KR20010103615A

KR20010103615A - 해양 및 수생 동물 조직으로부터의 지질 추출 방법

Info

Publication number: KR20010103615A
Application number: KR1020017004998A
Authority: KR
Inventors: 보두왕아드리엥; 마르땡쥬느비에브
Original assignee: 알랑 까이엘르; 위니베르시떼드쉐르브루끄
Priority date: 1998-10-21
Filing date: 1999-10-21
Publication date: 2001-11-23
Also published as: CA2251265A1; CN1269940C; DE69938504D1; ATE391763T1; BR9914699B1; JP4181305B2; NO20011915D0; DK1123368T3; NO321481B1; JP2008150586A; ES2306527T3; DE69938504T2; EP1123368A1; JP2002527604A; JP5172281B2; NO20011915L; US6800299B1; PL347396A1; WO2000023546A1; BR9914699A

Abstract

아세톤 추출법에 의해 해양 및 수생 동물성 물질로부터 지질 분획을 추출하는 방법을 제공한다. 얻어지는 불용성 및 입자화된 분획은 바람직하게는, 알콜, 바람직하게는 에탄올, 이소프로판올 또는 t-부탄올 또는 아세트산 에스테르, 바람직하게는 에틸 아세테이트에 의한 추가 용매 추출법을 적용하여 해양 및 수생 동물성 물질로부터 잔류하는 가용성 지질 추출물을 추출하는 것을 달성한다. 나머지 불용성 입자 물질도 프로테인이 풍부하고, 유용한 양의 활성 효소를 함유하고 있기 때문에 회수된다. 또한, 본문에서는 크릴 새우 추출물이 제공된다.

Description

해양 및 수생 동물 조직으로부터의 지질 추출 방법{METHOD OF EXTRACTING LIPIDS FROM MARINE AND AQUATIC ANIMAL TISSUES}

본 발명은 크릴 새우, 칼라누스(Calanus), 어류 및 바다 포유류 등과 같은 해양 및 수생 동물들로부터 지질 분획들을 추출하는 것에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 용매를 이용한 탈수화에 의해 지질 분획을 추출하는 향상된 방법에 관한 것이다.

크릴 새우, 칼라누스, 어류 및 바다 포유류 등과 같은 해양 및 수생 동물로부터 얻어지는 지질 분획들은 다음과 같은 다양한 용도를 갖는다:

의약 용도

해양 및 수생 동물 오일 및 그의 분획들은 다양한 치료 성분을 포함한다. 예컨대, 다양한 해양 및 수생 동물 오일이 소염 특성을 갖는 것으로 알려져 있다. 해양 및 수생 동물 오일은 또한 심혈관계 질환의 증상을 완화시키는 데 도움이 되는 것으로 알려져 있다. 또한, 일부 해양 및 수생 동물 오일은 소정 유형의 루프스 및 신장 질환의 전개를 억제하는 것으로 알려져 있다. 추가 예로서, 크릴 새우는 궤양이나 상처의 효소 소제법의 원료로서 및 음식의 소화를 용이하게 하는 데 사용될 수 있다. 또한, 해양 및 수생 오일은 잠재적 치료 특성을 갖을 수 있는 다양한 항산화물질을 포함한다.

식이조절제

오메가-3 지방산의 유리한 효과면에서, 크릴 새우, 칼라누스 및 어류의 오일은 인체의 식이조절의 식이요법 공급원으로서 사용될 수도 있다. 이 지방산들은 뇌와 눈의 적절한 발달에 필수적인 것들이다. 해양 및 수생 동물 오일에는 또한 지용성 비타민 A, D 및 E와 카로티노이드가 풍부하다.

화장품

다양한 해양 및 수생 동물 오일은 모이스쳐 크림 제조용으로 사용된다.

어류 양식

크릴 새우, 칼라누스 및 어류에서 발견되는 지질 중에는, 고농도의 지방산 20:5(에이코사펜타노산) 및 22:6(도코사헥산노산)이 존재한다. 이들 지방산들은 필수 영양소들이며 어류의 사료로서 유용하다. 게다가, 이들 필수 영양소들은 이러한 식이요법으로 배양된 어류를 먹음으로써 인간의 식이 요법으로 전가된다.

동물 사료

오메가-3 지방산이 풍부한 동물 사료 양생법은 고기의 콜레스테롤 레벨을 감소시키고 불포화 지방산의 레벨을 증가시킬 수 있다. 이 특성은 이미 달걀의 품질을 향상시키기 위해 가금류 산업 분야에서 활용되고 있다.

해양 및 수생 동물 오일을 추출하는 다양한 방법들이 알려져 있다. 예컨대, 헥산 및 에탄올과 같은 유기 용매를 이용하여 어류의 오일을 추출하는 것이 알려져 있다. 또한, 아세톤과 같은 용매를 사용하여 어류 근조직내의 지방 함량을 측정하는 것이 알려져 있다.

