BR9914699B1 - método para extração de frações de lipìdios de material de animais marinhos e aquáticos, extrato de lipìdio de cril, uso do mesmo, fração de lipìdio, e, uso da mesma. - Google Patents

método para extração de frações de lipìdios de material de animais marinhos e aquáticos, extrato de lipìdio de cril, uso do mesmo, fração de lipìdio, e, uso da mesma. Download PDF

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Description

"MÉTODO PARA EXTRAÇÃO DE FRAÇÕES DE LIPÍDIOS DEMATERIAL DE ANIMAIS MARINHOS E AQUÁTICOS, EXTRATO DELIPÍDIO DE CRIL, USO DO MESMO, FRAÇÃO DE LIPÍDIO, E, USO DAMESMA"
CAMPO DA INVENÇÃO
Esta invenção está relacionada à extração de frações de lipídios deanimais marinhos e aquáticos tais como cnl, Calanus, peixes e mamíferos marinhos.De uma forma mais específica, esta invenção está relacionada a um processomelhorado para a extração de frações de lipídios por meio de desidratação comsolventes e a recuperação de um resíduo sólido rico em enzimas ativas.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
As frações de lipídios obtidas de animais marinhos e aquáticos taiscomo o cril, Calanus, peixes e mamíferos marinhos possuem diversas aplicações:
Aplicações medicinais
Os óleos de animais marinhos e aquáticos e frações dos mesmoscontêm diversos agentes terapêuticos. Por exemplo, é reportado que diversosóleos de animais marinhos e aquáticos possuem propriedades anti-inflamatórias.Os óleos de animais marinhos e aquáticos são também reportados como deauxílio na redução da incidência de doenças cardiovasculares. Além disso,alguns óleos de animais marinhos e aquáticos são reportados como suprimindo odesenvolvimento de determinadas formas de lupus e doenças renais. Como umexemplo adicional, o cril pode ser usado como uma fonte de enzimas para ocontrole de úlceras e ferimentos ou para facilitar a digestão de alimentos. Alémdisso, os óleos marinhos e aquáticos contêm diversos antioxidantes, os quaispodem apresentar propriedades terapêuticas em potencial.
Nutriceuticos
Considerando os efeitos benéficos dos ácidos graxos omega-3,os óleos de cril, Calanus e de peixe poderão ser usados como suplementosdietéticos para a dieta humana. Esses ácidos graxos são essenciais para odesenvolvimento apropriado do cérebro e da vista. Os óleos de animaismarinhos e aquáticos são ainda ricos em vitaminas liposolúveis A, D e E, ecarotenóides.
Cosméticos
Diversos óleos de animais marinhos e aquáticos são usadospara a produção de cremes umectantes.
Criação de peixes
Entre os lipídios encontrados no cril, Calanus e peixes, seacham presentes elevadas concentrações dos ácidos graxos 20:5 (ácidoeicosapentenóico) e 22:6 (ácido docosahexenóico). Esses ácidos graxos sãonutrientes essenciais e são benéficos como alimentação para peixes. Maisainda, esses nutrientes essenciais são levados adiante para a dieta humanapela alimentação com os peixes criados com essas dietas.
Alimentação animal
As dietas para alimentação animal ricas em ácidos graxosomega-3 podem elevar o nível de ácidos graxos não saturados e diminuir osníveis de colesterol na carne. Esta propriedade já é explorada na indústriaavícola para melhorar a qualidade dos ovos.
Diversos processos para a extração de óleos de animaismarinhos e aquáticos são conhecidos. Por exemplo, é bem conhecida aextração do óleo de peixe utilizando solventes orgânicos tais como hexano eetanol. E também conhecida a medição do conteúdo de gordura em um tecidode músculo de peixe utilizando solventes tais como acetona.
A Patente U.S. 4331695 descreve um processo utilizandosolventes pressurizados que são gasosos na temperatura ambiente, tais comopropano, butano ou hexano. A extração é levada a efeito nas temperaturaspreferidas de 15 a 80° C em produtos vegetais desfibrados ou animaisfinamente divididos. Os óleos extraídos são então induzidos a se precipitaremsob elevada pressão e elevadas temperaturas de 50 a 200° C. Entretanto, ohexano é um solvente insatisfatório para extração de animais marinhos talcomo o cril. Além disso, as elevadas temperaturas usadas na etapa deprecipitação alteram de forma negativa os lipídios.
O Pedido de Patente Canadense 2115571 descreve umprocesso para a extração de óleos de diversas espécies de algas castanhas evermelhas. O processo proporciona, por exemplo, uma extração em refluxo("Soxhlet") utilizando etanol quase puro durante 40 horas.
A Patente US 5006281 descreve um processo para a extraçãode óleo de animais marinhos e aquáticos tais como peixes. O animal marinhoou aquático é primeiro tratado com um composto antioxidante, finamentedividido e centrifugado para separar a fase óleo da fase aquosa e da fasesólida. A fase óleo é então tratada adicionalmente com um antioxidante pararemover indesejáveis odores ou gostos.
A Patente Canadense 1098900 descreve um processo para aextração de óleos de cril. O processo envolve emulsionar o cril fresco oudescongelado em um meio aquoso. A fração óleo é recuperada porcentrifugação.
Folch, no artigo publicado no ano de 1957 no J. Biol. Chem.226: 497-509, "A simple method for the isolation and purification of totallipids from animal tissues", propõe um processo de extração utilizandoclorofórmio e metanol. Esse processo não é comercialmente praticável porcausa da toxidez dos solventes envolvidos.
