CN1379823A - 发酵制备l-半胱氨酸或l-半胱氨酸衍生物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及通过微生物发酵制备L-半胱氨酸或L-半胱氨酸衍生物的方法,以及适于所述方法的微生物。适于发酵制备L-半胱氨酸或L-半胱氨酸衍生物的微生物菌株具有去调节的半胱氨酸代谢,所述半胱氨酸代谢不依赖于改变的CysB活性。所述微生物菌株的特征还在于增加的CysB活性,由此CysB活性具有野生型CysB典型的调节模式。
Description
本发明涉及通过发酵微生物而制备L-半胱氨酸或L-半胱氨酸衍生物的方法,以及适于该方法的微生物。
氨基酸L-半胱氨酸极具经济价值。举例言之,L-半胱氨酸用作食品添加剂(特别是焙烤食品工业),用作化妆品中使用的物质,以及用作制备药物活性化合物的起始原料(特别是N-乙酰半胱氨酸及S-羧甲基半胱氨酸)。
L-半胱氨酸衍生物均是含硫的代谢物,在它们的合成中,它们衍生自半胱氨酸,例如胱氨酸、甲硫氨酸、谷胱甘肽、生物素、噻唑烷、硫胺素、硫辛酸及辅酶A。
在细菌中,半胱氨酸的生物合成在两种水平被调节(图1):1.在酶活性水平,丝氨酸乙酰基转移酶(cysE基因的产物)受L-半胱氨酸的终产物抑制。这意味着L-半胱氨酸的累积直接导致半胱氨酸生物合成的第一特定反应的抑制,使进一步的合成中止。2.在转录水平,调节蛋白CysB(由cysB基因编码)起转录激活剂的作用并确保还原硫的提供受到调节。CysB需要N-乙酰丝氨酸作为诱发物,N-乙酰丝氨酸在还原硫对O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶反应而言不足时,于细胞内由O-乙酰丝氨酸形成。因此,所有与硫的吸收、还原及掺入有关的基因均受CysB的控制。这些基因是操纵子cysPTWAM、cysDNC及cysJIH以及cysK基因。乙酰丝氨酸是CysB的诱发物,而硫化物及硫代硫酸盐作为所谓“抗诱发物”具有负效应,因为它们的存在表明有SH基可用。
在WO 97/15673(相应于美国专利申请SN 09/065104)中,详细讨论了有关获得L-半胱氨酸及L-半胱氨酸衍生物的技术领域的状况。WO 97/15673本身描述了发酵制备方法,所述制备方法使用抗反馈丝氨酸乙酰基转移酶。该申请还公开了通过另外地在基因水平去调节(deregulate)调节蛋白CysB以使该基因组成型表达,可能获得半胱氨酸收率的进一步增加。
专利申请EP 885962 A1(相应于美国申请序列号SN 09/097759)公开了适于发酵制备L-半胱氨酸、L-胱氨酸、N-乙酰丝氨酸及噻唑烷衍生物的微生物,其特征在于,它们超量表达至少一种编码直接适于将抗生素或对微生物有毒的其他物质分泌出细胞的蛋白质的基因。
CysB属于LysR型转录调节剂(LTTR)族,它们中的100余种代表是已知的(Schell M.A.,1993,Annu.Rev.Microbiol.,47:597-626)。它们的显著特点是它们具有N-末端DNA结合域及C-末端诱发物结合域,该N-末端DNA结合域具有螺旋-转角-螺旋基元。对CysB有许多详细的DNA结合研究。再者,CysB是第一个晶体结构已知的LTTR蛋白(Tyrell等,1997,Structure 5:1017-1032)。通常,LTTR蛋白质起正基因调节剂的作用,其依赖于诱发物分子的存在。以前曾提出,仅与效应物分子无关的高活性CysB变体(所谓组成型活性变体)使半胱氨酸生产增加,因为这种形式显示恒定的高基因激活(Nakamori S.等,1998,Appl.Env.Microbiol.64:1607-1611)。
CysB组成型活性形式的实例曾于鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)的情况中有描述。这些变体显示高度活性,该活性完全与诱发物L-乙酰丝氨酸及硫代硫酸盐及硫化物的负效应无关(ColyerT.E.,Kredich N.M.,1994,Mol.Microbiol.13:797-805)。
