KR20020059620A

KR20020059620A - 발효에 의한 l-시스테인 또는 l-시스테인 유도체의 생산방법

Info

Publication number: KR20020059620A
Application number: KR1020027004742A
Authority: KR
Inventors: 마이에르토마스; 빈테르할테르크리스토프
Original assignee: 프레이 폴커; 콘소티움 퓌르 에렉트로헤미쉐 인두스트리 게엠베하
Priority date: 1999-10-14
Filing date: 2000-10-05
Publication date: 2002-07-13
Also published as: CN1379823A; DK1220940T3; ATE231918T1; JP2003511086A; WO2001027307A1; EP1220940B2; CA2386539C; EP1220940B1; CA2386539A1; DE19949579C1; EP1220940A1; KR100505336B1; SK4972002A3; CN1262646C; TWI249575B; DE50001193D1

Abstract

본 발명은 미생물 발효에 의한 L-시스테인 또는 L-시스테인 유도체의 생산방법 및 그 방법에 적합한 미생물에 관한 것이다.

L-시스테인 또는 L-시스테인 유도체의 발효생산에 적합한 미생물균주는 변동 cysB활성도에 따르지 않는 조절해제한 시스테인 대사를 구성한다.

또, 그 미생물균주는 증가 cysB 활성도에 특징이 있어 그 cysB 활성도는 주로 야생형 cysB 조절패턴을 구성한다.

Description

발효에 의한 L-시스테인 또는 L-시스테인 유도체의 생산방법{METHOD FOR PRODUCTION OF L-CYSTEINE OR L-CYSTEINE DERIVATIVES BY FERMENTATION}

아미노산 L-시스테인은 경제적인 면에서 중요한 것이다.

예로서, 아미노산 L-시스테인은 식품첨가제(특히, 베이킹공업분야의 식품첨가제): 화장품에 사용되는 물질 및 약리활성화합물의 제조용 출발재(특히 N-아세틸시스테인 및 S-카르복시메틸시스테인)로 사용되었다.

L-시스테인 유도체는 모두 S 함유대사물질로서, 이들의 합성에서 시스테인으로부터 유도되며, 예로서, 시스틴, 메티오닌, 글루타티온, 바이오틴.(biotin). 티아졸리닌. 티아민. 립포산(lipoic acid) 및 코엔자임(coenzyme)A가 있다.

세균에 있어서는 시스테인 생합성이 두가지 레벨에서 조절된다(도 1):

1. 효소활성도의 레벨에서 세린아세틸전이효소(cysE 유전자의 생성물)가 L-시스테인에 의해 최종생성물을 억제시킨다. 이것은 L-시스테인의 축적으로 시스테인 생합성의 소정의 1차반응을 직접 억제시키며, 또 합성이 정지되는 기술적인 의미가 있다.

2. 전사(transcription)의 레벨에서 조절단백질 CysB(CysB 유전자에 의해 엔코딩함)가 전사활성제(transeription activator)로서 작용하여 환원황(reduced sulphur)의 형성을 조절하도록 한다.

CysB는 N-아세틸세린을 필요로하며, N-아세틸세린은 불충분한 환원황이 O-아세틸세린 SH효소반응에 이용될때 O-아세틸세린으로부터 세포내에서 유도물질 (inducer)로 생성된다. 그 결과, 황의 흡수, 환원 및 결합과 관련되어 있는 모든 유전자는 CysB를 조절한다.

이들의 유전자에는 오페론(operons) cysPTWAM, cysDNC 및 cysJIH와 cysK유전자가 있다.

이에 대하여, 아세틸세린은 cysB 의 유도물질로 작용하며, 설파이드(sulphide)와 티오설페이트는 "항유도물질(antiinducers)"로서 음효과 (negative effect)를 나타낸다.

그 이유는 이들의 존재가 SH기의 유효성(availability)을 나타내기 때문이다.

L-시스테인과 L-시스테인 유도체의 취득에 관한 종래기술은 특허문헌 WO98/15673(미국특허출원 09/065104에 대응되는 특허문헌)명세서에 구체적으로 기재되어있다.

이 특허문헌 WO97/15673 명세서에서는 피드백(feedback)내성 세린 아세틸전이효소를 사용하는 발효에 의한 생산방법에 대하여 기재되어 있다.

이 특허문헌 명세서에서는 또 유전자를 구조에 의해 발현하도록 한 유전자레벨에서 조절단백질 CysB를 추가로 조절해제함으로써 시스테인 수율의 증가를 더 얻을 수 있는 기술구성에 대하여 기재되어있다.

특허문헌 EP 885962 A1(미국특허출원 09/097759에 대응함) 명세서에서는 미생물에 대하여 기재되어 있는 바, 이들의 미생물은 L-시스테인, L-시스틴, N-아세틸세린 및 티아졸리딘유도체의 발효에 의한 생산에 적합하며, 항생물질 또는 그 미생물에 독성이 있는 다른 물질을 세포밖에서 분리하는데 적합한 단백질을 엔코팅하는 최소한 하나의 유전자를 과잉 발현하도록 하는데 그 특징이 있다.