Entretanto, os processos com a tecnologia precedente sãogeralmente impraticáveis do ponto de vista comercial ou proporcionambaixos rendimentos quantitativos. Assim sendo, é um objetivo da presenteinvenção proporcionar um processo melhorado para a extração de óleo deanimais marinhos ou aquáticos, que permita a recuperação de uma valiosafração de lipídios e uma recuperação separada de um valioso resíduo sólidorico em proteínas, que contém enzimas ativas.
Outros objetivos e o escopo de aplicabilidade adicional dapresente invenção tornar-se-ão evidentes a partir da descrição detalhadaproporcionada aqui adiante. Entretanto, deverá ser compreendido que estadescrição detalhada, embora indique as formas de realização preferidas dainvenção, é proporcionada somente como forma de ilustração, uma vez quediversas alterações e modificações dentro do espírito e do escopo da invençãotambém tornar-se-ão evidentes para aqueles especializados nesta tecnologia.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS
Figura 1. Cromatografia gás-líquido de ácidos graxos de crilseco (clorofórmio-metanol).
Figura 2. Cromatografia gás-líquido de ácidos graxos de crilseco (acetona).
Figura 3. Cromatografia gás-líquido de ácidos graxos de crilcongelado (acetona).
Figura 4. Cromatografia gás-líquido de ácidos graxos de crilcongelado (etanol).
Figura 5. Cromatografia gás-líquido de ácidos graxos de crilcongelado (t-butanol).
Figura 6. Cromatografia gás-líquido de ácidos graxos de crilcongelado (etil acetato).
Figura 7. Cromatografia em camada fina de lipídios neutros deCalanus sp. e M. Norvegica
Figura 8. Cromatografia em camada fina de lipídios neutros deE pacifica
Figura 9. Cromatografia em camada fina de lipídios neutros deMschmitti
Figura 10. Cromatografia em camada fina de lipídios neutrosde G galeus
Figura 11. Cromatografia em camada fina de lipídios neutrosde Tubarão Anjo
Figura 12. Cromatografia em camada fina de fosfolipídeos deCalanus sp. e M Norvegica
Figura 13. Cromatografia em camada fina de fosfolipídeos deE pacifica
Figura 14. Cromatografia em camada fina de fosfolipídeos deMschmitti
Figura 15. Cromatografia em camada fina de fosfolipídeos deG. Galeus
Figura 16. Cromatografia em camada fina de fosfolipídeos deTubarão Anjo
Figura 17. Influência do volume de acetona na extração delipídios (E. Pacifica)
Figura 18. Influência do tempo de incubação em acetona naextração de lipídios (E. Pacifica)
Figura 19. Influência do volume de etanol na extração delipídios (E. Pacifica)
Figura 20. Influência do tempo de incubação em etanol naextração de lipídios (T. Raschii).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA FORMA DE REALIZAÇÃO PREFERIDA
Antes da descrição em detalhes da presente invenção, deveficar entendido que a invenção não se acha limitada na sua aplicação aosdetalhes de processo aqui descritos. A invenção é capaz de outras formas derealização e de ser praticada de diversas maneiras. Deve ficar entendidotambém que a fraseologia ou a terminologia aqui utilizadas são com afinalidade de descrição e não de limitação.O processo da invenção compreende suspender em acetona omaterial marinho ou aquático recolhido fresco. Os lipídios são extraídos comuma cetona tal como a acetona. Isto permite uma rápida desidratação dotecido animal e uma migração da fração lipídio para o solvente. O resíduoseco é um produto valioso rico em enzimas ativas.
Em uma forma de realização preferida, a extração é levada aefeito por meio de sucessivos tratamentos com acetona e álcool. Os álcooispreferidos são isopropanol e t-butanol. O álcool pode ser também substituídopor um éster do ácido acético, tal como o etil acetato. Este procedimentoproduz duas frações sucessivas de lipídios e um resíduo seco enriquecido emproteína, incluindo enzimas ativas. A recuperação de lipídios totais écomparável ao procedimento de Folch et ai. (1957) que se acha reportado nosfundamentos da invenção. Ele foi testado com tecidos de cril, Calanus,peixes e tubarão.
De forma surpreendente, foi descoberto que tratamentos paraextração sucessivos conforme proposto pela presente invenção apresentamum melhor rendimento na extração de lipídios que um sistema com extraçõescom um único solvente. A extração utilizando dois solventes em sucessão oqual se inicia com uma cetona, tal como a acetona, é especialmente vantajosouma vez que a acetona, com efeito, desidrata o tecido animal. Estando otecido animal em uma forma desidratada fica grandemente facilitado oprocesso de extração com o segundo solvente, álcool ou um éster do ácidoacético tal como o etil acetato.
No caso do zooplâncton tal como o cril e Calanus e no casodos subprodutos da produção de filé de peixe, tal como as vísceras de peixe, éobservado que a extração com acetona somente pode ser suficiente parapermitir uma recuperação efetiva em termos de custo de frações lipídio e umarecuperação separada de um produto sólido seco rico em proteínas incluindoenzimas ativas.O processo geral de extração da presente invenção será agoradescrito. O material de partida, que consiste de recém colhido e depreferência finamente dividido material de animais marinhos e aquáticos, ésubmetido a uma extração com acetona por aproximadamente duas horassendo de preferência de um dia para o outro. Entretanto o tempo de extraçãonão é crítico para o rendimento da extração dos lipídios. Para facilitar aextração, é preferível usar partículas menores que 5 mm de diâmetro. Aextração é conduzida de preferência em uma atmosfera inerte e a umatemperatura da ordem de aproximadamente 5o C ou menos.
