO 세포에서 발현시켰다. Lec13CHO 세포를 사이드-바이-사이드 세포감염에서 2H7 scFv VHS11 hIgG1 (CSS-S)H WCH2 WCH3 및 (CSC-S) H WCH2 WCH3 발현 플라스미드에 대한 포유동물 세포 호소트로서 사용하였다. 모든 세포감염을 100 mm 조직 배양 접시에서 실행하였다. 제조자의 지시에 따라 약 90% 융합되었을 때 리포펙타민 2000 (Invitrogen, Catalog #: 11668-027, 0.75 ml)을 사용하여 세포를 세포감염하였다. 두 세포주를 혈청 존재하에 성장시켜 세포배양 접시에 대한 부착력을 증대 및 유지하여 형질감염 조작, 세정 및 상청액 수거를 단순화한다. 생성물 인서트에 기록된 제안 프로토콜/조건에 따라 DNA:리포펙타민 착물이 혈청 및 항생물질 없이 형성되도록 두었다. 배양 상청액을 형질감염 72 시간후 수거한 다음 첫 수확후 다시 72 시간 후에 수거하였다. 두 CHO 공급원으로부터의 융합 단백질을 앞에 기술되고 CD20 결합 및 ADCC 분석에 사용된 단백질 A 정제에 의하여 분리하였다.
CD20 양성 세포중에서 ADCC를 조절하는 돌연변이된 융합 단백질의 능력을 실시예 2에 개시된 방법을 사용하여 측정하였다. Lec13 CHO 세포내에서 발현된 구조체는 CD20 CHO 표적 세포에 대한 양호한 결합을 나타내었고 도 67에 도시된 바와 동일한 농도로 CHO DG44 유도된 단백질에 대한 ADCC 분석에서 현저히 개선된 활성을 나타내었다.
실시예 43
고 및 저 친화도 대립유전자의 구조체
인간의 CD16 세포외 도메인의 158 위치에서 저(V) 및 고(F) 친화도 대립 유전자를 PCR 분석을 사용하여 인간의 PBMC로부터 유도된 DNA로부터 클로닝하였다. PCR 반응은 수확 전에 부동화시킨 항-CD3 항체(64.1)로 3일간 자극시킨 PBMC로부터 제조한 랜덤 프라이밍된 cDNA를 사용하였다. PCR 반응은 2, 4, 6 또는 8 ㎕의 cDNA를 포함하였고, 각 프라이머는 25 pmol이고, 증폭 프로필은 35 싸이클 동안 94C 60초; 55C 60초; 72C 2분이었다. PCR 프라이머는 하기에 열거된 바와 같다:
5' 프라이머 - 리더 펩티드 없음: 5'-GTTGTTACCGGTGCAATGCGGACTGAAGATCTCCC AAAGGCTGTG-3'(서열 번호 _)
3' 안티센스 프라이머: 5'-GTTGTTTGATCAGCCAAACCTTGAGTGATGGTGATGTTCACA-3'(서열 번호 _)
양성 클론을 시퀀싱하고 효율적인 리더 펩티드 및 (SSS-S) HP238SCH2 WCH3 인간 IgG 꼬리를 함유하는 벡터로 삽입하였다. 2 개의 상이한 버전의 CD16 ED 융합 단백질을 발현시켰다. 제1 단백질은 F158(고 친화도)을 함유하고 제2 단백질은 V158(저 친화도) 대립 유전자를 함유하였다. 구조체를 (SSS-S)H P238S CH2 WCH3 pD18 플라스미드내로 클로닝시키고 앞의 실시예 1 및 10에 개시한 바와 같이 COS 및 CHO 세포에서 발현시켰다. CHO 클론을 IgG 삽입된 ELISA를 사용하여 발현을 스크리닝하여 하기 프로토콜을 사용하여 배양 상청액 중의 융합 단백질의 상대적 발현 농도를 측정하였다: Immulon 1V 플레이트를 4C에서 PBS 완충액 중에서 0.4 ㎍ /ml 염소 항인간 IgG (mouse Adsorbed), (CalTag, Catalog # H10500)로 코팅하였다. 이후, 플레이트를 야간에 4C에서 PBS/1.5% 탈지 우유 중에서 블록킹하였다. 플레이트를 PBS/0.1% Tween 20에서 3회 세정한 다음, 실온에서 3 시간 동안 CHO 클론 배양 상청액으로부터 얻은 100 ㎕의 희석물 시리즈로 항온처리하였다. 클론당 4 개의 희석물을 연속 웰에 첨가하고 1:5 내지 1:375의 5배 증분으로 희석하였다. 또한, 표준 곡선은 농도 표준으로서 CTLA4 hIgG1 (SSS-S)H P238SCH2 WCH3을 사용하여 유도하였다. 희석물 시리즈는 0.5 ㎍/ml에서 출발하여 5배 희석을 사용하고; 제2 세트의 8 웰을 사용하여 0.34 ㎍/ml에서 출발하여 2-배 희석 시리즈를 제조하였다. 플레이트를 PBS/0.1% Tween 20에서 3회 세정하고, 1 시간 동안 PBS/0.5% BSA중에서 1:5000의 양고추냉이색 퍼옥시다제(GAH IgG-HRP)에 공액시킨 항인간 IgG로 항온처리하였다. 플레이트를 PBS/0.1% Tween 20으로 4회 세정한 다음 TMB 크로마겐 기질(BD-Pharmingen)을 10분간 첨가하고 100 ㎕의 IN 황산을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 이후 플레이트를 415nm에서 SpectraCount 플레이트 리더 상에서 판독하였다. 융합 단백질의 농도는 선형 범위의 OD를 각 플레이트 상에서 실행된 CTLA4Ig 표준 곡선과 비교하여 평가하였다.
단백질을 단백질 A 정제를 사용하여 정제하고, 실시예 42에 개시된 바와 같은 플루오레신 이소티오시아네이트(FITC)에 직접 공액시켰다. 이들 단백질을 실시예 2에 개시된 방법에 따라 감소 및 비감소 조건하에 SDS 겔 상에서 실행하였다. 이들 단백질의 이동은 도 68에 나타나 있다.
고 및 저 대립 유전자의, CD20+ CHO 표적 세포의 세포 표면에서 발현되는 2H7 VHl11S (SSS-S) H (P238S) CH2 WCH3 또는 2H7 VHl11S (CSC-S) H WCH2 WCH3 결합력을 실시예 2에 개시된 방법에 따라 유세포 분석기를 사용하여 측정한다. 도 69의 결과는, 고 및 저 친화도의 대립 유전자가 2H7 VHL11S (CSC-S) H WCH2 WCH3(서열 번호 _)을 결합시킬 수 있고 P238S 돌연변이가 구조체(서열 번호 _)의 CH2 영역으로 도입될 때 결합력이 약간 손실되었음을 증명한다.
실시예 44
포유동물 디스플레이 시스템
도 70A는 FcRIII(CD16) 가용성 융합 단백질의 FITC 공액체가 어떻게 CHO 세포에 의하여 발현되는 CD20에 부착된 2H7 scFv-Ig 구조체에 결합하는가를 나타낸다. scFv-Ig에 대한 CD16 결합은 표적화된 또는 부위-특이적 돌연변이를 함유하는 변형 scFv-Ig 구조체에 결합하는 CD16 변화를 검출하기 위한 스크리닝 도구를 제공한다. CD16 결합 특성에서의 변화는 CD16 고친화도 단백질(158F) 또는 CD16 저친화도 단백질(158 V) 또는 둘다의 결합 변화일 수 있다.
이러한 스크리닝 방법은 도 70B에 개략적으로 나타나 있으며, 여기서 scFv-Ig 구조체는 포유동물 세포의 세포 표면에 디스플레이된다. 이 실시예에서 scFv-Ig 분자는 이들이 트랜스멤브레인 도메인 앵커를 함유하므로 세포 표면 상에 디스플레이된다. 이들 분자는 단일 scFv-Ig 구조체를 나타내거나 또는 이러한 분자의 라이브러리로서 포유동물 세포의 군집내로 도입될 수 있다. 이후, 결합 특성이 변화된 형질감염된 세포를 패닝, 소팅 또는 선별 조건의 엄격함을 변화시키고 결합 프로브로서 CD 16 융합 단백질을 사용함으로써 다른 세포로부터 분리할 수 있다. CD16 고 친화도 대립 유전자(158F) 또는 CD16 저친화도 대립 유전자(158V) 또는 둘다에 대한 결합력이 변화된 scFv-Ig 분자를 발현시키는 세포를 분리할 수 있다. 예컨대, 이 디스플레이 시스템을 사용하여 랜덤화된 올리고누클레오티드 또는 합성 아미노산을 비롯한 모든 가능한 아미노산 치환을 갖는 단일 잔기의 임의 랜덤화로 교체된 CH2의 쇼트 스트래치를 갖는 돌연변이된 Ig 꼬리의 라이브러리를 생성할 수 있다. 이러한 라이브러리가 구축되면, 이것은 업계에 널리 공지된 방법으로 COS 세포내로 형질감염시킬 수 있다. 이후, 형질감염을 표지된 CD16 구조체에 결합시키고, 대립유전형/이소형을 배가시키는 이들의 상대적 결합 특성을 기초로 패닝 또는 소팅할 수 있다. 패닝된 세포를 수거하고, 플라스미드 DNA를 분리한 다음 박테리아내로 형질전환한다. 이 과정은 단일 클론이 포유동물 호스트 세포로부터 분리될 때까지 여러번 반복할 수 있다 (Seed B and Aruffo A, PNAS 84: 3365-3369 (1987) and Aruffo A and Seed B, PNAS 84: 8573-8577 (1987) 참조). 이러한 유형의 스크리닝 시스템의 한 용도는 다양한 환자 군집에서 scFv-Ig 구조체에 의하여 매개된 이펙터 기능의 향상을 목표로 CD16의 고친화도 및 저친화도 대립 유전자 둘다에 대하여 동일하게 잘 결합하는 Ig 꼬리를 분리하는 것이다. 다른 Fc 수용체에 대한 결합 특성이 변화된 Ig 꼬리도 개시된 디스플레이 시스템을 사용하여 선별할 수 있다. 예컨대 박테리오파지 또는 효모균을 사용하는 다른 디스플레이 시스템은, 비포유동물 시스템에서 발생하지 않는 Ig CH2 도메인에서 글리코실화에 대한 요구조건으로 인하여 FcR 결합 특성이 변화된 Ig 꼬리의 선별에 적당하지 않다.
이 시스템은 또한 고레벨에서 생성되는 변화된 scFv-Ig 분자의 선별에도 유 용하다. 이 실시예에서, COS 세포와 같은 포유동물 세포는 세포 표면으로 이들의 발현을 배향시키는 플라스미드중 scFv-Ig 구조체의 라이브러리로 형질감염될 수 있다. 고레벨의 scFv-Ig 분자를 발현시키는 COS 세포는 업계에 널리 공지된 기술(예컨대, 패닝, 무균 세포 소팅, 자기 비이드 분리 등)에 의하여 선별될 수 있고, 플라스미드 DNA는 분리되어 박테리아로 형질전환된다. 몇회의 선별후, 고레벨의 발현이 가능한 scFv-Ig 분자를 암호화하는 단일 클론을 분리한다. 분리된 클론을 변화시켜 멤브레인 앵커를 변화시킨 다음 포유동물 세포에서 발현시키고, scFv-Ig 구조체를 고레벨로 배양액으로 분비될 것이다. 이것은, 세포 표면에서의 발현 수준 개선을 나타내는 분자 선별이 분비 단백질의 수준 개선을 나타내는 분자 선별이 되도록, 통상적으로 발현을 위해 골지를 통한 과정 및 시그널 펩티드에 분비 글리코단백질 및 세포 표면 글리코단백질을 요함을 시사한다.
실시예 45
G28-1 맵 및 SCFVS의 특성화
실시예 3에 개시된 방법을 사용하여 Annexin V를 결합함으로써 G28-1 mAbs 및 scFvs의 아폽토시스 유도능을 측정하였다. 도 71의 결과를 2H7 항체 및 scFv 구조체로 처리할 경우 G28-1 항체 및 scFv의 Annexin V 결합이 증가함을 증명한다.
실시예 46
FC2-2 SCFV 구조체의 구축
FC2-2 하이브리도마로부터 분리한 총 RNA를 사용하여 FC2-2 (항-CD 16) scFv의 구축을 실행하고, 실시예 35에 개시된 방법을 사용하여 클로닝하였다. 폴리누클 레오티드 서열은 서열 번호 _에 제공되어 있고, 암호화된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _에 제공되어 있다. 2차 PCR 반응에 특이적인 프라이머를 아래에 열거한다. 하기는 경쇄 가변 영역에 대한 프라이머이다:
HindIII 부위를 포함하고 리더를 포함하지 않는 5' 프라이머:
5'-GTTGTTAAGCTTGCCGCCATGGATTCAC
AGGCCCAGGTTCTT-3'(서열 번호 _)
SalI 부위 및 리더를 포함하는 5' 프라이머:
5'- GTTGTTGTCGACATTGTGATGTCACAGTCTCC
ATCCTCCCTA-3'(서열 번호 _)
3'프라이머:
5'-TCAGTGCTGATCATGAGGAGACGGTGACTGAGGTTCCTT-3'(서열 번호 _)
하기는 중쇄 가변 영역에 대한 프라이머이다:
5' 프라이머: 5'-TCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCGTCACAGGTGCAGTTG AAGGAGTCAGGA-3'(서열 번호 _)
3' 프라이머: 5'-ACCCGACCCACCACCGCCCGAGCCACCGCCACCTTTTATTTCCAGCTTG GTGCCACCTCCGAA-3'(서열 번호 _)
실시예 33에 개시된 방법에 따라 부위-지향 돌연변이화에 의하여 중쇄 가변 영역의 위치 11(Kabat 넘버링)의 류신에서 세린으로의 변화를 FC2-2 scFv로 도입하였다. scFv를 실시예 33에 개시된 방법에 따라 (SSS-S) H WCH2 WCH3 IgG 꼬리에 부착하였다. 돌연변이는 FC2-2 scFv VH L11S (SSS-S) H WCH2 WCH3으로 명시한다. 폴 리누클레오티드 서열은 서열 번호 _에 제공되어 있고, 암호화된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _에 제공되어 있다.
실시예 47
5B9 SCFV 구조체의 구축
5B9 하이브리도마로부터 분리한 총 RNA를 사용하여 5B9 (항-CD137) scFv의 구축을 실행하고, 실시예 35에 개시된 방법을 사용하여 클로닝하였다. 폴리누클레오티드 서열은 서열 번호 _에 제공되어 있고, 암호화된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _에 제공되어 있다. 2차 PCR 반응에 특이적인 프라이머를 아래에 열거한다. 하기는 경쇄 가변 영역에 대한 프라이머이다:
HindIII 부위를 포함하고 리더를 포함하지 않는 5' 프라이머:
5'-GTTGTTAAGCTTGCCGCCATGAGGTTCT
CTGCTCAGCTTCTG-3'(서열 번호 _)
SalI 부위 및 리더를 포함하는 5' 프라이머:
5'-GTTGTTGTCGACATTTGTGATGACGCAGGCTG
CATTCTCCAATT3'(서열 번호 _)
3' 프라이머: 5'-TCAGTGCTGATCAGAGGAGGACGGTGACTGAGGTTCCTTG-3'(서열 번호 _)
하기는 중쇄 가변 영역에 대한 프라이머이다:
5' 프라이머:
5'-CGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCGTCACAGGTGCAGCTGAAGCAGTCAGGA-3'(서열 번호 _)
3' 프라이머:
5'-CCCGACCCACCACCGCCCGAGCCACCGCCACCCTTCAGCTCCAGCTTG
GTGCCAGCACC-3'(서열 번호 _)
실시예 33에 개시된 방법에 따라 부위-지향 돌연변이화에 의하여 중쇄 가변 영역의 위치 11(Kabat 넘버링)의 류신에서 세린으로의 변화를 5B9 scFv로 도입하고, 실시예 33에 개시된 방법에 따라 (SSS-S) H WCH2 WCH3에 부착하였다. 이 구조체는 5B9 scFv VH L11S (SSS-S) H WCH2 WCH3으로 명시하였다. 폴리누클레오티드 서열은 서열 번호 _에 제공되어 있고, 암호화된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _에 제공되어 있다.
실시예 48
UCHL1 SCFV 구조체의 구축
UCHL1 하이브리도마로부터 분리한 총 RNA를 사용하여 UCHL1 (항-CD45RO) scFv의 구축을 실행하고, 실시예 35에 개시된 방법을 사용하여 클로닝하였다. 폴리누클레오티드 서열은 서열 번호 _에 제공되어 있고, 암호화된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _에 제공되어 있다. 하기는 경쇄 가변 영역에 대한 프라이머이다:
HindIII 부위를 포함하는 5' 프라이머:
5'-GTTGTTAAGCTTGCCGCCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTG-3'(서열 번호 _)
Sac 부위를 포함하는 3' 프라이머:
5'-AGAGCTCCCACCTCCTCCAGATCCACCACCGCCCGAGCCACCGCCATCTTTGATTTCCAGCTTGGT- 3'(서열 번호 _)
하기는 중쇄 가변 영역에 대한 프라이머이다:
5' 프라이머: 5'-
TTTCAGAGTAATCTGAGAGCTCCCACCTCCTCCAGATCCACCACCGCCCGA3'(서열 번호 _)
3' 프라이머: 5'-TCAGTGCTGATCATGCAGAGAGACAGTGACCAGAGTCCC-3'(서열 번호 _)
실시예 33에 개시된 방법에 따라 부위-지향 돌연변이화에 의하여 중쇄 가변 영역의 위치 11(Kabat 넘버링)의 류신에서 세린으로의 변화를 5B9 scFv로 도입하고, 실시예 33에 개시된 방법에 따라 (SSS-S) H WCH2 WCH3에 연결하였다. 돌연변이는 UCHL1 scFv VH L11S (SSS-S) H WCH2 WCH3으로 명시하였다. 폴리누클레오티드 서열은 서열 번호 _에 제공되어 있고, 암호화된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _에 제공되어 있다.
실시예 49
L6 VHL11S scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3
실시예 33에 개시된 방법에 따라 부위-지향 돌연변이화에 의하여 중쇄 가변 영역의 위치 11(Kabat 넘버링)의 류신에서 세린으로의 변화를 L6 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3으로 도입(실시예 106에 개시된 방법에 따라 구축)하였다. L6 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 pD18 플라스미드를 주형으로서 사용하였다. 실시예 33에 개시된 방법에 따라 (SSS-S) H WCH2 WCH3을 함유하는 pD18 플라스미드로 양성 클론을 삽입하였다. 돌연변이는 L6 scFv VH L11S (SSS-S) H WCH2 WCH3으로 명시하였다. 폴리누클레오티드 서열은 서열 번호 _에 제공되어 있고, 암호화된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _에 제공되어 있다.
PCR 프라이머는 하기 열거되어 있다:
PstI 제한 부위를 포함하는 5' 프라이머: 5'-
ggcggatctctgcagatccagttggtgcagtctggacctgagtcgaagaagcct
ggagag-3'(서열 번호 _)
3' 프라이머: 5'-ggacagtgggagtggcacc-3'(서열 번호 _)
실시예 50
HD37 scFv VHLllS 구조체의 구축
실시예 33에 개시된 방법에 따라 부위-지향 돌연변이화에 의하여 중쇄 가변 영역의 위치 11(Kabat 넘버링)의 류신에서 세린으로의 변화를 HD37 scFv로 도입하였다. HD37 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 pD18 플라스미드를 주형으로서 사용하였다. 실시예 33에 개시된 방법에 따라 (SSS-S)H WCH2 WCH3을 함유하는 pD18 플라스미드로 양성 클론을 삽입하였다. 돌연변이는 HD37 scFv VH L11S (SSS-S) H WCH2 WCH3으로 명시하였다. 폴리누클레오티드 서열은 서열 번호 _에 제공되어 있고, 암호화된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _에 제공되어 있다.
PCR 프라이머는 하기 열거되어 있다:
5' 프라이머: 5'-caggttcagctgcagcagtctggggctgagtcggtgaggcctgg-3'(서열 번호 _)
3' 프라이머: 5'-ggaggattcgtctgcagtcagagtggc-3'(서열 번호 _)
실시예 51
2H7 scFv VHL11S 구조체
추가의 2H7 VHL11S 구조체를 상이한 연결 영역으로 제조하였다. pD18 2H7 scFv VHL11S (SSS-S) H WCH2 WCH3 벡터를 BelI 및 XbaI로 이화시켜 연결 영역 CH2 및 CH3을 제거하였다. 이들을 실시예 13에 개시된 방법에 따라 각각 상이한 연결 영역 CH2 및 CH3로 교체하였다. 신규한 구조체는 하기와 같았다: 2H7scFv VHL11S (CSS-S) H WH2 WH3(서열 번호 _). 2H7 scFv VHL11S는 또한 IgA 연결 영역, CH2, CH3 및 IgE CH2, CH3, CH4에 부착되었다. pD18 2H7 scFv VHL11S (SSS-S) H WCH2 WCH3 플라스미드를 상기 방법을 사용하여 이화시켜 연결 영역 CH2 및 CH3를 제거하였다. 실시예 13에 개시된 방법을 사용하여 IgA 영역을 삽입하였다. 구조체는 2H7 scFv VHLIIS IGAH IgACH2 T4CH3(서열 번호 _)으로 명시하였다. IgE CH2 CH3 CH4 영역을 실시예 39에 개시된 방법을 사용하여 상기 지정된 pD18 벡터에 삽입하였다. 이 구조체는 2H7 scFv VHL11S IgECH2 CH3 CH4(서열 번호 _)로 명시하였다.
실시예 52
2H7 scFvVH L11S (CSC-S) H WCH2 WCH3
이 구조체는 실시예 33에 개시된 바와 같이 류신이 세린으로 변화된 중쇄 가변 영역의 아미노산 잔기 11에 점 돌연변이를 갖는 2H7 (항-CD20) 단일쇄 Fv 결합 영역을 가진다. 이 결합 영역은 인간의 IgG1 연결 영역, CH2 및 CH3 영역에 연결되며, 여기서, 연결 영역의 제2 시스테인 및 프롤린이 실시예 32에 개시된 바와 같이 세린 (SSS-S)으로 변화되었다. 폴리누클레오티드 서열은 서열 번호 _에 제공되어 있고, 암호화된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _에 제공되어 있다.
실시예 53
2H7 scFv VH L11S IcE CH2 CH3 CH4
이 구조체는 실시예 33에 개시된 바와 같이 류신이 세린으로 변화된 중쇄 가변 영역의 아미노산 잔기 11에 점 돌연변이를 갖는 2H7 (항-CD20) 단일쇄 Fv 결합 영역을 가진다. 이 결합 영역은 실시예 38에 개시된 바와 같이 CH2, CH3 및 CH4를 포함하는 인간의 IgE 불변 영역에 부착된다. 폴리누클레오티드 서열은 서열 번호 _에 제공되어 있고, 암호화된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _에 제공되어 있다.
실시예 54
2H7 scFv VH L11S MIGE CH2 CH3 CH4
이 구성은 실시예 33에 기재된 바와 같이 류신이 세린으로 변한 중쇄 가변 영역내 아미노산 잔기 11에서 점 돌연변이를 갖는 2H7(안티-CD20) 단일쇄 Fv 결합 영역을 갖는다. 이 결합 영역은 실시예 39에 기재된 바와 같이 CH2, CH3 및 CH4를 함유하는 마우스 IgE 불변 영역에 부착된다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 55
2H7 scFv VH L11S MIGAH WIGACH2 T4CH3
이 구성은 실시예 33에 기재된 바와 같이 류신이 세린으로 변한 중쇄 가변 영역내 아미노산 잔기 11에서 점 돌연변이를 갖는 2H7(안티-CD20) 단일쇄 Fv 결합 영역을 갖는다. 이 결합 영역은 실시예 5에 기재된 바와 같이 인간 IgA로부터 연결 영역에 부착된다. 이 결합 영역은 실시예 39에 기재된 바와 같이 3' 중지 코돈 전 에 4개의 아미노산 잔기의 절단이 존재하는 돌연변이 CH3 영역과 야생형 CH2 영역으로 구성되는 마우스 IgA 불변 영역에 부착된다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 56
2H7 scFv VH L11S (SSS-S)H K322S CH2 WCH3
이 구성은 실시예 33에 기재된 바와 같이 류신이 세린으로 변한 중쇄 가변 영역내 아미노산 잔기 11에서 점 돌연변이를 갖는 2H7(안티-CD20) 단일쇄 Fv 결합 영역을 갖는다. 이 결합 영역은 모든 시스테인과 하나의 프롤린이 실시예 5에 기재된 방법에 따라 세린(SSS-S)으로 변한 돌연변이 인간 IgG 연결 영역에 연결된다. 연결 영역은 돌연변이 IgG CH2 영역 및 야생형 IgG CH3 영역에 부착된다. CH2 영역내 K322S 돌연변이는 중복 PCR 분석을 이용하여 리신이 세린으로 변한 잔기 322에 존재한다. pD18 벡터내 (SSS-S) H WCH2 WCH3 IgG1 주형을 PCR 증폭에 이용하여 이러한 CH2 돌연변이를 함유하는 (SSS-S) H 유도체를 생성한다. PCR 반응은 반응을 종결시키기 위해 37 주기에 대해 94C, 30 초; 55C, 30 초; 72C, 30 초의 순환 프로필을 이용하였다. 제1 및 제2 반응에서 중복 올리고뉴클레오티드를 이용하는 순차 PCR 반응을 이용하여 이 IgG1 유도체를 구성하였다. 제1 증폭 프라이머는 돌연변이(들)을 유도하였지만, Fc 도메인의 하나의 말단을 삭제하였다. 중복 프라이머를 이용하여 제2 반응 프라이머를 이들 말단에 재부착하였다. 제1 중복 프라이머를 PCR의 개시부에 첨가하고, 반응을 12 주기 동안 진행시킨 후, 중지시키고 제2 중복 프라이머를 반응에 첨가한 후, 25 주기를 더 진행시켜 중복 연장 PCR 반응을 완결시 켰다.
제1 PCR 반응에 대한 프라이머:
5' 프라이머: 5'-ggagatggttttctcgatgggggctgggagggctttgttggagaccgagcacttgtactcc-3'(SEQ ID NO )
3' 프라이머: 5'-ggacagtgggagtggcacc-3'(SEQ ID NO )
PCR 생성물을 TOPO 벡터로 클로닝하고, 검정을 위해 서열화하였다. 제2 중복 PCR 반응을 위한 주형으로서 양성 벡터를 이용하였다
5' 프라이머: 5'ccgtctctgatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtccccagc-3'(SEQ ID NO )
5' 프라이머 중복 프라이머: 5'-tccccaccgtccccagcacctgaactcctggggggatcgtcagtctlcctcttccccccaaaacc-3'(SEQ ID NO )
3' 프라이머: 5'-caggaaacagotatgac-3'(SEQ ID NO )
PCR 생성물을 TOPO 벡터로 클로닝하고, 서열화하였다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 57
2H7 scFv VH L11S (CSS-S) H K322S CH2 WCH3
이 구성은 실시예 33에 기재된 바와 같이 류신이 세린으로 변한 중쇄 가변 영역내 아미노산 잔기 11에서 점 돌연변이를 갖는 2H7(안티-CD20) 단일쇄 Fv 결합 영역을 갖는다. 이 결합 영역은 실시예 13에 기재된 방법에 따라 제2 및 제3 시스테인이 세린으로 변하고, 프롤린이 세린(CSS-S)으로 변한 돌연변이 IgG 연결 영역에 부착된다. 연결 영역은 돌연변이 IgG CH2 영역 및 야생형 IgG CH3 영역에 부착된다. CH2 영역내 K322S 돌연변이는 중복 PCR 분석을 이용하여 리신이 세린으로 변한 잔기 322에 존재한다. 연결 영역은 돌연변이 IgG CH2 영역 및 야생형 IgG CH3 영역에 부착된다. 하기에 기재된 제1 PCR 반응에서 주형으로서 (CSS-S) H WCH2 WHC3 IgG1 pD 18 벡터를 이용하고, 제2 PCR 반응에서 상이한 프라이머를 이용하여 실질적으로 실시예 57에 따라 중복 PCR 반응에 의해 CH2 영역내 돌연변이를 첨가하였다.
5' 프라이머: 5'-ccgtctctgatcaggaccccaaatcttgtgacaaaactcacacatccccaccgtccccagc-3'(SEQ ID NO )
5' 중복 프라이머: 5'- tccccaccgtccccagcacctgaactcctggggggatcgtcagtcttcctcttcccccaaaacc-3'
3' 프라이머: 5'-caggaaacagctatgac-3'(SEQ ID NO )
PCR 생성물을 TOPO 벡터로 클로닝하고, 서열화하였다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 58
2H7 scFv VH L11S (SSS-S) H P331S CH2 WCH3
이 구성은 실시예 33에 기재된 바와 같이 류신이 세린으로 변한 중쇄 가변 영역내 아미노산 잔기 11에서 점 돌연변이를 갖는 2H7(안티-CD20) 단일쇄 Fv 결합 영역을 갖는다. 이 결합 영역은 모든 시스테인과 하나의 프롤린이 실시예 5에 기재된 방법에 따라 세린(SSS-S)으로 변한 돌연변이 인간 IgG1 연결 영역에 연결된다. 연결 영역은 돌연변이 IgG1 CH2 영역 및 야생형 IgG1 CH3 영역에 부착된다. (SSS-S) H WCH2 WCH3 pD18 주형 및 37 주기에 대해 94C, 30 초; 55C, 30 초; 72C, 30 초의 순환 프로필을 이용하여 잔기 331에서 프롤린이 세린으로 변한 CH2 영역내 돌연변이 P331S 돌연변이를 단일 PCR 반응을 이용하여 삽입하였다. 반응에 대한 상세한 프라이머는 하기에 기재한다.
5' 프라이머: 5'ccgtctctgatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtccccagc-3'(SEQ ID NO )
3' 프라이머: 5'-gcagggtgtacacctgtggttctcggggctgccctttggctttggagatggttttctcgatggaggctgggagg-3'(SEQ ID NO )
폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 59
2H7 scFv VH L11S (CSS-S) H P331S CH2 WCH3
이 결합 영역은 실시예 13에 기재된 방법에 따라 제2 및 제3 시스테인이 세린으로 변하고, 프롤린이 세린(CSS-S)으로 변한 돌연변이 IgG 연결 영역에 부착된다. 연결 영역은 돌연변이 IgG CH2 영역 및 야생형 IgG CH3 영역에 부착된다. (CS- S) H WCH2 WCH3 pD18 주형 및 37 주기에 대해 94C, 30 초; 55C, 30 초; 72C, 30 초의 순환 프로필을 이용하여 잔기 331에서 프롤린이 세린으로 변한 CH2 영역내 돌연변이 P331S 돌연변이를 단일 PCR 반응을 이용하여 삽입하였다. 반응에 대한 상세한 프라이머는 하기에 기재한다.