本发明涉及微生物菌株,所述微生物菌株适于发酵制备L-半胱氨酸或L-半胱氨酸衍生物,其具有去调节的半胱氨酸代谢,该半胱氨酸代谢的去调节不基于CysB活性的改变,其特征在于,该菌株另外具有增加的CysB活性,且CysB活性具有野生型CysB典型的调节模式。
具有去调节的半胱氨酸代谢且其中这种去调节不是由于CysB活性的改变的微生物菌株是已知的。这些菌株是,具有修饰的cysE等位基因的菌株,例如,如WO 97/15673(该文献引入本文作参考)或Nakamori S.等,1998,Appl.Env.Microbiol.64:1607-1611(该文献引入本文作参考)中所述,或者外流基因已插入其中的菌株,例如,在EP 0885962 A1(相应于美国专利申请序列号SN 09/097759(该文献引入本文作参考))中所述,或者用非特异性诱变结合筛选半胱氨酸超量生产或降低的半胱氨酸分解的方法分离的菌株,例如,在WO97/15673或在Nakamori S.等,1998,Appl.Env.Microbiol.64:1607-1611中所述。
在本发明的含义内,当CysB活性比野生型菌株的高至少10%时,该活性是增加的。
优选CysB活性至少高25%。
特别优选CysB活性至少高50%。
在实施例2中描述了适于确定CysB活性的大肠杆菌菌株(MC4100∷λKZL300)。依照布达佩斯条约,该菌株于1999年6月23日,以保藏号DSM 12886保藏在DSMZ(德意志微生物保藏中心,D-38142,不伦瑞克)。此外,将各分别含有CysB的构建体(construct)以已知的方式导入菌株MC4100∷λKZL300内。
当以硫代硫酸盐生长的细胞的CysB活性低于以硫酸盐生长的细胞的75%,及以半胱氨酸生长的细胞的CysB活性低于以硫酸盐生长的细胞的20%时(参见实施例2),与硫源无关,CysB活性显示野生型CysB典型的调节模式。
本发明的微生物菌株分泌的L-半胱氨酸或L-半胱氨酸衍生物的量远大于半胱氨酸代谢被去调节而CysB活性不增加的微生物菌株所分泌的。
因此,本发明的微生物菌株是具有去调节的半胱氨酸代谢的微生物菌株,该半胱氨酸代谢的去调节不基于CysB活性的改变,且在该微生物菌株中,编码具有野生型CysB典型的调节模式的CysB的同源或异源cysB基因的表达程度增加。
优选的菌株是具有去调节的半胱氨酸代谢的大肠杆菌菌株,该半胱氨酸代谢的去调节不基于CysB活性的改变,且在该大肠杆菌菌株中野生型cysB基因超量表达。
特别优选的菌株是具有去调节的半胱氨酸代谢的大肠杆菌菌株,该半胱氨酸代谢的去调节不基于CysB活性的改变,且在该大肠杆菌菌株中大肠杆菌野生型cysB基因的拷贝数增加而且该基因超量表达。
令人惊奇的是,如上述已有技术的公开中所假定的,发现使用编码组成型活性CysB调节蛋白的cysB等位基因增加半胱氨酸的产生,但是正相反,通过增加野生型cysB基因的表达,半胱氨酸的产生获得增加。
此项发现亦令人惊奇而且是未预期的,因为没有已知的例子中来自LysR型转录调节剂族的调节蛋白的增加的表达使代谢物超量表达产生。
因此,本发明还涉及来自LysR型转录调节剂族的调节蛋白用于超量生产代谢物的用途,并涉及超量生产代谢物的方法,其特征在于,来自LysR型转录调节剂族的调节基因在微生物内超量表达并在该微生物内导致增加的代谢物的产生。
举例言之,可以通过以下方法增加微生物内CysB活性,同时保留典型的调节模式:1.在启动子的控制下,于微生物内,增加编码具有野生型CysB典型的调节模式的CysB的cysB基因的拷贝数,或者2.通过用更强的启动子代替调节野生型cysB基因表达的启动子,增加编码具有野生型CysB典型的调节模式的CysB的cysB基因的表达。
已知cysB基因来自大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)及桃红荚硫菌(Thiocapsaroseopersicina)。优选cysB基因是其基因产物与大肠杆菌CysB蛋白显示至少40%相同的基因。同源性值指用“Wisconsin Package Version9.0,Genetics Computer Group(GCG),Madison,威斯康辛州”计算机程序获得的结果。在这方面,用标准参数以“blast“子程序检索数据库。
