JP2003511086A - Ｌ−システイン又はｌ−システイン誘導体を発酵により製造する方法 - Google Patents

Ｌ−システイン又はｌ−システイン誘導体を発酵により製造する方法

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JP2003511086A
JP2003511086A JP2001530510A JP2001530510A JP2003511086A JP 2003511086 A JP2003511086 A JP 2003511086A JP 2001530510 A JP2001530510 A JP 2001530510A JP 2001530510 A JP2001530510 A JP 2001530510A JP 2003511086 A JP2003511086 A JP 2003511086A
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    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/12—Methionine; Cysteine; Cystine

Abstract

(57)【要約】 本発明は、微生物の発酵を用いてＬ-システイン又はＬ-システイン誘導体を製造する方法、並びにこの方法のために好適である微生物に関する。Ｌ-システイン又はＬ-システイン誘導体の発酵による製造に好適である微生物株は、脱調節性システイン代謝を有し、この際、このシステイン代謝の脱調節は変更されたＣｙｓＢ-活性に基づくものではない。記載微生物株は、付加的に高められたＣｙｓＢ-活性を有し、この際、このＣｙｓＢ-活性は野生型-ＣｙｓＢに典型的な調節パターンを有する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、微生物の発酵を用いてＬ-システイン又はＬ-システイン誘導体を製
造する方法及びこの方法に好適な微生物に関する。
【０００２】 アミノ酸Ｌ-システインは、経済的に重要である。これは、例えば食品添加物
質（殊にベーキング工業で）として、化粧品中の装入物として又は薬剤作用物質
（殊にＮ-アセチル-システイン及びＳ-カルボキシ-メチル-システイン）の製造
のための出発物質として使用される。
【０００３】 Ｌ-システイン誘導体は、システインのその合成時に生じる全てのＳ-含有代謝
産物、即ちシスチン、メチオニン、グルタチオン、ビオチン、チアゾリジン、チ
アミン、リポン酸及び補酵素Ａである。
【０００４】 細菌内でのシステイン生合成の調節は、２つの面で行われる（図１）： １. 酵素活性の面で、セリン-アセチル-トランスフェラーゼ（ｃｙｓＥ-遺伝子
産物）が、Ｌ-システインによる最終生成物-阻害の基礎となっている。このこと
は、Ｌ-システインの蓄積が、直接、システイン-生合成の最初の特異的反応を阻
害し、更なる合成が妨げられることを意味する。
【０００５】 ２. 転写の面で、レギュレータ蛋白質ＣｙｓＢ（ｃｙｓＢ-遺伝子によりコード
）が、転写アクチベータとして機能し、還元硫黄の調節性製造（regulierte Ber
eitstellung)のために作用する。Ｏ-アセチルセリン-スルフヒドリラーゼ-反応
のために充分な還元硫黄が利用されない場合には、ＣｙｓＢは、インジューサー
として細胞中でＯ-アセチル-セリンから生じるＮ-アセチル-セリンを必要とする
。結果的に、硫黄の吸収、還元及び取り込みと結びついている全ての遺伝子が、
ＣｙｓＢのコントロール下にある。これらは、オペロン：ｃｙｓＰＴＷＡＭ、ｃ
ｙｓＤＮＣ、ｃｙｓＪＩＨ及びｃｙｓＫ-遺伝子である。アセチル-セリンはＣｙ
ｓＢのインジューサーとして作用し、他方で硫化物及びチオ硫酸塩は、その存在
がＳＨ-基の利用性を示すので、いわゆる「抗インジューサー」としての負の効
果を示す。
【０００６】 Ｌ-システイン及びＬ-システイン誘導体の取得に関連する技術水準は、ＷＯ９
７/１５６７３（米国特許出願ＳＮ０９/０６５１０４に相当）中で議論されてい
る。ＷＯ９７/１５６７３それ自体は、フィード-バック抵抗性のセリン-アセチ
ル-トランスフェラーゼを使用する発酵による製造法を記載している。更に、こ
の出願は遺伝子面上のレギュレータ蛋白質ＣｙｓＢの付加的脱調節によりシステ
イン収率の更なる上昇が、構成的発現の意味で可能であることを開示している。
【０００７】 特許出願ＥＰ８８５９６２Ａ１（ＵＳ特許出願整理番号ＳＮ０９/０９７７５
９に相当）明細書は、Ｌ-システイン、Ｌ-シスチン、Ｎ-アセチル-セリン及びチ
アゾリジン誘導体の発酵による製造のために好適である微生物を開示しており、
これは、それらが、直接、細胞からの抗生物質又は微生物に有害な他の物質の流