5' 프라이머: 5'-ccgtctctgatcaggaccccaaatcttgtgacaaaactcacacatccccaccgtccccagc-3'(SEQ ID NO )
3' 프라이머: 5'- gcagggtgtacacctgtggttctcggggctgccctttggctttggagatggttttctcgatggaggctgggagg-3'(SEQ ID NO )
폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 60
2H7 scFv VHL11S (SSS-S) H T256N CH2 WCH3
이 구성은 실시예 33에 기재된 바와 같이 류신이 세린으로 변한 중쇄 가변 영역내 아미노산 잔기 11에서 점 돌연변이를 갖는 2H7(안티-CD20) 단일쇄 Fv 결합 영역을 갖는다. 이 결합 영역은 모든 시스테인과 하나의 프롤린이 실시예 5에 기재된 방법에 따라 세린(SSS-S)으로 변한 돌연변이 인간 IgG 연결 영역에 연결된다. 연결 영역은 돌연변이 IgG CH2 영역 및 야생형 IgG CH3 영역에 부착된다. 잔기 256에서 트레오닌인 CH2 영역내 T256N 돌연변이는 실시예 56에 기재된 중복 PCR 방법을 이용하여 아스파라긴으로 변화시켰다. 특정 프라이머를 하기에 기재한다.
제1 PCR 반응에 대한 프라이머:
5' 프라이머: 5'ttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggaaccctgaggtcac-3'(SEQ ID NO )
3' 프라이머: 5'-ggacagtgggagtggcacc-3'(SEQ ID NO )
PCR 생성물을 TOPO 벡터로 클로닝하고, 서열화하였다. 생성물을 제2 PCR 반응에서 주형으로서 이용하였다.
제2 PCR 반응에 대한 프라이머:
5' 프라이머: 5'ccgtctctgatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtccccagc-3'(SEQ ID NO )
5' 중복 프라이머: 5'-tccccaccgtccccagcacctgaactcctggggggatcgtcagtcttcctcttccccccaaaacc-3'(SEQ ID NO )
3' 프라이머: 5'-caggaaacagctatgac-3'(SEQ ID NO )
폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 61
2H7 scFv VH L11S (SSS-S) HR TPE/QNAK (255-258) CH2 WCH3
이 구성은 실시예 33에 기재된 바와 같이 류신이 세린으로 변한 중쇄 가변 영역내 아미노산 잔기 11에서 점 돌연변이를 갖는 2H7(안티-CD20) 단일쇄 Fv 결합 영역을 갖는다. 이 결합 영역은 모든 시스테인과 하나의 프롤린이 실시예 5에 기재된 방법에 따라 세린(SSS-S)으로 변한 돌연변이 인간 IgG 연결 영역에 연결된다. 연결 영역은 돌연변이 IgG CH2 영역 및 야생형 IgG CH3 영역에 부착된다. 실시예 56에 기재된 중복 PCR 반응을 이용하여 잔기 255-258인 CH2 영역내 RTPE/QNAK 돌연변이가 아르기닌, 트레오닌, 프롤린, 글루탐산으로부터 글루타민, 아스파라긴, 알라닌 및 리신으로 각각 돌연변이시켰다. 특정 프라이머를 하기에 기재한다.
제1 PCR 반응에 대한 PCR 프라이머:
5' 프라이머: 5'-ttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccagaacgctaaggtcacatgc-3'(SEQ ID NO )
3' 프라이머: 5'-ggacagtgggagtggcacc-3'(SEQ ID NO )
PCR 생성물을 TOPO 벡터로 클로닝하고, 서열화하여 제2 PCR 반응을 위한 주형으로서 이용하였다.
제2 PCR 반응에 대한 프라이머:
5 프라이머: 5'ccgtctctgatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtccccagc-3'(SEQ ID NO )
5' 중복 프라이머: 5'-tccccaccgtccccagcacctgaactcctggggggatcgtcagtcttcctcttccccccaaaacc-3'(SEQ ID NO )
3' 프라이머: 5'-caggaaacagctatgac-3'(SEQ ID NO )
폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 62
2H7 scFv VH L11S (SSS-S) H K290Q CH2 WCH3
이 구성은 실시예 33에 기재된 바와 같이 류신이 세린으로 변한 중쇄 가변 영역내 아미노산 잔기 11에서 점 돌연변이를 갖는 2H7(안티-CD20) 단일쇄 Fv 결합 영역을 갖는다. 이 결합 영역은 모든 시스테인과 하나의 프롤린이 실시예 5에 기재된 방법에 따라 세린(SSS-S)으로 변한 돌연변이 인간 IgG 연결 영역에 연결된다. 연결 영역은 돌연변이 인간 IgG1 CH2 영역 및 야생형 인간 IgG1 CH3 영역에 부착된다. 잔기 290에서 리신인 CH2 영역내 K290Q 돌연변이를 실시예 58에 기재된 방법에 따라 단일 PCR 반응을 이용하여 글루타민으로 변화시켰다. 이 반응에 이용된 특정 프라이머를 하기에 기재한다.
5' 프라이머: 5'ccgtctctgatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtccccagc-3'(SEQ ID NO )
3' 프라이머: 5'-gctcccgcggctgtgtcttggc-3'(SEQ ID NO )
PCR 생성물을 TOPO로 클로닝하고, 서열화하였다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 63
2H7 scFv VH L11S (SSS-S) H A339P CH2 WCH3
이 구성은 실시예 33에 기재된 바와 같이 류신이 세린으로 변한 중쇄 가변 영역내 아미노산 잔기 11에서 점 돌연변이를 갖는 2H7(안티-CD20) 단일쇄 Fv 결합 영역을 갖는다. 이 결합 영역은 모든 시스테인과 하나의 프롤린이 실시예 5에 기재된 방법에 따라 세린(SSS-S)으로 변한 돌연변이 인간 IgG 연결 영역에 연결된다. 연결 영역은 돌연변이 인간 IgG1 CH2 영역 및 야생형 인간 IgG1 CH3 영역에 부착된다. 잔기 339에서 알라닌인 CH2 영역내 A339P 돌연변이는 실시예 58에 기재된 방법에 따라 단일 PCR 반응을 이용하여 프롤린으로 변화시켰다. 이 반응에 이용된 특정 프라이머를 하기에 기재한다.
5' 프라이머: 5'ccgtCtCtgatcaggagcocaaatcttctgacaaaactcacacatcOccacOgtccccagc-3'(SEQ ID NO )
3' 프라이머: 5'-ggaggtgggcagggtgtacacctgtggttctcggggctgccctttgggtttggagatgg-3'(SEQ ID NO )
PCR 생성물을 TOPO 벡터로 클로닝하고, 서열화하였다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 64
G28-1 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3
이 구성은 실시예 35에 기재된 방법에 따라 제조된 G28-1(안티-CD37) 단일쇄 Fv 결합 영역을 갖는다. 이 결합 영역은 모든 시스테인과 하나의 프롤린이 실시예 5에 기재된 방법에 따라 세린(SSS-S)으로 변한 돌연변이 인간 IgG 연결 영역에 연결된다. 이 연결 영역은 실시예 1에 기재된 바와 같은 야생형 인간 IgG1 CH2 및 CH3 영역에 연결된다. 이 구성은 이전에 G28-1-MHWTG1C 및 G28-1 scFv Ig로 명명되었는데, 이들 모두는 상기 구성과 동일한 서열을 갖는다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 65
G28-1 scFv IGAH WCH2 WCH3
이 구성은 실시예 35에 기재된 방법에 따라 제조된 G28-1(안티-CD37) 단일쇄 Fv 결합 영역을 갖는다. 이 결합 영역은 실시예 5에 기재된 바와 같은 인간 IgA 연결 영역 및 야생형 인간 IgG CH2 및 CH3 영역에 연결된다. 이 구성은 이전에 G28-1-IgAHWTGlC로 명명되었다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 66
G28-1 scFv VHL11S (SSS-S) H WCH2 WCH3
이 구성은 실시예 35에 기재된 바와 같이 류신이 세린으로 변한 중쇄 가변 영역내 아미노산 잔기 11에서 점 돌연변이를 갖는 G28-1(안티-CD37) 단일쇄 Fv 결합 영역을 갖는다. 이 결합 영역은 모든 시스테인과 하나의 프롤린이 실시예 5에 기재된 방법에 따라 세린(SSS-S)으로 변한 돌연변이 인간 IgG 연결 영역에 연결된다. 이 연결 영역은 실시예 1에 기재된 바와 같은 야생형 인간 IgG1 CH2 및 CH3 영역에 부착된다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩 티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 67
G28-1 scFv VH L11S (CSS-S) H WCH2 WCH3
이 구성은 실시예 35에 기재된 바와 같이 류신이 세린으로 변한 중쇄 가변 영역내 아미노산 잔기 11에서 점 돌연변이를 갖는 G28-1(안티-CD37) 단일쇄 Fv 결합 영역을 갖는다. 이 결합 영역은 실시예 13에 기재된 방법에 따라 제2 및 제3 시스테인이 세린으로 변하고, 프롤린이 세린(CSS-S)으로 변한 돌연변이 인간 IgG1 연결 영역에 부착된다. 이 결합 영역은 실시예 1에 기재된 바와 같은 야생형 인간 IgG1 CH2 및 CH3 영역에 부착된다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 68
G28-1 scFv VHL11S (CSC-S) H WCH2 WCH3
이 구성은 실시예 35에 기재된 바와 같이 류신이 세린으로 변한 중쇄 가변 영역내 아미노산 잔기 11에서 점 돌연변이를 갖는 G28-1(안티-CD37) 단일쇄 Fv 결합 영역을 갖는다. 이 결합 영역은 실시예 32에 기재된 방법에 따라 제2 시스테인 및 프롤린이 세린(CSC-S)으로 변한 돌연변이 인간 IgG1 연결 영역에 부착된다. 이 연결 영역은 실시예 1에 기재된 바와 같은 야생형 인간 IgG1 CH2 및 CH3 영역에 부착된다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 69
G28-1 scFv VHL11S (SSC-P) H WCH2 WCH3
이 구성은 실시예 35에 기재된 바와 같이 류신이 세린으로 변한 중쇄 가변 영역내 아미노산 잔기 11에서 점 돌연변이를 갖는 G28-1(안티-CD37) 단일쇄 Fv 결합 영역을 갖는다. 이 결합 영역은 실시예 13에 기재된 방법에 따라 제1 및 제2 시스테인이 세린(SSC-P)으로 변한 돌연변이 인간 IgG 연결 영역에 부착된다. 이 결합 영역은 실시예 1에 기재된 바와 같은 야생형 인간 IgG1 CH2 및 CH3 영역에 연결된다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 70
CTLA4 (SSS-S) H P238SCH2 WCH3
이 구성은 실시예 14에 기재된 바와 같은 세포외 CTLA-4 결합 영역을 갖는다. 이 결합 영역은 모든 시스테인과 하나의 프롤린이 실시예 5에 기재된 방법에 따라 세린(SSS-S)으로 변한 돌연변이 인간 IgG1 연결 영역에 연결된다. 이 힌지 영역은 돌연변이 인간 IgG1 CH2 영역 및 야생형 인간 IgG1 CH3 영역에 부착된다. 잔기 238에서 프롤린이 세린으로 변한 P238S를 PCR 분석을 이용하여 도입하였다. 인간 편도 B 세포 RNA로부터 제조한 랜덤 프라임화 cDNA를 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR 증폭은 30 주기에 대해 94C 4 분; [94C 1 분; 55C 1 분; 72C 1 분에 이어 72C에서 6 분 동안 최종 연장하는 증폭 프로필을 사용하였다. PCR 프래그먼트를 TOPO 클로닝하고, 약 800 bp의 EcoRI 삽입을 포함하는 클론을 실시예 1에 기재된 바와 같이 서열화하였다. PCR에 사용된 프라이머를 하기에 기재한다:
5' 프라이머: 5'-gttgttgatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatctccaccgtccccagcacctgaactcctgggtgg accgtcagtcttcc-3'(SEQ ID NO )
3' 프라이머: 5'gttgtttctagattatcatttacccggagacag-3'(SEQ ID NO )
이 구성은 이전에 CTLA-4 IgG MTH (SSS) MTCH2WTCH3으로 명명되었는데, 이는 상기 구성과 동일한 서열을 갖는다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 71
CTLA4 (CCC-P) WH WCH2 WCH3
이 구성은 실시예 14에 기재된 바와 같은 CTLA-4 결합 영역을 갖는다. 이 결합 영역은 실시예 1에 기재된 바와 같은 야생형 인간 IgG1 연결 영역(CCC-P)에 부착된다. 이 연결 영역은 실시예 1에 기재된 바와 같은 야생형 인간 IgG1 CH2 및 CH3 영역에 연결된다. 이 구성은 이전에 CTLA-4 IgG WTH (CCC) WTCH2CH3로 명명되었는데, 이는 상기 구성과 동일한 서열을 갖는다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 72
FC2-2 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3
이 구성은 실시예 46에 기재된 방법에 따라 제조된 FC2-2(안티-CD16) 단일쇄 Fv를 갖는다. 이 결합 영역은 모든 시스테인과 하나의 프롤린이 실시예 5에 기재된 방법에 따라 세린(SSS-S)으로 변한 돌연변이 인간 IgG 연결 영역에 연결된다. 이 연결 영역은 실시예 1에 기재된 바와 같은 야생형 인간 IgG1 CH2 및 CH3 영역에 연결된다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 73
FC2-2 scFv VHL11S (SSS-S) H WCH2 WCH3
이 구성은 실시예 46에 기재된 바와 같이 류신이 세린으로 변한 중쇄 가변 영역내 아미노산 잔기 11에서 점 돌연변이를 갖는 FC2-2(안티-CD 16) 단일쇄 Fv를 갖는다. 이 결합 영역은 모든 시스테인과 하나의 프롤린이 실시예 5에 기재된 방법에 따라 세린(SSS-S)으로 변한 돌연변이 인간 IgG1 연결 영역에 연결된다. 이 연결 영역은 실시예 1에 기재된 바와 같은 야생형 인간 IgG1 CH2 및 CH3 영역에 연결된다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 74
UCHL-1 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3
이 구성은 실시예 48에 기재된 방법에 따라 제조된 UCHL-1(안티-CD45RO) 단일쇄 Fv를 갖는다. 이 결합 영역은 모든 시스테인과 하나의 프롤린이 실시예 5에 기재된 방법에 따라 세린(SSS-S)으로 변한 돌연변이 인간 IgG 연결 영역에 연결된다. 이 연결 영역은 실시예 1에 기재된 바와 같은 야생형 인간 IgG1 CH2 및 CH3 영역에 연결된다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 75
UCHL-1 scFv VHL11S (SSS-S) H WCH2 WCH3
이 구성은 실시예 48에 기재된 바와 같이 류신이 세린으로 변한 중쇄 가변 영역내 아미노산 잔기 11에서 점 돌연변이를 갖는 UCHL-1(안티-CD45RO) 단일쇄 Fv를 갖는다. 이 결합 영역은 모든 시스테인과 하나의 프롤린이 실시예 5에 기재된 방법에 따라 세린(SSS-S)으로 변한 돌연변이 인간 IgG 연결 영역에 연결된다. 이 연결 영역은 실시예 1에 기재된 바와 같은 야생형 인간 IgG1 CH2 및 CH3 불변 영역에 연결된다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 76
5B9 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3
이 구성은 실시예 47에 기재된 방법에 따라 제조된 5B9(안티-CD137) 단일쇄 Fv를 갖는다. 이 결합 영역은 모든 시스테인과 하나의 프롤린이 실시예 5에 기재된 방법에 따라 세린(SSS-S)으로 변한 돌연변이 인간 IgG 연결 영역에 연결된다. 이 연결 영역은 실시예 1에 기재된 바와 같은 야생형 인간 IgG1 CH2 및 CH3 불변 영역에 연결된다. 이 구성은 이전에 5B9 scFv IgG MTH (SSS) WTCH2CH3로 명명되었는데, 이는 상기 구성과 동일한 서열을 갖는다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 77
5B9 scFv VHL11S (SSS-S) H WCH2 WCH3
이 구성은 실시예 47에 기재된 바와 같이 류신이 세린으로 변한 중쇄 가변 영역내 아미노산 잔기 11에서 점 돌연변이를 갖는 5B9(안티-CD137) 단일쇄 Fv를 갖는다. 이 결합 영역은 모든 시스테인과 하나의 프롤린이 실시예 5에 기재된 방법에 따라 세린(SSS-S)으로 변한 돌연변이 인간 IgG1 연결 영역에 연결된다. 이 연결 영역은 실시예 1에 기재된 바와 같은 야생형 인간 IgG1 CH2 및 CH3 영역에 연결된다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 78
2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3
이 구성은 실시예 1에 기재된 바와 같은 2H7(안티-CD20) 단일쇄 Fv 결합 영역을 갖는다. 이 결합 영역은 모든 시스테인과 하나의 프롤린이 실시예 5에 기재된 방법에 따라 세린(SSS-S)으로 변한 돌연변이 인간 IgG1 연결 영역에 연결된다. 이 연결 영역은 실시예 1에 기재된 바와 같은 야생형 인간 IgG1 CH2 및 CH3 영역에 연결된다. 이 구성은 이전에 2H7-MHWTG1C, CytoxB-(MHWTGlC)-Ig, 안티-CD20 scFv IgG MTH (SSS) WTCH2CH3, CytoxB-MHWTGIC, 2H7 scFv-인간 IgG1 야생형 힌지-CH2-CH3, 및 2H7 scFv IgG MTH(SSS) W'I'CH2CH3로 명명되었는데, 이들 모두는 상기 구성과 동일한 서열을 갖는다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 79
2H7 scFv (SSS-S) H P238SCH2 WCH3
이 구성은 실시예 1에 기재된 바와 같은 2H7(안티-CD20) 단일쇄 Fv 결합 영역을 갖는다. 이 결합 영역은 모든 시스테인과 하나의 프롤린이 실시예 5에 기재된 방법에 따라 세린(SSS-S)으로 변한 돌연변이 인간 IgG1 연결 영역에 연결된다. 이 결합 영역은 모든 시스테인과 하나의 프롤린이 실시예 5에 기재된 방법에 따라 세린(SSS-S)으로 변한 돌연변이 인간 IgG1 연결 영역에 연결된다. 이 힌지 영역은 돌연변이 인간 IgG1 CH2 영역 및 야생형 인간 IgG1 CH3 영역에 부착된다. 잔기 238에서 프롤린이 세린으로 변한 P238S 돌연변이를 실시예 70에 기재된 방법에 따라 도입하였다. 이 구성은 이전에 2H7 scFv IgG MTH (SSS) MTCH2WTCH3, 안티-CD20 scFv IgG MTH (SSS) MTCH2CH3 및 CytoxB-MHMGlC로 명명되었는데, 이들 모두는 상기 구성과 동일한 서열을 갖는다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 80
2H7 scFv IgAH WCH2 WCH3
이 구성은 실시예 1에 기재된 바와 같은 2H7(안티-CD20) 단일쇄 Fv 결합 영역을 갖는다. 이 결합 영역은 실시예 5에 기재된 바와 같은 인간 IgA 연결 영역 및 야생형 인간 IgG1 CH2 및 CH3 불변 영역에 연결된다. 이 구성은 이전에 2H7 scFv IgAH IgG WTCH2CH3, 2H7 scFv IgA 힌지-IgG1 CH2-CH3 및 CytoxB-IgAHWTHGIC로 명명되었는데, 이들 모두는 상기 구성과 동일한 서열을 갖는다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 81
2H7 scFvIgAH WIgACH2 T4CH3
이 구성은 실시예 1에 기재된 바와 같은 2H7(안티-CD20) 단일쇄 Fv 결합 영역을 갖는다. 이 결합 영역은 실시예 5에 기재된 바와 같은 인간 IgA로부터 연결 영역에 부착된다. 이 연결 영역은 실시예 13에 기재된 바와 같이 3' 중지 코돈 전에 4개의 아미노산 잔기의 절단이 존재하는 돌연변이 CH3 영역과 야생형 CH2 영역으로 구성되는 인간 IgA 불변 영역에 부착된다. 이 구성은 이전에 2H7 scFv IgAH IgAT4로 명명되었는데, 이는 상기 구성과 동일한 서열을 갖는다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 82
2H7 scFv IGAH WIGACH2 WCH3 + JCHAIN
이 구성은 실시예 1에 기재된 바와 같은 2H7(안티-CD20) 단일쇄 Fv 결합 영역을 갖는다. 이 결합 영역은 실시예 5에 기재된 바와 같은 야생형 인간 IgA 연결 영역에 부착된다. 이 결합 영역은 실시예 13에 기재된 방법에 따라 야생형 인간 IgG1 CH2 영역 및 CH3 불변 영역에 부착된다. 이 불변 영역은 실시예 13에 기재된 바와 같이 J-쇄 영역에 부착된다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 83
2H7 scFv (CCC-P) WH WCH2 WCH3
이 구조체는 실시예 1에 기재된 2H7 (항-CD20) 단일쇄 Fv 결합 부위를 가진 다. 이 결합 부위는 실시예 1에 기재된 야생형 인간 IgG1 연결 부위 (CCC-P)에 결합한다. 이 연결 부위는 실시예 1에 기재된 야생형 인간 IgG1 CH2 및 CH3 불변 부위에 결합한다. 이 구조체는 이전에 2H7 scFv Ig WTH (CCC) WTCH2CH3, 2H7 scFv IgG WTH WTCH2CH3, 및 2H7 scFv-Ig 로 지칭되었으며, 이들은 모두 상기 구조체와 동일한 서열을 갖는다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되며, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 84
2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 F405YCH3
이 구조체는 실시예 1에 기재된 2H7 (항-CD20) 단일쇄 Fv 결합 부위를 가진다. 이 결합 부위는 모든 시스테인 및 하나의 프롤린이 실시예 5에 기술된 방법에 따라 세린 (SSS-S)으로 바뀐 돌연변이된 인간 IgG1 연결 부위에 연결된다. 이 연결 부위는 야생형 인간 IgG1 CH2 및 돌연변이된 인간 IgG1 CH3 부위에 결합한다. 잔기 405번의 페닐알라닌이 티로신으로 바뀐, F405Y 돌연변이를 실시예 21에 기술된 방법에 따라 도입하였다. 이 구조체는 이전에 2H7 scFv MTH WTCH2 MTCH3 Y405 로 지칭되었으며, 이는 상기 구조체와 동일한 서열을 갖는다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되며, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 85
2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 F405ACH3
이 구조체는 실시예 1에 기재된 2H7 (항-CD20) 단일쇄 Fv 결합 부위를 가진다. 이 결합 부위는 모든 시스테인 및 하나의 프롤린이 실시예 5에 기술된 방법에 따라 세린 (SSS-S)으로 바뀐 돌연변이된 인간 IgG1 연결 부위에 연결된다. 이 연결 부위는 야생형 인간 IgG1 CH2 및 돌연변이된 인간 IgG1 CH3 부위에 결합한다. 잔기 405번의 페닐알라닌이 알라닌으로 바뀐, F405A 돌연변이를 실시예 21에 기술된 방법에 따라 도입하였다. 이 구조체는 이전에 2H7 scFv MTH WTCH2 MTCH3 A405 로 지칭되었으며, 이는 상기 구조체와 동일한 서열을 갖는다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되며, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 86
2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 Y407ACH3
이 구조체는 실시예 1에 기재된 2H7 (항-CD20) 단일쇄 Fv 결합 부위를 가진다. 이 결합 부위는 모든 시스테인 및 하나의 프롤린이 실시예 5에 기술된 방법에 따라 세린 (SSS-S)으로 바뀐 돌연변이된 인간 IgG1 연결 부위에 연결된다. 이 연결 부위는 야생형 인간 IgG1 CH2 및 돌연변이된 인간 IgC1 CH3 부위에 결합한다. 잔기 407 번의 티로신이 알라닌으로 바뀐, Y407A 돌연변이를 실시예 21에 기술된 방법에 따라 도입하였다. 이 구조체는 이전에 scFv MTH WTCH2 MTCH3 A407 로 지칭되었으며, 이는 상기 구조체와 동일한 서열을 갖는다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되며, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 87
2H7 scFv (SSS-S) HWCH2 F405A, Y407ACH3
이 구조체는 실시예 1에 기재된 2H7 (항-CD20) 단일쇄 Fv 결합 부위를 가진다. 이 결합 부위는 모든 시스테인 및 하나의 프롤린이 실시예 5에 기술된 방법에 따라 세린 (SSS-S)으로 바뀐 돌연변이된 인간 IgG1 연결 부위에 연결된다. 이 연결 부위는 야생형 인간 IgG1 CH2 및 돌연변이된 인간 IgG1 CH3 부위에 결합한다. 잔기 405번의 페닐알라닌이 알라닌으로 바뀌고 잔기 407번의 티로신이 알라닌으로 바뀐, F405A 및 Y407A 돌연변이를 실시예 21에 기술된 방법에 따라 도입하였다. 이 구조체는 이전에 scFv MTH WTCH2 MTCH3 A405A407 로 지칭되었으며, 이는 상기 구조체와 동일한 서열을 갖는다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되며, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다
실시예 88
2H7 scFv (CSS-S) H WCH2 WCH3
이 구조체는 실시예 1에 기재된 2H7 (항-CD20) 단일쇄 Fv 결합 부위를 가진다. 이 결합 부위는 실시예 13에 기술된 방법에 따라 제2 및 제3 시스테인이 세린으로 바뀌고 프롤린이 세린 (CSS-S)으로 바뀐 돌연변이 인간 IgG1 연결 부위에 결합한다. 이 연결 부위는 실시예 1에 기재된 야생형 인간 IgG1 CH2 및 CH3 불변 부위에 결합한다. 이 구조체는 이전에 2H7 scFv MTH (CSS) WTCH2CH3 로 지칭되었으며, 이는 상기 구조체와 동일한 서열을 갖는다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되며, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 89
2H7 scFv (SCS-S) H WCH2 WCH3
이 구조체는 실시예 1에 기재된 2H7 (항-CD20) 단일쇄 Fv 결합 부위를 가진다. 이 결합 부위는 실시예 13에 기술된 방법에 따라 제1 및 제3 시스테인이 세린 으로 바뀌고 프롤린이 세린 (SCS-S)으로 바뀐 돌연변이 인간 IgG1 연결 부위에 결합한다. 이 연결 부위는 실시예 1에 기술된 야생형 인간 IgG1 CH2 및 CH3 불변 부위에 결합한다. 이 구조체는 이전에 2H7 scFv IgG MTH (SCS) WTCH2CH3 로 지칭되었으며, 이는 상기 구조체와 동일한 서열을 갖는다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되며, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 90
2H7 scFv (SSC-P) H WCH2 WCH3
이 구조체는 실시예 1에 기재된 2H7 (항-CD20) 단일쇄 Fv 결합 부위를 가진다. 이 결합 부위는 실시예 13에 기술된 방법에 따라 제1 및 제2 시스테인이 세린 (SSC-P)으로 바뀐 돌연변이 인간 IgG1 연결 부위에 결합한다. 이 연결 부위는 실시예 1에 기술된 야생형 인간 IgG1 CH2 및 CH3 불변 부위에 결합한다. 이 구조체는 이전에 2H7 scFv MTH (SSC) WTCH2CH3 로 지칭되었으며, 이는 상기 구조체와 동일한 서열을 갖는다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되며, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 91
2H7 scFv (CSC-S) H WCH2 WCH3
이 구조체는 실시예 1에 기재된 2H7 (항-CD20) 단일쇄 Fv 결합 부위를 가진다. 이 결합 부위는 제2 시스테인 및 프롤린이 실시예 32에 기술된 방법에 따라 세린 (CSC-S)으로 바뀐 돌연변이 인간 IgG1 연결 부위에 결합한다. 이 연결 부위는 실시예 1에 기재된 야생형 인간 IgG1 CH2 및 CH3 불변 부위에 결합한다. 이 구조체 는 이전에 2H7 scFv MTH (CSC) WTCH2CH3 로 지칭되었으며, 이는 상기 구조체와 동일한 서열을 갖는다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되며, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 92
2H7 scFv (CCS-P) H WCH2 WCH3
이 구조체는 실시예 1에 기재된 2H7 (항-CD20) 단일쇄 Fv 결합 부위를 가진다. 이 결합 부위는 제3 시스테인이 실시예 22에 기술된 방법에 따라 세린 (CCS-P)으로 바뀐 돌연변이 인간 IgG1 연결 부위에 결합한다. 이 연결 부위는 실시예 1에 기재된 야생형 인간 IgG1 CH2 및 CH3 불변 부위에 결합한다. 이 구조체는 이전에 2H7 scFv MTH (CCS) WTCH2CH3 로 지칭되었으며, 이는 상기 구조체와 동일한 서열을 갖는다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되며, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 93
2H7 scFv (SCC-P) H WCH2 WCH3
이 구조체는 실시예 1에 기재된 2H7 (항-CD20) 단일쇄 Fv 결합 부위를 가진다. 이 결합 부위는 제1 시스테인이 실시예 32에 기술된 방법에 따라 세린 (SCC-P)으로 바뀐 돌연변이 인간 IgG1 연결 부위에 결합한다. 이 연결 부위는 실시예 1에 기재된 야생형 인간 IgG1 CH2 및 CH3 불변 부위에 결합한다. 이 구조체는 이전에 2H7 scFv MTH (SCC) WTCH2CH3 로 지칭되었으며, 이는 상기 구조체와 동일한 서열을 갖는다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되며, 코딩된 폴리펩티드 서 열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 94
2H7 scFv VH L11S (SSS-S) H WCH2 WCH3
이 구조체는 실시예 33에 기술된 바와 같이 루이신이 세린으로 바뀐, 중쇄 가변 부위의 11번 아미노산 잔기에서 점 돌연변이를 갖는 2H7 (항-CD20) 단일쇄 Fv 결합 부위를 가진다. 이 결합 부위는 모든 시스테인 및 하나의 프롤린이 실시예 5에 기술된 방법에 따라 세린 (SSS-S)으로 바뀐 돌연변이된 인간 IgG1 연결 부위에 연결된다. 이 연결 부위는 실시예 1에 기재된 야생형 인간 IgG1 CH2 및 CH3 불변 부위에 결합한다. 이 구조체는 이전에 2H7 scFv VH11 SER IgG MTH (SSS) WTCH2CH3 및 2H7 scFv VHSER11 WTH WTCH2CH3 로 지칭되었으며, 이들은 모두 상기 구조체와 동일한 서열을 갖는다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되며, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 95
2H7 scFv VH L11S (CSS-S) H WCH2 WCH3
이 구조체는 실시예 33에 기술된 바와 같이 루이신이 세린으로 바뀐, 중쇄 가변 부위의 11번 아미노산 잔기에서 점 돌연변이를 갖는 2H7 (항-CD20) 단일쇄 Fv 결합 부위를 가진다. 이 결합 부위는 실시예 13에 기술된 방법에 따라 제2 및 제3 시스테인이 세린으로 바뀌고 프롤린이 세린 (CSS-S)으로 바뀐 돌연변이 인간 IgG1 연결 부위에 결합된다. 이 연결 부위는 실시예 1에 기재된 야생형 인간 IgG1 CH2 및 CH3 불변 부위에 결합한다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되며, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 96
G28-1 scFv VH L11S (SCS-S) H WCH2 WCH3
이 구조체는 실시예 35에 기술된 바와 같이 루이신이 세린으로 바뀐, 중쇄 가변 부위의 11번 아미노산 잔기에서 점 돌연변이를 갖는 G28-1 (항-CD37) 단일쇄 Fv 결합 부위를 가진다. 이 결합 부위는 실시예 13에 기술된 방법에 따라 제1 및 제3 시스테인이 세린으로 바뀌고 프롤린이 세린 (SCS-S)으로 바뀐 돌연변이 인간 IgG1 연결 부위에 결합된다. 이 연결 부위는 실시예 1에 기재된 야생형 인간 IgG1 CH2 및 CH3 불변 부위에 결합한다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되며, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 97
G28-1 scFv VH L11S (CCS-P) H WCH2 WCH3
이 구조체는 실시예 35에 기술된 바와 같이 루이신이 세린으로 바뀐, 중쇄 가변 부위의 11번 아미노산 잔기에서 점 돌연변이를 갖는 G28-1 (항-CD37) 단일쇄 Fv 결합 부위를 가진다. 이 결합 부위는 실시예 22에 기술된 방법에 따라 제3 시스테인이 세린 (CCS-P)으로 바뀐 돌연변이 인간 IgG1 연결 부위에 결합된다. 이 연결 부위는 실시예 1에 기재된 야생형 인간 IgG1 CH2 및 CH3 불변 부위에 결합한다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되며, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 98
G28-1 scFv VH L11S (SCC-P) H WCH2 WCI13
이 구조체는 실시예 35에 기술된 바와 같이 루이신이 세린으로 바뀐, 중쇄 가변 부위의 11번 아미노산 잔기에서 점 돌연변이를 갖는 G28-1 (항-CD37) 단일쇄 Fv 결합 부위를 가진다. 이 결합 부위는 실시예 32에 기술된 방법에 따라 제1 시스테인이 세린 (SCC-P)으로 바뀐 돌연변이 인간 IgG1 연결 부위에 결합된다. 이 연결 부위는 실시예 1에 기재된 야생형 인간 IgG1 CH2 및 CH3 불변 부위에 결합한다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되며, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 99
G28-1 scFv VH L11S MIGE CH2 CH3 CH4
이 구조체는 실시예 35에 기술된 바와 같이 루이신이 세린으로 바뀐, 중쇄 가변 부위의 11번 아미노산 잔기에서 점 돌연변이를 갖는 G28-1 (항-CD37) 단일쇄 Fv 결합 부위를 가진다. 이 결합 부위는 실시예 39에 기술된 방법을 이용하여 야생형 마우스 IgE CH2 CH3 및 CH4 부위에 결합한다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되며, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 100
G28-1 scFv VH L11S MIGAH WIGACH2 T4CH3
이 구조체는 실시예 35에 기술된 바와 같이 루이신이 세린으로 바뀐, 중쇄 가변 부위의 11번 아미노산 잔기에서 점 돌연변이를 갖는 G28-1 (항-CD37) 단일쇄 Fv 결합 부위를 가진다. 이 결합 부위는 실시예 39에 기술된 바와 같이 마우스 IgA 의 연결 부위에 결합한다. 이 연결 부위는 실시예 39에 기술된 바와 같이 야생형 CH2 부위 및 잔기들에서 4개의 아미노산 단절이 존재하는 돌연변이된 CH3 부위로 이루어진 마우스 IgA 불변 부위에 결합한다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되며, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 101
G28-1 scFv VH L11S HIGE CH2 CH3 CH4
이 구조체는 실시예 35에 기술된 바와 같이 루이신이 세린으로 바뀐, 중쇄 가변 부위의 11번 아미노산 잔기에서 점 돌연변이를 갖는 G28-1 (항-CD37) 단일쇄 Fv 결합 부위를 가진다. 이 결합 부위는 실시예 38에 기술된 바와 같이 CH2, CH3 및 CH4를 함유하는 야생형 인간 IgE 불변 부위에 결합한다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되며, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 102
G28-1 scFv VH L11S HIGAH WIGACH2 T4CH3
이 구조체는 실시예 35에 기술된 바와 같이 루이신이 세린으로 바뀐, 중쇄 가변 부위의 11번 아미노산 잔기에서 점 돌연변이를 갖는 G28-1 (항-CD37) 단일쇄 Fv 결합 부위를 가진다. 이 결합 부위는 실시예 5에 기술된 바와 같이 인간 IgA의 연결 부위에 결합한다. 이 연결 부위는 실시예 13에 기술된 바와 같이 야생형 CH2 부위 및 3' 정지 코돈 이전에 4개의 아미노산 잔기들의 단절이 존재하는 돌연변이된 CH3 부위로 이루어진 마우스 IgA 불변 부위에 결합한다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되며, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 103
HD37 scFv IGAH WCH2 WCH3
HD37 scFv 를 Novagen-Ig 군 프라이머 세트, TOPO 클로닝 및 시퀀싱 및 소잉(sewing) PCR 분석을 이용하여 HD37 하이브리도마로부터 클로닝하였다. 소잉 전에 초기 PCR 반응에서, TOPO 클론 주형 HD37 VH C-1 및 HD37 KVL B-9 를 94C 30 초; 55C, 30 초; 72C, 25 사이클 동안 30초의 증폭 프로파일을 갖는 1:100으로 사용하였다. 2차 SEWING PCR 반응을 위한 주형을 제공하기 위해, 1차 반응 산물을 겔 정제, QIAQUICK 정제하고, 용출물을 50배 희석하였다. 1 ㎕인 각각의 VL 및 VH 중첩되는 주형을 하기 프로파일의 PCR 반응에 첨가하였다: 94C, 60 초, 55C, 60 초, 72C, 60 초; 30 사이클. 두 사이클 후, 기계를 멈추고 플랭킹(flanking) 5'VL 및 3'VH 프라이머를 각각 25 pmol로 반응에 첨가하고 PCR 반응을 재개하였다. PCR 산물을 겔 상에서 750-800 bp 단편의 존재에 대해 확인하였고, 반응 산물을 QIQUICK 정제하고 pD18 Ig 발현 벡터로의 삽입을 위해 적절한 제한 효소로 절단하였다.