此外,cysB基因是野生型cysB基因的等位基因,其基因产物的序列改变,而野生型CysB典型的调节模式并未失去。其实例是含有保守氨基酸置换的CysB变体。
举例言之,本发明的微生物可以通过以下方法制备:在具有去调节的半胱氨酸代谢的微生物菌株内,该半胱氨酸代谢的去调节不基于CysB活性的改变,使用本领域已知的方法增加野生型cysB基因的拷贝数或增加编码具有野生型CysB典型的调节模式的CysB的cysB基因的拷贝数,或者使用本领域已知的方法增加野生型cysB基因的表达,或增加编码具有野生型CysB典型的调节模式的CysB的cysB基因的表达。
在下文中,术语“CysB”指“野生型CysB”及“具有野生型CysB典型的调节模式的CysB变体”。在下文中,术语“cysB基因”指“野生型cysB基因”及“编码具有野生型CysB典型的调节模式的CysB的cysB基因”。
本领域技术人员已知的方法可以用于增加微生物内cysB基因的拷贝数。因此,举例言之,可以将cysB基因克隆入质粒载体,所述质粒载体在每个细胞中以多个拷贝存在(例如pUC19、pBR322及pACYC184)并将其导入具有去调节的半胱氨酸代谢的微生物内。或者,可以将cysB基因数次整合入具有去调节的半胱氨酸代谢的微生物的染色体中。可以使用的整合方法是采用温和噬菌体或整合质粒的已知系统,或通过同源重组的整合(例如Hamilton等,1989,J.Bacteriol.171:4617-4622)。
优选通过在启动子的控制下将cysB基因克隆入质粒载体而增加拷贝数。特别优选通过将cysB基因克隆入pACYC衍生物,如pACYC184-LH(依照布达佩斯条约,于1995年8月18日,以保藏DSM 10172保藏于德意志微生物保藏中心)而增加拷贝数。
基因的天然启动子及操纵基因区可以用作控制区以表达质粒编码的cysB基因。
但是,使用其他启动子也可以增加cysB基因的表达。适宜的启动子系统是本领域技术人员已知的(Makrides S.C.,1996,Microbiol.Rev.60:512-538)。这种构建体可以以本领域已知的方式用在质粒或染色体上。
举例言之,cysB基因如下克隆入质粒载体:通过使用包含包括起动子及操纵子序列的完整基因的特定引物的聚合酶链反应进行特异性扩增,然后连接到载体DNA片段上。
用以克隆cysB基因的优选的载体是已经含有用以去调节半胱氨酸代谢的遗传因子的质粒,例如,cysEX基因(WO 97/15673)及外流基因(EP 0885962 A1)。这种载体使得本发明的微生物菌株能够自任何微生物菌株制备,因为这种载体也去调节微生物内的半胱氨酸代谢。
因此本发明还涉及质粒,其特征在于,其具有用以去调节半胱氨酸代谢的遗传因子,这些遗传因子并不导致CysB活性的任何改变,所述质粒还含有在启动子控制下的cysB基因。
用现有的转化方法(例如电穿孔)将含有cysB的质粒导入细菌,举例言之,通过抗生素耐药性将选择包含(harbour)质粒的克隆。
因此,本发明还涉及用以制备本发明的微生物菌株的方法,其特征在于,将本发明的质粒导入微生物菌株内。
本发明的微生物菌株用于以本领域已知的方法在发酵罐内制备半胱氨酸或半胱氨酸衍生物。举例言之,所用碳源可以是葡萄糖或乳糖,或其他糖类,而所用氮源可以是铵或蛋白质水解产物。举例言之,所用硫源可以是硫化物、亚硫酸盐、硫酸盐或硫代硫酸盐。在发酵期间形成的L-半胱氨酸可加以氧化而生成难溶的胱氨酸或与醛或酮缩合而生成噻唑烷(例如与丙酮酸生成2-甲基噻唑烷-2,4-二羧酸)。
因此,本发明还涉及制备L-半胱氨酸或L-半胱氨酸衍生物的方法,其特征在于,本发明的微生物菌株以本领域已知的方式用在发酵中,且将L-半胱氨酸或L-半胱氨酸衍生物自发酵混合物中分离。
以下实施例用以阐明本发明。实施例1:克隆野生型cysB基因及cysB(T149M)等位基因
