SK4972002A3 - Method for production of l-cysteine or l-cysteine derivatives by fermentation - Google Patents

Method for production of l-cysteine or l-cysteine derivatives by fermentation Download PDF

Info

Publication number
SK4972002A3
SK4972002A3 SK497-2002A SK4972002A SK4972002A3 SK 4972002 A3 SK4972002 A3 SK 4972002A3 SK 4972002 A SK4972002 A SK 4972002A SK 4972002 A3 SK4972002 A3 SK 4972002A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
cysb
cysteine
gene
activity
wild
Prior art date
Application number
SK497-2002A
Other languages
English (en)
Inventor
Thomas Maier
Christoph Winterhalter
Original Assignee
Consortium Elektrochem Ind
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=7925659&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=SK4972002(A3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Consortium Elektrochem Ind filed Critical Consortium Elektrochem Ind
Publication of SK4972002A3 publication Critical patent/SK4972002A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/12—Methionine; Cysteine; Cystine

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Description

SPÔSOB VÝROBY L-CYSTEÍNU ALEBO DERIVÁTOV L-CYSTEÍNU
Oblasť vynálezu
Vynález sa týka spôsobu výroby L-cysteínu alebo derivátov L-cysteínu fermentáciou pomocou mikroorganizmov, ako aj vhodných mikroorganizmov pre tento spôsob.
Doterajší stav techniky
Aminokyselina L-cysteín má hospodársky význam. Používa sa napríklad ako prísada do potravín (obzvlášť pri výrobe pekárskych prípravkov), ako vsádzková surovina v kozmetike, taktiež ako východiskový produkt pri výrobe farmakologicky účinných látok (najmä N-acetyl-cysteínu a S-karboxy-metylcysteínu).
Deriváty L-cysteínu sú všetky síru obsahujúce metabolity, ktoré sú pri ich syntéze odvodené od cysteínu, teda napríklad cystín, metionín, glutatión, biotín, tiazolidín, tiamín, kyselina liponová a koenzým A.
Regulácia biosyntézy cysteínu v baktériách sa uskutočňuje na dvoch úrovniach, (obr. 1):
1. Na úrovni enzýmovej aktivity podlieha serín-acetyl-transferáza (cysEgénový produkt) inhibícii konečným produktom L-cysteínom. Toto znamená, že akumulácia L-cysteínu vedie priamo k inhibícii prvej špecifickej reakcie biosyntézy cysteínu čo zamedzí ďalšej syntéze.
2. Na úrovni transkripcie pôsobí regulačný protein CysB (kódovaný cysBgénom) ako transkripčný aktivátor a stará sa o regulovanú prípravu (aktiváciu) redukovanej síry. Ako induktor potrebuje CysB N-acetyl-serín, ktorý v bunke vzniká z O-acetyl-serínu, ak je k dispozícii nedostatočne redukovaná síra pre reakciu O-acetyl-serín-sulfhydrylázy. Následne sú všetky gény, ktoré súvisia s prijatím, redukciou a zabudovaním síry, pod kontrolou CysB. Toto sú operóny: cysPTWAM, cysDNC, cysJIH, a cysK-gén. Zatiaľ čo acetyl-serín pôsobí pre
31917/T h cysB ako induktor, vykazuje sulfid a tiosíran negatívny efekt ako takzvaný „antiinduktoľ, pretože jeho existencia poukazuje na disponibilnosť SH-skupín.
Stav techniky týkajúci sa získavania L-cysteínu a derivátov L-cysteínu sa obšírne diskutuje vo WO 97/15673 (zodpovedá US prihláške SN 09/065104). WO 97/15673 samotná opisuje fermentačný výrobný postup, pri ktorom sa využíva spätnoväzbová (feedback) rezistencia serín-acetyl-transferázy. Prihláška ďalej objasňuje, že je možné ďalšie zvyšovanie výťažkov cysteínu dodatočnou dereguláciou regulačného proteínu CysB na génovej úrovni v zmysle konštitutívnej expresie.
Patentová prihláška EP 885962 A1 (zodpovedá US prihláške SN 09/097759) zverejňuje mikroorganizmy, ktoré sú vhodné na fermentačnú výrobu L-cysteínu, L-cystínu, N-acetyl-serínu a derivátov tiazolidínu, charakteristické tým, že preexprimujú aspoň jeden gén, kódujúci proteín vhodný priamo na produkciu antibiotík alebo iných pre mikroorganizmy toxických látok z bunky.
CysB patrí do skupiny LysR-Typ-transkripčných regulátorov (LTTR), z ktorých je známych už viac ako 100 zástupcov (Schell M. A., 1993, Annu. Rev. Microbiol. 47: 597-626). Vyznačujú sa N-terminálnou DNA-väzbovou doménou s helix-turn-helix-motívom a C-terminálnou induktor-väzbovou doménou. O cysB boli predložené podrobné DNA-väzbové štúdie. K tomu je CysB prvý LTTR proteín, u ktorého je k dispozícii aj kryštálová štruktúra (Tyrell et al., 1997, Structure 5: 1017-1032). LTTR proteíny pôsobia spravidla ako pozitívne génové regulátory, ktoré sú závislé od existencie induktorovej molekuly. Už skôr sa zistilo, že len vysoko aktívne cysB-varianty, ktoré sú nezávislé od efektorových molekúl (takzvané konštitutívne aktívne varianty), pripúšťajú zvýšenie produkcie cysteínu, pretože takéto formy sa nemenia, vysoká génová aktivácia odpadá. (Nakamori S. et. al., 1998, Appl. Env. Microbiol. 64: 16071611).
Príklady pre konštitutívne aktívne formy CysB sú opísané pre Salmonella typhimuríum. Tieto varianty vykazujú vysokú aktivitu, pričom táto aktivita je
31917/T h úplne nezávislá od induktora N-acetyl-serinu a negatívneho účinku tiosíranu a sulfidu. (ColyerT. E., Kredich N. M., 1994, Mol. Microbiol. 13: 797-805).
Podstata vynálezu
Predložený vynález sa týka kmeňa mikroorganizmu, ktorý je vhodný na fermentačnú výrobu L-cysteínu a derivátov L-cysteínu a má deregulovanú cysteínovú látkovú výmenu, pričom táto deregulácia cysteínovej látkovej výmeny nespočíva na zmenenej cysB-aktivite, ale je charakteristická tým, že má dodatočne zvýšenú cysB-aktivitu, pričom táto cysB-aktivita je regulačným modelom typickým pre divoký typ cysB.