出のために好適である蛋白質をコードする少なくとも一つの遺伝子を過剰発現さ
せることを特徴としている。
【０００８】 ＣｙｓＢは、ＬｙｓＲ-タイプ-転写レギュレータ（ＬＴＴＲ）のファミリーに
属し、その内、既に１００以上の代表が公知である（Schell M. A., 1993, Annu
. Rev. Mocrobiol. 47 : 597-626 ) 。これらは、ヘリクス-ターン-ヘリクス-モ
チーフを有するＮ-末端ＤＮＡ-結合ドメイン及びＣ-末端インジューサー-結合ド
メインにより特徴的である。ＣｙｓＢの詳細なＤＮＡ-結合研究が存在する。更
に、ＣｙｓＢは、その結晶構造も利用できる最初のＬＴＴＲ-蛋白質である（Tyr
ell et al., 1997, Structure 5: 1017-1032) 。ＬＴＴＲ-蛋白質は、通常は、
インジューサー分子の存在に依存している正の遺伝子レギュレータとしての作用
をする。従来は、エフェクタ分子とは無関係である高活性ＣｙｓＢ-変体（いわ
ゆる構成的に活性な変体）のみが、システイン-生産を上昇させることができる
と想定されていた。それというのも、そのような形が一様に高い遺伝子活性を発
揮するからである（Nakamori S. et al., 1998, Appl. Env. Microbiol. 64: 16
07-1611) 。
【０００９】 ＣｙｓＢの構成的活性形の例がサルモネラ・チフィムリウムに関して記載され
た。この変体は、高い活性を示し、この際、その活性は、インジューサーＮ-ア
セチル-セリン及びチオ硫酸塩及び硫化物の負の作用とは全く無関係である（Col
yer T. E., Kredich N. M., 1994, Mol. Microbiol. 13: 797-805) 。
【００１０】 本発明は、Ｌ-システイン又はＬ-システイン誘導体の発酵による製造のために
好適であり、脱調節性システイン代謝(deregulierten Cysteinstoffwechsel)を
有し、この際、システイン代謝のこの脱調節は変更されたＣｙｓＢ-活性に基づ
くものではない、微生物株に関し、それは、付加的に高められたＣｙｓＢ-活性
を有し、この際、このＣｙｓＢ-活性は野生型-ＣｙｓＢに典型的な調節パターン
を有することを特徴とする。
【００１１】 その脱調節が変更されたＣｙｓＢ-活性に基づくものではない脱調節性システ
イン代謝を有する微生物株は公知である。これは、例えばＷＯ９７/１５６７３
（参照文献として提出）中に記載のような、又はNakamori S. et al., 1988 ,Ap
pl. Env. Microbiol. 64: 1607-1611( 参照文献として提出）に記載のような、
修飾ｃｙｓＢ-アレルを有する菌株又は例えばＥＰ０８８５９６２Ａ１（ＵＳ特
許出願整理番号ＳＮ０９/０９７７５９に相当）（参照文献として提出）に記載
のような、エフラックス-遺伝子が使用される菌株又は例えばＷＯ９７/１５６７
３又はNakamori S. et al., 1988, Appl. Env. Microbiol. 64: 1607-1611 に記
載されている様な、システイン過剰生産又は減少されたシステイン-分解のため
のスクリーニング-法と組み合わされた非特異的突然変異生成法の使用下に得ら
れる株である。
【００１２】 本発明の意味において、ＣｙｓＢの活性が野生型株中のＣｙｓＢ-活性に比べ
て少なくとも１０％だけ高められている場合に、高められたＣｙｓＢ-活性と記
載される。
【００１３】 このＣｙｓＢ-活性は少なくとも２５％高められているのが有利である。
【００１４】 このＣｙｓＢ-活性は少なくとも５０％高められているのが特に有利である。
【００１５】 ＣｙｓＢ-活性の測定のために好適であるエセリキア・コリ株（ＭＣ４１００
：：λＫＺＬ３００）は、例２に記載されている。これは、ＤＳＭＺ（Deusche
Sammlung fuer Microorganismen und Zellkulturen GmbH, D-38152 Braunschwei
g) に、ブダペスト条約により１９９年６月２３日にＤＳＭ１２８８６なる番号
で寄託された。更に、それぞれのｃｙｓＢ-含有構造は、株ＭＣ４１００：：λ
ＫＺＬ３００中に公知方法で取り入れられる。
【００１６】 野生型に典型的なＣｙｓＢ-活性の調節パターンは、Ｓ-源に依存して与えられ
、この際、チオ硫酸塩で生長される細胞のＣｙｓＢ-活性は、硫酸塩を用いて生
長される細胞に比べて７５％を下回り、シスチンを用いて生長される細胞のＣｙ
ｓＢ-活性は硫酸塩を用いて生長される細胞に比べて２０％を下回っている（例
２参照）。
【００１７】 本発明による微生物株は、脱調節性システイン代謝を有し、高められたＣｙｓ