使用聚合酶链反应(PCR)克隆大肠杆菌野生型cysB基因。将特定的寡核苷酸引物cysBP1(SEQ.ID.NO:1)及cysBP2(SEQ.ID.NO:2)(每种混合物20pmol)用于扩增长度为3107个碱基对的基因组DNA片段,所述片段包含(encompass)野生型cysB基因和侧翼区,并分别具有末端EcoRI及SalI限制切割位点。5′-GTT ACG AGA TCG AAG AGG-3′(在3′-端的硫代磷酸酯键)(SEQ.ID.NO:1)5′-GTC ACC GAG TGG TCA ATG-3′(在3′-端的硫代磷酸酯键)(SEQ.ID.NO:2)
使用Boehringer(Mannheim,德国)Pwo DNA聚合酶并采用10ng基因组DNA作为模板进行PCR反应。程序包括29个循环,退火温度为56℃(每个循环30秒),延伸温度为72℃(每个循环30秒),变性温度为94℃(每个循环30秒)。然后用限制酶EcoRI及SalI处理DNA片段,并用制备凝胶电泳及Geneclean方法(GenecleanKitBI0101P.O.Box 2284,La Jolla,加利福尼亚州,美国,92038-2284)纯化DNA片段。将该片段连接在Bio-Rad Laboratories(Hercules,加利福尼亚州,美国)噬菌粒载体pTZ19U内,该噬菌粒载体pTZ19U已经用EcoRI/SalI切割并用磷酸酶处理,由此形成质粒pTZ19U-CysB(图2)。转化之后,通过限制分析鉴定阳性克隆(positive clone)。
为了构建组成型活性cysB等位基因,使用来自Bio-RadLaboratories(Hercules,加利福尼亚州,美国)的“Mutagene In VitroMutagenesis”试剂盒,将野生型cysB基因的密码子147突变(类似于Colyer T.E.,Kredich N.M.,1994,Mol.Microbiol.13:797-805所述的鼠伤寒沙门氏菌野生型cysB基因的突变)为甲硫氨酸密码子。在本例中使用寡核苷酸CysBMut4(SEQ.ID.NO:3)。加下划线的碱基表示与野生型序列的不同。5′-TTC GCT ATC GCC A
TG GAA GCG CTG CAT-3′(SEQ.ID.NO:3)
为了进行活性测试(参见实施例2),以EcoRI/SalI片段,在用Klenow处理后,将两种cysB等位基因克隆入Ecl136II-切割、磷酸酶处理的载体pACYC184-LH。实施例2:体内测定CysB活性
选择报道基因以测定CysB活性。为此,将cysK基因的控制区融合至编码酶β-半乳糖苷酶的lacZ基因。当将该融合整合入缺乏内源β-半乳糖苷酶的菌株时,该酶的形成与CysB活性无关,因此以β-半乳糖苷酶活性的形式,提供CysB活性的间接测定。将Simons等(Simons等,1987,Gene 53:85-96)所述的系统用于构建融合。通过聚合酶链反应,利用寡核苷酸引物cysKP1(SEQ.ID.NO:4)及cysKP3(SEQ.ID.NO:5)及10ng大肠杆菌染色体DNA及Pwo聚合酶,首先扩增cysK基因的启动子区,包含前15个密码子,。5′-CCG GAA TTC CCG TTG CCG TTT CTG GCG-3′(SEQ.ID.NO:4)5′-CGC GGA TCC GTG TGA CCG ATA GTC AGC-3′(SEQ.ID.NO:5)
条件相应于实施例1中所述的条件。所得317个碱基对的产物依照制备商的说明书用限制酶EcoRI及BamHI消化,并通过制备凝胶电冰及Geneclean方法纯化。之后将该产物连接于载体pRS552(依照布达佩斯条约,于1999年9月14日,以保藏号DSM 13034保藏于德意志微生物保藏中心,不伦瑞克),该载体pRS552同样也已用EcoRI-BamHI消化并用磷酸酶处理。使用电穿孔,将菌株MC4100(ATCC 35695)用连接混合物转化,通过限制分析鉴定阳性克隆。这些阳性克隆含有翻译cysK-lacZ融合。依照Simons等的说明,将所得质粒与噬菌体λRS45(依照布达佩斯条约,于1999年9月14日,以保藏号DSM 13035保藏于德意志微生物保藏中心,不伦瑞克)重组,制得命名为λKZL300的重组噬菌体的均一溶胞产物。用该噬菌体感染Δlac菌株MC4100,通过卡那霉素选择而鉴定现在可以用于测定CysB活性的溶原性克隆(MC4100∷λKZL300)。