De preferência, o início da extração será conduzido sobagitação por aproximadamente 10 a 40 minutos, sendo de preferência 20minutos. Embora o tempo de extração não seja crítico, foi descoberto queuma extração de 2 horas com uma relação em volume de 6:1 de acetona parao material animal marinho e aquático é melhor.
As frações solubilizadas de lipídios são separadas do materialsólido por meio de técnicas padrão incluindo, por exemplo, filtração,centrifugação ou sedimentação. A filtração é utilizada de preferência.
Após a separação por filtração em um filtro resistente aosolvente orgânico (metal, vidro ou papel), o resíduo é opcionalmente lavadocom acetona pura, de preferência dois volumes (volume original do material)para recuperar ainda mais lipídios. Os filtrados combinados são evaporadossob pressão reduzida. Opcionalmente uma evaporação por descompressão("flash") ou uma secagem por atomização poderão ser utilizadas. O resíduode água obtido após a evaporação é deixado para se separar da fase óleo(fração I) em baixa temperatura.
O resíduo sólido recolhido no filtro é posto em suspensão eextraído com álcool, tal como etanol, isopropanol, t-butanol ou,alternativamente, com etil acetato, de preferência com dois volumes (volumeoriginal do material). O filtrado é evaporado deixando uma segunda fração delipídios (identificada como fração II). Embora o período de extração não sejacrítico, foi descoberto que um tempo de extração de aproximadamente 30minutos é o suficiente em temperaturas abaixo de aproximadamente 5o C.
A temperatura dos solventes orgânicos, exceto para o t-butanol, e a temperatura da amostra não são parâmetros críticos, mas épreferível que sejam tão frias quanto possível. Entretanto, no caso do t-butanol o qual é sólido na temperatura ambiente, é importante aquecer omesmo antes de usa-lo e levar a efeito a extração imediatamente a 25° C.
Exemplos comparativos
Para comparar a eficiência do processo de extração, umatécnica clássica (Folch et ai. 1957) utilizando clorofórmio e metanol foiaplicada ao cril. Este processo é a referência para medir a eficiência doprocesso de extração. Uma outra comparação foi feita com uma técnicausando hexano como o solvente de extração. A recuperação de lipídios foiestimada pela suspensão das frações de lipídios em pequenos volumes dosseus solventes originais e medindo por gravimetria pequenas alíquotas após aevaporação.
Para todos os exemplos aqui proporcionados, o processo dapresente invenção envolvendo uma extração por acetona seguida por umaextração com um segundo solvente (etil acetato, por exemplo) proporcionouum óleo translúcido possuindo uma aparência e propriedades mais atrativasque qualquer óleo obtido pela técnica clássica de Folch et al. (1957).
Para analisar a composição do lipídio, 780 μg de cada extratoforam colocados em placas de silica-gel e fracionados por cromatografia emcamada fina, TLC (thin layer chromatography)(Bowyer et al. 1962) com osseguintes solventes. Lipídios neutros: hexano, etil éter, ácido acético(90:10:1, v/v) e para fosfolipídeos: clorofórmio, metanol, água (80:25:5, v/v).A composição em ácidos graxos do E. pacifica foi analisada porcromatografia gás líquido, GLC (gas liquid chromatography)(Bowyer et al.1962) incluindo algumas modificações na técnica original: 2 h a 65° C emvez de 1 h a 80° C, três lavagens com hexano em vez de duas e nenhumalavagem com água.
Para eliminar os traços de solventes orgânicos, as frações delipídios I e II foram aquecidas até aproximadamente 125° C poraproximadamente 15 minutos, sob uma atmosfera inerte.
A gordura foi analisada de acordo com a "American OilChemisfs Society" (AOCS). O seguinte critério foi usado para analisar oslipídios extraídos: índices de saponificação e de iodo Wijs e níveis deumidade-matéria volátil. O conteúdo de colesterol foi também determinado,pelo processo de Plummer 1987 (ver bibliografia). As mesmas análises eoutras foram feitas por um laboratório independente sob a supervisão doProfessor Robert Ackman (Canadian Institute of Fisheries Technology,DalTech, Dalhousie University, Halifax, Nova Scotia, Canada). Estesincluem índice de iodo Wijs, valores de peróxido e anisidina, composição daclasse de lipídio, composição do ácido graxo, conteúdos de ácido graxo livreFAME, colesterol, tocoferol, todo trans-retinol, colecalciferol, astaxantina ecantaxantina.
A Tabela 1 mostra que os níveis mais altos de lipídios sãoextraídos do cril seco por acetona seguida de etanol, quando comparado como procedimento clássico de Folch et ai. (1957).
A Tabela 2 mostra os resultados da extração de lipídios doEuphausia pacifica congelado, uma espécie de cril do Oceano Pacífico.Assumindo um conteúdo de água de oitenta por cento, o conteúdo de lipídiosé comparável ao do cril seco, conforme mostrado na Tabela 1. Isopropanol, t-butanol e etil acetato, como o solvente para a segunda extração,proporcionaram um rendimento menos importante que o etanol, mas não sãonecessariamente menos eficazes na recuperação dos lipídios uma vez que oetanol carrega mais impurezas que o isopropanol, o t-butanol ou o etilacetato. Portanto, eles podem ser, da mesma forma, usados como o segundosolvente após a acetona. As variações entre os resultados das extrações comacetona são devidas principalmente às separações água-óleo. Essasseparações são influenciadas pela quantidade de acetona residual na soluçãoágua-óleo após a evaporação da acetona. Essa quantidade de acetona varia deuma experiência para outra, uma vez que o sistema de evaporação usado emuma escala reduzida é menos reproduzível (em escala industrial, a etapa deevaporação deverá ser otimizada). Os solventes únicos foram tambémtestados para extrair do cril a sua totalidade de lipídios. Isto mostra que o etilacetato (razão de extração 1,37 %), bem como o hexano (razão de extração0,23 %) não são bons solventes, se comparados com a acetona sozinha (razãode extração de 1,86 %, e razões de extração mesmo maiores com um sistemaeficiente de evaporação da acetona).