Ｂ-活性を有しない微生物株に比べて高められた量でＬ-システイン又はＬ-シス
テイン誘導体を分泌する。
【００１８】 したがって、本発明による微生物株は、脱調節性システイン代謝を有する微生
物株であり、この際、このシステイン代謝の脱調節は変更されたＣｙｓＢ-活性
に基づくものではなく、その中で、野生型-ＣｙｓＢに典型的な調節パターンを
有するＣｙｓＢをコードする相同又は非相同ｃｙｓＢ-遺伝子が増強して発現さ
れる。
【００１９】 脱調節性システイン代謝を有するエセリキア・コリ株が有利であり、この際、
このシステイン代謝の脱調節は変更されたＣｙｓＢ-活性に基づくものではなく
、この中で、野生型-ｃｙｓＢ-遺伝子が過剰発現される。
【００２０】 脱調節性システイン代謝を有するエセリキア・コリ株が特に有利であり、この
際、このシステイン代謝の脱調節は変更されたＣｙｓＢ-活性に基づくものでは
なく、その中で、エセリキア・コリの野生型-ｃｙｓＢ-遺伝子のコピー数が高く
、この遺伝子が過剰発現される。
【００２１】 意外にも、技術水準の前記の刊行物におけるようには構成的に活性のＣｙｓＢ
-調節蛋白質をコードするｃｙｓＢ-アレルの使用がシステイン-生産を上昇させ
ることが自明であるとは仮定されず、全く逆に、野生型-ｃｙｓＢ-遺伝子の増強
された発現がシステイン-生産を上昇させることが明らかになった。
【００２２】 ＬｙｓＲ-タイプ-転写レギュレータのファミリーからのレギュレータ蛋白質の
増加した発現が代謝産物の過剰発現を可能とする例は従来は公知でなかったので
、この発見は意想外かつ予想外でもある。
【００２３】 従って、本発明は、ＬｙｓＲ-タイプ-転写レギュレータのファミリーからのレ
ギュレータ蛋白質を、代謝産物の過剰生産のために使用すること及び代謝産物の
過剰生産の方法にも関し、これは、ＬｙｓＲ-タイプ-転写レギュレータのファミ
リーからのレギュレータ遺伝子を微生物中に過剰発現させ、微生物中でのこの代
謝産物の増強された生産を引き起こすことを特徴とする。
【００２４】 典型的な調節パターンの保持と同時に微生物中のＣｙｓＢ-活性を高めること
は、例えば： １. プロモータのコントロール下での、微生物中の野生型-ＣｙｓＢに典型的な
調節パターンを有するＣｙｓＢをコードするｃｙｓＢ-遺伝子のコピー数の増加
又は ２. 野生型-ｃｙｓＢ-遺伝子の発現を調節するプロモータを強力なプロモータ
で交換することによる、野生型-ＣｙｓＢに典型的なレギュレータパターンを有
するＣｙｓＢをコードするｃｙｓＢ-遺伝子の増強された発現 により達成することができる。
【００２５】 ｃｙｓＢ-遺伝子は、エセリキア・コリ、サルモネラ・チフィムリウム、クレ
ブシエラ・アエロゲネス、ヘモフィルス・インフルエンザ、シュードモナス・ア
エルギノサ及びチオカプサ・ロセオペルシチナから公知である。ｃｙｓＢ-遺伝
子とは、エセリキア・コリのＣｙｓＢ-蛋白質を有するその遺伝子産物が少なく
とも４０％のアイデンテイテイを有する遺伝子であると理解される。その相同性
値は、コンピュータプログラム”Wisconsin Package Version 9.0 , Genetics C
omputer Group (GCG), Madison, Wisconsin "を用いて得られる結果と関連して
いる。この場合に、データバンクの探索を標準パラメータの使用下でサブルーチ
ン”blast" を用いて行った。
【００２６】 更に、ｃｙｓＢ-遺伝子は、その遺伝子産物がその配列で変えられているが、
それによって典型的な野生型-ＣｙｓＢ調節パターンを失っていないような野生
型-ｃｙｓＢ-遺伝子のアレルである。この例は、保存性アミノ酸-交換を有する
ＣｙｓＢ-変体である。
【００２７】 本発明による微生物は、例えば、脱調節性システイン代謝を有する微生物株（
この際、このシステイン代謝の脱調節は変更されたＣｙｓＢ-活性に基づくもの
ではない）中で自体公知の方法を用いて、野生型-ｃｙｓＢ-遺伝子の又は野生型
-ＣｙｓＢに典型的な調節パターンを有するＣｙｓＢをコードするｃｙｓＢ-遺伝
子のコピー数を高めることによるか又は自体公知の方法を用いて野生型-Ｃｙｓ
Ｂ-遺伝子の又は野生型-ＣｙｓＢに典型的な調節パターンを有するＣｙｓＢをコ
ードするｃｙｓＢ-遺伝子の増強された発現を引き起こすことにより製造するこ
とができる。
【００２８】 以下で、概念「ＣｙｓＢ」は、「野生型-ＣｙｓＢ」をも、「野生型-ＣｙｓＢ
に典型的な調節パターンを有するＣｙｓＢ-変体」をも意味する。以下で、概念
「ｃｙｓＢ-遺伝子」は、「野生型-ｃｙｓＢ-遺伝子」をも、「野生型-ＣｙｓＢ
に典型的な調節パターンを有するＣｙｓＢをコードするｃｙｓＢ-遺伝子」をも
意味する。
【００２９】 微生物中のｃｙｓＢ-遺伝子のコピー数の増加は、当業者に公知の方法を用い