미국특허 제 4,331,695 호에는 프로판, 부탄 또는 헥산과 같이, 실온에서 기체상인 가압 용매를 이용하는 방법이 개시되어 있다. 이 추출법은 잘게 썰은 야채나 미세하게 분쇄한 동물성 산물들에 대해 15 내지 80 ℃의 바람직한 온도로 수행된다. 그후에, 추출된 오일은 50 내지 200 ℃의 고온 고압 조건 하에서 응결되어진다. 그러나, 헥산은 크릴 새우와 같은 해양 동물의 추출용으로는 바람직하지 않은 용매이다. 더욱이, 응결 단계에서 사용되는 고온은 지질을 변형시켜 불리하다.

캐나다특허출원 제 2,115,571 호에는 다양한 갈조류 및 홍조류의 오일 추출법이 개시되어 있다. 이 방법은 예컨대, 거의 순수한 에탄올을 40 시간 동안 사용하는 삭스흘릿(Soxhlet) 추출법을 제공한다.

미국특허 제 5,006,281 호에는 어류 등의 해양 및 수생 동물로부터 오일을 추출하는 방법이 개시되어 있다. 먼저 해양 및 수생 동물을 항산화 물질로 처리하고, 미세하게 분할하여 원심분리시킴으로써, 오일상을 물층과 고체상으로부터 분리시킨다. 그 후에, 이 오일상을 항산화물질로 처리하여 바람직하지 못한 향이나 맛을 제거한다.

캐나다 특허출원 제 1,098,900 호에는 크릴 새우로부터 오일을 추출하는 방법이 개시되어 있다. 이 방법은 신선한 또는 해동된 크릴 새우를 수성 매질에 에멀젼화하는 것을 수반한다. 오일 분획은 원심분리법을 통해 회수된다.

1957년, J. Biol. Chem. 226: 497-509에 개시된 "A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues"라는 논문에서 폴크(Folch)는 클로로포름과 메탄올을 이용한 추출법을 제시하였다. 이 방법은 사용되는 용매의 독성 때문에 실행할 수 없다.

이같이, 종래 기술 공정은 대개 실제 사용이 불가능하거나 수율이 낮다. 따라서, 본 발명의 목적은 유용한 지질 분획을 회수하고 활성 효소를 함유하는, 유용한 프로테인이 풍부한 고체 잔류 물질을 별도로 회수할 수 있도록 하는 향상된 해양 및 수생 동물 오일 추출법을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적 및 그의 추가적인 적용 범위는 다음의 상세한 설명으로부터 좀더 명확해질 것이다. 그러나, 이 기술 분야의 당업자라면 본 발명의 요지 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 수정 및 변형이 가능하기 때문에, 이 상세한 설명은 본 발명의 바람직한 일례를 예시하고자 하는 것으로서, 단지 예시를 목적으로 제공되는 것으로 여겨져야만 할 것이다.