Uma das principais vantagens deste procedimento é a remoçãode bactérias dos extratos (da fração lipídio e do material sólido rico emproteína). Na realidade, amostras de E. pacifica incubadas em diferentesrelações de acetona a 4o C por 112 dias foram inoculadas em um meio NAcontendo extrato de carne Bacto™, 0,3 %, peptona Bacto™, 0,5 %, e agarBacto™, 1,5 % (Difco Laboratories, Detroit, USA), e em seguida incubadasna temperatura ambiente ou a 4o C por 18 dias. Nenhum significativocrescimento bacteriano foi observado com uma relação de 1 volume deacetona por grama de cril. Em proporções mais elevadas de acetona (2volumes e 5 volumes), não houve qualquer crescimento bacteriano, o quesignifica que a acetona conserva as amostras de cril. A acetona é conhecidacomo um eficiente agente bactericida e viricida (Goodman et al. 1980).
A Tabela 3 mostra os rendimentos de lipídios do M.norvegica. O percentual de lipídios (3,67 %) é comparável com aquele obtidocom o E. pacifica (3,11 %) mostrado na Tabela 2. As variações podem seratribuídas à dieta e à época (estação) da coleta, as quais são diferentes paraessas duas espécies.
A Tabela 4 mostra a influência da moagem na eficiência daextração dos lipídios do M. norvegica. Essas extrações foram levadas a efeitoem condições ótimas e mostram a definitiva vantagem do procedimento emrelação ao processo clássico (4,46 % versas 3,30 %). Ela mostra também quea moagem pode ser um fator importante quando a espécie é grande (4,46 %versas 3,53 %).
A Tabela 5 reporta a extração de lipídios de Calanus.Consideráveis quantidades de lipídios foram obtidas. Algumas variações nacomposição das espécies Calanus podem explicar as variações entre asexperiências 1 e 2 (8,22 % e 10,90 % do peso fresco).
As Tabelas 6-8 reportam a quantidade total de lipídiosextraídos de tecido de peixe. O processo da presente invenção foidemonstrado com cavala, truta e arenque. O processo foi demonstrado comtecidos periféricos (músculos principalmente) e vísceras. Vantajosamente, opresente processo deverá permitir a recuperação de valiosas frações delipídios das partes de peixes que são normalmente descartadas após a retiradade filés dos peixes. Esses tecidos de peixe que não são usados após atransformação do peixe para consumo humano, poderão ser armazenados emacetona e os lipídios extraídos dos mesmos, de acordo com a presenteinvenção mesmo caso o processo Folch [1957] recupere mais lipídios que onosso processo. Na realidade pequenas quantidades de lipídios de cavala(0,52 % de vísceras e 1,45 % de tecidos) foram extraídas pelo processo Folchapós uma primeira extração com acetona e etanol, conforme descrito napresente invenção. Extrações comparativas com o processo descrito napresente invenção conduzidas em paralelo com o processo Folch em truta earenque mostram uma recuperação superior com este último. Entretanto, deveser observado que o processo Folch não pode ser aplicado para a recuperaçãode lipídios para usos comerciais (por causa da toxidez).Nas Tabelas 9 a 11 estão mostrados resultados da extração delipídios dos tecidos de fígado de tubarão. Não há uma diferença marcante nosresultados entre técnicas quanto às espécies.
As Tabelas 12 mostram alguns aspectos característicos dafração I (acetona) e da fração II (álcool ou etil acetato) para o óleo de cril(e. pacifica). Primeiro, o índice de saponificação da fração I (130,6) indicaque esta fração contém ácidos graxos com cadeias mais longas, comparadacom a fração II (185,7). O índice de iodo Wijs da fração I mostra que estafração contém níveis elevados de ácidos graxos poliinsaturados quandocomparada com o óleo de oliva que possui um índice de 81,1. Isto explicaporque a fração I é líquida na temperatura ambiente. É bem conhecido queos ácidos graxos não saturados apresentam um ponto de fusão inferior aaquele do seus homólogos saturados. As mesmas observações são feitaspara a fração II a qual apresenta um índice de iodo de 127,2. A composiçãoem ácidos graxos mostrada na Tabela 14 corrobora esses índices de iodo: afração I possui um elevado percentual (30,24 %) de ácidos graxospoliinsaturados (pentenos + hexenos) e da mesma forma a fração II (22,98%). Para finalizar, a Tabela 12 mostra também que a fração I é composta de10,0 % de matéria volátil e umidade após a evaporação do solvente. Para omesmo teste, a fração II proporciona um valor de 6,8 %. Para eliminar ostraços de solventes, é importante aquecer rapidamente (atéaproximadamente 125° C e por 15 minutos aproximadamente) o óleo sobnitrogênio.