て行うことができる。例えば、１細胞当たり多数のコピー数を有するプラスミド
-ベクター中のｃｙｓＢ-遺伝子（例えばｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ
１８４）をクローニングし、脱調節性システイン代謝を有する微生物中に取り込
むことができる。このｃｙｓＢ-遺伝子を脱調節性システイン代謝を有する微生
物の染色体中に多数組み込むこともできる。組み込み法としては、テンペレート
バクテリオファージを有する公知系、組み込み可能なプラスミド又は相同組み換
えを介しての組み込みを利用することができる（例えばHamilton et al., 1989,
J. Bacteriol. 171: 4617-4622) 。
【００３０】 プロモータのコントロール下でのプラスミド-ベクター中でのｃｙｓＢ-遺伝子
のクローニングによるコピー数の増加が有利である。ｐＡＣＹＣ-誘導体、例え
ばｐＡＣＹＣ１８４-ＬＨ（ブダペスト条約により、Deutsche Sammlung fuer Mi
croorganismen und Zellkulturen GmbH, D-38152 Braunschweigに、１９９５年
８月１８日にＤＳＭ１０１７２の番号で寄託）中でのｃｙｓＢ-遺伝子のクロー
ニングによるコピー数の増加が特に有利である。
【００３１】 プラスミド-コードされたｃｙｓＢ-遺伝子の発現のためのコントロール領域と
して、遺伝子の天然のプロモータ-又はオペレータ-領域を使用することができる
。
【００３２】 しかしながら、ｃｙｓＢ-遺伝子の増強された発現は、他のプロモータを用い
て行うこともできる。相応するプロモータ系は当業者には公知である（Makrides
S. C., 1996, Microbiol. Rev. 60: 512-538)。このような構成は、自体公知の
方法でプラスミド上で又は染色体中で使用することができる。
【００３３】 プラスミド-ベクター中でのｃｙｓＢ-遺伝子のクローニングは、例えば、特異
的プライマー（これはプロモータ-及びオペレータ-配列を有する完全ｃｙｓＢ-
遺伝子を包含する）の使用下でのポリメラーゼ-連鎖-反応を用いる特異的増幅及
び引き続くベクター-ＤＮＡ-フラグメントとの連結反応により行われる。
【００３４】 ｃｙｓＢ-遺伝子のクローニングのために有利なベクターとして、既にシステ
イン代謝の脱調節のための遺伝的機能因子（genetische Element)を含有するプ
ラスミド、例えばｃｙｓＥＸ-遺伝子（ＷＯ９７/１５６７３）及びエフラックス
-遺伝子（ＥＰ０８８５９６２Ａ１）が使用される。このようなベクターは、微
生物中でシステイン代謝の脱調節の作用もするので、このようなベクターは、任
意の微生物株からの本発明による微生物株の製造を可能にする。
【００３５】 従って、本発明は、システイン代謝の脱調節のための遺伝的機能因子を有する
ことを特徴とするプラスミドにも関し、この際、この遺伝的機能因子は、Ｃｙｓ
Ｂ-活性の変更に作用せず、かつプロモータのコントロール下にｃｙｓＢ-遺伝子
を含有する。
【００３６】 慣用の形質転換法（例えば電気穿孔）により、このｃｙｓＢ-含有プラスミド
は、細菌中に取り込まれ、例えば抗生物質-耐性を用いてプラスミド担持性クロ
ーン上で選択される。
【００３７】 従って、本発明は、微生物株中に本発明によるプラスミドを取り込むことを特
徴とする、本発明の微生物株の製法にも関する。
【００３８】 本発明による微生物株を用いるシステイン又はシステイン誘導体の生産は、発
酵槽中で自体公知の方法で行われる。Ｃ-源としては、例えばグルコース、ラク
トース又は他の糖類を、Ｎ-源としては、アンモニウム又は蛋白質加水分解物を
使用することができる。Ｓ-源としては、例えば硫化物、亜硫酸塩、硫酸塩又は
チオ硫酸塩を使用することができる。発酵の間に形成されるＬ-システインは、
酸化によって難溶性のシスチンまで、又はアルデヒド又はケトンとの縮合により
チアゾリジンまで（例えば、焦性ブドウ酸を用いて２-メチル-チアゾリジン-２,
４-ジカルボン酸まで）反応させることができる。
【００３９】 従って、本発明は、本発明による微生物株を自体公知の方法で発酵に使用し、
この発酵バッチからＬ-システイン又はＬ-システイン誘導体を分離することを特
徴とする、Ｌ-システイン又はＬ-システイン誘導体の製法にも関する。
【００４０】 次の実施例につき本発明を更に詳説する。
【００４１】 例１：野生型-ｃｙｓＢ-遺伝子及びｃｙｓＢ（Ｔ１４９Ｍ）-アレルのクロー
ニング エセリキア・コリの野生型-ｃｙｓＢ-遺伝子を、ポリメラーゼ-連鎖-反応（Ｐ
ＣＲ）の使用下にクローニングさせた。特異的オリゴヌクレオチド-プライマー