도 1은 건조 크릴 새우로부터 얻어진 지방산(클로로포름-메탄올)의 기체-액체 크로마토그래피를 나타낸 것이고,

도 2는 건조 크릴 새우로부터 얻어진 지방산(아세톤)의 기체-액체 크로마토그래피를 나타낸 것이고,

도 3은 동결 크릴 새우로부터 얻어진 지방산(아세톤)의 기체-액체 크로마토그래피를 나타낸 것이고,

도 4는 동결 크릴 새우로부터 얻어진 지방산(에탄올의 기체-액체 크로마토그래피를 나타낸 것이고,

도 5는 동결 크릴 새우로부터 얻어진 지방산(t-부탄올)의 기체-액체 크로마토그래피를 나타낸 것이고,

도 6은 동결 크릴 새우로부터 얻어진 지방산(에틸 아세테이트)의 기체-액체 크로마토그래피를 나타낸 것이고,

도 7은 칼라누스, Calanus sp. 및 크릴 새우, M. norvegica의 중성 지질의 얇은막 크로마토그래피를 나타낸 것이고,

도 8은 크릴 새우, E. pacifica의 중성 지질의 얇은막 크로마토그래피를 나타낸 것이고,

도 9는 상어, M. schmitti의 중성 지질의 얇은막 크로마토그래피를 나타낸 것이고,

도 10은 상어, G. galeus의 중성 지질의 얇은막 크로마토그래피를 나타낸 것이고,

도 11은 전자리 상어(Angel Shark)의 중성 지질의 얇은막 크로마토그래피를 나타낸 것이고,

도 12는 상어, Calanus sp. 및 크릴 새우류, M. norvegica의 인지질의 얇은막 크로마토그래피를 나타낸 것이고,

도 13은 크릴 새우, E. pacifica의 인지질의 얇은막 크로마토그래피를 나타낸 것이고,

도 14는 상어, M. schmitti의 인지질의 얇은막 크로마토그래피를 나타낸 것이고,

도 15는 상어, G. galeus의 인지질의 얇은막 크로마토그래피를 나타낸 것이고,

도 16은 전자리 상어의 인지질의 얇은막 크로마토그래피를 나타낸 것이고,

도 17은 지질 추출시에 아세톤 부피에 따른 영향력을 나타낸 것이고(E. pacifica),

도 18은 지질 추출시에 아세톤내에서의 인큐베이션 시간에 따른 영향력을 나타낸 것이고(E. pacifica),

도 19는 지질 추출시에 에탄올 부피에 따른 영향력을 나타낸 것이고(E. pacifica),

도 20은 지질 추출시에 에탄올내에서의 인큐베이션 시간에 따른 영향력을 나타낸 것이다(T. raschii).

본 발명의 상세한 설명을 기술하기 전에, 본 발명은 본문에 기재된 공정에 국한되어 적용되는 것이 아님이 주지되어야만 한다. 본 발명에서는 또다른 일례가 가능하고, 다양한 경로로 수행될 수 있다. 또한, 본문에 사용되는 용어 또는 표현들은 기재상의 목적을 갖는 것이며, 이에 국한시키고자 하는 것은 아님이 주지되어야만 한다.

본 발명의 방법은 신선하게 채집된 해양 및 수생 물질을 아세톤에 현탁시키는 것으로 이루어진다. 지질류는 아세톤과 같은 케톤에 의해 추출된다. 이로써 동물 조직이 신속하게 탈수화되고, 지질 분획이 용매로 이동되도록 한다. 건조 잔류물은 활성 효소가 풍분하 유용한 생성물이다. 바람직한 일례에서, 이 추출법은 연속적인 아세톤 및 에탄올 처리를 수행한다. 바람직한 알콜은 이소프로판올, 및 t-부탄올이다. 이 알콜은 또한 에틸 아세테이트와 같은 아세트산 에스테르로 대체될 수도 있다. 이 방법은 두 가지 연속 지질 분획들 및 활성 효소를 포함한 프로테인이 풍부한 건조 잔류물을 생성시킨다. 총 지질의 회수는 본 발명의 배경기술부에서 보고된 Folch 등의 공정(1957)과 유사하다. 크릴 새우, 칼라누스, 어류 및 상어 조직 등으로 테스트하였다.

놀랍게도, 본 발명에서 제시한 바와 같은 후속 처리법이 단일 용매계 추출법에 비해 지질 추출에 있어서 좀더 우수한 수율을 갖는 것임을 알게 되었다. 아세톤과 같은 케톤으로 시작하는 두 가지의 연속 용매를 이용한 추출법은, 아세톤이 사실상 동물 조직을 탈수시키기 때문에 특히 유리하다. 탈수된 형태로 동물 조직을 얻는 것은 알콜이나 에틸아세테이트와 같은 아세트산 에스테르 등의 이차 용매를 이용한 추출 공정을 용이하도록 한다.

크릴 새우 및 칼라누스와 같은 동물성 플랑크톤의 경우, 및 어류 창자와 같은 어류-여과 부산물의 경우에 있어서는, 아세톤에 의한 추출법만으로도 지질 분획들을 비용 효과적으로 회수하고 활성 효소를 포함한 프로테인이 풍부한 건조 고체 생성물을 별도로 회수하도록 하는 데 충분할 수 있음이 주지된다.

본 발명의 일반적인 추출법을 다음에 기술하고자 한다. 막 채취한, 바람직하게는 미세하게 분화시킨 해양 및 수생 동물 물질로 이루어진 출발물질을 약 2 시간 동나, 바람직하게는 밤새 아세톤으로 추출한다. 그러나, 추출 시간은 지질 추출의 수유에 결정적인 영향을 끼치는 것은 아니다. 추출을 용이하게 하기 위하여, 직경5 mm 이하의 입자로 이용하는 것이 바람직하다. 추출은 바람직하게는 비활성 분위기 하에서 약 5 ℃ 이하 정도의 온도로 수행된다.

바람직하게는, 추출은 약 10 내지 40분 동안, 바람직하게는 20 분 동안 교반하며 수행할 수 있다. 추출 시간이 결정적인 것은 아니긴 하지만, 아세톤 대 해양 및 수생 물질의 부피비가 6 : 1일 경우 2 시간 추출이 가장 좋은 것으로 밝혀졌다.

용해된 지질 분획들은 예컨대, 여과, 원심분리 또는 침강 등을 포함한 표준 기법에 의해 고체 물질과 분리된다.