为比较克隆入pACYC184-LH的多拷贝cysB基因的效果与cysB(T149M)基因的效果,将MC4100∷λKZL300用相应的质粒,即pACYC-CysB及pACYC-CysB(T149M)转化。将菌株在含有不同硫源(各例均是1mM硫)且每升添加有15mg四环素的VB基本培养基(3.5g Na(NH4)HPO4/l;10g KH2PO4/l;2g柠檬酸×H2O/l;0.078gMgCl2/l;用NaOH将pH调节至6.5,5g葡萄糖/l;5mg维生素B1/l)内培养。按照Miller(Miller J.H.,1972,Experiments in MolecularGenetics,Cold Spring Harbor,纽约,352-355)所述的方法测定β-半乳糖苷酶活性。
结果如表1所示。在对照(MC4100∷λKZL300/pACYC184-LH)的情况中,取决于硫源,发现CySB活性的调节模式是野生型CysB典型的调节模式;以硫代硫酸盐生长的细胞的CysB活性低于以硫酸盐生长的75%,以胱氨酸生长的细胞的CysB活性低于以硫酸盐生长的20%。在野生型cysB基因多拷贝(本发明实例MC4100∷λKZL300/pACYC-CysB)的存在下,在活性全面提升的水平,该模式保留。相比而言,cysB(T149M)等位基因导致组成型高水平活性而失去典型的调节模式。表1包含染色体cysK-lacZ融合的菌株的β-半乳搪苷酶活性形式的CysB活性的测定
实施例3:构建本发明的质粒
菌株 | MC4100∷λKZL300 | MC4100∷λKZL300 | MC4100∷λKZL300 |
质粒 | pACYC184-LH | pACYC-CysB | pACYC-CysB(T149M) |
基因型 | CysB单拷贝 | CysB多拷贝 | CysB(T149M)多拷贝 |
硫源 | β-半乳糖苷酶活性,Miller单位 | ||
胱氨酸 | 26 | 341 | 3791 |
硫酸盐 | 1906 | 2708 | 3824 |
硫代硫酸盐 | 726 | 1094 | 3595 |
本发明的微生物的特征在于去调节的半胱氨酸代谢,以及,例如以多拷贝存在的cysB基因。选择质粒(pACYC184-cysEX-GAPDH-ORF306)作为制备这些微生物的基本构建体。该质粒含有抗反馈cysE等位基因及外流基因作为去调节半胱氨酸代谢的因子。其在专利申请EP 0885962 A1(实施例2D)中有详细描述。将cysB片段插入该构建体cysEX等位基因与外流基因之间,该构体已用限制酶SnaBI消化并用磷酸酶处理。通过用酶EcoRI及BstXI限制及随后用Klenow酶整平(smooth)DNA末端,自质粒pTZ19U-cysB获得cysB片段(图2)。该质粒命名为pHC34。
本发明的微生物通过转化大肠杆菌菌株W3110(ATCC 27325;Bachmann B.J.,1996,in:Neidhardt F.C.(ed.)Escherichia coli andSalmonella:cellular and molecular biology(大肠杆菌及沙门氏菌:细胞及分子生物学),American Society for Microbiology,Washington D.C.,第133章)而获得。使用电穿孔进行转化。为了进行转化,将0.1μg质粒DNA加入冰冷10%甘油溶液内的浓稠细胞悬浮液中,之后使悬浮液经受2500V、200欧姆及12.5μF的电子脉冲。将混合物转移入无菌LB培养基(1%胰蛋白胨,0.5%酵母提取物,1%NaCl)中并在30℃培养一小时后,在含有15μg四环素/ml的LB琼脂板上选择包含质粒的克隆。