Os resultados com óleo de cril obtidos de acordo com oprocesso da presente invenção (fração I extraída com acetona e a fração IIextraída com etil acetato) se encontram proporcionados nas Tabelas 12, 13,14, 15, 16 e 17. É digno de nota mencionar que na Tabela 17, o conteúdo decarotenóides foi significativamente elevado, conforme medido em termos dedois carotenóides, nominalmente, astaxantina e cantaxantina. Na realidade, asanálises em duplicata revelaram valores de 92 a 124 μg/g de fração lipídiopara astaxantina e 262 a 734 μg/g para cantaxantina. Assim sendo, para afinalidade da presente invenção pode ser dito que o extrato de cril contémastaxantina como pelo menos 75, e de preferência, pelo menos 90 μg/g dafração lipídio. No caso de cantaxantina, pelo menos 250 e, de preferência,pelo menos 270 μg/g de fração lipídio. Os valores baixos para peróxido eanisidina são vantajosos e são devidos à presença de níveis elevados deantioxidantes naturais (astaxantina e cantaxantina). Esses compostos sãoindicativos de propriedades farmacêuticas e cosméticas favoráveis para oextrato de cril uma vez que níveis elevados de carotenóides indicamcaracterísticas excelentes de migração transdérmica. Assim sendo, o extratode cril é um bom candidato para a administração transdérmica demedicamentos.
A Tabela 18 mostra o melhor modo do processo de acordocom a presente invenção para a extração de lipídios de tecidos de animaisaquáticos.
A Tabela 19 mostra que a atividade das enzimas da fraçãosólida é mantida sendo seguido o processo da presente invenção. Narealidade, a demonstração foi completada para o resíduo sólido de cril obtidoapós a extração em sucessão com acetona e etil acetato. As atividadesproteolíticas foram medidas pela liberação de grupos amino por análiseespectrofotométrica utilizando como reagente o o-ftaldialdeído. Asconcentrações de proteína foram medidas pelo processo Bradford. Asproteínas solúveis foram extraídas com água e adicionadas a um concentradode proteína lactoserum a 10 % obtido por ultrafiltração. No término daincubação a 37° C, em uma solução tampão de fosfato de potássio 50 mM, foiadicionado ácido tricloroacético e a quantidade de grupos NH3 foi medida nosobrenadante de acordo com o processo de Church et al. [1983, J. Dairy Sei.66: 1219-1227].As Figuras 1 a 6 mostram cromatogramas da composição deácidos graxos dos lipídios de E. pacifica. Em cada uma delas, elevadasproporções de ácidos graxos 20:5 e 22:6 (característico de óleosmarinhos e aquáticos) podem ser observadas sendo representadas pordois picos distintos.
As variações nas configurações dos lipídios neutros (daFigura 7 à Figura 11) de uma espécie para outra são atribuíveis adiferenças nas fontes de alimentação. Dentro de uma espécie (E.pacifica; por exemplo) não existe uma variação marcante entre asconfigurações de lipídios obtidas com diferentes técnicas de extraçãodos lipídios. No que diz respeito a fosfolipídeos (Figura 12 a Figura 16),o oposto é observado: as variações são explicadas pelos diferentesprocessos de extração dos lipídios uma vez que espécies iguais nãolevam à mesma configuração de lipídios. Os lipídios de espécies detubarão (extraídos pelos processos mencionados) e de óleo de fígado debacalhau comercial (amostra disponível das farmácias Uniprix, Provínciade Québec, Canada) são compostos principalmente de lipídios neutros aocontrário de fosfolipídeos.
A influência do volume de solvente e do tempo deincubação na eficiência da acetona para a extração dos lipídios do E.pacifica está ilustrada nas Figuras 17 e 18, respectivamente. Uma relaçãode 1:6 (p/v) produziu um rendimento ótimo com uma extração quasecompleta após 2 h. A segunda etapa de extração foi testada com etanol.O volume desse solvente não parece ser crítico uma vez que o mesmorendimento foi obtido com diferentes volumes de etanol (Figura 19),embora os tempos de incubação em etanol deverão ser de pelo menos 30minutos, conforme indicado pelos resultados na Figura 20.
Um dos inventores, o Dr. Adrien Beaudoin, ingeriu asdiferentes frações de lipídio de cril. Nenhum perfil de efeito colateral foiobservado.
Embora a invenção tenha sido descrita acima em relação auma forma específica, deverá ficar evidente para uma pessoa especializadanesta tecnologia que ela poderá ser modificada e refina de diversas maneiras.
É portando desejado que seja entendido que a presente invenção não deveráser limitada em escopo, exceto pelos termos das reivindicações que seseguem.
Demonstração que o resíduo de cril, obtido após extração comacetona e etil acetato, contém atividades proteolíticas de enzimas. Asatividades proteolíticas foram medidas pela liberação de grupos amino poranálise espectrofotométrica usando o-ftaldialdeído como reagente. Asconcentrações de proteína foram medidas pelo processo Bradford.
A fonte de enzimas foi o resíduo obtido após a extração doslipídios com acetona e etil acetato. As proteínas solúveis foram extraídas comágua e adicionadas a um concentrado de proteína lactoserum a 10 % obtidopor ultrafiltração.