（１バッチ当たり２０ｐモル）ｃｙｓＢＰ１（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：１）及びｃ
ｙｓＢＰ２（ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ：２）を用いて、フランキング領域を有する野生
型-ｃｙｓＢ-遺伝子を包含し、末端ＥｃｏＲＩ-又はＳａｌＩ-制限切断位置を有
するゲノム性３１０７塩基対長さのＤＮＡ-フラグメントを増幅させた。
【００４２】
【外１】
【００４３】 ＰＣＲ-反応を、マトリックスとしてのゲノムＤＮＡ１０ｎｇと共にベーリン
ガー社（Firma Boehringer (Mannheim, D))のＰｗｏ-ＤＮＡ-ポリメラーゼを用
いて実施した。このプログラムは、アニーリング温度５６℃（１サイクル当たり
３０秒）、エクステンシヨン温度７２℃（１サイクル当たり６０秒）及び変性温
度９４℃（１サイクル当たり３０秒）での２９サイクルを包含した。このＤＮＡ
-フラグメントを、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで後処理し、調製用ゲル電
気泳動及び遺伝子クリーン-法（Geneclean Kit BIO101 P. O. Box 2284, La Jol
la, California ,USA, 92038-2284) により精製した。このフラグメントを、Fir
ma Bio-Rad Laboratories (Hercules,California,USA )のＥｃｏＲＩ-ＳａｌＩ-
切断され、かつホスファターゼ-処理されたプラスミド-ベクターｐＴＺ１９Ｕ中
で連結させ、こうしてプラスミドｐＴＺ１９Ｕ-ｃｙｓＢを得た（図２）。この
形質転換の後に、制限分析により陽性のクローンが同定された。
【００４４】 構成的活性のｃｙｓＢ-アレルの構築のために（Colyer T.E., Kredich N.M.,1
994, Mol. Microbiol. 13: 797-805 に記載のサルモネラ・チフィムリウムの野
生型ｃｙｓＢ-遺伝子中の突然変異生成と同様に）、野生型-ｃｙｓＢ-遺伝子の
コドン１４７の突然変異生成によるメチオニン-コドンへの変換を、Firma Bio-R
ad Laboratories (Hercules, California (USA) の”Mutagene In Vitro Mutage
nesis"-キットを用いて実施した。この場合に、オリゴヌクレオチドＣｙｓＢＭ
ｕｔ４（ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.３）を使用した。下線付き塩基は、野生型-配列から
の差異を示している。
【００４５】
【外２】
【００４６】 活性試験（例２参照）のために、クレノフ-処理後のＥｃｏＲＩ-ＳａｌＩ-フ
ラグメントとしての二つのｃｙｓＢ-アレルを、Ｅｃｏｌ１３６ＩＩ-切断され、
ホスファターゼ-処理されたベクターｐＡ-ＣＹＣ１８４-ＬＨ中でクローニング
させた。
【００４７】 例２：インビボでのＣｙｓＢ-活性の測定 ＣｙｓＢ-活性の測定のために、レポーター遺伝子-バッチを選択した。このた
めに、ｃｙｓＫ-遺伝子のコントロール-領域を、酵素β−ガラクトシダーゼをコ
ードするｌａｃＺ-遺伝子と融合させた。内因性β−ガラクトシダーゼなしでの
株中へのこの融合の組み込みにより、この酵素はＣｙｓＢ-活性に依存して形成
され、それに伴いβ−ガラクトシダーゼ-活性の形でＣｙｓＢ-活性の間接的尺度
を提供する。
【００４８】 この融合の構築のために、シモンズ等により記載された系を使用した（Simons
R. W. et al., 1987, Gene 53: 85-96) 。先ず、最初の１５個のコドンを含む
ｃｙｓＫ-遺伝子のプロモータ領域をオリゴヌクレオチドプライマーｃｙｓＫＰ
１（ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ：４）及びｃｙｓＫＰ３（ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ：５）及びエ
セリキア・コリの染色体ＤＮＡ１０ｎｇ及びＰｗｏ-ポリメラーゼの使用下に、
ポリメラーゼ-連鎖-反応を用いて増幅させた。
【００４９】
【外３】
【００５０】 条件は、例１に記載されたそれに相当した。生じる３１７塩基対-産物を製造
者指示に従い制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩを用いて消化させ、調製用ゲル
電気泳動及び遺伝子クリーン-法を用いて精製した。引き続き、この産物を同様
にＥｃｏＲＩ-ＢａｍＨＩ-消化され、かつホスファターゼ-処理されたベクター
ｐＲＳ５５２（ブダペスト条約によって、Deutsche Sammlung fuer Microorgani