유기 용매에 대해 내성이 있는 필터상에서의 여과에 의해 분리한 후에, 잔류물은 임의로 순수한 아세톤, 바람직하게는 두 배 용량(물질의 원래 부피에 대해)으로 씻어주어 더욱 많은 지질을 회수한다. 이를 모은 여과액을 감압 증발시킨다. 임의로 플래쉬 증발(flash evaporation) 또는 스프레이 건조법을 이용할 수도 있다. 증발 후에 얻어진 수분 잔류물은 저온에서 오일상(분획 I)과 분리시킨다.

필터상에서 모인 고체 잔류물은 에탄올, 이소프로판올, t-부탄올과 같은 알콜이나 에틸아세테이트 등에, 바람직하게는 두 배 부피(물질의 원래 부피에 대해)로 현탁시켜 추출한다. 여과액을 증발시켜 지질의 이차 분획(분획 II라 함)을 생성시킨다. 추출 시간이 결정적인 요소는 아니지만, 약 30 분 정도의 추출 시간이 약 5 ℃ 이하의 온도에서 충분한 것으로 밝혀졌다.

t-부탄올을 제외하고는, 유기 용매의 온도 및 샘플의 온도가 결정적인 인자는 아니지만, 가능한 차가운 것이 바람직하다. 그러나, 실온에서 고체인 t-부탄올의 경우에는, 이를 사용하기 전에 따뜻하게 데워서 25 ℃에서 바로 추출을 수행하는 것이 바람직하다.

비교예

추출 공정의 효율성을 비교하기 위하여, 클로로포름과 메탄올을 이용하는 종래 기술 방법(Folch 등, 1957)을 크릴 새우에 적용하였다. 이 방법은 이 추출 공정의 효율성을 측정하는 데 참조하고자 하는 것이다. 또다른 비교에서는 추출 용매로서 헥산을 이용한 기법이 사용되었다. 지질 회수율은 소량의 원래 용매들에 지질 분획들을 현탁시켜 증발시킨 후에 소량부를 중량 측정함으로써 산측되었다.

본문에 제공된 모든 실험 실시예에 있어서, 아세톤 추출 후에 이차 용매(예컨대, 에틸아세테이트)로 추출하는 것을 수반하는 본 발명의 방법은 폴크(Folch, 1957) 등의 종래기술 방법에 의해 얻어진 그 어떤 오일보다 특성상 및 외관상 우수한 투명 오일을 제공한다.

지질 조성의 분석하기 위하여, 각각의 추출물 780 ㎍을 실리카겔판에 로딩하고 다음과 같은 용매를 이용하여 얇은막 크로마토그래피, TLC(Bowyer 등, 1962)로 분획화하였다. 중성 지질: 헥산, 에틸 에테르, 아세트산(90:10:1 v/v) 및 인지질: 클로로포름, 메탄올, 물(80:25:2, v/v). 크릴 새우, E. pacifica의 지방산 조성은 기본 방법에 일부 수정을 포함한 기체 액체 크로마토그래피, GLC(Bowyer 등, 1962, 참고문헌 목록 참조)에 의해 분석되었다: 80 ℃에서 1 h 대신에 65 ℃에서 2 h, 물에 의한 세정 없이 및 2 회 대신에 헥산에 의한 3 회 세정.

미량의 유기 용매를 제거하기 위하여, 지질 분획 I 및 II를 약 125 ℃로 15분 동안 비활성 기체 분위기 하에서 가열하였다.

지방(fat)은 미국 오일 화학자 협회(AOCS)에 따라 분석되었다. 다음과 같은 기준 사항이 상기 추출된 지질을 분석하는데 사용되었다: 사포닌화 및 위지스(Wijs) 요오드 지수 및 수분-휘발성 물질 레벨. 콜레스테롤 함량은 또한 플러머(Plummer), 1987(참고문헌 목록 참조)에 따라 측정되었다. 동일한 분석 및 그외의 것들을 로버트 애크만(Robert Ackman) 교수의 지도 하에서 독립 실험실에 의해 수행되었다(Canadian Institute of Fisheries Technology, DalTech, Dalhousie University, Halifax, Nova Scotia, Canada). 이는 Wihs 요요오드 지수, 퍼옥사이드 및 아니시딘 수치, 지질류 조성, 지방산 조성, 유리 지방산 FAME, 콜레스테롤, 토코페롤, 모든-trans 레티놀, 콜레칼시페롤, 아스타크산틴 및 칸타크산틴 함량을 포함한다.

표 1로부터 폴크(Folch) 등의 종래 기술(1957)과 비교하여 좀더 높은 레벨의 지질이 건조 크릴 새우로부터 아세톤과 이후의 에탄올에 의해 추출되는 것을 알 수 있다.