고유의 선도 펩티드(native leader peptide)를 갖는 VE 도메인과 글리서 링커(glyser linker) 일부의 PCR:
5' 프라이머: 5'-gttgttaagcttgccgccatggagacagacacactcctgctatgg-3'(서열 번호 )
3' 프라이머:
5'-gccacccgacccaccaccgcccgagccaccgccacctttgatttccagcttggtgcctcc-3'(서열 번호 )
선도 펩티드가 없는 VL 도메인 (SaII 부위) 및 글리서 링커 일부의 PCR:
5' 프라이머: 5'-gttgttgtcgacattgtgctgacccaatctcca-3'(서열 번호 )
3' 프라이머:
5'-gccacccgacccaccaccgcccgagccaccgccaccmgatttccagcttggtgcctcc-3'(서열 번호 )
글리서 링커의 일부 및 Ig 꼬리와의 융합을 위한 BclI 부위를 갖는 VH 도메인의 PCR:
5' 프라이머:
5'-tcgggcggtggtgggtcgggtggcggcggatcgtcacaggttcagctgcagcagtctgg-3'(서열 번호)
3' 프라이머: 5'-tcagtgctgatcagaggagacggtgactgaggttccttg-3'(서열 번호 )
이 결합 부위는 실시예 5에 기술된 바와 같이 야생형 인간 IgA 연결 부위 및 야생형 인간 IgG CH2 및 CH3 불변 부위에 연결된다. 이 연결 부위는 실시예 1에 기술된 바와 같이 야생형 인간 IgG1 CH2 및 CH3 불변 부위에 결합한다. 이 구조체는 이전에 HD37 scFv-IgAHWTG1C 및 HD37-IgAHWTG1C 로 지칭되었으며, 이들은 모두 상기 구조체와 동일한 서열을 갖는다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되며, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 104
HD37 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3
이 구조체는 실시예 103에 기술된 바와 같이 HD 37 단일쇄 Fv 를 가진다. 이 결합 부위는 모든 시스테인 및 하나의 프롤린이 실시예 5에 기술된 방법에 따라 세린 (SSS-S)으로 바뀐 돌연변이된 인간 IgG1 연결 부위에 연결된다. 이 연결 부위는 실시예 1에 기재된 야생형 인간 IgG1 CH2 및 CH3 불변 부위에 결합한다. 이 구조체는 이전에 HD37- MHWTG1C 및 HD37 scFv-IgMHWTG1C 로 지칭되었으며, 이들은 모두 상기 구조체와 동일한 서열을 갖는다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되며, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 105
HD37 scFv VH L11S (SSS-S) H WCH2 WCH3
이 구조체는 실시예 50에 기술된 방법에 따라 루이신이 세린으로 바뀐, 아미노산 잔기 11번에서 중쇄 가변 부위에 돌연변이를 갖는 HD 37 단일쇄를 가진다. 이 결합 부위는 모든 시스테인 및 하나의 프롤린이 실시예 5에 기술된 방법에 따라 세린 (SSS-S)으로 바뀐 돌연변이된 인간 IgG1 연결 부위에 연결된다. 이 연결 부위는 실시예 1에 기재된 야생형 인간 IgG1 CH2 및 CH3 불변 부위에 결합한다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되며, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 106
L6 scFv IGAH WCH2 WCH3
L6 scFv를 Tissue Antigens Paper(1996)에 기술된 앵커-테일링(anchor-tailing) 방법을 이용하여 L6 하이브리도마 (I Hellstrom)로부터 클로닝하였다. PCR 프로파일은 94C, 1분; 50C, 2분; 72C, 2분; 35 사이클이었다. 일단 4개 이상의 TOPO 클론으로부터 VL 및 VH 부위에 대해 컨센서스 서열이 수득되면, 프라이머를SEWING PCR 반응 이전에 PCR 반응을 위해 하기와 같이 정렬하였다: 소잉 전에 초기 PCR 반응에서, TOPO 클론된 주형 L6VK 및 L6VH 를 94C 30 초; 55C, 30 초; 72C, 25 사이클 동안 30초의 증폭 프로파일을 갖는 1:100으로 사용하였다. 2차 SEWING PCR 반응을 위한 주형을 제공하기 위해, 1차 반응 산물을 겔 정제, QIAQUICK 정제하고, 용출물을 50배 희석하였다. 1 ㎕인 각각의 VL 및 VH 중첩되는 주형을 하기 프로파일의 PCR 반응에 첨가하였다: 94C, 60 초, 55C, 60 초, 72C, 60 초; 30 사이클. 두 사이클 후, 기계를 멈추고 플랭킹(flanking) 5'VL 및 3'VH 프라이머를 각각 25 pmol로 반응에 첨가하고 PCR 반응을 재개하였다. PCR 산물을 겔 상에서 750-800 bp 단편의 존재에 대해 확인하였고, 반응 산물을 QIQUICK 정제하고 pD18 Ig 발현 벡터로의 삽입을 위해 적절한 제한 효소로 절단하였다.
고유의 선도 펩티드(native leader peptide)를 갖는 VE 도메인과 글리서 링커(glyser linker) 일부의 PCR:
L6VLHindIII: 5'-gttgttaagcttgccgccatggattttcaagtgcagattttcagcttc-3'(서열 번호)
L6VLLK3:
5'- gccacccgacccaccaccgcccgagccaccgccaccagagagctctttcagctccagcttggt-3'
선도 펩티드가 없는 VL 도메인 (SaII 부위) 및 글리서 링커 일부의 PCR:
5' 프라이머: 5'-gttgttgtcgacattgttctctcccagtctccagcaatcctgtctg-3'(서열 번호 )
3' 프라이머:
5'-gccacccgacccaccaccgcccgagccaccgccaccagagagctctttcagctccagcttggt-3'(서열 번호 )
글리서 링커의 일부 및 Ig 꼬리와의 융합을 위한 BclI 부위를 갖는 VH 도메인의 PCR:
5': 5'-tcgggcggtggtgggtcgggtggcggcggatctctgcagatccagttggtgcagtct-3'(서열 번호)
3'Bcl: 5'-tcagtgctgatcagaggagactgtgagagtggtgccttg-3'(서열 번호)
이 결합 부위는 실시예 5에 기술된 바와 같이 야생형 인간 IgA 연결 부위 및 야생형 인간 IgG CH2 및 CH3 불변 부위에 연결된다. 이 연결 부위는 실시예 1에 기술된 바와 같이 야생형 인간 IgG1 CH2 및 CH3 불변 부위에 결합한다. 이 구조체는 이전에 L6 scFv IgAHWTG1C 로 지칭되었으며, 이들은 모두 상기 구조체와 동일한 서열을 갖는다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되며, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 107
L6 scFv VHL11S (SSS-S) H WCH2 WCH3
이 구조체는 실시예 49에 기술된 방법에 따라 루이신이 세린으로 바뀐 아미노산 잔기 11번에서 중쇄 가변 부위에 돌연변이를 갖는 L6 단일쇄 Fv 를 가진다. 이 결합 부위는 모든 시스테인 및 하나의 프롤린이 실시예 5에 기술된 방법에 따라 세린 (SSS-S)으로 바뀐 돌연변이된 인간 IgG1 연결 부위에 연결된다. 이 연결 부위 는 실시예 1에 기재된 야생형 인간 IgG1 CH2 및 CH3 불변 부위에 결합한다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되며, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 108
2H7 scFv-LLAMA IGG1
이 구조체는 실시예 1에 기재된 2H7 (항-CD20) 단일쇄 Fv 결합 부위를 가진다. 이 결합 부위는 실시예 10에 기술된 방법에 따라 라마 IgG1 힌지, CH2 및 CH3 부위에 결합한다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되며, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 109
2H7 scFv-LLAMA IGG2
이 구조체는 실시예 1에 기재된 2H7 (항-CD20) 단일쇄 Fv 결합 부위를 가진다. 이 결합 부위는 실시예 10에 기술된 방법에 따라 라마 IgG2 힌지, CH2 및 CH3 부위에 결합한다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되며, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 110
2H7 scFv-LLAMA IGG3
이 구조체는 실시예 1에 기재된 2H7 (항-CD20) 단일쇄 Fv 결합 부위를 가진다. 이 결합 부위는 실시예 10에 기술된 방법에 따라 라마 IgG3 힌지, CH2 및 CH3 부위에 결합한다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되며, 코딩된 폴리 펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 111
CD16 LOW (ED)(SSS-S) H P238SCH2 WCH3
이 구조체는 실시예 43에 기술된 바와 같이 세포외의, CD16 저 친화도 대립 유전자 결합 도메인을 가진다. 이 결합 부위는 모든 시스테인 및 하나의 프롤린이 실시예 5에 기술된 방법에 따라 세린 (SSS-S)으로 바뀐 돌연변이된 인간 IgG1 연결 부위에 연결된다. 이 힌지 부위는 돌연변이된 인간 IgG1 CH2 부위 및 야생형 인간 IgG1 CH3 부위에 결합된다. 잔기 238번에서 프롤린이 세린으로 바뀐 P238S 돌연변이는 실시예 70에 기술된 방법에 따라 도입된다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되며, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 112
CD16-9 HIGH (ED)(SSS-S) H P238SCH2 WCH3
이 구조체는 실시예 43에 기술된 바와 같이 세포외의, CD16 저 친화도 대립 유전자 결합 도메인을 가진다. 이 결합 부위는 모든 시스테인 및 하나의 프롤린이 실시예 5에 기술된 방법에 따라 세린 (SSS-S)으로 바뀐 돌연변이된 인간 IgG1 연결 부위에 연결된다. 이 힌지 부위는 돌연변이된 인간 IgG1 CH2 부위 및 야생형 인간 IgG1 CH3 부위에 결합된다. 잔기 238번에서 프롤린이 세린으로 바뀐 P238S 돌연변이는 실시예 70에 기술된 방법에 따라 도입된다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되며, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 113
2e12 scFv (SSS-S)H P238SCH2 WCH3-hCD80TM/CT
이 구조체는 실시예 12에 기술된 2e12 (항-CD28) 단일쇄 Fv 결합 부위를 가진다. 이 결합 부위는 모든 시스테인 및 하나의 프롤린이 실시예 5에 기술된 방법에 따라 세린 (SSS-S)으로 바뀐 돌연변이된 인간 IgG1 연결 부위에 연결된다. 이 힌지 부위는 돌연변이된 인간 IgG1 CH2 부위 및 야생형 인간 IgG1 CH3 부위에 결합된다. 잔기 238번에서 프롤린이 세린으로 바뀐 P238S 돌연변이는 실시예 70에 기술된 방법에 따라 도입된다. CH3 부위는 인간 CD80 투과막 및 세포질성 꼬리 부위 (hCD80 TM/CT)에 결합한다. hCD80 TM/CT 를 실시예 12에 기술된 방법에 따라 BJAB 세포주에서 유도된 무작위 프라임 cDNA를 이용하여 클로닝하였다. 이 TM/CT 부위를 오픈 리딩 프레임(open reading frame, ORF)을 갖는 Ig CH3에 결합하였다. 관심의 대상인 scFvIg 구조체의 오픈 리딩 프레임 버전은 상기 꼬리 중 각각 ORF를 갖는 -Ig 꼬리의 가용성 버전으로 대체하여 만들어진다. PCR 프라이머는 신규한 -Ig 카세트의 3' 말단에 정지 코돈을 삭제하고 하나 이상의 제한 부위를 추가하는 가용성 -Ig 꼬리의 기존 클론에 대해 고안된다. 바람직한 투과막 및 세포질성 꼬리 서열은 이후 이 신규한 -Ig 카세트에 하향으로 서브클로닝될 수 있다. 각 구조체는 PCR 반응을 위해 꼬리의 가용성 버전을 증폭하는데 사용되는 기존의 이용가능한 5' BCLI 올리고뉴클레오티드를 이용하였다. 3' 올리고뉴클레오티드는 정지 코돈을 세포자멸의 조절과 관련된 단백질 도메인에 대한 코딩 부위에 융합된 프레임외 제한 부위로 대체한다.
PCR 증폭을 25 pmol의 각 프라이머, 표준 PCR 시약, 및 다양한 부피의 클론 된 도메인 또는 PPMC, 비장, 또는 흉선 ROSA에서 수득된 cDNA로 수행하였다. 상기 반응은 94C, 60초; 55C, 60초; 72C, 2 분, 35 사이클의 사이클 프로파일을 사용하였다. IgG ORE 에 대한 프라이머는 하기에 열거하였다.
5'프라이머:
5'-gttgtagatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatctccaccstccccagcacctgaactcctggg ggaccgtcagtcttcc-3'(서열 번호 )
3' 프라이머:
5'-gttgttttcgaaggatccgctttacccgggagcagggagaggctcttctgcgtgtagtg-3'(서열 번호)
폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되며, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 114
10A8 scFv (SSS-S)H P238SCH2 WCH3-HCD80TM/CT
이 구조체는 실시예 12에서 기재되어 있는 10A8 (항-CD2152) 단일쇄 Fv 결합 부위를 갖는다. 이 결합 부위는 모든 시스테인 및 하나의 프롤린이 실시예 5에서 기재되어 있는 방법에 따라 세린(SSS-S)으로 바뀐 돌연변이의 인간 IgG1 연결 부위에 연결된다. 이 힌지 부위는 돌연변이의 인간 IgG1 CH2 부위 및 야생형 인간 IgG1 CH3 부위에 연결된다. 잔기 238번의 프롤린이 세린으로 바뀐, P238S 돌연변이가 실시예 70에서 기재되어 있는 방법에 따라 도입된다. 이 CH3 부위는 실시예 113에서 기재되어 있는 방법에 따라 hCD80 TM/CT에 연결된다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 115
40.2.220 scFv (SSS-S)H P238SCH2 WCH3-HCD80TM/CT
이 구조체는 실시예 12에서 기재되어 있는 40.2.220 (항-CD40) 단일쇄 Fv 결합 부위를 갖는다. 이 결합 부위는 모든 시스테인 및 하나의 프롤린이 실시예 5에서 기재되어 있는 방법에 따라 세린(SSS-S)으로 바뀐, 돌연변이의 인간 IgG1 연결 부위에 연결된다. 이 힌지 부위는 돌연변이의 인간 IgG1 CH2 부위 및 야생형 인간 IgG1 CH3 부위에 연결된다. 잔기 238번의 프롤린이 세린으로 바뀐, P238S 돌연변이가 실시예 70에서 기재되어 있는 방법에 따라 도입된다. 이 CH3 부위는 실시예 113에서 기재되어 있는 방법에 따라 hCD80 TM/CT에 연결된다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 116
2H7 scFv (SSS-S)H P238SCH2 WCH3-HCD80TM/CT
이 구조체는 실시예 1에서 기재되어 있는 2H7 (항-CD20) 단일쇄 Fv 결합 부위를 갖는다. 이 결합 부위는 모든 시스테인 및 하나의 프롤린이 실시예 5에서 기재되어 있는 방법에 따라 세린(SSS-S)으로 바뀐, 돌연변이의 인간 IgG1 연결 부위에 연결된다. 이 힌지 부위는 돌연변이의 인간 IgG1 CH2 부위 및 야생형 인간 IgG1 CH3 부위에 연결된다. 잔기 238번의 프롤린이 세린으로 바뀐, P238S 돌연변이가 실시예 70에서 기재되어 있는 방법에 따라 도입된다. 이 CH3 부위는 실시예 113에서 기재되어 있는 방법에 따라 hCD80 TM/CT에 연결된다. 이 구조체는 앞서 :로서 언급되었다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 117
G19-4 scFv (SSS-S)H P238SCH2 WCH3-HCD80TM/CT
이 구조체는 실시예 29에서 기재되어 있는 G19 (항-CD3) 단일쇄 Fv 결합 부위를 갖는다. 이 결합 부위는 모든 시스테인 및 하나의 프롤린이 실시예 5에서 기재되어 있는 방법에 따라 세린(SSS-S)으로 바뀐, 돌연변이의 인간 IgG1 연결 부위에 연결된다. 이 힌지 부위는 돌연변이의 인간 IgG1 CH2 부위 및 야생형 인간 IgG1 CH3 부위에 연결된다. 잔기 238번의 프롤린이 세린으로 바뀐, P238S 돌연변이가 실시예 70에서 기재되어 있는 방법에 따라 도입된다. 이 CH3 부위는 실시예 113에서 기재되어 있는 방법에 따라 hCD80 TM/CT에 연결된다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 118
2E12 scFv (SSS-S)H WCH2 WCH3-HCD80TM/CT
이 구조체는 실시예 12에서 기재되어 있는 2el2 (항-CD28) 단일쇄 Fv 결합 부위를 갖는다. 이 결합 부위는 모든 시스테인 및 하나의 프롤린이 실시예 5에서 기재되어 있는 방법에 따라 세린(SSS-S)으로 바뀐, 돌연변이의 인간 IgG1 연결 부위에 연결된다. 이 연결 부위는 실시예 1에서 기재되어 있는 바와 같이 야생형 인간 IgG1 CH2 및 CH3 불변 부위에 연결된다. 잔기 238번의 프롤린이 세린으로 바뀐, P238S 돌연변이가 실시예 70에서 기재되어 있는 방법에 따라 도입된다. 이 CH3 부위는 실시예 113에서 기재되어 있는 방법에 따라 hCD80 TM/CT에 연결된다. 이 구조체는 앞서 2e12 scFv IgG WTHWTHCH3CH2-CD80으로서 언급되었고, 이는 상기 구조체와 동일한 서열을 갖는다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 119
2E12 scFv IGAH IGACH2 T4CH3-HCD80TM/CT
이 구조체는 실시예 12에서 기재되어 있는 2el2 (항-CD28) 단일쇄 Fv 결합 부위를 갖는다. 이 결합 부위는 실시예 5에서 기재되어 있는 바와 같이 인간 IgA 유래의 연결 부위에 연결된다. 이 연결 부위는 실시예 13에서 기재되어 있는 바와 같이 3' 정지 코돈 앞의 4 아미노산 잔기가 절단된, 야생형 CH2 부위 및 돌연변이 CH3 부위로 이루어진 인간 IgA 불변 부위에 연결된다. 이 CH3 부위는 실시예 113에서 기재되어 있는 방법에 따라 hCD80 TM/CT에 연결된다. IgA ORF를 생성하기 위하여 사용된 특정 프라이머는 하기와 같다.
5'프라이머: 5'-gttgttgatcagccagttccctcaactccacctacc-3'(서열 번호 )
3'프라이머: 5'- gttgttttcgaaggatccgcgtccacctccgccatgacaacaga(서열 번호 )
폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 120
2E12 scFv IGE CH2CH3CH4-HCD80TM/CT
이 구조체는 실시예 12에서 기재되어 있는 2el2 (항-CD28) 단일쇄 Fv 결합 부위를 갖는다. 이 결합 부위는 실시예 38에서 기재되어 있는 바와 같이, CH2, CH3 및 CH4를 함유하는 인간 IgE 불변 부위에 연결된다. 이 CH4 부위는 특히 실시예 113에서 기재되어 있는 방법에 따라 hCD80 TM/CT에 연결된다. IgE ORF를 생성하기 위한 특정 프라이머는 하기와 같다.
5'프라이머: 5'-gttgttgatcacgtctgctccagggacttcacc-3'(서열 번호)
3'프라이머: 5'-gttgttttcgaaggatccgctttaccagatttacagacaccgctcgctg-3'(서열 번호)
폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 121
2E12 scFv (SSS-S)H P238SCH2 WCH3-MFADD-TM/CT
이 구조체는 실시예 12에서 기재되어 있는 2el2 (항-CD28) 단일쇄 Fv 결합 부위를 갖는다. 이 결합 부위는 모든 시스테인 및 하나의 프롤린이 실시예 5에서 기재되어 있는 방법에 따라 세린(SSS-S)으로 바뀐, 돌연변이의 인간 IgG1 연결 부위에 연결된다. 이 힌지 부위는 돌연변이의 인간 IgG1 CH2 부위 및 야생형 인간 IgG1 CH3 부위에 연결된다. 잔기 238번의 프롤린이 세린으로 바뀐, P238S 돌연변이가 실시예 70에서 기재되어 있는 것과 동일한 방법에 따라 도입된다. 이 CH3 부위는 마우스의 경막 FADD 및 세포질 꼬리 부위(mFADD TM/CT)에 연결된다. 이 부위는 특히 실시예 113에서 기재되어 있는 방법을 사용하여 클로닝된다. 이 도메인은 마우스의 비장 RNA 유래인 무작위로 프라이밍된 cDNA로부터 PCR 증폭된다. 이 특정 프라이머는 하기와 같다.
5'프라이머: 5'-gttgtggatccttogaacccattcotggtgctgctgoactcgctg-3'(서열 번호)
3'프라이머: 5'-gttgttatcgatctcgagtcagggtgtttctgaggaagacacagt-3'(서열 번호)
마우스 IgG ORF를 생성하기 위해 사용된 특정 프라이머는 하기와 같다.
5'프라이머: 5'-gttgtagatctggagcccagagggcccacaatcaagccctctcctccaagcaaaag
ccca-3'(서열 번호)
3'프라이머: 5'-gttgttttcgaaggatccgctttacccggagtccgggagaag-3'(서열 번호)
폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 122
2E12 scFv (SSS-S)H WCH2 WCH3-MFADD-TM/CT
이 구조체는 실시예 12에서 기재되어 있는 2el2 (항-CD28) 단일쇄 Fv 결합 부위를 갖는다. 이 결합 부위는 모든 시스테인 및 하나의 프롤린이 실시예 5에서 기재되어 있는 방법에 따라 세린(SSS-S)으로 바뀐, 돌연변이의 인간 IgG1 연결 부위에 연결된다. 이 연결 부위는 실시예 1에서 기재되어 있는 바와 같이 야생형 인간 IgG1 CH2 및 CH3 불변 부위에 연결된다. 이 CH3 부위는 실시예 113 및 121에서 기재되어 있는 방법에 따라 mFADD TM/TM 부위에 연결된다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 123
2E12 scFv (SSS-S)H WCH2 WCH3-MCASP3-TM/CT
이 구조체는 실시예 12에서 기재되어 있는 2el2 (항-CD28) 단일쇄 Fv 결합 부위를 갖는다. 이 결합 부위는 모든 시스테인 및 하나의 프롤린이 실시예 5에서 기재되어 있는 방법에 따라 세린(SSS-S)으로 바뀐, 돌연변이의 인간 IgG1 연결 부위에 연결된다. 이 연결 부위는 실시예 1에서 기재되어 있는 바와 같이 야생형 인간 IgG1 CH2 및 CH3 불변 부위에 연결된다. 이 CH3 부위는 실시예 113 및 121에서 기재되어 있는 방법에 따라 마우스의 casp3 경막 및 세포질 꼬리 부위에 연결된다. 이 mcasp3 TM/CT 부위를 분리하기 위해 사용되는 특정 프라이머는 하기와 같다.
5'프라이머: 5'-gttgttggatccttcgaacatggagaacaacaaaacctcagtggattca-3'(서열 번호)
3'프라이머: 5'-gttgttatcgatctcgagctagtgataaaagtacagttctttcgt-3'(서열 번호)
폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 124
2E12 scFv (SSS-S)H P238SCH2 WCH3-MCASP3-TM/CT
이 구조체는 실시예 12에서 기재되어 있는 2el2 (항-CD28) 단일쇄 Fv 결합 부위를 갖는다. 이 결합 부위는 모든 시스테인 및 하나의 프롤린이 실시예 5에서 기재되어 있는 방법에 따라 세린(SSS-S)으로 바뀐, 돌연변이의 인간 IgG1 연결 부위에 연결된다. 이 힌지 부위는 돌연변이의 인간 IgG1 CH2 부위 및 야생형 인간 IgG1 CH3 부위에 연결된다. 잔기 238번의 프롤린이 세린으로 바뀐, P238S 돌연변이가 실시예 70에 기재되어 있는 방법에 따라 도입된다. 실시예 113, 121 및 123에서 기재되어 있는 방법에 따라, 이 CH3 부위는 mcasp3 TM/CT 부위에 연결된다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 125
2E12 scFv (SSS-S)H WCH2 WCH3-MCASP8-TM/CT
이 구조체는 실시예 12에서 기재되어 있는 2el2 (항-CD28) 단일쇄 Fv 결합 부위를 갖는다. 이 결합 부위는 모든 시스테인 및 하나의 프롤린이 실시예 5에서 기재되어 있는 방법에 따라 세린(SSS-S)으로 바뀐, 돌연변이의 인간 IgG1 연결 부위에 연결된다. 이 연결 부위는 실시예 1에서 기재되어 있는 바와 같이 야생형 인간 IgG1 CH2 및 CH3 불변 부위에 연결된다. 이 CH3 부위는 특히 실시예 113 및 121에서 기재되어 있는 방법에 따라 마우스의 casp8 경막 및 세포질 꼬리 부위(mcasp8 TM/CT)에 연결된다. 이 mcasp8 TM/CT를 클로닝하기 위하여 사용된 특정 프라이머는 하기와 같다.