smen und Zellkulturen GmbH, D-38152 Braunschweigに１９９９年９月１４日に
ＤＳＭ１３０３４の番号で寄託）と連結させた。電気穿孔を用いて、株ＭＣ４１
００（ＡＴＣＣ３５６９５）を連結バッチで形質転換させ、陽性のクローンを制
限分析を用いて同定した。これは、翻訳ｃｙｓＫ-ｌａｃＺ-融合を含有する。得
られるプラスミドは、後記のSimons 等の指示に従がい、引き続きバクテリオフ
ァージλＲＳ４５（ブダペスト条約によって、Deutsche Sammlung fuer Microor
ganismen und Zellkulturen GmbH, D-38152 Braunschweigに１９９９年９月１４
日にＤＳＭ１３０３５の番号で寄託）で組み換え、かつ、名称λＫＺＬ３００を
有するこの組み換えファージの相同リゼートを製造した。このファージを用いて
、Δｌａｃ-株ＭＣ４１００を感染させ、カナマイシン-選択により、リソゲンク
ローンを同定（ＭＣ４１００：：λＫＺＬ３００）すると、これは、今やＣｙｓ
Ｂ-活性の測定のために使用することができた。
【００５１】 ｐＡＣＹＣ１８４-ＬＨ中でクローニングされた多コピーｃｙｓＢ-遺伝子及び
ｃｙｓＢ（Ｔ１４９Ｍ）-遺伝子の作用の比較のために、ＭＣ４１００：：λＫ
ＺＬ３００を相応するプラスミドｐＡＣＹＣ-ｃｙｓＢ及びｐＡＣＹＣ-ｃｙｓＢ
（Ｔ１４９Ｍ）で形質転換させた。
【００５２】 この株を種々の硫黄源（硫黄各１ｍＭ）を有するＶＢ-最小培地（Ｎａ（ＮＨ
４）ＨＰＯ４３.５ｇ/ｌ；ＫＨ２ＰＯ４１０ｇ/ｌ；クエン酸塩×Ｈ２Ｏ２ｇ/ｌ
；ＭｇＣｌ２０.０７８ｇ/ｌ；ＮａＯＨでｐＨ６.５まで調節、グルコース５ｇ/
ｌ；ビタミンＢ１５ｍｇ/ｌ）中で培養し、その際、テトラサイクリン１５ｍｇ/
ｌを添加した。β−ガラクトシダーゼ-活性の測定をミラーにより記載された方
法で行った（Miller, J.H., 1972, Experiments in Molecular Genetics, Cold
Spring Harbour , New York, 352-355）。
【００５３】 結果は第１表中に示されている。対照（ＭＣ４１００：：λＫＺＬ３００／ｐ
ＡＣＹＣ１８４-ＬＨ）では、ＣｙｓＢ-活性のＣｙｓＢ-野生型に典型的な調節
パターンがＳ-源に依存していることが明らかである：チオ硫酸塩で生長される
細胞のＣｙｓＢ-活性は、硫酸塩に比べて７５％を下回り、シスチンで生長され
る細胞のＣｙｓＢ-活性は硫酸塩に比べて２０％を下回る。このパターンは、野
生型-ｃｙｓＢ-遺伝子の存在の場合には、多コピーで全体的に高められた活性水
準に保持される（本発明の例ＭＣ４１００：：λＫＺＬ３００/ｐＡＣＹＣ-ｃｙ
ｓＢ）。これに反して、ｃｙｓＢ（Ｔ１４９Ｍ）-アレルは、典型的な調節パタ
ーンの損失下に構成的に高い活性をもたらす。
【００５４】
【表１】
【００５５】 例３：本発明によるプラスミドの構築 本発明による生物体は、脱調節性システイン代謝により及び例えば多数のコピ
ー数でのｃｙｓＢ-遺伝子により特徴的である。このような生物体を製造するた
めに、基本構造としてプラスミド（ｐＡＣＹＣ１８４-ｃｙｓＥＸ-ＧＡＰＤＨ-
ＯＲＦ３０６）を選択した。このプラスミドは、システイン代謝の脱調節のため
の機能因子フィードバック-抵抗性ｃｙｓＥ-アレル及びエフラックス-遺伝子を
含有する。これは、特許出願ＥＰ０８８５９６２Ａ１（例２Ｄ）中に詳細に記載
されている。制限酵素ＳｎａＢＩで消化され、かつホスファターゼ-処理された
この構造内に、ｃｙｓＥＸ-アレルとエフラックス-遺伝子との間にｃｙｓＢ-フ
ラグメントを挿入した。後者は酵素ＥｃｏＲＩ及びＢｓｔＸＩを用いる制限によ
り、かつ引き続くクレノフ-酵素を用いるＤＮＡ-末端の平滑化により、プラスミ
ドｐＴＺ１９Ｕ-ｃｙｓＢから取得される（図２）。このプラスミドは、名称ｐ
ＨＣ３４を有する。
【００５６】 エセリキア・コリ株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５；Bachmann B. J., 1996
, In: Neidhardt F. C. (ed) Escheichia coli und Salmonella : cellular and
molecular biology, American Society for Microbiology, Washington D.C.,
Chapter 133) の形質転換により本発明による生物体が生じる。形質転換は，電
気穿孔を用いて実施した。この場合に、氷冷１０％グリセリン溶液中の密な細胞
懸濁液にプラスミド-ＤＮＡ０.１μｇを加え、２５００Ｖ、２００Ω及び１２.