Kmene mikroorganizmov s deregulovanou cysteínovou látkovou výmenou, pri ktorej táto deregulácia nespočíva na zmenenej cysB-aktivite sú známe. Ide o kmene s modifikovanými cysE-alelami ako sú opísané napríklad vo WO 97/15673 (tu zahrnutá ako odkaz) alebo Nakamori S. et. al., 1998, Appl. Env. Microbiol. 64: 1607-1611 (tu zahrnutá ako odkaz), alebo o kmene, pri ktorých sa použijú eflux-gény, ako sú opísané napríklad v EP 0885962 A1 (zodpovedá US prihláške SN 09/097759, tu zahrnutá ako odkaz), alebo o kmene ktoré sa získavajú s použitím nešpecifických metód mutagenézy kombinovaných so skríningovými metódami pre nadprodukciu cysteinu alebo znížené odbúravanie cysteinu, ako je opísané napríklad vo WO 97/15673 alebo v Nakamori S. et. al., 1998, Appl. Env. Microbiol. 64: 1607-1611.
V zmysle vynálezu ide o zvýšenú aktivitu, ak aktivita cysB je najmenej o 10 % zvýšená v porovnaní k cysB aktivite u kmeňa divokého typu.
Výhodné je, ak je cysB aktivita zvýšená o najmenej 25 %.
Mimoriadne výhodné je ak je cysB aktivita zvýšená o najmenej 50 %.
Kmeň Escherichia coli (MC4100: :λΚΖΙ_300), ktorý je vhodný na určenie cysB-aktivity, je opísaný v príklade 2. Bol uložený 23.6.1999 pod číslom DSM 12886 v DSMZ (Deutsche Sammlung fúr Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, D-38142 Braunschweig), podľa Budapeštianskej dohody. Terajší cysB31917/T h obsahujúci konštrukt bol do kmeňa vnesený MC4100: :XKZL300 známym spôsobom.
Regulačný model cysB-aktivity typický pre divoký typ cysB, závisí od zdroja síry, pričom cysB-aktivita buniek vyrastených s tiosíranom oproti bunkám vyrasteným so síranom predstavuje menej ako 75 % a cysB-aktivita buniek vyrastených s cystínom oproti bunkám vyrasteným so síranom predstavuje menej ako 20 % (pozri príklad 2).
Kmene mikroorganizmov podľa vynálezu secernujú L-cysteín alebo derivát L-cysteínu v porovnaní ku kmeňu mikroorganizmu s deregulovanou cysteínovou látkovou výmenou bez zvýšenej cysB-aktivity vo zvýšenej miere.
Kmeň mikroorganizmu podľa vynálezu je podľa toho kmeň mikroorganizmu s deregulovanou cysteínovou látkovou výmenou, pričom deregulácia cysteínovej látkovej výmeny nespočíva v zmenenej cysB-aktivite, ale v ktorom sa homológny alebo heterológny cysB-gén zosilnené exprimuje a ten kóduje cysB regulačným modelom typickým pre divoký typ cysB.
Výhodne ide o kmene Escherichia coli s deregulovanou cysteínovou výmenou nespočívajúcou na zmenenej cysB-aktivite, v ktorom sa divoký typ cysB-génu preexprimuje.
Obzvlášť výhodne ide o kmene Escherichia coli s deregulovanou cysteínovou výmenou, pričom táto deregulácia cysteínovej latkovej výmeny nespočíva na zmenenej cysB-aktivite, v ktorom počet kópií divokého typu cysBgénov Escherichia coli\e zvýšený a tento gén sa preexprimuje.
Prekvapivo sa zistilo, že nie ako je v uvedenom stave techniky postulované, použitie cysB-alel, ktoré kódujú konštitutívne aktívne cysB regulačné proteíny, zvyšuje produkciu cysteínu, ale úplne opačne, produkciu cysteínu zvyšuje zosilnená expresia divokého typu cysB-génu.
Toto zistenie je tiež prekvapivé a nečakané preto, že doposiaľ nie je známy príklad, v ktorom by zvýšená expresia regulačného proteínu zo skupiny
LysR-Typ-transkripčných regulátorov umožnila nadprodukciu metabolitov.
31917/T h
Vynález sa týka tiež použitia regulačných proteínov z rodiny LysR-Typtranskripčných regulátorov k nadprodukcii metabolitu, ako aj spôsobu nadprodukcie metabolitu, ktorý je charakteristický tým, že regulačný gén z rodiny LysR-Typ-transkripčných regulátorov sa v mikroorganizme preexprimuje a spôsobí zosilnenú produkciu metabolitu v mikroorganizme.
Zvýšenie cysB-aktivity v mikroorganizme pri súčasnom prijatí typického regulačného modelu sa môže dosiahnuť napríklad:
1. zvýšením počtu kópií cysB-génu, kódujúceho cysB regulačným modelom typickým pre divoký typ cysB, v mikroorganizme pod kontrolou promótora, alebo
2. zosilnenou expresiou cysB-génu, kódujúceho cysB regulačným modelom typickým pre divoký typ cysB, výmenou promótora regulujúceho expresiu divokého typu cysB-génu za silnejší promótor.
CysB-gény sú známe z Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Klebsiella aerogenes, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa a Thiocapsa roseopersicina. Ako cysB-gény sú výhodne chápané také gény, ktorých génové produkty s cysB-proteínom z Escherichia coli vykazujú identitu najmenej 40 %. Hodnoty homológie sa vzťahujú na výsledky, ktoré sa dajú získať počítačovým programom „Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin“. Pritom sa uskutočňuje vyhľadávanie v banke dát s podprogramom „blast“ s použitím štandardných parametrov.
CysB-gény sú ďalej také alely divokého typu cysB-génov, ktorých génové produkty sú vo svojej sekvencií zmenené, bez toho, aby stratili pre divoký CysB-typ typický regulačný model. Príkladom sú cysB varianty s konzervatívnou aminokyselinovou výmenou.
Mikroorganizmus podľa vynálezu sa dá vyrobiť napríklad takým spôsobom, že v kmeni mikroorganizmu s deregulovanou cysteínovou látkovou výmenou, pričom táto deregulácia cysteínovej látkovej výmeny nespočíva na zmenenej cysB-aktivite, sa pomocou známych metód zvyšuje počet kópií cysB
31917/T h génov divokého typu alebo cysB-génov kódujúcich cysB regulačným modelom typickým pre divoký typ cysB-génov, alebo sa známymi metódami dosiahne zosilnená expresia cysB-génu divokého typu alebo cysB-génu kódujúceho cysB regulačným modelom typickým pre cysB divoký typ.