CysB는 LysR형 전사레귤레이터(regulators)(LTTR) 과(family)에 속하며, 그 레귤레이터의 100여종 이상의 대표적인 물질은 이미 공지되어있다(Schell M.A., 1993, Annu. Rev. Microbiol. 47: 597-626).

이들의 레귤레이터는 나사선-선회-나사선모티프(helix-turn-helix motif)를 가진 N-말단 DNA-결합도메인과 C-말단 유도물질 결합도메인(domain)을 가진 구성에 특징이 있다.

구체적인 DNA-결합연구는 CysB에 이용할 수 있다.

또, CysB는 1차 LTTR단백질로서, 그 단백질에 대하여는 결정구조를 이용할 수 있다(Tyrell et al., 1997, Structure 5:1017-1032).

일반적으로, LTTR 단백질은 포지티브(positive)유전자 레귤레이터로 작용하며, 이들의 레귤레이터는 유도물질분자의 존재에 따라 결정된다.

종래에는 이펙터분자(effector molecules)(구조적인 면에서 활성인 변이형)와 관련없는 활성이 높은 CysB 변이형만이 시스테인 제조를 증가하도록 하였다.

그이유는이와같은 형태가 유전자의 높은 활성도를 일정하게 유지할 수 있기 때문이다(Nakamori S. et al., 1998, Appl.Env. Microbiol. 64: 1607-1611).

구조에 의해 활성이 있는 CysB의 형태에는 살모넬라 타이피무륨(Salmonella typhimurium)의 경우에 기재되어있다.

이들의 변이형은 높은 활성도를 나타내며, 이 활성도가 유도물질 N-아세틸세린과, 티오설페이트 및 설파이드의 음효과(negative effect)와는 관련이 없다(Colyer T. E., Kredich N.M., 1994. Mol. Microbiol. 13: 797-805),

본 발명은 미생물의 발효에 의한 L-시스테인 또는 L-시스테인 유도체의 생산방법 및 그 방법에 적합한 미생물에 관한 것이다.

본 발명은 L-시스테인 또는 L-시스테인 유도체의 발효에 의한 생산에 적합하고, 조절해제시킨 시스테인 대사를 가지며 이 시스테인 대사의 조절해제가 CysB활성도의 변동에 의하지 않는 미생물균주에 있어서, 증가시킨 CysB활성도를 추가로 가지며, CysB 활성도가 주로 야생형 CysB의 조절패턴을 가짐을 특징으로 하는 미생물균주에 관한 것이다.

이와같은 조절해제가 CysB 활성도의 변동에 기인되지 않은 조절해제한 시스테인 대사를 가진 미생물균주는 공지되어있다.

이들의 균주에는 예로서 특허문헌 WO97/15673 또는 참고문헌(Nakamori S. et al., 1998, Appl. Env. Microbiol. 64: 1607-1611)에 기재되어 있는 바와 같이 변경 cysE 대립유전자를 가진 균주, 또는 예로서 특허문헌 EP 0885962 A1(미국특허출원 09/097759 에 대응함) 명세서에 기재되어있는 바와 같이 유출유전자(efflux genes)를 삽입한 균주, 또는 예로서 특허문헌 97/5673 또는 참고문헌(Nakamori S.et al., 1998, Appl. Env. Microbiol. 64: 1607-1611)에 기재되어 있는 바와같이 시스테인의 과잉생산 또는 감소시스테인의 파괴에 대한 선별방법과 함께 합친 특정되지 않는 돌연변이유발 방법을 사용하여 분리한 균주가 있다.

본 발명의 기술적 범위내에서 CysB 활성도가 야생형균주의 활성도보다 최소 10% 더 높을때 증가한다.

CysB 활성도는 최소 25% 더 높은 것이 바람직하다.

CysB 활성도는 최소 50% 더 높은 것이 특히 바람직하다.

CysB 활성도 측정에 적합한 에쉐리키아 콜리(Escherichia coli) 균주(MC4100:: λKZL300)는 실시예 2에 기재되어있다.

이 균주는 부다페스트조약에 따라 독일 DSMZ에 기탁번호 DSM 12886 으로 1999.6.23에 기탁되었다.

또, 각각의 CysB 함유 구조물이 균주 MC4100::λKZL300에 공지의 방법으로 도입되었다.

티오설페이트로 성장한 세포의 CysB 활성도가 설페이트로 성장한 세포의 CysB활성도의 75% 미만이고, 시스틴으로 성장시킨 세포의 CysB활성도가 설페이트로 성장시킨 세포의 CysB활성도의 20% 미만일때 CysB활성도는 황원(S source)에 따라 주로 야생형 CysB인 조절패턴을 나타낸다(실시예 2 참조).

본 발명에 의한 미생물균주는 CysB 활성의 증가없이 시스테인 대사를 조절해제시킨 미생물균주에서 보다 상당히 많은 량의 L-시스테인 또는 L-시스테인 유도체를 분비한다.