５μＦで電気パルスを当てた。このバッチの無菌ＬＢ-培地（トリプトン１％、
酵母エキス０.５％、ＮａＣｌ１％）中への移行及び３０℃で１時間インキュベ
ーションの後に、プラスミド担持クローンをテトラサイクリン１５μｇ/ｍｌを
有するＬＢ-寒天プレート上で選択した。
【００５７】 構成的ｃｙｓＢ（Ｔ１４９Ｍ）-アレルに比べた野生型-ｃｙｓＢ-遺伝子の作
用の比較のために、類縁構造（ｐＨＣ３０）を用意し、同様に株Ｗ３１００中に
取り込んだ。更に、ＥＰ８８５９６２Ａ１に記載の生物体Ｗ３１１０を、プラス
ミドｐＡＣＹＣ１８４/ｃｙｓＥＸ-ＧＡＰＤＨ-ｏｒｆ３０６で形質転換して、
技術水準に対する比較と同時に制限のための遺伝子構造として用いた。
【００５８】 Ｗ３１１０は野生型株であるので、全てのシステイン-生産効果はプラスミド-
コード化遺伝子に帰せしめることができる。
【００５９】 例４：本発明の微生物でのシステイン-生産 システイン-生産の証明のために、例３に記載の微生物を、発酵槽中で連続的
グルコース-及びチオ硫酸塩-供給を伴うフエド-バッチ-モード（Fed-Batch-Modu
s）で培養した。装置として、Firma Braun Biotech (Melsungen ,D) の最大培養
容積２リットルを有するビオスタットＭ-装置を用いた。
【００６０】 前培養物として、付加的にテトラサイクリン１５ｍｇ/ｌを含有するＬＢ-培地
（トリプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ/ｌ、ＮａＣｌ１０ｇ/ｌ）２０ｍｌを
接種し、３０℃及び１５０ｒｐｍで振動装置中でインキュベートした。７時間後
に全バッチを、グルコース５ｇ/ｌ、ビタミンＢ１０.５ｍｇ/ｌ及びテトラサイ
クリン１５ｍｇ/ｌが補充されたＳＭ１-培地１００ｍｌ（Ｋ２ＨＰＯ４１２ｇ/
ｌ；ＫＨ２ＰＯ４３ｇ/ｌ；（ＮＨ４）２ＳＯ４５ｇ/ｌ；ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ
０.３ｇ/ｌ；ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ０.０１５ｇ/ｌ；ＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ０.
００２ｇ/ｌ；クエン酸Ｎａ３×２Ｈ２Ｏ１ｇ/ｌ；ＮａＣｌ０.１ｇ/ｌ；Ｎａ２ ＭｏＯ４×２Ｈ２Ｏ０.１５ｇ/ｌ、ＮａＢＯ３２.５ｇ/ｌ、ＣｏＣｌ２×６Ｈ２ Ｏ０.７ｇ/ｌ、ＣｕＳＯ４×５Ｈ２Ｏ０.２５ｇ/ｌ、ＭｎＣｌ２×４Ｈ２Ｏ１.
６ｇ/ｌ、ＺｎＳＯ４×７Ｈ２Ｏ０.３ｇ/ｌからなる微量元素溶液１ｍｌ/ｌ）中
に移した。３０℃、１５０ｒｐｍで更に１７時間インキュベートした。
【００６１】 この前培養物（６００ｎｍでの光学密度約３）を、発酵培地（グルコース１５
ｇ/ｌ；トリプトン１０ｇ/ｌ；酵母エキス５ｇ/ｌ；（ＮＨ４）２ＳＯ４５ｇ/ｌ
；ＫＨ２ＰＯ４１.５ｇ/ｌ；ＮａＣｌ０.５ｇ/ｌ；ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ０.３
ｇ/ｌ；ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ０.０１５ｇ/ｌ；ＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ０.０７５
ｇ/ｌ；クエン酸Ｎａ３×２Ｈ２Ｏ１ｇ/ｌ；及び微量元素溶液（上記参照）１ｍ
ｌ/ｌ；ビタミンＢ１５ｍｇ/ｌ及びテトラサイクリン１５ｍｇ/ｌ；２５％アン
モニアを用いてｐＨ７.０に調節）９００ｍｌを有する発酵槽に接種した。この
発酵の間に、３０℃の温度に調節し、ｐＨ値を２５％アンモニアの供給により７
.０の値で一定に保持した。この培養液に除菌圧縮空気を１.５ｖｏｌ／ｖｏｌ/
ｍｉｎで吹き込み、２００ｒｐｍの撹拌回転数で撹拌した。酸素飽和度を５０％
の値まで低下の後に、５０％の飽和度を保持するために、コントロール装置を介
して回転数を１２００ｒｐｍの値まで高めた。
【００６２】 ２時間後に、３０％チオ硫酸Ｎａ-溶液の供給を３ｍｌ/ｈの速度で行った。発
酵槽中の含分が最初の１５ｇ/ｌから約５〜１０ｇ/ｌまで低下したら直ちに、５
６％原液からグルコースを供給した。このグルコース供給は、８〜１４ｍｌ/ｌ
の流速で行い、この際、約５〜１０ｇ/ｌのグルコース濃度を一定に保つ試みを
した。このグルコース-測定を、Firma YSI (Yellow Springs ,Ohio, USA) のグ
ルコース分析装置を用いて実施した。
【００６３】 Ｌ-システインの生産を、Gaitonde のテスト（Gaitonde, M. K. (1967), Bioc
hem. J. 104, 627-633) を用いて比色的に追跡した。この場合に、このテストは
Ｌ-システインとＥＰ０８８５９６２Ａ１に記載のＬ-システイン及びピルベート
の縮合生成物（２-メチル-チアゾリジン-２,４-ジカルボン酸）との間を区別し
ないことを考慮すべきである。Ｌ-システインから酸化により生じる難溶性シス
チンは、８％塩酸中の溶解及び引き続くｐＨ８.０で希溶液中でのジチオレイト
ール（ＤＴＴ）を用いる還元の後に、同様にＬ-システインとして証明された。
【００６４】 第２表は、ＥＰ０８８５９６２Ａ１に記載の基本構造ｐＡＣＹＣ１８４/ｃｙ