5'프라이머: 5'-gttgtttcgaacatggatttccagagttgtctttatgctattgctg-3'(서열 번호)
3'프라이머: 5'-gttgttatcgatctcgagtcattagggagggaagaagagcttcttccg-3'(서열 번호)
폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 126
2EI2 scFv (SSS-S)H P238SCH2 WCH3-MCASP8-TM/CT
이 구조체는 실시예 12에서 기재되어 있는 2el2 (항-CD28) 단일쇄 Fv 결합 부위를 갖는다. 이 결합 부위는 모든 시스테인 및 하나의 프롤린이 실시예 5에서 기재되어 있는 방법에 따라 세린(SSS-S)으로 바뀐, 돌연변이의 인간 IgG1 연결 부위에 연결된다. 이 힌지 부위는 돌연변이의 인간 IgG1 CH2 부위 및 야생형 인간 IgG1 CH3 부위에 연결된다. 잔기 238번의 프롤린이 세린으로 바뀐, P238S 돌연변이가 실시예 70에 기재되어 있는 방법에 따라 도입된다. 실시예 113, 121 및 125에서 기재되어 있는 방법에 따라, CH3 부위는 mcasp8 TM/CT 부위에 연결된다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 127
2E12 scFv (SSS-S)H WCH2 WCH3-HCASP3-TM/CT
이 구조체는 실시예 12에서 기재되어 있는 2el2 (항-CD28) 단일쇄 Fv 결합 부위를 갖는다. 이 결합 부위는 모든 시스테인 및 하나의 프롤린이 실시예 5에서 기재되어 있는 방법에 따라 세린(SSS-S)으로 바뀐, 돌연변이의 인간 IgG1 연결 부 위에 연결된다. 이 연결 부위는 실시예 1에서 기재되어 있는 바와 같이 야생형 인간 IgG1 CH2 및 CH3 불변 부위에 연결된다. 이 CH3 부위는 특히 실시예 113에서 기재되어 있는 방법에 따라 인간의 casp3 경막 및 세포질 꼬리 부위(hcasp3 TM/CT)에 연결된다. 이 hcasp3 TM/CT 부위를 클로닝하기 위해 사용되는 특정 프라이머는 하기와 같다.
5' Primer: 5'-gttgtggatccttcgaacatggagaacactgaaaactcagtggat-3'(서열 번호)
3'Primer:5'-gttgttatogatctogagttagtgataaaaatagagttcttttgtgag-3'
(서열 번호)
폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 128
2E12 scFv (SSS-S)H P238SCH2 WCH3-HCASP3-TM/CT
이 구조체는 실시예 12에서 기재되어 있는 2el2 (항-CD28) 단일쇄 Fv 결합 부위를 갖는다. 이 결합 부위는 모든 시스테인 및 하나의 프롤린이 실시예 5에서 기재되어 있는 방법에 따라 세린(SSS-S)으로 바뀐, 돌연변이의 인간 IgG1 연결 부위에 연결된다. 이 힌지 부위는 돌연변이의 인간 IgG1 CH2 부위 및 야생형 인간 IgG1 CH3 부위에 연결된다. 잔기 238번의 프롤린이 세린으로 바뀐, P238S 돌연변이가 실시예 70에 기재되어 있는 방법에 따라 도입된다. 실시예 113 및 127에서 기재되어 있는 방법에 따라, 이 CH3 부위는 hcasp3 TM/CT 부위에 연결된다. 폴리뉴클레 오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 129
2E12 scFv (SSS-S)H WCH2 WCH3-HCASP8-TM/CT
이 구조체는 실시예 12에서 기재되어 있는 2el2 (항-CD28) 단일쇄 Fv 결합 부위를 갖는다. 이 결합 부위는 모든 시스테인 및 하나의 프롤린이 실시예 5에서 기재되어 있는 방법에 따라 세린(SSS-S)으로 바뀐, 돌연변이의 인간 IgG1 연결 부위에 연결된다. 이 연결 부위는 실시예 1에서 기재되어 있는 바와 같이 야생형 인간 IgG1 CH2 및 CH3 불변 부위에 연결된다. 이 CH3 부위는 실시예 133에서 기재되어 있는 방법에 따라 인간의 casp8 경막 및 세포질 꼬리 부위(hcasp8 TM/CT)에 연결된다. hcasp8 TM/CT 부위를 클로닝하기 위해 사용되는 특정 프라이머는 하기와 같다.
5'프라이머: 5'-gttgtggatccttcgaacatggacttcagcagaaatctttatgat-3'(서열 번호)
3'프라이머: 5'-gttgttatcgatgcatgctcaatcagaagggaagacaagtttttttct-3'(서열 번호)
폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 130
2E12 scFv (SSS-S)H P238SCH2 WCH3-HCASP8-TM/CT
이 구조체는 실시예 12에서 기재되어 있는 2el2 (항-CD28) 단일쇄 Fv 결합 부위를 갖는다. 이 결합 부위는 모든 시스테인 및 하나의 프롤린이 실시예 5에서 기재되어 있는 방법에 따라 세린(SSS-S)으로 바뀐, 돌연변이의 인간 IgG1 연결 부위에 연결된다. 이 힌지 부위는 돌연변이의 인간 IgG1 CH2 부위 및 야생형 인간 IgG1 CH3 부위에 연결된다. 잔기 238번의 프롤린이 세린으로 바뀐, P238S 돌연변이가 실시예 70에 기재되어 있는 방법에 따라 도입된다. 실시예 113 및 129에서 기재되어 있는 방법에 따라, 이 CH3 부위는 hcasp8 TM/CT 부위에 연결된다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 131
1D8 scFv (SSS-S)H P238SCH2 WCH3-HCD80TM/CT
이 구조체는 실시예 25에서 기재되어 있는 1D8 (항-4-1BB) 단일쇄 Fv 결합 부위를 갖는다. 이 결합 부위는 모든 시스테인 및 하나의 프롤린이 실시예 5에서 기재되어 있는 방법에 따라 세린(SSS-S)으로 바뀐, 돌연변이의 인간 IgG1 연결 부위에 연결된다. 이 힌지 부위는 돌연변이의 인간 IgG1 CH2 부위 및 야생형 인간 IgG1 CH3 부위에 연결된다. 잔기 238번의 프롤린이 세린으로 바뀐, P238S 돌연변이가 실시예 70에 기재되어 있는 방법에 따라 도입된다. 실시예 113에서 기재되어 있는 방법에 따라, 이 CH3 부위는 hCD80 TM/CT 부위에 연결된다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 132
1D8 scFv (SSS-S)H WCH2 WCH3-HCD8OTM/CT
이 구조체는 실시예 25에서 기재되어 있는 1D8 (항-4-1BB) 단일쇄 Fv 결합 부위를 갖는다. 이 결합 부위는 모든 시스테인 및 하나의 프롤린이 실시예 5에서 기재되어 있는 방법에 따라 세린(SSS-S)으로 바뀐, 돌연변이의 인간 IgG1 연결 부위에 연결된다. 이 연결 부위는 실시예 1에서 기재되어 있는 바와 같이 야생형 인간 IgG1 CH2 및 CH3 불변 부위에 연결된다. 이 CH3 부위는 실시예 113에서 기재되어 있는 방법에 따라 hCD80 TM/CT 부위에 연결된다. 이 구조체는 앞서 1D8 scFv IgG WTHWTCH2CH3-CD80으로서 언급되었고, 이는 상기 구조체와 동일한 서열을 갖는다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 133
1D8 scFv-MIGAH WIGA CH2 T4CH3-HCD80TM/CT
이 구조체는 실시예 25에서 기재되어 있는 1D8 (항-4-1BB) 단일쇄 Fv 결합 부위를 갖는다. 이 결합 부위는 실시예 5에서 기재되어 있는 바와 같이 인간 IgA 유래의 연결 부위에 연결된다. 이 연결 부위는 실시예 39에서 기재되어 있는 바와 같이 3' 정지 코돈 앞의 4 아미노산 잔기가 절단된, 야생형 CH2 부위 및 돌연변이 CH3 부위로 이루어진 마우스 IgA 불변 부위에 연결된다. 이 CH3 부위는 IgA ORF를 생성하는 프라이머를 사용하여 실시예 113에서 기재되어 있는 방법에 따라 hCD80 TM/CT에 연결된다.
실시예 134
1D8 scFv IGE CH2CH3CH4-HCD80TM/CT
이 구조체는 실시예 25에서 기재되어 있는 1D8 (항-4-1BB) 단일쇄 Fv 결합 부위를 갖는다. 이 결합 부위는 실시예 38에서 기재되어 있는 바와 같이 CH2, CH3 및 CH4를 함유하는 인간 IgE 불변 부위에 연결된다. 이 CH4 부위는 실시예 113 및 120에서 기재되어 있는 방법에 따라 hCD80 TM/CT에 연결된다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 135
1D8 scFv (SSS-S)H P238SCH2 WCH3-MFADD-TM/CT
이 구조체는 실시예 25에서 기재되어 있는 1D8 (항-4-lBB) 단일쇄 Fv 결합 부위를 갖는다. 이 결합 부위는 모든 시스테인 및 하나의 프롤린이 실시예 5에서 기재되어 있는 방법에 따라 세린(SSS-S)으로 바뀐, 돌연변이의 인간 IgG1 연결 부위에 연결된다. 이 힌지 부위는 돌연변이의 인간 IgG1 CH2 부위 및 야생형 인간 IgG1 CH3 부위에 연결된다. 잔기 238번의 프롤린이 세린으로 바뀐, P238S 돌연변이가 실시예 70에서 기재되어 있는 방법에 따라 도입된다. 이 CH3 부위는 실시예 113 및 121에서 기재되어 있는 방법에 따라 mFADD TM/TM에 연결된다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 136
1D8 SCFV (SSS-S)H WCH2 WCH3-MFADD-TM/CT
이 구조체는 실시예 25에서 기재되어 있는 1D8 (항-4-lBB) 단일쇄 Fv 결합 부위를 갖는다. 이 결합 부위는 모든 시스테인 및 하나의 프롤린이 실시예 5에서 기재되어 있는 방법에 따라 세린(SSS-S)으로 바뀐, 돌연변이의 인간 IgG1 연결 부위에 연결된다. 이 연결 부위는 실시예 1에서 기재되어 있는 바와 같이 야생형 인간 IgG1 CH2 및 CH3 불변 부위에 연결된다. 이 CH3 부위는 실시예 113 및 121에서 기재되어 있는 방법에 따라 mFADD TM/TM 부위에 연결된다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 137
1D8 scFv (SSS-S)H WCH2 WCH3-mcasp3-TM/CT
이 구조체는 실시예 25에서 기재되어 있는 1D8 (항-4-lBB) 단일쇄 Fv 결합 부위를 갖는다. 이 결합 부위는 모든 시스테인 및 하나의 프롤린이 실시예 5에서 기재되어 있는 방법에 따라 세린(SSS-S)으로 바뀐, 돌연변이의 인간 IgG1 연결 부위에 연결된다. 이 연결 부위는 실시예 1에서 기재되어 있는 바와 같이 야생형 인간 IgG1 CH2 및 CH3 불변 부위에 연결된다. 이 CH3 부위는 실시예 113, 121 및 123에서 기재되어 있는 방법에 따라 mcasp3 TM/TM 부위에 연결된다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 138
1D8 scFv (SSS-S)H P238SCH2 WCH3-mcasp3-TM/CT
이 구조체는 실시예 25에서 기재되어 있는 1D8 (항-4-lBB) 단일쇄 Fv 결합 부위를 갖는다. 이 결합 부위는 모든 시스테인 및 하나의 프롤린이 실시예 5에서 기재되어 있는 방법에 따라 세린(SSS-S)으로 바뀐, 돌연변이의 인간 IgG1 연결 부위에 연결된다. 이 힌지 부위는 돌연변이의 인간 IgG1 CH2 부위 및 야생형 인간 IgG1 CH3 부위에 연결된다. 잔기 238번의 프롤린이 세린으로 바뀐, P238S 돌연변이가 실시예 70에서 기재되어 있는 방법에 따라 도입된다. 이 CH3 부위는 실시예 113, 121 및 123에서 기재되어 있는 방법에 따라 mcasp3 TM/TM 부위에 연결된다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 139
1DS scFv (SSS-S)H WCH2 WCH3-MCASP8-TM/CT
이 구조체는 실시예 25에서 기재되어 있는 1D8 (항-4-lBB) 단일쇄 Fv 결합 부위를 갖는다. 이 결합 부위는 모든 시스테인 및 하나의 프롤린이 실시예 5에서 기재되어 있는 방법에 따라 세린(SSS-S)으로 바뀐, 돌연변이의 인간 IgG1 연결 부위에 연결된다. 이 연결 부위는 실시예 1에서 기재되어 있는 바와 같이 야생형 인간 IgG1 CH2 및 CH3 불변 부위에 연결된다. 이 CH3 부위는 실시예 113 ,121 및 125에서 기재되어 있는 방법에 따라 mcasp3 TM/TM 부위에 연결된다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 140
1DS scFv (SSS-S)H P238SCH2 WCH3-MCASP8-TM/CT
이 구조체는 실시예 25에서 기재되어 있는 1D8 (항-4-lBB) 단일쇄 Fv 결합 부위를 갖는다. 이 결합 부위는 모든 시스테인 및 하나의 프롤린이 실시예 5에서 기재되어 있는 방법에 따라 세린(SSS-S)으로 바뀐, 돌연변이의 인간 IgG1 연결 부위에 연결된다. 이 힌지 부위는 돌연변이의 인간 IgG1 CH2 부위 및 야생형 인간 IgG1 CH3 부위에 연결된다. 잔기 238번의 프롤린이 세린으로 바뀐, P238S 돌연변이가 실시예 70에서 기재되어 있는 방법에 따라 도입된다. 이 CH3 부위는 실시예 113, 121 및 125에서 기재되어 있는 방법에 따라 mcasp3 TM/TM 부위에 연결된다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 141
1D8 scFv (SSS-S)H WCH2 WCH3-HCASP3-TM/CT
이 구조체는 실시예 25에서 기재되어 있는 1D8 (항-4-lBB) 단일쇄 Fv 결합 부위를 갖는다. 이 결합 부위는 모든 시스테인 및 하나의 프롤린이 실시예 5에서 기재되어 있는 방법에 따라 세린(SSS-S)으로 바뀐, 돌연변이의 인간 IgG1 연결 부위에 연결된다. 이 연결 부위는 실시예 1에서 기재되어 있는 바와 같이 야생형 인간 IgG1 CH2 및 CH3 불변 부위에 연결된다. 이 CH3 부위는 실시예 113 및 127에서 기재되어 있는 방법에 따라 hcasp3 TM/CT에 연결된다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 142
1 D8 scFv (SSS-S)H P238SCH2 WCH3-HCASP3-TM/CT
이 구조체는 실시예 25에서 기재되어 있는 1D8 (항-4-lBB) 단일쇄 Fv 결합 부위를 갖는다. 이 결합 부위는 모든 시스테인 및 하나의 프롤린이 실시예 5에서 기재되어 있는 방법에 따라 세린(SSS-S)으로 바뀐, 돌연변이의 인간 IgG1 연결 부위에 연결된다. 이 힌지 부위는 돌연변이의 인간 IgG1 CH2 부위 및 야생형 인간 IgG1 CH3 부위에 연결된다. 잔기 238번의 프롤린이 세린으로 바뀐, P238S 돌연변이가 실시예 70에서 기재되어 있는 방법에 따라 도입된다. 이 CH3 부위는 실시예 113 및 127에서 기재되어 있는 방법에 따라 hcasp3 TM/CT에 연결된다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 143
1 D8 scFv (SSS-S)H WCH2 WCH3-HCASP8-TM/CT
본 구조체는 실시예 25 에 기재된 1D8 (항-4-1BB) 단일쇄 Fv 결합 영역을 갖는다. 상기 결합 영역은 모든 시스테인 및 하나의 프롤린이 실시예 5 에 기재된 방법에 따라 세린 (SSS-S)으로 바뀐 돌연변이화 인간 IgG1 연결 영역에 연결된다. 상기 연결 영역은 실시예 1 에 기재된 야생형 인간 IgG1 CH2 및 CH3 불변 영역에 부착한다. 상기 CH3 영역은 실시예 113 및 129 에 기재된 방법에 따라 hcasp8 TM/CT 에 부착한다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _ 로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 144
1D8 scFv(SSS-s) H P238SCH2 WCH3-HCASP8-TM/CT
상기 구조체는 실시예 25 에 기재된 1D8 (항-4-1BB) 단일쇄 Fv 결합 영역을 갖는다. 상기 결합 영역은 모든 시스테인 및 하나의 프롤린이 실시예 5 에 기재된 방법에 따라 세린 (SSS-S)으로 바뀐 돌연변이화 인간 IgG1 연결 영역에 연결된다. 상기 힌지 영역은 돌연변이화 인간 IgG1 CH2 영역 및 야생형 인간 IgG1 CH3 영역에 부착한다. 잔기 238 에 있는 프롤린이 세린으로 바뀐 P238S 돌연변이를 실시예 70 에 기재된 방법에 따라 도입하였다. CH3 영역은 실시예 113 및 129 에 기재된 방법에 따라 hcasp8 TM/CT 에 부착한다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _ 로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 145
L6 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3
본 구조체는 실시예 105 에 기재된 L6 scFv 결합 도메인을 갖는다. 상기 결합 영역은 모든 시스테인 및 하나의 프롤린이 실시예 5 에 기재된 방법에 따라 세린 (SSS-S)으로 바뀐 돌연변이화 인간 IgG1 연결 영역에 연결된다. 상기 연결 영역은 실시예 1 에 기재된 야생형 인간 IgG1 CH2 및 CH3 불변 영역에 부착한다. 본 구조체는 L6 scFv-IgMHWTG1C 로서 이미 칭해져있고, 이는 상기 구조체와 동일한 서열을 갖는다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _ 로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 146
2H7 scFv CD154 (L2)
본 구조체는 실시예 1 에 기재된 바와 같은 2H7 (항-CD20) 단일쇄 Fv 결합 영역을 갖는다. 상기 결합 영역은 실시예 4 에 기재된 방법에 따라 CD154 세포외 도메인에 부착되었다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _ 로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 147
2H7 scFv CD154 (S4)
본 구조체는 실시예 1 에 기재된 바와 같은 2H7 (항-CD20) 단일쇄 Fv 결합 영역을 갖는다. 상기 결합 영역은 실시예 4 에 기재된 방법에 따라 CD154 세포외 도메인에 부착되었고, 부착 방법은 실시예 146 에 기재된 구조체와 비교하여 생략된(truncated) 변형체를 발생시켰다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _ 로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 148
CTLA4 IGAH IGA CH2 CH3
본 구조체는 실시예 14 에 기재된 바와 같은 세포외 CTLA-4 결합 영역을 갖는다. 상기 결합 영역은 실시예 5 에 기재된 바와 같은 야생형 인간 IgA 연결 영역에 부착한다. 상기 연결 영역은 실시예 13 에 기재된 방법에 따라 야생형 인간 IgA CH2 및 CH3 불변 영역에 부착한다. 상기 불변 영역은 실시예 13 에 기재된 바와 같은 J-쇄 영역에 부착한다. 본 구조체는 CTLA-4 IgAH IgACH2CH3 로서 이미 칭해져있고, 이는 상기 구조체와 동일한 서열을 갖는다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _ 로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 149
CTLA4 IGAH IGA CH2 T4CH3
본 구조체는 실시예 14 에 기재된 바와 같은 세포외 CTLA-4 결합 영역을 갖는다. 상기 결합 영역은 실시예 5 에 기재된 바와 같은 인간 IgA 로부터 연결 영역에 부착한다. 상기 연결 영역은 실시예 13 에 기재된 바와 같이 3' 중단 코돈 이전에 4 아미노산 잔기의 생략이 있는 돌연변이된 CH3 영역 및 야생형 CH2 영역으로 이루어진 인간 IgA 불변 영역에 부착한다. 상기 구조체는 CTLA-4 IgAH IgA-T4 로서 이미 칭해져있고, 이는 상기 구조체와 동일한 서열을 갖는다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _ 로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 150
2H7 scFv IGAH IGACH2CH3
본 구조체는 실시예 1 에 기재된 바와 같은 2H7 (항-CD20) 단일쇄 Fv 결합 영역을 갖는다. 상기 결합 영역은 실시예 5 에 기재된 바와 같은 야생형 인간 IgA 연결 영역에 부착한다. 상기 연결 영역은 실시예 13 에 기재된 방법에 따른 야생형 인간 IgA CH2 및 CH3 불변 영역에 부착한다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _ 로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 151
2H7 scFv IGAH IGAHCH2 T18CH3
본 구조체는 실시예 1 에 기재된 바와 같은 2H7 (항-CD20) 단일쇄 Fv 결합 영역을 갖는다. 상기 결합 영역은 실시예 5 에 기재된 바와 같은 인간 IgA 연결 영 역에 부착한다. 상기 연결 영역은 실시예 13 에 기재된 바와 같이 3' 중단 코돈 이전에 18 아미노산 잔기의 생략이 있는 돌연변이된 CH3 영역 및 야생형 CH2 영역으로 이루어진 인간 IgA 불변 영역에 부착한다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _ 로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 152
2H7-40.2.220 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3
이중특이 융합 단백질을 2H7 scFv (항-CD20) 및 40.2.220 (항-CD40) 사이에 구성하였다 (상기 둘 모두가 B 세포 수용체를 표적함). 발현 벡터 pD18 에서 2H7 scFv hIgG1 (SSS- S) H WCH2 WCH3 구조체가, BelI 자리에서의 절단을 위해 댐(dam) 박테리아를 통과하였다. 절단된 플라스미드를 알칼리성 포스파타아제로 처리한 후, BelI 절단 연결부(cut linker)-CD40 scFv 분절을 결찰(ligation)해준다. 상기 분절은 현존 40.2.220 scFv 로부터 연속적 PCR 반응에 의해 프라이머를 오버래핑(overlapping)하며 합성되었다. 부착된 연결부는 다수의 라이신 및 글루탐산 잔기가 있는 이미 특허된 (BMS 특허 허여) 나선형 형태의 연결부이다. CD40 에 대한 scFv 는 SalI-BclI 분절로서 리더(leader) 펩티드없이 PCR 증폭되었으나, 꼬리(tail) 은 CD20 에 대한 현존 scFvIg 구조체 (2H7 scFv hIgG 구조체)에 포함되었다. 3' 말단부는 VH 도메인 말단에 있는 VTVSS 형 서열에 융합된 프레임 BclI 자리 밖의 다른 scFv VH 분자와 유사하였다.
PCR 올리고(oligos):
40.2.220 scFv:
5' 프라이머--40.2.220 S5: 5'-gttgttgtcgacattgttctgactcagtctccagccaccct gtc-3'(서열 번호)
3' 프라이머-40.2.220 Bcl3 : 5'-gttgttgatcagagacagtgaccagtgtcccttgg-3'(서열 번호)
연결부 프라이머:
BelI-SalI 분절은 상보성 올리고뉴클레오티드를 어닐링하여 생성시켰다. 그 후, 상기 분절을 SalI-BcII scFv 을 따라 BelI 소화 벡터(digested vector)에 결찰하여, 셔틀링(shuttling)용으로 목적된 (연결부- scFv) BelI 분절을 만들었다.
5' 프라이머: 5'-gatcaatccaactctgaagaagcaaagaaagaggaggccaaaaaggaggaagccaagaaatctaacagcg-3' (서열번호)
3' 프라이머: 5'-tcgacgctgttagatttcttggcttcctcctttttggcctcctctttctttgcttcttcagagttggatt-3' (서열번호)
그 후, 상기 BelI 분절을 pD18-Ig 에서 2H7 scFv 의 하류에 결찰하였다. 변환체는, 추가의 연구 이전에 서열화된 포지티브 클론 및 2.4 kb HindIII-Xba 삽입물의 존재에 대해 스크리닝되었다. 상기 구조물을 사용하여 COS 세포 일시적 트랜스펙션을 실시하고, 배양 상청액을 CD20 및 CD40 트랜스펙션된 CHO 세포에 대한 결합 및 예측한 크기의 단백질의 존재에 대하여 스크리닝하였다.
새로운 이중특이 구조물은, 연결부의 어느 한 말단에 하나 또는 바람직하게 는 두개의 제한 자리를 포함하는 힌지형 연결부를 고안하여 상이한 구조물 사이에서의 (연결부-scFv) 또는 (scFv-연결부) 카세트(cassette)의 이동 및 비대칭적 소화를 용이하게 함으로써 만들어질 수 있다. 또한, 상기 구조물은 VH L11S 및 다른 V 영역 치환부를 포함할 것이고, 이는 아마도 적절한 폴딩(folding)을 용이하게 하고, 이들이 삽입된 분자의 발현을 증가시킬 것이다.
상기 결합 영역은 모든 시스테인 및 하나의 프롤린이 실시예 5 에 기재된 방법에 따라 세린 (SSS-S)으로 바뀐 돌연변이화 인간 IgG1 연결 영역에 연결된다. 상기 연결 영역은 상기 구조물과 동일한 야생형 인간 IgG1 CH2 서열에 부착된다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _ 로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 153
2H7 scFv IGAH IGACH2 T4CH3-HCD80 TM/CT
본 구조체는 실시예 1 에 기재된 바와 같은 2H7 (항-CD20) 단일쇄 Fv 결합 영역을 갖는다. 상기 결합 영역은 실시예 5 에 기재된 바와 같은 인간 IgA 로부터의 연결 영역에 부착한다. 상기 연결 영역은 실시예 13 에 기재된 바와 같이 3' 중단 코돈 이전에 4 아미노산 잔기의 생략이 있는 돌연변이화 CH3 영역 및 야생형 CH2 영역으로 이루어진 인간 IgA 불변 영역에 부착한다. 상기 CH3 영역은 실시예 113 및 119 에 기재된 방법에 따른 hCD80 TM/CT 에 부착된다. 상기 구조체는 상기 구조체와 동일한 서열을 갖는 2H7 scFv IgA 힌지 IgA-T4-CD80 및 2H7 scFv IgAH IgA-T4-CD80 으로 이미 칭해져있다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _ 로 제공 되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 154
G19-4 scFv (CCC-P)WH WCH2WCH3-HCD80 TM/CT
상기 구조체는 실시예 29 에 기재된 G19 (항-CD3) 단일쇄 Fv 결합 영역을 갖는다. 상기 결합 영역은 실시예 1 에 기재된 바와 같은 야생형 인간 IgG1 연결 영역 (CCC-P)에 부착한다. 상기 연결 영역은 실시예 1 에 기재된 바와 같은 야생형 인간 IgG1 CH2 및 CH3 불변 영역에 부착한다. 상기 CH3 영역은 실시예 113 에 기재된 방법에 따른 hCD80 TM/CT 에 부착한다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _ 로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 155
2E12 scFv(CCC-P) WH WCH2 WCH3-HCD80 TM/CT
상기 구조체는 실시예 12 에 기재된 2el2 (항-CD28) 단일쇄 Fv 결합 구영역을 갖는다. 상기 결합 영역은 실시예 1 에 기재된 바와 같은 야생형 인간 IgG1 연결 영역 (CCC-P)에 부착한다. 상기 연결 영역은 실시예 1 에 기재된 바와 같은 야생형 인간 IgG1 CH2 및 CH3 불변 영역에 부착한다. 상기 CH3 영역은 실시예 113 에 기재된 방법에 따른 hCD80 TM/CT 에 부착한다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _ 로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 156
2H7 VHL11S scFv (SSS-S)IGECH3CH4
본 구조체는 실시예 33 에 기재된 바와 같이 류신이 세린으로 바뀐, 중쇄 가 변 영역에서 아미노산 잔기 11 에 포인트 돌연변이를 갖는 2H7 (항-CD20) 단일쇄 Fv 결합 영역을 갖는다. 상기 결합 영역은 모든 시스테인 및 하나의 프롤린이 실시예 5 에 기재된 방법에 따라 세린 (SSS-S)으로 바뀐 돌연변이화 인간 IgG1 연결 영역에 연결된다. 상기 연결 영역은 인간 IgE CH3 및 CH4 불변 영역에 부착된다. 상기 생략된 불변 영역은 실시예 38 에 기재된 방법에 따라 만들어졌다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _ 로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 157
IGD 힌지
대안적인 힌지 영역이 목적 영역을 단리하기 위한 PCR 검정을 사용함으로써 인간 IgD 면역글로불린 힌지 영역으로부터 단리될 수 있다. 상기 PCR 반응은 실시예 1 에 기재된 바와 동일하다. 상기 힌지은 3' 말단에서 6 아미노산 잔기에 의해 생략되었다. 상기 PCR 반응에서 사용된 프라이머는 하기에 열거한다:
5" 프라이머: 5'-GTGGATCCAGGTTCGAAGTCTCCAAAGGCACAGGCC-3' (서열번호)
3' 프라이머: 5'-GTTGI'CGACTGCACCGGTCTTTGTCTCTCTCTCTTC-3' (서열번호)
폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _ 로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 158
HCD28 TM/CT
세포 표면 ORF 구조물의 일부에 대하여, CD80 의 트랜스멤브레인 도메인을 인간 CD28 의 트랜스멤브레인 도메인으로 대체하였다 (이는 CD80 처럼 단량체를 형성하기 보다는 세포 표면에서 이량체를 형성하기 때문임). 아폽토시스 프로그램을 구동하는 몇몇 분자는 신호화 복합체를 형성하기 위하여 올리고머화/3량체화를 필요로 하므로; 세포 표면에서 이들 재조합 수용체의 올리고머화도를 제어함으로써 신호화의 개시를 제어할 수 있는 것이 중요하다.