따라서, 본 발명에 의한 미생물균주는 조절해제시킨 시스테인 대사를 가지며, 시스테인 대사의 이 조절해제는 CysB 활성도의 변동에 의존되지 않는 미생물균주로서, 이 미생물균주에서는 주로 야생형 CysB인 조절패턴을 가진 CysB를 엔코딩한 상동 또는 비상동 CysB 유전자가 증가범위까지 발현된다.

에쉐리키아콜리균주가 바람직하며, 이 균주는 조절해제시킨 시스테인 대사를 가지며 시스테인 대사의 이 조절해제가 CysB 활성도의 변동에 따르지 않는 균주이며 야생형 cysB 유전가 과잉발현되어있다.

에쉐리키아콜리균주로서 조절해제시킨 시스테인 대사를 가지며 시스테인 대사의 이 조절해제가 CysB활성도의 변동에 따르지 않으며, 에쉐리카아콜리야생형 cysB 유전자의 복제수를 증가시키고 이 유전자를 과잉발현시킨 균주가 특히 바람직하다.

종래기술에 대한 위에서 설명한 내용에서와 같이, 시스테인 생산은 구조적으로 활성인 CysB 조절단백질을 엔코딩한 cysB 대립유전자를 사용하여 증가시켰으나, 이와같은 구성과는 전혀 달리 야생형 cysB유전자의 발현을 증가시킴으로써 시스테인 생산을 증가시킨다는 것을 기대이상으로 확인하지 못하였다.

이와같은 확인은 기대이상이며 비예측적이다.

종래의 공지실시예에서는 LysR형 전사레귤레이터과에서 조절단백질의 발현증가에 의해 대사산물 (metabolite)이 과잉생산될 수 있다는 이와같은 구성을 확인할 수 없다.

따라서, 본 발명은 또 대사산물을 과잉생산하는 LysR형 전사레귤레이터과에서 조절단백질의 사용방법과, 대사산물의 과잉생산방법에서 LysR형 전사레귤레이터과에서 조절유전자를 미생물에서 과잉발현시켜 미생물에서의 대사산물의 생산을 증가시킴을 특징으로 하는 과잉생산방법에 관한 것이다.

예로서 1) 촉진제의 조절에 의해 미생물내에서 주로 야생형 CysB인 조절패턴을 가진 CysB를 엔코딩한 cysB 유전자의 복제수를 증가시키거나,

2) 또는 야생형 cysB 유전자의 발현을 조절하는 촉진제를 더 강력한 촉진제로 대치시켜 주로 야생형 CysB인 조절패턴을 가진 CysB를 엔코딩한 cysB유전자의 발현을 증가시켜 미생물의 CysB 활성도를 증가시킴과 동시에 주요한 조절패턴을 유지시킬 수 있다.

cysB유전자는 에쉐리키아콜리, 살모넬라타이무륨, 클레브시엘라 애로겐스(Klebsiella aerogenes), 해모필러스인플루엔재(Haemophilus influenzae), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 티오카프사 로세오페르시키나(Thiocapsa roseopersicina)에서 공지되어 있다.

cysB 유전자는 유전자생성물이 에쉐리키아콜리 단백질로 최소 40%의 동일성을 나타내는 유전자가 바람직하다.

상동치(homology values)는 컴퓨터 프로그램("Wisconsin package Version 9.0, Genetics Computer Group(GCG), Madison, Wisconsin")에 의해 얻어진 측정치(results)이다.

이와관련하여, 데이타베이스는 표준파라미터를 사용하여 "블라스트(blast)섭프로그램(subprogram)으로 조사하였다.

또, cysB 유전자는 야생형 cysB 유전자의 대립유전자이며, 그 유전자생성물의 서열은 주로 야생형 CysB인 조절패턴없이 변형되어 상실된다.

이와같은 구성의 한예로는 보존성아미노산치환을 포함하는 CysB 변이형(variants)이 있다.

본 발명에 의한 미생물은 예로서 조절해제시킨 시스테인 대사를 가지며, 시스테인 대사의 조절해제가 CysB활성도의 변동에 따르지 않는 미생물균주에서, 공지의 방법을 사용하여 야생형 cysB 유전자 또는 주로 야생형 CysB인 조절패턴을 가진 cysB를 엔코딩한 cysB유전자의 복제수를 증가시키거나, 또는 공지의 방법을 사용하여 야생형 cysB 유전자 또는 주로 야생형 CysB인 조절패턴을 가진 CysB를 엔코딩한 cysB 유전자의 발현을 증가시켜 제조할 수 있다.

아래에서 설명하는 내용에서, 용어 "CysB"는 "야생형 CysB"와 "주로 야생형 CysB인 조절패턴을 가진 CysB 변이형"을 의마한다.

또, 아래의 설명내용에서 용어 "cysB유전자"는 "야생형 cysB 유전자" 와 "주로 야생형 CysB인 조절패턴을 가진 CysB를 엔코딩한 "cysB유전자"를 의미한다.