V nasledujúcom znamená výraz „cysB'·, nielen „divoký typ cysB“, ale aj „cysB variant s regulačným modelom typickým pre divoký typ cysB. Výraz „cysB-gén“ znamená v nasledujúcom „divoký typ cysB génu“ ako aj „ cysB-gén, kódujúci cysB regulačným modelom typickým pre divoký typ cysB“.
Zvýšenie počtu kópií cysB-génov v mikroorganizme sa môže vykonávať metódami odborníkom v odbore známymi. Tak sa môže napríklad klonovať cysB-gén v plazmidových vektoroch s viacnásobným počtom kópií na bunku (napr. pUC19, pBR322, pA-CYC184) a vnesie sa do mikroorganizmu s deregulovanou cysteínovou výmenou. Alternatívne sa môže cysB-gén viackrát integrovať v chromozóme mikroorganizmu s deregulovanou cysteínovou látkovou výmenou. Ako integračné postupy sa môžu využiť známe systémy s miernymi bakteriofágmi, integratívnymi plazmidmi alebo integrácia cez homológnu rekombináciu. (Napríklad Hamilton et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 4617- 4622).
Výhodné je zvýšenie počtu kópií klonovaním cysB-génu v plazmidovom vektore kontrolované promótorom. Obzvlášť výhodné je zvýšenie počtu kópií klonovaním cysB-génu v pACYC-deriváte, ako napr. pACYC184-LH (uložený podľa Budapeštianskej dohody v nemeckej zbierke mikroorganizmov a bunkových kultúr, Braunschweig, 18.8.1995 pod číslom DSM 10172.
Ako kontrolná oblasť pre expresiu plazmidu kódujúceho cysB-gén môže slúžiť prírodná promótorova a operačná oblasť génu.
Zosilnená expresia cysB-génu sa môže uskutočniť tiež prostredníctvom iných promótorov. Zodpovedajúce promótorové systémy sú odborníkom v odbore známe (Makrides S. C., 1996, Microbiol. Rev. 60: 512-538). Takéto konštrukty je možné použiť známym spôsobom v plazmidoch alebo chromozomálne.
31917/T h
Klonovanie cysB-génu v plazmidovom vektore sa uskutočňuje napríklad špecifickou amplifikáciou pomocou polymerázovej reťazovej reakcie s použitím špecifických primérov, ktoré zachytávajú kompletný cysB-gén s promótorovou a operačnou sekvenciou a následnou ligáciou vektora s DNA fragmentárni.
Ako výhodné vektory pre klonovanie cysB-génu sa použijú plazmidy, ktoré už obsahujú genetické prvky pre dereguláciu cysteínovej látkovej výmeny, napríklad cysEX-gén (WO 97/15673) a eflux-gén (EP 0885962 A1). Takéto vektory umožňujú produkciu kmeňa mikroorganizmu podľa vynálezu z ľubovoľného kmeňa mikroorganizmu, pretože takýto vektor tiež spôsobí dereguláciu cysteínovej látkovej výmeny v mikroorganizme.
Vynález sa týka tiež plazmidu, ktorý má genetické prvky na dereguláciu cysteínovej látkovej výmeny, pričom tieto genetické prvky nevykazujú žiadnu zmenu cysB-aktivity a ďalej obsahuje cysB-gén kontrolovaný promótorom.
Bežnou transformačnou metódou (napríklad elektroporáciou) sa plazmidy obsahujúce cysB prenesú do baktérií a napríklad prostredníctvom rezistencie na antibiotiká sa selektujú na klone nesúcom plazmid.
Vynález sa týka i postupu výroby kmeňa mikroorganizmu, ktorý je charakteristický tým, že do kmeňa mikroorganizmu sa vnesie plazmid podľa vynálezu.
Výroba cysteínu alebo cysteínových derivátov pomocou kmeňa mikroorganizmu podľa vynálezu sa uskutočňuje vo fermentore známymi spôsobmi. Ako zdroj uhlíka sa môžu použiť napríklad glukóza, laktóza alebo iné cukry, ako zdroj dusíka amónium alebo hydrolyzát proteínu. Ako zdroj síry sa môže použiť napríklad sulfid, siričitan, síran alebo tiosíran. Počas fermentácie vytvorený L-cysteín môže oxidovať ťažko rozpustný cystín alebo kondenzovať s aldehydmi alebo ketónmi na tiazolidíny (napríklad s kyselinou pyrohroznovou na kyselinu 2-metyl-tiazolidín-2,4-dikarboxylovú).
Vynález sa týka i postupu výroby L-cysteínu alebo derivátov L-cysteínu, ktorý je charakteristický tým, že kmeň mikroorganizmu podľa vynálezu sa
31917/T h známym spôsobom vsádza do fermentora a L-cysteín alebo jeho deriváty sa z fermentačnej vsádzky oddelia.
Nasledujúce príklady slúžia ďalšiemu objasneniu vynálezu.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Klonovanie divokého typu cysB-génu a cysB(T149M)-alely
Divoký typ cysB-génu z Escherichia coli sa klonuje s použitím polymerázovej reťazovej reakcie (PCR). So špecifickými oligonukleotidovými primérmi (20 pmol na vsádzku) cysBPI (SEQ.ID.NO. 1) a cysBP2 (SEQ.ID.NO: 2) sa amplifikuje genómový DNA-fragment dlhý 3107 párov báz, zahrňujúci divoký typ cysB-génu s korigovanými oblasťami a terminálne EcoRI- prípadne Sall-reštrikčné štiepne miesta.
5'-GTT ACG AGA TCG AAG AGG-3' (fosforotioátová väzba na 3'-konci) (SEQ.ID.NO: 1)
5'-GTC ACC GAG TGG TCA ATG-3' (fosforotioátová väzba na 3'-konci) (SEQ.ID.NO: 2)
Uskutočnila sa polymerázová reťazová reakcia s Pwo-DNA-polymerázou firmy Boehringer (Mannheim, D) s 10 ng genómovej DNA ako matricou. Program zahrňoval 29 cyklov s anelingovou teplotou 56 °C (30 sekúnd na cyklus), extenznou teplotou 72 °C (60 sekúnd na cyklus) a denaturačnou teplotou 94 °C (30 sekúnd na cyklus). DNA-fragment sa reštrikčným enzýmom EcoRI a Sali dodatočne upravil a vyčistil gélovou elektroforézou a génovou čistiacou metódou (Genclean Kit BIO101, P.O.Box 2284, La Jolla, Califirnia, USA, 92038-2284). Tento fragment sa liguje v EcoRI-Sall-štiepenom a
31917/T h fosfatázou upravenom fagemid-vektore pTZ19U firmy Bio-Rad Laboratories (Hercules, California, USA). Po transformácii sa pozitívne klony identifikujú reštrikčnou analýzou.
Na konštrukciu konštitutívne aktívnej cysB-alely sa uskutočnila mutácia (analogická k mutácii v divokom type cysB-génu zo Salmonella typhimuríum opísanej u Colyer T. E., Kredich N. M., 1994, Mol. Microbiol. 13: 797-805) kodónu 147 divokého typu cysB-génu ku kodónu metionínu s „Mutagene In Vitro Mutagenezis“ - kit firmy Bio-Rad Laboratories (Hercules, California, USA). Pritom sa použil oligonukleotid CysBMut4 (SEQ.ID.NO.3). Podčiarknuté bázy poukazujú na odchýlku od sekvencie divokého typu.