CD28 꼬리의 PCR 증폭에 사용된 프라이머는 하기이다:
5' 프라이머: 5'-gttgtggatccttcgaaccccttttgggtgctggtggtggttggtgga-3' (서열번호 )
3' 프라이머: 5'-gttgttatcgatctcgagtcaggagcgataggctgcgaagtc-3' (서열번호)
폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _ 로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 159
2H7 scFv VH L11S (SSS-S) H K322L CH2 WCH3
상기 구조물은 실시예 33 에 기재된 바와 같이 류신이 세린으로 바뀐, 중쇄 가변 영역에서 아미노산 잔기 11 에 포인트 돌연변이를 갖는 2H7 (항-CD20) 단일쇄 Fv 결합 영역을 갖는다. 상기 결합 영역은 모든 시스테인 및 하나의 프롤린이 실시예 5 에 기재된 방법에 따라 세린 (SSS-S)으로 바뀐 돌연변이화 인간 IgG1 연결 영역에 연결된다. 상기 연결 영역은 돌연변이화 IgG CH2 영역 및 야생형 IgG CH3 영역에 부착한다. CH2 영역에서의 K322L 돌연변이화는 잔기 322 에서 있고, 여기서, 라이신을 실시예 56 에 기재된 오버래핑 PCR 을 사용하되 첫번째 PCR 반응에 대해 상이한 프라이머를 사용하여 류신으로 바꾸었다. 프라이머는 하기에 열거한다:
5' 프라이머: 5'ttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggaaccctgaggtcac-3' (서열번호)
3' 프라이머: 5'-ggacagtgggagtggcacc-3' (서열번호)
PCR 생성물은 TOPO 벡터로 클로닝되었고, 서열화되었다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _ 로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 160
2H7 scFv VH L11S (CSS-S) H K322L CH2 WCH3
본 구조물은 실시예 33 에 기재된 바와 같이 류신이 세린으로 바뀐, 중쇄 가변 영역에서 아미노산 잔기 11 에 포인트 돌연변이를 갖는 2H7 (항-CD20) 단일쇄 Fv 결합 영역을 갖는다. 상기 결합 영역은 실시예 13 에 기재된 방법에 따라, 제 2 및 제 3 시스테인이 세린으로 바뀌고 프롤린이 세린으로 바뀐 (CSS-S), 돌연변이화 IgG 연결 영역에 부착한다. 상기 연결 영역은 돌연변이화 IgG CH2 영역 및 야생형 IgG CH3 영역에 부착한다. CH2 영역에서 K322L 돌연변이화는 잔기 322 에서 이고, 여기서, 실시예 56 에 기재된 오버래핑 PCR 을 사용하여, 제 1 PCR 반응에서는 실시예 159의 프라이머를, 제 2 PCR 반응에 대하여는 실시예 57 의 프라이머를 사용하여 라이신을 류신으로 바꾸었다.
PCR 생성물은 TOPO 벡터에 클로닝되었고, 서열화되었다. 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 _ 로 제공되고, 코딩된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 _로 제공된다.
실시예 161
2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 및 2H7 scFv (SSS-S) H P238SCH2 WCH3 에 의한 생체내 B 세포 고갈
본 실시예는 CH2 도메인 (2H7 scFv (SSS-S) HP238SCH2 WCH3)에 있는 세린 아미노산 치환에 대해 항-CD20 구조물 (2H7 scFv(SSS-S) H WCH2 WCH3) 및 항-CD20 구조물의 활성과 프롤린의 비교를 통해 B 세포의 고갈에 있어서 ADCC 효과기 메커니즘에 관련한 실험을 기재한다. 도 72 는 이들 구조물에 의한 아폽토시스 도입에 대한 실험 결과를 보여준다. 상기 결과는 두 분자 모두가 CD20 을 결합하고 카스파제 3 의 활성화에 의해 중재되는 아폽토시스를 유도한다는 것을 나타낸다.
도 73 은 항-CD20 구조물이 CD20 포지티브 표적 세포에 대한 CDC 활성을 중재하는 것을 묘사한다. 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 구조물, 2H7 scFv (SSS-S) HP238SCH2 WCH3 구조물, 또는 리툭시맵 (Rituximab)을, 60 분 동안 100 마이크로리터의 부피에서 104 Bjab 표적 세포 및 토끼 보체 (PelFreez)의 1 : 10 희석물과 함께 증가된 농도로 배양하였다. 분취량을 트리판 블루(trypan blue) (Invitrogen)로 염색하고, 혈구측정기 (hemacytometer)를 사용하여 계수하여, 처리 동안에 죽은 세포 수의 백분율을 결정하였다. 세포 및 오직 하나의 시약만을 사용한 네거티브 대조군이 또한 포함되었다. 도 74 는 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 구조물이 말초 혈액 단핵 세포를 이용한 ADCC 에서 효과적임을 묘사한다. 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 또는 리툭시맵의 ADCC 활성을, 효과기 세포로서 신선한 인간 PBMC 를 사용하여 표적 세포로서 BJAB B 임파종 세포주에 대해 생체외 측정하였다. 효과기 대 표적 비는 하기와 같이 변화되었다: 100 : 1, 50 : 1, 및 25 : 1 (웰 당 BJAB 세포의 수는 일정하게 남지만, PBMC 의 수는 다양하게 함). BJAB 세포는 51Cr 을 사용하여 2 시간 동안 표지화되었고, 넓적바닥 96 웰 플레이트의 각 웰에 5x104 세포/웰의 세포 농도로 분취하였다. 정제된 융합 단백질 또는 리툭시맵을 10 ㎍/ml 의 농도로 첨가하고, PBMC 를 최종 부피 200 ㎕ 로 하여, 1.25 x 106 세포/웰 (25:1), 2.5 x 106 세포/웰 (50:1), 또는 5 x 106 세포/웰 (100:1) 로 첨가하였다. 자연 사멸을 구조물 또는 MAb 의 생략에 의해 각 효과기 : 표적 비에서 측정하였다. 자발적 방출을 PBMC 또는 융합 단백질의 첨가 없이 측정하였고, 최대 방출을 적당한 웰에 세제 (1% NP-40)을 첨가함으로써 측정하였다. 반응을 5 시간 동안 배양하고, 100 ㎕ 배양 상청액을 Lumaplate (Packard Instruments)로 수확하고, 하룻밤동안 건조시킨 후, Packard Top Count NXT 마이크로플레이트 섬광 계수기에 방출된 cpm 을 계수하였다. 도 75 는 2H7 scFv (SSS-S)H WCH2 WCH3 구조물이 가용성 CD16 융합 단백질 (높은 혹은 낮은 친화성 대립형질로부터 구축됨 (158V/F))에 결합하고, 2H7 scFv (SSS-S) H P238SCH2 WCH3 구조물은 검출가능한 결합을 나타내지 않는다는 것을 묘사한다. CD20 CHO 세포 (106)를 포화량의 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 또는 2H7 scFv (SSS-S) H P238SCH2 WCH3 (10 ㎍/㎖)로 PBS/2 % FBS 중에서 1 시간 동안 얼음 위에서 배양하였다. 세포를 PBS/2 % FBS 로 세척하고, 1 시간 동안 얼음 위에서 0.5 mg/㎖ FITC-CD16 의 일련의 희석액으로 배양하였다. 세포를 세척하고, Beckman-Coulter Epics C 기계를 사용하여 유세포 분류기에 의해 특이 결합을 측정하였다. 결과는 Expo 분석 소프트웨어를 사용하여 분석하였고, 정규화한 형광 단위를 농도의 함수로 그래프화하였다. 도 76 은 U937 세포에 결합하는 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 및 2H7 scFv (SSS-S) H P238SCH2 WCH3 의 능력에 대한 실험을 묘사한다. CD64 를 발현하는 U937 세포 (106) 를, 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 또는 2H7 scFv (SSS-S) H P238SCH2 WCH3 를 사용하여 1 시간 동안 얼음 위에서 PBS/2% FBS 에서 배양하였다. 세포를 세척하고, 1 : 100 의 최종 희석액으로 FITC-염소 항-인간 IgG1 (Fc 특이) (Caltag)를 사용하여 1 시간 동안 얼음 위에서 배양하였다. 세포를 세척하고, Beckman-Coulter EpicsC 유세포 분류기로 형광 분석하였다. Expo 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고, 형광 강도를 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 또는 2H7 scFv (SSS-S) H P238SCH2 WCH3 의 농도 함수로서 형광 강도를 그래프화하였다. 상기 도면은 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 구조물 및 2H7 scFv (SSS-S) H P238SCH2 WCH3 구조물 모두가 등가의 적정 곡선을 가지고 U937 세포에 결합한다는 것을 보여준다. 상기 결과는 2H7 scFv (SSS-S) H P238SCH2 WCH3 구조물이 고찬화성 Fc 수용체 FcγRI (CD64)에 대한 결합에 있어서 손상되지 않았음을 나타내었다. U937 세포에서 고친화성 FcγRI 에 대한 결합이 이 실험에서 두 분자에 대해 유사하다는 사실은, P238S 아미노산 변화가 FcγRIII 에 대한 결합을 선택적으로 감소시켰음을 나타내었다. 도 77 은, 짧은 꼬리 원숭이에서 B 세포 고갈이 CH2 도메인 돌연변이가 있는 항-CD20 구조물 (2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3) 및 항-CD20) scFv 에 의해 중재되었다는 것을 묘사한다. 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 또는 2H7 scFv(SSS-S) H P238SCH2 WCH3 를 정맥내 주사에 의하여 6 mg/kg 으로 짧은 꼬리 원숭이(M. fasicularis)에 투여하였다 (두 주입물은 1주일 간격으로 투여되었음). B 세포 순환에 대한 효과는, 말초 혈액에서 CD40 포지티브 B 세포의 검출에 의해 측정되었다. 혈액 시료를 7, 0, 1, 3, 7, 8, 10, 14, 28, 및 43 일에 상기 주사한 동물에서 채취하였다. B 세포 고갈은, 원숭이 혈액에 대한 CBC (전 혈액 검사) 및 2색 유세포 분류기 분석을 실시함으로써 추정되었다. CD40, CD19, CD20, IgG, CD3, CD8 에 대한 항체의 FITC 또는 PE 콘쥬게이트를 다양한 조합으로 사용하였다. B 세포의 초기 주사전 시간 정점(point) 수준에 대하여 시간에 대한 밀리리터당 수천 세포로 CD40 포지티브 혈액 B 세포의 수를 표로 만들어서 데이터를 도시하였다. 이 실험은 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 scFv 주사가 두번째 주사 이후 28 일보다 오래 지속된 B 세포 순환의 급속하고 완전한 고갈을 발생시킨다는 것을 보여주었다. 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 scFv 의 주사는, CD20 에피토프가 포화되었을지라도, B 세포를 완전히 고갈시키지 않는다. 초기 수준의 대략 50% 까지 B 세포에서의 느린 감소는 첫번째 2 주 동안 관찰되었으나, B 세포는 이들 동물에서 출발 수준으로 급속히 회복되었다. 이들 결과는, 고친화성 FcγRI 를 결합하는 능력 및 보체 의존성 세포독성을 중재하는 능력이 CytoxB20G 분자가 B 세포 순환을 완전히 고갈하기에는 충분하지 않다는 것 및 CD16 과의 상호작용에 의해 중재되는 ADCC 가 급속하고 지속적인 B 세포 고갈에 필수적일 수도 있다는 것을 나타낸 다.
이들 실험은 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 scFv 가 3가지 상이한 작용 메커니즘인 (1) 아폽토시스의 유도, (2) CDC 효과기 메커니즘, 및 (3) ADCC 효과기 메커니즘을 통하여 B 세포 고갈 기능을 촉발시킬 수 있음을 나타내었다. 이들 메커니즘 3개 모두가 아마도 생체내 B 세포의 고갈에 기여할 것이다. 상기 데이터는 B 세포의 완전하고 지속적인 고갈이 무손상 ADCC 효과기 메커니즘을 필요로 한다는 것을 나타낸다. 그러나, ADCC 네거티브 돌연변이로 수득한 부분적인 고갈은 또한, 아폽토시스 및 CDC 메커니즘이 전체 B 세포 고갈 효과의 일부를 중재하는데 기여한다는 것을 가리킨다. 이들 결과는 CD20 포지티브 B 세포 악성종양 또는 자가면역 질환을 가진 환자에게서 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 scFv의 사용을 지지한다.
실시예 162
항-CD37 GS-1VL11S SCFV (SSS) H WCH2WCH3 구조물에 의한 B 세포에서의 아폽토시스 도입
본 실시예에서는, 항-CD37 GS-1VL11S scFv (SSS) H WCH2WCH3 구조물의 표적 세포 결합 능력 및 아폽토시스 유도 능력을 평가하였다. 또한, 상기 구조물은 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 물리적으로 특성화되었다. 도 78은, SSC 힌지 도메인을 갖는 G28-1 (항-CD37) 구조물의 SEC 프로필이 (GS-1VL11S scFv(SSC) H WCH2WCH3)를 형성한다는 것을 묘사한다. G28-1 (항-CD37) 구조물은 단백질 A 친화 크로마토그래피에 의해 CHO 배양 상청액으로부터 정제되었다. 10∼25 mg의 정제된 분취물을 공극 크기가 5 mm인 TSK3000SWXL HPLC 칼럼 (Tosoh Biosep, Inc. 제)을 통해 HPLC 에 가하였다. 유량은 PBS, pH 7.2 실시 완충제에서 1 ml/분이었다. 분자량 표준의 이동량은 자취 아래에 나타낸다. GS-1L VL11S scFv (SSS) H WCH2WCH3 구조물은 청색으로 나타내고, GS-1 VL 11S scFv (SSC) HWCH2WCH3 구조물은 적색으로 나타낸다. GS-1VLllS scFv (SSS) HWCH2WCH3 구조물은 대략 75∼100 kDa 의 균일한 피이크를 발생시켰고, GS-1 VL11S scFv (SSC) H WCH2WCH3 구조물은 200 kDa 초과의 고분자량 형태를 포함하여 더욱 작은 형태 및 기타 분균질한 형태를 발생시켰다. 도 79는 B 세포 임파종 세포주에 대한 G28-1 (항-CD37) 구조물의 결합을 묘사한다. 정제된 GS-1VL11S scFv (SSS) H WCH2WCH3 또는 GS-1 VL11S scFv (SSC) HWCH2WCH3 의 일련의 희석물을 PBS/2% FBS 중 얼음에서 60분 동안 각 세포 형태의 106 세포로 배양하였다. 시료를 2회 세척하고, 45분 동안 얼음에서 FITC 염소 항-인간 IgG 및 FITC 염소 항-인간 IgG F(ab')2 (CalTag)의 혼합물 (각각 1:100)로 배양하였다. 시료를 세척하고, FACsCalibur(Becton-Dickinson)를 사용하여 유세포 분류기에 의해 분석하였다. 본 실험의 결과는 두 GS-1VL11S scFv (SSS) H WCH2WCH3 및 GS-1VL11S scFv (SSC) H WCH2WCH3 구조물이 라모스(Ramos) 세포 및 온건하게는 WIL-2 세포에 결합하였다는 것을 나타낸다. G28-1 (항-CD37) (SSS) H G scFv 또는 G28-1 (SSC) H G scFv 구조물 분자가 본 실험에서 더욱 낮은 수준으로 Raji 및 Namalwa 세포를 결합하였다. 백그라운드(background) 형광을 도 79에 나타낸 데이터에서 뺐기 때문에, 모든 세포주의 결합이 현저하였다. 도 80은 scFv 의 GS-1VL11S scFv (SSS) H WCH2WCH3 또는 GS-1VL11S scFv (SSC) H WCH2WCH3 형태로 하룻밤동안 배양한 후, 라모우스(Ramous) 세포에 대한 아넥신(annexin) 및 v-프로피듐 요오다이드의 결합을 묘사한다. 라모우스 세포의 아넥신 V-PI 염색을 G28-1 (항-CD37) scFv를 사용하여 24시간 동안 배양하였다. 106 세포/ml에서의 라모스 B 세포를 12 웰 디쉬에서 24시간 동안 2 ㎖의 전체 부피로 10 mg/㎖로 G28-1 (항-CD37) scFv 를 사용하여 배양하였다. 세포는 Immunotech에서 구입한 키트를 사용하여 제조자 지시에 따라서, 아넥신V 및 프로피듐 요오다이드를 사용하여 염색되었다. 시료는 FACsCalibur 유세포 분류기(Becton-Dickinson)를 사용하여 2색 유세포 분류기에 의해 분석되었다. 각 4분면에서 전체 시료의 %를 각 점 도시도의 옆에 나타내었다. 도 83은 GS-1VL11S scFv (SSS) H WCH2WCH3 또는 GS-1 VL11S scFv (SSC) H WCH2WCH3을 사용한 하룻밤 배양 이후 세포에 대한 아넥신 V-프로피듐 요오다이드의 결합을 나타낸다. 결과는 두 GS-1VLIES scFv (SSS) H WCH2WCH3 및 GS-1VI llS sc(SSC) H WCH2WCH3 구조물 모두가 아폽토시스를 유도할 수 있으나, SSC 형태가 SSS 형태보다 더욱 많이 아폽토시스를 유도하였음을 나타내었다. 도 81은 G28-1 (항-CD37) 구조물의 존재 하에 성장한 라모스 세포의 증식 억제를 나타낸다. 라모스 B 세포는 (SSS)H 또는 (SSC)H 로서 동정된 IgGI 힌지 중 하나를 포함하는 정제된 G28-1 (항-CD37) 구조물의 일련의 희석물로 배양되었다. 배양물은, 48시간의 배양 (0.75 mCi/웰) 중 마지막 12시간 동안 3H-티미딘을 사용하여 펄스화하기 이전에 36시간 동안 37℃, 5% CO2 에서 96 웰 넓적 바닥 조직 배양 디쉬 (Costar)에서 배양되었다. 세포는 Packard 하비스터(harvester)를 사용하여 96 웰 GFC 플레이트에서 수확되었고, 건조하고, 25 ㎖ Microscint 섬광 유체를 각 웰에 첨가한 후, TopCount NXT 마이크로플레이트 (Packard) 섬광 계수기에서 계수하였다. 데이터를 포함된 cpm 대 단백질 농도로서 도시하였다. 각 구조물은 단백질 농도 증가와 함께 증식 억제 증가를 나타내었다. 도 82는 2H7 (항-CD20) 및 G28-1 (항-CD37) 구조물의 존재 하에 배양된 라모스 B 세포에서의 아폽토시스 유도를 나타낸다.
라모스 B 세포는 용액 중 CD20 및/또는 CD37 표적된 구조물(10 mg/ml)로 20 시간 동안 배양되었다. 그 후, 세포를 수확하고, 세척하고, 염색 키트 (Immunotech 제)를 사용하여 아넥신V 및 프로피듐 요오다이드에서 배양한 후, FACsCalibur 유세포 분류기(Becton-Dickinson)를 사용하여 2색 유세포 분류하였다. 그래프는 점 도시도의 오른쪽 사분면에서 이들의 염색에 의하여 동정된 아넥신 V 포지티브 세포의 백분율을 나타낸다. 상기 실험의 결과는, 두 G28-1 구조물 모두가 2H7 구조물보다 더 효율적이라는 것 및 G28-1VL11S scFv (SSS) H WCH2 WCH3 구조물이 G28-1VL11S scFv (SSC) H WCH2 WCH3 구조물보다 더 효율적이라는 것을 나타낸다. 그러나, 라모스 세포의 아폽토시스의 양은 2H7 및 G28-1 구조물을 조합하여 사용하였을 때 가장 많았다. 도 83은 힌지 영역 돌연변이가 있는 2H7 (항-CD20) 구조물 및 G28-1 (항-CD37) 구조물에 의해 유도된 보체 의존성 세포독성 (CDC)에 의한 라모스 세포의 사멸을 묘사한다. 2H7 scFv (CSS-S) H WCH2 WCH3 (항-CD20), G28-1 scFv (SSS) H G, G28-1 (SCS) H (항-CD37-scFv), G28-1 (CSS) H (항-CD37-scFv), 또는 G28-1 (SSC) H (항-CD37-scFv) 는 90 분 동안 150 ㎖ 의 부피로 토끼 보체 (PelFreez)의 1:10 희석물 및 104 라모스 표적 세포를 사용하여 10 mg/㎖ 로 배양되었다. 분취물을 트리판 블루 (Invitrogen)로 염색하고, 혈구 계산기를 사용하여 계수하여, 처리 동안 사멸된 세포의 백분율을 결정하였다. 세포 및 오직 하나의 시약을 사용한 네거티브 대조군도 또한 포함되었다. 두 G28-1 (SSS) (항-CD37 scFv) 및 G28-1 (SSC) (항-CD37 scFv) 모두가 본 실험에서 토끼 보체의 존재 하에 라모스 세포를 신속히 사멸시켰다. G28-1 (SSC) (항-CD37scFv) 의 활성이 G28-1 (SSS)(항-CD37 scFv)의 활성보다 더 높고, 본 검정에서 거의 CD20-지향 2H7 scFv (CSS-S)H WCH2 WCH3 scFv 분자만큼 강력하였다. 도 84는 G28-1 (항-CD37) scFvs.으로 배양된 라모스 세포의 ADCC 의 유도를 묘사한다. 10 mg/㎖ 에서 G28-1(항-CD37) 구조물을 0 내지 100 범위의 상이한 효과기 : 표적 비에서 104 51Cr-표지화된 라모스 세포 및 휴면 인간 PBMC를 사용하여 넓적바닥 96 웰 플레이트에서 배양하였다. 모든 배양은 각 효과기 : 표적 비에서 3회 실시되었다. 자연 사멸을 구조물을 생략하여, 각 효과기 : 표적 비에서 측정하였다. 자발적 방출을 PBMC EH는 융합 단백질의 첨가 없이 측정하였고, 최대 방출을 적절한 웰에 세정제 (1% NP-40)을 첨가함으로써 측정하였다. 반응을 6시간 동안 배양하고, 100 ml 배양 상청액을 Lumaplate (Packard Instruments) 에 수확하고, 하룻밤 동안 건조시킨 후, Packard Top Count NXT 마이크로플레이트 섬광 계수기에 방출된 cpm 을 계수하였다. 상기 실험으로부터의 결과는 G28-1 (항-CD37) 구조물이 표적 세포를 결합한다는 것, 이들이 B 세포주에서의 아폽토시스를 유도한다는 것, 및 이들이 CDC 및 ADCC 를 포함하는 효과기 기능을 중재한다는 것을 나타내었다.
본 발명에 속하거나 본 발명에서 유용한 추가 비제한적인 대표 구성체 또는 서열은 다음과 같다:
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상기로부터, 본 발명의 특정 실시양태는 예시의 목적으로 본원에서 기재되어 있지만, 본 발명의 의미 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 이에 대해 각종 수정을 할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부되는 특허청구범위에 의해서가 아니라면 제한되지 않는다.
본원에서 참고하거나 언급하는 모든 특허, 특허 출원, 공보, 과학적 문헌, 웹 사이트, 및 기타 문헌 및 자료는 본 발명이 보유하고 있는 당업자의 기술 수준을 보여주고, 이러한 참고된 문헌 및 자료 각각은, 이들 각각의 전체 내용이 참고로 인용되거나 전체 내용이 본원에서 제시되는 것처럼 일정 범위로 본원에서 참고로 인용된다. 또한, 최초의 청구항을 포함하지만 그에 국한되지는 않는, 본 특허의 모든 청구항, 및 모든 우선권 주장은 본 발명의 상세한 설명에 전체가 인용되어 그의 일부를 이룬다. 출원인은 임의의 이러한 특허, 출원, 공보, 과학적 문헌, 웹 사이트, 전자적으로 입수가능한 정보, 및 기타 참고 자료 또는 문헌으로부터의 임의 및 모든 자료 및 정보를 본 명세서에 인용할 권리를 갖는다. 출원인은 임의의 최초의 청구항을 포함하지만 이에 국한되지는 않는 상기 언급한 청구항을, 상세한 설명의 임의의 부분을 포함하는, 본 명세서의 임의의 부분에 인용할 권리를 갖는다.
본원에서 기재되어 있는 특정 방법 및 조성물은 바람직한 실시양태를 대표하고 본 발명의 범위를 예시하지만 이를 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서를 고려하여, 당업자는 기타 목적, 구체예 및 실시양태를 생각할 수 있고, 이들은 본 특허청구범위에 의해 정의된 본 발명의 의미에 포함된다. 본 발명의 범위 및 의미로부터 벗어나지 않고, 본원에서 개시되어 있는 본 발명에 다양한 대체 및 수정을 할 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 본원에서 예시적으로 기재되어 있는 본 발명은 본원에서 특별히 필수적인 것으로 기재되어 있지 않는, 임의의 요소 또는 요소들, 또는 제한 또는 제한들의 존재 하에 적절히 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본원의 각 경우에 있어서, 본 발명의 실시양태 또는 실시예에 있어서, "포함하는(comprising)", "반드시 이루어진", 및 "이루어진" 이라는 용어는 본 명세서에서 서로 혼용되어 사용될 수 있다. 또한, 용어 "포함하는(comprising)", "포함하는(including)", "함유하는" 등의 용어는 비제한적으로 광범위하게 이해될 수 있다. 본원에서 예시적으로 기재되어 있는 방법 및 공정은 상이한 순서의 단계로 실시될 수 있고, 본원이나 특허청구범위에서 지시되어 있는 순서의 단계에 반드시 국한되지는 않는다. 또한, 본원 및 특허청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수의 형태("a", "an", 및 "the")는 문맥에서 달리 명백하게 명시되고 있지 않는 한, 복수개에 대한 언급도 포함한다. 따라서, 예를 들어, "숙주 세포(a host cell)"에 대 한 언급은 복수개(예를 들어, 배지 또는 군)의 그러한 숙주 세포들을 포함한다. 본 특허가 본원에서 구체적으로 개시되어 있는 특정 실시예 또는 실시양태 또는 방법에 국한되는 것으로 결코 해석해서는 안된다. 심사관 또는 특허청의 임의의 다른 공무원 또는 직원에 의한 임의의 진술은, 출원인이 그러한 진술에 대한 답신에서 구체적으로 및 제한이나 유보 없이 명시적으로 그 진술을 채택되지 않는 한 본 특허를 제한하는 것을 해석해서는 안된다.
사용된 용어 및 표현은 비제한적인 기재를 위한 용어로서 포함되었고 사용되었으며, 그러한 용어 및 표현의 사용에 있어서, 보여지고 기재되어 있는 특성 또는 그의 일부의 임의의 등가물을 배제하고자 하는 의도는 없고, 주장된 본 발명의 범위 내에서 각종 수정을 할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 따라서, 본 발명은 바람직한 실시양태 및 임의의 특성에 의해 구체적으로 개시되었지만, 당업자는 본원에서 개시되어 있는 개념에 대한 수정 및 변형을 할 수 있고, 그러한 수정 및 변형은 첨부된 특허청구범위에 의해 정의된 본 발명의 범위에 있는 것으로 생각된다는 것이 이해될 것이다.
본 발명은 본원에서 광범위하게 속에 관하여 기재하고 있다. 이 속의 개시 내용에 있는 더 좁은 종 및 하위 속의 그룹 각각도 본 발명의 일부를 이룬다. 본 발명은 속으로부터의 임의의 주제가 제외된 본 발명의 속에 대한 기재를, 제외된 자료를 본원에서 구체적으로 언급하는 지의 여부에 관계 없이 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 주제는 "Binding Domain-Immunoglobulin Fusion Proteins"라는 제목의, Ledbetter et al.에 의한 관련 출원 공보인 U.S.S.N. 2003/0118592 A1(2003년 6월 26일)(및 USPTO에 의해 발행된 서열 번호1-427의 서열 목록)에 기재되어 있거나 포함되어 있는 임의의 주제 또는 서열을 임의로 제외할 수 있다.
기타 실시양태가 하기의 특허청구범위에 속한다. 또한, 본 발명의 특징 및 구체예는 마쿠시 군의 용어로 기재되어 있는 반면, 당업자는 마쿠시 군의 임의의 각 요소 또는 부군(subgroup)의 용어로도 기재된다는 것을 인지할 것이다.

Claims (413)

  1. i) 표적 분자에 결합할 수 있는 결합 도메인 폴리펩티드를 가지는 제1 폴리펩티드로서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 또는 결실을 포함하는 것인 제1 폴리펩티드;
    ii) 상기 제1 폴리펩티드에 결합되고 연결 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드; 및
    iii) 제2 폴리펩티드에 결합되고 N-말단 절두형 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드를 포함하는 제3 폴리펩티드
    를 포함하는 비자연 발생적 단일쇄 단백질로서, 하나 이상의 면역 활성을 나타낼 수 있는 것인 비자연 발생적 단일쇄 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 단일쇄 Fv인 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역 중 하나 이상의 아미노산이 치환 또는 결실되는 것이 상기 결실 또는 치환이 일어나지 않은 단백질에 비해 상기 단백질의 발현 또는 안정성을 증가시키는 데 효과적인 것인 단백질.
  4. 제1항에 있어서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 면역글로불린 경쇄 가변 영 역 폴리펩티드 및 면역글로불린 중쇄 가변 영역 폴리펩티드를 포함하는 것인 단백질.
  5. 제4항에 있어서, 제2 표적 분자에 결합할 수 있는 제2 결합 도메인 폴리펩티드를 더 포함하며, 상기 제2 결합 도메인 폴리펩티드는 면역글로불린 경쇄 가변 영역 폴리펩티드 및 면역글로불린 중쇄 가변 영역 폴리펩티드를 포함하는 것인 단백질.
  6. 제5항에 있어서, 제1 표적 분자와 제2 표적 분자는 상이한 것인 단백질.
  7. 제5항에 있어서, 제1 표적 분자와 제2 표적 분자는 동일한 것인 단백질.
  8. 제1항에 있어서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 상기 중쇄 가변 영역 중 9번, 10번, 11번, 12번, 108번, 110번 및 112번 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 단일쇄 Fv인 것인 단백질.
  9. 제1항에 있어서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 상기 중쇄 가변 영역 중 11번 위치의 아미노산 치환을 포함하는 단일쇄 Fv인 것인 단백질.
  10. 제9항에 있어서, 단일쇄 Fv 중쇄 가변 영역의 11번 위치의 아미노산에 대해 치환된 아미노산은 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 글루타민, 아스파르트산, 글루탐산, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘 중에서 선택되는 것인 단백질.
  11. 제9항에 있어서, 단일쇄 Fv 중쇄 가변 영역의 11번 위치의 루신은 세린 이외의 아미노산으로 치환되는 것인 단백질.
  12. 제9항에 있어서, 11번 위치의 루신이 세린으로 치환되고, 상기 단백질은 항체 의존성 세포 매개형 세포 독성 반응 및 보체 결합 반응을 나타낼 수 있으며, 상기 표적 분자에 결합하여 표적 세포수를 감소시킬 수 있는 것인 단백질.
  13. 제9항에 있어서, 11번 위치의 루신이 데스-루신(des-leucine)으로 치환되는 것인 단백질.
  14. 제12항에 있어서, 11번 위치의 아미노산이 치환되지 않은 상기 단백질에 비해 재조합 발현 또는 안정성이 증가된 것인 단백질.
  15. 제14항에 있어서, 11번 위치의 아미노산이 치환된 상기 단백질은 11번 위치의 아미노산이 치환되지 않은 상기 단백질보다 10∼100배 더 발현되는 것인 단백질.
  16. 제14항에 있어서, 상기 발현은 포유동물 세포에서 일어나는 것인 단백질.
  17. 제1항에 있어서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 경쇄 Fv이며, 상기 경쇄 Fv의 중쇄 가변 영역의 11번 위치의 아미노산은 결실된 것인 단백질.