통상의 기술자에 의해 공지된 방법을 사용하여 미생물에서 cysB 유전자의 복제수를 증가시킬 수 있다.

따라서, cysB 유전자를 예로서 세포당 다수복제(multiple copies)상태에 있는 플라스미드벡터(즉, pUC19, pBR322 및 pACYC184)에 클로닝할 수 있고, 조절해제시킨 시스테인 대사를 가진 미생물에 도입할 수 있다.

또, cysB유전자는 조절해재시킨 시스테인 대사를 가진 미생물의 크로모솜에수회 통합시킬 수 있다(integration).

사용할 수 있는 통합방법에는 적합한 박테리오파지(bacteriophages) 또는 통합플라스미드, 또는 상동재조합에 의한 통합을 사용하는 공지의 시스템이 있다(즉, Hamilton 등, 1989, J. Bacteriol.171: 4617-4622).

촉진제의 조절에 의해 cysB유전자를 플라스미드 벡터에 클로닝시켜 복제수를 증가시키는 것이 바람직하다.

cysB 유전자를 pACYC184-LH등 pACYC유도체(부다베스트조약에 의해 독일 DSMZ에 기탁번호 DSM10172로 95.8.18자 기탁되어있음)에 클로닝시켜 복제수를 증가시키는 것이 바람직하다.

자연촉진제(natural promoter)와 그 유전자의 오퍼레이터영역(operator region)은 플라스미드엔코딩 cysB유전자를 발현하는 조절영역으로 작용할 수 있다.

그러나, cysB 유전자의 발현은 또 다른 촉진제를 사용하여 증가시킬 수 있다. 적합한 촉진제 시스템은 통상의 기술자에 의해 공지되어있다(Makrides S.C., 1996, Microbiol. Rev. 60: 512-538).

이들의 구성물은 플라스미드 또는 크로모솜에 공지의 방법으로 사용할 수 있다.

예로서, cysB 유전자는 촉진제 및 오퍼레이터 서열을 함유한 완전 cysB 유전자를 포함하는 소정의 프라이머를 사용하여 벡터 DNA 프라그멘트에 결찰하는 중합효소사슬반응에 의해 특정지게 중복시켜 플라스미드 벡터에 클로닝하였다.

cysB 유전자의 클로닝에 사용되는 바람직한 벡터에는 시스테인 대사를 조절해제하는 유전자 요소, 예로서 cysEX 유전자(특허문헌 WO97/15673)와 유출유전자(efflux gene)(특허문헌 EP 08859621 A1)을 이미 포함하는 플라스미드가 있다.

이와같은 벡터는 본 발명에 의한 미생물균주에 의해 임의의 미생물균주로 부터 제조할 수 있다.

그 이유는 이와같은 벡터가 미생물에서 시스테인의 대사를 조절해제 하기 때문이다.

따라서, 본 발명은 시스테인대사를 조절해제하는 유전자요소를 가저, 이들의 유전자요소가 CysB 활성도의 변동을 발생하지 않으며, 또 촉진제의 조절에 의해 cysB 유전자를 포함함을 특징으로 하는 플라스미드에 관한 것이다.

cysB 함유 플라스미드는 전기형질전환방법(즉, 이렉트로포레이션: eletro-poration)을 사용하여 세균에 도입하며, 플라스미드함유클론은 예로서 항생물질 내성(antibiotic resistance)에 의해 선택한다.

따라서, 본 발명은 또 본 발명에 의한 플라스미드를 미생물균주에 도입시킴을 특징으로 하는 본 발명에 의한 미생물균주를 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 의한 미생물균주는 공지의 방법에 의해 발효조내에서 시스테인 또는 시스테인 유도체의 제조에 사용된다.

사용한 C원(Sorces)에는 예로서 글루코오스 또는 락토오스가 있으며, 사용한 N원(sources)에는 암모늄 또는 단백질 가수분해물이 있다.

사용한 S원에는 설파이드, 설파이트, 설페이트 또는 티오설페이트가 있다.

발효시에 생성되는 L-시스테인은 산화되어 난용성시스틴을 얻거나, 또는 알데히드 또는 케톤과 축합하여 티아졸리딘을 얻을 수 있다(즉, 피루빈산과 축합하여 2-메틸티아졸리딘-2,4-디카르복실산을 얻을 수 있음).

따라서, 본 발명은 또 본 발명에 의한 미생물균주를 공지의 방법으로 발효에 사용하여 L-시스테인 또는 L-시스테인 유도체를 발효혼합액에서 분리시킴을 특징으로 하는 L-시스테인 또는 L-시스테인 유도체의 생산방법에 관한 것이다.

다음 실시예를 들어 본 발명을 더 구체적으로 설명한다.

실시예 1: 야생형 cysB유전자와 cysB(T149M)대립유전자의 클로닝

중합효소사슬반응(PCR)을 사용하여 에쉐리키아콜리야생형 cysB 유전자를 클로닝하였다.