표 2는 태평양산 크릴 새우의 한 종류인, 냉동 유푸시아 퍼시피카(Euphusia pacifica)로부터의 지질 추출의 결과를 나타낸 것이다. 물의 함량을 80%로 추정하고, 지질 함량은 상기 표 1에 나타낸 바와 같이 건조 크릴 새우와 유사하다. 이차 추출용 용매로서 이소프로판올, t-부탄올 및 에틸 아세테이트는 에탄올보다 중요성이 떨어지는 수율을 제공하지만, 에탄올이 이소프로판올, t-부탄올 또는 에틸아세테이트보다 불순물은 좀더 많이 수반하기 때문에 지질 회수에서의 유효성도 당연히떨어지는 것이라 할 수 없다. 따라서, 이들은 아세톤 다음에 사용하는 이차 용매로서 동일하게 사용될 수 있다. 아세톤 추출로부터 얻어진 결과들 사이의 편차는 주로 물-오일 분리로부터 기인한다. 이들 분리는 아세톤 증발 후에 물-오일 용액내에서 아세톤의 잔류량에 의해 영향을 받는다. 아세톤의 이 양은 소량으로 사용되는 증발 시스템이 재생성이 떨어지기 때문에 매 실험마다 달라진다(산업용 스케일에서는, 증발 단계가 최적화될 것이다). 단일 용매 또한 크릴 새우로부터 얻어진 지질의 총계를 추출하기 위해 테스트되었다. 이로부터, 에틸 아세테이트(1,37% 추출율)가 헥산(0,23% 추출율)이 좋은 용매가 아닌 바와 같이, 아세톤 단독(1,86% 추출율, 및 유능한 아세톤 증발 시스템에 의해 훨씬 큰 추출율을 얻을 수 있음)과 비교하여 큰 효과가 없음을 알 수 있다.

이 공정의 주요 장점 중 하나는 추출물(지질 분획 및 고체 프로테인-풍부 물질)로부터 박테리아를 제거하는 것에 있다. 사실, 4 ℃로 112 일 동안 아세톤의 다양한 비율로 배양된 크릴 새우, E. pacifica의 샘플들은 Bcto™비프 추출물 0,3%, Bacto™0,5% 및 Bacto™아가 1,5%(Difco Laboratories, Detroit, USA)를 함유하는 NA 배지상에서 접종된 후에, 실온 또는 4 ℃에서 18 일 동안 인큐베이팅되었다. 유의한 박테리아 생장이 크릴 새우 그램당 아세톤 1 배 부피의 비에서 관찰되지 않았다. 아세톤을 비율을 높여서도(2 배 부피 또는 5 배 부피), 박테리아 생장이 전혀 관찰되지 않았으며, 이는 아세톤이 크릴 새우 샘플을 보존시키는 것을 의미한다. 아세톤은 유용한 항박테리아제 및 항균제로서 알려져 있다(Goodman 등, 1980).

표 3은 크릴 새우, M. norvegica로부터 얻어진 지질의 수율을 나타낸 것이다. 지질의 퍼센트(3,67%)는 표 2에서 나타낸 E. pacifica로부터 얻어진 수율(3,11%)에 필적할 만한 정도이다. 편차는 이 두 종류가 상이한 채집 기간(계절) 및 양생법에 기인할 것일 수 있다.

표 4는 크릴 새우, M. norvegica의 지질 추출 효용성에 대한 분쇄시의 영향성을 나타낸 것이다. 이 추출은 최적의 조건 하에서 수행되었으며, 종래기술 방법에 비하여 공정상의 명확한 유익성을 알 수 있었다(4,46% 대 3,30%). 또한, 분쇄가 그 종이 클 경우에 중요한 인자가 될 수 있다는 것을 알 수 있다(4,46% 대 3,53%).

표 5는 칼라누스로부터의 지질 추출에 대한 것이다. 상당한 양의 지질을 얻었다. 칼라누스 종 조성물에서 일부 편차는 실험 1 및 2 사이의 상이함을 설명할 수 있다(바로 측정한 중량의 8,22% 및 10,90%).

표 6∼8은 어류 조직으로부터 추출된 지질의 총량을 기재한 것이다. 본 발명의 방법은 고등어, 송어 및 청어 등을 통해 입증되었다. 본 발명의 방법은 말초 조직(주로 근육) 및 내장을 통해 입증되었다. 유익하게, 본 발명의 방법은 대개 어류의 필터 철회 후에 폐기되는 어류의 일부분으로부터 유용한 지질 분획을 회수할 수 있다. 어류를 인간의 소비 형태로 변환시킨 후에 사용되지 않는 이 어류 조직들을 아세톤에 보관할 수 있으며, 폴크(Folch)의 방법[1957]이 본 발명의 방법보다 좀더 많은 지질을 회수한다 하여도 본 발명에 따라 이들로부터 지질을 회수한다. 실제로는, 고등어로부터의 소량의 지질(내장으로부터 0.52% 및 조직으로부터 1,45%)은 본 발명에서 기재한 바와 같이 아세톤과 에탄올로 일차 추출한 후에 폴크(Folch)의 방법에 의해 추출되었다. 본 발명에 기재된 바와 같은 방법에 의한 비교 추출을 송어에 대해 폴크(Folch)의 방법과 동시에 수행하였으며, 청어는 후자에 의해 우수한 회수율을 나타낸다. 그러나, 폴크(Folch) 방법은 상용 용도로는 지질 회수에 적용될 수 없다는 것이 주지되어야할 것이다(독성 때문에).