No término da incubação a 37° C em uma solução tampão defosfato de potássio 50 mM, foi adicionado ácido tricloroacético e aquantidade de grupos NH3 foi medida no sobrenadante, de acordo comChurch eal. 1983.BIBLIOGRAFIA
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<table>table see original document page 19</column></row><table>
Determinações em triplicata (variação < 5 %)
a) extração feita com uma relação amostra-solvente de 1:9 (p/v), semincubação.
b) extração feita com uma relação amostra-solvente de 1:4 (p/v), incubada1 noite a 4o C, em seguida a uma primeira extração com acetona
c) Folchetal. 1957
TABELA 2. EXTRAÇÃO DE LIPÍDIOS DE CRIL CONGELADO
<table>table see original document page 19</column></row><table>TABELA 2. (continuação)EXTRAÇÃO DE LIPIDIOS DE CRILCONGELADO (E.Pacifica)
<table>table see original document page 20</column></row><table>
Determinações em triplicata (variação < 5 %)
a) extração feita com uma relação amostra-solvente de 1:6 (p/v), incubada2 h a 4o C
b) extração feita com uma relação amostra-solvente de 1:2 (p/v), incubada30 min a 4o C, em seguida a uma primeira extração com acetona
c) extração feita com uma relação amostra-solvente de 1:2 (p/v), incubada30 min a 25° C, em seguida a uma primeira extração com acetona
d) extração feita com uma relação amostra-acetona-etanol de 1:5:5 (p/v/v),incubada 2 h a 4o C
e) extração feita com uma relação amostra-solvente de 1:9 (p/v), incubada2 h a 4o C
f) Folch et al. 1957.TABELA 3. EXTRAÇÃO DE LIPIDIOS DE CRIL CONGELADO (Mnorvegica)
<table>table see original document page 21</column></row><table>
Determinações em triplicata (variação < 5 %)
a) extração feita com uma relação amostra-solvente de 1:9 (p/v), incubada1 noite a 4o C
b) extração feita com uma relação amostra-solvente de 1:4 (p/v), incubada1 h a 4o C, em seguida a uma primeira extração com acetona
TABELA 4. INFLUÊNCIA DA MOAGEM NA EXTRAÇÃO DE LIPÍDIOSDE CRIL CONGELADO (M norvegica)
<table>table see original document page 21</column></row><table>
Determinações em triplicata (variação < 5 %)
a) extração feita com uma relação amostra-solvente de 1:6 (p/v), incubada2 h a 4o C
b) extração feita com uma relação amostra-solvente de 1:2 (p/v), incubada30 min a 4o C, em seguida a uma primeira extração com acetona
c) Folchetal. 1957.TABELA 5. EXTRAÇÃO DE LIPÍDIOS DE Calanus CONGELADO
<table>table see original document page 22</column></row><table>
Determinações em triplicata (variação < 5 %)
a) extração feita com uma relação amostra-solvente de 1:9 (p/v), incubada1 noite a 4o C
b) extração feita com uma relação amostra-solvente de 1:4 (p/v), incubada1 h a 4o C, em seguida a uma primeira extração com acetona.
TABELA 6. EXTRAÇÃO DE LIPÍDIOS DE PEIXE FRESCO (Cavala)
<table>table see original document page 22</column></row><table>
a) extração feita com uma relação amostra-solvente de 1:9 (p/v), tempo deincubação:
• extração vísceras peixe 1: 4 h, tecidos peixe 1: 23 h
• extração vísceras peixe 2: 23h45, tecidos peixe 2: 45h30
• extração vísceras peixe 3: 8 dias 2h20, tecidos peixe 3: 8 dias 2h30• extração vísceras peixe 4: 17 dias 23h, tecidos peixe 4: 18 dias 2h25
b) extração feita com uma relação amostra-solvente de 1:4 (p/v), incubada1 h a 4o C, em seguida a uma primeira extração com acetona
c) Folch et al. 1957, em seguida a extrações com acetona e depois etanol.
TABELA 7. EXTRAÇÃO DE LIPÍDIOS DE PEIXE FRESCO (Truta)
<table>table see original document page 23</column></row><table>
Determinações em triplicata (variação < 5 %)
a) extração feita com uma relação amostra-solvente de 1:9 (p/v), incubada1 noite a 4o C
b) extração feita com uma relação amostra-solvente de 1:4 (p/v), incubada1 h a 4o C, em seguida a uma primeira extração com acetona
c) Folch et al. 1957.
TABELA 8. EXTRAÇÃO DE LIPÍDIOS DE PEIXE FRESCO (Arengue)
<table>table see original document page 23</column></row><table>
Determinações em triplicata (variação < 5 %)
a) extração feita com uma relação amostra-solvente de 1:9 (p/v), incubadalnoite a 4o C
b) extração feita com uma relação amostra-solvente de 1:4 (p/v), incubada1 h a 4o C, em seguida a uma primeira extração com acetona
c) Folch et al. 1957.TABELA 9. EXTRAÇÃO DE LIPÍDIOS DE FÍGADO FRESCO DETUBARÃO (M. schmitti)
<table>table see original document page 24</column></row><table>
Determinações em triplicata (variação < 5 %)
a) extração feita com uma relação amostra-solvente de 1:9 (p/v), incubada2 h a 4 oC
b) extração feita com uma relação amostra-solvente de 1:2 (p/v), incubada30 min a 4 oC, em seguida a uma primeira extração com acetona
c) extração feita com uma relação amostra-solvente de 1:9 (p/v), incubada2 h a 4 oC
d) Folch et al. 1957.