为了比较野生型cysB基因的效果及组成型cysB(T149M)等位基因的效果,制备类似的构建体(pHC30)并同样地导入菌株W3100。此外,在EP 885962 A1中描述的微生物W3100,经用质粒pACYC184/cysEX-GAPDH-orf306转化,用作用于比较的基本构建体,同时,用以与已有技术划界限。
因为W3110是野生型菌株,因此所有半胱氨酸的产生效果均归功于质粒编码的基因。实施例4:使用本发明的微生物制备半胱氨酸
为了检测半胱氨酸的产生,在发酵罐内,以补料分批模式培养实施例3中所述的微生物,同时连续加入葡萄糖及硫代硫酸盐。所用装置是Braun Biotech(Melsungen,德国)Biostat M设备,其最大培养物容量为21。
接种20ml LB培养基(10g胰蛋白胨/l,5g酵母提取物/l,10gNaCl/l),其另外含有15mg四环素/l),作为预培养物,并于摇床内,在30℃及150rpm下培养。7小时后,将全部混合物转移入100ml SM1培养基(12g K2HPO4/l;3g KH2PO4/l;5g(NH4)2SO4/l;0.3g MgSO4×7H2O/l;0.015g CaCl2×2H2O/l;0.002g FeSO4×7H2O/l;1g Na3柠檬酸×2H2O/l;0.1g NaCl/l;1ml由0.15g Na2MoO4×2H2O/l;2.5gNaBO3/l;0.7g CoCl2×6H2O/l;0.25g CuSO4×5H2O/l;1.6g MnCl2×4H2O/l;0.3g ZnSO4×7H2O/l组成的补充有5g葡萄糖/l的微量元素溶液/l;0.5mg维生素B1/l及15mg四环素/l。随后在30℃及150rpm下培养17小时。
该预培养物(在600nm处的光密度约为3)用于接种含有900ml发酵培养基(15g葡萄糖/l;10g胰蛋白胨/l;5g酵母提取物/l;5g(NH4)2SO4/l;1.5g KH2PO4/l;0.5g NaCl/l;0.3g MgSO4×7H2O/l;0.015g CaCl2×2H2O/l;0.075g FeSO4×7H2O/l;1g Na3柠檬酸×2H2O/l及每升1ml上述微量元素溶液,5mg维生素B1/l及15mg四环素/l,用25%氨水调节pH至7.0)的发酵罐。在发酵期间,温度设定在30℃并通过计量加入25%氨水保持pH为7.0恒定。以1.5体积/体积/分钟的速率,将无菌压缩空气通入培养物中并用搅拌器在转速为200rpm下搅拌。氧饱和度降至50%后,用控制装置将转速提高至1200rpm以保持50%氧饱和度。
两小时后,以3ml/h的速率将30%硫代硫酸钠溶液计量加入。当发酵器的葡萄糖含量由初始的15g/l降至约5-10g/l时,立即将葡萄糖从56%储备液加入。添加葡萄糖的流速为8-14ml/h,试图将葡萄糖浓度保持在约5-10g/l恒定。用YSI(Yellow Springs,俄亥俄州,美国)的葡萄糖分析仪测定葡萄糖。
用Gaitonde试验(Gaitonde,M.K.(1967),Biochem.J.104,627-633)以比色方式监控L-半胱氨酸的产生。在这方面,必须考虑以下事实,该试验不能区分L-半胱氨酸与EP 0885962 A1中所述的L-半胱氨酸及丙酮酸的缩合产物(2-甲基噻唑烷-2,4-二羧酸)。由L-半胱氨酸氧化所形成的难溶的胱氨酸,经溶解于8%盐酸及随后用二硫苏糖醇(DTT)还原后,在pH 8.0的稀溶液内同样被检测为L-半胱氨酸。
表2所示是在EP 0885962 A1中描述的包含基本构建体pACYC184/cysEX-GAPDH-ORF306的微生物发酵的制备过程,与本发明的包含质粒pHC34的微生物的发酵的制备过程及包含含有编码组成型活性cysB基因产物的cysB(T149M)等位基因的相应的构建体的微生物的发酵的制备过程比较。显然,依照本发明,使用野生型cysB基因对生产性能产生正面影响,而组成型等位基因cysB(T149M)则显示负面影响。表2使用本发明的pHC34构建体及使用对照构建体制备L-半胱氨酸
质粒构建体 | pACYC184-cysEX-GAPDH-ORF306 | pHC34 | pHC30 |