소정의 올리고뉴클레오티드프라이머 cysBP1(SEQ.IN.NO:1)와 cysBP2 (SEQ.ID.NO:2)(혼합액당 20pmol)을 사용하여 야생형 cysB 유전자를 측면영역 (flanking regions)과 함께 포함하며 각각 말단 EcoRI 및 Sa1I 제한 분할분위를 가진 길이 3107개 염기쌍의 게놈 DNA단편을 증폭하였다.

5'-GTT ACG AGA TCG AAG AGG-3'(3'단부에서 포스포로티오에이트결합)(SEQ. ID.NO:1)

5'-GTC ACC GAG TGG TCA ATG-3'(3'단부에서 포스포로티오에이트 결합)(SEQ. ID.NO:2)

PCR반응은 Pwo DNA 중합요소(Boehringer, 독일 Mannheim)를 사용하고 템플레이트로서 게놈 DNA 10ng를 사용하여 실시하였다.

프로그램은 서냉온도 56℃(사이클당 30초), 연장온도 72℃(사이클당 60초) 및 변성온도 94℃(사이클당 30초)로 구성하였다.

그 다음으로, DNA 단편을 제한효소 EcoRI 및 SalI로 처리하여 조제전 전기영동(preparative gel electrophoresis)및 게네크린방법(Geneclean method)(Geneclean Kit BI0101 P.O. Box 2284, La Jolla, California, USA, 92038-2284)에 의해 정제하였다.

이 단편을 바이오래드라보레이트리스(Bio-Rad Laboratories, Hercules, California, USA)의 파지미드벡터(phagemid vector)pTZ19U에 결찰시켜, EcoRI/SalI로 절단시키고 포스페이트효소(phosphatase)로 처리함으로써 플라스미드 pTZ19U-cysB(도 2)를 얻었다.

그 다음으로, 형질전환하여 제한분석에 의해 포지티브클론(positive clones)을 확인하였다.

구조적으로 활성인 cysB 대립유전자를 구성하기 위하여, 야생형 cysB 유전자의 코돈 147을 "초자 돌연변이 유발에서의 돌연변이원 "키트("mutagene In vitro mutagenesis" Kit)(BiO-Rad Laboratories, Hercules, California, USA)를 사용하여 메티오닌 코돈에 돌연변이를 발생시켰다[참고문헌(Colyer T.E., Kredich N.M., 1994, Mol. Microbiol 13: 797-805)에 기재되어 있는 살모넬라타이피무륨야생형 cysB 유전자에서의 돌연변이와 유사함).

이 실시예에서 올리고뉴클레오 티드 CysBMut4(SEQ.ID.NO.d)를 사용하였다.

다음의 밑줄친 염기는 야생형서열과의 차이를 나타낸다.

5'-TTC GCT ATC GCCATGGAA GCG CTG CAT-3'(SEQ.ID.NO.3)

활성도테스테(activity tests)에 있어서 (실시예 2참조), EcoRI/SalI단편 처리에서와 같이 클레노브(Klenow)와의 처리후 EC1136II를 절단하여 포스페이트효소 처리한 벡터 pACYC184-LH에 2종의 cysB 대립유전자를 클로링하였다.

실시예 2: 생체내 CysB 활성도의 측정

CysB의 활성도를 측정하기 위하여 리포터(reporter) 유전자검정을 선택하였다.

이 검정을 선택하기 위하여 cysK 유전자의 조절영역을 효소 β-갈락토시다아제를 엔코딩하는 lacZ 유전자에 융합하였다.

이 융합물을 내인성(endogenous) β-칼락토시다아제가 없는 균주에 결찰하였을때, 이 효소는 CysB 활성도에 따라 생성되므로, β-갈락토시다아제 활성도 형태에서 CysB 활성도의 간접측정치를 얻었다.

참고문헌(Simons R.W 등, 1987, Gene 53: 85-96)에 기재되어 있는 시스템(system)을 사용하여 용융물을 구성하였다.

첫번째 15개 코돈을 포함하는 cysK 유전자의 촉진제영역은 올리고뉴클레오티드 프라이머 cysKP1(SEQ.ID.NO:4) 및 cysKP3(SEQ.ID.NO:5)와, 에쉐리키아콜리크로 모솜 DNA 10ng와 Pwo중합효소를 사용하는 중합효소사슬반응에 의해 우선 증폭시켰다.

5'-CCG GAA TTC CCG TTG CCG TTT GTG GCG-3' (SEQ.ID.NO:4)

5'- CGC GGA TCC GTG TGA CCG ATA GTC AGC-3 '(SEQ.ID.NO:5)

그 처리조건은 실시예 1에 기재되어 있는 조건과 대응 되도록 처리하였다.

그 결과 얻어진 317개 염기쌍 생성물은 제조업자의 지시서에 따라 제한효소 EcoRI 및 BamHI로 분해시켜 조제겔전기영동(preparative gel electrophoresis) 및 게네클린(Geneclean)방법에 의해 정제하였다.