ｓＥＸ-ＧＡＰＤＨ-ＯＲＦ３０６を有する生物体の発酵の生産経過を、本発明に
よるプラスミドｐＨＣ３４と、かつ構成的活性のＣｙｓＢ-遺伝子産物をコード
するｃｙｓＢ（Ｔ１４９Ｍ）-アレルを有する相応する構造と比較して示してい
る。野生型-ｃｙｓＢ-遺伝子の本発明による使用は生産能力に正の効果を発揮す
るが、構成的アレルｃｙｓＢ（Ｔ１４９Ｍ）は負の作用効果を示していることが
明らかになる。
【００６５】
【表２】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 細菌内でのシステイン生合成の調節を示す図
【図２】 本発明によるプラスミドｐＨＣ３４の構築を示す図
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１４年１月２５日（２００２．１．２５）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｐ 13/12 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 クリストフ ヴィンターハルター ドイツ連邦共和国 ペッキング ケルテン シュトラーセ 27 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA05 BA80 CA04 DA06 EA04 FA13 GA11 4B064 AE14 CA02 CA19 CC24 DA10 DA16 4B065 AA26X AB01 AC20 BA02 CA17 CA24 CA47 CA50

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 Ｌ-システイン又はＬ-システイン誘導体を発酵により製造す
    るために好適であり、脱調節性システイン代謝を有し、この際、このシステイン
    代謝の脱調節は変更されたＣｙｓＢ-活性に基づくものではない、微生物株にお
    いて、これは、付加的に高められたＣｙｓＢ-活性を有し、この際、このＣｙｓ
    Ｂ-活性は野生型-ＣｙｓＢに典型的な調節パターンを有することを特徴とする、
    微生物株。
  2. 【請求項２】 Ｌ-システイン又はＬ-システイン誘導体を発酵により製造す
    るために好適であり、脱調節性システイン代謝を有し、この際、このシステイン
    代謝の脱調節は変更されたＣｙｓＢ-活性に基づくものではなく、その中で野生
    型-ＣｙｓＢに典型的な調節パターンを有するＣｙｓＢをコードする相同又は非
    相同ｃｙｓＢ-遺伝子が増強されて発現される、微生物株。
  3. 【請求項３】 その中で野生型-ｃｙｓＢ-遺伝子が過剰発現される、脱調節
    性システイン代謝を有するエセリキア・コリ株であることを特徴とする、請求項
    ２に記載の微生物株。
  4. 【請求項４】 その中でエセリキア・コリの野生型-ｃｙｓＢ-遺伝子のコピ
    ー数が高められていて、この遺伝子が過剰発現される、脱調節性システイン代謝
    を有するエセリキア・コリ株であることを特徴とする、請求項３に記載の微生物
    株。
  5. 【請求項５】 請求項１から４までのいずれか１項に記載の微生物を製造す
    る方法において、脱調節性システイン代謝を有する微生物株中で、自体公知の方
    法を用いて、野生型-ｃｙｓＢ-遺伝子の又は野生型-ＣｙｓＢに典型的な調節パ
    ターンを有するＣｙｓＢをコードするｃｙｓＢ-遺伝子のコピー数を高めるか、
    又は自体公知の方法を用いて、野生型-ｃｙｓＢ-遺伝子の又は野生型-ＣｙｓＢ
    に典型的な調節パターンを有するＣｙｓＢをコードするｃｙｓＢ-遺伝子の増強
    された発現を引き起こすことを特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項
    に記載の微生物を製造する方法。
  6. 【請求項６】 Ｌ-システイン又はＬ-システイン誘導体を製造する方法にお
    いて、請求項１から４までのいずれか１項に記載の微生物株を、自体公知の方法
    で発酵に使用し、この発酵バッチからＬ-システイン又はＬ-システイン誘導体を
    分離することを特徴とする、Ｌ-システイン又はＬ-システイン誘導体を製造する
    方法。
  7. 【請求項７】 システイン代謝の脱調節のための遺伝的機能因子を有し、こ
    の際、この遺伝的機能因子はＣｙｓＢ-活性の変更に作用せず、かつプロモータ
    ーのコントロール下にｃｙｓＢ-遺伝子を含有することを特徴とする、プラスミ
    ド。
  8. 【請求項８】 微生物株中に請求項７に記載のプラスミドを取り込むことを
    特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項に記載の微生物株の製造法。
  9. 【請求項９】 ＬｙｓＲ-タイプ-転写レギュレータのファミリーからの調節
    遺伝子を１微生物中で過剰発現させ、この微生物中での代謝産物の増強された生
    産を引き起こすことを特徴とする、代謝産物の過剰生産法。
  10. 【請求項１０】 代謝産物の過剰生産のための、ＬｙｓＲ-タイプ-転写レギ
    ュレータのファミリーからの調節遺伝子の使用。
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