  18. 제1항에 있어서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 경쇄 Fv이고, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 이 때 상기 경쇄 가변 영역은 12번, 80번, 81번, 83번, 105번, 106번 및 107번 위치의 아미노산 중 하나 이상에서 아미노산이 결실 또는 치환되는 것인 단백질.
  19. 제18항에 있어서, 106번 위치의 아미노산이 치환 또는 결실된 것인 단백질.
  20. 제2항에 있어서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 종양 항원에 결합하는 것인 단백질.
  21. 제2항에 있어서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 면역 효과기 세포 상의 항원에 결합하는 것인 단백질.
  22. 제2항에 있어서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 암세포 항원에 결합하는 것 인 단백질.
  23. 제22항에 있어서, 상기 암세포 항원은 표면 항원인 것인 단백질.
  24. 제22항에 있어서, 상기 암세포 항원은 세포내 항원인 것인 단백질.
  25. 제1항에 있어서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 B 세포 항원에 결합하는 것인 단백질.
  26. 제25항에 있어서, 상기 B 세포 항원은 CD19, CD20, CD22, CD37, CD40, CD80 및 CD86 중에서 선택되는 것인 단백질.
  27. 제2항에 있어서, 상기 단일쇄 Fv는 B 세포 항원에 결합하는 것인 단백질.
  28. 제27항에 있어서, 상기 B 세포 항원은 CD19, CD20, CD22, CD37, CD40, CD80 및 CD86 중에서 선택되는 것인 단백질.
  29. 제28항에 있어서, 상기 단일쇄 Fv는 HD37 단일쇄 Fv, 2H7 단일쇄 Fv, G28-1 단일쇄 Fv 및 4.4.220 단일쇄 Fv 중에서 선택되는 것인 단백질.
  30. 제2항에 있어서, 상기 단일쇄 Fv는 HD37 단일쇄 Fv, 2H7 단일쇄 Fv, G28-1 단일쇄 Fv, FC2-2, UCHL-1, 5B9, L6, 1OA8, 2e12, 40.2.36, G19-4, 1D8 및 4.4.220 단일쇄 Fv 중에서 선택되는 것인 단백질.
  31. 제1항에 있어서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 B 세포 분화 항원에 결합하는 scFv인 것인 단백질.
  32. 제31항에 있어서, 상기 B 세포 항원은 CD19, CD20, CD22, CD37 및 CD40 중에서 선택되는 것인 단백질.
  33. 제1항에 있어서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD8, CD10, CD11b, CD14, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD28, CD30, CD37, CD40, CD43, CD50(ICAM3), CD54(ICAM1), CD56, CD69, CD80, CD86, CD134(OX40), CD137(41BB), CD152(CTLA-4), CD153(CD30 리간드), CD154(CD40 리간드), ICOS, L6, B7-H1 및 HLA 클래스 II 중에서 선택된 표적에 결합하는 것인 단백질.
  34. 제1항에 있어서, 상기 단백질 중 둘 이상을 포함하는 복합체를 형성할 수 있는 것인 단백질.
  35. 제34항에 있어서, 상기 복합체는 이량체인 단백질.
  36. 제1항에 있어서, 단량체인 단백질.
  37. 제1항에 있어서, 약물, 독소, 면역조절제, 폴리펩티드 효과기, 동위원소, 라벨 또는 효과기 부분에 커플링되는 것인 단백질.
  38. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 면역 활성은 항체 의존성 세포 매개형 세포 독성, 보체 결합, 아폽토시스 유도, 생물학적으로 활성인 하나 이상의 신호의 유도, 하나 이상의 면역 효과기 세포의 유도, 세포 분화의 활성화, 세포 활성화, 생물학적으로 활성인 하나 이상의 분자의 방출 및 감염성 물질 또는 독소의 중화 중에서 선택되는 것인 단백질.
  39. 제38항에 있어서, 상기 면역 활성은 항체 의존성 세포 매개형 세포 독성, 보체 결합, 아폽토시스 유도, 생물학적으로 활성인 하나 이상의 신호의 유도, 하나 이상의 면역 효과기 세포의 유도, 세포 분화의 활성화, 세포 활성화, 생물학적으로 활성인 하나 이상의 분자의 방출 및 감염성 물질 또는 독소의 중화 중에서 선택된 2가지의 면역 활성을 포함하는 것인 단백질.
  40. 제38항에 있어서, 단백질 키나제, 단백질 포스파타제, G-단백질, 환형 뉴클 레오티드 또는 다른 2차 메신저, 이온 채널 및 분비성 경로 성분 중에서 선택된 하나 이상의 분자를 활성화 또는 억제시켜 생물학적으로 활성인 신호를 유도할 수 있거나, 또는 NK 세포, 단핵구, 대식 세포, B 세포, T 세포, 비만 세포, 호중구, 호산구 및 호염구 중에서 선택된 하나 이상의 면역 효과기 세포를 유도할 수 있는 것인 단백질.
  41. 제40항에 있어서, 상기 하나 이상의 면역 효과기 세포의 유도는 항체 의존성 세포 매개형 세포 독성 반응 또는 생물학적으로 활성인 하나 이상의 분자의 방출을 유도하는 것인 단백질.
  42. 제38항에 있어서, 세포를 활성화시킬 수 있으며, 상기 활성화는 세포 전사 활성의 변화를 유도하는 것인 단백질.
  43. 제42항에 있어서, 상기 세포 전사 활성을 증가시키는 것인 단백질.
  44. 제42항에 있어서, 상기 세포 전사 활성을 감소시키는 것인 단백질.
  45. 제38항에 있어서, 생물학적으로 활성인 상기 하나 이상의 분자는 프로테아제인 것인 단백질.
  46. 제38항에 있어서, 생물학적으로 활성인 상기 하나 이상의 분자는 사이토카인인 것인 단백질.
  47. 제46항에 있어서, 상기 사이토카인은 모노카인, 림포카인, 케모카인, 성장 인자, 콜로니 자극 인자, 인터페론 및 인터루킨 중에서 선택되는 것인 단백질.
  48. 제38항에 있어서, 감염성 물질을 중화시킬 수 있으며, 상기 감염성 물질은 박테리아, 바이러스, 기생충 또는 진균류인 것인 단백질.
  49. 제38항에 있어서, 독소를 중화시킬 수 있으며, 상기 독소는 내독소 및 외독소 중에서 선택되는 것인 단백질.
  50. 제38항에 있어서, 독소를 중화시킬 수 있으며, 상기 독소는 탄저균 독소, 콜레라 독소, 디프테리아 독소, 백일해 독소, 이.콜라이(E.coli) 열-불안정성 독소 LT, 이.콜라이 열 안정성 독소 ST, 시가(shiga) 독소, 슈도모나스(Pseudomonas) 외독소 A, 보툴리누스 독소, 파상풍 독소, 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis) AC 독소 및 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis) EF 중에서 선택된 외독소인 것인 단백질.
  51. 제38항에 있어서, 독소를 중화시킬 수 있으며, 상기 독소는 색시톡신, 테트 로도톡신, 버섯 독소, 아플라톡신, 피롤리지딘 알칼로이드, 피토헤마글루티닌 및 그라야노톡신 중에서 선택된 내독소인 것인 단백질.
  52. 제1항에 있어서, 세포내 표적에 결합하여 세포 기능에 효과를 미칠 수 있는 것인 단백질.
  53. 제1항에 있어서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 결합 도메인 링커에 의해 상기 중쇄 가변 영역에 결합된 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 결합 도메인 링커는 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser을 가지는 하나 이상의 펩티드를 포함하는 것인 단백질.
  54. 제53항에 있어서, 3개의 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser 펩티드를 포함하는 것인 단백질.
  55. 제1항에 있어서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 인간, 뮤린, 래트, 돼지 및 원숭이 중에서 선택된 종에서 얻은 야생형 및 유전자 조작된 면역글로불린 가변 영역을 포함하는 것인 단백질.
  56. 제1항에 있어서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 인간화된 면역글로불린 가변 영역을 포함하는 것인 단백질.
  57. 제2항에 있어서, 상기 N-말단 절두형 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드는 면역글로불린 중쇄 IgG CH3 불변 영역 폴리펩티드에 결합된 IgG CH2 불변 영역 폴리펩티드를 포함하는 것인 단백질.
  58. 제2항에 있어서, 상기 N-말단 절두형 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드는 본질적으로 면역글로불린 중쇄 IgG CH3 불변 영역 폴리펩티드에 결합된 IgG CH2 불변 영역 폴리펩티드로 이루어지는 것인 단백질.
  59. 제2항에 있어서, 상기 N-말단 절두형 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드는 면역글로불린 중쇄 IgG CH3 불변 영역 폴리펩티드에 결합된 IgG CH2 불변 영역 폴리펩티드를 포함하는 것인 단백질.
  60. 제2항에 있어서, 상기 N-말단 절두형 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드는 본질적으로 면역글로불린 중쇄 IgG CH3 불변 영역 폴리펩티드에 결합된 IgG CH2 불변 영역 폴리펩티드로 이루어지는 것인 단백질.
  61. 제1항에 있어서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 인간 불변 영역의 적어도 일부분을 포함하는 단일쇄 Fv인 것인 단백질.
  62. 제2항에 있어서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 인간 불변 영역의 적어도 일부분을 포함하는 단일쇄 Fv인 것인 단백질.
  63. 제1항에 있어서, 상기 연결 영역은 인간 힌지 또는 이의 일부분, 인간 IgG 힌지 또는 이의 일부분, 인간 IgA 힌지 또는 이의 일부분, 인간 IgE 힌지 또는 이의 일부분, 카멜리드(camelid) 힌지 영역 또는 이의 일부분, IgG1 라마 힌지 영역 또는 이의 일부분, 너스 상어 힌지 영역 또는 이의 일부분, 및 반점 은상어 힌지 영역 또는 이의 일부분 중에서 선택된 자연 발생적 힌지 영역을 포함하는 것인 단백질.
  64. 제1항에 있어서, 상기 연결 영역은 인간 IgE 힌지 또는 이의 일부분을 포함하는 것인 단백질.
  65. 제1항에 있어서, 상기 연결 영역은 시스테인 잔기가 0개 또는 1개인 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 힌지 영역을 포함하는 것인 단백질.
  66. 제1항에 있어서, 상기 연결 영역은 시스테인 잔기가 0∼2개인 인간 IgGA 힌지 영역을 포함하는 것인 단백질.
  67. 제1항에 있어서, 상기 연결 영역은 야생형 인간 IgG1 면역글로불린 힌지 영 역을 포함하는 것인 단백질.
  68. 제1항에 있어서, 상기 연결 영역은 글리코실화 부위를 포함하는 것인 단백질.
  69. 제1항에 있어서, 상기 연결 영역은 이황화 결합을 형성할 수 있는 시스테인 잔기를 가지고 있지 않은 것인 단백질.
  70. 제1항에 있어서, 상기 연결 영역은 1개의 시스테인 잔기를 가지는 것인 단백질.
  71. 제1항에 있어서, 상기 연결 영역은 1개 이하의 시스테인 잔기를 포함하는 돌연변이된 야생형 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드를 포함하는 것인 단백질.
  72. 제1항에 있어서, 상기 연결 영역이 변경되어, 감소된 이량체화 능력을 가지는 것인 단백질.
  73. 제1항에 있어서, 상기 연결 영역은 3개의 시스테인 잔기 및 1개의 프롤린 잔기를 포함하며, 이 때 상기 시스테인 잔기 중 하나 이상은 결실 또는 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 치환 또는 결실되는 것인 단백질.
  74. 제1항에 있어서, 상기 연결 영역은 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기를 포함하는 돌연변이된 야생형 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드를 포함하며, 이 때 상기 제1 시스테인 잔기는 상기 제2 시스테인의 N-말단 쪽에 위치하고, 상기 제2 시스테인은 상기 제3 시스테인의 N-말단 쪽에 위치하며, 이 때 상기 제1 시스테인 잔기는 치환 또는 결실되는 것인 단백질.
  75. 제74항에 있어서, 상기 야생형 힌지 영역 폴리펩티드는 인간 IgG1 유래인 것인 단백질.
  76. i) 표적 분자에 결합할 수 있는 결합 도메인 폴리펩티드를 가지는 제1 폴리펩티드로서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 9번, 10번, 11번, 12번, 108번, 110번 및 112번 위치에서 하나 이상의 아미노산의 결실 또는 치환을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것인 제1 폴리펩티드;
    ii) 상기 제1 폴리펩티드에 결합되고 연결 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드; 및
    iii) 상기 제2 폴리펩티드에 결합되고 N-말단 절두형 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드를 포함하는 제3 폴리펩티드
    를 포함하는 비자연 발생적 단일쇄 단백질로서, 상기 비자연 발생적 단일쇄 단백질은 하나 이상의 면역 활성을 나타낼 수 있으며, 상기 단백질은 아미노산이 결실 또는 치환되지 않은 상기 단백질에 비해 재조합 발현 또는 안정성이 증가된 것인 비자연 발생적 단일쇄 단백질.
  77. i) 표적 세포 상의 표적 분자에 결합할 수 있는 결합 도메인 폴리펩티드를 가지는 제1 폴리펩티드로서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 중쇄 가변 영역의 제1 골격 영역 중 11번 위치의 루신이 결실되거나 다른 아미노산으로 치환된 중쇄 가변 영역을 포함하는 것인 제1 폴리펩티드;
    ii) 상기 제1 폴리펩티드에 결합되고 연결 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드; 및
    iii) 상기 제2 폴리펩티드에 결합되고 N-말단 절두형 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드를 포함하는 제3 폴리펩티드
    를 포함하는 비자연 발생적 단일쇄 Fv 단백질로서, 상기 비자연 발생적 단일쇄 단백질은 (1) 상기 표적 분자에 결합할 수 있고, (2) 항체 의존성 세포 매개형 세포 독성 반응 및 보체 결합 반응을 나타낼 수 있으며, (3) 표적 세포수를 감소시킬 수 있는 것인 비자연 발생적 단일쇄 Fv 단백질.
  78. 제77항에 있어서, 중쇄 가변 영역의 제1 골격 영역 중 10번 위치에서의 아미노산 치환 또는 결실을 더 포함하는 것인 단백질.
  79. 제77항에 있어서, 11번 위치의 아미노산 치환이 상기 결실 또는 치환이 일어 나지 않은 단일쇄 Fv 단백질에 비해 상기 단일쇄 Fv 단백질의 발현 또는 안정성을 증가시키는 데 효과적인 것인 단백질.
  80. 제77항에 있어서, 잔기의 넘버링(numbering)은 Kabat에 따른 EU 인덱스인 것인 단백질.
  81. 제77항에 있어서, 상기 연결 영역은 프롤린 및 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기를 포함하며, 상기 제1 시스테인 잔기는 상기 제2 시스테인의 N-말단 쪽에 위치하고, 상기 제2 시스테인은 상기 제3 시스테인의 N-말단 쪽에 위치하며, 상기 제3 시스테인 잔기는 상기 프롤린 잔기의 N-말단 쪽에 위치하는 것인 단백질.
  82. 제77항에 있어서, 상기 연결 영역은 IgA 힌지 영역 또는 이의 일부분을 포함하는 것인 단백질.
  83. 제81항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 2H7 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제2 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 단백질.
  84. 제82항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 2H7 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 상기 연결 영역은 뮤린 IgA 힌지 또는 이의 일부분을 포함하고, 상기 중쇄 불변 영역은 뮤린 IgA 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하며, 이 때 상기 CH3 도메인은 IgA 중쇄 불변 영역이 J쇄 폴리펩티드와 회합할 수 없게 하는 아미노산 4개의 결실 또는 치환을 포함하는 것인 단백질.
  85. 제81항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 2H7 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 연결 영역 중 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는데, 이 때 상기 CH2 영역 중 322번 위치에서 라이신이 세린으로 치환되는 것인 단백질.
  86. 제81항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 2H7 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는데, 이 때 상기 CH2 영역 중 322번 위치에서 라이신이 세린으로 치환되는 것인 단백질.
  87. 제81항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 2H7 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세 린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는데, 이 때 상기 CH2 영역 중 331번 위치에서 프롤린이 세린으로 치환되는 것인 단백질.
  88. 제81항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 2H7 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는데, 이 때 상기 CH2 영역 중 331번 위치에서 프롤린이 세린으로 치환되는 것인 단백질.
  89. 제81항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 2H7 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는데, 이 때 상기 CH2 영역 중 256번 위치에서 트레오닌이 아스파라긴으로 치환되는 것인 단백질.
  90. 제81항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 2H7 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 2H7 단일 쇄 Fv CH2 및 CH3 도메인을 포함하는데, 이 때 상기 CH2 도메인 중 255번 위치에서 아르기닌이 글루타민으로 치환되고, 256번 위치에서 트레오닌이 아스파라긴으로 치환되고, 257번 위치에서 프롤린이 알라닌으로 치환되며, 258번 위치에서 글루탐산이 라이신으로 치환되는 것인 단백질.
  91. 제81항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 2H7 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는데, 이 때 상기 CH2 영역 중 290번 위치에서 라이신이 글루타민으로 치환되는 것인 단백질.
  92. 제81항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 2H7 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는데, 이 때 상기 CH2 영역 중 339번 위치에서 알라닌이 프롤린으로 치환되는 것인 단백질.
  93. 제81항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 G28-1 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 단백질.
  94. 제81항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 G28-1 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 단백질.
  95. 제81항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 G28-1 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제2 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 단백질.
  96. 제81항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 G28-1 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1 및 제2 시스테인 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 단백질.
  97. 제81항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 FC2-2 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 단백질.
  98. 제81항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 UCHL-1 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 단백질.
  99. 제81항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 5B9 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 단백질.
  100. 제81항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 2H7 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 단백질.
  101. 제81항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 2H7 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 단백질.
  102. 제81항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 G28-1 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 단백질.
  103. 제81항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 연결 영역을 포함하는 G28-1 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 상기 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 단백질.
  104. 제81항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 G28-1 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1 시스테인 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 단백질.
  105. 제82항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 G28-1 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 상기 연결 영역은 뮤린 IgA 힌지 영역을 포함하고, 상기 중쇄 불변 영역은 뮤린 IgA 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하며, 상기 CH3 도메인은 IgA 중쇄 불변 영역이 J쇄 폴리펩티드와 회합할 수 없게 하는 아미노산 4개의 결실 또는 치환을 포함하는 것인 단백질.
  106. 제82항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 G28-1 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 상기 연결 영역은 인간 IgA 힌지 영역을 포함하고, 상기 중쇄 불변 영역은 인간 IgA 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하며, 상기 CH3 도메인은 IgA 중쇄 불변 영역이 J쇄 폴리펩티드와 회합할 수 없게 하는 아미노산 4개의 결실 또는 치환을 포함하는 것인 단백질.
  107. 제81항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 HD37 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 단백질.
  108. 제81항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 L6 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 단백질.
  109. i) 표적 분자에 결합할 수 있는 결합 도메인 폴리펩티드를 가지는 제1 폴리펩티드로서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 중쇄 가변 영역의 제1 골격 영역 중 11번 위치의 루신이 세린으로 치환되는 중쇄 가변 영역을 포함하고; 이 때 단백질은 상기 아미노산이 치환되지 않은 단백질에 비해 포유동물 세포에서의 발현 또는 안정성이 증가되는 것인 제1 폴리펩티드;
    ii) 상기 제1 폴리펩티드에 결합되고 연결 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드; 및
    iii) 상기 제2 폴리펩티드에 결합되고 N-말단 절두형 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드를 포함하는 제3 폴리펩티드
    를 포함하는 비자연 발생적 단일쇄 Fv 단백질로서, 하나 이상의 면역 활성을 나타낼 수 있는 것인 비자연 발생적 단일쇄 Fv 단백질.
  110. i) 표적 분자에 결합할 수 있는 결합 도메인 폴리펩티드를 가지는 제1 폴리펩티드로서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 중쇄 가변 영역의 제1 골격 영역 중 11번 위치의 루신이 세린으로 치환되는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것인 제1 폴리펩티드;
    ii) 제2 폴리펩티드에 결합되고 N-말단 절두형 IgE 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드를 포함하는 제2 폴리펩티드
    를 포함하는 비자연 발생적 단일쇄 Fv 단백질로서, 하나 이상의 면역 활성을 나타낼 수 있는 것인 비자연 발생적 단일쇄 Fv 단백질.
  111. 제110항에 있어서, 11번 위치의 아미노산 치환이 상기 결실 또는 치환되지 않은 단일쇄 Fv 단백질에 비해 상기 단일쇄 Fv 단백질의 발현 또는 안정성의 증가에 효과적인 것인 단백질.
  112. 제110항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 2H7 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하고, 상기 중쇄 불변 영역은 IgE 유래의 CH2, CH3 및 CH4 도메인을 포함하는 것인 단백질.
  113. 제110항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 2H7 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하고, 상기 중쇄 불변 영역은 뮤린 IgE 유래의 CH2, CH3 및 CH4 도메인을 포함하는 것인 단백질.
  114. 제110항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 G28-1 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하고, 상기 중쇄 불변 영역은 뮤린 IgE 유래의 CH2, CH3 및 CH4 도메인을 포함하는 것인 단백질.
  115. 제110항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 G28-1 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하고, 상기 중쇄 불변 영역은 인간 IgE 유래의 CH2, CH3 및 CH4 도메인을 포함하는 것인 단백질.
  116. 표적 분자에 결합할 수 있는 결합 도메인 폴리펩티드를 포함하는 제1 폴리펩티드, 상기 제1 폴리펩티드에 결합되고 연결 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드, 상기 제2 폴리펩티드에 결합되고 N-말단 절두형 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드를 포함하는 제3 폴리펩티드를 포함하는 비자연 발생적 단일쇄 단백질로서, 이 때 상기 연결 영역은 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기를 포함하고, 상기 제1 시스테인 잔기는 상기 제2 시스테인의 N-말단 쪽에 위치하고, 상기 제2 시스테인은 상기 제3 시스테인의 N-말단 쪽에 위치하고, 상기 제2 및 제3 시스테인 잔기 중 하나 또는 둘 다는 치환 또는 결실되며, 하나 이상의 면역 활성을 나타낼 수 있는 것인 비자연 발생적 단일쇄 단백질.
  117. 제116항에 있어서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 단일쇄 Fv인 것인 단백질.
  118. 제116항에 있어서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 면역글로불린 경쇄 가변 영역 폴리펩티드 및 면역글로불린 중쇄 가변 영역 폴리펩티드를 포함하는 것인 단백질.
  119. 제118항에 있어서, 제2 표적 분자에 결합할 수 있는 제2 결합 도메인 폴리펩티드를 더 포함하며, 상기 제2 결합 도메인 폴리펩티드는 면역글로불린 경쇄 가변 영역 폴리펩티드 및 면역글로불린 중쇄 가변 영역 폴리펩티드를 포함하는 것인 단백질.
  120. 제116항에 있어서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 중쇄 가변 영역을 포함하는 단일쇄 Fv이고, 상기 중쇄 가변 영역은 9번, 10번, 11번, 12번, 108번, 110번 및 112번 아미노산 위치 중 하나 이상에서 아미노산이 결실 또는 치환되는 것인 단백질.
  121. 제117항에 있어서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일쇄 Fv이고, 상기 경쇄 가변 영역은 12번, 80번, 81번, 83번, 105번, 106번 및 107번 아미노산 위치 중 하나 이상에서 아미노산이 결실 또는 치환되는 것인 단백질.
  122. 제116항에 있어서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 중쇄 가변 영역을 포함하는 단일쇄 Fv이고, 상기 중쇄 가변 영역은 11번 아미노산 위치에서 아미노산이 치환되는 것인 단백질.
  123. 제122항에 있어서, 단일쇄 Fv 중쇄 가변 영역의 11번 위치의 아미노산은 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 글루타민, 아스파르트산, 글루탐산, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘 중에서 선택되는 것인 단백질.
  124. 제122항에 있어서, 단일쇄 Fv 중쇄 가변 영역의 11번 위치의 아미노산에 대해 치환된 아미노산은 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민 중에서 선택되는 것인 단백질.
  125. 제122항에 있어서, 11번 위치의 루신이 세린으로 치환되는 것인 단백질.
  126. 제122항에 있어서, 11번 위치의 루신이 데스-루신으로 치환되는 것인 단백질.
  127. 제116항에 있어서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 단일쇄 Fv이고, 상기 단일쇄 Fv의 중쇄 가변 영역의 11번 위치의 아미노산은 결실되는 것인 단백질.
  128. 제121항에 있어서, 106번 위치의 루신이 세린으로 치환되는 것인 단백질.
  129. 제117항에 있어서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 종양 항원에 결합하는 것인 단백질.
  130. 제117항에 있어서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 면역 효과기 세포 상의 항원에 결합하는 것인 단백질.
  131. 제117항에 있어서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 암세포 항원에 결합하는 것인 단백질.
  132. 제131항에 있어서, 상기 암세포 항원은 표면 항원인 것인 단백질.
  133. 제131항에 있어서, 상기 암세포 항원은 세포내 항원인 것인 단백질.
  134. 제116항에 있어서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 B 세포 항원에 결합하는 것인 단백질.
  135. 제135항에 있어서, 상기 B 세포 항원은 CD19, CD20, CD22, CD37, CD40, CD80 및 CD86 중에서 선택되는 것인 단백질.
  136. 제117항에 있어서, 상기 단일쇄 Fv는 B 세포 항원에 결합하는 것인 단백질.
  137. 제136항에 있어서, 상기 B 세포 항원은 CD19, CD20, CD22, CD37, CD40, CD80 및 CD86 중에서 선택되는 것인 단백질.
  138. 제137항에 있어서, 상기 단일쇄 Fv는 HD37 단일쇄 Fv, 2H7 단일쇄 Fv, G28-1 단일쇄 Fv 및 4.4.220 단일쇄 Fv 중에서 선택되는 것인 단백질.
  139. 제117항에 있어서, 상기 단일쇄 Fv는 HD37 단일쇄 Fv, 2H7 단일쇄 Fv, G28-1 단일쇄 Fv, FC2-2, UCHL-1, 5B9, L6, 10A8, 2e12, 40.2.36, G19-4, 1D8 및 4.4.220 단일쇄 Fv 중에서 선택되는 것인 단백질.
  140. 제116항에 있어서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 B 세포 분화 항원에 결합하는 scFv인 것인 단백질.
  141. 제136항에 있어서, 상기 B 세포 항원은 CD19, CD20, CD22, CD37 및 CD40 중에서 선택되는 것인 단백질.
  142. 제116항에 있어서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD8, CD10, CD11b, CD14, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD28, CD30, CD37, CD40, CD43, CD50(ICAM3), CD54(ICAM1), CD56, CD69, CD80, CD86, CD134(OX40), CD137(41BB), CD152(CTLA-4), CD153(CD30 리간드), CD154(CD40 리간드), ICOS, L6, B7-H1 및 HLA 클래스 II 중에서 선택된 표적에 결합하는 것인 단백 질.
  143. 제116항에 있어서, 상기 단백질 중 둘 이상을 포함하는 복합체를 형성할 수 있는 단백질.
  144. 제143항에 있어서, 상기 복합체는 이량체인 단백질.
  145. 제116항에 있어서, 단량체인 단백질.
  146. 제116항에 있어서, 약물, 독소, 면역조절제, 폴리펩티드 효과기, 동위원소, 라벨 또는 효과기 부분에 커플링되는 것인 단백질.
  147. 제116항에 있어서, 상기 면역 활성은 항체 의존성 세포 매개형 세포 독성, 보체 결합, 아폽토시스 유도, 생물학적으로 활성인 하나 이상의 신호의 유도, 하나 이상의 면역 효과기 세포의 유도, 세포 분화의 활성화, 세포 활성화, 생물학적으로 활성인 하나 이상의 분자의 방출 및 감염성 물질 또는 독소의 중화 중에서 선택되는 것인 단백질.
  148. 제147항에 있어서, 단백질 키나제, 단백질 포스파타제, G-단백질, 환형 뉴클레오티드 또는 다른 2차 메신저, 이온 채널 및 분비성 경로 성분 중에서 선택된 하 나 이상의 분자를 활성화 또는 억제시켜 생물학적으로 활성인 신호를 유도할 수 있는 것인 단백질.
  149. 제147항에 있어서, NK 세포, 단핵구, 대식 세포, B 세포, T 세포, 비만 세포, 호중구, 호산구 및 호염구 중에서 선택된 하나 이상의 면역 효과기 세포를 유도할 수 있는 것인 단백질.
  150. 제149항에 있어서, 상기 하나 이상의 면역 효과기 세포의 유도는 항체 의존성 세포 매개형 세포 독성 반응 또는 생물학적으로 활성인 하나 이상의 분자의 방출을 유도하는 것인 단백질.
  151. 제147항에 있어서, 세포를 활성화시킬 수 있으며, 상기 활성화는 세포 전사 활성의 변화를 유도하는 것인 단백질.
  152. 제151항에 있어서, 상기 세포 전사 활성을 증가시키는 것인 단백질.
  153. 제151항에 있어서, 상기 세포 전사 활성을 감소시키는 것인 단백질.
  154. 제147항에 있어서, 생물학적으로 활성인 상기 하나 이상의 분자는 프로테아제인 것인 단백질.
  155. 제147항에 있어서, 생물학적으로 활성인 상기 하나 이상의 분자는 사이토카인인 것인 단백질.
  156. 제155항에 있어서, 상기 사이토카인은 모노카인, 림포카인, 케모카인, 성장 인자, 콜로니 자극 인자, 인터페론 및 인터루킨 중에서 선택되는 것인 단백질.
  157. 제147항에 있어서, 감염성 물질을 중화시킬 수 있으며, 상기 감염성 물질은 박테리아, 바이러스, 기생충 또는 진균류인 것인 단백질.
  158. 제147항에 있어서, 독소를 중화시킬 수 있으며, 상기 독소는 내독소 및 외독소 중에서 선택되는 것인 단백질.
  159. 제147항에 있어서, 독소를 중화시킬 수 있으며, 상기 독소는 탄저균 독소, 콜레라 독소, 디프테리아 독소, 백일해 독소, 이.콜라이 열-불안정성 독소 LT, 이.콜라이 열 안정성 독소 ST, 시가 독소, 슈도모나스 외독소 A, 보툴리누스 독소, 파상풍 독소, 보르데텔라 페르투시스 AC 독소 및 바실러스 안트라시스 EF 중에서 선택된 외독소인 것인 단백질.
  160. 제147항에 있어서, 독소를 중화시킬 수 있으며, 상기 독소는 색시톡신, 테트 로도톡신, 버섯 독소, 아플라톡신, 피롤리지딘 알칼로이드, 피토헤마글루티닌 및 그라야노톡신 중에서 선택된 내독소인 것인 단백질.
  161. 제116항에 있어서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 결합 도메인 링커에 의해 상기 중쇄 가변 영역에 결합된 경쇄 가변 영역을 포함하며, 상기 결합 도메인 링커는 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser을 가지는 하나 이상의 펩티드를 포함하는 것인 단백질.
  162. 제116항에 있어서, 3개의 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser 펩티드를 포함하는 것인 단백질.