5'-TTC GCT ATC GCC ATG GAA GCG CTG CAT-3'(SEQ.ID.NO: 3)
Na test aktivity (pozri príklad 2) sa klonovali obidve cysB-alely ako EcoRI-Sall-fragmenty podľa Klenowovej úpravy.v Ec/136ll štiepenom vektore pA-CYC184-LH upravenom fosfatázou.
Príklad 2
Stanovenie cysB-aktivity in vivo
Na meranie cysB-aktivity sa zvolila vsádzka reportérových génov. Tu sa fúzovala kontrolná oblasť cysK-génu s lacZ-génom, ktorý kóduje enzým βgalaktozidázu. Integráciou tejto fúzie v kmeni bez endogénnej β-galaktozidázy sa vytvoril tento enzým v závislosti od cysB-aktivity a sprostredkoval tak vo forme aktivity β-galaktozidázy nepriamo zmeranie cysB-aktivity. Na konštrukciu fúzie sa použil systém opísaný Simons et al. (Simons R. W. et al., 1987, Gene 53: 85-96). Najprv sa amplifikovala polymerázovou reťazovou reakciou promótorova oblasť cysK-génu vrátane prvých pätnásť kodónov s použitím oligonukleotidových primérov cysKPI (SEQ.ID.NO: 4) a cysKP3 (SEQ.ID.NO: 5) a 10 ng chromozomálnej DNA z Escheríchia coli a Pwo-polymerázy.
319170 h
5'-CCG GAA TTC CCG TTG CCG TTT GTG GCG-3' (SEQ.ID.NO: 4) 5'-CGC GGA TCC GTG TGA CCG ATA GTC AGC-3' (SEQ.ID.NO: 5)
Podmienky zodpovedali tým, ktoré boli opísané v príklade 1. Výsledný produkt s 317 pármi báz sa štiepil reštrikčným enzýmom EcoRI a BamHI podľa údajov výrobcu a vyčistil sa pomocou preparatívnej gélovej elektroforézy a génovej čistiacej metódy. Napokon sa produkt taktiež EcoRI-BamHI štiepeným a fosfatázou upraveným vektorom pRS552 (uložený 14.9.1999 podľa Budapeštianskej dohody v nemeckej zbierke mikroorganizmov a bunkových kultúr, Braunschweig pod číslom DSM 13034) ligoval. Pomocou elektroporácie sa kmeň MC4100 (ATCC 35695) s ligačnou vsádzkou transformoval a pozitívne klony sa identifikovali reštrikčnou analýzou. Tieto obsahujú translačnú cysKlacZ-fúziu. Získaný plazmid sa následne rekombinoval podľa Simons et al. s bakteriofágom XRS45 (uložený podľa Budapeštianskej dohody v nemeckej zbierke mikroorganizmov a bunkových kultúr, v Braunschweigu 14.9.1999 pod číslom DSM 13035) a vyrobil sa homogénny lyzát rekombinantného fágu s označením λΚΖΙ_300. S týmto fágom sa infikoval Alac-kmeň MC4100 a kanamycínovou selekciou sa identifikoval lyzogénny kloň, (MC4100: :λΚΖΙ_300), ktorý sa teraz mohol použiť na meranie cysB aktivity.
Na porovnanie účinnosti viacnásobnej kópie cysB-génu klonovanom v pACYC184-LH a cysB(T149M)-génu sa transformoval MC4100: :λΚΖΙ_300 so zodpovedajúcim plazmidom pACYC-cysB a pACYC-cysB(T149M).
Kmene sa vo VB-minimálnom médiu (3,5 g/l Na(NH4)HPO4; 10 g/l KH2PO4; 2 g/l citrát x H2O ; 0,078 g/l MgCI2; pH sa nastavilo na 6,5 s NaOH, 5 g/l glukózy; 5 mg/l vitamínu Bi) s rozličnými zdrojmi síry (vždy 1 mM síry) kultivovali, pričom sa pridalo 15 mg/l tetracyklínu. Určenie β-galaktozidázovej aktivity sa uskutočnilo podľa metódy opísanej Millerom (Miller J. H. 1972, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbour, New York, 352-355).
31917/T h
Výsledky sú uvedené na tabuľke 1. Pri kontrole sa ukázalo, (MC4100: :XKZL300/pACYC184-LH) pre cysB-divoký kmeň typický model regulácie cysBaktivity v závislosti od zdroja síry: cysB-aktivita buniek vyrastených s tiosíranom oproti síranu predstavovala menej ako 75 % a cysB aktivita buniek vyrastených s cystínom oproti síranu predstavovala menej ako 20 %. Tento model sa zachová pri existencii divokého typu cysB-génu vo viacerých kópiách na celkovo zvýšenej úrovni aktivity (podľa vynálezu napríklad MC4100: :λΚΖΙ_300 / pACYC-cysB). CysB(T149M)-alela vedie oproti tomu ku konštitutívne vysokej aktivite pri strate typického modelu regulácie.
Tabuľka 1 - Stanovenie cysB-aktivity vo forme β-galaktozidázovej aktivity kmeňov s chromozomálnou cysK-lacZ-fúziou
Kmeň MC4100: :λΚΖΙ_300 MC4100: :λΚΖ1_300 MC4100: :λΚΖ1_300
plazmid PACYC184-LH pACYC-cysB pACYC-cysB(T149M)
genotyp cysB jedna kópia cysB viac kópií cysB(T149M) viac kópií
zdroj-síry: β-galaktozidázová aktivita v Millerových jednotkách
cystín 26 341 3791
síran 1906 2708 3824
tiosíran 726 1094 3595
Príklad 3
Konštrukcia plazmidu podľa vynálezu
Organizmy podľa vynálezu sú charakteristické deregulovanou cysteínovou látkovou výmenou a napríklad cysB-génom vo viacnásobnom počte kópií. Na produkciu takýchto mikroorganizmov sa zvolil plazmid (pACYC184-cysEX-GAPDH-ORF306) ako základný konštrukt. Tento plazmid obsahoval prvky cysE-alely rezistentnej na spätnú väzbu a eflux-gén na dereguláciu cysteínovej látkovej výmeny. Podrobne je opísaný v patentovej
31917/T h prihláške EP 0885962 A1 (príklad 2D). V tomto konštrukte štiepenom reštrikčným enzýmom SnaBI, ako aj upravenom fosfatázou, sa medzi cysEXalelu a eflux-gén inzeroval cysB-fragment. Posledný sa získal reštrikciou s enzýmom EcoRI a BstXI a následným pripájaním zarovnaných DNA-koncov s Klenowovým enzýmom z plazmidu pTZ19U-cysB. Plazmid má označenie pHC34.
Transformáciou kmeňa W3110 Escheríchia coli (ATCC 27325; Bachmann B. J., 1996, In: Neidhardt F. C: (ed.) Escheríchia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology, American Society for Microbiology, Washington D.C., kap. 133) vznikol organizmus podľa vynálezu. Transformácia sa vykonala pomocou elektroporácie. Pritom sa zmiešala hustá suspenzia buniek v ľadovom 10 %-nom roztoku glycerínu s 0,1 pg plazmidu DNA a pri 2500 V, 200 Ohm a 12,5 pF sa vystavila elektrickému impulzu. Po transfere vsádzky do sterilného LB-média (1 % tryptónu, 0,5 % kvasnicového extraktu, 1 % NaCl) a inkubácii pri 30 °C počas 1 hodiny sa selektovali plazmid nesúce klony na LB-agarových platniach s 15 pg/ml tetracyklínu.