基因型 | cysEXorf306 | cysEXcysBorf306 | CysEXcysB(T149M)orf306 |
发酵时间 | L-半胱氨酸收率,g/l | ||
24小时 | 6.3 | 8.0+2.6* | 2.0 |
48小时 | 10.2+7.0* | 10.0+12.6* | 3.4 |
*有星号的值以是以难溶胱氨酸的氧化显示存在的L-半胱氨酸的值。
序列表<110>电化学工业有限公司(国际)(Consortium fuer elektrochemische Industrie GmbH)<120>发酵制备L-半胱氨酸或L-半胱氨酸衍生物的方法<130>Co9905<140><141><160>5<170>PatentIn Vers.2.0<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>1gttacgagat cgaagagg 18<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>2gtcaccgagt ggtcaatg 18<210>3<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于体外诱变的寡核苷酸<400>3ttcgctatcg ccatggaagc gctgcat 27<210>4<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>4ccggaattcc cgttgccgtt tgtggcg 27<210>5<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>5cgcggatccg tgtgaccgat agtcagc 27
Claims (10)
1、适于发酵制备L-半胱氨酸或L-半胱氨酸衍生物,且具有去调节的半胱氨酸代谢的微生物菌株,该半胱氨酸代谢的去调节不基于CysB活性的改变,其特征在于,该菌株另外具有增强的CysB活性,该CysB活性具有野生型CysB典型的调节模式。
2、适于发酵制备L-半胱氨酸或L-半胱氨酸衍生物,且具有去调节的半胱氨酸代谢的微生物菌株,该半胱氨酸代谢的去调节不基于CysB活性的改变,在该微生物菌株内,编码具有野生型CysB典型的调节模式的CysB的同源或异源cysB基因的表达程度增加。
3、如权利要求2所述的微生物菌株,其特征在于其是具有去调节的半胱氨酸代谢的大肠杆菌菌株,且在所述大肠杆菌菌株中,野生型cysB基因超量表达。
4、如权利要求3所述的微生物菌株,其特征在于其是具有去调节的半胱氨酸代谢的大肠杆菌菌株,且在所述大肠杆菌菌株中,大肠杆菌野生型cysB基因的拷贝数增加且该基因超量表达。
5、制备权利要求1至4之一的微生物的方法,其特征在于,在具有去调节的半胱氨酸代谢的微生物菌株内,使用本领域已知的方法增加野生型cysB基因的拷贝数或编码具有野生型CysB典型的调节模式的CysB的cysB基因的拷贝数,或者其特征在于,使用本领域已知的方法产生野生型cysB基因的增加的表达或编码具有野生型CysB典型的调节模式的CysB的cysB基因的增加的表达。
6、制备L-半胱氨酸或L-半胱氨酸衍生物的方法,其特征在于,采用权利要求1至4之一的微生物菌株以本领域已知的方式进行发酵,并自发酵混合物中分离L-半胱氨酸或L-半胱氨酸衍生物。
7、质粒,其特征在于,其具有去调节半胱氨酸代谢的遗传因子,这些遗传因子不导致CysB活性的任何改变,且其还含有在启动子控制下的cysB基因。
8、制备权利要求1至4之一的微生物菌株的方法,其特征在于,将权利要求7的质粒导入微生物菌株内。
9、超量生产代谢物的方法,其特征在于,使来自LysR型转录调节子家族的调节基因在微生物内超量表达,导致在该微生物内代谢物的增加的生产。
10、来自LysR型转录调节子家族的调节基因用于超量生产代谢物的用途。
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