표 9 내지 11에는 상어의 간 조직으로부터의 지질 추출 결과를 나타내었다. 종들내에서의 기법간의 결과상에 차이는 표시되어 있지 않다. 표 12는 다양한 용맹 의한 추출 이후에 크릴 새우 오일(E. pacifica)의 지방산 조성을 나타낸 것이다.

표 13은 크릴 새우 오일(E. pacifica)에 대한 분획 I(아세톤) 및 분획 II(알콜 또는 에틸 아세테이트)의 일부 특징적인 성질을 나탄낸 거이다. 먼저, 분획 I의 사포닌화 지수(130,6)로부터 분획 II(185,7)에 비해 좀더 긴사슬을 갖는 지방산을 포함하는 것을 알 수 있다. 분획 I의 위지스(Wijs) 요오드 지수는 81.1의 지수를 갖는 올리부 오일에 비해, 이 분획이 높은 레벨의 폴리-불포화 지방산을 포함한다는 것을 나타낸다. 이로부터 분획 I이 실온에서 액상인 이유를 알 수 있다. 불포화 지방산은 이들의 포화 동족체 중 하나보다 낮은 용융점을 갖는 것으로 알려져 있다. 동일한 관찰이 요오드 지수가 127,2인 분획 II에 대해 이루어졌다. 표 12에 나타낸 바와 같은 지방산 조성은 이들 요오드 지수를 확실하게 한다: 분획 I은 폴리-불포화 지방산(펜탄+헥산)의 높은 퍼센트(30.24%)를 갖고, 분획 II(22.98%) 또한, 그와 마찬가지이다. 최종적으로, 표 13은 또한 분획 I이 용매를 증발시킨 후에 10,0%의 휘발성 물질 및 수분을 함유한다는 것을 나타낸다. 동일한 테스트에서, 분획 II는 6,8%의 지수를 제공한다. 미량의 용매를 제거하기 위하여, 질소 분위기 하에서 상기 오일을 간단히 가열하는 것이 중요하다(약 125 ℃까지 약 15 min 동안).

본 발명의 방법에 따라 얻어진 크릴새우 오일에 대한 결과(아세톤으로 추출한 분획 I 및 에틸 아세테이트로 추출한 분획 II)를 표 13, 14, 15, 16, 17 및 18에 기재하였다. 표 18에서 카로티노이드 함량은 아스타크산틴 및 칸타크산틴의 두 가지 카로티노이드에 있어서 측정된 바와 같이 현저하게 높다. 사실, 이중 분석을 통해 지질 분획 중 칸타크산틴에 있어서 262 내지 734 ㎍/g 및 아스타크산틴에 있어서 값이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 목적을 위해, 상기 크릴새우 추출물은 적어도 지질 분획 중 75 ㎍/g, 바람직하게는 90 ㎍/g 이상의 아스타크산티을 함유한다고 할 수 있다. 칸타크산틴의 경우, 적어도 250 ㎍/g, 바람직하게는 270 ㎍/g이 지질 분획 중에 포함되어 있다. 퍼옥사이드 및 아니시딘의 낮은 값은 높은 레벨의 천연 항산화제(아스타크산틴 및 칸타크산틴)이 조재하기 때문에 유리한 것이다. 이들 화합물들은 높은 레벨의 카로티노이드가 우수한 경피 이동 특성을 나타내는 것이므로 크릴새우 추출물의 의약적으로 또는 화장품 용도로서의 유리한 특성을 나타내는 것이다. 따라서, 크릴 새우 추출물은 의약의 경피 전달용으로 우수한 후보 물질이다.

표 19는 수생 동물 조직의 지질 추출용으로 본 발명에 따른 방법의 가장 바람직한 유형을 나타낸 것이다.

표 20에는 고체 분획의 효소 활성이 본 발명의 방법 이후에 유지되는 것을 나타내었다. 실제로, 연이은 아세톤 및 에틸 아세테이트의 추출 이후에 얻어지는 고체 크릴 새우 잔류물에 대해 그 증명을 완료하였다. 단백질 가수분해 활성(proteolytic activity)은 시약으로서 o-프탈디알데히드를 사용한 분광학적 분석으로 아미노기의 유리에 의해 측정된 것이다. 프로테인 농도는 브래드포드(Bradford) 방법에 의해 측정되었다. 가용성 프로테인을 물로 추출하여, 한외여과법에 의해 얻어진 10% 락토 세럼 프로테인 농축액에 첨가하였다. 50 mM 칼륨 포스페이트 완충액내에서 37 ℃로 인큐베이션하는 끝에, 트리클로로아세트산을 첨가하고 NH₃기의 양을 Church 등의 방법에 따라 상등액내에서 측정하였다[1983, J Dairy Sci 66: 1219-1227].