Na porovnanie účinnosti divokého typu cysB-génu oproti konštitutívnej cysB(T149M)-alele sa vytvoril analogický konštrukt (pHC30) a rovnako sa vniesol do kmeňa W3100. Na ďalšie použitie slúžil v EP 885962 A1 opísaný organizmus W3110, transformovaný s plazmidom pA-CYC184/cysEX-GAPDHorf306, ako základný konštrukt na porovnanie a súčasne na vymedzenie voči stavu techniky.
Pretože u W3110 ide o divoký typ kmeňa, vzťahujú sa všetky cysteínové produkčné efekty na plazmidom kódovaný gén.
Príklad 4
Produkcia cysteínu mikroorganizmami podľa vynálezu
Na dôkaz produkcie cysteínu sa kultivovali v príklade 3 opísané mikroorganizmy vo fermentoroch fed-batch spôsobom s kontinuálnym
31917/T h pridávaním glukózy a tiosíranu. Ako zariadenie sa použil prístroj Biostat M firmy Braun Biotech (Melsungen, D) s maximálnym objemom kultúry 2 I.
Ako štartovacia kultúra sa naočkovalo 20 ml LB-média (10 g/l tryptónu, 5 g/l kvasnicového extraktu, 10 g/l NaCl), ktoré navyše obsahovalo 15 mg/l tetracyklínu a inkubovalo sa na trepačke pri 30 °C a 150 rpm. Po siedmich hodinách sa celková vsádzka previedla do 100 ml SM1-média (12 g/l K2HPO4; 3 g/l KH2PO4; 5 g/l (NH4)2SO4; 0,3 g/l MgSO4 x 7 H2O; 0,015 g/l CaCI2 x 2 H2O; 0,002 g/l FeSO4 x 7 H2O; 1 g/l Nascitrát x 2 H2O; 0,1 g/l NaCl; 1 ml/l roztoku stopových prvkov pozostávajúceho z 0,15 g/l Na2MoO4 x 2 H2O; 2,5 g/l NaBO3; 0,7 g/l C0CI2 x 6 H2O; 0,25 g/l CuSO4 x 5 H2O; 1,6 g/l MnCI2 x 4 H2O; 0,3 g/l ZnSO4 x 7 H2O), ktoré sa suplementovalo s 5 g/l glukózy; 0,5 mg/l vitamínu Bi a 15 mg/l tetracyklínu. Ďalšia inkubácia sa uskutočnila pri 30 °C počas 17 hodín pri 150 rpm.
S touto štartovacou kultúrou (optická hustota pri 600 nm cca 3) sa naočkoval fermentor s 900 ml fermentačného média (15 g/l glukózy, 10 g/l tryptónu, 5 g/l kvasnicového extraktu, 5 g/l (NH4)2SO4; 1,5 g/l KH2PO4; 0,5 g/l NaCl; 0,3 g/l MgSO4 x 7 H2O; 0,015 g/l CaCI2 x 2 H2O; 0,075 g/l FeSO4 x 7 H2O; 1 g/l Nascitrát x 2 H2O; a 1 ml/l roztoku stopových prvkov ako bol uvedený vyššie, 5 mg/l vitamínu Βί a 15 mg/l tetracyklínu, nastavené na pH 7,0 s 25 %ným amoniakom).
Počas fermentácie sa nastavila teplota 30 °C a pH hodnota sa udržiavala konštantná na hodnote 7,0, pridávaním 25 %-ného amoniaku. Kultúra sa zavzdušnila sterilizovaným stlačeným vzduchom pri 1,5 obj/obj/min a miešala sa v miešadle s počtom otáčok 200 rpm. Po poklese nasýtenia kyslíkom na hodnotu 50 % sa zvýšil počet otáčok kontrolného pristroja až na hodnotu 1200 rpm, aby sa udržalo nasýtenie kyslíkom na hodnote 50 %.
Po dvoch hodinách sa pridal 30 %-ný roztok tiosíranu sodného pri dávkovaní 3 ml/hod. Glukóza sa pridávala z 56 %-ného zásobného roztoku, kým obsah vo fermentore, ktorý bol spočiatku 15 g/l, klesol na 5-10g/l. Pridávanie glukózy sa vykonávalo pri prietoku 8-14 ml/hod, pričom sa pri pokuse dodržiavala konštantná koncentrácia 5-10g/l. Stanovenie glukózy sa
31917/T h uskutočnilo glukózovým analyzátorom firmy YSI (Yellow Springs, Ohio, USA).
Produkcia L-cysteinu sa sledovala kolorimetricky testom podľa Gaitonde (Gaitonde, M. K. 1967, Biochem. J. 104, 627-633). Pri tom treba brať do úvahy, že, test nerozlišuje medzi L-cysteínom a v EP 0885962 A1 opísaným kondenzačným produktom L-cysteínu a pyruvátu (kyselina 2-metyltiazolidín-2,4dikarboxylová). Ťažko rozpustný cystín ktorý vzniká oxidáciou z L-cysteínu, sa po rozpustení v 8 %-nej kyseline chlorovodíkovej a následnej redukcii s ditiotreitolom (DTT) v zriedenom roztoku pri pH 8,0 dokázal rovnako ako Lcysteín.
Tabuľka 2 znázorňuje priebeh produkcie pri fermentácii organizmami so základným konštruktom pA-CYC184/cysEX-GAPDH-orf306 opísanom v EP 0885962 A1 v porovnaní s plazmidom pHC34 podľa vynálezu a zodpovedajúcim konštruktom s cysB(T149M)alelou, ktorý kóduje konštitutívne aktívny cysB-génový produkt. Je zrejmé, že vsádzka divokého typu cysB-génov podľa vynálezu má pozitívny vplyv na produkčný výkon, zatiaľ čo konštitutívna alela cysB(T149M) má negatívny účinok.
Tabuľka 2 - Produkcia L-cysteínu s konštruktom pHC34 podľa vynálezu resp. kontrolným konštruktom
plazmidový konštrukt pA-CYC184/cysEX- GAPDH-ORF306 pHC34 pHC30
genotyp cysEX orf306 cysEX cysB orf306 cysEX cysB(T149M) orf306
ferment. čas výťažok L-cysteínu v g/l
24 hod 6,3 8,0+ 2,6* 2,0
48 hod 10,2 + 7,0* 10,0+12,6* 3,4
* hviezdičkou označené údaje znamenajú L-cysteín, ktorý sa predkladá v oxidovanej forme ako ťažko rozpustný cystín
31917/T h
SEKVENČNÝ PROTOKOL <110> Consortium fuer elektrochemische Industrie GmbH <120> Spôsob výroby L-cysteínu alebo derivátov L-cysteinu <130> Co9905 <140>
<141>
<160> 5 <170> Patentln Verš. 2.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Primér pre PCR <400> 1 gttacgagat cgaagagg
<210> 2 <211> 18
<212> DNA
31917/T h <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Primér pre PCR <400> 2 gtcaccgagt ggtcaatg 18 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Oligonukleotid pre in vitro mutagenézu <400> 3 ttcgctatcg ccatggaagc gctgcat 27 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Primér pre PCR <400> 4 ccggaattcc cgttgccgtt tgtggcg 27
31917/T h <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Primér pre PCR <400> 5 cgcggatccg tgtgaccgat agtcagc 27
31917/T h