그 다음, 생성물을 벡터 pRS552(부라베스트 조약에 따라 독일 DSMZ에서 기탁번호 DSM 13034로 1999.9.14에 기탁되었음)에 결찰시켰으며, EcoRI-BamHI로 분해시켜 포스페이트효소로 처리하였다.

미생물균주 MC4100(ATCC 35695)는 엘렉트로포레이션(electroparation)을 사용하여 결찰혼합액(ligation mixture)으로 형질전환시켜, 포지티브클론(positive clones)을 제한분석에 의해 확인하였다.

이들의 포지티브클론에는 번역 cysK-lacZ 융합물이 포함되어있다.

그 결과 얻어진 플라스미드는 박테리오파지(bacteriophage) λ Rs45(부다페스트조약에 따라 독일 DSMZ에 기탁번호 DSM13035로 1999.09.14.기탁하였음)와 재조합하였다.

그 다음으로, 시몬스(Simons)등의 지시서에 따라 처리하여 λ KZL300으로 지정한 재조합파지의 균질여액을 제조하였다.

△ lac 균주 MC4100을 이 파지로 감염시키고, CysB 활성도를 측정하는데 사용할 수 있는 용원성클론(lysogenic clones)(MC4100:: λ KZL300)은 카나마이신 선택에 의해 확인하였다.

pACYC184-LH에 클론닝한 다수복제 cysB 유전자와 cysB(T149M)유전자의 효과를 비교하기 위하여, MC4100:: λ KZL300을 그 대응하는 플라스미드, 즉 pACYC-cysB 및 pACYC-cysB(T149M)으로 형질전환하였다.

그 균주는 서로 다른 황원(각각의 경우 1mM황)을 포함하며 1ℓ 당 테트라시클린 15mg을 첨가한 VB최소배지(1ℓ 당 Na(NH₄)HPO₄3.5g; 1ℓ 당 KH₂PO₄10g; 1ℓ 당 시트레이트 × H₂O 2g, 1ℓ 당 MgCl₂0.078g; PH를 NaOH로 6.5로 조절, 1ℓ 당 클루코오스 5g; 1ℓ당 비타민 B₁5mg)에 배양하였다.

β-갈락토시드효소 활성도는 참고문헌(Miller J.H., 1972, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, New York, 352-355)에 기재된 방법에 따라 측정하였다.

그 결과를 다음표 1에 나타낸다.

대조(MC4100::λKZL300/pACYC184-LH)의 경우 S원에 따르는 CysB활성도의 조절패턴은 주로 야생형 CysB의 조절패턴인것으로 확인되었다.

티오설페이트로 성장한 세포의 CysB 활성도는 설페이트로 성장했을때 세포의 CysB 활성도의 75% 미만이며, 시스틴으로 성장한 세포의 CysB 활성도는 설페이트로 성장했을때 세포의 cysB 활성도의 20% 미만이다.

이와같은 패턴은 전반적으로 증가시킨 활성도레벨에서 야생형 cysB 유전자(본 발명에 의한 실시예 MC4100:: λ KZL300/ pACYC-cysB)의 다수 복제의 존재하에 유지되었다.

대비하여 보면, cysB(T149M)대립유전자는 대표적인 조절패턴을 상실한 구조적으로 높은 레벨의 활성도로 되었다.

실시예 3: 본 발명에 의한 플라스미드의 구성

본 발명에 의한 미생물은 조절해제시킨 시스테인 대사와 예로서 다수복제의 존재하에 있는 cysB 유전자에 특징이 있다.

플라스미드(pACYC184-cysEX-GAPDH-ORF306)는 이들의 미생물을 제조하는 기초구조물로 선택하였다.

이 플라스미드에는 시스테인 대사를 조절해제하는 구성요소로서 피드백내성 cysE 대립유전자와 유출유전자가 포함되어 있다.

이것은 특허문헌 EP 0885962 A1(실시예 2D)명세서에 구체적으로 기재되어있다.

cysB단편은 제한 효소 SnaBI로 분해시키고 포스페이트 효소로 처리한 cysEX 대립유전자와 유출유전자사이의 이 구조물에 삽입하였다.

cysB 단편은 효소 EcoRI 와 BstXI로 제한시킨다음 DNA단부를 클레노브효소로 스무싱(smoothing)시켜 플라스미드 pTZ19U-cysB(도 2)에서 얻었다.

그 플라스미드는 pHC34로 설정하였다.

본 발명에 의한 미생물은 에쉐리키아콜리균주 W3110(ATCC 27325; Bachmann B.J., 1996. in: Neidhardt F.C.(ed) Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology, American Society for Microbiology, Washington D.C., Chapter 133)을 형질전환시켜 얻었다.

그 형질전환은 엘렉트로포레이션을 사용하여 실시하였다.

형질전환처리에서는 빙냉한(ice-cold) 글리세롤 10% 용액중에서 두께가 두꺼운 세포의 현탁액에 플라스미드 DNA 0.1㎍을 첨가하였다.

그 다음 현탁액을 2500V, 200옴 및 12.5㎌에서 전기펄스 처리를 하였다.