도 1 내지 6은 E. pacifica 지질의 지방산 아미노산 조성물의 크로마토그래피를 나타낸 것이다. 이들 각각에 있어서, 20:5 및 22:6 지방산의 높은 비율(해양 및 수생 오일의 특징적인)은 주목할만한 것이며, 두가지 고유한 피크에 의해 대표된다. 데이타는 표 12에 나타내었다.

다른 종과 비교하여 어느 한 종의 중성 지질의 지질 패턴의 상이함(도 7 내지 11)은 음식원에서의 차이에 기인하는 것일 수 있다. 동종내에서(예컨대, E. pacifica)는, 지질 추출의 다양한 기법에 의해 얻어진 지질 패턴들 사이에서 현저한 차이는 없다. 인지질의 경우(도 12 내지 도 16), 반대 현상이 관찰된다: 동일한 종이 동일한 지질 패턴을 유도하는 것이 아니기 때문에 차이점들은 다양한 지질 추출 공정 때문으로 여겨진다. 상어 종류의 지질(기재된 바와 같은 방법에 의해 추출) 및 상용의 대구-간 오일(Uniprix drugstores로부터 구입한 샘플, Province of Quebec, Canada)은 주로 인지질과 대립되는 것으로 중성 지질을 함유한다.

크릴 새우, E. pacifica로부터 지질을 추출하는 아세톤의 효능에 대해 용매의 양 및 인큐베이션 시간의 영향을 각각 도 17 및 18에 나타내었다. 2 h 동안의 거의 완전 추출에 의한 최적의 수율이 1:6(w/v)의 비로 얻어졌다. 이차 추출 단계는 에탄올로 실시되었다. 상이한 부피의 에탄올로 동일한 수율이 얻어졌기에 용매의 양은 결정적인 것으로 보이지는 않지만(도 19), 에탄올내에서 인큐베이션 시간은 도 20의 결과에 나타난 바와 같이 적어도 30 분 이상이 되어야만 한다.

발명자중 한 사람인, 보두왕 아드리엥 박사(Dr. Adrien Beaudoin)가 크릴 새우의 다양한 지질 분획을 섭취하였는데, 부작용 양상이 나타나지 않았다.

본 발명을 하나의 특정 형태 측면에서 상기한 바와 같이 기술하였으나, 이 분야의 당업자라면 충분히 다양한 방법으로 이에 대한 변형 및 개량이 가능할 것이다. 따라서, 본 발명은 청구의 범위를 기준으로 하여서만 그의 범위가 한정되어야 한다고 이해되어져야 한다.

아세톤 및 에틸 아세테이트 추출 이후에 얻어진 크릴 새우 잔류물 분석은 효소 단백질 가수분해 활성을 포함한다. 단백질 가수분해 활성은 o-프탈디알데히드를 이용한 분광학적 분석을 통해 아미노기의 유리에 의해 측정되었다. 프로테인 농도를 브래드포드(Bradford) 기법으로 측정하였다.

상기 효소 공급원은 지질의 아세톤 및 에틸 아세테이트 추출 이후에 얻어지는 잔류물이었다. 가용성 프로테인은 물로 추출되어, 한외여과법에 의해 얻어진 10% 락토세럼 프로테인 농축액에 첨가하였다.

50 mM 칼륨 포스페이트 완충액내에서 37 ℃로 인큐베이션하는 끝에, 트리클로로아세트산을 첨가하고 NH₃기의 양을 1983년도 처어치(Church) 등의 방법에 따라 상등액내에서 측정하였다.

참고문헌

Claims

다음의 단계로 이루어지는 해양 및 수생 동물성 물질로부터 지질 분획을 추출하는 방법:

(a) 해양 및 수생 동물성 물질을 케톤 용매, 바람직하게는 아세톤에 넣고 상기 해양 및 수생 동물성 물질로부터 가용성 지질 분획의 추출을 달성하고;

(b) 상기 액상 및 고체상 성분을 분리하고;

(c) 상기 액상 성분에 존재하는 용매를 증발시킴으로써, 상기 액상 성분으로부터 제 1의 지질이 풍부한 분획을 회수하고;

(d) 알콜, 바람직하게는 에탄올, 이소프로판올, 또는 t-부탄올, 및 아세트산의 에스테르, 바람직하게는 에틸아세테이트로 이루어진 군 중에서 선택된 유기 용매에 상기 고체 성분을 넣고 상기 해양 및 수생 동물성 물질로부터 잔여 가용성 지질 분획의 추출을 달성하고,