Claims (8)

1. Kmeň mikroorganizmu, ktorý je vhodný na fermentačnú výrobu Lcysteínu alebo jeho derivátov a má deregulovanú cysteínovou látkovú výmenu, pričom táto deregulácia cysteínovej látkovej výmeny nespočíva na zmenenej cysB-aktivite, vyznačujúci sa tým, že navyše má zvýšenú cysB aktivitu, pričom cysB-aktivita je regulačným modelom typickým pre divoký typ cysB.
2. Kmeň mikroorganizmu, ktorý je vhodný na fermentačnú výrobu Lcysteínu alebo jeho derivátov a má deregulovanú cysteínovou látkovú výmenu, pričom táto deregulácia cysteínovej látkovej výmeny nespočíva na zmenenej cysB-aktivite, v ktorom sa homológne alebo heterológne cysB-gény zosilnené exprimujú a tie kódujú cysB regulačným modelom typickým pre divoký typ cysB.
3. Kmeň mikroorganizmu podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že ide o kmeň Escherichia coli s deregulovanou látkovou výmenou cysteínu, v ktorom je preexprimovaný cysB-gén.
4. Kmeň mikroorganizmu podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že ide o kmeň Escherichia coli s deregulovanou látkovou výmenou cysteínu, v ktorom počet kópií divokého cysB-génu z Escherichia coli je zvýšený a tento gén je preexprimovaný.
5. Spôsob výroby mikroorganizmu podľa niektorého z nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že v kmeni mikroorganizmu s deregulovanou cysteínovou látkovou výmenou sa prostredníctvom známych metód zvýši počet kópií divokého typu cysB-génu alebo cysB-génu kódujúceho cysB regulačným modelom typickým pre divoký typ cysB-génu alebo sa známymi metódami
31917/T h ·· • · · • · ·· · • · · • · · • · • · • · dosiahne zosilnená expresia divokého typu cysB-génu alebo cysB-génu kódujúceho cysB regulačným modelom typickým pre divoký typ cysB-génu.
6. Spôsob výroby L-cysteínu alebo jeho derivátov, vyznačujúci sa tým, že sa mikroorganizmus podľa niektorého z nárokov 1 až 4 známym spôsobom použije vo fermentácii a L-cysteín alebo derivát L-cysteínu sa z fermentačnej vsádzky oddelí.
7. Plazmid, vyznačujúci sa tým, že má genetické prvky na dereguláciu cysteínovej látkovej výmeny, pričom tieto genetické prvky nespôsobujú zmenu cysB-aktivity, a obsahuje aj cysB-gén kontrolovaný promótorom.
8. Spôsob výroby kmeňa mikroorganizmu podľa niektorého z nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že do mikroorganizmu sa vnesie plazmid podľa nároku 7.
SK497-2002A 1999-10-14 2000-10-05 Method for production of l-cysteine or l-cysteine derivatives by fermentation SK4972002A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19949579A DE19949579C1 (de) 1999-10-14 1999-10-14 Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Cystein oder L-Cystein-Derivaten
PCT/EP2000/009720 WO2001027307A1 (de) 1999-10-14 2000-10-05 Verfahren zur fermentativen herstellung von l-cystein oder l-cystein-derivaten