TABELA 10. EXTRAÇÃO DE LIPÍDIOS DE FÍGADO FRESCO DETUBARÃO (G. galeus)
<table>table see original document page 24</column></row><table>
Determinações em triplicata (variação < 5 %)
a) extração feita com uma relação amostra-solvente de 1:9 (p/v), incubada2 h a 4 oC
b) extração feita com uma relação amostra-solvente de 1:2 (p/v), incubada30 min a 4 oC, em seguida a uma primeira extração com acetona
c) extração feita com uma relação amostra-solvente de 1:9 (p/v), incubada2 h a 4 oC
d) Folch et al. 1957.TABELA 11. EXTRAÇÃO DE LIPÍDIOS DE FÍGADO FRESCO DETUBARÃO (Tubarão Anjo)
<table>table see original document page 25</column></row><table>
Determinações em triplicata (variação < 5 %)
a) extração feita com uma relação amostra-solvente de 1:9 (p/v), incubada 2 h a 4o C
b) extração feita com uma relação amostra-solvente de 1:2 (p/v), incubada 30 min a 4oC, em seguida a uma primeira extração com acetona
c) extração feita com uma relação amostra-solvente de 1:9 (p/v), incubada 2 h a 4° C
d) Folchetal. 1957.
TABELA 12. CARACTERÍSTICAS DO ÓLEO DE CRIL (E. Pacifica)
<table>table see original document page 25</column></row><table>
a) laboratório do Professor Robert Ackman, Canadian Institute of Fisheries Technology,Halifax, Nova Scotia
b) Harwood and Geyer 1964
c) extração feita com uma relação amostra-acetona de 1:6 (p/v), incubada 2 h a 4o C
d) extração feita com uma relação amostra-etil acetato de 1:2 (p/v), incubada 30 min a4o C, em seguida a uma primeira extração com acetona
e) óleo de oliva extra virgem extraído a frio Bertolli®.TABELA 13. COMPOSIÇÃO DE CLASSE DE LIPÍDIOS DO OLEO DECRIL (AREA %)(£. pacifica)
<table>table see original document page 26</column></row><table>
Dados do laboratório do Professor Robert Ackman, Canadian Institute of FisheriesTechnology, Halifax, Nova Scotia
a) extração feita com uma relação amostra-acetona de 1:6 (p/v), incubada 2 h a 4o C
b) extração feita com uma relação amostra-etil acetato de 1:2 (p/v), incubada 30 min a4o C, em seguida a uma primeira extração com acetona.TABELA 14. COMPOSIÇÃO EM ÁCIDOS GRAXOS DO ÓLEO DE CRIL
<table>table see original document page 27</column></row><table>TABELA 14. (continuação) COMPOSIÇÃO EM ÁCIDOS GRAXOS DOÓLEO DE CRIL (P/P%)(£. Pacifica)
<table>table see original document page 28</column></row><table>
Dados do laboratório do Professor Robert Ackman, Canadian Institute of FisheriesTechnology, Halifax, Nova Scotia
a) extração feita com uma relação amostra-acetona de 1:6 (p/v), incubada 2 h a 4o C
b) extração feita com uma relação amostra-etil acetato de 1:2 (p/v), incubada 30 min a 4o C,em seguida a uma primeira extração com acetona.TABELA 15. ÁCIDOS GRAXOS DE CRIL LIVRES DE LIPÍDIOS
<table>table see original document page 29</column></row><table>TABELA 15. (continuação) ÁCIDOS GRAXOS DE CRIL LIVRES DELIPÍDIOS (P/P%)(£. pacifica)
<table>table see original document page 30</column></row><table>
Dados do laboratório do Professor Robert Ackman, Canadian Institute of FisheriesTechnology, Halifax, Nova Scotia
a) extração feita com uma relação amostra-acetona de 1:6 (p/v), incubada 2 h a 4o C
b) extração feita com uma relação amostra-etil acetato de 1:2 (p/v), incubada 30 min a4o C, em seguida a uma primeira extração com acetona.TABELA 16. CONTEÚDO DE TOCOFEROL, TODO-trans RETINOL E COLECALCIFEROL NO ÓLEO DE CRIL (E. pacifica)
<table>table see original document page 31</column></row><table>
Dados do laboratório do Professor Robert Ackman, Canadian Institute of FisheriesTechnology, Halifax, Nova Scotia
Dados expressos por grama de óleo de cril.
a) extração feita com uma relação amostra-acetona de 1:6 (p/v), incubada 2 h a 4o C
b) extração feita com uma relação amostra-etil acetato de 1:2 (p/v), incubada 30 min a4o C, em seguida a uma primeira extração com acetona.
TR = traços
N.D. = não detectado
Conversão: Vitamina alfa-tocoferol mg/g óleo χ 1,36 =Unidade Internacionaltodo-trans retinol μg/g - 0,3 =Unidade InternacionalTABELA 17. CONTEÚDO DE ASTAXANTINA E CANTAXANTINA DOÓLEO DE CRIL (E. pacifica)
<table>table see original document page 32</column></row><table>
Dados do laboratório do Professor Robert Ackman, Canadian Institute of FisheriesTechnology, Halifax, Nova Scotia
a) extração feita com uma relação amostra-acetona de 1:6 (p/v), incubada 2 h a 4o C
b) extração feita com uma relação amostra-etil acetato de 1:2 (p/v), incubada 30 min a4o C, em seguida a uma primeira extração com acetona.
TABELA 18. CONDIÇÕES ÓTIMAS PARA EXTRAÇÃO DE LIPÍDIOSDE TECIDOS DE ANIMAIS AQUÁTICOS (procedimento sugerido)
<table>table see original document page 32</column></row><table>
a) etanol pode ser substituído por isopropanol, t-butanol ou etil acetato
b) 25° C quando usado t-butanol.TABELA 19. ATIVIDADE PROTEOLÍTICA DO RESÍDUO DE CRILUSANDO LACTOSERUM COMO O SUBSTRATO, A 37° c, pH 7,0, PARAUMA RELAÇÃO ENZIMA:SUBSTRATO DE 1:43
<table>table see original document page 33</column></row><table>
* quantidade total de enzimas no meio de hidrólise.