  163. 제116항에 있어서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 인간, 뮤린, 래트, 돼지 및 원숭이 중에서 선택된 종에서 얻은 야생형 및 유전자 조작된 면역글로불린 가변 영역을 포함하는 것인 단백질.
  164. 제116항에 있어서, 세포내 표적에 결합하여 세포 기능에 효과를 미칠 수 있는 것인 단백질.
  165. 제116항에 있어서, 상기 N-말단 절두형 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드는 면역글로불린 중쇄 IgG CH3 불변 영역 폴리펩티드에 결합된 IgG CH2 불변 영역 폴리펩티드를 포함하는 것인 단백질.
  166. 제116항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드는 기능적으로 활성인 CH1 도메인이 없는 것인 단백질.
  167. 제116항에 있어서, 상기 N-말단 절두형 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드는 본질적으로 면역글로불린 중쇄 IgG CH3 불변 영역 폴리펩티드에 결합된 IgG CH2 불변 영역 폴리펩티드로 이루어지는 것인 단백질.
  168. 제116항에 있어서, 인간 불변 영역의 적어도 일부분을 포함하는 것인 단백질.
  169. 제116항에 있어서, 상기 연결 영역은 인간 힌지 또는 이의 일부분, 인간 IgG 힌지 또는 이의 일부분, 인간 IgA 힌지 또는 이의 일부분, 인간 IgE 힌지 또는 이의 일부분, 카멜리드 힌지 영역 또는 이의 일부분, IgG1 라마 힌지 영역 또는 이의 일부분, 너스 상어 힌지 영역 또는 이의 일부분, 및 반점 은상어 힌지 영역 또는 이의 일부분 중에서 선택된 자연 발생적 힌지 영역을 포함하는 것인 단백질.
  170. 제116항에 있어서, 상기 연결 영역은 인간 IgE 힌지 또는 이의 일부분을 포함하는 것인 단백질.
  171. 제116항에 있어서, 상기 연결 영역은 시스테인 잔기가 0개 또는 1개인 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 힌지 영역을 포함하는 것인 단백질.
  172. 제116항에 있어서, 상기 연결 영역은 시스테인 잔기가 0∼2개인 인간 IgGA 힌지 영역을 포함하는 것인 단백질.
  173. 제116항에 있어서, 상기 연결 영역은 야생형 인간 IgG1 면역글로불린 힌지 영역을 포함하는 것인 단백질.
  174. 제116항에 있어서, 상기 연결 영역은 글리코실화 부위를 포함하는 것인 단백질.
  175. 제116항에 있어서, 상기 연결 영역은 이황화 결합을 형성할 수 있는 시스테인 잔기를 가지고 있지 않은 것인 단백질.
  176. 제116항에 있어서, 상기 연결 영역은 1개의 시스테인 잔기를 가지는 것인 단백질.
  177. 제116항에 있어서, 상기 연결 영역은 1개 이하의 시스테인 잔기를 포함하는 돌연변이된 야생형 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드를 포함하는 것인 단백질.
  178. 제116항에 있어서, 상기 연결 영역이 변경되어, 감소된 이량체화 능력을 가지는 것인 단백질.
  179. 제116항에 있어서, 상기 연결 영역은 프롤린 및 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기를 포함하며, 상기 제1 시스테인 잔기는 상기 제2 시스테인의 N-말단 쪽에 위치하고, 상기 제2 시스테인은 상기 제3 시스테인의 N-말단 쪽에 위치하며, 상기 제3 시스테인 잔기는 상기 프롤린 잔기의 N-말단 쪽에 위치하는 것인 단백질.
  180. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 CTLA-4 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는데, 이 때 상기 CH2 도메인 중 238번 위치에서 프롤린이 세린으로 치환되는 것인 단백질.
  181. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 CTLA-4 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하고, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 단백질.
  182. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 FC2-2 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 단백질.
  183. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 UCHL-1 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 단백질.
  184. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 5B9 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3를 포함하는 것인 단백질.
  185. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 2H7 scFv 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 단백질.
  186. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 2H7 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 단백질.
  187. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 연결 영역을 포함하는 2H7 단일쇄 Fv를 포함하며, 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는데, 이 때 상기 CH3 영역 중 405번 위치에서 페닐알라닌이 티로신으로 치환되는 것인 단백질.
  188. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 2H7 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는데, 이 때 상기 CH3 영역 중 405번 위치에서 페닐알라닌이 알라닌으로 치환되는 것인 단백질.
  189. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 2H7 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함 하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는데, 이 때 상기 CH3 영역 중 407번 위치에서 티로신이 알라닌으로 치환되는 것인 단백질.
  190. 제189항에 있어서, 겉보기 분자량이 약 75 kDa인 것인 단백질.
  191. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 2H7 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는데, 이 때 상기 CH3 영역 중 405번 위치에서 페닐알라닌이 알라닌으로 치환되고 상기 CH3 영역 중 407번 위치에서 티로신이 알라닌으로 치환되는 것인 단백질.
  192. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 2H7 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 단백질.
  193. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 2H7 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 단백질.
  194. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 2H7 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1 및 제2 시스테인 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 단백질.
  195. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 연결 영역을 포함하는 2H7 단일쇄 Fv를 포함하며, 상기 제2 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 단백질.
  196. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 연결 영역을 포함하는 2H7 단일쇄 Fv를 포함하며, 상기 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 단백질.
  197. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 2H7 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함 하며, 연결 영역 중 상기 제1 시스테인 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 2H7 단일쇄 Fv CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 단백질.
  198. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 HD37 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 단백질.
  199. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 2H7 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하고, 상기 중쇄 불변 영역은 라마 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 불변 영역 폴리펩티드를 포함하는 것인 단백질.
  200. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 2H7 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하고, 상기 중쇄 불변 영역은 라마 IgG2 유래의 CH2 및 CH3 불변 영역 폴리펩티드를 포함하는 것인 단백질.
  201. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 2H7 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하고, 상기 중쇄 불변 영역은 라마 IgG3 유래의 CH2 및 CH3 불변 영역 폴리펩티드를 포함하는 것인 단백질.
  202. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 CD-16-6 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는데, 이 때 상기 CH2 영역 중 238번 위치에서 프롤린이 세린으로 치환되는 것인 단백질.
  203. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 CD-16 수용체 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는데, 이 때 상기 CH2 영역 중 238번 위치에서 프롤린이 세린으로 치환되는 것인 단백질.
  204. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 2e12 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는데, 이 때 상기 CH2 영역 중 238번 위치에서 프롤린이 세린으로 치환되며, 상기 CH3 도메인은 CD80 막통과 및 세포질 꼬리 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는 것인 단백질.
  205. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 10A8 scFv 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는데, 이 때 상기 CH2 영역 중 238번 위치에서 프롤린이 세린으로 치환되며, 상기 CH3 도메인은 CD80 막통과 및 세포질 꼬리 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는 것인 단백질.
  206. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 40.2.36 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는데, 이 때 상기 CH2 영역 중 238번 위치에서 프롤린이 세린으로 치환되며, 상기 CH3 도메인은 CD80 막통과 및 세포질 꼬리 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는 것인 단백질.
  207. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 2H7 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는데, 이 때 상기 CH2 영역 중 238번 위 치에서 프롤린이 세린으로 치환되며, 상기 CH3 도메인은 CD80 막통과 및 세포질 꼬리 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는 것인 단백질.
  208. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 G19-4 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는데, 이 때 상기 CH2 영역 중 238번 위치에서 프롤린이 세린으로 치환되며, 상기 CH3 도메인은 CD80 막통과 및 세포질 꼬리 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는 것인 단백질.
  209. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 G19-4 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는데, 이 때 상기 CH3 도메인은 CD80 막통과 및 세포질 꼬리 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는 것인 단백질
  210. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 2e12 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는데, 이 때 상기 CH3 도메인은 CD80 막 통과 및 세포질 꼬리 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는 것인 단백질.
  211. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 2e12 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는데, 이 때 상기 CH2 영역 중 238번 위치에서 프롤린이 세린으로 치환되며, 상기 CH3 도메인은 mFADD 막통과 및 세포질 꼬리 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는 것인 단백질.
  212. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 2e12 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는데, 이 때 상기 CH3 도메인은 mFADD 막통과 및 세포질 꼬리 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는 것인 단백질.
  213. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 2e12 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는데, 이 때 상기 CH3 도메인은 mcasp3 막통과 및 세포질 꼬리 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는 것인 단백질.
  214. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 2e12 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는데, 이 때 상기 CH2 영역 중 238번 위치에서 프롤린이 세린으로 치환되며, 상기 CH3 도메인은 mcasp3 막통과 및 세포질 꼬리 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는 것인 단백질.
  215. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 2e12 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는데, 이 때 상기 CH3 도메인은 mcasp8 막통과 및 세포질 꼬리 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는 것인 단백질.
  216. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 2e12 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는데, 이 때 상기 CH2 영역 중 238번 위 치에서 프롤린이 세린으로 치환되며, 상기 CH3 도메인은 mcasp8 막통과 및 세포질 꼬리 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는 것인 단백질.
  217. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 2e12 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는데, 이 때 상기 CH3 도메인은 hcasp3 막통과 및 세포질 꼬리 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는 것인 단백질.
  218. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 2e12 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는데, 이 때 상기 CH2 영역 중 238번 위치에서 프롤린이 세린으로 치환되며, 상기 CH3 도메인은 hcasp3 막통과 및 세포질 꼬리 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는 것인 단백질.
  219. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 2e12 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역 은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는데, 이 때 상기 CH3 도메인은 hcasp8 막통과 및 세포질 꼬리 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는 것인 단백질.
  220. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 2e12 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는데, 이 때 상기 CH2 영역 중 238번 위치에서 프롤린이 세린으로 치환되며, 상기 CH3 도메인은 hcasp8 막통과 및 세포질 꼬리 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는 것인 단백질.
  221. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 2e12 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는데, 이 때 상기 CH3 도메인은 CD80 막통과 및 세포질 꼬리 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는 것인 단백질.
  222. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 1D8 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는데, 이 때 상기 CH2 영역 중 238번 위 치에서 프롤린이 세린으로 치환되며, 상기 CH3 도메인은 CD80 막통과 및 세포질 꼬리 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는 것인 단백질.
  223. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 1D8 scFv 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는데, 이 때 상기 CH3 도메인은 CD80 막통과 및 세포질 꼬리 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는 것인 단백질.
  224. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 1D8 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는데, 이 때 상기 CH2 영역 중 238번 위치에서 프롤린이 세린으로 치환되며, 상기 CH3 도메인은 mFADD 막통과 및 세포질 꼬리 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는 것인 단백질.
  225. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 1D8 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는데, 이 때 상기 CH3 도메인은 mFADD 막통과 및 세포질 꼬리 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는 것인 단백질.
  226. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 1D8 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는데, 이 때 상기 CH3 도메인은 mcasp3 막통과 및 세포질 꼬리 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는 것인 단백질.
  227. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 1D8 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는데, 이 때 상기 CH2 영역 중 238번 위치에서 프롤린이 세린으로 치환되며, 상기 CH3 도메인은 mcasp3 막통과 및 세포질 꼬리 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는 것인 단백질.
  228. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 1D8 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는데, 이 때 상기 CH3 도메인은 mcasp8 막통과 및 세포질 꼬리 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는 것인 단백질.
  229. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 1D8 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는데, 이 때 상기 CH2 영역 중 238번 위치에서 프롤린이 세린으로 치환되며, 상기 CH3 도메인은 mcasp8 막통과 및 세포질 꼬리 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는 것인 단백질.
  230. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 1D8 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는데, 이 때 상기 CH3 도메인은 hcasp3 막통과 및 세포질 꼬리 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는 것인 단백질.
  231. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 1D8 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는데, 이 때 상기 CH2 영역 중 238번 위치에서 프롤린이 세린으로 치환되며, 상기 CH3 도메인은 hcasp3 막통과 및 세포질 꼬리 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는 것인 단백질.
  232. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 1D8 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는데, 이 때 상기 CH3 도메인은 hcasp8 막통과 및 세포질 꼬리 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는 것인 단백질.
  233. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 1D8 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는데, 이 때 상기 CH2 영역 중 238번 위치에서 프롤린이 세린으로 치환되며, 상기 CH3 도메인은 hcasp8 막통과 및 세포질 꼬리 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는 것인 단백질.
  234. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 L6 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함 하며, 연결 영역 중 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 단백질.
  235. 제179항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 연결 영역을 포함하는 G28-1 단일쇄 Fv를 포함하며, 상기 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린으로 치환되고, 상기 프롤린 잔기는 세린으로 치환되며, 상기 중쇄 불변 영역은 G28-1 단일쇄 Fv CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 단백질.
  236. 약 150 kD 미만인 단백질의 치료적 유효량을 피험체에 투여하는 것을 포함하는, 피험체 중 표적 세포군을 감소시키는 방법으로서,
    a) 상기 표적 세포군 내 세포에 결합하는 제1 단백질 또는 펩티드로 표적 세포군을 처리하는 단계, 및
    b) i) Fc 수용체에의 결합, ii) 표적 세포 아폽토시스의 유도 또는 iii) 보체 고정 중 하나 이상을 할 수 있는 제2 단백질 또는 펩티드로 표적 세포군을 처리하는 단계
    를 포함하며, 이 때 상기 제1 단백질 또는 펩티드 분자는 상기 제2 단백질 또는 펩티드 분자에 직접 연결되거나, 또는 경우에 따라 상기 제1 단백질 또는 펩티드 분자와 상기 제2 단백질 또는 펩티드 분자가 제3 단백질 또는 펩티드 분자에 의해 연결되며, 상기 단백질 분자는 항체, TNF 패밀리 또는 TNF 수용체 패밀리의 구성원이 아니고, 박테리아 독소, 세포 독성 약물 또는 방사능 동위원소에 접합되지 않는 것인 방법.
  237. 약 150 kD 미만인 단백질의 치료적 유효량을 피험체에 투여하는 것을 포함하는, 피험체 중 표적 세포군을 감소시키는 방법으로서, 본질적으로
    a) 상기 표적 세포군 내 세포에 결합하는 제1 단백질 또는 펩티드로 표적 세포군을 처리하는 단계, 및
    b) i) Fc 수용체에의 결합, ii) 표적 세포 아폽토시스의 유도 또는 iii) 보체 고정 중 하나 이상을 할 수 있는 제2 단백질 또는 펩티드로 표적 세포군을 처리하는 단계
    로 이루어지며, 이 때 상기 제1 단백질 또는 펩티드 분자는 상기 제2 단백질 또는 펩티드 분자에 직접 연결되거나, 또는 경우에 따라 상기 제1 단백질 또는 펩티드 분자와 상기 제2 단백질 또는 펩티드 분자가 제3 단백질 또는 펩티드 분자에 의해 연결되며, 상기 단백질 분자는 항체, TNF 패밀리 또는 TNF 수용체 패밀리의 구성원이 아니고, 박테리아 독소, 세포 독성 약물 또는 방사능 동위원소에 접합되지 않는 것인 방법.
  238. i) 표적 분자에 결합할 수 있는 결합 도메인 폴리펩티드를 가지는 제1 폴리펩티드로서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산이 결실 또는 치환된 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 제1 폴리펩티드;
    ii) 상기 제1 폴리펩티드에 결합되고 연결 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드; 및
    iii) 상기 제2 폴리펩티드에 결합되고 N-말단 절두형 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드를 포함하는 제3 폴리펩티드
    를 포함하는 비자연 발생적 단일쇄 단백질로서, 하나 이상의 면역 활성을 나타낼 수 있는 것인 비자연 발생적 단일쇄 단백질.
  239. i) 표적 분자에 결합할 수 있는 결합 도메인 폴리펩티드를 가지는 제1 폴리펩티드로서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 12번, 80번, 81번, 83번, 105번, 106번 및 107번 위치에서 하나 이상의 아미노산이 결실 또는 치환된 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 제1 폴리펩티드;
    ii) 상기 제1 폴리펩티드에 결합되고 연결 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드; 및
    iii) 상기 제2 폴리펩티드에 결합되고 N-말단 절두형 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드를 포함하는 제3 폴리펩티드
    를 포함하는 비자연 발생적 단일쇄 단백질로서, 하나 이상의 면역 활성을 나타낼 수 있는 것인 비자연 발생적 단일쇄 단백질.
  240. 제238항에 있어서, 상기 경쇄 가변 영역 중 하나 이상의 아미노산이 치환 또는 결실되는 것이 상기 결실 또는 치환이 일어나지 않은 단백질에 비해 상기 단백 질의 발현 또는 안정성을 증가시키는 데 효과적인 것인 단백질.
  241. 제238항에 있어서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 단일쇄 Fv인 것인 단백질.
  242. 제238항에 있어서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 면역글로불린 경쇄 가변 영역 폴리펩티드 및 면역글로불린 중쇄 가변 영역 폴리펩티드를 포함하는 것인 단백질.
  243. 제242항에 있어서, 제2 표적 분자에 결합할 수 있는 제2 결합 도메인 폴리펩티드를 더 포함하며, 상기 제2 결합 도메인 폴리펩티드는 면역글로불린 경쇄 가변 영역 폴리펩티드 및 면역글로불린 중쇄 가변 영역 폴리펩티드를 포함하는 것인 단백질.
  244. 제241항에 있어서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 단일쇄 Fv이고, 상기 단일쇄 Fv의 상기 경쇄 가변 영역은 106번 위치의 아미노산이 결실되거나 치환된 것인 단백질.
  245. 제241항에 있어서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 단일쇄 Fv이고, 상기 단일쇄 Fv의 중쇄 가변 영역의 106번 위치의 아미노산이 결실된 것인 단백질.
  246. 제238항에 있어서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 단일쇄 Fv이고, 상기 단일쇄 Fv의 상기 경쇄 가변 영역은 106번 위치의 아미노산이 치환된 것인 단백질.
  247. 제244항에 있어서, 106번 위치의 루신이 세린으로 치환되는 것인 단백질.
  248. 제244항에 있어서, 106번 위치의 루신이 데스-루신으로 치환되는 것인 단백질.
  249. 제244항에 있어서, 단일쇄 Fv 경쇄 가변 영역의 106번 위치의 아미노산에 대해 치환된 아미노산은 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 글루타민, 아스파르트산, 글루탐산, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘 중에서 선택되는 것인 단백질.
  250. 제244항에 있어서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 중쇄 가변 영역을 포함하는 단일쇄 Fv이며, 상기 중쇄 가변 영역은 11번 위치의 아미노산이 치환되는 것인 단백질.
  251. 제241항에 있어서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 종양 항원에 결합하는 것인 단백질.
  252. 제241항에 있어서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 면역 효과기 세포 상의 항원에 결합하는 것인 단백질.
  253. 제241항에 있어서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 암세포 항원에 결합하는 것인 단백질.
  254. 제253항에 있어서, 상기 암세포 항원은 표면 항원인 것인 단백질.
  255. 제253항에 있어서, 상기 암세포 항원은 세포내 항원인 것인 단백질.
  256. 제238항에 있어서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 B 세포 항원에 결합하는 것인 단백질.
  257. 제256항에 있어서, 상기 B 세포 항원은 CD19, CD20, CD22, CD37, CD40, CD80 및 CD86 중에서 선택되는 것인 단백질.
  258. 제241항에 있어서, 상기 단일쇄 Fv는 B 세포 항원에 결합하는 것인 단백질.
  259. 제258항에 있어서, 상기 B 세포 항원은 CD19, CD20, CD22, CD37, CD40, CD80 및 CD86 중에서 선택되는 것인 단백질.
  260. 제259항에 있어서, 상기 단일쇄 Fv는 HD37 단일쇄 Fv, 2H7 단일쇄 Fv, G28-1 단일쇄 Fv 및 4.4.220 단일쇄 Fv 중에서 선택되는 것인 단백질.
  261. 제238항에 있어서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 B 세포 분화 항원에 결합하는 scFv인 것인 단백질.
  262. 제261항에 있어서, 상기 B 세포 항원은 CD19, CD20, CD22, CD37 및 CD40 중에서 선택되는 것인 단백질.
  263. 제238항에 있어서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD8, CD10, CD11b, CD14, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD28, CD30, CD37, CD40, CD43, CD50(ICAM3), CD54(ICAM1), CD56, CD69, CD80, CD86, CD134(OX40), CD137(41BB), CD152(CTLA-4), CD153(CD30 리간드), CD154(CD40 리간드), ICOS, L6, B7-H1 및 HLA 클래스 II 중에서 선택된 표적에 결합하는 것인 단백질.
  264. 제238항에 있어서, 상기 단백질 중 둘 이상을 포함하는 복합체를 형성할 수 있는 것인 단백질.
  265. 제264항에 있어서, 상기 복합체는 이량체인 단백질.
  266. 제238항에 있어서, 단량체인 단백질.
  267. 제283항에 있어서, 상기 면역 활성은 항체 의존성 세포 매개형 세포 독성, 보체 결합, 아폽토시스 유도, 생물학적으로 활성인 하나 이상의 신호의 유도, 하나 이상의 면역 효과기 세포의 유도, 세포 분화의 활성화, 세포 활성화, 생물학적으로 활성인 하나 이상의 분자의 방출 및 감염성 물질 또는 독소의 중화 중에서 선택되는 것인 단백질.
  268. 제267항에 있어서, 단백질 키나제, 단백질 포스파타제, G-단백질, 환형 뉴클레오티드 또는 다른 2차 메신저, 이온 채널 및 분비성 경로 성분 중에서 선택된 하나 이상의 분자를 활성화 또는 억제시켜 생물학적으로 활성인 신호를 유도할 수 있는 것인 단백질.
  269. 제267항에 있어서, NK 세포, 단핵구, 대식 세포, B 세포, T 세포, 비만 세포, 호중구, 호산구 및 호염구 중에서 선택된 하나 이상의 면역 효과기 세포를 유도할 수 있는 것인 단백질.
  270. 제267항에 있어서, 상기 하나 이상의 면역 효과기 세포의 유도는 항체 의존성 세포 매개형 세포 독성 반응 또는 생물학적으로 활성인 하나 이상의 분자의 방출을 유도하는 것인 단백질.
  271. 제267항에 있어서, 세포를 활성화시킬 수 있으며, 상기 활성화는 세포 전사 활성에 변화를 유도하는 것인 단백질.
  272. 제271항에 있어서, 상기 세포 전사 활성을 증가시키는 것인 단백질.
  273. 제271항에 있어서, 상기 세포 전사 활성을 감소시키는 것인 단백질.
  274. 제267항에 있어서, 생물학적으로 활성인 상기 하나 이상의 분자는 프로테아제인 것인 단백질.
  275. 제267항에 있어서, 생물학적으로 활성인 상기 하나 이상의 분자는 사이토카인인 것인 단백질.
  276. 제275항에 있어서, 상기 사이토카인은 모노카인, 림포카인, 케모카인, 성장 인자, 콜로니 자극 인자, 인터페론 및 인터루킨 중에서 선택되는 것인 단백질.
  277. 제267항에 있어서, 감염성 물질을 중화시킬 수 있으며, 상기 감염성 물질은 박테리아, 바이러스, 기생충 또는 진균류인 것인 단백질.
  278. 제267항에 있어서, 독소를 중화할 수 있으며, 상기 독소는 내독소 및 외독소 중에서 선택되는 것인 단백질.
  279. 제267항에 있어서, 독소를 중화할 수 있으며, 상기 독소는 탄저균 독소, 콜레라 독소, 디프테리아 독소, 백일해 독소, 이.콜라이 열-불안정성 독소 LT, 이.콜라이 열 안정성 독소 ST, 시가 독소, 슈노모나스 외독소 A, 보툴리누스 독소, 파상풍 독소, 보르데텔라 페르투시스 AC 독소 및 바실러스 안트라시스 EF 중에서 선택된 외독소인 것인 단백질.
  280. 제267항에 있어서, 독소를 중화할 수 있으며, 상기 독소는 색시톡신, 테트로도톡신, 버섯 독소, 아플라톡신, 피롤리지딘 알칼로이드, 피토헤마글루티닌 및 그라야노톡신 중에서 선택된 내독소인 것인 단백질.
  281. 제238항에 있어서, 세포내 표적에 결합하여 세포 기능에 효과를 미칠 수 있는 것인 단백질.
  282. 제238항에 있어서, 상기 N-말단 절두형 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩 티드는 면역글로불린 중쇄 IgG CH3 불변 영역 폴리펩티드에 결합된 IgG CH2 불변 영역 폴리펩티드를 포함하는 것인 단백질
  283. 제238항에 있어서, 상기 N-말단 절두형 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드는 본질적으로 면역글로불린 중쇄 IgG CH3 불변 영역 폴리펩티드에 결합된 IgG CH2 불변 영역 폴리펩티드로 이루어지는 것인 단백질.
  284. 제238항에 있어서, 인간 불변 영역의 적어도 일부분을 포함하는 것인 단백질.
  285. 제238항에 있어서, 상기 연결 영역은 인간 힌지 또는 이의 일부분, 인간 IgG 힌지 또는 이의 일부분, 인간 IgA 힌지 또는 이의 일부분, 인간 IgE 힌지 또는 이의 일부분, 카멜리드 힌지 영역 또는 이의 일부분, IgG1 라마 힌지 영역 또는 이의 일부분, 너스 상어 힌지 영역 또는 이의 일부분, 및 반점 은상어 힌지 영역 또는 이의 일부분 중에서 선택된 자연 발생적 힌지 영역을 포함하는 것인 단백질.
  286. 제238항에 있어서, 상기 연결 영역은 인간 IgE 힌지 또는 이의 일부분을 포함하는 것인 단백질.
  287. 제238항에 있어서, 상기 연결 영역은 시스테인 잔기가 0∼1개인 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 힌지 영역을 포함하는 것인 단백질.
  288. 제238항에 있어서, 상기 연결 영역은 시스테인 잔기가 0∼2개인 인간 IgGA 힌지 영역을 포함하는 것인 단백질.
  289. 제238항에 있어서, 상기 연결 영역은 야생형 인간 IgG1 면역글로불린 힌지 영역을 포함하는 것인 단백질.
  290. 제238항에 있어서, 상기 연결 영역은 글리코실화 부위를 포함하는 것인 단백질.
  291. 제238항에 있어서, 상기 연결 영역은 이황화 결합을 형성할 수 있는 시스테인 잔기를 가지고 있지 않은 것인 단백질.
  292. 제238항에 있어서, 상기 연결 영역은 1개의 시스테인 잔기를 가지는 것인 단백질.
  293. 제238항에 있어서, 상기 연결 영역은 1개 이하의 시스테인 잔기를 포함하는 돌연변이된 야생형 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드를 포함하는 것인 단백질.
  294. 제238항에 있어서, 상기 연결 영역이 변경되어, 감소된 이량체화 능력을 가지는 것인 단백질.
  295. 제238항에 있어서, 상기 연결 영역은 프롤린 및 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기를 포함하며, 상기 제1 시스테인 잔기는 상기 제2 시스테인의 N-말단 쪽에 위치하고, 상기 제2 시스테인은 상기 제3 시스테인의 N-말단 쪽에 위치하며, 상기 제3 시스테인 잔기는 상기 프롤린 잔기의 N-말단 쪽에 위치하는 것인 단백질.
  296. 표적 분자에 결합할 수 있는 결합 도메인 폴리펩티드를 포함하는 제1 폴리펩티드, 상기 제1 폴리펩티드에 결합되고 연결 영역[IgA 힌지 영역의 적어도 일부분을 포함함]을 포함하는 제2 폴리펩티드, 상기 제2 폴리펩티드에 결합되고 N-말단 절두형 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드를 포함하는 제3 폴리펩티드를 포함하는, 하나 이상의 면역 활성을 나타낼 수 있는 것인 비자연 발생적 단일쇄 단백질.
  297. 제296항에 있어서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 면역글로불린 경쇄 가변 영역 폴리펩티드 및 면역글로불린 중쇄 가변 영역 폴리펩티드를 포함하는 것인 단백질.
  298. 제297항에 있어서, 제2 표적 분자에 결합할 수 있는 제2 결합 도메인 폴리펩 티드를 포함하며, 상기 제2 결합 도메인 폴리펩티드는 면역글로불린 경쇄 가변 영역 폴리펩티드 및 면역글로불린 중쇄 가변 영역 폴리펩티드를 포함하는 것인 단백질.
  299. 제296항에 있어서, 상기 연결 영역은 본질적으로 IgA 힌지 영역의 적어도 일부분으로 이루어지는 것인 단백질.
  300. 제296항에 있어서, 상기 연결 영역은 본질적으로 IgA 힌지 영역으로 이루어지는 것인 단백질.
  301. 제300항에 있어서, 겉보기 분자량이 약 70 kDa 이상인 단백질로서 발현되는 것인 단백질.
  302. 제300항에 있어서, 겉보기 분자량이 약 70∼약 700 kDa인 단백질로서 발현되는 것인 단백질.
  303. 제296항에 있어서, 상기 연결 영역은 아미노산을 10∼50개 포함하는 것인 단백질.
  304. 제296항에 있어서, 상기 연결 영역은 변형된 인간 IgA 면역글로불린 힌지 영 역 폴리펩티드를 포함하는 것인 단백질.
  305. 제296항에 있어서, 상기 연결 영역은 시스테인 잔기를 하나만 가지는 것인 단백질.
  306. 제296항에 있어서, 상기 연결 영역은 시스테인 잔기를 2개 가지는 것인 단백질.
  307. 제296항에 있어서, 제3 폴리펩티드 중 상기 N-말단 절두형 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드는 IgA 면역글로불린 중쇄 불변 영역을 포함하는 것인 단백질.
  308. 제307항에 있어서, IgA 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 단백질.
  309. 제308항에 있어서, 상기 IgA CH3 불변 영역 도메인은 IgA 중쇄 불변 영역이 J쇄 폴리펩티드와 회합할 수 없게 하는 아미노산 1개 이상의 치환 또는 결실을 포함하는 것인 단백질.
  310. 제308항에 있어서, 상기 IgA 중쇄 불변 영역은 J쇄 폴리펩티드와 회합할 수 있는 것인 단백질.
  311. 제309항에 있어서, 상기 IgA CH3 영역 도메인은 아미노산 4∼20개가 결실된 것인 단백질.
  312. 제309항에 있어서, 상기 IgA 영역 도메인은 아미노산 4개가 결실된 것인 단백질.
  313. 제309항에 있어서, 상기 IgA 영역 도메인은 아미노산 20개가 결실된 것인 단백질.
  314. 제296항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 L6 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역은 IgA 힌지 영역 또는 이의 일부분을 포함하고, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 단백질.
  315. 제296항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 L6 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역은 IgA 힌지 영역 또는 이의 일부분을 포함하고, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 단백질.
  316. 제296항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 CTLA-4 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역은 IgA 힌지 영역 또는 이의 일부분을 포함하고, 상기 중쇄 불변 영역은 뮤린 IgA 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 단백질.