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK4972002A3 true SK4972002A3 (en) 2002-09-10

Family

ID=7925659

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK497-2002A SK4972002A3 (en) 1999-10-14 2000-10-05 Method for production of l-cysteine or l-cysteine derivatives by fermentation

Country Status (11)

Country Link
EP (1) EP1220940B2 (sk)
JP (1) JP2003511086A (sk)
KR (1) KR100505336B1 (sk)
CN (1) CN1262646C (sk)
AT (1) ATE231918T1 (sk)
CA (1) CA2386539C (sk)
DE (2) DE19949579C1 (sk)
DK (1) DK1220940T3 (sk)
SK (1) SK4972002A3 (sk)
TW (1) TWI249575B (sk)
WO (1) WO2001027307A1 (sk)

Families Citing this family (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10046934A1 (de) * 2000-09-21 2002-04-18 Consortium Elektrochem Ind Verfahren zur fermentativen Herstellung von nicht-proteinogenen L-Aminosäuren
ES2313555T3 (es) * 2001-07-11 2009-03-01 Evonik Degussa Gmbh Proceso para la preparacion de l-treonina que utiliza cepas de la familia enterobacteriaceas.
DE10237479A1 (de) * 2002-08-16 2004-02-26 Degussa Ag Schwefel-haltiges Tierfuttermitteladditiv
US7348037B2 (en) 2002-08-16 2008-03-25 Evonik Degussa Gmbh Sulfur-containing animal-feed additives
US20060270013A1 (en) 2003-02-18 2006-11-30 Michel Chateau Method for the production of evolved microorganisms which permit the generation or modification of metabolic pathways
WO2004113373A1 (en) * 2003-06-21 2004-12-29 University Of Sheffield Overexpression of the cyddc transporter
DE10331291A1 (de) 2003-07-10 2005-02-17 Consortium für elektrochemische Industrie GmbH Varianten der 3-Phosphoglyceratdehydrogenase mit reduzierter Hemmung durch L-Serin und dafür codierende Gene
RU2275425C2 (ru) * 2003-11-03 2006-04-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Бактерия, принадлежащая к роду escherichia, - продуцент l-цистеина и способ получения l-цистеина
JP2009118740A (ja) 2006-03-03 2009-06-04 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
EP2351830B1 (en) 2006-03-23 2014-04-23 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an L-amino acid using bacterium of the Enterobacteriaceae family with attenuated expression of a gene coding for small RNA
JP2009165355A (ja) 2006-04-28 2009-07-30 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸を生産する微生物及びｌ−アミノ酸の製造法
WO2007136133A1 (en) 2006-05-23 2007-11-29 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family
WO2008013187A1 (fr) 2006-07-25 2008-01-31 Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. Procédé de production d'un acide aminé
RU2006143864A (ru) 2006-12-12 2008-06-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ cynT, cynS, cynX, ИЛИ cynR, ИЛИ ИХ КОМБИНАЦИИ
JP2010041920A (ja) 2006-12-19 2010-02-25 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
CN101627110B (zh) 2007-01-22 2014-08-13 味之素株式会社 生产l-氨基酸的微生物和l-氨基酸的生产方法
DE102007007333A1 (de) 2007-02-14 2008-08-21 Wacker Chemie Ag Verfahren zur Reinigung von L-Cystein
JP2010110216A (ja) 2007-02-20 2010-05-20 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸または核酸の製造方法
JP2010110217A (ja) 2007-02-22 2010-05-20 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
CN101715484B (zh) 2007-04-06 2014-02-19 协和发酵生化株式会社 二肽的制造方法
JP2011067095A (ja) 2008-01-10 2011-04-07 Ajinomoto Co Inc 発酵法による目的物質の製造法
EP2248906A4 (en) 2008-01-23 2012-07-11 Ajinomoto Kk PROCESS FOR THE PREPARATION OF L-AMINO ACID
RU2008105793A (ru) 2008-02-19 2009-08-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Способ конструирования оперонов, содержащих трансляционно сопряженные гены, бактерия, содержащая такой оперон, способ продукции полезного метаболита и способ мониторинга экспрессии гена
WO2009104731A1 (ja) 2008-02-21 2009-08-27 味の素株式会社 Ｌ－システイン生産菌及びｌ－システインの製造法
EP2138585B1 (en) 2008-03-06 2011-02-09 Ajinomoto Co., Inc. An L-cysteine producing bacterium and a method for producing L-cysteine
JP5332237B2 (ja) 2008-03-06 2013-11-06 味の素株式会社 Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法
WO2009116566A1 (ja) 2008-03-18 2009-09-24 協和発酵キリン株式会社 工業的に有用な微生物
WO2010024267A1 (ja) 2008-09-01 2010-03-04 国立大学法人信州大学 有用物質の製造法
PE20110369A1 (es) 2008-09-08 2011-06-24 Ajinomoto Kk Un microorganismo que produce l-aminoacido y un metodo para producir un l-aminoacido
WO2010084995A2 (en) 2009-01-23 2010-07-29 Ajinomoto Co.,Inc. A method for producing an l-amino acid
US8623619B2 (en) 2009-02-09 2014-01-07 Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. Process for producing L-amino acid
JP5698001B2 (ja) 2009-02-10 2015-04-08 協和発酵バイオ株式会社 アミノ酸の製造法
US20120034669A1 (en) 2009-02-18 2012-02-09 Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. Process for producing useful substance
JP5463528B2 (ja) 2009-02-25 2014-04-09 味の素株式会社 Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法
JP5359409B2 (ja) 2009-03-12 2013-12-04 味の素株式会社 Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法
CN102471790B (zh) 2009-07-29 2014-10-29 味之素株式会社 产生l-氨基酸的方法
RU2009136544A (ru) 2009-10-05 2011-04-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Способ получения l-цистеина с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae
BR112012012915B1 (pt) 2009-11-30 2020-12-01 Ajinomoto Co., Inc. método para produção de l-cisteína, l-cistina, um derivado das mesmas, ou uma mistura das mesmas
JP2013074795A (ja) 2010-02-08 2013-04-25 Ajinomoto Co Inc 変異型ｒｐｓＡ遺伝子及びＬ−アミノ酸の製造法
RU2471868C2 (ru) 2010-02-18 2013-01-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Мутантная аденилатциклаза, днк, кодирующая ее, бактерия семейства enterobacteriaceae, содержащая указанную днк, и способ получения l-аминокислот
RU2482188C2 (ru) 2010-07-21 2013-05-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ РОДА Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ОПЕРОН astCADBE
RU2501858C2 (ru) 2010-07-21 2013-12-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae
BR112013006031A2 (pt) 2010-09-14 2016-06-07 Ajinomoto Kk bactéria,e, método para produzir um aminoácido contendo enxofre, uma substância relacionada ao mesmo, ou uma mnistura dos mesmos.
JP2014036576A (ja) 2010-12-10 2014-02-27 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
EP2479279A1 (de) * 2011-01-20 2012-07-25 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur fermentativen Herstellung schwefelhaltiger Aminosäuren
BR112013020216B1 (pt) 2011-02-09 2020-12-01 Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. processo para produzir substância-alvo através do processo defermentação
JP2014087259A (ja) 2011-02-22 2014-05-15 Ajinomoto Co Inc Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法
US9234223B2 (en) 2011-04-01 2016-01-12 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-cysteine
BR112013023465B1 (pt) * 2011-04-01 2020-10-27 Ajinomoto Co., Inc método para produzir l-cisteína
JP2014131487A (ja) 2011-04-18 2014-07-17 Ajinomoto Co Inc Ｌ−システインの製造法
DE102011075656A1 (de) 2011-05-11 2012-03-29 Wacker Chemie Ag Verfahren zur fermentativen Produktion von L-Cystin
DE102011078481A1 (de) 2011-06-30 2013-01-03 Wacker Chemie Ag Verfahren zur fermentativen Produktion von natürlichem L-Cystein
RU2011134436A (ru) 2011-08-18 2013-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") Способ получения l-аминокислоты с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae, обладающей повышенной экспрессией генов каскада образования флагелл и клеточной подвижности
EP2628792A1 (de) 2012-02-17 2013-08-21 Evonik Industries AG Zelle mit verringerter ppGppase-Aktivität
EP2837688A4 (en) 2012-04-13 2016-06-29 Kyowa Hakko Bio Co Ltd PROCESS FOR PREPARING AN AMINO ACID
DE102012208359A1 (de) 2012-05-18 2013-11-21 Wacker Chemie Ag Verfahren zur fermentativen Produktion von L-Cystein und Derivaten dieser Aminosäure
EP2700715B1 (de) 2012-08-20 2018-07-25 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
DE102012216527A1 (de) 2012-09-17 2014-03-20 Wacker Chemie Ag Verfahren zur fermentativen Produktion von L-Cystein und Derivaten dieser Aminosäure
US9611461B2 (en) 2013-03-19 2017-04-04 National University Corporation NARA Institute of Science and Technology Enterobacteriaceae bacteria exhibiting increased L-cysteine producing ability
RU2013118637A (ru) 2013-04-23 2014-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ РАЗРЕГУЛИРОВАН ГЕН yjjK
DE102013209274A1 (de) 2013-05-17 2014-11-20 Wacker Chemie Ag Mikroorganismus und Verfahren zur fermentativen Überproduktion von Gamma-Glutamylcystein und Derivaten dieses Dipeptids
JP2016165225A (ja) 2013-07-09 2016-09-15 味の素株式会社 有用物質の製造方法
RU2013140115A (ru) 2013-08-30 2015-03-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ НАРУШЕНА ЭКСПРЕССИЯ КЛАСТЕРА ГЕНОВ znuACB
RU2013144250A (ru) 2013-10-02 2015-04-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА, КОДИРУЮЩЕГО ФОСФАТНЫЙ ТРАНСПОРТЕР
JP5958653B2 (ja) 2013-10-02 2016-08-02 味の素株式会社 アンモニア制御装置およびアンモニア制御方法
JP6459962B2 (ja) 2013-10-21 2019-01-30 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸の製造法
RU2014105547A (ru) 2014-02-14 2015-08-20 Адзиномото Ко., Инк. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, ИМЕЮЩЕЙ СВЕРХЭКСПРЕССИРУЕМЫЙ ГЕН yajL
RU2015120052A (ru) 2015-05-28 2016-12-20 Аджиномото Ко., Инк. Способ получения L-аминокислоты с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, в которой ослаблена экспрессия гена gshA
WO2017146195A1 (en) 2016-02-25 2017-08-31 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing l-amino acids using a bacterium of the family enterobacteriaceae overexpressing a gene encoding an iron exporter
JP7066977B2 (ja) 2017-04-03 2022-05-16 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸の製造法
WO2020071538A1 (en) 2018-10-05 2020-04-09 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing target substance by bacterial fermentation
KR102112286B1 (ko) * 2018-12-05 2020-05-19 서울대학교산학협력단 내산성 관련 유전자 및 이를 포함하는 메탄자화균
WO2020171227A1 (en) 2019-02-22 2020-08-27 Ajinomoto Co., Inc. METHOD FOR PRODUCING L-AMINO ACIDS USING A BACTERIUM BELONGING TO THE FAMILY Enterobacteriaceae HAVING OVEREXPRESSED ydiJ GENE
JP7524909B2 (ja) 2019-04-05 2024-07-30 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸の製造方法
JP2022550084A (ja) 2019-09-25 2022-11-30 味の素株式会社 細菌の発酵によるｌ－アミノ酸の製造方法
CN115244183A (zh) 2020-04-03 2022-10-25 瓦克化学股份公司 作为用于生物催化还原胱氨酸的酶催化氧化还原系统的核心组分的生物催化剂
US20230265473A1 (en) 2020-06-26 2023-08-24 Wacker Chemie Ag Improved cysteine-producing strains
WO2023165684A1 (de) 2022-03-01 2023-09-07 Wacker Chemie Ag Verbesserte cystein produzierende stämme