얻어진 혼합물을 살균시킨 LB배지(1%트립톤, 0.5% 이스트엑스, 1% NaCl)로 옮겨 1시간동안 30℃에서 배양한후, 1㎖당 15㎍의 테트라시클린을 함유한 LB한천플레이트상에서 플라스미드함유클론을 선택하였다.

야생형 cysB 유전자의 효과와 구성성(constitutive) cysB(T149M)대립유전자의 효과를 대비하기 위하여, 상사구성물(pHC30)을 제조하여 동일하게 미생물균주 W3100에 도입하였다.

또, 특허문헌 EP885962 A1 명세서에 기재되어 있는 미생물균주 W3110 을 사용하여 대비용으로 동시에 종래기술에서 한정하는 기초구성물로서 플라스미드 pACYC184/cysEX-GAPDH-orf306으로 형질전환하였다.

미생물균주 W3110이 일종의 야생형균주이므로, 모든 시스테인 생성효과가 플라스미드엔코딩유전자에 기인되는 것으로 간주하였다.

실시예 4: 본 발명에 의한 미생물을 사용하는 시스테인의 제조

시스테인의 생성을 검출하기 위하여, 실시예 3의 미생물을 글루코오스와 티오설페이트의 연속적인 공급을 하는 피드배치식(fed batch mode)으로하여 발효조내에서 배양하였다.

그 발효조장치는 최대 배양용량 2ℓ의 바이오스태트엠장치(Biostat M appliance)(Braun Biotech사 제품, 독일, Melsungen)를 사용하였다.

1ℓ당 테트라시클린 15mg을 추가로 포함한 LB배지(1ℓ당 트립톤 10g, 1ℓ당 NaCl 10g)20㎖를 예비배양액으로 접종하여, 진탕기내에서 온도 30℃에서 150rpm으로 배양하였다.

7시간후, 혼합액 전체를 1ℓ 당 글루코오스 5g, 1ℓ당 비타민 B₁0.5mg 및 1ℓ당 테트라시클린 15mg을 추가시킨 SM1배지(1㎖ 당 K₂HPO₄12g; 1㎖ 당 KH₂PO₄3g; 1ℓ당(NH₄)₂SO₄5g; 1ℓ 당 MgSO₄× 7H₂O 0.3g; 1ℓ당 CaCl₂× 2H₂O 0.015g; 1ℓ 당 FeSO₄× 7H₂O 0.002g; 1ℓ당 소듐시트레이트 ×2H₂O 1g; 1ℓ당 NaCl 0.1g; 1ℓ당 Na₂MoO₄×2H₀O 0.15g, 1ℓ당 NaBO₃2.5g, 1ℓ당 CoCl₂×6H₂O 0.7g, 1ℓ당 CuSO₄×5H₂O 0.25g, 1ℓ당 MnCl₂×4H₂O 1.6g, 1ℓ당 ZnSO₄×7H₂O 0.3g으로 이주어진 1ℓ 당 미량원소용액 1㎖) 100㎖에 옮긴다음, 온도 30℃에서 17시간 동안 150rpm으로 하여 배양을 실시하였다.

이와같이하여 얻어진 예비배양액(600nm에서 흡광도 약 3)을 사용하여, 발효배지(1ℓ당 글루코오스 15g; 1ℓ당 트립톤 10g; 1ℓ당 이스트엑스 5g; 1ℓ 당 (NH₄)₂SO₄5g; 1ℓ당 KH₂PO₄1.5g; 1ℓ당 NaCl 0.5g; 1ℓ당 MgSO₄×7H₂O 0.3g; 1ℓ 당 CaCl₂×2H₂O 0.015g; 1ℓ당 FeSO4 ×7H₂O 0.075g; 1ℓ당 소듐시트레이트 × 2H₂O 1g및 1ℓ당 미량원소용액(위에서 설명한 미량원소용액 참조) 1㎖, 1ℓ당 비타민 B₁5mg 및 1ℓ당 테트라시클린 15mg, 25%암모니아로 PH7.0으로 조절함) 900㎖를 포함하는 발효조에 접종하였다.

발효중에, 온도는 30℃로 고정시키고 PH는 25% 암모니아를 계량하여 혼합시켜 PH7.0으로 일정하게 유지하였다.

배양액에는 살균압축공기를 1.5vol/vol/min으로 보충시켜 교반장치를 사용하여 회전속도 200rpm으로 교반하였다.

산소포화도를 50%로 감소시킨다음 산소포화도 50% 를 유지시키기 위하여 회전속도를 제어장치에 의해 1200rpm까지 증가하였다.

2시간후, 소듐티오설페이트 30% 용액을 3㎖/h의 유량으로 혼합하였다.

초기에 15g/ℓ이었던 발효조내 함량이 약 5∼10g/ℓ으로 감소되는 즉시 56%원 용액에 클루코오스를 공급하였다.

글루코오스를 8∼14㎖/h의 유량으로 공급하여 글루코오스농도는 약 5∼10g/ℓ으로 일정하게 유지하였다.