  317. 제296항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 CTLA-4 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역은 IgA 힌지 영역 또는 이의 일부분을 포함하고, 상기 중쇄 불변 영역은 뮤린 IgA 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하며, 상기 CH3 도메인은 IgA 중쇄 불변 영역이 J쇄 폴리펩티드와 회합할 수 없게 하는 아미노산 4개의 결실 또는 치환을 포함하는 것인 단백질.
  318. 제296항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 2H7 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역은 IgA 힌지 영역 또는 이의 일부분을 포함하고, 상기 중쇄 불변 영역은 뮤린 IgA 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 단백질.
  319. 제296항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 2H7 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 상기 연결 영역은 IgA 힌지 또는 이의 일부분을 포함하고, 상기 중쇄 불변 영역은 IgA 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하며, 이 때 상 기 CH3 도메인은 IgA 중쇄 불변 영역이 J쇄 폴리펩티드와 회합할 수 없게 하는 아미노산 18개의 결실 또는 치환을 포함하는 것인 단백질.
  320. 제296항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 2e12 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 상기 연결 영역은 IgA 힌지 또는 이의 일부분을 포함하고, 상기 중쇄 불변 영역은 IgA 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하며, 이 때 상기 CH3 도메인은 IgA 중쇄 불변 영역이 J쇄 폴리펩티드와 회합할 수 없게 하는 아미노산 4개의 결실 또는 치환을 포함하고, 상기 CH3 도메인은 CD80 막통과 및 세포질 꼬리 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는 것인 단백질.
  321. 제296항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 2e12 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 상기 연결 영역은 IgA 힌지 또는 이의 일부분을 포함하고, 상기 중쇄 불변 영역은 IgA 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하며, 이 때 상기 CH3 도메인은 IgA 중쇄 불변 영역이 J쇄 폴리펩티드와 회합할 수 없게 하는 아미노산 4개의 결실 또는 치환을 포함하고, 상기 CH3 도메인은 CD80 막통과 및 세포질 꼬리 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는 것인 단백질.
  322. 제296항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 1D8 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 상기 연결 영역은 IgA 힌지 또는 이의 일부분을 포함하고, 상기 중쇄 불변 영역은 IgA 유래의 CH2 및 CH3 도메인으로 포함하며, 이 때 상기 CH3 도메인은 IgA 중쇄 불변 영역이 J쇄 폴리펩티드와 회합할 수 없게 하는 아미노산 4개의 결실 또는 치환을 포함하고, 상기 CH3 도메인은 CD80 막통과 및 세포질 꼬리 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는 것인 단백질.
  323. 제296항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 G28-1 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역은 IgA 힌지 영역 또는 이의 일부분을 포함하고, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 단백질.
  324. 제296항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 2H7 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역은 IgA 힌지 영역 또는 이의 일부분을 포함하고, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 단백질.
  325. 제296항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 2H7 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역은 IgA 힌지 영역 또는 이의 일부분을 포함하고, 상기 중쇄 불변 영역은 IgA 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하며, 이 때 상기 CH3 도메인은 IgA 중쇄 불변 영역이 J쇄 폴리펩티드와 회합할 수 없게 하는 아미노산 4개의 결실 또는 치환을 포함하고, 상기 CH3 도메인은 CD80 막통과 및 세포 질 꼬리 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는 것인 단백질.
  326. 제296항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 2H7 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역은 IgA 힌지 영역 또는 이의 일부분을 포함하고, 상기 중쇄 불변 영역은 IgA 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하며, 이 때 상기 IgA 중쇄 불변 영역은 J쇄 폴리펩티드와 회합할 수 있는 것인 단백질.
  327. 제296항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 HD37 하이브리도마 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하며, 연결 영역은 IgA 힌지 영역 또는 이의 일부분을 포함하고, 상기 중쇄 불변 영역은 IgA 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 단백질.
  328. i) 표적 분자에 결합할 수 있는 결합 도메인 폴리펩티드를 포함하는 제1 폴리펩티드, 및
    ii) 제2 폴리펩티드에 결합된 IgE 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드의 적어도 일부분을 포함하는 제2 폴리펩티드
    를 포함하는 비자연 발생적 단일쇄 단백질로서, 하나 이상의 면역 활성을 나타낼 수 있는 것인 비자연 발생적 단일쇄 단백질.
  329. 제328항에 있어서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 비-IgE 가변 영역을 포함 하는 것인 단백질.
  330. 제328항에 있어서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 HD37 단일쇄 Fv, 2H7 단일쇄 Fv, G28-1 단일쇄 Fv, FC2-2, UCHL-1, 5B9, L6, 10A8, 2e12, 40.2.36, G19-4, 1D8 및 4.4.220 단일쇄 Fv 중에서 선택된 단일쇄 Fv인 것인 단백질.
  331. 제328항에 있어서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 면역글로불린 경쇄 가변 영역 폴리펩티드 및 면역글로불린 중쇄 가변 영역 폴리펩티드를 포함하는 것인 단백질.
  332. 제331항에 있어서, 제2 표적 분자에 결합할 수 있는 제2 결합 도메인 폴리펩티드를 더 포함하며, 상기 제2 결합 도메인 폴리펩티드는 면역글로불린 경쇄 가변 영역 폴리펩티드 및 면역글로불린 중쇄 가변 영역 폴리펩티드를 포함하는 것인 단백질.
  333. 제332항에 있어서, 상기 면역글로불린 경쇄 및 중쇄는 IgG 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 또는 이의 일부분을 포함하는 것인 단백질.
  334. 제328항에 있어서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 IgG 면역글로불린 가변 영역의 적어도 일부분을 포함하는 것인 단백질.
  335. 제334항에 있어서, 상기 IgG 가변 영역은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 단백질.
  336. 제328항에 있어서, IgE에 특이적인 Fc 수용체에 결합할 수 있는 것인 단백질.
  337. 제328항에 있어서, IgE 가변 쇄 영역이 없는 것인 단백질.
  338. 제328항에 있어서, 결합 도메인은 본질적으로 IgG 면역글로불린 경쇄 영역 및 IgG 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 영역으로 이루어지는 것인 단백질.
  339. 제328항에 있어서, 상기 IgE 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드는 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 단백질.
  340. 제328항에 있어서, 상기 IgE 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드는 CH2, CH3 및 CH4 도메인을 포함하는 것인 단백질.
  341. 제328항에 있어서, 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 중쇄 가변 영역을 포함하는 단일쇄 Fv이며, 상기 중쇄 가변 영역은 아미노산 11번 위치에서 아미노산이 치 환되는 것인 단백질.
  342. 제328항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 HD37 단일쇄 Fv, 2H7 단일쇄 Fv, G28-1 단일쇄 Fv 및 4.4.220 단일쇄 Fv 중에서 선택된 단일쇄 Fv인 것인 단백질.
  343. 제328항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 2H7 단일쇄 Fv 또는 G28-1 단일쇄 Fv를 포함하는 단일쇄 Fv인 것인 단백질.
  344. 비자연 발생적 단일쇄 단백질의 치료적 유효량을 피험체에 투여하는 것을 포함하는, 상기 피험체 중 표적 세포군을 감소시키는 방법으로서, 상기 단백질은 결합 도메인 폴리펩티드를 포함하는 제1 폴리펩티드[상기 결합 도메인 폴리펩티드는 IgG 가변 영역의 적어도 일부분을 포함하여 표적 분자에 결합할 수 있음], 상기 제1 폴리펩티드에 결합되고 연결 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드에 결합되고 IgE 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드를 포함하는 제3 폴리펩티드를 포함하고, 하나 이상의 면역 활성을 나타낼 수 있는 것인 방법.
  345. 제344항에 있어서, 상기 단백질을 환자의 혈류로 투여하는 것인 방법.
  346. 제344항에 있어서, 단백질의 투여 결과, 단핵구는 활성화되지만, 비만 세포는 활성화되지 않는 것인 방법.
  347. 제344항에 있어서, 단백질을 투여하거나, 또는 단백질을 히스타민 방출 차단제와 함께 공투여하는 것인 방법.
  348. 변형된 IgE 단백질을 동물의 혈류로 투여하는 것을 포함하는, 동물 중 세포를 고갈시키는 방법.
  349. 제348항에 있어서, 변형된 IgE 단백질을 투여하거나, 또는 변형된 IgE 단백질을 히스타민 방출 차단제와 함께 공투여하는 것인 방법.
  350. 제328항에 있어서, 상기 연결 영역은 IgG 힌지 또는 이의 일부분을 포함하고, 상기 중쇄 불변 영역은 IgE 유래이며 CH2 도메인 없이 CH3 및 CH4 도메인을 포함하는 것인 단백질.
  351. 제328항에 있어서, 상기 단일쇄 단백질은 2e12 유래의 단일쇄 Fv 결합 도메인을 포함하고, 상기 중쇄 불변 영역은 IgE CH2, CH3 및 CH4 도메인을 포함하며, 상기 중쇄 불변 영역은 CD80 막통과 및 세포질 꼬리 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는 것인 단백질.
  352. i) 표적 분자에 결합할 수 있는 결합 도메인 폴리펩티드를 가지는 제1 폴리 펩티드;
    ii) 상기 제1 폴리펩티드에 결합되고 연결 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드로서, 상기 연결 영역은 3개의 시스테인 잔기 및 1개의 프롤린 잔기를 포함하며, 상기 시스테인 잔기 중 하나 이상은 결실 또는 치환되는 것인 제2 폴리펩티드; 및
    iii) 상기 제2 폴리펩티드에 결합되고 N-말단 절두형 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드를 포함하는 제3 폴리펩티드
    를 포함하는 비자연 발생적 단일쇄 단백질로서, 하나 이상의 면역 활성을 나타낼 수 있는 것인 비자연 발생적 단일쇄 단백질.
  353. 제352항에 있어서, 상기 연결 영역은 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기를 포함하며, 상기 제1 시스테인 잔기는 상기 제2 시스테인의 N-말단 쪽에 위치하고, 상기 제2 시스테인은 상기 제3 시스테인의 N-말단 쪽에 위치하며, 상기 제1 시스테인 잔기는 치환 또는 결실되지 않고, 상기 제2 및 제3 시스테인은 치환 또는 결실되는 것인 단백질.
  354. 제353항에 있어서, 상기 제2 및 제3 시스테인 잔기는 다른 아미노산으로 치환되는 것인 단백질.
  355. 제354항에 있어서, 상기 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린 잔기로 치환되는 것인 단백질.
  356. 제352항에 있어서, 겉보기 분자량이 약 75 kDa인 동종성 단백질로서 발현되는 것인 단백질.
  357. 제352항에 있어서, 상기 연결 영역은 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기를 포함하며, 상기 제1 시스테인 잔기는 상기 제2 시스테인의 N-말단 쪽에 위치하고, 상기 제2 시스테인은 상기 제3 시스테인의 N-말단 쪽에 위치하며, 상기 제1 시스테인 잔기는 치환 또는 결실되는 것인 단백질.
  358. 제352항에 있어서, 상기 연결 영역 중 상기 제2 및 제3 시스테인 잔기는 치환 또는 결실되지 않는 것인 단백질.
  359. 제352항에 있어서, 상기 연결 영역은 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기를 포함하며, 상기 제1 시스테인 잔기는 상기 제2 시스테인의 N-말단 쪽에 위치하고, 상기 제2 시스테인은 상기 제3 시스테인의 N-말단 쪽에 위치하며, 상기 제2 시스테인 잔기는 치환 또는 결실되는 것인 단백질.
  360. 제352항에 있어서, 상기 연결 영역 중 상기 제1 및 제3 시스테인 잔기는 치환 또는 결실되지 않는 것인 단백질.
  361. 제352항에 있어서, 상기 연결 영역은 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기를 포함하며, 상기 제1 시스테인 잔기는 상기 제2 시스테인의 N-말단 쪽에 위치하고, 상기 제2 시스테인은 상기 제3 시스테인의 N-말단 쪽에 위치하며, 상기 제3 시스테인 잔기는 치환 또는 결실되는 것인 단백질.
  362. 제10항에 있어서, 상기 연결 영역 중 상기 제1 및 제2 시스테인 잔기는 치환 또는 결실되지 않는 것인 단백질.
  363. 제352항에 있어서, 상기 연결 영역은 5∼65개의 아미노산을 포함하는 것인 단백질.
  364. 제352항에 있어서, 상기 연결 영역은 10∼50개의 아미노산을 포함하는 것인 단백질.
  365. 제352항에 있어서, 상기 연결 영역은 15∼35개의 아미노산을 포함하는 것인 단백질.
  366. 제352항에 있어서, 상기 연결 영역은 5개 이상의 연속 힌지 영역 아미노산을 포함하는 것인 단백질.
  367. 제352항에 있어서, 상기 연결 영역은 10개 이상의 연속 힌지 영역 아미노산을 포함하는 것인 단백질.
  368. 제352항에 있어서, 상기 연결 영역은 15개 이상의 연속 힌지 영역 아미노산을 포함하는 것인 단백질.
  369. 제353항에 있어서, 상기 제2 및 제3 시스테인은 세린 잔기로 치환되고, 상기 연결 영역은 IgG1 힌지 영역의 적어도 일부분을 포함하는 것인 단백질.
  370. 제369항에 있어서, 상기 연결 영역은 IgG1 힌지 영역의 5개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 것인 단백질.
  371. 제353항에 있어서, 상기 제2 및 제3 시스테인은 세린 잔기로 치환되고, 상기 연결 영역은 IgG2 힌지 영역의 적어도 일부분을 포함하는 것인 단백질.
  372. 제371항에 있어서, 상기 연결 영역은 IgG2 힌지 영역의 5개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 것인 단백질.
  373. 제353항에 있어서, 상기 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린 잔기로 치환되고, 상기 연결 영역은 IgG3 힌지 영역의 적어도 일부분을 포함하는 것인 단백질.
  374. 제373항에 있어서, 상기 연결 영역은 IgG3 힌지 영역의 5개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 것인 단백질.
  375. 제353항에 있어서, 상기 제2 및 제3 시스테인 잔기는 세린 잔기로 치환되고, 상기 연결 영역은 IgG4 힌지 영역의 적어도 일부분을 포함하는 것인 단백질.
  376. 제375항에 있어서, 상기 연결 영역은 IgG4 힌지 영역의 5개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 것인 단백질.
  377. 제352항에 있어서, 상기 제2 및 제3 시스테인 잔기는 치환 또는 결실되고, 상기 프롤린 잔기는 치환 또는 결실되며, 상기 중쇄 불변 영역 폴리펩티드는 407번 위치에서 티로신이 알라닌으로 치환된 CH3 도메인을 포함하며, 상기 단백질의 겉보기 분자량이 약 75 kDa인 것인 단백질.
  378. 제352항에 있어서, 상기 제1 및 제3 시스테인 잔기는 치환 또는 결실되고, 상기 프롤린 잔기는 치환 또는 결실되며, 상기 중쇄 불변 영역은 407번 위치에서 티로신이 알라닌으로 치환된 CH3 도메인을 포함하며, 상기 단백질의 겉보기 분자량 이 약 75 kDa인 것인 단백질.
  379. 표적 분자에 결합할 수 있는 결합 도메인 폴리펩티드를 포함하는 제1 폴리펩티드, 상기 제1 폴리펩티드에 결합되고 연결 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드, 상기 제2 폴리펩티드에 결합되고 N-말단 절두형 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드를 포함하는 제3 폴리펩티드를 포함하는 비자연 발생적 단일쇄 단백질로서, 상기 연결 영역은 제1, 제2 및 제3 시스테인 잔기를 포함하는데, 이 때 상기 제1 시스테인 잔기는 상기 제2 시스테인 잔기의 N-말단 쪽에 위치하고, 상기 제2 시스테인은 상기 제3 시스테인의 N-말단 쪽에 위치하고, 상기 제2 및 제3 시스테인 잔기 중 하나 또는 둘 다는 치환 또는 결실되며, 하나 이상의 면역 활성을 나타낼 수 있는 것인 비자연 발생적 단일쇄 단백질.
  380. 제352항에 있어서, 상기 연결 영역은 변형된 인간 IgG1 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드를 포함하는 것인 단백질.
  381. 제352항에 있어서, 상기 연결 영역은 1개의 시스테인 잔기를 가지는 것인 단백질.
  382. 제381항에 있어서, 상기 연결 영역은 변형된 인간 IgG1 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드를 포함하는 것인 단백질.
  383. 제352항에 있어서, 상기 N-말단 절두형 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드는 면역글로불린 중쇄 IgG CH3 불변 영역 폴리펩티드에 결합된 IgG CH2 불변 영역 폴리펩티드를 포함하는 것인 단백질.
  384. 제352항에 있어서, 상기 N-말단 절두형 면역글로불린 중쇄 불변 영역 폴리펩티드는 본질적으로 면역글로불린 중쇄 IgG CH3 불변 영역 폴리펩티드에 결합된 IgG CH2 불변 영역 폴리펩티드로 이루어지는 것인 단백질.
  385. 표적 분자에 결합할 수 있는 결합 도메인 폴리펩티드를 포함하는 제1 폴리펩티드, 상기 제1 폴리펩티드에 결합되고 연결 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드, 면역글로불린 중쇄 CH2 불변 영역 폴리펩티드 및 면역글로불린 중쇄 CH3 불변 영역 폴리펩티드를 포함하는 제3 폴리펩티드를 포함하는 비자연 발생적 단일쇄 단백질로서, 상기 CH3 불변 영역 폴리펩티드는 상기 단백질 중 둘이 서로 회합하여 비공유 이량체를 형성하는 것을 억제하는 하나 이상의 아미노산의 치환 또는 결실을 포함하며, 하나 이상의 면역 활성을 나타낼 수 있는 것인 비자연 발생적 단일쇄 단백질.
  386. 표적 분자에 결합할 수 있는 결합 도메인 폴리펩티드를 포함하는 제1 폴리펩티드, 상기 제1 폴리펩티드에 결합되고 연결 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드, 면 역글로불린 중쇄 CH2 불변 영역 폴리펩티드 및 면역글로불린 중쇄 CH3 불변 영역 폴리펩티드를 포함하는 제3 폴리펩티드를 포함하는 비자연 발생적 단일쇄 단백질로서, 상기 CH3 불변 영역 폴리펩티드는 405번 및 407번 위치에서 하나 이상의 아미노산이 치환 또는 결실을 포함하며, 하나 이상의 면역 활성을 나타낼 수 있는 것인 비자연 발생적 단일쇄 단백질.
  387. 제252항 또는 제253항에 있어서, 405번 위치 및 407번 위치의 아미노산 치환을 포함하는 것인 단백질.
  388. 제387항에 있어서, 405번 위치의 페닐알라닌이 알라닌으로 치환되고, 407번 위치의 티로신이 알라닌으로 치환되는 것인 단백질.
  389. 제387항에 있어서, 겉보기 분자량이 약 40∼약 50 kDa인 것인 단백질.
  390. 제387항에 있어서, 작동제 또는 길항제의 생물학적 활성을 갖는 것인 단백질.
  391. 제390항에 있어서, 길항제의 생물학적 활성을 갖는 것인 단백질.
  392. 제387항에 있어서, 405번 및 407번 위치의 1개의 아미노산만이 치환되는 것 인 단백질.
  393. 제392항에 있어서, 겉보기 분자량이 약 70∼약 80 kDa인 것인 단백질.
  394. 제387항에 있어서, 405번 위치의 페닐알라닌이 알라닌으로 치환되는 것인 단백질.
  395. 제387항에 있어서, 405번 위치의 페닐알라닌이 티로신으로 치환되는 것인 단백질.
  396. 제386항에 있어서, 407번 위치의 티로신이 알라닌으로 치환되는 것인 단백질.
  397. 제386항에 있어서, 405번 위치 및 407번 위치의 아미노산 치환을 포함하는 것인 단백질.
  398. 제393항에 있어서, 405번 위치의 페닐알라닌이 알라닌으로 치환되고, 407번 위치의 티로신이 알라닌으로 치환되는 것인 단백질.
  399. 제1항, 제8항, 제9항, 제12항, 제18항, 제30항 및 제112항 내지 제109항 중 어느 한 항에 따른 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  400. 제116항, 제120항, 제121항 및 제180항 내지 제235항 중 어느 한 항에 따른 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  401. 제238항, 제239항, 제296항, 제328항, 제352항, 제353항, 제385항 및 제386항 중 어느 한 항에 따른 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  402. 제399항 내지 제401항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 중 폴리뉴클레오티드의 발현을 증강시키는 프로모터 또는 다른 서열에 기능적으로 연결되는 것인 폴리뉴클레오티드.
  403. 제399항 내지 제401항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포.
  404. 제1항, 제8항, 제9항, 제12항, 제18항, 제30항 및 제112항 내지 제109항 중 어느 한 항에 따른 단백질을 발현할 수 있는 재조합 벡터.
  405. 제116항, 제120항, 제121항 및 제180항 내지 제235항 중 어느 한 항에 따른 단백질을 발현할 수 있는 재조합 벡터.
  406. 단백질이 발현되는 조건 하에 제1항, 제8항, 제9항, 제12항, 제18항, 제30항 및 제112항 내지 제109항 중 어느 한 항에 따른 단백질을 발현시키는 방법.
  407. 단백질이 발현되는 조건 하에 제116항, 제120항, 제121항 및 제180항 내지 제235항 중 어느 한 항에 따른 단백질을 발현시키는 방법.
  408. 단백질이 발현되는 조건 하에 제238항, 제239항, 제296항, 제328항, 제352항, 제353항, 제385항 및 제386항 중 어느 한 항에 따른 단백질을 발현시키는 방법.
  409. 하나 이상의 추가 치료 화합물과 함께 제238항, 제239항, 제296항, 제328항, 제352항, 제353항, 제385항 및 제386항 중 어느 한 항에 따른 단백질을 포함하는 조성물.
  410. 제238항, 제239항, 제296항, 제328항, 제352항, 제353항, 제385항 및 제386항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 제1 화합물을 피험체에 투여하는 단계를 포함하는 피험체의 치료 방법으로서, 상기 제1 화합물과 제2 화합물을 함께 피험체에 투여 또는 공투여하며, 질병, 병 또는 바람직하지 않은 병태를 치료 또는 예방하는 데 효과적인 것인 치료 방법.
  411. 제410항에 있어서, 제2 화합물은 화학요법 화합물, 치료 약물, 신생혈관형성 억제제, 스테로이드, B-세포 활성인자, T-세포 활성인자, 콜로니 자극 인자, 종양 괴사 인자, 인터페론, 항체, 본 발명의 결합 구성체, 유전자 요법, 레티노이드, 외과적 처치, 알킬화제, 뉴클레오시드 유사체, 토포이소머라제 II, VEGF, IFN-알파, DMAR 제제, 인터루킨-1, 글루코코르티코이드, p38 억제인자, 인터루킨-4, 인터루킨-6, 인터루킨-2, 인터루킨-12, IFN-γ, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, 항-CTLA-4, Bcl-2 안티센스, 비타민 A, 항-CD19, 항-CD20, 항-CD22, 항-CD28 또는 항-CD3 중에서 선택되는 것인 방법.
  412. 천연(native) 또는 유전자 조작된 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 포함하는 재조합 분자를 디스플레이(display)하는 방법으로서, 상기 중쇄 가변 영역 중 9번, 10번, 11번, 12번, 108번, 110번 및 112번 위치에 해당하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 하나 이상의 돌연변이, 치환, 변경 및/또는 결실을 포함하는 면역글로불린 중쇄 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  413. 2H7 scFv VH L11S (CSC-S) H WCH2 WCH3, 2H7 scFv VH L11S IgE CH2 CH3 CH4, 2H7 scFv VH L11S mIgE CH2 CH3 CH4, 2H7 scFv VH L11S mIgAH WIgACH2 T4CH3, 2H7 scFv VH L11S (SSS-S) HK322S CH2 WCH3, 2H7 scFv VH L11S (CSS-S) HK322S CH2 WCH3, 2H7 scFv VH L11S (SSS-S) H P331S CH2 WCH3, 2HU scFv VH L11S (CSS-S) H P331S CH2 WCH3, 2H7 scFv VH L11S (SSS-S) H T256N CH2 WCH3, 2H7 scFv VH L11S (SSS-S) H RTPE/QNAK (255-258) CH2 WCH3, 2H7 scFv VH L11S (SSS-S) H K290Q CH2 WCH3, 2H7 scFv VH L11S (SSS-S) H A339P CH2 WCH3, G28-1 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3, G28-1 scFv IgAH WCH2 WCH3, G28-1 scFv VH L11S (SSS-S) H WCH2 WCH3, G28-1 scFv VH L11S (CSS-S) H WCH2 WCH3, G28-1 scFv VH L11S (CSC-S) H WCH2 WCH3, G28-1 scFv VH L11S (SSC-P) H WCH2 WCH3, CTLA4 (SSS-S) H P238SCH2 WCH32, CTLA4 (CCC-P) WH WCH2 WCH3, FC2-2 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3, FC2-2 scFv VH L11S (SSS-S) H WCH2 WCH3, UCHL-1 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3, UCHL-1 scFv VH L11S (SSS-S) H WCH2 WCH3, 5B9 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3, 5B9 scFv VH L11S (SSS-S) H WCH2 WCH3, 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3, 2H7 scFv (SSS-S) H P238SCH2 WCH3, 2H7 scFv IgAH WCH2 WCH3, 2H7 scFv IgAH WIgACH2 T4CH3, 2H7 scFv IgAH WIgACH2 WCH3 + J쇄, 2H7 scFv (CCC-P) WH WCH2 WCH3, 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 F405YCH3, 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 F405ACH3, 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 Y407ACH3, 2H4 scFv (SSS-S) HWCJH2 F405A, Y407ACH3, 2H7 scFv (CSS-S) H WCH2 WCH3, 2H7 scFv (SCS-S) H WCH2 WCH3, 2H7 scFv (SSC-P) H WCH2 WCH3, 2H7 scFv (CSC-S) H WCH2 WCH3, 2H7 scFv (CCS-P) H WCH2 WCH3, 2H7 scFv (SCC-P) H WCH2 WCH3, 2H7 scFv VH L11S (SSS-S) H WCH2 WCH3, 2H7 scFv VH L11S (CSS-S) H WCH2 WCH3, G28-1 scFv VH L11S (SCS-S) H WCH2 WCH3, G28-1 scFv VH L11S (CCS-P) H WCH2 WCH3, G28-1 scFv VH L11S (SCC-P) H WCH2 WCH3, G28-1 scFv VH L11S mIgE CH2 CH3 CH4, G28-1 scFv VH L11S mIgAH WIgACH2 T4CH3, G28-1 scFv VH L11S hIgE CH2 CH3 CH4, G28-1 scFv VH L11S hIgAH WIgACH2 T4CH3, HD37 scFv IgAH WCH2 WCH3, HD37 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3, HD37 scFv VH L11S (SSS-S) H WCH2 WCH3, L6 scFv IgAH WCH2 WCH3, L6 scFv VH L11S (SSS-S) H WCH2 WCH3, 2H7 scFv-라마 IgG1, 2H7 scFv-라마 IgG2, 2H7 scFv-라마 IgG3, CD16-6 저 (ED) (SSS-S) H P238SCH2 WCH3, CD16-9 고 (ED) (SSS-S) H P238SCH2 WCH3, 2e12 scFv (SSS-s) H P238SCH2 WCH3-hCD80TM/CT, 10A8 scFv (SSS-s) H P238SCH2 WCH3-hCD80TM/CT, 40.2.36 scFv (SSS-s) H P238SCH2 WCH3-hCD80TM/CT, 2H7 scFv (SSS-s) H P238SCH2 WCH3-hCD80TM/CT, G19-4 scFv (SSS-s) H P238SCH2 WCH3-hCD80TM/CT, 2e12 scFv (SSS-s) H WCH2 WCH3-hCD80TM/CT, 2e12 scFv IgAH IgACH2 T4CH3-hCD80TM/CT, 2e12 scFv IgE CH2CH3CH4-bCD80TM/CT, 2e12 scFv (SSS-s) H P238SCH2 WCH3-mFADD-TM/CT, 2e12 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3-mFADD-TM/CT, 2e12 scFv (SSS-s) H WCH2 WCH3-mcasp3-TM/CT, 2e12 scFv(SSS-s) H P238SCH2 WCH3-mcasp3-TM/CT, 2e12 scFv (SSS-s) H WCH2 WCH3-mcasp8-TM/CT, 2e12 scFv (SSS-s) H P238SCH2 WCH3-mcasp8-TM/CT, 2e12 scFv (SSS-s) H WCH2 WCH3-hcasp3-TM/CT, 2e12 scFv (SSS-s) H P238SCH2 WCH3-hcasp3-TM/CT, 2e12 scFv (SSS-s) H WCH2 WCH3-hcasp8-TM/CT, 2e12 scFv (SSS-s) H P238SCH2 WCH3-hcasp8-TM/CT, 1D8 scFv-hIgG1 (SSS-s) H P238SCH2 WCH3-hCD80TM/CT, 1D8 scFv-hIgG1 (SSS-s) H WCH2 WCH3-hCD80TM/CT, 1D8 scFv-mIgAT4-hCD80TM/CT, 1D8 scFv-hIgE-hCD80TM/CT, 1D8 scFv-hIgG1 (SSS-s) H P238SCH2 WCH3-mFADD-TM/CT, 1D8 scFv-hIgG1 (SSS-s) H WCH2 WCH3-mFADD-TM/CT, 1D8 scFv-hIgG1 (SSS-s) H WCH2 WCH3-mcasp3-TM/CT, 1D8 scFv-hIgG1 (SSS-s) H P238SCH2 WCH3-mcasp3-TM/CT, 1D8scFv-hIgG1 (SSS-s) H WCH2 WCH3-mcasp8-TM/CT, 1D8 scFv-hIgG1 (SSS-s) H P238SCH2 WCH3-mcasp8-TM/CT, 1D8 scFv-hIgG1 (SSS-s) H WCH2 WCH3-hcasp3-TM/CT, 1D8 scFv-hIgG1 (SSS-s) H P238SCH2 WCH3-hcasp3-TM/CT, 1D8 scFv-hIgG1 (SSS-s) H WCH2 WCH3-hcasp8-TM/CT, 1D8 scFv-hIgG1 (SSS-s) H P238SCH2 WCH3-hcasp8-TM/CT, L6 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3, 2H7 scFv CD154 (L2), 2H7 scFv CD154 (S4), CTLA4 IgAH IGACH2CH3, CTLA4 IgAH IgACH2 T4CH3, 2H7 scFv IgAH IgACH2CH3, 2H7 scFv IgAH IgAHCH2 T18CH3, 2H&-40.2.220 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 (이특이성 항-ccd20-항-cd40), 2H7 scFv IgAH IgACH2 T4CH3-hCD89 TM/CT, G19-4 scFv (CCC-P) WH WCH2 WCH3-hCD89 TM/CT 및 2e12 scFv (CCC-P) WH WCH2 WCH3-hCD89 TM/CT 중에서 선택된 식으로 표시되는 단백질을 포함하는 비자연 발생 단일쇄 항원-결합 단백질.
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