(e) 액상 및 고체상 성분을 분리하고;

(f) 상기 액상 성분으로부터 용매를 증발시킴으로써 제 2의 지질이 풍부한 분획을 회수하고;

(g) 상기 고체 성분을 회수함.
제 1 항에 있어서, 단계 (a)에서 용매 및 동물성 물질을 균일화시키는 방법.
제 1 항에 있어서, 단계 (d)에서 상기 용매 및 고체 성분을 균일화시키는 방법.
제 1 항 내지 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b) 및 (d)를 비활성 기체 분위기 하에서 수행하는 방법.
제 1 항 내지 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b) 및 (e)를 여과법, 원심분리법 및 침강법으로 이루어진 군 중에서 선택된 기법으로 수행하는 방법.
제 1 항 내지 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계(c) 및 (f)를 증발법, 플래쉬 증발법 및 스프레이 건조법으로 이루어진 군 중에서 선택된 기법으로 수행하는 방법.
제 1 항 내지 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b) 이후 및 단계 (c) 이전에 추가로 고체 성분을 용매로 씻어주고 얻어진 세정 용액을 상기 단계 (b)의 액상 성분에 첨가하는 중간 단계를 포함하는 방법.
제 1 항 내지 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (e) 이후 및 단계 (f) 이전에 추가로 상기 단계 (d)에서 선택된 유기 용매로 상기 고체 성분을 씻어주는 중간 단계를 포함하는 방법.
제 1 항 내지 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a) 이전에 상기 해양 및 수생 동물성 물질을 미세하게 분화시키는, 바람직하게는 평균 입자 크기 5 mm 이하로 분화시키는 방법.
제 1 항 내지 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (a) 및 (b)를 약 5 ℃ 이하의 용매 온도로 수행하는 방법.
제 1 항 내지 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 해양 및 수생 동물이 동물성 플랑크톤인 방법.
제 11 항에 있어서, 상기 동물성 플랑크톤이 크릴새우인 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 동물성 플라크톤이 칼라누스인 방법.
제 1 항 내지 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 해양 및 수생 동물이 어류 필터링 부산물인 방법.
다음의 단계로 이루어지는 동물성 플랑크톤 및 어류 필터링 부산물, 바람직하게는 내장으로 이루어진 군 중에서 선택된 해양 및 수생 동물성 물질로부터 지질분획을 추출하는 방법:

(a) 상기 동물성 물질을 케톤 용매, 바람직하게는 아세톤에 넣고 상기 해양 및 수생 동물성 물질로부터 가용성 지질 분획의 추출을 달성하고;

(b) 상기 액상 및 고체상 성분을 분리하고;

(c) 상기 액상 성분에 존재하는 용매를 증발시킴으로써, 상기 액상 성분으로부터 지질이 풍부한 분획을 회수하고;

(d) 상기 고체상 성분을 회수함.
제 15 항에 있어서, 상기 동물성 물질이 크릴 새우인 방법.
제 15 항에 있어서, 상기 동물성 물질이 칼라누스인 방법.
제 15 항 내지 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a) 동안에 상기 용매 및 동물성 물질을 균일화시키는 방법.
제 15 항 내지 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b) 및 (d)를 비활성 기체 분위기 하에서 수행하는 방법.
제 15 항 내지 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)를 여과법, 원심분리법 및 침강법으로 이루어진 군 중에서 선택된 기법으로 수행하는 방법.
제 15 항 내지 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)를 진공 증발법, 플래쉬 증발법 및 스프레이 건조법으로 이루어진 군 중에서 선택된 기법으로 수행하는 방법.
제 15 항 내지 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b) 이후 및 단계 (c) 이전에 추가로 고체 성분을 용매로 씻어주고 얻어진 세정 용액을 상기 단계 (b)의 액상 성분에 첨가하는 중간 단계를 포함하는 방법.
제 15 항 내지 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a) 이전에 상기 해양 및 수생 동물성 물질을 미세하게 분화시키는, 바람직하게는 평균 입자 크기 5 mm 이하로 분화시키는 방법.
제 15 항 내지 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (a) 및 (b)를 용매 온도 약 5 ℃ 이하에서 수행하는 방법.
아스타크산틴내에서의 카로티노이드 함량이 크릴 새우 추출물 중 약 75 ㎍/g 이상, 바람직하게는 약 90 ㎍/g 이상인 크릴 새우 지질 추출물.
칸탄크산틴내에서의 카로티노이드 함량이 크릴 새우 추출물 중 약 250 ㎍/g이상, 바람직하게는 약 270 ㎍/g 이상인 크릴 새우 지질 추출물.
제 1 항 또는 15 항에 있어서, 마지막 단계에서 회수된 고체 성분이 활성 효소를 포함한 탈수 잔여물로 이루어지는 지질 추출 방법.