글루코오스는 YSI(Yellow Springs, 미국, Ohio)글루코오스분석기를 사용하여 측정하였다.

L-시스테인의 생성은 가이톤드(Gaitonde)테스트(Gaitonde, M.K.;1967, Biochem.J.104,627-633)를 사용하여 비색계에 의해 감시하였다.

이와관련하여, L-시스테인과, L-시스테인과 특허문헌 EP 0885962A1 명세서에 기재되어 있는 피루베이트(2-메틸티아졸리딘-2.4-디카르복실산)의 축합생성물의 테스트는 구별할 수 없다는 것을 고려할 필요가 있다.

L-시스테인으로부터 산화에 의해 생성된 난용성 시스틴은 동일하게 8%염산에 용해시켜 디티오트레이톨(DTT)로 환원시킨다음 PH8.0의 희석용액중에서 L-시스테인으로 검출하였다.

표 2에서는 본 발명에 의한 플라스미드 pHC34 함유 미생물의 발효와, 구성활성 CysB 유전자 생성물을 엔코팅한 cysB(T149M)대립유전자를 함유한 대응구성물을 포함한 미생물의 발효에 대한 생성과정을 비교할때, 특허문헌 EP 0 885 962 A1 명세서에 기재되어 있는 기본구성물 pACYC184/cysEX-GAPDH-GAPDH-ORF3060RF306을 함유한 미생물의 발효의 생산과정을 나타낸다.

본 발명에 의해 야생성 cysB 유전자의 사용이 생산 효능상에서 포지티브 효과를 나타내나, 구성성 대립유전자 cysB(T149M)는 네가티브 효과를 나타냄을 알 수 있다.

본 발명에 의해 L-시스테인 또는 L-시스테인 유도체를 미생물 발효에 의해 효과적으로 생산할 수 있고, 이와같은 생산방법에 적합한 미생물균주를 얻을 수 있다.

본 발명에 의해 적합한 미생물균주는 변동 CysB 활성도에 따르지 않는 조절해제시킨 시스테인 대사로 구성할 수 있다.

또, 본 발명에 의한 미생물균주는 증가 cysB 활성도에 특징을 가저 그 활성도는 주로 야생형 cysB인 조절패턴으로 구성한다.

Claims

L-시스테인 또는 L-시스테인 유도체의 발효에 의한 생산에 적합하고 조절해제한 시스테인대사를 가저 시스테인 대사의 조절해제가 CysB 활성도의 변동을 기준으로 하지 않는 미생물균주에 있어서, 증가한 CysB 활성도를 추가로 가저 그 CysB 활성도가 주로 야생형 CysB인 조절패턴을 구비함을 특징으로 하는 미생물균주.
L-시스테인 또는 L-시스테인 유도체의 발효에 의한 생산에 적합하고 조절해제한 시스테인 대사를 가저 시스테인 대사의 조절해제가 CysB 활성도의 변동을 기준으로 하지 않는 미생물 균주에 있어서,

주로 야생형 CysB인 조절패턴을 가진 CysB를 엔코딩한 상동(homologous)또는 비상등(heterologous) CysB 유전자가 증가범위까지 발현됨을 특징으로 하는 미생물균주.
제2항에 있어서,

미생물균주는 조절헤재한 시스테인 대사를 가진 에쉐리키아콜리 균주이며, 야생형 cysB 유전자가 과잉발현됨을 특징으로 하는 미생물균주.
제3항에 있어서,

미생물균주는 조절해제한 시스테인 대사를 가진 에쉐리키아콜리 균주로서 에쉐리키아콜리 야생형 cysB 유전자의 복제수를 증가시켜 야생형 cysB 유전자를 과잉발현시킴을 특징으로 하는 미생물균주.
제2항의 미생물균주의 제조방법에 있어서,

조절해제한 시스테인 대사를 가진 미생물균주에서 야생형 cysB 유전자 또는 주로 야생형 CysB인 조절패턴을 가진 CysB를 엔코딩한 cysB유전자의 복제수를 공지의 방법을 사용하여 증가시키거나, 또는 야생형 cysB유전자 또는 주로 야생형 CysB인 조절패턴을 가진 CysB를 엔코딩한 cysB유전자의 증가발현을 공지의 방법을 사용하여 얻음을 특징으로 하는 제조방법.
L-시스테인 또는 L-시스테인 유도체의 생산방법에 있어서, 제2항의 미생물균주를 공지의 방법의 발효중에 사용하여 발효혼합액에서 L-시스테인 또는 L-시스테인 유도체를 분리시킴을 특징으로 하는 생산방법.
시스테인대사를 조절해제하는 유전자요소를 가저 이들의 유전자 요소가 CysB 활성도의 어떤 변동도 발생하지 않으며, 촉진제의 제어에 의한 cysB 유전자를 포함함을 특징으로 하는 플라스미드.
제1항의 미생물균주의 제조방법에 있어서, 제7항의 플라스미드를 미생물균주에 도입함을 특징으로 하는 제조방법.