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19539952A1 (de) * 1995-10-26 1997-04-30 Consortium Elektrochem Ind Verfahren zur Herstellung von O-Acetylserin, L-Cystein und L-Cystein-verwandten Produkten
DE19726083A1 (de) * 1997-06-19 1998-12-24 Consortium Elektrochem Ind Mikroorganismen und Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Cystein, L-Cystin, N-Acetyl-Serin oder Thiazolidinderivaten

Also Published As

Publication number Publication date
KR100505336B1 (ko) 2005-07-29
CN1379823A (zh) 2002-11-13
CA2386539C (en) 2007-04-17
EP1220940A1 (de) 2002-07-10
EP1220940B1 (de) 2003-01-29
JP2003511086A (ja) 2003-03-25
CN1262646C (zh) 2006-07-05
ATE231918T1 (de) 2003-02-15
DE19949579C1 (de) 2000-11-16
DE50001193D1 (de) 2003-03-06
CA2386539A1 (en) 2001-04-19
WO2001027307A1 (de) 2001-04-19
EP1220940B2 (de) 2010-07-28
DK1220940T3 (da) 2003-06-23
KR20020059620A (ko) 2002-07-13
TWI249575B (en) 2006-02-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK4972002A3 (en) Method for production of l-cysteine or l-cysteine derivatives by fermentation
RU2346038C2 (ru) Способ ферментативного получения аминокислот и производных аминокислот из семейства фосфоглицератов
CA2235752C (en) Process for preparing o-acetylserine, l-cysteine and l-cysteine-related products
JP5805202B2 (ja) Ｏ−ホスホセリンを生産する微生物およびそれを用いてｏ−ホスホセリンからｌ−システインまたはその誘導体を生産する方法
PL195784B1 (pl) Szczep mikroorganizmu, białko, sposób wytwarzania L-cysteiny, L-cystyny, N-acetyloseryny i/lub pochodnych tiazolidynowych oraz zastosowanie białka
WO2007012078A1 (en) Methionine producing recombinant microorganisms
US7582460B2 (en) 3-phosphoglycerate dehydrogenase variants whose inhibition by L-serine is reduced, and genes encoding them
RU2280687C2 (ru) Клетка микроорганизма, плазмидный вектор, способ создания клетки микроорганизма и способ получения l-метионина
EP3039153B1 (en) Microorganism for methionine production with improved methionine synthase activity and methionine efflux
KR100464906B1 (ko) 발효에 의한 ｏ-아세틸-ｌ-세린의 제조방법
KR20080052593A (ko) 미생물을 사용한 아미노산 생산 방법
JP2015528301A (ja) Ｌ−システインおよび該アミノ酸の誘導体の発酵生産方法

Legal Events

Date Code Title Description
FD9A Suspended procedure due to non-payment of fee