Claims (31)

1. Método para extração de frações de lipídios de material deanimais marinhos e aquáticos, caracterizado pelo fato de compreender asetapas de:(a) colocar o material de animais marinhos e aquáticos emum solvente cetona, para obter uma extração da fração solúvel de lipídio domencionado material de animais marinhos e aquáticos;(b) separar os conteúdos líquido e sólido;(c) recuperar uma primeira fração rica em lipídios do conteúdolíquido de b) por evaporação do solvente presente no conteúdo líquido;(d) colocar o mencionado conteúdo sólido em um solventeorgânico selecionado do grupo de solventes que consiste de álcool, e ésteresde ácido acético para obter a extração da restante fração solúvel de lipídiosdo mencionado material de animais marinhos e aquáticos;(e) separar os conteúdos líquido e sólido;(f) recuperar a segunda fração rica em lipídios por meio deevaporação do solvente do conteúdo líquido de e);(g) recuperar o conteúdo sólido.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o solvente de cetona é acetona.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizadopelo fato de que o referido álcool é etanol, isopropanol ou t-butanol.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-3, caracterizado pelo fato de que o referido solvente orgânico é etil acetato.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-4, caracterizado pelo fato de que durante a etapa (a), o solvente e o materialanimal são homogeneizados.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-5, caracterizado pelo fato de que durante a etapa (d) o solvente e o conteúdosólido são homogeneizados.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que as etapas (b) e (d) são conduzidas sob umaatmosfera de gás inerte.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que as etapas (b) e (e) são levadas a efeito pormeio de técnicas selecionadas de filtração, centrifugação e sedimentação.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que as etapas (c) e (f) são levadas a efeito pormeio de técnicas selecionadas de evaporação a vácuo, evaporação pordescompressão e secagem por atomização.
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 9, caracterizado pelo fato de que após a etapa (b) e antes da etapa (c), oprocesso compreende adicionalmente a etapa intermediária de lavar oconteúdo sólido com o solvente e adicionar a solução de lavagem resultanteao conteúdo líquido da etapa (b).
11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 10, caracterizado pelo fato de que após a etapa (e) e antes da etapa (f), ométodo compreende adicionalmente a etapa intermediária de lavar oconteúdo sólido com o solvente orgânico selecionado na etapa (d).
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1ali, caracterizado pelo fato de que antes da etapa (a) o material de animaismarinhos e aquáticos é finamente dividido.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que o material animal é finamente dividido até um tamanho departícula médio de 5 mm ou menos.
14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 13, caracterizado pelo fato de que as etapas (a) e (b) são conduzidas emtemperaturas de solvente de aproximadamente 5o C ou menos.
15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-1 a 14, caracterizado pelo fato de que o animal marinho e aquático ézooplâncton.
16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizadopelo fato de que o zooplâncton é cril.
17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizadopelo fato de que o zooplâncton é Calanus.
18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-1 a 14, caracterizado pelo fato de que o animal marinho e aquático é umsubproduto da produção de filés de peixe.
19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 18, caracterizado pelo fato de que as frações de lipídio compreendem pelomenos astaxantina e cantaxantina.
20. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizadopelo fato de que o subproduto da produção de filés de peixe é víscera.
21. Método de acordo com a reivindicação 18 ou 20,caracterizado pelo fato de que o referido material animal é cril.
22. Método de acordo com a reivindicação 18 ou 20,caracterizado pelo fato de que o referido material animal é Calanus.
23. Extrato de lipídio de cril obtido pelo método comodefinido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fatode que o conteúdo de carotenóide como astaxantina é de pelo menosaproximadamente 75 \iglg de extrato de cril, e que o conteúdo de carotenóidecomo cantaxantina é de pelo menos aproximadamente 250 μg/g de extrato de cril.
24. Extrato de lipídio de cril de acordo com reivindicação 23,caracterizado pelo fato de que o conteúdo de carotenóide como astaxantina éde pelo menos aproximadamente 90 \iglg de extrato de cril.
25. Extrato de lipídio de cril de acordo com reivindicação 23,caracterizado pelo fato de que o conteúdo de carotenóide como cantaxantinaé de pelo menos aproximadamente 270 de extrato de cril.
26. Método para extração de lipídio de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que o conteúdosólido da etapa b) e/ou e) é recuperado e consiste de um resíduo desidratadocontendo enzimas ativas.
27. Uso do extrato de lipídio como definido em qualquer umadas reivindicações 23 a 25, caracterizado pelo fato de ser em uma aplicaçãoselecionada a partir de um grupo consistindo de aplicações medicinais,nutriceuticas, cosméticas, criação de peixes e alimentação animal.
28. Uso do extrato de lipídio como definido em qualquer umadas reivindicações 23 a 25, caracterizado pelo fato de ser na manufatura deum produto selecionado a partir de um grupo consistindo de produtos demedicinais, nutriceuticos, cosméticos, criação de peixes e alimentaçãoanimal.
29. Fração de lipídio, caracterizada pelo fato de ser obtidapelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 22 e 26.
30. Uso da fração de lipídio como definida na reivindicação 29, caracterizado pelo fato de ser em uma aplicação selecionada a partir deum grupo consistindo de aplicações medicinais, nutriceuticas, cosméticas,criação de peixes e alimentação animal.
31. Uso da fração de lipídio como definida na reivindicação 29, caracterizado pelo fato de ser na manufatura de um produto selecionado apartir de um grupo consistindo de produtos de medicinais, nutriceuticos,cosméticos, criação de peixes e alimentação animal.
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